KR101753978B1 - 고병원성 조류 인플루엔자(h5n1) 및 뉴캣슬병 바이러스 융합 바이러스 유사 입자 백신 및 이를 이용한 백신 - Google Patents

고병원성 조류 인플루엔자(h5n1) 및 뉴캣슬병 바이러스 융합 바이러스 유사 입자 백신 및 이를 이용한 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자(H5N1) 및 뉴캣슬병 바이러스 융합 바이러스 유사 입자 백신 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.

Description

고병원성 조류 인플루엔자(H5N1) 및 뉴캣슬병 바이러스 융합 바이러스 유사 입자 백신 및 이를 이용한 백신{A chimeric virus-like particle vaccine against lethal HPAIV and NDV infection and vaccine using the same}
본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자(H5N1) 및 뉴캣슬병 바이러스 융합 바이러스 유사 입자 백신 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.
고병원성 조류 인플루엔자(이하, 'HPAI'라 함) 및 뉴캣슬병은 가금류에서 대재앙적인 질환들로 치사율이 100%에 이르며 세계동물보건기구에서 A 급 주의 질환으로 분류되었다. 특히 아시안 H5N1 HPAI 계열은 유라시아 및 아프리카를 포함하는 대륙에 걸쳐 확산되고 있고 1996년 중국에서 최초 검출된 후 남동아시아에서 풍토병화되었다. 또한, 약 60%의 인간 케이스가 치명적으로 판명났으며 H5N1 HPAIV는 인간에서 차세대 인플루엔자 전세계 전염병에 대한 후보가 될 수 있다.
뉴캣슬병(이하, 'ND'라 함)은 가금 및 240 종 이상의 다른 조류에 전염될 수 있는 조류 paramyxovirus 혈청형 1 (APMV-1) 바이러스에 의하여 야기된다. NDV의 악성 균주로 감염된 치사률은 임상적 신호가 거의 없는 완전하게 민감한 닭의 가금 집단에서 100%에 도달할 수 있다.
통상적인 인플루엔자 및 뉴캣슬병 백신은 발육란(embryonated eggs)에서 생선된 불활화된 전체 바이러스 백신에 기반한다. 그들은 높은 생물학적안전성 수준을 요하는 계란에서 성장하는 악성 바이러스에 대한 잠재적인 문제 및 백신접종 개체와 감염개체 감별 (DIVA)에 대한 제한을 가진다.
바이러스 유사입자(Virus-like particles; 이하, 'VLP'라 함)은 신규한 대체 백신 후보물질로 제안되었다 . VLP는 바이러스의 가장 중요한 면역원성 단백질들을 사용하여 제조하고 VLP 백신은 여러 바이러스 병에 대한 높은 수준의 방어 효과를 나타내었다(Lee DH, Park JK, Song CS. 2014. Clin Exp Vaccine Res 3:133-139;Li TC, Yamakawa Y, Suzuki K, Tatsumi M, Razak MA, Uchida T, Takeda N, Miyamura T. 1997. J Virol 71:7207-7213;Buonaguro L, Tornesello ML, Tagliamonte M, Gallo RC, Wang LX, Kamin-Lewis R, Abdelwahab S, Lewis GK, Buonaguro FM. 2006. J Virol 80:9134-91438-10).
인플루엔자의 HA 단백질은 바이러스에서 클래식 타입 I 막 glycoprotein으로 나타난다. 뉴캣슬 병 바이러스의 경우, 바이러스 감염은 두 envelope glycoproteins의 작용에 의하여 시작된다. attachment 단백질(HN)은 세포 표면에 바이러스의 1차 흡착에 관여하고, 융합 단백질(F)은 숙주세포로 투과, 바이러스 유도된 세포 융합 및 hemolysis에 관여한다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 공개특허 제10-2012-0134015호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 고병원성 조류 인플루엔자(H5N1) 및 뉴캣슬병 바이러스 융합 바이러스 유사 입자 백신을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)조류 인플루엔자 A/Chicken/Korea/ES/2003(H5N1)의 헤마글루티닌(HA);
b) 조류 인플루엔자 A/Chicken/Korea/ES/2003(H5N1)의 기질 단백질 M1; 및
c) 뉴캣슬 바이러스 KR-005/00 유래 융합 단백질(F)과 상기 ES03 유래 헤마글루티닌(HA) 단백질의 융합 단백질;을 포함하는 키메릭 바이러스 유사 입자(VLP)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 HA 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하고, 상기 M1 단백질은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하며, 상기 F와 HA 융합 단백질은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 HA 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하고, 상기 M1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5에 기재된 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하며, 상기 F와 HA 융합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6에 기재된 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 