CN101193655A

CN101193655A - 抗大流行性流感病毒株的疫苗

Info

Publication number: CN101193655A
Application number: CNA200680020766XA
Authority: CN
Inventors: 舒里娅普拉卡什·桑布哈拉; 杰奎琳·卡茨; 玛丽·霍尔舍; 苏雷什·K·米塔尔; 迪内希·S·邦高里
Original assignee: Government Of United States, Represented By Secretary Dep; Purdue Research Foundation
Current assignee: Government Of United States, Represented By Secretary Dep; Purdue Research Foundation; US Government
Priority date: 2005-04-11
Filing date: 2006-04-10
Publication date: 2008-06-04
Also published as: EP1877088A2; WO2006113214A3; US20080187557A1; AU2006236910A1; KR20080052509A; US8163545B2; US20100158939A1; EP1877088B1; BRPI0609362A2; WO2006113214A2; IL186611A0; CA2604732A1; AU2006236910B2

Abstract

本公开文本提供了针对禽类或大流行性流感引起免疫应答的组合物和方法。所述组合物包括含有禽流感抗原的腺病毒载体、重组腺病毒以及含有此类重组载体和腺病毒的免疫原性组合物。本发明还提供了涉及施用此类腺病毒载体或重组腺病毒，针对禽流感或大流行性流感引起免疫应答的方法。

Description

抗大流行性流感病毒株的疫苗

相关申请的交叉参考

本申请要求2005年4月11日提交的美国临时申请60/670,826的优先权，其说明书被全文引用作为参考。

鸣谢政府资助

本发明的各个方面是源于国立卫生研究院的资助在美国政府的支持下完成的。美国政府对本发明具有确定的权利。

领域

本申请涉及疫苗领域。更具体地，本申请涉及用于制备禽流感病毒疫苗的重组载体

背景

强毒性禽流感的大流行性爆发对世界范围内的人类和动物健康造成了重大的风险。人类和禽流感病毒之间的遗传重配可导致病毒具有禽类来源的新型血凝素(HA)，而人类对此却缺乏免疫力。在20世纪，1918、1957和1968年的大流行就是这种抗原性转变的结果。近期由H5N1、H7N7和H9N2亚型流感病毒引起的禽流感爆发，及其对人类的感染都引起了对在家禽中传播的流感病毒大规模流行的潜在可能的新警惕。单就美国而言，一次大流行造成的经济影响据估计可高达1650亿美元，以及多达200,000例的死亡，730,000例的住院，42例门诊以及5千万例其它疾病。

在盛行的全球生物恐怖主义威胁的态势之下，故意感染了强毒性流感株的个体可被用作难以检测的大规模杀伤性生物武器。

迄今为止，已经尝试了三种主要的途径来开发安全有效地抗潜在的大流行性禽流感株的疫苗，但无一完全成功(Wood等人，Vaccine20：S84-S87，2002；Stephenson等人，The Lancet 4：499-509，2004，及其中所引用的参考文献)。

由于这些流感株在家禽中的致死性，目前涉及在鸡蛋中培养病毒的疫苗制备策略是行不通的。有一些方法致力于分离表达潜在流行性流感株相关免疫原性抗原的非致病性或减毒的流感株。例如，天然存在的、具有H5亚型抗原病毒的无致病性流感株就被评为疫苗候选物。一般而言，已证明了这些病毒难以使用常规技术进行培养，并且保护是取决于针对所述无致病性疫苗株而产生的抗体与毒性病毒株交叉反应的能力(Takada等人，J.Virol.73：8303-8307，1999；Wood等人，Vaccine18：579-80，2000)。已采用反向遗传学方法在致病性H5N1病毒(A/HK/97)的HA抗原的切割位点缺失了一段碱性氨基酸，从而开发出了候选疫苗(Li等人，J.Infect.Dis.179：1132-1138，1999)。

另一种方法利用了在杆状病毒表达系统产生的重组HA(“H5”)。然而，要获得满意的免疫应答需要高剂量的纯化蛋白以及使用佐剂(Treanor等人，Vaccine 19：1732-1737，2001)。

对于开发在人类和非人类群体中均能防护禽流感株引起的感染的疫苗，且其可有效地制备和给药而无需依赖病毒在鸡蛋中的生长，存在着持续的需求。本公开致力于这一需求，并提供了可用于预防由禽类和大流行性流感株引起的感染的新组合物和方法。

发明概述

本公开涉及针对潜在流行性流感株引起保护性免疫应答的方法，以及组合物，包括本文所公开的方法中有用的核酸载体和非感染性病毒。

本公开的一个方面涉及重组核酸。本文所述的重组核酸包括腺病毒载体。所述腺病毒载体，包括人和非人腺病毒载体，都含有编码对应于禽流感株抗原的一种或多种多肽。

在另一方面，本公开提供了重组腺病毒，例如表达一种或多种禽流感抗原的复制缺陷型人或非人腺病毒。

公开了含有本文所公开的腺病毒载体和/或重组腺病毒的药物组合物，包括疫苗组合物。

本公开的另一个特征涉及产生针对禽类和/或大流行性流感株的免疫应答的方法。在本文公开的方法中，基于编码至少一种禽流感株抗原的腺病毒载体和/或表达至少一种禽流感株抗原的重组腺病毒的免疫原性组合物，可在对象暴露于禽类或大流行性流感株之前或之后向对象给药。

根据下文参照附图进行的详细描述，本发明的上述及其他目的、特征和优势将变得更加显而易见。

附图简述

图1A示意性说明了HAd5-H5HA载体。使用Cre重组酶介导的位点专一性重组系统来产生表达禽流感病毒(H5N1)A/HK/156/97的HA的HAd5载体。处于CMV启动子控制之下的HA基因被插入穿梭载体(pDC311-含有3.1kb E1缺失的HAd5(4kb)的左末端，在Cre重组酶存在下用于位点专一性重组的loxP位点以及完整的包装信号)的StuI位点，以制备pDC311-H5。使用pDC311-H5HA和pBHGloxΔE1，3Cre(含有除包装信号E1和E3缺失之外几乎完整的HAd5基因组，在Cre重组酶存在时用于位点专一性重组loxP位点的质粒)共转染293Cre细胞(表达Cre重组酶的293细胞)，从而产生了HAd-H5HA载体。图1B是Western印迹，图示了HAd-H5HA载体编码的血凝素(HA)的表达。在感染细胞中HAd-H5HA有效地表达HA。在HAd-H5HA载体中H5-HA基因盒的结构(A)以及在用HAd-H5HA载体感染细胞中的H5HA表达(B)。使用HAd-ΔE1E3或HAd-H5HA对293Cre细胞进行模拟感染或感染。感染后24小时收集细胞并制备细胞提取液。使用由编码H5HA的DNA载体免疫兔子产生的兔H5HA特异性血清，通过Western印迹对细胞提取物进行分析。

图2是线形图，说明了HAd-H5HA载体针对高致病性同型H5N1(A/HK/483/97)病毒的攻击赋予了完全的保护。将25只(6-8周龄)雌性BALB/c小鼠随机分成5组(5只动物/组)，并在0天和28天肌肉接种PBS(□)，10μg没有明矾的重组H5HA(在杆状病毒中表达的禽HK/156/97流感病毒的血凝素)(

)，10μg含有明矾的纯化H5HA(×)，10⁸p.f.u.的HAd-ΔE1E3(△)，或10⁸p.f.u.的HAd-H5HA(■)。在70天用100LD₅₀的H5N1(A/HK/483/97)病毒攻击动物。每天监测小鼠的临床症状和体重变化，直至攻击后14天。

图3A-C是须盒图，显示了在用HAd-H5HA疫苗免疫的小鼠中，针对同源和异源禽流感病毒株的中和抗体反应的平均值、IQR和范围。(A)为HK/156/97，(B)为HK/213/03，且(C)为VN/1203/04株。*，#和$：在标记数据之间的差异为p＝0.001。im＝肌肉免疫。in＝鼻内免疫。

图4所示为一组流氏细胞分析的散点图，表明了在用HAd-H5HA疫苗免疫小鼠中，HA-518-表位特异性CD8T细胞的诱导。免疫小鼠(3只/组)脾细胞的流氏细胞分析是用HA518五聚体表位染色的。五聚体-阳性细胞(圈出的)表现为CD8T淋巴细胞群的百分数。

图5是条形图，表明了HA-518表位特异性CD8 T细胞引起的干扰素γ分泌。在免疫小鼠的脾细胞中进行了干扰素γ的ELISpot测定。数据为平均值和SD(误差棒)。im＝肌肉免疫。in＝鼻内免疫。用NP_147-155(对角线阴影条)，HA(白色条)，或佛波醇-豆蔻肢-乙酸酯(PMA)+离子霉素(黑色条)刺激培养物。

图6A-D为线形图而图6E为条形图，说明的是针对最近H5N1病毒的保护作用。BALB/C小鼠(15只动物/组)用10⁸p.f.u.的HAd-H5HA间隔4周进行两次肌肉(●)或鼻内(○)接种。HAd-ΔE1E3(■)作为阴性对照。第二次免疫四周后，每组5只动物用100倍50％致死剂量(LD₅₀)的A/HK/483/97(A和B)或A/VN/1203/04(C和D)或100倍50％小鼠感染剂量(MID₅₀)的A/HK/213/03(E)进行攻击。显示了初始体重的百分数(A和C)以及攻击后的存活率(B和D)。误差棒描述了平均值的标准差。每天监测A/HK/483/97或A/VN/1203/04攻击的小鼠的临床症状和体重变化，直到攻击后14天。将A/HK/213/03攻击的小鼠在攻击后3天行安乐死并收集肺脏。将组织冻融一次，然后在含有抗生素的1ml PBS中进行匀浆。在将匀浆液在11日龄鸡蛋中进行病毒感染性滴定之前，通过短暂的离心沉淀固体残渣团块。

图7A-D是Western印迹的示意性说明(A和C)和图像(B和D)，表明了来自猪和牛腺病毒载体的禽流感血凝素的表达。制备了带有禽H5N1流感病毒(A/HK/156/97)血凝素亚型5(H5HA)基因的PAd载体(PAd-H5HA)，所述基因处于PAd基因组早期区域1(E1)中插入的巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的控制之下。(A)PAd载体的结构图示：PAd-ΔE1E3(具有E1和E3缺失的PAd)，以及PAd-H5HA(具有H5HA基因盒的PAd-ΔE1E3)。ITR，反向末端重复；ΔE1，E1中的缺失；ΔE3，E3中的缺失；H5，H5HA；pA，猿猴病毒40多聚腺苷化信号。(B)FPRT HE1-5细胞用PAd-ΔE1E3或PAd-H5HA模拟感染或感染。感染后24小时，收集细胞，并使用针对H5HA的兔超免疫血清，通过Western印迹对细胞提取物进行分析。制备了带有禽H5N1流感病毒(A/HK/156/97)血凝素亚型5(H5HA)基因的BAd载体(BAd-H5HA)，所述基因处于BAd基因组早期区域1(E1)中插入的巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的控制之下。(C)BAd载体的结构图示：BAd-ΔE1E3(具有E1和E3缺失的PAd)，以及BAd-H5HA(具有H5HA基因盒的BAd-ΔE1E3)。ITR，反向末端重复；ΔE1，E1中的缺失；ΔE3，E3中的缺失；H5，H5HA；pA，猿猴病毒40多聚腺苷化信号。(D)FBRT HE1-5细胞用BAd-ΔE1E3或BAd-H5HA模拟感染或感染。感染后24小时，收集细胞，并使用针对H5HA的兔超免疫血清通过Western印迹对细胞提取物进行分析。

图8A和B是显示牛和猪E1基因在转染细胞中的表达的图片。(A)使用特异性引物组通过RT-PCR测定的BAd3E1A、E1B-19kDa(E1B-1)、以及E1B-55kDa(E1B-2)信息的表达。(B)使用特异性的引物组通过RT-PCR测定的PAd3E1A、E1B-19kDa(E1B-1)、以及E1B-55kDa(E1B-2)信息的表达。特异性的条带由箭头指出。

序列表简述

SEQ ID NO：1(5’-tccatgagcttcctgatcct-3’)是免疫刺激性寡核苷酸。

SEQ ID NO：2(5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’)是免疫刺激性寡核苷酸。

SEQ ID NO：3(5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’)是免疫刺激性寡核苷酸。

SEQ ID NO：4是HAd5 E1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5和6是用于扩增牛腺病毒E1的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：7是BAd3 E1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8-13是检测BAd3 E1转录物的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：14和15是用于扩增猪腺病毒E1的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：16是PAd3 E1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17-22是检测PAd3 E1转录物的寡核苷酸引物。

具体说明书

引言

流感病毒是具包膜的负义病毒，属于正粘病毒科。根据其核心蛋白，流感病毒被分为3种不同的类型：A，B和C。在这一广义的分类中，根据两种抗原表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)可进一步分为亚型。尽管B和C型流感病毒主要限于人，但流感A型病毒却是包括人、非人哺乳动物、和鸟类在内的很多种物种的病原体。周期性地，非人病毒株，特别是禽流感，会感染人群体，在某些情况下还会引起具有高致死性的严重疾病。在共感染个体内这类禽类病毒株和人病毒株之间的重组产生了重组流感病毒，对此人群缺乏免疫力，导致了流感的流行。在20世纪发生了三次这样的流行，即在1918年，1957年和1968年，导致了世界范围内大量的死亡。

高致病性禽流感H5N1病毒正在东南亚的家禽业中成为地方病。2004年初，就已报告了在所述地区H5N1病毒的人感染频率增加和死亡率高。1997年，首次认识到高致病性H5N1流感病毒导致人呼吸道疾病，当时18个记载在案的病例，包括6例死亡，发生在香港的养鸡场和市场爆发流感之后。2003年，在香港的一个家庭中又鉴定了二例另外的人H5N1感染。从那以后，H5N1病毒已经散布到9个亚洲国家，而最近已经将其地理分布扩张到了东欧的若干国家。从2004年1月开始，已有超过120例实验室证实的致死率高于50％的人感染病例被报道至世界卫生组织。直到今天，大多数人H5N1病毒感染都是由于病毒从已感染家禽直接传播，尽管也有过人和人之间传播的例外情况。在H5N1病毒基因组中，人和禽流感病毒和/或突变体之间的遗传重组可导致产生H5亚型的新流感病毒，如果其获得了在未经免疫的人群中耐受持续传播的能力，则可能引发大流行。因此，亟需能够有效针对高致病性H5N1和其它禽流感株的疫苗。

响应1997年H5N1流感爆发而开发和评定的疫苗对人仅具有适中的免疫原性，而在2004年从人中分离到的H5N1病毒则与之前在1997年和2003年分离到的那些病毒在遗传性和抗原性上差异显著，有必要开发新的疫苗候选物，因为所引起的免疫应答不防护抗原性迥异的病毒株。

非致病性的禽流感病毒，或是从天然存在的与致病株共有HA亚型的不致病株制备的，或是通过缺失自发蛋白剪接位点被工程化为不致病性的，迄今为止都只能够在鸡蛋中进行制备。在世界范围内的流行事件中，家禽的感染很有可能传播甚广，从而需要将鸡只杀死并导致可用于疫苗制备的鸡蛋短缺。重组HA疫苗已经经过了评定，但却需要可能有害的佐剂来发挥有效保护作用。因此，期望的是包括基于细胞和/或重组DNA技术的疫苗制备底物多样化，提高在流行情况下的疫苗生产能力。此外，重组DNA技术在加速疫苗可用性上是有利的，因为一旦获知了病毒的序列，就可以开始对一个或多个病毒基因进行克隆和表达。

本公开提供了新的组合物和方法，所述组合物和方法用于针对禽类和/或流行性流感病毒株制备流感疫苗和预防接种人、非人哺乳动物以及禽类群体，并克服了现有流感疫苗免疫原性差和制备缺点，其已适用于引起针对禽流感株的免疫应答。在此所述的组合物和方法是基于表达一种或多种免疫原性禽流感抗原的腺病毒载体，并任选与在暴露或感染禽类或流行性流感株之后能够进一步增强免疫应答、降低发病率且有助于恢复的内部蛋白组合。本公开提供了人和非人腺病毒是引发针对禽(以及潜在流行性)流感株免疫应答的有效载体的第一个证据。此外，本文所述的组合物和方法还提供了优于之前被评定为针对潜在流行性禽流感病毒株的疫苗策略的若干益处。例如，本文所述的腺病毒载体和腺病毒在组织培养条件下易于生长，并以适合商业化制造的规模进行纯化。此外，所引起的免疫应答强烈且持续时间长，并依赖于抗原的组合，涉及中和抗体产生和T细胞应答，并防护抗原性迥异的流感株。

示例性实施方案的描述

本公开的一个方面涉及重组腺病毒载体，其包括编码一种或多种流感抗原的多核苷酸序列。特别地，本文所述的腺病毒载体包括编码至少一种禽流感株抗原(“禽流感抗原”)的多核苷酸序列。例如，所述腺病毒载体能够编码一种或多种禽血凝素(“HA”)抗原。所述载体可包括编码禽流感株单个HA的序列，所述禽流感株例如H5亚型株，H7亚型株或H9亚型株，例如，选自在近期禽流感爆发中流行的H5N1、H7N7或H9N2株。或者，所述载体可编码多种(超过一种)禽HA抗原。在这种情况下，所编码的HA抗原可以是一种亚型的变异体(例如，H5HA的变异体，或H7HA的变异体，或H9HA的变异体)或者所述HA抗原可以是不同亚型的HA抗原(即，H5、H7和/或H9的组合，例如H5和H7，H5和H9，H7和H9，或H5、H7和H9，包括一种或超过一种任一亚型的HA抗原与一种或超过一种任一其他亚型HA抗原的组合)。

