CN105112428A - 猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及猿腺病毒核酸和氨基酸序列、包含其的载体及其用途。具体地，本发明涉及具有改进的血清阳性率的新腺病毒毒株。在一个方面，本发明涉及腺病毒衣壳蛋白例如六邻体、五邻体和纤维蛋白的分离的多肽及其片段和编码其的多核苷酸。也提供了包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体和包含根据本发明的分离的多核苷酸或多肽的腺病毒和包含所述载体、腺病毒、多肽和/或多核苷酸的药物组合物。本发明还涉及分离的多核苷酸、分离的多肽、载体、腺病毒和/或药物组合物用于疾病的治疗或预防的用途。

Description

猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途
本申请是申请日为2010年2月2日、中国申请号为201080006197.X、发明名称为“猿腺病毒核酸和氨基酸序列，包含其的载体及其用途”的发明申请的分案申请。
本发明涉及具有改进的血清阳性率的新腺病毒毒株。在一个方面，本发明涉及腺病毒衣壳蛋白例如六邻体、五邻体和纤维蛋白的分离的多肽及其片段和编码其的多核苷酸。也提供了包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体和包含根据本发明的分离的多核苷酸或多肽的腺病毒和包含所述载体、腺病毒、多肽和/或多核苷酸的药物组合物。本发明还涉及分离的多核苷酸、分离的多肽、载体、腺病毒和/或药物组合物用于疾病的治疗或预防的用途。
背景技术
腺病毒(Ad)包括在两栖动物、鸟类和哺乳动物中发现的具有无囊膜二十面体衣壳结构的双链DNA病毒大家族(Straus,Adenovirusinfectionsinhumans；TheAdenoviruses,451-498,1984；Hierholzer等人,J.Infect.Dis.,158:804-813,1988；Schnurr和Dondero,Intervirology.,36:79-83,1993；Jong等人,J.Clin.Microbiol.,37:3940-3945:1999)。与逆转录病毒相比，腺病毒可以转导若干哺乳动物物种的许多细胞类型，包括分裂和不分裂细胞，并且不整合至宿主细胞的基因组。
一般而言，腺病毒DNA通常非常稳定和保持游离型(例如染色体外的)，除非发生转化或肿瘤发生。此外，腺病毒载体可在良好确定的生产系统中增殖至高产量，所述生产系统易于临床级组合物的制药规模生产。这些特征和其表征良好的分子遗传学使重组腺病毒载体成为用作疫苗载体的有力候选者。重组腺病毒载体的产生可依赖于使用能够补充已被删除或被改造为无功能的腺病毒基因产物功能的包装细胞系。
目前，广泛使用2种表征良好的人C亚群腺病毒血清型(即hAd2和hAd5)作为用于基因治疗的大多数腺病毒载体的病毒骨架来源。还已检验了复制缺陷的人腺病毒载体作为疫苗载体用于递送来源于多种感染原(infectiuosagent)的多种免疫原。在实验动物(例如啮齿类、犬类和非人灵长类)中进行的研究表明携带编码免疫原和其他抗原的转基因的重组复制缺陷的人腺病毒载体引起针对转基因产物的体液和细胞介导的免疫应答。一般而言，研究者已报导了使用人腺病毒作为疫苗载体在非人实验系统中的成功，其通过使用利用高剂量的预计可引起免疫应答的重组腺病毒载体的免疫方案，或通过使用利用相继施用来源于不同血清型但携带相同的转基因产物的腺病毒载体用于加强免疫的免疫方案(Mastrangeli等人,HumanGeneTherapy,7:79-87(1996)。
已开发了基于人5型腺病毒(Ad5)的病毒载体用于不同的基因治疗和疫苗应用。尽管基于Ad5的载体在动物模型中极其有效，在临床试验中已证明了在人中存在的针对Ad5野生型病毒的先存(pre-existing)免疫力，以降低基因转导的效率。特别是在参与基于Ad5载体的疫苗临床试验的受试者中证明了免疫效率的明确降低，这些受试者具有超过200的中和抗体滴度。在Merck进行的HIV疫苗STEP试验(MooreJP等人Science.2008May9；320(5877):753-5)中得到以Ad5为载体的疫苗的最全面表征。所述疫苗研究基于在具有HIV感染高风险的受试者中共注射3个表达不同HIV抗原的Ad5载体作为概念研究的证据。令人惊讶地，数据显示在具有抗-Ad5先存免疫力的接种的受试者中HIV感染率提高而不是具有保护作用。尽管此矛盾的观察的机制尚不清楚，所述结果对基于人源腺病毒的疫苗在健康受试者中的疫苗应用的安全性和效率提出了另外的问题。综合考虑目前在不同疫苗和基因治疗临床试验例如使用Ad5载体的试验中得到的全部结果提高了对以在人中具有极低的或缺乏先存免疫力为特征的腺病毒的需要。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:14-19、50和53中任意氨基酸序列的多肽，
(b)多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:14-19、50和53中任意多肽的功能性衍生物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
(c)多核苷酸，其编码在全长上与SEQIDNO:14-19、50和53中任意氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:20-25、51和54中任意氨基酸序列的多肽，
(b)多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:20-25、51和54中任意多肽的功能性衍生物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
(c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:20-25、51和54中任意氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
也提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:26-31、52和55中任意氨基酸序列的多肽，
(b)多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:26-31、52和55中任意多肽的功能性衍生物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
(c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:26-31、52和55中任意氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
本发明也涉及包含至少一种如上概述的根据本发明的分离的多核苷酸的多核苷酸。本发明还提供了由根据本发明的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽或其功能性衍生物。
在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体。
也提供了重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据本发明的分离的多核苷酸和/或至少一种根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽。
本发明的另一个方面是包含佐剂和以下(i)至(iv)中至少一种物质的组合物：
(i)一种或多种根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽；
(ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
(iii)根据本发明的载体；
(iv)根据本发明的重组腺病毒；
和任选地，药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及包含以下至少一种的细胞：
(i)一种或多种根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽；
(ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
(iii)根据本发明的载体；
(iv)根据本发明的重组腺病毒。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽、根据本发明的分离的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的重组腺病毒和/或根据本发明的组合物用于疾病的治疗或预防的用途。
具体地，本发明涉及以下项：
1.一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:14-19、50和53中任意氨基酸序列的多肽，
(b)多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:14-19、50和53中任意多肽的功能性衍生物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
(c)多核苷酸，其编码在全长上与SEQIDNO:14-19、50和53中任意氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
2.一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:20-25、51和54中任意氨基酸序列的多肽，
(b)多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:20-25、51和54中任意多肽的功能性衍生物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
(c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:20-25、51和54中任意氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
3.一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:26-31、52和55中任意氨基酸序列的多肽，
(b)多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:26-31、52和55中任意多肽的功能性衍生物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
(c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:26-31、52和55中任意氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
4.一种多核苷酸，其包含至少一种根据项1、2和3中任一项的分离的多核苷酸。
5.根据项1-4中任一项的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含以下至少一项：
(a)腺病毒5’-端，优选腺病毒5’反向末端重复，
(b)腺病毒E1a区或其选自13S、12S和9S区的片段，
(c)腺病毒E1b区或其选自小T、大T和IX区的片段，
(d)腺病毒E2b区或其选自小pTP、聚合酶和IVa2区的片段，
(e)腺病毒L1区或其片段，所述片段编码选自28.1kD蛋白、聚合酶、agnoprotein、52/55kDa蛋白和IIIa蛋白的腺病毒蛋白质；
(f)腺病毒L2区或其片段，所述片段编码选自根据项3的五邻体蛋白、VII、V和Mu蛋白的腺病毒蛋白质，
(g)腺病毒L3区或其片段，所述片段编码选自VI蛋白、根据项2的六邻体蛋白和内切蛋白酶的腺病毒蛋白质，
(h)腺病毒E2a区，
(i)腺病毒L4区或其片段，所述片段编码选自100kD蛋白、33kD同源物和蛋白质VIII的腺病毒蛋白质，
(j)腺病毒E3区或其选自E3ORF1、E3ORF2、E3ORF3、E3ORF4、E3ORF5、E3ORF6、E3ORF7、E3ORF8和E3ORF9的片段，
(k)腺病毒L5区或其片段，所述片段编码根据项1的纤维蛋白，
(l)腺病毒E4区或其选自E4ORF7、E4ORF6、E4ORF5、E4ORF4、E4ORF3、E4ORF2和E4ORF1的片段，和/或
(m)腺病毒3’-端，优选腺病毒3’反向末端重复。
6.根据项4的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与基本上由SEQIDNO:13、62、63或65中的任一个组成的序列或由SEQIDNO:13、62、63或65中的任一个组成但缺乏SEQIDNO:13、62、63或65的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4的序列至少90％同一。
7.一种由根据项1-3中任一项的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽，或其功能性衍生物。
8.一种载体，其包含根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸。
9.根据项8的载体，其中所述载体不包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域中的基因，和/或包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因，其中所述至少一个基因包含使所述至少一个基因无功能的缺失和/或突变。
10.一种重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸和/或至少一种根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽。
11.项10的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒包含用于递送至靶细胞的分子。
12.根据项10或11的重组腺病毒，其中所述腺病毒在人受试者中具有低于5％的血清阳性率和优选在人受试者中无血清阳性率。
13.根据项10-12中任一项的重组腺病毒，其中所述腺病毒能够感染哺乳动物细胞。
14.根据项11-13中任一项的重组腺病毒，其中所述用于递送至靶细胞的分子是编码抗原蛋白或其片段的多核苷酸。
15.项10-14中任一项的重组腺病毒，其中所述腺病毒是已被保藏的腺病毒并具有选自08110601(ChAd83)、08110602(ChAd73)、08110603(ChAd55)、08110604(ChAd147)和08110605(ChAd146)的保藏号。
16.一种组合物，其包含佐剂和以下(i)至(iv)中至少一项：
(i)一种或多种根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽，
(ii)根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸，
(iii)根据项8-9中任一项的载体，
(iv)根据项10-15中任一项的重组腺病毒，
和任选地，药学上可接受的赋形剂。
17.根据项16的组合物，其中所述佐剂是受体的激动剂，所述受体选自I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、TNF受体、担当转录因子的维生素D受体、以及Toll样受体1(TLR1)、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7和TLR9。
