CN114410593B - 一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺 - Google Patents

一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺，属于病毒载体疫苗制备领域。所述方法包括以下步骤：(1)细胞培养：在装载有细胞微载体的生物反应器内加入无血清细胞生长液，培养Vero细胞至密度为2～5×105cell/cm2；(2)病毒接种和培养：将重组病毒按0.001～0.1MOI接种到Vero细胞，用无血清病毒维持液培养7天，收获培养上清，得病毒收获液；(3)粗滤；(4)酶切；(5)超滤和洗滤(6)终滤。本发明的生产工艺安全、稳定、可控，批次间质量均一，利用该生产工艺制得的重组新型冠状病毒疫苗不仅效价高，而且Vero细胞DNA和Vero细胞宿主蛋白残留量低。本发明的生产工艺能够大规模生产高质量的重组新型冠状病毒疫苗，应用前景广阔。

Description

一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生 产工艺
技术领域
本发明属于病毒载体疫苗领域，具体涉及一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺。
背景技术
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2，又称新型冠状病毒)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是一个全球性的卫生紧急事件。人感染了SARS-CoV-2后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。研发出有效、稳定的新型冠状病毒疫苗对预防新型冠状病毒肺炎具有重要意义。研究发现，SARS-CoV-2与引发2003年严重急性呼吸综合征(SARS)的病毒基因组序列相近，是一种有包膜的单股正链RNA病毒，体现在病毒表面的棘突蛋白S蛋白是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒的表面形成了大量的刺突蛋白，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞识别时发挥着重要作用。多项研究表明，SARS的S蛋白疫苗可以产生高效价的抗SARS-CoV病毒的中和抗体，可以有效预防SARS-CoV的感染，因此鉴于SARSCoV-2与SARS的S蛋白三维结构高度相似，在研制新型冠状病毒疫苗时通常将新冠的S抗原作为主要靶点。
将目标病毒的结构蛋白组装到其他病毒(称为“病毒载体”)，得到重组病毒进而得到病毒载体疫苗，是病毒疫苗研发的新方向，例如：2021年2月25日国家药品监督管理局宣布附条件批准康希诺生物股份公司“克威莎”的上市注册申请，该疫苗就是以5型腺病毒为载体的重组新冠病毒疫苗(Ad5-nCoV)。重组病毒疫苗主要有如下优点：一方面，病毒载体疫苗具有目标病毒的抗原表位，能够刺激机体产生中和抗体以及细胞免疫应答；另一方面，病毒载体疫苗具有在感染细胞中有限复制的能力，能够保证机体内部有足够的免疫原，持续刺激机体不断产生抗体和T细胞，进而延长疫苗的预防时效。此外，病毒载体疫苗含有RNA等Toll样受体的配体，可以有效激活机体的固有免疫，因此无需佐剂就可以诱导Th1和Th2平衡的免疫应答。
病毒类疫苗在生产过程中需要对相应病毒进行培养，病毒培养工艺是否优良是在整个疫苗生产过程中直接决定疫苗质量和疫苗总量的关键性因素。为了在最短时间内、快速获得可用于人类预防的新型冠状病毒灭活疫苗，需在保证安全的前提下大批量、规模化制备新型冠状病毒。
Vero细胞由于具有易培养、可适用于大规模培养等特性，目前已广泛应用于狂犬病疫苗、流感疫苗、甲型肝炎病毒疫苗等的生产和研发。但在实际生产中，由于Vero细胞的贴壁特性，悬浮驯化较难，较多使用的是微载体培养法。但是，适用于微载体培养法的安全、稳定、可控的无血清培养基的应用较少，导致疫苗质量和生产效率差异较大。考虑到利用生物反应器培养细胞进行病毒繁殖的技术操作简单，运行稳定可靠，自动化控制程度高、培养表面积大、易于规模化生产，近年来，应用生物反应器微载体系统大规模培养Vero细胞生产病毒类疫苗的方法引起了广泛的关注。
申请号为202010537730.0的中国专利申请公开了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的Vero细胞灭活疫苗病毒液的大规模生产方法，该方法包括如下步骤：在装填有片状载体的10L、40L或300L篮式生物反应器中加入细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长成致密单层后，采用细胞维持液洗换；洗换结束后注入细胞维持液，进行新型冠状病毒的接种，病毒接种的MOI为0.005～0.4，病毒培养温度为36±1℃，溶氧≥40％，控制病毒培养阶段体系pH值为7.2～7.6；病毒接种后培养48～96h，收获病毒液。但是，该方法使用的是含血清Vero细胞培养工艺，过程中需要洗换去掉血清残留，工艺较复杂；另外，利用该方法培养新型冠状病毒SARS-CoV-2需要P3生物安全级别工厂，生产条件苛刻，成本较高。
开发出一种工艺简单、成本较低的大规模化生产重组新型冠状病毒疫苗的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺。
本发明提供了一种重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺，包括以下步骤：
(1)细胞培养：在装载有细胞微载体的生物反应器内加入无血清细胞生长液，培养Vero细胞至密度为2～5×105cell/cm2；
(2)病毒接种和培养：将重组病毒按0.001～0.1MOI接种到Vero细胞，用无血清病毒维持液培养7天，收获培养上清，得病毒收获液；