키메릭 바이러스 유사 입자 및 보조제(adjuvant) 또는 면역 자극제(immune stimulator)를 포함하는 것인 항원 제형을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 키메릭 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 백신은 조류 인플루엔자 및 뉴캣슬병 바이러스 감염에 대하여 방어효과를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 본 발명의 항원 제형을 투여하는 것을 포함하는 인간을 제외한 동물에서 조류 인플루엔자 및 뉴캣슬병 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 인간을 제외한 동물에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 포함하는 인간을 제외한 동물에서 조류 인플루엔자 및 뉴캣슬병 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 VLP는 면역원 또는 약학 조성물의 조제에 사용된다. 그렇게 하기 위해서는, VLP를 적정 농도가 되게 조정하고 임의의 적당한 보조제, 희석제 또는 담체로 제형된다. 생리학적으로 허용 가능한 매질이 담체 및/또는 희석제로 사용될 수 있다. 이러한 것들로는 적당한 등장성 매질, 글리세롤, 에탄올 및 기타 통상의 용매, 포스페이트 완충 생리식염수 등이 포함되며 이에 한정되지 않는다. 적당한 보조제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, MPLTM(3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton,MT, 현 Corixa), 529와 같은 합성 지질 A 동족체(Corixa), Stimulon TM QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals,Framingham, MA), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드와 같은 합성 폴리뉴클레오타이드(U.S. 특허 No. 6,207,646 (28)), 이.콜라이의 열-불안정성 독소, 및 콜레라독소 (야생형 또는 돌연변이체형에서,예를 들면, 아미노산 위치 29에서의 글루탐산이 또 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 대치될 경우, 공개된 국제특허출원 No. WO 00/18434 (29))가 포함되며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, VLP를 포함하는 제형은 면역원 조성물로서 사용하기 위한 것이다. 바이러스는 단백질(예를 들면, 알부민, 젤라틴), 당(예를 들면, 수크로스, 락토스, 솔비톨), 아미노산(예를 들면, 나트륨 글루타메이트), 생리식염수, 또는 기타 보호제와 같은 저온보호 첨가제 또는 안정제와 혼합시킬 수 있다. 이 혼합물을 액체 상태로 유지시키고, 또는 그런 다음 수송과 보관을 위해 건조 또는 동결 건조시키고 투여 직전에 물과 혼합한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 F/HA 단백질 및 AIV의 HA 및 M1 단백질(AIV HA 단백질의 원형질/막횡단 도메인 및 NDV F 단백질의 ectodomain을 포함한 키메릭 단백질)을 발현하는 곤충 세포주에서 키메릭 VLP를 생산하였다. 이 키메릭 VLP는 효과적으로 생성되고 lethal HPAIV 및 NDV 공격 접종에 대해서 면역화된 특정 병원체 부재(SPF) 닭에서 완전하게 방어하는 것을 나타내었다. 또한, DIVA 테스트는 NDV에 대한 HI 및 AIV에 대한 cELISA와 같은 통상적인 방법들을 사용하여 양 질환 모두에서 VLP-백신화된 닭으로부터 백신 후 감염된 닭을 구별하는 것을 성공적으로 수행되었다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 키메릭 VLP 백신은 강한 면역성을 나타내고 닭에서 lethal HPAIV 및 NDV 감염에 대하여 방어효과를 가지며 DIVA 전략을 가능하게 한다.
도 1은 키메릭 VLPs의 생산을 위한 Baculovirus 컨스트럭트: (A) NDV KR-005/00 strain F 유전자 및 H5N1 avian influenza virus ES03 strain HA를 포함하는 F/HA 융합의 구축. 개략도는 F의 ectodomain, 막횡단(TM) 도메인 및 원형질 테일(CT), HA 단백질 및 junction의 위치를 나타냄. HA 단백질의 TM/CT 도메인은 F 단백질의 C 말단과 융합하여 전장 F/HA 융합 단백질을 형성한다; (B) 그 자신의 Pph(polyhedrin promoter) 및 전사 종결 서열을 가지는 HA, M1, 키메릭 F/HA 유전자를 나타냄.
도 2는 농축된 키메릭 VLP의 분석: (A) anti-H5 단클론 항체를 사용한 HA 단백질의 웨스턴 블럿 동정. M, standard molecular size marker (EBM-1032, Elpisbio), HA, 키메릭 VLPs ; (B) anti-NDV F 항-혈청을 사용한 F/HA 키메릭 단백질의 웨스턴 블럿 동정 ; (C) scale bar를 가지는 키메릭 VLPs의 TEM 동정.
도 3은 백신화 3 주 후 HI 타이너: 혈청 샘플들을 ES03 H5 AIV에 대한 HI 항체의 존재에 대한 표준 HI 테스트로 분석. 에러 바는 표준 편차를 나타냄. ***, P<0.001, **, P<0.01
도 4는 lethal HPAIV 공격 접종 후 생존 곡선. 면역화 3 주 후, SPF 닭을 lethal dose의 ES03 HPAI 바이러스로 비강내 감염시켰다. 닭들을 생존에 대해 14일 동안 매일 관찰하였다.