所述重组腺病毒载体还可包括编码禽流感神经氨酸酶(“NA”)抗原的多核苷酸序列。所述NA抗原可由所述载体单独编码，或与禽HA抗原组合。当载体包括编码禽HA抗原和禽NA抗原二者的多核苷酸序列时，所述HA和NA抗原可以相同的流感株，或可以选自不同的禽流感株。例如，禽流感在亚洲人群中最近的爆发就是由H5N1、H7N7和H9N2的A型流感株引起的。腺病毒载体可以编码，例如，N1亚型NA，N7亚型NA，或NA的N2亚型。或者，所述载体可编码不同的NA亚型，例如N3(例如，对应于不致病的H5N3禽流感病毒株)。本领域所属技术人员应该意识到，任意禽类HA亚型(最常见的，H5，H7或H9)都可在腺病毒载体中与任意的9NA亚型进行组合。如上所述，就HA抗原而言，腺病毒载体可编码多种NA抗原，其可以是单中NA亚型的变异体或者是不同NA亚型的代表。

如上文所述，腺病毒载体可以编码多种流感抗原。所述多种流感抗原可以编码两种或更多种禽流感抗原，例如多个禽类HA抗原，多个禽类NA抗原，或禽类HA抗原和NA抗原的组合。或者，所述载体能够编码与一种或多种禽类或非禽类流感株的内部蛋白组合的一种或多种禽类流感抗原。在禽流感内部蛋白的情况下，所述内部蛋白可选自相同或不同的禽流感株。所编码的内部蛋白也可选自非禽类流感株，例如人流感株(通常是，A型流感)。例如，所述一种或多种内部蛋白可选自H1N1，H2N2或H3N2流感株。任何内部蛋白(M1，M2，NP，PB1，PB2，NS1和NS2)都可由腺病毒载体来编码。内部蛋白的组合也可由所述载体来编码。例如，所述载体可以编码M蛋白(M1和/或M2的一种或多种)，NP蛋白或M和NP蛋白这二者。

人和非人腺病毒载体是本领域所公知的，且这二者都能被构建成包括有一种或多种上述的流感抗原。人腺病毒载体包括人腺病毒血清型5(“HAd5”)载体。或者，所述腺病毒载体是非人的，例如猪或牛的，腺病毒载体(例如，BAd3和PAd3载体)。通常，所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒，其在人和动物细胞中不能进行插入基因转录和翻译的多次循环。所述复制缺陷型腺病毒载体可以在涉及复制的一个或多个基因(或区域)中，包括E1区域基因、E3区域基因、E2区域基因和/或E4区域基因中的一个或多个中，具有突变。例如，复制缺陷型腺病毒载体可以在E1区域基因(例如，E1A)、E3区域基因、E2区域基因、E4区域基因或其组合中具有缺失或突变。

因此，在一个示例性的实施方案中，所述腺病毒载体是复制缺陷型人腺病毒载体，其包括编码禽流感HA抗原、禽流感NA抗原、或同时编码禽HA抗原与禽NA抗原这二者的多核苷酸序列。任选所述腺病毒载体编码多种禽HA抗原，其是单种HA亚型的变异体或是不同的HA亚型。在某些实施方案中，所述腺病毒载体还编码至少一种流感内部蛋白，例如M1蛋白，M2蛋白，NP蛋白或M和NP蛋白的组合。

在另一个实施方案中，所述腺病毒载体是复制缺陷型非人腺病毒载体，例如猪或牛腺病毒载体，其包括编码禽流感HA抗原、禽流感NA抗原、或同时编码禽HA抗原和禽NA抗原的多核苷酸序列。任选所述腺病毒载体编码多种禽HA抗原，其可以是单种HA亚型的变异体或者是不同的HA亚型。在某些实施方案中，所述腺病毒载体还可编码至少一种流感内部蛋白，例如M1，M2蛋白，NP蛋白或其任何组合。

本公开的另一方面涉及表达(包括)至少一种禽流感株抗原的重组腺病毒。通常，所述腺病毒表达禽HA抗原和/或禽NA抗原。因此，所述腺病毒可包括禽HA抗原，例如，H5HA抗原，H7HA抗原，和/或H9HA抗原。类似地，所述腺病毒可包括禽NA抗原，例如，H1NA抗原，H7NA抗原，和/或H2NA抗原。在一些情况下，所述腺病毒表达多种禽流感抗原，例如多种禽HA抗原或多种禽NA抗原或禽HA和NA抗原的组合。例如，所述腺病毒可表达单种HA(或NA)亚型的两种或更多种变异体。或者，所述腺病毒可表达不同亚型的两种或更多种HA(或NA)抗原。在一些情况下，所述腺病毒表达至少一种流感内部蛋白，例如M1，M2和/或NP蛋白。当腺病毒表达多种流感抗原时，所述的多种抗原可以是相同的株或亚型，或者是不同的株或亚型。

重组腺病毒可以是人腺病毒或者是非人腺病毒，例如猪或牛腺病毒。一般而言，所述腺病毒是复制缺陷型人或非人腺病毒。例如，所述复制缺陷型腺病毒可在E1区域基因、E3区域基因、E2区域基因和/或E4区域基因中具有突变(例如，缺失，插入或替换)。

这样的腺病毒载体和腺病毒可适用于多种目的。例如，这样的腺病毒和腺病毒载体适用于在体外和体内(包括卵内)制备禽(和其他)流感抗原。因此，制备重组禽流感抗原的方法是本公开的一个特征。例如，可通过复制包括编码禽流感病毒抗原的至少一种异源多核苷酸序列的腺病毒，来制备重组禽流感抗原。在一些实施方案中，所述腺病毒包括编码两种或更多种禽流感病毒抗原、或至少一种禽流感病毒抗原和非禽流感病毒抗原的序列。例如，所述禽流感抗原可以是HA抗原或NA抗原，例如选自H5、H7或H9流感株的HA或NA抗原。在某些实施方案中，所述腺病毒含有编码多种流感抗原的多核苷酸序列。

在某些实施方案中，表达重组禽流感病毒抗原的腺病毒是通过向能够支持复制缺陷型载体进行复制的细胞中引入复制缺陷型腺病毒载体制备而成的。这样的细胞通常包括提供补充复制功能的至少一种异源核酸，例如编码复制缺陷型腺病毒载体缺失的一种或多种E蛋白的异源核酸。在某些实施方案中，能够支持复制缺陷型腺病毒载体生长的细胞能够支持具有不同种向性的不同腺病毒株的生长。任选，可将所述重组禽流感病毒抗原进行分离，和，比如，用于制备免疫原性组合物，例如疫苗。

本公开的另一方面涉及支持种向性不同的多种复制缺陷型腺病毒株复制的细胞系。这样的多功能细胞系包括编码不同腺病毒株的多种E蛋白的异源核酸。在示例性的实施方案中，所述细胞系包括一种或多种异源核酸，其包括至少两种截然不同的多核苷酸序列，其中一种编码第一腺病毒株的至少一种E蛋白，而另一种则编码不同腺病毒株的至少一种E蛋白。选择E蛋白，用于补充要在细胞系中生长的重组腺病毒载体所缺失的E蛋白。因此，在一些实施方案中，当所述细胞旨在支持缺乏一种或多种E1蛋白的复制缺陷型腺病毒的生长时，所述多核苷酸序列编码所对应的E1蛋白。类似地，当所述细胞旨在支持缺乏一种或多种E3蛋白的复制缺陷型腺病毒的生长时，所述多核苷酸序列编码所对应的E3蛋白。通常，所述细胞包括编码具有不同种向性的腺病毒株E蛋白的核酸，从而使得所述细胞能够最适地支持具有不同种向性的多种腺病毒株的生长，例如人腺病毒E基因(或其片段)和非人E基因(或其片段)。在特定的实施例中，所述多核苷酸序列编码的是人和牛或猪的E蛋白。

这里公开的腺病毒载体和重组腺病毒可用于免疫原性组合物的范畴，包括疫苗。这样的免疫原性组合物可包括具有编码前述至少一种禽流感抗原的多核苷酸序列的腺病毒载体。所述免疫原性组合物还可包括表达上述至少一种禽流感抗原的重组腺病毒。除了所述腺病毒载体和/或腺病毒之外，所述免疫原性组合物还包括药物可接受的载体或赋形剂。因此，所述免疫原性组合物可包括编码或表达本文所公开的禽流感抗原的任何腺病毒载体和/或腺病毒。任选，所述免疫原性组合物包括佐剂，免疫刺激分子，微颗粒，或纳米颗粒。

本公开还提供了引起和产生针对禽类或流行性(或潜在流行性)流感株的免疫应答的方法。这里所公开的方法涉及向对象施用表达(或编码)禽流感抗原的至少一种腺病毒或腺病毒载体。通常，所述腺病毒或腺病毒载体是在暴露于至少一种禽流感或大流行性流感株之前，向对象给药的。即，通常，表达所述禽流感抗原的腺病毒或腺病毒载体是预防性给药的，例如，作为疫苗。

施用所述重组腺病毒和腺病毒载体可以引起免疫应答，所述免疫应答保护对象免受由于一种或多种禽类或大流行性流感株感染引起的严重疾病或死亡。在一些情况中，所述免疫应答防护超过一种流感株引起的疾病，例如多种禽流感株护。通常，所述免疫应答包括结合于至少一种禽流感抗原的中和抗体，在某些情况下，所述中和抗体可与多种禽流感株交叉反应。例如，施用表达禽流感HA抗原的腺病毒或腺病毒载体，可以引起针对HA亚型的中和抗体，其防护(或部分防护)相应HA亚型的流感引起的感染。类似地，施用表达禽类NA抗原的腺病毒或腺病毒载体，能够引起针对NA亚型的抗体反应。

在一些情况下，所施用的腺病毒或腺病毒载体表达(或编码)两种或更多种禽类HA和/或NA抗原。或者，施用多种腺病毒或腺病毒载体，其每一种都包括单种禽流感抗原。无论是以单种病毒或载体还是以多种病毒或杂体进行给药，所述抗原，例如，HA抗原，都可以是相同抗原亚型的变异体或者可以是不同流感亚型的抗原。任选，所述一种(或几种)腺病毒或载体导致流感结构性或非结构性蛋白例如M1、M2、NP或NS1蛋白的表达。在HA和NA抗原的情况下，所述内部蛋白可包括在一种或超过一种腺病毒或载体内。包含一种或多种内部蛋白抗原适用于加强由疫苗通过提高流感特异性T细胞产生的免疫应答。因此，本文所述组合物引起的免疫应答可包括T细胞应答。一般而言，所述T细胞应答对于流感内部蛋白的表位是特异的，所述内部蛋白在多种流感株例如多种相同或不同流感亚型株中都是保守的。

例如，在一个实施方案中，施用了表达单种禽HA抗原例如H5HA抗原、H7HA抗原或H9HA抗原的复制缺陷型腺病毒。在另一个实施方案中，施用了表达两种或更多种禽HA抗原的腺病毒。在又一个实施方案中，施用了表达至少一种禽HA抗原和至少一种禽NA抗原的腺病毒。在又一个实施方案中，所述腺病毒表达至少一种禽HA抗原，至少一种禽NA抗原，以及禽或非禽流感株的一种或多种流感内部蛋白(例如M1，M2和/或NP蛋白)。这类腺病毒的示例性实施方案是表达H5禽HA、N1禽NA以及人M(M1和/或M2)和/或NP蛋白的腺病毒。本领域所属技术人员可根据免疫应答所希望针对的病毒株，来确定各种其他的实施例。

在其他实施方案中，施用了多种不同的人或非人腺病毒，其每一种都包括一种或多种流感抗原。例如，可在相同或不同的时间施用多种腺病毒(即，在同时或依次递送一种或多种免疫组合物)。在一些情况下，可将多种腺病毒以“鸡尾酒”给药。当以鸡尾酒给药时，每一种腺病毒都可以表达单种流感抗原，或者一些或全部的腺病毒可表达多种流感抗原。例如，在一种有效的鸡尾酒配方中，表达H5禽HA抗原的腺病毒与表达M2蛋白的腺病毒共同给药。在另一个实施例中，表达H5禽HA抗原和N1禽NA抗原的腺病毒与人流感M2和/或NP蛋白组合给药。在又一个示例性的实施方案中，表达多种禽HA抗原(例如单种HA亚型的变异体，或对应于不同的HA亚型)的第一腺病毒与表达禽或人M2和/或NP蛋白的第二腺病毒一同给药。本领域所属技术人员还可确定各种其他的组合。

在其他实施方案中，腺病毒载体而不是重组腺病毒以核酸(例如，DNA)疫苗的方式向对象给药。

任选，腺病毒或腺病毒载体以免疫原性组合物向对象给药，所述免疫原性组合物除药物可接受载体或赋形剂之外，还包括至少一种其他免疫刺激成分对象。这样的免疫刺激成分包括佐剂，例如MF59和铝佐剂。或者，与涉及天然免疫的受体结合或对其刺激的天然存在或合成的免疫刺激性组合物可与所述腺病毒和/或腺病毒载体共同给药。例如，可将刺激某些Toll样受体(例如TLR7，TLR8和TLR9)的试剂可以与表达流感抗原的腺病毒重组子和/或腺病毒载体组合给药。在一些实施方案中，所述腺病毒或载体与免疫刺激性CpG寡核苷酸组合给药。在其他实施方案中，所述腺病毒或载体与分别表达导致受体活化的Toll样受体和配体的其他腺病毒载体组合给药。

可将本文所述的免疫原性组合物对人或非人(例如，猫，狗，猪，鸟)对象给药，以引起流感特异性免疫应答。例如，如果对象是人对象，那么可以施用包括一种或多种禽流感抗原的人、牛或猪腺病毒重组子(或腺病毒载体)，以引起免疫应答。此外，可利用本文所述的组合物和方法，在禽类对象，包括家禽，例如鸡，鸭，珍珠鸡，火鸡，鹅等中，引起流感特异性免疫应答。此外，可利用本文所述的组合物和方法在非人对象，包括猫，狗，马，非人灵长类，以及其他家养和野生动物中，引起流感特异性免疫应答。

多种给药途径可适合施用本文所述的免疫原性组合物。这些方法包括鼻内、经口腔、经眼睛、静脉内、肌肉内、透皮、皮内和皮下递送所述腺病毒和/或腺病毒载体。在特定的实施方案中，可在饮用水中，通过喷雾或受控滴灌或在孵出前在卵内的方式，将所述免疫原性组合物施用于家禽。

另外的技术细节在下文特定的主题标题之下提供。

术语

除非另有说明，在本文中所使用的全部技术和科学术语都与本公开所属领域普通技术人员所通常理解的意思相同。在分子生物学中常用术语的定义可见于Benjamin Lewin的Genes V，Oxford UniversityPress出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人编著的TheEncyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers编著的MolecularBiology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

除非文中另有明确的说明，单数形式“a”，“an”和“the”都包括了复数的指示物。类似地，除非文中另有明确的说明，单词“或”也意在包括了“和”。还应该进一步理解，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及全部分子量或分子质量值都是近似的，并且是用于描述。尽管与本文所述的相似或等同的方法和材料可被用于本公开的实施和检测，但适当的方法和材料在下文叙述。术语“包含”意味着“包括”。缩略词“e.g.”来自于拉丁文exempli gratia，在本文中用于指示非限制性的示例。因此，缩略词“e.g.”是术语“例如”的同义词。

为了便于研读本公开的各种实施方案，下文中提供了特定术语的解释。

佐剂：用于增强抗原性的介质；例如抗原能够吸附于其上的矿物质的悬液(明矾，氢氧化铝，磷酸铝)；或者油包水乳液，其中抗原溶液被乳化入油(MF-59，弗氏不完全佐剂)，有时还包含已杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步地增强抗原性(抑止抗原的分解和/或引起巨噬细胞的摄入)。

抗原：能够在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括通过注射、吸收或以其它方式导入动物的组合物。术语“抗原”包括全部相关的抗原表位。“抗原性多肽”是能够能够刺激免疫应答例如T细胞应答或抗体反应的多肽。“表位”或“抗原决定簇”是指在抗原上的位点，B和/或T细胞对其发生反应。在一个实施方案中，当表位结合MHC分子存在时，T细胞与所述表位反应。表位可由比邻的氨基酸或由抗原多肽经三级折叠而并列的非比邻氨基酸形成。由比邻氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常能够保留，而由三级折叠形成的表位在以变性溶剂处理后则通常会丧失。表位通常包括至少3个，或更常见地，至少5个，约9个，或约8-10个空间构型唯一的氨基酸。确定表位空间构型的方法包括，例如，X-光晶体学以及多维核磁共振波谱。

流感抗原可以是多态血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)抗原，其选自期望对其产生免疫应答的流感株或共享有抗原表位的相关株。流感抗原还可以是流感内部蛋白，例如PB1，PB2，PA，M1，M2，NP，NS1或NS2蛋白。禽流感抗原是禽流感株的流感抗原。流感抗原的变异体可以是天然存在的变异体或者是工程变异体。用于本文，术语“变异体”是指相对于参考蛋白或相对于其他的变异体而言，具有一个或多个氨基酸改变，例如缺失、插入或取代的蛋白质。

抗体：免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合(免疫应答)抗原的抗原结合位点的分子。天然存在的抗体(例如，IgG，IgM，IgD)包括四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键相互交联。短语“抗体反应”是针对于抗原的免疫应答，涉及分泌对所述抗原具有特异性的抗体。抗体反应是B细胞介导的免疫应答，通过抗原(或表位)与B细胞受体(膜结合IgD)在B细胞表面相互作用而启动。在通过其同源抗原与B细胞受体的刺激物结合之后，B细胞分化为分泌抗原特异性免疫球蛋白从而产生抗体反应的浆细胞。“中和抗体”是这样一种抗体，其与病毒上的表位结合，根据例如噬斑中和分析的测定，抑制感染和/或复制。