其中，重组病毒是携带SARS-CoV-2病毒的S基因的麻疹病毒，S基因的序列如SEQID NO.1所示；
(3)粗滤：将病毒收获液用深层滤器过滤，收集滤过液；
(4)酶切：在滤过液中加入核酸酶进行酶切，得到酶切后的病毒收获液；
(5)超滤和洗滤：将酶切后的病毒收获液进行超滤和洗滤，得到浓缩后的病毒收获液；
(6)终滤：将浓缩后的病毒收获液用深层滤器过滤，收集滤过液。
进一步地，步骤(1)中，所述重组病毒表达序列如SEQ ID NO.10所示的S蛋白。
进一步地，步骤(1)中，所述生物反应器为固定床式生物反应器；
所述无血清细胞生长液是Vero SFM细胞培养基；
所述培养的温度为37℃，溶氧为≥60％，pH为7.2±0.1；
所述细胞微载体为片式载体；
所述密度为2～5×105cell/cm2。
进一步地，步骤(1)中，所述固定床式生物反应器为14L固定床式生物反应器；
所述Vero SFM细胞培养基的型号为633A；
所述片式载体为天信和cellcomb片式载体。
进一步地，步骤(2)中，所述无血清病毒维持液是199细胞培养基；
所述培养的温度为33℃，溶氧为≥60％，pH为7.4±0.1。
进一步地，步骤(2)中，所述199细胞培养基的型号为304。
进一步地，步骤(3)中，所述深层滤器的孔径为2.5～3.5μm；
步骤(4)中，所述核酸酶的终浓度为15～25U/ml；
步骤(5)中，超滤时采用的超滤膜包分子量为250～350kD，浓缩倍数为3～10倍，液体流速为3～10L/h，进液端压力为≤0.1Bar，回流端压力≤0.1Bar，跨膜压差≤0.1Bar，温度为室温；洗滤时采用的清洗液体为5％蔗糖溶液，浓缩倍数为10～20倍，液体流速为3～10L/h，进液端压力≤0.1Bar，回流端压力≤0.1Bar，跨膜压差≤0.1Bar，温度为室温；
步骤(6)中，所述深层滤器的孔径为1.0～1.5μm。
进一步地，步骤(3)中，所述深层滤器的孔径为3μm；
步骤(4)中，所述核酸酶的终浓度为20U/ml；
步骤(5)中，超滤时采用的超滤膜包分子量为300kD；
步骤(6)中，所述深层滤器的孔径为1.2μm。
进一步地，还包括以下步骤：
(7)在步骤(6)所得滤过液中加入保护剂，得到重组新型冠状病毒疫苗。
本发明还提供了上述大规模生产工艺制得的重组新型冠状病毒疫苗。
本发明以麻疹病毒为载体构建了一种重组新型冠状病毒，该重组新型冠状病毒是携带SARS-CoV-2病毒的S基因的麻疹病毒，所述S基因的序列如SEQ ID NO.1所示，该重组新型冠状病毒能够表达序列如SEQ ID NO.10所示的S蛋白。
本发明进一步采用生物反应器微载体系统，提供了上述重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺。本发明经过大量筛选实验，最终确定了生产工艺中各个步骤的工艺参数，该生产工艺作为一个整体制得了高质量的重组新型冠状病毒疫苗。
本发明的生产工艺中，Vero细胞培养使用无血清培养工艺，省去了洗换去血清步骤，操作更简便。另外，本发明的重组病毒是携带SARS-CoV-2病毒的S基因的麻疹病毒，这种重组病毒生物安全级别低，仅为BSL-1级，无需P3生物安全级别工厂，生产条件容易实现，成本降低。
本发明的生产工艺安全、稳定、可控，批次间质量均一，得到的重组新型冠状病毒疫苗不仅效价高，而且Vero细胞DNA和Vero细胞宿主蛋白残留量低：病毒收获液滴度高达6.29-6.57lgCCID50/ml，Vero细胞DNA残留量低至1.33-1.88ng/剂，Vero细胞宿主蛋白残留低至0.54-0.69ug/剂。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1.表达SARS-CoV-2相关抗原表位重组麻疹病毒质粒图谱。
图2.酶切鉴定质粒pT7-MVS191-S、pT7-MVS191-S-ecto、pT7-MVS191-preS。
图3.候选重组麻疹病毒毒种麻疹病毒N蛋白及新冠S抗原的表达原位免疫荧光检测。
图4.Western blot检测候选重组麻疹病毒毒种抗原S蛋白表达。
图5.MVS191-S生长曲线图。
图6.从左到右边依次为用型号为630、633、633A的Vero SFM细胞培养基(购自天信和(苏州)生物科技有限公司)作为生长培养基培养Vero细胞的结果。从中看出型号为633A的Vero SFM细胞培养基培养效果最优。
图7.地鼠血清新冠抗S蛋白IgG抗体检测。
图8.地鼠血清新冠假病毒中和抗体检测。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
表1.本发明涉及的核苷酸或氨基酸序列
实施例1、以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒的制备
1.重组麻疹病毒载体的构建
1.1外源基因S的优化及获得
人源密码子优化编码SARS-CoV-2Spike蛋白(protein_id＝"QHD43416.1")的基因(简称“S基因”)，在基因的5′端引入BsiWI酶切位点及ATG起始密码子，3′端引入BssHII位点及TAA终止密码子，核苷酸序列送金唯智合成。合成基因序列见SEQ ID NO.1。
膜外可溶性结构域(S-ecto)基因片段依据S基因用引物(S-ecto正向引物、S-ecto反向引物)进行扩增得到，所得DNA翻译S蛋白的第1-1208号氨基酸。融膜前结构(preS)基因片段为S蛋白氨基酸986-987突变为脯氨酸，氨基酸682-685蛋白酶切位点替换为GSAS。
1.2 pT7-IRES His-C DNA载体
以pT7-IRES His-C DNA载体为模板，以pT7-IRES-NotI以及pT7-IRES-NheI为上下游引物，PCR扩增去除pT7-IRES His C DNA载体EMCV-IRES序列及SacII酶切位点。合成NheI-AscI-SacII-XmaI-PacI-EcoRI-KpnI-BsrGI-NotI限制性内切酶的多克隆位点序列(MCS)。将多克隆位点序列(MCS)通过NheI和NotI酶切位点与载体PCR扩增产物连接，经转化后，挑取菌落进行扩大培养，提取质粒，选取合适的限制性内切酶对质粒进行鉴定。改造后的载体命名为pT7-MCS。
