CN101282744A - 针对副粘病毒的病毒样颗粒疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备和使用新的、非感染性、副粘病毒疫苗的方法。病毒样颗粒(VLP)内的副粘病毒结构蛋白包含这种疫苗的一个实例。据观察基质蛋白的单独存在对提供有效VLP释放是充分必要。不过,四种副粘病毒结构蛋白质的共表达导致非感染性VLP的释放,释放的浓度和效率类似于感染性颗粒的浓度和效率。VLP疫苗对其可能有用的代表性疾病包括,但不限于,新城疫、麻疹、呼吸道合胞病毒感染和副流感病毒3型感染。
Description
政府支持声明
本工作由国立卫生研究院AI 3 30572基金支持。
发明领域
本发明涉及病毒疫苗领域。在一个实施方案中,本发明包括副粘病毒疫苗,其对诸如,但不限于,新城疫、麻疹、副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒的疾病有效。在一个实施方案中,本发明包括含有新城疫病毒(NDV)-样颗粒(VLP)的疫苗。在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其用编码主要NDV结构蛋白质的cDNAs来转染鸟类细胞。在另一个实施方案中,包括一种方法,其中以几乎100%的效率释放类似感染性病毒的颗粒。在一个实施方案中,所述颗粒是非感染性的并且提供安全有效的NDV疫苗。
背景
在最近十年,对于有关副粘病毒疫苗的安全性问题给予了很多关注,所述副粘病毒疫苗对公信力有负面影响。这些关注不仅影响其孩子是儿童期疾病疫苗的主要接种者的父母,还影响致力于饲养对各种类型的副粘病毒易感的动物的牧场主。
历史上,新城疫是家禽的毁灭性疾病,在许多国家该病仍然是影响家禽产业存在或发展的主要问题之一。甚至在新城疫被认为得到控制的国家,仍存在与疫苗接种和/或维持严格生物安全测量相关的经济负担。新城疫病毒株在对家禽毒力上的可变性质以及不同鸟类物种的不同易感性意味着对于控制和商业目的而言,新城疫需要仔细的定义。新城疫的确诊需要分离并表征相关的病毒。当前新城疫控制局限于预防传入和扩散,良好的生物安全做法和/或活体减毒病毒免疫接种。新城疫病毒可以传染人,通常引起短暂结膜炎,但从未报道过人-人的传播。Alexander D.J.,“Newcastle disease and other avianparamyxoviruses”Rev Sci Tech.19(2):443-62(2000)。
历史上,活体减毒麻疹病毒(MV)疫苗和多价麻疹、腮腺炎和风疹(MMR)疫苗的组合由于预防传染性疾病而对全世界儿童的健康带来了积极的影响。不过,已知使用这些活体减毒病毒疫苗所诱导的有效抗病毒免疫反应导致显著比率的副作用(即,例如,孤独症)。Kennedy等人,“Measles virus infection and vaccination:potential role inchronic illness and associated adverse events”Crit Rev Immunol.24(2):129-56(2004)。
健康的以及有患病风险的儿童,对于与病毒诱发的呼吸道疾病相关联的发病率和死亡率易感,所述呼吸道疾病包括呼吸道合胞病毒(RSV)和流感。当前,世界卫生组织正在努力发展和分发有效疫苗以便预防/减少主要病毒性呼吸道疾病。不过,这一进程缓慢并且风险/效益比高。病毒性呼吸道感染的疫苗接种计划应当包括预防下呼吸道感染和预防与感染相关联的发病率、住院治疗和死亡率。目前,有两种流感疫苗:i)三价灭活疫苗,和ii)活的、冷适应的减毒疫苗。不过,医患配合率相对低(即,10-30%)。由于认为低的配合率与已知污染疫苗的高风险相关,所以本领域技术人员建议应当继续研究对于所有儿童期病毒疾病安全和有效的疫苗。Greenberg等人,“Immunizationagainst viral respiratory disease:A review”Pediatr Infect Dis J.23(11Suppl):S254-61(2004)。
本领域需要低风险的高效副粘病毒疫苗,其与低成本、高产率的广泛人群配发的市场目标相符。
概述
本发明涉及病毒疫苗领域。在一个实施方案中,本发明包括有效针对诸如,但不限于,新城疫、麻疹、副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒的疾病的副粘病毒疫苗。在一个实施方案中,本发明包括含有新城疫病毒样颗粒(VLP)的疫苗。在一个实施方案中,本发明一种方法,其包括用编码主要NDV结构蛋白质的cDNAs来转染鸟类细胞。在另一个实施方案中,包括一种方法,其中以几乎100%的效率释放类似感染性病毒的颗粒。在一个实施方案中,所述颗粒是非感染性的并且提供安全有效的NDV疫苗。
在一个实施方案中,本发明包括这样的方法,其包含;a)提供,i)包含编码新城疫病毒基质蛋白的DNA序列的表达载体;ii)能够被所述载体转染的细胞;b)在生成新城疫病毒样颗粒的条件下用所述载体转染所述细胞。在一个实施方案中,该方法进一步包括步骤c)收获所述病毒样颗粒以便生成无细胞的颗粒制剂。在一个实施方案中,该方法进一步包括步骤d)对鸡施用包含所述颗粒制剂的疫苗。在一个实施方案中,细胞是细胞培养物的一部分并且所述收获包括从所述培养物的上清液中获得所述颗粒。在一个实施方案中,细胞培养物包含分汇合状态的鸟类细胞。在一个实施方案中,载体进一步包含编码其它新城疫病毒蛋白质的DNA序列,所述其它新城疫病毒蛋白质选自核壳体蛋白、融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中,所述颗粒不含新城疫病毒DNA。
在一个实施方案中,本发明包括含有表达载体的经转染细胞,所述表达载体包含编码能够生成新城疫病毒样颗粒的新城疫病毒基质蛋白的DNA序列。
在一个实施方案中,本发明包括无细胞的病毒样颗粒制剂,其收获自包含表达载体的经转染细胞,所述表达载体包含编码能够生成新城疫病毒样颗粒的新城疫病毒基质蛋白的DNA序列。
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括:a)提供,i)包含新城疫病毒样颗粒的疫苗,所述颗粒包含新城疫病毒基质蛋白;ii)对新城疫易感的宿主;b)在产生针对所述病毒样颗粒的抗体的条件下,用所述疫苗免疫所述宿主。在一个实施方案中,宿主选自鸟类、鼠和人。在一个实施方案中,所述颗粒进一步包含一种或多种其它新城疫病毒蛋白质,其选自融合蛋白、核壳体蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。
在一个实施方案中,本发明包括含有新城疫病毒样颗粒的疫苗,所述颗粒包含新城疫病毒基质蛋白。在一个实施方案中,所述颗粒不含新城疫病毒DNA。在一个实施方案中,所述颗粒进一步包含一种或多种其它病毒蛋白质,其选自融合蛋白、核壳体蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。
在一个实施方案中,本发明包括含有新城疫病毒样颗粒和新城疫病毒基质蛋白的疫苗。在一个实施方案中,所述疫苗进一步包含至少两种病毒糖蛋白。在一个实施方案中,所述糖蛋白选自融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中,所述疫苗进一步包含核壳体蛋白。在一个实施方案中,所述基质蛋白包含晚期结构域。在一个实施方案中,所述晚期结构域包含FPIV序列(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中,所述晚期结构域包含PXXP序列(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中,所述晚期结构域包含YXXL序列(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中,所述疫苗是非感染性的。
本发明的一个实施方案包括一种含有新城疫病毒样颗粒和新城疫病毒基质蛋白的鸟类疫苗。在一个实施方案中,所述疫苗进一步包含至少两种病毒糖蛋白。在一个实施方案中,所述糖蛋白选自融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中,所述疫苗进一步包含核壳体蛋白。在一个实施方案中,所述病毒样颗粒包含副粘病毒病毒样颗粒。在一个实施方案中,所述副粘病毒病毒样颗粒包含新城疫病毒样颗粒。在一个实施方案中,所述基质蛋白包含晚期结构域。在一个实施方案中,所述晚期结构域包含FPIV序列(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中,所述晚期结构域包含PXXP序列(SEQ ID NO:2)。在一个实施方案中,所述晚期结构域包含YXXL序列(SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中,所述病毒样颗粒是非感染性的。
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括:a)提供,i)包含编码新城疫病毒基质蛋白和至少两种病毒糖蛋白的cDNA序列的表达载体;ii)能够被所述载体转染的细胞;b)在生成新城疫病毒样颗粒的条件下用所述载体转染所述细胞,其中所述颗粒包含所述基质蛋白。在一个实施方案中,所述细胞包含分汇合状态的鸟类细胞。在一个实施方案中,所述表达载体包含pCAGGS。在一个实施方案中,所述糖蛋白选自融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中,所述表达载体进一步包含编码核壳体蛋白的cDNA序列。在一个实施方案中,所述方法进一步包含以至少85%的效率释放所述病毒样颗粒。在一个实施方案中,所述病毒样颗粒进一步包含所述至少两种病毒糖蛋白。
本发明的一个实施方案包括一种方法,其包含;a)提供,i)包含编码新城疫病毒基质蛋白和至少两种病毒糖蛋白的cDNA序列的表达载体;ii)能够被所述载体转染的细胞;和b)在生成包含病毒样颗粒的鸟类疫苗的条件下用所述载体转染所述细胞。在一个实施方案中,所述细胞包含分汇合状态的鸟类细胞。在一个实施方案中,所述细胞包含人细胞。在一个实施方案中,所述表达载体包含pCAGGS。在一个实施方案中,所述糖蛋白选自融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中,所述载体进一步包含编码核壳体蛋白的cDNA序列。在一个实施方案中,所述方法进一步包括以至少85%的效率释放所述病毒样颗粒。在一个实施方案中,所述病毒样颗粒包含所述基质蛋白和所述至少两种病毒糖蛋白。
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包含;a)提供,i)包含新城疫病毒样颗粒和新城疫病毒基质蛋白和至少两种病毒糖蛋白的疫苗;ii)能够被所述病毒样颗粒免疫的宿主;b)在产生针对所述病毒样颗粒的抗体的条件下用所述病毒样颗粒免疫所述宿主。在一个实施方案中,所述宿主选自鸟类、鼠和人。在一个实施方案中,所述糖蛋白选自融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中,所述疫苗进一步包含核壳体蛋白。
本发明的一个实施方案包括一种方法,其包含;a)提供,i)包含新城疫病毒病毒样颗粒、新城疫病毒基质蛋白和至少两种病毒糖蛋白的鸟类疫苗;ii)能够被所述病毒样颗粒免疫的宿主;b)在产生针对所述病毒样颗粒的抗体的条件下用所述疫苗免疫所述宿主。在一个实施方案中,所述宿主选自鸟类、鼠和人。在一个实施方案中,所述病毒样颗粒包含新城疫病毒样颗粒。在一个实施方案中,所述糖蛋白选自融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。在一个实施方案中,所述疫苗进一步包含核壳体蛋白。
在一个实施方案中,本发明包括一种VLP疫苗表达系统,其包含编码来自第一种新城疫病毒株的第一种病毒蛋白质基因的第一种cDNA;编码来自第二种新城疫病毒株的第二种病毒蛋白质基因的第二种cDNA;编码来自第三种病毒株的第三种病毒蛋白质基因的第三种cDNA。在一个实施方案中,第一种病毒蛋白质基因选自HN蛋白、F蛋白、NP蛋白或M蛋白。在一个实施方案中,第一种病毒株选自Hertz株、AV株或B1株。在一个实施方案中,第二种病毒蛋白质基因选自HN蛋白、F蛋白、NP蛋白或M蛋白。在一个实施方案中,第二种病毒株选自Hertz株、AV株或B1株。在一个实施方案中,第三种病毒蛋白质基因选自HN蛋白、F蛋白、NP蛋白或M蛋白。在一个实施方案中,第三种病毒株选自Hertz株、AV株或B1株。在一个实施方案中,本发明包括一种方法,用于检测并入VLP疫苗的病毒蛋白质基因,其包括将病毒蛋白质基因与病毒株特异性的抗体或并入的序列标签相接触。
定义
本发明中所用的术语一般根据本领域普通技术人员所接受的定义来使用,下列为例外情况:
本文所用的术语“病毒样颗粒”,指带有,或不带有病毒蛋白质的非感染性病毒亚单位。例如,病毒样颗粒可以完全缺失DNA或RNA基因组。另外,包含病毒壳蛋白的病毒样颗粒可以进行自发的自组装。在一个实施方案中包括病毒样颗粒的制剂,其中所述制剂经纯化而不含感染性毒粒(或至少基本上不含感染性毒粒,从而使得该制剂没有足够的数目以具有感染性)。
本文所用的术语“基质蛋白”、“膜蛋白”或“M蛋白”,意指位于包膜和核壳体核心之间,并且有利于毒粒结构以及出芽过程的组织和维持的任何蛋白质。
本文所用的术语“融合蛋白”或“F蛋白”,意指从包膜表面凸出并通过诱导病毒包膜和细胞膜之间融合而介导宿主细胞进入的任何蛋白质。不过,本发明并不限于功能性F蛋白。例如,F蛋白可以由突变体F基因所编码,所述突变体F基因如,但不限于,F-K115Q。据信F-K115Q消除融合蛋白的正常剪切和随后的激活。F-K115Q在无毒力NDV株中和在细胞培养中模拟天然发生的F-蛋白突变,消除了在VLP释放后细胞-细胞融合的任何潜在副作用。
本文所用的术语“核壳体蛋白”或“NP蛋白”,意指与基因组RNA相关联(即,例如,每个六聚体一个分子)并保护RNA免受核酸酶消化作用的任何蛋白质。
本文所用的术语“血凝素-神经氨酸酶蛋白”、“HN蛋白”或G蛋白质,意指跨越病毒包膜并从表面凸起为刺突从而促进细胞附着和进入(即,例如,通过结合细胞表面上的唾液酸)的任何蛋白质。这些蛋白质具有血凝反应和神经氨酸酶活性。
本文所用的术语“糖蛋白”,指偶联到包含糖的非蛋白质基团上的任何蛋白质。
本文所用的术语“副粘病毒”,指单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)副黏液病毒科(Paramyxoviridae)的任何病毒;它是引起人和动物许多疾病(即,例如,新城疫)的反义单链RNA病毒。副粘病毒包括,但不限于,例如,仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞(RS)病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、猿副流感病毒(SV5)、I、II和III型人副流感病毒等。仙台病毒可以是野生型株、突变株、实验室制备株、人工构建株等等。不完全病毒如DI颗粒(J.Virol.,1994,68,8413-8417)、合成的寡核苷酸等等,也可以用作生产本发明疫苗的材料。
本文所用的术语“晚期结构域”,指病毒蛋白质中涉及病毒颗粒从细胞质膜上出芽的任何区域。晚期结构域包含已知介导细胞蛋白质之间蛋白质-蛋白质相互作用的高度保守的基序。例如,至少三类基序,其包括PTAP(SEQ ID NO:4)、PPXY(SEQ ID NO:5)或YXXL(SEQ IDNO:3)(即,例如,YANL序列)。
本文所用的术语“载体”,指包含能够在细胞内表达的外源操作性基因的任何核苷酸序列。例如,载体可以包含编码病毒基质蛋白和至少两种糖蛋白的核酸,其可以在人、鸟类或昆虫细胞培养系统中表达。例如,杆状病毒载体可以用于转染各种鳞翅类(Lepidoptera)物种。
本文所用的术语“转染”或“转染性的”,指可以将载体并入宿主细胞中的任何机制。成功的转染导致宿主细胞能够表达载体所携带的任何操作性基因。转染可以是稳定的或瞬时的。瞬时转染的一个实例包括在细胞内表达的载体,其中所述载体未整合在宿主细胞基因组中。或者,稳定的转染包括在细胞内表达的载体,其中所述载体整合在宿主细胞基因组中。
本文所用的术语“宿主”,指能够被病毒感染和被病毒样颗粒免疫的任何生物。宿主可以是鸟类宿主(即,例如,鸡)或哺乳动物宿主(即,例如,人、小鼠、狗、兔、牛、羊等)。
本文所用的术语″序列标签″,指可以用于提供可检测的(优选可量化的)信号,并且可以附于核酸或蛋白质上的任何原子或分子。“序列标签”可以提供可通过荧光、放射活性、比色、重量测定、X-射线衍射或吸收、磁力、酶学活性等等检测的信号。“序列标签”可以是带电荷的部分(正或负电荷),或者可以是中性电荷。只要包含“序列标签”的序列是可检测的,“序列标签”可以包括核酸或蛋白质序列,或由核酸或蛋白质序列组成,。
本文所用的术语″佐剂″,指当与抗原一起施用时,增强或刺激免疫反应的任何化合物。
附图简述
下列附图只是作为本发明具体实施方案的图解说明来给出,并不是限定性的。
附图1给出显示NP、F、HN和M蛋白共表达的示例性数据,所述共表达导致VLP形成和释放。用对所有病毒蛋白质特异性的抗体混合物将转染(A版)和感染(B版)提取物中的放射性标记的蛋白质免疫沉淀,沉淀的经标记蛋白质显示于每版的左侧。如实施例4中所述纯化细胞上清液中的VLP颗粒。在浮选入蔗糖梯度后,用抗体混合物将每种梯度级分进行免疫沉淀(每版的右侧)。每种级分的密度(g/cc)显示于下部。
A版:用35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸对用pCAGGS(-NP)、(-M)、(F-K115Q)和(-HN)共转染的鸟类细胞进行放射性标记4小时(P),随后在非放射性培养基中示踪8小时(C)。
B版:将用NDV、AV株以5pfu的感染复数(MOI)感染5小时的鸟类细胞,脉冲标记30分钟并在非放射性培养基中示踪8小时。
C版显示通过脉冲和示踪细胞提取物中M蛋白的量所测定的毒粒和VLP释放效率的量。平均3次单独实验的结果并显示标准偏差。
附图2给出显示M蛋白足够用于VLP释放的示例性数据。用pCAGGS-NP、-M、-F-K115Q、和-HN分别转染鸟类细胞。
A版显示脉冲(左)和示踪(右)时提取物中的放射性标记的蛋白质。浓缩分别表达NP、M、F和HN的鸟类细胞的上清液中的颗粒并浮选入上述附图1中的蔗糖梯度中。
B版显示来自每种上清液的放射性标记的蛋白质在梯度中的分布。
C版显示VLP中每种蛋白质量的量化。平均3次单独实验的结果并显示标准偏差。
附图3给出显示与M蛋白共表达的NP、F或HN蛋白对VLP释放的作用的示例性数据。鸟类细胞,用两种NDV结构蛋白质基因的所有可能组合进行转染(即,配对组合包括,但不限于,F+NP、F+M、F+HN、HN+NP、HN+M和NP+M,其中F是F-K115Q)。在脉冲-示踪方案中的标记如附图1中所述。将存在于上清液中的颗粒浓缩并随后浮选入实施例4中所述的蔗糖梯度中。
A版显示在脉冲(上部)和示踪(下部)时细胞提取物中经标记的蛋白质。
B版显示用抗体混合物对每种级分免疫沉淀后,存在于每种梯度级分中的蛋白质。级分的密度(g/cc)显示于下部。未显示来自不包含M蛋白的转染的梯度,因为在这些梯度中没有放射性标记的蛋白质。
C版显示由经转染的鸟类细胞释放的VLP中每种蛋白质的量。结果是三次实验的平均值并显示标准偏差。
附图4给出示例性数据显示表达三种病毒蛋白质的所有组合对VLP释放的影响。在脉冲-示踪方案中对用三种NDV结构蛋白基因的所有可能组合转染的鸟类细胞进行标记,并浓缩上清液中的颗粒并浮选入附图1中的蔗糖梯度中。用抗体混合物对细胞提取物中的蛋白质进行免疫沉淀。
A版显示在脉冲(上部)和示踪(下部)时细胞提取物中经标记的蛋白质。
B版显示用针对一些病毒蛋白组合的抗体混合物对每种级分免疫沉淀后,存在于每种梯度级分中的蛋白质。级分的密度(g/cc)显示于下部。
C版显示VLPs中每种蛋白质的量的量化。
D版显示基于残余在示踪提取物中脉冲标记M蛋白的百分比的VLP释放的效率。
E版显示脉冲提取物中M蛋白的相对量。
附图5给出示例性数据显示CHMP3和Vps4-E228Q的显性-阴性突变体阻抑包含M蛋白的颗粒的释放。
A版,左,显示用pCAGGS-M(1.0μg)和pDsRed2-Nl载体(0.1,0.5和1.0μg)或pDsRed2-Nl-CHMP3-RFP(0.1、0.5和1.0μg)同时转染的人293T细胞的脉冲标记提取物。A版,右,显示8小时示踪后从这些细胞释放的VLPs。
B版,左,显示用pCAGGS-M和pBJ5载体或pBJ5-Vps4A-E228Q-Flag同时转染的脉冲标记细胞的提取物。B版,右,显示8小时示踪后从这些细胞释放的VLPs。如附图1中所述在脉冲-示踪方案中对A和B中的经转染293T细胞进行标记。如实施例4中所述,通过离心将来自上清液中的颗粒浓缩到蔗糖垫上。
版C和D显示相对于从只用pCAGGS-M和载体转染的细胞中释放的VLPs,从用pCAGGS-M和pDsRed2-Nl-CHMP3或pBJ5-Vps4A-E228Q转染的细胞中释放的VLPs百分比。
版E和F显示细胞提取物中蛋白表达(脉冲标记)的量化。在两次独立实验中获得相同结果。
附图6给出代表性副粘病毒的病毒蛋白质结构的一个实施方案的示意图。
附图7给出由代表性副粘病毒引发的感染循环的一个实施方案的示意图。
附图8给出编码第一种新城疫病毒核壳体蛋白(AB124608)的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:7)(B版)。
附图9给出编码第一种新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白(AY288990)的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)(A版)和核苷酸序列(SEQ IDNO:9)(B版)。
附图10给出编码第一种新城疫病毒融合蛋白(Y18728)的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:10)(A版)和部分核苷酸序列(SEQ ID NO:11)(B版)。
附图11给出编码第一种新城疫病毒基质蛋白(AY728363)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:13)(B版)。
附图12A/B给出杆状病毒表达载体(DQ003705)的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)。
附图13给出两种包括pCAGGS表达载体的示例性质粒。
A版:pCAGGS/MCS;B版:pJW4303(美国专利序号5,916,879,在此并入作为参考)。应当注意pCAGGS表达载体包含杂交巨细胞病毒(CMV)β肌动蛋白启动子序列。
附图14给出示例性的放射自显影数据,显示来自脉冲-示踪实验的病毒蛋白质积聚,所述实验比较来自鸟类和COS-7细胞的病毒释放物。A版:F蛋白。B版:NP蛋白。
附图15给出示例性数据,显示图14中所示脉冲-示踪放射自显影的量化。A版:F蛋白。B版:NP蛋白。菱形:鸟类细胞。方形:COS-7细胞。
附图16给出示例性的放射自显影数据,其来自由鸟类细胞(A版)和COS-7细胞(B版)释放的蔗糖梯度中的VLP的纯化。泳道1-9分别提供1.12-1.26的蔗糖密度中的带型。HN=血凝素-神经氨酸酶蛋白。F0=融合蛋白;NP=核壳体蛋白;M=基质蛋白。
附图17给出示例性的放射自显影,显示脉冲-示踪实验之后细胞提取物裂解物中的残余病毒蛋白质。A版:鸟类细胞。B版;COS-7细胞。
附图18给出示例性的数据,表明当只通过M蛋白cDNA转染时,来自鸟类(A版)细胞中M蛋白VLP释放物相对于COS-7灵长类动物细胞(B版)效率提高。显示每种蔗糖梯度级分(即,泳道1-9;1.12-1.26)中的放射性标记的M蛋白(M箭头)。
附图19给出示例性的密度计量学数据,其在通过NP、M、F-K115Q和HN蛋白cDNA分别转染,或利用NP、M、F-K115Q和HN蛋白cDNA的组合以组合(全部)转染后,比较来自鸟类(A版)和COS-7灵长类动物细胞(B版)的VLP颗粒释放的量化。
附图20给出编码第二种新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶mRNA(M22110)的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)(A版)和核苷酸序列(SEQ IDNO:16)(B版)。
附图21给出编码第三种新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白(U37193)的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)(A版)和核苷酸序列(SEQ IDNO:18)(B版)。
附图22给出编码第二种新城疫病毒融合蛋白(M21881)的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:20)(B版)。
附图23给出第三种新城疫病毒B1融合蛋白(AAG36978)的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。
附图24给出编码第二种新城疫病毒核壳体蛋白(AF060483)的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:23)(B版)。
附图25给出编码第二种新城疫病毒基质蛋白(M16622)的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:25)(B版)。
附图26给出编码第三种新城疫病毒基质蛋白(U25828)的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:27)(B版)的一个实施方案。
附图27A-27D给出新城疫病毒B1完全基因组(AF309418)的核苷酸序列(SEQ ID NO:28)。
附图28图示了一种构建杆状病毒重组DNA的方法。
附图29图示了一种产生包含His-标签和S-标签序列标签的杆状病毒重组DNA的不依赖连接的克隆技术。
附图30描绘了包含154个推定开放阅读框的野生型AcNPV C6基因组的圆形图谱。用实心箭头标记的基因是已知的并在蛋白质序列数据库中报道过。hr=AcNPV重复同源性区域位置。
附图31图示了杆状病毒转移质粒(pBAC)的七种(7)实施方案。
附图32给出编码第一种麻疹病毒血凝素蛋白质(AY249267)的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:30)(B版)的一个实施方案。
附图33给出编码第二种麻疹病毒血凝素蛋白质(AY249269)的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:32)(B版)的一个实施方案。
附图34给出编码第三种麻疹病毒血凝素蛋白质(DQ011611)的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:34)(B版)的一个实施方案。
附图35给出编码第一种麻疹病毒融合蛋白(AJ133108)的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:36)(B版)的一个实施方案。
