CN101248186A

CN101248186A - 不含腺病毒的重组腺病毒载体的快速生产

Info

Publication number: CN101248186A
Application number: CNA2006800269435A
Authority: CN
Inventors: D·C·唐; J·张; K·R·范坎彭
Original assignee: Vaxin Inc
Current assignee: Kent R van Kampen
Priority date: 2005-05-23
Filing date: 2006-05-23
Publication date: 2008-08-20
Also published as: AU2006249877A1; JP2008541730A; ZA200710860B; EP1899470A4; WO2006127956A3; EP1899470A2; US20090175897A1; CA2609276A1; WO2006127956A2; KR20080052512A

Abstract

总的来说，本发明涉及基因治疗、免疫学和疫苗技术领域。更具体而言，本发明涉及可以快速产生不含可复制腺病毒(RCA)的高效价腺病毒载体的新型系统。还提供了产生这些不含RCA的腺病毒载体的方法，包含这些不含RCA的腺病毒载体的免疫原性或疫苗组合物，在这些腺病毒载体中表达目的异源核酸的方法，和使用这些腺病毒载体引起免疫原性应答的方法。

Description

不含腺病毒的重组腺病毒载体的快速生产

与相关申请的交叉参照

本申请要求于2005年5月23日提交的美国临时申请系列号60/683,638的优先权。

还提及的是于2002年1月18日提交的美国专利申请系列号10/052,323；于2002年4月5日提交的10/116,963；于2003年1月16日提交的10/346,021和美国专利号6,706,693；6,716,823；6,348,450，以及于1998年8月13日提交的PCT/US/98/16739。

本文中引用的这些申请、专利中的每一个和每个文件，以及这些申请、专利和文件中的每一个中引用的每个文件(“申请引用的文件”)，以及在申请及其专利的文本中或其依法进行过程中申请引用的文件中参考或引用的每个文件，以及在其依法进行过程中提出的支持专利性的所有争辨，在此引入本文作为参考。

发明领域

总的来说，本发明涉及免疫学、基因治疗和疫苗技术领域。更具体而言，本发明涉及可以快速产生不含可复制腺病毒(RCA)的高效价腺病毒载体的新型系统。还提供了产生这些不含RCA的腺病毒载体的方法，包含这些不含RCA的腺病毒载体的免疫原性或疫苗组合物，在这些腺病毒载体中表达目的异源核酸的方法，和使用这些腺病毒载体引起免疫原性应答的方法。

发明背景

流感病毒是重新席卷以及浮现的针对公共卫生的微生物威胁。由该病毒造成的呼吸道感染通常伴随咳嗽、发热和肌痛。致死性流感毒株的出现(Subbarao等人，1998)和产生设计的流感病毒的允许技术的开发(Hoffmann等人，2002；Neumann等人，1999)已发出如下警告信号，通过恶意人士意图作为致死性武器或失能剂散播的毒性流感毒株或编码外毒素的人造病毒可以使某一区域瘫痪。目前可用的、得到临床许可的流感疫苗由三价灭活病毒组成，所述三价灭活病毒自20世纪40年代早期已肌内施用(Pfleiderer等人，2001)。使用这些疫苗每年秋季的接种疫苗在保护人们免于遭受这种接触性传染病方面是有效的(Nichol等人，1995)。然而，需要含胚鸡蛋以产生疫苗限制了疫苗生产的速度。可以想象当超过计算的新流感病毒株出现时，鸡场被禽流感破坏，和/或生产设备变得被污染，如2004年的情况，将出现流感疫苗缺乏。

近来，已开发了活减毒流感病毒疫苗(FluMist^TM)作为用于流感接种疫苗的无针可替代物(Hilleman，2002)。活减毒疫苗通过鼻内喷雾剂直接向呼吸道施用，以预防健康儿童、青少年和成年人(年龄5-49岁)中的流感。如同灭活流感病毒疫苗，活减毒流感病毒疫苗也在含胚鸡蛋中生产。尽管蛋中鸡病原体的存在对于甲醛杀死的病毒疫苗不是问题，但这对于活减毒流感病毒疫苗是生物危害。通过活减毒和野生流感病毒之间重组产生的可能有害的重配提出了另一个生物危害忧虑。活减毒流感疫苗的鼻内接种也与轻度不利事件相关，例如鼻漏、咽喉痛或低热。此外，活减毒病毒在复制期间可能破坏上呼吸道中的上皮细胞，从而为具有肺并发症的继发感染铺路(Hilleman，2002；Marwick，2000)。

在含胚鸡蛋中生产活减毒和灭活流感病毒疫苗的需要对流感疫苗的流水线制备造成主要障碍，因为该过程是耗时的且某些流感病毒株在蛋中不会繁殖至高效价(Van Kampen等人，2005)。人可以通过鼻内和局部应用腺病毒(Ad)运载的流感疫苗有效且安全地被免疫的证明(Van Kampen等人，2005)代表了用于以不依赖含胚鸡蛋的及时方式制备流感疫苗的新方法。

腺病毒作为疫苗载体是有利的，因为Ad载体能够原位转导有丝分裂和有丝分裂后的细胞(Shi等人，1999)，可以制备包含高效价病毒的原液(超过10¹¹pfu/ml)，从而使得可能以高感染复数(MOI)原位转导细胞。此外，根据其作为疫苗的长期使用，Ad载体是安全的。病毒可以诱导高水平的异源核酸表达，且载体由于多功能性可以在大的程度上被工程改造。结果已显示E1/E3缺陷型Ad5载体作为鼻疫苗载体的效力不受动物模型中针对Ad5的任何先前存在的免疫抑制(Shi等人，2001；Xiang等人，1996)。在Ad5运载的鼻流感疫苗的效力和人中先前存在的抗Ad5中和抗体效价之间同样没有关联(Van Kampen等人，2005)。与基因治疗不同，Ad运载的疫苗通过免疫反应级联触发免疫应答，而无需临界水平的异源核酸表达。复制缺陷型Ad运载的鼻流感疫苗应比FluMist^TM更安全，因为后者在呼吸道中复制、且通过与其他循环毒株或重组形式的遗传重配可能促成新流感病毒株的产生。此外，Ad运载的流感疫苗的制备可以是流水线化的，因为它不需要含胚鸡蛋。

构建复制缺陷型重组Ad载体的常规方法需要一系列耗时和耗力步骤，涉及哺乳动物包装细胞中的2个转染的质粒之间的同源重组(Graham和Prevec，1995)。同源重组可以在大肠杆菌(E.coli)中进行(Chartier等人，1996；He等人，1998)的发现，通过允许重组在细菌细胞中过夜发生且消除蚀斑纯化的需要而使程序流水线化。AdEasy系统(He等人，1998)例示了通过大肠杆菌中的同源重组用于产生重组Ad的快速跟踪系统。参见图6。一般地，编码卡那霉素(Kan)抗性的线性化穿梭载体质粒与编码氨苄青霉素(Amp)抗性的腺病毒主链质粒(例如，pAdEasy1)混合，随后共转化到感受态大肠杆菌BJ5183细胞内。随后选择重组体的Kan抗性，且通过大小与限制性内切核酸酶分析结合进行鉴定。最后，重组Ad载体通过将重组质粒转染到哺乳动物包装细胞系(例如，293细胞)内来产生。

在AdEasy系统中在大肠杆菌中生产重组载体的关键步骤可以通过在递送穿梭载体质粒之前预先选择Ad主链质粒得到增强(Zeng等人，2001)。可以想象在转化后只有小部分pAdEasy1质粒库可以被允许在大肠杆菌细胞中继续存在，因为通过例如沿着其长DNA链产生缺口使大质粒[pAdEasy1的大小为33kb(He等人，1998)]有缺陷的可能性很高，和/或使大质粒与细胞复制机器连接的效率可能低。穿梭载体质粒和Ad主链质粒之间的同源重组因此对于产生可选的重组质粒是起反作用的，所述Ad主链质粒在大肠杆菌细胞中不能作为复制子存在，因为此类重组体是无效的。2步AdEasier系统(Zeng等人，2001)通过下列确保同源重组以生产方式发生：预先消除缺陷的和非复制Ad主链质粒，从而在选择重组体过程中允许更高的成功率(AdEasy^TM XLadenoviral vector system；Strategies 15(3)：58-59，2002)。总之，这种2步转化规程在涉及细菌中的同源重组的系统中可以具有广泛效用。

关于由人293细胞产生的E1缺失Ad载体的关键问题是可复制腺病毒(RCA)的出现。这些污染物通过293细胞展示的构成E1基因座的相同序列与载体主链之间的同源重组出现(Robert等人，2001；Zhu等人，1999)。RCA代表生物危害，因为如同野生型Ad，它可以在感染的宿主中复制且潜在地可能引起疾病。不含RCA的Ad载体已使用PER.C6相容的穿梭质粒例如pAdApt在PER.C6细胞中产生(Fallaux等人，1998)。PER.C6基因组中的Ad5核苷酸459-3510排除了与基于pAdApt的穿梭质粒(Crucell)的双交换型同源重组，所述基于pAdApt的穿梭质粒不包含任何重叠序列。Ad原液中RCA的消除减少了暴露于潜在癌基因E1a的危险和由Ad在宿主中复制诱导的发病机制。

然而，PER.C6顺应的基于pAdApt的穿梭质粒的使用不顺应在大肠杆菌中与pAdEasy1的同源重组，因为它的“左臂”腺病毒序列缺掉了。通过将pAdApt和Ad主链质粒共转染到PER.C6细胞内产生重组Ad载体(Fallaux等人，1998)是耗时且耗力的。一般地，对于通过使用在大肠杆菌细胞中发生同源重组无需2-3个蚀斑纯化循环的AdEasy系统构建新Ad载体，可以节省大约1-2个月的时间。

因此，本领域存在快速制备安全流感疫苗的需要，优选使用腺病毒载体系统。然而，目前的腺病毒载体，尤其是由人细胞例如293细胞产生的那些，主要通过产生RCA可能携带疾病的危险。本发明通过提供用于快速产生基于腺病毒的疫苗或免疫原性组合物的新型系统来解决这2个问题，所述疫苗或组合物还包含安全性增加的附加利益。

发明概述

长久以来已寻找用于产生流感疫苗的快速生产系统，以帮助对抗每年流感爆发的战斗。致死性流感毒株的出现(Subbarao等人，1998)和设计的流感病毒用作生物武器的可能性(Hoffmann等人，2002；Neumann等人，1999)强调了开发新技术用于快速生产流感疫苗的紧急。本发明通过提供尤其是新型腺病毒载体和用于产生高效价疫苗的方法来解决本领域的这些问题，所述方法通过以及时的方式产生不含RCA(可复制腺病毒)、编码异源核酸例如但不限于流感抗原的Ad载体来实现。该方法消除了在含胚鸡蛋中培养流感病毒的需要(VanKampen等人，2005)，促进通过鼻喷雾剂施用非复制流感疫苗(Shi等人，2001；Van Kampen等人，2005)，且减少了生产时间以及成本。

