KR101780257B1 - 인플루엔자 바이러스의 제조를 위한 영구 세포주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 영구 인간 양막 세포를 이용한 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조 방법 및 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조를 위한 영구 인간 양막 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 바이러스의 제조를 위한 영구 세포주{PERMANENT HUMAN AMNIOCYTE CELL LINES FOR PRODUCING INFLUENZA VIRUSES}
본 발명은 영구 인간 양막 세포(permanent human amniocyte cell)를 이용한 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조 방법 및 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조를 위한 영구 인간 양막 세포의 용도에 관한 것이다.
예방 접종은 매년 유행하는 인플루엔자에 의한 질병을 예방하기 위한 것으로, 건강 관리에 있어서 가장 중요한 대책이다. 백신의 성공적인 사용은 안정하고 사용하기 용이한 소스로부터 사독 바이러스와 같은 백신을 충분히 많은 양으로 가장 신속하게 제조하는데 달려있다. 백신의 신속한 개발 및 이의 충분한 이용은 많은 인간 및 동물 질병과 싸우는데 중요하다. 백신의 제조가 지연되고 양이 손실되면, 질병의 발생의 취급과 관련된 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 백신용 세포 배지에서 백신의 배양에 대한 최근의 노력이 있었다.
지금까지,이용가능한 인플루엔자 백신은 유정 달걀에서 제조된다. 이러한 달걀은 특정의 바이러스 및 세균의 오염이 없어야 한다. 특정 병원체가 없는(specific pathogen free; (SPF)) 달걀이 상업적으로 이용가능하다. 달걀은 동물 및 인간 바이러스의 증식에서 매우 유용한 것으로 확인되어 왔으나, 백신의 제조에는 몇몇 단점이 있다. 예를 들어, 유행병의 경우, 1회 투여량의 통상적인 백신의 제조를 위해 1개의 달걀이 필요하기 때문에 백신 제조를 위한 달걀에 많은 수요가 있다. 달걀의 제한된 입수성을 감안하면, 충분한 양의 달걀을 제공하는데 약 1년의 기간이 예상된다. 또한, 닭에 대하여 고병원성이어서 유행병의 경우 달걀 공급의 부족을 초래할 수 있는 인플루엔자 아형이 있다. 또한, 그 제조 과정은 비용 및 시간이 매우 많이 든다. 달걀에서 백신 제조의 또 다른 단점은 이들 백신은 달걀 흰자가 없기 때문에, 몇몇 환자의 경우 알레르기 반응이 발생할 수 있다. 따라서, 천연 백신과 상이한 아집단을 선택하기 위해서는 대안의 숙주 세포계가 필요하다.
달걀과 반대로, 세포 배양을 통해 인플루엔자 백신을 제조하기 위한 세포는 항상 입수가능한 것이다. 이들 세포는 동결 보존되고 필요시 수시로 필요한 양으로 즉시 해동 및 재생될 수 있다. 따라서, 백신 제조가 임의의 원하는 시간에 시작될 수 있다. 에상치 못한 높은 수요의 경우나 예상치 못한 신종의 바이러스가 더욱 빈번하게 퍼지는 경우, 적절한 백신이 단시간내에 제공될 수 있다.
세포 배양을 이용한 제조 방법은 정의되고 제어된 조건하에서 밀페된 표준 장치에서 바이러스 백신을 제조할 수 있다. 제어된 제조 방법으로 인해. 완성된 인플루엔자 백신은 항생제를 첨가할 필요가 없다. 세포 배양 인플루엔자 백신의 제조는 달걀과 완전히 무관하기 때문에, 이러한 방법으로 제조한 백신은 달걀 흰자가 없으므로, 환자에서 달걀의 비내성(intolerance)으로 인해 알레르기 반응을 유발하지 않는다.