附图36给出编码第二种麻疹病毒融合蛋白(X05597)的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:38)(B版)的一个实施方案。
附图37给出编码第三种麻疹病毒融合蛋白(Y17840)的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:40)(B版)的一个实施方案。
附图38给出编码第一种麻疹病毒核壳体蛋白(M89921)的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:42)(B版)的一个实施方案。
附图39给出编码第二种麻疹病毒核壳体蛋白(AF171232)的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:44)(B版)的一个实施方案。
附图40给出编码第三种麻疹病毒核壳体蛋白(X01999)的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:46)(B版)的一个实施方案。
附图41给出编码第一种麻疹病毒基质蛋白(D12682)的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:48)(B版)的一个实施方案。
附图42给出编码第二种麻疹病毒基质蛋白(D12683)的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:50)(B版)的一个实施方案。
附图43给出编码第三种麻疹病毒基质蛋白(AY124779)的氨基酸序列(SEQ ID NO:51)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:52)(B版)的一个实施方案。
附图44给出编码第一种呼吸道合胞病毒G蛋白质(即,例如,糖蛋白G蛋白质)(U92104)的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:54)(B版)的一个实施方案。
附图45给出编码第二种呼吸道合胞病毒G蛋白质(AY333361)的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:56)(B版)的一个实施方案。
附图46给出编码第三种呼吸道合胞病毒G蛋白质(AB117522)的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:58)(B版)的一个实施方案。
附图47给出编码第一种呼吸道合胞病毒融合蛋白(AY198177)的氨基酸序列(SEQ ID NO:59)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:60)(B版)的一个实施方案。
附图48给出编码第二种呼吸道合胞病毒融合蛋白(Z26524)的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:62)(B版)的一个实施方案。
附图49给出编码第三种呼吸道合胞病毒融合蛋白(D00850)的氨基酸序列(SEQ ID NO:63)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:64)(B版)的一个实施方案。
附图50给出编码第一种呼吸道合胞病毒基质蛋白(U02470)的氨基酸序列(SEQ ID NO:65)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:66)(B版)的一个实施方案。
附图51给出编码第二种呼吸道合胞病毒基质蛋白(AY198177)的氨基酸序列(SEQ ID NO:67)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:68)(B版)的一个实施方案。
附图52给出编码第一种呼吸道合胞病毒核壳体蛋白(U07233)的氨基酸序列(SEQ ID NO:69)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:70)(B版)的一个实施方案。
附图53给出编码第二种呼吸道合胞病毒核壳体蛋白(X00001)的氨基酸序列(SEQ ID NO:71)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:72)(B版)的一个实施方案。
附图54给出编码第三种呼吸道合胞病毒核壳体蛋白(S40504)的氨基酸序列(SEQ ID NO:73)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:74)(B版)的一个实施方案。
附图55给出编码第一种副流感病毒3型核壳体蛋白(D10025)的氨基酸序列(SEQ ID NO:75)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:76)(B版)的一个实施方案。
附图56给出编码第一种副流感病毒3型融合蛋白(D00016)的氨基酸序列(SEQ ID NO:77)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:78)(B版)的一个实施方案。
附图57给出编码第二种副流感病毒3型融合蛋白(AF394241)的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:80)(B版)的一个实施方案。
附图58给出编码第一种副流感病毒3型基质蛋白(D00130)的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)(A版)和核苷酸序列(SEQ ID NO:82)(B版)的一个实施方案。
附图59给出编码第一种副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白(AB189960)的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)(A版)和核苷酸序列(SEQID NO:84)(B版)的一个实施方案。
附图60给出编码第二种副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白(AB189961)的氨基酸序列(SEQ ID NO:85)(A版)和核苷酸序列(SEQID NO:86)(B版)的一个实施方案。
附图61给出编码第三种副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白(L25350)的氨基酸序列(SEQ ID NO:87)(A版)和核苷酸序列(SEQ IDNO:88)(B版)的一个实施方案。
附图62给出示例性数据,显示M蛋白可以包装在膜性颗粒中。用pCAGGS-M转染鸟类细胞并分离和纯化放射性标记的VLPs。用不同浓度的蛋白酶K(0.25、0.5、1、5、10和20μg/ml;分别对应(2-7泳道)在冰上处理提取物(上版)和VLPs(中版)30分钟。同时,在蛋白酶K处理之前将VLPs在1%Triton X-100中孵育(下版)。在用蛋白酶孵育后,通过加入0.1mM PMSF停止反应。随后免疫沉淀M蛋白。
附图63给出示例性数据,显示M蛋白是VLP释放所必需的。在不存在M的cDNA情况下,用pCAGGS载体中编码NP、F和HN蛋白的cDNA的所有可能组合转染鸟类细胞(F-K115Q+HN、F-K115Q+NP、HN+NP、NP+F-K115Q+HN)。随后纯化细胞上清液中的颗粒。图版显示存在于每个梯度级分中的蛋白质。使用放射性标记的经感染细胞提取物作为标记。将梯分的密度显示在下部(g/cc)。
附图64给出示例性数据,显示M蛋白与F和HN蛋白的共定位。通过免疫荧光显微镜分析NDVF和HN蛋白的细胞表面定位和M蛋白的细胞定位。分别单独地(A)或用F-K115Q+M或HN+M(B),用NP+M+F-K115Q、NP+M+HN或M+F-K115Q+HN(C)和所有4种cDNA(D)转染鸟类细胞。转染后40h用DAPI(蓝色)对核染色。如在图版中所示,用兔抗F蛋白抗体或抗HN蛋白抗体对完整的经转染细胞进行染色。在与抗M蛋白抗体一起孵育前用0.05%Triton X-100对细胞透性化。二抗是抗兔Alexa 488偶联物(绿色)和抗小鼠Alexa 568偶联物(红色)。利用Adobe Photoshop合并图像。
附图65给出示例性数据,显示病毒蛋白质在VLP中的共同免疫沉淀。在TNE缓冲液中用1%Triton X-100裂解由表达NP+M+F-K115Q+HN(A)、M+F-K115Q+HN(B)、NP+M+F-K115Q(C)和NP+M+HN(D)的细胞生成的放射性标记的VLPs。随后将裂解的VLPs与过量的抗F蛋白抗体(抗HR1、抗HR2、抗F尾部、抗F2-96和单克隆抗F(G5))混合物、抗HN蛋白抗体的混合物(单克隆抗体的混合物)、抗M蛋白单克隆抗体或NDV-特异性抗体的混合物一起于4℃过夜孵育。使用无抗体以及预免疫血清作为阴性对照。在4℃并且不断混合的状态下用预洗涤的Pansorbin A沉淀免疫复合物至少2h。在冷TNE中用0.5%Triton X-100将样品洗涤三次。所有共同免疫沉淀的步骤都在4℃完成。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。结果显示三次独立实验之一,这三次实验结果都相同。
附图66给出示例性数据,显示VLPs中的蛋白质-蛋白质相互作用。插页:通过VLPs中蛋白质的共同免疫沉淀检测的病毒蛋白质-蛋白质相互作用的各种实施方案。还显示了例证性的潜在相互作用,其可以导致VLPs的组装,所述VLPs由NP、F和HN蛋白与M蛋白的共同表达而形成。
附图67给出示例性数据,显示释放自293T细胞的VLPs。用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸对用pCAGGSM(A版)或pCAGGS-NP、-M、-F-K155Q和-HN的混合物(B版)转染的293T细胞进行放射性标记4小时(P),并随后在非放射性介质中示踪8小时(C)。用所有病毒蛋白质的特异性抗体的混合物对存在于细胞裂解物中的蛋白质进行免疫沉淀,并将沉淀的标记蛋白质显示在每个图版的左侧。随后纯化细胞上清液中的颗粒。在浮选入蔗糖梯度后(每版的右侧),用抗体混合物对每种梯度级分进行免疫沉淀。每种级分的密度(g/cc)显示于下部。
附图68给出示例性数据,显示VPS途径M蛋白VLP释放的野生型和显性-阴性突变体蛋白质的作用。A版显示293T细胞的细胞提取物(上部)和相应释放的颗粒(下部),其来自用pCAGGS-M和pDsRed2-N1载体(泳道1)、pBJ5-WT-CHMP3(泳道2)或pDsRed2-N1-CHMP3-RFP(泳道3)共转染的细胞。C版显示293T细胞的细胞提取物(上部)和相应释放的颗粒(下部),其来自用pCAGGS-M和pBJ5载体(泳道1)、pBJ5-WT-Vps4A(泳道2)或pBJ5-Vps4A-E228Q(泳道3)共转染的细胞。E版显示293T细胞的提取物(上部)和相应的VLP(下部),其来自用pCAGGS-M和pDsRed2-N1载体(泳道1)、pBJ5-AIP1-HA(泳道2)或pDsRed2-N1-AIP1-HA-CHMP3-RFP(泳道3)共转染的细胞。提取物来自脉冲标记的细胞。VLPs释放自8小时非放射性示踪期间脉冲标记的细胞。随后纯化颗粒。利用NDV蛋白质特异性抗体对蛋白质进行免疫沉淀并通过SDS-PAGE分离。图版B、D和F显示相对于释放自野生型VPS蛋白质对照的颗粒,所释放颗粒的量化。在两次独立实验中获得相同的结果。
附图69给出示例性数据,显示CHMP3、Vps4A和AIP1的显性-阴性突变体对于完整VLPs释放的影响。A版显示293T细胞的提取物(泳道1-3)和相应的释放的VLPs(泳道4-6),其来自用编码NP、M、HN和F蛋白的NDVcDNAs和pDsRed2-N1载体(泳道1和4)、pBJ5-WT-CHMP3(泳道2和5)或pDsRed2-N1-CHMP3-RFP(泳道3和6)共转染的细胞。C版显示293T细胞的提取物(泳道1-3)和相应的释放的VLPS(泳道4-6),其来自用四种NDVcDNAs的混合物和pBJ5载体(泳道1和4)、pBJ5-WT-Vps4A(泳道2和5)或pBJ5-Vps4A-E228Q(泳道3和6)共转染的细胞。E版显示293T细胞的提取物(泳道1-3)和相应的VLPs(泳道4-6),其来自用NDVcDNAs的混合物和pDsRed2-N1载体(泳道1和4)、pBJ5-AIP1-HA(泳道2和5)或pDsRed2-N1-AIP1-HA-RFP(泳道3和6)共转染的细胞。提取物来自脉冲标记的细胞。VLPs释放自8-小时非放射性示踪期间脉冲标记的细胞。随后纯化颗粒。利用NDV蛋白质特异性抗体对蛋白质进行免疫沉淀并通过SDS-PAGE分离。图版B、D和F显示相对于载体和野生型Vps蛋白质对照,释放VLPs的量化。在两次独立实验中获得相同的结果。
附图70给出示例性数据,证明L结构域在NDVM蛋白中的功能性。A版显示野生型M蛋白、在氨基酸位置216和219处(M-A216A219)或232和235处(M-A232A235)有丙氨酸取代,以及在位置232-235上有YPDL或PTAP取代的突变M蛋白。B版显示提取物(上部)以及释放自293T细胞的VLPs(下部),所述293T细胞表达野生型或突变体M蛋白。D版显示提取物(左)和释放自293T细胞的VLPs(右),所述293T细胞表达NP、F和HN蛋白,以及野生型或突变体M蛋白。随后纯化颗粒。利用NDV蛋白质特异性抗体将蛋白质免疫沉淀并通过SDS-PAGE进行分离。图版C和E显示相对于野生型M蛋白,释放的VLPs的量化。在两次独立实验中获得相同的结果。
附图71给出示例性数据,显示AIP1并入VLP中。用pCAGGSM和空白载体或具有HA标签的AIP1的载体转染293T细胞。A版显示用M蛋白特异性单克隆抗体由细胞提取物(抗M的IP)和VLP中沉淀的放射性标记的M蛋白。通过利用偶联了过氧化物酶的HA抗体(抗HA-IB)的免疫印迹在提取物和VLPs中检测HA-AIP1(N-末端标记的)和AIP1-HA(C-末端标记的)。B版显示由细胞提取物(上部)和VLPs(下部)中沉淀的放射性标记的M蛋白和AIP1-HA。
附图72给出示例性数据,比较未进行预先免疫沉淀的纯化的NDV病毒和VLPs的蛋白质含量。
附图73给出示例性的电子显微照片,显示病毒(B1)(上版)、仅M蛋白-VLPs(中版)以及NP、M、F和HN VLPs(下版)。
附图74给出示例性数据,显示与制备自大规模组织培养物的VLPs相比,病毒(B1)生长在卵中时的银染。
发明详述
本发明涉及病毒疫苗领域。在一个实施方案中,本发明包括有效抗疾病的副粘病毒疫苗,所述疾病诸如,但不限于,新城疫、麻疹、副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒。在一个实施方案中,本发明包括含有新城疫病毒样颗粒(VLP)的疫苗。在一个实施方案中,本发明包括用编码主要NDV结构蛋白质的cDNAs来转染鸟类细胞的方法。在另一个实施方案中,包括一种方法,其中以几乎100%的效率释放类似感染性病毒的颗粒。在一个实施方案中,所述颗粒是非感染性的并且提供安全有效的NDV疫苗。
副粘病毒具有负、单链RNA基因组,其通常是线性的。副粘病毒形态学包含具有大约150-350纳米(nm)直径的相对球形。通常,基因组与核蛋白一起被包装入核蛋白核心中。聚合酶蛋白也可以与这些核蛋白核心相关联,所述核蛋白核心在早期感染复制和转录过程中发挥作用。基质蛋白是副粘病毒的显著特征,并排列在病毒膜的内表面。跨膜蛋白(即,例如,血凝素、融合或神经氨酸酶蛋白)都形成同质寡聚复合物(即,本领域已知的刺突蛋白)并辅助位于宿主细胞质膜上的病毒组装。Garoff等人,“Virus Maturation By Budding”MicrobiolMol Biol Rev 62:1171-1190(1998)。
I.病毒结构和组装
副粘病毒是包膜的,并且已知在受感染细胞的质膜上组装它们的毒粒组分,随后通过出芽过程来释放后代颗粒。新城疫病毒(NDV)、麻疹、副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒都属于副粘病毒(Paramyxoviridae),特征是具有基因组负链RNA(即,例如,大约16KB)的包膜病毒,所述负链RNA与核蛋白质一起包装入核蛋白(RNP)核心中。
副粘病毒RNP核心还包含聚合酶复合物,其由磷蛋白和大聚合酶组成。RNP核心包围在膜中,所述膜包含两种跨膜糖蛋白:血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)蛋白,以及基质(M)蛋白,其与含脂的病毒包膜内表面相关联。Lamb等人,“Paramyxoviridae:The Viruses andTheir Replication”pp.1305-1340.In:Fields Virology,Third Edition, Vol.1.,Eds:D.M.K.&.P.M.Howley,LippincottWilliams &Wilkins,Philadelphia(2001)。
据信许多包膜的RNA病毒的基质蛋白在病毒组装和出芽中发挥作用。Freed,E.O.,“The HIV-TSGI0l interface:recent advances ina budding field”Trends Microbiol.11:56-9(2003);Jasenosky等人,“Filovirus budding”Virus Res.106:1B1-8(2004);Jayakar等人,“Rhabdovirus assembly and budding”Virus Res.106:117-32(2004);Peeples M.E.,“Paramyxovirus M proteins:pulling it all together andtaking it on the road”pp.427-456.In:The Paramyxoviruses,Ed:D.W.Kingsbury,Plenum,New York,N.Y(1991);Pornillos等人,“Mechanisms of enveloped RNA virus budding”Trends Cell Biol.12:569-79(2002);Schmitt等人,“Escaping from the cell:assembly andbudding of negative-strand RNA viruses”Cuff Top MicrobiolImmunol 283:145-96(2004)和Takimoto等人,“Molecular mechanismof paramyxovirus budding”Virus Res.106:133-45(2004)。不过,在缺少其它病毒组分的情况下,逆转录病毒gag前体蛋白的表达,也导致由质膜中组装和释放gag病毒样颗粒(VLPs)。Delchambre等人,“TheGAG precursor of simian immunodeficiency virus assembles intovirus-like particles”EMBO J 8:2653-60(1989)、Demirov等人,“Retrovirus budding”Virus Res 106:87-102(2004);Gheysen等人,“Assembly and release of HIV-l precursor Pr55gag virus-likeparticles from recombinant baculovirus-infected insect cells”Cell59:103-12(1989)和Morita等人,“Retrovirus budding”Annu Rev CellDev Biol.20:395-425(2004)。所以,尚不清楚,哪种NDV蛋白质是指导病毒颗粒形成和释放的充分必要条件。
A.M蛋白
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括来自副粘病毒的M蛋白,而无任何其它糖蛋白,其中生成VLPs。
M蛋白分离自:
i)埃博拉病毒(Jasenosky等人,“Filovirus budding”Virus Res.106:1B1-8(2004);Jasenosky等人,“Ebola virus VP40-induced particleformation and association with the lipid bilayer”J.Virol.75:5205-14(2001)和Timmins等人,“Vesicular release of Ebola virusmatrix protein VP40”Virology 283:1-6(2001));
ii)疱疹性口炎病毒(Jayakar等人,“Rhabdovirus assembly andbudding”Virus Res.106:117-32(2004);Li等人,“Viral liposomesreleased from insect cells infected with recombinant baculovirusexpressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus”J.Virol.67:4415-20(1993)和Sakaguchi等人,“Double-layered membranevesicles released from mammalian cells infected with Sendai virusexpressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus”Virology263:230-43(1999))
和,iii)流感病毒(Gomez-Puertas等人,“Influenza virus matrixprotein is the major driving force in virus budding”J.Virol.74:11538-47(2000)),当单独表达时,组装成VLPs并释放出来。
相反地,已知M蛋白缺陷型狂犬病病毒在毒粒形成中被严重削弱。Mebatsion等人,“Matrix protein of rabies virus is responsible forthe assembly and budding of bullet-shaped particles and interactswith the transmembrane spike glycoprotein G”J.Virol.73:242-50(1999)。
几种副粘病毒系统中的研究也已经提示M蛋白在病毒组装和出芽中发挥作用。通过反向遗传修饰的缺失M蛋白基因的麻疹病毒(MV)和仙台病毒(SV)在出芽上受到削弱。分别参见Cathomen等人,“Amatrix-less measles virus is infectious and elicits extensive cell fusion:consequences for propagation in the brain”EMBO J 17:3899-3908(1998)和Inoue等人,“A new Sendai virus vector deficient in thematrix gene does not form virus particles and shows extensivecell-to-cell spreading”J.Virol.77:6419-29(2003)。另外,在出芽中也可检测到包含来自亚急性硬化性全脑炎(SSPE)病毒的突变M蛋白的MV。Patterson等人,“Evidence that the hypermutated M proteinof a subacute sclerosing panencephalitis measles virus activelycontributes to the chronic progressive CNS disease”Virology291:215-25(2001)。
对副粘病毒组装的研究最近也集中在鉴定VLPs组装和出芽所需的病毒蛋白质上,并证明了M蛋白的作用。单独表达的人副流感病毒1型(hPIV1)的M蛋白和SV的M蛋白诱导VLPs由质膜上出芽。Coronel等人,“Human parainfluenza virus type 1 matrix andnucleoprotein genes transiently expressed in 12 mammalian cellsinduce the release of virus-like particles containing 13nucleocapsid-like structures”J.Virol.73:7035-8(1999);Sakaguchi等人,“Double-layered membrane vesicles released from mammaliancells infected with Sendai virus expressing the matrix protein ofvesicular stomatitis virus”Virology 263:230-43(1999);Sugahara等人,“Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation byexpression of multiple viral proteins and acceleration of its release byC protein”Virology 325:1-10(2004)和Takimoto等人,“Role of matrixand fusion proteins in budding of Sendai virus”J.Virol.75:11384-91(2001)。M蛋白的表达对于猿病毒5(SV5)VLP形成也是必需的。Schmitt等人,“Requirements for budding of paramyxovirus simianvirus virus-like particles”J Virol 76:3952-64(2002)。
不过,与PIY1和SV相反,SV5的M蛋白并不足以使VLP释放。而是,需要SV5的M蛋白与NP和任一种糖蛋白同时表达。尽管现有的报道认同M蛋白在副粘病毒颗粒释放中作为出芽组织者的作用,但在病毒粒的组装和出芽中的蛋白质需求仍有所不同。逆转录病毒gag蛋白质、埃博拉病毒M蛋白和流感Ml蛋白质的出芽能力部分归因于晚期结构域(下文)。Demirov等人,“Retrovirus budding”Virus Res106:87-102(2004);Freed,E.O.,“Viral late domains”J.Virol.76:4679-87(2002);Jasenosky等人,“Filovirus budding”Virus Res.106:1B1-8(2004);Jayakar等人,“Rhabdovirus assembly andbudding”Virus Res.106:117-32(2004);Morita等人,“Retrovirusbudding”Annu Rev Cell Dev Biol.20:395-425(2004);Nayak等人,“Assembly and budding of influenza virus”Virus Res 106:147-65(2004);Pornillos等人,“Mechanisms of enveloped RNA virusbudding”Trends Cell Biol.12:569-79(2002);Schmitt等人,“Escapingfrom the cell:assembly and budding of negative-strand RNA viruses”Cuff Top Microbiol Immunol 283:145-96(2004);Strack等人,“AlP1/ALIX is a binding partner for HIV-1 p6 and EIA V p9functioningin virus budding”Cell 114:689-99(2003)和von Schwedler等人,“Theprotein network of HIV budding”Cel1 4:701-13(2003)。
