KR101986071B1 - 인플루엔자 ｈ5 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 계통군 1 H5N1의 H5 단백질이, 특히, 단일-샷 백신접종(single-shot vaccination)에 의해, H5N1 HA를 지닌 인플루엔자 바이러스들에 대한 교차-계통군 보호성 면역 반응을 유도한다는 놀랄만한 발견에 기초한다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스, 즉, 계통군 1과 상이한 계통군, 또는 계통군 1을 제외한 임의의 계통군으로부터의 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 각각 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 Ｈ5 백신{INFLUENZA H5 VACCINES}
본 발명은, 의약 분야, 바람직하게는 감염성 질환의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인플루엔자 단백질 및 백신에 관한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명은 인플루엔자 감염의 치료 및 예방, 추가로 인플루엔자 바이러스의 종-내 및 종-간 전염(intra- and inter-species transmission)의 예방을 위한 이러한 단백질 또는 백신 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 감염은 동물 및 사람에서 중요한 감염을 존속시킨다. 인플루엔자는 연속적 항원성 변화/변형을 겪는 바이러스 및 동물 전염원(animal reservoir)을 지니는 바이러스에 의해 야기된다. 따라서, 새로운 유행병 및 범발 유행병이 미래에 발생할 수 있으며, 질환의 근절을 달성하기가 어려울 것이다. 인플루엔자 바이러스들은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: P. Palese , Nature Medicine , vol . 10, no . 12, pp . S 82 to S 86 of December 2004]과 추가의 참조문헌들에 보다 상세히 기술되어 있다. 요약하면, 인플루엔자 A 바이러스의 게놈은 8개의 단일-가닥 분절(single-stranded segment)들로 이루어져 있으며, 바이러스 입자들은 이의 표면에 2개의 주요 당단백질들: 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미니다제(N)를 갖는다. 적어도 16개의 상이한 헤마글루티닌(H1 내지 H16) 및 9개의 상이한 뉴라미니다제(N1 내지 N9) 아형(subtype)들로 인해, 인플루엔자 바이러스들 중에 고려할만한 항원성 변이가 존재한다.
H5N1 가금류 전염병 바이러스(Fowl Plague virus) 중 인플루엔자 바이러스는 가금류, 돼지 및 사람을 감염시키는 것으로 입증되어 왔다. 또한, 이 바이러스는 조류 종으로부터 사람에게 직접 전염될 수도 있다[참조: Claas et al ., Lancet 1998, 351: 472; Suarez et al ., J. Virol . 1998, 72: 6678; Subbarao et al ., Science 1998, 279: 393; Shortridge , Vaccine 1999, 17 ( Suppl . 1): S26 - S29]. 공지된 사람 임상의 경우에서 사망률은 약 50%에 이른다.
지난 100여년에 걸쳐 돼지는 인플루엔자 범발 유행병에 대한 중요한 벡터(vector)였다. 돼지, 낙타, 및 물개, 바람직하게 돼지는 조류 인플루엔자 바이러스들에 대한 '혼합 챔버(mixing chamber)'로서 작용하므로, 인플루엔자 바이러스의 천연적인 전염원인 가금류로부터 포유동물들로 종 장애물(species hurdle)을 극복하기 위한 잠재적인 위험 인자를 나타낼 수 있다. 이는 민감한 동물들, 예를 들면, 확립된 포유동물(돼지)뿐만 아니라 조류 인플루엔자 바이러스 둘 다를 갖는 돼지의 이중 감염들에 의해 일반적으로 발생한다. 이러한 이중 감염은 사람 또는 돼지 범발 유행병들의 원인일 수 있는 새로운 재조합체 바이러스(recombinant virus)들을 생성한다. 그러나, 최근의 증거는, 현재의 조류 H5 균주들과 포유동물 인플루엔자 바이러스들의 재조합이 고도로 맹독성인 재조합체들을 생성하지 않을 것임을 나타낼 수 있다. 한편, 조류 인플루엔자 바이러스는 돼지들을 감염시킬 수 있으며, 자발적인 돌연변이들에 의해 돼지들에 대해 적응될 수 있다. 중요한 장애물은, 바이러스가 돼지(또는 다른 포유동물) 집단 내에서 수평 감염들을 야기할 수 있게 되자마자 극복될 것이다.
여전히, 동남 아시아 돼지들의 대부분은 이웃하고 있는 양계장으로부터 기원하는 조류 (H5) 인플루엔자 바이러스 균주들로 감염되어 왔다. 이러한 감염들은 지금까지 준-임상적(sub-clinical)이었기 때문에, 이들은 실험실 방법들에 의해서만 진단될 수 있으므로 흔히 간과되고 있다. 이들 준-임상적으로-감염된 돼지들이, 바이러스에 대해, 포유동물 시스템에 적응하여, 돼지 집단 내에서 확산되고, 또한 사람도 감염시키기 위한 기회로서 작용할 것인 고도의 위험이 존재한다.
현재의 인플루엔자 백신들은 아단위(subunit) 백신[참조: Babai et al ., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238; Crawford et al ., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson et al ., Vaccine 1999, 17 (15-16) .2073-2080], 약독화 백신(attenuated vaccine)[참조: Horimoto et al ., Vaccine 2004, 22(17-18):2244-2247], DNA 백신[참조: Watabe et al ., Vaccine 2001, 19(31):4434-4444] 및 불활성화된 인플루엔자 백신[참조: Cao et al ., Vaccine 1992, 10(4): 238-242]을 포함하며, 불활성화된 인플루엔자 백신은 상업적 규모로 가장 광범위하게 사용되고 있다[참조: Lipatov et al ., J Virol 2004, 78(17):8951-8959].
아단위 백신들, 재조합체 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제[참조: Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9-10) :1223-1238; Crawford et al ., Vaccine 1999, 17(18) .2265-2274; Johansson et al ., Vaccine 1999, 17(15-16). 2073-2080]는 불활성화된 백신에 대한 매력적인 대안이 될 수 있지만, 이들 중 어느 것도 현재 상업적 백신들로서 사용되지 않고 있다. 이러한 백신들의 제조는 불활성화된 백신의 제조보다 명백하게 더 안전하다. 또한, 아단위 백신들은 내부 인플루엔자 바이러스 단백질들에 대해 항체 반응들을 생성하지 않으므로, 백신접종된 동물들과 감염된 동물들 사이가 구별되도록 하다[참조: Crawford et al ., Vaccine 1999, 17(18). 2265-2274].
헤마글루티닌 단백질은 인플루엔자 바이러스의 수용체-결합 및 막 융합 당단백질이고, 감염성-중화 항체들에 대한 표적이다. H5N1 유래의 전체 헤마글루티닌 단백질(HA)은 568개의 아미노산으로 구성되며, 분자량은 56kDa이다. HA 분자는 HA1 및 HA2 아단위들로 이루어져 있고, HA1 아단위는 세포막과의 초기 접촉을 매개하고 HA2는 막 융합에 관여한다[참조: Chizmadzhev , Bioelectrochemistry 2004, 63(1-2):129-136].
배큘로바이러스(baculovirus)/곤충 세포 시스템들을 사용하여 조류 인플루엔자 아형들로부터 분리된 헤마글루티닌 유전자들을 발현시켜 왔다[참조: Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238; Crawford et al ., Vaccine 1999, 17(18): 2265-2274; Johansson et al ., Vaccine 1999, 17(15-16): 2073-2080); Nwe et al ., BMC Mircobiology 2006, 6(16): doi : 10. 1186/1471-2180-6-16]. 그러나, 이들 재조합체 단백질들은 어떠한 경우에도 보호성이 아닌 것으로 보이거나, 일부 종들에 대해서 단지 적어도 거의 효과가 없다(참조: Treanor et al ., Vaccine 2001, 19: 1732-1737).
문헌[참조: Lin et al. (J Vet Med Sci. 2008 70(11): 1 147-52]은 계통군(clade) 2 바이러스 A/duck/China/E319-2/03에 의한 감염을 예방하기 위한 기본-부스터 백신접종(prime-booster vaccination)에 유용한, 계통군 2 H5N1 바이러스 A/duck/China/E319-2/03의 H5 단백질의 생산을 위한 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템의 사용을 개시하고 있다.
브라이트 등(Bright et al .)[참조: PLoS One. 2008 30; 3(1):e1501]은 마우스에서 계통군 1 H5N1 바이러스 A/VN/1203/2004를 사용한 챌린지(challenge)에 대해 교차-계통군 보호성 면역 반응을 유도하기 위한 계통군 2 H5N1 바이러스 유래의 뉴라미니다제, 헤마글루티닌 및 매트릭스 1 단백질을 포함하는, 바이러스-유사 입자(VLP)들을 생성하기 위한 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템의 사용을 기술하고 있다.
그러나, VLP의 생산은, 실제 바이러스를 효과적으로 모사하는 기능성 VLP를 생성하기 위하여, 이후에 감염성 바이러스의 외부 쉘(outer shell: 캡시드(capsid))의 확인(confirmation)을 재생산하는 입자 내로 정확하게 조립되어야 하는 다수의 바이러스 구조 단백질들이 요구되므로, 문제점이 없는 것은 아니다. 추가로, 연구는 또한 VLP의 시험관내 조립이 응집과 경쟁함도 밝힌다[참조: Ding et al . Biotechnology and Bioengineering 107 (3): 550-560].
따라서, 인플루엔자 감염을 제어하고 질환 부하(disease load)에 있어 긍정적인 영향을 갖는 보다 우수한 시도들을 제공하기 위한 개선된 백신들 및 신규 백신접종의 이용가능성을 증가시키는 것이 요구되고 있다. 특히, 바람직하게는 단일-샷 백신접종(single-shot vaccination)에 의해, H5N1 HA를 지닌 인플루엔자 바이러스들에 대해 교차-계통군 보호성 면역 반응을 유도하는, 간단하고 효과적이며 취급이 용이한 시스템이 강력하게 요구되고 있다.
본 발명의 실시형태들 전에, 본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태들("a", "an", 및 "the")은 본문에 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "제제"에 대한 참조는 복수의 이러한 제제들을 포함하고, "담체"에 대한 참조는 하나 이상의 담체들 및 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 이의 등가물들 등에 대한 참조이다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 기술을 가진 자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미들을 갖는다. 모든 제공된 범위들 및 값들은 달리 나타내지 않거나 당해 분야의 숙련가에게 달리 공지되지 않는 한 1 내지 5%로 변할 수 있으므로, 용어 "약"은 이러한 설명에서 생략되었다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들, 장치들, 및 재료들은 이하에 기술된다. 본원에 언급된 모든 공보들은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공보들에 보고된 바와 같은 물질들, 부형제들, 담체들, 및 방법들을 기술하고 개시할 목적으로 인용에 의해 본원에 포함된다. 본원에서 어느 것도, 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 개시내용을 선행할 권리가 없음을 인정하는 것으로 고려되지 않는다.
상기 기술적 과제에 대한 해결책은 상세한 설명 및 특허청구범위에서 특성분석된 실시형태들에 의해 달성된다.
인플루엔자 단백질들 및 이들을 암호화하는 핵산 분자들
본 발명은, 계통군 1 H5N1의 H5 단백질이, 특히, 단일-샷 백신접종에 의해, H5N1 HA를 지닌 인플루엔자 바이러스들에 대한 교차-계통군 보호성 면역 반응을 유도한다는 놀라운 발견에 근거한다. 하나의 특징으로서, 명확성의 이유로 본원에서 "H5 단백질 (1)"으로도 칭하는 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질은, 서열번호 1에 나타낸 폴리펩타이드 서열과 98% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 이러한 폴리펩타이드 서열로 이루어진다.
"단일-샷 백신접종"은, 부스터(booster)를 필요로 하지 않는 이의 단일 투약 후, 감염의 발생률 또는 중증도를 감소시키는데 효과적인 면역원성 조성물을 말한다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은, 상이한 계통군, 즉, 계통군 1, 또는 계통군 1을 제외한 임의의 계통군과 각각 상이한 계통군의 H5N1 바이러스에 의한 감염을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질 (1)에 관한 것이고, 여기서, 상기 H5 단백질 (1)은 서열번호 1의 폴리펩타이드 서열과 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 이러한 폴리펩타이드 서열로 이루어진다.
본원에 사용되는 용어 "계통군" 또는 "계통군들"은, 인용에 의해 본원에 포함되는, WHO 웹사이트 URL: who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/nomenclature/en/ (12.08.2011)에 요약된 고 병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N1)에 대한 WHO 명명법 시스템의 계통군(들)에 관한 것이다.
바이러스들의 10개의 명확한 초기 계통군들(0 내지 9번)이 정의되어 있으며(참조: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group, 2008), 이들은 제1차 계통군들로 칭한다. 계통군들은 WHO/OIE/FAO H5N1 진화 연구 그룹에 의해 개발된 다음의 3개의 구체적인 계통군 정의 기준들을 충족시키는 것으로서 뉴클레오타이드 수준에 대해 엄격히 정의된다:
ㆍ 공통(계통군-정의되는) 노드(node)의 공유;
ㆍ 계통군-정의되는 노드(1000개의 이웃-결합 부트스트랩(bootstrap) 복제들 후)에서 60 이상의 부트스트랩 값을 갖는 단일 계통 그룹화; 및
ㆍ 각각 >1.5% 및 <1.5%의 계통군들 사이 및 내에 쌍을 이룬 뉴클레오타이드 거리들의 평균 백분율.
이들 10개의 계통군들 내의 바이러스들은 계속해서 진화하므로, 신규의 아계통들(sublineages)(잠재적인 H5N1 계통군들)이 주기적으로 출현한다. 이들 아계통들이 초기 10개의 계통군들(0 내지 9로 번호매김)과 동일한 3개의 구체적인 계통군 정의 기준들을 충족하면, 이들은 별도의 계통군들로 지정된다[참조: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7 (2008)]. 이들 새로운 계통군들은 제2(또는 제3 등)차 계통군들로서 정의되고, 계급별 십진법 번호매김 시스템을 사용하여 이들을 이들 원래의 계통군에 연결시키는 수적 '어드레스(address)'로 지정된다. 예를 들면, 항원적으로 명백한 계통군 2.3 내에서, 계통군 정의를 충족시키는 제3차 계통군들은 2.3.1 및 2.3.2 등으로 지정된다. 이러한 논리적인 계급별 번호매김 시스템(logical hierarchal numbering system)은 HA 계통 발생과 객관적으로 관련되어 있다.
H5N1에 대한 WHO 명명법 시스템에 따른 계통군 지정에 사용된 당해 기준들은 다음과 같다:
1 가능한 경우 이미 지정된 계통군 번호들을 유지함(즉, 계통군 2.2는 2.2로 유지하고 계통군 1은 1로 유지함)
2 모든 이용가능한 서열들[큰 계통수(large tree)]로부터 유도된 계통수 위상기하학(phylogenetic tree topology)에 기초한 새로운 계통군 지정
H5N1 선조들(Gs/Guangdong/1/96에 가장 근접함)은 계통군 0으로 재-지정됨
후속적인 계통군들은 계통군 3으로부터 출발하여 번호매김(즉, 계통군 3 내지 9)
계통군들은 적어도 4개의 분리체들(단일 계통 그룹 내)에 의해 공유된 명백한 공통 노드의 존재로 지정됨
단일 계통군으로 지정된 추가의 가지들은 하나 이상의 명백한 계통(즉, 공통 노드 및 단일 계통 그룹화의 공유에 기초한 계통군 2.2 또는 계통군 2.3.1)으로 진화함
3 계통군들 사이 및 계통군들 내의 쌍별 거리의 평균 백분율(average percent pairwise distances)[키무라(Kimura) 2-매개변수]
명백한 계통군들은 다른 계통군들 사이에 >1.5% 평균 거리를 가져야만 함
명백한 계통군들은 계통군 내에 <1.5% 평균 거리를 가져야만 함(고도로 진화된 아웃라이어(outlier)들을 갖는 계통군들에서 약간 더 높을 수 있음; 즉, 계통군 7에서의 Ck/Shanxi/2/2006)
4 계통군-정의되는 노드에서 부트스트랩 값이 ≥60%인 부트스트랩(1,000개의 이웃-결합 부트스트랩 복제물들에 기초함)
[문헌: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7 (2008)의 표 1로부터 취함].
각각의 계통군에 대한 원형 균주(prototype strain)는 다음 표에 나열한다:
Figure 112014024531059-pct00001
[문헌: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7(2008)의 표 2로부터 취함].
인용에 의해 본원에 포함된 문헌[참조: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7 (2008)]은 CDC 웹사이트 URL: cdc.gov/EID/content/14/7/e1.htm (12.08.2011)에서 발견된다.
공지된 H5N1 바이러스들의 계통군 분류의 개요는 인용에 의해 본원에 포함된 WHO 웹사이트 URL: who.int/csr/disease/avian_influenza/H5CompleteTree.pdf (15.08.2011)에서 계통수에 의해 제공된다.
H5N1의 H5 단백질의 계통군을 측정하기 위해, 예를 들면, 웹 기반 도구 "Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 HA clade prediction"을 사용할 수 있으며, 당해 웹 기반 도구는, 루(Lu), 데이비스(Davis), 로울리(Rowley), 및 도니스(Donis)에 의한 문헌["A Web-based tool for the clade designation of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses" in Options for the Control of Influenza VI. J.M. Katz, N. Cox & A.W. Hampson (Eds.) London: Blackwell, 2007]에 기술되어 있고, 당해 문헌은, 인용에 의해 본원에 포함되며 웹사이트 URL: h5n1.flugenome.org/grouping.php (12.08.2011)에서 발견된다.
따라서, 예를 들면, 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질(H5 단백질 (1))은 H5N1에 대해 상기-언급된 WHO 명명법 시스템에 따른 계통군 1의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 HA이다.
따라서, 예를 들면, 계통군 2.3.1 H5N1 바이러스는 H5N1에 대해 상기-언급된 WHO 명명법 시스템에 따른 계통군 2.3.1의 기준 하에 속하는 H5N1이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 H5 단백질 (1), 즉, 본원에 기술된 바와 같은 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질은, 서열번호 1의 폴리펩타이드 서열과 98.1% 이상, 바람직하게는 98.2% 이상, 보다 바람직하게는 98.3% 이상, 및 가장 바람직하게는 98.4% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 이러한 폴리펩타이드 서열로 이루어진다.