오늘날, 주로 세종의 세포주, 즉, 인간 PER.C6 세포, 매딘 다비 개의 신장(Madin Darby Canine Kidney (MDCK)) 세포 및 게논 신장 세포(guenon kidney cell(Vero))가 인플루엔자 바이러스의 제조에 사용된다. 또한, 오늘날 오리의 망막 세포주(AGE1.CR) 및 조류 배아 줄기 세포주가 개발되고 있다. 포유동물 세포주에서 백신의 제조는 달걀을 이용한 백신 제조에 대한 대안이 아니지만, 이러한 세포는 이의 성장을 위해 혈청 및/또는 고체 지지체에의 부착을 필요로 한다. 따라서, 안전성의 이유로 혈청은 완전히 분리되어야 하고 지지체 상의 세포 성장이 제한되어 수율이 감소하므로 이러한 세포에서 백신을 제조하는 것은 어렵고 비용이 더욱 많이 든다.
포유동물 세포에서 백신 제조의 이점은 세포 배양시 바이러스의 분리 및 복제가 임상적으로 야생형과 상이한 표현형의 임의의 패신져 의존성 선택을 발생하지 않는다는 것이다. 따라서, 그를 통해 바이러스가 감염 세포에 부착되고 세포내로의 통합되는 바이러스의 당단백질 헤마글루티닌은 천연 형태로 발현되므로, 개선된 특이성 및 결합 활성(avidity)을 갖기 때문에, 인간에서의 세포 매개 면역을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조를 위한 영구 인간 세포주를 제공함에 있다.
상기 목적은 특허청구범위에서 정의된 바와 같은 주제를 통해 달성된다.
도면은 본 발명을 예시한다.
도 1A 내지 1G는 100 ml 진탕 플라스크에서 293SFMII 배지(●)에서 영구 양막 세포주 CAP 1D5, PEM 배지(▲)를 이용한 영구 양막 세포주 CAP 1D5 및 SMIF8 배지(◆)에서 영구 개 신장 세포주 MDCK.SUS2 (마딘 다비 개 신장)의 배양시 상이한 파라미터들의 추이를 개략적으로 도시한다. 도 1A는 비교로서 3종의 세포주의 생존 세포 농도를 그래프로 도시한다. 도 1B는 세포주의 죽은 세포 농도를 도시한다. 도 1C는 세포주의 생존율을 도시한다. 도 1D 내지 1G는 pH 값(D), 글루코오스(밝은 기호) 및 락토오스(어두운 기호) 농도(E), 글루타민(Gln) (밝은 기호) 및 암모늄(어두운 기호) 농도(F), 및 글루탐산(Glu) (밝은 기호) 및 피루베이트(어두운 기호) 농도(G)를 개략적으로 도시한다.
도 2는 CAP-1D5 세포 293SFMII 및 PEM 배지에서 인플루엔자 변종인 A/PR/8/34 (H1N1) 및 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)의 4계대에 걸쳐서 TCID50 값으로서 측정 바이러스 역가를 도시하는 막대 그래프이다. 약어: 293SFMII 배지에서 CAP-1D5 세포에서의 인플루엔자 변종 A/PR/8/34 (H1N1), A/PR PEM: PEM 배지에서 CAP-1D5 에서의 인플루엔자 변종 A/PR/8/34 (H1N1); A/Urug 293: 293SFMII 배지에서 CAP-1D5 세포에서의 인플루엔자 (H3N2)의 A/Uruguay/716/2007 변종; A/Urug PEM: PEM 배지에서 CAP-1D5 세포에서의 인플루엔자 변종 A/Uruguay/716/2007 (H3N2); TCID50 값은 숙주 세포의 50%를 감염시키는데 필요한 바이러스 역가(바이러스수/ml)이다.
도 3A 내지 도 3F는 log HA (헤마글루티닌) 단위수/100 ㎕로서 나타낸 바이러스 입자의 양을 나타내고, 감염 다중도(MOI (multiplicity of infection)) 값으로 나타낸 여러 가지 양의 바이러스를 사용할 때 인플루엔자 바이러스 종 A/PR/8/34를 이용하여 세포를 감염시킨 후 293SFMII- 배지 (A, B) 및 PEM 배지(C , D)에서 영구 양막 세포 CAP-1D5 및 SMIF8 배지(E, F)에서 영구 개 신장 세포 MDCK.SUS2의 배양시 생존 세포 농도를 개략적으로 도시한다. MOI: 0.0025 (△) MOI: 0.025 (□), MOI: 0.25 (○). MOI (세포다중도)는 표적 세포에 대한 감염 입자의 수의 비를 나타낸다.
