MX2011004292A - Metodo para la produccion de vectores adenovirales. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para la producción a gran escala de adenovirus recombinante 35, usando sistemas de perfusión e infección a muy altas densidades celulares.

Description

METODO PARA LA PRODUCCION DE VECTORES ADENOVIRALES Campo de la invención La invención se refiere al campo de cultivo de células y producción de adenovirus. Más particularmente, está relacionada con métodos mejorados para el cultivo de células de mamífero, infección de esas células con adenovirus y la producción de partículas de adenovirus a partir de las mismas .

Antecedentes de la invención Desarrollos recientes en el campo de la vacunación de ADN usando vectores virales recombinantes han creado la necesidad de fabricación a gran escala de material grado clínico. Se requieren procesos que sean capaces de apoyar a los países menos y no desarrollados con cantidades suficientes de vacunas adeno-basadas recombinantes para combatir, por ejemplo, el problema de la tuberculosis y la malaria en el mundo. Una evaluación de la cohorte de nacimiento muestra que más de 150,000,000 de nacimientos se esperan para los países menos y no desarrollados en 2010-2015. Con base en esta cohorte de nacimiento la demanda anual proyectada para una vacuna podría alcanzar aproximadamente 1.5 x 1019 partículas virales (VP) anualmente (http : //esa . norg/unpp/índex . asp?panel=2 ) .

Varios procesos para la producción de adenovirus EF . : 219360 han sido descritos. Estos procesos usan cultivos de células adherentes en botellas rodantes, factorías de células (Nunclon de Nunc o CellStack de Corning) , o Cell Cubes (Corning) . Los procesos de producción en cultivos de células adherentes no pueden satisfacer la demanda mundial de vacunas adeno-basadas . Por lo tanto las células usadas en el proceso adherente son adaptadas a cultivos en suspensión (por ejemplo, lineas de células HEK293 y PER.C6 ) . Con el uso de cultivos en suspensión es posible procesos de producción ascendentes a biorreactores a gran escala. Los cultivos de células en suspensión para la producción de adenovirus se logran rutinariamente entre una escala de 3 a 20L y una escala ascendente exitosa ha sido reportada hasta 100L (Kamen et al., 2004), y 250L (Xie et al., 2003). Se reportan experimentos en los cuales una escalada ascendente .hasta 10,000L es anticipada (Xie et al., 2003).

Sin embargo, una gran desventaja de la escalada ascendente hasta 10,000L es la alta inversión de capital (CAPEX, por sus siglas en inglés) que se requiere para diseñar y construir una instalación con biorreactores de 10,000L. Además, el compromiso de CAPEX para construir una instalación de 10,000L, bajo condiciones BSL 2, debe lograrse incluso antes de saber si el producto será exitoso (Fase IV en adelante) . El costo de inversión total para una planta de biorreactores de 10,000L se reporta de entre €225,000,000 y €320,000,000 (Estape et al., 2006). Por lo tanto, sería deseable una preparación a escala más baja, por ejemplo, en los biorreactores de 1,000L o más pequeños.

Con el uso de procesos actualmente existentes, más de 150 lotes a la escala de 1,000L al año deben producirse para alcanzar el objetivo de 1.5xl019VP/año . Por lo tanto, existe la necesidad por mejorar sistemas para la producción de adenovirus, por mejorar los rendimientos de partículas de adenovirus para de esta manera satisfacer la demanda mundial de vacunas de adenovirus, de preferencia a costos no prohibitivos .

Uno de los aspectos que se encuentra en la optimización de la producción de adenovirus es el llamado "efecto de densidad celular" . En la operación en modo intermitente, varias referencias sugieren la existencia de una densidad celular óptima después de infección para la producción de adenovirus. El óptimo se encuentra entre 0.5-lxlO6 células/mL ( aranga et al., 2005; Kamen et al., 2004). Se demostró para la producción de adenovirus (Ad5) en un biorreactor de tanque agitado intermitente que la productividad de virus por célula permanece constante hasta alrededor de 0.9xl06 células/mL, pero cae abruptamente a alrededor de lxlO6 células/mL (Altaras et al., 2005). Más allá de 2xl06 células/mL, no fueron detectables partículas infecciosas. El valor crítico relacionado con la caída 'en producción específica con densidades celulares después de infección es dependiente del medio. Ningún medio comercial disponible hasta la fecha ha mostrado el potencial de soportar altos rendimientos de partículas virales, conservando al mismo tiempo la producción específica óptima a densidades celulares más allá de lxlO6 células/mL (Kamen et al., 2004) . Las razones de esta caída no se conocen aún pero podría deberse a" una disponibilidad de nutrientes limitada para la producción de virus, o a altas concentraciones de metabolitos que son inhibidoras de la producción de virus.

Las operaciones de alimentación intermitente, tal como la adición de glucosa, glutamina y aminoácidos permitieron infecciones a densidades celulares de hasta 2x10s células/mL. Sin embargo, las productividades logradas a altas densidades celulares fueron más bajas que aquellas obtenidas con la infección a densidades celulares de lxlO6 células/mL (Kamen et al., 2004).

En procesos de perfusión las células son retenidas en el biorreactor por fibras huecas, filtros centrífugos o separadores acústicos mientras el medio de cultivo es perfundido a través del biorreactor. En estos procesos, densidades celulares de >100xl06 células/mL pueden algunas veces ser alcanzadas (por ejemplo, Yallop et al., 2005) .

Las células de perfusión infectadas mostraron pérdida celular prematura durante la perfusión con un sistema de fibras huecas. Esto podría estar relacionado con su sensibilidad cortante más alta debido a la infección viral (Cortin et al., 2004). Las tensiones hidrodinámicas inducidas en los tubos, las fibras huecas o la bomba peristáltica en células infectadas más frágiles fue muy probablemente la causa de este fenómeno. Ya que las células infectadas son más frágiles, particularmente el separador acústico (Henry et al., 2004) ha sido sugerido como deseable si la perfusión va a conservarse a lo largo de la fase de infección. Sin embargo, infecciones llevadas a cabo en modo de perfusión sólo podrían conservarse para densidades celulares de hasta 3xl06 células/mL con una velocidad de perfusión de 2 vol/día. La infección a una densidad celular de 6xl06 células/mL llevó a una reducción de cinco veces en la productividad específica (Henry et al., 2004).

A pesar del efecto de densidad celular reportado por otros, un reporte (Yuk et al., 2004) describió cultivos de perfusión exitosos de células de tumor humanas como una plataforma de producción para vectores adenovirales oncolíticos. Ese reporte describía un proceso de perfusión de alta densidad celular usando tecnología de flujo tangencial alternante (ATF) a una densidad celular viable promedio en infección de 9 x 106 HeLaS3 células/mL, un título viral promedio de alrededor de 4 x 1011 VP/mL fue observado. Las células tumorales usadas en ese reporte no se prefieren como células de producción, toda vez que el uso de células tumorales puede presentar riesgos de seguridad cuando las partículas de adenovirus producidas vayan a ser administradas a humanos. El adenovirus recombinante en ese reporte se basaba en Ad5. Estos adenovirus tienen posibilidades limitadas para usarse como vacunas toda vez que una mayoría de la población humana contiene anticuerpos neutralizantes pre-existentes contra Ad5, y adenovirus recom inantes de otros serotipos son por lo tanto más adecuados para usarse como vacunas (véase, por ejemplo, O 00/70071) . En particular, adenovirus recombinantes del subgrupo B, tal como Ad35, son especialmente adecuados para usarse como vacunas (WO 00/70071) .

Información limitada, si la hay, está disponible para la producción a gran escala de adenovirus recombinantes de otros serotipos que no sean Ad5 , en particular para el serotipo 35 adecuado. Algunas diferencias entre Ad35 y Ad5 han sido descritas con respecto a la purificación de los mismos usando intercambio aniónico (por ejemplo, WO 2005/080556). Las propiedades físicas algo diferentes de los adenovirus recombinantes de diferentes serotipos pueden dar origen a diferencias en procesos de producción o bajo ciertas condiciones. Estas diferencias potenciales pueden ser especialmente importantes a escala industrial, en donde diferencias incluso aparentemente pequeñas a pequeña escala pueden tener grandes consecuencias económicas en la escala contemplada para la producción de la demanda anual . Por ejemplo, hasta la fecha se desconoce si el efecto de densidad celular reportado para Ad5 será similar para otros serotipos. Por lo tanto, para satisfacer la demanda mundial de vacunas de rAd35, existe la necesidad por mejorar sistemas para la producción de adenovirus recombinante serotipo 35 (rAd35) .

Breve descripción de la invención Se ha encontrado en la presente que rendimientos de adenovirus recombinante serotipo 35 (rAd35) se incrementaron más cuando las células de producción fueron infectadas a densidades de más de lOxlO6 células viables/mL, en cultivos de perfusión. En contraste, los rendimientos de adenovirus recombinante serotipo 5 (rAd5) fueron más bajos cuando las células de producción fueron infectadas a 20 x 106 o 30 x 10s células/mL en comparación con infección a 10 x 106 células viables/mL. Así, rAd35 se propaga de manera diferente que rAd5 en las células productoras bajo las condiciones empleadas . Además se ha observado que otro serotipo adicional se comporta nuevamente en forma diferente, sugiriendo que procesos para serotipos de adenovirus específicos pueden tener que ser diseñados específicamente para cada serotipo, para obtener así resultados óptimos. La presente invención proporciona un sistema optimizado para la producción de rAd35 en términos de rendimiento, calidad del rAd35 obtenido y facilidad de manejo de la cosecha para procesamiento corriente abajo.

La invención proporciona un método para producir adenovirus recombinante serotipo 35 (rAd35) , el método comprende: a) cultivar células productoras en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre aproximadamente lOxlO6 células viables/mL y 16xl06 células viables/mL con rAd35; c) cultivar más las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd35; y d) cosechar el rAd35.

En ciertas modalidades las células en la etapa b) son infectadas con rAd35 a una densidad de entre aproximadamente 10x10s y 14xl06 células viables/mL.

En ciertas modalidades preferidas, el sistema de perfusión en la etapa c) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternante (ATF) . En otras modalidades preferidas, el sistema de perfusión en la etapa a) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternante (ATF) . En una modalidad preferida, el sistema de perfusión en ambas etapas a) e c) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternante (ATF) .

En ciertas modalidades, el método de la invención comprende además: e) purificar el rAd35. En modalidades adicionales, el método comprende además: f) preparar una composición farmacéutica que contenga el rAd35 purificado.