动物：活的多细胞脊椎动物有机体，其类别包括，例如，哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括了人和非人哺乳动物。类似地，术语“对象”包括了人和非人对象，包括鸟类和非人哺乳动物，例如非人灵长类，伴侣动物(例如狗和猫)，家畜(例如猪，羊，牛)，以及非驯养动物，例如大猫。术语对象的应用不关乎所述有机体生命周期的阶段。因此，根据所述有机体，术语对象可适用于在子宫中或在卵中的有机体(即，无论所述有机体是哺乳动物或鸟类，例如家禽或野禽)。

cDNA(互补DNA)：缺乏内部的非编码片段(内含子)和确定转录的调节序列的一段DNA。cDNA通常是在实验室中通过从细胞中提取的信使RNA经过反转录合成的。在制备包括编码流感抗原的多核苷酸序列的腺病毒载体的内容中，可通过，例如，对负链流感RNA基因组(或基因组片段)进行反转录或扩增(例如，通过聚合酶链反应，PCR)，来制备cDNA。

宿主细胞：在其中多核苷酸，例如，多核苷酸载体或病毒载体，能够得以扩增且其DNA得以表达的细胞。所述细胞可以是原核或真核的。该术语还包括了所述对象宿主细胞的任意后代。应该理解，所有后代可以与其亲代细胞是不一致的，因为有可能在复制过程中出现了突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括了这样的子代。因此，可将本文所述的腺病毒载体引入宿主细胞，在其中它们的多核苷酸序列(包括编码流感抗原的序列)可以得到表达，例如，从而产生重组腺病毒和/或流感抗原。

免疫应答：免疫系统细胞，例如B细胞，T细胞或单核细胞对于刺激的反应。在一些情况下，所述反应对特定的抗原具有特异性(即，“抗原特异性反应”)。在一些情况下，免疫应答是T细胞应答，例如CD4⁺反应或CD8⁺反应。或者，所述反应是B细胞反应，且导致了特异性抗体的产生。“保护性免疫应答”是这样一种免疫应答，其能够抑制致病性流感病毒的有害功能或活性，降低由致病性流感病毒引起的感染，或降低由致病性有机体引起的感染产生的症状(包括死亡)。可通过，例如，在噬斑降低分析或ELISA-中和分析(NELISA)中抑制病毒复制或噬斑形成，或通过体内测定对病毒攻击的抵抗力，来测定保护性免疫应答。可通过各种免疫分析，例如ELISpot，四聚体标记，细胞毒性分析，来确定细胞介导的免疫应答。

免疫原性组合物：含有至少一种流感病毒(或其他致病性有机体)表位的组合物，其能够诱导可检测的CTL反应，或诱导可检测的B细胞反应(例如，产生特异性结合表位的抗体)。还进一步是指编码流感病毒(或其他病原体)免疫表位的分离的核酸，其能够用于表达所述表位(并因此可用于引起针对这种多肽或由所述病原体表达的相关多肽的免疫应答)。对体外使用而言，所述免疫原性组合物可由分离的核酸、蛋白或肽组成。对体内使用而言，所述免疫原性组合物通常包括在药物可接受载体或赋形剂中能够表达所述免疫表位的核酸或病毒，和/或其他试剂，例如，佐剂。可通过本领域所公知的分析，可以方便地测定免疫多肽(例如流感抗原)、或编码所述多肽的核酸诱导CTL或抗体反应的能力。

内部蛋白：除血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)这两种表面抗原之外，流感的内部蛋白包括由流感基因组编码的全部结构和非结构蛋白。A型流感的内部蛋白是由六个基因组RNA片段编码的，并包括三种被称为PB1、PB2和PA的聚合酶组分；核衣壳蛋白(NP)；基质蛋白(M1)；膜通道蛋白(M2)；以及两种非结构蛋白：NS1和NS2。

分离的：“分离的”生物学成分(例如核酸或蛋白或细胞器)已从天然存在所述成分的有机体的细胞中与其他生物学组分，例如，其他染色体或染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器基本上分离开或纯化出来。被“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括了通过在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸。

可操作连接：当第一核酸序列与第二核酸序列以功能相关的方式进行放置时，则所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是可操作连接的。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子就是可操作连接于所述编码序列的。

多核苷酸：术语多核苷酸或核酸序列是指长度为至少10个碱基的核苷酸聚合形式。重组多核苷酸包括这样的多核苷酸，其并未与两种编码序列立即相连，而所述编码序列在其来源的有机体的天然存在基因组中是与其立即相连的(一种在5’末端而另一种在3’末端)。该术语因而包括重组DNA，其例如整合入载体；整合入自主复制质粒或病毒；或整合入原核生物或真核生物的基因组DNA，或其作为独立于其他序列的分离分子(例如，cDNA)而存在。所述核苷酸可以是核糖核苷酸，脱氧核苷酸，或任一核苷酸的修饰形式。该术语还包括单链和双链形式的DNA或RNA。

多肽：任何氨基酸链，无关乎长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)的，例如蛋白或蛋白的片段或亚序列。术语“肽”通常用来指长度为3-20个氨基酸的氨基酸链。例如，免疫相关肽的长度可为约7-约25个氨基酸，例如，为约8-约10个氨基酸。

预防或治疗疾病：抑制由流感病毒引起的感染是指抑制由于暴露于致病性的流感病毒而引起疾病的完整发展。例如，抑制流感感染是指减轻由所述病毒所引起感染的症状，例如在已知曾暴露于所述病毒的人中预防症状的发展，或在暴露于所述病毒的对象中降低病毒数量或病毒的感染性。“治疗”是指缓解或预防与对象感染病毒相关的疾病或病理症状的征象或症状的治疗性或预防性干预。

启动子：启动子是指导核酸转录的核酸控制序列的排列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子(TATA元件)的情况下。启动子还任选包括与所述转录起始位点相距达数千碱基对的远端增强子或抑制子元件。组成型和诱导型启动子都包括(参见，例如，Bitter等人，Methods in Enzymology 153：516-544，1987)。

可以使用的启动子的具体非限制性示例包括得自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒(例如，巨细胞病毒立即早期基因启动子，逆转录病毒长末端重复；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。还可使用通过重组DNA或合成技术制备的启动子。可向含有启动子序列的表达载体中插入多核苷酸，所述启动子序列能够易化宿主的插入遗传序列的有效转录。所述表达载体通常含有复制起点，启动子，以及允许转化细胞进行表型筛选的特异性核酸序列。

纯化的：术语“纯化的”(例如，就腺病毒载体或重组腺病毒而言)并不需要绝对的纯度；相反，其旨在作为一个相对的术语。因此，例如，纯化的核酸是指这样的核酸，其中所述核酸比在天然环境中细胞内的核酸更加富集。类似地，纯化的肽制剂是这样的肽制剂，其中肽或蛋白比天然环境中细胞内的肽或蛋白更富集。在一个实施方案中，对制剂进行纯化使得特定的成分占总制剂重量或体积的至少50％(例如，但不限于，70％，80％，90％，95％，98％或99％)。

重组子：重组核酸是这样的核酸，其具有非天然存在的序列或具有由两种相互分离的序列片段经过人工组合制成的序列，例如编码融合蛋白的多核苷酸。这种人工组合通常是通过化学合成完成的，或者更常见的，是通过，例如遗传工程技术，对分离的核酸片段进行人工操作制成的。

对象：活的多细胞脊椎动物有机体，其类别包括人和兽类对象，包括人和非人哺乳动物和鸟类。

T细胞：对免疫应答至关重要的血白细胞。T细胞包括，但不限于，CD4⁺细胞和CD8⁺细胞。CD4⁺T淋巴细胞是在其表面上携带有被称为CD4的标记的免疫细胞。这些细胞，也被称为辅助性T细胞，帮助配合免疫应答，包括抗体反应以及杀伤性T细胞应答。CD8⁺T细胞携带有CD8标记，并包括具有细胞毒性或“杀伤”效应功能的T细胞。

转导或转染：转导细胞是通过分子生物学技术向其中引入了核酸分子的细胞。用于本文，术语引入或转导包括可将核酸分子引入到这样的细胞中的全部技术，包括采用病毒载体进行转染，采用质粒载体进行转化，以及通过电穿孔、脂质体转染、以及颗粒枪加速来引入裸露的DNA。

疫苗：疫苗是在对象中引起预防性或治疗性免疫应答的药物组合物。在一些情况下，所述免疫应答是保护性免疫应答。通常，疫苗引起针对病原体抗原的抗原特异性免疫应答。在本公开的内容中，所述疫苗引起针对禽(或大流行性)流感的免疫应答。本文所述的疫苗包括腺病毒载体或重组腺病毒。

载体：引入宿主细胞、由此产生转化宿主细胞的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中进行复制的核酸序列，例如复制原点。载体还可包括一种或多种选择性标记基因以及其他本领域公知的遗传元件。术语载体包括质粒，线性核酸分子，以及通篇所述的腺病毒载体和腺病毒。术语腺病毒载体用在这里是指包括一种或多种腺病毒成分的核酸，其在宿主细胞中复制从而产生(例如，感染性)病毒颗粒。腺病毒包括编码至少一部分所装配的病毒的核酸。因此，在许多情况下，所述术语是可以交替使用的。因此，用于本文，所述术语旨在特定使用，以促进理解，而不是旨在以任何方式限制实施方案。

流感病毒

流感病毒具有片段化的单链(负义或反义)基因组。流感病毒粒子由含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心以及由基质蛋白相连的外侧脂蛋白包膜组成。A型流感的片段化基因组由编码10种多肽的8条线性RNA分子组成。两种多肽，HA和NA包括了针对流感的保护性免疫应答所必需的主要抗原决定簇或表位。根据HA和NA蛋白的抗原特征，可将流感株分类成亚型。例如，根据其HA和NA表型，可将最近在亚洲爆发的禽流感分成H5N1、H7N7和H9N2。已证明这些亚型都在禽类中具有高度传染性并且能够跳过种属屏障从而直接感染人，引起严重的发病率和死亡率。

HA是一种表面糖蛋白，其突出于脂蛋白包膜并介导对细胞的吸附和侵入。HA蛋白的长度为约566个氨基酸，并由基因组片段4约1780碱基的多核苷酸序列编码。从最近以及历史上的禽流感株中分离到的HA(以及其他流感抗原)的多核苷酸和氨基酸序列可以在，例如，GENEBANK

数据库(可从万维网ncbi.nlm.nih.gov/entrez中得到)中找到。例如，最近的禽类H5亚型HA序列包括：AY075033，AY075030，AY818135，AF046097，AF046096和AF046088；最近的H7亚型HA序列包括：AJ704813，AJ704812和Z47199；而最近的禽类H9亚型HA序列包括：AY862606，AY743216和AY664675。本领域所属技术人员应该理解，在本质上任何前述的或新发现的禽类HA抗原都可以被用于本文所述的组合物和方法中。通常，适合的(一或多种)HA序列是根据循环或预测的禽类和/或大流行性HA亚型选择的，例如由世界卫生组织推荐。

除了HA抗原之外，其是中和抗体针对流感的主要靶位，神经氨酸酶(NA)包膜糖蛋白也是针对流感的保护性免疫应答的靶位。NA是由流感基因组片段6的约1410个核苷酸序列编码的约450个氨基酸的蛋白。最近的致病性禽流感株属于N1，N7和N2亚型。示例性的NA多核苷酸和氨基酸序列包括，例如，N1：AY651442，AY651447和AY651483；N7：AY340077，AY340078和AY340079；以及N2：AY664713，AF508892和AF508588。其他的NA抗原可基于循环和/或预测的禽类和/或大流行性NA亚型，从之前所述的或新发现的NA抗原中进行选择。

剩余的流感基因组片段编码的是内部蛋白。尽管使用内部蛋白单独进行免疫并不能产生显著的保护性中和抗体反应，但对于一种或多种内部蛋白的T细胞应答却能够明显地有益于对流感感染进行保护。与多态性HA和NA抗原相比，内部蛋白在株之间，和亚型之间更加高度保守。因此，由暴露于禽类或人流感亚型内部蛋白而引起的T细胞受体，也能够结合于禽类和人亚型的其他可比较的内部蛋白。

PB2是759个氨基酸的多肽，其是组成RNA-依赖的RNA聚合酶复合物的三种蛋白之一。PB2是由流感基因组片段1的约2340个核苷酸编码的。剩余的两种聚合酶蛋白中，PB1，757个氨基酸的多肽，以及PA，716个氨基酸的多肽，是分别由2341个核苷酸序列以及2233个核苷酸序列(片段2和3)编码的。

片段5由1565个核苷酸组成，其编码形成核衣壳的498个氨基酸核蛋白(NP)蛋白。片段7由1027个核苷酸序列组成，编码252个氨基酸的M1蛋白，以及96个氨基酸的M2蛋白，其是从M RNA的剪接变异体翻译而来的。片段8由890个核苷酸序列组成，其编码两种非结构蛋白，NS1和NS2。

在这些蛋白中，M(M1和M2)和NP蛋白最有可能引起保护性的体液和/或细胞T细胞应答。因此，尽管在本文所述的组合物和方法中可以包括任何内部蛋白(例如，在一种或多种禽HA和/或NA抗原以外)，但腺病毒载体和腺病毒通常还可以包括一种或多种M1，M2和/或NP蛋白。当对一种病毒株的内部蛋白产生的反应倾向于与其他流感株的内部蛋白相互反应时，基本上可从任何禽类和/或人株中选择所述内部蛋白。例如，所述内部蛋白可选自禽H5N1，H7N7和/或H9N2株。或者，所述内部蛋白可选自人H3N2，H1N1，和/或H2N2。示例性的内部蛋白多核苷酸和氨基酸序列可以在，例如GENEBAN

中找到。例如，H3N2M和NP核酸和蛋白分别由登记号AF255370和CY000756表示。流感内部蛋白在病毒株之间更为保守，且倾向于引起交叉反应性T细胞应答，该反应有益于针对流感的保护性免疫应答。

本领域所属技术人员应该理解，由上述登记号所指出的特定核酸和蛋白都是非限制性的示例，在本文所公开的腺病毒载体的内容中还会表述众多其他的流感抗原序列。例如，其他的流感抗原，以及编码这些抗原的核酸都与以上所参考的抗原和核酸在一级结构上基本相似。在氨基酸(和多核苷酸)序列之间的相似性可根据序列间的相似性表述，或者可称之为序列一致性。序列一致性通常是以一致性(或相似性)的百分比来进行测定的；百分比越高，这两种序列的一级结构就越相似。一般而言，两条氨基酸序列的一级结构越相似，折叠和组装之后的高级结构就越相似。因此，例如，相同流感亚型的HA抗原通常共有高度的序列一致性。HA抗原(来自于特定亚型)的变异体可具有一个或少数的氨基酸缺失、插入或取代，但却依然共有很高百分数的其氨基酸(和通常是其多核苷酸序列)序列。直到亚型的变异体彼此不同的程度，其总体的抗原性特征依然保留。相反，不同亚型的HA抗原共有的序列一致性较低(例如，在受体结合袋)和/或彼此不同，从而使得其抗原性特征不再一致。

确定序列一致性的方法是本领域所公知的。各种程序和比对算法均记载于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needlemanand Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Higgins和Sharp，Gene 73：237，1988；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151，1989；Corpet等人，NucleicAcids Research 16：10881，1988；以及Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988。Altschul等人，Nature Genet.6：119，1994，提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

可通过若干来源获得NCBIBasic Local Alignment SearchTool(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403，1990)，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)以及互联网，与序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn以及tblastx共同使用。关于如何使用这一程序确定序列一致性的描述可在互联网上在NCBI的网站上获得。

两条核酸之间序列相似性的另一种标记就是杂交能力。两条核酸序列越相似，其能够杂交的条件就越严格。杂交条件的严格性是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。因此，导致特定严格程度的杂交条件会根据所选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组合物和长度而不同。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na⁺和/或Mg⁺⁺浓度)会确定杂交的严格性，虽然洗涤时间也会影响严格性。一般地，在确定的离子强度和pH条件下，可将严格条件选定为比特定序列的热熔温度(T_m)低约5℃-20℃。T_m是靶序列与完全匹配的探针杂交了50％的温度(在确定的离子强度和温度下)。核酸杂交的条件以及严格条件的计算可参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，2001；Tijssen，Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I：Theory and Nucleic Acid Preparation，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Ltd.，NY，NY，1993，以及Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，John Wiley & Sons，Inc.，1999。

出于本公开的目的，“严格的条件”包括在该条件下，仅在如果杂交分子和靶序列之间的错配低于25％的话，才会发生杂交。“严格的条件”可被分解为特定的严谨水平用于更精确的限定。因此，用于本文，“适度严格”条件是在该条件下序列错配超过25％的分子就不能杂交的条件；“中度严格”的条件是在该条件下序列错配超过15％的分子就不能杂交的条件，而“高度严格”条件则是错配超过10％的序列就不能杂交的条件。“非常高度严格”条件是超过6％错配的序列就不能杂交的条件。相反，在“低严格”条件下杂交的核酸分子包括那些序列一致性低得多的分子，或序列一致性仅在于所述核酸的短亚序列。

因此，在文公开的腺病毒载体可包括和/或表达任何的众多流感抗原，例如序列相似的H5、H7和/或H9亚型血凝素抗原(或其他在此讨论抗原)的变异体，正如通过上述序列相似性或杂交检测所测定的那样。