在本发明的第一个方面，提供了重组腺病毒载体，其包括包含SEQID NO：1的第一种腺病毒序列、启动子序列、多克隆位点(MCS)、转录终止子、包含SEQ ID NO：2的第二种腺病毒序列、包含SEQ IDNO：4的第三种腺病毒序列，其中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4包含允许在原核细胞中在重组腺病毒穿梭质粒和腺病毒主链质粒之间发生同源重组的重叠序列。

在一个实施方案中，启动子选自巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、β肌动蛋白启动子、清蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子、疱疹病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、或任何其他真核启动子。

转录终止子可以是SV40多腺苷酸化信号、或任何其他真核多腺苷酸化信号。细菌复制起点可以来源于pBR322复制起点。在另一实施方案中，腺病毒穿梭和主链质粒中的抗生素抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因和zeocin抗性基因。

原核细胞可以是大肠杆菌，优选大肠杆菌BJ5183细胞。

在优选实施方案中，腺病毒穿梭载体是pAdHigh，其包括包含来源于腺病毒血清型5序列1-454的第一种腺病毒序列、启动子序列、MCS、转录终止子、包含来源于腺病毒血清型5序列3511-6055的包含pIX启动子的第二种腺病毒序列、细菌复制起点和抗生素抗性基因，其中所述第一种腺病毒序列和第二种腺病毒序列包含允许在原核细胞中在重组腺病毒穿梭质粒和腺病毒主链质粒之间发生同源重组的序列。

本发明的另一方面提供了产生基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒的方法，其包括：将第一种穿梭质粒和第二种穿梭质粒共转化到原核细胞内，其中第一种穿梭质粒包含第一种腺病毒序列和第一种抗生素抗性基因；且其中第二种穿梭质粒包含第二种腺病毒序列和第二种抗生素抗性基因，所述第二种腺病毒序列包含第一种穿梭质粒中不存在的另外腺病毒序列，且所述第二种抗生素抗性基因不同于所述第一种抗生素抗性基因，其中共转化允许在第一种和第二种穿梭质粒之间发生同源重组，且其中表达第一种和第二种穿梭质粒中的两种抗生素抗性基因的原核转化体包含第一种重组腺病毒穿梭质粒；从原核细胞回收第一种重组穿梭腺病毒质粒(pAdHighβ)；将AdHigh穿梭质粒和腺病毒主链质粒共转化到原核细胞(例如，大肠杆菌BJ5183)内，其中原核转化体产生编码转基因的第二种重组腺病毒质粒；从原核细胞回收第二种重组腺病毒质粒；用第二种重组腺病毒质粒转染PER.C6细胞；和从PER.C6细胞回收重组腺病毒，其中所述重组腺病毒基本上不含RCA。

包含Ad5序列459-3510的其他细胞也可以用作包装细胞系，用于由AdHigh系统生产不含RCA的Ad载体。

在一个实施方案中，为了产生pAdHigh穿梭质粒，第一种穿梭质粒是pShuttle-CMV。在另一实施方案中，第二种穿梭质粒是pAdApt(Havenga，MJ.，等人，2001；von der Thüsen，J.H.等人，2004)。

在pAdHigh中存在但在pShuttleCMV中缺掉的另外腺病毒序列(He等人，1998)包含腺病毒血清型5的腺病毒核苷酸342-454，和来自腺病毒血清型5的腺病毒核苷酸3511-3533。核苷酸3511-3533之间的区段是腺病毒pIX启动子的部分。功能性pIX启动子的缺乏可以解释为什么AdEasy系统在293细胞中产生高效价Ad但在PER.C6细胞中则不是，因为前者表达pIX而后者则不。

原核细胞可以是大肠杆菌，优选大肠杆菌BJ5183。

本发明的另一方面提供了产生基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒的方法，其包括：用一种或多种限制性内切核酸酶消化第一种和第二种穿梭质粒，其中第一种穿梭质粒包含第一种腺病毒序列，且其中第二种穿梭质粒包含第一种穿梭质粒中不存在的另外腺病毒序列；切除包含来自第二种穿梭质粒的另外腺病毒序列的片段；将片段插入到合适位点内以置换第一种穿梭质粒的配对物片段，从而产生遗传缺陷(例如有缺陷的pIX启动子)被修复的第一种重组腺病毒质粒；将第一种重组腺病毒穿梭质粒(pAdHighα)和腺病毒主链质粒共转化到原核细胞内，其中原核转化体产生第二种重组腺病毒质粒；从原核细胞回收第二种重组腺病毒质粒；将第二种重组腺病毒质粒转染到PER.C6细胞内；和从细胞回收重组腺病毒，其中所述重组腺病毒基本上不含RCA。

本发明还提供了免疫原性组合物，其包含与药学可接受的赋形剂混合的重组腺病毒，所述重组腺病毒基本上不含可复制腺病毒(RCA)、表达一种或多种目的异源核酸。

在一个实施方案中，一种或多种目的异源核酸包含来源于流感毒株的流感基因，所述流感毒株包含流感A、流感B、流感C、循环重组形式、杂交形式、临床分离物和野外分离物。流感基因可以包含流感血凝素基因、流感基质基因、流感神经氨酸酶基因和流感核内蛋白基因。免疫原性组合物可以进一步包含佐剂。

本发明的另一方面提供了免疫原性组合物，其包含与药学可接受的赋形剂混合的重组腺病毒，所述重组腺病毒基本上不含可复制腺病毒(RCA)、表达一种或多种流感免疫原。

在本发明的另一方面，提供了在基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒中表达一种或多种目的异源核酸的方法，其包括下列步骤：用一种或多种限制性内切核酸酶消化本发明的腺病毒载体DNA，从而使腺病毒载体线性化；将一种或多种异源核酸连接到腺病毒载体内，其中一种或多种异源核酸与启动子序列可操作地连接；将腺病毒载体DNA转染到PER.C6或其他包装细胞内；和从细胞回收表达一种或多种目的异源核酸的重组腺病毒。

本发明还提供了在有此需要的受试者中引起针对流感的免疫原性应答的方法，其包括给所述受试者施用免疫有效量的本发明组合物。

本发明进一步提供了在目的细胞中引入和表达一种或多种异源核酸的方法，其包括使细胞与基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒接触，其中所述重组腺病毒表达一种或多种异源核酸，和在足以表达异源核酸的条件下培养细胞或维持具有所述细胞的动物。

本发明还提供了包含本发明的pAdHigh穿梭质粒、腺病毒主链质粒和大肠杆菌BJ5183细胞的试剂盒。

这些及其他实施方案由下列详细描述公开、或由于下列详细描述是显而易见的，且由下列详细描述包含。

附图简述

作为例子给出但不希望将本发明限制于所述具体实施方案的下列详细描述，可以结合引入本文作为参考的附图进行理解，其中：

图1是pShuttleCMV穿梭质粒的质粒图。

图2是pAdApt穿梭质粒的质粒图。

图3描述了pShuttleCMV穿梭质粒和pAdApt穿梭质粒之间的同源重组。pShuttle-CMV编码卡那霉素(Kan)抗性基因，pAdApt-Tc编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tc)抗性基因。只有重组体可以给予对Kan和Tc两者的抗性。质粒中的个别区段通过特定颜色进行标记且通过特定带色的图例指出。

图4是pAdHighβ穿梭质粒的质粒图。

图5的一般示意图描述了使用pAdHigh和Ad主链质粒构建重组Ad载体。

图6的图显示了编码流感HA基因的AdApt、AdEasy和AdHighα衍生的腺病毒载体在293和PER.C6细胞中的繁殖。

图7的图显示了AdHighα和AdApt衍生的腺病毒载体在引起血凝抑制抗体效价中的效力。

SEQ ID NO：1指腺病毒血清型5的核苷酸1-454。

SEQ ID NO：2指腺病毒血清型5的核苷酸3511-5796。

SEQ ID NO：3指腺病毒血清型5的核苷酸3511-6095。

SEQ ID NO：4指腺病毒血清型5的核苷酸34931-35935。

发明详述

在本公开内容中，“包含”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法中归于其的含义，且可以意指“包括”；“基本上由......组成”也具有美国专利法中归于其的含义，且该术语是开放式的，从而允许存在超过所述的那种，只要所述那种的基本或新特征不被超过所述那种的存在改变，但现有技术实施方案除外。

术语“核酸”或“核酸序列”指单或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。该术语包含核酸，例如包含天然核苷酸的已知类似物的寡核苷酸。该术语还包含具有合成主链的核酸样结构，参见，例如，Eckstein，1991；Baserga等人，1992；Milligan，1993；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，1997；Strauss-Soukup，1997；Samstag，1996。

如本文使用的，“重组体”指在体外合成或以其他方式操作的多核苷酸(例如重组多核苷酸)，使用重组多核苷酸在细胞或其他生物学系统中生产基因产物的方法，或由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组手段”还包含将来自不同来源、具有各种编码区或结构域或启动子序列的核酸切除和连接到表达盒或载体内，用于在本发明的载体中表达例如诱导型或组成型表达多肽编码序列。

术语“异源的”当关于核酸使用时指核酸在它通常在自然界中未发现的细胞或病毒中；或包含2个或更多个子序列，所述子序列不是以与自然界中通常发现的相同的彼此关系发现，或被重组工程改造，从而使得其表达水平、或与细胞中的其他核酸或其他分子的物理关系、或结构通常在自然界中未发现。例如，异源核酸一般由重组产生，具有来自无关基因、以自然界中未发现的方式排列的2个或更多个序列；例如，插入本发明的基于腺病毒的载体内与启动子序列可操作连接的人基因。作为例子，目的异源核酸可以编码免疫原性基因产物，其中腺病毒作为疫苗或疫苗组合物治疗性或预防性地施用。异源序列可以包含启动子和序列的各种组合，所述组合的例子在本文中详细描述。

“抗原”是由免疫系统识别且诱导免疫应答的物质。这个上下文中使用的类似术语是“免疫原”。

术语“末端反向重复序列”或“ITR”指该术语关于腺病毒的通常用法，且包括功能上等价的所有ITR序列及其变异，例如该术语指位于线性腺病毒基因组侧面(右和左侧上)、且是腺病毒基因组核酸复制必需的序列组(基序)。本发明的载体和载体系统的Ad序列两侧是优选来源于血清型5腺病毒的ITRs。在不同血清型腺病毒之间的ITR内存在高度的序列保守(参见，例如Schmid，1995)。

“受试者”在本发明的上下文中可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物或鱼；更有利地，人、或伴侣或驯养或生产食物或生产饲料或家畜或狩猎或竞赛或运动动物，例如但不限于牛、犬、猫、山羊、绵羊、猪、马和禽类。优选地，脊椎动物是人。因为所有脊椎动物的免疫系统类似地运作，所以描述的应用可以在所有脊椎动物系统中实现。

基因或核酸的“表达”不仅包含细胞基因表达，而且还包含核酸在克隆系统和任何其他背景中的转录和翻译。

术语“基因产物”主要指由其他核酸(例如，非编码和调节RNAs例如tRNA、sRNPs)编码的蛋白质和多肽。

如本文使用的，“载体”是允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。例如，在重组DNA技术中使用的某些载体允许实体例如DNA区段(例如异源DNA区段)被转移到靶细胞内。本发明包含重组腺病毒载体。

