KR101546064B1 - 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자 - Google Patents

인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자{Newcastle disease virus virus-like particles expressing NDV fusion protein along with influenza virus matrix1 protein and use of the same}
본 발명은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자 및 그 용도에 관한 것이다.
뉴캣슬 병 바이러스 (NDV), 조류 파라미소바이러스 serotype 1 (APMV-1)으로 알려지고, Paramyxoviridae 계 아부라바이러스 속의 일원인 엔벨로프된 비분절 네가티브-가닥 RNA 바이러스이다. 특별하게 대뇌병원성 지수(intracerebral pathogenicity index;ICPI)에 의한 닭에 대한 그들의 병원성에 기반하여, NDVs는 준임상적(asymptomatic), 경증형(lentogenic), 중간독(mesogenic), 또는 강독형(virulent) 균주로 분류된다[OIE Terrestrial Manual 2012 [Chapter 2.3.14. Newcastle disease] ]. 이들 NDV 균주에 의한 감염 중에서, 강독형 NDV 균주에 의한 감염만을 가금 산업에서 가장 심각한 질환 중 하나인 뉴캣슬 병 (이하, 'ND'라 함)으로 정의한다[OIE Terrestrial Manual 2012 [Chapter 2.3.14. Newcastle disease] , Saif YM, Barnes HJ: Diseases of poultry. 12th edn. Ames, Iowa: Blackwell Pub. Professional; 2008]. 1926에 영국 Newcastle-upon-Tyne에서 처음으로 인지된 후, ND는 전세계적으로 거대한 경제적인 손실을 야기하는 전 세계적인 지역에 걸친 풍토병화되었다[Saif YM, Barnes HJ: Diseases of poultry . 12th edn. Ames, Iowa: Blackwell Pub. Professional; 2008]. ND 대발생(outbreak)은 종종 완전하게 영향받는 가금 종에서는 약 100% 치사를 야기하고, 대발생의 심각한 충격으로 인하여, ND는 세계 동물 보건기구 (OIE) 리스트 A 질병에 속하였으며, 현재 OIE 신고의무질병 (notifiabel disease) 으로 지정되어 있다.
최근, ND를 제어하기 위하여, 전세계적으로 많은 나라들에서 강력한 백신화 정책을 유지하고 있다. 전통적으로, 블활 또는 생 NDV 백신을 ND를 제어하기 위하여 사용하였다. 이들 백신은 특히 ND 풍토병 지역에서 수 세기 동안 일상적으로 사용하여 왔고, ND 대발생에 대한 효과적인 제어방법으로 작용하여 왔다[OIE Terrestrial Manual 2012 [Chapter 2.3.14. Newcastle disease]]. 그러나 ND 제어에 대한 그들의 기여에도 불불구하고, 이들 백신은 감염된 동물을 백신화된 동물과 구별(DIVA)에 대한 현저한 제한을 가지고, 이것은 견고한 보호 효과를 가지며 DIVA 전략을 가능하게 하는 신규 백신의 개발을 필요로 한다.
실제 바이러스 구조와 형태학적으로 유사한 바이러스-유사 입자(이하, 'VLP'라 함)는 여러 바이러스 병균에 대한 신규한 백신 항원으로 제안되어 왔다[Roldao A, Mellado MC, Castilho LR, Carrondo MJ, Alves PM: Expert review of vaccines 2010, 9:1149-1176;Kang SM, Kim MC, Compans RW: Expert review of vaccines 2012, 11:995-1007;Kushnir N, Streatfield SJ, Yusibov V: Vaccine 2012, 31:58-83].