腺病毒载体

术语“腺病毒”用于本文旨在包括全部的腺病毒，包括哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。迄今为止，已经鉴定出了至少47种人血清型的腺病毒(参见，例如，FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第67章(第三版).，Lippincont-Raven Publishers)。腺病毒是大小为约36kb的线性双链DNA病毒。其基因组包括每个末端的反向序列(ITR)，壳体化序列，早期基因和晚期基因。主要的早期基因包含于E1，E2，E3和E4区域中。其中，包含于E1区域中的基因(尤其是E1a和E1b)是病毒复制所必需的。E4和L5区域，举例，涉及病毒传播，且主要的晚期基因包含于L1-L5区域中。例如，人的Ad5腺病毒基因组已经全部测序完成且可在万维网上获得其序列(参见，例如，GENEBANK登记号M73260)。类似地，部分或者在某些情况下全部的不同血清型(Ad2，Ad3，Ad7，Ad12等等)的人和非人腺病毒基因组也都得到了测序。

一旦使用重组腺病毒感染对象(或宿主)，或引入重组腺病毒载体，包含于所述腺病毒基因组中的外源核酸可由宿主细胞RNA聚合酶和翻译系统(machinery)转录，以及翻译。因此，可将编码一种或多种流感抗原的多核苷酸序列整合入腺病毒载体并导入对象的细胞，在那里所述多核苷酸序列转录和翻译，从而产生流感抗原。近来，还可以使用非复制性的腺病毒载体来制备和递送免疫有效的HA1株疫苗(VanKampen等人，Vaccine 23：1029-1036，2005)。在本文所述的组合物和方法的内容中，可使用已建立的分子生物学方法，将编码至少一种禽流感抗原(如上所述，例如H5、H7或H9亚型的血凝素抗原)的多核苷酸序列整合入腺病毒载体中。可采用标准程序来对编码流感抗原的核酸(例如，cDNA)进行操作，例如限制性酶消化，DNA聚合酶补平，通过外切酶进行缺失，通过末端脱氧核苷酸转移酶进行延伸，合成或克隆的DNA序列连接，通过单链噬菌体介导的位点指导性序列改变，或使用特异性的寡核苷酸结合PCR或其他的体外扩增技术。

在生产包括编码一种(或超过一种)流感抗原多核苷酸序列的重组腺病毒载体全过程中，足以指导本领域所属技术人员的示例性方法可见于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Spring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Spring Harbor Laboratory Press，2001；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，1992(and Supplements to 2003)；以及Ausubel等人，ShortProtocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology，第4版，Wiley & Sons，1999。

通常，编码流感抗原的多核苷酸序列可操作地连接于转录控制序列，包括，例如，启动子和多聚腺苷酸信号。启动子是被宿主细胞的转录系统(或引入的合成系统)所识别的多核苷酸序列，其涉及转录的起始。多聚腺苷化信号是指导在mRNA转录体的末端添加一系列核苷酸的多核苷酸序列，对所述转录体进行适当的加工并运输出细胞核进入到细胞质中进行翻译。

本领域中已知的示例性启动子包括病毒启动子，包括巨细胞病毒立即早期基因启动子(“CMV”)、单纯疱疹病毒胸腺苷酸激酶(“tk”)、SV40早期转录单位、多瘤病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒、乙肝病毒、以及人和猿免疫缺陷病毒的启动子。其他的启动子分离自哺乳动物基因，包括免疫球蛋白重链，免疫球蛋白轻链，T-细胞受体，HLA DQα和DQβ，β-干扰素，白介素-2，白介素-2受体，MHC II类，HLA-DRα，β-肌动蛋白，肌肉肌酸激酶，前白蛋白(转甲状腺素蛋白)，弹性蛋白酶I，金属硫蛋白，胶原酶，白蛋白，胎蛋白，β-球蛋白，c-fos，c-HA-ras，胰岛素，神经细胞附着分子(NCAM)，α1-抗胰蛋白酶，H2B(TH2B)组氨酸，I型胶原，葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)，大鼠生长激素，人血清淀粉状蛋白A(SAA)，肌钙蛋白I(TNI)，血小板源生长因子，以及肌养蛋白，树突细胞特异性启动子，例如CD11c，巨噬细胞特异性启动子，例如CD68，朗氏细胞特异性启动子，例如Langerin，以及角化细胞、皮肤和肺的上皮细胞的特异性启动子。

启动子可以是诱导型或组成型的。诱导型的启动子是没有活性或表现出低活性的启动子，除非有诱导物的存在。可被包括作为本发明的一部分的启动子的一些示例包括，但不限于，MT II，MMTV，胶原酶，溶基质蛋白酶，SV40，鼠MX基因，α-2-巨球蛋白，MHC I类基因h-2kb，HSP70，多育曲菌素，肿瘤坏死因子，或促甲状腺激素基因启动子。通常，然而，所述启动子是组成型启动子，其可在缺乏其他因素的条件下，在引入宿主细胞时导致高水平的转录。任选，所述转录控制序列可包括一种或多种增强子元件，其是与一种或多种转录因子结合的结合识别位点，所述转录因子能够将转录增加到超过单独使用基本启动子所观察到的转录。

通常，还希望的是包括多聚腺苷化信号从而能够影响所述基因转录体的适当终止和聚腺苷化。示例性的多聚腺苷化信号已从牛生长激素、SV40以及单纯疱疹病毒腺苷酸激酶基因中分离出来。在本文所述的腺病毒载体的内容中还可以使用任何的这些或其他多聚腺苷酸信号。

通常，编码流感抗原的多核苷酸序列可以是包括翻译起始位点的全长开放阅读框。然而，同样也有可能使用编码所述抗原的免疫原性部分(亚部分)的多核苷酸序列。如果所述多核苷酸序列缺乏翻译起始位点或密码子，则可以在制备所述载体时，在编码抗原亚部分的多核苷酸序列之前的适当位点将其引入。

编码腺病毒的核酸载体是本领域所公知的，并可用于基因治疗和疫苗应用。示例性的腺病毒载体记载于Berkner，BioTechniques6：616-629，1988；Graham，Trend Biotechnol，8：85-87，1990；Graham&Prevec，Vaccines：new approaches to immunological problems，Ellis(ed.)，pp.363-90，Butterworth-Heinemann，Woburn，1992；Mittal等人，Recombinant and Synthetic Vaccines，Talwar等人，(eds)pp.362-366，Springer Verlag，New York，1994；Rasmussen等人，Hum.Gene Ther.16：2587-2599，1999；Hitt&Graham，Adv.Virus Res.55：479-505，2000，公开的美国专利申请2002/0192185，在此将其全文引用作为参考。

一般地，可对载体进行修饰使其成为复制缺陷型，即，不能够在宿主细胞中自主复制，即使除了这样的辅助依赖性腺病毒载体之外，还可以使用条件复制有效和复制有效的腺病毒载体以及病毒。一般地，复制缺陷型病毒的基因组缺少病毒在感染细胞中进行复制所必需的至少一些序列。这些区域可以是被去除(全部或部分)，或是变成了非功能性的，或者为其他序列所取代，且特别是由编码治疗目的分子的序列所取代。通常，所述缺陷型病毒保留了涉及病毒颗粒壳体化的序列。

复制缺陷型腺病毒通常含有突变，例如，缺失，在一个或多个E1(E1a和/或E1b)、E3区域、E2区域和/或E4区域中缺失。除了ITR和包装元件，整个腺病毒基因组也可被缺失，且所得的腺病毒载体被称为辅助依赖的载体或“无活性”载体。在一些情况下，可在缺失的腺病毒序列的位置上插入异源DNA序列(Levrero等人，Gene101：195-202，1991；Ghosh-Choudhury等人，Gene 50：161-171，1986)。其他的构建含有在E1区域和E4区域的非必需部分的缺失(WO94/12649)。示例性的腺病毒载体可见于美国专利6,328,958，6,669,942和6,420,170，在此将其全文引用作为参考。

这些复制缺陷型重组腺病毒可以用不同的方式制备，例如，在能够补充重组腺病毒复制所必需的所有缺陷型功能的感受态细胞系中。例如，可在整合有部分腺病毒基因组的补充细胞系(例如293细胞)中制备腺病毒载体。这样的细胞系含有腺病毒血清型5(Ad5)基因组的左手末端(约11-12％)，所述左手末端包括左手ITR、壳体化区域以及E1区域，所述E1区域包括E1a、E1b以及编码pIX蛋白的部分区域。该系能够反向-互补E1区域缺陷的重组腺病毒。通常，E1补充需要E1A和E1B蛋白的表达。

通常可利用人腺病毒载体将外源核酸导入人和动物细胞和有机体。腺病毒展现出广泛的宿主细胞范围，且腺病毒可被用于感染人以及非人动物，包括鸟类。最常见的，所述人腺病毒载体是得自腺病毒血清型5病毒的HAd5载体。由于完整腺病毒的基因组尺寸大，所以使用穿梭质粒进行异源多核苷酸序列的插入最方便。可将诸如那些流感抗原的序列克隆进入穿梭载体，所述载体随后会与培养细胞中的全部或部分腺病毒基因组进行同源重组。此外，还可以在细菌中进行同源重组，从而产生全长腺病毒载体。

在一些情况下，所希望的是使用非人腺病毒载体以避免预先存在的对于人腺病毒的宿主免疫性。使用人腺病毒进行感染在人群中是很普通的，许多或大多数个体都具有循环抗体滴度，其将结合和中和重组人腺病毒。因此，由于含有所述流感序列载体的中和，在采用人腺病毒载体接种的至少一部分人群中并不会导致有效的针对流感的免疫应答产生。为了避免这个问题，可使用非人腺病毒载体来规避对于人腺病毒预先存在的任何免疫性。

动物来源的腺病毒同样能够有效地感染人，以及非人细胞，而随后的感染通常并不能够在人细胞中传播(参见，国际申请WO94/26914)。因此，动物来源的腺病毒可被用于本文所述的载体和病毒范畴中。使用为人和动物疫苗开发的动物腺病毒载体在Bangari&Mittal，Vaccine24：849-862，2006中进行了详细的讨论，在此将其引用作为参考。例如，动物腺病毒载体可选自犬，牛，鼠(例如：MAV1，等人，Virology 75：81，1990)，羊，猪，禽(例如，鸡)或备选的猿(例如：SAV)腺病毒。例如，牛和猪腺病毒可被用来制备表达流感抗原的腺病毒载体，所述流感抗原包括在参考物ATCC VR-313，314，639-642，768和769下得自ATCC(类型1-8)的各种牛血清型，以及猪腺病毒5359。此外，还可以使用各种血清型的猿腺病毒，包括SAd25，Sad22，SAd23和SAd24，例如在ATCC中参考编号为VR-591-594，941-943，195-203等等的那些，可在ATCC获得的若干禽腺病毒血清型(1-10)，例如病毒株Phelps(ATCC VR-432)，Fontes(ATCC VR-280)，P7-A(ATCC VR-827)，IBH-2A(ATCC VR-828)，J2-A(ATCC VR-829)，T8-A(ATCC VR-830)，K-11(ATCC VR-921)以及参考编号为ATCC VR-831-835的病毒株，以及鼠腺病毒FL(ATCC VR-550)和E20308(ATCC VR-528)，以及绵羊腺病毒类型5(ATCC VR-1343)或类型6(ATCC VR-1340)。

例如，牛和猪腺病毒载体能够感染人细胞，且可被用作载体来表达禽流感抗原。示例性的牛和猪腺病毒载体记载于公布的美国专利申请2002/0192185，以及美国专利6,492,343和6,451,319，在此将其引用作为参考。

本文所述的组合物和方法可适用于任何流感抗原。特别是，所述组合物和方法可用于表达并产生针对禽流感株的免疫应答。例如，在本文中所公开的腺病毒载体、重组腺病毒和免疫组合物可包括任何禽类或大流行流感株的HA抗原。现已鉴定了众多的禽类HA抗原，并且其序列可通过例如使用公众可获得的NCBI数据库(万维网ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi)获得。来自最近禽流感爆发的示例性HA抗原可由AY818135(A/Viet Nam/1203/04)；AF084280(A/HongKong/483/97)；AF036356(A/Hong Kong/156/97)；AY575870(A/HongKong/213/03)所代表。可通过对病毒分离物进行克隆和/或扩增来获得包括这些序列的核酸，或者可以合成制备。类似地，从新出现株或新分离株中分离到的新HA抗原也可以包括在本文所述的组合物中。类似地，可将已知的禽类或新发现禽类株的NA抗原整合到本文所述的载体、病毒和组合物中。任选，所述病毒、载体和/或免疫原性组合物可包括一种或多种禽或非禽类例如人流感株的内部蛋白。

可在将腺病毒载体引入适当的宿主细胞之后，从上述载体制备表达禽类和/或其他流感抗原的重组腺病毒。在复制缺陷型载体的情况下，通常可将所述腺病毒载体引入补充所述缺陷功能的细胞系。例如，由于表达了编码腺病毒E1蛋白的引入核酸，所以可在补充E1功能的细胞系中生长E1缺陷型病毒。示例性的细胞系包括被工程化以表达腺病毒E1(例如E1A)蛋白的人和非人细胞系。例如，表达腺病毒E1蛋白的293细胞就通常被用来生长具有E区域缺失的重组复制缺陷型腺病毒。其他适合的细胞系包括MDBK-221，FBK-34，以及多种来源的胚胎肾细胞。适于生长猪和牛重组腺病毒的细胞系特定示例分别包括FPRT-HE1-5细胞(Bangari&Mittal，Virus Res.105：127-136，2004)和FBRT-HE1细胞(van Olphen等人，Virology，295：108-118，2002)。在某些实施方案中，所述细胞表达超过一种病毒株的腺病毒E1基因，例如2种或更多具有不同种向性的病毒株。例如，所述细胞能够表达人和非人的E1基因(例如，猪和/或牛E1基因)。本领域所属技术人员可以方便地选择或制备补充复制缺陷型腺病毒载体的复制功能的适当的其他或可选择的细胞系。例如，根据所要生长的特定腺病毒载体，可以用任何腺病毒株例如本文公开的示例性病毒株的E1和/或E3基因，转染本文公开的(或本领域公知的)任何各种哺乳动物细胞系。例如，通常可选择对应于(即，得自相同或功能类似的病毒株)相同株的E1(和/或E3)来作为所述腺病毒载体。本领域所属技术人员应该理解，对任何示例性腺病毒基因的功能类似的变异体(例如共有基本序列一致性的变异体，或者，例如，在高度严格条件下特异性杂交的变异体)而言，其都可被用于制备支持编码流感抗原腺病毒载体生长的细胞系。

在Ng等人，Hum.Gene Ther.10：2667-2672，1999和Hum.GeneTher.11：693-699，2000中描述了一种制备整合有外源核酸的复制缺陷型腺病毒载体的常见方法，在此将其全文引用。简言之，为了制备含有流感抗原的人腺病毒载体，可将可操作连结于强启动子(例如CMV立即早期启动子)的编码流感抗原(例如，一种或多种禽HA抗原)的多核苷酸序列插入穿梭载体，例如pDC311中。pDC311穿梭载体是含有3.1kb E1缺失的HAd5(约4kb)的左末端，、在存在有Cre重组酶时适于位点特异性重组的loxP位点和完整的包装信号(ψ)的质粒。可将所述穿梭载体与质粒共转染至表达Cre重组酶(例如，293Cre细胞)的适当细胞中，所述质粒包括缺乏包装信号的复制缺陷型HAd5基因组(例如，在E1和/或E3区域基因中含有缺失)，并含有loxP位点。同源Cre介导的重组导致了腺病毒载体质粒的产生，其编码表达所插入的流感抗原的复制缺陷型腺病毒。

表达补充于复制功能(例如当复制缺陷型腺病毒载体缺乏E1功能时候的E1)的细胞可根据标准程序，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体转染等等，用重组腺病毒载体进行转染，或以以腺病毒进行低传染性感染(例如，介于1-1000p.f.u./细胞)对。在一些情况下，可使用，例如，在60mm培养皿中汇合的单层细胞。随后将所述细胞培养(生长)至足以表达和复制腺病毒的时间段，在收获重组腺病毒之前，将所述细胞分开，以维持活性生长和最大化病毒回收。通常在经过若干次传代之后(例如，2-5代)，通过裂解细胞释放病毒来收集重组子，并随后浓缩所述病毒。可通过将含有所述病毒的裂解物通过密度梯度(例如CsCl密度梯度)，来对重组腺病毒进行浓缩。在浓缩之后，通常利用缓冲液(例如10mM Tris pH 8.0，2mM MgCl₂，5％蔗糖)对所述重组腺病毒进行透析，滴定并保存于-80℃直至使用。以较大规模制备腺病毒的方法，例如，适于制备用作疫苗的免疫原性组合物的方法可见于，例如，公布的美国专利申请20030008375，将其引用在此作为参考。

从腺病毒载体制备重组流感病毒抗原

除了利用它们制备包含能够表达禽流感抗原的腺病毒载体核酸和/或腺病毒的免疫组合物之外，本文所公开的腺病毒载体还可用于制备和生产重组流感抗原，例如得自高致病性禽流感株的重组HA抗原以及其他流感抗原。使用人和非人腺病毒载体制备重组抗原的方法是本领域所公知的，示例性的组合物和方法可见于，例如，美国专利5,824,770，6,319,716和6,824,770，在此将其全文引用。此外，可使用商业可获得的载体，例如来自Stratagene(La Jolla，CA)的ADEASY^TM腺病毒载体系统，来制备能够表达重组流感蛋白的腺病毒载体和腺病毒重组子(重组腺病毒)。