术语“质粒”指DNA转录单位，其包含根据本发明的多核苷酸和其重组、复制到Ad内、且在宿主中表达转基因所需的元件。优选环状质粒形式，它可以是超螺旋的或不是超螺旋的。线性形式也包括在本发明的背景中。

关于在载体中表达的外源DNA(例如编码目的表位和/或抗原和/或治疗剂)和提供此类外源DNA的文件，以及关于用于增强核酸分子表达的转录和/或翻译因子的表达，以及关于术语例如“目的表位”、“治疗剂”、“免疫应答”、“免疫学应答”、“保护性免疫应答”、“免疫学组合物”、“免疫原性组合物”和“疫苗组合物”和其他的事物，参考于1999年11月23日授权的美国专利号5,990,091，以及WO 98/00166和WO99/60164，以及其中引用的文件及那个专利和那些PCT申请依法进行中记录的文件；所有这些引入本文作为参考。因此，美国专利号5,990,091以及WO 98/00166和WO 99/60164、以及其中引用的文件及那个专利和那些PCT申请依法进行中记录的文件、以及本文引用或以其他方式引入本文作为参考的其他文件，可以在本发明实践中进行参考；并且其中引用的所有外源核酸分子、启动子和载体可以在本发明实践中使用。在这点上，还可以提及美国专利号6,706,693；6,716,823；6,348,450；美国专利申请系列号10/424,409；10/052,323；10/116,963；10/346,021；和来自PCT/US98/16739的于1999年2月25日公开的WO9908713。

如本文使用的，术语“免疫原性组合物”和“免疫学组合物”和“免疫原性或免疫学组合物”包含引起针对目的异源核酸的免疫应答的任何组合物，所述目的异源核酸由本发明的腺病毒载体和病毒表达；例如，在施用到受试者内后，引起针对靶定的目的免疫原或抗原的免疫应答。术语“疫苗的组合物”和“疫苗”和“疫苗组合物”包含诱导针对一种或多种目的抗原的保护性免疫应答的任何组合物，或有效针对抗原保护的任何组合物；例如，在施用或注射到受试者内后，引起针对靶定的抗原或免疫原的保护性免疫应答，或提供针对由本发明的发明性腺病毒载体表达的抗原或免疫原的有效保护。术语“药物组合物”指包含表达治疗蛋白质的载体的任何组合物，所述治疗蛋白质如，例如促红细胞生成素(EPO)或免疫调谐蛋白例如GM-CSF。

“免疫有效量”是编码目的基因的重组载体的量或浓度，所述量或浓度当给受试者施用时，产生针对目的基因产物的免疫应答。

“循环重组形式”指已在2种或更多种亚型或毒株中经历遗传重配的重组病毒。在本发明的上下文中使用的另一术语是“杂交形式”。

“临床分离物”指例如常用的实验室病毒株，其从感染的患者中分离、且用实验室适应的高生长穿梭病毒主毒株在实验室细胞或受试者中进行重申。

“野外分离物”指从感染的患者中或从环境中分离的病毒。

本发明的方法可以作为预防接种适当地应用于预防疾病，或作为治疗接种提供针对疾病症状的减轻。

本发明的重组载体可以单独或作为免疫学组合物的部分给受试者施用。本发明的重组载体也可以通过蛋白质的体内表达用于将蛋白质递送给目的受试者、或给目的受试者施用蛋白质。

应当指出依照本发明获得的免疫学产物和/或抗体和/或表达的产物可以在体外表达和以其中此类免疫学和/或表达的产物和/或抗体一般使用的方式使用，且表达此类免疫学和/或表达的产物和/或抗体的细胞可以在体外和/或先体外后体内应用中使用，例如此类用途和应用可以包括诊断、测定、先体外后体内疗法(例如，其中表达基因产物和/或免疫学应答的细胞在体外扩增且再引入宿主或动物内)等，参见美国专利号No.5,990,091、WO 99/60164和WO 98/00166以及其中引用的文件。此外，根据本文的方法分离，或由根据本文的施用方法在体外扩增的细胞中分离的表达的抗体或基因产物，可以在组合物中施用，类似于亚单位表位或抗原或治疗剂或抗体的施用，以诱导免疫、刺激治疗应答和/或刺激被动免疫。

术语“腺病毒”如本文使用的意欲包含所有腺病毒，包括腺胸腺病毒属(Atadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽腺病毒属(Aviadenovirus)。迄今为止，超过51种人血清型的腺病毒已被鉴定(参见，例如，Fields等人，Virology 2，第67章(第3版，Lippincott-Raven Publishers)。腺病毒可以为血清群A、B、C、D、E或F。腺病毒可以是血清型2(Ad2)、血清型11(Ad11)、血清型35(Ad35)，或优选地，血清型5(Ad5)，但不限于这些例子。

腺病毒是无包膜DNA病毒。来源于腺病毒的载体具有使得它们对于基因转移特别有用的众多特征。如本文使用的，“重组腺病毒载体”是携带一种或多种异源核苷酸序列(例如，2、3、4、5或更多种异源核苷酸序列)的腺病毒载体。例如，腺病毒的生物学被详细表征，腺病毒与严重的人病理学无关，该病毒在将其DNA导入宿主细胞内方面极其有效，该病毒可以感染广泛多样的细胞且具有广泛的宿主范围，该病毒可以相对容易地大量产生，且该病毒可以通过病毒基因组早期区1(“E1”)中的缺失而导致复制缺陷。

腺病毒(“Ad”)的基因组是大约36,000个碱基对(“bp”)的线性双链DNA分子，具有与每条链的5’末端共价结合的55-kDa末端蛋白质。Ad DNA包含约100bp的相同末端反向重复序列(“ITRs”)，确切长度取决于血清型。病毒复制起点位于正好在基因组末端处的ITRs内。DNA合成在2个阶段中发生。首先，复制通过链置换进行，从而产生子代双链体分子和亲本置换链。置换链是单链的且可以形成所谓的“锅柄(panhandle)”中间物，这允许复制起始和产生子代双链体分子。可替代地，复制可以从基因组的2个末端同时进行，从而消除了形成锅柄结构的需要。

在生产性感染循环期间，病毒基因在2个时期中表达：早期，这是直至病毒DNA复制的时间段，和晚期，这与病毒DNA复制起始相符。在早期期间，只表达由区域E1、E2、E3和E4编码的早期基因产物，它们执行为细胞合成病毒结构蛋白作准备的许多功能(Berk，A.J.1986)。在晚期期间，除早期基因产物之外还表达晚期病毒基因产物，且宿主细胞DNA和蛋白质合成被关闭。因此，细胞变成献身于生产病毒DNA和病毒结构蛋白(Tooze，J.，1981)。

腺病毒的E1区是感染靶细胞后腺病毒表达的第一个区域。这个区域由2个转录单位——E1A和E1B基因组成，这2种基因都是原代(胚胎)啮齿类动物培养物致癌性转化所需的。E1A基因产物的主要功能是诱导休眠细胞进入细胞周期且重新开始细胞DNA合成，和转录激活病毒基因组的E1B基因及其他早期区(E2、E3和E4)。用E1A基因单独转染原代细胞可以诱导无限制的增殖(无限增殖化)，但不会导致完全转化。然而，在大多数情况下E1A的表达导致诱导程序性细胞死亡(细胞凋亡)，且只是偶尔获得无限增殖化(Jochemsen等人，1987)。需要E1B基因的共表达以防止诱导细胞凋亡和发生完全形态学转化。在确立的无限增殖化细胞系中，E1A的高水平表达在不存在E1B的情况下可以引起完全转化(Roberts等人，1981)。

E1B编码的蛋白质帮助E 1A更改细胞功能方向以允许病毒复制。E1B 55kD和E433kD蛋白质形成基本上位于核内的复合物，发挥作用抑制宿主蛋白质合成和促进病毒基因表达。它们的主要影响是伴随感染晚期的开始确立病毒mRNAs从核到细胞质的选择性转运。E1B 21kD蛋白质对于生产性感染循环的正确时序控制是重要的，从而防止宿主细胞在病毒生活周期已完成前过早死亡。不能表达E1B 21kD基因产物的突变型病毒显示感染循环缩短，这伴随宿主细胞染色体DNA过量降解(deg表型)和致细胞病变效应增强(cyt表型；Telling等人，1994)。当另外E1A基因突变时，deg和cyt表型被抑制，从而表明这些表型是E1A的功能(White等人，1988)。此外，E1B 21kDa蛋白质减慢E1A接通其他病毒基因的速度。E1B 21 kD猝灭这些E1A依赖性功能的机制仍未知。

与例如逆转录病毒相反，腺病毒不整合到宿主细胞基因组内，能够感染不分裂细胞，且能够在体内有效转移重组基因(Brody等人，1994)。这些特征使得腺病毒成为用于将例如目的异源核酸体内基因转移到有此需要的细胞、组织或受试者内的有吸引力的候选物。

本发明的使用腺病毒重组体的实施方案可以包括E1缺陷或缺失、E3缺陷或缺失、和/或E4缺陷或缺失的腺病毒载体，或其中所有病毒基因都缺失的“无内容”腺病毒载体。腺病毒载体可以包含E1、E3或E4基因中的突变，或这些或所有腺病毒基因中的缺失。E1突变增加了载体的安全极限，因为E1缺陷型腺病毒突变体据说在非许可细胞中是复制缺陷型的，且最低限度地，是高度减毒的。E3突变通过破坏腺病毒下调MHCI类分子的机制来增强抗原的免疫原性。E4突变通过抑制晚期基因表达来减少腺病毒载体的免疫原性，从而可以允许利用相同载体的重复再接种。本发明包含了在E1、E3、E4、E1和E3、以及E1和E4中缺失或突变的任何血清型或血清群的腺病毒载体。本发明还包含了人Ad5毒株的腺病毒。

“无内容”腺病毒载体是腺病毒载体家族中的最新模型。它的复制需要辅助病毒以及表达E1a和Cre两者的特定人293细胞系，这是在天然环境中不存在的条件；该载体失去所有病毒基因，因此该载体作为疫苗载体是非免疫原性的且可以多次接种用于再接种。“无内容”腺病毒载体还包含36kb的空间用于容纳一种或多种目的异源核酸，从而允许将大量抗原或免疫原共递送到细胞内。

本领域已知的其他腺病毒载体系统包括AdEasy系统(He等人，1998)和随后改良的AdEasier系统(Zeng等人，2001)，它们被开发为通过允许穿梭质粒和Ad主链质粒之间的同源重组在大肠杆菌中过夜发生，在293细胞中快速产生重组Ad载体。然而，呈现对人应用的可能生物危害的低水平RCA污染了在293细胞中产生的Ad载体。RCA的产生是由于Ad载体和293细胞基因组之间的重叠序列(Fallaux等人，1998；Zhu等人，1999)。

尽管在与PER.C6相容的穿梭质粒结合转染Ad主链质粒后，已在PER.C6细胞中产生了不含RCA的Ad载体，所述穿梭质粒不包含与PER.C6基因组的任何重叠序列(Fallaux等人，1998)，但在与大肠杆菌细胞中的AdEasy重组系统比较时，通过人细胞背景中的同源重组用于构建Ad载体的方法是耗时的。AdEasy衍生的Ad载体可以在PER.C6细胞中快速产生，然而，这种方法产生低效价[＜10⁸蚀斑形成单位(pfu)/ml]，可能是由于不能由PER.C6包装细胞系反式互补的pShuttleCMV中的缺陷序列(He等人，1998)。