B.晚期结构域
晚期结构域是介导与E类蛋白成员相互作用的短肽基序,所述E类蛋白涉及囊泡蛋白质分选(VPS)途径。晚期结构域通过与细胞机构的组分相互作用来促进出芽,所述细胞机构负责将货物分选至多泡体(MVB)中。MVB囊泡的形成和病毒的出芽是在拓扑学上类似的过程。现有证据提示包膜RNA病毒通过征用正常情况下用来在细胞内生成MVB的细胞机构来出芽。Carter,C.A.,“Tsg101:HIV-l′s ticket toride”Trends Microbiol.10:203-205(2002);Demirov等人,“Retrovirusbudding”Virus Res 106:87-102(2004);Freed,E.O.,“TheHIV-TSGI01 interface:recent advances in a budding field”TrendsMicrobiol.11:56-9(2003);Freed,E.O.,“Viral late domains”J.Virol.76:4679-87(2002);Garrus等人,“Tsg l-0l and the vacuolar proteinsorting pathway are essential for HIV-l budding”Cell 107:55-65(2001);Morita等人,“Retrovirus budding”Annu Rev Cell Dev Biol.20:395-425(2004);Pornillos等人,″Mechanisms of enveloped RNAvirus budding”Trends Cell Biol.12:569-79(2002)、Pornillos等人,“HN Gag mimics the TsgI0l-recruiting activity of the human Hrsprotein”J Cell Biol 162:425-34(2003);Strack等人,“AlP 1/ALIXis a binding partner for HIV-1 p6 and EIA V p9functioning in virusbudding”Cell 114:689-99(2003);von Schwedler等人,“The proteinnetwork of HIV budding”Cell 4:701-13(2003)。Martindale,D.,“Budding viral hijackers co-opt the endocytic machihery to make agetaway”J Biol.3:2(2003)和Simons等人,“The budding mechanismsof enveloped animal viruses”J.Gen.Virol.50:1-21(1980)。
在一个实施方案中,本发明包括VPS途径的显性阴性突变蛋白质组分还可以抑制颗粒释放。在一个实施方案中,NDV的M蛋白中的YXXL(SEQ ID NO:3)序列具有晚期结构域的特性。尽管不必理解发明的机制,但相信YXXL突变终止颗粒释放而晚期结构域(如YPDL和/或PTAP)的取代充分恢复颗粒释放。
C.出芽
在副粘病毒家族内,已知VPS途径参与SV5出芽。据显示显性-阴性突变VPS4(E228Q)(涉及VPS途径的再循环蛋白质复合物所必需的ATP酶)抑制SV5病毒粒以及VLPs的出芽。Schmitt等人,“Evidencefor a new viral late-domain core sequence,FPIV,necessary forbudding of a paramyxovirus”J.Virol.79:2988-97(2005)。由于已经知道VPS4(E228Q)也抑制VPS途径,可以相信VPS途径涉及SV5出芽。此外,鉴定了SV5M中推定的晚期结构域。不过,SV5的M蛋白并不足以导致VLP形成和释放,使得这一结果难以解释。因而,副粘病毒组装和释放的一般性规则尚不清楚。Schmitt等人,“Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-likeparticles”J Virol 76:3952-64(2002)。公开的问题包括:i)病毒结构蛋白中副粘病毒晚期结构域的进一步鉴定,ii)每种病毒蛋白质在病毒组装中的作用和贡献,和iii)参与组装和出芽过程的细胞因子。
本发明多个实施方案回答了这些问题。在一个实施方案中,本发明包括一种由转染了编码病毒结构蛋白的核酸的细胞生产NDV的VLPs的方法。在另一个实施方案中,本发明包括用编码NDV的M蛋白的核酸进行转染,所述蛋白是含脂颗粒(即,例如VLPs)释放的必要和充分条件。在另一个实施方案中,本发明包括将其它病毒蛋白最有效地(即,例如,几乎100%)并入VLPs中需要M蛋白与至少两种其它NDV蛋白一起表达。例如,已知CHMP3和VPS4蛋白(二者都是宿主VPS系统的组分)的显性-阴性突变抑制VLPs的释放。Morita等人,“Retrovirus budding”Annu Rev Cell Dev Biol.20:395-425(2004);Strack等人,“AlP 1/ALIX is a binding partner for HIV-1 p6 and EIAV p9functioning in virus budding”Cell 114:689-99(2003)和vonSchwedler等人,“The protein network of HIV budding”Cell4:701-13(2003)。另外包括AIP1也并入VLPs中,由此在NDV颗粒出芽中发挥作用。
D.显性阴性突变
显性阴性Vps4蛋白可以阻抑由NP、HN、F和M蛋白组成的SV5病毒粒或VLP的释放,暗示副粘病毒释放中存在VPS系统。Schmitt等人,“Evidence for a new viral late-domain core sequence,FPIV,necessary for budding of a paramyxovirus”J.Virol.79:2988-2997(2005)。Vps4的显性阴性变体,Vps4A-E228Q,阻抑NDV的VLP释放,确证了这些结果。Martin-Serrano等人,“Role of ESCRT-I inretroviral budding”J Virol 77:4794-4804(2003);Strack等人,“AIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1p6and EIAV p9functioning in virus budding”Cell 114:689-699(2003)和vonSchwedler等人,“The protein network of HIV budding”Cell114:701-713(2003))。
尽管不必理解本发明的机制,但据信本文所示的结果显示这些显性阴性蛋白阻抑只包含M蛋白的颗粒的释放。例如,CHMP3的显性阴性变体(ESCRT III复合物(1)的亚基)以及结合ESCT I和III蛋白的AIP1的显性阴性突变体,抑制NDV的VLP释放以及只包含M蛋白的颗粒释放。这种抑制并非因为蛋白质的过表达,因为这些蛋白质的野生型的转染对于M颗粒释放的影响很小。这些结果显示完整的VPS途径有助于NDVVLP出芽。另外,这些结果表明VPS途径参与M颗粒释放。
许多研究已经证明病毒基质蛋白中的L结构域介导它们与VPS途径中特异性分子的相互作用。Bieniasz,P.D.,“Late buddingdomains and host proteins in enveloped virus release”Virology344:55-63(2006);Freed,E.O.,“Viral late domains”J.Virol.76:4679-4687(2002)和Morita等人,“Retrovirus budding”Annu RevCell Dev Biol 20:395-425(2004)。已经在逆转录病毒(Puffer等人,“Equine infectious anemia virus utilizes a YXXL motif within thelate assembly domain of the Gag p9protein”J Virol 71:6541-6546(1997))、棒状病毒和丝状病毒(Irie等人,“Budding of PPxY-containingrhabdoviruses is not dependent on host proteins TGS101andVPS4A”J Virol 78:2657-2665(2004))中鉴定了三种L结构域基序,即PTAP、YPXL和PPXY(Pornillos等人,“Mechanisms of enveloped RNA virusbudding”Trends Cell Biol.12:569-579(2002))。在orthomyxo病毒中鉴定YRKL序列为晚期结构域(Hui等人,“YRKLsequence ofinfluenza virus M1 functions as the L domain motif and interactswithVPS28and Cdc42”J Virol 80:2291-2308(2006))。
已经报道过PTAP序列结合ESCRT I的组分TSG101(肿瘤易感性基因101)蛋白。Huang等人,“p6Gag is required for particleproduction from full-length human immunodeficiency virus type 1molecular clones expressing protease”J Virol 69:6810-6818(1995)。另外,已经显示YPXL序列与AP2(接头蛋白2)和AIP1相互作用。分别参见Chen等人,“Functions of early(AP-2)and late(AIP1/ALIX)endocytic proteins in eq uine infectious anemia virus budding”J BiolChem(2005)和Strack等人,“AIP1/ALIX is a binding partner forHIV-1 p6 and EIAV p9 functioning in virus budding”Cell114:689-699(2003)。流感病毒M1蛋白中的YRKL序列结合VSP28(一种结合tsg101的ESCRT 1蛋白),以及GTP结合蛋白的Rho家族成员Cdc42。PPXY基序结合Nedd4样(神经前体细胞表达的,随着发育下调的基因4)泛素连接酶。Vana等人,“Role of Nedd4andubiquitination of Rous sarcoma virus Gag in budding of virus-likeparticles from cells”J Virol 78:13943-13953(2004)和Xiang等人,“Fine mapping and characterization of the Rous sarcoma virusPr76gag late assembly domain”J Virol 70:5695-5700(1996))。
副粘病毒M蛋白没有PTAP、YPXL、YRKL或PPXY基序。不过,SV5的M蛋白中的序列FPIV可能是副粘病毒中的晚期结构域。FPIV的突变抑制颗粒的释放,并且在逆转录病毒gag构建体中加入这一序列刺激颗粒的释放。不过,由于SV5的M蛋白并不足以导致SV5颗粒释放,相信FPIV在这一副粘病毒M蛋白中并不独立地充当晚期结构域。Schmitt等人,“Evidence for a new virallate-domain coresequence,FPIV,necessary for budding of a paramyxovirus”J.Virol.79:2988-2997(2005)。
因此,并不清楚SV5如何利用VPS途径或FPIV序列如何充当晚期结构域。NDV的M蛋白的序列分析显示这一FPIV基序的存在。此外,NDV的M蛋白包含PKSP和YANL序列,其并未在SV5的M蛋白中发现。在一个实施方案中,本发明包括一种包含L结构域特性的YANL基序。在一个实施方案中,YANL突变减弱M蛋白颗粒的释放。尽管不必理解本发明的机制,但相信用其它已知的晚期结构域(即,例如,PTAP或YPDL)取代YANL突变,可以完全恢复颗粒释放。
另外据信通过YANL序列突变抑制颗粒释放好像并不仅仅归因于蛋白质折叠的作用。本文提供的数据提示NDV的M蛋白可能利用其它类型的晚期结构域,YPDL或PTAP结构域,进入VPS途径,并且NDV的M蛋白中的FPIV序列可能并不充当独立于YANL序列的晚期结构域,因为YANL突变体蛋白M-A232-A235具有野生型FPIV序列。
已经显示YPDL晚期结构域与VPS蛋白AIP1相互作用。在一个实施方案中,本发明包括AIP1蛋白质在只包含M蛋白的释放颗粒中发现。
还已显示仙台病毒M蛋白足以导致颗粒的释放(Sugahara等人,“Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expressionof multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein”Virology 325:1-10(2004)和Takimoto等人,“Role of matrix andfusion proteins in budding of Sendai virus”J.Virol.75:11384-11391(2001))。仙台病毒M蛋白具有YLDL序列,其可以充当SV的M蛋白的晚期结构域。如上所注,SV5的M蛋白既不足以导致颗粒的释放,它也没有YXXL基序。Schmitt等人,“Requirements forbudding ofparamyxovirus simian virus 5 virus-like particles”J Virol76:3952-3964(2002)。不过,SV5的NP蛋白有许多包括YPLL序列的YXXL基序。或者,SV5晚期结构域可能存在于SV5的NP而非M蛋白上。事实上,据报道,SV5的NP蛋白与M蛋白以及糖蛋白的表达显著增强了SV5的VLP释放。Schmitt等人,“Requirements forbudding of paramyxovirus simian virus 5 virus-like particles”J Virol76:3952-3964(2002)。
因此,显然在不同的副粘病毒系统中对于颗粒的释放存在不同的要求,并且可能部分归因于结构蛋白上晚期结构域的不同分布。不过,本发明包括宿主细胞VPS途径有助于M蛋白出芽并且NDV的M蛋白中的YANL基序具有晚期结构域的特性。
II.病毒样颗粒(VLP)的形成和释放
在一个实施方案中,本发明包括用只编码副粘病毒M蛋白的核酸转染宿主细胞从而使经转染的细胞表达基质蛋白并生成副粘病毒VLPs。在另一个实施方案中,本发明包括在发生副粘病毒VLP形成和释放的条件下共表达两种或多种副粘病毒糖蛋白,所述副粘病毒糖蛋白包括但不限于,NP、F-Kl15Q和/或HN蛋白(与M蛋白一起)。
本发明包括有效生成毒性副粘病毒株的VLPs的条件。在一个实施方案中,副粘病毒株包括,但不限于,新城疫、麻疹、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒。在另一个实施方案中,VLPs包含相同的主要抗原作为感染性病毒。在另一个实施方案中,VLPs包含具有相同比例的主要抗原作为感染性病毒。在一个实施方案中,主要抗原选自核壳体蛋白、膜/基质蛋白、血凝素-神经氨酸酶蛋白和融合蛋白。
根据本发明的实施方案的VLPs生产比现有活体或减毒病毒疫苗更简单并且有可能成本效率更高。VLPs可以从细胞上清液中收获并通过与用来纯化病毒的相同方案进行纯化。可以对VLPs进行工程改造以提高免疫反应的幅度。还可以对VLPs进行工程改造从而能够将所述免疫反应与由感染诱导的免疫反应相区别。
A.VLP的释放特性
在一个实施方案中,VLPs从共表达副粘病毒主要结构蛋白质的细胞中释放。在一个实施方案中,从共表达NP、M、F和HN蛋白的鸡成纤维细胞系释放NDV的VLP颗粒,所述NP、M、F和HN蛋白可以进行纯化和表征。在一个实施方案中,未经剪切的F蛋白消除了细胞-细胞融合对病毒释放的可能影响。在一个实施方案中,使用鸟类细胞,因为是鸟类NDV的天然宿主。例如,如下面实施例中所详述的,以之前确定的DNA浓度,用编码NDV病毒蛋白质的质粒共转染细胞(即,例如,鸟类或人)来达到与经感染细胞相当的表达水平和蛋白质的比例。随后用35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸对细胞进行脉冲-标记,随后示踪8小时(这一时间也导致最大值的颗粒释放)。通过蔗糖密度超速离心来分离并分级细胞上清液中的VLPs。
在一个实施方案中,由表达至少四种病毒蛋白质的细胞释放副粘病毒VLP的效率(85%)与由副粘病毒感染细胞释放感染性颗粒的效率(92%)相当。尽管不必理解本发明的机制,但相信这一结果提示四种副粘病毒蛋白(即,例如,M蛋白、NP蛋白、F蛋白质或HN蛋白)可以提供颗粒的有效形成。进一步相信病毒的大聚合酶或磷蛋白对于病毒释放的定量影响很小。
尽管不必理解本发明的机制,但相信可以在蔗糖梯度上分离的副粘病毒VLPs,具有相对均一的密度,其稍小于真正病毒的平均密度。尽管不必理解本发明的机制,但相信这一结果有可能归因于颗粒中缺少病毒基因组RNA。所以,进一步相信VLPs是非感染性的。
尽管不必理解本发明的机制,但相信副粘病毒VLPs有可能折叠成与真正病毒实质上相同的构象,并以与副粘病毒颗粒相同的方式包装入颗粒中。作为结果,这些颗粒应当与真正病毒一样具有抗原性。不过,VLPs并不包含病毒基因组,因为正在形成和释放这些颗粒的细胞(即,例如,鸟类或人),并未被病毒感染。所以,VLPs不能是感染性的并且不能引起疾病。
B.M蛋白的功能
在一个实施方案中,副粘病毒M蛋白对VLP颗粒释放是充分必要的。在一个实施方案中,副粘病毒选自,包括但不限于新城疫病毒、麻疹病毒、副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒的组。即,M蛋白的单独表达导致包含M蛋白的副粘病毒VLP颗粒非常有效地释放。例如,M蛋白的释放效率与当共表达至少四种蛋白质时观察到的效率相当。尽管不必理解本发明的机制,但相信这一结果提示正是M蛋白引导了副粘病毒VLPs的出芽。另外,当只有M蛋白存在时,释放VLPs。因此,在缺少M蛋白时,即使存在病毒蛋白质表达(或病毒蛋白质组合的共表达),也不会出现显著的VLP颗粒释放。例如,单独表达HN蛋白的细胞,只释放痕量的包含极轻密度HN蛋白的物质进入细胞上清液,并且这种物质不太可能反映病毒组装的显著组分。在一个实施方案中,本发明包括除了M蛋白之外,没有NDV蛋白质可以在含脂颗粒的释放中独立发挥作用,所述释放反映了病毒组装。
尽管不必理解本发明的机制,但相信从只表达M蛋白的细胞中释放的VLP颗粒具有非常不一致的密度,因为这种出芽从不同的细胞膜或从不同的质膜结构域上无分别地发生,因此,由于不同的M蛋白寡聚作用而包含不同的脂-蛋白质比例。例如,由单体M蛋白形成的颗粒可以比由寡聚状态M蛋白形成的颗粒具有更高的脂-蛋白质比例。已知其它负链RNA病毒的M蛋白可以形成寡聚结构。Garoff等人,“Virus maturation by budding”Microbiol Mol Biol Rev 62:1171-90(1998)和Panch等人,“In vivo oligomerization and raft localization ofEbola virus protein VP40 during vesicular budding”Proc Natl AcadSci USA 100:15936-41(2003)。
C.糖蛋白的功能
据信感染性副粘病毒毒粒的形成包括HN和F糖蛋白二者的并入。在一个实施方案中,本发明包括一种组合物,当M蛋白与至少两种糖蛋白共表达时,该组合物包含糖蛋白并入副粘病毒VLP中。单糖蛋白共表达(即,例如HN+M或F+M)只导致痕量的HN或F糖蛋白并入VLP颗粒。另外,当HN和F糖蛋白与M蛋白一起共表达时,糖蛋白并入水平与至少四种蛋白质共表达时观察到的水平相当。
尽管不必理解本发明的机制,但相信这些结果表明M蛋白更加有效地与HN和F糖蛋白的复合物结合。这种可能性也被下列观察结果所支持,即这两种糖蛋白与M蛋白的共表达得到了具有更加均一和降低密度的副粘病毒VLPs。M蛋白VLP颗粒通常具有非常不一致的密度。M蛋白与任一种糖蛋白单独的共表达并不改变包含M蛋白的颗粒的大致的密度。相信这些结果表明M蛋白与HN-F蛋白复合物的相互作用影响VLPs的蛋白质-脂比例,或影响释放颗粒的膜。
应当注意并非M蛋白和病毒糖蛋白的任意组合都产生本文所包括的良好产量的副粘病毒VLPs。例如,当与在:i)与所有四种蛋白质共表达;ii)M蛋白与至少两种糖蛋白一起表达;和iii)M蛋白单独表达之后与观察到的VLP释放相比,单一糖蛋白和M蛋白的共表达导致40-60%的VLP释放抑制。实验研究揭示这种释放抑制被M蛋白与NP和另一种糖蛋白的共表达所解除。
尽管不必理解本发明的机制,但相信单一糖蛋白+M蛋白对VLP释放的抑制与观察结果一致,即NP+M蛋白VLP释放:i)当与表达至少四种蛋白质的细胞的释放相比,要低70%;和ii)当与只表达M蛋白的细胞的释放相比,要低80%。尽管不必理解本发明的机制,但相信细胞质中大量的NP可以将M蛋白拉离质膜,由此阻止其与这种膜的关联,从而阻止颗粒的出芽。因此,一种假说提示与另一种糖蛋白的共表达可以再次引导NP和M蛋白至细胞膜上,由此解除VLP的释放抑制。
D.囊泡蛋白质分选(VPS)系统和多泡体芽(MVB)
尽管不必理解本发明的机制,相信副粘病毒M蛋白依赖型VLP释放利用宿主囊泡蛋白质分选(VPS)系统。已经报道VPS系统介导其它包膜病毒的出芽。Morita等人,“Retrovirus budding”Annu RevCell Dev Biol.20:395-425(2004)和Pornillos等人,“Mechanisms ofenveloped RNA virus budding”Trends Cell Biol.12:569-79(2002)。
据认为逆转录病毒、丝状病毒和流感病毒的出芽依赖于宿主细胞的VPS途径。VPS途径还作用来形成MVB。Demirov等人,“Retrovirusbudding”Virus Res 106:87-102(2004);Jasenosky等人,“Filovirusbudding”Virus Res.106:1B1-8(2004);Morita等人,“Retrovirusbudding”Annu Rev Cell Dev Biol.20:395-425(2004);Pornillos等人,“Mechanisms of enveloped RNA virus budding”Trends Cell Biol.12:569-79(2002);Freed,E.O.,“Viral late domains”J.Virol.76:4679-87(2002)和Schmitt等人,“Escaping from the cell:assemblyand budding of negative-strand RNA viruses”Cuff Top MicrobiolImmunol 283:145-96(2004)。由内涵体膜内陷入内体腔(endosomallumen)中,由此生成囊泡内的囊泡,而形成MVB。Martindale,D.,“Budding viral hijackers co-opt the endocyticmachinery to make a getaway”J Biol.3:2(2003)。MVB形成的拓扑学类似于从质膜的病毒出芽的拓扑学。
有人提出病毒蛋白质侵占这种宿主细胞机构以引导病毒出芽。Demirov等人,“Retrovirus budding”Virus Res 106:87-102(2004);Martindale,D.,“Budding viral hijackers co-opt the endocyticmachinery to make a getaway”J Biol.3:2(2003)和Morita等人,“Retrovirus budding”Annu Rev Cell Dev Biol.20:395-425(2004)。目前,研究提示MVBs的形成涉及三种蛋白质复合物,第一种蛋白质复合物在酵母中表征,并统一命名为转运必需的内体分选复合物(Endosomal Sorting Complexes Required for Transport)(即,例如,ESCRT I、II和III)。Babst等人,“ESCRT-III:an endosome-associatedheterooligomeric protein complex 4required for MVB sorting”DevCell 3:271-282(2002);Jiang等人,“Multivesicular bodies:amechanism to package lytic and storage functions in one organelle?”Trends Cell Biol.12:362-7(2002);Katzmann等人,“Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathwayrequires the function of a conserved endosomal protein sortingcomplex,ESCRT-I”Cell 106:145-55(2001)和Katzmann等人,“Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVBsorting”J Cell Biol.162:413-23(2003)。此外,Vps4蛋白(即,例如,一种ATP酶)对于完整ESCRT复合物的解离是必需的。Raiborg等人,“Protein sorting into multivesicular endosomes”Cuff Opin CellBiol 15:446-55(2003)。
E.VLP的释放抑制
对大量病毒类型,绝大多数是逆转录病毒的研究,已经显示参与MVBs形成的细胞蛋白质由逆转录病毒gag蛋白和其它基质样蛋白,通过病毒晚期结构域与VPS途径的一种组分相互作用而招募。Demirov等人,“Retrovirus budding”Virus Res 106:87-102(2004);Morita等人,“Retrovirus budding”Annu Rev Cell Dev Biol.20:395-425(2004);Pornillos等人,“Mechanisms of enveloped RNAvirus budding”Trends Cell Biol.12:569-79(2002);44。已经发现Vps4、CHMP3和CHMP2的显性阴性突变体可以阻抑逆转录病毒释放。Strack等人,“PIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1p6andEIAV p9 functioning in virus budding”Cell 114:689-699(2003)。