본 발명의 내용에서 서열 동일성은, 단백질 서열들 사이에서 측정된 쌍별 유사성에 기초한 것으로 이해된다. 2개의 서열들 사이의 유사성 백분율(percent similarity)의 측정은, 컴퓨터 알고리즘, 특히, 익히 공지되어 있는 Basic Local Alignment Search Tool을 사용하여 바람직하게 달성된다[참조: Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ: Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990, 215(3):403-410]. 본 발명의 목적들을 위해, 아미노산 서열의 서열 동일성 백분율은, 다음 매개변수들을 사용한 BLAST blastp 동종 조사 알고리즘(homology search algorithm)을 사용하여 측정한다: 10의 예측된 한계점(threshold), 워드 크기 3, BLOSUM62 매트릭스, 11의 갭 개방 페널티(gap opening penalty), 1의 갭 연장 패널티(gap extension penalty), 및 조건 조성 점수 매트릭스 조정(conditional compositional score matrix adjustment). 조사하기 위한 데이터베이스는 불필요하지 않은(non-redundant) 단백질 서열들(nr)의 세트이다. BLAST 동종 조사 알고리즘은 문헌[참조: Altschul SF (1990),J Mol Biol 1990, 215(3):403-410]에 기술되어 있고, 당해 문헌은 인용에 의해 본원에 포함된다.
예를 들면, 변이체는 신호 펩타이드(signal peptide)(N-말단의 16개 아미노산 잔기들은 서열번호 1에 나타나 있지 않다)가 없는 참조 수탁 번호 BAE07201 분자와는 1 내지 15개 아미노산 잔기들만큼 적게, 1 내지 10개 아미노산 잔기들만큼 적게, 예를 들면, 6 내지 10개, 5개만큼 적게, 4, 3, 2개 만큼 적게, 또는 심지어 1개의 아미노산 잔기만큼 적게 상이할 수 있다.
한 예시적 실시형태에서, 본 발명에 따른 H5 단백질 (1), 즉, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질 (1)은, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스의 H5 단백질이고, 여기서, 당해 H5 단백질은 아미노산 223N 및 변형 328K+를 갖고, 여기서, 당해 H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다. 또한, 상기 바람직한 H5 단백질 (1)은 이하에 Mut k+ 또는 mutK+로서도 명명된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 이러한 H5 단백질 및 임의의 추가의 H5 단백질은, 분리된 H5 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "계통군 1 H5N1의 H5 단백질 (1)"은 바람직하게는 "계통군 1 H5N1 바이러스의 단일 항원으로서의 H5 단백질 (1)", 또는 특히 "단일 항원으로서의 H5 단백질 (1)"을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어들 "헤마글루티닌 5(H5)" 또는 "조류 인플루엔자 바이러스의 H5" 또는 "H5 단백질"은, 자연적으로 발생하는 H5 단백질, 및 H5 단백질의 임의의 결실, 치환 및/또는 삽입 돌연변이체를 포함하는 H5 단백질의 임의의 변형된 형태들과 동등하고 이들을 의미하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 H5 단백질 (1) Mut k+의 아미노산 위치들의 번호매김은, 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말한다. 서열번호 2는 균주 duck/China/E319-2/03의 헤마글루티닌의 아미노산 서열을 나타내지만, 서열번호 2에는 아미노 말단 신호 펩타이드가 결여되어 있다. 다시 말해서, 223번 위치의 아미노산(아미노산 223)을 참조하는 경우, 아미노산 잔기는 서열번호 2의 아미노산 223에 상응함을 의미한다. 그러나, 이는, 본 발명에 따른 H5 단백질 Mut k+가 서열번호 2와 동일한 아미노산 서열을 가짐을 의미하는 것은 아니다. 이는 단지 본 발명에 따른 H5 단백질들의 상응하는 아미노산들이 분명하게 언급한 바와 같이, 아미노산 잔기를 암호화함을 말한다. 현재의 경우, 아미노산 223은 세린(S)일 수 있다. 용어 "223N", 또는 "155N"은, 예시적으로, 서열번호 2의 아미노산 위치들에 따라 번호매겨진 223번 및 155번 위치 각각에서의 아미노산이 아미노산 아스파라긴(N)을 암호화함을 의미한다. 다시 말해서, "아미노산 223N을 갖는 H5 단백질 (1)"에 대하여 참조하는 경우, 서열번호 2의 아미노산 위치들에 따라 번호매겨진 223번 아미노산 위치에서 일반적으로 세린을 암호화하는 H5 아미노산 분자는, 아미노산이 아스파라긴(N)으로 치환될 것임을 의미한다. 용어 "328K+" 또는 "변형 328K+"는, 서열번호 2의 아미노산 위치들에 따라 번호매겨진 H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입됨을 의미한다. 328번 및 329번 위치들에서 아미노산 서열들이 자연적으로 라이신-라이신을 암호화하는 경우, 추가의 라이신(K)은 삽입되지 않을 것이다. 그러나, 공지되어 있는 H5 서열들 중 대부분은 아미노산 위치 328번 및 329번에서 라이신-아르기닌을 암호화한다. 임의의 이러한 경우에, 용어 328K+ 변형은, 제2 라이신(K)이 328번 위치에서의 라이신과 329번 위치에서의 아르기닌 사이에 삽입될 것임을 의미한다. 이어서, 변형된 서열은 라이신-라이신-아르기닌(KKR)으로 판독될 것이다.
본 예시와 관련하여, 균주 duck/China/E319-2/03의 헤마글루티닌은, 당해 HK 분리체의 년/위치/숙주인, 계통군 1 H5N1 바이러스 A/HongKong/213/2003의 H5 서열과 유사하므로, 계통군 1 H5N1의 H5 단백질 (1)로 이동하고, 계통군-1-특이적 항체들과의 반응성을 나타낸다. 따라서, Mut K+ 서열은 계통군 1 H5N1의 H5 서열로 분류된다. 따라서, 본 발명의 내용 내에서, 고안된 Mut K+ 서열은 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질인 것으로 이해되고 정의된다.
따라서, 특히, 임의의 고안된 H5 단백질도, H5N1에 대해 상기-언급된 WHO 명명법 시스템에 따라 계통군 1의 뉴클레오타이드 서열의 기준들을 충족시키는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 경우, 본 발명에 따른 계통군 1 H5N1 바이러스의 H5 단백질로서 이해되고 정의된다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명은, H5 단백질, 및 H5 단백질의 임의의 결실, 치환 및/또는 삽입 돌연변이체를 포함하는 H5 단백질의 임의의 변형된 형태들로 시행되고, 여기서, 이들 H5 단백질들은 아미노산 223N 및 변형 328K+를 갖고, 여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다. 본원에서 제공되는 바와 같은 H5 단백질들 중 어느 하나는 항원성이고, 이는, 이들이 인플루엔자 바이러스들에 대한 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 항원 특성을 나타냄을 의미함이 자명하다.
또한, 추가의 실시형태에 따르면, 본 발명은 H5 단백질 (1)의 임의의 부분에 관한 것이고, 이는, 표준 헤마글루티닌 억제 검정에서 항원 특성들을 나타내며, 한 실시형태에서는 적어도 아미노산 223N 및 변형 328K+을 가짐을 의미하고, 여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다.
H5 단백질 (1)은, H5 단백질 (1)이, 예를 들면, 실시예 2에 기술되는 바와 같이 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 헤마글루틴화를 억제하는 경우에 항원 특성들을 나타낸다. 일반적으로, 상기 H5 단백질 (1)의 항원성 부분은, 실시예 2에 기술되는 바와 같이 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 항원 특성들을 나타내는, 변형되거나 변형되지 않은, 상기에서 언급된 바와 같은 H5 단백질을 암호화하는 아미노산 서열의 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 또는 가장 바람직하게는 105개의 인접한(contiguous) 아미노산들을 포함한다. 또한, 표준 헤마글루티닌 억제 검정은, 예를 들면, 문헌[참조: Stephenson et al., Virus Research vol. 103, pp. 91 -95 (2004)] 및 추가의 참조문헌들에도 기술되어 있다. 그러나, 실시예 2에 기술되는 바와 같은 HI 검정은 본원에 기술되는 본 발명의 모든 양상들과 관련하여 관련 참조 검정인 것으로 이해될 것이다.
요약하면, HI 검정을 수행하여 HA-특이적인 항체들의 존재를 검출하였다. 이종 H5N2 바이러스, A/chicken/Mexico/232/94를 HI 검정에서 4개의 헤마글루틴화 단위들[4 HA 단위들]의 농축시에 사용하였다. U-바닥 미세역가 플레이트(U-bottomed microtiter plate)에서 PBS 중의 일련의 2배 혈청 희석물들을 바이러스의 4HA 단위들을 함유한 동등한 용적들(25μL)과 후속적으로 혼합하였고, 실온(약 25℃)에서 30분 동안 항온배양하였다. PBS 중의 0.5% 농도의 닭 적혈구 세포들을 혈청-바이러스 함유 웰(well)들에 첨가하고 실온에서 40분 동안 항온배양하였다. HI 역가들은 최고 혈청 희석물들의 역수(reciprocal)들로 측정하였으며, 여기서, 헤마글루틴화의 억제가 관찰되었다.
흥미롭게도, 문헌[참조: Haesebrouck and Pensaert (1986)]에서는 "챌린지 바이러스에 대한 HI 역가들과 챌린지로부터의 보호 사이에 상관관계가 존재할 수 있음"을 발견하였다. 또한, 문헌[참조: Haesebrouck and Pensaert (1986)]에서는 HI 역가들이 ≥40인 돼지들이 "챌린지에 대해 완전히 내성이고 챌린지시 호흡관에서 발생한 바이러스의 복제가 없었음"이 측정되었다. 따라서, 백신접종된 돼지에서 40 이상인 HI 역가의 발달은 보호와 상호관련될 수 있다(참조: F. Haesebrouck and M.B. Pensaert , 1986). 비육 돼지(fattening pig)들의 기관내 챌린지의 효과는, 불활성화된 인플루엔자 H1N1 백신으로 사전에 면역화하였다[참조: Veterinary Microbiology, 11 (1986) 239-249]. 또한, 등가 또는 적어도 거의 등가인 H5 HI 역가들은 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 돼지의 완전한 면역 보호를 초래할 것임을 가정하여야 한다. 보다 낮은 역가들은 적어도 백신접종된 동물들의 혈청전환을 초래하여, 이들 동물들의 부분적인 면역 보호를 초래하고, 또한, 이는 범발 유행병들의 위험을 현저하게 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 H5 단백질 (1)의 항원성 부분은, H5 단백질의 결실 돌연변이체들을 포함하지만, 이들에 한정되지 않고, 상기 H5 단백질 (1)의 항원성 부분은,
i. 아미노산 223N을 둘러싸고 이를 포함하는 아미노산 서열의 적어도 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, 또는 가장 바람직하게는 8개의 인접한 아미노산 들; 및
ii. 아미노산 변형 328+를 둘러싸고 이를 포함하는 아미노산 서열의 적어도 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, 또는 가장 바람직하게는 8개의 인접한 아미노산들을 포함하고,
iii. 여기서, H5 단백질의 이러한 항원성 부분 중 어느 하나는 실시예 2에 기술된 바와 같은 표준 헤마글루티닌 억제 검정에서 헤마글루티닌 억제를 나타낸다.
바람직하게, 아미노산 223N 및/또는 328K+의 이들 주위(surrounding) 아미노산들은 서열번호 2 또는 서열번호 5에 의해 암호화된다.
추가로, 본 발명에 따른 바람직한 H5 단백질 (1)은
i. 아미노산 223N 및 변형 328K+를 갖는 상기 언급된 것들 중 어느 하나;
ii. 아미노산 94N/223N 및 변형 328K+를 갖는 상기 언급된 것들 중 어느 하나;
iii. 아미노산 223N, 및 변형 328K+를 갖는 조류 기원의 임의의 H5 단백질(여기서, 조류 기원은, H5 서열이 조류 인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
iv. 아미노산들 94N/223N 및 변형 328K+를 갖는 조류 기원의 임의의 H5 단백질(여기서, 조류 기원은, H5 서열이 조류인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
v. 아미노산 155N/223N 및 변형 328K+를 갖는 조류 기원의 임의의 H5 단백질(여기서, 조류 기원은, H5 서열이 조류 인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
vi. 아미노산 120N/155N/223N 및 변형 328K+를 갖는 조류 기원의 임의의 H5 단백질(여기서, 조류 기원은, H5 서열이 조류 인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
vii. 변형들 94N/223N 및 변형 328K+를 갖는 임의의 H5 단백질; 또는
viii. 변형들 94N/155N/223N 및 변형 328K+를 갖는 임의의 H5 단백질; 또는
ix. 변형들 94N/120N/155N/223N 및 변형 328K+를 갖는 임의의 H5 단백질; 또는
x. 변형들 223N, 변형 328K+, 및
a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 123 내지 125: SDH
c. aa 128 내지 130: SSG
d. aa 138 내지 140: GSS
e. aa 226 내지 228: MDF
f. aa 270 내지 272: EVE
g. aa 309 내지 311: NKL로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 임의의 H5 단백질; 또는
xi. 아미노산 223N, 및 변형 328K+, 및
a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 128 내지 130: SSG
c. aa 138 내지 140: GSS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 임의의 H5 단백질; 또는
xii. 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 임의의 H5 단백질이다.
추가로, 본원에서 제공되는 바람직한 H5 단백질들 (1)은 문헌(참조: Hoffmann et at , PNAS , vol . 106, no .36, pp . 12915-12920, 2005년 9월 6일)에 기술된 바와 같은 H5 단백질들을 포함하고, 여기서, H5 단백질들은 상기 기술된 바와 같은 변형들, 적어도 아미노산 223N 및 변형 328K+ 중 하나 이상을 포함하며, 여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다. 본 참조문헌의 개시는 전문이 인용에 의해 본원에 포함될 것이다.
추가로, 본원에서 제공되는 바람직한 H5 단백질들 (1)은, 아미노산 223N 및 변형 328K+를 포함하는 펩타이드를 포함하는, H5 단백질들(여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다), 및
i. 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열; 또는
ii. 상기 기술된 바와 같은 표준 헤마글루티닌 억제시 헤마글루티닌 억제를 포함하는 상기 i)의 폴리펩타이드에 대해 약 85% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더욱 더 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 훨씬 더 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성, 및 훨씬 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는, 임의의 펩타이드; 또는
iii. 상기 i) 또는 ii)의 펩타이드들 중 어느 하나의 적어도 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9, 또는 가장 바람직하게는 8개의 인접한 아미노산들을 포함하는 상기 i) 또는 ii)의 폴리펩타이드들의 임의의 항원성 부분;
iv. 아미노산들 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, 223N, 또는 120N/155N을 갖는 상기 i), ii) 또는 iii)의 임의의 펩타이드들;
v. a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 123 내지 125: SDH
c. aa 128 내지 130: SSG
d. aa 138 내지 140: GSS
e. aa 226 내지 228: MDF
f. aa 270 내지 272: EVE
g. aa 309 내지 311: NKL로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 상기 i), ii), iii) 또는 iv)의 임의의 펩타이드; 또는
vi. a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 128 내지 130: SSG
c. aa 138 내지 140: GSS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 상기 i), ii), iii) 또는 iv)의 임의의 펩타이드를 포함하는, H5 단백질들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "서열 상동성"은 2개의 서열들의 관련성을 측정하는 방법을 말한다. 서열 상동성을 측정하기 위해, 2개 이상의 서열들을 최적으로 정렬시키고, 필요할 경우 갭들을 도입시킨다. 서열 동일성과는 대조적으로, 보존적 아미노산 치환들은 서열 상동성을 측정하는 경우에 부합(match)으로서 계수된다. 다시 말하면, 참조 서열과 95%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 참조 서열에서 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%의 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오타이들이, 다른 아미노산 또는 뉴클레오타이드를 지닌 보존적 치환과 부합되거나 이들을 포함하여야만 하거나, 참조 서열에 보존적 치환들을 포함하지 않는, 전체 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오타이드들 중 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 다수의 아미노산들 또는 뉴클레오타이드들을 참조 서열 내에 삽입시킬 수 있다. 바람직하게, 상동성 서열은 적어도 50, 보다 더 바람직하게는 100, 더욱 바람직하게는 250, 더욱 더 바람직하게는 500개의 뉴클레오타이드들의 길이(stretch)를 포함한다. 이러한 정렬시, 서열 상동성은 위치별 위치 기준(position-by-position basis)으로 확인되고, 예를 들면, 서열들은, 특정 위치에서 뉴클레오타이드들 또는 아미노산 잔기들이 동일한 경우, 이러한 특정 위치에서 "상동성"이다. 이어서, 이러한 위치 동일성들의 총 수를 참조 서열에서의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산 잔기들의 총 수로 나누어 서열 상동성 %를 수득한다. 서열 상동성은 문헌[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), 이들의 교시는 인용에 의해 본원에 포함된다]에 기술된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 공지되어 있는 방법들에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 서열 상동성을 측정하기 위한 바람직한 방법들을 고안하여 시험한 서열들 사이에 최대 부합을 제공한다. 서열 상동성을 측정하기 위한 방법들은, 제공된 서열들 사이의 서열 동일성을 측정하는 공공의 이용가능한 컴퓨터 프로그램들에서 암호화된다. 이러한 프로그램들의 예로는 GCG 프로그램 패키지[참조: Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)], BLASTP, BLASTN 및 FASTA[참조: Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)]가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원들[참조: BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이들의 교시는 인용에 의해 본원에 포함된다]로부터 공공으로 이용가능하다. 이들 프로그램들은, 제공된 서열들과 참조 서열들 사이에 최대 수준의 서열 상동성을 생산하기 위하여 디폴트 갭 중량(default gap weight)들을 사용하여 서열들을 최적으로 정렬한다.