도 4A 내지 4D는 1 L 바이오반응기에서 PEM 배지내 영구 양막 세포주 CAP-1D5의 배양시 여러 가지 파라미터들을 개략적으로 도시하는 것으로, 감염은 114 시간 후에 일어나고, MOI로 나타낸 바이러스 양은 0.025이고, 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34가 이용되는 것을 도시한다. 도 4A는 생존 세포 농도(▲), 죽은 세포 농도(△) 및 세포 생존율(▲)을 개략적으로 도시한다. 도 4B는 배지내의 log HA (헤마글루티닌) 단위수/100 ㎕(▲), 글루타메이트(△) 및 피루베이트(●) 농도로 나타낸 바이러스 입자의 양을 개략적으로 도시한다. 도 4C는 pH 값(△)을 개략적으로 도시하고, 도 4D는 감염성(TCID50/ml)의 추이를 도시한다. TCID50 값은 숙주 세포의 50%를 감염시키는데 필요한 바이러스 역가(ml 당 바이러스의 수)를 나타낸다.
도 5A 및 5B는 293SFMII 및 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 A/Brisbane/59/2007, B/Florida/4/2006, 돼지 인플루엔자(A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) 및 말 인플루엔자(A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))의 4 계대 동안 log HA 단위수/100 ㎕(A) 또는 TCID50 값(B)로서 측정한 바이러스 역가를 나타내는 막대 그래프이다. 약어: A/Bris 293: 293SFMII 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 A/Brisbane/59/2007; A/Bris PEM: PEM 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 A/Brisbane/59/2007; B/Flor 293: 293SFMII 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 B/Florida/4/2006; B/Flor PEM: PEM 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 B/Florida/4/2006; Schw 293: 293SFMII 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00; Schw PEM: PEM 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 A/Swine (H1N2) Bakum/1832 00; horse 293: 293SFMII 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8); horse PEM: PEM 배지내 CAP-1D5 세포상의 인플루엔자 변종 A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8); TCID50 값은 숙주 세포의 50%를 감염시키는데 필요한 바이러스 역가(바이러스 수/ml)이다.
도 6A 및 6B는 진탕 플라스크에서 100 ml의 PEM 배지내 영구 양막 세포주 CAP-1D5의 배양시 생존 세포 농도 및 pH 값의 추이를 개략적으로 도시하는 것으로, 초기 세포 농도가 5 x 105 개 세포(cells)/ml 이고 배지가 4 mM 피루베이트를 추가로 함유하거나(◆), 초기 세포 농도가 8 x 105 개 세포/ml이고 배지가 4 mM 피루베이트를 추가로 함유하거나(▲), 초기 세포 농도가 8 x 105 개 세포/ml이고 배지가 10 mM 피루베이트 및 아미노산을 추기로 함유하는 것(●)을 도시한다.
도 7A 내지 도 7C는 log HA 단위수(units)/100 ㎕ 배지로 측정한 바이러스 역가를 개략적으로 도시하는 것으로, CAP-1D5 세포가 적응된 인플루엔자 바이러스 종 A/PR/8/34로 감염된 것을 도시한다. 감염 전, 배지의 비교체(A), PEM 배지로 1:2 희석 (B) 또는 완전한 배지 교체를 수행했다. 도 7A는 배지를 교체하지 않은 CAP-1D5 세포 배양액의 바이러스 역가를 개략적으로 도시하는 것으로, 1 x 10-4 U /cell (◆), 3 x 10-5 U/cell (▲) 및 5 x 10-5 U/cell (■)의 여러 가지 트립신 농도가 감염에 사용된 것을 도시한다. 도 7B는 PEM 배지로 1:2로 희석한 CAP-1D5 세포 배양액의 바이러스 역가를 개략적으로 도시하는 것으로, 1 x 10-4 U /cell (◆), 3 x 10-5 U / cell (▲) 및 5 x 10-5 U/cell (■)의 여러 가지 트립신 농도가 감염에 사용된 것을 도시한다. 도 7C는 배지를 완전히 교체한 CAP-1D5 세포 배양액의 역가를 개략적으로 도시하는 것으로, 트립신이 없거나 1 x 10-4 U/cell (◆),1 x 10-5 U/cell (▲), 5 x 10-5 U /cell (■) 및 1 x 10-6 U/cell (x)의 여러 가지 트립신 농도가 감염에 사용된 것을 도시한다.