尽管不必理解本发明的机制,但相信Vps4或Vps4A-E228Q的显性-阴性突变能够阻抑M蛋白副粘病毒VLP释放。进一步相信CHMP3(即,例如,ESCRT III复合物的一种亚基)的显性-阴性突变抑制M蛋白副粘病毒VLP释放。这些观察结果不仅表明VPS途径参与副粘病毒出芽(即,例如,VLP释放),还表明正是M蛋白直接与VPS途径相互作用。
最近报道SV5的VLP和病毒粒释放也被VSP4的显性阴性形式的表达所抑制,暗示SV5组装和释放中存在的VPS途径。Schmitt等人,“Evidence for a new viral late-domain core sequence,FPIV,necessary for budding of a paramyxovirus”J.Virol.79:2988-97(2005)。另外,据信SV5的M蛋白中的序列FPIV(SEQ ID NO:1)是晚期结构域。不过,已知SV5的M蛋白并不足以导致颗粒释放。Schmitt等人,“Requirements for budding of paramyxovirus simian virusvirus-like particles”J Virol 76:3952-64(2002)。因此,并不清楚SV5如何利用VPS途径或这一序列如何充当晚期结构域。
在一个实施方案中,NDV的M蛋白的序列分析也显示存在FPIV基序(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中,NDV的M蛋白进一步包含PXXP基序(SEQ ID NO:2)和YXXL基序(SEQ ID NO:3),上述序列在SV5的M蛋白中未发现。本领域鉴定的其它基序也可以作为其它副粘病毒M蛋白的晚期结构域;即,不依赖其它病毒蛋白质而作用于出芽的结构域。Demirov等人,“Retrovirus budding”Virus Res 106:87-102(2004);和Freed,E.O.,“Viral late domains”J.Virol.76:4679-87(2002)。
F.宿主特异性VLP的表达
在三种其它副粘病毒系统(仙台病毒(SV)、PIV1和SV5)中已经报道由人293T细胞表达病毒样颗粒,效率为18%-70%。Schmitt等人,“Requirements for budding of paramyxovirus simian virus virus-likeparticles”J Virol 76:3952-64(2002);Sugahara等人,“ParamyxovirusSendai virus-like particle formation by expression of multiple viralproteins and acceleration of its release by C protein”Virology325:1-10(2004)和Takimoto等人,“Role of matrix and fusion proteinsin budding of Sendai virus”J.Virol.75:11384-91(2001)。
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括通过使用来自病毒天然宿主的细胞来提高副粘病毒VLP释放的效率。在一个实施方案中,副粘病毒选自,包括但不限于,新城疫病毒、麻疹病毒、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒。在一个实施方案中,M蛋白副粘病毒VLP以90%的效率从鸟类细胞释放。在另一个实施方案中,M蛋白副粘病毒VLP以50%的效率从人293T细胞释放。另外,由COS细胞释放M蛋白VLP,以及完整VLP的效率比由鸟类细胞释放的效率显著更低;差异并不是因为COS细胞的病毒蛋白质表达水平低于鸟类细胞。尽管不必理解本发明的机制,但相信副粘病毒VLP形成效率之间的差异可以归因于宿主细胞特异性的依赖。
已知在其它副粘病毒系统中对于VLP形成的蛋白质需求也不同。例如,认为包含SV、hPIVl和SV5的M蛋白的副粘病毒系统参与引导病毒组装和出芽,但M蛋白在实际颗粒形成中的作用有差异。Coronel等人,“Human parainfluenza virus type 1 matrix andnucleoprotein genes transiently expressed in 12 mammalian cellsinduce the release of virus-like particles containing 13nucleocapsid-like structures”J.Virol.73:7035-8(1999);Schmitt等人,“Req uirements for budding of paramyxovirus simian virusvirus-like particles”J Virol 76:3952-64(2002);Sugahara等人,“Paramyxovirus Sendai virus-like particle formation by expressionof multiple viral proteins and acceleration of its release by C protein”Virology 325:1-10(2004)和Takimoto等人,“Role of matrix and fusionproteins in budding of Sendai virus”J.Virol.75:11384-91(2001)。与NDV的M蛋白相似,SV和hPIVl的M蛋白足以导致颗粒释放,不过SV5的M蛋白则不足以致此。SV5的M蛋白与NP和至少一种糖蛋白的共表达对于有效形成和释放SV5的VLP是必需的。Schmitt等人,“Requirements for budding of paramyxovirus simian virusvirus-like particles”J Virol 76:3952-64(2002)。
在一个实施方案中,本发明包括只有M蛋白,并且没有其它副粘病毒蛋白质,可以单独引导VLP颗粒释放。以往的研究确实表明SV的F蛋白可以显示出自发胞外分泌活性,所述活性通过只包含F蛋白的囊泡的释放而得以证实。Sugahara等人,“Paramyxovirus Sendaivirus-like particle formation by expression of multiple viral proteinsand acceleration of its release by C protein”Virology 325:1-10(2004)和Takimoto等人,“Role of matrix and fusion proteins in budding ofSendai virus”J.Virol.75:11384-91(2001)。
相反地,本发明包括的细胞单独表达NDV的F蛋白,并不释放包含F蛋白的物质,并且单独表达HN蛋白的细胞只释放痕量的包含HN蛋白的极轻密度物质进入细胞上清液。这些观察结果类似于其它报告,所述报告显示单独SV5的F或HN糖蛋白的表达并不导致VLP颗粒释放。Schmitt等人,“Requirements for budding ofparamyxovirus simian virus virus-like particles”J Virol 76:3952-64(2002)。尽管不必理解本发明的机制,但相信尽管观察到SV的F和其它包膜的负链病毒糖蛋白已经显示展现出芽活性,在任何病毒糖蛋白中尚未鉴定出晚期结构域。Schmitt等人,“Escaping from the cell:assembly and budding of negative-strand RNA viruses”Cuff TopMicrobiol Immunol 283:145-96(2004)。
本发明的包括M蛋白和NP共表达的实施方案也与在SV系统中所报告的相反。例如,已知同时表达SV的M和NP导致包含两种病毒蛋白质的VLPs的释放。Sugahara等人,“Paramyxovirus Sendaivirus-like particle formation by expression of multiple viral proteinsand acceleration of its release by C protein”Virology 325:1-10(2004)。
G.蛋白质-蛋白质相互作用
本发明包括利用NDV作为原型副粘病毒以阐明每种副粘病毒蛋白质在颗粒组装和释放中的作用。利用这种模型,某些实施方案整合了对于组装和释放VLPs所要求的病毒蛋白质的规定,其特征是在由不同病毒蛋白质组合形成的VLPs中的蛋白质-蛋白质相互作用。
另外,在本发明的一些实施方案中,本发明包括将M蛋白与病毒糖蛋白共定位于质膜中。尽管不必理解本发明的机制,但相信本文所示的数据显示颗粒组装涉及具体蛋白质-蛋白质相互作用的网络,并且有可能将蛋白质的靶向校正至特定细胞结构域。
在一个实施方案中,本发明包括三种和四种蛋白质(即,例如,当通过共同免疫沉淀所定义)的所有组合的VLP蛋白质相互作用形式。在另一个实施方案中,当以与M和NP蛋白的不同组合表达时,将细胞表面HN和F蛋白与M蛋白一起共定位。在另一个实施方案中,两种病毒蛋白质与M蛋白的共表达也显著增强M蛋白与HN或F蛋白在质膜中的共定位,表明与M蛋白的相互作用增强。
为了定义这些蛋白质-蛋白质相互作用,用非离子性去污剂溶解由三种和四种蛋白质的不同组合形成的VLPs,并且以针对M、HN或F蛋白的单特异性抗体的混合物来沉淀蛋白质。首先,每种抗体混合物沉淀所有来自VLP的蛋白质,所述VLP由M、HN、F和NP形成,尽管每种蛋白质的沉淀效率随着抗体特异性而不同。尽管不必理解本发明的机制,但相信这些结果与所有四种蛋白质之间的相互作用网络一致,从而一种蛋白质沉淀导致其它三种蛋白质的沉淀,但效率由蛋白质与沉淀蛋白质的关联程度决定而不同。
蛋白质-蛋白质相互作用由来自VLPs的蛋白质的免疫沉淀更加清楚地定义,所述VLPs由三种蛋白质的所有组合形成。这些结果显示HN和M蛋白之间,NP和M蛋白之间,以及F蛋白和NP之间的特定相互作用。(见,附图66)。未直接观察到F蛋白和M蛋白之间的直接相互作用,但在F和HN蛋白之间有可能有弱相互作用,因为抗F蛋白抗体沉淀来自VLPs的HN蛋白,所述VLPs包含M、HN和F蛋白。F和M蛋白明显没有相互作用提示F蛋白并入这些VLP中可以通过与HN蛋白的相互作用来介导。或者,HN蛋白和NP之间的相互作用也可能促进并入过程。
因而,当所有四种蛋白质共表达时,NP和HN蛋白通过与M蛋白的直接相互作用而并入VLPs。(见,附图66)。尽管不必理解本发明的机制,但相信F蛋白有可能由于与NP和HN蛋白的相互作用而间接被并入。另外相信当所有四种蛋白质共表达时,四种蛋白质的有序复合物被M蛋白与F蛋白以及M蛋白与HN蛋白在质膜中的共定位而支持。
不过,当只有F与M蛋白一起表达时,F蛋白有可能不明显地被并入VLPs中,因为并未观察到这两种蛋白质之间的直接相互作用。(见,附图66)。支持这种结论的是在这些细胞的质膜中没有观察到F和M蛋白的共定位。
尽管M与NP有直接关联,当NP和M蛋白在匹配组合中共表达时,只有少量NP蛋白并入VLPs中。以往的报道显示仙台病毒的M蛋白在细胞质中被病毒核壳体所招募。Stricker等人,“The Sendaivirus matrix protein appears to be recruited in the cytoplasm by theviral nucleocapsid to function in viral assembly and budding”J GenVirol 75(Pt 5):1031-1042(1994)。也许NP引起M蛋白再次靶向到这一隔室。事实上,M蛋白与NP的共表达导致包含M蛋白的VLP释放的2.5倍抑制,此结果也与细胞中的M蛋白被NP蛋白所持滞相一致。
尽管由M、HN和F蛋白形成的VLP蛋白的共同免疫沉淀表明HN蛋白与M蛋白的直接相互作用,但当HN和M蛋白在匹配组合中共表达时,只有低水平的HN蛋白并入到VLPs中。另外,两种蛋白质在质膜中有少量的共定位。也许在缺失其它蛋白质的情况下,HN和M蛋白在细胞相同区域中显示最小量的共定位,由此防止它们的关联。或者,也有可能HN蛋白跨膜或胞质尾巴的构象在F蛋白或NP蛋白表达缺失的情况下可能是不同的,所述F蛋白或NP蛋白抑制HN蛋白与M蛋白的关联。目前并不能解释在HN蛋白与M蛋白共表达之后M蛋白VLPs减少50%,但类似的结果先前已经在仙台病毒系统中报道过。Sugahara等人,“Paramyxovirus Sendai virus-like particleformation by expression of multiple viral proteins and acceleration ofits release by C protein”Virology 325:1-10(2004)。
应当意识到免疫沉淀并非产生纯化VLPs所必需的。在一个实施方案中,本发明包括一种包含纯病毒蛋白质的VLP制剂。在纯化的NDV完整病毒和未进行免疫淀淀的VLPs之间比较蛋白质组成。数据显示VLP制剂并不包含不存在于完整病毒制剂中的任何蛋白质。见,附图72。因此VLPs与完整病毒一样纯。
尽管不必理解本发明的机制,但相信由NP、M和F蛋白形成的VLPs有可能归因于M和NP之间的相互作用以及F和NP之间的相互作用。(见,附图66)。例如,F蛋白可以将NP重新定位到质膜上,将M拉至包含F蛋白的特定结构域上。事实上,本文所示的数据显示添加NP增强M蛋白与F蛋白在质膜中的共定位。另外相信由NP、M和HN蛋白形成的VLPs有可能归因于两种HN蛋白和NP与M蛋白的相互作用而形成。本文所示的数据显示NP与HN和M蛋白一起表达增强M和HN蛋白在质膜上的共定位。一种可能的假说提示NP-M蛋白相互作用改变M的构象,由此促进其与HN蛋白的相互作用。事实上,在NP存在时表面HN蛋白沿着细胞边缘似乎更加断断续续。
上面提出的相互作用的这种网络能够得出以下结论,即HN和F蛋白的细胞质结构域(CT)具有冗余功能。Schmitt等人,“Requirementsfor budding of paramyxovirus simian virus 5virus-like particles”JVirol 76:3952-3964(2002)。例如,F蛋白的CT结构域通过与NP蛋白的相互作用可以将NP-M复合物靶向至质膜上,而HN蛋白CT结构域通过与M蛋白直接相互作用的功效靶向这些复合物。
使用仙台病毒的研究支持由本文数据所提示的M蛋白和NP的相互作用。Stricker等人,“The Sendai virus matrix protein appears tobe recruited in the cytoplasm by the viral nucleocapsid to function inviral assembly and budding”J Gen Virol 75(Pt 5):1031-1042(1994)。另外,HN蛋白与其它病毒蛋白质的可能相互作用与许多研究一致,所述研究提示在副粘病毒感染的细胞或副粘病毒cDNA转染的细胞中存在M蛋白与病毒糖蛋白的相互作用。Ali等人,‘Assembly of Sendaivirus:M protein interacts withFand HN proteins and with thecytoplasmic tail and transmembrane domain ofFprotein”Virology276:289-303(2000);Ghildyal等人,“Interaction between therespiratory syncytial virus G glycoprotein cytoplasmic domain andthe matrix protein”J Gen Virol 86:1879-1884(2005);Henderson等人,“Sorting of the respiratory syncytial virus matrix protein intodetergent-resistant structures is dependent on cell-surface expressionof the glycoproteins”Virology 300:244-254(2002);Sanderson等人,“Sendai virus assembly:M protein binds to viral glycoproteins intransit through the secretory pathway”J Virol 67:651-663(1993)和Yoshida等人,“Membrane(M)protein of HVJ(Sendai virus)-Its rolein virus assembly”Virology 71:143-161(1976)。事实上,已经报道过呼吸道合胞病毒G蛋白与M蛋白特异性相互作用。不过,以往没有报道F蛋白和NP之间的直接相互作用。有可能病毒蛋白质之间的相互作用在副粘病毒内不同,形成VLPs的必要条件可能依赖于晚期结构域在病毒蛋白质上的分布。本文给出的结果与以下提议一致,即在其它病毒蛋白质缺失的情况下,NDV的M蛋白从不同的细胞膜上无分别地出芽和释放。尽管不必理解本发明的机制,但相信当糖蛋白和M蛋白都存在于质膜中时,M蛋白-质膜关联的稳定性提高。另外相信NP与F和M蛋白的关联也可以进一步稳定并组织组装颗粒内相互作用的网络。
这种蛋白质-蛋白质相互作用网络假说已经得到下列观察结果的支持,即比较完整病毒(B1)与仅用M蛋白形成的VLPs,以及用NP、M、F和HN蛋白形成的VLPs的电子显微照片。见,附图73。当存在所有四种病毒蛋白质时,VLP大小和形状非常类似于完整病毒。不过,当与完整病毒相比时,只有M蛋白的VLP大小和形状更加不一致,但仍然明显相似。
在一个实施方案中,本发明包括一种NDV的VLP生产系统。在一个实施方案中,M蛋白促进NDV的VLP出芽,从而NDV的VLP出芽在缺失M蛋白时完全不存在。在其它实施方案中,参与颗粒的有序组装的VLPs中出现特定蛋白质-蛋白质相互作用。在一个实施方案中,M和HN或F和NP之间的相互作用引导M和NP入质膜内的组装位置位点。
III.副粘病毒疾病
本发明并不限于NDV、麻疹、副流感病毒3型和呼吸道合胞副粘病毒疾病。许多其它副粘病毒疾病也在本发明的范围之内。例如,包括人疾病(见表1)和动物疾病(见表2)。
表1:对VLP疫苗接种易感的副粘病毒介导的人疾病
病毒类型 | 疾病类型 | 目前的疫苗接种 |
副流感(1、2、3和4)病毒 | 急性呼吸道感染 | 无 |
腮腺炎病毒 | 儿童期疾病 | 活体减毒病毒 |
麻疹病毒 | 儿童期疾病 | 活体减毒病毒 |
呼吸道合胞病毒 | 严重呼吸道感染 | 无 |
尼帕病毒 | 突发性感染急性神经疾病 | 无 |
亨得拉病毒 | 突发性感染急性神经疾病 | 无 |
肺炎后病毒(Metapneumovirus) | 急性呼吸道感染 | 无 |
表2:对VLP疫苗接种易感的副粘病毒介导的动物疾病
病毒类型 | 动物物种 |
犬瘟热 | 犬 |
牛瘟 | 牛 |
肺炎病毒 | 鸟类 |
A.新城疫
新城疫病毒(NDV)是一种鸟类病原。在世界许多地区已经分离了这种病毒的不同病毒株。一些病毒株是无毒的并且被用作活体减毒疫苗。其它是有毒力的并且引发鸟类严重的全身性疾病,死亡率高。由于对家禽产业的威胁,美国政府已经将毒性NDV株分类为爱国者法案(Patriots Act)下的选择剂。
美国的大多数鸡接种了无毒NDV株。不过,目前的疫苗并不理想。所述疫苗,是活体减毒病毒,感染鸡并引发轻度呼吸道疾病。结果,接种过的鸟类比未接种的鸟类体重更轻并且产蛋更少。为此,许多其它国家并不针对NDV接种疫苗。因而,在这些国家有该疾病的周期性爆发,被迫宰杀大量鸟类以控制该病。经过接种的鸡群也可以对一些NDV病毒株易感。因此,在美国有新城疫病毒爆发。例如,2001-2002在加利福尼亚有NDV爆发。
需要一种NDV疫苗,其不会导致生产力降低并且能够诱导比目前所用的疫苗更加广泛的保护范围。
在鸟类中,NDV的临床证据包括,但不限于,呼吸、神经和胃肠道系统。主要在幼鸟中观察到新城疫临床病征的提示。共同的症状包括,但不限于,不能走或飞翔、圈形行走、瘫痪、颈部扭曲、萎靡不振和高频率的突然死亡。在哺乳动物中,新城疫的症状包括,但不限于,急性结膜炎。
目前所用NDV疫苗的显著问题是不能防治所有NDV株。目前,有时使用灭活的NDV疫苗(即,减毒的)接种鸟类群体。尽管消除了活体病毒接种的有害作用,但这些疫苗仍然具有缺点,即它们并不刺激广谱的免疫反应。另外,不完全的减毒导致一定比例的接种鸟类感染新城疫。这些疫苗也比本发明包括的实施方案花费更高,因为灭活以及监测灭活效果需要增加操作。
目前所用NDV疫苗(活体病毒或灭活病毒)的另一个问题,是难以区分已经接种过的鸟类和感染了野生病毒的鸟类。本发明包括并入VLP制剂的抗原,所述VLP制剂包含序列标签。在一个实施方案中,所述序列标签可以在体内检测,由此鉴定接种过的动物。
B.麻疹
据信麻疹是一种儿童期感染,其特征是发热、咳嗽、感冒(即,例如,上呼吸道感染或炎症),以及经常有结膜炎,并随后出现斑丘疹。已经观察到病毒的严重性随着病毒株以及被感染儿童的健康状况而变化。在大多数儿童中,恢复是完全的。不过,有低发生率的变化严重性的神经学并发症。另外,营养不良或另一种潜在疾病可以显著增强疾病的严重性。此外,感染是免疫抑制性的,导致儿童对其它威胁生命的感染的易感性提高,特别是在第三世界环境中。
目前所用的疫苗是活体减毒的病毒,其可有效生成保护性免疫反应。不过,免疫年龄是有问题的。接种过早导致归因于母体抗体的微弱抗体反应。提高剂量以克服这一作用,导致免疫抑制并提高对其它潜在威胁生命感染的易感性。较晚的接种使得幼儿处于在免疫前但在母体抗体水平降低后的染病危险中。因而需要一种疫苗,其将在母体抗体存在的情况下产生有效免疫反应,并且更加重要的是,需要一种在任何剂量上都不会发生免疫抑制的疫苗。在一个实施方案中,本发明包括VLPs是这种疫苗的候选物。
本发明的某些实施方案提供病毒样颗粒(VLPs)作为安全、广谱和有效的疫苗来保护哺乳动物抗麻疹病毒。此外,这些实施方案提供大规模地、经济地生产麻疹VLP疫苗的系统和方案(即,例如,为了用作疫苗,VLP生产必须简易和经济)。
本发明包括生成麻疹病毒株的VLPs的条件。在另一个实施方案中,所述VLPs包含相同的主要抗原作为感染性病毒(但是,当然,缺少完整病毒基因组)。在另一个实施方案中,所述VLPs包含具有相同比例的主要抗原作为感染性病毒。在一个实施方案中,主要抗原选自核壳体蛋白、膜/基质蛋白、血凝素蛋白质和融合蛋白。
本发明的其它实施方案提供了来自许多不同麻疹病毒株的抗原,其可以并入单一VLP制剂中。目前所用麻疹疫苗的显著问题是不能防治所有麻疹病毒株。
麻疹被认为是一种高度传染性的病毒性疾病,主要症状包括,但不限于,发热、咳嗽、结膜炎(即,眼膜中发红和炎症)和扩散性皮疹。病毒感染可以通过接触被感染人员的鼻、口或喉的液滴而传播。在症状常规出现前的潜伏期为8到12天。
对疾病的免疫性在接种或活性感染后出现。目前,接种限于减毒的活体病毒,其具有在接种受试者中引发麻疹的很大危险。另外一些人认为麻疹-腮腺炎-风疹疫苗可以引发孤独症。在广泛免疫之前,麻疹在儿童中如此普遍,以致于大部分人群到20岁时都曾被感染过。由于广泛的免疫,麻疹病例在过去几十年中在美国和加拿大下降至几乎没有,但目前比率在上升。所以,公众担心导致更低的接种率,这可以引发麻疹、腮腺炎和风疹的严重爆发。本发明的一个实施方案的优点是VLP非复制性麻疹疫苗没有感染的危险。因而预期VLP疫苗产生高得多的医患配合率,随后麻疹发生率将显著下降。
在一个实施方案中,麻疹症状包括,但不限于,喉咙痛、流鼻涕、咳嗽、肌肉疼痛、发热、眼睛充血、口内小白点(叫做Koplik氏斑点)、畏光(光敏症),在大约疾病第五天附近出现的皮疹并持续4-7天,其通常起始于头部并扩散到其它区域,向下发展(所述皮疹可能是斑丘疹,表现为斑(扁平、无色区域)和丘疹(实体、红色、突出区域),其后来合并在一起(汇合的)),进一步皮诊可能发痒。
没有针对麻疹的特异性治疗,尽管一些儿童可能需要补充维生素A。用卧床休息、对乙酰氨基酚和湿润空气可能减轻症状。在简单病例中可以有很好的结果。不过,肺炎或脑炎是可能的并发症。
C.呼吸道合胞病毒
据信呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界婴幼儿呼吸道感染住院治疗的单独的最常见原因。再次感染也经常发生。对于全部婴儿群体来说RSV感染率据估计在100%和83%之间,并且估计其中50%在生命最早的两年期间经历过两次或更多次感染(在Collins等人,RespiratorySyncytial Virus,in Fields Virology,Ed.Knipe,D.and Howley,P.Lippincott Williams and Wilkins,2001中综述)。RSV也日益被认为是老年人的严重病原。
目前,没有可用于这种病原的疫苗。用福尔马林灭活的病毒制剂的早期治疗具有灾难性作用,即在接触活体病毒后,增强了疾病的严重性。此外,蛋白质亚基疫苗在实验动物中具有类似影响。推测通过福尔马林处理或通过个别蛋白质的表达和纯化诱导的具有异常构象的蛋白质,导致刺激保护性免疫反应的表位的损失。动物研究提示免疫病理归因于免疫细胞(在Collins等人,Respiratory Syncytial Virus,inFields Virology,Ed.Knipe,D.and Howley,P.Lippincott Williamsand Wilkins,2001中综述)。用RSV蛋白质形成的VLPs将有可能以其天然构象并入病毒蛋白质。这些免疫原有潜力刺激保护性免疫反应并且避免未折叠蛋白质的副作用。
本发明某些实施方案提供病毒样颗粒(VLPs)作为安全、广谱和有效的疫苗来保护哺乳动物免受呼吸道合胞病毒(RSV)感染。此外,这些实施方案提供大规模地、经济地生产RSV的VLP疫苗的系统和方案(即,例如,为了用作疫苗,VLP生产必须简易和经济)。
本发明包括有效生成毒性RSV株的VLPs的条件。在另一个实施方案中,所述VLPs包含相同的主要抗原作为感染性病毒。在另一个实施方案中,所述VLPs包含具有相同比例的主要抗原作为感染性病毒。在一个实施方案中,主要抗原选自核壳体蛋白、膜/基质蛋白、G或附着蛋白和融合蛋白。
本发明的其它实施方案提供了来自许多不同RSV株的抗原,其可以并入单一VLP制剂中。目前所用RSV疫苗的显著问题是不能防治所有的RSV株。
呼吸道合胞病毒(RSV)被认为是引起成人和较大健康儿童中度感冒样症状的非常常见的病毒。RSV可以引起幼儿严重的呼吸道感染,特别是早产儿、患有心脏或肺病的幼儿或无免疫应答的幼儿。
据信RSV是婴幼儿中最常见的呼吸道病原。具体地,相信到两岁时,RSV感染几乎所有的婴儿。每年都发生急性呼吸道疾病的季节性爆发,其在每个地区的时间表在某种程度上是可预测的。发生季节通常开始于秋季并延续至春季。
RSV可以通过身体接触轻易传播,其包括,但不限于,与被感染受试者接触、亲吻和握手。尽管不必理解本发明的机制,但相信RSV传播通常是通过与受污染分泌物相接触,其可以包括小的液滴或液滴碰到的物体。RSV在皮肤表面可以存活半小时或更长。还相信RSV也可以在工作台上存活高达五小时并且在用过的纸巾上存活若干小时,因此,RSV经常在拥挤的居室和日托中心非常迅速地传播。