En ciertas modalidades, el adenovirus recombinante carece de por lo menos una porción de la región El, y comprende ácido nucleico heterologo.

En modalidades preferidas, la relación partícula física a partícula infecciosa (VP/IU) del rAd35 producido es menor que 30:1, de preferencia menos de 20:1.

También es un aspecto de la invención proporcionar un método para producir al menos lxlO12 partículas de virus (VP) rAd35/mL, el método comprende: a) cultivar células productoras en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre aproximadamente 10x10s células viables/mL y 16xl06 células viables/mL con rAd35; c) cultivar más las células infectadas con un sistema de perfusión hasta propagar el rAd35, con lo cual la concentración de partículas de virus rAd35 alcanza por lo menos lxlO12 VP/mL; y d) cosechar el rAd35.

La invención proporciona también un biorreactor con un volumen de trabajo de entre 2L y 1,000L, que comprende: medio de cultivo, células productoras y al menos lxlO12 de partículas de virus (VP) rAd35/mL. En ciertas modalidades, el biorreactor tiene un volumen de trabajo de entre 50L y 500L. En modalidades preferidas, el biorreactor se conecta a un sistema de perfusión ATF.

Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra la infección a alta densidad celular en agitadores con rAd5.

La figura 2 muestra la infección a alta densidad celular en agitadores y biorreactor de 2L con rAd35.TB-S.

La figura 3 muestra la infección a alta densidad celular en agitadores con rAd35.eGFP.

Descripción detallada de la invención La presente invención describe un proceso nuevo para la producción de grandes cantidades de adenovirus recombinante 35. Este proceso optimizado se basa en la capacidad para infectar cultivos a alta densidad celular con preservación de una alta productividad de virus por célula. En la presente, se ofrece un método para obtener una solución de virus cosechada con alta concentración de virus en un solo biorreactor. Los rendimientos típicos de los procesos actuales para rAd35 son de aproximadamente 2 -3x1o11 VP/mL. De hecho, se cree que cantidades muy grandes de partículas de rAd35 pueden producirse usando los procesos de la presente invención, por ejemplo cantidades de al menos aproximadamente 5x1o11 VP/mL, de preferencia al menos alrededor de 6 , 7, 8 ó 9x1o11 VP/mL. Preferiblemente por lo menos lxlO12 VP/mL de rAd35 se producen, muy preferiblemente al menos 1.5xl012 VP/mL, todavía más preferiblemente al menos 2xl012 VP/mL, por ejemplo, entre alrededor de lxlO12 y 5xl012 VP/mL. Típicamente, el proceso no producirá más de alrededor de lxlO13 VP/mL de rAd35. Los rendimientos que se pueden obtener con los procesos de acuerdo con la presente invención, son probablemente suficientes para preparar la cantidad deseada de ciertas vacunas a base de rAd35 en el mundo, sin requerir de instalaciones con biorreactores que tengan volúmenes de trabajo de más de 1,000L.

La invención proporciona un método para producir adenovirus recombinante serotipo 35 (rAd35) , el método comprende: a) cultivar células productoras en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de al menos lOxlO6 células viales/mL con rAd35; c) cultivar más las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd35; y d) cosechar el rAd35.

En ciertas modalidades, las células en la etapa b) son infectadas con rAd35 a una densidad de entre aproximadamente lOxlO6 y 50xl06 células viables/mL. En modalidades adicionales, las células en la etapa b) son infectadas con rAd35 a una densidad de entre aproximadamente lOxlO6 y 20xl06 células viables/mL. En modalidades adecuadas adicionales, las células en la etapa b) son infectadas con rAd35 a una densidad de entre aproximadamente lOxlO6 y 16xl06 células viables/mL, por ejemplo a alrededor de 10, 11, 12, 13, 14 ó 15xlOe células viables/mL.

En otras modalidades, las células en la etapa b) son infectadas con rAd35 a una densidad de entre aproximadamente 20xl06 y 50xl06 células viables/mL.

Células productoras y adenovirus recombinantes Una célula productora (algunas veces también llamada en la técnica y en la presente 'célula de empaque' o 'célula de complemento' o 'célula anfitriona' ) de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier célula productora en la que un adenovirus deseado pueda ser propagado. Por ejemplo, la propagación de vectores de adenovirus recombinantes se lleva a cabo en células productoras que complementan deficiencias en el adenovirus. Estas células productoras tienen de preferencia en su genoma por lo menos una secuencia de adenovirus El, y de esta manera son capaces de complementar adenovirus recombinantes con una supresión en la región El. Además, el adenovirus puede tener una supresión en la región E3, la cual sea prescindible del genoma de Ad, y por consiguiente esta supresión no tiene que ser complementada. Cualquier célula productora de complemento de El puede ser usada, tal como células de retina humana inmortalizadas por El, por ejemplo, células 911 o PER.C6 (véase patente de E.U.A. 5,994,128), amniocitos transformados con El (véase patente Europea 1230354) , células A549 transformadas con El (véase, por ejemplo, WO 98/39411, -..patente de E.U.A. 5,891,690), GH329 :HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy 11:213-219), 293, y similares. En ciertas modalidades, las células productoras son por ejemplo células HEK293 o células PER.C6, o células 911 o células IT293SF, y similares. De preferencia, se usan como células productoras células PER.C6 (ECACC depósito 96022940; véase patente de E.U.A. 5,994,128), o células derivadas de las mismas.

Se muestra en la presente que el adenovirus recombinante serotipo 35 (rAd35) tiene propiedades adecuadas hasta la fecha desconocidas en comparación con rAd5 en procesos que aplican infección de alta densidad celular. Se conoce también que aún otro serotipo se comporta nuevamente de manera diferente en procesos similares, sugiriendo que condiciones óptimas para la producción a gran escala de adenovirus recombinante pueden tener que ser establecidas para diferentes serotipos. Por consiguiente, en ciertas modalidades preferidas, el adenovirus de la invención es rAd35.

De preferencia, el vector adenoviral es deficiente en por lo menos una función génica esencial de la región El, por ejemplo, la región Ela y/o la región Elb, del genoma adenoviral que se requiere para la replicación viral. En ciertas modalidades, el vector es deficiente en por lo menos una función génica esencial de ' la región El y por lo menos parte de la región E3 no esencial. El vector adenoviral puede ser "múltiplemente deficiente", significando que el vector adenoviral es deficiente en una o más funciones génicas esenciales en cada una de dos o más regiones del genoma adenoviral. Por ejemplo, los vectores adenovirales deficientes en El o deficientes en El y E3 mencionados arriba pueden ser además deficientes en por lo menos un gen esencial de la región E4 y/o al menos un gen esencial de la región E2 (por ejemplo, la región E2a y/o región E2b) . Los vectores adenovirales suprimidos de la región E4 completa pueden provocar respuestas inmunitarias en anfitrión inferiores. Ejemplos de vectores adenovirales adecuados incluyen vectores adenovirales que carecen (a) de toda o parte de la región El y de toda o parte de la región E2, (b) toda o parte de la región El, toda o parte de la región E2 y toda o parte de la región E3, (c) toda o parte de la región El, toda o parte de la región E2 , toda o parte de la región E3 y toda o parte de la región E4 , (d) al menos parte de la región Ela, por lo menos parte de la región Elb,. al menos parte de la región E2a y al menos parte de la región E3 , (e) al menos parte de la región El, por lo menos parte de la región E3 , y al menos parte de la región E , y (f) todos los productos génicos adenovirales esenciales (por ejemplo, amplicones adenovirales que comprenden ITRs y la señal de empaque únicamente) . Como se conoce por la persona capacitada, en el caso de supresiones de regiones esenciales del genoma del adenovirus, las funciones codificadas por estas regiones tienen que ser proporcionadas en trans, de preferencia por la célula productora, es decir, cuando partes o todas las regiones El, E2 y/o E4 sean suprimidas del adenovirus, éstas tienen que estar presentes en la célula productora, por ejemplo integradas en el genoma, o en forma del llamado adenovirus auxiliar o plásmidos auxiliares.

El vector adenoviral de replicación deficiente puede generarse usando cualquier especie, cepa, subtipo o mezcla de especies, cepas o subtipos, de un adenovirus o un adenovirus quimérico como la fuente de ADN de vector (véase, por ejemplo, WO 96/26281, WO 00/03029) , el cual por ejemplo puede proporcionar al vector adenoviral con la capacidad de infectar ciertos tipos de células deseados.

En una modalidad preferida de la presente invención, se usa rAd35 como un adenovirus.

En modalidades adicionales, el adenovirus de la invención carece de al menos una porción de la región El, por ejemplo, secuencias de codificación de E1A y/o E1B, y comprende además ácido nucleico heterólogo. Acido nucleico heterólogo adecuado se conoce bien por la persona capacitada, y por ejemplo puede incluir marcos de lectura abierta transgénicos , por ejemplo marcos de lectura abierta que codifiquen para polipéptidos contra los cuales se desee una respuesta inmune cuando el vector rAd se use para propósitos de vacunación, por ejemplo, transgenes adecuados para generar una respuesta inmune contra malaria (véase, por ejemplo, WO 2004/055187) , VIH, tuberculosis (véase, por ejemplo, WO 2006/053871), ciertos virus, etc., todos bien conocidos por la persona capacitada. De hecho, la naturaleza del ácido nucleico heterólogo no es crítica para la presente invención, puede ser cualquier ácido nucleico heterólogo, y por consiguiente no requiere de una mayor elaboración aquí.

La persona capacitada en la técnica estará consciente de las posibilidades de propagar vectores adenovirales de diferentes serotipos en células anfitrionas específicas, usando métodos tales como por ejemplo los descritos en la patente de E.U.A. 6,492,169 o en WO 03/104467, y referencias en las mismas. Por ejemplo, la propagación de rAd35 deficiente en El, células productoras específicas que expresan E1B-55K de Ad35 pueden construirse, por ejemplo con base en células productoras existentes que expresen E1A y E1B de Ad5 tales como células PER.C6 o HEK293 (véase, por ejemplo, US 6,492,169), como se conoce por la persona capacitada. Como alternativa y de preferencia, líneas de células de complemento (Ad5-) existentes tales como por ejemplo PER.C6 o HEK293 pueden usarse sin modificación de las células para la propagación de rAd35 deficiente en El, mediante la inclusión de la secuencia de codificación E4-orf6 de Ad5 en el vector rAd35, como se describe extensamente por ejemplo en WO 03/104467, incorporado en su totalidad por referencia en la presente. Así, la propagación de vectores adenovirales de cualquier serotipo se puede hacer en células productoras usando medios y métodos bien conocidos por la persona experta en la técnica. Vectores adenovirales , métodos para la construcción de los mismos y métodos para la propagación de los mismos, se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191 y 6,13,913, y Thomas Shenk, "Adenoviridae and Their Replication" , M.S. Horwitz, "Adenoviruses" , capítulos 67 y 68, respectivamente, en Virology, B. N. Fields et al., eds . , 3a edición, Raven Press, Ltd., Nueva York (1996), y otras referencias mencionadas en la presente.