如上所述，所述腺病毒载体含有在所述腺病毒载体E1和/或E3基因区域的位置上编码一种或多种禽流感病毒抗原的异源多核苷酸序列。任选，可通过所述异源核酸编码两种、或甚至于三种或更多种流感抗原。相反，含有免疫原性表位的流感抗原片段可通过插入于腺病毒载体的多核苷酸序列来编码。通常，编码所述流感抗原的多核苷酸序列可操作地连结于能够制备高水平表达的转录调节序列(例如，启动子和/或增强子元件，和/或多聚腺苷化序列)。在哺乳动物细胞中提供成功表达外源基因的多种真核启动子和多聚腺苷化序列，以及如何构建表达盒，都是本领域所公知的，例如可见于美国专利5,151,267，其公开内容引用在此作为参考。可对选择启动子从而给出免疫蛋白的最佳表达，所述免疫蛋白随后令人满意地导致了如公知标准所述的体液、细胞介导的以及粘膜的免疫应答。

任选，编码流感抗原的多核苷酸包括编码肽(例如，表位)或多肽标签的部分，从而易化所述重组抗原后续的纯化。通常，所述流感抗原作为融合蛋白进行表达，其中所述流感抗原被连接于易化表达和/或纯化的一种或多种肽(或多肽)结构域。多种适当的标签都是本领域所公知的，而包括这类标签的表达蛋白可方便地使用商业可获得的试剂和试剂盒进行分离。如果需要的话，在所述重组抗原被用于后续的应用之前，可将所述标签，例如通过酶或化学切割，从抗原上去除。示例性的标签包括Mys表位标签、组氨酸标签以及GST标签。

可在引入了编码补充E1区域(和/或E2区域)表达盒的细胞系中，表达含有一种或多种流感病毒抗原的重组腺病毒载体。这些重组细胞系能够使得重组腺病毒(具有被编码一种或多种流感抗原或其片段的异源核苷酸序列所取代的E1基因区域缺失)复制和表达由所述重组腺病毒编码的所需外源基因或片段。任选，这样的细胞系可包括对应于超过一种腺病毒株的E1(和/或E2)基因。例如，适当的细胞系包括了那些含有表达人腺病毒的E1以及例如猪或牛腺病毒株的E1的核酸的细胞系。

为了用于药物组合物中，重组流感抗原通常在培养细胞中表达之后进行纯化。培养细胞中表达的重组蛋白的分离方法是本领域所公知的，而具体的方法可见于Sambrook等人，(In Molecular Cloning：ALaboratory Manual，CSHL，New York，2001)和Brent等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，2003)。本领域所属技术人员应该理解，可用众多方法来纯化重组多肽，且这些蛋白纯化的典型方法可用于从腺病毒载体中纯化所表达的流感抗原。这样的方法包括，例如，包括离子交换的蛋白层析，凝胶过滤，HPLC，单克隆抗体亲和层析以及在制备之后对不溶性蛋白包含体进行纯化。此外，还可基于所附着的标签(如上所述)，例如6-组氨酸序列进行纯化，所述标签可重组融合于所述蛋白，并用于使用镍亲和柱(例如，(镍-氨三乙酸(Ni-NTA))金属亲和层析基质(QIAexpressionist，QIAGEN，1997)来易化多肽纯化。

如果需要的话，可将所述重组流感抗原轭合于疫苗载体用于对对象给药。疫苗载体是本领域所公知的：例如，牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)钥孔血兰蛋白(KLH)，以及轮状病毒VP6。在一些情况下，一种或多种佐剂，例如明矾，可与所述重组流感抗原组合用于对对象给药，如下文所述。

含有腺病毒载体和重组腺病毒的免疫原性组合物

表达流感抗原(例如，禽流感抗原)的重组腺病毒载体和重组腺病毒可在体外、先体外后体内或在体内向细胞或对象给药。一般地，所希望的是制备载体和病毒作为适合预期应用的药物组合物。因此，本文包括了制备含有如上所述腺病毒载体或腺病毒的药剂或药物组合物的方法。通常，制备药物组合物(药剂)需要制备基本上不含有热原以及能够对人或动物造成伤害的任何其他杂质的药物组合物。通常，所述药物组合物含有适当的盐和缓冲液，从而使得所述组合物的成分稳定并允许靶细胞摄取核酸或病毒。

药物(例如，免疫原性)组合物通常都包括分散于(例如，溶解或悬浮于)药物可接受载体或赋形剂中的有效量腺病毒载体或病毒。短语“药物可接受的”或“药理可接受的”是指当给药于人或动物对象时，不会产生不良的、过敏的或其他不希望的反应的分子实体和组合物。多种药物可接受的载体和/或药物可接受的赋形剂都是本领域所公知的，并可见于，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，由E.W.Martin，Mack Publishing Co.出版，Easton，PA，第15版(1975)。

一般而言，所述载体的性质依赖于拟采用的特定给药模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的液体，其包括药物和生理可接受的液体，例如水，生理盐水，平衡的盐溶液，水性右旋糖，甘油或其他等等作为载体。对固体组合物(例如，粉剂，丸剂，片剂，或胶囊形式)而言，常规的非毒性固体载体可包括，例如，药物级甘露醇，乳糖，淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体，拟给药的药物组合物还可包括少量的无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，防腐剂，和pH缓冲剂等等，例如，乙酸钠或失水山梨醇单月桂酸酯。

用于本文，“药物可接受的载体”包括任何和所有的溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等等。这些用于药物活性物质的介质和试剂的使用是本领域所公知的。除了任何与所述活性成分不相容的常规介质或试剂外，其在免疫组合物中的使用是预期中的。补充性的活性成分也可以整合于所述组合物中。例如，某些药物组合物可包括在水中，与适当表面活性剂例如羟丙基纤维素混合的载体或病毒。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和油中制备分散体。在常规的保存和使用条件下，这些制剂都含有防腐剂以防止微生物的生长。

所制备的所述药物组合物(药剂)可用于预防给药方案(例如，疫苗)并施用于人或非人对象(包括鸟类，例如家禽，例如，鸡，鸭，珍珠鸡，火鸡和鹅)，以引起针对流感抗原(或多种流感抗原)的免疫应答。因此，所述药物组合物通常含有免疫有效量的腺病毒载体或腺病毒(或确实是由本文公开的表达腺病毒载体而产生的重组流感抗原)。免疫有效量的，例如，疫苗组合物，是当施用一剂或多剂时，能够在免疫活性对象中引起所希望的免疫应答，例如保护性免疫应答的足够量。通常，可在暴露于(即，预防性地)感染剂(例如流感病毒)之前，向对象施用一剂或多剂免疫有效量的疫苗，从而引起针对所述感染剂的保护性免疫应答。在本说明书中，可向对象施用一剂或多剂含有禽流感抗原(和/或由表达这样的腺病毒制备的重组流感抗原)的腺病毒载体和/或腺病毒，从而引起针对禽和/或大流行性流感的保护性反应。

在一些情况下，所述组合物可在感染之后给药，以增强免疫应答，在这样的应用中，所述药物组合物可以治疗有效量给药。治疗有效量是用于在对象中达到所需效果的量。例如，其可以是抑制病毒复制或防止或可检测到的改变病毒感染外在症状的组合物的量。当向对象给药时，常用的剂量是能够达到靶组织浓度(例如，在淋巴细胞中)，所述浓度表现出达到了体外或体内效果。

例如，本文所述的组合物可向人(或非人)对象给药，从而引起针对禽流感病毒例如致病性H5N1、H7N7或H9N2禽流感病毒株的免疫应答。一般地，本文所述的腺病毒载体和/或腺病毒引起针对至少一种禽(大流行)流感株或亚型的保护性或部分保护性免疫应答。即，本文所述的药物组合物通常能够预防流感，或能够在后来暴露于致病性病毒株之后，在至少一大部分给药所述组合物的群体中降低症状(例如，发病率和/或死亡率)的严重程度。在一些情况下，所述免疫应答对针对多种病毒株，或甚至于禽(或大流行)流感的多种亚型，包括对人和非人受试者(包括鸟类)的给药而言都是保护性的或部分保护性的。

通常，针对流感的保护性免疫应答都涉及制备与HA抗原结合的中和抗体。因为这些抗原都是高度多态的，而针对一种亚型而产生的抗体通常不能够对另一种流感亚型具有保护性，所以本文所述的免疫原性药物组合物可以包括表达超过一种HA抗原的腺病毒载体或腺病毒，例如，通过一种或多种载体或病毒。如前所述，所述HA抗原可以是单种亚型或超过一种HA亚型的变异体。任选，还可以施用表达NA抗原的腺病毒(或编码NA抗原的载体)。

针对流感抗原的T-细胞反应扩宽了针对流感的免疫应答，增加了疫苗效力。内部蛋白，例如A型流感的M2和NP蛋白拥有适合的B-细胞和/或T-细胞表位，而当与抗原性多肽例如HA和NA抗原组合给药时，引起T细胞应答，增强保护且有助于降低由于流感感染所引起的发病率。此外，这样的内部蛋白表位在流感亚型中是高度保守的，提供了针对多种禽和人流感株的交叉保护。因此，可以使用包括一种或多种表达禽流感内部蛋白的腺病毒载体或腺病毒的药物组合物来引起流感特异性免疫应答。

可以通过任何常见的方式给药包括表达流感抗原(包括禽流感抗原)的重组腺病毒的治疗性组合物，只要靶组织(通常是，呼吸道)能够接受那种途径。这包括口服，鼻内，眼睛，颊膜，或其他粘膜(例如，直肠，阴道)或局部给药。或者，可通过原位，皮内，皮下，肌肉，腹膜内的，或静脉注射途径给药。这样的免疫原性组合物通常作为包括生理性可接受的载体、缓冲液或其他赋形剂的药物可接受组合物进行给药。

所述免疫原性组合物还可以用液体溶液或悬液的可注射组合物形式给药；还可以制备在注射之前适合于液体的溶液或悬液的固体形式。还可将这些制剂乳化。适合于这样目的的典型组合物包括药物可接受的载体。例如，所述组合物可含在每毫升磷酸缓冲盐水中含有约100mg人血清白蛋白。其他药物可接受的载体包括水溶液，无毒赋形剂，包括盐，防腐剂，缓冲液以及可以使用的其它等等。非水溶性溶剂的示例有丙二醇，聚乙二醇，植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性载体包括水，乙醇/水溶液，盐水溶液，肠胃外介质，例如氯化钠，林格右旋糖(Ringer′s dextrose)等。静脉介质包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体。可根据公知的参数对所述药物组合物中各种成分的pH和确切的浓度进行调节。

还有其他的适于口服给药的制剂。口服制剂可包括赋形剂，例如药物纯的甘露糖，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等等。所述组合物(药剂)通常采用溶液、悬液、气溶胶或粉末的形式。示例性的制剂可见于美国专利公布20020031527，在此将其公开全文引用作为参考。当所述途径是局部时，所述形式可以是乳膏，药膏，油膏或喷雾。本文所述的腺病毒载体和腺病毒的肌肉、鼻内和局部给药的示例性方法可见于，例如，USPN 6,716,823，在此将其引用作为参考。

任选，所述药物组合物或药剂可包括适合的佐剂，从而增强针对流感抗原的免疫应答。用于本文，“佐剂”是免疫应答的任何增效剂或增强剂。术语“适合于”是指包括可与腺病毒载体或腺病毒组合使用以增强免疫应答而在接种的对象中不产生不良反应的任何物质。特定佐剂的有效量可被方便地确定，从而优化所述佐剂对于已接种对象的免疫应答的增强效果。例如，0.5％-5％(例如，2％)氢氧化铝(或磷酸铝)和MF-59油乳液(0.5％聚山梨酸酯80和0.5％去水山梨糖醇三油酸酯。角鲨烯(5.0％)水性乳液)是非常适合用于流感疫苗的佐剂。其他的佐剂包括矿物油、植物油或鱼油与水的乳液，不完全弗氏佐剂，大肠杆菌(E.coli)J5，硫酸右旋糖苷，氧化铁，藻酸钠，Bacto-佐剂，某些合成性聚合物，例如Carbopol(BF Goodrich Company，Cleveland，Ohio)，聚氨基酸和氨基酸共聚物，皂角苷，角叉菜胶，REGRESSIN(Vetrepharm，Athens，Ga.)，AVRIDINE(N，N-双十八基-N′，N′-双(2-羟乙基)-丙二胺)，分布有O-乙酰化基团的长链多分散性β(1，4)连接的甘露聚糖聚合物(例如，ACEMANNAN)，得自非致病性分支杆菌种类株的脱蛋白高度纯化的细胞壁提取物(例如，EQUIMUNE，VetrepharmResearch Inc.，Athens Ga.)，甘露醇单油酸酯，石蜡油和胞壁酰二肽。适合的佐剂可由本领域所述技术人员进行选择。

可根据预期的目标，例如对人或非人对象的接种，来确定有效量的免疫组合物。适合的剂量会根据所述对象的特征(例如对象是人或非人，年龄，重量，和关于所述对象条件或状态的其他健康考虑)，给药的模式、途径，剂量数，以及是否所述药物组合物包括核酸或病毒而改变。一般地，可出于引起针对流感抗原(或多种抗原)或流感病毒的免疫应答的目的，来施用本文所述的免疫原性组合物。因此，所述剂量通常是重组腺病毒的免疫有效量。

表达流感抗原的重组腺病毒的典型剂量可从10p.f.u.-10¹⁵ p.f.u./给药。例如，药物组合物可在单一剂量中包括约100p.f.u.重组腺病毒，例如约1000p.f.u.，约10,000p.f.u.，或约100,000p.f.u.的每种重组腺病毒。任选，药物组合物每次给药可包括至少约一百万p.f.u.或更高。例如，在一些情况下，希望施用约10⁷，10⁸，10⁹，或10¹⁰p.f.u.的表达特定流感抗原的重组腺病毒。在一些情况下，例如，当施用单种腺病毒时，可向对象施用较高剂量的病毒，例如，在施用表达多种流感抗原的重组病毒时。或者，当施用若干种腺病毒，每种都表达不同的流感抗原时，可以施用较少的每种病毒，尽管总的病毒剂量仍然可高达10⁸，或高于10⁹，或10¹⁰p.f.u.。

此外，还可以施用腺病毒载体(核酸载体)。例如，当施用包括有编码流感抗原的腺病毒载体的核酸疫苗时，还可包括核酸摄入和/或表达的易化剂，例如布比卡因、心脏毒素和蔗糖，以及转染易化介质，例如可常规用于递送核酸分子的脂质体或脂质制剂。阴离子和中性脂质体是可广泛获得地并公知用于递送核酸分子(参见，例如，Liposomes：APractical Approach，RPC New Ed.，IRL Press，1990)。阳离子脂制剂也是公知的可用于递送核酸分子的介质。适合的脂质制剂包括DOTMA(N-[1-(2，3-二油烯基氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)，以商品名LIPOFECTIN

获得，以及DOTAP(1，2-二(油烯基氧)-3-(三甲铵)丙烷)，参见，例如Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416，1987；Malone等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6077-6081，1989；美国专利5,283,185和5,527,928，以及国际申请WO 90/11092、WO 91/15501和WO 95/26356。这些阳离子脂质可优选与中性脂质共同使用，例如DOPE(二油烯基磷脂酰乙醇胺)组合使用。可向上述脂质或脂质体制剂中加入的其它转染易化组合物包括精胺衍生物(参见，例如国际公布WO 93/18759)和膜渗透化合物，例如GALA，短杆菌肽S和阳离子胆汁盐(参见，例如，国际公布WO 93/19768)。

或者，可对编码禽流感病毒基因的核酸(腺病毒载体)用微粒载体包囊、吸附、或缔合。适合的微粒载体包括得自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的载体，以及得自聚(交酯)和聚(交酯-共-乙交酯)的PLG微颗粒。参见，例如，Jeffery等人，Pharm.Res.10：362-368，1993。还可以使用其他颗粒体系和聚合物，例如，聚合物，如聚赖氨酸，聚精氨酸，聚鸟氨酸，精胺，亚精胺，以及这些分子的轭合物。

所配制的疫苗组合物因此通常包括发动免疫应答的有效量的含有腺病毒的多核苷酸(例如，质粒)，所述腺病毒包括编码禽流感抗原的多核苷酸序列。本领域所属技术人员可方便地确定适当的有效量。这样的量可落在可通过常规实验所确定的相对宽的范围内。例如，可使用少至1μg DNA来获得免疫应答，而在其他的给药中，可使用高至2mg的DNA。一般预期有效剂量的含有基因组片段的多核苷酸落在约10μg-1mg的范围内，然而，高于和低于这个范围也有可能是有效的。

可使用多种本领域公知的技术向载体颗粒(例如，核心载体)上包被腺病毒载体核酸。载体颗粒选自具有密度适当的材料，所述密度在通常从适当的颗粒介导递送装置用于在细胞内递送的粒度范围内。最适的载体粒度，当然，是依赖于靶细胞的直径。或者，可使用胶体金颗粒，其中所述包被的胶体金可被施用(例如，注射)入组织(例如，皮肤或肌肉)并随后被免疫感受态细胞所摄取。

可以使用钨，金，铂和铱载体颗粒。钨和金颗粒是优选的。平均粒径0.5-2.0μm的钨颗粒容易获得。虽然这样的颗粒具有用于颗粒加速递送方法的最适密度，并允许采用DNA进行较高效率的包被，但是钨对某些细胞类型可能具有潜在毒性。还发现金颗粒或微晶体金(例如，金粉A1570，得自Engelhard Corp.，East Newark，N.J.)也可用于本发明。金颗粒提供了均一的尺寸(从Alpha Chemicals获得，粒度1-3μm，或得自Degussa，South Plainfield，N.J.，粒度范围包括0.95μm)以及降低的毒性。

对于向金或钨颗粒上包被或沉淀DNA或RNA，有多种方法都是公知的并已经作了描述。大多数这样的方法通常都会将预定量的金或钨与质粒DNA、CaCl₂和亚精胺组合。在包衣过程中持续对所得溶液进行涡旋，从而确保了反应混合物的均一性。在所述核酸沉淀之后，可将所包被的颗粒转移到适合的膜上并使其在使用前干燥，包被于样本模块或盒的表面，或负载至用于适合颗粒递送装置例如基因枪的递送盒中。或者，核酸疫苗可通过粘膜或通过皮肤，例如使用透皮贴给药。这样的贴可包括湿润剂、化学剂和其他组分，其能够破坏皮肤完整性，使所述核酸进入对象细胞。