VLPs는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 생성되어 왔고[Kushnir N, Streatfield SJ, Yusibov V: Vaccine 2012, 31:58-83;Noad R, Roy P: Trends Microbiol 2003, 11:438-444], VLP 백신은 여러 바이러스 병원균에 대한 높은 수준의 보호 효과를 준다. 숙주 면역 반응을 자극하는 모드, 안정성, 면역원성 및 보호 효과가 최근 연구에서 잘 기재되어 있다[Kang SM, Yoo DG, Kim MC, Song JM, Park MK, Eunju O, Quan FS, Akira S, Compans RW: Journal of virology 2011, 85:11391-11400;Akahata W, Yang ZY, Andersen H, Sun S, Holdaway HA, Kong WP, Lewis MG, Higgs S, Rossmann MG, Rao S, Nabel GJ: Nature medicine 2010, 16:334-338;Cubas R, Zhang S, Kwon S, Sevick-Muraca EM, Li M, Chen C, Yao Q: J Immunother 2009, 32:118-128;Jennings GT, Bachmann MF: Biological chemistry 2008, 389:521-536]. NDV VLPs의 형성은 조류 세포주를 사용한 Pantua et al.에 의하여 처음 기술되었으나[OIE Terrestrial Manual 2012 [Chapter 2.3.14. Newcastle disease] ], 닭에서 NDV VLP 백신의 강독 NDV공격에 대한 보호효과는 연구된 적이 없다.
[선행 특허문헌]
대한민국특허공개번호 제 10-2008-0072627
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 및 전좌를 통하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 얻는 모든 돌연변이 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 및 전좌를 통하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 얻는 모든 돌연변이 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질를 코딩하는 유전자와 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 각각 트랜스퍼 벡터에 클로닝하고, 상기 재조합된 트랜스퍼 벡터를 곤충세포에 트랜스퍼하여 재조합 베큘로바이러스를 제조하고, 상기 재조합 베큘로바이러스를 곤충세포에 동시 감염시켜, 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자가 형성되는 조건 하에서 발현하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 유전자는 뉴캣슬 병 바이러스 균주로부터 바이러스 RNA를 추출하여 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의하여 얻은 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 곤충세포는 Sf9 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 바이러스 유사입자를 조류에 투여하는 단계를 포함하는 조류에서 면역력을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스 유사입자의 용량은 10ug 내지 50ug/0.5ml인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 항원 조제물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 항원 조제물을 조류에 투여하는 단계를 포함하는 조류에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서, 본 발명자들은 최초로 곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 (M1) 단백질과 함께 NDV 융합 (F) 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 (NDV) 바이러스-유사입자(VLP)를 개발하고 특정 무균 닭에서 강독 NDV 공격 접종에 대한 보호 효과 및 면역원성을 평가하였다.또한, DIVA 테스트를 백신화되고 감염된 닭을 VLP 백신화된 닭과 구별하기 위하여 수행하였다.
본 발명자들은 곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 (이하, 'M1'이라 함) 단백질과 함께 NDV 융합 (이하, 'F'라 함) 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 (NDV) 바이러스-유사입자(이하, 'VLP'라 함)를 개발하였다. 특정한 무균 닭을 증가되는 용량(0.4, 2, 10, 또는 50ug의 VLP/0.5ml/dose)의 VLPs을 함유하는 오일 유화 NDV VLP으로 면역화하였다. 면역화 3 주 후, NDV VLP 백신의 면역원성(immunogenicity)을 상용 ELISA 키트를 사용하여 결정하였고, 강력한 병원성 NDV 균주로 공격접종을 NDV VLP 백신의 보호 효과를 평가하기 위하여 수행하였다. NDV VLP 백신은 항-NDV 항체를 생성하고 용량의존적으로 공격접종에 대한 보호를 제공하였다. 비록 0.4 또는 2ug의 VLPs를 함유한 VLP 백신이 높은 수준의 보호를 달성하는데는 실패하였지만, 10ug 또는 50ug를 함유하는 NDV VLP 백신로 단일 면역화는 공격접종으로부터 닭을 완전하게 보호할 수 있었고 공격(challenge) 바이러스 배출(shedding)을 크게 감소시켰다. 또한, 본 발명자들은 헤마글루틴화(hemagglutination) 저해 테스트를 사용하여 감염된 동물을 백신화된 동물과 구별(DIVA;differentiating infected from vaccinated animals) 테스트를 수행하였다. 이 결과들은 가금 종에서 NDV VLP 백신의 이용은 ND의 효과적인 제어를 위한 유망한 전략일 수 있다는 것을 강력하게 시사한다.