도 8A 내지 8F는 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34, A/Brisbane/59/2007 또는 B/Florida/4/200로 감염시킨 CAP-1D5 세포 배양액에서의 바이러스 역가를 개략적으로 도시하는 것으로, 감염 전에 배지 교체가 실시되거나(A 내지 C) 실시되지 않은것(D 내지 F)을 도시한다.
인플루엔자 종 A/PR/8/34 및 B/Florida/4/2006를 이용한 감염은 0.25, 0.025 및 0.0025의 MOI로 나타낸 양의 바이러스를 이용하여 실시했다. 인플루엔자 종 A/Brisbane/59/2007를 이용한 감염은 0.1, 0.025 및 0.0025의 MOI 값에서 일어났다. MOI (감염 다중도)는 표적 세포에 대한 감염성 입자의 수의 비를 나타낸다.
도 9A 및 도 9B는, 적응된 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스로 감염시키고 STR (Sartorius) (B16, B26, 및 MDCK) 또는 Wave Bioreactors (Wave Biotech AG) (Wave)에서 1리터 규모로 배양시킨 CAP-1D5-세포 배양액(B16, B26, 및 Wave) 및 개의 신장-MDCK. SUS2 배양액 (MDCK)의 생존 세포 농도 및 바이러스 역가를 개략적으로 도시한다. 감염 전에, B26 배양액 및 Wave의 경우 배지 교체를 실시했다.
도 10A 내지 10C는, 적용형 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염시키고 진탕 플라스크에서 PEM 100 ml에서 배양시킨 CAP-1D5 세포 배양액의 바이러스 역가(log HA 단위/100 ㎕), 생존 세포 농도 및 pH 값을 개략적으로 도시한다. 감염 전, 293SFMII 배지(□) 또는 PEM 배지(◇)를 이용한 1:1 배지 교체(밝은 기호) 또는 293SFMII 배지(■) 또는 PEM 배지(◆)를 이용한 완전 배지 교체(어두운 기호)를 실시했다.
본원에서 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스"는 인간 및 동물을 감염시키는 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)를 말한다. 이들 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A형, B형 및 C형으로 분류된다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 속(genus)으로 요약된다. 인플루엔자 C 바이러스는 이의 게놈 단편에 의해 구별된다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 8개의 게놈 단편을 갖는다. 또한, 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 각각 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)를 각각 암호화한다. 이와 대조로, 인플루엔자 C 바이러스는 두 가지의 특성을 갖는 헤마글루티닌-에스테라제 융합 단백질(HEF)인 표면 단백질을 암호화한다. 인플루엔자 A 바이러스는 헤마글루티닌(H1-H15) 및 뉴라미니다제(N1-N9) 분자의 서열을 기준으로 아형들로 나누어진다.
본원에서 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 단백질"은 인플루엔자 바이러스의 단백질 또는 유도체를 의미한다. 대표적으로, 인플루엔자 바이러스의 유도체는 면역 목적에 사용될 수 있는 인플루엔자 바이러스의 단백질 또는 이의 일부이다. 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 이의 유도체는 바이러스 외피의 단백질 또는 이의 일부를 포함한다. 특히, 인플루엔자 바이러스 단백질은 인플루엔자 A 단백질, 인플루엔자 B 단백질 또는 인플루엔자 C 단백질, 예를 들어, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 핵단백질(NP), 기질 단백질(M1) 및 (M2), 폴리머라제 단백질 (PB1), (PB2) 및 (PA), 및 비구조 단백질(NS1) 및 (NS2), 및 이들의 일부를 포함한다. 인플루엔자 바이러스 단백질의 일부분은 인플루엔자 A 단백질, 인플루엔자 B 단백질 또는 인플루엔지 C 단백질의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 그 에피토프는 CD4 + T-세포 에피토프일 수 있고, 이는 MHC 클래스 II의 결합 모티프를 함유하는 펩티드를 대표하고 MHC 클래스 II의 분자를 통해 항원 제시 세포의 표면에 표시된다. 또는 상기 에피토프는 CD8 + T-세포 에피토프일 수 있고, 이는 MHC 클래스 I의 결합 모티프를 함유하는 펩티드이고 MHC 클래스 I의 분자를 토ㅓㅇ해 항원 제시 세포의 표면에 표시된다. 예를 들어, 알고리즘 모델, MHC 결합 분석, 인실리코 항원 동정 방법 및 X-선 결정학적 방법은 여러 가지 MHC 분자를 결합할 수 있는 항원의 동정을 가능하게 한다.