추가로, 바람직한 H5 단백질들 (1)로는, 상기 언급된 바와 같은 328K+ 변형, 및 표 1에 제공되는 아미노산 서열, 또는 이들의 임의의 면역원성 부분을 포함하는, H5 단백질들이 포함된다.
Figure 112014024531059-pct00002
Figure 112014024531059-pct00003
추가로, 본 발명은 또한 적어도 아미노산 223N 및 변형 328K+를 갖는 H5 단백질들 (1)[여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다]에 관한 것이고,
i. 상기 기술된 방식으로 변형된(이는, 이들 서열들이, 야생형 서열들의 부분이 아닌 상기에 언급된 변형들 223N 및 328K+를 포함함을 의미한다), NCBI 수탁 번호 제AAT65209호, 제CAJ32556호, 제ABC47656호, 제CAF21874호, 제CAF21870호, 제AAC58998호, 제AAC58997호, 제AAC58996호, 제AAC58994호, 제AAC58993호, 제AAC58992호, 제AAC58991호, 제AAC58990호, 제AAC58995호, 제AAS45134호, 제AAN17270호, 제AAN17269호, 제AAN17268호, 제AAN17267호, 제AAN17266호, 제AAN17265호, 제AAN17264호, 제AAN17263호, 제AAN17262호, 제AAN17261호, 제AAN17260호, 제AAN17259호, 제AAN17257호, 제AAN17256호, 제AAN17255호, 제AA17254호, 제AAA43083호, 제AAA43082호, 제AAB19079호, 제BAE48696호, 제BAE48693호, 제BAE48696호, 제BAE48695호, 제BAE48694호, 제BAE48692호, 제BAE48691호, 제BAE48690호, 제BAE48689호, 제BAE48688호, 제BAE48687호, 제BAE48686호, 제BAE48685호, 제BAE48684호, 제BAE48683호, 제AAC58999호, 제ABC72082호, 제AAV91149호, 제AAP71993호, 제AAP71992호, 제AAP71991호, 제AAP71990호, 제AAP71989호, 제AAP72011호, 제AAP72010호, 제AAP72009호, 제AAP72008호, 제AAP72007호, 제AAP72006호, 제AAP72005호, 제AAP72004호, 제AAP72003호, 제AAP72002호, 제AAP72001호, 제AAP72000호, 제AAP71999호, 제AAP71998호, 제AAP71997호, 제AAP71996호, 제AAP71995호, 제AAP71994호, 제AAF99718호, 제ABF58847호, 제AAG38534호, 제AAC32102호, 제AAC32099호, 제AAL75847호, 제AAC32101호, 제AAC32098호, 제AAC32088호, 제AAC32078호, 제AAR99628호, 제AAC32100호, 제AAM49555호, 제AAL75843호, 제AAL75839호, 제AAD13573호, 제AAD13568호, 제AAF04720호, 제AAF04719호, 제AAC34263호, 제AAR16155호, 제AAD13574호, 제AAD13570호, 제AAD13575호, 제AAD13572호, 제AAD13569호, 제AAD13567호, 제AAD13566호, 제AAK57506호, 제AAG01225호, 제AAG01215호, 제AAG01205호, 제AAG01195호, 또는 제ABD83813호의 서열들을 갖는 펩타이드; 또는
ii. 상기 i)의 폴리펩타이드에 대해 85% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 더욱 더 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 상동성, 훨씬 더 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성, 및 훨씬 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖고, 상기 기술한 바와 같은 표준 헤마글루티닌 억제시 헤마글루티닌 억제를 나타내는, 임의의 펩타이드;
iii. 아미노산들 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A, 263T, 또는 120N/155N을 갖는 상기 i) 또는 ii)의 펩타이드들 중 어느 하나; 또는
iv. a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 123 내지 125: SDH
c. aa 128 내지 130: SSG
d. aa 138 내지 140: GSS
e. aa 226 내지 228: MDF
f. aa 270 내지 272: EVE
g. aa 309 내지 311: NKL로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 상기 i), ii), 또는 iii)의 이러한 펩타이드들 중 어느 하나; 또는
v. a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 128 내지 130: SSG
c. aa 138 내지 140: GSS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 상기 i), ii) iii) 또는 iv)의 이러한 펩타이드들 중 어느 하나를 포함한다.
바람직하게는, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 H5 단백질 (1)은, 바람직하게는 배양된 곤충 세포들 내에서 배큘로바이러스 발현 시스템에 의해 재조합적으로 발현되고/되거나 생산된다.
따라서, 본원에서 언급되는 용어 "H5 단백질 (1)"은, 특히, 본원에서 사용되는 용어 "재조합체 H5 단백질"과 동등하다.
본원에 언급된 바와 같이, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스와 관련하여, 상이한 계통군의 상기 H5N1 바이러스는, 계통군 0 H5N1 바이러스, 계통군 2 H5N1 바이러스, 계통군 3 H5N1 바이러스, 계통군 4 H5N1 바이러스, 계통군 5 H5N1 바이러스, 계통군 6 H5N1 바이러스, 계통군 7 H5N1 바이러스, 계통군 8 H5N1 바이러스 및 계통군 9 H5N1 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 바람직하게 선택된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시형태에서, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스는 계통군 2.2 H5N1 바이러스 또는 계통군 2.3 H5N1 바이러스이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스는 계통군 2.2.1 H5N1 바이러스 또는 계통군 2.3.2 H5N1 바이러스이다.
명확성의 이유로, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스의 H5 단백질은 이후에 "H5 단백질 (2)"로 명명된다. 따라서, 본원에 언급된 H5 단백질 (2)는, 특히, 계통군 1을 제외한 임의의 계통군의 H5N1의 게놈에 의해 암호화된 H5 단백질이다.
또한, 추가의 바람직한 실시형태에서, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스는 북아프리카 또는 베트남 기원의 H5N1 바이러스이며, 여기서, 상기 북 아프리카 기원의 H5N1 바이러스는 바람직하게는 인플루엔자 바이러스의 H5 단백질 (2)를 포함하는 H5N1 바이러스이고, 여기서, 상기 H5 단백질 (2)는
(a) 아미노산들 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, 및 181N(여기서, 변형 145(-)는, H5의 아미노산 위치 145번이 결실되어 있음을 의미한다), 또는
(b) 아미노산들 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G 및 421K, 또는
(c) 아미노산들 145L, 172T, 및 254V를 갖고,
여기서, 상기 H5 단백질 (2)의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 8에 예시적으로 제공되는 바와 같은 아미노산 위치를 말하거나;
여기서, 상기 H5 단백질 (2)은, 서열번호 9 내지 서열번호 46에 나타낸 바와 같은 서열들 중 어느 하나와 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상, 또는 특히 바람직하게는 100% 상동성인 아미노산 서열로 이루어지거나, 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 내용에서, (a)에 따른 상기 H5 단백질 (2)는 아계통군(subclade) A 단백질이고, (b) 또는 (c)에 따른 상기 H5 단백질은 아계통군 B 단백질이다.
본 발명의 내용에서, 용어 "아미노산"은, 특히, 아미노산 잔기, 또는 각각 2개의 추가의 아미노산들에 대한 펩타이드 결합들을 통해 공유 결합된 아미노산, 또는 아미노산이 펩타이드 서열 내에 N- 또는 C-말단적으로 위치하는 경우에는 1개의 추가의 아미노산을 말하는 것으로 이해된다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 실시형태에서, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스는,
(a) 아미노산들 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, 및 181N, 또는
(b) 아미노산들 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G 및 421K, 또는
(c) 아미노산들 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H, 및
254V를 갖는, H5 단백질 (2)를 포함하고/하거나,
여기서, 이러한 H5 단백질 (2)는,
i. 서열번호 9 내지 서열번호 46의 아미노산 서열들 중 어느 하나;
ii. 상기 i)의 폴리펩타이드에 대해 85% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 96% 이상, 더욱 더 바람직하게는 97% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 98% 이상, 훨씬 더욱 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 서열 상동성을 갖는 임의의 펩타이드; 또는
iii. 상기 i) 또는 ii)의 이러한 펩타이드들 중 어느 하나의 334개 이상의 인접한 아미노산들을 포함하는 상기 i) 또는 ii)의 폴리펩타이드들의 임의의 부분(여기서, 이러한 펩타이드 중 어느 하나는 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 헤마글루티닌 억제를 포함한다)을 포함하는, 펩타이드를 포함하고/하거나,
여기서, 이러한 H5 단백질 (2)는 서열번호 9 내지 서열번호 46에 나타낸 바와 같은 서열들 중 어느 하나와 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 96% 이상, 더욱 더 바람직하게는 97% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 98% 이상, 훨씬 더욱 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 서열 유사성을 갖는 인접한 아미노산 서열로 이루어지거나, 이러한 아미노산 서열을 포함한다.
보다 구체적으로, 상이한 계통군의 H5N1 바이러스는, 서열번호 15 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 서열들 중 어느 하나와 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 더 바람직하게는 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 99% 이상, 또는 특히 바람직하게는 100%의 상동성인 아미노산 서열로 이루어지거나, 이러한 아미노산 서열을 포함하는, H5 단백질 (2)를 포함하고, 여기서, 특히, 서열번호 20에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 이루어진, 이러한 H5 단백질 (2)가 더욱 바람직하다.
특히, 본 발명은,
(A) 북아프리카 기원의 아계통군 A H5N1 바이러스에 의한 감염, 즉, 특허청구범위의 제13항 또는 제14항의 (a)에 따른 아미노산들을 갖는 H5 단백질 (2)를 포함하거나, 서열번호 9 내지 서열번호 19, 또는 서열번호 42 또는 서열번호 43에 나타낸 바와 같은 서열들 중 어느 하나와 관련된 제16항 또는 제17항에 따른 H5 단백질을 포함하는, H5N1 바이러스에 의한 감염,
또는
(B) 북아프리카 기원의 아계통군 B H5N1 바이러스에 의한 감염, 즉, 특허청구범위 제13항 또는 제14항의 (b) 또는 (c)에 따른 아미노산들을 갖는 H5 단백질을 포함하거나, 서열번호 20 내지 서열번호 41, 또는 서열번호 44 내지 서열번호 46에 나타낸 바와 같은 서열들 중 어느 하나와 관련된 제16항 또는 제17항에 따른 H5 단백질을 포함하는, H5N1 바이러스에 의한 감염
을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 H5 단백질 (1)에 관한 것이다.
추가의 실시형태에 따라서, 본 발명은 또한 상이한 계통군의 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 상기 기술된 바와 같은 H5 단백질들(1) 중 어느 하나를 암호화하는, 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게, 이들 핵산 분자들은 RNA, DNA 또는 카피 (c) DNA 분자들이다.
따라서, 본 발명은 핵산 분자, 바람직하게는 H5 단백질, 또는 H5 단백질의 임의의 결실, 치환 및/또는 삽입 돌연변이체를 포함하는, H5 단백질의 임의의 변형된 형태들을 암호화하는 cDNA 분자에 관한 것이고, 여기서, 이들 H5 단백질들은 아미노산 223N 및 변형 328K+를 갖고, 여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다.
추가의 실시형태에 따르면, 본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 표준 헤마글루티닌 억제 검정에서 항원 특성들을 나타내는 임의의 펩타이드-단편을 암호화하고, 적어도 아미노산 223N 및 변형 328K+(여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다)를 가짐을 의미하는, 핵산 분자, 바람직하게는 H5 단백질 (1)의 특정 부분을 암호화하는 cDNA 분자를 말한다. 일반적으로, 상기 H5 단백질의 항원성 부분을 암호화하는 이러한 핵산 분자들은, 본원에 기술된 바와 같은 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 항원 특성들을 나타내는, 변형되거나 변형되지 않은, 상기에서 언급된 바와 같은 H5 단백질을 암호화하는, 뉴클레오타이드 서열의 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330 또는 가장 바람직하게는 315개의 인접한 뉴클레오타이드들을 포함한다.
H5 단백질 (1)의 항원성 부분들의 추가의 실시형태들은 상기에 기술되어 있다. 임의의 이러한 핵산 분자들, 바람직하게는 상기에 기술된 바와 같은 H5 단백질의 항원성 부분을 암호화하는 cDNA 분자들을 작제하는 것은 당해 분야의 숙련가의 일반적인 지식 내이다. 이는, 또한, H5의 결실 돌연변이체를 포함하는 상기에 언급된 바와 같은 H5 단백질의 항원성 부분을 암호화하는, 핵산 분자들의 작제, 바람직하게는 cDNA 분자들의 작제를 포함하지만, 이에 한정되지 않고, 이는
i. 아미노산 223N을 암호화하는 암호화 서열을 둘러싸고 이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, 또는 가장 바람직하게는 24개의 인접한 아미노 뉴클레오타이드들; 및
ii. 변형 328K+를 암호화하는 암호화 서열을 둘러싸고 이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27, 또는 가장 바람직하게는 24개의 인접한 아미노 뉴클레오타이드들을 포함하고,
iii. 여기서, H5 단백질의 이러한 항원성 부분 중 어느 하나는 실시예 2에 기술된 바와 같은 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 헤마글루티닌 억제를 나타낸다.
바람직하게, 아미노산들 223N 및/또는 328K+를 암호화하는 뉴클레오타이드들의 이들 주위 뉴클레오타이드들은 서열번호 2 또는 서열번호 5를 암호화한다.
또한, 본 발명에 따른 H5 단백질 (1)을 암호화하는 바람직한 핵산 분자들은,
i. 아미노산 223N 및 변형 328K+를 암호화하는 상기 언급된 것들 중 어느 하나;
ii. 아미노산 94N/223N 및 변형 328K+를 암호화하는 상기 언급된 것들 중 어느 하나;
iii. 아미노산 223N, 및 변형 328K+를 암호화하는 조류 기원의 임의의 핵산 분자들(여기서, 조류 기원은, H5 서열이, 조류 인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
iv. 아미노산들 94N/223N 및 변형 328K+를 암호화하는 조류 기원의 임의의 핵산 분자들(여기서, 조류 기원은, H5 서열이, 조류 인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
v. 아미노산들 155N/223N 및 변형 328K+를 암호화하는 조류 기원의 임의의 핵산 분자들(여기서, 조류 기원은, H5 서열이, 조류 인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
vi. 아미노산 120N/155N/223N 및 변형 328K+를 갖는 조류 기원의 H5 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자(여기서, 조류 기원은, H5 서열이, 조류 인플루엔자 바이러스 제5형으로 감염된 가금류로부터 처음 분리된 바이러스 분리체로부터 유도되었음을 의미한다); 또는
vii. 변형들 94N/223N 및 변형 328K+을 갖는 H5 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 또는
viii. 변형들 94N/155N/223N 및 변형 328K+를 갖는 H5 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 또는
ix. 변형들 94N/120N/155N/223N 및 변형 328K+를 갖는 H5 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 또는
x. 변형들 223N, 변형 328K+, 및
a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 123 내지 125: SDH
c. aa 128 내지 130: SSG
d. aa 138 내지 140: GSS
e. aa 226 내지 228: MDF
f. aa 270 내지 272: EVE
g. aa 309 내지 311: NKL로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 H5 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 또는
xi. 아미노산 223N, 변형 328K+, 및
a. aa 93 내지 95: GNF
b. aa 128 내지 130: SSG
c. aa 138 내지 140: GSS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 H5 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 또는
xii. 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 H5 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자이다.
또한, 본원에 제공된 바와 같은 바람직한 H5 단백질들 (1)은 문헌[참조: Hoffmann et al , PNAS , vol . 106, no .36, pp . 12915-12920 of September 6, 2005]에 기술된 바와 같은 H5 단백질들을 포함하고, 여기서, 상기 H5 단백질들은 상기에 기술된 바와 같은 변형들 중 하나 이상, 적어도 아미노산 223N 및 변형들 328K+를 포함하며, 여기서, 상기 H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은, 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 상기 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다. 당해 참조문헌의 개시는 이의 전문이 인용에 의해 본원에 포함될 것이다. 따라서, 추가의 실시형태들에 따르면, 본 발명은 또한 문헌[참조: Hoffmann et al , PNAS , vol . 106, no .36, pp. 12915-12920, 2005년 9월 6일]에 기술된 이러한 단백질들 중 어느 하나를 암호화하는 임의의 핵산 분자, 바람직하게는 cDNA 분자에 관한 것이고, 여기서, 상기 H5 단백질들은 상기에 기술된 바와 같은 변형들 중 하나 이상, 적어도 아미노산 223N 및 변형 328K+를 포함하고, 여기서, 상기 H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 상기 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다.
인플루엔자 바이러스의 H5 단백질의 암호화 서열을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열 내의 상기-언급된 변형들 중 어느 하나를 도입시키는 방법들은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 전체 인플루엔자 바이러스의 게놈 서열은, 본 발명에 따라, 예를 들면, 추가의 참조문헌들과 함께, US 제6,951,754호에 기술된 방법들에 따라 변형시킬 수 있다.
또한, 당해 분야의 기술 내에서 종래의 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합체 DNA 기술들을 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 항원을 암호화하는 핵산 서열을 변형시킬 수 있다. 이러한 기술들은 문헌에 완벽하게 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor , N. Y.; DNA Cloning : A Practical Approach , Volumes I and II (D. N. Glover ed . 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed . 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds . (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins , eds . (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney , ed . (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [ IRL Press , (1986)]; B. Perbal , A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al . ( eds .), Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, Inc . 1994]을 참조한다.
추가의 실시형태에 따르면, 본 발명은, 또한, 상기 기술된 바와 같은 이러한 핵산 분자들 중 어느 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 다시 말해서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 임의의 이러한 H5 단백질 (1), 또는 이의 부분의 암호화 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 벡터는 상기에 기술된 바와 같은 임의의 이러한 H5 단백질 (1) 또는 이의 부분의 발현을 가능하게 하는, 발현 벡터이다. 본 발명에 따른 벡터들은 시험관내에서 또는 생체내에서 세균, 효모 또는 동물 세포들의 형질감염 또는 감염에 적합한 벡터들이다.