La construcción de vectores adenovirales se entiende bien en la técnica e implica el uso de técnicas de biología molecular estándares, tales como aquellas descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2a edición, Scientific American Books (1992), y Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995) , y otras referencias mencionadas en la presente.

Las células productoras de acuerdo con la invención se cultivan para incrementar los números de células y virus y/o títulos virales. Cultivar una célula se hace para hacerle posible metabolizar, y/o crecer, y/o dividirse, y/o producir virus de interés de acuerdo con la invención. Esto se puede lograr mediante métodos como aquellos bien conocidos por las personas expertas en la técnica, e incluyen pero no se limitan a proporcionar nutrientes para la célula, por ejemplo en los medios de cultivo adecuados. Se pueden usar diferentes medios de cultivo, y la elección del medio de cultivo óptimo para las células y circunstancias usadas es parte de las tareas rutinarias de la persona capacitada en este campo. Los medios de cultivo adecuados para el propósito de la presente invención son entonces aquellos bien conocidos para la persona experta y pueden obtenerse generalmente a partir de fuentes comerciales en grandes cantidades, o hacerse a la medida de acuerdo con protocolos estándares. El cultivo puede llevarse a cabo por ejemplo en cajas, botellas rodantes o en biorreactores , usando sistemas intermitentes, de alimentación intermitente, continuos y similares. Para lograr la producción a gran escala (continua) de virus a través de cultivo de células se prefiere en la técnica tres células capaces de crecer en suspensión, y se prefiere tener células capaces de ser cultivadas en ausencia de suero derivado de animales o humanos o de componentes séricos derivados de animales o humanos. Las condiciones adecuadas para cultivar células se conocen (véase, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), and R.I. Freshney, Culture of animal cells: A Manual of basic technique, cuarta edición ( iley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

Sistema de cultivo de células y sistema de perf sión Los biorreactores se han usado ampliamente para la producción a gran escala de productos biológicos a partir de cultivos de células animales dependientes de suspensión. De acuerdo con la invención, los biorreactores usados para la propagación de adenovirus pueden por ejemplo ser tanques agitados, biorreactores desechables, reactores de levantamiento con aire y similares.

De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención el biorreactor es un tanque agitado.

De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, el biorreactor tiene un volumen de trabajo de entre aproximadamente 2L y 2,000L, entre significando aquí que incluye los valores de límite superior e inferior descritos, es decir, 2L siendo el volumen de trabajo más pequeño y 2,000L siendo el volumen de trabajo más grande. Los biorreactores que tienen un volumen de trabajo de cualquier valor individual entre estos valores intentan estar incluidos en la invención. El término 'aproximadamente' para valores numéricos según se usa en la presente descripción significa el valor +10%. En ciertas modalidades preferidas, el volumen de trabajo es de entre 10L y 1,000L, de preferencia entre 20L y 800L, por ejemplo, entre 30L y 600L, por ejemplo, entre 50L y 500L, por ejemplo aproximadamente 250 L o alrededor de 500L. Una ventaja de usar biorreactores con un volumen de trabajo de acuerdo con la invención es que el uso de biorreactores de volumen muy grande, es decir, aquellos con un volumen de trabajo de mucho más de 2,000L, de preferencia 1,000L, es evitado, y de esta manera la gran inversión de capital y tiempo en la construcción de un reactor tan grande no se requiere. Además, el producto, es decir, el rAd, es mucho más concentrado cuando se hace uso de los métodos de la presente invención, lo cual ahorra tiempo y costos en la cosecha y/o procesamiento corriente abajo adicional de rAd desde los biorreactores. El volumen de trabajo es el volumen de cultivo efectivo en el biorreactor. Los tanques agitados tienen generalmente una relación altura a diámetro de 1:1 a 3:1. El cultivo se mezcla normalmente con uno o más agitadores, con base en discos con cuchillas o patrones de propulsores marinos. Los sistemas agitadores que ofrecen menos fuerzas cortantes que las cuchillas han sido descritos. La agitación puede conducirse ya sea directa o indirectamente por excitadores acoplados magnéticamente. Los excitadores indirectos reducen el riesgo de contaminación microbiana a través de las juntas en los ejes de los agitadores. La instrumentación y controles de estos biorreactores incluyen (sin limitación) : controles de agitación, temperatura, oxígeno disuelto, H y biomasa. La agitación, pH, temperatura, concentración de oxígeno disuelto del medio de cultivo de células son en principio no críticos y dependen del tipo de célula seleccionado. De preferencia, la agitación, pH, temperatura, concentración de oxígeno disuelto se seleccionan de tal manera que sean óptimas para el crecimiento de las células. La persona capacitada en la técnica sabe cómo encontrar la agitación, pH, temperatura, concentración de oxígeno disuelto óptimas para el cultivo. Normalmente, la agitación óptima está entre 50 y 300 rpm, por ejemplo, 100-250 rpm, el pH óptimo es de entre 6.7 y 7.7, la temperatura óptima de entre 30 y 39°C, por ejemplo, 34, 35, 36, 37 ó 38°C.

La mayoría de los cultivos en suspensión a gran escala se operan como procesos intermitentes o de alimentación intermitente toda vez de que son los más simplificados de operar y escalar. Sin embargo, procesos continuos a base de principios de perfusión se están haciendo cada vez más comunes. De acuerdo con la presente invención las células productoras se cultivan en un sistema de perfusión. El cultivo de perfusión de células tiene su significado convencional en la técnica, es decir, significa que durante el cultivo las células son retenidas por un dispositivo de separación en el cual hay un flujo saliente de líquido que tiene una densidad celular más baja que antes de la separación y en el cual hay un flujo interior de medio de cultivo de células. El uso de cultivo perfundido es en respuesta al reto de cultivar células a altas densidades (por ejemplo, 10-50 x 106 células viables/mL) . Para incrementar las densidades más allá de 2-4 x 106 células viables/mL, el medio es constantemente, o intermitentemente, reemplazado con un suministro fresco para, de esta manera compensar las deficiencias nutricionales y para eliminar productos tóxicos. La perfusión permite también un control mucho mejor del ambiente de cultivo (pH, d02, niveles de nutrientes, etc.) . La perfusión de medio fresco a través del cultivo se puede lograr al retener las células con una variedad de dispositivos de separación (por ejemplo, filtro centrífugo de malla fina, filtro hueco o filtros de membranas de placa plana, tubos de sedimentación) . En modalidades preferidas del proceso de la presente invención, el dispositivo de separación es un módulo de filtros que comprende fibras huecas .

Con el término "fibra hueca" se intenta decir una membrana tubular. El diámetro interno del tubo es de preferencia de entre 0.3 y 6.0 mm, muy preferiblemente entre 0.5 y 3.0 mm, más preferiblemente entre 0.5 y 2.0 mm. En ciertas modalidades, el tamaño de malla (tamaño de poro) en la membrana se selecciona de tal manera que el tamaño de los poros en la malla esté cerca del diámetro de las células, asegurando una alta retención de células mientras que los restos celulares pueden pasar el filtro. En otras modalidades, el tamaño de malla es significativamente más pequeño que el diámetro de las células. Preferiblemente, el tamaño de malla es de entre 0.1 y 3 µta, por ejemplo, alrededor de 0.2 µp?. Los módulos de filtros que comprenden fibras huecas están disponibles comercialmente de por ejemplo, General Electric (anteriormente Amersham) . Cantidades significativas de partículas de adenovirus no fueron observadas en el medio de cultivo de flujo saliente durante el proceso de la presente invención, a pesar de que las partículas de virus son más pequeñas que el tamaño de malla aplicado.

La perfusión se usa para conservar los niveles deseados de ciertos metabolitos y para eliminar y de esta manera reducir impurezas en el medio de cultivo. Las velocidades de perfusión pueden medirse de varias maneras, tal como en términos de volúmenes de reemplazo/tiempo unitario o en términos de niveles de ciertos metabolitos, los cuales deben mantenerse, durante periodos de perfusión. Es típicamente el caso de que la perfusión no se lleva a cabo en todo momento durante el cultivo y generalmente se lleva a cabo sólo de vez en cuando durante el cultivo según se desee. Por ejemplo, la perfusión no se inicia típicamente sino hasta que después de que ciertos componentes del medio tales como glucosa empiecen a agotarse y tengan que ser reemplazados .

Varios sistemas de perfusión se conocen en la técnica y son en principio adecuados para los métodos de la presente invención. Con el término "sistema de perfusión" se intenta decir la combinación de un biorreactor conectado a un dispositivo de separación. El dispositivo de separación puede ser ya sea incorporado en el biorreactor (por ejemplo, filtro centrífugo de malla fina) o permanecer fuera del biorreactor (por ejemplo, fibra hueca) . En ambos casos, como se explicó arriba, el dispositivo de separación presenta enjuague de la masa celular del reactor y hace posible el refrescamiento del medio.

Los presentes inventores llevaron a cabo experimentos piloto con varios sistemas de perfusión a partir de los cuales el sistema de perfusión de flujo tangencial alternante (ATF) dio los mejores resultados. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, los biorreactores son operados con (conectados a) un sistema de perfusión ATF (por ejemplo, ATF System, Refine Technology, Co., East Hanover, NJ) . El sistema consiste en una bomba de diafragma montada a un extremo de un alojamiento de fibra hueca. El otro extremo del alojamiento se une a un ensamble conjunto, el cual, a su vez, se conecta a un biorreactor a través de un puerto disponible. La bomba de diafragma y sistema de control sirve para generar flujo tangencial alternante a través de las fibras huecas. Esto hace posible que haya un flujo en la misma dirección que (es decir, tangencial a) las superficies de membrana de las fibras huecas, flujo que está yendo y viniendo, y hay otro flujo en una dirección sustancialmente perpendicular a la superficie del filtro. El flujo tangencial puede lograrse de acuerdo con métodos conocidos por la persona capacitada en la técnica y según se describe en, por ejemplo, US 6,544,424.