본원에서 사용되는 용어 "백신"은 전체 바이러스 입자 또는 이의 일부일 수 있는 것으로, 단백질, 단백질 아단위, 펩티드, 탄수화물, 지질, 헥산, 사독 또는 약독화 바이러스, 또는 이의 조합을 포함하는 생물학적 또는 유전적 조작 항원을 말한다. 상기 항원은 적어도 에피토프, 예를 들어 T-세포 및/또는 B-세포 에피토프일 수 있다. 상기 항원은 T-세포 수용체 또는 B-세포 수용체와 같은 면역 수용체에 의해 검출된다. 상기 백신은 특정 바이러스에 대한 면역계의 활성화후에 사용된다. 따라서, 면역계의 반응을 이용하여, 바이러스 및 이의 특이적인 항원의 존재하에서 면역 반응을 유발한다. 이는 바이러스의 종류에 따라 수년 내지 전체 수명 동안 지속할 수 있는 특정 질병에 대하여 장기 보호를 제공할 수 있는 항체 및 특수한 T-헬퍼 세포를 형성한다. 백신은 생백신 또는 불활화 백신을 포함한다. 생백신은 예를 들어, 질병을 유발할 수 없는 바이러스를 재생할 수 있는 약독화 바이러스를 포함한다. 불활화 백신의 경우, 바이러스는 사독 바이러스이거나, 그 바이러스의 단편(항원)을 함유한다. 예를 들어, 바이러스의 불활화(사독화)는 포름알데히드, 베타-프로피오락톤 및 소랄렌(psoralene)과 같은 화학물질을 통해 이루어진다. 바이러스 외피는 그대로 남아있는다. 또한, 사군 백신에도 포함되는 것으로, 바이러스의 독소 생물학적 불활성 부분(톡소이드, 예를 들어 파상풍 톡소이드)만을 함유하는 톡소이드 백신이 있다. 특히, 불활화 백신은 바이러스 외피 단백질의 단편으로 이루어지는 분할 백신일 수 있다. 바이러스 외피의 파괴 또는 분할은 예를 들어, 세제 또는 강한 유기 용매를 이용하여 이루어질 수 있다. 또한, 그 바이러스는 화학제로 불활화 및 사독화될 수 있다. 또한, 아단위 백신은 사독 백신의 일부인데, 이는 바이러스의 특정 성분, 예를 들어 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 단백질로 구성된다.
본원에서 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스계 백신"은 인플루엔자에 대한 면역목적을 위해 사용될 수 있는 것으로, 인플루엔자 바이러스의 모든 단백질, 펩티드 또는 이의 단편 외에도, 이러한 단백질을 암호화하는 핵산, 펩티드 또는 이의 일부분뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스 입자 그 자체, 인플루엔자 외피 단백질을 비롯한 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질, 서브 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자(VLP), VLP-복합체, 및/또는 이의 일부분을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "아쥬반트"(adjuvant)는 항원의 면역원성을 조절할 수 있는 물질을 의미한다. 아쥬반트의 예로는 무기 염, 스쿠알란 혼합물, 무라밀 펩티드, 사포닌 유도체, 마이코박테리아 세포벽 제제, 특정 에멀션, 모노포스포릴 지질 A, 마이콜 산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B의 아단위체, 폴리포스파젠 및 이의 유도체, 면역 자극 복합체, 시토킨 아쥬반트, MF59 아쥬반트, 지질 아쥬반트, 점막 아쥬반트, 특정 박테리아 외독소, 특정 올리고펩티드, 및 PLG가 있다.