在一个实施方案中,本发明包括一种VLP RSV疫苗,其预防婴儿和青年人疾病的发展,所述疾病如,但不限于,肺炎、细支气管炎(肺部小气管的炎症)和气管支气管炎(假膜性喉炎)。在一个实施方案中,本发明包括一种VLP RSV疫苗,其预防健康成年人和较大儿童中的中度呼吸道疾病。
缺少安全有效的RSV疫苗造成了显著的公共安全和健康危险。例如,相信多达125,000个婴儿由于严重的RSV疾病而住院治疗;这些婴儿中的大约1-2%死亡。另外,i)早产;ii)患有慢性肺病;iii)无免疫应答的;或iv)患有某种形式的心脏病的婴儿患严重RSV疾病的危险提高。甚至暴露于烟草烟雾、参加日托、生活在拥挤条件中或有学龄期兄弟姐妹的成人也处于感染RSV的更高危险中。
在一个实施方案中,本发明包括RSV症状,其包括,但不限于,鼻充血、鼻翼煽动、咳嗽、呼吸急促(呼吸促迫)、呼吸困难或强力呼吸、气短、青紫症(由缺氧引发的皮肤发青)、哮喘、发热或喉炎性咳嗽(经常表述为″海豹″咳嗽)。应当意识到所述症状随着年龄变化和不同。例如,一岁以下的婴儿受到最严重影响并且经常具有最困难的呼吸(the most trouble breathing)。相反地,较大的儿童通常只有中度感冒样的症状。一般,症状在接触后4-6天出现。
由于对于活性RSV感染没有已知的治疗方案,所以本领域技术人员已经考虑预防性药物。例如,已经批准(palivizumab)用于24月龄以下儿童的预防RSV疾病,这些儿童具有患严重RSV疾病的高度危险。不过必须经过开具处方并且成月给药以提供完全的保护。
D.副流感3型(PIV 3)
据信PIV3是呼吸道疾病(鼻炎、咽炎、喉炎、细支气管炎和肺炎)的常见病因。这种病毒是住院儿科患者呼吸道感染的第二常见病因。尚无针对PIV 3的疫苗。已经考虑过许多不同的方法进行接种,但都没有得到许可的疫苗。(在Chanock等人,Parainfluenza Viruses,inFields Virology,Ed.Knipe,D.and Howley,P.Lippincott Williamsand Wilkins,2001中进行综述)。
在生理上,PIV 3通常感染上和下呼吸系统。目前,已知五种血清型的副流感病毒(1、2、3、4a和4b),其全部都与引发疾病相关联。据信儿童对于副流感最易感,并且占所有假膜性喉炎病例的大约40%到50%,占细支气管炎和支气管炎及一些肺炎的10%到15%。在一般群体中,副流感的发生率未知,但怀疑是非常高的。只引发鼻涕和感冒样症状的病可以视为简单感冒而非副流感。危险因素包括年龄小。到学龄时,大多数儿童已经接触过副流感病毒。大多数成人有针对副流感的抗体,尽管它们可以反复感染。
据信喉气管支气管炎(即,例如,假膜性喉炎)是副流感病毒感染的常见临床症状。偶而发现副流感病毒与其它儿童呼吸道感染相关联,如气管支气管炎、细支气管炎和支气管肺炎。偶而,在副流感病毒感染后见到中度非特异性疾病。在北半球和南半球的整个温带的儿童中,副流感病毒整年都造成疾病,但高峰流行率发生在呼吸道感染(特别是假膜性喉炎)的冬季爆发期间。副流感病毒感染主要是儿童期疾病,对于假膜性喉炎的最高的年龄特异性侵染率发生在3岁以下儿童中。通过血清流行病学研究测定,血清型3型感染发生最早且最频繁,从而使得美国50%儿童在生命的第一年期间被感染,并且到6岁时几乎所有儿童被感染。
副流感病毒一般通过吸入被感染的液滴核进入宿主。病毒在整个气管支气管网中繁殖,诱发产生粘液。喉咙的声带变得粗肿,引发阻塞空气流入,其表现为吸气喘鸣。在成人中,病毒通常限于引发呼吸道上面部分的炎症。在婴儿和幼儿中,偶而涉及支气管、细支气管和肺,这可能反映了气管小以及相对不成熟的免疫性。病毒血症既非感染的必要阶段也非普遍阶段。
一般,儿童可能呈现假膜性咳嗽、吸气喘鸣、声音嘶哑或叫喊和吸气困难,并且通常无热。大约80%的患者在咳嗽发作前1-3天开始呈现咳嗽和流鼻涕。在整个肺部区域经常听到呼吸诊音。放射学检查一般正常。偶而会厌粗肿并发红。可能继发严重的气管阻塞,必须实施紧急气管切开术。
IV.VLP疫苗
副粘病毒VLP疫苗在本领域中是新的。而病毒颗粒疫苗是已知的,这些疫苗需要破坏纯化的病毒,提取基因组,并用病毒蛋白质和脂重新组装颗粒以形成包含病毒蛋白质的脂颗粒。这种方法的成本非常高。另外,由于起始材料是活体病毒,疫苗有被活体病毒污染的危险。此外,得到的疫苗不太可能是广谱疫苗。另外,针对这一疫苗的免疫反应不能与病毒感染相区别。
据信副粘病毒VLPs是亚基疫苗的高度有效类型,其模仿完整的病毒结构,而不包含导致宿主细胞感染的遗传物质。例如,病毒样颗粒可以完全缺乏DNA或RNA基因组,同时保留病毒衣壳蛋白的真正构象。因此,VLP是非感染性的。另外,包含病毒衣壳蛋白的病毒样颗粒可以进行类似于真正病毒的自发性自组装。不过,已知多瘤病毒VLP制剂在本领域的发展程度非常低。Noad等人,“Virus-likeparticles as immunogens”Trends Microbiol 11:438-444(2003)。
在一个实施方案中,本发明包括含有副粘病毒VLP的疫苗。在一个实施方案中,所述副粘病毒选自包括,但不限于,新城疫、麻疹、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒的组。在一个实施方案中,VLP包含M蛋白。在另一个实施方案中,VLP进一步包含至少两种糖蛋白。在一个实施方案中,糖蛋白选自F蛋白和HN蛋白。
A.新城疫病毒
本发明的某些实施方案提供病毒样颗粒(VLPs)作为安全、广谱和有效的疫苗,以保护家离免受新城疫病毒感染。此外,这些实施方案提供大规模经济地生产VLPs的系统和方案(即,例如,为了可用作疫苗,VLP生产必须容易且经济)。
将生长在卵中的完整病毒(B1)的银染比较与生长在大规模组织培养物中的VLPs相比较,表明VLPs以微克的量生产(即,足以在小鼠中进行免疫原性测试)。见,附图74。已经从大量介质中快速纯化VLPs以推动大规模VLP生产技术。见,表3。
表3:大规模VLP制备
制剂1被白蛋白污染,其与F蛋白共同迁移。所以,当与NP比较时,制剂1中F的量似乎提高了。这种白蛋白污染在制剂2和3中被成功地消除。
尽管不必理解本发明的机制,但相信生长在卵中(本领域标准性的)的病毒(B1)缺乏HN和F糖蛋白(典型的无毒(AV)病毒颗粒),而不像目前公开的VLP生产方法,其中病毒(AV)VLP包含HN和F糖蛋白。在一个实施方案中,本发明包括含有NVD VLP的改进疫苗,所述VLP包含HN和F糖蛋白。
本领域已经报道过NDV亚基蛋白质表达。例如,电子显微镜检查来自感染了表达新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的重组杆状病毒的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞培养物的负染色细胞外液(ECF)揭示了NDV样的包膜,其类似真正NDV的包膜。用抗NDV的HN单克隆抗体免疫金染证实了在NDV样包膜上的刺突中的HN抗原。来自重组感染培养物的ECF也包含杆状病毒颗粒,其类似标准杆状病毒颗粒,除了一些显示包膜的极性突起。不像本发明中所包括的实施方案,据推断NDV的HN,在缺少基质蛋白(即,M蛋白)时,可能能够起始和控制病毒包膜的生产,所述包膜在形态上与真正NDV的包膜相同。Nagy等人,“Synthesis of Newcastle diseasevirus(NDV)-like envelopes in insect cells infected with a recombinantbaculovirus expressing the haemagglutinin-neuraminidase of NDV”JGen Virol.72:753-756(1991)。
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括一种在商业上可用的NDV的VLP疫苗。在一个实施方案中,NDV的VLP疫苗的生产是经济并有效的。在另一个实施方案中,用NDV的VLP疫苗进行免疫刺激广谱的保护性抗体的产生。在一个实施方案中,鸟类细胞系持续地表达至少四种NDV糖蛋白。
在一个实施方案中,本发明包括在瞬时表达系统中生产NDV的VLP疫苗的方法。在一个实施方案中,该系统包含转染了编码至少一种NDV病毒糖蛋白的核酸(例如,在质粒、表达载体等中)的鸟类细胞。在一个实施方案中,该系统包含具有选择病毒基因作为鸟类细胞染色体一部分的鸟类细胞系,其中整合的病毒基因持续释放用作疫苗的NDV的VLP颗粒。在一个实施方案中,病毒基因包含病毒糖蛋白。在一个实施方案中,病毒糖蛋白选自NP蛋白、M蛋白、F-K115Q蛋白质或HN蛋白。
在一个实施方案中,本发明包括产生含有针对NDV许多不同NDV株的抗原的VLPs的方法。尽管不必理解本发明的机制,但相信整合的NDV疫苗赋予比目前疫苗更广泛的保护范围。在一个实施方案中,本发明包括一种VLP疫苗表达系统,其包含编码来自第一种病毒株的第一种病毒蛋白质的第一种cDNA;编码来自第二种病毒株的第二种病毒蛋白质的第二种cDNA和编码来自第三种病毒株第三种病毒蛋白质的第三种cDNA。在一个实施方案中,第一种病毒蛋白质基因选自HN蛋白、F蛋白、NP蛋白或M蛋白。在一个实施方案中,第一种病毒株选自包含Hertz株、AV株或B1株。在一个实施方案中,第二种病毒蛋白质基因选自HN蛋白、F蛋白、NP蛋白或M蛋白。在一个实施方案中,第二种病毒株选自包含Hertz株、AV株或B1株。在一个实施方案中,第三种病毒蛋白质基因选自HN蛋白、F蛋白、NP蛋白或M蛋白。在一个实施方案中,第三种病毒株选自包含Hertz株、AV株或B1株。在一个实施方案中,本发明包括一种检测整合入VLP疫苗中的病毒蛋白质基因的方法,其包括将病毒蛋白质基因与病毒株特异性抗体或整合序列标签相接触。
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括生产NDV的VLP疫苗的杆状病毒表达系统。尽管不必理解本发明的机制,但相信杆状病毒表达系统能够达到所有可得的表达系统中最高的蛋白质表达水平。在一个实施方案中,杆状病毒表达系统产生毫克级的VLP疫苗。在一个实施方案中,用杆状病毒表达载体编码NDV的VLP疫苗。在一个实施方案中,编码NDV的VLP疫苗的杆状病毒表达系统转染昆虫细胞。在一个实施方案中,杆状病毒载体包含至少四种NDV结构蛋白质。对于要成为实际疫苗候选物的VLP来说,它需要在适于大规模生产的安全表达系统中生产。对于VLP生产来说,基于昆虫细胞的蛋白质生产系统具有许多优点。第一是可以在真核细胞的高密度细胞培养条件下产生大量的重组蛋白质,导致可以正确折叠抗原的高度恢复。第二,由于用于疫苗生产的昆虫细胞可以在没有哺乳动物细胞衍生添加剂存在下进行培养,使得培养偶发病毒的危险最小化。第三,用于重组蛋白质表达的杆状病毒具有狭窄的宿主范围,其只包括少数几种鳞翅目(Lepidoptera)物种,因此对于接种个体没有威胁。第四,杆状病毒易于被简单的化学处理灭活,并且主要位于昆虫细胞制剂的核以及培养基中,由此从细胞质提取物中可以纯化大多数的VLPs。最后,杆状病毒系统可以扩大规模用于大规模疫苗生产。
B.麻疹
在一个实施方案中,本发明包括一种包含麻疹病毒样颗粒的麻疹疫苗,其中所述颗粒包含麻疹病毒基质蛋白。在一个实施方案中,所述疫苗进一步包含至少两种麻疹病毒糖蛋白。
已经提议对麻疹副粘病毒使用VLP疫苗,但在酵母细胞中只有逆转录病毒HIV的VLP生产得到证实。Morikawa Y.,“Virus-likemicrograins and process of producing the same”美国专利申请公开序号20040009193(2004)。此种提出的技术局限于真核细菌性细胞中的VLP表达,并且未提出杆状病毒或哺乳细胞培养技术。另外,没有显示这些真核性VLP疫苗在事实上是安全有效的。更重要的是,如Garoff等人,同上所述,Morikawa的VLP麻疹疫苗依赖于IV型出芽。本文所述的一些实施方案清楚地表明核酸核心并非副粘病毒出芽所必需;如Garoff等人所教导的。
提出的可用于发展副粘病毒麻疹疫苗的另一种方法包括通过施用DNA疫苗的基因治疗技术。Robinson等人,“Compositions andmethods for generating an immune response”美国专利申请公开序号20040105871(2004)。宿主基因组被包含HIV DNA VLP疫苗的表达盒稳定转染已经证实了这种技术。还见,Mazzara等人,“Self assembled,defective,nonself-propagating viral particles”美国专利序号5,804,196(1998)(在此并入作为参考)。
其它的基因治疗方法建议在体内或体外将活体减毒麻疹病毒并入表达载体中以生产疫苗。不过,未包括VLPs作为麻疹病毒疫苗。HeroldJ.,“SARS-coronavirus virus-like particles and methods of use”美国专利申请公开序号20050002953(2005)。
C.呼吸道合胞病毒
在一个实施方案中,本发明包括含有呼吸道合胞病毒样颗粒的呼吸道合胞病毒疫苗,其中所述颗粒包含呼吸道合胞病毒基质蛋白。在一个实施方案中,该疫苗进一步包含至少两种呼吸道合胞病毒糖蛋白。
已经公开了VLPs用于HIV相关疫苗的生产和用途。顺便提出许多其它病毒(即,呼吸道合胞病毒和麻疹病毒)也适于所公开的技术。不过,未给出细节以支持这些推测。Barnett等人,Expression of HIVpolypeptides and production of virus-like particles”美国专利序号6,602,705(2003)。
还提出有可能以与包含VP3、VP7、VP2和VP5基因的蓝舌病毒VLPs相同的方式来生产呼吸道合胞病毒VLP疫苗。Ermak等人,“Oral immunization with multiple particulate antigen deliverysystem”美国专利序号5,690,938(1997)(并入本文作为参考)。除了这种简短提及之外,Ermak并未提供任何关于副粘病毒的技术信息,并且局限于环状病毒属(呼肠孤病毒科)。
假设体内的小鼠细胞毒性淋巴细胞反应(即,免疫反应)发生在
接触重组HIV-1-IIIB gp160包膜糖蛋白复合物之后,所述重组HIV-1-IIIB gp160包膜糖蛋白与微球体复合并作为疫苗施用。Rock,K.L.,“Compositions and methods for inducing cytotoxic Tlymphocyte responses by immunization with protein antigens”美国专利序号6,328,972(2001)。Rock提出具有呼吸道合胞病毒或麻疹病毒抗原的VLPs也可以刺激这些细胞毒性淋巴细胞产生免疫反应。不过没有讨论任何技术细节,或关于这种技术成功的预期。事实上,Rock并未显示任何与针对任何抗原的VLP疫苗的数据。
D.副流感病毒3型
在一个实施方案中,本发明包括含有副流感病毒3型样颗粒的副流感病毒3型疫苗,其中所述颗粒包含副流感病毒3型基质蛋白。在一个实施方案中,该疫苗进一步包含至少两种副流感3型糖蛋白。
E.VLP疫苗的增强
本发明的疫苗或治疗组合物可以通过例如,皮下或肌内注射来进行胃肠外给药。适于其它给药模式的其它剂型包括栓剂,在一些情况下,包括口服剂型或适于作为气雾剂给药的剂型。口服剂型包括正常采用的赋形剂,例如,制药级的甘露醇、乳糖、淀粉硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些的组合物的形式为溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂型或粉剂,并包含10%-95%的活性成分,优选25-70%。
对于口服剂型,采用佐剂的T-细胞集、抗原包被或向各种剂型中加入个别细胞因子的操作能够产生优化免疫反应的改进口服疫苗。
1.佐剂
本发明进一步包括用或不用佐剂进行免疫。在一个实施方案中,本发明包括共同施用副粘病毒VLP疫苗和佐剂,其中导致发生的免疫反应增强。如果使用佐剂,并非意指本发明局限于任何特定的佐剂类型,或一旦使用一种佐剂就在所有时间都使用同一种佐剂。尽管本发明包括所有类型的佐剂,既可以是单独使用也可以是组合使用,但佐剂的优选使用是使用完全福氏佐剂,并在一段时间后使用不完全福氏佐剂。另一种优选使用的佐剂是Gerbu佐剂(GMDP;C.C.BiotechCorp.)。本发明还包括使用RIBI家禽佐剂(MPL;RIBIImmunochemical Research,Inc.)。其它佐剂包括,但不限于,铝酸钾、正磷酸铝、氢氧化铝、QS21(Cambridge Biotech)、Titer Max佐剂(CytRx)或Quil A佐剂。
2.细胞因子
在一个实施方案中,本发明包括共同施用副粘病毒VLP疫苗和细胞因子,其中导致发生的免疫反应增强。尽管不必理解本发明的机制,但相信细胞因子可以介导造血干细胞的增殖、生长和分化,所述造血干细胞最终产生疫苗相关抗体。在一个实施方案中,细胞因子可以选自白介素-12(IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、白介素-6(IL-6)、白介素-18(IL-18)、α、β或γ-干扰素(α,β,γ-IFN)或趋化因子。特别优选的细胞因子包括IL-12和GM-CSF。可以各种组合来使用细胞因子以便调整动物免疫系统的反应,包括抗体和细胞毒性T淋巴细胞反应,以便产生控制或消除副粘病毒感染所需的特定水平的反应。
V.VLP疫苗表达系统
在一个实施方案中,本发明包括经济并且高生产率生产VLP疫苗的方法。在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括用包含副粘病毒VLP疫苗盒的核酸表达载体转染细胞培养物。在一个实施方案中,细胞培养物包含鸟类细胞(即,例如,ELL-0细胞)。在一个实施方案中,细胞培养物包含病毒(即,例如,杆状病毒)。
A.鸟类连续细胞培养表达系统
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括利用鸟类细胞培养物(即,例如,ELL-0细胞培养物)来表达副粘病毒蛋白质。在一个实施方案中,细胞培养物持续表达蛋白质。在一个实施方案中,副粘病毒蛋白质选自,包括但不限于,新城疫病毒蛋白质、麻疹病毒蛋白质、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒蛋白质。在一个实施方案中,副粘病毒蛋白质选自包括,但不限于,基质(M)蛋白质、核壳体(NP)蛋白质、融合(F)蛋白质或凝血素-神经氨酸酶(NM)蛋白质(及其组合)。
为了生成表达副粘病毒蛋白质的鸟类细胞系,将病毒基因整合入鸟类细胞染色体中是有用的。使用逆转录病毒载体是实现这种整合的有用方法。可以用包含副粘病毒基因的逆转录病毒感染鸟类细胞,并且作为逆转录病毒复制循环的一部分,带有副粘病毒基因的逆转录病毒基因组将整合入细胞染色体中。将制备四种鸟类细胞系:i)表达M、NP、F和HN蛋白的鸟类细胞;ii)表达M、NP和F的鸟类细胞;iii)表达M、NP和HN蛋白的鸟类细胞;和iv)表达M、HN和F蛋白的鸟类细胞。
可以构建逆转录病毒载体使该载体不能在鸟类细胞中指导新的后代逆转录病毒的形成(即,不可复制性)。对于这类研究的一般方法如下。将副粘病毒基因克隆入带有逆转录病毒末端(LTRs)和包装信号的载体中。不过,这种载体由于缺少复制所必需的基因(即,例如,gag或pol),是无法复制的。
将载体DNA转染入包装细胞系(即,例如,GP-293)中,该细胞系表达逆转录病毒结构蛋白质;gag、pol和env。与载体一起转染的还有另一种编码疱疹性口炎病毒(VSV)G蛋白质(即,例如,pVSV-G)的DNA。这些细胞随后复制逆转录病毒载体并将载体RNA与env蛋白质以及VSV-G蛋白质一起包装在包膜中(叫作假型)。这些细胞释放颗粒,随后将其纯化并用来感染鸟类细胞。VSV-G蛋白质的存在允许这些颗粒起始在鸟类细胞中的感染并扩展逆转录病毒的宿主范围。
转染后,载体RNA转变成DNA,它随后被整合入鸟类细胞染色体中。由于该鸟类细胞不表达gag或pol,逆转录病毒感染不继续进行并且没有后代病毒被释放出来。因而经转染的鸟类细胞持续表达整合的副粘病毒基因,但不表达逆转录病毒基因。
将重复这一方案以便依次整合四种副粘病毒蛋白质中的每一种。对细胞系表征副粘病毒基因的表达,并将检验从这些细胞系中释放的VLPs。
实现这些步骤的载体和包装细胞系(泛嗜性逆转录病毒表达系统)可购自Clontech(BD Biosciences Clontech)。此外,现有一种载体(Q载体),其经过工程改造从而当表达盒整合入鸟类细胞基因组后,由内在启动子驱动靶基因的转录。Q载体减少了位于载体整合位点邻近的细胞序列干扰副粘病毒基因表达的可能性,或这些序列由于接近逆转录病毒LTR而异常表达的可能性。
B.杆状病毒表达系统
在一个实施方案中,本发明可以利用Bac载系统(Novagen)实施。这一系统使用杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV),其包含插入基因以便在昆虫细胞系中表达蛋白质(即,例如,Sf9)。见附图30。本发明并不限于一种将靶基因整合入AcNPV基因组的方法。可以使用许多不同的转移质粒。例如,通过用AcNPV DNA和转移质粒共转染细胞,可以分离出通过同源重组在病毒基因组中插入基因的病毒(即,例如,使用Bac载Triple Cut病毒DNA,Novagen)。见附图28。在一个实施方案中,可以将靶基因(即,例如,NDV、麻疹,副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒颗粒蛋白质)克隆入pBAC转移质粒以生产重组杆状病毒载体。在一个实施方案中,重组可以包括不依赖连接的克隆(LIC)技术。见附图29。例如,LIC转移质粒pBAC/pBACgus-2cp可以编码具有肠激酶(ek)剪切位点的上游His-标签和S-标签肽。通过引物序列促进重组,所述引物序列包括:有义链,5’至ATG:GACGACGACAAG(SEQ ID NO:89);反义链,5’至TTA:GAGGAGAAGCCCGG(SEQ ID NO:90)。
转染后,Bac载DNA将不会产生病毒,除非在病毒DNA和转移质粒之间有重组事件;即,修复复制所需的环状病毒DNA的重组。在一个实施方案中,转移质粒包含pBAC4x-1(Novagen)。见附图31。尽管不必理解本发明的机制,但相信pBAC4x-1是这样构建的,即将多达四种(4)基因插入单一质粒中,从而作为单一的AcNPV。还据信每种基因都是利用polh或p10启动子进行表达的;所述启动子可以导致在感染24-72小时后极高水平的蛋白质表达。pBAC4x-1转移载体被设计来用于表达多亚质蛋白质复合物并且能够单独或以任何组合形式表达NDVM、NP、HN、F基因。
使用转移质粒和病毒DNA共转化之后,被感染的细胞(即,例如,Sf9)形成噬菌斑并表达病毒颗粒。随后分离这些噬菌斑,其中纯化表达的病毒颗粒并表征插入蛋白质基因的表达。在一个实施方案中,本发明包括一种表达包含NDV、麻疹、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒蛋白质基因的病毒颗粒的受感染细胞,其中所述细胞用杆状病毒转移质粒转化。在一个实施方案中,对表达表征优化条件,以及表达时间,以支持大规模的VLP制备。
已知AcNPV感染的细胞产生极大量的主要极晚期基因产物;多角体蛋白(polh)和p10;到感染周期结束时总的细胞蛋白质的40-50%由这两种基因产物组成。由于在昆虫和组织培养物的感染中都是非常晚期的(即,发生在出芽和释放期后),大部分的细胞转录活性集中于polh和p10启动子,这使得它们对于用来驱动替代这些病毒基因的导入靶基因的高水平表达是十分理想的。可以获得高达100mg靶蛋白质/109细胞的产量。
通过发展这样的病毒提高了杆状病毒表达系统的便利性,所述病毒具有位于必需基因(即,例如,ORF 1629)内的Bsu36I限制性位点,所述必需基因在AcNPV多角体蛋白基因下游和ORF 603上游,从而使得消化释放包含病毒生长所必需序列的片段。Kitts等人,BioTechniques 14:810-817(1993)。当用合适的重组转移质粒和Bsu36I-cut病毒DNA共转染昆虫细胞时,通过同源重组由转移质粒提供必需的ORF 1629序列。来自这些共转染的绝大部分后代病毒包含具有靶基因的修复病毒,因而使得筛选和增殖噬菌斑纯化重组体的需求最小化。或者,其它杆状病毒表达系统利用其它必需基因。例如,前体Bac载体-和Bac载体-病毒具有lacZ基因(β-半乳糖苷酶)代替AcNPV多角体蛋白基因,由其制备出高效Bac载体-1000和2000Triple Cut病毒用于共转染。这些lacZ-阴性重组体可以轻易地与任何残余亲本病毒区别,所述亲本病毒当用X-Gal染色时显现蓝斑。
在用X-Gal染色时,LacZ重组体形成清晰的噬菌斑,因为当转移质粒与病毒基因组重组时靶基因替代了lacZ。在lacZ基因内的第三个Bsu36I位点进一步减小了再次形成亲本病毒的可能性。在实践中和在优化的条件下,可商购的杆状病毒转染技术产生大约>95%重组体的噬菌斑。
133,894bp AcNPV基因组完整序列的近期阐述已经揭示了总共大约154种潜在基因。见附图30。这些基因中很多并非组织培养中病毒生长所必需的。已知这些非必需基因与靶基因竞争细胞资源并且能够对一些基因产物的表达有害。优选使用这样的杆状病毒表达系统,其中已经删除了竞争性的非必需基因。
在一个实施方案中,本发明包括利用设计来表达靶蛋白质(即,例如,NDV、麻疹、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒蛋白质)的pBAC转移质粒。几种潜在的pBAC转移质粒显示在附图31中。例如,两种载体主链(显示在上部)的区别仅仅是存在由p6.9启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶(gus)报告基因(即,例如,pBACgus系列)。由于gus基因和P6.9与靶基因一起携带入杆状病毒基因组,重组体产生β-葡萄糖苷酸酶并且可以用X-gluc染色进行鉴定。缺少gus指示基因的相应的转移质粒小大约2kbp并且通过一些大插入片段可以产生更高的克隆效率。
因此,LIC载体,包括,但不限于,pBAC-2cp和pBACgus-2cp质粒,易于与适当制备的插入片段一起退火。见附图31。在实践中,利用延伸了限定序列的引物通过PCR生成靶序列。见附图29。例如,通过在dATP存在的情况下用T4DNA聚合酶处理产生与载体相容的粘性末端(分别是N-和C-末端编码序列13和14bp)。酶的3′-5′核酸外切酶活性消化双螺旋的一条链直到dT残基出现在互补链上,此时通过聚合酶活性添加现有的dA。Aslanidis等人,Nucleic Acids Res.18:6069-6074(1990)。经过处理的插入片段和pBAC LIC转移质粒经过简单退火,混合物转化入NovaBlue感受态细胞中。
