CN106636015B - 一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于禽病预防疫苗制备技术领域，具体涉及一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法的专利申请。该方法包括制备新城疫病毒样颗粒、制备GM‑CSF‑GPI锚定蛋白、嵌合型新城疫病毒样颗粒组装等步骤。利用本发明所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒，其基于蛋白水平的修饰策略，可避免基因水平转染不稳定的缺陷，并且嵌合的蛋白可被准确定量；同时，该嵌合型新城疫病毒样颗粒可作为新型灭活疫苗应用，在免疫鸡后可诱导机体产生特异性免疫反应，有效提高免疫应答，因而具有广阔的应用前景。

Description

一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法
技术领域
本发明属于禽病预防疫苗制备技术领域，具体涉及一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法的专利申请。
背景技术
新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，被OIE列为必报动物疫病，也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在病毒学分类中属于副黏病毒科、禽副黏病毒属的一个种，即禽副黏病毒1型，是一种不分节段的单分子负链RNA病毒。新城疫病毒基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphor protein，P）、基质蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L）。新城疫病毒颗粒为有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直径约为120nm~300nm，囊膜表面覆盖有8nm长的纤突，病毒粒子内部为一直径17nm左右的卷曲核衣壳。基质蛋白M位于囊膜和核衣壳之间，既与膜结合又与核衣壳结合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驱动力。
鸡新城疫自1946年在我国首次报道至今，已在中国存在60多年，表现出一定新的临床及流行特点。流行病学数据充分证明基因VII型已经成为我国NDV流行的主要优势基因型，但也存在基因III、IX和VI型等散发，基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升趋势。与此同时，NDV经过世界范围内四次大流行后，其宿主范围也不断扩大，迄今能自然或人工感染的禽类已超过250多种。过去认为，NDV一般不对鸭、鹅等水禽有致病性，而近十几年，在鸭群、鹅群中常见新城疫的暴发与流行。大量流行病学调查数据显示，当前我国NDV的优势流行株属于基因VII型，而目前国内普遍使用的疫苗LaSota为基因II型，虽然它们同属一个血清型，但在遗传距离上相差较远，对当前NDV强株的攻击并不能提供理想的免疫保护效力。目前常用的生产活疫苗的毒株有Mukteswar株（I系苗）、Hitchner B1株（II系苗）、F株（III系苗）、LaSota株（IV系苗）以及V4弱毒苗。其中I系苗为中等毒力型，II、III、IV系疫苗毒力较弱。弱毒苗可大规模饮水、喷雾和气雾免疫，能刺激黏膜免疫，而且疫苗毒可以从免疫禽传播给未免疫禽。其不足之处在于污染环境，并且有毒力返强可能，在机体抵抗力下降时，可能引起发病。生产灭活苗的毒种一般包括LaSota、Ulster等，实际生产中多用来制造二联或多联疫苗。灭活苗产生抗体水平较高，持续时间较长，比较容易储存，受母源抗体影响小，免疫不良反应小；但灭活苗的灭活、乳化及免疫时需要较大剂量，所以成本较高。鉴于新城疫的流行对我国整个养禽业造成了巨大的经济损失，加紧研制有效疫苗十分有必要。
病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，在形态上与天然病毒颗粒相似，能够通过与病毒感染一样的途径，以接近真实构象的形式递呈给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应。
病毒样颗粒的制备可基于大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及昆虫杆状病毒这四种表达系统，而利用昆虫杆状病毒表达系统制备的病毒样颗粒种类已占到了30%以上，其主要原因是该系统具有不同于其他表达系统的独特优点：（1）承载量大，杆状病毒可容纳较大的外源DNA插入(约l0kb)而不影响病毒的复制与装配；(2)高效表达，多角体基因和p10基因有非常强大的启动子能驱动靶基因的高水平表达，外源基因表达量往往是其他系统的几十到几百倍；(3)表达产物后加工较完善，昆虫细胞对蛋白质的后加工系统与哺乳动物细胞接近，具有表达产物能糖基化、磷酸化、脂肪酞化、酞胺化、切割信号肤和形成三级或四级高级结构的特点，所以在结构、生物活性、抗原性和免疫性等方面与天然蛋白有很高的相似性；(4)借助多元表达载体或借助几个不同重组病毒