본 발명자들은 곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 최초로 NDV VLP 백신을 개발하였고, 그것은 높은 면역원성을 가지고 강독 NDV 감염으로부터 닭을 보호하며, 공격 바이러스 배출을 크게 감소시켰다. 또한, DIVA 테스트는 단순한 혈청학적 테스트 HI 테스트를 성공적으로 수행하였다. 이 결과들은 가금 종들에서 NDV VLP 백신의 이용은 ND의 효과적인 제어를 위한 유망한 전략일 수 있다는 것을 강력하게 시사한다.
도 1은 NDV VLPs의 동정. (A) 인플루엔자 M1 단백질에 대한 토끼 다클론 항체 및 NDV F 단백질에 대한 마우스 항-NDV 닭 항혈청을 사용한 웨스턴 블럿팅에 의한 VLP의 분석. 발현된 F 및 M1의 분자량을 왼편에 나타냄. (B) 정제된 NDV VLP의 음성 염색 투사 현미경 조사. 바는 100 nm를 나타냄.
도 2는 NDV에 대한 평균 혈청 항체 수준. 전체 50 마리의 6 주령 SPF 닭(그룹 단 10 마리)을 증가되는 용량의 NDV VLP 백신(0.4, 2, 10, 또는 50ug의 VLP/0.5ml/dose)으로 근육내 면역화하였다. NDV에 대한 혈청 항체 레벨을 단일 면역화 3주 후 상용화된 ELISA 키트를 사용하여 결정하였다. Mock-ISA70을 가지는 PBS의 유화된 용액. Tukey-Kramer post hoc 테스트를 가지는 ANOVA에 의한 *P < 0.05, **P < 0.005, 및 ***P < 0.001
도 3은 강독 NDV 공격 접종 후 임상 스코어 및 생존 곡선. 그룹 당 10마리를 1ml의 105.5 EID50/ml의 강독 NDV 균주 Kr-005/00로 근육내 접종하였다. 그 닭들을 14 일 동안 매일 생존(A) 및 임상 증상을 조사하였다. 임상 증상의 분류는 하기와 같다:정상(스코어 0), 경 우울증(스코어 1), 신경변증 및/또는 심한 우울증(스코어 2), 또는 사망(스코어 3). 일상 스코어는 주어진 날 동안 그룹 당 모든 닭에 대한 평균 값들을 나타낸다.
도 4는 HI 테스트를 사용한 DIVA 테스트. 혈청 샘플을 접종 0 일 및 14일 후 50ug VLP 백신, 2ug VLP 백신 또는 통상적인 불활 NDV 백신으로 면역화된 닭으로부터 취함. 혈청 샘플을 NDV LaSota 균주에 대한 HI 항체의 존재에 대한 표준 HI 테스트로 분석. 평균±SEM를 나타냄. 언페어된 t-테스트에 의한 ***p < 0.001 by unpaired t-test.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 뉴캣슬 병 바이러스 F 및 인플루엔자 M1 유전자의 클로닝
NDV F 유전자의 증폭을 위하여, 바이러스 RNA를 제조업자의 지시에 따라 Viral Gene-Spin Viral DNA/RNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology, Korea)를 사용한 NDV 균주 Kr-005/00(GenBank accession no.: AY630423)로부터 추출하였다. cDNA 증폭을 위하여, reverse transcription (RT)를 랜덤 헥사머로 Superscript III (Invitrogen, USA)를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하여 사용하였다. 상기 cDNA로부터, NDV F 유전자를 F (+) 5'AGAATTCATGGGCTCCAAACTTTCTAC-3'(서열번호 3) 및 F (-) 5' TAAGCTTTCATGTTCTTG TAGTGGCTC -3'(서열번호 4)를 사용하여 PCR-증폭하였다.