본원에서 사용되는 용어 "양막세포"(amniocyte)는 양수에 존재하고 양수천자를 통해 얻을 수 있는 모든 세포를 의미한다. 이들 세포는 양수와 접촉하는 태아 조직 또는 양막에서 유래한다. 형태를 기준으로 구별되는 세 개의 주요한 부류의 양막세포가 알려져 있다: 섬유아세포 유사 세포(F-세포), 상피모양 세포(E-세포) 및 양수 세포(AF 세포) (Hohn et al, Pediat. Res 8:746-754, 1974). AF 세포가 주요한 세포 타입이다.
본원에서 사용되는 용어 "영구 세포주"(permanent cell line)는 적절한 세포 배양 조건하에서 세포 배양액에서 영구 성장할 수 있도록 유전자 변형된 세포를 의미한다. 이러한 세포는 불멸화 세포라고도 한다.
본원에서 사용되는 용어 초대배양 세포"(primary cell)는 유기체나 조직으로부터 직접 추출을 통해 얻어져서 배양되어진 세포를 의미한다. 초대배양 세포는 매우 제한된 수명을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "형질감염"(transfection)은 세포에 핵산(들)을 도입하기에 적당한 임의의 과정을 의미한다. 예로는 통상적인 인산칼슘 방법, 전기천공, 모든 유형의 리포좀 시스템 및 이들 방법들의 조합이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "캡"(CAP)은 아데노바이러스의 E1A 및 E1B 유전자 기능을 갖는 초대배양 인간 양막세포의 불멸화를 통해 얻은 영구 인간 양막 세포주를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "CAP-T"은 SV40 거대 T-항원의 서열을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 적당한 방법으로 형질감염시킨 CAP 세포를 의미한다.
본 발명의 목적은 하기의 단계들을 포함하는 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조 방법에 관한 것이다:
(i) 인플루엔자 바이러스를 영구 인간 세포와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 인간 세포를 배양하는 단계;
(iii) 상기 인플루엔자 바이러스를 발현시키는 단계; 및
(iv) 배지로부터 상기 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 영구 인간 세포는 세포 성장에 적당한 조건(예를 들어, 온도, 배지 및 pH)하에서 배양된다. 상기 온도, 배지, pH 값 및 기타 성장 파라미터와 관련된 조건은 당업자에게 알려져 있고 통상의 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 배양액이 원하는 성장 밀도에 도달하면, 그 세포의 감염을 위해 인플루엔자 바이러스가 첨가된다. 상기 바이러스는 세포내에서의 증식을 위해 수 일을 필요로 할 수 있다. 이러한 증식 과정 동안, 대부분의 세포가 죽고 바이러스가 배지내로 방출된다. 그 바이러스 함유 용액은 예를 들어 원심분리를 통해 세포 파쇄물로부터 분리된다. 다음에, 예를 들어 크로마토그래피 칼럼을 통해 바이러스가 배지 용액으로부터 분리될 수 있고, 그 체적이 감소될 수 있다. 다음에, 그 바이러스는 예를 들어 화학적 방법을 통해 불활화될 수 있다. 다음에, 바이러스 분할이 수행될 수 있다. 추가의 정제 및 농축 단계 후, 바이러스 종의 항원 농축물이 얻어진다.
바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 변종인 A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007, A/Brisbane/59/2007, B/Florida/4/2006, 돼지 인플루엔자 (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) 또는 말 인플루엔자 (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))가 영구 인간 세포의 감염에 사용된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 영구 인간 세포의 감염에 사용되는 인플루엔자 바이러스는 사전에 세포에 적응되는데, 이들 바이러스는 상기 열거한 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하다. 바람직하게, 이러한 적응(adaptation)은 4계대(passage)에 걸쳐 이루어진다. 바람직하게, 인플루엔자 바이러스의 적응은 293SFMII 배지 또는 PEM 배지에서 이루어진다.