的共感染，可以同时表达两个或多个外源蛋白，便于研究肽链的装配和蛋白寡聚体的结构和功能；(5)适合表达细胞毒性蛋白，应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使表达产物是细胞毒性蛋白，也不影响表达水平，因为在这些有毒产物表达之前，病毒已经完成复制并释放出大量成熟的子代毒粒，不会干扰病毒的复制；(6)安全性好，杆状病毒是昆虫或者节肢动物病毒，对人畜无害，外源基因插入多角体蛋白基因位点引起其缺失或失活，因此重组病毒不能产生包涵体，这不仅为重组病毒提供了选择标记，而且重组病毒无多角体蛋白形成，失去了病毒粒子的天然护物一多角体蛋白结晶体，极易在自然环境中失活，不能像野生病毒那样在环境中长期存在，在自然界生存能力弱，所以更加安全；(7)杆状病毒表达载体通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。因此，用该系统生产病毒样颗粒容易形成产业化。
嵌合病毒样颗粒(chimeric VLPs，cVLPs)是一种改良型VLP，通过基因融合表达或以VLP为载体通过化学偶联或基因融合的方法将外源抗原与其偶联制备而成。嵌合型病毒样颗粒在同一细胞中复合基因的共转染及协同表达在许多方面还困难重重，cVLPs的组装程度较低，同时还需要特定的结构蛋白，因此缺点十分明显。
GPI锚定蛋白是一种新型真核细胞表面蛋白，它只通过GPI结构锚定于真核细胞膜表面而不跨越其磷脂膜双层结构。与传统跨膜型细胞表面蛋白不同，它只通过其梭基末端的GPI结构锚定于细胞膜表面，并不跨越其磷脂膜双层结构。GPI锚定蛋白转染法是指将目的蛋白编码序列和GPI锚定信号肽编码序列重组，制备该目的蛋白的GPI重组衍生物，当它在适宜的温度下与靶细胞共同孵育时，可自动整合至真核细胞膜表面并表达活性。其优点在于: ① 许多原始细胞，无论正常细胞或肿瘤细胞均不易在体外长期生长，且难以稳定转染(病毒性载体除外)，而蛋白转化法则不依赖于细胞自身增殖潜能及可转染性，可以锚定于难于转染的细胞，故可用于原代细胞的转化，与细胞类型无关。② 在同一细胞中复合基因的共转染及协同表达在许多方面还困难重重，而蛋白转化原则上可允许无限数量的蛋白同时或顺序地传递至同一细胞，表达于细胞表面的蛋白含量可精确控制。③ 与基因转化不同，蛋白转化是另一个非常迅速的过程，可以减少细胞的培养时间而迅速改变细胞表面性状，尤其适用于临床治疗。④G P I 锚定蛋白可在磷脂酶C的作用下由细胞表面分离，当它被非离子型去污剂由细胞表面洗脱后，可在一定条件下重新整合至细胞表面并恢复其功能，从而克服了传统基因转化法的不足。⑤不同种GPI锚定蛋白可以相继或同时锚定于同一种细胞膜。
现有技术中，尚未见到较好的利用GPI锚定蛋白策略来构建新城疫病毒样颗粒的有关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用新的制备策略所提供的一种嵌合型新城疫病毒样颗粒制备方法，利用该方法制备的新城疫病毒样颗粒可为相关新型新城疫疫苗的开发奠定良好基础。
本发明所采取的技术方案详述如下。
一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备新城疫病毒样颗粒，具体为：
将新城疫病毒基质基因（基质蛋白M对应M基因）和血凝素-神经氨酸酶基因（HN基因）分别克隆至T载体中，分别构建重组克隆质粒pT-M和pT-HN；
对pT-M和pFastBac Dual质粒分别进行SalI-NotI双酶切，将酶切产物进行连接构建重组质粒pFastBac-M；
再将质粒pFastBac-M和pT-HN分别进行NheI-KpnI双酶切，将酶切产物进行连接，最终构建穿梭质粒pFastBac-M+HN；
将所构建的穿梭质粒pFastBac-M+HN转化DH10 Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rBacmid-M+HN；
将重组杆粒rBacmid-M+HN转染昆虫Sf 9细胞后得到重组杆状病毒rBV-M+HN，经培养并纯化处理后，得到新城疫病毒样颗粒；
所述培养并纯化处理，具体为，将重组杆状病毒rBV-M+HN以MOI=5的条件感染昆虫Sf9细胞，感染5天后，收集细胞培养上清；
经8000r/min离心30分钟后，可初步去除大的细胞碎片；
对所收集的细胞培养上清采用蔗糖密度梯度进行纯化，采用不连续20%-40%-60%蔗糖密度梯度离心，浓缩样品在20%和40%蔗糖层的中间会形成白色条带，而杆状病毒则沉淀于底部，其他小的杂蛋白会停留在顶层，收集白色条带层，最后收集所获得的即为新城疫病毒样颗粒；
所述新城疫病毒基质基因，具体例如为由新城疫病毒株Newcastle diseasevirus NA-1 strain（GenBank：DQ659677）中所提取的病毒基质基因；其中基质基因和血凝素-神经氨酸酶基因为新城疫病毒基因组上固定的结构基因，基质蛋白M为形成新城疫病毒样颗粒的必须蛋白，血凝素-神经氨酸酶HN为新城疫病毒主要毒力蛋白，也是重要的保护性抗原；
（2）制备GM-CSF-GPI锚定蛋白，具体为：
人工合成融合序列（该序列包含依次连接的蜂素信号肽序列、His标签序列、GM-CSF全长序列、TEV切割序列以及GPI信号肽序列，具体如SEQ ID NO.1所示）；
将该融合序列与pFastBac1 在T4 DNA连接酶的作用下进行连接；