1.3麻疹病毒载体构建
将麻疹沪191株病毒反基因组构建到pT7-MCS载体上，并做如下修饰：反基因组5’端插入T7启动子和锤头核酸酶序列(HamRz)，反基因组3’端插入T7终止子和丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRz)，P基因和M基因之间引入人工合成的附加转录单元(ATU)，获得质粒pT7-MVS191。
1.4插入外源基因
外源基因S、S-ecto、preS分别用BsiWI和BssHII限制性内切酶连接至pT7-MVS191质粒的ATU序列之间，转化JM109感受态，挑取单克隆提取质粒毒质粒大小进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。构建得到SARS-CoV-2相关抗原表位基因的重组麻疹病毒载体。质粒图谱如图1所示。用限制性内切酶NdeI、NcoI、EcoRI、SpeI酶切鉴定质粒pT7-MVS191-S、pT7-MVS191-S-ecto、pT7-MVS191-preS。鉴定结果如图2所示，酶切图谱与目标序列酶切理论片段一致。
2.病毒拯救
将5×105个Vero细胞用电转缓冲液充分混匀悬浮。12μg重组麻疹病毒载体和8μgpT7-IRES-MVN质粒(以Takara pT7-IRES His-C DNA为载体，多克隆位点插入麻疹N蛋白(MVN)基因所得)，4μg pT7-IRES-MVP(以Takara pT7-IRES His-C DNA为载体，多克隆位点插入麻疹P蛋白(MVP)基因所得)，1μg pT7-IRES-MVL(以Takara pT7-IRES His-C DNA为载体，多克隆位点插入麻疹L蛋白(MVL)基因所得)及4ug pCDIBP-T7RNAP(表达T7RNA聚合酶的质粒)4种辅助质粒混合，按如下步骤拯救病毒：
1)混合物转入直径为2mm的BioRad电转杯，指数波、140V、950μF电击1次。
2)电转染后将细胞移入T25瓶，补加5mL 10％NBS/MEM，5％CO237℃培养24h。
3)5mL 10％NBS/MEM换液，继续培养4d后，观察病变。培养到细胞病变约80～90％。
4)将转染细胞及上清混合物反复冻融3次，收获重组病毒。
3.重组麻疹病毒的检测
3.1 RT-PCR及基因测序外源基因
取拯救病毒P2代病毒培养液，4℃，1500g离心2min。取上清，按照Roche高纯度病毒RNA提取试剂盒说明书提取重组病毒的基因组RNA，以随机引物将基因组RNA反转录为cDNA。以此cDNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶及引物seq-F2ATU-FOR、seq-F2ATU-REV扩增外源基因片段，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果显示两个毒种均能扩增到单一目的条带，片段大小正确。PCR产物送金唯智测序。测序结果比对表明：测序结果与目的序列一致。
3.2原位免疫荧光检测麻疹病毒N蛋白及抗原S的表达
Vero细胞接种于6孔板中，37℃，5％CO2培养至细胞汇合度80％～90％，按照MOI＝0.03分别接种重组病毒。37℃，5％CO2吸附30min后补加2％NBS/MEM至2mL/孔，37℃，5％CO2培养3d。吸取病毒培养上清，2mLPBS清洗病毒孔3次。加入1mL 4％多聚甲醛固定细胞20min；含1％Trixon-100的PBS透化10min；PBS清洗3次；加入含有0.3％山羊血清的0.05％Tween20PBST溶液封闭1h；PBST清洗3次，每次5min；加入PBS稀释的抗新冠S2蛋白兔多抗(1:3000，义翘神州，货号：40590-T62)及抗麻疹病毒N蛋白鼠单克隆抗体(1:3000，Abcam，货号：ab106292)4℃过夜；PBST清洗3次，每次5min；加入相应的Cy3标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1:3000，碧云天，货号：A0521)及FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)(1:3000，碧云天，货号：A0562)室温1h；PBST清洗3次，每次5min。加入抗荧光淬灭PVP封片液。蔡司荧光显微镜观察荧光。
原位免疫荧光检测如图3所示，重组病毒在白光视野下可见重组病毒形成以核胞体为主的典型细胞病变。抗麻疹病毒N蛋白抗体检测，可见红色荧光信号，说明重组病毒可检测到麻疹病毒N蛋白的表达。新冠S蛋白检测，重组病毒感染孔可见绿色荧光信号，说明重组病毒可检测到新冠S蛋白的表达。且表达的N蛋白和S蛋白在红光和绿光位置重叠。结果表明：拯救获得的重组病毒原位免疫荧光实验中可检测到麻疹病毒N蛋白及新冠S蛋白的表达。
3.3 Western Blot检测麻疹病毒N蛋白和抗原表位的表达
Vero细胞接种入T25细胞瓶，10％NBS/MEM培养基，37℃，5％CO2培养至细胞汇合度80％～90％，按MOI＝0.03分别接种重组病毒，37℃，5％CO2吸附30min后补加2％NBS/MEM至5mL，37℃，5％CO2培养3d。Vero细胞上培养的MVS191作为对照。1个T25细胞瓶收集培养上清，细胞及病毒用5mL PBS洗涤3次，加入1mL RAPI裂解液充分裂解细胞及病毒，收集裂解液。10000g离心10min，收集上清。抗新冠S2蛋白兔多抗(1:3000，义翘神州，货号：40590-T62)为一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1:3000，碧云天，货号：A0208)为二抗。Western Blot检测重组病毒。