不含RCA的Ad运载的流感疫苗的快速和高效价生产可以通过下述来完成，修复pShuttleCMV中的缺陷序列，以产生在本发明实施方案中限定的、命名为pAdHigh的新穿梭质粒。预期Ad运载的流感疫苗可以与AdEasy一样快速地由AdHigh产生，因为2个系统中的穿梭质粒包含用于在大肠杆菌优选大肠杆菌BJ5183背景中，与腺病毒主链质粒pAdEasy1(He等人，1998)同源重组的相同组分。

pAdEasy1包含的腺病毒序列在与表达目的异源核酸的穿梭质粒例如pShuttle-CMV和pAdHigh重组时，导致产生包装成腺病毒壳体的、编码异源核酸(例如，免疫原和/或治疗基因)的E1/E3缺陷型腺病毒基因组。pAdEasy1序列是本领域众所周知的，且可公开获得和可通过Stratagene商业获得。与AdEasy衍生的Ad载体相反，AdHigh衍生的Ad载体繁殖至与PER.C6相容性载体衍生的配对物的那种一样高的效价，且在PER.C6细胞中生产时避免RCA污染，因为，AdHigh衍生的Ad载体中的Ad序列等同于由PER.C6相容性穿梭质粒pAdApt(Crucell；Leiden，荷兰)产生的其配对物。

本发明提供了产生新型腺病毒穿梭质粒的方法，所述穿梭质粒顺应不含RCA的Ad载体的生产，所述方法包括将第一种和第二种穿梭质粒共转化到原核细胞内，其中第一种穿梭质粒包含腺病毒序列的子片段和第一种抗生素抗性基因，且其中第二种穿梭质粒包含腺病毒序列的子片段和第二种抗生素抗性基因，所述腺病毒序列的子片段包含在第一种穿梭质粒中不存在的腺病毒序列，且所述第二种抗生素抗性基因不同于第一种抗生素抗性基因。在这种方法中，pAdHigh通过2种穿梭质粒的同源重组产生，所述2种穿梭质粒包含的腺病毒序列是产生不含RCA的重组腺病毒所需的。

第一种穿梭质粒可以是pShuttleCMV，或另一种穿梭质粒，其包含的腺病毒序列在与来源于另一种质粒的腺病毒序列的同源重组中有用。pShuttleCMV是商购可得的并且其序列存在于公开的域中(He等人，1998)。pShuttleCMV包含可以用于插入一种或多种目的异源核酸的多克隆位点，所述多克隆位点与CMV启动子可操作地连接。pShuttleCMV还包含卡那霉素抗性基因。

第二种穿梭质粒可以是pAdApt(Fallaux等人，1998；von derThüsen，J.H.等人，2004；Havenga，M.J.，2001)，其包含的腺病毒序列子片段包含第一种穿梭质粒中不存在的另外腺病毒序列。第二种穿梭质粒例如pAdApt中存在的另外序列包括来源于Ad5的序列，但还包含来自其他腺病毒血清型的序列。这些序列包含对应来自Ad5的腺病毒序列1-454的SEQ ID NO：1，和对应来自Ad5的腺病毒序列3511-6095的SEQ ID NO：3。本发明还包含来自其他腺病毒血清型的相应序列的使用，所述其他腺病毒血清型包括但不限于Ad2、Ad7、Ad 11和Ad35。技术人员熟悉序列比对的方法，例如BLAST(Altschul，S.F.等人，(1990)，它可以鉴定其他腺病毒血清型或血清群中的合适序列。包含这些序列或其序列变体的任何穿梭质粒都可以在本发明的方法中使用。

本发明涉及通过下列方法产生重组腺病毒质粒：如上所述的第一种和第二种穿梭质粒的同源重组，或切除来自第二种穿梭质粒的另外腺病毒序列且通过连接将所述序列插入第一种穿梭质粒内。在一个实施方案中，本发明提供了产生pAdHigh的方法，其通过下述实现：用一种或多种限制性内切核酸酶消化第一种和第二种穿梭质粒，其中第一种穿梭质粒包含第一种腺病毒序列和第一种抗生素抗性基因，且其中第二种穿梭质粒包含第一种穿梭质粒中不存在的另外腺病毒序列，将另外的腺病毒序列插入第一种穿梭质粒内，从而产生第一种重组腺病毒穿梭质粒pAdHighα。无需过度实验，本领域技术人员熟悉核酸克隆和操作的方法。

质粒的回收是本领域众所周知的，且可以通过裂解原核转化体(此类方法包括但不限于，弗氏压碎器、碱裂解、氮空化)和通过除了别的以外的氯化铯离心、乙醇沉淀、柱层析(例如Qiagen prep)纯化质粒来完成。转染细胞的任何方法都可以在本发明的方法中使用。此类方法包括使用磷酸钙沉淀、阳离子脂质、脂质体、显微注射和通过病毒递送的感染。

本发明的腺病毒载体对于在体外和体内将核酸递送给细胞有用，具体地，本发明的载体可以有利地用于将核酸递送或转移给动物，更优选哺乳动物细胞。目的核酸包括编码肽和蛋白质的核酸，优选治疗性(例如对于医学或兽医学用途)或免疫原性(例如对于疫苗)肽或蛋白质。

优选地，编码目的异源核酸的密码子是“人源化的”密码子，例如密码子是高度表达的人基因中频繁出现的那些，而不是由例如流感频繁使用的那些密码子。此类密码子选择提供了异源核酸在人或其他动物细胞中的有效表达。密码子选择模式是用于许多种类的高度表达基因的文献(例如，Nakamura等人，1996；Wang等人，1998；McEwan等人，1998)中已知的。

作为进一步的可替代方案，腺病毒载体可以用于感染培养中的细胞或动物以表达所需基因产物，例如，以生产目的蛋白质或肽。优选地，蛋白质或肽被分泌到培养基内且可以使用本领域已知的常规技术从其中纯化。指导蛋白质的细胞外分泌的信号肽序列是本领域已知的，且编码其的核苷酸序列可以通过本领域已知的常规技术，与编码目的肽或蛋白质的核苷酸序列可操作地连接。可替代地，细胞可以被裂解且表达的重组蛋白质可以从细胞裂解物纯化。细胞可以是真核的。优选地，细胞是动物细胞(例如昆虫、禽类或哺乳动物)，更优选哺乳动物细胞。还优选的是能够通过腺病毒转导的细胞。

此类细胞包括PER.C6细胞、911细胞和HEK293细胞。PER.C6细胞是有用的，这是由于PER.C6细胞繁殖不含RCA的Ad载体的能力。PER.C6细胞是用互补无复制能力的腺病毒生产的E1基因区段转导的原代人成视网膜细胞，但设计成防止通过同源重组产生RCA。PER.C6在于1997年1月3日公开的WO 97/00326中描述，其内容引入本文作为参考。另外，应当指出HEK 293细胞(Graham等人，1977)携带可以与本发明的腺病毒序列重组以产生RCA的重叠序列。

本发明还提供了用作疫苗的载体。免疫原或抗原可以在腺病毒壳体中呈递，可替代地，抗原可以由导入重组腺病毒基因组内且由本发明的腺病毒携带的异源核酸表达。腺病毒载体可以提供任何目的免疫原。目的免疫原是本领域众所周知的，且包括但不限于来自人免疫缺陷病毒的免疫原(例如，包膜蛋白，例如gp160、gp120、gp41)、流感病毒、gap蛋白质、癌抗原、HBV表面抗原(以针对肝炎免疫)、狂犬病糖蛋白等。免疫原的另外例子在本文详细描述。

一种或多种异源核苷酸序列优选与合适的表达控制序列可操作地结合。表达载体包括表达控制序列，例如复制起点(这可以是细菌起源的，例如，来源于细菌载体例如pBR322，或真核起源的，例如自主复制序列(ARS))、启动子、增强子、和必要的信息加工位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点、包装信号和转录终止序列。

例如，本发明的重组腺病毒载体优选包含与待递送给靶细胞的一种或多种异源核酸序列可操作地结合的，合适的转录/翻译控制信号和多腺苷酸化信号(例如，来源于牛生长激素的多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号)。取决于所需水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。取决于所需表达模式，启动子可以是组成型或诱导型的(例如，金属硫蛋白启动子)。启动子可以是天然或外来的，且可以是天然或合成序列。外来意指转录起始区域在所述转录起始区域所导入其中的野生型宿主中未发现。启动子这样进行选择，从而使得它将在一种或多种目的靶细胞或组织中发挥功能。本发明预期了脑特异性、肝特异性和肌肉特异性(包括骨骼肌、心肌、平滑肌和/或膈肌特异性)启动子。哺乳动物启动子也是优选的。

启动子可以有利地是“早期”启动子。“早期”启动子是本领域已知的且定义为驱动基因表达的启动子，所述基因在不存在从头蛋白质合成的情况下快速和瞬时表达。启动子还可以是“强”或“弱”启动子。术语“强启动子”和“弱启动子”是本领域已知的，且可以通过启动子处的转录起始的相对频率(次数/分钟)来定义。“强”或“弱”启动子还可以通过其与痘病毒RNA聚合酶的亲和力来定义。

更优选地，一种或多种异源核苷酸序列可以与例如人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、β肌动蛋白启动子、清蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子或劳斯肉瘤病毒启动子可操作地结合。其他表达控制序列包括来源于免疫球蛋白基因、腺病毒、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等的启动子。任何哺乳动物病毒启动子也可以在本发明实践中使用。已推测使用CMV启动子驱动异源核苷酸转录导致在免疫活性动物中的表达下调(参见，例如，Guo等人，1996)。因此，还优选使异源核苷酸序列与改良的CMV启动子可操作地结合，所述改良的CMV启动子不导致这种异源核酸表达下调。

本发明的载体还可以包含多克隆位点(“MCS”)，它可以有利地位于第一种启动子的下游。MCS提供了用于插入与启动子序列“符合读框”的异源核酸分子的位点，从而导致启动子序列与目的异源核酸“可操作地连接”。多克隆位点是本领域技术人员众所周知的。如本文使用的，术语“可操作地连接”意指所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中。

取决于载体，当用于重组载体的体外扩增和纯化时，且为了监控穿梭质粒和腺病毒载体之间的同源重组，可以存在编码抗生素抗性的选择标记。本发明的方法描述了促进穿梭质粒和腺病毒载体之间在重叠序列处的同源重组。每种载体包含不同的抗生素抗性基因，且通过双重选择可以选择表达重组载体的重组体。可以掺入本发明载体内的此类抗生素抗性基因的例子包括但不限于，除了别的以外的氨苄青霉素、四环素、新霉素、zeocin、卡那霉素、博来霉素、潮霉素、氯霉素。

在其中存在超过一种异源核苷酸序列的实施方案中，异源核苷酸序列可以与单个上游启动子以及一种或多种下游内部核糖体进入位点(IRES)序列(例如，小RNA病毒EMC IRES序列)可操作地结合。