인플루엔자 바이러스 매트릭스1 (M1) 유전자를 증폭하기 위하여, 바이러스 RNA를 인플루엔자 바이러스 균주 A/Puerto Rico/9/1934 (H1N1)로부터 추출하고 인플루엔자 M1 유전자를 Park JK, Lee DH, Youn HN, Kim MS, Lee YN, Yuk SS, Lim TH, Jang JH, Kwon JH, Kim BY, et al: Influenza and other respiratory viruses 2013, 7:340-348에 기재된 것과 같이 증폭하였다.
PCR 증폭된 NDV F 및 인플루엔자 M1 유전자를 TA 클로닝 벡터 pGEM-T (Promega, USA)로 클로닝하고 각 서열을 DNA 시퀀싱에 의하여 결정하였다. NDV F 및 인플루엔자 M1 유전자를 포함하는 두 결과 산물 플라즈미드를 각각 vF 및 vM1으로 명명하였다.
실시예 2: 재조합 베큘로바이러스의 제조 및 NDV VLP의 생산
각각 F 및 vM1으로부터 유래한 F 및 M1 유전자를 pFastBacT1 (Invitrogen) bacmid 트랜스퍼 벡터에 클로닝하였다. F 및 M1 유전자를 함유한 상기 트랜스퍼 벡터를 각각 pF 및 pM1으로 명명하였다. 제조업자의 지시에 따라서 MAX Efficiency®DH10Bac™competent Escherichia coli 세포(Invitrogen)를 상기 구축된 트랜스퍼 벡터 플라즈미드 pF 또는 pM1으로 형질전환하여 재조합 bacmids를 제조하였다. 그 재조합 bacmid를 재조합 베큘로바이러스(rBV)를 제조하기 위하여 6-웰 플레이트에 8x105 cells/well 밀도로 시딩된 Sf9 세포에 Cellfectin Reagent (Invitrogen)를 사용하여 트랜스퍼하였다. NDV F 또는 인플루엔자 바이러스 M1 유전자를 코딩하는 상기 rBV를 각각 rBV F 및 rBV M1으로 명명하였다.
실시예 3: NDV VLP의 생산 및 특성, 그리고 VLP 백신의 제조
NDV VLP 생성을 위하여, Sf9 세포를 72시간 동안 rBV F 및 rBV M1으로 MOI(multiplicity of infection) 5에서 동시감염시켰다. VLPs를 함유한 배양 배지를 모아서 큰 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 저속 원심분리(2000xg, 30 분, 4℃)에 의하여 청징하였고, 그 청징된 상등액으로부터 유래된 VLP를 펠렛화하였다(30,000xg, 1.5 h, 4℃). 그 펠렛을 인산 버퍼 식염수(PBS) 용액(pH 7.2)에 재부유하고, 20-35-50% (w/v) 불연속 수크로스 밀도 구배 상에 로딩하고 초원심분리 (150,000xg, 1.5 h, 4℃)dp 의하여 침전시켰다. 침전 후, 35% 및 50% 수크로스 밀도의 상단에서 두 주요한 가시적인 밴드를 모아서 웨스턴 블럿팅에 의하여 분석하였다. NDV F 단백질의 발현을 NDV에 대한 치킨 다클론 혈청 및 horse-radish peroxidase (HRP)-부착된 토끼 항-chicken IgG 2차 항체(Bethyl, USA)로 검출하였다. 인플루엔자 M1 단백질은 토끼 항-M1 항체(Immune Technology, USA) 및 HRP-부착 염소 항-rabbit IgG 2차 항체(Merck, Germany)로 검출하였다. VLPs의 존재를 음성 염색 방법을 사용하여 투사 전자현미경(TEM)으로 관찰하였다[Lee DH, Bae SW, Park JK, Kwon JH, Yuk SS, Song JM, Kang SM, Kwon YK, Kim HY, Song CS:Vaccine 2013, 31:3268-3273]. NDV VLPs의 최종 단백질 농도는 Bradford Protein Assay (Pierce, USA)으로 정량화하고, 여러 다른 농도의 VLPs를 오일 어쥬번트 Montanide ISA70 (SEPPIC, France)에 30:70 (v/v)의 비로 유화하여 증가되는 용량의 VLP 백신 (0.4, 2, 10, 또는 50ug의 VLP/0.5ml/용량)을 얻었다.