以MVS191培养上清和裂解病毒液为对照，收集细胞裂解液和培养上清进行目标抗原S的Western Blot检测，MVS191-S，MVS191-S-ecto，MVS191-preS三个毒种均可检测到目标蛋白的表达，其中MVS191-S的目标抗原表达量明显高于其他两个重组病毒。结果如图4所示，其中1和2为MVS191感染Vero细胞，1:裂解液，2:上清。3和4为MVS191-S感染Vero细胞，3:裂解液，4:上清。5和6为MVS191-preS感染Vero细胞，5:裂解液，6:上清。7和8为MVS191-S-ecto感染Vero细胞，7:裂解液，8:上清。
4.重组病毒滴度及生长曲线测定
4.1滴度检测
采用终点稀释法检测重组病毒的感染性滴度，用Reed-Muench法计算细胞半数感染剂量(CCID50)。重组病毒在Vero细胞上传代培养，培养5天后，将细胞及培养液于-20℃冻融一次收集病毒液。重组病毒用含2％NBS的MEM进行10倍系列稀释每稀释度病毒液100μl/孔接种至96孔板培养的Vero细胞中，每个稀释度接种8个孔，置37℃，5％CO2条件下培养7天判定结果。
4.2生长曲线测定
在Vero细胞上传至第4代的MVS191和重组病毒用含2％NBS的MEM适当稀释病毒液，按MOI＝0.03接种T225瓶的Vero细胞，吸附接种，33℃吸附0.5h后补加含2％NBS的MEM，使T225瓶的终体积为40mL，33℃条件下培养。在感染后0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d分别取T225瓶内的培养液上清0.5mL。用终点稀释法检测感染性滴度。以时间为横坐标，滴度为纵坐标，绘制病毒生长曲线。结果显示：MVS191-S在Vero细胞上培养至第6天时滴度最高，可达6.5TCID50/mL。
实施例2、大规模生产重组新型冠状病毒疫苗
1、重组病毒疫苗生产的上游工艺
1.1细胞培养工艺
取Vero工作库细胞在37℃水浴复苏后，以型号为633A的Vero SFM细胞培养基作为生长培养基，经T75、T225、2层细胞工厂、10层细胞工厂逐级放大培养，培养方式为贴壁培养。在细胞培养过程中，培养温度为37℃，溶氧为≥60％，pH为7.2±0.1，细胞传代密度为3～5×104cell/cm2，传代比例为1:4～1:8。
然后取6个长满单层细胞的10层细胞工厂，将Vero细胞全部消化后转移至14L固定床式生物反应器中继续培养，培养基体积为10L，以天信和cellcomb片式载体作为细胞微载体，载体表面积2138cm2/g，载体加量100g。培养过程中采用的培养基是型号为633A的VeroSFM细胞培养基(购自天信和(苏州)生物科技有限公司)，培养温度为37℃，溶氧为≥60％，pH为7.2±0.1。
上述型号为633A的Vero SFM细胞培养基商品名为“ Vero CD”，购自天信和(苏州)生物科技有限公司，网页链接为：http://www.txhbio.com/product/45.html。
2.2病毒培养工艺
Vero细胞在14L固定床式生物反应器中培养3～5天后，细胞长至2～5×105cell/cm2，将培养基更换为型号为304的199细胞培养基(购自天信和(苏州)生物科技有限公司)，将实施例1制得的重组病毒按照感染复数(MOI)为0.001～0.1接种到Vero细胞，控制培养温度为33℃，溶氧为≥60％，pH为7.4±0.1，7天后收获培养上清，得到病毒收获液。
上述型号为304的199细胞培养基购自天信和(苏州)生物科技有限公司网页链接为：http://2103155057.pool8-site.make.yun300.cn/product/42.html。
2、重组病毒疫苗生产的下游纯化工艺
2.1粗滤
将病毒收获液用3μm深层滤器过滤，收集滤过液，以去除大部分的细胞碎片。
2.2酶切
将粗滤后的病毒收获液定量后，加入终浓度为20U/ml的核酸酶和终浓度为终浓度为的MgCl2，室温放置3h后，转入2-8℃环境放置3～5天。
2.3超滤/洗滤
将酶切后的病毒收获液用300kD超滤膜包超滤，浓缩3～10倍后用5％蔗糖溶液洗滤，浓缩10～20倍后收获。
超滤和洗滤时控制参数如下：液体流速为3～10L/h，进液端压力≤0.1Bar，回流端压力≤0.1Bar，跨膜压差(TMP)≤0.1Bar，温度为室温。
2.4终滤
将超滤/洗滤后的病毒收获液用1.2μm深层滤器过滤，收集滤过液。
3、配制
在终滤后的病毒收获液中加入保护剂(主要成分为5％蔗糖)，得到重组新型冠状病毒疫苗。规格：0.5ml/剂。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、重组新型冠状病毒疫苗的质量指标检测
1.单次病毒收获液滴度检测
按照中国药典2020版要求进行病毒滴度检测，检测结果符合药典要求，连续3批病毒收获液滴度不低于4.5lgCCID50/ml。
表2.连续3批14L生物反应器规模培养的重组病毒滴度检测结果
批次 滴度(lgCCID50/ml)
第一批 6.38
第二批 6.57
第三批 6.29
2.Vero细胞DNA残留量结果
按照中国药典2020版通则3407进行检测，检测结果符合药典要求，连续3批检测结果均不高于3ng/剂。
表3.连续3批14L生物反应器规模培养的Vero细胞DNA残留量检测结果
批号 DNA(ng/剂)
第一批 1.64
第二批 1.88
第三批 1.33
3.Vero细胞宿主蛋白(HCP)检测结果
按照中国药典2020版通则3429进行检测，检测结果符合药典要求，连续3批检测结果均不高于6ug/剂。
表4.连续3批14L生物反应器规模培养的Vero细胞宿主蛋白检测结果
批号 HCP(ug/剂)
第一批 0.65
第二批 0.69
第三批 0.54
上述实验结果表明，利用本发明的大规模生产工艺制得了批次间质量稳定的高质量重组新型冠状病毒疫苗，其病毒收获液滴度高达6.29-6.57lgCCID50/ml，Vero细胞DNA残留量低至1.33-1.88ng/剂，Vero细胞宿主蛋白残留低至0.54-0.69ug/剂。