18.根据项17的组合物，其中所述佐剂是Toll样受体4或9激动剂。
19.一种细胞，其包含以下至少一项：
(i)一种或多种根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽，
(ii)根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸，
(iii)根据项8-9中任一项的载体，
(iv)根据项10-15中任一项的重组腺病毒。
20.根据项18的细胞，其中所述细胞是表达至少一种选自E1a、E1b、E2a、E2b、E4、L1、L2、L3、L4和L5的腺病毒基因的宿主细胞。
21.根据项7的分离的腺病毒衣壳多肽、根据项1-6中任一项的分离的多核苷酸、根据项8-9中任一项的载体、根据项10-15中任一项的重组腺病毒和/或根据项18的组合物用于疾病的治疗或预防的用途。
22.根据项21的用途，其中所述治疗或预防是接种。
23.根据项21的用途，其中所述治疗是基因治疗。
发明详述
在以下详细描述本发明以前，应当理解本发明不受限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，无意限制本发明的范围，本发明仅受限于所附权利要求书。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语如"Amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms:(IUPACRecommendations)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Klbl,H.编(1995),HelveticaChimicaActa,CH-4010Basel,Switzerland)中所描述的以及AxelKleemann和JurgenEngel的"PharmaceuticalSubstances:Syntheses,Patents,Applications",ThiemeMedicalPublishing,1999；"MerckIndex:AnEncyclopediaofChemicals,Drugs,andBiologicals",SusanBudavari等人编,CRCPress,1996,和UnitedStatesPharmcopeialConvention,Inc.,RockvilleMd.,2001出版的UnitedStatesPharmacopeia-25/NationalFormulary-20中所描述的定义。
在本说明书和后面的权利要求书通篇中，除非上下文另有需要，否则词语“包含(comprise)”和变体例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当被理解为指包含所述的特征、整体(integer)或步骤或多个特征、整体或步骤的组但不排除任意其他特征、整体或步骤或多个整体或步骤的组。在后面的段落中更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指出有相反的意思，这样定义的每个方面可与任意其他方面或多个方面组合。特别地，指示为优选的或有利的任意特征可与指示为优选的或有利的任意其他特征或多个特征组合。
在本说明书正文通篇中引用了一些文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)，不管在上文或下文中，在此以其整体引入作为参考。不应将本文的任何内容解释为承认本发明无权先于因先前发明所作的此类公开。
下面提供了在本说明书中经常使用的一些术语的定义。这些术语在其每次使用时在说明书的其余部分具有分别定义的含义和优选的含义。
一般而言，腺病毒基因组是被良好地表征的。就具有类似位置的特定开放阅读框而言，在腺病毒基因组的总体组织中具有一般的保守性，例如每个病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、LI、L2、L3、L4和L5基因的位置。腺病毒基因组的每个末端包含被称为反向末端重复(ITR)的序列，其对病毒复制是必需的。病毒也包含病毒编码的蛋白酶，其对加工某些产生感染性病毒粒子所需的结构蛋白是必需的。根据宿主细胞转导后表达的病毒基因的顺序描述腺病毒基因组的结构。更具体地，根据转录是否在DNA复制开始前或后发生将病毒基因称为早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期，腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因被表达以制备适于病毒复制的宿主细胞。在感染的晚期，激活晚期基因L1-L5的表达，其编码病毒颗粒的结构成分。
下表1提供了本文涉及的序列的概述：
表1
如本文使用的，术语“分离的”指基本上不含与其天然有联系的其他分子的分子。因此分离的分子不含其在自然界的活动物中，即实验设备之外可能相遇或接触的其他分子。
如本文使用的，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可通篇互换使用。这些术语指天然存在的肽(例如天然存在的蛋白质)和可能包括天然或非天然存在的氨基酸的合成的肽二者。肽也可被化学修饰，通过修饰天然或非天然存在的氨基酸的侧链或游离氨基或羧基端。此化学修饰包括加入其他的化学部分以及在氨基酸侧链中的功能基团的修饰，例如糖基化。肽是优选具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少100个氨基酸，最优选至少8个或至少30个氨基酸的聚合物。由于本文公开的多肽和蛋白质来源于腺病毒，优选地本文使用的分离的多肽或蛋白质的分子量不超过200kDa。
如本文使用的术语“载体”包括技术人员已知的任意载体，包括质粒载体，黏粒载体，噬菌体载体例如λ噬菌体，病毒载体例如腺病毒(Ad)载体(例如现有技术(例如WO2005/071093A2)已知的非复制型Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82载体或可复制的Ad4和Ad7载体)，腺相关病毒(AAV)载体(例如AAV5型)，甲病毒载体(例如委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEE)，辛德比斯病毒(SIN)，塞姆利基森林病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合体)，疱疹病毒载体，麻疹病毒载体，痘病毒载体(例如牛痘病毒，修饰的牛痘病毒Ankara(MVA)，NYVAC(来源于牛痘病毒的Copenhagen毒株)，和禽痘病毒载体：金丝雀痘(ALVAC)和禽痘病毒(FPV)载体)，和水疱性口炎病毒载体，类病毒颗粒或细菌孢子。载体也包括表达载体，克隆载体和可用于在宿主细胞中产生重组腺病毒的载体。
术语“表达载体”指包含至少一种待表达的核酸序列以及其转录和翻译控制序列的核酸分子。改变表达盒将导致包含其的载体引导不同序列或序列组合的表达。因为限制性位点被优选地改造在5'和3'端，可容易地插入、去除表达盒，或将其替换为另一个表达盒。优选地，表达盒包括用于有效表达给定基因的顺式调控元件，例如启动子、起始位点和/或多聚腺苷酸化位点，如下进一步描述。
术语“抗体”指单克隆和多克隆抗体二者，即任意免疫球蛋白或其能够结合抗原或半抗原的部分。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学切割产生。在某些实施方案中，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)变体，单链抗体(scFv)，嵌合抗体，人源化抗体，双抗体和包含抗体的至少一部分的多肽，所述抗体的至少一部分足以赋予特定抗原与该多肽结合。
在本发明上下文中将在哺乳动物中施用免疫原/抗原以引起/产生免疫应答称为“引发”，将在哺乳动物中施用免疫原/抗原以增强针对所述免疫原/抗原例如特定病原(例如病毒粒子或病毒病原体，病原细菌的抗原或肿瘤抗原)的免疫应答称为“加强”。短语“异源引发-加强”的意思是用于在哺乳动物中引起/产生免疫应答(引发)的载体和用于在哺乳动物中增强免疫应答(加强)的载体是不同的。如果受试者例如患者已对第一个载体产生了抗体并需要加强，“异源引发-加强”是有用的。因此，在异源引发-加强的优选实施方案中可使用2种不同的腺病毒，例如用于接种和/或基因治疗。在此上下文中，如果在第一种腺病毒引发过程中引起的抗体应答不能阻止超过70％或优选超过80％的施用的用于加强的第二种腺病毒颗粒进入已经历引发和加强的动物的细胞核，第一种和第二种腺病毒应具有足够大的差异。
术语“可复制的”重组腺病毒(AdV)指在细胞中不包含任意重组辅助蛋白质的情况下可以在宿主细胞中复制的腺病毒。优选地，“可复制的”腺病毒包含以下完整或功能必需的早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。从特定动物分离的野生型腺病毒可在该动物中复制。
术语“复制缺陷的”重组AdV指已变得不能复制的腺病毒，因为其已被改造为包含至少一个功能性缺失，即损伤基因功能但不完全将其去除的缺失，例如引入人工终止子，缺失或突变活性位点或相互作用结构域，突变或缺失基因的调控序列等等，或完全去除编码对于病毒复制所必需的基因产物的基因，例如一个或多个选自E1、E2、E3和E4的腺病毒基因。本发明的重组黑猩猩腺病毒载体优选地是复制缺陷的。
在多核苷酸、多肽或蛋白质序列的上下文中，术语“同一性”或“相同的”(“identical”)指当进行最大对应性比对时，在2条序列中相同的残基数。特别地，2条序列的序列同一性百分比(不管是核酸或氨基酸序列)是2条比对的序列之间的精确匹配数除以较短的序列长度然后乘以100。可用于比对2条序列的比对工具是本领域技术人员熟知的，例如可从万维网，例如ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw)或Align(http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)上获得。2条序列之间的比对可使用标准设置进行，对AlignEMBOSS::needle优选:矩阵:Blosum62,缺口开放10.0,缺口延伸0.5。本领域技术人员理解可能有必要在2条序列中的任一条中引入缺口以产生令人满意的比对。将2条多肽之间的“最佳序列比对”定义为产生最大的比对同一残基数的比对。
腺病毒
腺病毒(Ad)是已在若干禽类和哺乳动物宿主中鉴定的无囊膜二十面体病毒。人腺病毒(hAd)属于哺乳动物腺病毒属，其包括所有已知的人腺病毒和许多动物(例如牛、猪、犬、鼠、马、猿和羊)腺病毒。通常基于大量生物学、化学、免疫学和结构标准将人腺病毒分为6个亚群(A-F)，这些标准包括大鼠和猕猴红细胞的血凝性能，DNA同源性，限制酶切割模式，G+C含量百分比和致癌性(Straus,1984,inTheAdenoviruses,H.Ginsberg编,pps.451-498,NewYork:PlenusPress,和Horwitz,1990；inVirology,B.N.Fields和D.M.Knipe编,pps.1679-1721)。
腺病毒粒子具有二十面体对称和60-90nm的直径(取决于血清型)。二十面体衣壳包含3种主要蛋白质、六邻体(II)、五邻体基质(III)和隆起的(knobbed)纤维(IV)蛋白(W.C.Russel,J.Gen.Virol.,81:2573-2604(2000))。在人中观察到的先存免疫力的一个方面是体液免疫，其可导致特异性针对腺病毒蛋白质的抗体的产生和持续。腺病毒引起的体液应答主要针对3个主要的结构蛋白：六邻体、五邻体和纤维。
至今已识别了51个不同的人腺病毒血清型并基于其血凝性能和生物物理和生物化学标准分为亚群。已发表的报导已确定包含针对多种血清型的抗体的滴度是普遍的(Dambrosio,E.(1982)J.Hyg.(London)89:209-219)并且滴度的相当大的一部分具有中和活性。
如所述，重组腺病毒可用于基因治疗和作为疫苗。基于黑猩猩腺病毒的病毒载体为使用人源Ad载体用于基因疫苗的开发提供了替代方案(FarinaSF,JVirol.2001Dec；75(23):11603-13.；FattoriE,GeneTher.2006Jul；13(14):1088-96)。从黑猩猩中分离的腺病毒与从人中分离的腺病毒紧密相关，如它们在人源细胞中的有效增殖所证明的。但是，由于人和黑猩猩腺病毒是近亲，可以预期在2个病毒物种之间的血清学交叉反应。
当黑猩猩腺病毒被分离和表征后，此推测得到证实。然而，来自黑猩猩的腺病毒分离株显示了与人腺病毒表位的普通血清型的减少的交叉反应。因此，黑猩猩腺病毒(本文中又将普通黑猩猩腺病毒简称为“ChAd”和将倭黑猩猩腺病毒简称为“PanAd”)提供了降低与人中针对人腺病毒普通血清型的先存免疫力相关的副作用的基础。但是，在人血清的亚群中检测到针对目前分离的黑猩猩腺病毒的低至中度中和滴度，因此所有已知的黑猩猩腺病毒血清型仍然可被人血清在一定程度上中和。
本发明包含意料之外的发现：可分离到新的黑猩猩腺病毒毒株，即从普通黑猩猩(Pantroglodytes)中分离的ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147和从倭黑猩猩(Panpaniscus)中分离的PanAd1、PanAd2和PanAd3。所有这些新的毒株在人中显示了测量不到的血清阳性率，即这些腺病毒毒株代表了迄今为止描述的黑猩猩腺病毒中的例外，因为检测的所有人血清对中和抗体的存在完全呈阴性。在此上下文中，中和抗体指这样的抗体，其结合腺病毒的表位并阻止腺病毒在宿主细胞中产生有效感染或阻止表达转基因的不能复制的载体转导靶细胞，例如腺病毒DNA能够进入宿主细胞。尽管在所有现有技术中的黑猩猩来源的腺病毒中观察到中和抗体，新的腺病毒类型ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3的特征在于：在人中完全缺乏针对这些腺病毒类型的先存中和抗体。因此，这些腺病毒提供了有价值的医学工具，例如可被用于免疫和/或基因治疗。
如下进一步详细描述的，本发明在一个方面提供了代表大部分暴露在表面的腺病毒表位的腺病毒衣壳蛋白，即六邻体、五邻体和纤维蛋白的新序列。如已经提到的，在人血清中不包含特异性针对根据本发明的病毒的中和抗体。因此，上述黑猩猩六邻体、五邻体和纤维蛋白的新序列的一个优势是可将这些蛋白质序列用于增强现有技术中已被改造用于例如医学目的的腺病毒。例如，本发明的衣壳蛋白或其功能片段可用于例如分别替换/置换不同的腺病毒(例如现有技术的腺病毒)的一个或多个主要结构衣壳蛋白或其功能片段以得到在人中具有减少的血清阳性率的改进的重组腺病毒。因为本发明的新腺病毒以及如上所述的已重新改造的腺病毒在施用时在人中不会遭遇任何显著的抑制性免疫应答，其总体转导效率和感染性将提高。因此，预期这样改进的腺病毒被期望是例如更有效的疫苗，因为病毒进入宿主细胞和抗原盒的表达将不会受到任何显著滴度的中和抗体的阻碍。此外，如在实施例中所示，甚至在使用包含ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2或PanAd3分离株的六邻体、五邻体和纤维蛋白的编码HIV-gag的重组腺病毒接种的初次接受实验的小鼠中引起了针对HIVgag的有效免疫应答。ChAd55-gag、ChAd73-gag、ChAd83-gag、ChAd146-gag、ChAd147-gag、PanAd1-gag、PanAd2-gag和PanAd3-gag腺病毒引起的免疫应答与迄今为止基于现有技术中表达HIVgag蛋白的重组人Ad5载体开发的最有效的载体所观察到的应答相当(见图5A、5B、5C中酶联免疫斑点(ELIspot)测定的数据)。