在其中一种或多种异源核苷酸序列将在靶细胞中被转录且随后被翻译的本发明实施方案中，一般需要特异性起始信号用于有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些外源翻译控制序列可以包括ATG起始密码子和相邻序列，可以具有多种天然和合成起源。

治疗肽和蛋白质包括但不限于，囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)、肌养蛋白(包括肌养蛋白小基因的蛋白质产物，参见，例如Vincent等人，1993)、utrophin(Tinsley等人，1996)、凝血因子(例如，因子XII、因子IX、因子X等)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β珠蛋白、α珠蛋白、血影蛋白、α抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子、细胞因子、自杀基因产物(例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子)、赋予对癌症治疗中使用的药物抗性的蛋白质、肿瘤抑制基因产物(例如，p53、Rb、Wt-1)，以及在有此需要的受试者中具有治疗作用的任何其他肽或蛋白质。

本发明提供的重组载体还可以编码免疫调谐分子，它可以充当佐剂以引起体液和/或细胞免疫应答。此类分子包括细胞因子、共刺激分子、或可以改变免疫应答进程的任何分子。一种或多种所述分子可以包含编码此类免疫调谐分子的基因，例如但不限于GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白细胞介素2基因、白细胞介素12基因和干扰素基因。本领域技术人员可以设想其中这项技术可以被改进以再进一步增强抗原和/或免疫原的免疫原性的途径。

本发明还涉及其中外源核酸分子编码一种或多种抗原或其部分的此类方法，例如来自病原体的一种或多种目的表位，例如修饰变应性应答的表位、抗原或基因产物，修饰生理功能的表位抗原或基因产物，流感血凝素，流感核内蛋白，流感M2，破伤风毒素C片段，炭疽保护性抗原，炭疽致死因子，狂犬病糖蛋白，HBV表面抗原，HIV gp120，HIV gp160，人癌胚抗原，疟疾CSP，疟疾SSP，疟疾MSP，疟疾pfg，和结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)HSP；和/或治疗性或免疫调谐基因、共刺激基因和/或细胞因子基因。

根据本发明的优选实施方案，重组载体表达编码或表达流感免疫原或抗原的核酸分子。具体地，编码产物的任何或所有流感基因或可读框(ORFs)可以被分离、表征和插入载体重组体内。优选的流感基因或ORFs包括但不限于，血凝素、核内蛋白、基质和神经氨酸酶。所得到的重组腺病毒载体用于免疫或接种受试者。

本发明还提供了引起针对流感的免疫应答的方法。流感是引起遍及全世界的严重呼吸系统疾病的、有包膜的单链负义RNA病毒。它是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的唯一成员且已分成3类亚群，A、B和C。流感病毒体由包含单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核(螺旋状核蛋白质)，和由基质蛋白(M)衬里的外部脂蛋白包膜组成。流感A的节段基因组由8个线性、负极性、单链RNAs分子组成(对于流感C是7个)，所述RNAs编码10种多肽，包括：RNA指导的RNA聚合酶蛋白质(PB2、PB1和PA)和形成核壳体的核内蛋白(NP)；基质蛋白(M1、M2)；由脂蛋白包膜伸出的2种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；以及功能未知的非结构蛋白质(NS1和NS2)。基因组的转录和复制在核内发生且经由在质膜上出芽发生装配。病毒基因在混合感染期间可以重配(例如，经历同源重组)。

流感病毒经由HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸寡糖。病毒体胞吞后，HA分子中的构象变化在细胞内体内发生，这促进膜融合，从而触发脱壳。核壳体迁移至核，在其中病毒mRNA被转录作为感染中的必需起始事件。病毒mRNA通过独特机制进行转录，其中病毒内切核酸酶从细胞异源mRNAs切割加帽的5’末端，所述mRNAs随后充当引物用于通过病毒转录酶转录病毒RNA模板。转录物在距离其模板末端15-22个碱基的位点处结束，其中寡尿苷酸(oligo(U))序列充当模板依赖性添加聚腺苷酸区(tract)的信号。在8个如此产生的病毒mRNA分子中，6个是单顺反子信使，它们直接翻译成代表HA、NA、NP的蛋白质，以及病毒聚合酶蛋白质PB2、PB1和PA。其他2个转录物经历剪接，从而各自产生2个mRNAs，它们在不同的读框中进行翻译以产生M1、M2、NS1和NS2。换言之，8个病毒mRNAs编码10种蛋白质：8种结构的和2种非结构的。

流感A基因组包含编码9种结构和1种非结构蛋白质的8个负极性单链RNA区段。非结构蛋白质NS1在流感病毒感染的细胞中很丰富，但在病毒体中未检测到。NS1是在感染期间早期在核中发现的磷蛋白，且在病毒循环晚期时还在细胞质中发现(Krug等人，1975)。使用携带NS基因损害的温度敏感(ts)流感突变体的研究暗示，NS 1蛋白质是转录和转录后机制调节物，通过所述机制病毒能够抑制宿主细胞基因表达和刺激病毒蛋白质合成。如同调节转录后过程的许多其他蛋白质，NS1蛋白质与特定RNA序列和结构相互作用。已报告NS1蛋白质与不同RNA种类结合，包括：vRNA、聚腺苷酸、U6(sn)RNA、病毒mRNAs的5’非翻译区和ds RNA(Qiu等人，1995；Qiu等人，1994)。在转染的细胞中来自cDNA的NS1蛋白质表达已与几种作用相关：mRNA核质转运的抑制、前mRNA剪接的抑制、宿主mRNA多腺苷酸化的抑制和病毒mRNA翻译的刺激(Fortes等人，1994；Enami，K.等人，1994；de Ia Luna等人，1995；Lu，Y.等人，1994；Park等人，1995)。

流感A病毒具有编码总共10种蛋白质的8个单链负义病毒RNAs(vRNAs)的基因组。流感病毒的生活周期始于HA与宿主细胞表面上的含唾液酸受体的结合，随后为受体介导的胞吞。晚期内体中的低pH触发了HA的构象变化，从而暴露HA2亚单位(所谓的融合肽)的N末端。融合肽起始病毒和内体膜的融合，且基质蛋白(M1)和RNP复合物被释放到细胞质内。RNPs由核内蛋白(NP)和病毒聚合酶复合物组成，所述核内蛋白使vRNA包壳，所述病毒聚合酶复合物由PA、PB1和PB2蛋白质形成。RNPs被转运到核内，在其中发生转录和复制。RNA聚合酶复合物催化3种不同反应：合成具有5’帽和3’聚腺苷酸结构的mRNA、合成全长互补RNA(cRNA)、和使用cDNA作为模板合成基因组vRNA。新合成的vRNAs、NP和聚合酶蛋白质随后装配成RNPs，从核中输出，且转运至质膜，在其中发生子代病毒颗粒的出芽。神经氨酸酶(neuramimidase)(NA)蛋白质在感染晚期中起关键作用，其通过下述实现：从唾液酸寡糖去除唾液酸，从而从细胞表面中释放新装配的病毒体，且防止病毒颗粒的自我聚集。尽管病毒装配涉及蛋白质-蛋白质和蛋白质-vRNA相互作用，但这些相互作用的性质大部分是未知的。

尽管流感B和C病毒在结构上和功能上类似于流感A病毒，但存在某些差异。例如，流感B病毒没有具有离子通道活性的M2蛋白质。相反，NA基因的产物NB蛋白质可能具有离子通道活性，且因此具有与流感A病毒的M2蛋白质类似的功能。类似地，流感C病毒没有具有离子通道活性的M2蛋白质。然而，CM1蛋白质可能具有这种活性。

此类流感A毒株包括但不限于，亚型H10N4、H10N5、H10N7、H10N8、H10N9、H11N1、H11N13、H11N2、H11N4、H11N6、H11N8、H11N9、H12N1、H12N4、H12N5、H12N8、H13N2、H13N3、H13N6、H13N7、H14N5、H14N6、H15N8、H15N9、H16N3、H1N1、H1N2、H1N3、H1N6、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N5、H2N7、H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N8、H4N1、H4N2、H4N3、H4N4、H4N5、H4N6、H4N8、H4N9、H5N1、H5N2、H5N3、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N4、H6N5、H6N6、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N5、H7N7、H7N8、H8N4、H8N5、H9N1、H9N2、H9N3、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9、杂交亚型、循环重组形式、临床和野外分离物。它们的序列可从GenBank获得，且病毒原液可以从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.获得，或可以其他方式公开获得。

流感B毒株包括但不限于，来源于下列的毒株：Aichi、Akita、Alaska、Ann Arbor、阿根廷、Bangkok、北京、比利时、Bonn、巴西、Buenos Aires、加拿大、Chaco、Chiba、重庆、CNIC、Cordoba、捷克斯洛伐克、Daeku、Durban、芬兰、福建、Fukuoka、Genoa、广东、广州、Hannover、哈尔滨、Hawaii、河北、河南、Hiroshima、香港、Houston、湖南、Ibaraki、印度、以色列、Johannesburg、Kagoshima、Kanagawa、Kansas、Khazkov、Kobe、Kouchi、Lazio、Lee、Leningrad、Lissabon、Los Angeles、Lusaka、Lyon、马来西亚、Maputo、Mar del Plata、Maryland、Memphis、Michigan、Mie、Milano、Minsk、Nagasaki、Nagoya、南昌、Nashville、Nebraska、荷兰、New York、NIB、宁夏、挪威、阿曼、Oregon、Osaka、Oslo、巴拿马、Paris、Parma、Perugia、菲律宾、Pusan、Quebec、Rochester、Roma、Saga、Seoul、Shangdong、上海、深圳、Shiga、Shizuoka、四川、Siena、新加坡、South Carolina、South Dakota、西班牙、Stockholm、瑞士、台湾、Texas、Tokushima、Tokyo、Trento、Trieste、英国、Ushuaia、苏联、Utah、Victoria、Vienna、武汉、Xuanwu、Yamagata、Yamanashi、云南，杂交亚型、循环重组形式、临床和野外分离物。它们的序列可从GenBank获得，且病毒原液可以从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.获得，或可以其他方式公开获得。

流感C毒株包括但不限于，来源于下列的毒株：Aichi、Ann Arbor、Aomori、北京、Berlin、California、England、Great Lakes、希腊、Hiroshima、Hyogo、JHB、Johannesburg、Kanagawa、Kansas、Kyoto、Mississippi、Miyagi、Nara、New Jersey、Saitama、Sapporo、Shizuoka、Taylor、Yamagata，杂交亚型、循环重组形式、临床和野外分离物。它们的序列可从GenBank获得，且病毒原液可以从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.获得，或可以其他方式公开获得。

本发明的优选实施方案提供了包含至少一种、优选3种或更多种流感免疫原例如血凝素的免疫原性组合物，所述流感免疫原来源于不同地理区域或靶向具体年份的不同毒株、循环重组形式、临床或野外分离物。目前商购可得的流感疫苗是三价疫苗，其包含来自如由世界卫生组织(World Health Organization)确定的、3种最流行的流感毒株或循环重组形式的流感血凝素免疫原。此类疫苗可以使用本文公开的方法进行制备，且预期作为本发明的部分。还预期的是包含至少3种不同神经氨酸酶或核内蛋白流感免疫原的免疫原性组合物，所述流感免疫原来源于可能在特定地理区域起源的目的毒株或循环重组形式。