实验例2、重组新型冠状病毒疫苗的免疫检测
1、实验方法
6-12周龄金黄地鼠，0天初免、21天加强免疫。选择表达量高的候选毒种MVS191-S，接种剂量约5×105TCID50/mL。0，21，27，35、49天心脏采血，每次采全血1ml分离血清，检测抗麻疹病毒抗体，抗新冠S抗体和假病毒中和抗体。免疫期间及免疫后观察进食情况，第49天采血后处死动物。
表5.地鼠免疫组别及免疫途径
2、实验结果
2.1新冠S抗体IgG检测
采用义翘神州公司生产的货号KIT003试剂盒检测。图6结果显示：地鼠腹腔注射和鼻内滴加MVS191-S第27天产生最高的血清IgG抗体，随后持续降低直到在D49与D55稳定在血清IgG抗体滴度1:5000以上。两种方式免疫地鼠，MVS191-S表现出良好的免疫原性，可诱导地鼠产生高水平的血清抗新冠S蛋白的IgG抗体。
表6.地鼠不同采血点新冠S抗体IgG检测效价EC50值
2.2假病毒中和抗体检测
血清稀释：取待检血清18μL+72μL完全培养基，混匀，为1:5倍稀释样品。依次3倍倍比稀释，共7个稀释梯度。
病毒稀释：取滴度6.36×107Tu/mL假病毒COVID-19-Luc原液100μL+2.444mL稀释液混匀，滴度为2.5×106Tu/mL，每个实验孔加入40μL，最终滴度为1×105Tu/孔。室温孵育1h。
病毒对照孔：不加待检血清，仅加入40μL稀释病毒与60μL完全培养液。
空白对照孔：不加待检血清以及病毒，仅加入100μL完全培养液。
室温孵育结束，将3×105个/mL ACE2-293T细胞以50μL/孔加入到实验孔，细胞加入量为1.5×104个/孔，轻轻拍打混匀。细胞板放置37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育72-90h。将96孔板放到室温，每个孔加入100μL One-Glo试剂，避光静置10min以裂解细胞，上机One-Glo Luciferase Assay检测。酶标仪读数。数据RLU值采用GraphPad Prism5.0进行曲线拟合、EC50计算。
地鼠第27天血清假病毒中和抗体检测结果显示：腹腔免疫或者滴鼻免疫MVS191-S，血清抗体假病毒中和活性高于康复者血清的中和活性。地鼠与康复者血清中和抗体滴度比例最高可达6:1，最低的中和抗体滴度与康复者血清滴度水平相当。
综上，本发明提供了一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺。该生产工艺中Vero细胞培养使用无血清培养工艺，省去了洗换去血清步骤，操作更简便。另外，本发明的重组病毒是携带SARS-CoV-2病毒的S基因的麻疹病毒，这种重组病毒生物安全级别低，仅为BSL-1级，无需P3生物安全级别工厂，生产条件容易实现，成本降低。该生产工艺安全、稳定、可控，批次间质量均一，利用该生产工艺制得的重组新型冠状病毒疫苗不仅效价高，而且Vero细胞DNA和Vero细胞宿主蛋白残留量低：病毒收获液滴度高达6.29-6.57lgCCID50/ml，Vero细胞DNA残留量低至1.33-1.88ng/剂，Vero细胞宿主蛋白残留低至0.54-0.69ug/剂。本发明的生产工艺能够大规模生产高质量的重组新型冠状病毒疫苗，应用前景广阔。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都生物制品研究所有限责任公司
<120> 一种以麻疹病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺
<130> GY014-2021P0114128CC
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3834
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtacgatgt tcgtttttct ggtgctgctg cctctggtgt ctagccagtg cgtgaacctg 60
acaaccagaa cccagctgcc tccagcgtac accaattcct ttaccagagg cgtgtattac 120
cccgacaagg tgttcagaag ttccgtgctg cacagcacac aggatctctt cctgcccttc 180
ttctccaacg tgacctggtt ccacgccatc cacgtgagcg gcacaaacgg cacaaaaaga 240
ttcgacaacc ccgtcctgcc gttcaacgac ggcgtatact ttgccagcac agaaaagtct 300
aatatcatcc ggggctggat cttcggcaca accttggact ctaaaaccca gagcctgctg 360
atcgtgaaca acgccaccaa cgttgtgatc aaagtgtgtg agttccagtt ctgcaacgac 420
cccttcctgg gagtgtacta ccacaagaac aacaaaagct ggatggaaag cgagttccga 480
gtgtactcta gcgccaacaa ctgcacgttc gagtacgtgt cccagccctt cctgatggac 540
ctggaaggca agcagggaaa cttcaagaac ctgagagagt tcgtgttcaa aaatatcgac 600
ggctacttca agatctactc taagcacacc cccatcaacc tggtgcggga tctgcctcaa 660
ggcttcagcg ccctggaacc tctggtcgac ctgcctatcg gcatcaacat cacccggttt 720
cagaccctgc tggccctgca tagaagttac ctgactcctg gcgactcctc ttctggctgg 780
