CN113214366B

CN113214366B - 一种重组新城疫病毒基质蛋白及其应用

Info

Publication number: CN113214366B
Application number: CN202110571930.2A
Authority: CN
Inventors: 仇旭升; 丁铲; 孟春春; 谭磊; 孙英杰; 于圣青; 刘炜玮; 宋翠萍; 廖瑛
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113214366A

Abstract

本发明提供了一种重组新城疫病毒基质蛋白及其应用，所述重组新城疫病毒基质蛋白为发生了R247K和/或S263R突变的基质蛋白；所述新城疫病毒为新城疫病毒疫苗株La Sota株。本发明还提供了一种核酸分子、一种重组载体、一种重组细胞、一种重组新城疫病毒及其制备方法以及一种新城疫病毒疫苗。所述重组新城疫病毒基质蛋白具有更好的核质穿梭效率、更强的出胞能力及更快的出芽速度，可以促进新城疫病毒的增殖与释放；含有重组基质蛋白的重组新城疫病毒具有更高的滴度和更快的增殖速度，且依然保持弱毒毒力，对于疫苗的研发与改进具有重要的意义。

Description

一种重组新城疫病毒基质蛋白及其应用

技术领域

本发明属于重组病毒蛋白技术领域，尤其涉及一种重组新城疫病毒基质蛋白及其应用。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是国际兽疫局(OIE)列出的危害全球养禽业的高度接触性、烈性动物传染病病原之一。NDV属于副黏病毒科、正腮腺炎病毒属、禽正腮腺炎病毒I型，是一类有囊膜病毒，基因组由不分节段的单股负链RNA构成，依次编码NP-P-M-F-HN-L多种结构蛋白。

NDV曾经给养禽业造成了严重的经济损失，因此，研发相应的疫苗具有重要的意义。CN106754765A公开了一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用，通过将新城疫病毒M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行组装形成空心化结构的蛋白颗粒，可应用于相关疫苗的制备中。然而，该方法制备过程繁琐，对人员的技术水平要求较高，且生产成本较高，限制了相关产品的应用。

目前，应用最为广泛的新城疫病毒疫苗株为LaSota株，可制成弱毒活疫苗或灭活疫苗。新城疫是一种传播能力极强的病原，商品化禽类在生产过程中需要多次免疫，因此对于该疫苗的需求量巨大，而病毒的产量直接决定疫苗的生产数量，与生产成本直接相关。因此，如何在疫苗制备过程中提高病毒的滴度，增加疫苗产量，降低生产成本，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种重组新城疫病毒基质蛋白及其应用，通过对La Sota株的基质蛋白进行改造，提高了其出核效率，进而提高VLPs的出芽效率及病毒的增殖效率，含有重组基质蛋白的重组病毒的滴度更高，制备得到的疫苗效价更好。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种重组新城疫病毒基质蛋白，所述重组新城疫病毒基质蛋白为发生了R247K和/或S263R突变的基质蛋白；

所述新城疫病毒为新城疫病毒疫苗株La Sota株。

本发明中，基质(Matrix protein，M)蛋白简称M蛋白，基因长度约1.2kb，相对分子量约40kDa，结构较为保守。M蛋白位于病毒囊膜内表面，作为核糖核蛋白复合体与糖蛋白之间的桥梁，在促进子代病毒粒子的组装和出芽过程中起重要作用，同时其依赖于自身携带的出核信号(Nuclear export signal，NES)和入核信号(Nuclear localization signal，NLS)，具有核质穿梭的特点。

本发明中，通过对La Sota株的M蛋白进行R247K和/或S263R的突变改造，显著提高了其核质穿梭的能力，出胞效率更高，进而提高了NDV的VLPs的出芽效率及病毒的增殖效率。含有上述重组M蛋白的重组La Sota株病毒的增殖速度明显加快，病毒滴度显著提高，具有极高的应用价值。

优选地，所述重组新城疫病毒基质蛋白包括SEQ ID No.1～3所示的氨基酸序列中的任意一种。

SEQ ID No.1：KKGKKVTFDKLEKKIRS；

SEQ ID No.2：RKGKKVTFDKLEKKIRR；

SEQ ID No.3：KKGKKVTFDKLEKKIRR。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的重组新城疫病毒基质蛋白。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.4～6所示的核苷酸序列中的任意一种。

SEQ ID No.4：aagaaggggaagaaagtgacatttgacaagctggaaaagaaaataaggagc；

SEQ ID No.5：aggaaggggaagaaagtgacatttgacaagctggaaaagaaaataaggaga；

SEQ ID No.6：aagaaggggaagaaagtgacatttgacaagctggaaaagaaaataaggaga。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的重组载体。