도 5는 백신화된 후 닭과 감염된 닭으로부터 백신화된 닭의 구별. 혈청 샘플을 공격 접종 전(백신화 3 주 후) 및 공격 접종 14일 후 10㎍ 및 2㎍ VLP-백신화된 닭으로부터 수집하였다. NP 항체 레벨을 통상의 NP-cELISA 키트로 테스트하였다. 각 dot는 각 닭의 NP-특이적인 항체 값을 나타냄.
도 6은 혈청내 NDV에 대한 항체의 평균 레벨. 혈청에서 NDV에 대한 항체 레벨을 단일 면역화 3 주 후에 통상 ELISA 키트를 사용하여 결정함. 통계적 유의성을 Tukey-Kramer post hoc 테스트와 ANOVA로 결정함. ***, P<0.001. **, P<0.01;
도 7은 lethal NDV 공격 접종 후 생존 곡선. 면역화 3 주 후, SPF 닭을 lethal 용량의 KR005 NDV로 근육내 감염시켰다. 닭들을 생존에 대해 14일 동안 매일 관찰하였다.
도 8은 공격 접종 2 주 후HI 타이터: 혈청 샘플을 La Sota NDV 균주에 대한 HI 항체의 존재에 대한 표준 HI 테스트로 분석. 에러 바는 표준 편차를 나타냄. ***, P<0.001, **, P<0.01
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포 및 바이러스
Sf9 곤충 세포는 혈청 없는 SF900III SFM 배지(Gibco)에서 현탁액으로 27℃에서 유지하였다. velogenic NDV 유전형 VII 바이러스 KR-005/00 및 HPAI H5N1 A/chicken/Korea/ES/2003 (ES03)는 대한민국 농림축산 검역본부로부터 제공받았다. 바이러스들은 9-11 일령 닭 발육란에서 번식시켰다.
실시예 2: HA, M1 , 및 F/HA 키메릭 유전자들의 클로닝
A/chicken/Korea/ES/2003의 HA (Genbank AY676035), M1(Genbank AY676047) 유전자들 및 A/chicken/Korea/ES/2003 및 KR-005/00의 F 유전자(Genbank AV630423)들을 추출하고 2 단계 역전사(RT)-PCR (RNeasy®Mini Kit, Omniscript™RT Kit, Qiagen)로 증폭하였다. cDNA 합성을 위하여, Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR. 2001. Arch Virol 146:2275-2289 및 Park JK, Lee DH, Yuk SS, Tseren-Ochir EO, Kwon JH, Noh JY, Kim BY, Choi SW, Kang SM, Lee JB, Park SY, Choi IS, Song CS. 2014. Clin Vaccine Immunol 21:360-365에 기재된 것과 같이 Uni12 프라이머를 HA, M1 유전자에 대해서 사용하였고, 5'-ATGGGCTCCAAACTTTC -3'(서열번호 7)를 F 유전자에 대해서 사용하였다. 뉴캣슬병 바이러스 F 및 인플루엔자 M1 사이의 상호작용을 최대화하기 위하여, 본 발명자들은 키메릭 F/HA 단백질을 구축하였다. F 유전자의 ectodomain은 PCR에 의하여 생성되고 코돈 최적화된 HA TM/CT 도메인은 Bioneer (Daejeon, Republic of Korea)에 의하여 합성하였다. 두 생성물을 동일하게 혼합하고 F/HA 키메릭 유전자를 프라이머 EcoRI-F-1 및 HindIII-HA TM/CT-2를 사용한 오버랩 PCR에 의하여 구축하였다(도 1A, 표 1). 각 세그먼트를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다. 증폭된 유전자를 TA 벡터(RBC bioscience)로 클로닝하고 시퀀싱하였다. 세 결과 플라즈미드 벡터를 각각 vHA, vM1, 및 vF/HA로 명명하였다.