벡터들, 및 발현용 벡터들(또는 재조합체들)을 제조하고/하거나 사용하기 위한 방법들은, 각각이 인용에 의해 본원에 포함되는, 문헌[참조: 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 제5,174,993호, 제5,505,941호, 제5,338,683호, 제5,494,807호, 제4,722,848호, 제5,942,235호, 제5,364,773호, 제5,762,938호, 제5,770,212호, 제5,942,235호, 제382,425호, PCT 공보들 제WO 94/16716호, 제WO 96/39491호, 제WO 95/30018호, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996, Smith et al., 미국 특허 제4,745,051호, (recombinant baculovirus), Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, No. 3, p. 399-406; EPA0 370 573, 1986년 10월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 제920,197호, 유럽 특허 공보 제265785호, 미국 특허 제4,769,331호(recombinant herpesvirus), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,"PNAS USA 93: 11307-11312, October 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,"PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996, Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,"PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996, Kitson et al., J. Virol. 65,3068-3075, 1991; 미국 특허 제5,591,439호, 제5,552,143호, 제WO 98/00166호, 허여된 미국 특허 출원 일련 번호 제08/675,556호, 및 제08/675,566호(둘 다 1996년 7월 3일자로 출원됨)(recombinant adenovirus), Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p.3861-65, Graham, Tibtech 8,85-87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70,42434, PCT WO 91/11525, Feigner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993 and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996, 및 미국 특허 제5,591,639호, 제5,589,466호, 및 제5,580,859호, 및 또한 제WO 90/11092호, 제W093/19183호, 제W094/21797호, 제W095/11307호, 제WO95/20660호, Tang et al., Nature and Furth et al. Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, 특히, 또한 제WO 98/33510호; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739,1998 (lentiviral expression system); Sanford et al., 미국 특허 제4,945,050호; Fischbachet al.(Intracel), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems); Szoka et al., 미국 특허 (method of inserting DNA into living cells); McCormick et al., 미국 특허 제5,677,178호 (use of cytopathic viruses); 및 미국 특허 제5,928,913호(vectors for gene delivery), 및 본원에 인용된 다른 문헌들]에 기재된 방법들에 의한 것이거나, 이러한 방법들과 유사할 수 있다.
예를 들면, 아우제스츠키병 바이러스(Aujeszky's disease virus), 돼지 아데노바이러스(porcine adenovirus), 폭스바이러스(poxvirus)들, 특히 백시니아바이러스(vaccinia virus), 아비폭스 바이러스(avipox virus), 카나리폭스 바이러스(canarypox virus), 및 스와인폭스 바이러스(swinepox virus)와 같은 돼지 헤르페스 바이러스들, 및 DNA 벡터들(DNA 플라스미드들)로부터 선택되는 바이러스 벡터가 본 발명의 실시에서 유리하게 사용된다.
본 발명에 따른 H5 단백질들 (1)을 생산하는 방법들
다른 양상에 따르면, 본 발명은, i) H5 DNA 암호화 서열들을 함유하는 재조합체 바이러스 벡터를 사용하여 배양물 내에서 민감한 세포들의 감염을 허용하는 단계(여기서, H5 단백질은 재조합체 바이러스 벡터에 의해 발현된다), ii) 그 후에 세포 배양물로부터 H5 단백질을 회수하는 단계에 의해, 다량의 재조합체 H5 단백질을 생산하고/하거나 회수하는 방법들을 제공한다. 다량의 H5 단백질은, 약 20㎍/mL 초과의 세포 배양물, 바람직하게는 약 25㎍/mL 초과, 보다 바람직하게는 약 30㎍/mL 초과, 더욱 바람직하게는 약 40㎍/mL 초과, 보다 더 바람직하게는 약 50㎍/mL 초과, 더욱 더 바람직하게는 60㎍/mL 초과, 훨씬 더 바람직하게는 약 80㎍/mL 초과, 훨씬 보다 더 바람직하게는 약 100㎍/mL 이상, 훨씬 더욱 더 바람직하게는 약 150㎍/mL 초과, 가장 바람직하게는 약 190㎍/mL 초과를 의미하지만, 이들에 한정되지 않는다.
바람직한 실시형태에 따르면, H5 단백질 (1)은, H5 단백질을 발현하는 전체(즉, 온전한) SF+ 세포들을 수거함으로써 회수된다.
바람직한 세포들은, H5 DNA를 함유하고 H5 단백질 (1)을 발현하는, 적절한 재조합체 바이러스 벡터를 사용한 감염에 민감한 세포들이다. 바람직하게, 당해 세포들은 곤충 세포들이고, 보다 바람직하게는 이들은 상표명 SF+ 곤충 세포들[제조원: 코네티컷주 메리덴(Meriden) 소재의 프로테인 사이언시즈 코포레이션(Protein Sciences Corporation) 하에 시판된 곤충 세포들을 포함한다.
바람직한 세포 배양물들은, 약 0.3 내지 2.0 x 106개 세포들/mL, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 1.9 x 106개 세포들/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 x 106개 세포들/mL, 더욱 더 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 x 106개 세포들/mL, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5 x 106개 세포들/mL 사이의 세포 수(cell count)를 갖는다.
바람직한 바이러스 벡터들은, BaculoGold[제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 비디 바이오사이언시즈 파밍겐(BD Biosciences Pharmingen)], 특히, 생산 세포들이 곤충 세포들인 것으로 제공된 배큘로바이러스를 포함한다. 배큘로바이러스 발현 시스템이 바람직하지만, 당해 분야의 숙련가는, 본 발명의 목적들을 위해, 즉, 세포 배양물의 상청액 내로 H5를 발현시키기 위해, 다른 발현 시스템들이 작동할 것임을 이해한다. 이러한 다른 발현 시스템들은 H5 발현을 배지 내로 야기시키기 위하여 신호 서열의 사용을 필요로 할 수 있다.
또한, 적절한 성장 배지는 Excell 420[캔사스주 레넥사(Lenexa) 소재의 제이알에이치 바이오사이언시즈, 인코포레이티드(JRH Biosciences, Inc.)] 등과 같은 혈청-불포함 곤충 세포 배지인 바람직한 성장 배지를 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 측정될 수 있을 것이다.
H5 DNA 서열들을 함유하는 재조합체 바이러스 벡터는, 민감한 세포들의 감염에 사용하는 경우, 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0의 바람직한 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI)를 갖는다. 바람직하게, 상기 언급된 MOI들은 세포 배양물 유액 1mL에 관한 것이다. 바람직하게, 본원에 기술된 방법은, H5 DNA를 함유하고 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0의 MOI(감염 다중도)를 갖는 H5 단백질을 발현하는, 재조합체 바이러스 벡터를 사용한 0.35 내지 1.9 x 106개 세포들/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 x 106개 세포들/mL, 더욱 더 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 x 106개 세포들/mL, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5 x 106개 세포들/mL의 감염을 포함한다.
이어서, 감염된 세포들은 10일 이하, 보다 바람직하게는 약 2일 내지 약 10일, 보다 더 바람직하게는 약 4일 내지 약 9일, 및 가장 바람직하게는 약 5일 내지 약 8일의 기간에 걸쳐 항온배양된다. 바람직한 항온배양 조건들로는 약 22 내지 32℃, 보다 바람직하게는 약 24 내지 30℃, 보다 더 바람직하게는 약 25 내지 29℃, 더욱 더 바람직하게는 약 26 내지 28℃, 및 가장 바람직하게는 약 27℃의 온도가 포함된다. 바람직하게, SF+ 세포들은 특징적인 배큘로바이러스-유도된 변화들을 위한 다음의 접종(inoculation)으로 관찰된다. 이러한 관찰은 세포 밀도 경향성 및 감염-후 기간 동안의 생존능에 있어서의 감소를 모니터링함을 포함할 수 있다. 피크 바이러스 역가(peak viral titer)는 감염 후 3 내지 5일 경과 후에 관찰되고, 세포들 내에서의 피크 H5 단백질 발현은 5 내지 8일 사이에 수득되고/되거나 세포 생존능은 10% 미만으로 감소됨이 발견되었다.
따라서, 본 발명의 한 양상은, i) 상기에 정의한 바와 같은, MOI를 갖는 재조합체 바이러스 벡터를 사용하여 배양물 중의 다수의 민감한 세포들(상기 참조)의 감염을 허용하는 단계, ii ) 재조합체 바이러스 벡터에 의해 H5 단백질을 발현시키는 단계, 및 iii ) 그 후에 H5 단백질을 감염 후 5일 내지 8일 경과 후에 및/또는 세포 생존능이 10% 미만으로 감소된 후에 수득된 세포들로부터 회수하는 단계에 의해, 재조합체 H5 단백질을 바람직하게는 상기에 기술한 양으로 생산하고/하거나 회수하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 재조합체 바이러스 벡터는 H5 DNA 암호화 서열들을 함유하는 재조합체 배큘로바이러스이고, 세포들은 SF+ 세포들이다. 추가로, 배양물을 오염의 거시적 및 현미경적 증거, 또는 감염-후 기간 동안 세포 형태학에 있어서 이례적인 변화들에 대해 주기적으로 실험하는 것이 바람직하다. 임의의 오염을 나타내는 임의의 배양물은 폐기되어야만 한다.
백신과 같은 면역원성 또는 면역학적 조성물에서 사용될 것인 H5 단백질 (1)의 회수를 위해, 불활성화 단계의 포함은, 바이러스 벡터를 불활성화시키기 위해 바람직하다.
"면역원성 또는 면역학적 조성물"은, 목적한 조성물 또는 백신에 대해 세포성 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 숙주 내에서 면역학적 반응을 유발하는 하나 이상의 항원을 포함하는 물질의 조성물을 말한다. 일반적으로, "면역학적 반응"은 다음 효과들 중 하나 이상을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다: 목적한 조성물 또는 백신 내에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된, 항체들, B 세포들, 헬퍼 T 세포들, 억제인자 T 세포들, 및/또는 세포독성 T 세포들 및/또는 감마-델타 T 세포들. 바람직하게, 숙주가 치료학적 또는 보호성 면역학적 반응을 나타내어 신규 감염에 대한 내성은 향상되고/되거나 질환의 임상적 중증도는 감소될 것이다. 이러한 보호는, 감염된 숙주에 의해 일반적으로 나타나는 증상들의 감소 또는 결여, 감염된 숙주 내에서의 보다 신속한 회복 시간 및/또는 저하된 바이러스 역가에 의해 입증될 것이다.
본원에 사용된 것으로서, "백신"은 당해 분야의 숙련가에 의해 사용되는 용어를 말한다. 보다 구체적으로, "백신"은 이를 필요로 하는 동물에게 투여되는 경우, 인플루엔자 감염의 임상적 징후(clinical sign)들의 발생률 또는 중증도에 있어서 이러한 임상적 징후들의 완전한 예방을 포함하는 정도까지의 감소를 초래하는 면역원성 조성물을 말한다.
바람직하게, 발생률 또는 중증도에 있어서의 감소는, 본 발명의 조성물들을 투여받지는 않았지만 임상적 징후들을 나타내는 인플루엔자 감염을 일반적으로 초래할 수 있는 인플루엔자 바이러스의 감염 수준들에 노출된 동물 또는 동물들의 그룹과 비교하여, 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 더 바람직하게는 30% 이상, 더욱 더 바람직하게는 40% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 보다 더 바람직하게는 60% 이상, 훨씬 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 그보다 더 바람직하게는 80% 이상, 그보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 그보다 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 100%이다.
따라서, 본 발명은, 또한, i) 상기에 정의한 바와 같은 MOI를 갖는 재조합체 바이러스 벡터를 사용하여 배양물 중의 다수의 민감한 세포들(상기 참조)의 감염을 허용하는 단계, ii ) 재조합체 바이러스 벡터에 의해 H5 단백질을 발현시키는 단계, iii) 감염 후 5일 내지 8일 경과 후에 및/또는 세포 생존능이 10% 미만으로 감소된 후에 수득된 세포들에서 발현된 H5 단백질을 회수하는 단계, 및 iv ) 재조합체 바이러스 벡터를 불활성화시키는 단계에 의해, 재조합체 H5 단백질을, 바람직하게는 상기 기술된 양으로 생산하고/하거나 회수하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 불활성화는 여과 단계 직전에 또는 직후에 수행되며, 여과 단계 후가 불활성화를 위해 바람직한 시간이다. 임의의 종래 불활성화 방법을 본 발명의 목적들을 위해 사용할 수 있다. 따라서, 불활성화는 화학적 및/또는 물리적 처리들에 의해 수행할 수 있다. 바람직한 형태들에서, 수거된 유액들의 용적을 측정하고 온도를 약 32 내지 42℃, 보다 바람직하게는 약 34 내지 40℃, 및 가장 바람직하게는 약 35 내지 39℃가 되게 한다. 바람직한 불활성화 방법들은 폐환된 이원 에틸렌이민(BEI)을, 바람직하게는 약 1 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 2 내지 약 10mM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8mM, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 7mM, 가장 바람직하게는 약 5mM의 농도로 첨가함을 포함한다. 예를 들면, 불활성화는 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드의 용액을, 0.3N NaOH 중 0.2M 이원 에틸렌이민(BEI)으로 폐환된, 바람직하게는 약 0.4M로 당해 유액들에 첨가하여 약 5mM BEI의 최종 농도를 수득한다. 이어서, 바람직하게, 유액들은 72 내지 96 시간 동안 연속적으로 교반하고, 불활성화된 수거 유액들을 -40℃ 이하 또는 약 1 내지 7℃에 저장할 수 있다. 불활성화가 완료된 후, 바람직하게는 1.0M의 티오황산 나트륨 용액을 첨가하여 임의의 잔류 BEI도 중화시킨다. 바람직하게, 티오황산 나트륨을, 불활성화 이전에 첨가된 BEI와 비교하여, 동등한 양으로 첨가한다. 예를 들면, BEI가 5mM의 최종 농도로 첨가되는 경우에, 1.0M의 티오황산 나트륨 용액을 첨가하여 5mM의 최종 최소 농도를 수득함으로써 임의의 잔류 BEI를 중화시킨다.
따라서, 본 발명의 한 추가의 양상은, i) 상기에 정의한 바와 같은 MOI를 갖는 재조합체 바이러스 벡터를 사용하여 배양물 내의 다수의 민감한 세포들(상기 참조)의 감염을 허용하는 단계, ii ) 재조합체 바이러스 벡터에 의해 H5 단백질을 발현시키는 단계, iii ) 감염 후 5일 내지 8일 경과 후에 및/또는 세포 생존능이 10% 미만으로 감소된 후에 수득된 세포들에서 발현된 H5 단백질을 회수하는 단계, 및 iv) 재조합체 바이러스 벡터를 불활성화시키는 단계에 의해, 재조합체 H5 단백질을, 바람직하게는 상기 기술된 양으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 재조합체 바이러스 벡터는 H5 DNA 암호화 서열들을 함유하는 배큘로바이러스이고, 세포들은 SF+ 세포들이다. 바람직한 불활성화 단계들은 상기에서 기술된 것들이다. 바람직하게, 불활성화는 약 35 내지 39℃에서 및 2 내지 8mM BEI의 존재 하에, 보다 더 바람직하게는 약 5mM BEI의 존재 하에 수행된다.
본 발명의 한 추가의 양상에 따르면, 상기 기술된 방법은, 또한, 단계 iv ) 후에 중화 단계도 포함한다. 이러한 단계 v)는 용액 내에서 불활성화 제제를 중화시키는 동등한 양의 제제를 첨가함을 포함한다. 바람직하게, 불활성화 제제가 BEI인 경우, 티오황산 나트륨을 등량으로 첨가하는 것이 바람직하다. 따라서, 추가의 양상에서 따르면, 단계 v)는, 불활성화 제제가 BEI인 경우, 티오황산 나트륨 용액을 약 1 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 2 내지 약 10mM, 보다 더 바람직하게는 약 2 내지 약 8mM, 더욱 더 바람직하게는 약 3 내지 약 7mM, 가장 바람직하게는 약 5mM의 최종 농도로 첨가하는 것을 포함한다.
바람직한 형태들, 및 특히, 백신과 같은 면역원성 조성물 중의 재조합체 H5 단백질을 사용할 형태들에서, 수거된 H5 단백질의 각각의 로트(lot)는 앵커리지(anchorage) 의존성인, 배큘로바이러스 민감성 곤충 세포들, 예를 들면, Sf9 세포들 내에서 계대배양(passage)함으로써 불활성화에 대해 시험될 것이다. 이러한 시험의 바람직한 형태에서, 150cm2의 적절한 세포 배양 단층에 1.0mL의 불활성화된 H5 유액들을 접종하고, 25 내지 29℃에서 14일 동안 2회 이상의 계대배양을 유지시킨다. 유지 기간의 말기에, 세포 단층들을 H5 배큘로바이러스의 대표적인 세포병원성 효과(CPE)에 대해 실험한다. 바람직하게, 양성 바이러스 대조군들도 사용한다. 이러한 대조군들은 비-불활성화된 참조 H5 배큘로바이러스가 접종된 Sf9 세포들의 1개 배양물 및 접종되지 않은 상태로 유지된 Sf9 세포들의 1개 플라스크로 이루어질 수 있다. 접종 및 계대배양 후, BEI 처리된 바이러스 유액들 중의 바이러스-감염된 세포들의 부재는, 만족스러운 불활성화 시험을 구성할 수 있다. 참조 바이러스가 접종된 대조군 세포들은 H5 배큘로바이러스의 대표적인 CPE를 나타내어야만 하고, 접종되지 않은 플라스크는 H5 배큘로바이러스 CPE의 어떠한 증거도 나타내지 않아야 한다. 대안으로, 유지 기간의 말기에, 상청액 샘플들을 수집하여, Sf9 세포들이 부하된 후 25 내지 29℃에서 5 내지 6일 동안 유지시킨, Sf9 96웰 플레이트 상에 접종할 수 있다. 이어서, 플레이트를 고정시키고, FITC에 접합된 항-H5 항체 또는 배큘로바이러스 특이적 단백질들(즉, gp64)에 대해 지시된 임의의 표지된 항체를 이용하여 염색(staining)한다. BEI 처리된 바이러스 유액들 중의 CPE의 부재, H5 발현 또는 배큘로바이러스 특이적 단백질들(즉, gp64)의 발현은 만족스러운 불활성화 시험을 구성한다. 참조 바이러스가 접종된 대조군 세포들은 CPE 및 IFA 활성을 나타내어야 하고, 접종되지 않은 플라스크는 H5 배큘로바이러스 CPE의 어떠한 증거도 나타내지 않아야 하며, IFA 활성을 함유하지 않아야 한다.