优选地，所述重组细胞中还含有辅助质粒。

第五方面，本发明提供了一种重组新城疫病毒，所述重组新城疫病毒含有第一方面所述的重组新城疫病毒基质蛋白和/或第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述重组新城疫病毒由第四方面所述的重组细胞培养得到。

本发明中，含有重组M蛋白的重组La Sota株病毒的增殖速度更快，病毒滴度更高，更适合应用于NDV疫苗的制备中。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的重组新城疫病毒的制备方法，所述制备方法包括：

将重组载体和辅助质粒共转染至包装细胞中，得到重组细胞；培养所得重组细胞，收集培养上清，接种至鸡胚中，传代培养，得到所述的重组新城疫病毒。

本发明中，通过将编码重组M蛋白及编码NDV病毒其他蛋白的重组载体及辅助质粒共同转染至重组细胞中，培养后收集上清，即可获得重组病毒，技术成熟，成功率高；获得重组病毒后再进行接种鸡胚复壮，可以刺激重组病毒的复制及增殖能力，病毒的滴度更高，制备得到的疫苗效价更高。

优选地，所述重组载体含有编码所述重组新城疫病毒的全长序列。

优选地，所述包装细胞包括BSR T7/5细胞。

优选地，所述辅助质粒包括PCI-NP、PCI-P或PCI-L中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述培养的时间为54～66h，例如可以是54h、55h、56h、57h、58h、59h、60h、61h、62h、63h、64h、65h或66h，优选为60h。

优选地，所述传代培养的次数为4～6次，例如可以是4次、5次或6次，优选为5次。

作为优选技术方案，本发明所述重组新城疫病毒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将编码所述重组新城疫病毒的全长序列的重组载体和辅助质粒PCI-NP、PCI-P和PCI-L共转染至BSR T7/5细胞中，得到重组细胞；

(2)培养所得重组细胞54～66h，收集培养上清，接种至鸡胚中，传代培养4～6次，得到所述的重组新城疫病毒。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的重组新城疫病毒基质蛋白、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组细胞、第五方面所述的重组新城疫病毒或第六方面所述的重组新城疫病毒的制备方法中的任意一种或至少两种的组合在制备新城疫病毒疫苗方面的应用。

本发明中，所述重组新城疫病毒基质蛋白的出芽能力更强，所述重组新城疫病毒具有更强的复制及增殖能力，滴度更高，且制备方法技术成熟，制备得到的疫苗效价更高，可以降低生产成本，具有实际应用的价值。

第八方面，本发明提供了一种新城疫病毒疫苗，所述新城疫病毒疫苗含有第一方面所述的重组新城疫病毒基质蛋白和/或第五方面所述的重组新城疫病毒。

本发明中，可以将重组M蛋白制成蛋白疫苗，或将重组新城疫病毒制成减毒/灭活疫苗，可以显著提高禽类对NDV的防御能力，降低或避免经济损失，促进养禽业的发展，具有广阔的应用前景。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)相比于野生型M蛋白，本发明所述重组新城疫基质蛋白具有更好的核质穿梭效率、更强的出胞能力及更快的出芽速度，从而促进NDV病毒的增殖与释放，具有实际应用的价值；

(2)含有所述重组M蛋白的重组新城疫病毒具有更高的滴度、弱毒毒力及更快的增殖速度，第三代病毒的血凝价均不低于12.00±0.87b，第四代病毒的血凝价均不低于10.81±1.07b,c，第五代病毒的血凝价均不低于11.40±0.49b；TCID₅₀值均不低于10^5.25；MDT均不高于117.4h；ICPI数值与野生型相比无明显变化；在DF-1细胞和HeLa细胞中的增殖速度均明显提高，为NDV疫苗的改造创造了条件，在生产实践中具有极其重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中菌液PCR扩增的结果图片，图中，泳道M-标准DNA分子量marker，泳道1～9-单克隆菌落的PCR扩增结果；

图2为本发明实施例2中分别转染了编码野生型M蛋白、发生R247K突变的重组M蛋白、发生S263R突变的重组M蛋白以及发生R247K和S263R突变的重组M蛋白的真核表达载体的HeLa细胞的间接免疫荧光的结果图片；

图3为本发明实施例2中分别转染了编码野生型M蛋白、发生R247K突变的重组M蛋白、发生S263R突变的重组M蛋白以及发生R247K和S263R突变的重组M蛋白的真核表达载体的HeLa细胞在转染后12/24/48h的M蛋白、GAPDH和actin表达量的WB结果图片；