将连接产物转化至Escherichia coli DH5α中，用含有特定抗生素的（氨苄青霉素终浓度100μg/mL，庆大霉素终浓度100μg/mL）选择培养基筛选阳性菌落并提取质粒，构建穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI；
将穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI转化至DH10 Bac感受态细胞中，使其进行同源重组，经含有三抗（卡那霉素终浓度100μg/mL、庆大霉素终浓度50μg/mL、四环素终浓度70μg/mL）的IPTG条件筛选培养基（IPTG终浓度24mg/mL，X-gal终浓度20mg/mL，该筛选培养基可通过菌落形成颜色判定是否发生同源重组，白色菌落即代表重组成功，蓝色菌落则未成功）筛选培养基培养48h，挑取白斑，筛选获得重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI；
将重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI转染（例如利用Roche公司的X-tremeGENE HPDNA transfection Reagent进行转染）昆虫Sf9细胞，得到重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI，经培育并纯化处理后，得到GM-CSF-GPI锚定蛋白；
所述培育并纯化处理，具体为：
将重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI以MOI=1的条件感染昆虫Sf9细胞，感染3天后，收集培养悬液，8000转离心30分钟，弃上清液，收集细胞沉淀，用PBS（磷酸盐缓冲液）重悬细胞后，采用超声破碎的方式裂解细胞，此时再以8000转离心30分钟的条件处理，收集上清液进行后续；
对所收集的上清液，采用镍柱（特异性结合His标签）亲和层析技术将含有His标签蛋白纯化收集，再经TEV蛋白酶处理，最后收集的产物即为GM-CSF-GPI锚定蛋白，此时将该蛋白浓度控制在1-5mg/ml，保存于-20℃；
（3）制备嵌合型新城疫病毒样颗粒，具体为：
将步骤（1）中制备所得新城疫病毒样颗粒和步骤（2）制备所得GM-CSF-GPI锚定蛋白，混合均匀后进行孵育，37℃孵育1~3小时，孵育的具体时间根据蛋白浓度所决定，例如：GM-CSF-GPI锚定蛋白浓度为1mg/ml时孵育3小时，GM-CSF-GPI锚定蛋白浓度为5mg/ml时孵育1小时，随后将孵育的样品经4℃、100000×g超速离心6小时，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。
利用嵌合型新城疫病毒样颗粒制备方法所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒。
嵌合型新城疫病毒样颗粒在新城疫疫苗制备中的应用。
本发明的总体设计思路为：
首先，将新城疫病毒基质蛋白和血凝素-神经氨酸酶基因序列克隆、重组至昆虫杆状病毒基因组中，得到能够表达这两种结构蛋白的重组杆状病毒，重组杆状病毒高效表达蛋白并形成完整的病毒样颗粒，收集细胞培养上清经纯化后获得大量新城疫病毒样颗粒；
其次，将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）序列与糖基化磷脂酰肌醇（GPI）序列进行融合拼接，并将融合序列重组至昆虫杆状病毒基因组中，经表达纯化后获得GM-CSF-GPI蛋白；
最后，将GM-CSF-GPI蛋白与制备的新城疫病毒样颗粒在37℃下孵育后，获得嵌合型新城疫病毒样颗粒。
总体而言，本发明的主要技术优势体现在如下几个方面：
（1）具有较好的安全性和免疫原性，本发明通过较为成熟的昆虫杆状病毒表达系统所制备的新城疫病毒样颗粒，可形成与真实病毒相类似的结构，其不含有核酸等遗传物质，保留了病毒原有的保护性抗原，因此具有良好的安全性和免疫原性；
（2）制备了新的GM-CSF-GPI蛋白，所制备的GM-CSF-GPI蛋白可通过GPI锚羧基末端的磷酸基团与膜中的磷脂相连，以共价键形式结合于细胞膜表面，而不跨越其磷脂双层结构，最终达到嵌合至新城疫病毒样颗粒表面的目的；同时，所制备的GM-CSF-GPI蛋白，一定程度上提高了新城疫病毒样颗粒的免疫原性；
（3）蛋白嵌合稳定且嵌合蛋白可被定量，本发明中制备嵌合病毒样颗粒时，是将新城疫病毒样颗粒和GM-CSF-GPI蛋白在适宜温度条件下孵育方式的嵌合，这种嵌合方式充分考虑了GM-CSF-GPI蛋白的特殊性，避免了基因水平转染不稳定的问题，而且嵌合的蛋白可被准确定量；
（4）可作为新型灭活疫苗应用，利用本发明所提供的嵌合型新城疫病毒样颗粒制备方法所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒，可作为新型灭活疫苗应用，在免疫鸡后可诱导机体产生特异性免疫反应。
需要解释的是，新城疫病毒样颗粒其表面为真核细胞膜，具有真核细胞膜多特征的磷脂双分子层，因此可以被GPI锚定蛋白所嵌合。本申请的主要目的之一在于改良新城疫病毒样颗粒的组装策略，并且提高其装载外源蛋白的能力以及对外源蛋白进行准确定量。