accgccggag ctgcagctta ctacgtgggc tacctgcagc ctagaacatt cctgctgaag 840
tacaacgaga acggaacaat cacagatgcc gtggattgcg ccctggatcc tctgagcgaa 900
accaagtgca ccctgaagag cttcaccgtg gaaaagggca tctaccaaac cagcaatttt 960
agagtccagc cgaccgagag catcgtgcgg ttccctaaca tcacaaacct gtgtcctttc 1020
ggcgaggtgt tcaacgccac cagattcgcc tctgtctatg cctggaacag aaagcggatc 1080
tccaactgcg tggccgacta cagcgttctg tataacagcg ctagcttttc cacattcaag 1140
tgctacggag ttagccccac caagctgaat gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgat 1200
agcttcgtga tcaggggcga cgaggtccga cagatcgccc ccggccagac cggcaagatc 1260
gccgactata actacaagct gcctgatgat tttaccggct gcgtgattgc ctggaacagc 1320
aacaacctag attctaaggt aggtggaaat tacaactacc tgtaccggct cttccggaag 1380
agcaatctga agcctttcga gagagacatc agcaccgaaa tctaccaggc cggcagcaca 1440
ccttgtaacg gcgtcgaggg cttcaattgt tacttccctc tgcagagcta cggcttccag 1500
cctacaaacg gtgttggcta tcagccatac cgggtggtgg tgctgagctt cgagctgctc 1560
cacgcccctg ctacagtgtg cggacctaag aaatctacta acctggttaa gaacaagtgt 1620
gtgaacttca acttcaacgg actgacaggc accggcgtgc tgaccgagag caacaagaag 1680
ttcctgcctt tccagcagtt tggcagagat atcgccgaca ccacagacgc tgtgcgggac 1740
ccccagacac tggaaatcct ggacatcaca ccttgcagtt tcggcggagt aagcgtgata 1800
acgcctggca ccaacacctc caaccaggtg gccgtgctgt accaggacgt gaactgcacc 1860
gaggtgcccg tggcaatcca cgccgatcag ctgaccccta catggcgggt gtactctaca 1920
ggctccaatg tgttccaaac cagagccgga tgcctgatcg gagccgagca cgtgaacaat 1980
tcctacgagt gtgatatccc cattggggcc ggcatctgcg cctcttacca gacccagacc 2040
aatagccctc gtagagccag aagcgtggcc agccagagca ttatcgccta caccatgagc 2100
ctgggtgctg aaaactccgt cgcctacagc aacaactcca tcgccatccc cacaaacttc 2160
accatctccg tgacgaccga aatcctgcct gtcagcatga ccaagacaag cgtggactgc 2220
accatgtata tctgcggcga ctccaccgag tgcagcaacc tgctgcttca atacggctcc 2280
ttctgcacac agctcaatag agccctgact ggcatcgccg tggaacagga caagaatacc 2340
caggaggtgt tcgctcaagt gaagcagatc tataagaccc ctcctatcaa ggacttcgga 2400
ggcttcaatt tcagccagat cctgcctgat cctagcaagc ccagcaaaag atctttcatc 2460
gaggacctgc tgttcaataa ggtgaccctc gccgatgccg gcttcatcaa gcagtacggc 2520
gattgcctgg gggacatcgc cgctagagat ctgatatgcg ctcagaagtt caacggactg 2580
accgtgctgc ctcctctgct gacagacgag atgatcgctc agtatacctc cgcccttctt 2640
gccggcacta tcacaagcgg ctggacattc ggagctggcg ctgctctgca gatccctttc 2700
gccatgcaga tggcctacag atttaacgga attggcgtga cccaaaacgt gctctatgaa 2760
aaccaaaaac ttatcgctaa tcagttcaac agcgccatag gcaaaatcca ggacagcctg 2820
tccagcactg ccagcgctct gggcaaactg caagacgtgg tgaatcagaa tgcccaagcc 2880
ctgaacaccc tggtgaagca actgtctagc aatttcggcg ctatctctag cgtgctgaac 2940
gatatcctga gtagactgga taaggtggaa gccgaagtgc agatcgacag actgatcacc 3000