El f ncionamiento del sistema de perfusión ATF ha sido descrito (Furey, 2002) . Los sistemas ATF permiten a las células ser cultivadas durante un periodo de tiempo más largo y alcanzar altas densidades celulares sin tener un filtro bloqueado. De hecho, densidades celulares extremadamente altas de más de 100 x 106 células viables/mL pueden obtenerse con el uso de un sistema de perfusión ATF, por ejemplo, con células PER.C6 (véase, por ejemplo, Yallop et al.). Sin embargo, en reportes anteriores las células PER.C6 en sistemas de perfusión se usaron para un propósito completamente diferente y no se infectan con adenovirus .

Una ventaja adicional del sistema ATF es que el sistema genera bajo estrés cortante. Se agrega energía a la superficie del líquido, generando un flujo laminar cortante bajo. Esto puede ser una ventaja especialmente para la presente invención, en donde las células son infectadas con adenovirus. Durante los procesos de perfusión, después de la infección, con el sistema ATF no se encontró ninguna pérdida de densidad celular y ninguna pérdida de células prematuras fue observada, sino que más bien incluso el crecimiento celular fue observado. Ya que las células permanecían intactas, se crean condiciones óptimas para la propagación de virus .

La perfusión con el sistema ATF es por lo tanto adecuada durante la fase de precultivo (etapa a de acuerdo con la presente invención) , toda vez que permite obtener densidades celulares muy altas, y las células están en buenas condiciones para su infección subsecuente con adenovirus, posiblemente contribuyendo a los altos rendimientos obtenidos. Para alcanzar estas altas densidades celulares, el medio de cultivo es en ciertas modalidades al menos parcialmente perfundido durante una porción de tiempo durante el crecimiento de células de las células productoras (etapa a) . En ciertas modalidades, la perfusión se inicia una vez que se alcanza una densidad celular de entre aproximadamente 2xl06 células viables/mL y 8xl06 células viables/mL.

Además, la perfusión con el sistema ATF es adecuada después de la etapa de infección (etapa c de acuerdo con la presente invención) , toda vez que permite obtener rendimientos de adenovirus muy altos de las células infectadas. En modalidades preferidas por lo tanto, tanto la etapa precultivo como la etapa post- infección de los procesos de la invención emplean un sistema de perfusión ATF. El volumen de medio de cultivo usado durante ATF puede ser variado de acuerdo con las necesidades de las células como se puede establecer y ajustar fácilmente por la persona capacitada, y varía típicamente de entre alrededor de 0.5-5 volúmenes de recipiente/día (vol/d) , por ejemplo, entre 1-3 vol/d, por ejemplo alrededor de 2 vol/d. En ciertas modalidades adecuadas, la velocidad de refrescamiento es de entre alrededor de 1 y 2 vol/d, ya que los inventores han mostrado en la presente que esto da resultados muy buenos en términos de rendimientos y calidad del rAd35 obtenido, mientras que al mismo tiempo el consumo del medio y por lo tanto los costos asociados con el mismo aún son razonables.

Finalmente, el sistema de perfusión ATF es un sistema escalable. Las unidades ATF de tamaños diferentes están disponibles. Ya que se usa flujo de aire para conducir el cultivo a través de la membrana de fibras huecas, se pueden generar velocidades de flujo tangencial muy rápidas y poco cortantes haciendo posible que se use la tecnología de R&D para escalar la producción hasta 1,000 L (Furey, 2002). Posiblemente, desarrollos adicionales permitirán una escalada ascendente todavía mayor del sistema de perfusión ATF.

En Yuk et al., rAd5 se produce usando una línea de células tumorales, y ahí el proceso completo se lleva a cabo en un solo biorreactor, lo cual tardará aproximadamente 8-10 días en un biorreactor de producción. En ciertas modalidades de la presente invención, se usan dos biorreactores diferentes, uno para el precultivo (etapa a; biorreactor de precultivo) , y uno para la infección (etapa b) y cultivo post- infección (etapa c; biorreactor de producción) de las células. Una ventaja del uso de dos biorreactores separados para estas etapas es que sólo aproximadamente 1.5-5, típicamente alrededor de 2-3 días de cultivo en el biorreactor de producción se requieren, y por lo tanto mucho más corridas pueden llevarse a cabo al año. La adición de una gran cantidad de medio de cultivo fresco durante la infección es además adecuada para reducir el volumen de medio de cultivo requerido durante la perfusión en el biorreactor de producción. En modalidades alternativas también es posible llevar a cabo todas las etapas a-c de la invención en un solo biorreactor.

Infección En los métodos de la invención, células productoras son infectadas con adenovirus recombinante . Típicamente, el virus será expuesto a la célula productora adecuada bajo condiciones óptimas, permitiendo la absorción del virus. Las condiciones óptimas dependen del tipo de célula y del tipo de adenovirus seleccionado. La persona capacitada en la técnica sabe cómo encontrar las condiciones óptimas, es decir, agitación, pH, temperatura, oxígeno disuelto (d02 o DO) , multiplicidad de infección (MOI) . Normalmente, la agitación óptima es de entre alrededor de 50 y 300 rpm, típicamente alrededor de 100-200, por ejemplo, alrededor de 150, DO típica es 20-60%, por ejemplo, 40%, el pH óptimo es de entre 6.7 y 7.7, la temperatura óptima de entre 30 y 39°C, por ejemplo 34-37°C y la MOI óptima entre 5 y 1,000, por ejemplo alrededor de 50-300. Típicamente, el adenovirus infecta células productoras espontáneamente, y poner las células productoras en contacto con partículas rAd es suficiente para la infección de las mismas. Generalmente, una solución de siembra de adenovirus se añade al cultivo para iniciar la infección, y posteriormente el adenovirus se propaga en las células productoras. Esto es todo rutinario para la persona capacitada en la técnica.

En cierta modalidad de la presente invención, la perfusión se detiene antes de la infección y se reanuda después de entre 1 y 20 horas, por ejemplo 3-15 horas, por ejemplo 5 horas después de la infección. Este retraso debe permitir a las partículas de virus entrar en las células e impedir que las partículas de virus sean expulsadas fuera del sistema. Las velocidades de perfusión, post-infección, se definen en términos del nivel de glucosa que se mantiene por medio de la perfusión. Por ejemplo, en la presente invención la concentración de glucosa en el medio se conserva normalmente a una concentración de entre alrededor de 2 mmoles/L y 20 mmoles/L, típicamente entre alrededor de 5 y 10 mmol/L .

Fue adecuadamente posible infectar un biorreactor con rAd35 a altas densidades celulares, es decir, más altas que lOxlO6 células viables/mL, con la preservación de una alta productividad de virus por célula. En ciertas modalidades, la productividad específica permanece entre aproximadamente 0.5xl05 y 1.5xl05 VP/célula.

Además, en la presente invención, la viabilidad del cultivo de células antes de la infección permanece más alta que 75%. Significando que al menos 75% de la cantidad total de células en el cultivo es viable en el momento de la infección. En ciertas modalidades, la viabilidad del cultivo de células en la infección es de al menos 80%, en modalidades adicionales por lo menos 85%. La viabilidad puede medirse usando métodos de rutina disponibles para la persona capacitada, por ejemplo, exclusión de azul tripano, recuento de células Casy y similares.

En cierta modalidad, la densidad celular en infección es de entre aproximadamente lOxlO6 y 50xl06 células viables/mL, por ejemplo entre alrededor de lOxlO6 y 20xl06 células viables/mL, por ejemplo, entre aproximadamente 10x10s y 15xl06 células viables/mL, por ejemplo entre alrededor de lOxlO6 y 14xl06 células viables/mL, por ejemplo aproximadamente 12-13xl06 células viables/mL. Estas densidades celulares permiten alta productividad de virus con acumulación limitada de restos celulares y ADN de células anfitrionas, lo cual da una ventaja de estas modalidades en el procesamiento corriente abajo de la cosecha de adenovirus. Así, la presente invención proporciona un proceso optimizado para la producción de rAd35, produciendo altos números de partículas rAd35 de buena calidad, mientras se proporciona al mismo tiempo un material de cosecha que aún es manejable para propósitos de procesamiento corriente abajo.

En otras modalidades descritas en la presente, la densidad celular después de infección es de entre alrededor de 15xl06 y 50xl06 células viables/mL, por ejemplo entre aproximadamente 17xl06 y 45xl06 células viables/mL, por ejemplo entre alrededor de 20xl06 y 40xl0106, por ejemplo entre 25xl06 y 35xl06 células viables/mL, por ejemplo alrededor de 30xl06 células viables/mL. Infecciones a estas densidades celulares pueden producir concentraciones todavía más altas de adenovirus recombinante , en particular rAd35, y sobrepasar los rendimientos para rAd35 descritos hasta el momento. Como se muestra por primera vez en la presente divulgación, en contraste con infección de rAd5 a altas densidades celulares (arriba de lOxlO6 células viables/mL) , la infección con rAd35 a densidades por arriba de lOxlO6 células viables/mL aún incrementó la productividad volumétrica de rAd35 con densidades celulares cada vez más altas de hasta al menos 30xl06 células viables/mL después de infección, usando células productoras en suspensión con un sistema de perfusión.

En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un método para producir al menos lxlO12 partículas de virus (VP) rAd35/mL.

Los procesos de la presente invención permiten la recuperación de rAd35 con una relación partícula física a partícula infecciosa de menos de 30:1, lo cual es un parámetro importante para adenovirus que se va a administrar a humanos. Esto se puede medir como una relación partícula de virus (VP) /unidad infecciosa (IU) , empleando por ejemplo un ensayo QPA ( ang et al., 2005). Una relación más baja es adecuada toda vez que menos partículas de virus tienen que ser administradas para infectar el mismo número de células en tal caso. Las regulaciones de la FDA actuales requieren una relación VP/IU de menos de 30:1, y por consiguiente los procesos de la invención descrita en la presente son adecuados para preparar grandes números de rAd35 que cumplen con este requerimiento particular. Los autores de Yuk et al (2004) reportaron números absolutos más bajos de partículas de virus que los números descritos en la presente, y además la relación VP/IU de las muestras descritas en Yuk et al (2004) son de alrededor de 100 (figura 2A/2B en Yuk et al, 2004). En contraste, en la presente se reportan rendimientos absolutos más altos y además relaciones VP/IU significativamente mejores de menos de 20:1. En ciertas modalidades preferidas por lo tanto, los procesos de la invención proporcionan lotes de rAd35 que tienen una relación VP/IU de menos de 20:1, por ejemplo, entre alrededor de 20:1 y aproximadamente 5:1.