异源序列例如流感免疫原在受试者中的表达，可以导致受试者中针对异源序列的表达产物的免疫应答。因此，本发明的重组载体可以在免疫学组合物或疫苗中使用，以提供诱导免疫应答的手段，所述免疫应答可以但无需是保护性的。本发明背景中使用的分子生物学技术由Sambrook等人，(1989)描述。

再进一步可替代地或另外地，在由本发明包含的免疫原性或免疫学组合物中，编码抗原的核苷酸序列可以已从其中缺失编码跨膜结构域的部分。再进一步可替代地或另外地，载体或免疫原性组合物可以进一步包含和在宿主细胞中表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码异源tPA信号序列例如人tPA，和/或稳定内含子例如兔β珠蛋白基因的内含子II。

本发明还提供了将异源核苷酸序列在体外或体内递送和/或施用到细胞内的方法。根据这种方法，细胞用根据本发明的至少一种缺失的腺病毒载体(如本文详细描述的)进行感染。细胞可以通过病毒转导的天然过程用腺病毒载体进行感染。可替代地，载体可以通过本领域已知的任何其他方法导入细胞内。例如，细胞可以与靶定的腺病毒载体(如下文所述)接触且通过可替代机制摄入，例如通过受体介导的胞吞。作为另一个例子，载体可以使用抗体或其他结合蛋白靶向内在化的细胞表面蛋白。

待施用本发明的病毒载体的细胞可以是任何类型的，包括但不限于神经元细胞(包括外周和中枢神经系统细胞)、视网膜细胞、上皮细胞(包括皮肤、肠、呼吸、膀胱和乳腺组织上皮)、肌细胞(包括心肌、平滑肌、骨骼肌和膈肌)、胰细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞(例如实质)、成纤维细胞、内皮细胞、生殖细胞、肺细胞(包括支气管细胞和肺泡细胞)、前列腺细胞等。此外，细胞可以来自如上所述的任何来源物种。优选的是由腺病毒天然转导的细胞。由腺病毒转导的此类细胞的例子包括但不限于，HEK 293细胞、PER.C6细胞和911细胞。在一个实施方案中，使用PER.C6细胞。

参考于2004年4月6日授权的美国专利号6,716,823；于2004年3月16日授权的美国专利号6,706,693；于2002年2月19日授权的美国专利号6,348,450；美国申请系列号10/052,323和10,116,963；以及10/346,021，其内容明确引入本文作为参考。

关于可以在本发明实践中使用的涉及表达的基因产物、抗体及其用途，用于体内和体外表达外源核酸分子的载体，用于驱动待表达的核酸分子表达或与待表达的核酸分子可操作地连接的启动子，用于生产此类载体的方法和文件，包含此类载体或核酸分子或抗体的组合物，施用剂量、以及方式和/或途径(包括用于鼻内施用的组合物)，和其他的事物的信息，还参考于1999年11月23日授权的美国专利号5,990,091，Einat等人或Quark Biotech，Inc.，于1999年5月14日提交、来自PCT/US99/11066于1999年11月25日公开的WO 99/60164，Fischer或Rhone Merieux，Inc.，于1997年6月30日提交、来自PCT/US97/11486于1998年1月8日公开的WO 98/00166(要求来自美国申请系列号08/675,556和08/675,566的优先权)，van Ginkel等人，1997，和Osterhaus等人，1992)；并且因此于1999年11月23日授权的美国专利号5,990,091，Einat等人或Quark Biotech，Inc.，于1999年5月14日提交、来自PCT/US99/11066于1999年11月25日公开的WO 99/60164，Fischer或Rhone Merieux，Inc.，于1997年6月30日提交、来自PCT/US97/11486于1998年1月8日公开的WO 98/00166(要求来自美国申请系列号08/675,556和08/675,566的优先权)，vanGinkel等人，1997，和Osterhaus等人，1992)和其中引用或参考的所有文件，以及于1999年11月23日授权的美国专利号5,990,091，Einat等人或Quark Biotech，Inc.，于1999年5月14日提交、来自PCT/US99/11066于1999年11月25日公开的WO 99/60164，Fischer或Rhone Merieux，Inc.，于1997年6月30日提交、来自PCT/US97/11486于1998年1月8日公开的WO 98/00166(要求来自美国申请系列号08/675,556和08/675,566的优先权)，van Ginkel等人，1997，和Osterhaus等人，1992)各自引用的文件中引用或参考的所有文件，在此引入本文作为参考。对于本发明的实践(例如表达的产物、抗体及其用途，用于体内和体外表达外源核酸分子的载体，编码目的表位或抗原或治疗剂等的外源核酸分子，启动子，包含此类载体或核酸分子或表达的产物或抗体的组合物，剂量和其他的事物)可以依赖于1999年11月23日授权的美国专利号5,990,091，WO 99/60164，WO98/00166，vanGinkel等人，1997和Osterhaus等人，1992中的信息。

载体可以施用于患者或宿主，其量达到对基因产物(例如，表位、抗原、治疗剂和/或抗体)组合物规定的量。当然，本发明设想了在本文例示的那些以下和以上的剂量，且对于待施用于动物或人的任何组合物，包括其组分，且对于任何具体施用方法，优选因此测定：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物例如小鼠中测定半数致死剂量(LD₅₀)；和引起合适应答的一种或多种组合物剂量，其中组分的浓度以及施用一种或多种组合物的时间选择，例如通过血清滴定及其分析，例如通过ELISA和/或血清中和(seroneutralization)分析。由于技术人员的知识、本公开内容和本文引用的文件，此类测定不需要过度实验。

本发明的组合物的例子包括用于孔口或粘膜，例如口、鼻、肛门、阴道、经口、胃内等施用的液体制剂，例如悬浮液、溶液、喷雾剂、糖浆或酏剂；和用于肠胃外、皮肤(epicutaneous)、皮下、皮内、肌内、鼻内、或静脉内施用(例如可注射施用)的制剂，例如无菌悬浮液或乳剂。参考于2004年4月6日授权的美国专利号6,716,823；于2004年3月16日授权的美国专利号6,706,693；于2002年2月19日授权的美国专利号6,348,450；美国申请系列号10/052,323和10,116,963；以及10/346,021，其内容引入本文作为参考，且公开了通过非侵入性递送方式例如皮肤和鼻内施用，免疫接种和递送免疫原性或疫苗组合物。

本发明还包含本发明组合物的顺次施用或本文方法的顺次进行，例如本发明组合物例如在用于状况的治疗或处理过程中的定期施用，和/或免疫组合物的加强施用和/或在初始(prime)-加强方案中；并且关于顺次施用的时间和方式无需过度实验即可确定。

此外，本发明包含用于制备和使用载体的组合物和方法，包括用于体内和/或体外和/或先体外后体内(例如后面2种在例如在从已具有根据本发明的非侵入性施用的宿主的细胞分离后，例如在此类细胞任选扩增后)生产基因产物和/或免疫学产物和/或抗体的方法，以及此类基因和/或免疫学产物和/或抗体的用途，包括在诊断、测定、治疗、处理等中的用途。

载体组合物通过使载体与合适的载体或稀释剂混合进行配制；并且基因产物和/或免疫学产物和/或抗体组合物同样通过使基因和/或免疫学产物和/或抗体与合适的载体或稀释剂混合进行配制；参见，例如美国专利号5,990,091、WO 99/60164、WO 98/00166，其中引用的文件，和本文引用的其他文件，以及本文的其他教导(例如，关于载体、稀释剂等)

在此类组合物中，重组载体可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。组合物还可以是冻干的。取决于施用途径和所需制剂，组合物可以包含辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、色料等。可以参考标准文本以无需过度实验制备合适制剂，例如引入本文作为参考的“REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985。

待施用的重组载体的量将因待治疗的患者(宿主)和状况而变，且将从1或几微克到几百或几千微克不同，例如1μg-1mg，每天约100ng/kg体重-100mg/kg体重，且优选将是每天10pg/kg-10mg/kg。当施用重组腺病毒时，免疫学、治疗或预防有效剂量可以包含1×10⁷-1×10¹²病毒颗粒或蚀斑形成单位(PFU)。载体可以非侵入性地施用于患者或宿主，其量达到对基因产物(例如，表位、抗原、治疗剂和/或抗体)组合物规定的量。当然，本发明设想了在本文例示的那些以下和以上的剂量，且对于待施用于受试者的任何组合物，包括其组分，且对于任何具体施用方法，优选因此测定：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物例如小鼠中测定致死剂量(LD)和LD₅₀；和引起合适应答的一种或多种组合物剂量，其中组分的浓度以及施用一种或多种组合物的时间选择，例如通过血清滴定及其分析，例如通过ELISA和/或血清中和分析。由于技术人员的知识、本公开内容和本文引用的文件，此类测定不需要过度实验。

重组载体可以以合适的量进行施用，以获得对应于本文和/或本文引用的文件中所述剂量的体内表达。例如，关于病毒悬浮液的合适范围可以根据经验来确定。如果超过一种的基因产物通过超过一种的重组体表达，那么每种重组体可以以这些量施用；或每种重组体可以这样施用，从而使得组合地存在包含这些量的重组体总和。

然而，引起合适的免疫学应答的一种或多种组合物剂量，其中组分的浓度以及施用一种或多种组合物的时间选择，可以通过如下方法，例如通过血清抗体滴定，例如通过ELISA和/或血清中和测定分析进行测定。由于技术人员的知识、本公开内容和本文引用的文件，此类测定不需要过度实验。而且，关于顺次施用的时间可以同样使用由于本公开内容和本领域的知识可确定的方法，无需过度实验进行确定。

本发明预期的免疫原性或免疫学组合物还可以包含佐剂。合适的佐剂包括fMLP(N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸；美国专利号6,017,537)和/或丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和/或马来酐和链烯基衍生物的共聚物。丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物可以例如与糖或多元醇的聚链烯基(polyalkenyl)醚交联。这些化合物在术语“卡波姆”(Pharmeuropa，第8卷，第2号，1996年6月)下已知。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462(引入作为参考)，所述专利讨论了与包含至少3个羟基的多羟基化合物交联的此类丙烯酸类聚合物：在一个实施方案中，多羟基化合物包含至多8个羟基；在另一实施方案中，至少3个羟基的氢原子用包含至少2个碳原子的不饱和脂族原子团置换；在其他实施方案中，原子团包含约2-约4个碳原子，例如，乙烯基、烯丙基和其他烯键式不饱和基团。不饱和原子团其自身可以包含其他取代基，例如甲基。

在名称

(Noveon Inc.，Ohio，USA)下销售的产品特别适合于用作佐剂。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联，关于这点可以提及的是产品

974P、934P和971P。

关于马来酐和链烯基衍生物的共聚物，可以提及的是

产品(Monsanto)，这是马来酐和乙烯的共聚物，它可以是线性或交联的，例如与二乙烯基醚交联。同样，可以参考美国专利号6,713,068和Regelson，W.等人，1960；(引入作为参考)。