图4为本发明实施例2中分别转染了编码野生型M蛋白、发生R247K突变的重组M蛋白、发生S263R突变的重组M蛋白以及发生R247K和S263R突变的重组M蛋白的真核表达载体的293T细胞在转染后24和48h在VLPs和细胞中M蛋白和GAPDH表达量的WB结果图片；

图5为本发明实施例3中菌液PCR扩增的结果图片，图中，泳道M-标准DNA分子量marker，泳道1-单克隆菌落的片段1的PCR扩增结果，泳道2-单克隆菌落的片段2的PCR扩增结果，泳道3-单克隆菌落的片段3的PCR扩增结果，泳道4-单克隆菌落的片段4的PCR扩增结果；

图6为本发明实施例5中野生型La Sota病毒、M蛋白发生了R247K突变的重组LaSota病毒、M蛋白发生了S263R突变的重组La Sota病毒以及M蛋白发生了R247K和S263R突变的重组La Sota病毒在DF-1细胞中的生长曲线图片；

图7为本发明实施例5中野生型La Sota病毒、M蛋白发生了R247K突变的重组LaSota病毒、M蛋白发生了S263R突变的重组La Sota病毒以及M蛋白发生了R247K和S263R突变的重组La Sota病毒在HeLa细胞中的生长曲线图片。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

高保真PCR酶、快速定点突变同源重组试剂盒、T4 DNA连接酶、DpnI酶和重组酶ExnaseII购自诺维赞；

EcoRI和XbaI购自ThermoFisher；

Opti-MEM培养基购自Gibco；

转染试剂Fugene HD和反转录酶购自Promega；

多聚甲醛购自上海生工；

TritonX购自BioFroxx；

BSA购自Formerty ICN Biomedicals(InC)；

一抗、二抗购自CST；

NC膜购自Millipore；

ECL发光液购自圣尔生物；

HeLa细胞、293T细胞和DF-1来自ATCC；

TVT-La Sota C5质粒为实验室前期构建，构建过程参见《新城疫病毒La Sota C5株感染性克隆的构建及病毒拯救》(中国动物传染病学报，2013，21(6)：1～7.)；

质粒提取试剂盒购自QIAGEN；

鸡胚来自济南赛斯家禽。

实施例1

本实施例构建含有发生了R247K突变、S263R突变和R247K和S263R突变的重组M蛋白的真核表达重组载体，所述重组载体通过如下步骤制备得到：

(1)根据La Sota毒株M蛋白(GenBank登录号：AEY84921.1)全长核苷酸序列设计M蛋白点突变引物，并引入XbaI和EcoRI酶切位点，其中，R247K点突变的引物序列如SEQ IDNo.7～8所示，S263R点突变的引物序列如SEQ ID No.9～10所示，扩增M蛋白的引物序列如SEQ ID No.11～12所示。

SEQ ID No.7：accgtagataagaaggggaagaaagtgacat；

SEQ ID No.8：tccccttcttatctacggtggtcataagtc；

SEQ ID No.9：taaggagacttgatctatctgtcgggct；

SEQ ID No.10：agatcaagtctccttattttcttttccag；

SEQ ID No.11：ttaagcttgcggccgcgaattcatg；

SEQ ID No.12：tctttgtagtcagcccgggatcctc。

(2)获取M蛋白点突变目的序列

使用高保真PCR酶以野生型M蛋白的序列作为模板进行扩增，第一轮Overlap PCR反应体系如下：

扩增程序如下：

预变性：95℃，3min；

循环扩增：95℃，10s；55℃，60s；72℃，30s；循环30次；

延伸：72℃，10min。

扩增时，使用点突变引物分别与上/下游引物进行扩增，得到两个分段的PCR扩增产物，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并胶回收后，以扩增产物作为模板进行第二轮OverlapPCR，反应体系如下：

扩增程序如下：

预变性：95℃，3min；

循环扩增：95℃，10s；55℃，90s；72℃，30s；循环30次；

延伸：72℃，10min。

扩增结束后，将PCR扩增产物全部进行凝胶电泳检测，并切取1100bp左右的目的条带进行纯化回收。

(3)突变目的片段与真核表达载体p3×FLAG-CMV14的连接

将切胶纯化后的扩增产物进行双酶切，体系如下：

反应体系置于37℃下水浴酶切2h，切胶回收目的片段，使用T4连接酶进行连接，反应体系如下：

在16℃下连接过夜。

(4)重组载体的鉴定与提取

连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布在Amp抗性LB平板上，过夜培养后，挑取单克隆菌落进行培养，随后进行菌液PCR鉴定，使用的引物为SEQ ID No.11～12，扩增体系如下：