Métodos de cosecha y lisis de células Después de la infección de un adenovirus, el virus se replica dentro de la célula y es de esta manera amplificado. La infección con adenovirus se traduce finalmente en la lisis de las células que están siendo infectadas. Las características líticas del adenovirus permiten por lo tanto dos modos diferentes de producción de virus. El primer modo es cosechar virus antes de la lisis celular, empleando factores externos para lisar las células. El segundo modo es cosechar sobrenadante de virus después (casi) de la lisis celular completa por el virus producido (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. 6,485,958, que describe la cosecha de adenovirus sin lisis de las células anfitrionas por un factor externo) . Para el segundo modo, tiempos de incubación más grandes se requieren para lograr una lisis celular completa, y por consiguiente altos rendimientos de virus. Además, el derrame gradual de los contenidos de la célula anfitriona en el medio puede ser dañino para la integridad y rendimiento de los virus obtenidos. Por consiguiente, se prefieren emplear factores externos para lisar activamente las células para cosechar el adenovirus, de acuerdo con la invención.

Los métodos que se pueden usar para lisis celular activa se conocen por la persona capacitada en la técnica, y han sido por ejemplo descritos en WO 98/22588, pp . 28-35. Los métodos útiles a este respecto son por ejemplo, congelación-descongelación, corte sólido, lisis hipertónica y/o hipotónica, corte líquido, sonificación, extrusión a alta presión, lisis con detergentes, combinaciones de las anteriores, y similares. En una modalidad de la invención, las células son lisadas usando al menos un detergente. El uso de un detergente para lisis tiene la ventaja de que es un método fácil, y de que es fácilmente escalable.

Los detergentes que pueden usarse, y la manera en que son empleados, se conoce generalmente por la persona capacitada en la técnica. Varios ejemplos son por ejemplo descritos en WO 98/22588, pp . 29-33. Los detergentes, según se usa en la presente, pueden incluir detergentes aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos y no iónicos. Es claro para la persona capacitada en la técnica que la concentración del detergente puede variar, por ejemplo dentro del intervalo de aproximadamente 0.1%-5% (v/v) . En una modalidad, el detergente usado es Tritón X-100.

Se puede emplear nucleasa para remover los ácidos nucleicos contaminantes, es decir, principalmente células productoras. Las nucleasas ejemplares adecuadas para usarse en la presente invención incluyen Benzonase*, Pulmozyme®, o cualquier otra DNasa y/o RNasa usada comúnmente en la técnica. En modalidades preferidas, la nucleasa es Benzonase , la cual hidroliza rápidamente ácidos nucleicos al hidrolizar enlaces de fosfodiéster internos entre nucleótidos específicos, reduciendo de esta manera la viscosidad del © lisado celular. Benzonase pude obtenerse comercialmente de Merck. KGaA (código W214950) . La concentración en la cual la nucleasa es empleada está de preferencia dentro del intervalo de 1-100 unidades/mi.

Los métodos para cosechar adenovirus de cultivos de células productoras han sido descritos extensamente en WO 2005/080556.

De acuerdo con la presente invención, el tiempo de cosecha es de entre aproximadamente 24 y 120 horas después de infección, por ejemplo, entre alrededor de 48 y 96 horas post-infección, por ejemplo 72 horas post-infección.

Métodos de purificación En ciertas modalidades, el adenovirus cosechado se purifica más. La purificación del adenovirus puede llevarse a cabo en varias etapas que comprenden aclaración, ultrafiltración, diafiltración o separación con cromatografía como se describe por ejemplo en WO 05/080556, incorporado por referencia en la presente. La aclaración puede hacerse por una etapa de filtración, removiendo restos celulares y otras impurezas del lisado de células. La ultrafiltración se usa para concentrar la solución de virus. La diafiltración, o intercambio de reguladores de pH, usando ultrafiltros es una manera de remoción e intercambio de sales, azúcares y similares. La persona capacitada en la técnica sabe cómo encontrar las condiciones óptimas para cada etapa de purificación. También O 98/22588, incorporado en su totalidad a manera de referencia en la presente, describe métodos para la producción y purificación de vectores adenovirales . Los métodos comprenden cultivar células anfitrionas, infectar las células anfitrionas con adenovirus, cosechar y lisar las células anfitrionas, concentrar el lisado crudo, intercambiar el regulador de pH del lisado crudo, tratar el lisado con nucleasa y purificar más el virus usando cromatografía.

La purificación puede por ejemplo ser lograda mediante centrifugación de gradiente de densidad, como por ejemplo se describe en WO 98/22588, pp. 59-61.

Sin embargo, de preferencia, la purificación emplea al menos una etapa de cromatografía, como se describe por ejemplo en WO 98/22588, pp . 61-70. Se han descrito muchos procesos para la purificación adicional de adenovirus en los que etapas de cromatografía se incluyen en el proceso. La persona capacitada en la técnica estará consciente de estos procesos, y puede variar la manera exacta de emplear etapas cromatográficas para optimizar el proceso.

Es por ejemplo posible purificar adenovirus mediante etapas de cromatografía de intercambio aniónico, véase por ejemplo O 05/080556. Para la purificación de adenovirus, se prefiere usar por lo menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico, el virus puede ser suficientemente puro. Sin embargo, en ciertas modalidades una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño se lleva a cabo además para incrementar la robustez del proceso. Esta etapa puede ser antes de o después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Obviamente, también se pueden combinar adecuadamente otras etapas de purificación con una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.

El uso de una cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de adenovirus ha sido extensamente descrito, y este aspecto está por lo tanto dentro del alcance de la persona capacitada en la técnica. Muchas matrices de cromatografía diferentes han sido empleadas para la purificación de adenovirus y son adecuadas, y la persona capacitada en la técnica puede encontrar fácilmente el material de intercambio aniónico óptimo para purificar el virus, por ejemplo guiado por la siguiente técnica.

Patente de E.U.A. 5,837,520 (véase también Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416) describe un método para purificar adenovirus en el que el lisado de células anfitrionas se trata con una nucleasa, seguido por intercambio aniónico y cromatografía de afinidad a iones de metal .

La patente de E.U.A. 6,485,958 describe el uso de cromatografía de intercambio aniónico fuerte para la purificación de adenovirus recombinantes .

Se ha empleado cromatografía de intercambio aniónico con columnas de lecho fluidizado para la purificación de partículas de adenovirus, véase WO 00/50573.

Además, la cromatografía de intercambio aniónico de lecho expandido, y ciertas resinas cromatográficas para cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de partículas de adenovirus han sido descritas en la patente de E.U.A. 6,586,226.

Además de columnas de intercambio aniónico, los productos de cromatografía de membrana de intercambio aniónico tales como aquellos producidos por Pall (por ejemplo, series Mustang™) y Sartorius (por ejemplo, series Sartobind) son adecuados. Para el uso de estos filtros y sus ventajas en la purificación de adenovirus véase por ejemplo WO 03/078592 y WO 2005/080556.

La patente de E.U.A. 6,537,793 describe la purificación de partículas adenovirales a partir de células anfitrionas usando cromatografía de intercambio iónico, en particular enseña una preferencia para los tipos Q Sepharose XL de soporte cromatográfico para este propósito. En una modalidad de la presente invención, un adenovirus se purifica más usando una columna Q Sepharose XL .

El proceso de purificación también puede emplear adecuadamente una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño.

La solicitud internacional WO 97/08298 describe la purificación de adenovirus usando ciertas matrices cromatográficas para evitar el daño a los virus, incluyendo las etapas de intercambio aniónico y exclusión de tamaño. La patente de E.U.A. 6,261,823 describe un método para purificar adenovirus en el que la preparación de adenovirus se somete a cromatografía de intercambio aniónico seguida por cromatografía de exclusión de tamaño. En la etapa de exclusión de tamaño, se logra una separación en grupos de partículas virales a partir de impurezas de bajo peso molecular .

También es posible emplear un medio de hidroxiapatita para purificar adenovirus, véase WO 02/44348.

Una etapa de adsorción en fase inversa también puede usarse, tal como la que se describe por ejemplo en WO 03/097797, p . 26.

La solicitud internacional WO 97/08298 describe la purificación de adenovirus usando ciertas matrices cromatográficas para evitar daño a los virus, incluyendo etapas de intercambio aniónico y exclusión de tamaño.

Ciertos métodos de ultrafiltración también son muy adecuados para la purificación de adenovirus, como se describe en WO 2006/108707. Estas etapas pueden llevarse a cabo además de o en lugar de ciertas etapas de purificación cromatográficas .

Preparación de una preparación farmacéutica En ciertas modalidades, el adenovirus purificado es formulado en una composición farmacéutica. Esto se puede hacer de acuerdo con una variedad de métodos y usando una variedad de reguladores de pH todos de acuerdo con métodos rutinarios bien conocidos por la persona capacitada en la técnica. En general, implica poner las partículas de adenovirus en una composición armacéuticamente aceptable, que comprende el adenovirus y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede prepararse bajo condiciones conocidas por la persona capacitada, y en ciertas modalidades es adecuada para su administración a humanos.

Por ejemplo, el adenovirus puede ser intercambiado en regulador de pH durante la separación en grupos al -y finalmente almacenado en- regulador de pH que también se use para la Adenovirus World Standard (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing Marzo de 2002, pp . 43-48) : 20 mM de Tris pH 8, 25 mM de NaCl, 2.5% de glicerol.

Obviamente, muchos otros reguladores de pH pueden ser usados, y varios ejemplos de formulaciones adecuadas para el almacenamiento y administración farmacéutica de preparaciones de (adeno) virus purificadas pueden por ejemplo encontrarse en la patente europea No. 0853660, y en las solicitudes de patente internacionales WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763.

En ciertas modalidades, los vectores de adenovirus se usan como vacunas, y éstos se mantienen típicamente en portadores o excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los portadores o excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica y se usan extensamente en una amplia variedad de productos terapéuticos. De preferencia, se aplican portadores que funcionan bien en vacunas. Muy preferiblemente, las vacunas comprenden además un adyuvante. Los adyuvantes se conocen en la técnica porque incrementan más la respuesta inmune a un determinante antigénico aplicado, y composiciones farmacéuticas que comprenden adenovirus y un adyuvante de fosfato de aluminio se describen por ejemplo en WO 2007/110409.