Target gene Primer (5'→3') Expected size( bp)
HA BamHI-HA-1:
GGA TCC ATG GAG AAA ATA GTG C(서열번호 8)		 1695
HindIII-HA-2:
AAG CTT AGT AGA AAC AAG G(서열번호 9)
M1 EcoRI-M1-1:
GAA TTC ATG AGT CTT CTA ACC GAG G(서열번호 10)		 759
HindIII-M1-2:
AAG CTT TCA CTT GAA TCG CTG C(서열번호 11)
F
(TM/CT removed)		 EcoRI-F-1:
GAA TTC ATG GGC TCC AAA CTT TC(서열번호 12)		 1500
XhoI-F-2:
CTC GAG AGC AGA TGT GCT GGT TAG(서열번호 13)
HA TM/CT XhoI-HA TM/CT-1:
CTC GAG CAG ATC CTG TCC ATC TAC(서열번호 14)		 117
HindIII-HA TM/CT-2:
AAG CTT TTA GAT GCA GAT ACG GCA C(서열번호 15)
표 1은 키메릭 바이러스 유사 입자의 유전자의 RT-PCR 증폭에 사용된 프라이머 세트
실시예 3: 발현 벡터의 구축
상기 벡터 vHA는 BamHI/HindIII로 처리하고 vM1, vF/HA는 EcoRI/HindIII로 처리하였다. 그 결과 절편은 동일한 효소로 처리한 pFastBacT1 bacmid transfer vector (Invitrogen)로 라이게이션하여 pHA, pM1, 및 pF/HA를 야기하였다. 벡터 pHA 및 pF/HA는 SnaBI/HpaI로 처리하고 그 처리된 단편들을 각각 pM1의 SnaBI 및 HpaI 부위에 라이게이션하여 pHAM1F/HA를 생성하였다. 그 자신의 polyhedrin 프로모터 및 전사 종결 서열을 가지는 인플루엔자 HA, M1 및 키메릭 F/HA 유전자들을 포함하는 그 결과 산물 플라즈미드는 그것의 전체를 확인하여 부가적인 변화가 없다는 것을 입증하였다(도 1B).
실시예 4: 트랜스팩션 및 재조합 baculovirus 의 제조
pHAM1F/HA 벡터를 제조업자의 지시에 따라 DH10Bac™(Invitrogen)에 형질전환하여 재조합 bacmid를 제조하였다. 이 재조합 bacmid를 2015년 6월 12일 대한민국 대전시 유성구 소재 한국유전자 은행에 KCTC 12844BP로 기탁하였다. 이 재조합 bacmid를 PureLink™HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit (Invitrogen)로 분리하고 Sf9 세포에 Cellfectin®Reagent를 사용하여 트랜스팩션하였다. 트랜스팩션 72시간 후, 배지로 분비된 budded 재조합 baculovirus (rBV)를 모아서 Sf9에 접종하여 high-titer rBV 스탁을 제조하였다. baculovirus 스탁의 타이트레이션을 제조업자의 추천에 따라 Sf9 세포를 사용한 플라크 어세이에 의하여 수행하였다.
실시예 5: 키메릭 바이러스 유사 입자의 생산
Sf9 세포를 스핀너 플라스크 내 Sf900III 배지에서 150 rpm의 속도로 현탁액에서 27℃에서 유지시켰다. 키메릭 VLP 생성을 위하여, Sf9 세포를 MOI(multiplicity of infection)의 5에서 3일 동안 A/chicken/Korea/ES/2003 및 KR-005/00의 HA, M1 및 F/HA를 발현하는 rBV로 2 x 106 cells/ml로 감염시켰다. 배양된 배지를 모아서 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 10분 동안 2000 x g에서 원심분리하였다.
상등액 내 VLPs를 농축하기 위하여 19Ti rotor (Beckman)를 사용하여 18,000 rpm에서 1.5시간 동안 4℃에서 초고속원심분리하여 펠렛화한 후, PBS에 재부유화하고 20% 및 50% sucrose 용액(g/ml)을 사용한 수크로스 구배에 의하여 35,000 rpm에서, 2.5 시간 동안, 4℃에서 SW41Ti rotor (Beckman)를 사용하여 정제하였다. VLP 밴드들을 모아서 mouse anti-H5 단클론 항체 및 닭 anti-Kr-005/00 sera를 사용하여 웨스턴 블럿에 의하여 분석하였다. HRP-conjugated goat anti-mouse 항체 및 goat anti-chicken 항체를 검출을 위한 2차 항체로 사용하였다. VLP의 전체 단백질 농도를 Bradford protein 어세이(Thermo Scientific)로 결정하였다.
실시예 6: 전자 현미경 분석
키메릭 VLPs를 신선하게 discharged 400 mesh 카본 코팅된 구리 그리드 상에 부유에 의하여 흡수하였다. 그 그리드들을 헹구고 2% uranyl acetate로 네가티브하게 염색한 후, aspiration에 의하여 건조하였다. 그 VLPs를 100,000x 배율에서 120 kV에서 작동하는 투과 전자 현미경(BIO-TEM, Tecnai G2 spirit, 한국 기초 과학연구원)을 사용하여 확인하였다.
실시예 7: VLP 백신의 제조
VLP 백신을 Montanide ISA70 어쥬번트(SEPPIC)로 10㎍/chicken 및 2㎍/chicken의 최종농도로 30:70 (w/w)의 비율에서 정제된 VLP를 에멀젼화하여 제조하였다. Mock 백신은 VLP 백신과 동일한 방법을 사용하여 PBS로 제조하였다.