包含季铵盐的阳离子脂质在美国专利号6,713,068中描述，所述专利的内容引入作为参考，也可以在本发明的方法和组合物中使用。在这些阳离子脂质中，优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷基氧)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质、有利地DOPE(二油酰基-磷脂酰基-乙醇胺；Behr J.P.等人，1994)结合以形成DMRIE-DOPE。

重组疫苗或免疫原性或免疫学组合物还可以以水包油型乳剂的形式进行配制。水包油乳剂可以基于例如轻液体石蜡油(EuropeanPharmacopea类型)；类异戊二烯油例如角鲨烷、角鲨烯、EICOSANETM或四十四烷；由烯例如异丁烯或癸烯寡聚化产生的油；包含线性烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯，例如异硬脂酸酯。油有利地与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如脱水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇、和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，所述酯任选是乙氧基化的，和聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如

产品，例如L121。佐剂可以是乳化剂、胶束形成剂、和油的混合物，例如在名称

(IDECPharmaceuticals，San Diego，CA)下可获得的那种。

表达一种或多种目的异源核酸的重组腺病毒或重组腺病毒载体，例如根据本公开内容的载体，可以以液体形式于约5℃，或以冻干或冷冻干燥形式在稳定剂的存在下被保存和/或保藏和贮存。冷冻干燥可以根据众所周知的标准冷冻干燥操作。药学可接受的稳定剂可以是SPGA(蔗糖磷酸盐谷氨酸清蛋白；Bovarnik等人，1950)，碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)，谷氨酸钠(Tsvetkov，T.等人，1983；Israeli，E.等人，1993)，蛋白质例如蛋白胨、清蛋白或酪蛋白，包含蛋白质的试剂例如脱脂乳(Mills，CK.等人，1988；Wolff，E.等人，1990)，和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、碱性金属磷酸盐缓冲液)。佐剂和/或载体或赋形剂可以用于制备可溶性冷冻干燥制剂。

本发明现在将经由下列非限制性实施例进一步描述，所述实施例作为本发明各种实施方案的举例说明而给出，且并不意味着以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：表达流感HA的复制缺陷型腺病毒的产生

编码流感HA的2种腺病毒(Ad)载体使用AdEasy系统进行构建。在2003-2004年选择用于疫苗生产的2种最近的流感病毒株[A/巴拿马/2007/99(H3N2)和B/香港/330/01]由疾病控制和预防中心(The Centersfor Disease Control and Prevention)(CDC)提供。A/巴拿马/2007/99HA通过下述方法进行克隆：逆转录流感RNA，随后使用下列引物用聚合酶链反应(PCR)扩增HA基因：

表1：用于扩增流感基因的引物序列

这些引物包含对A/巴拿马/2007/99 HA基因的5’和3’末端退火的序列，紧在HA起始ATG密码子上游的真核核糖体结合位点(Kozak，1986)，和用于随后克隆的KpnI位点。将包含全长HA基因的KpnI片段以正确方向插入pShuttleCMV(He等人，1998)的KpnI位点内，其在巨细胞病毒(CMV)早期启动子的转录控制下。编码A/巴拿马/2007/99HA的E1/E3-缺陷型Ad载体(AdPNM2007/99.H3)使用AdEasy系统在人293细胞中产生。编码B/香港/330/01 HA基因的Ad载体(AdHK330/01.B)使用表1中的引物序列同样地进行构建。

2种Ad载体通过DNA测序进行验证且在293细胞中繁殖至10¹¹pfu/ml的效价。在鼻内分别滴注AdPNM2007/99.H3和AdHK330/01.B运载的流感疫苗后，在小鼠中引起了针对A/巴拿马/2007/99和B/香港/330/01的血凝抑制(HI)抗体。然而，当将在大肠杆菌BJ5183细胞中产生的重组质粒转染到PER.C6细胞而不是293细胞内时，对于2种抗体产生了低效价的Ad载体(＜10⁸pfu/ml)。PER.C6产生的AdPNM2007/99.H3载体被送到Molecular Medicine BioServices，Inc.(LaJolla，CA)用于在PER.C6细胞中大量生产，且在4轮扩增后效价为2×10⁷ pfu/ml。低效价Ad载体的生产不是在PER.C6细胞中的内在问题，因为本发明人(未公开的结果)和其他人(Fallaux等人，1998；Murakami等人，2002)已显示通过基于pAdApt的穿梭质粒产生的Ad载体在这种细胞系中生长至高效价(＞10¹¹pfu/ml)。AdEasy系统看来与PER.C6细胞不相容，且因此不能用于不含RCA的Ad载体的高效价生产。

尽管Ad运载的流感疫苗的构建比常规的基于蛋的生产系统更快，甚至在不存在AdEasy系统的情况下，但AdEasy系统或等价物可以通过允许穿梭质粒和Ad主链质粒之间的同源重组在大肠杆菌细胞中过夜发生得到进一步加速。总之，如果使用AdEasy系统构建新Ad载体而不是用于Ad构建的常规方法，那么可以节省1-2个月的时间。这种省时程序对于流感疫苗生产是有意义的，因为新流感病毒株可以在这个时间范围内变得广泛流行。

然而，在293细胞中产生RCA以及AdEasy系统和PER.C6细胞系之间的不相容性是妨碍不含RCA污染的Ad载体的快速和高效价生产的障碍。AdEasy衍生的Ad载体在PER.C6细胞中的低效价生产可能归因于pShuttleCMV载体中的缺陷型Ad序列，因为基于pAdApt的载体在这种细胞系中可以产生高效价和不含RCA的Ad载体。可能促成AdEasy和PER.C6之间的不相容性的Ad序列可以在Ad核苷酸342-454和3511-3533中进行鉴定，因为这2个区段在pAdApt(由Crucell提供的序列)中存在，但在pShuttleCMV中缺少。Ad核苷酸编号与Chroboczek的编号系统(Chroboczek等人，1992)的那种一致。pIX启动子(Babiss和Vales，1991)在pAdApt中是完整的，但在pShuttleCMV中是有缺陷的。pIX作为壳体接合剂参与Ad颗粒的稳定性(Rosa-Calatrava等人，2001)。可能还存在由pShuttleCMV中缺少的Ad序列编码的其他功能。pShuttleCMV载体可以经由在大肠杆菌BJ5183细胞中的同源重组，通过用其在pAdApt中的配对物置换推测缺陷的序列进行修复。

实施例2：pAdHighα的构建

Crucell的穿梭质粒pAdApt用限制酶SgrAI+EcoRI，和BstXI+EcoRI分开进行消化。平行地，穿梭质粒pShuttleCMV用SgrAI+BstXI进行消化。将所得到的pAdApt SgrAI-EcoRI和BstXI-EcoRI片段通过3路线连接插入pShuttleCMV的SgrAI-BstXI位点内，从而导致产生复制缺陷型Ad载体。编码流感HA基因的复制缺陷型Ad载体(Ad_HighαPNM2007/99.H3)通过将重组质粒转染到PER.C6细胞内来产生。致细胞病变效应(CPE)在感染后大约7天出现，其时间范围与AdEasy系统在293细胞中所需的那种相同(He等人，1998)。

实施例3：pAdHighβ的构建

为了修复缺陷序列，pShuttleCMV的CMV启动子、邻近多克隆位点和侧翼Ad序列作为1个单位，通过同源重组用其来自pAdApt的配对物置换，因为这2种穿梭质粒共享广泛重叠的序列。然而，同样需要新标记用于选择重组体。来自质粒pBR322的全长四环素(Tc)抗性基因(Backman和Boyer，1983；Peden，1983)通过PCR，使用具有内置KpnI位点的引物5′-GAGCTCGGTACCTTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3′和5′-TCTAGAGGTACCAACGCTGCCCGAGATGCGCCGCGT-3′进行扩增。将扩增的Tc基因插入Amp抗性质粒pAdApt的KpnI位点内以产生新质粒pAdApt-Tc，所述pAdApt-Tc可以通过对生长培养基应用Amp和Tc进行选择。

pShuttleCMV中的Ad序列使用高效率AdEasier重组规程(Zeng等人，2001)用其在pAdApt-Tc中的配对物置换。简言之，将pShuttleCMV转化到大肠杆菌BJ5183细胞，和卡那霉素(Kan)抗性选择的转化体内。Kan抗性细胞立即用pAdApt-Tc进行转化，且通过对培养基应用Kan和Tc来选择重组体。只有当其在pAdApt-Tc中的配对物通过同源重组置换pShuttleCMV中的指定Ad序列时，重组体才能对大肠杆菌BJ5183细胞赋予Kan和Tc抗性。所得到的pAdHighβ质粒从大肠杆菌BJ5183细胞进行纯化，如所述的(Zeng等人，2001)转化到大肠杆菌DH10B细胞内。该质粒随后通过DNA测序进行验证。

实施例4：使用AdHigh系统构建编码流感HA的腺病毒载体

将AdPNM2007/99.H3载体中包含A/巴拿马/2007/99HA基因的KpnI片段插入pAdHigh-Tc的KpnI位点内以置换Tc基因。如所述的(Zeng等人，2001)，所得到的质粒被允许与Ad主链质粒pAdEasy1在大肠杆菌BJ5183细胞中重组。在重组质粒转染后，编码HA基因的Ad载体在PER.C6细胞中产生。RCA污染的水平在3×10¹¹的颗粒中是不可检测的。

实施例5：AdApt、AdEasy和AdHighα衍生的腺病毒载体的比较

测定了编码流感HA基因的AdApt、AdEasy和AdHighα衍生的腺病毒载体在293和PER.C6细胞中的繁殖。大约10⁶细胞通过使用AdApt、AdEasy和AdHighα之一开发的腺病毒载体以25∶1的ifu∶细胞比率进行感染。感染后，将细胞冷冻2天。解冻后，如图6中所示，裂解物通过Adeno-X效价试剂盒进行分析。数据表示在单个孔中产生的平均效价。由AdApt和AdHighα产生的腺病毒载体在平均感染单位中没有显示出显著差异，不管载体是在PER.C6细胞中还是在293细胞中进行繁殖，相反，由AdEasy产生的载体导致平均感染单位中的显著差异，与在PER.C6细胞中繁殖的配对物比较时，在293细胞中繁殖的载体在平均感染单位中平均减少大约3个对数级。

将AdHighα衍生的腺病毒载体在引起血凝抑制抗体效价中的效力与AdApt衍生的腺病毒载体的那种进行比较。ICR小鼠通过鼻内施用2.5×10⁸ifu AdHPNM2007/99.H3(AdHighα衍生的)或AdPNM2007/99.H3(AdApt衍生的)载体进行免疫，所述载体各自编码相同的流感HA蛋白质。免疫接种后1个月，收集血清用于血凝抑制测定。

如图7中所示，使用2种抗体获得了几乎相同的HI效价，从而证实与AdApt衍生的腺病毒载体比较，腺病毒载体的效力通过使用AdHighα衍生的腺病毒载体并未减少。

尽管本发明的优选实施方案已因此得到详细描述，但应当理解由附加权利要求限定的本发明并不受上文说明书中阐述的具体细节限制，因为无需背离其精神或范围即可能进行其许多显而易见的变化。