扩增程序如下：

预变性：95℃，3min；

循环扩增：95℃，10s；55℃，45s；72℃，1min；循环30次；

延伸：72℃，10min。

对扩增产物进行凝胶电泳验证，结果如图1所示。选取扩增条带在1200bp左右的菌液送交测序，选取测序结果正确的菌液扩大培养，并参照试剂盒上的说明书提取质粒，成功制备得到所述重组载体。

实施例2

本实施例使用实施例1构建的重组载体，验证重组M蛋白的功能。

核质穿梭效率验证

将构建的表达重组M蛋白真核表达载体分别瞬时转染至HeLa细胞中，转染后24h进行固定，并进行间接免疫荧光观察。同时参照实施例1中的方法构建表达野生型M蛋白的真核表达载体进行相同的操作作为对照，过程如下：

(1)质粒瞬时转染

①转染前12h，按照1.2×10⁶个细胞/孔接种细胞于六孔板中，细胞密度为60％～80％时进行转染；

②取100μL Opti-MEM培养基于1.5mL无菌EP管中，加入6μL转染试剂Fugene HD，移液枪轻轻吹打混匀，静置5min；

③加入2μg质粒，轻弹混匀，静置15min，形成转染复合物；

④PBS清洗细胞3次，每孔加入1mL Opti-MEM培养基，将转染复合物缓慢滴加入细胞孔中，并轻轻混匀培养基，将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下培养，4h后，PBS清洗细胞3次，加入2mL 2％FBS DMEM维持液常规培养。

(2)间接免疫荧光观察

①将转染后的细胞用PBS清洗3次，向每孔加入1mL新鲜配置的4％多聚甲醛，轻轻晃动六孔板，室温固定15min；

②用1×TBST清洗3次，去除残余液体后每孔加入1mL 0.5％TritonX-100TBST，透化15min；

③用1×TBST清洗3次，去除残余液体后每孔加入1mL 5％BSA，置于37℃水浴箱封闭1h；

④去除封闭液，每孔用1×TBST清洗三次，加入一抗，置于37℃水浴箱中孵育2h；

⑤去除一抗，用1×TBST置于摇床上清洗3次，每次5min，洗净残留一抗；

⑥加入二抗，置于37℃水浴锅中避光孵育1h；

⑦去除二抗，用1×TBST置于摇床上清洗3次，每次5min，洗净残留二抗；

⑧按照1:1000比例稀释DAPI原液，配置DAPI核染色液，每孔加入1mL核染色液，室温孵育10min；

⑨每孔用1×TBST置于摇床上清洗3次，每次5min，洗净残留DAPI；

⑩滴如抗荧光淬灭剂，在避光阴凉处风干3h，置于荧光显微镜下观察。

重组载体瞬时转染的间接免疫荧光图片如图2所示。由图可知，与野生型M蛋白相比，发生了R247K突变、S263R突变以及R247K和S263R突变的重组M蛋白的出核效率得以提升，这表明发生R247K和/或S263R突变后，M蛋白的核质穿梭效率得以提升。

出胞能力验证

将编码野生型及重组M蛋白的真核表达载体瞬时转染至HeLa细胞中，培养12/24/48h后收集样品，通过WB验证点突变是否会影响M蛋白的出胞能力，步骤如下：

(1)质粒瞬时转染：与核质穿梭效率验证中相同；

(2)蛋白样品的收集：

①弃细胞培养上清，每孔加入1mL PBS，轻轻晃动，洗净细胞后，弃上清，重复操作3次；

②每孔加入300μL胰酶，待细胞沙状脱落后，加入600μL含10％FBS的DMEM培养基中和胰酶，吹打，将细胞收集在EP管内，以500×g的转速离心10min，弃上清；

③加入1mL PBS重悬细胞，以500×g的转速离心10min，弃上清；

④将沉淀细胞震散，加入100μL WB裂解液，震荡混匀，冰浴10min；

⑤12000×rpm离心5min，取上清，加入新EP管中；

⑥在上清中加入蛋白上样缓冲液，颠倒混匀，瞬时离心；

⑦金属浴100℃煮样10min，使蛋白质样品变性后，放置在-20℃保存备用。

(3)WB检测：

①配置10％的蛋白分离胶及5％的蛋白浓缩胶；

②SDS-PAGE凝胶电泳：蛋白样品室温解冻，上下颠倒EP管使蛋白混匀后瞬时离心。每种样品取10μL上样，以恒压80V电泳30min后，观察到蛋白Ladder逐级分开且所有蛋白样品电泳至分离胶同一水平线时，电压调至120V继续电泳至溴酚蓝泳动至分离胶底部；