制备的载体允许靶基因在最有利的位置上融合,所述最有利的位置是相对于His-标签和S-标签融合序列之后的肠激酶剪切位点而言的。可以用这样的方式放置插入片段,即使得载体编码的序列能够通过肠激酶剪切完整去除。见附图29。此外,在多克隆区中限制性位点的构型允许将许多pET细菌性载体上的插入片段直接亚克隆入pBAC-1或-2系列质粒中。可以将His-标签序列并入,例如,pBAC-1或-2载体并编码6个组氨酸的连续链。或者,S-标签序列编码核糖核酸酶A的15AA结构域,其具有对于104 AA S-蛋白的强烈亲和性。Richards等人,In:The Enzymes,Vol.IV(Boyer,P.D.,Ed.),pp.647-806,Academic Press,New York(1971)。这种高度特异性的蛋白质-蛋白质相互作用形成了灵敏检测具有S-蛋白质-报告分子偶联物的融合蛋白的基础。利用S-蛋白质HRP偶联物和SuperSignalTMCL-HRP底物可以观察S-标签融合蛋白的化学发光检测(S-标签快速测定试剂盒,Novagen)。
pBAC4x载体被设计用来在相同细胞中共表达多达4种基因。这些载体对于多亚基蛋白质、多拷贝基因、多蛋白复合物的表达,以及研究蛋白质-蛋白质相互作用非常有用。Weyer等人,J.Gen.Virol.72:2967-2974(1991);Belyaev等人,Nucleic Acids Res.21:1219-1223(1993)和Belyaev等人,Gene 156:229-233(1995)。
已知杆状病毒表达技术可以发展成真核病毒展示系统。Boublik等人,Bio/Technology 13:1079-1084(1995)。通过适当地改造AcNPV的主要表面糖蛋白(即,例如,gp64),可以在病毒表面表达功能性蛋白,其中包括糖蛋白。可以设计pBACsurf-1转移质粒来将靶基因框内插入到gp64信号序列和成熟蛋白编码序列之间,在polh启动子的控制之下。见附图31。用这一系统,有可能构建和筛选复合蛋白质的病毒文库,以便找到所需功能特性。
在一个实施方案中,本发明包括利用杆状病毒表达技术感染Sf9昆虫细胞培养物以表达NDV、麻疹、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒蛋白质。可以调整这些细胞用于血清或无血清单层、混悬或发酵培养,并易于指导感染、转染和噬菌斑测定。
感染和未感染野生型AcNPV的Sf9细胞提取物可用于阻抑抗体和其它试剂与病毒和昆虫蛋白质的非特异性结合。提取物也可用作蛋白质印迹、ELISA、结合测定法或酶学测定法中的阴性对照,在所述测定法中于细胞裂解物中分析靶蛋白质。
在一个实施方案中,本发明包括含有来自不同副粘病毒株的蛋白质的VLP疫苗。在一个实施方案中,副粘病毒株选自包括,但不限于,新城疫病毒、麻疹病毒、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒。在一个实施方案中,NDV株是毒性的。在另一个实施方案中,毒性NDV株可以选自AV株和Hertz株。在一个实施方案中,NDV株是无毒的。在另一个实施方案中,无毒的病毒株包括B1株。
在一个实施方案中,本发明包括一种组合物,其包含编码至少一种副粘病毒结构蛋白质的cDNA克隆。在一个实施方案中,所述结构蛋白质包含HN糖蛋白。在一个实施方案中,副粘病毒选自包括,但不限于,新城疫病毒、麻疹病毒、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒。在一个实施方案中,所述克隆来自毒性NDV株。在另一个实施方案中,毒性NDV株可以选自AV株和Hertz株。在另一个实施方案中,所述克隆来自无毒的NDV株。在一个实施方案中,无毒的病毒株包括B1株。
VI.VLP疫苗的序列标签
在另一个实施方案中,本发明包括副粘病毒VLP疫苗,如,但不限于,新城疫病毒VLP疫苗、麻疹病毒VLP疫苗、副流感病毒3型VLP疫苗或呼吸道合胞病毒VLP疫苗,其中所述疫苗包含序列标签。在一个实施方案中,将疫苗施用给宿主。在一个实施方案中,对序列标签进行检测。
在一个实施方案中,本发明包括含有至少一种编码副粘病毒蛋白质的cDNA的载体,其中所述cDNA包含序列标签。在一个实施方案中,将cDNA转染入宿主细胞中。在一个实施方案中,将cDNA并入宿主基因组中。在另一个实施方案中,cDNA存在于宿主细胞质中。在一个实施方案中,对序列标签进行检测。
A.抗体标签
本发明包括一些实施方案,其包括与末端序列标签一起表达的副粘病毒糖蛋白。在一个实施方案中,标签包含FLAG、HA和MYC标签。
相应于快速生长的蛋白质组学领域,近年来重组蛋白质的使用大大增多。重组杂合体包含多肽融合部分,称为亲和性标签(即,例如,序列标签),以有助于靶标多肽的纯化。利用融合蛋白促进纯化以及重组蛋白质检测的优点是公知的。本发明可适用各种亲和性序列标签,所述序列标签包括,但不限于,Arg-标签、钙调蛋白-结合肽、纤维素结合结构域、DsbA、c-myc-标签、谷胱甘肽S-转移酶、FLAG-标签、HAT-标签、His-标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、S-标签、SBP-标签、Strep-标签和硫氧还蛋白。Terpe K.,“Overview of tag protein fusions:from molecular and biochemical fundamentals to commercialsystems”Appl Microbiol Biotechnol.60:523-33(2003)。
FLAG、HA和MYC是短氨基酸序列,对于它们有可商购的抗体(即,例如,ELISA试剂盒)。在一个实施方案中,F蛋白包含末端FLAG标签。在一个实施方案中,末端包含C-末端。在另一个实施方案中,末端包含N-末端。尽管不必理解本发明的机制,但相信包含末端序列标签(即,例如,FLAG或HA)的F或HN病毒蛋白质是完全功能性的。另外相信当包含末端标签的F蛋白(或任何其它病毒蛋白质)并入VLP时,被免疫的动物将不仅生成针对F蛋白的抗体,还生成针对末端标签(即,例如,FLAG氨基酸序列)的抗体。
对序列标签特异性的抗体对于称作表位的特异性蛋白质序列具有亲和性。表位具有与包含受体基团的分子和/或物质选择性相互作用的特性。本发明与文献中报道的许多表位序列相容,其中包括,但不限于,HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO:91)(ClonTech)、C-myc(-EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:92)(Roche-BM)、FLAG(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:93)(Stratagene)、SteptTag(WSHPQFEK)(SEQ IDNO:94)(Sigma-Genosys)和HA标签(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:95)(Roche-BM)。
FLAG肽(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)(SEQ ID NO:93)在许多细胞类型中被用作表位标签。例如,包含细胞巨化病毒(CMV)启动子的载体(pCMV5)修饰,生成两种瞬时表达载体,其设计用来在哺乳动物细胞内分泌和细胞内表达FLAG-融合蛋白。作为功能性测试,将细菌碱性磷酸酶基因克隆入两种载体内,并使用抗FLAG单克隆抗体来在哺乳动物细胞中检测FLAG表位标记的细菌碱性磷酸酶。此外,通过抗FLAG亲和层析从细胞外介质中纯化出分泌的细菌碱性磷酸酶。Chubet等人,“Vectors for expression and secretion of FLAGepitope-tagged proteins in mammalian cells”Biotechniques 20:136-41(1996)。
已经证明来自血凝素流感病毒的带负静电的HA-标签序列(Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala)(SEQ ID NO:95)可用于标记涉及广泛蛋白质组学应用的蛋白质。在一个实施方案中,本发明的实施方案包括一种改进的HA表位标签。尽管不必理解本发明的机制,但相信用35S-蛋氨酸代谢性标记蛋白质的能力有助于分析蛋白质合成和翻折。不过,蛋白质在体内的有效标记经常被少数已有的蛋氨酸残基,或被与蛋白质过量表达相关的有害副作用所限制。为了克服这些限制,广泛使用的HA标签的蛋氨酸富集变体(被称作HAM),可能对于错位表达的蛋白质有用。在一个实施方案中,本发明包括发展系列载体,以及相应的抗血清,用于表达和检测HAM-标记的VLP病毒蛋白质。这些HAM标签提高了35S-蛋氨酸标记的灵敏性并可以分析Myc致癌蛋白质翻折,甚至当HAM-标记的Myc以与内生蛋白质相当的水平表达时亦如此。由于HAM标签提高了灵敏性,本文所述的载体应当可用于检测放射性标记的VLP蛋白质。Herbst等人,“HAM:a new epitope-tag for in vivo protein labeling”Mol Biol Rep.27:203-8(2000)。
或者,可以生成抗体来识别蛋白质或寡核苷酸内的特异性序列。这种抗体可以是多克隆或单克隆的。例如,通过抗体可以检测癌胚抗原的特异性序列。Barnett等人,“Antibody preparations specificallybinding to unique determinants of CEA antigens or fragments thereofand use of the antibody preparations in immunoassays”美国专利序号6,013,772(2000)(并入本文作为参考)。类似地,可以培育针对特异性核苷酸序列的抗体。Tchen等人,“Probe containing a modifiednucleic acid recognizable by specific antibodies and use of this probeto detect and characterize a homologous DNA sequence”美国专利序号65,098,825(1992)(并入本文作为参考)。
根据本发明可以利用多种免疫测定法。能够在这些测定中使用的读出系统有多种,这些系统的非限制性实例包括荧光和比色酶系统、放射性同位素标记和检测以及化学发光系统。例如,将对于序列标记的NDV病毒蛋白质(优选VLP颗粒蛋白)具有序列特异性亲和力的抗体制剂附着到固相上(即,例如,微量滴定板或乳胶珠)。随后洗涤这种抗体-VLP蛋白质复合物以除去未结合的VLP颗粒蛋白质。洗涤后,通过加入发色或荧光底物激活VLP蛋白质序列标签来显示颜色或荧光。显示出来的颜色或荧光的量与样品中VLP蛋白的量成比例。
B.化学标签
序列标签(即,核苷酸和/或蛋白质序列)也包括没有原子空间排列或静电的干扰,被转录和/或翻译过程的酶所识别的分子。可以通过释放标记来进行序列标签的检测。这些标记可以包括,但不限于一种或多种任意的染料、放射性标记、结合部分(如生物素)、质量标签(如金属离子或化学基团)、电荷标签(如多胺或带电染料)、半抗原(如地高辛)、发光、发磷光或发荧光的部分以及荧光染料,可以单独也可以结合如通过荧光共振能量转化(FRET)或碰撞荧光能量转化抑制或转变发射光谱的部分使用。Aizenstein等人,“Methods andcompositions for detecting target sequences”美国专利序号6,913,881(2005)(并入本文作为参考)。
当采用TdT或polyA聚合酶时,寡核苷酸可以包含5′末端标记。本发明并不被5′末端标记的性质所限制;本领域已知很多合适的5′末端标记,包括生物素、荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、Cy3amidite、Cy5amidite和地高辛。可以将放射性同位素标记(例如,32P或35S标记的核苷酸)置于寡核苷酸的5′或3′末端,或者,分布在整个寡核苷酸上(即,均一标记的寡核苷酸)。生物素标记的寡核苷酸可以通过用偶联到指示剂(例如,碱性磷酸酶或荧光团)上的链霉亲和素分子,或半抗原(如地高辛)探测而进行检测,并可以利用偶联到类似指示剂上的特异性抗体进行检测。反应性基团也可以是特异性构型或核苷酸序列,其可以结合或与第二种试剂相互作用,所述第二种试剂如另一种核酸、和酶、或抗体。
为了有用,序列标签必须具有某些物理和理化特性。第一,序列标签必须适于并入生长中的肽链或寡核苷酸中。这可以通过参与肽或磷酸二酯键形成的化学基团的存在而确定。第二,序列标签应当可附着到tRNA分子或核酸聚合酶复合物上。第三,序列标签能够具有一种或多种其它物理特性,其有助于检测和可能分离新生成的蛋白质或寡核苷酸。有用的物理特性包括特征性的电磁光谱特性,如发射或吸收、磁性、顺磁共振、电容、介电常数或导电率。
有用的序列标签包含偶联了可检测标记的天然氨基酸、可检测的非天然氨基酸、可检测的氨基酸类似物和可检测的氨基酸衍生物。标记和其它可检测的部分可以是铁磁的、顺磁性的、反磁性的、发光的、电化学发光的、发荧光的、发磷光的、彩色的或具有独特的质量。可以用作序列标签的荧光部分包括丹磺基荧光团、香豆素和香豆素衍生物、荧光性吖啶部分和基于苯并芘的荧光团。优选地,荧光标记在不同于天然氨基酸的波长上可以产出大量的荧光,更加优选地在UV和可见光谱中可以激发出大量荧光。在预定波长的激发下,通过目视或利用传统的荧光检测方法可以检测出低浓度的标记。当希望极高的灵敏度时,优选电化学发光标记(如钌螯合物及其衍生物或硝基氧氨基酸及其衍生物)。DiCesare等人,BioTechniques 15:152-59(1993)。这些序列标签在毫微微摩尔及以下的范围是可以检测的。
除了荧光之外,基于序列标签与电磁场、放射、光吸收(即,例如,UV、可见光和红外线)、共振拉曼光谱、顺磁共振活性、核磁共振和质谱的相互作用和反应的特性。序列标签的电磁分光特性优选地不被天然发生的化合物所具备,所以是容易区分的。例如,氨基酸色氨酸在290nm附近吸收,并在340nm附近具有荧光发射。因而,具有足以与色氨酸区别的吸收和/或荧光特性的色氨酸类似物可以用于促进它们在蛋白质中的检测。
例如,可以用作序列标签的许多不同修饰的氨基酸可以商购(Sigma Chemical;St.Louis,Mo.;Molecular Probes;Eugene,Oreg.)。一种这样的序列标签是N-ε-丹磺酰赖氨酸并且可以通过丹磺基荧光团与tRNA分子的错误氨基酰化作用来生成。另一种这样的序列标签是基于高度荧光性分子香豆素的荧光性氨基酸类似物。这种荧光团具有比丹磺酰氯高得多的荧光量并且可以促进更低水平的检测。Rothschild等人,“Methods for the detection,analysis and isolation ofnascent proteins”美国专利序号6,875,592(2005)(并入本文作为参考)。
蛋白质的序列标签可以由天然氨基酸和正常情况下不能充当氨基酸的具有标记特性的分子来化学合成。例如可以将高荧光性分子化学连接到天然氨基酸基团上。化学修饰可以发生在氨基酸侧链上,使得羰基和氨基官能团游离以参与多肽键形成。例如,可以将高度荧光性的丹磺酰氯连接到多种氨基酸的亲核性侧链上,主要作为氨基或硫酸键的磺胺以生成荧光衍生物,所述氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸等。这种衍生作用带来形成完整肽键的能力,允许丹磺酰赖氨酸正常并入蛋白质。
在一个实施方案中,本发明包括一种荧光团,其包含氟硼荧(BODIPY)衍生物。所有BODIPY荧光团的核心结构是4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省。见美国专利序号4,774,339;5,187,288;5,248,782;5,274,113;5,433,896;5,451,663(特此全部并入作为参考)。所有BODIPY荧光团具有高度消光系数、高度荧光量、对溶解极性和pH不敏感的光谱、导致与其它染料如荧光素相比更高的峰强度的狭窄发射带宽、无离子性电荷和与荧光素相比增强的光稳定性。可以利用向基本的BODIPY结构中加入取代物(其引发其它偶联作用)来将激发或发射波长转变为与检测手段相容的便利波长。
许多以胺反应形式存在的BODIPY分子可以商购,其可以用于衍生氨酰化的tRNAs。来自这一家族的化合物的一个例子(其显示出将可检测的序列标签并入新生蛋白质中的优越特性),是4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省(BODIPY-FL)。当使用BODIPY-FL的磺化N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生物将序列标签放置在大肠杆菌起始子tRNAfmet上时,利用标准的UV透射仪和照相或CCD成相系统可以在电泳后在聚丙烯酰胺凝胶上轻易检测到标记的蛋白质。这可以通过利用纯化的tRNAfmet来实现,其首先用蛋氨酸氨基酰化,随后利用NHS-BODIPY特异性修饰蛋氨酸的α-氨基。Varshney等人,“Direct analysis of aminoacylation levels of tRNA invitro”J.Biol.Chem.266:24712-24718(1991)。
C.独特的序列标签
基因表达连续分析(SAGE)是一种能够快速详细分析数千种转录本的技术。SAGE基于两种原理。第一,只要是分离自该转录本内的特定位置,短核苷酸序列标签(即,例如,9-10个碱基对(bps))包含足够的信息以唯一地鉴定转录本。例如,根据在标签位点上给出随机的核苷酸分布,短至9bp的序列可以区分262,144种转录本,而目前估计即使是人的基因组也只编码大约80,000种转录本。第二,通过对单一克隆内的多个标签进行测序,短序列标签的串联可以有效分析连续方式的转录本。如同信息作为连续数据串传送的计算机的连续通信一样,序列标签的连续分析需要一种方法以建立每种标签的记录和边界。
随后可以通过生物素标记的寡(dT)引物由mRNA合成双链cDNA。随后用限制性内切酶(锚定酶)剪切eDNA,所述内切酶预期剪切大多数转录本至少一次。一般,为此目的使用带有4-bp识别位点的限制性内切酶,因为它们平均每256bp剪切一次,而大多数转录本大得多。随后通过结合链霉亲和素珠分离经剪切eDNA的大多数3′部分。这一过程在每一转录本上提供独特位点,其对应于位于距多腺苷[poly(A)]化的尾巴最近的限制性位点。随后平分eDNA并通过锚定限制性位点连接到到包含IIS型(标记性酶)的两个接头之一上。IIS型限制性内切酶在距离它们的不对称识别位点多达20bp的限定距离上剪切。设计接头使得用标记性酶剪切连接产物导致释放具有短片段cDNA的接头。
例如,可以采用锚定酶和标记性酶的组合,产生9-bp标签。生成钝末端后,将两组释放的标签彼此连接。随后将连接后的标签充当聚合酶链式反应(PCR)扩增的模板,所述反应使用对每个接头特异性的引物。这一步骤除了扩增标签序列之外,还达到几个目的。第一,它以非常紧湊的方式提供了标签序列的定向和截断。得到的扩增产物包含两条尾对尾连接的标签(一个双标签),侧接锚定酶的位点。在最后的测序模板中,这导致每个双标签的4bp的截断。第二并且最重要的,对于任何扩增步骤前形成的双标签的分析,提供了完全消除由PCR引入的潜在变形的方法。因为任何两种标签偶联在同一个双标签中的可能性小,即使对于过量的转录本来说也是,可能由偏差PCR产生的重复性双标签也可以由分析排除,而不会在实质上改变最后结果。用锚定酶剪切PCR产物允许分离双标签,其随后可以通过连接来浓缩、克隆并测序。
除了对于大量已知转录本提供量化信息外,SAGE还可以用于鉴定NDV表达的基因。SAGE可以提供有关基因表达的定量和定性数据。具有各种识别位点的不同锚定酶与具有距离其识别元件5-20bp的剪切位点的IIS型酶的组合为这一策略带来很大的弹性。
D.直接检测技术
当存在足量待检测核酸时,有直接检测该序列的有利条件,而不用制备该靶标的更多拷贝,(例如,通过PCR和LCR)。最特别的是,不用指数扩增信号的方法更加适于定量分析。即使通过将多种染料附着于单个寡核苷酸上来增强信号,最终信号强度与靶标量的关联也是直接的。这种系统具有额外的优点,即反应产物自身不会促进进一步反应,从而不必关注产物对实验室表面的污染。传统的直接检测方法包括RNA和DNA印迹以及RNA酶保护测定法,通常需要使用放射性并且不适于自动控制。最近发明的技术试图消除放射性的使用和/或提高自动化形式的灵敏性。两个例子是″循环性探针反应″(CPR),和″分枝DNA″(bDNA)。
循环性探针反应(CPR),使用长的嵌合性寡核苷酸,其中中心部分由RNA构成,而两端则由DNA构成。Duck等人,BioTech.,9:142(1990)。探针杂交到靶DNA上并接触热稳定性RNA酶H引起RNA部分被消化掉。这破坏了双螺旋的剩余DNA部分的稳定,将剩余探针从靶DNA上释放出来,并允许另一种探针分子重复该过程。以剪切探针分子形式存在的信号,以线性速率积聚。在重复过程增强信号的同时,寡核苷酸的RNA部分相对于在样品制备中存在的RNA酶是脆弱的。
分枝DNA(bDNA)包括具有分枝结构的寡核苷酸,其允许每个寡核苷酸携带35-40个标记(例如,碱性磷酸酶)。Urdea等人,Gene61:253-264(1987)。在这增强来自杂交事件的信号的同时,来自非特异性结合的信号得到类似的增强。
VII.体内接种
在一个实施方案中,本发明包括一种副粘病毒VLP疫苗,其包含至少一种病毒糖蛋白,其中所述疫苗是抗原性的。在一个实施方案中,所述疫苗刺激针对疾病的免疫反应,所述疾病包括,但不限于,新城疫、麻疹、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒感染。在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括向在产生免疫反应的条件下,向宿主(即,例如,小鼠或鸡)施用纯化的抗原性副粘病毒VLP疫苗。在一个实施方案中,通过测量血清糖蛋白抗体水平来表征所述免疫反应。在一个实施方案中,所述病毒糖蛋白包含NDV糖蛋白。在一个实施方案中,所述病毒糖蛋白包含麻疹病毒糖蛋白。在一个实施方案中,所述病毒糖蛋白包含呼吸道合胞病毒糖蛋白。
在一个实施方案中,本发明包括一种方法,其包括向鸡施用一种纯化的抗原性NVD、麻疹、副流感病毒3型或呼吸道合胞病毒VLP疫苗以生成经接种的鸡。在一个实施方案中,该方法进一步包括向经接种的鸡施用活体病毒攻击。在一个实施方案中,该方法进一步包括测定对经接种鸡的NDV感染率。
实验
下列实施例仅是举例说明本发明的具体实施方案,并不旨在于限制本发明。
实施例1:细胞培养
本实施例描述在下面的实施例中使用的细胞培养物以形成本发明的具体的实施方案。
来自鸡胚(UMNSAH/DF-l)的East Lansing株系(ELL-O)的自发转化的成纤维细胞细胞系获自美国典型培养物中心(American TypeCulture Collection)并且保存在Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)中,所述培养基中补充了青霉素-链霉素和10%胎牛血清(FCS)。
还在DMEM中增殖表达SV 40T抗原(293T)的人肾上皮细胞,所述DMEM补充了10%FCS、青霉素-链霉素、维生素、非必需氨基酸和谷氨酰胺。在含胚的鸡卵中通过标准方法增殖NDV,株系AV。
实施例2:质粒
该实施例描述了用在下面的实施例中的质粒类型以构建本发明的各种实施方案。
将编码NP(即,例如,SEQ ID NO:23)、M(即,例如,SEQ IDNO:27)、HN(即,例如,SEQ ID NO:18)和未裂解的F(即,例如,SEQID NO:20,或者,F-K115Q)蛋白的NDVcDNA序列亚克隆到表达载体pCAGGS中以分别产生pCAGGS-NP、pCAGGS-M、pCAGGS-HN和pCAGGS-F-KI15Q。Miyazaki等人,“Expression vector systembased on the chicken beta-actin promoter directs efficient productionof interleukin-5”Gene 79:269-77(1989)和Niwa等人,“Efficientselection for high-expression transfectants with a NDVel eukaryoticvector”Gene 108:193-9(1991)。
F蛋白cDNA在裂解位点序列F-KI15Q中包含点突变,这去除了弗林蛋白酶识别位点。Li等人,“Effect of cleavage mutants onsyncytium formation directed by the wild-type fusion protein ofNewcastle disease virus”J.Virol.72:3789-95(1998)。
在前面描述了pBJ5表达载体和pDsRed2-Nl载体(Clontech),所述pBJ5表达载体包含编码Flag-标记的、具有E228Q突变的Vps4A基因,所述pDsRed2-Nl载体包含编码CHMP3-RFP融合蛋白的基因。Strack等人,“PIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1 p6 andEIAV p9 functioning in virus budding”Cell 114:689-699(2003)。
实施例3:转染,感染,和代谢标记
本实施例描述用于发展和表达本发明的各种实施方案的基本技术。
如生产商所推荐,使用Lipofectamine(Invitrogen)完成分汇合ELL-O细胞和/或293T细胞的转染。在每个35mm碟中使用下述量的质粒DNA:1.0μg pCAGGS-NP、1.0μg pCAGGS-M、0.75μgpCAGGS-F-KI15Q和1.0μg pCAGGS-HN,单独地或混合地。预先确定这些量以产生类似于以感染复数5用NDV感染的细胞的表达水平。
所有的转染实验中使用总共3.75μg质粒DNA/35mm板。当仅使用一种、两种或三种cDNAs时,通过加入载体pCAGGSDNA保持转染的DNA的总量恒定。对于每次转染,将DNA和5μl的Lipofectamine在OptiMEM培养基(Gibco/Invitrogen)中的混合物在室温温育45分钟,再加入到用OptiMEM预先洗涤的细胞中。将所述细胞温育5小时,去除Lipofectamine-DNA复合物,并加入2ml的补充DMEM。
36小时后,将培养基用0.7ml DMEM替换,所述DMEM不含半胱氨酸和甲硫氨酸,并补充以100μCi的35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸混合物(NEG-772EASYTAGTM表达蛋白质标记混合物,35S,PerkinElmer Life Sciences Inc.)。4小时的脉冲标记后,将一组转染的板进行细胞裂解,同时在另一组中,用1.0ml的补充了0.1mM冷甲硫氨酸(Nutritional Biochemicals Corporation)的DMEM替换培养基。8小时的示踪后,收集培养基并将细胞在包含Triton-DOC(1%Triton、1%脱氧胆酸钠)和25mg N-乙基马来酰亚胺(NEM)的0.5ml裂解缓冲液中裂解。用细胞刮器收集细胞,并将其通过26号针10到15次进行均质化。
用pCAGGS-M和不同浓度的pBJ5-Vps4-E228Q-Flag或pDsRed2-NI-CHMP3同时转染分汇合的293T细胞。将相应的空载体用作对照。将细胞温育36小时并如上述进行相同的脉冲-示踪程序。
以5pfu的MOI感染ELL-O细胞5小时,用35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸混合物标记30分钟,并如上述在非放射性培养基中示踪8小时。收集细胞上清液并如下面所述进行毒粒的纯化。如上述进行裂解细胞并均质化。