如上所述，腺病毒引起的体液应答主要针对3种主要的腺病毒结构蛋白质：六邻体、五邻体和纤维蛋白，其均包含组成腺病毒衣壳的一部分和暴露在病毒颗粒以外的多肽序列(又见：MadischI,等人,J.Virol.2005Dec；79(24):15265-76；又见：MadischI,等人,JVirol.2007Aug；81(15):8270-81和Pichla-GollonSL,等人,J.Virol.2007Feb；81(4):1680-9)。
如图1所示的多重序列比对所示，本发明的PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147这一组的新腺病毒分离株共有非常相似的六邻体蛋白质序列。在比对中也标记了高变区(HVR)，其出现在六邻体分子顶端位于病毒粒子外部并覆盖大量病毒粒子表面的环中(见JophnJ.Ruxet.Al,J.ofVirology,Sept2003,vol.77,no.17)。在图2和3中分别提供了新的黑猩猩腺病毒的其他衣壳蛋白纤维蛋白和五邻体的序列相关性。预计所有3种结构衣壳蛋白均作用于低血清阳性率，因此可彼此独立地或组合用于抑制腺病毒与先存中和抗体的亲和力，例如用于制备具有减少的血清阳性率的重组嵌合腺病毒。
因此，在一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物并且其选自：
(a)编码具有根据SEQIDNO:14-19、50和53；即SEQIDNO:14、15、16、17、18、19、50或53中任意氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码根据SEQIDNO:14-19、50和53；即SEQIDNO:14,15,16,17,18,19、50或53中任意多肽的功能性衍生物的多核苷酸，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换；和
(c)编码具有在全长上与SEQIDNO:14-19、50和53；即SEQIDNO:14、15、16、17、18、19、50或53中任意氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少99％相同的氨基酸序列的功能性衍生物的多核苷酸。
“腺病毒纤维蛋白”的意思是腺病毒中包含的隆起的纤维(IV)蛋白。在优选的实施方案中，本发明第一个方面和以下描述的其优选的实施方案中包含的分离的多核苷酸编码与感染性腺病毒粒子中的纤维蛋白或其片段具有相同功能的纤维蛋白或其功能性衍生物。因此，优选包含所述纤维蛋白或功能纤维蛋白衍生物作为衣壳蛋白的重组腺病毒能够进入宿主细胞。可以容易地测定重组腺病毒是否能够进入宿主细胞。例如，在宿主细胞接触腺病毒后可洗涤并裂解重组宿主细胞，使用例如特异性针对腺病毒RNA和/或DNA的合适的杂交探针可测定是否在宿主细胞中发现了腺病毒RNA和/或DNA。可选或另外地，可洗涤、裂解并用腺病毒特异性抗体探测(例如使用蛋白质印迹)已与重组腺病毒接触的宿主细胞。在另一个可选方案中，例如在体内观察宿主细胞在被重组腺病毒感染后是否表达一种基因产物，例如荧光蛋白，所述重组腺病毒包含合适的表达盒以在宿主细胞中表达所述基因产物。
进一步优选地，纤维蛋白和其功能性衍生物对腺病毒五邻体蛋白例如对SEQIDNO:26-31、52和/或55具有亲和力。一般技术人员熟知如何检测蛋白质-蛋白质亲和力。为了测定第一种蛋白是否能够结合第二种蛋白，例如黑猩猩来源的腺病毒的五邻体蛋白，技术人员可使用例如遗传学的酵母双杂交测定或生物化学测定例如拉拽(pull-down)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，基于荧光激活的细胞分选(FACS)测定或等离子共振测定。当使用拉拽或等离子共振测定时，将至少一种蛋白质与亲和标签例如HIS-标签、GST-标签或其他生物化学领域中熟知的其他标签融合是有用的。腺病毒纤维蛋白以其糖基化形式能够进一步三聚化。因此，也优选根据本发明的第一个方面的多核苷酸编码的纤维蛋白或其片段能够被糖基化和/或形成三聚体。
如本申请通篇使用的，短语蛋白质或多肽的“功能性衍生物”通常指蛋白质或多肽的修饰形式，例如蛋白质或多肽的一个或多个氨基酸可被缺失、插入、修饰和/或置换。上面也提到过，如果在其衣壳中包含功能性衍生物的嵌合腺病毒能够感染宿主细胞，则衍生物是有功能的。此外，在“功能性衍生物”的上下文中，插入指在原始多肽或蛋白质中插入一个或多个氨基酸。优选地功能性衍生物不含有超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100个氨基酸改变(即缺失、插入、修饰和/或置换的氨基酸)。在另一个实施方案中，优选地不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或不超过20％(最优选不超过5％)的蛋白质或多肽的所有氨基酸被改变(即缺失、插入、修饰和/或置换的氨基酸)。也可修饰，例如化学修饰蛋白质或多肽的氨基酸。例如，通过例如糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等可修饰蛋白质或多肽的氨基酸的侧链或游离氨基或羧基末端。如本领域熟知的，也可在体内例如在宿主细胞内进行化学修饰。例如，在蛋白质的氨基酸序列中存在的合适的化学修饰基序，例如糖基化序列基序将导致蛋白质被糖基化。在衍生物中的置换可以为保守或非保守置换，优选保守置换。在某些实施方案中，置换也包括天然存在氨基酸和非天然存在氨基酸的交换。保守置换包含将氨基酸置换为另一个与被置换的氨基酸具有类似化学性质的氨基酸。优选地，保守置换是选自下述的置换：
(i)将碱性氨基酸置换为另一个不同的碱性氨基酸；
(ii)将酸性氨基酸置换为另一个不同的酸性氨基酸；
(iii)将芳香族氨基酸置换为另一个不同的芳香族氨基酸；
(iv)将非极性脂肪族氨基酸置换为另一个不同的非极性脂肪族氨基酸；
(v)将极性、不带电荷的氨基酸置换为另一个不同的极性、不带电荷的氨基酸。
碱性氨基酸优选地选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选地是天冬氨酸或谷氨酰胺。芳香族氨基酸优选地选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性、脂肪族氨基酸优选地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性、不带电荷的氨基酸优选地选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸置换相反，非保守氨基酸置换是一个氨基酸与任意不属于上述所列保守置换(i)至(v)的氨基酸的交换。
如果功能性衍生物包含缺失，那么在衍生物中已去除了在参考多肽或蛋白质序列中存在的一个或几个氨基酸。但是缺失不能过多以致衍生物总共包含的氨基酸少于200个。
上面已描述了测定序列同一性的方法。此外，也可使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877的数学算法测定2条序列之间的百分比同一性。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTP程序也包含这样的算法。当使用BLASTN和BLASTP时优选使用这些程序的默认参数。
如上所述，腺病毒六邻体蛋白的高变结构域暴露在腺病毒的外侧。因此可通过中和抗体识别和结合腺病毒衣壳的这些区域。因此，具有包含来源于本发明的新的腺病毒分离株之一的六邻体蛋白的衣壳的腺病毒在人中将展示改进的即较小的血清阳性率。因此，在第二个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物并且其选自：
(a)编码具有根据SEQIDNO:20-25、51和54，即SEQIDNO:20、21、22、23、24、25、51或54中任意氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码根据SEQIDNO:20-25、51和54、即SEQIDNO:20、21、22、23、24、25、51或54中任意多肽的功能性衍生物的多核苷酸，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换；和
(c)编码具有在全长上与SEQIDNO:20-25、51和54，即SEQIDNO:20、21、22、23、24、25、51或54中任意氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99.95％相同的氨基酸序列的功能性衍生物的多核苷酸。
在优选的实施方案中，在本发明的第二个方面和以下描述的其优选实施方案中包含的分离的多核苷酸编码与感染性腺病毒粒子中的六邻体蛋白或其片段具有相同功能的六邻体蛋白或其功能性衍生物。因此，优选包含所述六邻体或功能性衍生物作为衣壳蛋白的重组腺病毒能够进入宿主细胞。产生六邻体蛋白的功能性衍生物的一种合适方法在美国专利5,922,315中描述，将其引入作为参考。在此方法中，腺病毒六邻体的至少一个环区域改变为另一种腺病毒血清型的至少一个环区域。例如，本发明的六邻体蛋白质的环区域可用于置换现有技术中的腺病毒的对应的六邻体环以产生改进的杂交腺病毒。类似地也可产生本发明的五邻体和纤维蛋白的衍生物。
在第三个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物并且其选自：
(a)编码具有根据SEQIDNO:26-31、52和55，即SEQIDNO:26、27、28、29、30、31、52或55中任意氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)编码根据SEQIDNO:26-31、52和55，即SEQIDNO:26、27、28、29、30、31、52或55中任意多肽的功能性衍生物的多核苷酸，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换；和
(c)编码具有在全长上与SEQIDNO:26-31、52和55，即SEQIDNO:26、27、28、29、30、31、52或55中任意氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少99％相同的氨基酸序列的功能性衍生物的多核苷酸。
优选地，五邻体蛋白和其功能性衍生物对腺病毒纤维蛋白例如对SEQIDNO:14-19、50和/或53具有亲和力。如上所述一般技术人员熟知如何检测蛋白质-蛋白质亲和力。“腺病毒五邻体蛋白”的意思是在腺病毒中包含的五邻体基质(III)蛋白。腺病毒五邻体蛋白的特征在于其位于衣壳的二十面体对称的转角(corner)。如上所述，在本发明的第一、第二和/或第三个方面和如下文描述的其优选实施方案的多核苷酸的优选实施方案中，所述多核苷酸编码一种或多种多肽，其中优选包含所述一种或多种多肽作为衣壳蛋白的重组腺病毒能够感染，即进入宿主细胞。
下面将对本文公开的每个新黑猩猩腺病毒分离株详细说明本发明的第一、第二和第三个方面的优选实施方案。
腺病毒ChAd55
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:14的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:14的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:20的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:20的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:26的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:26的氨基酸序列至少98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99.9％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用Ad5基因组作为参考)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
腺病毒ChAd73
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:15的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:15的氨基酸序列至少98％、99％或至少99.9％，更优选至少99％和最优选至少99.9％相同的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:21的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:21的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:27的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:27的氨基酸序列至少98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用Ad5基因组作为参考)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
腺病毒ChAd83
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:16的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:22的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:22的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:28的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:28的氨基酸序列至少98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在最优选的实施方案中，本发明的多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与由SEQIDNO:65组成的序列或与由SEQIDNO:65组成的但缺乏SEQIDNO:65的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4中的任意区域，最优选缺乏SEQIDNO:65的基因组区域E1、E3和E4的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一和最优选至少99％或100％同一。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用如SEQIDNO:65所示的ChAd83基因组)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
腺病毒ChAd146
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:17的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:23的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:23的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:29的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:29的氨基酸序列至少98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用Ad5基因组作为参考)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