③蛋白转印：电泳结束后，从蛋白胶玻璃板中取出凝胶，并将滤纸、海绵、裁剪后大小适中的NC膜及蛋白胶一起浸泡于已预冷的转印缓冲液中，按照“负极-海绵-滤纸-蛋白胶-NC膜-滤纸-海绵-正极”的顺序安装成类似“夹心面包”的结构；在电泳槽内加入预冷的1×转印液，并在转印槽外加入适量冰袋及冰水，恒流250mA在冰浴条件下转印90min；

④封闭：转印结束后，使用5％脱脂乳将NC膜在室温下于摇床上缓慢摇动，封闭1h；

⑤封闭结束后，去除封闭液，用1×TBST洗NC膜，每次5min，重复操作3次，去除残留脱脂乳；

⑥一抗孵育：用加入5％BSA的1×TBST稀释一抗，并按1:1000加入防腐剂以防抗体变质；将NC膜旋转放置于有抗体的离心管中，4℃孵育过夜；

⑦将NC膜取出后用1×TBST清洗，每次5min，重复操作3次，去除残留一抗；

⑧按照1:5000稀释比例稀释二抗，将NC膜旋转放置于有抗体的离心管中，室温孵育1h；

⑨将NC膜取出后用1×TBST洗膜，每次5min，重复操作3次，去除残留二抗；

⑩避光配置ECL发光液，将发光液均匀置于NC膜上，在化学成像分析仪中显影并观察。

验证结果如图3所示。由图可知，与野生型M蛋白相比，发生了R247K突变、S263R突变以及R247K和S263R突变的重组M蛋白的胞内表达量显著降低，说明分泌到胞外的M蛋白的表达量显著提高，表明发生了R247K和/或S263R突变后，M蛋白的出胞效率得以提升。

出芽能力验证

将编码野生型及重组M蛋白的真核表达载体瞬时转染至293T细胞中，培养24/48/72h后收集细胞上清，超滤浓缩后，通过WB验证VLPs的出芽效率，步骤如下：

(1)质粒瞬时转染：参照核质穿梭效率验证中的方法；

(2)VLPs的收集：

转染后24和48h分别收取细胞上清至15mL离心管中，在4℃下，以转速5000×g离心10min，去除悬浮的死细胞后，将上清转移至50mL Millipore蛋白超滤管中，借助超滤管NMWL滤膜进行蛋白浓缩，在4℃下，以离心力6000×g离心5min，将200μL滤膜上清再转移至15mL Millipore超滤管中，在4℃下，以离心力8000×g离心至最终体积为100μL，使细胞上清浓缩倍数一致，最后将产物保存于-80℃。

(3)WB检测：与出胞能力验证中相同。

验证结果如图4所示。由图可知，与野生型M蛋白相比，发生了R247K突变、S263R突变以及R247K和S263R突变的重组M蛋白的VLPs分泌量显著提高，进一步证明发生了R247K和/或S263R突变后，M蛋白的出芽能力得以提升，VLPs分泌能力增强。

综合上述结果，表明发生了R247K和/或S263R突变后，重组M蛋白的核质穿梭能力增强，出胞效率得以提升，VLPs的出芽率显著提高，说明本发明所述的重组M蛋白可以通过提高病毒的出芽效率进而促进病毒的增殖。

实施例3

本实施例分别构建编码含有发生了R247K突变、S263R突变和R247K和S263R突变的重组M蛋白的La Sota病毒的全长序列的重组载体，所述重组载体通过如下步骤制备得到：