실시예 8: 동물 및 실험 고안
재조합 VLP를 건국대학교 동물실험 윤리위원회(KU14008)의 감독하에 ND 및 HPAI에 대한 방어 효과를 확인하기 위하여 두 실험에서 닭에서 테스트하였다.
30마리 6주령 SPF 닭을 3 군(n=10)으로 나누고 생물학적안전성 레벨 3 조건 하에서 다른 아이솔레이터에서 키웠다. 두 군의 닭을 0.5 ml의 10㎍/chicken 및 2㎍/chicken HAM1F/HA VLP 백신으로 각각 근육내 면역화하고 다른 군은 양성 대조군으로 PBS로 백신화하였다. 혈청 샘플을 백신화 3 주 후에 모아서 HI 어세이를 사용하여 항체 타이터를 결정하기 위하여 사용하였다.
단일 면역화 3 주 후, 닭들을 100 ㎕의 106.0EID50/dose의 야생형(wild-type) HPAI 바이러스로 비강내 공격 접종하였다. HAM1F/HA VLP 백신의 방어 효과를 평가하기 위하여, 치사율 및 임상 증상을 14dpc 동안 관찰하였다. 또, viral shedding을 실시간 역전사효소 중합효소 연쇄반응(rRT-PCR)로 2, 3, 5, 7, 10, 14 dpc(days post-challenge)에서 정량화하였다 .
HPAI 바이러스 shedding를 결정하기 위하여, 구강인두(oropharyngeal) 및 배설강(cloacal) 스왑 샘플을 모아서 1 ml의 PBS로 현탁하였다. 이 현탁액 중에서 150 ㎕를 제조업자의 지시에 따라 Viral gene-spin™(Intron)로 RNA 추출에 사용하였다. RNA 농도는 Spackman E, Senne DA, Bulaga LL, Myers TJ, Perdue ML, Garber LP, Lohman K, Daum LT, Suarez DL. 2003. Avian Dis 47:1079-1082.에 기재된 것과 같이 M 유전자 기반된 rRT-PCR를 사용한 Ct(cycle threshold) 방법에 의하여 정량화하였다.
유사하게, 40마리 6주령 SPF 닭을 3 군(n=10)으로 나누고 생물학적안전성 레벨 2 조건 하에서 다른 아이솔레이터에서 키웠다. 두 군의 닭을 0.5 ml의 10㎍/chicken 및 2㎍/chicken 키메릭 VLP 백신으로 각각 근육내 면역화하고 다른 군은 양성 대조군으로 PBS로 백신화하였다. 혈청 샘플을 백신화 3 주 후에 모아서 HI assay and ELISA against NDV strain La Sota (Genbank JF950510.1)에 대한 HI 어세이 및 ELISA를 사용하여 항체 타이터를 결정하기 위하여 사용하였다.
단일 면역화 3 주 후, 닭들을 1ml의 105.5EID50/ml의 velogenic strain NDV Kr-005/00를 근육내 공격 접종하였다. HAM1F/HA VLP 백신의 방어 효과를 평가하기 위하여, 치사율 및 임상 증상을 14dpc 동안 관찰하였다.
실시예 9:혈청학
VLP 백신의 효과를 결정하기 위하여, 혈청 샘플을 백신화 전과 AIV에 대한 HI 테스트 및 NDV에 대한 ELISA를 위한 백신화 3 주 후에 모았다. AIV에 대하여, 모아진 혈청 샘플을 formalin-불활화 호모로고스 AI 바이러스를 사용한 OIE 표준 방법에 따라 HI 항체의 존재에 대해 분석하였다. NDV에 대해, 제조업자의 추천에 따라 NDV strain LaSota로 미리코팅된 통상 ELISA 키트(Median Diagnostics, Republic of Korea)를 사용하여 분석하였다.
실시예 10:DIVA
백신화된 닭과 감염된 치키으로부터 VLP-백신화된 닭의 혈청학적 구별을 위하여, 상용 ELISA를 AIV에 대해 사용하였고, HI(hemagglutination inhibition ) 테스트를 NDV에 대해 사용하였다. 본 발명에서 개발된 키메릭 VLP는 AIV의 NP(nucleoprotein) 및 NDV의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 단백질을 포함하지 않아서, AIV에 대한 항-NP 항체 및 NDV에 대한 HI 항체는 바이러스 감염 후에만 생성될 것이다. 혈청 샘플을 0 dpc 및 lethal AIV 또는 NDV 공격 접종으로부터 모두 생존한 닭으로부터 14dpc에 모았다.
Tukey-Kramer post-hoc 테스트에 따른 ANOVA(Analysis of variance)를 그룹간에 혈청 항체 타이터의 비교를 위하여 수행하였다. P 값, <0.05를 가지는 결과를 통계적으로 유의적이라고 간주하였다.