Para su administración a humanos, la invención puede emplear composiciones farmacéuticas que comprendan el rAd y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En el presente contexto, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador excipiente, a las dosis y concentraciones empleadas, no causará ningún efecto dañino o no deseado en los sujetos a los cuales se administren. Estos portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company

[1990] ; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Próteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds . , Taylor & Francis

[2000]; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed.; Pharmaceutical Press

[2000] ) . El rAd purificado se formula y administra de preferencia como una solución estéril aunque está dentro del alcance de esta invención utilizar preparaciones liofilizadas . Las soluciones estériles se preparan mediante filtración estéril o mediante otros métodos conocidos per se en la técnica. Las soluciones son después liofilizadas o rellenas en recipientes de dosis farmacéuticos. El pH de la solución está generalmente en el intervalo de pH 3.0 a 9.5, por ejemplo pH 5.0 a .5. El rAd típicamente está en una solución que tiene un regulador de pH farmacéuticamente aceptable adecuado, y la solución de rAd también puede contener una sal. Opcionalmente puede estar presente un agente estabilizador, tal como albúmina. En ciertas modalidades, se añade detergente. En ciertas modalidades, rAd puede formularse en una preparación inyectable. Estas formulaciones contienen cantidades efectivas de rAd, son ya sea soluciones líquidas estériles, suspensiones líquidas o versiones liofilizadas y contienen opcionalmente estabilizadores o excipientes.

La presente invención describe métodos para producir vectores adenovirales , en particular rAd35, con rendimientos muy altos, y en cuanto a lo que los presentes inventores saben los rendimientos obtenidos y descritos en la presente no han sido reportados anteriormente. En los procesos de la invención, se usan biorreactores , y el biorreactor con el número muy alto de partículas de adenovirus por volumen es un producto directo (intermedio) de la invención. La invención proporciona también por lo tanto un biorreactor con un volumen de trabajo de entre 2L y 2,000L, de preferencia entre 10L y 1,000L, que comprende: medio de cultivo, células productoras y al menos lxlO12 partículas de virus rAd35 (VP/mL. El medio de cultivo puede ser cualquier medio de cultivo adecuado para la propagación de las células e infección para adenovirus, como se describió arriba. Los aspectos del volumen del biorreactor, las células productoras y el número de partículas rAd35 y relación VP/IU son como los descritos arriba para los métodos de la invención. En modalidades preferidas, el biorreactor es conectado a un sistema de perfusión ATF.

En otro aspecto más, la invención proporciona un método para producir al menos lxlO12 partículas de virus (VP) rAd35/mL, el método comprende: a) cultivar células productoras en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre 10x10s células viables/mL y 16xl06 células viables/mL con rAd35; c) cultivar más las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd35, con lo cual la concentración de partículas de virus rAd35 alcanza al menos lxlO12 VP/mL; y d) cosechar el rAd35. Antes de la presente divulgación, se desconocía si estos rendimientos tan altos de rAd35 eran posibles en absoluto, mucho menos cómo lograr estos altos rendimientos. La presente invención describe que estos rendimientos son posibles de acuerdo con métodos descritos en la presente. De preferencia, la relación partícula física a partícula infecciosa del rAd35 cosechado es menor que 30:1. Modalidades adicionales y adecuadas son como las descritas para los métodos de acuerdo con la invención como las descritas arriba.

La invención se explica más en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no limitan la invención de ninguna manera. Sirven simplemente para aclarar la invención.

Ej emplos Ejemplo 1 Infección a altas densidades celulares con un vector Ad5 De un banco de células de trabajo PER.C6 se descongelaron células y se propagaron en medio de cultivo libre de suero en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de C02. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que suficiente densidad celular se alcanzara para inocular un biorreactor de 2L hasta un volumen de 1.5L y una densidad celular de 0.2 a 0.5xl06 células viables/mL. Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37°C, DO de 40% y un pide 7.3. El proceso de perfusión ATF se inició a una densidad celular de 4.7xl06 células totales/mL. El ATF fue de Refine Technology, Co., East Hanover, NJ. Después de 89 horas se alcanzó una densidad celular de 12.4xl06 células totales/mL. En este momento una parte de las células se cosechó y las células fueron centrifugadas durante 5 minutos a 300g. El sedimento celular fue resuspendido hasta las siguientes concentraciones en medio libre de suero fresco: - 1.3xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL lOxlO6 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL 20xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL - 30xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL Los agitadores fueron infectados con Ad5.CS (un vector rAd5, Shott et al, 2008) a una MOI de 90 VP/célula y se incubaron a 36 °C, 10% de C02 y 100 rpm. El día 1 y 2 después de la infección se llevó a cabo un reabastecimiento del medio para los agitadores infectados a 10, 20 y 30x10s células viables/mL. Este refrescamiento de medio se llevó a cabo por una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 300 g y resuspendiendo el sedimento celular en 30 mL de medio fresco por agitador. El día 3 después de la infección los agitadores fueron cosechados y muestreados para análisis AEX-HPLC. La lisis celular de la cosecha se llevó a cabo al mezclar un volumen de muestra de 1 mL de cada agitador con 100 \ih de Tritón X-100 al 10% e incubación a 37°C durante 30 minutos. Después de la ¦ incubación las muestras fueron mezcladas con 2.42 µL de benzonase/MgCl2 seguidos por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37°C. Finalmente 100 µL de sucrosa al 50% fueron añadidos a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2,500 g, las muestras fueron almacenadas debajo de -65°C hasta que se llevara a cabo el análisis AEX-HPLC para determinar el número de partículas de virus producidas (VP/mL) . Los resultados se muestran en la figura 1.

El rendimiento volumétrico de una infección a una densidad celular de lOxlO6 células viables/mL fue 10 veces más alto que a lxlO6 células viables/mL. Esto fue de cierta forma inesperado dado el efecto de densidad celular reportado en reportes anteriores a densidades mucho más bajas (es decir, a aproximadamente 0.5-3xl06 células/mL, por ejemplo, Maranga et al., 2005; Kamen et al., 2004; Altaras et al., 2005) . Sin embargo, más allá de las lOxlO6 células/mL, se observó un efecto de densidad celular y los rendimientos volumétricos se redujeron.

Así, con Ad5 recombinante se observa un efecto de densidad celular en el sistema de perfusión.

Ejemplo 2 Infección con rAd35 a bajas densidades celulares (1-I.6xl06 células viables/mli) En el ejemplo 1, se usó rAd5. Sin embargo, se conocen diferentes serotipos de adenovirus y se han descrito para propósitos diferentes. Estos serotipos pueden tener propiedades diferentes, y por consiguiente los procesos útiles para un serotipo no siempre son necesariamente adecuados para otro serotipo. Esto podría ser especialmente relevante en procesos de escala industrial, en donde diferencias aparentemente pequeñas pueden ser económicamente de gran importancia. Un serotipo particularmente adecuado para usarse por ejemplo en vacunas es Ad35, y en los siguientes ejemplos se prueba la posibilidad de mejorar los rendimientos de rAd35 para obtener grandes cantidades del mismo. Este ejemplo muestra la infección con un vector rAd35 a bajas densidades celulares, como una comparación con los siguientes ejemplos en donde las células se infectan a densidades celulares más altas. <s> De un banco de células de trabajo PER.C6 , se descongelaron células y se propagaron en medio de cultivo libre de suero en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de C02. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que suficiente densidad celular se alcanzara para incoular biorreactores de 10L a un volumen de 5L y a una densidad celular de 0.2 a 0.35xl06 células viables/mL. Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37°C, DO de 40% y un pH de 7.3. Cuatro días después de la inoculación (cuando se alcanzó una densidad celular de entre 2 a 3.5xl06 células viables/mL) , la suspensión de células fue diluida con 5L de medio fresco y posteriormente infectada con rAd35.TB-S (un vector de rAd35; Radosevic et al, 2007) a una MOI de 70 VP/célula. La propagación del virus se llevó a cabo a 36°C, pH 7.3 y DO de 40%. Tres días después de la infección los biorreactores fueron muestreados para recuento de células y determinación de la producción de virus. Para liberar el virus, una muestra de 1 mL de cada biorreactor fue mezclada con 100 ih de Tritón X-100 al 10% e incubada a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación las muestras fueron mezcladas con 2.42 µ?? de benzonase/MgCl2 seguidas por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37°C. Finalmente, 100 µ?? de sucrosa al 50% se añadió a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2,500 g, las muestras fueron almacenadas a una temperatura debajo de -65°C hasta el análisis por AEX-HPLC. Un total de diez corridas del biorreactor se llevaron a cabo y se analizaron de acuerdo con el proceso descrito arriba, y estas corridas dieron resultados consistentes (no mostrados) . La producción de partículas de virus promedio fue de 2.3x1o11 VP/mL.

Para una demanda anual de alrededor de 1.5xl019 VP, con tal rendimiento alrededor de 65,000 L tendrían que ser procesados. Esto requeriría de grandes instalaciones y por lo tanto de una gran inversión inicial durante el desarrollo de vacunas .

Ejemplo 3 Estudio de viabilidad de un proceso de infección de rAd35 a altas densidades celulares (>10xl06 células viables/mL) De un banco de células de trabajo PER.06* se descongelaron y propagaron células en medio de cultivo libre de suero en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de C02. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que se alcanzara densidad celular suficiente para inocular un biorreactor de 2L a un volumen de 1.5L y una densidad celular de 0.2 a 0.5xl06 células viables/mL. Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37°C, DO de 40% y un pH de 7.3. La perfusión del medio se inició a una densidad celular de 6.8xl06 células totales/mL, usando un sistema ATF. Después de 70 horas se alcanzó una densidad celular de 36.8xl06 células totales/mL. En este momento se llevaron a cabo las siguientes infecciones: • Infección en agitadores a densidades celulares de: o 1.3xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL o lOxlO6 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL o 20xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL o 30xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL • Infección a escala de biorreactor de 2L a 8.7xl06 células totales/mL (84% de viabilidad) o Una hora después de la infección del biorreactor se retiró una muestra del biorreactor y se transfirió a dos agitadores de 250 mL, 30 mL/agitador.

Para el proceso de infección en agitadores de 250 mL una parte de la suspensión celular del biorreactor de 2L se cosechó y esta suspensión fue centrifugada durante 5 minutos a 300g. El sedimento celular se resuspendió hasta las concentraciones mencionadas arriba en medio libre de suero fresco. Los agitadores fueron infectados con Ad35.TB-S a una MOI de 70 VP/célula y se incubaron a 36°C, 10% de C02 y 100 rpm. El día 1 y 2 después de la infección el refrescamiento del medio se llevó a cabo para los agitadores infectados a 10, 20 y 30xl06 células viables/mL. Este refrescamiento de medio se llevó a cabo por una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 300 g y resuspendiendo el segmento celular en 30 mL de medio fresco por agitador. El día 3 después de la infección los agitadores fueron cosechados y muestreados para el análisis AEX-HPLC. Las lisis celulares de la cosecha se llevaron a cabo al mezclar 1 mL de volumen de muestra de cada agitador con 100 µL de Tritón X-100 al 10% e incubación a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación las muestras fueron mezcladas con 2.42 L de benzonase/MgCl2 seguidas por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37°C. Finalmente 100 µL de sucrosa al 50% se añadieron a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2,500 g, las muestras fueron almacenadas debajo de -65°C hasta que se llevara a cabo el análisis por AEX-HPLC.