除了通常以非特异性方式，例如通过抗原的浓缩或缓慢扩散，增效或增强免疫应答的佐剂，遗传免疫刺激剂可与腺病毒载体或腺病毒一起包括在所述药物组合物中，从而增强抗禽流感免疫应答。例如，当与抗原一同给药时，已显示某些CpG寡核苷酸(例如5’-tccatgagcttcctgatcct-3’(SEQ ID NO：1)；5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’(SEQID NO：2)和5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’(SEQ ID NO：3)是有效的免疫刺激分子。示例性的CpG寡核苷酸可见于美国专利6,610,661；6,589,940和6,514,948，出于全部目的在此将其公开文本引用。含有CpG的寡核苷酸与Toll样受体(例如TLR 7和TLR 9)相互作用，并导致产生加强抗病毒免疫应答的干扰素γ(INF-γ)。

此外，某些TLR表达较低的对象(例如，老年对象)可受益于细胞中TLR(例如TLR5，TLR7和TLR9)的共表达，所述细胞中表达了表达所述流感抗原的腺病毒载体或腺病毒。因此，含有TLR的腺病毒载体颗包含于上述的药物组合物中。TLR可整合入编码所述流感抗原的相同腺病毒载体中，或可包含于所述药物组合物(药剂)中作为分离的腺病毒载体或病毒。任选，TLR及其配体(例如，CpG寡核苷酸，鞭毛蛋白)一同包含在药物组合物中。

在某些实施方案中，可将所述药物(例如，疫苗组合物)向禽类对象给药，例如家禽，包括但不限于，鸡，鸭，火鸡和鹅。所述药物组合物施用于雏鸟和/或成鸟和/或卵中的胚胎。用于家禽业中给药疫苗组合物的方法是本领域所公知的，且任何这样的方法均适合施用免疫组合物，例如本文所公开的含有禽流感抗原的腺病毒。例如，可在饮水中向家禽施用基于流感疫苗的腺病毒。各种方法都可用于在家禽饮水中施用疫苗。在一个方便的方法中，可将含有免疫组合物的溶液放置于静脉溶液袋(例如，得自Merial，Inc.，Lyon，France的SELECT FIELDBAG BOOST^TM体系)中，其可连接于一条或多条饮水器线。任选，溶液含有染料(或其他视觉可察觉的指示剂，例如脱脂奶粉)和稀释剂，用于易化监测疫苗的给药。在基于腺病毒疫苗的情况下，重要的是所述溶液没有消毒剂，例如氯或可用于清洁所述递送系统的其他消毒剂。如果需要的话，可以刺激禽类的饮水积极性，从而增加所述疫苗/水溶液的消耗。例如，通过增加光强度，递送食物和/或扰乱禽类(例如，通过走过禽群)，可刺激鸟类增加负载有疫苗的饮水消耗。

在另一种方法中，所述疫苗组合物可通过喷雾给药。通常可对笼养于共用空间的许多禽类进行喷雾应用，例如，可对运输箱里的1日龄禽类，或对常规笼养的禽类进行喷雾给药。例如，可使用喷雾递送系统对新孵出的禽类进行疫苗接种，如美国专利6,713,073、4,674,490和4,449,968所述，在此将其公开文本引用作为参考。在一个示例性的方法中，可将装于运输箱中多至约150个对象的1日龄禽类群暴露于稀释于水性介质例如水的疫苗，通过喷嘴方法递送，其形成了非常小的液滴(例如，约100μ-约500μ直径范围)。1日龄禽类可通过眼睛、鼻内、以及来自容器表面和其他禽类的口服途径来摄取疫苗。疫苗可通过喷雾给药递送给较大的禽类，例如使用加压喷射装置或受控液滴施用装置。加压喷射装置通常包括压力室、喷枪和喷嘴。喷嘴和操作压力可发生变化，从而改变粒度，其通常在约10μ-约1000μ的范围内。液滴或是从喷嘴喷射通过呼吸或通过眼睛或口服途径直接与禽类接触，或与通过喷雾装置沉积在地面或其他禽类上的疫苗间接接触。用于疫苗组合物喷雾给药的装置是容易获得的，其示例性的装置公开于，例如，美国专利5,312,353和4,863,443，在此将其公开内容引用作为参考。开发用于园艺和昆虫控制用途的受控液滴施用装置也可被用于向家禽递送基于腺病毒的疫苗。在这样的装置中，当稀释的疫苗被递送至旋转盘时可通过离心力产生喷雾，其形成了具有适于通过呼吸摄取的大小范围的雾状疫苗喷雾。这种雾状疫苗可通过风扇的方式进行分布，其比加压喷射装置所达到的疫苗分布区域更广。这种方法提供了需要相对少量稀释液(例如，水)的附加优势。例如，用约1升的疫苗溶液可对多至30,000只禽类进行免疫接种。

还可采用更有创性和/或费力的方法，将本文所公开的免疫原性组合物施用于家禽，除了上述公开的方法之外，还包括：滴眼，穿刺和划痕(例如，在翅内侧或足中通过皮下方式)，注射和卵内给药。适合向家禽递送所公开疫苗的自动化和半自动化注射装置可见于，例如，美国专利4,681,565和4,515,590，在此将其公开文本引用作为参考。

含有禽流感抗原的腺病毒卵内给药同样可良好地用于在家禽中引起针对流感的保护性免疫应答。卵内给药通常涉及在免疫能力发育的适当孵化阶段，在出雏之前，向卵内注射含有一种或多种禽流感病毒抗原的免疫有效量腺病毒。例如，鸡蛋通常是在孵化17.5-19天之间进行注射。所计算的体积为基本上不破坏蛋的完整性，且通常为0.01-0.1ml(例如，0.05ml)的范围。通常，会在蛋壳上穿一个小孔，从中插入注射针以递送所述免疫组合物。注射可以手动进行，或根据制造商的指导使用商业可获得的自动化装置(例如可得自Embrex，TrianglePark，N.C.)辅助进行。向适于施用本文公开的疫苗组合物的禽蛋进行卵内溶液给药的方法和装置可见于美国专利4,903,635，5,056,464，5,136,979，5,699,751，5,900,929，6,032,612，6,244,214和6,981,470，在此将其公开的全文引用作为参考。

实施例

实施例1：制备表达禽类血凝素(HA)抗原的腺病毒载体

可使用同源重组来制备表达禽类H5血凝素(HA)抗原的示例性腺病毒载体。可使用Ng等人(Human Gene Therapy 10：2667-2672，1999)的Cre重组酶介导的位点专一性重组系统来制备包括禽类HA抗原的HAd5载体。为了制备表达H5N1流感株HA抗原的HAd5 E1插入载体，可将处于巨细胞病毒立即早期启动子(“CMV”启动子)控制之下的A/Hong Kong/156/97株的HA基因插入穿梭载体(pDC311)的Stu I位点。pDC311穿梭载体是含有具有3.1kb E1缺失的HAd5(4kb)的左末端、在存在Cre重组酶条件下用于进行位点专一性重组的loxP位点、以及完整包装信号(ψ)的质粒。将所得载体pDC311-H5与pBHGloxΔE1，3Cre共转染入293Cre(表达Cre重组酶的293细胞)。pBHGloxΔE1，3Cre质粒含有除了E1和E3区域基因中的包装信号和缺失以外的几乎整个HAd5基因组。该质粒还包括了适用于Cre重组酶介导重组的loxP位点。当被一同引入293Cre细胞时，Cre介导的两种质粒之间的重组产生了载体HAd5-HA(图1A)。

通过Western杂交对细胞提取物的分析说明，所引入的禽类HA抗原得到表达(图1B)。

实施例2：HAd-H5免疫的动物中的免疫原性和保护效力

为了证明表达禽类HA的重组腺病毒的免疫原性，可使用重组腺病毒接种小鼠并使用致死量的禽流感病毒攻击。以每组5只动物将25只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠分成5组。在第1天和28天对所述动物肌肉接种PBS，15μg不含明矾的重组H5(杆状病毒中表达的禽类H5N1流感病毒的血凝素)(只有H5)，15μg含有明矾的H5(H5+明矾)，10⁸p.f.u.的HAd-ΔE1F3(HAd5对照载体)，或10⁸p.f.u.的HAd-H5(表达H5的HAd5载体)。在21和49天收集血清样本，通过ELISA和微中和分析来监测H5-特异性免疫应答的发展。在70天使用100LD₅₀的H5N1(A/Hong Kong/483/97)病毒攻击动物，并每天监测体重的增加或损失以及明显的流感感染临床征象。

HAd5-H5的单次接种在21天时引起了超过3.5 log的H5特异性IgG ELISA滴度，证明了由HAd5-H5表达的H5具有高度的免疫原性。在49天收集血清样本，通过病毒中和分析来监测H5N1病毒中和抗体反应的发展。使用HAd5-H5免疫小鼠引起的H5N1特异性中和抗体反应与使用高剂量H5+明矾所获得的反应相类似(表1)。

使用HAd5-H5免疫的小鼠在经过致病性H5N1病毒的攻击之后，可对致病和致死具有完全的保护。在70天使用100LD₅₀的H5N1(A/HK/483/97)病毒攻击所述动物。所述保护水平要好于用高剂量重组H5+明矾所观察到的水平(表1和图2)。在攻击之后，HAd5-H5组中没有小鼠表现出任何可观察到的不适。

表1：用HAd5-H5HA疫苗免疫的小鼠中的血清学反应

组别	几何平均马HI滴度	几何平均中和滴度	存活率
组别	几何平均马HI滴度	几何平均中和滴度	存活率	PBS	25	20	0
HAd-5(10⁸p.f.u.)i.m.	25	20	0	PBS	25	20	0
HAd-5(10⁸p.f.u.)i.m.	25	20	0	HAd-H5HA(10⁸p.f.u.)i.m.	696.4	2228	100
rH5HA+明矾i.m.	696.4	2228	100	HAd-H5HA(10⁸p.f.u.)i.m.	696.4	2228	100
rH5HA+明矾i.m.	696.4	2228	100	rH5HA i.m.	37.9	60	80

实施例3：鼻内施用HAd5-HA引起的保护性免疫应答

HAd5-H5HA载体引起HA特异性抗体反应的能力，可在肌肉和鼻内给药之后进行测定。将三组15只(6-至8-周龄)雌性BALB/c小鼠随机分成3组(5只动物/组)并在0和28天肌肉接种10⁸p.f.u.的HAd-ΔE1E3或肌肉或鼻内给药10⁸p.f.u.的HAd-H5HA。在21和49天收集血清，使用马红细胞通过凝血抑制(HI)分析来监测针对A/HK/483/97、A/HK/213/03和A/VN/1203/04株的H5特异性免疫应答的发展。ELISA说明肌肉或鼻内施用HAd5-H5HA引起了强HA抗体滴度，如表2所示。

表2：针对由HAd5-HA疫苗诱导的同源和近期H5株的滴度

类似地，用1x10⁸p.f.u.的HAd-H5HA对病毒中和分析BALB/c小鼠(20只/组)进行间隔4周的两次肌肉或鼻内免疫。其他组的小鼠(20只/组)用10⁸p.f.u.的HAd-ΔE1E3或3μg有明矾的rH5HA进行肌肉免疫。在第二次免疫之后4周采得血清样本，并通过病毒中和分析进行分析从而评估其与同源病毒(HK/156/97)、或与抗原异源病毒(A/HongKong/213/2003[HK/213/03]和A/Vietnam/1203/04[VN/1203/04])进行反应的能力。与HK/156/97比较，在血凝素亚单位中的氨基酸同源性对HK213/03而言为94.8％，而对VN/1203/04而言为95.5％。示例性的结果如图3所示。用rH5HA+明矾免疫的小鼠表现出针对同源HK/156/97病毒的病毒中和抗体滴度高，但却不能够中和K/213/03或VN/1203/04病毒。相反，用HAd-H5HA免疫的小鼠产生了针对同源和异源病毒的中和抗体，表明了针对HK/156/97的中和抗体滴度较高和针对异源HK/213/03或VN/1203/04病毒的滴度较低。

实施例4：用HAd5-H5接种引起HA特异性T细胞应答

为了评估HAd-H5HA疫苗是否诱导HA-特异性CD8⁺T细胞应答，用肌肉或鼻内施用10⁸p.f.u.HAd-ΔE1E3或10⁸p.f.u.HAd-H5HA来免疫BALB/c小鼠，并通过用针对免疫显性HA518(HA_518-526)表位的Kd-特异性五聚体染色(最早记载用于H1N1病毒，A/Puerto Rico/8/34的HA)，来评估针对流感表位的脾T细胞应答。所述表位在H5N1病毒中是广泛保守的，包括目前传播的禽类和人H5N1病毒，以及更多样的病毒，例如H9N2株。相比于用HAd-ΔE1E3免疫的小鼠，鼻内或肌肉接受HAd-H5HA载体的小鼠具有高出至少3-8倍频率的HA特异性CD8⁺T细胞(图4)。在用HAd-H5HA疫苗免疫的动物中，没有观察到NP-147(NP_147-155)表位特异性CD8⁺T细胞的可检测增加。相反，用H5N1病毒感染的对照小鼠却表现出了强烈的NP147表位特异性CD8⁺T细胞应答。在用HAd-ΔE1E3或rH5HA+明矾接种的小鼠中没有一只表现出了HA 518表位特异性CD8⁺T细胞的频率升高。

通过用10μg/ml指定的肽(包括MHC I类结合表位：NP 147和HA462和HA 518，其在H5N3感染动物中表现为主要表位)脉冲的协同性γ-辐射的脾细胞对1x10⁶脾细胞进行刺激，来确定表位特异性T细胞应答。PMA+离子霉素用作阳性对照。通过ELISpot分析评价IFN-γ的产生，如图5所示。用HAd5-H5接种引起针对HA的I类MHC结合表位的HA特异性T细胞应答。这种T细胞应答在用重组H5+明矾接种的动物中是观察不到的。

实施例5：用HAd5-H5HA接种产生针对致死攻击的保护

使同源病毒株和最近的禽流感株来刺激通过肌肉或鼻内给药途径接种HAd5-H5HA的动物。在接种之后，可用100 LD₅₀A/HK/156/97或A/VN/1203/04病毒株攻击小鼠。如表3所示，接受使用同源病毒或不同的H5N1病毒株的致死攻击之后，所有接种的动物依然存活。

表3：HAd-5H5HA提供了针对致死攻击的保护

实施例6：用A/HK/483/97或A/VN/1203/04病毒攻击动物的发病率

为了评估针对用H5N1变异株攻击的保护效力，用HK/483/97、HK/213/03或VN/1203/04病毒来攻击用HAd-H5HA免疫的小鼠。与烈性HK/483/97和VN/1203/04株不同，HK/213/03病毒对小鼠不是高度致死性的。因此，为了评估针对HK/213/03的疫苗效力，可在攻击后4天在感染了HK/213/03的动物中测定肺中的病毒滴度。HAd-H5HA鼻内或肌肉接种的小鼠表现出了最低的发病率，并在用HK/483/97病毒攻击之后提供了针对死亡的完全保护(图6A和B)。正如由体重减少测定，在使用更近期的H5N1病毒，VN/1203/04进行致命攻击之后，任一接种途径接种HAd-H5HA的全部小鼠都存活并表现出了最低的发病率(图6C和D)。此外，任一接种途径接种HAd-H5HA并以HK/213/03病毒攻击的小鼠，在感染之后4天肺中没有可检测到的病毒(图6E)，而用对照载体HAd--ΔE1E3接种的小鼠则具有高于10⁶EID₅₀/ml的平均肺病毒滴度(p＜0.001)。因此，HAd-H5HA疫苗诱导了针对异源H5N1病毒的明显保护，甚至是在存在低水平交叉中和血清抗体滴度的时候。

这些数据确证了基于Ad载体来递送禽流感抗原作为大流行性流感疫苗的潜力。这样的载体诱导了强烈的体液和细胞免疫并无需佐剂产生针对连续发展的H5N1病毒的交叉保护。

实施例7：表达H5N1流感病毒HA的非人载体的制备和表征

可通过同源重组在大肠杆菌BJ5183中制备含有E1和E3区域缺失以及含有或不含有E1插入的非人腺病毒(猪腺病毒3型，PAd3或牛腺病毒3型，BAd3)完整基因组的感染性克隆。将侧翼带有CMV启动子的H5N1的HA基因，以及牛生长激素BGH聚腺苷化信号克隆入pDS2((Bangari&Mittal，Virus Research 105：127-136，2004)的Avr II位点，从而获得pDS2-H5。在大肠杆菌BJ5183中使用同源重组，如vanOlphen&Mittal，J.Virol.Methods 77：125-129，1999所述，至于牛腺病毒，可通过使用缺失E3的PAd3基因组DNA和Stu I线性化的pDS2-H5共转染大肠杆菌来制备pPAd-H5(在猪腺病毒的E1A基因区域插入有禽类HA的基因组质粒)。

为了从PAd3载体制备H5N1流感的HA，根据制造商的推荐使用LIPOFECTIN

介导的转染，用PacI-消化的pPAd-H5(5μg/60-mm培养皿)转染FPRT HE1-5细胞(如Bangari&Mittal，Virus Res.105：127-136，2004所述的表达E1的猪细胞系)的单层培养物。可在转染后2-3周观察到重组病毒诱导的细胞病变效应。