상기 실시예의 결과는 아래와 같다.
키메릭 VLP 발현
A/Chicken/Korea/ES/2003(H5N1)의 HA, M1 유전자 및 KR-005/00 및 ES03의 F/HA 유전자를 포함하는 키메릭 VLP는 성공적으로 생성되었고 Sf9 세포로부터 분비되었다. VLPs를 배양 상등액으로부터 정제하고 상기와 같이 분석하였다. HA 및 F/HA 단백질을 웨스턴 블럿(도 2A-2C) 및 투과 전자현미경(TEM) (도 2D)에서 검출하였다.
조류 인플루엔자
면역반응
단일 백신화 3 주 후, VLP-백신화된 그룹들 모두는 H5 influenza virus에 대한 HI 항체 타이터가 PBS 그룹과 비교하여 현저하게 증가하였다(P<0.001). 또한, 10㎍/chicken 백신화된 그룹은 용량 의존적으로 2㎍/chicken 백신화된 군에 비하여 더 높은 HI 항체 타이터를 나타내었다(P<0.01) (도 3).
방어 및 virus shedding
백신의 방어 효과를 조사하기 위하여, 백신화 3 주 후 닭을 lethal 용량의 HPAI ES03으로 비강내로 공격 접종하였다. Mock-백신화된 닭들은 공격 접종 4일 후 100% 치사율을 나타내었다(MDT = 3.2 day), 그러나 모든 VLP-백신화된 닭들은 치사로부터 방어되고 임상 증상도 관찰되지 않았다. (도 4)
구강인두(Oropharyngeal) 및 배설강 스왑 샘플을 2, 3, 5, 7 dpc에 모아서 viral shedding을 rRT-PCR 방법으로 정량화하였다. 모든 백신화된 조류는 구강인두 및 배설강 모두에서 mock-백신화된 닭에 비하여 감소된 바이러스 배출(viral shedding)을 나타내었다(표 2, 3). 구강인두 배출에서, 10㎍ 백신화된 군에서 단지 한 마리 닭이 3 dpc에서 낮은 Ct 값의 바이러스를 배출하였고 (33.98) 2㎍ 백신화된 군의 어떠한 닭도 전체 실험 기간동안 바이러스를 배출하지 않았다. 배설강 배출에서, 모든 백신화된 닭들이 3dpc에서 바이러스를 배출하였지만, mock-백신화된 닭보다 더 낮은 타이터의 바이러스가 검출되었고 5dpc 후에는 어떤 닭도 바이러스를 배출하지 않았다.
days
post-challenge		 HAM1F/HA 10ug HAM1F/HA 2ug Mock vaccinated
No. of positive
/total		 Avg. Ct No. of positive
/total		 Avg. Ct No. of positive
/total		 Avg. Ct
2 0/10 - 0/10 - 3/10 30.72
3 1/10 33.98 0/10 - 2/2 30.24
5 0/10 - 0/10 - N.A.
7 0/10 - 0/10 - N.A.
표 2는 구강인두 스왑 샘플에서 공격 접종 바이러스 배출
N.A. Not applicable
days
post-challenge		 HAM1F/HA 10ug HAM1F/HA 2ug Mock vaccinated
No. of positive
/total		 Avg. Ct No. of positive
/total		 Avg. Ct No. of positive
/total		 Avg. Ct
2 8/10 33.05 7/10 32.78 5/8 31.33
3 10/10 30.99 10/10 30.13 1/2 27.28
5 0/10 - 0/10 - N.A.
7 0/10 - 0/10 - N.A.
표 3은 배설강 스왑 샘플로부터 공격 접종 바이러스 배출
N.A. Not applicable
ELISA-DIVA
백신화된 닭을 백신화된 닭과 감염된 닭으로부터 구별하기 위하여, 혈청 샘플들을 ELISA 테스트를 위하여 바이러스 공격 접종 전 및 공격 접종 14일 후에 모았다. VLP-백신화된 닭으로부터 Pre-challenge 혈청은 제조업자(Bionote, Korea) 추천에 의한 NP-cELISA에 의하여 음성이었다. pre-challenge 혈청과 대조적으로, 10 중 2 및 10 post-challenge 혈청 중 3의 10㎍ 및 2㎍ VLP-백신화된 조류가 각각 양성이었다 (도 5).
뉴캣슬병
면역반응
단일 백신화 3 주 후, 10㎍ VLP-백신화된 그룹은 용량 의존적으로 2㎍ 백신화된 군 및 PBS 군에 비하여 현저하게 증가된 항체 타이터를 나타내었다(P<0.001). 2㎍ VLP-백신화된 군은 PBS 군보다는 더 높은 항체 타이터를 나타내었으나 통계적으로 유의적인 차이는 ANOVA에서 관찰되지 않았다. (P>0.05)
방어
키메릭 VLP 백신의 방어효과를 평가하기 위하여, 닭들을 백신화 3 주 후lethal 용량의 NDV KR-005/00로 근육내 감염시켰다.