Las células restantes en el biorreactor de 2L fueron diluidas con medio libre de suero fresco hasta una concentración celular de 8.7xl06 células totales/mL (84% de viabilidad). El biorreactor fue infectado con Ad35.TB-S a una MOI de 70 VP/célula y se incubó a 36°C, pH 7.3 y DO de 40%. El sistema ATF fue iniciado 15 horas después de la infección a una velocidad de refrescamiento de medio de 1 volumen de biorreactor por día. Los días 1, 2, 3 y 4 después de la infección el biorreactor fue muestreado para recuento celular (contador celular CASY) y la determinación de la producción de virus por AEX-HPLC. La preparación de las muestras se llevó a cabo como se describió arriba. Las muestras fueron almacenadas debajo de -65°C hasta que se llevara a cabo el análisis por AEX-HPLC. Aproximadamente una hora después de la infección del biorreactor se tomó una muestra de por lo menos 60 mL del biorreactor de 2L y se iniciaron dos infecciones (en agitadores de 250 mL) a un volumen de 30 mL por agitador. El día 1 y 2 después de la infección el refrescamiento del medio se llevó a cabo para imitar el sistema de perfusión. Este re rescamiento de medio se llevó a cabo por una etapa de centrif gación durante 5 minutos a 300 g y resuspendiendo el sedimento celular en 30 mL de medio fresco por agitador. El día 3 después de la infección los agitadores fueron cosechados y muestreados para el análisis AEX-HPLC. La preparación de las muestras se llevó a cabo como se describió arriba. Las muestras se almacenaron debajo de -65°C hasta que se llevara a cabo el análisis por AEX-HPLC.

Los resultados se presentan en la figura 2. Los resultados muestran que la infección entre 1.3xl06 células viables/mL y 30xl06 células viables/mL es posible. En contraste con los resultados con rAd5, los rendimientos totales de rAd35 se incrementaron con una densidad celular cada vez más alta después de infección incluso por arriba de las muestras de lOxlO6 células viables/mL. A 30xl06 células viables/mL se alcanzó un rendimiento volumétrico de 1.4xl012 VP/mL.

Los resultados indican claramente que las infecciones con Ad35.TB-S a altas densidades celulares, es decir, lOxlO6 células viables/mL o más altas, son posibles. Incluso a 30xl06 células viables/mL, las infecciones tienen altos rendimientos volumétricos.

Se hace notar que se observa una reducción en la productividad unitaria de 120,000 VP/célula a 1.3xl06 células a 47,000 VP/célula a 30xl06 células viables/mL. Los agitadores iniciaron a partir de una suspensión celular, la cual fue infectada en el biorreactor, muestran un rendimiento de cosecha de 8.0x1o11 VP/mL y una productividad unitaria de 92,000 VP/célula. Los resultados en el biorreactor de 2L son un poco más bajos: se alcanza un rendimiento de cosecha de ????11 VP/mL, la cual es una productividad unitaria de 57,000 VP/célula.

Ejemplo 4 Viabilidad de infección a altas densidades celulares con otro vector rAd35 ® De un banco de células de trabajo PER.C6 se descongelaron y propagaron células en medio de cultivo libre de suero en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de C02. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que se alcanzara densidad celular suficiente para inocular un biorreactor de 2L a un volumen de 1.5L y una densidad celular de 0.2 a 0.5xl06 células viables/mL. Las células fueron propagadas en el biorreactor a 37°C, DO de 40% y un pH de 7.3. El proceso de perfusión ATF fue iniciado a una densidad celular de 5.1xl06 células totales/mL. Después de 70 horas se alcanzó una densidad celular de 25xl06 células totales/mL. En este momento una parte de las células fue cosechada. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 300 g y el sedimento celular fue resuspendido hasta las siguientes concentraciones en medio libre de suero fresco: • 1.3xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL • lOxlO6 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL • 20xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL · 30xl06 células viables/mL, 30 mL/agitador, dos agitadores de 250 mL Los agitadores fueron infectados con Ad35.eGFP (rAd35 que comprende otro transgen, a saber un gen GFP) a una MOI de 70 VP/célula y se incubaron a 36°C, 10% de C02 y 100 rpm. Los días 1 y 2 después de la infección se llevó a cabo refrescamiento de medio para los agitadores infectados a 10, 20 y 30xl06 células viables/mL. Este refrescamiento de medio se llevó a cabo por una etapa de centrifugación durante 5 minutos a 300 g y resuspendiendo el sedimento celular en 30 mL de medio fresco por agitador. El día 3 después de infección los agitadores fueron cosechados y muestreados para el análisis AEX-HPLC. La lisis celular de la cosecha se llevó a cabo al mezclar un volumen de muestra de 1 mL de cada agitador con 100 µL de Tritón X-100 al 10% e incubación a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación las muestras fueron mezcladas con 2.42 uL de benzonase/MgCl2 seguidas por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente se añadieron 100 µL de sucrosa al 50% a las muest as. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 1,500 g, las muestras se almacenaron debajo de -65°C hasta que se llevara a cabo el análisis por AEX-HPLC. Los resultados se presentan en la figura 3. Los resultados muestran que infecciones a altas densidades celulares también son viables con otro vector Ad35 (Ad35.eGFP) . Los rendimientos volumétricos (figura 3) y productividad unitaria (datos no mostrados) estuvieron en el mismo intervalo que para el vector Ad35.TB-S.

Ejemplo 5 Experimentos adicionales de infección a altas densidades celulares con un vector rAd35 De un banco de células de trabajo PER.06® se descongelaron células y se propagaron en medio de cultivo libre de suero, en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de C02. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que una densidad celular suficiente se alcanzara para inocular un biorreactor de 2L a una densidad celular de 0.25xl06 células viables/mL. Las Células fueron propagadas en el biorreactor de 2L a 37°C, DO de 40% y un pH de 7.3. Cuando se alcanzó una densidad celular de aproximadamente 3.7 xlO6 células totales/mL (día 4 después de la inoculación) se inició un sistema ATF. Después de 67 horas se alcanzó una densidad celular de 40.7xl06 células totales/mL. En este momento una parte de la suspensión celular se cosechó y las células restantes fueron diluidas con medio fresco en el biorreactor de 2L hasta una densidad celular de 12.7xl06 células totales/mL (87% de viabilidad, por consiguiente llxlO6 células viables/mL) .

Posteriormente el biorreactor de 2L fue infectado con Ad35.TB-S a una MOI de 70 VP/célula e incubado a 36°C, pH 7.3 y DO de 40%. El sistema ATF fue iniciado 15 horas después de la infección a una velocidad de refrescamiento de medio de 5 volúmenes de recipiente al día. Los días 1, 2, 3 y 4 después de la infección el biorreactor de 2L fue muestreado para recuento celular y producción de virus por AEX-HPLC. Para liberar el virus una muestra de 1 mL se mezcló con 100 ]ih de Tritón X-100 al 10% y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación la muestra se mezcló con 2.42 pL de benzonase/MgCl2 seguida por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37 °C. Finalmente se añadieron 100 ]iL de sucrosa al 50% a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2,500 g las muestras se almacenaron a una temperatura debajo de -65°C hasta el análisis por AEX-HPLC. Los resultados se presentan en la tabla 1.

Tabla 1 Resultados del ejemplo 5 Día Recuento de AEX-HPLC QPA AEX/QPA después de células (VP/mL) (IU/mL) (VP/IU) infección (xlO6 células totales/mL) 0 12.70 NA NA NA 1 22.18 Debajo de 1.77xl09 LOQ 2 9.20 1.34xl012 8.5xl010 15.8 3 10.10 1.46xl012 8.3xl010 17.6 4 7.60 1.43xl012 8.3X1010 17.2 Los resultados demostraron que las infecciones a densidades celulares por arriba de lOxlO6 células viables/mL son viables en biorreactores acoplados a un sistema de perfusión y que es posible incrementar el rendimiento volumétrico casi 7 veces en comparación con un proceso intermitente (ejemplo 2) . Ninguna pérdida de células prematura del cultivo infectado fue observada, indicando que el proceso ATF es un sistema adecuado para cultivar células infectadas .

Un requerimiento de la FDA para lotes de rAd es una relación de VP/IU <30. El análisis QPA (ensayo de potencia a base de Q-PCR; Wang et al, 2005) demostró que todas las muestras satisfacían este requerimiento. En contraste, las muestras descritas en Yuk et al (2004) tienen una relación VP/IU de alrededor de 100 (figuras 2A/2B ahí) . La relación de partículas físicas a partículas infecciosas es un parámetro relevante para adenovirus, y se prefiere una relación más baja para lotes de rAd. Los lotes preparados en este ejemplo tienen de manera consistente una relación tan baja de entre aproximadamente 15:1 a 18:1.

Para una demanda anual de aproximadamente 1.5xl019 VP y con un rendimiento de alrededor de 1.5xl012 VP/ml, casi 10,000 L tendrían que ser procesados. Estos volúmenes pueden ser procesados en instalaciones de 1, 000L o menos, y de esta manera reducirían el compromiso de costo inicial durante el desarrollo de vacunas.