실시예 4: 동물의 면역화 및 면역원성의 결정
전체 50 마리 6주령의 SPF white leghorn 치킨(Namduck Sanitec, Korea)을 5 그룹(10 치킨/그룹)으로 나누고 각각을 표시하였다. 5 그룹의 치킨을 증가되는 용량(0.4, 2, 10, 또는 50ug의 VLP/chicken)의 NDV VLP 백신으로 근육내 면역화(0.5ml/치킨)하였다. mock-백신화된 대조군으로, 또다른 10마리 SPF 치킨들을 ISA70를 가지는 PBS의 유화 용액으로 주사하였다.
본 발명에서 수행된 모든 동물 실험은 건국대학교 동물실험 윤리 위원회(IACUC)에 의하여 감수되고 승인되고 감독되었다. 단일 면역화 3주 후, NDV LaSota 균주(GenBank accession no.: JF950510.1)로 사전 코팅된 상용화된 ELISA 키트(MEDIAN Diagnostics, Korea)를 사용하여 혈청 NDV 특이적인 항체 수준의 결정을 위하여 수집하였다. ELISA 테스트를 제조업자의 지시에 따라 약간 변형하여 수행하였다. 요약하면, 혈청 샘플을 50-배로 희석하고, 웰에 첨가하였다. 20℃에서 30분 후, 플레이트를 세척하고 HRP-부착된 항-chicken immunoglobulin G 항체를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30 분 후에 20℃에서 세척하고. 그 기질 tetramethylbenzidine peroxidase (TMB)를 첨가하고, 그 플레이트를 15 분 동안 20℃에서 배양하였다. 그 반응을 스톱 용액의 첨가에 의하여 정지시키고 450m (OD 450)에서 흡광도를 각 샘플의 S/P 값의 계산[샘플 S/P 값 = (OD450 샘플 - 평균 OD450 negative) / (mean OD450 positive - mean OD450 negative)]을 위하여 ELISA 리더(Tecan, Switzerland)를 사용하여 측정하였다.
실시예 5: 강독 NDV 접종 및 보호 평가
단일 면역화 3 주 후, 닭을 1ml의 105.5 EID50/ml의 강독 NDV 균주 Kr-005/00으로 근육내 접종하였다. NDV VLP 백신의 보호 효과를 평가하기 위하여, 사망률 및 임상 증상을 접종 후 14(dpc)일 동안 매일 관찰하였다. 임상 증상은 정상(스코어 0), 경 우울증(스코어 1), 신경변증 및/또는 심한 우울증(스코어 2), 또는 사망(스코어 3)으로 분류하고 각 그룹에 대한 각 평균 임상 스코어를 매일 계산하였다.