正如Western印迹所证明的(图7B)，含有插入于PAd3基因组(图7A)早期区域1(E1)中的H5N1病毒(HK/156/97)HA基因的全长编码区域的复制缺陷型重组PAd3载体(PAd-H5HA)，可在FPRT HE1-5细胞中有效地表达(图7B)。具有E1和E3区域缺失的PAd(PAd-ΔE1E3)作为阴性对照。

类似地，含有插入于BAd3基因组(图7C)早期区域1(E1)中的H5N1病毒(HK/156/97)HA基因全长编码区域的复制缺陷型重组BAd3载体(BAd-H5HA)，可在表达BAd3 E1(van Olphen等人，Virology295：108-118，2002)的FBRT HE1细胞中有效地表达，如图7D所示。具有E1和E3区域缺失的Bad3(BAd-ΔE1E3)作为阴性对照。

这些非人腺病毒载体适合作为疫苗载体，其可施用于人和非人对象，从而引起对禽类(和其他)流感株特异的保护性免疫应答。

实施例8：用于表达腺病毒载体的细胞系

制备表达具有不同种向性(人和非人)的腺病毒载体E1抗原的新细胞系。这样的多功能细胞系对于从多种病毒株中的病毒所对应的重组载体中优化制备复制缺陷型腺病毒，从而制备腺病毒和/或重组蛋白，是特别有利的。

基于之前所述的在牛或猪细胞中表达HAd5 E1基因的细胞系，制备了两种示例性的多功能细胞系。FBRT-HE1是表达人腺病毒株HAd5的E1基因(SEQ ID NO：4)的胎牛肾细胞系。FBRT-HE1细胞系的构建与分离披露于van Olphen等人，(Virology 295：108-118，2002)，在此将其引用作为参考。简言之，用含有HAd5 E1(其中HAd5 E1处于PGK启动子的控制之下)的质粒转染初级胎牛肾(FBRT)细胞。分离到多个G418抗性克隆，并通过Western印迹检测E1B-19kDa蛋白的表达。通过免疫沉淀法，对表达E1B-10kDa的细胞系进一步检测E1A、E1B-19kDa和E1B-55kDa的表达。命名为FBRT-HE1的代表性细胞系，表达全部三种E1蛋白：E1A，E1B-19kDa和E1B-55kDa。所述FBRT-HE1细胞系支持E1缺失的人腺病毒载体以及E1缺失的牛腺病毒载体的生长。

为了制备多功能的细胞系，使用BAd E1-F(ccatgaagtacctggtcctc；SEQ ID NO：5)和BAd E1-R(ccccacctatttatacccctc；SEQ ID NO：6)引物组扩增含有BAd3 E1(604-3148)的片段。可将含有BAd3 E1基因(SEQ IDNO：7)的PCR片段在EcoR V位点克隆入pPGK-puro以及在KpnI-XbaI位点克隆入pCMV-puro，从而分别获得pPGK-BE1和pCMV-BE1。然后使用Lipofectin(Life Technologies)，使用这些质粒转染FBRT-HE1细胞。转染48小时之后，将所述细胞生长于含有3μg/ml嘌呤霉素的选择培养基中。在约30天抗生素筛选之后，在pPGK-BE1或pCMV-BE1转染的FBRT-HE1细胞中可见到分离(discreet)的细胞克隆。挑取24个克隆(pPGK-BE1和pCMV-BE1转染细胞中各12个克隆)，使用特异性引物组(表4)，通过RT-PCR扩增和筛选全部三种BAd3 E1转录物(E1A，E1B-1和E1B-2)的表达，从而鉴定表达了全部三种BAd E1转录物的克隆。图8A所示的FBRT-HE1/PE1细胞克隆说明了全部三种BAdE1基因都在PGK启动子下表达。

表4：用于牛E1转录物进行RT-PCR的引物

基因	引物序列(5’至3’)
基因	引物序列(5’至3’)	BAd E1A(正)	CTGATATCATGAAGTACCTGGCCTC(SEQ ID NO：8)
BAd E1A(反)	ATGCAATGGTAGGTTTGG(SEQ ID NO：9)	BAd E1A(正)	CTGATATCATGAAGTACCTGGCCTC(SEQ ID NO：8)
BAd E1A(反)	ATGCAATGGTAGGTTTGG(SEQ ID NO：9)	BAd E1B-1(正)	GATATCATGGATCACTTAAGCGTTC(SEQ ID NO：10)
BAd E1B-1(反)	GTCGACAACTGATGTGCTCGAAACG(SEQ ID NO：11)	BAd E1B-1(正)	GATATCATGGATCACTTAAGCGTTC(SEQ ID NO：10)
BAd E1B-1(反)	GTCGACAACTGATGTGCTCGAAACG(SEQ ID NO：11)	BAd E1B-2(正)	GATATCGTTCAAGATCACCCAGAG(SEQ ID NO：12)
BAd E1B-2(反)	GTCGACCACTTTTAATCCTGCTC(SEQ ID NO：13)	BAd E1B-2(正)	GATATCGTTCAAGATCACCCAGAG(SEQ ID NO：12)

类似地，可通过向表达HAd5 E1的细胞系中引入猪腺病毒E1(PAd3 E1)，制备多功能的猪细胞。FPRT-HE1-5是组成型表达HAd5E1(SEQ ID NO：4)的胎猪肾细胞系。FPRT-HE1-5的制备公开于Bangari&Mittal(Virus Res.105：127-136，2004)，在此将其引用作为参考。简言之，用含有处于巨细胞病毒(CMV)立即早期或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子控制之下的HAd5 E1的质粒转染初级胎猪肾(FPRT)细胞。对用处于CMV或PGK启动子控制之下的HAd5 E1序列转染所得的转化细胞系进行选择，和进一步表征。FPRT-HE1-5是有效表达全部三种E1基因的示例性细胞系，并可用于制备和生长E1缺失的猪和人腺病毒载体。

以下述方式构建用于转染进入FPRT-HE1-5细胞的PAd3质粒。用来自pBABE-puro(Addgene)的嘌呤霉素ORF替换pcDNA3.1(Invitrogen)中的新霉素ORF，从而获得了质粒pCMV-puro。用来自pGT-N28(NewEngland Biolabs)的PGK启动子替换质粒pcDNA3.1-puro中的CMV启动子序列，从而获得了质粒pPGK-puro。用PAdE1-F(TGGATCCTCGACATGGCGAACAGACTT；SEQ ID NO：14)和PAd E1-R(TCTCGAGTCATCCTCAGTCATCGTCATCG；SEQ IDNO：15)引物组扩增含有PAd3 E1(526-3259)的片段。将包括PAd3 E1基因(SEQ ID NO：16)编码序列的所得PCR产物随后克隆至pPGK-puro或pCMV-puro的BamHI-XhoI位点，从而分别获得了pPGK-PE1和pCMV-PE1。

然后使用Lipofectin(Life Technologies)，用这些质粒转染FPRT-HE1细胞系。转染48小时后，将所述细胞生长于含有2μg/ml嘌呤霉素的选择培养基中。在pPGK-PE1和pCMV-PE1转染的FPRT-HE1细胞中，在约30天抗生素筛选之后，可见到分离的细胞克隆。挑取24个克隆(pPGK-PE1和pCMV-PE1转染细胞各12个克隆)，使用特异性引物组(表5)，通过RT-PCR扩增和筛选全部三种PAd3 E1转录物(E1A，E1B-1和E1B-2)的表达。来自pPGK-PE1转染细胞和pCMV-PE1转染细胞的多个克隆被发现对于表达了全部三种PAd E1转录物是阳性。图8B所示的FBRT-HE1/PE1细胞克隆说明了处于PGK启动子下E1的表达。

表5：猪E1转录物进行RT-PCR的引物

基因	引物序列(5’至3’)
基因	引物序列(5’至3’)	PAd E1A(正)	AGGTGGAGGTGATTGTGACTGA(SEQ ID NO：17)
PAd E1A(反)	GACGCAAGAGGAAGTACTGCTA(SEQ ID NO：18)	PAd E1A(正)	AGGTGGAGGTGATTGTGACTGA(SEQ ID NO：17)
PAd E1A(反)	GACGCAAGAGGAAGTACTGCTA(SEQ ID NO：18)	PAd E1B-1(正)	CTGGCCAAGCTTACTAACGTGAAC(SEQ ID NO：19)
PAd E1B-1(反)	TTTAAGTCTTCTGGTGCCGCCA(SEQ ID NO：20)	PAd E1B-1(正)	CTGGCCAAGCTTACTAACGTGAAC(SEQ ID NO：19)
PAd E1B-1(反)	TTTAAGTCTTCTGGTGCCGCCA(SEQ ID NO：20)	PAd E1B-2(正)	ATGCATGAGCGCTACAGCTTTG(SEQ ID NO：21)
PAd E1B-2(反)	CTGAGTTCCGCAAGAATGTGCT(SEQ ID NO：22)	PAd E1B-2(正)	ATGCATGAGCGCTACAGCTTTG(SEQ ID NO：21)

实施例9：表达多种流感抗原的腺病毒载体

腺病毒载体整合了多种(多个)流感抗原而制备。可利用Ng等人(Human Gene Therapy 10：2667-2672，1999)的Cre重组酶介导的位点专一性重组系统来制备含有两种或更多种流感抗原的HAd5载体。为了制备表达多种流感抗原的HAd5 E1插入载体，可将编码所选定抗原的多核苷酸序列在启动子例如巨细胞立即早期启动子(“CMV启动子”)的控制之下克隆，并插入，例如在穿梭载体的Stu I位点。所述穿梭载体，例如pDC311，包括Cre重组酶存在下用于位点特异性重组的loxP位点，以及完整的包装信号(ψ)。将所得载体与pBHGloxΔE1，3Cre共转染入293 Cre(表达Cre重组酶的293细胞)。所述pBHGloxΔE1，3Cre质粒含有除包装信号以及E1和E3区域基因缺失之外的几乎完整的HAd5基因组。该质粒还含有用于Cre重组酶介导重组的loxP位点。当被一起引入293 Cre细胞时，Cre介导的两种质粒之间的重组产生了包括编码所选定流感抗原多核苷酸序列的载体。任选，可使用这种方法来整合编码增强免疫功能的其他多肽的多核苷酸序列，例如上述TLR。示例性的流感抗原组合在表6提供。在表6中所给出的示例性组合可理解为举例说明性的。其他的抗原组合可由本领域所属技术人员确定。类似地，可使用非人腺病毒载体(例如，PAd3或BAd3)来制备表达如表6提供的示例性流感抗原组合的各种重组子。

表6：在多抗原腺病毒载体中示例性的抗原组合

示例性组合	血凝素(HA)	神经氨酸酶(NA)	内部蛋白(s)
示例性组合	血凝素(HA)	神经氨酸酶(NA)	内部蛋白(s)	1	H5	N1	(-)
2	H7	N7	(-)	1	H5	N1	(-)
2	H7	N7	(-)	3	H9	N2	(-)
4	H5	N1	M^*	3	H9	N2	(-)
4	H5	N1	M^*	5	H7	N7	M
6	H9	N2	M	5	H7	N7	M
6	H9	N2	M	7	H5	N1	NP
8	H7	N7	NP	7	H5	N1	NP
8	H7	N7	NP	9	H9	N2	NP
10	H5	N1	M+NP	9	H9	N2	NP
10	H5	N1	M+NP	11	H7	N7	M+NP
12	H9	N2	M+NP	11	H7	N7	M+NP
12	H9	N2	M+NP	13	H5	N1	NS1
14	H7	N7	NS1	13	H5	N1	NS1
14	H7	N7	NS1	15	H9	N2	NS1
16	H5		M	15	H9	N2	NS1
16	H5		M	17	H5		NP
18	H5		M+NP	17	H5		NP
18	H5		M+NP	19	H7		M
20	H7		NP	19	H7		M
20	H7		NP	21	H7		M+NP
22	H9		M	21	H7		M+NP
22	H9		M	23	H9		NP
24	H9		M+NP	23	H9		NP
24	H9		M+NP	25	H5¹+H5²+H5³
26	H5¹+H5²+H5³	N1		25	H5¹+H5²+H5³
26	H5¹+H5²+H5³	N1		27	H5¹+H5²+H5³		M
28	H5¹+H5²+H5³		NP	27	H5¹+H5²+H5³		M

29	H5¹+H5²+H5³		M
29	H5¹+H5²+H5³		M	30	H5¹+H5²+H5³	N1	NP
31	H5¹+H5²+H5³	N1	M+NP	30	H5¹+H5²+H5³	N1	NP
31	H5¹+H5²+H5³	N1	M+NP	32	H5+H7+H9
33	H5+H7+H9	N1		32	H5+H7+H9
33	H5+H7+H9	N1		34	H5+H7+H9		M
35	H5+H7+H9		NP	34	H5+H7+H9		M
35	H5+H7+H9		NP	36	H5+H7+H9		M
37	H5+H7+H9	N1	NP	36	H5+H7+H9		M
37	H5+H7+H9	N1	NP	38	H5+H7+H9	N1	M+NP

上标是指变异体。

^*M是指M1，M2或M1和M2二者。

考虑到本公开发明的原理可用于许多可能的实施方案，应该意识到，所述说明性的实施方案只是本发明的优选实施例而不应该被认为是对本发明范围的限制。更确切的是，本发明的范围是由所附权利要求所限定的。因此我们主张我们的本发明整体都在这些权利要求的范围和精神之内。

序列表

<110>美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心

(Government of the United States of America，as representedby the Secretary of the Department of Health and Human Services，Centers for Disease Control and Prevention)普渡(大学)研究基金(Purdue Research Foundation)

<120>抗大流行性流感病毒株的疫苗

(VACCINE AGAINST PANDEMIC STRAINS OF INFLUENZA VIRUSES)

<130>SCT075063-66

<140>PCT/US2006/013384

<141>2006-04-10

<150>60/670,826

<151>2005-04-11

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>immunostimulatory oligonucleotide

<400>1

tccatgagct tcctgatcct 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>immunostimulatory oligonucleotide

<400>2

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>immunostimulatory oligonucleotide

<400>3

tgactgtgaa cgttcgagat ga 22

<210>4

<211>2950

<212>DNA

<213>Human adenovirus type 5

<400>4

atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60

gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120

cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180

gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240

ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300

cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360

gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420

gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480

cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540

atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600

tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660

ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720

gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780

ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840

agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900

gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960

tgagctgtaa acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc 1020

ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc 1080

atggcgtgtt aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg 1140

ttacatctga cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact 1200

tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc 1260

aggcaaagtt agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga 1320

aatcctgtgg tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga 1380

aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt 1440

tgagttttat aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg 1500

attttctggc catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt 1560

tgtcttccgt ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag 1620

ccaggcggcg gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg 1680

aatgaatgtt gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac 1740

agaggatggg caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga 1800

ggaggctagg aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt 1860

tcaacagatc aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat 1920

agagcagctg accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt 1980

atatgcaaag gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat 2040

caggaattgt tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag 2100

ggtggccttt agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt 2160

ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa 2220

taccaacctt atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc 2280

ctggaccgat gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340

tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat 2400

cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat 2460

gctagtgaaa agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag 2520

ggcctctcag atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt 2580

agccagccac tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc 2640

cttgcatttg ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac 2700

taagatattg cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat 2760

gaccatgaag atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt gcagaccctg 2820