Ejemplo 6 Experimentos adicionales de infección a altas densidades celulares con un vector rAd35 con velocidades de perfusión reducidas De un banco de células de trabajo PER-CS® se descongelaron y propagaron células en medio de cultivo libre de suero en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de C02. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que se alcanzara celular suficiente para inocular un biorreactor de 2L a una densidad celular de 0.59xl06 células viables/mL. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 2L a 37°C, DO de 40% y un pH de 7.3. Cuando una densidad celular de aproximadamente 2.9xl06 células totales/mL fue alcanzada (día 4 después de la inoculación) se inició un sistema ATF. Después de 118 horas de perfusión se alcanzó una densidad celular de 29xl06 células totales/mL. En este momento una parte de la suspensión celular se cosechó y las células restantes fueron diluidas con medio fresco en el biorreactor de 2L hasta una densidad celular de 16.4xl06 células totales/mL (82% de viabilidad, por consiguiente 13.4xl06 células viables/mL) . Posteriormente el biorreactor de 2L fue infectado con Ad35.TB-S a una MOI de 70 VP/célula y se incubó a 36°C, pH 7.3 y DO de 40%. El sistema ATF fue iniciado 15 horas después de infección a una velocidad de refrescamiento de medio de 2 volúmenes de recipiente al día. Los días 1, 2 y 3 después de infección el biorreactor de 2L fue muestreado para recuento celular y producción de virus por AEX-HPLC. Para liberar el virus 1 muestra de 1 mL se mezcló con 100 µ??? de Tritón X-100 al 10% y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación la muestra se mezcló con 2.42 µ ??. de benzonase /MgCl 2 seguida por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37°C. Finalmente se añadieron a las muestras 100 ]il¡ de sucrosa al 50%. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 12,500 g, las muestras se almacenaron a una temperatura debajo de -65 °C hasta el análisis por AEX-HPLC. Los resultados se presentan en la tabla 2.

Los resultados demostraron que infecciones a densidades celulares por arriba de 10x10s células viables/mL son viables en biorreactores acoplados a un sistema de perfusión y que es posible incrementar el rendimiento volumétrico casi 10 veces en comparación con un proceso intermitente (ejemplo 2) . Ninguna pérdida celular prematura del cultivo infectado fue observada, indicando que el proceso ATF es un sistema adecuado para el cultivo de células infectadas .

Tabla 2 Resultados del ejemplo 6 Un requerimiento de la FDA para lotes de rAd es una relación de VP/IU <30. El análisis QPA (ensayo de potencia a base de Q-PCR; Wang et al, 2005) demostró que todas las muestras satisfacían este requerimiento. En contraste, las muestras descritas en Yuk et al (2004) tienen una relación VP/IU de alrededor de 100 (figuras 2A/2B ahí) . La relación de partículas físicas a partículas infecciosas es un parámetro relevante para adenovirus, y una relación más baja se prefiere para lotes de rAd. Los lotes preparados en este ejemplo tienen consistentemente una relación tan baja de menos de 10:1.

Para una demanda anual de aproximadamente 1.5xl019 VP y con un rendimiento de alrededor de 2xl012 VP/ml, una cosecha de menos de 7,500 L tendría que ser procesada. Estos volúmenes pueden ser procesados en instalaciones de 1,000L o menos, y de esta manera reducirían el compromiso de costo inicial durante el desarrollo de vacunas.

Ejemplo 7 Experimentos adicionales de infección a altas densidades celulares con un vector rAd35 con velocidades de perfusión reducidas De un banco de células de trabajo PER.C6 se descongelaron y propagaron células en medio de cultivo libre de suero en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de CO2. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que se alcanzara densidad celular suficiente para inocular un biorreactor de 2L a una densidad celular de 0.44xl06 células totales/mL. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 2L a 37°C, DO de 40% y un pH de 7.3. El sistema ATF fue iniciado 4 días después de la inoculación a una densidad celular de aproximadamente 2.72xl06 células totales/mL. Después de 144 horas de perfusión una densidad celular de 30.5xl06 células totales/mL fue alcanzada. En este momento una parte de la suspensión celular se cosechó y las células restantes fueron diluidas con medio fresco en el biorreactor de 2L hasta una densidad celular de 16.2xl06 células totales/mL (viabilidad de 81%, por consiguiente 13. lxlO6 células viables/mL) . Posteriormente el biorreactor de 2L se infectó con Ad35.TB-S a una MOI de 70 VP/célula y se incubó a 36°C, pH 7.3 y DO de 40%. El sistema ATF fue iniciado 5 horas después de la infección a una velocidad de refrescamiento de medio de 2 volúmenes de recipiente al día. Los días 2, 3 y 4 después de infección el biorreactor de 2L fue tnuestreado para recuento de células y producción de virus por AEX-HPLC. Para liberar el virus se mezcló una muestra de 1 mL con 100 ]iL de Tritón X-100 al 10% y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación la muestra se mezcló con 2.42 µL de benzonase/MgCl2 seguida por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37°C. Finalmente se añadieron 100 uL de sucrosa al 50% a las muestras. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2,500 g las muestras fueron almacenadas a una temperatura debajo de -65°C hasta el análisis por AEX-HPLC. Los resultados se presentan en la tabla 3.

Tabla 3 Resultados del ejemplo 7 Día recuento de AEX-HPLC QPA AEX/QPA después de células (VP/mL) (IU/mL) (VP/IU) infección (xlO6 células totales/mL) 0 16.19 NA NA NA 1 20.40 NA NA NA 2 24.14 1.42xl012 1.77X1011 8.0 3 24.60 2.20xl012 1.82X1011 12.1 4 16.26 1.90xl012 1.51X1011 12.5 Los resultados demostraron nuevamente que infecciones a densidades celulares por arriba de lOxlO6 células viables/mL son viables en biorreactores acoplados a un sistema de perfusión y que es posible incrementar el rendimiento volumétrico casi 10 veces en comparación con un proceso intermitente (ejemplo 2) . Además, con el ejemplo 6 y 7 se demostró que la velocidad de perfusión después de infección puede ser limitada a 2 volúmenes de recipiente al día sin comprometer la producción de virus.

Para una demanda anual de alrededor de 1.5xl019 VP y con un rendimiento de alrededor de 2xl012 VP/ml, una cosecha de menos de 7,500 L tiene que ser procesada. Estos volúmenes pueden procesarse en instalaciones de 1,000L o menos, y de esta manera reducirían el compromiso de costo inicial durante el desarrollo de vacunas.

Ejemplo 8 Experimentos adicionales de infección a altas densidades celulares con un vector rAd35 a escala de 50L ® De un banco de células de trabajo PER.C6 se descongelaron células y se propagaron en medio de cultivo libre de suero en una incubadora humidificada a 37°C y 10% de C02. El sub-cultivo se llevó a cabo cada 3 a 4 días hasta que se alcanzara una densidad suficiente para inocular un biorreactor de 10L a una densidad celular de 0.52xl06 células totales/mL. Las células fueron propagadas en el biorreactor de 10L a 37°C, DO de 40% y un pH de 7.3. El sistema ATF fue iniciado cuando se alcanzó una densidad celular de aproximadamente 5.3xl06 células totales/mL (4 días después de la inoculación) . Después de 169 horas de perfusión se alcanzó una densidad celular de 77xl06 células totales/mL. En este momento la suspensión celular de 10L fue diluida con medio fresco en un biorreactor de 50L hasta una densidad celular de 15.5xl06 células totales/mL (81% de viabilidad, por consiguiente 12.6xl06 células viables/mL) . Posteriormente el biorreactor de 50L fue infectado con Ad35.TB-S a una MOI de 70 VP/célula y se incubó a 36°C, pH 7.3 y DO de 40%. El sistema ATF fue iniciado 5 horas después de la infección a una velocidad de refrescamiento de medio de 2 volúmenes de recipiente al día. Los días 2 y 3 después de infección el biorreactor de 50L fue muestreado para recuento celular y producción de virus por AEX-HPLC. Para liberar el virus una muestra de 1 mL se mezcló con 100 L de Tritón X-100 al 10% y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación la muestra se mezcló con 2.42 ih de benzonase/MgCl2 seguidos por una etapa de incubación subsecuente de 30 minutos a 37°C. Finalmente se añadieron a las muestras 100 ]ih de sucrosa al 50%. Después de una etapa de centrifugación de 5 minutos a 2,500 g las muestras se almacenaron a una temperatura debajo de -65°C hasta el análisis por AEX-HPL. Los resultados se presentan en la tabla 4.

Tabla 4 Los resultados demostraron que infecciones a densidades celulares por arriba de 10x10s células viables/mL fueron viables en biorreactores de 50L acoplados a un sistema de perfusión y que era posible a escalas de 50L incrementar el rendimiento volumétrico casi 10 veces en comparación con un proceso intermitente (ejemplo 2). Se mostró con esto que el proceso desarrollado podría ser escalado hacia arriba. Los volúmenes de cosecha que deben ser procesados al año para satisfacer la demanda viral anual, pueden producirse con el proceso actual . Para una demanda anual de aproximadamente 1.5xl019 VP y con un rendimiento de alrededor de 2xl012 VP/ml, una cosecha menor que 7,500 L tiene que ser procesada. Estos volúmenes pueden procesarse en instalaciones de 1,000L o menos, y de esta manera reducirían el compromiso de costo inicial durante el desarrollo de vacunas.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para producir adenovirus recombinante serotipo 35 (rAd35) , caracterizado porque comprende: a) cultivar células productoras en suspensión con un sistema de perfusión; b) infectar las células a una densidad de entre aproximadamente lOxlO6 células viables/mL y 16xl06 células viables/mL con rAd35; c) cultivar más las células infectadas con un sistema de perfusión para propagar el rAd35; y d) cosechar el rAd35.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células en la etapa b) son infectadas con rAd35 a una densidad de entre aproximadamente lOxlO6 y 14xl06 células viables/mL.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema de perfusión en la etapa c) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternante (ATF) .

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además : e) purificar el rAd35, y opcionalmente f) preparar una composición farmacéutica que contenga el rAd35 purificado.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el adenovirus recombinante carece de por lo menos una porción de la región El, y comprende ácido nucleico heterólogo.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema de perfusión en la etapa a) es un sistema de perfusión de flujo tangencial alternante (ATF) .

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa a) se lleva a cabo en un primer biorreactor, y las etapas b) y c) se llevan a cabo en un segundo biorreactor.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la relación partícula física a partícula infecciosa (VP/IU) del rAd35 producido es menor que 30:1, de preferencia menos de 20:1.

9. Un biorreactor que comprende medio de cultivo, células productoras y partículas de virus, en donde el biorreactor tiene un volumen de trabajo de entre 2L y 1,000L, preferiblemente de entre 50L y 500L, y caracterizado porque el biorreactor comprende al menos lxlO12 partículas de virus (VP) rAd35/mL.

10. El biorreactor de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque está conectado a un sistema de perfusión ATF.

11. El biorreactor de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque las partículas de virus rAd35 tienen una relación VP/IU de menos de 30:1, preferiblemente menos de 20:1.

12. Un método para producir al menos lxlO12 partículas de virus (VP) rAd35/mL, caracterizado porque comprende el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde en la etapa c) , la concentración de partículas de virus rAd35 alcanza al menos lxlO12 VP/mL.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 12, caracterizado porque las células productoras son células PER.C6.

14. El biorreactor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque las células productoras son células PER.C6.