접종 바이러스 배출을 결정하기 위하여, 구강인두(oropharyngeal) 및 배설강(cloacal) 스왑 샘플을 모아서 gentamycin (400ug/ml)으로 보충된 1ml의 PBS에서 at 3, 5, 7, 및 10 dpc에서 부유하였다. 바이러스 RNA를 Viral Gene-Spin Viral DNA/RNA 추출 키트(iNtRon Biotechnology)를 사용하여 150ul의 이 부유액으로부터 추출하고, M 유전자 기반 real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR)을 사용하여 cycle threshold (Ct) 값에 의하여 정량화하였다[Wise MG, Suarez DL, Seal BS, Pedersen JC, Senne DA, King DJ, Kapczynski DR, Spackman E: Journal of clinical microbiology 2004, 42:329-338]. 감염 유닛에 대한 rRT-PCR의 Ct 값의 외삽법(extrapolation)을 위하여, 3 dpc에서 대조군 유래된 일련의 구강인두 및 배설강 스왑 샘플의 희석액을 50% 에그 감염 용량(EID50/mL)으로 계산하였다. 병행해서, 그 해당 바이러스 용량을 rRT-PCR에 의하여 분석하고, 바이러스의 EID50을 바이러스 희석액의 Ct 값에 대해서 작도하였다. 그 보정 곡선은 매우 상관관계가 높았고(r2 > 0.99) Ct 값을 EID50으로 전환하는데 사용하였다.
실시예 6: 감염된 동물을 백신화된 동물과 구별(DIVA)
백신화되고 감염된 치킨으로부터 NDV VLP-백신화된 치킨의 혈청학적 구별을 위하여, HI(hemagglutination inhibition) 테스트를 본 발명에서 개발된 NDV VLP는 hemagglutinin-neuraminidase (HN) 단백질을 포함하지 아니하고 따라서 HI 항체들은 단지 NDV 감염 후에만 나타날 것이기 때문에 사용하였다. 혈청 샘플을 2ug 및 50ug VLP 백신화된 그룹에서 모든 생존 치킨으로부터 벡신화 3주인 0 dpc 및 14 dpc에서 수집하였다. 또한 5주령 SPF 치킨을 3 wpv에서 강독 NDV 균주 Kr-005/00로 접종된 상용화된 불활 오일 유화 ND 백신(Zoetis, USA)으로 근육내 면역화하였다. 이들 다섯 마리 SPF 치킨으로부터 혈청 샘플을 0 dpc 및 14 dpc에서 취하였다. 수집된 혈청 샘플을 NDV LaSota 항원을 사용한 OIE 표준 방법[OIE Terrestrial Manual 2012 [Chapter 2.3.14. Newcastle disease] ]에 따라 HI 항체의 존재에 대하여 분석하였다.
본 발명의 통계분석은 다음과 같이 수행하였다.
Tukey-Kramer post hoctest을 가지는 분산분석(ANOVA)을 그룹 간에 혈청 항체 타이터의 비교를 위하여 수행하였다. Fisher's exact 테스트를 사망률 및 이병률(morbidity) 결과의 통계적 분석을 위하여 사용하였다. 50ug 및 2ug VLP-백신화 그룹 간의 HI 타이터의 차이를 비교하기 위하여, unpaired t-테스트를 사용하였다. p 값< 0.05을 가지는 결과를 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
상기 실시예의 결과는 하기와 같다.
NDV VLP의 특성
NDV F 단백질 및 인플루엔자 M1 단백질을 함유한 NDV VLPs를 Sf9 세포에서 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)을 사용하여 제조하였다. 농축화 및 정제과정은 각각 초원심분리 및 스쿠르스 밀도 구배 원심분리로 수행하였다. 35% 수크로스 밀도의 상단에 위치된 밴드는 웨스턴 블럿팅에 의하여 NDV F1 및 인플루엔자 M1 단백질을 나타내는 48 kDa 및 28 kDa 밴드로 동정된 F 및 M1 단백질 모두를 함유하는 것을 발견하였다(도 1A). F1 단백질의 동정, F 단백질의 절단 산물은 강독 NDV 균주로부터 유래된 sf9 세포는 숙주 프로테이즈에 의하여 절단될 수 있다는 것을 시사한다. TEM에 의한 음성적으로 염색된 제조의 조사는 약 70 nm 직경의 VLP의 존재를 나타내었다(도 2B).