腺病毒ChAd147
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:18的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:18的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少90％相同的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:24的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:24的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:30的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:30的氨基酸序列至少98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用Ad5基因组作为参考)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
腺病毒PanAd1
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:19的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:19的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:25的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:25的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:31的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:31的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少90％相同的氨基酸序列。
在最优选的实施方案中，本发明的多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与由SEQIDNO:13组成的序列或与由SEQIDNO:13组成的但缺乏SEQIDNO:13的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4中任意区域，最优选缺乏SEQIDNO:13的基因组区域E1、E3和E4的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一和最优选至少99％或100％同一。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用如SEQIDNO:13所示的PanAd1基因组)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
腺病毒PanAd2
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:50的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:50的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:51的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:51的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:52的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:52的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少90％相同的氨基酸序列。
在最优选的实施方案中，本发明的多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与由SEQIDNO:62组成的序列或与由SEQIDNO:62组成的但缺乏SEQIDNO:62的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4中任意区域，最优选缺乏SEQIDNO:62的基因组区域E1、E3和E4的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一和最优选至少99％或100％同一。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用如SEQIDNO:62所示的PanAd1基因组)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
腺病毒PanAd3
在本发明的第一个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:53的氨基酸序列的腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:53的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在本发明的第二个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:54的氨基酸序列的腺病毒六邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:54的氨基酸序列至少95％、98％、99％、99.5％、99.9％或至少99.95％，更优选至少98％和最优选至少99％相同的氨基酸序列。
在本发明的第三个方面的优选实施方案中，分离的多核苷酸编码具有根据SEQIDNO:55的氨基酸序列的腺病毒五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所述功能性衍生物(i)不包含超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或超过100，优选不超过10个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸或(ii)具有在全长上与SEQIDNO:55的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，更优选至少85％和最优选至少90％相同的氨基酸序列。
在最优选的实施方案中，本发明的多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与由SEQIDNO:63组成的序列或与由SEQIDNO:63组成的但缺乏SEQIDNO:63的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4中任意区域，最优选缺乏SEQIDNO:63的基因组区域E1、E3和E4的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一和最优选至少99％或100％同一。
在另一个方面，本发明涉及包含第一、第二、第三、第一和第二、第一和第三、第二和第三或第一、第二和第三个方面的多核苷酸。优选包含这个或这些多核苷酸的多核苷酸包含其他在腺病毒基因组中(例如使用如SEQIDNO:63所示的PanAd1基因组)与六邻体、五邻体和/或纤维基因邻近的腺病毒基因和核苷酸区段。优选所述多核苷酸也包含将多核苷酸包装进腺病毒颗粒所需的序列。
在重组腺病毒中，根据本发明的第一、第二和第三个方面和根据本文公开的各个优选的实施方案的纤维、六邻体和五邻体蛋白各自单独地作用于降低所述重组腺病毒与人和/或啮齿类中和抗体的相互作用。由此，编码本发明的所述纤维、六邻体和/或五邻体蛋白的多核苷酸可用于构建增强的重组腺病毒。因此，本发明的另一个即第四个方面提供了包含至少一种、优选至少2种和最优选3种分离的多核苷酸的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自由根据本发明的第一个方面、本发明的第二个方面和本发明的第三个方面的多核苷酸组成的多核苷酸组。因此，最优选地，第四个方面是包含本发明的第一、第二和第三个方面的分离的多核苷酸。在优选的实施方案中，根据本发明的第四个方面的多核苷酸是选自下述的多核苷酸：
(i)包含根据本发明的第一、第二或第三个方面的一种多核苷酸的多核苷酸；
(ii)包含根据本发明的第一个方面的多核苷酸和根据本发明的第二个方面的多核苷酸的多核苷酸；
(iii)包含根据本发明的第一个方面的多核苷酸和根据本发明的第三个方面的多核苷酸的多核苷酸；
(iv)包含根据本发明的第二个方面的多核苷酸和根据本发明的第三个方面的多核苷酸的多核苷酸；
(v)包含根据本发明的第一、第二和第三个方面的多核苷酸的多核苷酸；
其中优选地包含在根据(i)至(v)的多核苷酸中的所述多核苷酸选自相同的腺病毒分离株，例如分别编码纤维、六邻体和五邻体或其功能性衍生物的所有3种多核苷酸仅来自以下腺病毒中的一种：ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147PanAd1、PanAd2或PanAd3。此外，优选地在本发明的第四个方面或其优选的实施方案中，例如如上概述的，每种“功能性衍生物”不包含超过10个、超过5个或超过3个氨基酸改变(即缺失、插入、修饰和/或置换的氨基酸)。
下表2列出了如上概述的本发明的第四个方面的多核苷酸的大量特别优选的实施方案。优选的多核苷酸选自表2所示的多核苷酸A1至AF1，其中所述多核苷酸包含根据本发明的第一、第二和第三个方面的可选项(c)的3种多核苷酸，每种多核苷酸分别编码腺病毒的纤维、六邻体和五邻体蛋白或其功能性衍生物。下表2显示了所述3种编码的蛋白质中的每一个在其全长上必须具有的与根据表2也显示的SEQIDNO的氨基酸序列的最小序列同一性(即至少是指示的序列同一性)：
例如，如上表1中所示的优选多核苷酸A1包含：
(i)编码具有在全长上与SEQIDNO:14至少85％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(ii)编码具有在全长上与SEQIDNO:20至少95％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(iii)编码具有在全长上与SEQIDNO:26至少98％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
如上所述最优选地在表2中所列的多核苷酸的所述“功能性衍生物”不包含超过10个氨基酸改变(即缺失、插入、修饰和/或置换的氨基酸)。
下表3列出了本发明的第四个方面的多核苷酸的进一步优选的实施方案。优选的多核苷酸选自从表3选择的多核苷酸A2至J2，其中所述多核苷酸包含命名为“多核苷酸1”、“多核苷酸2”和“多核苷酸3”的3种多核苷酸，其中每种多核苷酸在全长上分别与根据表3所示的SEQIDNO的对应多核苷酸具有指示的序列同一性：
因此，作为实例，上表3的优选实施方案A2(“A2–ChAd55”)是包含下述的多核苷酸：
(i)在全长上与SEQIDNO:32至少98％相同的多核苷酸；
(ii)在全长上与SEQIDNO:38至少98％相同的多核苷酸；
(iii)在全长上与SEQIDNO:44至少98％相同的多核苷酸。
下表4列出了上面概述的本发明的第四个方面的多核苷酸的大量进一步特别优选的实施方案。优选的多核苷酸选自表4所示的多核苷酸A3至H3，其中所述多核苷酸编码根据指示的SEQIDNO的腺病毒纤维、六邻体和五邻体蛋白或其功能性衍生物，其中所有3种蛋白质和/或编码的功能性衍生物总共包含等于或少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或大于100，优选不超过20个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸：
在本发明的第四个方面的多核苷酸的另一个实施方案中，所述多核苷酸编码根据表4所示的各个SEQIDNO的同一毒株的腺病毒纤维和六邻体蛋白或其功能性衍生物。在本发明的第四个方面的多核苷酸的另一个实施方案中，所述多核苷酸编码根据表4所示的各个SEQIDNO的同一毒株的腺病毒纤维和五邻体蛋白或其功能性衍生物。在本发明的第四个方面的多核苷酸的另一个实施方案中，所述多核苷酸编码根据表4所示的各个SEQIDNO的同一毒株的腺病毒六邻体和五邻体蛋白或其功能性衍生物。在此上下文中，在每种情况下所述功能性衍生物包含少于1、2、3、4、5、6、7、8、9或少于10，最优选少于3个缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸。
在本发明的第四个方面的另一个优选的实施方案中，所述多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与(i)由SEQIDNO:13、62、63或65中的任一个组成的序列或(ii)由SEQIDNO:13、62、63或65中的任一个组成的并缺乏一个或多个基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3ORF1、E3ORF2、E3ORF3、E3ORF4、E3ORF5、E3ORF6、E3ORF7、E3ORF8、E3ORF9、E4ORF7、E4ORF6、E4ORF5、E4ORF4、E4ORF3、E4ORF2和/或E4ORF1的序列至少90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％，优选98％同一。因此，上述一个或多个基因组区域优选地在测定同一性百分比的比对中不予考虑。在本发明的分离的多核苷酸的另一个优选的实施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO:13、62、63或65或由SEQIDNO:13、62、63或65组成，其中一个或多个基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3ORF1、E3ORF2、E3ORF3、E3ORF4、E3ORF5、E3ORF6、E3ORF7、E3ORF8、E3ORF9、E4ORF7、E4ORF6、E4ORF5、E4ORF4、E4ORF3、E4ORF2和E4ORF1分别从SEQIDNO:13、62、63或65中被缺失或被置换为编码异源蛋白质的转基因或表达盒(如本文中描述的)。在最优选的实施方案中，缺失腺病毒区域E1、E3和/或E4，这也在实施例2中举例说明。上述优选的缺乏一个或多个指示的基因组区域的多核苷酸可进一步包含编码异源蛋白质的多核苷酸序列或包含这样的编码异源蛋白质的多核苷酸序列的表达盒。可将所述编码异源蛋白质的多核苷酸序列和所述包含这样的编码异源蛋白质的多核苷酸序列的表达盒插入例如本发明的多核苷酸的缺失区域，这是本领域所熟知的并也在下面的实施例中描述。所述异源蛋白质可为如本文描述的用于递送至靶细胞的分子，例如编码抗原蛋白或其片段，优选病原体的抗原蛋白或片段例如HIVgag蛋白，肿瘤抗原或单纯疱疹病毒的蛋白质的多核苷酸，如实施例中描述。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的分离的多核苷酸进一步包含编码选自病毒抗原、病原细菌抗原和肿瘤抗原的抗原的多核苷酸。在一个实施方案中，所述异源蛋白质因此可为选自RNA病毒抗原、病原细菌抗原和肿瘤抗原的抗原。抗原指能够在哺乳动物中引起免疫应答的任意蛋白质或肽。抗原优选地包含至少8个氨基酸和最优选包含8至12个氨基酸。因此，当测定序列同一性时，在比对中优选地不考虑基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4，即使用下述序列进行比对，其由SEQIDNO:13、6263或65的全序列组成的但不包括基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4和/或任意编码异源多肽的多核苷酸或包含这样的多核苷酸的表达盒。还如上所述地，优选根据本发明的第四个方面和所有其优选实施方案的多核苷酸编码功能性六邻体、五邻体和/或纤维衣壳蛋白或其功能性衍生物，例如编码的蛋白质具有与感染性腺病毒粒子中的各个衣壳蛋白具有相同的功能。因此，在其衣壳中包含所述编码的重组五邻体、六邻体和/或纤维蛋白或其功能性衍生物的重组腺病毒能够进入宿主细胞。进一步优选根据本发明的或由本发明的多核苷酸编码的衣壳蛋白或其功能性衍生物在人中没有血清阳性率。