cgagtgtggc ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct 2880

gaggcccgat cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga 2940

tacagattga 2950

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>5

ccatgaagta cctggtcctc 20

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>6

ccccacctat ttatacccct c 21

<210>7

<211>2507

<212>DNA

<213>Bovine adenovirus type 3

<400>7

atgaagtacc tggtcctcgt tctcaacgac ggcatgagtc gaattgaaaa agctctcctg 60

tgcagcgatg gtgaggtgga tttagagtgt catgaggtac ttcccccttc tcccgcgcct 120

gtccccgctt ctgtgtcacc cgtgaggagt cctcctcctc tgtctccggt gtttcctccg 180

tctccgccag ccccgcttgt gaatccagag gcgagttcgc tgctgcagca gtatcggaga 240

gagctgttag agaggagcct gctccgaacg gccgaaggtc agcagcgtgc agtgtgtcca 300

tgtgagcggt tgcccgtgga agaggatgag tgtctgaatg ccgtaaattt gctgtttcct 360

gatccctggc taaatgcagc tgaaaatggg ggtgatattt ttaagtctcc ggctatgtct 420

ccagaaccgt ggatagattt gtctagctac gatagcgatg tagaagaggt gactagtcac 480

ttttttctgg attgccctga agaccccagt cgggagtgtt catcttgtgg gtttcatcag 540

gctcaaagcg gaattccagg cattatgtgc agtttgtgct acatgcgcca aacctaccat 600

tgcatctata gtaagtacat tctgtaaaag aacatcttgg tgatttctag gtattgttta 660

gggattaact gggtggagtg atcttaatcc ggcataacca aatacatgtt ttcacaggtc 720

cagtttctga agaggaaatg tgagtcatgt tgactttggc gcgcaagagg aaatgtgagt 780

catgttgact ttggcgcgcc ctacggtgac tttaaagcaa tttgaggatc acttttttgt 840

tagtcgctat aaagtagtca cggagtcttc atggatcact taagcgttct tttggatttg 900

aagctgcttc gctctatcgt agcgggggct tcaaatcgca ctggagtgtg gaagaggcgg 960

ctgtggctgg gacgcctgac tcaactggtc catgatacct gcgtagagaa cgagagcata 1020

tttctcaatt ctctgccagg gaatgaagct tttttaaggt tgcttcggag cggctatttt 1080

gaagtgtttg acgtgtttgt ggtgcctgag ctgcatctgg acactccggg tcgagtggtc 1140

gccgctcttg ctctgctggt gttcatcctc aacgatttag acgctaattc tgcttcttca 1200

ggctttgatt caggttttct cgtggaccgt ctctgcgtgc cgctatggct gaaggccagg 1260

gcgttcaaga tcacccagag ctccaggagc acttcgcagc cttcctcgtc gcccgacaag 1320

acgacccaga ctaccagcca gtagacgggg acagcccacc ccgggctagc ctggaggagg 1380

ctgaacagag cagcactcgt ttcgagcaca tcagttaccg agacgtggtg gatgacttca 1440

atagatgcca tgatgttttt tatgagaggt acagttttga ggacataaag agctacgagg 1500

ctttgcctga ggacaatttg gagcagctca tagctatgca tgctaaaatc aagctgctgc 1560

ccggtcggga gtatgagttg actcaacctt tgaacataac atcttgcgcc tatgtgctcg 1620

gaaatggggc tactattagg gtaacagggg aagcctcccc ggctattaga gtgggggcca 1680

tggccgtggg tccgtgtgta acaggaatga ctggggtgac ttttgtgaat tgtaggtttg 1740

agagagagtc aacaattagg gggtccctga tacgagcttc aactcacgtg ctgtttcatg 1800

gctgttattt tatgggaatt atgggcactt gtattgaggt gggggcggga gcttacattc 1860

ggggttgtga gtttgtgggc tgttaccggg gaatctgttc tacttctaac agagatatta 1920

aggtgaggca gtgcaacttt gacaaatgct tactgggtat tacttgtaag ggggactatc 1980

gtctttcggg aaatgtgtgt tctgagactt tctgctttgc tcatttagag ggagagggtt 2040

tggttaaaaa caacacagtc aagtccccta gtcgctggac cagcgagtct ggcttttcca 2100

tgataacttg tgcagacggc agggttacgc ctttgggttc cctccacatt gtgggcaacc 2160

gttgtaggcg ttggccaacc atgcagggga atgtgtttat catgtctaaa ctgtatctgg 2220

gcaacagaat agggactgta gccctgcccc agtgtgcttt ctacaagtcc agcatttgtt 2280

tggaggagag ggcgacaaac aagctggtct tggcttgtgc ttttgagaat aatgtactgg 2340

tgtacaaagt gctgagacgg gagagtccct caaccgtgaa aatgtgtgtt tgtgggactt 2400

ctcattatgc aaagcctttg acactggcaa ttatttcttc agatattcgg gctaatcgat 2460

acatgtacac tgtggactca acagagttca cttctgacga ggattaa 2507

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>8

ctgatatcat gaagtacctg gcctc 25

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>9

atgcaatggt aggtttgg 18

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>10

gatatcatgg atcacttaag cgttc 25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>11

gtcgacaact gatgtgctcg aaacg 25

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>12

gatatcgttc aagatcaccc agag 24

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>13

gtcgaccact tttaatcctg ctc 23

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>14

tggatcctcg acatggcgaa cagactt 27

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>15

tctcgagtca tcctcagtca tcgtcatcg 29

<210>16

<211>2722

<212>DNA

<213>Porcine adenovirus 3

<400>16

atggcgaaca gacttcacct ggactgggac ggaaaccccg aggtggtgcc ggtgctggaa 60

tgggacccgg tggatctgcg cgacccctct ccgggggatg agggcttctg tgagccgtgc 120

tgggagagtc tggtcgatgg actgccggac gagtggctgg acagtgtgga cgaggtggag 180

gtgattgtga ctgagggggg tgagtcagag gacagtggtg ggagtgccgc tggtgactca 240

ggtggctctc agggggtctt tgagatggac cccccagaag agggggacag taatgaggag 300

gatatcagcg cggtggctgc ggaggtgctg tctgaactgg ctgatgtggt gtttgaggac 360

ccacttgcgc caccctctcc gtttgtgttg gactgccccg aggtacctgg tgtgaactgc 420

cgctcttgtg attaccatcg ctttcactcc aaggacccca atctgaagtg cagtctgtgc 480

tacatgaggg atgcatgcct ttgctgtcta tggtgagtgt ttttggacat ttgtgggatt 540

atgtggaaaa aaaggaaaaa gtgcttgtaa gaaatctcat gtgctatttc ccattttttg 600

tctttttaga agctgtttct ccagcacctc acaggtcggg ttccccggga cttggagacc 660

tgccaggacg caagaggaag tactgctatg actcatgcag cgaacaacct ttggacctgt 720

ctatgaagcg cccccgcgat taatcattaa cctcaataaa cagcatgtga tgatgactga 780

ttgtctgtgt ctctgcctat atataccctt gtggtttgca gggaagggat gtggtgactg 840

agctattcct cagcatcatc atcgctctgc ttttttctac tgcaggctat ttcttgctag 900

ctcgctgtcc cttttctttt tctgtgggca tggactatca acttctggcc aagcttacta 960

acgtgaacta ccttaggaag gtgatagtac aggggtctca gaactgccct tggtggaaaa 1020

agattttttc ggacaggttt atcaaggtag tagcagaggc caggaggcag tacgggcaag 1080

agttgattga gatttttgtg gagggtgaga ggggctttgg tcctgagttc ctgcgggaag 1140

ggggactgta cgaagaggcc gttctgaaag agttggattt cagcaccttg ggacgcaccg 1200

tagctagtgt ggctctggtc tgcttcattt ttgagaagct tcagaagcac agcgggtgga 1260

ctgacgaggg tattttaagt cttctggtgc cgccactatg ttccctgctg gaggcgcgaa 1320

tgatggcgga gcaggtgcgg caggggctgt gcatcatcag gatgccgagc gcggagcggg 1380

agatgctgtt gcccagtggg tcatccggca gtggcagcgg ggccgggatg cgggaccagg 1440

tggtgcccaa gcgcccgcgg gagcaggaag aggaggagga ggacgaggat gggatggaag 1500

cgagcgggcg caggctcgaa gggccggatc tggtttagat cgccgccggc ccgggggagc 1560

gggtggagag gggagcgggg aggaggcggg ggggtcttcc atggttagct atcagcaggt 1620

gctttctgag tatctggaga gtcctctgga gatgcatgag cgctacagct ttgagcagat 1680

taggccctat atgcttcagc cgggggatga tctgggggag atgatagccc agcacgccaa 1740

ggtggagttg cagccgggca cggtgtacga gctgaggcgc ccgatcacca tccgcagcat 1800

gtgttacatc atcgggaacg gggccaagat caagattcgg gggaattaca cggagtacat 1860

caacatagag ccgcgtaacc acatgtgttc cattgcgggc atgtggtcgg tgactatcac 1920

ggatgtggtt tttgatcggg agctaccggc ccggggtggt ctgattttag ccaacacgca 1980

cttcatcctg cacggctgca acttcctggg ctttctgggc tcggtaataa cggcgaacgc 2040

cgggggggtg gtgcggggat gctacttttt cgcctgctac aaggcgcttg accaccgggg 2100

gcggctgtgg ctgacggtga acgagaacac gtttgaaaag tgtgtgtacg cggtggtctc 2160

tgcggggcgt tgcaggatca agtacaactc ctccctgtcc accttctgct tcttgcacat 2220

gagctatacg ggcaagatag tggggaacag catcatgagc ccttacacgt tcagcgacga 2280

cccctacgtg gacctggtgt gctgccagag cgggatggtg atgcccctga gcacggtgca 2340

catcgctccc tcgtctcgcc tgccctaccc tgagttccgc aagaatgtgc tcctccgcag 2400

caccatgttt gtgggcggcc gcctgggcag cttcagcccc agccgctgct cctacagcta 2460

cagctccctg gtggtggacg agcagtccta ccggggtctg agtgtgacct gctgcttcga 2520

tcagacctgt gagatgtaca agctgctgca gtgtacggag gcggacgaga tggagacgga 2580

tacctctcag cagtacgcct gcctgtgcgg ggacaatcac ccctggccgc aggtgcggca 2640

gatgaaagtg acagacgcgc tgcgggcccc ccggtccctg gtgagctgca actgggggga 2700

gttcagcgat gacgatgact ga 2722

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>17

aggtggaggt gattgtgact ga 22

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>18

gacgcaagag gaagtactgc ta 22

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>19

ctggccaagc ttactaacgt gaac 24

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>20

tttaagtctt ctggtgccgc ca 22

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>21

atgcatgagc gctacagctt tg 22

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>oligonucleotide primer

<400>22

ctgagttccg caagaatgtg ct 22

Claims

1.重组腺病毒载体，包括编码禽流感株至少一种抗原的多核苷酸序列。

2.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述多核苷酸序列编码禽流感HA抗原。

3.权利要求2的重组腺病毒载体，其中所述多核苷酸序列编码多种禽流感HA抗原。

4.权利要求3的重组腺病毒载体，其中所述多核苷酸序列编码相同HA抗原亚型的多种变异体。

5.权利要求3的重组腺病毒载体，其中所述多核苷酸序列编码不同HA亚型的多种HA抗原。

6.权利要求1的重组腺病毒载体，其中至少一种多核苷酸序列编码禽流感NA抗原。

7.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述禽流感抗原是H5N1株抗原，H7N7株抗原或H9N2株抗原。

8.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述多核苷酸序列编码多种流感抗原。

9.权利要求8的重组腺病毒载体，其中所述多核苷酸序列编码至少一种流感内部蛋白。

10.权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述流感内部蛋白是M1蛋白，M2蛋白，NP蛋白，PB1蛋白，PB2蛋白，以及NS1蛋白，和NS2蛋白，或其组合。

11.权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述流感内部蛋白是M1蛋白，M2蛋白，NP蛋白，或其二种或更多种的组合。

12.权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述内部蛋白是非禽流感株的内部蛋白。

13.权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述内部蛋白是H1N1、H2N2或H3N2流感株的内部蛋白。

14.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述腺病毒载体是人腺病毒载体。

15.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述腺病毒载体是非人腺病毒载体。

16.权利要求15的重组腺病毒载体，其中所述非人腺病毒载体是猪腺病毒载体，牛腺病毒载体，犬腺病毒载体，鼠腺病毒载体，绵羊腺病毒载体，禽腺病毒载体或猿腺病毒载体。

17.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。

18.权利要求17的重组腺病毒载体，其中所述复制缺陷型腺病毒包括在E1区域基因和E3区域基因的至少一个中的突变。

19.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述腺病毒载体包括复制缺陷型人腺病毒载体，其包括编码禽流感株的HA、NA抗原、或HA抗原和NA抗原二者以及另一流感株的M1蛋白、M2蛋白、NP蛋白、或两种或多种M1蛋白、M2蛋白和NP蛋白组合的多核苷酸序列。

20.权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述腺病毒载体包括复制缺陷型猪或牛腺病毒载体，其包括编码禽流感株的HA、NA抗原，或HA抗原和NA抗原二者以及另一流感株的M1蛋白、M2蛋白、NP蛋白、或M1蛋白、M2蛋白和NP蛋白的两种或多种组合的多核苷酸序列。

21.包括至少一种禽流感株抗原的重组腺病毒。

22.权利要求21的重组腺病毒，包括禽HA抗原和禽NA抗原的至少一种。

23.权利要求22的重组腺病毒，包括多种HA抗原。

24.权利要求23的重组腺病毒，其中所述腺病毒含有相同HA抗原亚型的多种变异体。

25.权利要求23的重组腺病毒，其中所述腺病毒含有不同HA亚型的多种HA抗原。

26.权利要求23的重组腺病毒，包括多种流感抗原。

27.权利要求26的重组腺病毒，其中所述多种流感抗原含有至少一种流感内部蛋白。

28.权利要求27的重组腺病毒，其中所述至少一种流感内部蛋白来自与禽流感抗原不同的株。

29.权利要求27的重组腺病毒，其中所述至少一种流感内部蛋白含有NP蛋白和M蛋白的一种或多种。

30.权利要求21的重组腺病毒，其中所述腺病毒是人腺病毒。

31.权利要求21的重组腺病毒，其中所述腺病毒是非人腺病毒。

32.权利要求31的重组腺病毒，其中所述非人腺病毒是猪腺病毒，牛腺病毒，犬腺病毒，鼠腺病毒，绵羊腺病毒，禽腺病毒或猿腺病毒。

33.权利要求21的重组腺病毒，其中所述腺病毒是复制缺陷型腺病毒。

34.权利要求33的重组腺病毒，其中所述腺病毒包括在E1区域基因和E3区域基因的至少一种中的突变。

35.免疫原性组合物，包括：

腺病毒载体和重组腺病毒的至少一种，该腺病毒载体或腺病毒包括一种或多种编码至少一种禽流感抗原的多核苷酸和禽流感抗原；以及

药物可接受的载体。

36.权利要求35的免疫原性组合物，包括权利要求1-20任一项的腺病毒载体，以及药物可接受的载体。

37.权利要求35的免疫原性组合物，包括权利要求21-34任一项的重组腺病毒，以及药物可接受的载体。

38.权利要求35的免疫原性组合物，还包括至少一种佐剂。

39.含有一种或多种异源核酸的分离细胞，所述的一种或多种异源核酸包括编码至少第一腺病毒E蛋白的第一多核苷酸序列以及编码至少第二腺病毒E蛋白的第二多核苷酸序列，其中所述第一和第二腺病毒E蛋白选自不同的腺病毒株，且

其中所述细胞支持多种复制缺陷型人和/或非人腺病毒株的生长。

40.权利要求39的细胞系，其中所述至少第一腺病毒E蛋白和所述至少第二腺病毒E蛋白都是E1蛋白。

41.权利要求39的细胞系，其中所述至少第一和第二腺病毒E蛋白来自具有不同种向性的不同腺病毒株。

42.权利要求41的细胞系，其中所述至少第一腺病毒E蛋白含有一种或多种人腺病毒E蛋白，且其中所述至少第二腺病毒E蛋白含有一种或多种非人腺病毒E蛋白。

43.权利要求42的细胞系，其中所述至少第二腺病毒E蛋白含有一种或多种牛E蛋白。

44.权利要求43的细胞系，包括多种人E1蛋白和多种牛E1蛋白。

45.权利要求42的细胞系，其中所述至少第二腺病毒E蛋白含有一种或多种猪E蛋白。

46.权利要求45的细胞系，包括多种人E1蛋白和多种猪E1蛋白。

47.在对象中针对至少一种禽或大流行性流感株产生免疫应答的方法，所述方法包括：

向对象施用免疫原性组合物，其含有下述的至少一种：

重组腺病毒载体，其含有编码禽流感株的至少一种抗原的多核苷酸；以及

重组腺病毒，其含有禽流感株的至少一种抗原。

48.权利要求47的方法，其中所述免疫应答是针对一种或多种禽或大流行性流感株的保护性或部分保护性免疫应答。

49.权利要求48的方法，其中所述免疫应答是针对多种禽或大流行性流感株的保护性或部分保护性的免疫应答。

50.权利要求47的方法，其中所述免疫应答包括产生与至少一种禽或大流行性流感株的抗原结合的中和抗体。

51.权利要求47的方法，其中所述免疫应答包括产生与多种禽或大流行性流感株的抗原结合的中和抗体。

52.权利要求47的方法，其中所述免疫应答还包括至少一种流感内部蛋白的特异性T细胞应答。

53.权利要求52的方法，其中所述的至少一种内部蛋白是M1蛋白，M2蛋白，NP蛋白，或其组合。

54.权利要求53的方法，其中所述T细胞应答对多种流感株中保守的流感内部蛋白的表位是特异性的。

55.权利要求54的方法，其中所述的多种流感株是超过一种血清型的流感株。

56.权利要求47的方法，包括鼻内，口服，经眼部，静脉内，肌肉内，透皮，皮内或皮下施用所述免疫原性组合物。

57.权利要求47的方法，其中所述对象是人对象。

58.权利要求47的方法，其中所述对象是非人哺乳动物。

59.权利要求47的方法，其中所述对象是鸟。

60.权利要求59的方法，其中所述对象是家禽。

61.权利要求60的方法，包括将所述免疫原性组合物向具有胚胎的蛋内卵内施用。

62.权利要求60的方法，包括将所述免疫原性组合物以喷雾或受控液滴的形式向常规空间中的多种鸟施用。

63.权利要求60的方法，包括施用在饮水中的所述免疫原性组合物。

64.权利要求47的方法，包括施用具有编码多种流感抗原的多核苷酸序列的腺病毒载体或含有多种流感抗原的腺病毒。

65.权利要求64的方法，其中所述的多种抗原包括禽流感株的HA抗原、NA抗原或HA抗原和NA抗原二者。

66.权利要求64的方法，其中所述的多种抗原包括相同HA抗原亚型的变异体。

67.权利要求64的方法，其中所述的多种抗原包括来自不同禽流感亚型的多种HA抗原。

68.权利要求64的方法，其中所述的多种抗原包括至少一种禽流感HA抗原和至少一种流感内部蛋白。

69.权利要求68的方法，其中所述的流感内部蛋白是M1蛋白，M2蛋白，NP蛋白，或其两种或更多种的组合。

70.制备重组禽流感病毒抗原的方法，所述方法包括：

在细胞中复制含有至少一种编码禽流感抗原的多核苷酸序列的腺病毒。

71.权利要求70的方法，包括通过向能够支持复制缺陷型载体进行复制的细胞中引入复制缺陷型腺病毒载体来复制所述腺病毒。

72.权利要求71的方法，其中所述细胞是表达至少两种不同E蛋白的多功能细胞，其中所述不同的E蛋白是具有不同种向性的至少两种不同腺病毒株的E蛋白。

73.权利要求70的方法，其中所述禽流感抗原是HA抗原或NA抗原中的至少一种。

74.权利要求73的方法，其中所述抗原选自H5，H7或H9流感株。

75.权利要求70的方法，其中所述的至少一种多核苷酸序列编码多种流感抗原。