따라서, 본원에 기술된 추가의 양상은, i) 재조합체 바이러스 벡터를 함유하는 배양 유액의 적어도 일부를 바람직하게는 상기 기술된 바와 같은 불활성화 제제와 접촉시키는 단계, ii ) 중화제를 첨가하여 바람직하게는 상기 기술된 바와 같은 불활성화 제제를 중화시키는 단계, 및 iii ) 상기 기술된 바와 같은 검정들에 의해 잔류 감염성을 측정하는 단계를 포함하는, H5 단백질 (1)을 발현하는 재조합체 바이러스 벡터의 불활성화의 유효성을 측정하기 위한 불활성화 시험에 관한 것이다.
불활성화 후, 샘플 중의 재조합체 H5 단백질의 상대적인 양은 다수의 방법들로 측정할 수 있다. 바람직한 정량화 방법들로는 SDS-PAGE 농도계, ELISA, 및 임상 결과(혈청학 등)들을 갖는 공지된 양의 백신과 상호관련된 동물 백신접종 연구들이 포함된다. SDS-PAGE를 정량화에 이용하는 경우, 공지되지 않은 양의 재조합체 H5 단백질을 함유하는 샘플 물질을 상이한 공지된 양들의 재조합체 H5 단백질을 함유하는 샘플들과 함께 겔 상에 이동시킨다. 이어서, 공지된 샘플들을 기준으로 표준 곡선을 생성할 수 있고, 공지되지 않은 샘플들 중 재조합체 H5의 양을 표준 곡선과 비교하여 측정할 수 있다. ELISA들은 일반적으로 항원 정량화를 위한 산업 표준으로서 인식되므로, 이들이 정량화에 바람직하다.
H5 단백질들(1) 또는 이들을 암호화하는 핵산 분자들 또는 벡터들을 포함하는 백신들
추가로, 본 발명은,
상이한 계통군의 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 특히, 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하는 임의의 방법에서 사용하기 위한,
(a) 본원에 기술된 H5 단백질 (1),
및
(b) 불활성화된 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스
의 조합물을 제공한다.
또한, 상기 조합물은 이후에 "본원에 기술된 조합물"로 명명된다.
본 발명에 따르면, 본원에 기술된 조합물은 바람직하게는 다가의 조합 백신 중에 포함되거나, 본원에 기술된 조합물은, 특히, 조합된 백신접종, 보다 구체적으로, 본원에 기술된 H5 단백질의 투여, 및 동물, 특히, 가금류, 또는 치료를 필요로 하는 사람에게 최대 24시간 내에 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스의 투여에 관한 것임이 이해된다.
바람직하게는, 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스는, 불활성화된 전체 뉴캐슬병 비리온(virion)이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스는, 불활성화된, 서열번호 51에 나타낸 폴리뉴클레오타이드의 RNA 카피[라소타 균주 바이러스(LaSota strain virus)의 cDNA 서열]와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 또는 특히 100%의 서열 유사성을 갖는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스의 불활성화에 의해 수득된 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스이다.
특히, 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스는, 불활성화된 뉴캐슬병 라소타 균주 바이러스이다.
한 바람직한 실시형태에서, 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스는, 포름알데하이드, 이원 에틸렌이민(BEI), 베타-프로피오-락톤(BPL), 및 이들의 조합물들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 시약으로 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스이다.
본원에 기술된 조합물 중의 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스의 양은 바람직하게는 102 내지 1010 등량의 달걀 감염 용량(EID50), 바람직하게는 106 내지 109 EID50, 특히 바람직하게는 107 내지 109 EID50이다. 본원에 기술된 조합물 중의 H5 단백질 (1)의 양은 바람직하게는 본원에서 이후에 언급한 바와 동일하다.
본 발명에 따른 H5 단백질 (1)의 양은 바람직하게는 용량당 10 내지 1000의 헤마글루틴화 단위들(HAU's), 보다 바람직하게는 용량당 50 내지 950 HAU's, 더욱 바람직하게는 용량당 100 내지 900 HAU's, 보다 더 바람직하게는 용량당 200 내지 800 HAU's, 더욱 더 바람직하게는 용량당 300 내지 700, 훨씬 더 바람직하게는 용량당 300 내지 500 HAU's이다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은, 일반적으로,
i. 본원에 기술된 바와 같은 H5 단백질들 (1) 또는 본원에 기술된 조합물 중 하나 이상;
ii. 임의의 이러한 H5 단백질들(1)을 암호화하는, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자들 중 하나 이상; 및/또는
iii. 임의의 이러한 핵산 분자들 중 어느 하나를 포함하고 본원에 기술된 바와 같은 임의의 이러한 H5 단백질들 (1)을 암호화하는, 본원에 기술된 바와 같은 벡터들 중 하나 이상; 및
iv. 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제
를 포함하는, 백신들 또는 약제학적 조성물들에 관한 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 용어 "약제학적 조성물" "약제/백신 조성물"은 감염의 감소 또는 예방을 위한 백신들 또는 감염의 치료 또는 경감을 위한 물질의 조성물을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
인플루엔자 헤마글루티닌을 암호화하는, 핵산계 백신들, 바람직하게는 cDNA 백신들의 제조는, 예를 들면, 문헌[참조: Deck et al , Vaccine 1997; 15(1): 71-78; Ulmer et al ., Science 1993; 259: 1745-1749; Ulmer et al ., Vaccine 1994; 12(16): 1541-1544]에 기술되어 있다. 이들 방법들 중 어느 하나는 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 H5 단백질을 암호화하는, 핵산계 백신들, 바람직하게는 cDNA 백신들의 생산에 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 H5 단백질 (1) 또는 이의 부분들을 포함하는 백신은, 종래의 시도들에 의해, 예를 들면, 재조합체 발현 기술들에 의해 또는 생화학적 정제 및 분리 기술들에 의해 생산할 수 있다.
곤충 세포들에서의 발현을 포함하는 재조합체 발현 기술들은, 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor , N. Y.; DNA Cloning: A Practical Approach , Volumes I and II (D. N. Glover ed . 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed . 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds . (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins , eds . (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney , ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [ IRL Press , (1986)]; B. Perbal , A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al . ( eds .), Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons , Inc . 1994)]에 기술되어 있다. 잘 확립된 재조합체 발현 시스템들의 추가의 예들로는, 이. 콜라이(E. coli) 또는 비. 서브틸리스(B. subtilis)와 같은 세균 발현 시스템들, 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 또는 에스. 폼베(S. pombe)와 같은 효모-계 발현 시스템들, 또는 BHK-, CHO- 및/또는 NSO-계 발현 시스템들과 같은 포유동물 세포 발현 시스템들이 있다. 이러한 시스템들은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 일반적으로, 예를 들면, 클론테크 래보러토리즈, 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc., 미국 94303-4607 캘리포니아주 팔로 알토, 파비안 웨이 4030 소재)를 통해 상업적으로 이용가능하다. 추가의 발현 전략들은, 예를 들면, 문헌[참조: Lueschow et al., Vaccine no . 19 (2001), pp . 4249-4259, or Veit et al ., PNAS vol . 103 (2006), pp . 8197-8202]에 기술되어 있다. 또한, 재조합체 아데노-관련 바이러스 시스템들은 잘 확립되어 있으며, 예를 들면, US 제5,436,146호 또는 제WO200203872호에 추가의 참조문헌들과 함께 기술되어 있다. 또한, 예를 들면, US 제6,265,183호 및 추가의 참조문헌들에 기술된 바와 같은 백시니아(폭스)바이러스계 발현 시스템들은 잘 확립되어 있으며, 본 발명에 따라 사용된 바와 같은 재조합체 항원(들), 항원성 조성물(들)을 생산하는데 적합하다. 추가로, 적합한 발현 시스템들은 SV40과 같은 재조합체 포포바 바이러스(popova virus)들, 포울 폭스 바이러스(fowl pox virus), 슈도라비스 바이러스(pseudorabies viruse)들 및 레트로바이러스들을 사용하도록 한다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 관련된 약제/백신 조성물들은 본원에 기술된 바와 같은 H5 단백질 (1)을 포함하는 불활성화된 바이러스, 본원에 기술된 바와 같은 H5 단백질 (1)을 포함하는 생 바이러스의 비병원성 버젼, 바이러스의 제제 및/또는 단편들(여기서, 당해 제제 및/또는 단편은 본원에 기술된 바와 같은 H5 단백질 (1)을 포함한다)을 포함할 수 있다.
숙련가들은 항원과 함께 상기 조성물들/백신들에 포함될 수 있는 추가의 구성성분들을 알고 있다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences . (1990). 18 th ed . Mack Publ ., Easton]. 숙련가는, 공지의 주사가능한, 생리학적으로 허용되는 멸균 용액들을 사용할 수 있다. 즉시 사용가능한(ready-to-use) 용액을 제조하기 위하여, 예를 들면, 염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액들과 같은 등장성 수용액들이 용이하게 이용가능하다. 약제학적 조성물/백신은, 예를 들면, 부품들의 키트(kit)와 같이, 멸균 조건 하에서 사용 직전에 공지된 주사가능한 용액으로 재구성될 수 있는, 동결건조물들 또는 무수 제제들로서 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제/백신 조성물들은, 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체들을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "수의학적으로 허용되는 담체"는, 임의의 및 모든 용매들, 분산 매질들, 피복물들, 항원보강제들, 멸균제들, 희석제들, 방부제들, 항세균제들 및 항진균제들, 등장성 제제들, 흡수 지연제들 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
희석제들은 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장성 제제들은 그 중에서도 염화 나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨, 및 락토즈를 포함할 수 있다. 안정화제들은 그 중에서도 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리염들을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 방부제는, 예를 들면, 젠타마이신, 메르티올레이트 등과 같은 항-미생물적 활성 제제를 말한다. 특히, 방부제의 첨가가 다중-용량 조성물의 제조를 위해 가장 바람직하다. 이들 항-미생물적 활성 제제들은, 임의의 미생물적 오염에 대해 목적한 조성물을 예방하거나 목적한 조성물 내에서의 임의의 미생물 성장의 억제를 위해 효과적인 농도들로 첨가된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항원보강제들"은 수산화 알루미늄 및 인산 알루미늄, 사포닌들, 예를 들면, Quil A, QS-21[제조원: 매사츄세츠주 캠브릿지 소재의 캠브릿지 바이오테크 인코포레이션(Cambridge Biotech Inc.)], GPI-0100[제조원: 앨라바마주 버밍햄 소재의 갈레니카 파마슈티칼즈, 인코포레이티드(Galenica Pharmaceuticals, Inc.), 유-중-수(water-in-oil) 유액, 수-중-유(oil-in-water) 유액, 수-중-유-중-수(water-in-oil-in-water) 유액을 포함할 수 있다.
유액은, 특히, 액체 파라핀 경유(유럽 약전 유형); 이소프레노이드 오일, 예를 들면, 스쿠알란 또는 스쿠알렌; 알켄들, 특히, 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 생성된 오일; 직쇄 알킬 그룹, 보다 구체적으로는 식물성 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트를 함유하는, 산 또는 알코올의 에스테르들; 분지쇄(branched) 지방산들 또는 알코올들, 특히, 이소스테아르산 에스테르들을 기본으로 할 수 있다. 오일은 유화제들과 함께 사용되어 유액이 형성된다. 유화제들은, 바람직하게는 비이온성 계면활성제들, 특히, 소르비탄의, 만나이드(예를 들면, 무수 만니톨 올레에이트)의, 글리콜의, 폴리글리세롤의, 프로필렌 글리콜의 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르들이며, 이들은 임의로 에톡실화되고, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록들, 특히 플루로닉 제품(Pluronic product)들, 특히 L121이다. 문헌[참조: Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) 및 Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다. 적합한 수-중-유 유액들에 대한 예들로는 EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75®(제조원: 미국 네바다주 오마하 소재의 엠브리피 래보러토리즈, 인코포레이티드)와 같은 에멀시겐(Emulsigen)-계 항원보강제들이 있다. H5 단백질, 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 재조합체 H5 단백질을 포함하는 약제/백신 조성물들은, 이러한 에멀시겐-계 항원보강제들, 보다 바람직하게는 EMULSIGEN® 및 EMULSIGEN-D®와의 수-중-유 유액들과 함께 효과적으로 항원보강화되어 왔다.
더욱이, 문헌[참조: "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995)의 제147면에 기술된 SPT 유액, 및 동일한 서적의 제183면에 기술된 유액 MF59를 사용하는 것이 가능하다.
항원보강제의 추가의 예로는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체들, 및 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체들로부터 선택된 화합물이 있다. 유리한 항원보강제 화합물들은, 특히, 당들 또는 다가알코올들의 폴리알케닐 에테르들과 가교-결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체들이다. 이들 화합물들은 용어 카보머(참조: Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)로 공지되어 있다. 당해 분야의 숙련가들은, 하이드록실 그룹들이 적어도 3개, 바람직하게는 8개 미만이고, 적어도 3개의 하이드록실들 중 수소 원자들이, 탄소 원자들이 적어도 2개인 불포화 지방족 라디칼들로 치환된, 폴리하이드록실화된 화합물과 가교-결합된 이러한 아크릴성 중합체들을 기술하는 미국 특허 제2,909,462호를 언급할 수 있다. 바람직한 라디칼들은, 탄소수가 2 내지 4인 것들, 예를 들면, 비닐들, 알릴들 및 다른 에틸렌계 불포화 그룹들이다. 불포화된 라디칼들은 자체로 메틸과 같은 다른 치환체들을 함유할 수 있다. 명칭 카보폴(Carbopol) 하에 시판된 생성물들[제조원: 미국 오하이오주 소재의 비에프 굿리치(BF Goodrich)]이 특히 적절하다. 이들은 알릴 슈크로즈 또는 알릴 펜타에리트리톨과 함께 가교-결합된다. 이들 중에서, 카보폴 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. 카보폴 971P를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체들 중에서, 공중합체들 EMA(몬산토)는 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체들이다. 수중에서 이들 중합체들의 용해는 바람직하게는 생리학적 pH로 중화되어 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체가 혼입될 항원보강제 용액을 제공하기 위한 산 용액을 생성한다.
추가로, 적합한 항원보강제들은 그 중에서도 RIBI 항원보강제 시스템[제조원: 리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)], 블록 공중합체(제조원: 조지아주 애틀란타 소재의 CytRx), SAF-M[제조원: 캘리포니아주 에머리빌 소재의 키론(Chiron)], 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 항원보강제, 이. 콜라이로부터의 열에 불안정한 엔테로톡신(재조합체 또는 기타), 콜레라 독소, 또는 뮤라밀 디펩타이드를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 항원보강제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게는 항원보강제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로 첨가된다. 더욱 더 바람직하게는 항원보강제는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg의 양으로 첨가된다. 훨씬 더 바람직하게는 항원보강제는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게는 항원보강제는 용량당 약 1mg의 양으로 첨가된다.
또한, 약제/백신 조성물들은, 예를 들면, 인터류킨들, 인터페론들, 또는 다른 사이토카인들과 같은 하나 이상의 다른 면역조절제들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 약제/백신 조성물들은 젠타마이신 및 메르티올레이트도 포함할 수 있다. 본 발명의 내용에서 유용한 항원보강제들 및 첨가제들의 양들 및 농도들은 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 측정될 수 있지만, 본 발명은 약 50㎍ 내지 약 2000㎍의 항원보강제 및 바람직하게는 약 250㎍/1ml 용량의 백신 조성물을 포함하는 조성물들을 고려한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 약 1㎍/ml 내지 약 60㎍/ml의 항생제들, 및 보다 바람직하게는 약 30㎍/ml 미만의 항생제들을 포함하는 백신 조성물들을 고려한다.
따라서, 추가의 실시형태에 따라서, 본 발명은, 또한,
i. 본원에 기술된 바와 같은 인플루엔자 바이러스의 H5 단백질들 중 어느 하나의 치료학적 유효량(여기서, H5 단백질은 아미노산 223N 및 변형 328K+를 가지고, 여기서, H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 예시적으로 제공된 바와 같은 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는, H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미한다); 및
ii. 상기 기술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 항원보강제들
을 포함하는 약제/백신 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 항원보강제는,
a) 수-중-유 유액(o/w)인 에멀시겐(EMULSIGEN)®;
b) 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)와의 수-중-유(o/w)인 에멀시겐-D®;
c) 공중합체인 폴리젠(Polygen);
d) 등록된 면역자극제와의 수중유(o/w)인 EMULSIGEN-P®;
e) 가교-결합된 중합체인 카르비겐(Carbigen);
f) 가교-결합된 중합체와의 수-중-유(o/w)를 포함하는 이중 항원보강제들인 에멀시겐-75®;
g) 유-중-수(w/o)인 ISA 70
으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 항원보강제들은 에멀시겐®, 에멀시겐-D®, 에멀시겐-P®, 에멀시겐-75®, 에멀시겐® 및 에멀시겐-P®로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에멀시겐-계 항원보강제와 같은 수-중-유 유액이다. 가장 바람직하게는, 에멀시겐® 및 에멀시겐-P®가 본 발명의 제형에 사용된다.