本发明还提供了由根据本发明的分离的多核苷酸编码的分离的蛋白质，即由根据本发明的第一、第二和/或第三个方面的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽或其功能性衍生物。在此上下文中，在一个实施方案中的“功能性衍生物”不包含超过5、10或不包括超过25个的氨基酸改变(即缺失的、插入的、修饰的和/或置换的氨基酸)。
本发明还涉及包含根据本发明的分离的多核苷酸的载体。
优选地，载体不包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域中的基因，和/或包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因，其中所述至少一个基因包含使所述至少一个基因无功能的缺失和/或突变。使这些基因产物之一无功能的一种可能是在这些基因的开放阅读框中引入一个或多个人工终止子(例如TAA)。使病毒复制缺陷的方法是本领域熟知的(见例如Brody等人,1994AnnNYAcadSci.,716:90-101)。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码本发明的六邻体蛋白；五邻体蛋白；纤维蛋白；六邻体蛋白和五邻体蛋白；六邻体蛋白和纤维蛋白；五邻体蛋白和纤维蛋白；或六邻体蛋白、五邻体蛋白和纤维蛋白的多核苷酸和还包含另外的腺病毒多核苷酸。因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的分离的多核苷酸包含以下至少一项：
(a)腺病毒5'-反向末端重复(ITR)；
(b)腺病毒E1a区，或其选自13S、12S和9S区的片段；
(c)腺病毒E1b区，或其选自小T、大T和IX区的片段；
(d)腺病毒E2b区，或其选自小pTP、聚合酶和IVa2区的片段；
(e)腺病毒L1区，或其片段，所述片段编码选自28.1kD蛋白、聚合酶、agnoprotein、52/55kDa蛋白和IIIa蛋白的腺病毒蛋白质；
(f)腺病毒L2区或包含编码本发明的五邻体蛋白的多核苷酸的L2区，或其片段，所述片段编码选自五邻体蛋白或本发明的五邻体蛋白、VII、V和Mu蛋白的腺病毒蛋白质；
(g)腺病毒L3区或包含编码本发明的六邻体蛋白的多核苷酸的L3区，或其片段，所述片段编码选自VI蛋白、六邻体蛋白或本发明的六邻体蛋白和内切蛋白酶的腺病毒蛋白质；
(h)腺病毒E2a区；
(i)腺病毒L4区，或其片段，所述片段编码选自100kD蛋白、33kD同源物和蛋白质VIII的腺病毒蛋白质；
(j)腺病毒E3区，或其选自E3ORF1、E3ORF2、E3ORF3、E3ORF4、E3ORF5、E3ORF6、E3ORF7、E3ORF8和E3ORF9的片段；
(k)腺病毒L5区或包含编码本发明的纤维蛋白的多核苷酸的L5区，或其片段，所述片段编码纤维蛋白或本发明的纤维蛋白；
(l)腺病毒E4区，或其选自E4ORF7、E4ORF6、E4ORF5、E4ORF4、E4ORF3、E4ORF2和E4ORF1的片段；特别是所述E4区的ORF6；
和/或
(m)腺病毒3'-ITR。
在上述多核苷酸的一些实施方案中可能也如上所述地希望，优选地，所述多核苷酸不包含如上概述的基因组区域的ORF(例如如在实施例2中定义的区域E3和/或E4)和/或包含下述腺病毒基因，其包含使至少一个基因无功能的缺失和/或突变。在这些优选的实施方案中，合适的腺病毒区将被修饰以不包含上述基因或使选定的基因无功能。任意腺病毒基因缺失将为插入转基因例如如本文描述的小基因盒制造空间。此外，基因缺失可用于产生下述腺病毒载体，其在不使用包装细胞系或辅助病毒的情况下不能复制，这是本领域熟知的。因此，包含如上所述的包含一个或多个特定的基因/区域缺失或丧失功能的突变的多核苷酸的最终重组腺病毒可为例如基因治疗或接种提供更安全的重组腺病毒。
在特别优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含以下至少一项：
(a)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的5'-反向末端重复(ITR)区；
(b)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒E1a区，或其选自13S、12S和9S区的片段；
(c)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒E1b区，或其选自小T、大T和IX区的片段；
(d)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒E2b区；或其选自小pTP、聚合酶和IVa2区的片段；
(e)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒L1区，或其片段，所述片段编码选自28.1kD蛋白、聚合酶、agnoprotein、52/55kDa蛋白和IIIa蛋白的腺病毒蛋白质；
(f)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒L2区，或其片段，所述片段编码选自具有SEQIDNO:31、52或55的氨基酸序列的五邻体蛋白、VII、V和Mu蛋白的腺病毒蛋白质；
(g)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒L3区，或其片段，所述片段编码选自VI蛋白、具有SEQIDNO:25、51或54的氨基酸序列的六邻体蛋白和内切蛋白酶的腺病毒蛋白质；
(h)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒E2a区；
(i)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒L4区，或其片段，所述片段编码选自100kD蛋白、33kD同源物和蛋白质VIII的腺病毒蛋白质；
(j)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒E3区，或其选自E3ORF1、E3ORF2、E3ORF3、E3ORF4、E3ORF5、E3ORF6、E3ORF7、E3ORF8和E3ORF9的片段；
(k)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒L5区，或其片段，所述片段编码具有SEQIDNO:19、50或53的氨基酸序列的纤维蛋白；
(l)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的腺病毒E4区，或其选自E4ORF7、E4ORF6、E4ORF5、E4ORF4、E4ORF3、E4ORF2和E4ORF1的片段；或Ad5E4区的ORF6(SEQIDNO:64)；
和
(m)SEQIDNO:13、62、63或65中任一个的3'-ITR。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸还编码一个或多个优选所有以下腺病毒蛋白质：蛋白质VI、蛋白质VIII、蛋白质IX、蛋白质IIIa和蛋白质IVa2。优选地这些蛋白质由本文公开的PanAd1、PanAd2和PanAd3基因组序列的各自的开放阅读框编码。重组腺病毒领域的一般技术人员熟知如何测定编码上述特定腺病毒蛋白质的开放阅读框。他也知道腺病毒基因组的结构并可以不需过多劳动将本文概述的各个腺病毒区域和ORF定位至例如本发明的新腺病毒基因组PanAd1、PanAd2和PanAd3中的任一个。
为了表达多核苷酸，优选编码本发明的一个或多个腺病毒蛋白质的cDNA，可将所述多核苷酸亚克隆至表达载体，所述表达载体包含引导转录的强启动子，转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域所熟知的，例如大肠杆菌、芽孢杆菌属物种和沙门氏菌，并且用于这些表达系统的试剂盒是可以商业获得的。类似的用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域所熟知的并也可以商业获得。
除了启动子以外，表达载体通常包含转录单位或表达盒，所述转录单位或表达盒包含在宿主细胞中表达腺病毒蛋白质编码核酸所需的所有其他元件。因此一般的表达盒包含与编码腺病毒蛋白质/多肽的核酸序列可操作连接的启动子和转录物有效多聚腺苷酸化所需的信号，核糖体结合位点和翻译终止子。表达盒的其他元件可包括例如增强子。表达盒应也包含结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可从与启动子序列相同的基因中得到，或可从不同的基因得到。
用于运送遗传信息至细胞的具体表达载体不是特别关键。可使用用于在真核或原核细胞中表达的任意传统载体。标准细菌表达载体包括质粒例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D和融合表达系统例如GST和LacZ，但还有许多本领域技术人员已知的可被有效利用的载体。
包含来自真核病毒的调控元件的表达载体通常被用于真核表达载体，例如SV40载体，乳头状瘤病毒载体和EB病毒来源的载体。其他示例性真核载体包括pMSG,pAV009/A.sup.+、pMTO10/A.sup.+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、pcDNA3.1、pIRES和任意其他允许在下述启动子引导下表达蛋白质的载体：例如HCMV即早期启动子、SV早期启动子、SV晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他显示对真核细胞中的表达有效的启动子。
一些表达系统具有提供基因扩增的标记例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。可选地，不涉及基因扩增的高产表达系统也是合适的。
在表达载体中也可包括的元件包括在大肠杆菌中有功能的复制子，编码药物抗性以允许选择含有重组质粒的细菌的基因，和在质粒的非必需区的唯一限制性位点以允许插入真核序列。选择的具体药物抗性基因不是关键的——本领域已知的许多药物抗性基因中的任一种都是合适的。如果需要，任选地选择原核序列使其不干扰DNA在真核细胞中的复制。
可使用标准转染方法产生细菌、哺乳动物细胞、酵母或昆虫细胞系。可使用任意熟知的用于将外源多核苷酸序列引入宿主细胞的程序。例如，可商业获得的基于脂质体的转染试剂盒例如LipofectamineTM(Invitrogen)，可商业获得的基于脂的转染试剂盒例如Fugene(RocheDiagnostics)，基于聚乙二醇的转染，磷酸钙沉淀，基因枪(生物射弹)，电穿孔或病毒感染和可使用任意其他熟知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞的方法。仅需要使用的特定基因工程程序能够成功地将至少一个基因引入能够表达受体的宿主细胞中。
可使用标准技术任选地纯化表达的腺病毒蛋白质。例如，可在细胞进行沉淀和层析步骤前机械地或通过渗压震扰裂解细胞，重组蛋白质的性质和序列将取决于待回收的特定重组材料。可选地，重组蛋白质可以被分泌并从培养重组细胞的培养基中回收，如蛋白质表达领域已知的。
在一个优选的实施方案中，本发明的载体是质粒载体，例如表达载体。根据本发明的质粒也可用于产生重组腺病毒。
因此，本发明的另一个方面是重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据本发明的分离的多核苷酸和/或根据本发明的至少一种分离的腺病毒衣壳多肽。优选地本发明的重组腺病毒包含本发明的六邻体、纤维和五邻体蛋白，例如如在上表2中概述的组合。在优选的实施方案中，重组腺病毒的特征在于其能够感染人细胞——优选在所述腺病毒在人血清中孵育1小时后能够感染人细胞，所述人血清来源于以前从未接触黑猩猩腺病毒的人。
由于提供了本发明的新六邻体、五邻体和纤维蛋白的序列信息，可以获得所述重组腺病毒，例如通过构建由通常的腺病毒蛋白质组成但具有包含至少一种根据本发明的分离的腺病毒衣壳多肽或其功能性衍生物的衣壳的重组腺病毒。在这点上优选重组腺病毒包含含有编码本发明的五邻体蛋白的多核苷酸序列的L2区，含有编码本发明的六邻体蛋白的多核苷酸序列的L3区和/或含有编码本发明的纤维蛋白的多核苷酸序列的L5区。最优选地所述重组腺病毒包含分别编码本发明的五邻体、六邻体和纤维蛋白的L2区、L3区和L5区。
构建重组腺病毒的方法是本领域熟知的。例如在Graham&Prevec,1991InMethodsinMolecularBiology:GeneTransferandExpressionProtocols,(Ed.Murray,EJ.),p.109；和Hitt等人,1997"HumanAdenovirusVectorsforGeneTransferintoMammalianCells"AdvancesinPharmacology40:137-206中综述了制备重组腺病毒的有用技术。在WO2006/086284中描述了其他方法。为了制备复制缺陷的腺病毒，可在补充细胞系(complementingcellline)中表达E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因产物中的一种或几种，所述补充细胞系可用于增殖和挽救不能复制的重组腺病毒，因为其缺乏例如上述基因产物中的一种。这些细胞系的使用也在上述参考中描述。
在一个实施方案中，使用本发明的多核苷酸(或包含本文描述的本发明的所述多核苷酸的载体)产生重组腺病毒颗粒。重组腺病毒优选地如上述在一个或多个腺病毒区域例如E1a或E1b区功能性缺失，和任选地具有其他突变，例如温度敏感突变或在其他腺病毒基因中的缺失。在其他实施方案中，希望在重组腺病毒中保留完整的E1a和/或E1b区。这样的完整E1区可位于其在腺病毒基因组中的天然位置或被置于天然腺病毒基因组中的缺失位点(例如在E3区)。