ggtcgcctgc agagcctgca gacctacgtg acgcaacagc tgatcagagc cgccgagatc 3060
cgggcctctg ccaacctggc cgctaccaag atgtctgaat gtgtactcgg ccagtccaag 3120
cgggtggatt tctgtggcaa gggctaccac ctgatgagct ttcctcagtc tgctcctcac 3180
ggcgtggtgt tcctgcacgt gacatacgtg cctgcccaag agaagaattt caccacagct 3240
cctgctatct gccacgacgg aaaggcccac ttccccagag agggcgtgtt cgtgagcaac 3300
ggcacacact ggttcgtgac ccagagaaac ttctacgagc cccagatcat aacaaccgat 3360
aacaccttcg tgtctgggaa ctgcgacgtg gtcatcggaa ttgtgaacaa cacagtgtac 3420
gaccccctgc agcctgagct ggactcattc aaggaagagc tggacaagta cttcaagaac 3480
cacaccagcc cagacgtgga cctgggcgac atcagcggca tcaacgcctc agtggtgaac 3540
atccagaaag aaatcgacag actgaatgag gtggccaaga acctgaacga gagcctgatc 3600
gacctgcaag agctggggaa atacgagcag tacattaagt ggccttggta catctggctg 3660
ggatttattg ctggcctgat cgctatcgtg atggtgacga tcatgctgtg ctgcatgacc 3720
tcctgctgca gctgtctgaa gggatgttgc agctgcggca gctgctgcaa gtttgatgag 3780
gacgacagcg agcccgtgct caagggagtg aagctgcatt acacctgagc gcgc 3834
<210> 2
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgacccaa ctagcctacc ctccatcatt gttataaaaa acttaggaac caggtccaca 60
cagccgccag cccatcaacg cgtacgatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccactc 120
tcggcatgga cgagctgtac aagtaggcgc gcagcgctta gacgtctcgc gactagt 177
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctagctagt tggcgcgcca atccccgcgg ggatcccccc ggggggacct taattaaggc 60
cggaattccg gcggggtacc ccggcgctgt acagcgcata agaatgcggc cgc 113
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgacccaact agcctaccc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aacttgggag gcaatcactt 20
<210> 10
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
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305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
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690 695 700
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740 745 750
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820 825 830
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835 840 845
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1265 1270
<210> 11
<211> 1234
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
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1 5 10 15
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20 25 30
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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595 600 605
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Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
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675 680 685