总之，利用本发明所提供的嵌合型新城疫病毒样颗粒制备方法所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒，其基于蛋白水平的修饰策略，可避免基因水平转染不稳定的缺陷，并且嵌合的蛋白可被准确定量；同时该嵌合型新城疫病毒样颗粒可有效提高免疫应答，因而具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组杆状病毒rBV-M+HN的构建图谱；
图2为重组杆状病毒rBV-M+HN的PCR验证电泳图；其中泳道1为Trans2K DNA分子量标准，泳道2为M基因引物的PCR结果（1100bp），泳道3为HN基因引物的PCR结果（1700bp）；
图3为新城疫病毒样颗粒的透射电镜图；
图4为人工合成的融合序列的酶切鉴定电泳图；其中泳道1为DL 10000 ladderDNA分子量标准，泳道2为GM-CSF-GPI经EcoRI和HindIII酶切的电泳结果（662bp）；
图5为重组穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI的构建图谱；
图6为不同孵育时间对GM-CSF-GPI蛋白的鉴定图；其中泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为孵育1小时的结果，泳道3为孵育2小时的结果，泳道4为孵育3小时的结果；
图7为嵌合型新城疫病毒样颗粒的透射电镜图；
图8为免疫鸡血清抗体HI效价消长规律检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，对下述实施例中所涉及部分实验原理、实验设备情况简要介绍说明如下。
生物材料：
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍说明如下。
生物材料：
pFastBac1质粒、sf9昆虫细胞、DH10Bac感受肽细胞、DH5α感受态细胞等均为Thermo公司产品；
T载体，购自大连宝生物有限公司；
实验试剂：
Taq聚合酶，购自北京全式金公司；
脂质体转染试剂，为Roche公司产品；
质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒，购自康宁公司；
昆虫无血清培养基SFM-II，为Thermo公司产品；
实验设备：
实验过程中所用超纯水由超纯水发生装置（Christ Spetron Line）制备；
低温台式高速离心机，美国ICE公司产品；
PCR仪，Thermo Fisher Scientific公司产品；
紫外凝胶成像仪，Alpha Innotech Corporation公司产品；
蛋白纯化用柱子，美国GE公司产品。
还需说明的是，文本简要期间，下述实施例中未具体描述操作，参考现有技术及相关产品说明书进行操作即可，不再赘述。
实施例1
本实施例仅就新城疫病毒样颗粒的制备过程简要介绍如下。
（1）构建穿梭质粒pFastBac-M+HN
第一，提取新城疫病毒株NA-A1的基因组RNA，反转录为cDNA；
第二，设计引物，并以第一步中所制备的cDNA为模板进行PCR扩增获得基质基因M基因序列和血凝素-神经氨酸酶基因HN基因序列，引物序列具体为：
M上游引物5’-ATGGACTCATCTAGGACTATTGGACT-3’，
M下游引物：5’-TTATTTACGGAAGGGGTTGTATTTAGC-3’；
HN上游引物：5’-ATGGACCGCGCCGTGAA-3’，
HN下游引物：5’-TTACACTCTATCGTCCTTCAGAATCT-3’；
第三，将克隆获得的病毒基质基因M基因序列和血凝素-神经氨酸酶基因HN基因序列分别克隆至T载体中，测序验证，获得构建正确的重组克隆质粒pT-M和pT-HN；
第四，先对pT-M和pFastBac Dual质粒分别进行SalI-NotI双酶切，然后对酶切产物进行检测鉴定，并分别回收酶切产物；对所回收酶切产物采用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落并提取质粒备用，所提取质粒命名为pFastBac-M；
第五，将pFastBac-M和pT-HN进行NheI-KpnI双酶切，然后对酶切产物进行检测鉴定，并分别回收酶切产物；对所回收酶切产物采用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落并提取质粒检测鉴定，最终所制备质粒命名为pFastBac-M+HN。
整个过程是依次将基质基因M基因序列和血凝素-神经氨酸酶基因HN基因重组至pFastBacDual载体中，最终构建获得穿梭质粒pFastBac-M+HN。
（2）构建重组杆粒rBacmid-M+HN
将将步骤（1）中构建所得穿梭质粒pFastBac-M+HN转化Escherichia coli DH10Bac 感受态细胞，并进行抗性筛选，最终构建获得重组杆粒rBacmid-M+HN，具体过程如下：
将步骤（1）中构建所得穿梭质粒pFastBac-M+HN加入Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中，轻轻混匀；
在冰上放置30分钟，接着42℃热浴90秒，然后立即加入无抗性培养基；