추가의 양상에 따르면, 본원에 제공되는 약제/백신 조성물들은 하나 이상의 항원을 포함한다. 바람직하게는, 추가의 항원은 가금류 또는 포유동물 병원체의 항원이다. 추가의 실시형태들에 따르면, 추가의 항원은 헤마글루티닌 H5, H7, H9, 또는 인플루엔자 바이러스의 임의의 다른 헤마글루티닌과 같은 추가의 인플루엔자 항원이며, 여기서, H5는 바람직하게는 계통군 1 이외에 상이한 계통군의 H5N1 바이러스의 H5 단백질, 특히, 본원에 기술된 H5 단백질 (2)와 같은, 북아프리카 기원의 H5N1 바이러스의 H5 단백질이다. 추가의 항원(들)은, 정제된 형태로, 항원 제제의 부분으로서, 사멸된 미생물의 형태로, 또는 변형된 생 미생물의 형태로 첨가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원"은, 당해 항원이 투여된 숙주 내에서 당해 항원에 대해 지시된 면역 반응을 유발하거나, 활성화시키거나 자극시키기 위한 면역글로불린(항체) 또는 T 세포 항원 수용체와 같은, 면역계의 항원 인식 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 펩타이드들, 폴리펩타이드들, 당펩타이드들, 또는 다당류들을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 용어 "항원"은 또한 핵산 분자들, 바람직하게는 DNA- 또는 RNA-분자들을 말하며, 이들 각각은, 핵산 분자에 의해 암호화된 항원에 대해 면역 반응을 유발하거나, 활성화시키거나 자극시키기 위한 면역글로불린(항체) 또는 T 세포 항원 수용체와 같은, 면역 시스템의 항원 인식 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 당펩타이드를 암호화하여 이를 발현한다. 본 발명에 따라 사용된 약제학적 조성물의 제조를 위해 사용된 항원은 미생물 또는 당해 미생물의 항원 부분 및/또는 제제이다. 이와 관련하여, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "면역화"는 면역 반응의 임의의 야기 또는 향상을 의미하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 용어 "면역 반응"은 상기에 이미 기술되어 있다.
인플루엔자 백신들에 대한 투여 전략들은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 불활성화되고 약독화된 바이러스 백신들에 대한 점막 백신접종 전략들이 고려된다. 점막은 백신의 국소 전달에 의해 표적화될 수 있지만, 면역원성 단백질들을 점막에 전달하기 위해 다양한 전략들을 사용하여 왔다.
구체적인 실시형태에서, 백신은 콜레라 독소 B 또는 콜레라 독소 A/B 키메라와 같은 콜레라 독소와의 혼합물, 또는 접합체, 또는 키메라 융합 단백질로 투여될 수 있다(참조: Hajishengallis , J Immunol ., 154:4322-32, 1995; Jobling and Holmes, Infect Immun ., 60:4915-24, 1992). 콜레라 독소 B 아단위의 사용에 근거한 점막 백신들은 기술되어 있다(참조: Lebens and Holmgren , Dev Biol Stand 82:215-27, 1994). 다른 실시형태에서, 열 불안정성 장독소(LT)와의 혼합물이 점막 백신접종을 위해 제조될 수 있다.
다른 점막 면역화 전략들은 미세캡슐들 내에 바이러스를 봉입(encapsulating)하는 것(참조: US 제5,075,109호, US 제5,820,883호, 및 US 제5,853,763호) 및 면역강화막성 담체를 사용하는 것(참조: WO 98/0558)을 포함한다. 경구 투여된 면역원들의 면역원성은 적혈구 세포들(rbc) 또는 rbc 고스트(ghost)들(참조: US 제5,643,577호), 또는 청설병 항원(blue tongue antigen)(참조: US 제5,690,938호)을 사용하여 향상시킬 수 있다.
다른 양상에 따르면, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 약제/백신 조성물을 제조하는 방법, 바람직하게는 상기 기술된 바와 같은 재조합체, 배큘로바이러스 발현된 H5 단백질을 포함하는 백신을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 당해 방법은 바이러스 내로 작제물을 형질감염시키는 단계들을 포함하며, 여기서, 작제물은, i) 본원에 기술된 바와 같은 재조합체 H5 cDNA를 포함하고, ii ) 형질감염된 바이러스를 사용하여 성장 배지 속에서 세포들을 감염시키는 단계, iii ) 바이러스가, 본원에 기술된 바와 같은 재조합체 H5 단백질을 발현하도록 하는 단계; iv ) 배양물로부터, 발현된 H5 단백질을 회수하는 단계; 및 v) 발현된 H5 단백질을 적합한 항원보강제 및/또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체와 배합함으로써 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
바람직한 항원보강제들은 상기 기술된 것들이다. 따라서, 추가의 양상에 따르면, 예를 들면, 인플루엔자 감염들에 대해 면역 반응을 유발하기 위한 백신과 같은, 항원성 조성물을 제조하는 방법은, i) H5 단백질을 제조하여 회수하는 단계, 및 ii ) 이를 적합한 항원보강제들과 혼합하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 또한 희석제들, 등장성 제제들, 안정화제들, 및/또는 방부제들을 포함할 수 있다. 희석제들은 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장성 제제들은 무기 또는 유기 염들, 예를 들면, 그 중에서도 염화 나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨, 및 락토즈, 사카라이드들, 트레할로즈, 만니톨, 사카로즈를 포함할 수 있다. 안정화제들은 그 중세어도 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염들을 포함한다. 적합한 항원보강제들은 상기 기술된 것들이다.
본원에 기술된 이러한 H5 단백질들(1), 핵산 분자들, 벡터들, 백신들 및 조 합물들 중의 어느 하나의 의학적 용도
본원에 제공되는 바와 같은 H5 단백질들(1)은, 임의의 이러한 H5 단백질들 (1)을 암호화하는 핵산 분자들, 본원에 기술된 임의의 이러한 H5 단백질들 (1)을 암호화하는 임의의 이러한 핵산 분자들을 포함하는 벡터들, 및 본원에 기술된 이러한 H5 단백질 (1), 핵산 분자 또는 벡터 또는 조합물 중 어느 하나를 포함하는 임의의 약제/백신 조성물도, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스, 가장 바람직하게는 인플루엔자 A형 바이러스에 의해 야기된, 감염들의 치료 및 예방을 위한, 의약으로서 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 H5 단백질들 (1), 임의의 이러한 H5 단백질들을 암호화하는 핵산 분자들, 본원에 기술된 임의의 이러한 H5 단백질들 (1)을 암호화하는 임의의 이러한 핵산 분자들을 포함하는 벡터들, 및 본원에 기술된 이러한 H5 단백질 (1), 핵산 분자 또는 벡터 중 어느 하나를 포함하는 임의의 약제/백신 조성물도, 사람의 치료 또는 예방을 위한 의약 및 수의 의약(veterinary medicine)으로서 사용될 수 있다. 수의 의약으로 사용된 경우, 가금류, 바람직하게는 새, 닭, 오리, 칠면조 등 및 포유동물, 바람직하게는 돼지들, 소들, 말들, 물개들, 낙타들, 개들, 고양이들, 햄스터들, 마우스들 등의 치료가 바람직하다.
본 발명의 관점에서, "예방"은 이러한 임상적 징후들의 완전한 예방을 포함하는 정도까지의 인플루엔자 감염의 임상적 징후들의 발생률 또는 중증도에 있어서의 감소를 말한다. 바람직하게는, 발생률 또는 중증도에 있어서의 감소는 본 발명의 조성물들을 투여받지 않았으나 임상적 징후들을 나타내는 인플루엔자 감염을 일반적으로 초래할 수 있는 인플루엔자 바이러스의 감염 수준들에 노출된 동물 또는 동물들의 그룹과 비교하여 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 더 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 더욱 더 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 60% 이상, 훨씬 보다 더 바람직하게는 70% 이상, 훨씬 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 그보다 더 바람직하게는 90% 이상, 그보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 100%이다.
따라서, 다른 양상에 따르면, 본 발명은, 본원에 제공된 바와 같은 H5 단백질들 (1), 임의의 이러한 H5 단백질들(1)을 암호화하는 핵산 분자들, 본원에 기술된 것으로서 임의의 이러한 H5 단백질들(1)을 암호화하는 임의의 이러한 핵산 분자들을 포함하는 벡터들 및 본원에 기술된 이러한 H5 단백질 (1), 핵산 분자 또는 벡터 또는 본원에 기술된 조합물 중 어느 하나를 포함하는 임의의 약제/백신 조성물들을 사람용 의약 및/또는 바람직하게는 가금류, 특히, 닭용 수의 의약으로 사용할 수 있다.
또한, 본원에서 제공된 바와 같은 H5 단백질들 (1)은 임의의 이러한 H5 단백질들 (1)을 암호화하는 핵산 분자들, 본원에 기술된 바와 같은, 임의의 이러한 H5 단백질 (1)을 암호화하는 임의의 이러한 핵산 분자들을 포함하는 벡터들, 또는 본원에 기술된 조합물을 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 바람직하게는 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 야기된 감염들의 예방 또는 치료용의 단일 샷 백신(single-shot vaccine) 또는 1회 용량 백신의 제조를 위해 사용할 수 있으며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이다. 위에 언급된 바와 같이, 이들 약제학적 조성물들/백신 조성물들은 사람의 치료 및/또는 예방용 및 가금류, 바람직하게는 새, 닭, 오리, 칠면조 등과 같은 동물들 및 포유동물들, 바람직하게는 돼지들, 소들, 말들, 물개들, 낙타들, 개들, 고양이들, 햄스터들, 마우스들 등의 치료 및/또는 예방용으로 사용될 수 있다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은 또한 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염들의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이고, 여기서, 당해 방법은, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방이 요구되는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 H5 단백질 (1)을 치료학적 유효량으로 투여함을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염들의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이고, 여기서, 당해 방법은 치료학적 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 임의의 H5 핵산 분자 또는 벡터를 인플루엔자 바이러스 감염들의 치료 또는 예방이 요구되는 대상체에게 투여함을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염들의 치료 또는 예방용 방법에 관한 것이며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이고, 여기서, 당해 방법은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 이러한 H5 단백질 (1), 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 치료학적 유효량의 백신을 인플루엔자 바이러스 감염들의 치료 또는 예방이 요구되는 대상체에게 투여함을 포함한다. 인플루엔자 바이러스 감염들의 치료 또는 예방이 요구되는 대상체는 사람 및 동물, 바람직하게는 가금류, 심지어 보다 바람직하게는 새, 닭, 오리, 칠면조 또는 포유동물, 바람직하게는 돼지, 소, 말, 물개, 낙타, 개, 고양이, 햄스터, 마우스 등일 수 있다.
바람직하게는, 본원에 기술된 바와 같은 투여는 단일-샷 투여 또는 1회 용량 투여이다.
바람직하게는, 닭에 백신접종하는 경우, 본원에 기술된 바와 같은 H5 단백질은 1일령 또는 이후, 예를 들면, 10일령, 또는 1일 내지 10일령, 또는 10일령 또는 이후에 백신접종에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 임의의 H5 단백질 (1), 임의의 이러한 H5 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 약제/백신 조성물들도 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 야기되며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스, 및 경우에 따라 또한 다른 조류, 백조 또는 사람 인플루엔자 바이러스와 함께 또는 이들의 임의의 조합물 또는 하이브리드(hybrid)일 수 있다.
본 발명의 추가의 이점은, 이것이 백신접종된 사람 또는 동물들과 H5N1 바이러스로 감염된 사람 및 동물들 사이를 차별화하기 위한 특이적인 엘리자 키트(Elisa Kit)들의 개념에서 "DIVA"(감염된 및 백신접종된 동물들의 차별화)에 유리하다는 것이다.
다른 양상에 따르면, 본 발명은 i) 본원에 기술된 바와 같은 이러한 H5 단백질 (1), 임의의 이러한 H5 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터, 또는 본원에 기술된 바와 같은 이러한 H5 단백질, 핵산 분자 또는 벡터 중 어느 하나를 포함하는 임의의 약제/백신 조성물 중의 어느 하나, 및 ii ) 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 야기된 감염들의 치료 또는 예방용의 이러한 H5 단백질, 핵산 분자, 벡터 또는 백신의 용도를 나타내는 패키지 리플렛(package leaflet)을 포함하는 부품들의 키트에 관한 것이며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이다. 닭이 백신접종된 경우, 본원에 기술된 H5 단백질 (1)은 1일령 또는 이후에 백신접종에 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 언급된 바와 같은 부품들의 키트는 이러한 용도를 위한 것이거나, 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 야기된 감염들의 치료 또는 예방용으로 사용되며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이다.
추가의 실시형태에 따라서, 부품들내 키트는 가금류 또는 포유동물 병원체의 적어도 하나의 추가의 항원 및 추가의 항원, 특히 위에서 언급한 바와 같은 추가의 항원의 의약적, 사람 또는 가축 용도의 정보 지침을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 H5 단백질 (1) 또는 본원에 기술된 조합물을 계통분리 1 이외의 계통분리의 H5N1 바이러스에 의해 감염되거나 상기 바이러스에 의한 바이러스 감염 위험이 있는 대상체에게 투여함을 포함하여, 바이러스 쉐딩(viral shedding)을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이다.
본 발명은 또한 대상체에서 바이러스 쉐딩을 감소시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 H5 단백질 (1) 또는 본원에 기술된 바와 같은 조합물에 관한 것이며, 여기서, 상기 H5 단백질 (1) 또는 상기 조합물은 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스에 의해 감염되거나 상기 바이러스에 의한 바이러스 감염 위험이 있는 대상체에게 투여되어야 하며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 상기 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 계통군의 H5N1 바이러스이다.
또한, 본 발명은 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스로 감염되거나 상기 바이러스에 의한 바이러스 감염 위험이 있는 대상체에서 바이러스 쉐딩을 감소시키기 위한 의약 제조용의 본원에 기술된 H5 단백질 (1) 또는 본원에 기술된 바와 같은 조합물의 용도를 제공하며, 여기서, 계통군 1 이외의 계통군의 H5N1 바이러스는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 게통분기의 H5N1 바이러스이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 H5 단백질 (1), 본원에 기술된 조합물, 본원에 기술된 바와 같은 백신 또는 본원에 언급된 키트는 단일-샷 백신 또는 1회-용량 백신접종으로 사용하기 위한 것이다.
실시예들
다음 실시예들은 본 발명에 따른 바람직한 물질들 및 과정들을 설정한다. 그러나, 이들 실시예들은 단지 예시로서 제공되며, 실시예 내의 어느 것도 본 발명의 전체 영역을 제한하는 것으로 의도되지 않아야 한다.
실시예 1
HA H5 항원들을 암호화하고 발현하는 재조합체 배큘로바이러스들의 작제
H5 HA 항원을 함유하는 재조합체 배큘로바이러스를 다음과 같이 생성하였다: H5 HA(서열 3)의 암호화 서열들을 화학적으로 합성하고 전달 벡터 pVL1392[제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 비디 바이오사이언시즈 파밍겐(BD Biosciences Pharmingen)]내로 서브클로닝하였다. H5 HA MutK+(서열번호 5)를 올리고뉴클레오타이드 프라이머들 및 QuikChange® 부위-지시된 돌연변이유발 키트[제조원: 캘리포니아주 라 홀라 소재의 스트라타젠(Stratagene)]를 사용하여 생성시키고 전달 벡터 pVL1392(제조원: 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 비디 바이오사이언시즈)내로 서브클로닝하였다. H5 HA 항원(서열번호 3) 및 H5 HA MutK+(서열번호 5)를 암호화하는 유전자들을 함유하는 pVL1392 플라스미드들을 이후에 DiamondBac®[제조원: 시그마(Sigma)] 배큘로바이러스 DNA와 함께 Sf9 곤충 세포들(제조원: 비디 바이오사이언시즈 파밍겐) 내로 공동-형질감염시켜 서열번호 3을 암호화하는 유전자들 H5 HA 및 서열번호 5를 암호화하는 H5 HA mutK+를 함유하는 재조합체 배큘로바이러스를 생성하였다. H5 HA(서열번호 3) 및 H5 HA MutK+(서열번호 5)를 암호화하는 유전자들을 함유하는 재조합체 배큘로바이러스들을 플라크-정제(plaque-purifying)하고 마스터 식종 바이러스들(Master Seed Viruses: MSV)을 SF+ 세포주에서 증식시키고, 분취하여, -70℃에 저장하였다. 상기 기술한 바와 같은 H5 HA 배큘로바이러스들로 감염시켜 MSV 또는 작업 식종 바이러스들(Working Seed Viruses)을 생성하는 곤충 세포들은 간접적인 형광성 항체 검정 또는 웨스턴 블롯(Western blot)에서 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체들에 의해 검출되는 바와 같은 H5 HA 항원(서열번호 3) 및 H5 HA MutK+(서열번호 5)를 발현한다.
적절한 양들의 재조합체 배큘로바이러스들(각각 H5 HA 및 H5 HA MutK+)로 식종(seeding)한 후, SF+ 세포들[제조원: 코네티컷주 메리덴 소재의 프로테인 사이언시즈 인코포레이티드(Protein Sciences, Inc.)]을 함유하는 스피너 플라스크들을 27 ± 2℃에서 7일 동안 항온배양하고 100rpm에서 이 시간 동안 교반하였다. 당해 플라스크들은 환기된 뚜껑들을 사용하여 공기 흐름을 허용하였다. 배큘로바이러스 감염된 SF+ 세포들을 함유하는 조(crude) 전체 세포 배양물 및 각각의 배양물의 세포 배양 상청액들을 수거하였다.
실시예 2
HA H5 항원들을 포함하는 약제학적 조성물들(백신들)의 제조
배큘로바이러스-기반 발현 시스템에 의해 곤충 세포들에서 발현된 조 전체 세포 H5 HA 단백질 및 H5 HA Mutk+ 단백질을 수거하였다. 배큘로바이러스들을 5mM의 폐환된 이원 에틸렌이민(BEI)(최종 농도)의 존재 하에 약 32 내지 39℃에서 72 내지 96시간 동안 불활성화시켰다. 불활성화를 완료한 후, 0.3M의 티오황산 나트륨 용액을 5mM의 최종 농도로 첨가하여 임의의 잔류 BEI를 중화시켰다. 중화 후, 각종 항원보강제들을 첨가하고, 이어서, 백신/약제학적 조성물들이 생성되었다.