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725 730 735
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755 760 765
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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850 855 860
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865 870 875 880
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915 920 925
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930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
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980 985 990
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Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
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1055 1060 1065
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1100 1105 1110
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1130 1135 1140
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu
<210> 12
<211> 1234
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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115 120 125
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275 280 285
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1130 1135 1140
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1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu

Claims (7)

1.一种重组新型冠状病毒疫苗的大规模生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：
（1）细胞培养：在装载有细胞微载体的生物反应器内加入无血清细胞生长液，培养Vero细胞至密度为2~5×105cell/cm2；所述生物反应器为固定床式生物反应器；
（2）病毒接种和培养：将重组病毒按0.001~0. 1 MOI接种到Vero细胞，用无血清病毒维持液培养7天，收获培养上清，得病毒收获液；
其中，重组病毒是携带SARS-CoV-2病毒的S基因的麻疹病毒，S基因的序列如SEQ IDNO.1所示；
（3）粗滤：将病毒收获液用深层滤器过滤，收集滤过液；所述深层滤器的孔径为2.5~3.5μm；
（4）酶切：在滤过液中加入核酸酶进行酶切，得到酶切后的病毒收获液；所述核酸酶的终浓度为15~25U/ml；
（5）超滤和洗滤：将酶切后的病毒收获液进行超滤和洗滤，得到浓缩后的病毒收获液；所述超滤时采用的超滤膜包分子量为250~350kD，浓缩倍数为3~10倍，液体流速为3~10L/h，进液端压力为≤0.1Bar，回流端压力≤0.1Bar，跨膜压差≤0.1Bar，温度为室温；洗滤时采用的清洗液体为5%蔗糖溶液，浓缩倍数为10~20倍，液体流速为3~10L/h，进液端压力≤0.1Bar，回流端压力≤0.1Bar，跨膜压差≤0.1Bar，温度为室温；
（6）终滤：将浓缩后的病毒收获液用深层滤器过滤，收集滤过液；所述深层滤器的孔径为1.0~1.5μm。
2.根据权利要求1所述的大规模生产工艺，其特征在于：步骤（1）中，所述重组病毒表达序列如SEQ ID NO.12所示的S蛋白。
3.根据权利要求1所述的大规模生产工艺，其特征在于：步骤（1）中，所述细胞微载体为片式载体。
4.根据权利要求1所述的大规模生产工艺，其特征在于：步骤（1）中，所述无血清细胞生长液是Vero SFM细胞培养基；
所述培养的温度为37℃，溶氧为≥60%，pH为7.2±0.1；
所述密度为2~5×105cell/cm2。
5.根据权利要求1所述的大规模生产工艺，其特征在于：步骤（2）中，所述无血清病毒维持液是199细胞培养基；
所述培养的温度为33℃，溶氧为≥60%，pH为7.4±0.1。
6.根据权利要求1所述的大规模生产工艺，其特征在于：步骤（3）中，所述深层滤器的孔径为3μm；
步骤（4）中，所述核酸酶的终浓度为20U/ml；
步骤（5）中，超滤时采用的超滤膜包分子量为300kD；
步骤（6）中，所述深层滤器的孔径为1.2μm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的大规模生产工艺，其特征在于：还包括以下步骤：
（7）在步骤（6）所得滤过液中加入保护剂，得到重组新型冠状病毒疫苗。
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