实施例4:VLP纯化和分离
以前面报道的方法从细胞上清液中纯化病毒和VLP以及毒粒。Levinson等人,“Radiation studies of avian tumor viruses andNewcastle disease virus”Virology 28:533-542(1966)。将细胞上清液在4℃以5000rpm离心5分钟,层铺在由3.5ml 20%和0.5ml 65%的在TNE缓冲液(25mM Tris-HCI pH 7.4、150mM NaCI、5mM EDTA)中的蔗糖溶液组成的封闭梯度的顶部,并在4℃,使用SW50.1转子(Beckman),以40,000rpm再次离心12小时。将蔗糖梯度的界面(包含浓缩的颗粒)收集在0.5ml中,与2.0ml 80%的蔗糖混合,并层铺在1.0ml 80%蔗糖缓冲垫层的顶部。将另外的蔗糖层(1.0ml的50%和0.5ml的10%蔗糖)置于样品的顶部。将梯度在4℃,以38,000rpm离心20小时。使用polystaltic泵,将梯度从底部收集到一个1ml的级分和8个0.5ml的级分中。使用折射计测定每个级分的密度。在一个实验中制备来自所有的蛋白组合的表达的VLPs,因此能够直接比较结果。
将所述实验重复3次。免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过组合一体积的细胞裂解物或蔗糖梯度级分与2体积的TNE缓冲液来进行免疫沉淀。在4℃,将样品与特异性抗体温育16小时。用于沉淀NP、F和HN的抗血清是通过标准方法产生的针对UV灭活的NDV的兔多克隆抗体;抗HRI和抗HR2,McGinnes等人,“Newcastle disease virusHN protein alters the conformation of the Fprotein at cell surfaces”J.Virol.76:12622-33(2002);抗F2-96和抗-A.McGinnes等人,“Roleof carbohydrate processing and calnexin binding in the folding andactivity of the HN protein of Newcastle disease virus”Virus Res53:175-85(1998)。
针对谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白产生抗F2-96,所述融合蛋白包含从氨基酸96-117的F蛋白序列。用于沉淀M蛋白的抗血清是针对纯化的M蛋白产生的小鼠单克隆抗体。Faeberg等人,“Strainvariation and nuclear association of 20 NDVMatrix protein”J Virol.62:586-593(1988)。于4℃将免疫复合物(ICs)吸附到蛋白质A(Pansorbin细胞,CALBIOCHEM)上2小时,沉淀,接着在免疫沉淀(IP)洗涤缓冲液(包含0.5%9吐温-20和0.4%十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸缓冲盐(PBS))中洗涤3次。将ICs重新悬浮在具有1M J3巯基乙醇(BME)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液(125mMTris-HCI[pH 6.8]、2%SDS、10%甘油、0.4%溴酚蓝)中并煮沸。
将蛋白质在8%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中分离并通过放射自显影检测。使用Fluor-STM MultiImager(BioRad)完成所得放射自显影的量化。
实施例5:高效VLP释放
NP、M、F和HN蛋白的共表达导致具有1.19-1.16g/cc密度的VLPs的释放(附图1,A版)。从NDV、AV株、感染的细胞中平行纯化的病毒颗粒具有1.21-1.19g/cc的密度(附图1,B版)。尽管不必理解本发明的机制,但认为与真病毒比较VLPs的稍微更轻的密度可能是由于毒粒RNA在VLPs中的不存在。将VLP和病毒释放的效率计算为在示踪后在细胞提取物中剩余的M蛋白相对于脉冲中蛋白质的量的百分比。在实验的示踪部分中M蛋白质从细胞中的损失是由于VLPs或毒粒从细胞中的释放。按照该标准,VLP释放的效率是85%,而NDV释放的效率是92%(附图1,C版)。所述结果显示VLPs的释放几乎与毒粒的释放一样有效。
这些结果证实NDV的VLPs从表达四种主要结构蛋白质的鸟类细胞有效组装并且释放。在一个实施方案中,M蛋白对于VLP释放是足够的。通过分别评估每种蛋白质指导颗粒释放的能力来测定对于VLP形成的最少蛋白需求。将表达每种病毒蛋白质的细胞以脉冲-示踪的方法分别进行放射性标记并且如上所述分离VLPs。
实施例6:M蛋白依赖性VLP释放
VLPs仅从表达M蛋白的细胞释放。附图2,B版。8小时的示踪后,在细胞提取物中几乎检测不到M蛋白质。附图2A,右版。尽管不必理解本发明的机制,但认为这说明许多脉冲-标记的蛋白质从细胞中进行释放。进一步认为通过比较在脉冲标记提取物和示踪提取物中的M蛋白的水平,计算出释放的效率是90%。
相反地,大多数脉冲标记的NP,F和HN蛋白在示踪后保留在提取物中(附图2A)。尽管存在痕量的从HN蛋白表达细胞释放的极轻密度物质,但在相应的细胞上清液中也没有检测到显著量的VLPs(附图2,B版)。附图2,C版,显示从分别从表达每种蛋白质的细胞产生的VLPs的量化。令人感兴趣的是,来自只表达M蛋白的细胞的包含M蛋白的颗粒的量比当所有四种结构蛋白都表达时要大。不过,仅具有M蛋白的VLPs具有非常不均一的密度,其值范围从1.23到1.12g/cc(附图2,B版)。这些结果显示M蛋白对于颗粒的释放是足够的。
实施例7:M蛋白依赖性VLP释放:成对组合
如在实施例6所示,VLP释放需要M蛋白。为了测定NP、F或HN蛋白对于M蛋白-驱动的VLP形成的作用,将来自表达两种蛋白质的所有可能组合的细胞的VLPs分离并且如上所述进行表征。表达除M蛋白以外的任何蛋白组合的细胞不释放VLPs附图3;C版)。另外,在缺乏M蛋白时,以成对组合表达的NP、F和HN蛋白在8小时示踪后,仍旧保留在细胞提取物中(附图3A)。该发现显示对于颗粒释放需要M蛋白。与M蛋白一起成对表达NP、F或HN蛋白导致包含两种蛋白的VLPs的释放(附图3,B版)。不过,令人感兴趣的是,仅有痕量的NP、F或HN蛋白和M蛋白是在VLPs中的优势蛋白(附图3,B版)。
NP、F或HN蛋白在梯度中的分布与M蛋白的分布相同(附图3,B版。)此外,VLP密度非常不均一并且非常类似于仅有M蛋白的VLPs。还令人惊奇的是,包含M蛋白的VLPs的量在M蛋白与NP,F或HN蛋白共表达后显著减少(约2-2.5倍)(附图3,C版)。这些结果说明NP,F或HN蛋白可以分别抑制M蛋白-驱动的VLP的释放。
实施例8:M蛋白依赖性VLP蛋白质并入
其他病毒蛋白质有效并入VLPs需要M蛋白和至少两种其他蛋白质的表达。为了检验三种病毒蛋白质的表达对颗粒释放的作用,用三种cDNAs的所有可能的组合转染细胞。此外,VLPs仅从表达M蛋白的细胞释放。表达NP,F和HN蛋白而不表达M蛋白没有导致任何颗粒的释放(附图4,C版)。该发现进一步巩固了我们的结论,即释放VLPs需要M蛋白。
与单一糖蛋白和M蛋白的表达相反,F和HN糖蛋白与M蛋白的共表达导致了两种糖蛋白并入VLPs的显著增加(附图4,B版和C版)。在与M蛋白相同的梯度级分中检测到F和HN蛋白。此外,与来自只表达M蛋白或只表达M蛋白和单一糖蛋白的细胞的那些相比,VLPs的密度更加均一(比较附图4,B版和附图2,B版)。这些结果说明F和HN蛋白与M蛋白的表达对于将任何糖蛋白有效结合到颗粒中是必需的。
M蛋白与NP和F或HN蛋白的任一的表达导致NP以及糖蛋白并入VLPs的增加(附图4,B版和C版)。包含NP蛋白的颗粒在梯度中的分布与从表达所有四种结构蛋白质的细胞中释放的VLPs的分布相似(比较附图1,A版和附图4,B版)。重要的是,与从只表达M的细胞释放的颗粒相比,这些颗粒的密度更加均匀,并且类似于真病毒或完全VLPs的密度(比较附图4,B版和附图1,B版)。总而言之,这些结果说明M蛋白对于颗粒释放是必要且充分的,并且M蛋白与至少两种其他蛋白的表达是其他蛋白质有效并入VLPs所需要的。
实施例9:VLP释放抑制
宿主细胞VPS途径涉及VLP形成和释放。以前的研究已经指出了在其他包膜RNA病毒的出芽中的VPS途径。Demirov等人,“Retrovirus budding”Virus Res 106:87-102(2004);Pornillos等人,“Mechanisms of enveloped RNA virus budding”Trends Cell Biol.12:569-79(2002)和Morita等人,“Retrovirus budding”Annu Rev CellDev Biol.20:395-425(2004)。这种途径可能涉及M蛋白-驱动的VLP释放,因为CHMP3是ESCRT III复合物的亚基。von Schwedler等人,“The protein network of HIV budding”Cel1 4:701-13(2003)。
CHMP3与RFP的融合将其转化为显性-阴性蛋白质,其抑制HIV-1 gag VLP释放。Strack等人,“PIP1/ALIX is a binding partner forHIV-1p6and EIAV p9 functioning in virus budding”Cell114:689-699(2003)。M蛋白与CHMP3-RFP的同时表达导致VLP释放的98.5%抑制(附图5,A版和C版)。VPS途径的另一种显性-阴性成分Vps4A-E228Q与M蛋白的表达产生相同的结果,其具有96.2%的抑制(附图5,B版和D版)。显性-阴性CHMP3和Vps4A的表达都不抑制M蛋白的表达(附图5,E版和F版)。因此,完整的宿主细胞VPS途径对于M蛋白VLP释放是必需的。
实施例10:病毒和VLP释放的细胞类型依赖性作用
该实施例提供示例性数据,显示VLP释放依赖于宿主细胞类型。宿主细胞类型影响基本VLP释放机制以及总的VLP释放效率。
基本释放机制
比较从鸟类细胞(ELL-0)的VLP释放和从灵长类动物细胞(COS-7细胞)的VLP释放。为了比较从这些细胞的病毒颗粒释放,将等量的鸟类细胞和COS-7细胞用NDV以MOI=5进行感染。将细胞以脉冲方式进行放射性标记并接着进行非放射性示踪。在示踪过程中的各个时间点从细胞上清液收集毒粒,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离病毒颗粒中的蛋白质。
将在示踪的不同时间点的病毒颗粒中的NP和F蛋白的放射自显影分别显示于附图14A和附图14B中(上部凝胶:鸟类;底部凝胶:COS-7)。将每种蛋白质水平的量化分别显示于附图15A和附图15B中。其清楚地显示,从鸟类细胞释放的病毒量比从COS-7细胞释放的量要高,并且从鸟类细胞的释放速率比从COS-7细胞的释放速率要快。鸟类和灵长类动物细胞中的这种差异不是由于在两种细胞类型中蛋白表达水平的不同。在脉冲标记过程中获得的总病毒蛋白质水平在COS-7细胞中比在鸟类细胞中要更高(未显示),该结果说明病毒的进入复制和翻译在COS-7和鸟类细胞中至少一样有效。
这些数据显示病毒颗粒释放速率在鸟类细胞中比在灵长类动物细胞中要快,并且从鸟类细胞中释放的病毒量比从灵长类动物细胞中释放的量显著更高。
释放效率
为了测定鸟类细胞是否在释放VLPs上也更加有效,用编码NDV的NP、M、HN和F-K115Q蛋白质的cDNAs转染等量的鸟类细胞和COS-7细胞。将细胞进行放射性标记达四(4)小时(即,脉冲)并接着进行非放射性温育达八(8)小时(即,示踪)。随后,将VLPs从细胞上清液中分离出来。通过漂浮入蔗糖梯度中来纯化上清液中的VLPs。
产生分别包含从鸟类细胞和COS-7细胞释放的VLPs的蔗糖梯度。分别见附图16A和16B。数据清楚地显示从鸟类细胞中释放出比COS-7细胞更多的VLPs。
在脉冲标记和在非放射性示踪后,制备来自鸟类细胞和COS-7细胞的细胞裂解提取物。分别见,附图17A和17B。重要地是,在非放射性示踪后,HN、F和M蛋白不再存在于鸟类细胞提取物中。这种观察与更加有效的从鸟类细胞的释放和/或并入VLPs中一致。相反地,显著水平的这些病毒蛋白质仍旧保留在COS-7细胞提取物中。这种观察与COS-7细胞中的病毒蛋白质保留和病毒蛋白质向颗粒中的更低的释放一致。数据清楚地显示VLP从鸟类细胞比从COS-7细胞中释放更加有效。
实施例11:比较特异性病毒蛋白质诱导的VLP释放
该实施例显示当用仅包含M蛋白的NDV转染时,VLPs也从鸟类细胞中更加有效地释放。
如上所述测定从仅用M蛋白cDNA转染的细胞的VLP颗粒释放。从鸟类和COS-7灵长类动物细胞产生M蛋白VLPs的蔗糖密度梯度纯化的。分别见附图18A和附图18B。清楚地,从鸟类细胞释放的VLPM蛋白的量比从灵长类动物细胞释放的VLPM蛋白的量显著更高,因此更加有效。
进一步,用NP蛋白cDNA、M蛋白cDNA、F-K115Q蛋白质cDNA或HN蛋白cDNA中任一个单独地转染等量的细胞。或者,该实验使用用所有四(4)种病毒蛋白质cDNAs组合的载体转染的细胞。如上所述制备VLPs。产生每种转染的蔗糖梯度纯化并且通过测密度法测定颗粒释放。当分别转染各种病毒蛋白质cDNAs时,仅有M蛋白导致任何VLP病毒蛋白质释放(即,仅M蛋白)。当细胞用所有四种蛋白质转染时,VLP病毒蛋白质释放包含所有四种蛋白质。在两种情形中,释放的VLPs在鸟类细胞中比在COS-7细胞中包含更大量的病毒蛋白质。分别见附图19A和附图19B。清楚地,M蛋白VLPs和完全VLPs从鸟类细胞的释放效率比从COS-7细胞的释放效率更好。
实施例12:产生针对VLP病毒疫苗的抗体
I.单克隆抗体
用KLH偶联的NDV病毒肽的多次I.P.接种来免疫Balb/c小鼠。接着,使用标准方法,将来自免疫的动物的脾细胞与小鼠骨髓瘤AG8融合。Wunderlich等人,J.Immunol.Methods 147:1-11(1992)。接着使用本领域已知的标准ELISA方法,就对卵清蛋白偶联的NDV病毒肽的免疫反应性筛选从得到的杂交瘤的上清液。通过有限稀释将对免疫反应性MAbs的表达呈阳性的杂交瘤至少克隆两次并且进行MAb同种型分析。使用蛋白质-A亲和性层析法从腹水中制备纯化的MAbIgG。融合后,筛选显示出多个阳性亲本信号,从其中可以制备产生单克隆抗体的克隆。
用于杂交瘤筛选的免疫沉淀/闪烁测定法
为了开发和筛选识别在溶液中的VLP病毒蛋白,而不是与固相连接时的VLP病毒蛋白质的单克隆抗体,开发了一种测定法,其中测量35S-蛋氨酸-标记的体外翻译的VLP病毒蛋白质的免疫沉淀。使标准量的体外翻译VLP病毒蛋白质在溶液中形成抗体/抗原复合物,在所述溶液中对离子强度、pH和去垢剂组成进行优化。在与蛋白质G(Omnisorb细胞)一起沉淀免疫复合物并粗洗后,在液体闪烁计数器中计数结合的放射性;减去背景并且计算沉淀的效率。这种免疫沉淀/闪烁测定法(IPSA)容许抗体的快速鉴定和表征,并且用于测试多种单克隆VLP病毒蛋白质抗体。通常,这种测定法可以用于单克隆杂交瘤上清液以及多克隆血清以鉴定可以用于免疫沉淀的抗体。
简而言之,将约1.5×105DPMs的35S-蛋氨酸-标记的体外翻译的VLP病毒蛋白质加入10μl 10X免疫沉淀缓冲液(150mM NaCl、10%NP-40、5%去氧胆酸、1%SDS、500mM Tris pH8)中。向其中加入来自目标单克隆融合体的90μl单克隆细胞上清液并使其在4℃反应2小时。2小时后,加入平衡在1X免疫沉淀缓冲液(RIPA缓冲液;150mM NaCl、1%NP-40、0.5%去氧胆酸、0.1%SDS、50mM Tris pH8)中的40μl的10%Omnisorb细胞(Calbiochem)溶液并使其在4℃再反应2小时,其间伴随摇动。通过在4500g和4℃离心5分钟沉淀细胞,并用800μl冷1X免疫沉淀缓冲液洗涤3次。将沉淀物定量地转移到闪烁瓶中,并在Beckman LS6000闪烁计数器中以Auto DPM模式进行计数。接着可以计算免疫沉淀的VLP病毒蛋白质的百分比。
VLP病毒蛋白质MAbs的表征
为了进一步表征最佳的细胞系,可以进行竞争性免疫沉淀/闪烁测定法(竞争性IPSA)。在该变体中,将产生针对VLP病毒蛋白质的单克隆抗体的克隆与标记的体外翻译VLP病毒蛋白质同时加入约200倍摩尔过量的未标记的竞争性肽中。如预期,比较对待检的表位区域的肽与不被认为表示表位区域的肽。在包含待检表位区域的测定中的高比例竞争将证实VLP病毒蛋白质单克隆抗体结合特异性。
II.抗血清
用于沉淀病毒蛋白质的抗血清是抗NDV抗体的混合物。用于沉淀NP的抗血清是通过标准方法针对UV灭活的NDV产生的兔多克隆抗体。用于沉淀F蛋白的抗血清是针对谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白产生的,其包含氨基酸序列130-173(抗HR1)(McGinnes等人,“Newcastle disease virus HN protein alters the conformation oftheFprotein at cell surfaces”J.Virol.76:12622-12633(2002).)、470-500(抗HR2)(Dolganiuc等人,“Role of the cytoplasmic domain ofthe Newcastle disease virus fusion protein in association with lipidrafts”J Virol 77:12968-12979(2003))或96-117(抗F2-96)。用于沉淀HN蛋白的抗血清是针对从氨基酸96-117(抗A)的HN蛋白序列产生(McGinnes等人,“Role of carbohydrate processing and calnexinbinding in the folding and activity of the HN protein of Newcastledisease virus”Virus Res 53:175-185(1998))。用于沉淀M蛋白的抗血清是针对纯化的M蛋白产生的小鼠单克隆抗体(Faeberg等人,“Strain variation and nuclear association of NDVMatrix protein”J.Virol.62:586-593(1988))。用于沉淀HA-标记的蛋白质的抗体是与琼脂糖珠(Sigma)偶联的小鼠单克隆HA抗体。用于免疫印迹法的二抗是过氧化物酶偶联的小鼠单克隆抗HA抗体(Sigma)。
实施例13:构建重组杆状病毒载体
该实施例描述构建重组杆状病毒载体的一般方法。
将构建杆状病毒重组体的一般方法显示于附图28。作为第一个步骤,将显示为PCR-衍生的DNA的目标基因(即,例如,NDV颗粒蛋白质)克隆到在适合的质粒转移载体(即,例如,pBAC4x-1)中的AcNPV启动子的拷贝下游。转移载体在启动子和目标基因的侧翼具有杆状病毒DNA的上游和下游部分。
在细菌细胞培养物(即,例如,大肠杆菌(E.coli))、鸟类细胞培养物(即,例如,ELL-O)或人细胞培养物(即,例如,293T)中培养衍生的重组转移载体的选定的克隆,并且将得到的重组质粒DNA进行表征和纯化。
在第二个步骤中,将纯化的重组转移质粒与线性化病毒DNA一起共转染到昆虫细胞(即,例如,Sf9)中以构建重组杆状病毒。转移载体的侧翼区在病毒复制过程中参与了与病毒DNA序列的同源重组并且将目标基因引入杆状病毒基因组的特异的基因座(通常是多角体蛋白或p10,这依赖于转移质粒)。
转染和噬斑纯化以去除亲本病毒后,从适合的重组体制备高滴度的病毒贮存物。一旦获得高滴度的病毒贮存物,将其应用于测定目标蛋白质表达的最佳时间(依赖于启动子和基因产物的性质)。在建立这些参数之后,制备大规模的培养物并将其用于蛋白质生产。
实施例14:生产麻疹VLP疫苗
该实施例给出导致产生特异于麻疹病毒的VLP疫苗的方案。
载体:将编码NP(即,例如,SEQ ID NO:42)、M(即,例如,SEQID NO:48)、HA(即,例如,SEQ ID NO:30)和未裂解的F(即,例如,SEQ ID NO:36)蛋白质的MV cDNA序列分别亚克隆到表达载体pCAGGS中以产生pCAGGS-NP、pCAGGS-M、pCAGGS-HA和pCAGGS-F-K111G。突变编码MV的F蛋白的cDNA以去除在氨基酸108-112处的弗林蛋白酶识别位点。突变将在氨基酸111引入甘氨酸以取代赖氨酸,所述位置类似于NDV的F蛋白的K115Q突变。消除F蛋白的裂解将抑制F蛋白融合的能力。培养物中细胞-细胞融合的缺乏将可能增加VLPs的产量。
细胞系:麻疹病毒在人和灵长类动物细胞系中有效释放,而不从鼠细胞系中有效释放(Vincent等,Virology 265:185)。因此,使用Hela细胞(人宫颈癌细胞)、293细胞(人胚肾细胞)、VERO细胞(非洲绿猴肾细胞)和COS-7(灵长类动物)细胞。
转染、感染和代谢标记:如生产商所推荐,使用Lipofectamine(Invitrogen)进行分汇合细胞的转染。将下列量的质粒DNA用在每个35mm碟中:1.0μg pCAGGS-NP、1.0μg pCAGGS-M、0.75μg pCAGGS-F-K111G和1.0μg pCAGGS-HA。在所有的转染实验中使用总共3.75μg的质粒DNA/每个35mm板。当仅使用一种、两种或三种cDNAs时,通过加入载体pCAGGSDNA保持转染的DNA的总量恒定。对于每次转染,将DNA和5μl的Lipofectamine在OptiME培养基(Gibco/Invitrogen)中的混合物在室温温育45分钟,并加入至预先用OptiMEM洗涤的细胞中。将细胞温育5小时,并去除Lipofectamine-DNA复合物,并加入2ml的补充的DMEM。36小时后,将培养基用0.7ml不含半胱氨酸和蛋氨酸并补充了100μCi的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸混合物(NEG-772EASYTAGTM表达蛋白质标记混合物,35S,Perkin Elmer Life Sciences Inc.)的DMEM进行替换。4小时的脉冲标记后,将一组转染板裂解,同时在另一组中培养基用1.0ml的含有0.1mM冷蛋氨酸(Nutritional BiochemicalsCorporation)的补充的DMEM进行替换。8小时的示踪后,收集细胞上清液。此外,将细胞进行超声处理以释放细胞相关的VLPs。组合得到的细胞上清液。将细胞在0.5ml裂解缓冲液(10mM NaCl、1.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl pH7.4)中裂解,所述缓冲液包含Triton-DOC(1%Triton、1%脱氧胆酸钠)和1.25mg N-乙基马来酰亚胺(NEM)。用细胞刮器收集细胞并以通过26号针10-15次来进行均质化。
为了确定VPS途径是否涉及VLP出芽,用pCAGGS-M和不同浓度的pBJ5-Vps4-E228Q-Flag或pDsRed2-NI-CHMP3同时转染分汇合的293T细胞。将相应的空载体用作对照。将细胞温育36小时并如上述进行相同的脉冲-示踪程序。
为了产生病毒颗粒作为对照,如上所述,将灵长类动物或人的细胞以5pfu的MOI感染30小时,并用35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸混合物标记4小时,并在非放射性培养基中示踪8小时。如下面所述收集细胞上清液并纯化毒粒。如上所述裂解细胞并进行均质化。
病毒和VLP纯化:将VLPs以及毒粒按照前面用于病毒纯化所开发的方法从细胞上清液中进行纯化。将细胞上清液在4℃以5000rpm离心5分钟以进行澄清,并层铺在由3.5ml 20%和0.5ml 65%的在TNE缓冲液(25mM Tris-HCI pH 7.4,150mM NaCI,5mM EDTA)中的蔗糖溶液组成的分级梯度的顶部,并在4℃,使用SW50.1转子(Beckman),以40,000rpm离心12小时。将界面(包含浓缩的颗粒)收集在0.5ml中,与2.0ml 80%的蔗糖混合,并层铺在1.0ml 80%蔗糖缓冲垫层的顶部。将另外的蔗糖层(1.0ml的50%和0.5ml的10%蔗糖)置于样品的顶部。将梯度在4℃,以38,000rpm离心20小时。使用polystaltic泵,将梯度从底部收集到一个1ml的级分中和8个0.5ml的级分中。使用折射计测定每个级分的密度。在一个实验中制备来自所有的蛋白组合的表达的VLPs,因此能够直接比较结果。
免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳:通过组合一体积的细胞裂解物或蔗糖梯度级分与2体积的TNE缓冲液来进行免疫沉淀。在4℃,将样品与MV特异性多克隆抗体温育16小时。用于沉淀NP、F和HA的抗血清是通过标准方法产生的针对UV灭活的MV激发的兔多克隆抗体。在4℃将免疫复合物(ICs)吸附到蛋白质A(Pansorbin细胞,CALBIOCHEM)上2小时,沉淀,接着在免疫沉淀(IP)洗涤缓冲液(包含0.5%吐温-20和0.4%十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸缓冲盐(PBS)中洗涤3次。将ICs重新悬浮在具有1M β-巯基乙醇(BME)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液(125mM Tris-HCI[pH 6.8]、2%SDS、10%甘油、0.4%溴酚蓝)中并煮沸。将蛋白质在8%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中分离并进行放射自显影。使用Fluor-STM MultiImager(BioRad)完成得到的放射自显影照片的量化。
实施例15:生产呼吸道合胞病毒VLP疫苗
该实施例给出将导致生产特异于呼吸道合胞病毒(RSV)的VLP疫苗的方案。
载体:将编码NP(即,例如,SEQ ID NO:70)、M(即,例如,SEQID NO:66或者,备选地M2-1)、G(即,例如,SEQ ID NO:54)和未裂解的F(即,例如,SEQ ID NO:60)蛋白质的RSV cDNA序列分别亚克隆到表达载体pCAGGS中以产生pCAGGS-NP、pCAGGS-M2-1、pCAGGS-G和pCAGGS-F-R108N/R109N。编码RSV F蛋白的cDNA被突变以消除在氨基酸106-109和131-136处的两个弗林蛋白酶识别位点的其中一个,如前面所报道(Gonzalez-Reyes等,PNAS 98:9859)。裂解的消除将抑制F蛋白融合的能力。细胞-细胞融合的缺乏可能增加VLPs的释放。双突变,R108N/R109N消除一个裂解并抑制该蛋白质的融合活性(Gonzalez-Reyes等,PNAS 98:9859)。没有在其他副粘病毒中发现的另外的RSV蛋白质是NS1、NS2、M2-2和SH,但是所有的都显示对于病毒组装不是必需的(在Collins等,RespiratorySyncytical Virus,in Fields Virology,Ed.Knipe,D.和Howley,P.Lippincott Williams和Wilkins,2001中综述)。G蛋白对于组装也不是必需的,但是有助于针对病毒的保护性免疫反应。