NDV VLP 백신에 대한 면역 반응
NDV VLP 백신의 면역원성을 평가하기 위하여, 혈청전환을 상용화된 ELISA 키트를 사용하여 결정하였다. 단일 면역화 3 주 후, 도 2에 나타낸 것과 같이, VLP 백신화된 그룹은 0.4ug VLP 백신으로 면역화된 그룹을 제외하고는 현저하게 증가된 항체 반응을 나타내었다. 그룹 간의 항체 반응은 10ug VLP 백신까지 농도 의존적으로 증가하는 것을 보였다. 50ug 또는 10ug VLP 백신으로 면역화된 그룹은 다른 그룹에 비하여 통계적으로 유의성을 가지는(p<0.001) 우수한 항체 반응을 나타내었다.
강독 NDV 접종에 대한 보호 및 VLP-백신화된 치킨에서 감소된 바이러스 배출
NDV VLP 백신의 보호 효과를 조사하기 위하여, 강독 NDV 균주로 공격 접종을 단일 면역화 3 주 후에 수행하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이, mock-백신화된 치킨은 적정한 접종이 달성된 것으로 판단되는 접종 4일 이내에 심각한 임상적 증상 및 100% 사망률을 보였다. 0.4ug VLP 백신으로 면역화된 그룹은 100% 심각한 임상적 증상을 가지며 100% 사망률을 보였고, 2ug VLP 백신화된 그룹은 중간 임상 증상을 가지며 부분적인 보호(20% 사망률)를 나타내었다. 특히, 2ug VLP 백신화된 그룹으로부터 유래한 두 생존 치킨은 헤드 틸트(head tilt) 및 후구 부전마비(posterior paresis)를 포함하는 신경 증상을 보였고, 이것은 indicating that 2ug NDV VLP 백신은 치킨에서 강독 NDV 감염에 대해어 높은 수준의 보호 효과를 보이는데 충분하지 않았다. 그러나 10ug 또는 50ug VLP 백신화된 그룹으로 백신화된 치킨은 10ug VLP 백신화된 군으로부터 유래한 한 마리 치킨을 제외하고는 완전한 사망률 및 이환률( morbidity)로부터 보호되었다.
표 1 및 2에 나타낸 것과 같이, 10ug 및 50ug VLP 백신화된 치킨들은 생존하였을 뿐만 아니라 구강인두 및 배설강으로부터 유래한 mock 백신화된 치킨에 비하여도 현저하게 낮은 수준의 접종 바이러스 배출을 나타내엇다. 비록 2ug VLP 백신화된 그룹은 mock 백신화된 그룹에 비하여 현저하게 낮은 수준의 접종 바이러스 배출을 나타내었지만, 그것은 10ug 또는 50ug VLP-백신화된 치킨에 비하여 더 높은 수준의 바이러스 배출을 나타내었다. 2 ug VLP-백신화된 그룹에서 낮은 수준의 보호효과를 나타낸 것은 2ug VLP-백신화된 그룹이 10 또는 50 ug VLP-백신화된 그룹에 비하여 현저하게 낮은 수준의 항체 및 접종 후 사망률을 보인 결과와 일치하였다. 흥미롭게도, 도 4에 나타낸 것과 같이, 2ug VLP 백신화된 그룹은 14 dpc에서 50ug VLP 백신화된 그룹의 것보다 HI 테스트에 의하여 측정된 현저하게 높은 수준의 혈청변환을 나타내었고 접종 바이러스 복제의 억제는 50ug VLP 백신화된 치킨이 2ug VLP 백신화된 치킨에 비하여 더 높다는 것을 지지한다. 0.4ug VLP 백신으로 면역화된 모든 치킨은 사망하였을 뿐만 아니라 접종 바이러스 배출을 감소할 수 없었다.