在构建腺病毒载体以递送基因至宿主例如人(或其它哺乳动物)细胞时，可在本发明的载体中使用一系列腺病毒核酸序列。例如，可从组成重组病毒一部分的腺病毒序列中除去腺病毒延迟早期基因E3的全部或部分。认为猿E3的功能和重组病毒颗粒的功能和产生无关。在某些实施方案中，也可构建具有E4基因的至少ORF6区缺失的，和更理想地因为此区域功能中的冗余性，缺失全部E4区的腺病毒载体。本发明的还另一个载体在延迟早期基因E2a中含有缺失。也可在猿腺病毒基因组晚期基因L1至L5中的任意基因中进行缺失。类似地，在中期基因IX和IVa2中的缺失可用于某些目的。可在其他结构和非结构腺病毒基因中进行其他缺失。可单独使用上面讨论的缺失，即用于本发明的腺病毒序列可仅在单个区域中包含缺失。可选地，可以任意组合使用整个基因的缺失或有效破坏其生物活性的其部分的缺失。例如，在根据本发明的一个示例性载体中，腺病毒序列可具有E1和E4区的缺失，或El,E2a和E3区的缺失，或E1和E3区的缺失，或El,E2a和E4区的缺失，具有或不具有E3缺失，等等。如上讨论地，这些缺失可与其他腺病毒基因突变例如温度敏感突变组合使用以获得预期结果。
可在存在缺少的、对病毒感染性和腺病毒颗粒增殖所必需的腺病毒基因产物的情况下培养缺乏任意必需腺病毒序列(例如选自Ela、Elb、E2a、E2b、E4ORF6、L1或L4的区域)的腺病毒载体。可通过在一种或多种辅助构建体(例如质粒或病毒)或包装宿主细胞(如上所述的补充细胞系)的存在下培养腺病毒载体以提供这些辅助功能。见例如本文包括的实例和1996年5月9日公开的国际专利申请WO96/13597(引入本文作为参考)中所描述的用于制备“最小”人腺病毒载体的技术。
有用的辅助病毒包含补充在本发明的腺病毒载体的优选实施方案中缺失的和/或所述载体转染的包装细胞系不表达的各个基因的选定的腺病毒基因序列。在一个实施方案中，辅助病毒是复制缺陷的并包含除了上述序列以外的多种腺病毒基因。
可也使辅助病毒形成多聚阳离子缀合物，如Wu等人,J.Biol.Chem.,264:16985-16987(1989)；K.J.Fisher和J.M.Wilson,Biochem.J.,299:49(April1,1994)中所述。辅助病毒可任选地包含第二个报告小基因(minigene)。大量这样的报告基因是本领域已知的。在辅助病毒上存在不同于腺病毒载体上的转基因的报告基因允许独立地监控腺病毒载体和辅助病毒二者。在纯化时，此第二个报告基因可用于帮助得到的重组病毒和辅助病毒之间的分离。
为了产生在本文的优选实施方案中描述的缺失任意基因的重组腺病毒(Ad)，如果缺失的基因对病毒的复制和感染性是必需的，优选地通过辅助病毒或细胞系，即补充或包装细胞系提供缺失的基因的功能。在许多情况下，表达人E1的细胞系可用于反式补充用于产生重组腺病毒的载体。这是特别有利地，因为由于在本发明的多核苷酸序列和在目前可利用的包装细胞中发现的人腺病毒E1序列之间的差异，使用目前包含人E1的细胞在复制和生产过程中将避免产生能够复制的腺病毒。然而，在某些情况下，希望使用表达E1基因产物的细胞系以产生E1缺失的重组腺病毒。
如果希望，可使用本文提供的序列以产生在用于在选定的亲本细胞系例如HeLa细胞中表达的启动子的转录控制下在最低程度上表达来自ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2或PanAd3腺病毒的腺病毒E1基因的包装细胞或细胞系。为此可使用诱导型或组成型启动子。例如在本文描述的实施例中提供了启动子的实例。这样的表达E1的细胞系可用于产生重组腺病毒E1缺失的载体。此外，或可选地，本发明提供了表达一种或多种腺病毒基因产物，例如Ela、Elb、E2a和/或E4ORF6，优选Ad5E4ORF6(又见以下实施例)的细胞系，其可使用与在产生重组腺病毒载体中使用的基本上相同的程序构建。可使用这样的细胞系反式补充缺失了编码这些产物的必需基因的腺病毒载体或提供包装辅助依赖病毒(例如腺相关病毒)所必需的辅助功能。
通常，当通过转染递送本发明的包含例如小基因的载体时，以约0.1μg至约100μgDNA，和优选约10至约50μgDNA的量将载体递送至约1x104个细胞至约1x103个细胞，和优选约105个细胞。然而，可根据这些因素如选定的载体、递送方法和选定的宿主细胞来调节载体DNA与宿主细胞的相对量。载体至宿主细胞的引入可通过本领域已知的或本文公开的任意方法完成，包括转染和感染，例如使用CaPO4转染或电穿孔。
为了构建和组装期望的包含小基因的重组腺病毒，在一个实施例中如本领域熟知的可在辅助病毒的存在下将载体体外转染至包装细胞系，从而允许辅助病毒和载体序列之间发生同源重组，使载体中的腺病毒转基因序列能够复制和包装进病毒粒子衣壳，得到重组腺病毒载体颗粒。本发明的重组腺病毒可用于例如将选定的转基因转移至选定的宿主细胞。
在本发明的腺病毒的优选实施方案中，腺病毒在人受试者中具有低于5％的血清阳性率和优选地在人受试者中没有血清阳性率，最优选在以前没有接触黑猩猩腺病毒的人受试者中没有血清阳性率。在此上下文中优选人受试者属于选自欧洲、非洲土著人、亚洲、美洲土著人和大洋洲土著人的种族群。鉴定人受试者的种族起源的方法是本领域包括的(见例如WO2003/102236)。
在根据本发明的重组腺病毒的另一个优选实施方案中，腺病毒DNA能够进入哺乳动物靶细胞，即其具有感染性。本发明的感染性重组腺病毒可用作疫苗和用于基因治疗，也如下述。因此，在另一个实施方案中，优选重组腺病毒包含用于递送至靶细胞的分子。优选地，靶细胞是哺乳动物细胞，例如黑猩猩细胞、啮齿类细胞或人细胞。例如，用于递送至靶细胞的分子可为如本文定义的表达盒。将表达盒引入腺病毒基因组的方法是本领域熟知的(见例如上面提供的文献引用)。在一个实施例中包含编码例如小基因或反义基因的表达盒的本发明的重组腺病毒可通过下述方法产生：用所述表达盒替换选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的腺病毒基因组区域。通过与已知和有注释的腺病毒基因组例如人Ad5的基因组的比对可容易地鉴定本发明的腺病毒的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4(见：Birgitt和ThomasDobner,Oncogene(2001)20,p.7847–7854；和又见:AndrewJ.Davison,等人,“Geneticcontentandevolutionofadenoviruses”,JournalofGeneralVirology(2003),84,p.2895–2908)。在如下实施例1和2和图4中也提供了如何产生包含用于递送至靶细胞的分子的修饰的腺病毒的非限制性实例。
用于递送至靶细胞的分子优选地为多核苷酸，但也可为优选具有治疗或诊断活性的多肽或小化学化合物。在一个特别优选的实施方案中，用于递送至靶细胞的分子是包含腺病毒5’反向末端重复序列(ITR)，基因例如SEQIDNO:1和3’ITR的多核苷酸。对技术人员而言显而易见地，必须选择分子的分子大小使当重组腺病毒在例如包装细胞系中产生时衣壳可在分子周围形成并包装分子。因此，优选地基因是小基因，其可具有例如多达7000和最多可达8000个碱基对。
在优选的实施方案中，在根据本发明的重组腺病毒中包含的用于递送至靶细胞的分子是编码抗原蛋白质或其片段的多核苷酸。抗原蛋白质或其片段能够在哺乳动物中引起免疫应答，在一个特别优选的实施方案中可为如实施例中所示的HIV的gag蛋白并由根据SEQIDNO:1的多核苷酸编码。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的重组腺病毒是已在ECACC(欧洲动物细胞保藏中心(EuropeanCollectionofCellCulture),PortonDown,Salisbury,SP4OJG,UK)保藏的腺病毒并具有选自08110601(ChAd83)、08110602(ChAd73)、08110603(ChAd55)、08110604(ChAd147)和08110605(ChAd146)的保藏号。在2008年11月6日由OkairosAG,Elisabethenstr.3,4051Basel,Switzerland完成了上述腺病毒毒株(腺病毒科，哺乳动物腺病毒属(拉丁文名：Mastadenovirus,Adenoviridae))的保藏。
将根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的《布达佩斯条约》维持这些保藏。仅为本领域技术人员的便利进行这些保藏，根据35U.S.C.112并不承认保藏是必须的。除了根据37C.F.R.1.808(b)在授予专利权方面规定的要求以外，不能取消地去除对公众获得保藏材料的所有限制。
本发明的重组腺病毒的另一个优选的实施方案是由选自08110601(ChAd83)、08110602(ChAd73)、08110603(ChAd55)、08110604(ChAd147)和08110605(ChAd146)的腺病毒衍生的腺病毒。优选地由上述保藏的腺病毒衍生的腺病毒已通过在其基因组中引入功能性缺失、缺失或修饰被改变，例如以得到不能复制的腺病毒和/或在能够在宿主细胞中表达转基因的腺病毒。例如，选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因的一个或多个基因可被缺失、使其无功能和/或可被如上概述的表达盒替换。此外，可引入一个或多个另一种腺病毒的基因，优选地用于缺失的基因。技术人员熟知如何在保藏的毒株中引入这些基因组改变。在这方面，上面已经描述了产生包含保藏毒株的优选修饰的、用于递送至靶细胞的分子的修饰的腺病毒的方法。
在另一个方面提供了组合物，其包含免疫佐剂和以下(i)至(iv)中至少一种：
(i)根据本发明的分离的蛋白质；
(ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
(iii)根据本发明的载体；
(iv)根据本发明的重组腺病毒；
和任选地药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的包含佐剂的组合物可用作疫苗，例如用于人受试者。本文中也被简称为“佐剂”的免疫佐剂与单独施用抗原相比加快、延长和/或增强对抗原/免疫原的免疫应答的质量和/或强度，因此减少在任意给定疫苗中必需的抗原/免疫原的量和/或对目的抗原/免疫原产生足够免疫应答所必需的注射频率。
在根据本发明的组合物的上下文中可使用的佐剂实例是氢氧化铝(矾)的凝胶样沉淀物；AlPO4；铝胶；来自革兰氏阴性细菌外膜的细菌产品，特别是单磷酰脂质A(MPLA)、脂多糖(LPS)、胞壁酰二肽和其衍生物；弗氏不完全佐剂；脂质体，特别是中性脂质体，包含组合物和任选地包含细胞因子的脂质体；非离子嵌段共聚物；ISCOMATRIX佐剂(Drane等人,2007)；包含CpG二核苷酸(CpG基序)的未甲基化DNA，特别是具有硫代磷酸(PTO)骨架(CpGPTOODN)或磷酸二酯(PO)骨架(CpGPOODN)的CpGODN；合成的脂肽衍生物，特别是Pam3Cys；脂阿拉伯甘露聚糖；肽葡聚糖；酵母聚糖；热休克蛋白(HSP)，热别是HSP70；dsRNA和其合成衍生物，特别是PolyI:polyC；聚阳离子肽，特别是聚-L-精氨酸；紫杉酚；纤连蛋白；鞭毛蛋白；咪唑并喹啉；具有佐剂活性的细胞因子，特别是GM-CSF,白介素-(IL-)2、IL-6、IL-7、IL-18，I和II型干扰素，特别是干扰素-γ，TNF-α；25-二羟维生素D3(骨化三醇)；和合成的寡肽，特别是MHCII呈递肽。可使用包含聚氧化乙烯(POE)和聚氧化丙烯(POP)的非离子嵌段共聚物例如POE-POP-POE嵌段共聚物作为佐剂(Newman等人,1998)。此类型的佐剂对包含核酸作为活性成分的组合物特别有用。
任选地，可使用各种药学上可接受的赋形剂。优选的药学上可接受的赋形剂在下面讨论根据本发明的用途时描述。
特定受体的活化可刺激免疫应答。这些受体是熟练技术人员已知的并包括例如细胞因子受体，特别是I型细胞因子受体，II型细胞因子受体，TNF受体；和担当转录因子的维生素D受体；和Toll样受体1(TLR1)、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7和TLR9。这些受体的激动剂具有佐剂活性，即为免疫刺激性的。在优选的实施方案中，本发明的组合物的佐剂可为一种或多种Toll样受体激动剂。在更优选的实施方案中，佐剂是Toll样受体4激动剂。在特别优选的实施方案中，佐剂是Toll样受体9激动剂，其优选地由核苷酸tccatgacgttcctgacgtt(SEQIDNO:2)编码。
在另一个方面，本发明提供了细胞，优选非猿细胞，其包含以下至少一种：
(i)根据本发明的分离的蛋白质；
(ii)根据本发明的分离的多核苷酸；
(iii)根据本发明的载体；
(iv)根据本发明的重组腺病毒。
细胞可选自细菌细胞例如大肠杆菌细胞，酵母细胞例如酿酒酵母或毕赤酵母，植物细胞，昆虫细胞例如SF9或Hi5细胞，或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的优选实例是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚胎肾(HEK293)细胞，HELA细胞，人肝癌细胞(例如Huh7.5)，HepG2人肝癌细胞，Hep3B人肝癌细胞等等。
如果细胞包含根据(ii)的分离的多核苷酸，细胞中存在的此多核苷酸可(i)本身自由地分散，或(ii)整合至宿主细胞基因组或线粒体DNA。
在另一个优选的实施方案中，细胞是表达至少一种选自E1a、E1b、E2a、E2b、E4、L1、L2、L3、L4和L5的腺病毒基因的宿主细胞，优选293细胞或PER.C6TM细胞。
也提供了根据本发明的分离的多核苷酸、根据本发明的分离的蛋白质、根据本发明的载体、根据本发明的重组腺病毒和/或根据本发明的药物组合物用于疾病的治疗或预防的用途。
已证明了腺病毒载体作为疫苗载体的巨大潜力。临床前和临床研究已证明使用此系统在载体设计、稳健的抗原表达和保护性免疫方面的可行性。因此，优选的实施方案是根据本发明的用途，其中治疗或预防是例如对人受试者的接种。本领域包含的大量文献提供了如何使用腺病毒和将其制备用于接种的详细说明，这是技术人员已知的。
如果用途是接种，可以免疫学和/或预防有效剂量即优选1x108至1x1011个病毒颗粒(即1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、2.5x1010或5x1010个颗粒)施用本发明的重组腺病毒。此外，对需要加强的接种，优选应用如上定义的“异源引发-加强”方法。此外，当在疫苗中使用根据本发明的分离的多核苷酸、根据本发明的分离的蛋白质、根据本发明的载体、根据本发明的重组腺病毒和/或根据本发明的药物组合物时，优选所述疫苗包含佐剂。优选的免疫佐剂已在本文中描述并可在这样的疫苗中使用。
使用根据本发明的多核苷酸或重组腺病毒蛋白质或其片段制备的重组腺病毒可用于转导多核苷酸例如DNA至宿主细胞。因此，优选地可制备虽然有感染性即能够进入宿主细胞但复制缺陷的腺病毒以在宿主细胞中表达任意定制的(custom)蛋白质或多肽。因此，在优选的实施方案中，在根据本发明的用途中列举的治疗是基因治疗。如果在基因治疗中使用根据本发明的分离的多核苷酸、分离的蛋白质、载体、重组腺病毒和/或药物组合物并对待治疗的受试者施用，优选其以足够大的剂量施用从而使治疗的结果是患者的一个或多个细胞被转染，即转导。如果通过本文公开的任意优选施用方法施用根据本发明的重组腺病毒和/或药物组合物，优选地施用优选1x108至5x1011个病毒颗粒(即1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、2.5x1010、5x1010、1x1011，或最优选5x1011个颗粒)的有效剂量。在优选的实施方案中，在本发明的重组腺病毒中包含的优选异源多核苷酸能够在受试者的宿主细胞中表达蛋白质或多肽，其中所述蛋白质或多肽包含影响蛋白质或多肽从所述宿主细胞中分泌的信号肽。例如，可使用本发明的腺病毒治疗需要特定蛋白质的患者，所述腺病毒包含编码该蛋白质的可分泌形式的cDNA。
在本发明的用途的另一个实施方案中，将根据本发明的分离的多核苷酸、分离的蛋白质、载体、腺病毒和/或药物组合物(以下称为根据本发明的药物)配制为进一步包含一种或多种药学上可接受的稀释剂；载体；赋形剂，包括填充料、粘结剂、润滑剂、助流剂、崩解剂和吸附剂；和/或防腐剂。