(1)将La Sota全长片段分为4个大片段，分段扩增后利用快速定点突变同源重组试剂盒进行定点突变和同源重组，引物序列如SEQ ID No.13～23所示。

SEQ ID No.13：cgtagataagaaggggaagaaagtgacatttga；

SEQ ID No.14：tccccttcttatctacggtggtcataagtccaatat；

SEQ ID No.15：aggagacttgatctatctgtcgggctcagtga；

SEQ ID No.16：gatagatcaagtctccttattttcttttccagcttgt；

SEQ ID No.17：gacatttgacaagctggaaaagaaaataaggagacttgatctatctgtcgggctca；

SEQ ID No.18：ccagcttgtcaaatgtcactttcttccccttcttatctacggtggtcataagtccaatat；

SEQ ID No.19：tcgccacatgtaaaggctgccctaagggcatca；

SEQ ID No.20：agcctttacatgtggcgacatatgagctatttt；

SEQ ID No.21：cgactcactataggaccaaacagagaatccgtgagtta；

SEQ ID No.22：tggtcctatagtgagtcgtattaatttcgcggg；

SEQ ID No.23：ggggcacctatccatgacccagattatatagg。

(2)PCR扩增

以TVT-La Sota C5质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系如下：

扩增程序如下：

预变性：95℃，30s；

循环扩增：95℃，15s；55℃，15s；72℃，3min；循环30次；

延伸：72℃，10min。

(3)消化去除模板DNA

使用DpnI酶对扩增产物进行处理，反应体系如下：

将反应体系置于37℃下孵育1h。

(4)同源重组反应

反应体系如下：

其中，DpnI消化产物使用量＝(0.02×目标片段碱基对数)ng。

将反应体系置于37℃下孵育30min，随后置于冰上冷却。

(5)重组载体的鉴定与提取

连接产物转化HB101感受态细胞，涂布在氨苄抗性LB平板上，过夜培养后，挑取单克隆菌落进行培养，随后进行菌液PCR鉴定，使用的引物如SEQ ID No.13～23所示。

以菌液为模板进行PCR扩增，扩增体系如下：

扩增程序如下：

预变性：95℃，30s；

循环扩增：95℃，15s；55℃，15s；72℃，3min；循环30次；

延伸：72℃，10min。

对扩增产物进行凝胶电泳验证，结果如图5所示，可以看出4个片段均扩增成功。将相应的菌液送交测序，选取测序结果正确的菌液扩大培养，并参照试剂盒上的说明书提取质粒，成功制备得到所述重组载体。

实施例4

本实施例使用实施例3制备的编码含有发生了R247K突变、S263R突变和R247K和S263R突变的重组M蛋白的La Sota病毒的全长序列的重组载体，分别构建重组La Sota病毒，步骤如下：

(1)将重组载体和辅助质粒PCI-NP、PCI-P和PCI-L共转染至BSR T7/5细胞中，得到重组细胞：

①复苏BSR-T7/5细胞，将其培养于含有1mg/mL的G418的DMEM培养基中；转染前12h，将细胞接种于六孔板中，用不含抗生素、含有10％FBS的DMEM培养，细胞密度为60％～80％时进行转染；

②将冻存的MVA用无血清无抗生素的DMEM稀释500倍备用，将六孔板取出，用无菌PBS洗涤细胞3次，将痘苗病毒MVA稀释液按照每孔600μL加入六孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中吸附30min；

③EP管中加入100μL的Opti-MEM，以转染试剂FuGENE HD和质粒总和数目按照1:3的比例向EP管加入10μL FuGENE HD，混匀静置5min；

④将编码含有重组M蛋白的La Sota病毒的全长序列的重组载体和辅助质粒按照pCI-NP:pCI-P:pCI-L:重组载体＝2.0μg:1.0μg:0.5μg:5.0μg的比例加入A管中，轻微吹打混匀15min形成转染复合物，同时设计阴性对照；

⑤将孵育过痘苗病毒MVA的BSR细胞用无菌的PBS清洗3遍，每孔加入1mL Opti-MEM，将转染复合物均匀滴加到每孔中，得到所述重组细胞。

(2)培养所得重组细胞60h，收集培养上清，接种至鸡胚中，传代培养5次，得到所述的重组新城疫病毒：

①转染24h后，每孔加入1μg/mL的TPCK胰酶，间隔12h观察细胞状态，若细胞出现死亡飘浮现象，则向每孔滴加200μL FBS；

②转染60h后，收集细胞上清，每孔用200μL胰酶轻轻消化贴壁细胞，弃胰酶消化液，用收集的细胞上清轻轻吹落细胞，一并收集至EP管中；

③取新鲜上清接种9日龄SPF鸡胚，先用碘伏棉球对鸡胚气室进针位置进行轻微擦拭消毒，5min后使用75％酒精棉球反复擦拭鸡胚进行脱碘；

使用消毒的镊子快速轻敲鸡胚气室顶部，敲出小孔后，使用一次性无菌1mL针头按200μL/枚接种培养上清，最后用石蜡封住进针孔，防止污染；

接种后的SPF鸡胚置于37℃鸡胚培养箱中培养96h；

④将鸡胚取出置于4℃过夜，隔日收集尿囊液，按照OIE标准，检测鸡胚血凝价，表明拯救成功；

⑤将病毒传代至第五代后提取尿囊液RNA，反转录为cDNA后进行PCR扩增，步骤如下：

在超净台中使用无RNA酶的Tip枪头将鸡胚尿囊液和TRIzol抽提试剂按照1:1的比例吹打混匀，置于RNase-Free EP管中；

每个EP管中加入200μL氯仿，反复剧烈震动15s，室温静置3min；

在4℃下，12000×g离心15min，将上层水相转入新的RNase-Free EP管中，加入等体积异丙醇，来回混匀数次后，置于-20℃放置30min，沉淀RNA；