백신의 방어 효과는 용량의존적으로 나타내었다. 10㎍ VLP-백신화된 닭들은 치사로부터 방어되고 임상적 시그널도 관찰되지 않았다. 2㎍ 백신화된 닭들 중 2마리는 공격 접종 5일 후 죽었으나 생존된 닭들은 임상 증상이 없었다. Mock-백신화된 닭들은 공격 접종 4일 후 100% 치사율을 나타내었다(MDT = 3.9 day) (도 7).
HI-DIVA
백신화된 닭을 백신화된 닭과 감염된 닭으로부터 구별하기 위하여, 혈청 샘플들을 HI 테스트를 위하여 NDV 바이러스 공격 접종 전 및 공격 접종 14일 후에 모았다. VLP-백신화된 닭으로부터 Pre-challenge 혈청은 HI 타이터에서 증가를 나타내지 않았다. pre-challenge과 대조적으로, 모든 VLP-백신화된 닭의 post-challenge 혈청은 현저하게 높은 HI 항체 타이터를 나타내었고 이것은 성공적인 DIVA 전략을 의미한다(도 8).
한국생명공학연구원 KCTC12844 20150612
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A chimeric virus-like particle vaccine against lethal HPAIV and NDV infection and vaccine using the same <130> HY151011 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 564 <212> PRT <213> A/Chicken/Korea/ES/2003 <400> 1 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Pro Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Ser 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Ser Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 370 375 380 Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 385 390 395 400 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu 405 410 415 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 420 425 430 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 435 440 445 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 450 455 460 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe 465 470 475 480 Glu Phe Tyr His Arg Cys Asp Asn Glu Cys Ile Glu Ser Val Arg Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Gly Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg 500 505 510 Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile 515 520 525 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 530 535 540 Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 545 550 555 560 Arg Ile Cys Ile <210> 2 <211> 252 <212> PRT <213> A/Chicken/Korea/ES/2003 <400> 2 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Asn Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 3 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion mutant <400> 3 Met Gly Ser Lys Leu Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Ile Thr Leu Ile Leu Ser Cys Ile Arg Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Arg 100 105 110 Arg Gln Lys Arg Phe Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly 115 120 125 Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala 130 135 140 Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala 145 150 155 160 Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser 165 170 175 Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn 180 185 190 Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val 195 200 205 Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln 210 215 220 Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn 225 230 235 240 Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly 245 250 255 Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr 260 265 270 Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn 275 280 285 Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu 290 295 300 Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro 305 310 315 320 Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser 325 330 335 Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr 340 345 350 Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser 355 360 365 Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met 370 375 380 Ala Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg 385 390 395 400 Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val 405 410 415 Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile 420 425 430 Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile 435 440 445 Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser 450 455 460 Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Arg 465 470 475 480 Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr 485 490 495 Ser Thr Ser Ala Leu Glu Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala 500 505 510 Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met 515 520 525 Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 530 535 540 <210> 4 <211> 1695 <212> DNA <213> A/Chicken/Korea/ES/2003 <400> 4 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtc 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccacccaatg acctctgtta cccagggaat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgaaaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat 420 catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaggtc ctccttcttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gagaagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc aaatgatgcg 600 gcagagcaga caagactcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcagctt tgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caagcagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 aagagaggac tatttggagc tatagcaggt tttatagagg gaggatggca gggaatggta 1080 gatggttggt atgggtacca ccatagcaat gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa 1140 gaatccactc aaaaggcaat agatggagtc accaataagg tcaactcgat cattgacaaa 1200 atgaacactc agtttgaggc cgttggaagg gaatttaata acttagaaag gagaatagaa 1260 aatttaaaca agaagatgga agacggattc ctagatgtct ggacttataa tgctgaactt 1320 ctggttctca tggaaaatga gagaactcta gactttcatg actcaaatgt caagaacctt 1380 tacgacaagg tccgactaca gcttagggat aatgcaaagg agctgggtaa cggttgtttc 1440 gagttctatc acagatgtga taatgaatgt atagaaagtg taagaaacgg aacgtatggc 1500 tacccgcagt attcagaaga agcaagatta aaaagagagg aaataagtgg agtaaaattg 1560 gaatcaatag gaacttacca aatactgtca atttattcaa cagtggcaag ttccctagca 