Figure 112014024531059-pct00004
Figure 112014024531059-pct00005
Figure 112014024531059-pct00006
Figure 112014024531059-pct00007
실시예 3
조류 인플루엔자에 대한 닭의 백신접종
"BACULO AI + N D KV"로 명명된 H5 HA Mutk+(분획 1) 및 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스(분획 2)를 포함하는 조합 백신을 동물 시험들에서 평가하였다. 백신을 MutK+ 작제물을 기준으로 하는 배큘로바이러스 발현 시스템에서 생산된 헤마글루티닌 H5(실시예 1 및 실시예 2)와 함께 제형화하였다. 뉴캐슬병(ND) 바이러스 분획의 기원은 전체 바이러스이다.
분획 1 :
조류 인플루엔자 H5N1 바이러스로부터의 재조합체, 배큘로바이러스-발현된 H5 헤마글루티닌(H5 HA). 조류 인플루엔자( AI ) 분획.
AI 분획을 이원 에틸렌이민(BEI)으로 불활성화시킨다. 배큘로바이러스 벡터로부터 유래하는 잔류 감염성은 허용되지 않는다.
분획 2 :
전체 비리온, 뉴캐슬병 바이러스(ND), 라소타 균주(LaSota Strain). 뉴캐슬병 분획.
ND 분획을 포름알데하이드, BEI 또는 베타-프로피오-락톤(BPL)으로 불활성화시킨다. ND 바이러스로부터 유래하는 잔류 감염성은 허용되지 않는다.
제형 조성물:
H5 HA 단백질 및 ND로부터의 불활성화되고 수거된 물질을 물/오일 유액으로 배합한다. 당해 혼합물은 항원보강제로서 무기 오일(mineral oil)을 포함한다.
백신 효능의 평가를 위해, 3개의 임상 매개변수들을 고려하였다: 1) 이환율/사망율. 2) 항체들 수준들. 3) 바이러스 쉐딩.
모든 연구들에서 SPF 닭들을 백신접종하고, 당해 백신의 투여는 피하 경로로 목의 뒤쪽에서 수행하였다. 달리 기술하지 않는 한 0.5ml의 용량을 투여하였다.
닭들을 연구들의 전체 기간 동안 분리기 장치들 내에서 유지시켰다. 연구들은 조류 인플루엔자 백신들의 평가를 위한 OIE 국제 기준들에 부합하였다.
챌린지(challenge)를 수행하여 조류 인플루엔자(AI) 항원 분획을 평가하였다. 닭들에게 106 EID50의 챌린지 바이러스를 함유하는 총 100μl의 요막액을 비강내(50μl) 및 경구(50μl) 경로에 의해 백신접종 후 3주 경과 후에 접종하였다.
HPAI H5N1에 대한 챌린지로부터의 보호를 평가하기 위해, 2개의 연구들을 수행하였다:
1) 단일 또는 이중 백신접종(부스팅 효과(boosting effect)를 평가), 1일 또는 10일령 닭들(연령 효과 평가), 및 0.5 또는 0.2 ml의 용량들(용량 효과 평가)을 사용한 보호유형들 연구(Protectotypes study).
2개의 상이한 챌린지 균주들을 당해 연구를 위해 사용하였다: a) 동남 아시아(중국, 베트남) 가금류 생산에서 최근에 질환을 야기했던 아계통군 2.3.2 Vietnamese 균주(2006년에 분리됨). b) 이집트 가금류 생산에서 최근에 질병을 유발했던 아계통군 2.2.1 그룹 B1 이집트 균주(2010년에 분리됨). 챌린지 균주들은 유전적으로 백신 배큘로바이러스 작제물(MutK+)과 밀접하지 않다. 결과들은 유사하거나 상이한 백신들을 사용한 2개의 면역화들에 대해 부여된 보호를 상향 확장시키는 것으로서 보호유형들의 측면에서 해석된다.
결론들:
1) 80 내지 100%의 보호는 연령 또는 용량에 따라 관찰되었다. 100% 보호는 10일령에서 2가 제형을 0.5ml 용량으로 투여한 경우 관찰되었다.
2) 10일령에 BACULO AI + ND KV의 단일의 0.5ml의 면역물로서 투여된 경우, 불활성화되고 전통적으로 생산된 시판되는 Volvac AI KV 백신을 2회 샷으로 투여하는 경우에서와 달리, 동일한 보호가 관찰된다.
3) 10일령에 BACULO AI + ND KV의 단일 0.5ml 면역물로 투여시, 유사한 수준의 H5-특이적인 항체들이, 불활성화되고 전통적으로 생산된 시판되는 Volvac AI KV 백신의 2회 샷들의 투여와 비교하여 검출되었다.
4) 낮은 수준들의 바이러스 쉐딩이, 백신을 10일령에 BACULO AI + ND KV의 단일 0.5ml 면역물로서 투여하는 경우, 챌린지 후 3일까지 관찰되었다.
2) 10일령에 단일의, 독특한 백신접종을 사용한 BACULO 효능 연구
3개의 상이한 챌린지 균주들을 본 연구에 사용하였다: a) 아계통군 2.2.1 Egyptian 균주(2008년에 분리함). b) 아계통군 2.2.1 그룹 A1 Egyptian 균주(2010년에 분리함). c) 아계통군 2.2.1 그룹 B1 Egyptian 균주(2010년에 분리함). 마지막 2개 균주는 최근에 이집트 가금류 생산시 질병을 유발하였다.
결론들:
1) 90 내지 100 %의 보호가 관찰되었다.
2) 백신 BACULO AI + ND KV는 새들에서 HPAI 바이러스에 대한 백신들용 유럽 의약국(European Medicine Agency: ENA)기준들에 부합하는 수행능을 나타내었다.
3) 이는 챌린지에 사용된 바이러스들의 것들과는 유전적으로 상이한 헤마글루티닌을 포함하는 배큘로바이러스-계 백신에 대한 단일 샷 투여를 사용한 효능을 입증하는 이용가능한 최초 보고이다.
실시예 4
1. 실험 설계
당해 실험은 위에 기술된 실시예 3과 유사하게 설계하고 수행하였다:
백신 효능을 평가하기 위해, 3개의 임상 매개변수들을 고려하였다: 1) 이환율/사망률. 2) 항체들 수준들. 3) 바이러스 쉐딩.
모든 연구들에서 SPF 닭들을 백신접종하고, 당해 백신의 투여는 피하 경로로 목의 뒤쪽에서 수행하였다. 계통군 1 H5 단백질을 함유하는 백신 표현형을 사용하여(Mut K+로 불림) 제2의 ND(뉴캐슬병 바이러스) 항원 분획과 함께 이원 생성물로 제형화하였다. 달리 기술하지 않는 한 0.5ml의 용량을 투여하였다. 동물들을 10일령에 백신접종하였다. 닭들을 연구들의 전체 기간 동안 분리기 단위들 내에서 유지시켰다. 연구들은 조류 인플루엔자 백신들의 평가를 위한 OIE 국제 기준들에 부합하였다. 챌린지를 수행하여 조류 인플루엔자(AI) 항원 분획을 평가하였다. 닭들에게 106 EID50의 챌린지 바이러스를 함유하는 총 100μl의 요막액을 투여하는 비강내(50μl) 및 경구(50μl) 경로에 의해 백신접종 후 3주 경과 후에 접종하였다.
이는 또한 하기 표(표 A)에 요약한다[백신접종은 10일령에 수행하였다, 컬럼 1(적용된 백신에 따른 실험 그룹들의 ID), 컬럼 2(백신 용량), 및 컬럼 3(챌린지 연령)]. 챌린지 바이러스는 A/Chicken/Egypt/1063/2010이었으며, 이는 아계통군 2.2.1.1 HP AIV H5N1 아형으로 분류된다. 이는 백신 배취(batch)들의 평가를 위해 이집트에서 사용된 공식적인 챌린지 균주이다. 챌린지 용량은 106개 EID50이었다.
2. 결과들 및 데이터 분석
결과들 및 데이터 분석을 하기 표(표 A)에 요약한다: 컬럼 4(HI GMT (기하학적 평균 역가) 백신 접종 후 3주 경과 후, 챌린지 전), 컬럼 5(생존 백분율, 챌린지 후 2주 경과 후), 및 컬럼 6(바이러스 쉐딩의 검출, RT-PCR 양성 샘플들).
[표 A]
Figure 112014024531059-pct00008
3. 결론들
ㆍ 백신접종된 그룹은 챌린지에서 생존하였다. 백신 표현형은 동종 항원을 사용한 HI 역가로서 측정한 것으로서 효율적인 면역 반응을 개시하였다.
ㆍ Mut K+ 백신 표현형은 바이러스 쉐딩을 감소시키는 능력으로 측정한 것으로서 우수한 바이러스학적 보호를 제공하였다. RT-PCR Ct 값들은 감염성 바이러스를 나타내기에는 너무 낮았지만 대신 잔류성 유전 물질만을 나타내었다.
서열 목록(서열번호 1 내지 서열번호 51)에서:
서열번호 1은 신호 펩타이드가 없는 A/HongKong/213/2003(H5N1)의 H5에 상응하고,
서열번호 2 내지 서열번호 7은 국제 특허 출원(PCT) 제PCT/US2007/082699호의 서열번호 1 내지 서열번호 6에 상응하고,
서열번호 8은 H5N1 "1709-6"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 9는 H5N1 "1553-1/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 10은 H5N1 "1553-15/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 11은 H5N1 "2095-50/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 12는 H5N1 "3982-2/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 13은 H5N1 "3982-5/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 14는 H5N1 "3982-7/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 15는 H5N1 "3982-8/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 16은 H5N1 "3982-9/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 17은 H5N1 "3982-12/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 18은 H5N1 "3982-20/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 19는 H5N1 "3982-44/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 20은 H5N1553-2/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 21은 H5N1 "1553-6/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 22는 H5N1 "1553-13/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 23은 H5N1 "1553-26/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 24는 H5N1 "1553-28/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 25는 H5N1 "2095-39/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 26은 H5N1 "2095-46/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 27은 H5N1 "2095-49/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 28은 H5N1 "2095-65/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 29는 H5N1 "2095-68/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 30은 H5N1 "2095-70/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 31은 H5N1 "2095-73/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 32는 H5N1 "2095-75/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 33은 H5N1 "3982-3/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 34는 H5N1 "3982-4/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 35는 H5N1 "3982-13/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 36은 H5N1 "3982-14/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 37은 H5N1 "3982-19/B3"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 38은 H5N1 "3982-21/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 39는 H5N1 "3982-43/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 40은 H5N1 "3982-50/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 41은 H5N1 "3982-52/B1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 42는 H5N1 "3982-55/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 43은 H5N1 "3982-56/A1"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 44는 H5N1 "3982-78/B2"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 45는 H5N1 "4794-17/B"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 46은 H5N1 "4794-18/B"의 H5 서열에 상응하고,
서열번호 47은 서열번호 50으로부터 번역된 H5 서열에 상응하며,
서열번호 48은 H5N1 "3982-8/A1"(서열번호 15)의 H5 서열을 암호화하고,
서열번호 49는 H5N1 "1553-2/B1"(서열번호 20)의 H5 서열을 암호화하고,
서열번호 50은 서열번호 9 내지 서열번호 46을 암호화하는 38개의 H5 HA 유전자 서열들의 분석 후 수득된 컨센서스 서열(consensus sequence)에 상응하고,
서열번호 51은 뉴캐슬병 바이러스 라소타 균주의 cDNA에 상응한다.
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA S.A. DE C.V. BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH <120> INFLUENZA H5 VACCINES <130> Case P01-2749 <150> US 61/523,772 <151> 2011-08-15 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 552 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 1 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 115 120 125 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly 210 215 220 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 325 330 335 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 340 345 350 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 355 360 365 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 370 375 380 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 385 390 395 400 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 405 410 415 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 420 425 430 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 435 440 445 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 450 455 460 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 465 470 475 480 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 485 490 495 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 500 505 510 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 515 520 525 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 530 535 540 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550 <210> 2 <211> 551 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 2 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 325 330 335 Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 340 345 350 Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 355 360 365 Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile 370 375 380 Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn 385 390 395 400 Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 405 410 415 Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu 420 425 430 Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr 435 440 445 Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 450 455 460 Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 465 470 475 480 Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 485 490 495 Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 500 505 510 Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu 515 520 525 Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser 530 535 540 Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 545 550 <210> 3 <211> 567 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 3 Met Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile 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Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu 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Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 16 Xaa Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser 1 5 10 15 Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His 20 25 30 Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asn Leu 35 40 45 Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp 50 55 60 Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp 65 70 75 80 Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ile Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro 85 90 95 Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile 100 105 110 Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Asp 115 120 125 His Glu Ala Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Arg Ser 130 135 140 Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Thr Lys Lys Asn Asn Xaa Tyr 145 150 155 160 Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu 165 170 175 Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys 180 185 190 Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val 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<222> (558)..(558) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 29 Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser Asp Gln Ile 1 5 10 15 Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile 20 25 30 Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys 35 40 45 Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile 50 55 60 Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys 65 70 75 80 Asp Glu Phe Pro Asn Val Ser Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ile 85 90 95 Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asn Tyr Glu 100 105 110 Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn Arg Phe Glu Lys Ile Lys 115 120 125 Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Asp His Glu Ala Ser Leu Gly Val 130 135 140 Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Gly Pro Ser Phe Tyr Arg Asn Val 145 150 155 160 Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser 165 170 175 Tyr His Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His 180 185 190 His Pro Asn Asp 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misc_feature <222> (510)..(510) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 43 Xaa His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn 20 25 30 Gly Lys Leu Cys Asn Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp 35 40 45 Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe 50 55 60 Pro Asn Val Leu Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ile Asn Pro Ala 65 70 75 80 Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys 85 90 95 His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro 100 105 110 Lys Asn Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys 115 120 125 Pro Tyr Gln Arg Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Thr 130 135 140 Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr 145 150 155 160 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp 165 170 175 Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser 180 185 190 Val 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occurring amino acid <400> 46 Xaa Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly 1 5 10 15 Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys 20 25 30 Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn 35 40 45 Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp 50 55 60 Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe 65 70 75 80 Pro Asn Val Ser Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ile Asn Pro Ala 85 90 95 Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asn Tyr Glu Glu Leu Lys 100 105 110 His Leu Leu Ser Arg Ile Asn Arg Phe Glu Lys Ile Lys Ile Ile Pro 115 120 125 Lys Ser Ser Trp Pro Asp His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala 130 135 140 Cys Pro Tyr Gln Gly Gly Pro Ser Phe Tyr Arg Asn Val Val Trp Leu 145 150 155 160 Thr Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr His Asn 165 170 175 Ile Asn Lys Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn 180 185 190 Asp Glu Glu Glu Gln Ile Arg Ile Tyr Lys Asn Pro Thr Thr Tyr Ile 195 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cagatcatga agcctcagga gtgagctcag 420 catgtccata ccagggaaga tcctcctttt ttagaaatgt ggtatggctt accaaaaaga 480 acaatgcata cccaacaata aagaaaagtt acaataatac caaccaagaa gatcttttgg 540 tattatgggg gattcaccat ccaaatgatg cggcagagca gacaaggctt tatcaaaacc 600 caactaccta tatttccgtt gggacatcaa cactaaacca gagattggta cccaaaatag 660 ctactagatc taaggtaaac gggcaaagtg gaaggatgga gttcttttgg acaattttaa 720 aatcgaatga tgcaataaac tttgagagta atggaaattt cattgctcca gaaaatgcat 780 acaaaattgt caagaaaggg gactcaacaa ttatgaaaag tgagttggaa tatggtgact 840 gcaacaccaa gtgtcagact ccaatagggg cgataaactc cagtatgcca ttccacaaca 900 tccaccctct caccatcggg gaatgcccca aatatgtgaa atcaaacaga ttagtccttg 960 ctactgggct cagaaatagc cctcaaggag agagaagaag aaaaaagaga ggactatttg 1020 gagctatagc aggttttata gagggaggat ggcagggaat ggtagatggt tggtatgggt 1080 accaccatag caacgagcag gggagtgggt acgctgcaga caaagaatcc actcaaaagg 1140 caatagatgg agtcaccaat aaggtcaact cgatcattga caaaatgaac actcagtttg 1200 aggctgttgg gagggaattt aataacttag aaaggagaat agaaaattta aacaagaaga 1260 tggaagacgg attcctagat gtctggactt ataatgctga acttctggtt ctcatggaaa 1320 atgagagaac tctagacttt catgactcaa atgtcaagaa cctttatgac aaggtccgac 1380 tacagcttag ggataatgca aaggagcttg gtaacggttg tttcgagttc tatcacagat 1440 gtgataatga atgtatggaa agtgtaagaa acggtacgta tgactacccg cagtattcag 1500 aagaagcaag attaaaaaga gaggaaataa gtggagtaaa attggagtca ataggaactt 1560 accaaatact gtcaatttat tcaacagtgg cgagctccct agcactggca atcatggtgg 1620 <210> 49 <211> 1707 <212> DNA <213> H5N1 <400> 49 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcaacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtc 120 actgttacac acgctcaaga catactggaa aagacacaca atgggaaact ctgcgatcta 180 ggtggagtga agcctctaat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaac 240 ccaatgtgtg