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序列表

Claims

1. 一种重组腺病毒载体，其包括包含SEQ ID NO：1的第一种腺病毒序列、启动子序列、MCS、转录终止子、包含SEQ ID NO：2的第二种腺病毒序列、包含SEQ ID NO：4的第三种腺病毒序列、细菌复制起点、和抗生素抗性基因，其中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4包含允许在原核细胞中在重组腺病毒穿梭质粒和腺病毒主链质粒之间发生同源重组的序列，以产生能够在包装细胞中产生不含RCA的Ad载体的重组质粒。

2. 权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、β肌动蛋白启动子、清蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子和劳斯肉瘤病毒启动子。

3. 权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述转录终止子是真核多腺苷酸化信号，包括SV40多腺苷酸化信号。

4. 权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述细菌复制起点可以来源于pBR322复制起点。

5. 权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述抗生素抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因和zeocin抗性基因。

6. 权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

7. 权利要求6的重组腺病毒载体，其中所述大肠杆菌是BJ5183。

8. 权利要求1的重组腺病毒载体，其中所述载体是pAdHigh。

9. 一种重组腺病毒载体，其包括包含来源于腺病毒血清型5序列1-454的第一种腺病毒序列、启动子序列、多接头、转录终止子、包含来源于腺病毒血清型5序列3511-5796的第二种腺病毒序列、包含序列34931-35935的第三种腺病毒序列、细菌复制起点和抗生素抗性基因，其中所述第二种和第三种腺病毒序列包含允许在原核细胞中在重组腺病毒穿梭质粒和腺病毒主链质粒之间发生同源重组的序列。

10. 权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、β肌动蛋白启动子、清蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子、疱疹病毒启动子和劳斯肉瘤病毒启动子。

11. 权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述转录终止子是真核多腺苷酸化信号，包括SV40多腺苷酸化信号。

12. 权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述细菌复制起点可以来源于pBR322复制起点。

13. 权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述抗生素抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因和zeocin抗性基因。

14. 权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

15. 权利要求14的重组腺病毒载体，其中所述大肠杆菌是BJ5183。

16. 权利要求9的重组腺病毒载体，其中所述载体是pAdHigh。

17. 一种产生基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒的方法，其包括：

a.将第一种穿梭质粒和第二种穿梭质粒共转化到原核细胞内，其中所述第一种穿梭质粒包含第一种腺病毒序列和第一种抗生素抗性基因；且其中所述第二种穿梭质粒包含第二种腺病毒序列和第二种抗生素抗性基因，所述第二种腺病毒序列包含所述第一种穿梭质粒中不存在的腺病毒序列，且所述第二种抗生素抗性基因不同于所述第一种抗生素抗性基因，其中所述共转化允许在所述第一种和第二种穿梭质粒之间发生同源重组，且其中表达所述第一种和第二种穿梭质粒中的两种所述抗生素抗性基因的原核转化体包含第一种重组腺病毒质粒；

b.从所述原核细胞回收所述第一种重组腺病毒质粒；

c.将所述第一种重组腺病毒质粒和腺病毒主链质粒共转化到另一种原核细胞内，其中所述原核转化体包含第二种重组腺病毒质粒；

d.从所述原核细胞回收所述第二种重组腺病毒质粒；

e用所述第二种重组腺病毒质粒转染PER.C6包装细胞；和

f.从所述PER.C6细胞回收重组腺病毒，其中所述重组腺病毒基本上不含RCA。

18. 权利要求17的方法，其中所述第一种穿梭质粒是pShuttle-CMV。

19. 权利要求17的方法，其中所述第二种穿梭质粒是pAdApt-Tc。

20. 权利要求17的方法，其中所述抗生素抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因和zeocin抗性基因。

21. 权利要求17的方法，其中所述pShuttleCMV中不存在的所述另外腺病毒序列包含来自腺病毒血清型5的腺病毒序列342-454，和来自腺病毒血清型5的腺病毒序列3511-3533。

22. 权利要求17的方法，其中所述腺病毒主链质粒是pAdEasy1。

23. 权利要求17的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

24. 权利要求23的方法，其中所述大肠杆菌是BJ5183。

25. 一种重组腺病毒载体，其通过权利要求17的方法产生。

26. 一种重组腺病毒，其通过权利要求17的方法产生。

27. 一种产生基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒的方法，其包括：

a.用一种或多种限制性内切核酸酶消化第一种和第二种穿梭质粒，其中所述第一种穿梭质粒包含第一种腺病毒序列，且其中所述第二种穿梭质粒包含所述第一种穿梭质粒中不存在的另外腺病毒序列；

b.切除包含来自所述第二种穿梭质粒的所述另外腺病毒序列的片段；

c.将包含另外腺病毒序列的所述片段连接到所述第一种穿梭质粒内以置换配对物片段，从而导致产生第一种重组腺病毒质粒；

d.将所述第一种重组腺病毒质粒和腺病毒主链质粒共转化到另一种原核细胞内，其中所述原核转化体包含第二种重组腺病毒质粒；

e.从所述原核细胞回收所述第二种重组腺病毒质粒；

f.将所述第二种重组腺病毒质粒转染到PER.C6包装细胞内；和

g.从所述细胞回收所述重组腺病毒，其中所述重组腺病毒基本上不含RCA。

28. 权利要求27的方法，其中所述第一种穿梭质粒是pShuttleCMV。

29. 权利要求27的方法，其中所述第二种穿梭质粒是pAdApt。

30. 权利要求27的方法，其中所述抗生素抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因和zeocin抗性基因。

31. 权利要求27的方法，其中pShuttleCMV中不存在的所述另外腺病毒序列包含来自腺病毒血清型5的腺病毒序列342-454，和来自腺病毒血清型5的腺病毒序列3511-3533。

32. 权利要求27的方法，其中所述腺病毒主链质粒是pAdEasy1。

33. 权利要求27的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

34. 权利要求33的方法，其中所述大肠杆菌是BJ5183。

35. 一种重组腺病毒载体，其通过权利要求27的方法产生。

36. 一种重组腺病毒，其通过权利要求27的方法产生。

37. 一种免疫原性组合物，其包含与药学可接受的赋形剂混合的重组腺病毒，所述重组腺病毒基本上不含可复制腺病毒(RCA)、表达一种或多种目的异源核酸。

38. 权利要求37的组合物，其中基本上不含RCA的所述腺病毒是腺病毒血清型5(Ad5)。

39. 权利要求37的组合物，其中基本上不含RCA的所述腺病毒通过权利要求17的方法产生。

40. 权利要求37的组合物，其中基本上不含RCA的所述腺病毒通过权利要求27的方法产生。

41. 权利要求37的组合物，其中所述一种或多种目的异源核酸包含来源于流感毒株的流感基因，所述流感毒株包含流感A、流感B、流感C、循环重组形式、杂交形式、临床分离物和野外分离物。

42. 权利要求41的组合物，其中所述流感基因包含流感血凝素基因、流感基质基因、流感神经氨酸酶基因和流感核内蛋白基因。

43. 权利要求37的组合物，其进一步包含佐剂。

44. 一种免疫原性组合物，其包含与药学可接受的赋形剂混合的重组腺病毒，所述重组腺病毒基本上不含可复制腺病毒(RCA)、表达一种或多种流感免疫原。

45. 权利要求44的组合物，其中基本上不含RCA的所述腺病毒是腺病毒血清型5(Ad5)。

46. 权利要求44的组合物，其中基本上不含RCA的所述腺病毒通过权利要求17的方法产生。

47. 权利要求44的组合物，其中基本上不含RCA的所述腺病毒通过权利要求27的方法产生。

48. 权利要求44的组合物，其中所述一种或多种流感免疫原包含流感血凝素、流感基质、流感神经氨酸酶和流感核内蛋白。

49. 权利要求44的组合物，其中所述一种或多种流感免疫原来源于流感毒株，所述流感毒株包含流感A、流感B、流感C、循环重组形式、杂交形式、临床分离物和野外分离物。

50. 权利要求44的组合物，其进一步包含佐剂。

51. 一种在基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒中表达一种或多种异源核酸的方法，其包括：

a.用一种或多种限制性内切核酸酶消化权利要求1、9、25或35的重组腺病毒载体，从而使所述腺病毒载体线性化；

b.将一种或多种异源核酸连接到所述腺病毒载体内，其中所述一种或多种异源核酸与启动子序列可操作地连接；

c.将所述腺病毒载体转染到哺乳动物包装细胞内；和

d.从所述哺乳动物包装细胞回收表达所述一种或多种异源核酸的所述重组腺病毒。

52. 权利要求51的方法，其中所述腺病毒来源于腺病毒血清型5(Ad5)。

53. 权利要求51的方法，其中所述一种或多种异源核酸包含流感基因。

54. 权利要求51的方法，其中所述启动子序列选自巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、β肌动蛋白启动子、清蛋白启动子、延伸因子1-α(EF1-α)启动子、PγK启动子、MFG启动子、疱疹病毒启动子和劳斯肉瘤病毒启动子。

55. 权利要求53的方法，其中所述流感基因包含流感血凝素基因、流感基质基因、流感神经氨酸酶基因和流感核内蛋白基因。

56. 权利要求53的方法，其中所述流感基因来源于流感毒株，所述流感毒株包含流感A、流感B、流感C、循环重组形式、杂交形式、临床分离物和野外分离物。

57. 一种在有此需要的受试者中引起针对流感的免疫原性应答的方法，其包括给所述受试者施用免疫有效量的权利要求44的组合物。

58. 权利要求57的方法，其中所述流感免疫原包含流感血凝素、流感基质、流感神经氨酸酶和流感核内蛋白。

59. 权利要求57的方法，其中所述流感免疫原来源于流感毒株，所述流感毒株包含流感A、流感B、流感C、循环重组形式、杂交形式、临床分离物和野外分离物。

60. 权利要求57的方法，其进一步包含佐剂。

61. 一种在目的细胞中引入和表达一种或多种异源核酸的方法，其包括使所述细胞与基本上不含可复制腺病毒(RCA)的重组腺病毒接触，其中所述重组腺病毒表达所述一种或多种异源核酸，和在足以表达所述一种或多种异源核酸的条件下培养所述细胞或维持所述动物。

62. 权利要求61的方法，其中所述细胞是人细胞。

63. 权利要求61的方法，其中所述腺病毒来源于腺病毒血清型5(Ad5)。

64. 权利要求61的方法，其中所述一种或多种异源核酸包含流感基因。

65. 权利要求61的方法，其中所述流感基因包含流感血凝素基因、流感基质基因、流感神经氨酸酶基因和流感核内蛋白基因。

66. 权利要求61的方法，其中所述流感基因来源于流感毒株，所述流感毒株包含流感A、流感B、流感C、循环重组形式、杂交形式、临床分离物和野外分离物。

67. 一种试剂盒，其包含权利要求1的重组腺病毒载体、腺病毒主链质粒和大肠杆菌BJ5183细胞。

68. 权利要求67的试剂盒，其中所述重组腺病毒穿梭载体是pAdHigh或其衍生物。

69. 权利要求67的试剂盒，其中所述腺病毒主链质粒是pAdEasy1。