30℃培养箱内震荡培养3小时，取100 μL转化液涂布于含有卡那霉素（100μg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）、四环素（70μg/mL）、IPTG（24mg/mL）和X-gal溶液（20mg/mL）的固体培养基上，37℃培养2天，挑取白色单菌落提取杆粒，PCR鉴定获得重组正确的重组杆粒rBacmid-M+HN；PCR鉴定用引物及PCR程序参考步骤（1）中PCR扩增过程即可。
（3）制备重组杆状病毒rBV-M+HN
采用脂质体介导转染法，将步骤（2）中所得重组杆粒rBacmid-M+HN进行转染（利用Roche公司的X-tremeGENE HP DNA transfection Reagent），具体过程如下：
将转染试剂恢复室温，吸取4μL转染试剂与2μL重组杆粒（用无血清Grace稀释至2μg/100μL）轻轻混合，室温孵育30min；
将混合物加入已准备好的昆虫sf9细胞六孔板；
28℃培养96小时，待细胞病变后，收集细胞上清液即为第一代重组杆状病毒rBV-M+HN；
将第一代重组杆状病毒接种昆虫Sf9细胞，同样条件培养下，收集第二代重组杆状病毒；以此类推，收集至第四代重组杆状病毒；
为便于检测分析，可将每一代重组杆状病毒于-80℃保存备用。
所构建的重组杆状病毒rBV-M+HN的图谱结构如图1所示。
对所收集的含有第四代重组杆状病毒的上清液，提取病毒基因组DNA，同时进行PCR检测验证，以确保重组杆状病毒构建正确，PCR检测鉴定时，设计一对通用性引物序列如下：
M13上游引物：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，
M13下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
PCR验证结果如图2所示，对图2分析可以看出，针对M基因的鉴定条带为泳道2，约1100bp；针对HN基因的鉴定条带为泳道3，条带约为1700bp，分子量结果与理论值相符。
（4）制备并纯化获得新城疫病毒样颗粒
将步骤（3）中所收集的第四代重组杆状病毒rBV-M+HN感染悬浮培养的昆虫Sf9细胞，28℃120r/min摇床培养，感染复数为5，感染时间为96小时；
培养过程中，病毒结构蛋白在表达后会自行组装，最终所形成的病毒样颗粒会分泌到细胞培养上清中；
培养结束后，取培养上清，8000r/min离心30分钟，初步去除大的细胞碎片；
然后采用不连续20%-40%-60%蔗糖密度梯度离心，浓缩样品在20%和40%蔗糖层的中间会形成白色条带，而杆状病毒则沉淀于底部，其他小的杂蛋白会停留在顶层，收集白色条带层，即为病毒样颗粒。
对所制备的新城疫病毒样颗粒进行电子透射电镜观察，结果如图3所示，可见病毒粒子具有完整的结构，其表面有明显的囊膜突起，直径大小约为100nm左右。
同时，参照国家标准《GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术》，对所制备的新城疫病毒样颗粒进行血凝效价检测，检测结果显示未纯化的新城疫病毒样颗粒血凝效价为27，纯化后的新城疫病毒样颗粒血凝效价为210，纯化步骤可明显提高样品纯度以及血凝效价浓度。
需要解释的是，上述新城疫病毒样颗粒制备过程中所涉及的新城疫病毒的结构蛋白的编码基因高度保守（因而相关引物序列具有通用性），可采用多种病毒株进行制备，本实施例仅以特定的新城疫病毒株NA-1为例，对相关制备过程进行介绍，不应理解为本发明中新城疫病毒样颗粒制备时必须依赖于特定的病毒株。
实施例2
参考图5所示构建过程示意图，本实施例就GM-CSF-GPI蛋白的制备过程简要介绍如下。
（1）人工合成制备GM-CSF-GPI融合序列
GM-CSF-GPI融合序列如SEQ ID NO.1所示，该序列结构中包括蜂素信号肽序列（用于蛋白的分泌表达）、His标签序列（用于纯化蛋白）、GM-CSF全长序列（主要功能性蛋白）、TEV切割序列（被蛋白酶识别，用于切除His标签序列）以及GPI信号肽序列（用于将功能性蛋白与细胞膜锚定），委托南京金斯瑞公司将人工合成的序列插入pUC57载体上。
对人工合成制备的的融合序列进行EcoRI和HindIII双酶切，酶切产物进行电泳，电泳结果如图4所示，可见泳道有2条明显条带，一条约为660bp为人工合成的GM-CSF-GPI融合序列，另一条为约2700bp的pUC57载体序列，与理论值相符。
（2）构建穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI
将pFastBac1质粒采用EcoRI和HindIII进行双酶切，然后将酶切产物与步骤（1）中融合序列的双酶切产物进行连接，连接时，采用T4 DNA连接酶16℃连接过夜；
次日转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂于含有氨苄霉素和庆大霉素（氨苄青霉素终浓度100μg/mL，庆大霉素终浓度100μg/mL）的固体培养基上，挑取阳性菌落并提取质粒备用；
对所提取质粒进行双酶切鉴定及PCR鉴定，将鉴定正确的穿梭质粒命名为pFastBac-GM-CSF-GPI。
（3）构建重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI
将步骤（2）所得穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI转染Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞，具体过程如下：
将步骤（2）所得穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI加入到Escherichia coli DH10Bac 感受态细胞中，轻轻混匀；
在冰上放置30分钟，接着42℃热浴90秒，然后立即加入无抗性的LB培养基；
在30℃培养箱内震荡培养3小时后，取100μL涂于含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG和X-gal溶液（卡那霉素终浓度100μg/mL、庆大霉素终浓度50μg/mL、四环素终浓度70μg/mL、IPTG终浓度24mg/mL、X-gal终浓度20mg/mL）的固体培养基上，37℃培养2天，挑取白色单菌落提取杆粒，进行PCR鉴定，鉴定正确的命名为重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI；
利用脂质体介导转染法（具体过程参考实施例1即可），将重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI转染昆虫Sf9细胞，28℃培养96小时，待细胞病变后，收集细胞上清液即为第一代重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI；继续将第一代重组杆状病毒接种昆虫Sf9细胞，同样条件培养下，收集第二代重组杆状病毒，以此类推，收集至第四代获得重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI。
（4）GM-CSF-GPI蛋白的表达与纯化
将步骤（3）中所得重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI以MOI=1的条件感染昆虫Sf9细胞，感染3天后，收集培养悬液；
8000转离心30分钟，弃上清液，收集细胞沉淀，用PBS（磷酸盐缓冲液）重悬细胞；
采用超声破碎的方式裂解细胞，再以8000转离心30分钟的条件处理，收集上清液；
对所收集的上清液，采用亲和层析技术将含有His标签蛋白纯化收集（具体步骤为：
将上清液调节至pH8.0并添加终浓度为20mM咪唑，随后预先处理蛋白纯化柱子后，以3滴/10秒的速度使上清液经过蛋白纯化柱子，再将PBS液处理蛋白纯化柱子以去除未吸附的杂蛋白，配制洗脱液（PBS液基础上添加终浓度为300mM咪唑）冲洗蛋白纯化柱子并收集）；
再进行TEV蛋白酶处理，最后收集的产物即为GM-CSF-GPI锚定蛋白，此时将该蛋白浓度控制在1~5mg/ml，保存于-20℃；
实施例3
在实施例1、2基础上，本实施例主要介绍嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备工作。
（1）嵌合型新城疫病毒样颗粒的组装
将实施例1所制备的新城疫病毒样颗粒和实施例2所制备的GM-CSF-GPI蛋白，37℃条件下孵育1~3小时，具体为：
10mg/mL浓度的新城疫病毒样颗粒与1mg/mL浓度的GM-CSF-GPI锚定蛋白分别孵育1小时、2小时、3小时，随后将孵育的样品经4℃、100000×g超速离心6小时，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。
（2）嵌合型新城疫病毒样颗粒的鉴定
采用Western blot法，分别对上述孵育1小时、2小时、3小时的嵌合型新城疫病毒样颗粒进行GM-CSF蛋白的特异性鉴定，过程为：
先将样品进行SDS-PAGE，之后半干转至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉封闭1小时；
PBS洗涤，加入一抗4℃过夜；
PBS洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时；
PBS洗涤，采用BAD溶液进行显色观察。
显色结果如图6所示，图中：泳道2为孵育1小时的嵌合型新城疫病毒样颗粒，泳道3为孵育2小时的嵌合型新城疫病毒样颗粒，泳道4为孵育3小时的嵌合型新城疫病毒样颗粒，其中泳道3和泳道4的条带灰度明显大于泳道2，说明孵育2小时的嵌合型新城疫病毒样颗粒即可达到最大载量。
对所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒颗粒形态的电子透射电镜观察结果如图7所示，可见有完整的病毒粒子结构，形态与未嵌合的新城疫病毒样颗粒（图3）相似，并且嵌合了GM-CSF-GPI蛋白后不影响其病毒粒子的结构。同时，参照国家标准《GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术》，对所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒进行血凝效价检测，检测结果显示未纯化的新城疫病毒样颗粒血凝效价为27，纯化后的新城疫病毒样颗粒血凝效价为210，纯化步骤可明显提高样品纯度以及血凝效价浓度。
实施例4
本实施例主要是对实施例3所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒作为疫苗使用时的免疫效果进行评价，相关实验过程简要介绍如下。