acgaattccc caatgtgtcg gaatggtcct acatagtgga gaagatcaat 300 ccagccaatg acctctgtta cccagggaat ttcaacaact atgaagaact gaaacatcta 360 ttgagcagaa taaaccggtt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggccagat 420 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tacagttagt ttacctgcct atcaagttag aaaaaacacg 4500 ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ctccaggtgc aagatgggct ccagaccttc 4560 taccaagaac ccagcaccta tgatgctgac tatccgggtt gcgctggtac tgagttgcat 4620 ctgtccggca aactccattg atggcaggcc tcttgcagct gcaggaattg tggttacagg 4680 agacaaagcc gtcaacatat acacctcatc ccagacagga tcaatcatag ttaagctcct 4740 cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg tgcgaaagcc cccttggatg catacaacag 4800 gacattgacc actttgctca ccccccttgg tgactctatc cgtaggatac aagagtctgt 4860 gactacatct ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg gcggtgtggc 4920 tcttggggtt gcaactgccg cacaaataac agcggccgca gctctgatac aagccaaaca 4980 aaatgctgcc aacatcctcc gacttaaaga gagcattgcc gcaaccaatg aggctgtgca 5040 tgaggtcact gacggattat cgcaactagc agtggcagtt gggaagatgc agcagtttgt 5100 taatgaccaa cttaataaaa cagctcagga attagactgc atcaaaattg cacagcaagt 5160 tggtgtagag ctcaacctgt acctaaccga attgactaca gtattcggac cacaaatcac 5220 ttcacctgct ttaaacaagc tgactattca ggcactttac aatctagctg gtggaaatat 5280 ggattactta ttgactaagt 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tacagatcca catcccctaa tcttctatag aaaccacacc 7860 ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat ggtgtacaag caagacttaa ccctgcgtct 7920 gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc attactcgag tgagttcaag cagtaccaaa 7980 gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa gtggtcaaga ctaataagac ctattgtctc 8040 agcattgctg aaatatctaa tactctcttc ggagaattca gaatcgtccc gttactagtt 8100 gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa gccaggtctg gctagttgag tcaattataa 8160 aggagttgga aagatggcat tgtatcacct atcttctgcg acatcaagaa tcaaaccgaa 8220 tgccggcgcg tgctcgaatt ccatgttgcc agttgaccac aatcagccag tgctcatgcg 8280 atcagattaa gccttgtcaa tagtctcttg attaagaaaa aatgtaagtg gcaatgagat 8340 acaaggcaaa acagctcatg gtaaataata cgggtagaac atggcgagct ccggtcctga 8400 aagggcagag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tggtcaagca 8460 caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccgctt cctgatgaat gtgacttcga 8520 ccacctcatt ctcagccgac aatggaaaaa aatacttgaa tcggcctctc ctgatactga 8580 gagaatgata aaactcggaa gggcagtaca ccaaactctt aaccacaatt ccagaataac 8640 cggagtgctc caccccaggt gtttagaaga actggctaat attgaggtcc cagattcaac 8700 caacaaattt cggaagattg agaagaagat ccaaattcac aacacgagat atggagaact 8760 gttcacaagg ctgtgtacgc atatagagaa gaaactgctg gggtcatctt ggtctaacaa 8820 tgtcccccgg tcagaggagt tcagcagcat ccgtacggac ccggcattct ggtttcactc 8880 aaaatggtcc acagccaagt ttgcatggct ccatataaaa cagatccaga ggcatctgat 8940 ggtggcagct aggacaaggt ctgcggccaa caaattggtg atgctaaccc ataaggtagg 9000 ccaagtcttt gtcactcctg aacttgtcgt tgtgacgcat acgaatgaga acaagttcac 9060 atgtcttacc caggaacttg tattgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt 9120 caacataata tcaaccacgg cggtgcatct cagaagctta tcagagaaaa ttgatgacat 9180 tttgcggtta atagacgctc tggcaaaaga cttgggtaat caagtctacg atgttgtatc 9240 actaatggag ggatttgcat acggagctgt ccagctactc gagccgtcag gtacatttgc 9300 aggagatttc ttcgcattca acctgcagga gcttaaagac attctaattg gcctcctccc 9360 caatgatata gcagaatccg tgactcatgc aatcgctact gtattctctg gtttagaaca 9420 gaatcaagca gctgagatgt tgtgtctgtt gcgtctgtgg ggtcacccac tgcttgagtc 9480 ccgtattgcc gcaaaggcag tcaggagcca aatgtgcgca ccgaaaatgg tagactttga 9540 tatgatcctt caggtactgt ctttcttcaa gggaacaatc atcaacgggt acagaaagaa 9600 gaatgcaggt gtgtggccgc gagtcaaagt ggatacaata tatgggaagg tcattgggca 9660 actacatgca gattcagcag agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt ataagagttt 9720 atctgcactt gaatttgagc catgtataga atatgaccct gtcaccaacc tgagcatgtt 9780 cctaaaagac aaggcaatcg cacaccccaa cgataattgg cttgcctcgt ttaggcggaa 9840 ccttctctcc gaagaccaga agaaacatgt aaaagaagca acttcgacta atcgcctctt 9900 gatagagttt ttagagtcaa atgattttga tccatataaa gagatggaat atctgacgac 9960 ccttgagtac cttagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt 10020 gaaagttaat ggacggatct tcgctaagct gacaaagaag ttaaggaact gtcaggtgat 10080 ggcggaaggg atcctagccg atcagattgc acctttcttt cagggaaatg gagtcattca 10140 ggatagcata tccttgacca agagtatgct agcgatgagt caactgtctt ttaacagcaa 10200 taagaaacgt atcactgact gtaaagaaag agtatcttca aaccgcaatc atgatccgaa 10260 aagcaagaac cgtcggagag ttgcaacctt cataacaact gacctgcaaa agtactgtct 10320 taattggaga tatcagacaa tcaaattgtt cgctcatgcc atcaatcagt tgatgggcct 10380 acctcacttc ttcgaatgga ttcacctaag actgatggac actacgatgt tcgtaggaga 10440 ccctttcaat cctccaagtg accctactga ctgtgacctc tcaagagtcc ctaatgatga 10500 catatatatt gtcagtgcca gagggggtat cgaaggatta tgccagaagc tatggacaat 10560 gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agctagatcg cattgtcgtg ttgcctgtat 10620 ggtacagggt gataatcaag taatagcagt aacgagagag gtaagatcag acgactctcc 10680 ggagatggtg ttgacacagt tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattaattca 10740 tgtcaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa accatcaggt cagacacatt 10800 cttcatatac agcaaacgaa tcttcaaaga tggagcaatc ctcagtcaag tcctcaaaaa 10860 ttcatctaaa ttagtgctag tgtcaggtga tctcagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc 10920 caacattgcc tctactgtag cacggctatg cgagaacggg cttcccaaag acttctgtta 10980 ctatttaaac tatataatga gttgtgtgca gacatacttt gactctgagt tctccatcac 11040 caacaattcg caccccgatc ttaatcagtc gtggattgag gacatctctt ttgtgcactc 11100 atatgttctg actcctgccc aattaggggg actgagtaac cttcaatact caaggctcta 11160 cactagaaat atcggtgacc cggggactac tgcttttgca gagatccagc gactagaagc 11220 agtgggatta ctgagtccta acattatgac taatatctta actaggccgc ctgggaatgg 11280 agattgggcc agtctgtgca acgacccata ctctttcaat tttgagactg ttgcaagccc 11340 aaatattgtt cttaagaaac atacgcgaag agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt 11400 attgtctgga gtgcacacag aggataatga ggcagaagag aaggcattgg ctgaattctt 11460 gcttaatcaa gaggtgattc atccccgcgt tgcgcatgcc atcatggagg caagctctgt 11520 aggtaggaga aagcaaattc aagggcttgt tgacacaaca aacaccgtaa ttaagattgc 11580 gcttactagg aggccattag gcataaagag gctgatgcgg atagtcaatt attctagcat 11640 gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ttcctccagt agatccaacc accccttagt 11700 ctcttctaat atgtgttctc tgacactggc agactatgca cggaatagaa gctggtcacc 11760 tttgacggga ggcaggaaaa tactgggtgt atctaatcct gatacgatag aactcgtaga 11820 gggtgagatt cttagtgtaa gcggagggtg tacaagatgt gacagcggag atgaacaatt 11880 tacttggttc catcttccaa gcaatataga attgaccgat gacaccagca agaatcctcc 11940 gatgagggta ccatatctcg ggtcgaagac acaggagagg agagctgcct cacttgcaaa 12000 aatagctcat atgtcgccac atgtaaaggc tgccctaagg gcatcatccg tgttgatctg 12060 ggcttatggg gataatgacg taaattggac tgctgctctt acgattgcaa aatctcggtg 12120 taatgtaaac ttagagtatc ttcggttact gtccccttta cccacggctg ggaatcttca 12180 acatagacta gatgatggta taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacaggtg 12240 tcaccttaca ttcacatatc caatgattct caaaggctgt tcactgaaga aggagtcaaa 12300 gaggggaatg tggtttacca acagagtcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcgat 12360 atttccaatg acagcaacca ggacatatga tgagatcaca ctgcacctac atagtaaatt 12420 tagttgctgt atcagagaag cacctgttgc ggttcctttc gagctacttg gggtggtacc 12480 ggaactgagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat cctagccctg gatcggaggg 12540 agactttgcg agacttgact tagctatctt caagagttat gagcttaatc tggagtcata 12600 tcccacgata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttga ttggccagtc 12660 tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtacgacaa 12720 tacccgaaat tggatcagtg aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat ttgaatatgc 12780 agcacttgaa gtgctcctca actgttctta ccaactctat tacctgagag 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ctttctgtac ccgaggtaag 13680 atgtgcaaga cacgggaact ccttatactt agctgaaggg agcggagcca tcatgagtct 13740 tctcgaactg catgtaccac atgaaactat ctattacaat acgctctttt caaatgagat 13800 gaaccccccg caacgacatt tcgggccgac cccaactcag tttttgaatt cggttgttta 13860 taggaatcta caggcggagg taacatgcaa agatggattt gtccaagagt tccgtccatt 13920 atggagagaa aatacagagg aaagtgacct gacctcagat aaagcagtgg ggtatattac 13980 atctgcagtg ccctacagat ctgtatcatt gctgcattgt gacattgaaa ctcctccagg 14040 gtccaatcaa agcttactag atcaactagc tatcaattta tctctgattg ccatgcattc 14100 tgtaagggag ggcggggtag taatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat actactttca 14160 tctactcatg aacttgtttg ctccgtgttc cacaaaagga tatattctct ctaatggtta 14220 tgcatgtcga ggagatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc 14280 tacatttgta catgaggtgg tgaggatggc aaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct 14340 cttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt 14400 gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag attaataaag tacttgagga agaatattga 14460 cactgcgctg attgaagccg ggggacagcc cgtccgtcca ttctgtgcgg agagtctggt 14520 gagcacgcta gcgaacataa ctcagataac ccagattatc gctagtcaca ttgacacagt 14580 tatccggtct gtgatatata tggaagctga gggtgatctc gctgacacag tatttctatt 14640 taccccttac aatctctcta ctgacgggaa aaagaggaca tcacttaaac agtgcacgag 14700 acagatccta gaggttacaa tactaggtct tagagtcgaa aatctcaata aaataggcga 14760 tataatcagt ctagagctta aaggcatgat ctccatggag gaccttatcc cactaaggac 14820 atacttgaag catagtacct gccctaaata tttgaaggct gtcctaggta ttaccaaact 14880 caaagaaatg tttacagaca cttctgtact gtacttgact cgtgctcaac aaaaattcta 14940 catgaaaact ataggcaatg cagtcaacgg atattacagt aactgtgact cttaacgaaa 15000 atcacatatt aataggctcc ttttttggcc aattgtattc ttgttgattt aatcatatta 15060 tgttagaaaa aagttgaacc ctgactcctt aggactcgaa ttcgaactca aataaatgtc 15120 ttaaaaaaag gttgcgcaca attattcttg agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg 15180 tttggt 15186

Claims (40)

  1. 계통군(clade) 2 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한,
    배큘로바이러스-기반의 발현 시스템에 의해 곤충 세포에서 발현되는 계통군 1 H5N1의 조(crude) 전체 세포 H5 단백질 및
    불활성화된 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스
    의 조합을 포함하는 백신으로서,
    상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질은 서열번호 1의 폴리펩타이드 서열과 98% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 이러한 폴리펩타이드 서열로 이루어지고,
    상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질이 아미노산 223N 및 변형 328K+를 갖고, 여기서, 상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 제시된 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는 계통군 1 H5N1의 H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미하는, 백신.
  2. 계통군(clade) 2 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한,
    a. 계통군 1 H5N1의 H5 단백질 및 불활성화된 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스의 조합, 및
    b. 항원보강제 (adjuvant)
    를 포함하는 백신으로서,
    상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질은 서열번호 1의 폴리펩타이드 서열과 98% 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 이러한 폴리펩타이드 서열로 이루어지고,
    상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질이 아미노산 223N 및 변형 328K+를 갖고, 여기서, 상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 2에 제시된 아미노산 위치를 말하며, 여기서, 변형 328K+는 계통군 1 H5N1의 H5 단백질의 아미노산 위치 328번에 제2 라이신(K+)이 삽입되어 있음을 의미하는, 백신.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항원보강제가 에멀시겐(Emulsigen)-계 항원보강제인, 백신.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질 이 하기 아미노산
    a. 아미노산 94N,
    b. 아미노산 120N,
    c. 아미노산 155N
    중 하나 이상을 갖는, 백신.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계통군 1 H5N1의 H5 단백질이,
    i) 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드; 또는
    ii) 상기 i)의 폴리펩타이드에 대해 85% 이상의 서열 상동성(sequence homology)을 갖고, 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 헤마글루티닌 억제를 포함하는 펩타이드; 또는
    iv) 아미노산들 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120S, 155S, 156A, 156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 263A 또는 263T 중 하나를 갖는 상기 i) 또는 ii)의 펩타이드; 또는
    v) a. aa 93 내지 95: GNF
    b. aa 123 내지 125: SDH
    c. aa 128 내지 130: SSG
    d. aa 138 내지 140: GSS
    e. aa 226 내지 228: MDF
    f. aa 270 내지 272: EVE
    g. aa 309 내지 311: NKL로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 클러스터들 중 하나 이상을 갖는 상기 i), ii), 또는 iv)의 펩타이드
    를 포함하는, 백신.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계통군 2 H5N1 바이러스가 계통군 2.2 H5N1 바이러스 또는 계통군 2.3 H5N1 바이러스이거나, 계통군 2.2.1 H5N1 바이러스 또는 계통군 2.3.2 H5N1 바이러스인, 백신.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계통군 2 H5N1 바이러스가 북아프리카 또는 베트남 기원의 H5N1 바이러스이고, 상기 북아프리카 기원의 H5N1 바이러스가 계통군 2 H5N1 인플루엔자 바이러스의 H5 단백질을 포함하는 H5N1 바이러스이고,
    여기서, 상기 계통군 2 H5 단백질이
    (a) 아미노산들 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, 및 181N(여기서, 변형 145(-)는, H5의 아미노산 위치 145번이 결실되어 있음을 의미한다), 또는
    (b) 아미노산들 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G 및 421K, 또는
    (c) 아미노산들 145L, 172T, 및 254V를 갖거나 (여기서, 상기 계통군 2 H5N1의 H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 8에 제시된 아미노산 위치를 말한다);
    상기 계통군 2 H5N1의 H5 단백질이 서열번호 9 내지 서열번호 46에 나타낸 서열들 중 어느 하나와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 상동성인 아미노산 서열로 이루어지거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계통군 2 H5N1 바이러스가계통군 2 H5N1 인플루엔자 바이러스의 H5 단백질을 포함하는 H5N1 바이러스이고, 여기서, 상기 계통군 2 H5 단백질이,
    (a) 아미노산들 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, 및 181N, 또는
    (b) 아미노산들 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G 및 421K, 또는
    (c) 아미노산들 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H, 및 254V를 갖거나 (여기서, 상기 계통군 2 H5N1의 H5 단백질의 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 8에 제시된 아미노산 위치를 말한다);
    상기 계통군 2 H5N1의 H5 단백질이,
    i) 서열번호 9 내지 서열번호 46의 아미노산 서열들 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩타이드; 또는
    ii) 상기 i)의 폴리펩타이드에 대해 85% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상동성을 갖고, 표준 헤마글루티닌 억제 검정시 헤마글루티닌 억제를 포함하는 펩타이드
    를 포함하는, 백신.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 감염
    (A) 북아프리카 기원의 아계통군 A H5N1 바이러스에 의한 감염, 즉, 아미노산들 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, 및 181N(여기서, 변형 145(-)는, H5의 아미노산 위치 145번이 결실되어 있음을 의미한다), 또는 아미노산들 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, 및 181N을 갖는 계통군 2 H5N1의 H5 단백질, 또는
    서열번호 9 내지 서열번호 19, 또는 서열번호 42 또는 서열번호 43에 나타낸 서열들 중 어느 하나와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 상동성인 아미노산 서열로 이루어지거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는 H5 단백질
    을 포함하는 H5N1 바이러스에 의한 감염,
    또는
    (B) 북아프리카 기원의 아계통군 B H5N1 바이러스에 의한 감염, 즉,
    아미노산들 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G 및 421K,
    아미노산들 145L, 172T, 및 254V,
    아미노산들 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G 및 421K, 또는
    아미노산들 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H, 및 254V (여기서, 아미노산 위치들의 번호매김은 서열번호 8에 제시된 아미노산 위치를 말한다)를 갖는 H5 단백질; 또는
    서열번호 20 내지 서열번호 41, 또는 서열번호 44 내지 서열번호 46에 나타낸 서열들 중 어느 하나와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 상동성인 아미노산 서열로 이루어지거나 이러한 아미노산 서열을 포함하는 H5 단백질
    을 포함하는 H5N1 바이러스에 의한 감염
    을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한, 백신.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스가, 서열번호 51에 나타낸 폴리뉴클레오타이드의 RNA 카피와 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴캐슬병 바이러스의 불활성화에 의해 수득된 불활성화된 뉴캐슬병 바이러스인, 백신.
  11. a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 백신; 및
    b) 계통군 2 H5N1 바이러스에 의해 야기된 감염들의 치료 또는 예방을 위한 a) 백신의 사용을 지시하는 패키지 리플렛(package leaflet)
    을 포함하는, 계통군 2 H5N1 바이러스에 의한 감염들을 치료하거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 부품들의 키트(kit of parts).
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-샷(single-shot) 백신 또는 1회-용량 백신접종으로 사용하기 위한, 백신.
  13. 제11항에 있어서, 단일-샷 백신 또는 1회-용량 백신접종으로 사용하기 위한, 키트.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 바이러스 쉐딩(viral shedding)을 감소시키는데 사용하기 위한 백신으로서, 계통군 2 H5N1 바이러스에 의해 감염되거나 상기 바이러스에 의한 바이러스 감염의 위험이 있는 대상체에게 상기 조합이 투여되는 것인, 백신.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 계통군 2 H5N1 바이러스에 의해 감염되거나 상기 바이러스에 의한 바이러스 감염의 위험이 있는 대상체에서 바이러스 쉐딩을 감소시키기 위한 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 백신.
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