이 결과는 10ug 또는 50ug NDV VLP 백신으로 치킨의 단일 면역화는 강독 NDV 접종 후 완벽하게 치킨을 보호할 수 있을 뿐아니라 접종 바이러스 배출을 효과적으로 감소시켰다는 것을 시사한다.
감염된 동물을 백신화된 동물과 구별(DIVA)
예측한 것과 같이, HI 항체 반응은 VLP-백신화된 치킨으로부터 접종 전 혈청에서 관찰되지 않았다. 그러나, 도 3에 나타낸 것과 같이, HI 항체는 NDV 접종 후 모든 VLP-백신화된 치킨으로부터 검출되었고, 이것은 DIVA가 가능하게 하였다. 반면, 불활 백신으로 백신화된 치킨 유래 혈청(n=5)은 접종 전 및 후 모두에서 HI 항체에 대해서 모두 포지티브이었다. 따라서, VLP 백신 및 컴페니언 HI 테스트는 상용 불활 백신에 대해 적용할 수 없는 DIVA 전략의 이용을 가능하게 할 수 있다.
Figure 112013068589981-pat00001
표 1은 105.5 EID50 의 강독 NDV 균주로 공격 접종 후 NDV VLP- 및 mock- 백신화된 치킨에서 사망률 및 이환률
Figure 112013068589981-pat00002
표 2는 구강인두 스왑 샘플 유래 접종 바이러스 배출
Figure 112013068589981-pat00003
표 3은 배설강 스왑 샘플 유래 접종 바이러스 배출
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Newcastle disease virus virus-like particles expressing NDV fusion protein along with influenza virus matrix1 protein and use of the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> influenza virus <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 2 <211> 553 <212> PRT <213> Newcastle disease virus <400> 2 Met Gly Ser Lys Leu Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Ile Thr Leu Ile Leu Ser Cys Ile Arg Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Arg 100 105 110 Arg Gln Lys Arg Phe Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly 115 120 125 Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala 130 135 140 Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala 145 150 155 160 Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser 165 170 175 Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn 180 185 190 Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val 195 200 205 Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln 210 215 220 Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn 225 230 235 240 Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly 245 250 255 Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr 260 265 270 Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn 275 280 285 Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu 290 295 300 Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro 305 310 315 320 Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser 325 330 335 Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr 340 345 350 Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser 355 360 365 Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met 370 375 380 Ala Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg 385 390 395 400 Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val 405 410 415 Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile 420 425 430 Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile 435 440 445 Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser 450 455 460 Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Arg 465 470 475 480 Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr 485 490 495 Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu 500 505 510 Val Phe Gly Ala Phe Ser Leu Gly Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys 515 520 525 Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu 530 535 540 Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Thr 545 550

Claims (11)

  1. 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자.
  4. 제1항의 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
  5. 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질(F)을 코딩하는 유전자 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 (M1) 유전자를 백미드(bacmid) 트랜스퍼 벡터에 클로닝하고, Escherichia coli 세포를 상기 구축된 트랜스퍼 벡터 플라즈미드 pF 또는 pM1으로 형질전환하여 재조합 백미드(bacmid)를 제조하고, 그 재조합 백미드(bacmid)를 곤충세포 Sf9 세포에 트랜스퍼하여 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 제조하는 단계를 포함하는 제1항의 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 코딩하는 유전자는 뉴캣슬 병 바이러스 균주로부터 바이러스 RNA를 추출하여 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의하여 얻은 것을 특징으로 하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자 제조방법.
  7. 삭제
  8. 제1항의 바이러스 유사입자를 조류에 투여하는 단계를 포함하는 조류에서 면역력을 유도하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 바이러스 유사입자의 용량은 10ug 내지 50ug/0.5ml인 것을 특징으로 하는 조류에서 면역력을 유도하는 방법.
  10. 제1항의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 항원 조제물.
  11. 제10항의 항원 조제물을 조류에 투여하는 단계를 포함하는 조류에서 면역 반응을 유도하는 방법.
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