可通过各种熟知的途径施用本发明的药物，包括口服、直肠、胃肠内和胃肠外施用，例如静脉内、肌肉内、鼻内、皮内、皮下和类似的施用途径。优选胃肠外、肌肉内和静脉内施用。优选地将根据本发明的药物配制为糖浆、输注或注射溶液、药片、胶囊、囊片(capslet)、锭剂、脂质体、栓剂、膏药、创可贴、延迟胶囊、粉末或缓释制剂。优选地稀释剂为水、缓冲液、缓冲的盐溶液或盐溶液和载体优选地选自可可油和vitebesole。
用于在本发明的用途中施用根据本发明的药物的特别优选的药物形式是适于可注射的用途的形式并包含用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌水溶液或分散剂和无菌粉末。通常，这样的溶液或分散剂将包含溶剂或分散介质，其包括例如水缓冲的水溶液，例如生物可相容的缓冲液，乙醇，多元醇，例如甘油，丙二醇，聚乙二醇，其合适的混合物，表面活性剂或植物油。
可通过本领域已知的许多技术制备输注或注射溶液，包括但不限于加入防腐剂例如抗细菌或抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯(parabene)、氯丁醇、酚、山梨酸或硫柳汞(thimersal)。此外，可在输注或注射溶液中加入等渗剂，例如糖或盐，特别是氯化钠。
本发明的优选稀释剂是水、生理上可接受的缓冲液、生理上可接受的缓冲盐溶液或盐溶液。优选的载体是可可油和vitebesole。与根据本发明的药物的多种药物形式可一起使用的赋形剂可选自以下非限制性列表：
a)粘结剂例如乳糖、甘露醇、结晶山梨醇、二元磷酸盐、磷酸钙、糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等；
b)润滑剂例如硬脂酸镁、滑石、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、氢化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂酰延胡索酸钠，
c)崩解剂例如淀粉、croscaramellose、甲基纤维素钠、琼脂、膨润土、藻酸、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
其他合适的赋形剂可见AmericanPharmaceuticalAssociation出版的HandbookofPharmaceuticalExcipients，其在本文引入作为参考。
优选特定量的根据本发明的药物用于疾病的治疗或预防。但是应当理解取决于疾病的严重程度、疾病的类型以及待治疗的各个患者，例如患者的一般健康状态等等，需要不同剂量的根据本发明的药物引起治疗或预防作用。合适剂量的确定是主治医生的判断范围内的。
如果使用根据本发明的药物用于预防，可将其配制为疫苗。在这种情况下以上面概述的优选和特别优选剂量优选地施用根据本发明的药物。优选地，在确定的时间段中重复施用疫苗至少2、3、4、5、6、7、8、9或至少10次，直至接种的受试者已产生足够的针对本发明的药物的抗体从而降低发生各个疾病的风险。在这种情况下，取决于疫苗的抗原性，所述时间段通常是可变的。优选地所述时间段不超过4周、3个月、6个月或3年。在一个实施方案中，如果使用根据本发明的腺病毒用于接种的目的，可将六邻体蛋白的至少一个高变结构域替换为接种针对的各自疾病试剂的免疫原性表位。疫苗通常包含一种或多种如上概述的佐剂。在BangariDS和MittalSK(2006)Vaccine,24(7),p.849-862；又见:ZhouD,等人,ExpertOpinBiolTher.2006Jan；6(1):63-72；和:FolgoriA,等人,NatMed.2006Feb；12(2):190-7.；又见:DraperSJ,等人,NatMed.2008Aug；14(8):819-21.Epub2008Jul27中提供了用于接种的腺病毒的用途的详细总结和与其有关的方法。
在不背离本发明的范围下本发明的多种修改和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已结合特定优选的实施方案描述了本发明，应当理解要求保护的本发明不应当不适当地受限于这些特定实施方案。实际上，本发明旨在覆盖对相关领域技术人员而言显而易见的实施本发明的描述方式的多种修改。
下图仅为了说明本发明而不应被解释为限制本发明的范围，在任何方面，本发明的范围由附加的权利要求指出。
附图简述
图1：本发明的多个腺病毒分离株的六邻体蛋白之间的多重序列比对，使用具有默认设置的Clustal-W。显示了所述新黑猩猩腺病毒分离株的六邻体蛋白(名为PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147)。将高变结构域1至7分别称为“HVR1-6”和“HVR7”。
图2：腺病毒ChAd55和其他新黑猩猩腺病毒分离株(名为PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147)的纤维蛋白之间的多重序列比对，使用具有默认设置的Clustal-W。
图3：腺病毒ChAd55和其他新黑猩猩腺病毒分离株(名为PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147)的五邻体蛋白之间的多重序列比对，使用具有默认设置的Clustal-W。
图4：通过野生型病毒基因组和对应的穿梭质粒的同源重组构建复制缺陷的腺病毒载体的图解。又见实施例2。
图5：在接种了包含用于表达HIVgag蛋白(SEQIDNO:1)的表达盒的重组腺病毒的小鼠中的细胞介导的免疫应答。比较了重组人Ad5和黑猩猩ChAd55(图5A)，重组人Ad5和倭黑猩猩PanAd1、PanAd2和PanAd3腺病毒(图5B)，和重组ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147(图5C)的接种效力。通过用定位于Balb/C小鼠的CD8HIVgag表位孵育细胞，通过干扰素-γELIspot测定测量免疫应答。将结果报告为斑点形成细胞/106个脾细胞。
图6：在一组欧洲来源的人血清中评估了新腺病毒载体的血清阳性率。在相同组中平行评估了人腺病毒5型(Ad5)和黑猩猩腺病毒ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、PanAd3和CV-68的血清阳性率。将数据表示为显示免疫阳性率的受试者的％。仅检测到针对Ad5和CV-68腺病毒的中和抗体，但没有检测到针对本发明的新腺病毒中的任一种的中和抗体。
图7：在图7A中显示了BALB/c小鼠的PanAdHSV免疫和在图7B中显示了BALB/c小鼠的PanAd癌症Ag免疫。
图8：在引发/加强接种实验中显示了食蟹猴(Macacafascicularis)的PanAdHIVgag免疫。
实施例
实施例1：腺病毒的分离和表征
ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147是从在不同的欧洲和美国机构中饲养的健康动物中获得一组黑猩猩腺病毒。ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147具有与人血清没有可检测的反应性的性质。PanAd1、PanAd2和PanAd3是从在不同的欧洲和美国机构中饲养的健康倭黑猩猩(PanPaniscus)中分离的新腺病毒。PanAd1、PanAd2和PanAd3具有与人血清没有可检测的反应性的性质。
通过感染接种在96孔板中的293细胞，在第一代扩增后克隆普通黑猩猩和倭黑猩猩腺病毒原种。通过有限稀释在第一代病毒扩增时得到的细胞裂解物进行病毒克隆。挑选出5个分离的克隆并连续增殖。在3-4代连续扩增后，在置于5个双层细胞工厂(NUNC)(2亿细胞/细胞工厂)的细胞上进行腺病毒的大规模制备。通过在氯化铯密度梯度上的2个超速离心步骤从细胞裂解物中得到纯化的病毒颗粒。
通过在1％SDS-TEN中的蛋白酶K(0.5mg/ml)消化(55℃2小时)从3X1012pp的纯化病毒制品中分离基因组DNA。在酚-氯仿抽提和乙醇沉淀后，在水中重悬基因组DNA并用于基因组测序。
通过对六邻体基因的高变区7(HVR7)的序列分析获得新分离株的最初分类。为此在HVR7两侧的高度保守区设计了2个引物：TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA(SEQIDNO.3)和GTGGAARGGCACGTAGCG(SEQIDNO.4)。使用纯化的病毒DNA或粗293裂解物作为模板通过PCR扩增HVR7并且然后测序。通过测序高变区1至6得到有关分离株的更详细的信息。通过PCR使用寡核苷酸HVR1-6fd,CAYGATGTGACCACCGACCG(SEQIDNO.5)和HVR1-6rev,GTGTTYCTGTCYTGCAAGTC(SEQIDNO.6)扩增包含HVR1-6的DNA区域。基于HVR序列分析将新分离的病毒归类为人Ad病毒分类(Horowitz,MS(1990),Adenoviridaeandtheirreplication.InVirologyB.N.Fields和D.M.Knipe,编(ravenPress,NewYork)pp.1679-1740)的亚群E(ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147)和亚群C(PanAd1、PanAd2和PanAd3)。
通过比对人和黑猩猩腺病毒的六邻体氨基酸序列得到系统树。结果与使用AlignX程序(Informax,Inc)基于局限于六邻体HVR1-6和7的核苷酸序列比对的最初分类一致，证明ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147分离株与人Ad4(亚群E)的密切的系统发生关系，而倭黑猩猩腺病毒分离株PanAd1、PanAd2和PanAd3与人Ad1、2、5、6(亚群C)有关。
实施例2：载体构建
根据下述策略在质粒载体中克隆PanAd1、PanAd2和PanAd3以及ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147病毒基因组。对载体基因组的所有操作在大肠杆菌中根据标准技术进行。通过从ChAd和PanAd骨架缺失E1和E3区域构建载体系统。用基于人CMVIE启动子和BGHpA信号的包含HCV非结构区(HCVNS)和HIVgag(SEQIDNO:1)基因的表达盒替换E1区以用于在动物模型中评估免疫学效价。此外，构建了表达分泌的碱性磷酸酶基因(SEAP)的ChAd和PanAd载体用于中和测定。根据标准方案在293细胞中增殖载体并通过CsCl梯度纯化。
按照以下提供的步骤进行PanAd1、PanAd2和PanAd3ΔE1载体的构建。
I.PanAd穿梭载体的构建
使用PanAd1基因组构建穿梭载体，用于通过PanAd1、PanAd2和PanAd3全基因组的同源重组的克隆。简单地说，如下构建用于克隆倭黑猩猩腺病毒1的穿梭载体，在本文中将其称为pBAd1RLD_EGFP：
通过PCR使用寡核苷酸5’-ATCTGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG-3’(SEQIDNO:7)和5’-TCAGGAACTAGTTCCGTATACCTATAATAATAAAACGGAGACTTTG-3’(SEQIDNO:8)扩增PanAd1左端(nt1-450)，用SpeI和EcoRI消化，然后连接至已包含HCMV-EGFP-bghpolyA表达盒的质粒载体从而产生pBAd1-L。然后通过PCR使用寡核苷酸5’-TCCAGCGGCGCGCCAGACCCGAGTCTTACCAGGA-3’(SEQIDNO:9)和5’-ATTCAGGATCCGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG-3’(SEQIDNO:10)扩增PanAd1右端(nt37362-37772)，然后克隆至pBAd1-L，由此产生质粒pBAd1-RL。
然后通过PCR使用寡核苷酸5’-TATTCTGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGCG-3’(SEQIDNO:11)和5’-TTACTGGCGCGCCTGCCTCGAGTAAACGGCATTTGCAGGAGAAG-3’(SEQIDNO:12)扩增包含pIX编码区的PanAd1DNA片段(nt3498-4039)，然后将其克隆至pBAd1-RL，得到pBAd1RLDEGFP穿梭质粒。通过置换pBAd1RLDEGFP穿梭质粒中的EGFP基因也构建了包含分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、HIVgag、HCV非结构区(NS)基因的表达盒的穿梭质粒。
如Emini等人,国际公开号WO03/031588中所描述的构建基于人巨细胞病毒(HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号(BghpolyA)的HIVgag、HCVNS区、SEAP和EGFP表达盒。病毒DNA表达盒被设计为包含仅在2个ITR的末端存在的限制酶位点(PmeI)以允许从质粒DNA中释放病毒DNA。
II.ΔE1PanAd1、PanAd2和PanAd3载体的构建
通过在大肠杆菌菌株BJ5183中的同源重组构建PanAd1、PanAd2和PanAd3载体。用PanAd1、2和3的纯化病毒DNA和pBAd1RLD-EGFP或pBAd1RLD-Gag共转化BJ5183细胞。在线性化pBAd1RLD-EGFP或pBAd1RLD-Gag末端存在的pIX基因、右ITRDNA序列和病毒基因组DNA之间的同源重组允许病毒基因组DNA通过同时缺失E1区(其被表达盒置换)插入质粒载体。此策略允许构建表达EGFP或HIVgag转基因的preadeno质粒pPanAd1、pPanAd2和pPanAd3。然后通过替换EGFP或Gag表达盒将SEAP或HCV-NS表达盒克隆至pPanAd1、2和3载体。
III.E3区的缺失
通过使用包括在大肠杆菌中的克隆和同源重组的若干步骤的策略在PanAd1,PanAd2和PanAd3载体骨架中引入E3区的缺失。PanAd1E3缺失跨越基因组PanAd1序列(SEQIDNO.:13)的第28636位核苷酸至第32596位核苷酸；PanAd2E3缺失跨越基因组PanAd2序列(SEQIDNO.:62)的第28653位核苷酸至第32599位核苷酸；PanAd3E3缺失跨越基因组PanAd3序列(SEQIDNO.:63)的第28684位核苷酸至第32640位核苷酸。
IV.E4区的缺失
缺失PanAd1,PanAd2和PanAd3的天然E4区并替换为Ad5E4ORF6编码序列(SEQIDNO.:64)。在PanAd1,2和3骨架中引入的E4缺失的坐标如下：
PanAd1E4缺失跨越第34690至37369位核苷酸(SEQIDNO.:13)；
PanAd2E4缺失跨越第34696至37400位核苷酸(SEQIDNO.:62)；
PanAd3E4缺失跨越第34690至37369位核苷酸(SEQIDNO.:63)。
缺失的区域包括所有PanAdE4ORF但E4的天然启动子和多聚腺苷酸化信号未被缺失。
如Emini等人,国际公开号WO03/031588中所描述的构建基于人巨细胞病毒(HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号(BghpolyA)的HIVgag和HCVNS区表达盒并利用HCMV和BghpolyADNA序列之间的同源性通过在大肠杆菌菌株BJ5183中的同源重组插入PanAd1、2和3ΔE1EGFP载体。
V.ChAd55DE1表达载体的构建和挽救
构建用于ChAd55克隆的穿梭载体