沉淀后，在4℃下，12000×g离心15min；

弃上清，使用1mL 75％乙醇清洗沉淀，在4℃下，12000×g离心15min，重复1次后，空离5min，吸干残留液体；

吹干多余的乙醇，加入DEPC水溶解；

反转录体系如下：

反转录程序如下：

先将DEPC水与引物混合，70℃水浴10min后冰浴5min；

加入其他组分，37℃水浴2h后，75℃孵育5min，得到反转录产物。

以反转录产物作为模板进行PCR验证，扩增的体系及程序与实施例3中重组载体的鉴定中的相同。扩增产物大小与预期相符，将其送交测序，测序结果显示突变位点均成功突变，未发生回复突变且其他部位无突变，证明所述重组La Sota病毒制备成功。

实施例5

本实施例验证实施例4制备的3株重组La Sota病毒的生物学特性，同时使用野生型La Sota病毒作为对照。

血凝价测定

将重组病毒持续传代至第五代，每代次每种病毒稀释至10^-3，每种重组病毒至少接胚10枚，单枚胚接种100μL病毒稀释液。鸡胚接种培养96h后收取含有重组病毒的尿囊液，用新鲜阴性鸡血制得1％红细胞悬液进行血凝价测定。

在96孔血凝板中，每孔加入25μL无菌PBS，随后将重组病毒稀释液按照每孔25μL依次加入至血凝板中，混匀进行倍比稀释，室温等待15min判断血凝结果。第三代到第五代的血凝价测定结果如表1所示。

表1

由表1可以看出，含有重组M蛋白的重组La Sota病毒的血凝价均高于野生型LaSota，说明M蛋白发生了R247K和/或S263R突变后可以提高NDV的滴度，这对于相关疫苗的研发与制备具有重要的意义。

TCID₅₀测定

将四种病毒按10^-1至10^-8的稀释度进行稀释，并接种于96孔板中的DF-1细胞，50h后用4％多聚甲醛固定，通过间接免疫荧光观察细胞的病变情况，使用NDV La Sota鼠多抗和Alexa Fluor 488nm鼠荧光二抗孵育，操作步骤与实施例2中的相同。对结果进行统计，如表2所示。

表2

病毒	TCID<sub>50</sub>
		rLa Sota-WT	10<sup>4.6</sup>
rLa Sota-R247K	10<sup>5.25</sup>
		rLa Sota-S263R	10<sup>5.77</sup>
rLa Sota-R247K&S263R	10<sup>5.5</sup>

由表2可以看出，M蛋白突变后，TCID₅₀显著增高，进一步证实了M蛋白发生R247K和/或S263R突变可以使La Sota滴度增加，应用价值更高。

MDT测定

使用无菌PBS对四种病毒按10^-5至10^-9进行稀释，每种病毒的每个稀释度接种5只9日龄鸡胚，剂量为100μL/只，置于37℃恒温箱连续孵育7天，每天间隔6h观察并记录死亡时间，对结果进行统计，如表3所示。

表3

病毒	MDT(h)
		rLa Sota-WT	142
rLa Sota-R247K	117.4
		rLa Sota-S263R	115
rLa Sota-R247K&S263R	113

由表3可以看出，重组NDV病毒的MDT时间显著缩短，说明当M蛋白发生R247K和/或S263R突变后，可以增加La Sota毒株对鸡胚的毒力。

ICPI测定

使用无菌PBS对四种病毒按10^-5至10^-9进行稀释，每种病毒的每个稀释度在颅内接种10只1日龄SPF雏鸡，剂量为500μL/只，将雏鸡置于隔离器中连续观察8天，计算ICPI数值，对结果进行统计，如表4所示。

表4

病毒	ICPI
		rLa Sota-WT	0
rLa Sota-R247K	0.005
		rLa Sota-S263R	0.005
rLa Sota-R247K&S263R	0

由表4可以看出，重组NDV病毒的ICPI数值相比野生型病毒无明显差别，说明M蛋白发生R247K和/或S263R突变后，对雏鸡的毒力无影响。

生长曲线测定

将四种病毒以5MOI分别接种于DF-1细胞和HeLa细胞中，收取6/12/18/24/30/36h的细胞上清，提取RNA并反转录为cDNA后，进行RT-PCR，扩增La Sota NP基因，计算NP基因的拷贝数作为衡量病毒增殖速率的标准，RNA提取、反转录及扩增反应与实施例4中相同，生长曲线如图6和图7所示。

由图可以看出，M蛋白突变后，重组La Sota在DF-1细胞和HeLa细胞中的增殖速度均明显提高，说明M蛋白发生R247K和/或S263R突变后可以提高重组病毒在宿主细胞中的增殖速率，病毒释放速率也有提高，这对于NDV疫苗的制备具有重要的意义。