（1）免疫方案
取30只SPF鸡，随机分3组，每组10羽；
新城疫病毒样颗粒组：新城疫病毒样颗粒，每羽注射100μL体积，其中包含有30μg的新城疫病毒样颗粒（根据实施例1结果，30μg新城疫病毒样颗粒的血凝效价为29）；
嵌合新城疫病毒样颗粒组：嵌合新城疫病毒样颗粒，每羽注射100μL体积，其中包含有30μg的新城疫病毒样颗粒（根据实施例3结果，30μg新城疫病毒样颗粒的血凝效价为29）；
阴性对照组：生理盐水，100μL/只；
7日龄首免（胸部肌肉注射），14日龄加强免疫一次。
免疫过程中，鸡自由饮食。
（2）通过血凝抑制试验和血清IgG抗体检测对效价进行评价
从免疫后第一周开始，每隔一周翅下静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。
参照国家标准《GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术》，以新城疫血凝抑制试验阳性抗原作为检测抗原，倍比稀释血清样品后，加入25μL四单位抗原等体积混合，于37℃作用30分钟，再加入25μL的1%鸡红细胞，冰上作用30-45分钟，HI效价为发生红细胞完全凝集抑制的最高血清稀释倍数。
结果如图8所示，从图中可以看出，第3周开始，新城疫病毒样颗粒组和嵌合新城疫病毒样颗粒组的血凝抑制效价≥4log2，并且在第3周后，嵌合新城疫病毒样颗粒组相比于新城疫病毒样颗粒组血清中HI效价明显提升。这一结果说明经新城疫病毒样颗粒和嵌合型新城疫病毒样颗粒免疫后，能够刺激机体产生特异性免疫反应。
综上结果可以看出，实施例3所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒较原始新城疫病毒样颗粒具有更好免疫效果，可作为新型高效的疫苗候选，以达到预防禽新城疫的目的。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 662
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaattcgcca ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg tttttatggt cgtatacatt 60
tcttacatct atgcggatcg atggggacat caccatcacc atcacgatta cgatatccca 120
acgaccgaaa acctgtattt tcagggcaag ggctctgtcg acatggcacc cacccgctca 180
cccatcactg tcacccggcc ttggaagcat gtagaggcca tcaaagaagc cctgaacctc 240
ctggatgaca tgcctgtcac gttgaatgaa gaggtagaag tcgtctctaa cgagttctcc 300
ttcaagaagc taacatgtgt gcagacccgc ctgaagatat tcgagcaggg tctacggggc 360
aatttcacca aactcaaggg cgccttgaac atgacagcca gctactacca gacatactgc 420
cccccaactc cggaaacgga ctgtgaaaca caagttacca cctatgcgga tttcatagac 480
agccttaaaa cctttctgac tgatatcccc tttgaatgca aaaaaccagg ccaaaaaggt 540
accccaaata aaggcagcgg caccaccagc ggcaccaccc gcctcctgag cggcatgacc 600
tgcttcaccc tgaccggcct gctgggcacc ctggtgacca tgggcctgct gacctgaagc 660
tt 662

Claims (9)

1.一种嵌合型新城疫病毒样颗粒，其特征在于，利用GM-CSF-GPI锚定蛋白制备而成，所述GM-CSF-GPI锚定蛋白的编码碱基序列如SEQ ID NO.1所示；具体通过如下步骤制备获得：
（1）制备新城疫病毒样颗粒，具体为：
将新城疫病毒基质基因和血凝素-神经氨酸酶基因分别克隆至T载体中，分别构建重组克隆质粒pT-M和pT-HN；
对pT-M和pFastBac Dual质粒分别进行SalI-NotI双酶切，将酶切产物进行连接构建重组质粒pFastBac-M；
再将质粒pFastBac-M和pT-HN分别进行NheI-KpnI双酶切，将酶切产物进行连接，最终构建穿梭质粒pFastBac-M+HN；
将所构建的穿梭质粒pFastBac-M+HN转化DH10 Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rBacmid-M+HN；
将重组杆粒rBacmid-M+HN转染昆虫Sf 9细胞后得到重组杆状病毒rBV-M+HN，经培育并纯化处理后，得到新城疫病毒样颗粒；
（2）制备GM-CSF-GPI锚定蛋白，具体为：
人工合成如SEQ ID NO.1所示融合序列，将该融合序列与pFastBac1进行连接构建穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI；
将穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI转化至DH10 Bac感受态细胞中，筛选获得重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI；
将重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI转染昆虫Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI，经培育并纯化处理后，得到GM-CSF-GPI锚定蛋白；
（3）制备嵌合型新城疫病毒样颗粒，具体为：
将步骤（1）中制备所得新城疫病毒样颗粒和步骤（2）制备所得GM-CSF-GPI锚定蛋白，混合均匀后进行孵育，孵育结束后离心，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。
2.权利要求1所述新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）制备新城疫病毒样颗粒，具体为：
将新城疫病毒基质基因和血凝素-神经氨酸酶基因分别克隆至T载体中，分别构建重组克隆质粒pT-M和pT-HN；
对pT-M和pFastBac Dual质粒分别进行SalI-NotI双酶切，将酶切产物进行连接构建重组质粒pFastBac-M；
再将质粒pFastBac-M和pT-HN分别进行NheI-KpnI双酶切，将酶切产物进行连接，最终构建穿梭质粒pFastBac-M+HN；
将所构建的穿梭质粒pFastBac-M+HN转化DH10 Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rBacmid-M+HN；
将重组杆粒rBacmid-M+HN转染昆虫Sf 9细胞后得到重组杆状病毒rBV-M+HN，经培育并纯化处理后，得到新城疫病毒样颗粒；
（2）制备GM-CSF-GPI锚定蛋白，具体为：
人工合成如SEQ ID NO.1所示融合序列，将该融合序列与pFastBac1进行连接构建穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI；
将穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI转化至DH10 Bac感受态细胞中，筛选获得重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI；
将重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI转染昆虫Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI，经培育并纯化处理后，得到GM-CSF-GPI锚定蛋白；
（3）制备嵌合型新城疫病毒样颗粒，具体为：
将步骤（1）中制备所得新城疫病毒样颗粒和步骤（2）制备所得GM-CSF-GPI锚定蛋白，混合均匀后进行孵育，孵育结束后离心，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。
3.如权利要求2所述嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，基质基因和血凝素-神经氨酸酶基因序列通过PCR扩增获得，PCR扩增时，以新城疫病毒株Newcastledisease virus NA-1 的基因组为模板，PCR扩增时引物序列设计如下：
M上游引物5’-ATGGACTCATCTAGGACTATTGGACT-3’，
M下游引物：5’-TTATTTACGGAAGGGGTTGTATTTAGC-3’；
HN上游引物：5’-ATGGACCGCGCCGTGAA-3’，
HN下游引物：5’-TTACACTCTATCGTCCTTCAGAATCT-3’。
4.如权利要求2所述嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，新城疫病毒样颗粒通过蔗糖密度梯度纯化获得。
5.如权利要求2所述嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，GM-CSF-GPI锚定蛋白依次经镍柱亲和层析和TEV蛋白酶处理获得。
6.如权利要求2所述嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，孵育时，10mg/mL浓度的新城疫病毒样颗粒与1mg/mL浓度的GM-CSF-GPI锚定蛋白混合。
7.如权利要求2所述嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述孵育为37℃孵育1~3小时，所述离心为4℃、100000×g离心6小时。
8.如权利要求7所述嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，孵育不小于2小时。
9.权利要求1所述嵌合型新城疫病毒样颗粒在新城疫疫苗制备中的应用。
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