1620 ctggcaatca tggtggctgg tctatcttta tggatgtgct ccaatggatc gttacaatgc 1680 agaatttgca tttaa 1695 <210> 5 <211> 759 <212> DNA <213> A/Chicken/Korea/ES/2003 <400> 5 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga ttgcacagaa acttgaagat gtcttcgcag gaaagaacac cgatctcgag 120 gctctcatgg agtggttaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg 180 ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300 aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca 360 accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgactacg 420 gaagtggctt ttggcttagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480 tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca ggcatgagaa cagaatggtg 540 ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg 600 gaagccatgg aggtcgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag aacaattggg 660 actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720 cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtga 759 <210> 6 <211> 1623 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion mutant <400> 6 atgggctcca aactttctac caggatccca gcacctctga tgctgatcac ccggattacg 60 ctgatattga gctgtatccg tccgacaagc tctcttgacg gcaggcctct tgcagctgca 120 ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180 atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aggcgtgtgc aaaagcccca 240 ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300 aagatccaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360 gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420 ctaatacaag ccaaccagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480 accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540 aagatgcagc agttcgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600 aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660 ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720 ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780 agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacagact 840 caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900 acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960 aaagtagtga cacaggtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgcatagag 1020 tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080 tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140 acgccgtata tggcccttaa aggctcggtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200 tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagccgtatc cctgatagat 1260 agacattcgt gcaacgtctt atcattagac gggataactc tgaggctcag tggggaattt 1320 gatgcaactt atcaaaagaa tatctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380 cttgatatct caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaacgc cttggatagg 1440 ttggcagaaa gcaacagcaa gctggaaaaa gtcaatgtca gactaaccag cacatctgct 1500 ctcgagcaga tcctgtccat ctactccacc gtggcttcct ccctggctct ggctatcatg 1560 gtggctggtc tgtccctgtg gatgtgctcc aacggttccc tgcagtgccg tatctgcatc 1620 taa 1623 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgggctcca aactttc 17 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggatccatgg agaaaatagt gc 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aagcttagta gaaacaagg 19 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaattcatga gtcttctaac cgagg 25 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aagctttcac ttgaatcgct gc 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gaattcatgg gctccaaact ttc 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctcgagagca gatgtgctgg ttag 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctcgagcaga tcctgtccat ctac 24 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aagcttttag atgcagatac ggcac 25

Claims (13)

  1. a) 조류 인플루엔자 A/Chicken/Korea/ES/2003(H5N1)의 헤마글루티닌(HA);
    b) 조류 인플루엔자 A/Chicken/Korea/ES/2003(H5N1)의 기질 단백질 M1; 및
    c) 뉴캣슬 바이러스 KR-005/00 유래 융합 단백질(F)과 상기 조류 인플루엔자 A/Chicken/Korea/ES/2003(H5N1)의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 융합 단백질;을
    포함하고,
    조류 인플루엔자의 핵단백질(nucleoprotein; NP) 및 뉴캣슬 바이러스의 헤마글루티닌-뉴라미다제(hemagglutinin-neuraminidase; HN) 단백질을 포함하지 않는 키메릭 바이러스 유사 입자(VLP)로서,
    상기 HA 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하고,
    상기 M1 단백질은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하고,
    상기 F와 HA 융합 단백질은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 키메릭 바이러스 유사 입자(VLP).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 HA 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 키메릭 바이러스 유사 입자(VLP).
  6. 제1항에 있어서, 상기 M1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5에 기재된 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 키메릭 바이러스 유사 입자(VLP).
  7. 제1항에 있어서, 상기 F와 HA 융합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6에 기재된 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 키메릭 바이러스 유사 입자(VLP).
  8. 제 1항의 키메릭 바이러스 유사 입자 및 보조제(adjuvant) 또는 면역 자극제(immune stimulator)를 포함하는 것인 항원 제형.
  9. 제 1항의 키메릭 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신.
  10. 제9항에 있어서, 상기 백신은 조류 인플루엔자 및 뉴캣슬병 바이러스 감염에 대하여 방어효과를 가지는 것을 특징으로 하는 백신.
  11. 제9항에 있어서, 상기 백신은 보조제 또는 면역 자극제와 함께 제형되는 것인 백신.
  12. 인간을 제외한 동물에게 제8항의 항원 제형을 투여하는 것을 포함하는 인간을 제외한 동물에서 조류 인플루엔자 및 뉴캣슬병 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법.
  13. 인간을 제외한 동물에게 제9항의 백신을 투여하는 것을 포함하는 인간을 제외한 동물에서 조류 인플루엔자 및 뉴캣슬병 바이러스 감염에 대한 예방 면역을 유도하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102373183A (zh) * 2010-08-09 2012-03-14 中山大学 禽流感和新城疫混合病毒样颗粒、制备方法和应用
KR101546064B1 (ko) * 2013-07-29 2015-08-20 건국대학교 산학협력단 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1 단백질과 뉴캣슬 병 바이러스 융합 단백질을 발현하는 뉴캣슬 병 바이러스 바이러스 유사입자

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