综上所述，本发明提供了一种发生R247K和/或S263R突变的重组新城疫基质蛋白，其具有更高的核质穿梭效率、出胞效率及出芽能力，可以促进病毒的增殖；含有重组基质蛋白的重组新城疫病毒具有更高的血凝价、更高的病毒滴度，对鸡胚的毒力更强，对雏鸡的感染能力无影响，增殖速度更快，病毒释放的速率也更快，对于NDV疫苗的制备具有重要的意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海

分中心)

<120> 一种重组新城疫病毒基质蛋白及其应用

<130> 2021

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Lys Gly Lys Lys Val Thr Phe Asp Lys Leu Glu Lys Lys Ile Arg

1 5 10 15

Ser

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Arg Lys Gly Lys Lys Val Thr Phe Asp Lys Leu Glu Lys Lys Ile Arg

1 5 10 15

Arg

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Lys Lys Gly Lys Lys Val Thr Phe Asp Lys Leu Glu Lys Lys Ile Arg

1 5 10 15

Arg

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagaagggga agaaagtgac atttgacaag ctggaaaaga aaataaggag c 51

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggaagggga agaaagtgac atttgacaag ctggaaaaga aaataaggag a 51

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagaagggga agaaagtgac atttgacaag ctggaaaaga aaataaggag a 51

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accgtagata agaaggggaa gaaagtgaca t 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tccccttctt atctacggtg gtcataagtc 30

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taaggagact tgatctatct gtcgggct 28

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agatcaagtc tccttatttt cttttccag 29

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttaagcttgc ggccgcgaat tcatg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tctttgtagt cagcccggga tcctc 25

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtagataag aaggggaaga aagtgacatt tga 33

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tccccttctt atctacggtg gtcataagtc caatat 36

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aggagacttg atctatctgt cgggctcagt ga 32

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gatagatcaa gtctccttat tttcttttcc agcttgt 37

<210> 17

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gacatttgac aagctggaaa agaaaataag gagacttgat ctatctgtcg ggctca 56

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccagcttgtc aaatgtcact ttcttcccct tcttatctac ggtggtcata agtccaatat 60

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcgccacatg taaaggctgc cctaagggca tca 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agcctttaca tgtggcgaca tatgagctat ttt 33

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgactcacta taggaccaaa cagagaatcc gtgagtta 38

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tggtcctata gtgagtcgta ttaatttcgc ggg 33

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ggggcaccta tccatgaccc agattatata gg 32

Claims

1.一种重组新城疫病毒基质蛋白，其特征在于，所述重组新城疫病毒基质蛋白为发生了R247K和S263R突变的基质蛋白；

突变前的基质蛋白为M蛋白，其GenBank登录号为AEY84921.1；

所述新城疫病毒为新城疫病毒疫苗株La Sota株。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的重组新城疫病毒基质蛋白；

所述核酸分子包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中还含有辅助质粒。

6.一种重组新城疫病毒，其特征在于，所述重组新城疫病毒含有权利要求1所述的重组新城疫病毒基质蛋白和/或权利要求2所述的核酸分子。

7.一种权利要求6所述的重组新城疫病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将重组载体和辅助质粒共转染至包装细胞中，得到重组细胞；培养所得重组细胞，收集培养上清，接种至鸡胚中，传代培养，得到所述的重组新城疫病毒；

所述重组载体含有编码所述重组新城疫病毒的全长序列；

所述包装细胞包括BSR T7/5细胞；

所述辅助质粒包括PCI-NP、PCI-P或PCI-L中的任意一种或至少两种的组合；

所述培养的时间为54~66 h；

所述传代培养的次数为4~6次。

8.根据权利要求7所述的重组新城疫病毒的制备方法，其特征在于，所述培养的时间为60 h；

所述传代培养的次数为5次。

9.根据权利要求7所述的重组新城疫病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

（1）将编码所述重组新城疫病毒的全长序列的重组载体和辅助质粒PCI-NP、PCI-P和PCI-L共转染至BSR T7/5细胞中，得到重组细胞；

（2）培养所得重组细胞54~66 h，收集培养上清，接种至鸡胚中，传代培养4~6次，得到所述的重组新城疫病毒。

10.权利要求1所述的重组新城疫病毒基质蛋白、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体、权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求6所述的重组新城疫病毒中的任意一种或至少两种的组合在制备新城疫病毒疫苗方面的应用。

11.一种新城疫病毒疫苗，其特征在于，所述新城疫病毒疫苗含有权利要求1所述的重组新城疫病毒基质蛋白和/或权利要求6所述的重组新城疫病毒。