根据上面描述的构建PanAd载体的相同策略构建ChAd55穿梭质粒，然后用于克隆ChAd55病毒基因组。为此，用AscI限制酶线性化包含病毒基因组右端和左端的穿梭载体pARSChAd55(左端从ITR至pIX基因具有E1区被缺失并被置换为表达盒)并与ChAd55的纯化病毒DNA共转化至大肠杆菌菌株BJ5183。在线性化pARSChAd55以及ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147的纯化病毒基因组DNA末端存在的pIX基因和右ITR之间的DNA序列的同源重组允许病毒基因组DNA通过同时缺失E1区插入质粒载体。图4提供了黑猩猩腺病毒55(ChAd55)基因组克隆策略的图解。
构建了基于人巨细胞病毒(HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号(BghpolyA)的表达盒以表达分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、EGFP、HIVgag、HCVNS基因。将所有表达盒插入将要通过同源重组转移至ΔE1腺病毒预质粒(pre-plasmid)的pARSChAd55载体的单个SnaBI位点中。
实施例3：免疫实验
使用表达HIVgag转基因的载体在小鼠中评估了ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3载体作为潜在的重组疫苗的效力。在平行进行的免疫实验中比较了ChAd55gag和人Ad5gag的载体效价。对10只动物的实验组在四头肌内注射108vp/小鼠载体剂量的Ad5gag或ChAd55gag(图5A)。在单独的实验中对5只动物的实验组注射108vp/小鼠载体剂量的Ad5gag或PanAd1gag,PanAd2gag和PanAd3gag(图5B)。通过用108vp/小鼠载体剂量的ChAd55gag平行免疫5只小鼠的实验组也测定了ChAd73gag、ChAd83gag、ChAd146gag和Chad147gag的效价(图5C)。通过在脾细胞上的干扰素-γElispot测定测量针对HIVgag引起的免疫应答。相比人Ad5gag载体，ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147以及PanAd1、PanAd2和PanAd3在免疫实验中的结果显示本发明的新腺病毒在引发特异性免疫应答方面至少和现有技术的重组腺病毒Ad5一样有效。
实施例4：中和研究
进行了中和测定以评估针对普通黑猩猩腺病毒55、73、83、146、147和倭黑猩猩腺病毒1、2和3型的中和抗体在人血清中的阳性率。该测定评估了血清预孵育对携带分泌的碱性磷酸酶(SEAP)基因的ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3转导人293细胞的能力的影响。将中和滴度定义为使在具有病毒、缺乏血清的阳性对照中观察到的SEAP活性减少50％的血清稀释度。在多个稀释度上(5个4倍递增，从1/18稀释开始至1：4608)检测了每种血清样品。样品在37℃预孵育1小时，然后加入到接种至96孔板的293细胞中(3x104个细胞/孔)。检测了一组人血清的中和活性。对Ad5和黑猩猩和倭黑猩猩AdSEAP载体平行检测了相同的组。图6提供了结果。结果显示对黑猩猩腺病毒的血清阳性率低于人腺病毒Ad5。然而，通常在受试者的子集中可检测到针对已描述的ChAd(CV-68)的中和抗体的存在。相反地，目前检测的所有人血清不能中和ChAd55以及PanAd1、PanAd2和PanAd3，甚至在极低的滴度上。对ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147观察到相同的结果。因此，新腺病毒分离株ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147以及PanAd1、PanAd2和PanAd3代表了限制基于普通人Ad血清型例如Ad5的病毒载体的施用的先存抗人Ad免疫力问题的理想解决方案。
实施例5：与Ad5载体相比PanAd1和3载体的免疫效力
使用表达单纯疱疹病毒(HSV)抗原的载体和使用表达癌症抗原的载体在BALB/c小鼠中评估了PanAd1和PanAd3载体作为潜在的重组疫苗的效力。比较了表达HSVAg和癌症Ag的PanAd1和3的载体效价与基于人Ad5的对应载体。
为了评估抗病毒效价，对9组BALB/c小鼠在四头肌内以从107vp/小鼠开始直到109vp/小鼠的递增载体剂量平行注射PanAd1-HSV、PanAd3-HSV和Ad5-HSV(见图7A)。通过在与覆盖抗原的全部氨基酸序列的肽库孵育的小鼠脾细胞上的干扰素-γElispot测定来测量针对HSV抗原引起的免疫应答。在图7中报告的与人Ad5载体比较的PanAd1,PanAd2和PanAd3的免疫实验结果显示本发明的新腺病毒比现有技术的重组腺病毒Ad5在每个检测的浓度上均更有效地引起特异性免疫应答。在使用PanAd1和PanAd3载体免疫的小鼠中观察到的更高频率的抗原特异性T细胞明确证明了这一点。
通过对BALB/c小鼠组在四头肌内注射从107vp/小鼠开始直到109vp/小鼠的递增载体剂量免疫小鼠评估PanAd载体引起抗肿瘤T细胞应答的效力。对2组BALB/C小鼠以107vp/小鼠和109vp/小鼠注射表达肿瘤抗原的Ad5载体。平行地用107、108、109vp的携带相同肿瘤抗原的PanAd1或PanAd3载体免疫3组BALB/C小鼠。通过在脾细胞上使用表示已定位的CD8表位的单个肽的干扰素-γElispot测定来测量T细胞应答。图7B中显示的结果证明与用Ad5载体免疫的动物组相比，用PanAd载体免疫的动物组在最低载体剂量上应答的动物频率更高和抗原特异性T细胞的频率更高。
实施例6：用PanAd载体免疫食蟹猴
采用异源引发/加强方案通过肌肉内注射CsCl纯化的PanAd1和PanAd3免疫2组猕猴，每组3只。在第0周，组1中的每只动物在三角肌内接受108vp剂量的PanAd3Gag载体，而组2中的动物接受1010vp剂量。然后在第13周用1010vpPanAd1Gag的单一剂量加强两组中的所有动物。
通过IFN-γELISPOT测定在不同时间点测量CMI。此测定测量HIV抗原特异性CD8+和CD4+T淋巴细胞应答。制备了基于HIVGag蛋白的氨基酸序列的肽用于这些测定以测量接种腺病毒载体的猴子中的免疫应答。各个肽具有20-mer的重叠，10个氨基酸的偏移。
IFNγ-ELISPOT测定提供了抗原特异性T淋巴细胞应答的定量测定。连续稀释PBMC并将其置于用抗-恒河猴IFN-γ抗体(MD-1U-Cytech)包被的微板孔中。它们与HIVGag肽库一起培养20小时，导致前体细胞的再激发和IFN-γ的分泌。洗去细胞，留下在细胞存在的集中区域中与抗体包被的孔结合的分泌的IFN。用生物素化的抗-恒河猴IFN抗体(检测AbU-Cytech)和之后用碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素(Pharmingen13043E)检测捕获的IFN。不可溶的碱性磷酸酶底物的加入导致孔中在细胞存在(located)的位点处的暗斑，在分泌了IFN-γ的每个T细胞上留下一个斑点。
每个孔中的斑点数与抗原特异性T细胞的前体频率直接相关。在此测定中选择干扰素γ作为直观的细胞因子(使用特异性抗-干扰素γ单克隆抗体)，因为它是活化的T淋巴细胞合成和分泌的最常见的细胞因子和最大量的细胞因子之一。在此测定中，测定了样品在存在或缺乏(培养基对照)肽抗原时的斑点形成细胞数(SFC)/百万个PBMC。图8显示了在剂量1后和剂量2后的不同时间点获得的PBMC的来自猕猴的数据。在两种剂量上用PanAd3引发的所有动物显示了针对HIVGag的T细胞应答，通过PanAd1的第二次注射的有效加强证明：如六邻体、五邻体和纤维蛋白序列比对已暗示的，PanAd1和PanAd3是不同的血清型并可以在异源引发-加强免疫方案中组合。因此，在另一个方面，本发明提供了本发明的2种重组腺病毒在异源引发-加强免疫中的用途，其中本发明的2种重组腺病毒是不同的腺病毒血清型，最优选如本文描述的PanAd1和PanAd3。

Claims (19)

1.一种多核苷酸，其包含：
(i)一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:53中氨基酸序列的多肽；和
(b)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:53中氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的功能性衍生物；
(ii)一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒六邻体蛋白，并且所述多核苷酸选自：
(c)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:54中氨基酸序列的多肽；和
(d)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:54中氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的功能性衍生物；和
(iii)一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒五邻体蛋白，并且所述多核苷酸选自：
(e)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:55中氨基酸序列的多肽；和
(f)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:55中氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
2.根据权利要求1的多核苷酸，其另外包含以下至少一项：
(a)腺病毒5’-端，优选腺病毒5’反向末端重复，
(b)腺病毒E1a区或其选自13S、12S和9S区的片段，
(c)腺病毒E1b区或其选自小T、大T和IX区的片段，
(d)腺病毒E2b区或其选自小pTP、聚合酶和IVa2区的片段，
(e)腺病毒L1区或其片段，所述片段编码选自28.1kD蛋白、聚合酶、agnoprotein、52/55kDa蛋白和IIIa蛋白的腺病毒蛋白质；
(f)腺病毒L2区或其片段，所述片段编码选自VII、V和Mu蛋白的腺病毒蛋白质，
(g)腺病毒L3区或其片段，所述片段编码选自VI蛋白和内切蛋白酶的腺病毒蛋白质，
(h)腺病毒E2a区，
(i)腺病毒L4区或其片段，所述片段编码选自100kD蛋白、33kD同源物和蛋白质VIII的腺病毒蛋白质，
(j)腺病毒E3区或其选自E3ORF1、E3ORF2、E3ORF3、E3ORF4、E3ORF5、E3ORF6、E3ORF7、E3ORF8和E3ORF9的片段，
(k)腺病毒L5区，
(l)腺病毒E4区或其选自E4ORF7、E4ORF6、E4ORF5、E4ORF4、E4ORF3、E4ORF2和E4ORF1的片段，和/或
(m)腺病毒3’-端，优选腺病毒3’反向末端重复。
3.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸由下述多核苷酸组成或包含下述多核苷酸：其在全长上与基本上由SEQIDNO:63组成的序列或由SEQIDNO:63组成但缺乏SEQIDNO:63的基因组区域E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4的序列至少90％相同。
4.一种由根据权利要求1的分离的多核苷酸编码的分离的腺病毒衣壳多肽，或其功能性衍生物。
5.一种载体，其包含根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸。
6.根据权利要求5的载体，其中所述载体不包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域中的基因，和/或包含选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因，其中所述至少一个基因包含使所述至少一个基因无功能的缺失和/或突变。
7.一种重组腺病毒，优选不能复制的腺病毒，其包含根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸和/或至少一种根据权利要求1的分离的多核苷酸(i)、(ii)或(iii)中任一项的腺病毒衣壳多肽，其中所述重组腺病毒包含用于递送至靶细胞的分子。
8.根据权利要求6的重组腺病毒，其中所述腺病毒在人受试者中具有低于5％的血清阳性率和优选在人受试者中无血清阳性率，和/或其中所述腺病毒能够感染哺乳动物细胞。
9.根据权利要求7-8中任一项的重组腺病毒，其中所述用于递送至靶细胞的分子是编码抗原蛋白或其片段的多核苷酸。
10.一种组合物，其包含佐剂和以下(i)至(iv)中至少一项：
(i)根据权利要求4的腺病毒衣壳多肽，
(ii)根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸，
(iii)根据权利要求5-6中任一项的载体，
(iv)根据权利要求7-9中任一项的重组腺病毒，
和任选地，药学上可接受的赋形剂。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述佐剂是受体的激动剂，所述受体选自I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、TNF受体、担当转录因子的维生素D受体、以及Toll样受体1(TLR1)、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7和TLR9。
12.根据权利要求11的组合物，其中所述佐剂是Toll样受体4或9激动剂。
13.一种细胞，其包含以下至少一项：
(i)根据权利要求4的腺病毒衣壳多肽，
(ii)根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸，
(iii)根据权利要求5-6中任一项的载体，
(iv)根据权利要求7-9中任一项的重组腺病毒。
14.根据权利要求13的细胞，其中所述细胞是表达至少一种选自E1a、E1b、E2a、E2b、E4、L1、L2、L3、L4和L5的腺病毒基因的宿主细胞。
15.根据权利要求12的组合物用于疾病的治疗或预防的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中所述治疗或预防是接种。
17.根据权利要求15的用途，其中所述治疗是基因治疗。
18.一种分离的多核苷酸，其编码腺病毒纤维蛋白或其功能性衍生物，并且所述多核苷酸选自：
(a)多核苷酸，其编码具有根据SEQIDNO:14-19、50和53中任意氨基酸序列的多肽，
(b)多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:14-19、50和53中任意多肽的功能性衍生物，其中所述功能性衍生物包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或置换，和
(c)多核苷酸，其编码具有在全长上与SEQIDNO:14-19、50和53中任意氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的功能性衍生物。
19.一种重组腺病毒，其包含：
(i)由根据SEQIDNO:14的氨基酸序列组成的腺病毒纤维蛋白；
(ii)由根据SEQIDNO:20的氨基酸序列组成的腺病毒六邻体蛋白；和
(iii)根据SEQIDNO:26的氨基酸序列组成的腺病毒五邻体蛋白；
其中所述腺病毒是由已被保藏且具有保藏号ECACC08110603的腺病毒衍生的。
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