细胞系:RSV高效生长在来自人和动物来源的多种细胞系中。然而,HEp-2细胞(Hela细胞变体)在病毒生产中是最有效的(在Collins等,Respiratory Syncytical Virus,in Fields Virology,Ed.Knipe,D.和Howley,P.Lippincott Williams和Wilkins,2001中综述),因此将使用这些细胞。还将使用也报道许可RSV的A549细胞(II型肺泡上皮肺癌细胞)。
转染、感染和代谢标记:如生产商所推荐,使用Lipofectamine(Invitrogen)进行分汇合细胞的转染。将下列量的质粒DNA用在每个35mm碟中:1.0μg pCAGGS-NP,1.0μgpCAGGS-M2-1、0.75μg pCAGGS-F-R108N/R109N 和1.0μgpCAGGS-G。在所有的转染实验中使用总共3.75μg的质粒DNA/每个35mm板。当仅使用一种、两种或三种cDNAs时,通过加入载体pCAGGSDNA保持转染的DNA的总量恒定。对于每次转染,将DNA和5μl的Lipofectamine在OptiME培养基(Gibco/Invitrogen)中的混合物在室温温育45分钟,并加入至预先用OptiMEM洗涤的细胞中。将细胞温育5小时,并去除Lipofectamine-DNA复合物,并加入2ml的补充的DMEM。36小时后,将培养基用0.7ml不含半胱氨酸和蛋氨酸并补充了100μCi的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸混合物(NEG-772EASYTAGTM表达蛋白质标记混合物,35S,Perkin ElmerLife Sciences Inc.)的DMEM进行替换。4小时的脉冲标记后,将一组转染板裂解,同时在另一组中培养基用1.0ml的含有0.1mM冷蛋氨酸(Nutritional Biochemicals Corporation)的补充的DMEM进行替换。8小时的示踪后,收集培养基。此外,将细胞进行超声处理以释放细胞相关的VLPs。组合得到的细胞上清液。将细胞在0.5ml裂解缓冲液(10mM NaCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl pH7.4)中裂解,所述缓冲液包含Triton-DOC(1%Triton、1%脱氧胆酸钠)和1.25mg N-乙基马来酰亚胺(NEM)。用细胞刮器收集细胞并以通过26号针10-15次来进行均质化。
为了确定VPS途径是否涉及VLP出芽,用pCAGGS-M2-1和不同浓度的pBJ5-Vps4-E228Q-Flag或pDsRed2-N1-CHMP3同时转染分汇合的HEP-2细胞。将相应的空载体用作对照。将细胞温育36小时并如上述进行相同的脉冲-示踪程序。
为了产生病毒颗粒作为对照,如上所述,将细胞以10pfu的MOI感染30小时,并用35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸混合物标记4小时,并在非放射性培养基中示踪8小时。如下面所述收集细胞上清液并纯化毒粒。如上所述裂解细胞并进行均质化。
病毒和VLP纯化:将VLPs以及毒粒按照前面对于病毒纯化所开发的方法从细胞上清液中进行纯化。将细胞上清液在4℃以5000rpm离心5分钟以进行澄清,并层铺在由3.5ml 20%和0.5ml 65%的在TNE缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA)中的蔗糖溶液组成的分级梯度的顶部,并在4℃、使用SW50.1转子(Beckman),以40,000rpm离心12小时。将界面(包含浓缩的颗粒)收集在0.5ml中,与2.0ml 80%的蔗糖混合,并层铺在1.0ml 80%蔗糖缓冲垫层的顶部。将另外的蔗糖层(1.0ml的50%和0.5ml的10%蔗糖)置于样品的顶部。将梯度在4℃,以38,000rpm离心20小时。使用polystaltic泵,将梯度从底部收集到一个1ml的级分中和8个0.5ml的级分中。使用折射计测定每个级分的密度。在一个实验中制备来自所有的蛋白组合的表达的VLPs,因此能够直接比较结果。
免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳:通过组合一体积的细胞裂解物或蔗糖梯度级分与2体积的TNE缓冲液来进行免疫沉淀。在4℃,将样品与RSV特异性多克隆抗体温育16小时。所用的抗血清可以商购于多个供货商。在4℃将免疫复合物(ICs)吸附到蛋白质A(Pansorbin细胞,CALBIOCHEM)上2小时,沉淀,接着在免疫沉淀(IP)洗涤缓冲液(包含0.5%吐温-20和0.4%十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸缓冲盐(PBS)中洗涤3次。将ICs重新悬浮在具有1M β-巯基乙醇(BME)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液(125mM Tris-HCl[pH 6.8]、2%SDS、10%甘油、0.4%溴酚蓝)中并煮沸。将蛋白质在8%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中分离并进行放射自显影。使用Fluor-STM MultiImager(BioRad)完成得到的放射自显影照片的量化。
实施例16:生产副流感3VLP疫苗
该实施例给出导致生产特异于副流感3型(PIV)的VLP疫苗的方案。
载体:将编码NP(即,例如,SEQ ID NO:76)、M(即,例如,SEQID NO:80)、HN(即,例如,SEQ ID NO:84)和未裂解的F(即,例如,SEQ ID NO:78)蛋白质的PIV3cDNA序列分别亚克隆到表达载体pCAGGS中以产生pCAGGS-NP、pCAGGS-M、pCAGGS-HN和pCAGGS-F。突变编码PIV3F蛋白的cDNA以消除在氨基酸109的弗林蛋白酶识别位点。将在氨基酸108处的赖氨酸改变为甘氨酸。裂解的消除将抑制F蛋白融合的能力。缺乏细胞-细胞融合可能增加VLPs的释放。
细胞系:PIV 3高效生长在来自人和灵长类动物来源的多种细胞系中。因此,将使用Hela细胞(人宫颈癌细胞)、293细胞(人胚肾细胞)、VERO细胞(非洲绿猴肾细胞)和COS-7(灵长类动物)细胞。(在Chanock等,Parainfluenza,in Fields Virology,Ed.Knipe,D.和Howley,P.Lippincott Williams和Wilkins,2001中综述。还可以使用LLC-MK2(恒河猴肾细胞)和NCI-H292(人肺癌)细胞,因为它们已成功地用于产生病毒。
转染、感染和代谢标记:如生产商所推荐,使用Lipofectamine(Invitrogen)进行分汇合细胞的转染。将下列量的质粒DNA用在每个35mm碟中:1.0μg pCAGGS-NP、1.0μg pCAGGS-M、0.75μgpCAGGS-F-K108G和1.0μg pCAGGS-HN。在所有的转染实验中使用总共3.75μg的质粒DNA/每个35mm板。当仅使用一种、两种或三种cDNAs时,通过加入载体pCAGGSDNA保持转染的DNA的总量恒定。对于每次转染,将DNA和5μl的Lipofectamine在OptiME培养基(Gibco/Invitrogen)中的混合物在室温温育45分钟,并加入至预先用OptiMEM洗涤的细胞中。将细胞温育5小时,并去除Lipofectamine-DNA复合物,并加入2ml的补充的DMEM。36小时后,培养基用0.7ml不含半胱氨酸和蛋氨酸并补充了100μCi的35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸混合物(NEG-772EASYTAGTM表达蛋白质标记混合物35S,Perkin Elmer Life Sciences Inc.)的DMEM进行替换。4小时的脉冲标记后,将一组转染板裂解,同时在另一组中培养基用1.0ml的含有0.1mM冷蛋氨酸(Nutritional Biochemicals Corporation)的DMEM进行替换。8小时的示踪后,收集细胞上清液。将细胞在0.5ml裂解缓冲液(10mM NaCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HClpH7.4)中裂解,所述缓冲液包含Triton-DOC(1%Triton、1%脱氧胆酸钠)和1.25mg N-乙基马来酰亚胺(NEM)。用细胞刮器收集细胞并经通过26号针10-15次来进行均质化。
为了确定VPS途径是否涉及VLP出芽,用pCAGGS-M和不同浓度的pBJ5-Vps4-E228Q-Flag或pDsRed2-N 1-CHMP3同时转染分汇合的HEp-2细胞。将相应的空载体用作对照。将细胞温育36小时并如上述进行相同的脉冲-示踪程序。
为了产生病毒颗粒作为对照,如上所述,将细胞以10pfu的MOI感染30小时,并用35S-蛋氨酸和35S-半胱氨酸混合物标记4小时,并在非放射性培养基中示踪8小时。如下面所述收集细胞上清液并纯化毒粒。如上所述裂解细胞并进行均质化。
病毒和VLP纯化:将VLPs以及毒粒按照前面对于病毒纯化所开发的方法从细胞上清液中进行纯化。将细胞上清液在4℃以5000rpm离心5分钟以进行澄清,并层铺在由3.5ml 20%和0.5ml 65%的在TNE缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA)中的蔗糖溶液组成的分级梯度的顶部,并在4℃,使用SW50.1转子(Beckman),以40,000rpm离心12小时。将界面(包含浓缩的颗粒)收集在0.5ml中,与2.0ml 80%的蔗糖混合,并层铺在1.0ml 80%蔗糖缓冲垫层的顶部。将另外的蔗糖层(1.0ml的50%和0.5ml的10%蔗糖)置于样品的顶部。将梯度在4℃,以38,000rpm离心20小时。使用polystaltic泵,将梯度从底部收集到一个1ml的级分中和8个0.5ml的级分中。使用折射计测定每个级分的密度。在一个实验中制备来自所有的蛋白组合的表达的VLPs,因此能够直接比较结果。
免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳:通过组合一体积的细胞裂解物或蔗糖梯度级分与2体积的TNE缓冲液来进行免疫沉淀。在4℃,将样品与PIV3特异性多克隆抗体温育16小时。所用的抗血清可以商购自多个供应商。在4℃将免疫复合物(ICs)吸附到蛋白质A(Pansorbin细胞,CALBIOCHEM)上2小时,沉淀,接着在免疫沉淀(IP)洗涤缓冲液(包含0.5%吐温-20和0.4%十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸缓冲盐(PBS)中洗涤3次。将ICs重新悬浮在具有1Mβ-巯基乙醇(BME)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液(125mM Tris-HCl[pH 6.8]、2%SDS、10%甘油、0.4%溴酚蓝)中并煮沸。将蛋白质在8%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中分离并进行放射自显影。使用Fluor-STM MultiImager(BioRad)完成得到的放射自显影照片的量化。
实施例17
晚期结构域的位点特异性诱变
通过PCR在M蛋白PKSP和YANL序列中于氨基酸216和219以及氨基酸232和235处分别引入突变以产生M-A216A219和M-A232A235。设计特异性位点定向诱变引物以用丙氨酸分别在位置216和219处取代脯氨酸残基,和在位置232和235处取代酪氨酸和亮氨酸残基。通过在氨基酸位置232到235处用PTAP或YPDL序列取代YANL来构建另外的突变M基因。将每个M蛋白突变DNA的完整基因进行测序以证实通过诱变方法没有引入另外的突变。将产生的突变举例说明在图70中。
实施例18
从293T细胞的VLP释放
该实施例评估了对可用的显性阴性突变体人VPS蛋白质对颗粒释放的作用,以及人肾上皮细胞(293T)是否可以支持NDVVLPs的释放。
VLP颗粒从只表达M蛋白的293T细胞(上版)或共表达NP、M、F-K115Q和HN蛋白的293T细胞(底版)释放。附图67,A版。从只表达M蛋白的293T细胞释放的颗粒的密度是非常不均匀的(附图67,A版,上版),非常类似于从只表达M蛋白的鸟类细胞释放的颗粒(数据未显示)。与此相反,从表达所有的四种主要的结构蛋白的293T细胞释放的VLPs在密度上更加均匀。由于没有基因组RNA,这些颗粒与真实病毒(1.2g/cc)相比,致密性(1.18g/cc)稍小;(Lamb等人,In:Paramyxoviridae:The Virus and Their Replication,第三版,第一卷。LippincottWilliams & Wilkins,Philadelphia(2001)))。
这些合并的结果显示从293T细胞中释放M蛋白VLP和完全VLPs。不过如通过在长期非放射性示踪后保留在细胞中的脉冲标记的M蛋白的比例所测量,颗粒从293T细胞释放的效率比从鸟类细胞的VLP释放更低(分别为,50%对比84%,数据未显示)。
实施例19
显性阴性VPS蛋白质突变体抑制颗粒释放
设计该实施例以确定颗粒释放的抑制是否仅是由于显性阴性VPS蛋白质的过量表达造成的。
用载体对照、野生型CHMP3、野生型Vps4A、野生型AIP1、显性阴性(dn)CHMP3、dnVPS4A和dn AIP1转染293T细胞。
每种VPS蛋白质的野生型形式对于颗粒释放几乎没有作用。dn-CHMP3抑制M蛋白颗粒释放达约90%(附图68,版A和B)。Vps4A-E228Q抑制M蛋白VLP释放达约90%(附图68,版C和D),并且AIP-1-RFP抑制颗粒释放达90%(附图68,版E和F)。CHMP3、Vps4A和AIP1显性阴性形式,而不是野生型形式抑制包含所有四种病毒蛋白质的VLPs的释放。附图69。
这些合并的结果显示VLP释放的抑制不是由于VPS蛋白质的过量表达,而是由于dn突变体蛋白质的特异性作用。这些结果支持完整的VPS途径促进M蛋白颗粒释放的结论。
实施例20
YANL序列突变抑制VLP释放
该实施例给出数据显示NDV的M蛋白的L结构域参与颗粒出芽。例如,NDV的M蛋白的序列具有两个可能的L结构域序列,PKSP和YANL,其分别类似于经典的L结构域PTAP和YPXL(Freed,E.O.,“Mechanisms of enveloped virus release”Virus Res 106:85-86(2004))。下面的数据显示通过在这些L结构域序列中诱导突变,可以抑制VLP释放。
用丙氨酸取代在PKSP序列中的脯氨酸残基(M-A216A219);并且用丙氨酸取代在YANL序列中酪氨酸和亮氨酸(M-A232A235)(附图70,A版)。这些突变体M蛋白或单独表达(附图70,B版,提取物)或与NP、F-K115Q和HN蛋白组合表达(附图70,版D,提取物)。颗粒从表达M-A216A219突变体的细胞释放的水平与从表达野生型M蛋白的细胞释放的水平相当。附图5,版B-E。
与此相反,在从表达M-A232A235突变体的细胞释放的颗粒存在明显的减少(附图70,B版)。类似地,M-A232A235突变体蛋白质与NP、F-K115Q和HN蛋白的共表达导致了释放颗粒的80%的减少(附图70,版D,比较泳道6和8以及版E)。从共表达M-A216A219突变体蛋白质与NP、F-K115Q和HN蛋白的细胞释放的VLPs的量与野生型水平相当(附图70,版D,泳道6和7)。
为了确定YANL序列突变对颗粒释放的抑制是由L结构域活性的消除还是由M蛋白的构象缺陷所导致,分别用两个已知的经典L结构域序列,YPDL和PTAP取代YANL序列(Morita等人,“Retrovirusbudding”Annu Rev Cell Dev Biol 20:395-425(2004);Strack等人,“AIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1p6and EIAV p9funetioning in virus budding”Cell 114:689-699(2003))。
YPDL和PTAP序列都支持NDV的M蛋白颗粒的释放。附图705,版B&C。从包含取代的YPDL和PTAP基序的NDV的M蛋白释放的颗粒的量与野生型水平相当。这些结果有力地说明在NDV的M蛋白的位置232到235处的YANL序列作为L结构域发挥功能。
在YPXL L结构域具有gag蛋白质的逆转录病毒颗粒包含AIP1(Strack等人,“AIP1/ALIX is a binding partner for HIV-1p6andEIAV p9functioning in virus budding”Cell 114:689-699(2003))并且可以代表在包含NDV的VLP蛋白质或毒粒蛋白质的、在SDS-PAGE凝胶中具有大约100kD大小的多肽。AIP1被并入到NDV颗粒和VLPs中,由此共表达M蛋白和在N端的HA-标记的AIP1(HA-AIP1)或在C端的HA-标记的AIP1(AIP1-HA),或共表达M蛋白与载体。M蛋白颗粒从表达M蛋白与载体的细胞以及表达M蛋白和HA-标记的AIP1的细胞中释放。附图71,A版。HA-AIP1和AIP1-HA的表达具有可比的水平(附图71,A版,IB提取物凝胶,泳道2和3)。不过,仅AIP1-HA并入VLPs中(附图71,A版,IB VLP凝胶泳道3)。AIP1-HA也可以从纯化的破裂的VLPs中沉淀。附图71,B版,右。
这些结果证明AIP1并入到VLPs中并提示AIP1可以与颗粒中的M蛋白直接或间接相互作用。
实施例21
共免疫沉淀
将纯化的VLPs在冰冷的TNE缓冲液(25mM Tris HCl,pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA)中温育15分钟,所述TNE缓冲液包含1%Triton X-100、2.5mg/ml N-乙基马来酰亚胺。加入过量的一抗并将VLPs在4℃温育过夜。将Pansorbin细胞在包含1%Triton X-100和5mg牛血清白蛋白(BSA)的TNE缓冲液中封闭过夜,接着在包含1%Triton X-100和1mg/ml BSA的TNE中预洗涤,再如在初步实验中所测定的过量加入,并且继续在4℃温育,伴随持续混合至少2小时。通过离心(在微型离心机中,10,000rpm,30秒)收集免疫复合物,并在包含0.5%Triton X-100的冰冷的TNE中洗涤三次。将沉淀的复合物重新悬浮在凝胶样品缓冲液中。
实施例22
蛋白酶保护测定法
通过每ml样品加入0.25、0.5、1、5、10和20μg的蛋白酶K并在冰上温育30分钟来进行来自鸟类细胞提取物的M蛋白和VLPs的蛋白酶消化。平行地,还在用蛋白酶K温育前,以0.5%Triton X-100制备VLPs。消化后,加入苯甲基磺酰氟(PMSF)(0.1M)。对于随后的免疫沉淀,以1%Triton X-100和0.5%脱氧胆酸钠制备反应混合物。
实施例23
免疫荧光显微镜方法
如上所述,用NDVcDNAs的不同组合转染在包含玻璃盖玻片的35mm碟中生长的鸟类细胞。40小时后,在37℃,将细胞核用5μg/ml的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色30分钟。用冰冷的免疫荧光(IF)缓冲液(包含1%牛血清白蛋白、0.02%叠氮化钠和5mM CaCl2的PBS)洗涤细胞两次,用2%的多聚甲醛固定,用IF缓冲液封闭2小时,并且在4℃,在包含针对HN和F蛋白的多克隆抗体的IF缓冲液中温育1小时。
将细胞用冰冷的IF缓冲液洗涤两次,用0.05%Triton X-100渗透,用IF缓冲液封闭至少2小时,并在4℃,在包含纯化的腹水的IF缓冲液中温育1小时,所述腹水包含抗M蛋白单克隆抗体(52-E5)。接着用冰冷的缓冲液洗涤细胞两次,随后在4℃,在包含荧光素偶联的羊抗兔IgG(488;Molecular Probes)和罗丹明偶联的羊抗小鼠IgG(568;Molecular Probes)二抗的IF缓冲液中温育1小时。将细胞用冰冷的IF缓冲液洗涤,使用封固剂(VectorLabs,Inc)封片在玻璃上以进行免疫荧光显微镜观察。使用尼康荧光显微镜和软件获得荧光图像并使用Adobe处理。
实施例24
膜相关的M蛋白
该实施例通过用蛋白酶温育提供数据证实蔗糖梯度的数据,所述蔗糖梯度的数据说明M蛋白可能与膜相关。
VLPs和细胞提取物是未处理的(附图62,泳道1)或用不同浓度的蛋白酶K(泳道2到7)进行处理。如预期,细胞提取物中的M蛋白对低浓度的蛋白酶敏感(附图62上版)。M蛋白下面的较低条带是蛋白酶消化产物,说明M蛋白具有蛋白酶抗性核心。然而,VLPs的M蛋白大部分都被保护免于蛋白酶消化(附图62,中版)。与此相反,用去垢剂破坏颗粒膜导致M蛋白的消化(附图62,下版)。
总而言之,这些结果证明M蛋白VLPs是膜结合颗粒。
实施例25
M蛋白介导的VLP释放
该实施例通过研究在缺乏M蛋白基因时,VLPs的释放来扩展与对于VLP释放充分的M蛋白相关的数据。
在缺乏M基因时,用NP、F和HN cDNAs的所有可能的组合转染细胞。表达缺乏M蛋白的蛋白的任何组合的细胞没有释放VLPs。附图63。另外,在缺乏M蛋白时,NP、F和HN蛋白(以成对组合表达)在8小时示踪后仍保留在细胞提取物中(附图3;A版:泳道2、4和5以及C版)。
这些结果有力地支持VLP释放是由M蛋白介导的。
实施例26
M蛋白/糖蛋白共定位
该实施例进一步研究每种蛋白质在VLP组装中的作用。具体地,通过免疫荧光确定M、F和HN蛋白的质膜定位。
在细胞透化之前,将转染的细胞用抗F蛋白或抗HN蛋白抗体温育以限制抗体与细胞表面F或HN蛋白的结合。接着,使用0.05%Triton X-100透化细胞,接着将其与M蛋白特异性抗体一起温育。
载体转染的对照细胞以及分别表达M、F-K115Q或HN蛋白的细胞证明F-K115Q和HN蛋白分散地分布在细胞表面(附图64,A版)。M蛋白显示扩散的细胞质染色以及各种大小的细孔状结构(附图64,A版;抗M图像和融合的图像)。然而,F或HN蛋白与M蛋白的共表达对M蛋白、F蛋白或HN蛋白的分布几乎没有作用。此外,很少和没有观察到F或HN糖蛋白与M蛋白的共定位。
附图64,B版。这些观察与成对共表达后,F或HN蛋白向包含M蛋白的VLPs中的极少结合相关。
M蛋白与至少两种其它蛋白质的共表达轻微改变了M蛋白的分布。例如,M蛋白与F和HN蛋白的共表达增加了M蛋白与F或HN蛋白的共定位。附图64,C版。该结果与当两种蛋白与M蛋白共表达时,HN、F或NP蛋白的并入增加相一致。
当所有的四种蛋白质共表达时,M蛋白的分布被改变成主要沿细胞边缘分布的、更多细孔状的结构。此外,大多数F或HN蛋白信号与M蛋白共定位。附图64,版D。尽管不必理解本发明的机制,但相信该结果与当所有的四种蛋白共表达时VLPs更加有序的组装相一致。
总而言之,这些结果显示关于三种蛋白质的表达检测到病毒蛋白质的共定位,并且所述共定位当NP、M、F和HN蛋白共表达时是最显著的。这些结果还说明存在涉及组装颗粒的特异性蛋白质-蛋白质相互作用。
实施例27
VLP病毒蛋白质的相互作用
该实施例提供使用共同免疫沉淀技术来鉴定涉及VLP组装的数种特异性蛋白质相互作用。
将用不同组合的蛋白质形成的、放射性标记的VLPs溶解在1%Triton X-100中并且用针对M、HN或F蛋白的单特异性抗体的混合物分别沉淀存在的蛋白质。还将蛋白质用具有针对所有蛋白质具有特异性的抗体的混合物进行沉淀以沉淀总的VLP蛋白质(泳道6)。
首先,尽管每种蛋白质的沉淀效率随抗体特异性而改变,每种抗体的混合物从用M、HN、F和NP形成的VLPs中沉淀所有的蛋白质(附图65,A版)。尽管不必理解本发明的机制,相信这些结果与所有四种蛋白质之间的相互作用的网络一致从而使其中之一的沉淀导致其他三种蛋白质的沉淀。
这些结果还说明与沉淀的蛋白质间接相连的蛋白质和与沉淀的蛋白质直接相连的蛋白质相比,沉淀的效率更低。例如,抗F蛋白抗体非常有效地沉淀NP,而非常无效地沉淀M蛋白(泳道3)。这种观察显示在F蛋白和NP之间可能存在直接连接,但是在F蛋白和M蛋白之间可能不存在直接连接。
通过沉淀来自用三种蛋白质的所有组合形成的VLPs的蛋白质更清楚地进行限定在VLPs中的蛋白质相互作用。在从表达M、F-K115Q和HN蛋白的细胞释放的VLPs中,抗F蛋白仅沉淀F蛋白质和痕量的HN蛋白(附图65,B版,泳道3)。该结果说明F蛋白没有直接与M蛋白复合。
抗HN蛋白抗体共沉淀M蛋白和HN蛋白(附图65,B版,泳道4)。同样地,抗M蛋白抗体共沉淀HN蛋白和M蛋白(附图65,B版,泳道5)。这些结果有力地显示M蛋白与HN蛋白,而不是与F蛋白相互作用。
还释放包含NP、M和F-K115Q蛋白质的VLPs。抗F蛋白抗体共沉淀NP和F蛋白,而不是M蛋白。(附图65,C版,泳道3)。抗M蛋白抗体共沉淀NP和M蛋白,而不是F蛋白(附图65,C版,泳道4)。这些观察说明M蛋白与NP直接相互作用,F蛋白与NP相互作用,并且证实F和M蛋白不相互作用。
尽管不必理解本发明的机制,但相信抗M蛋白抗体不间接沉淀可检测量的F蛋白是因为NP蛋白的低效沉淀可能减少沉淀的F蛋白的量到极低的水平。或者,沉淀F蛋白与抗M蛋白抗体所需要的NP-NP相互作用可能被VLP裂解所破坏。例如,当使用包含NP、M和HN的VLPs时,用抗HN蛋白抗体形成的复合物包含NP和M蛋白以及HN蛋白(附图65,版D,泳道3)。此外,抗M蛋白抗体沉淀NP和HN蛋白(附图65,版D,泳道4)。这些观察与M蛋白与NP和HN蛋白二者相互作用的结论是一致的。在一个实施方案中进一步包括,HN蛋白和NP蛋白可以相互作用。
总之,VLPs中蛋白质共同免疫沉淀的结果以及细胞共定位研究的结果为病毒蛋白质并入VLPs提供了合理的基础,并提示特异性蛋白质相互作用参与NDV病毒样颗粒的组装。
Claims (15)
1. 一种方法,其包括;
a)提供,
i)包含编码新城疫病毒基质蛋白的DNA序列的表达载体;
ii)能够被所述载体转染的细胞;
b)在生成新城疫病毒样颗粒的条件下用所述载体转染所述细胞。
2. 权利要求1的方法,进一步包括步骤c)收获所述病毒样颗粒从而生成无细胞的颗粒制剂。
3. 权利要求2的方法,进一步包括步骤d)向鸡施用包含所述颗粒制剂的疫苗。
4. 权利要求2的方法,其中所述细胞是细胞培养物的一部分并且所述收获包括由所述培养物的上清液中获得所述颗粒。
5. 权利要求4的方法,其中所述细胞培养物包含鸟类细胞。
6. 权利要求1的方法,其中所述载体进一步包含编码其它新城疫病毒蛋白质的DNA序列,所述其它新城疫病毒蛋白质选自核壳体蛋白、融合蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。
7. 权利要求1的方法,其中所述颗粒不含新城疫病毒DNA。
8. 权利要求1的经转染的细胞。
9. 根据权利要求2生成的颗粒制剂。
10. 一种方法,其包括;
a)提供,
i)包含新城疫病毒样颗粒的疫苗,所述颗粒包含新城疫病毒基质蛋白;
ii)对新城疫易感的宿主;
b)在产生针对所述病毒样颗粒的抗体的条件下,用所述疫苗免疫所述宿主。
11. 权利要求10的方法,其中所述宿主选自鸟类、鼠和人。
12. 权利要求10的方法,其中所述颗粒进一步包含一种或多种其它新城疫病毒蛋白质,其选自融合蛋白、核壳体蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。
13. 一种包含新城疫病毒样颗粒的疫苗,所述颗粒包含新城疫病毒基质蛋白。
14. 权利要求13的疫苗,其中所述颗粒不含新城疫病毒DNA。
15. 权利要求13的疫苗,其中所述颗粒进一步包含一种或多种其它病毒蛋白质,其选自融合蛋白、核壳体蛋白和血凝素-神经氨酸酶蛋白。
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