본 발명의 추가의 목적은 하기의 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조 방법에 관한 것이다:
(i) 인플루엔자 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 영구 인간 세포와 접촉시키는 단계;
(ii) 상기 인간 세포를 배양하는 단계;
(iii) 인플루엔자 바이러스를 암호화하는 핵산 분자를 복제시키고/시키거나 인플루엔자 바이러스를 발현시키는 단계; 및
(iv) 배지로부터 인플루엔자 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 인플루엔자 바이러스 단백질을 분리하는 단계.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 영구 인간 세포는 영구 인간 양막 세포이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 영구 인간 세포는 진탕 플라스크 또는 바이오반응기, 바람직하게는 STR 또는 Wave 바이오반응기에 배양된다. 상기 영구 인간 세포는 여러 가지 배지에서 배양될 수 있으나, 바람직하게는 293SFMII 또는 PEM 배지에서 배양된다. 또한, 피루베이트, 글루타민, 글루코스 및 기타 아미노산이 배지에 첨가될 수 있다. 바람직하게, 상기 배지는 4 mM 또는 10 mM 피루베이트 및 기타 아미노산을 함유한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 진탕 플라스크에서 배양시 영구 인간 세포의 초기 세포 농도는 5 x 105 cells/ml이고 더욱 바람직하게는 8 x 105 cells/ml 이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 세포 배양액의 pH 값은 7.1 내지 7.8의 범위, 더욱 바람직하게는 7.3 내지 7.5의 범위, 더 더욱 바람직하게는 7.3 내지 7.5의 범위이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스를 이용한 영구 인간 세포의 감염전에 배지의 완전 교체 또는 배지를 이용한 1:2 희석이 실시된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 인간 영구 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키기 위해 1 x 10-4 U/cell, 1 x 10-5 U/cell, 3 x 10-5 U/cell, 5 x 10-5 U/cell 또는 1 x 10-6 U/cell의 트립신 농도가 사용된다. 인간 영구 세포의 감염전에 배지 교체가 없는 경우, 인플루엔자 바이러스를 이용한 세포의 감염을 위해 1 x 10-4 U/cell의 트립신 농도를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 영구 세포의 감염전에 1:2 배지 희석이 수행되는 경우, 인플루엔자 바이러스를 이용한 세포의 감염을 위해 5 x 10-5 U/cell의 트립신 농도를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 영구 세포의 감염전 배지의 완전 교체가 수행되는 경우, 인플루엔자 바이러스를 이용한 세포의 감염을 위해 5 x 10-6 U/cell의 트립신 농도를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 0.001 내지 0.3 범위의 MOI (multiplicity of infection; 감염 다중도)로 표시되는 바이러스 양이 영구 인간 세포의 감염에 사용된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 0.25, 0.1, 0.06, 0.025 또는 0.0025의 MOI 값으로 표시되는 바이러스 양이 영구 인간 세포의 감염에 사용된다. 바람직하게, 감염 전에 배지 교환 없이 영구 인간 세포가 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염되는 경우, 0.25의 MOI 값으로 표시되는 바이러스 양이 인플루엔자 바이러스를 이용한 영구 인간 세포의 감염에 사용되고, 감염전 배지 교체를 수행하지 않고 영구 인간 세포가 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane/59/2007로 감염되는 경우, 0.1의 MOI로 표시되는 바이러스 양이 인플루엔자 바이러스를 이용한 영구 인간 세포의 감염에 사용된다. 바람직하게, 배지 교체를 수행하면서 영구 인간 세포가 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염되는 경우, 0.1 또는 0.25의 MOI 값으로 표시되는 바이러스 양이 인플루엔자 바이러스를 이용한 영구 인간 세포의 감염에 사용되고, 배지 교체를 수행하면서 영구 인간 세포가 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane/59/2007로 감염되는 경우, 0.06 또는 0.25의 MOI 값으로 표시되는 바이러스 양이 인플루엔자 바이러스를 이용한 영구 인간 세포의 감염에 사용되고, 배지 교체를 수행하면서 영구 인간 세포가 인플루엔자 바이러스 B/Florida/4/2006로 감염되는 경우, 0.01, 0.025 또는 0.0025의 MOI 값으로 표시되는 바이러스 양이 인플루엔자 바이러스를 이용한 영구 인간 세포의 감염에 사용된다.
바람직한 구체예에서, 진탕 플라스크에서의 배양의 경우 감염시의 세포 농도는 1 x 106 내지 6 x 106 개 세포/ml이다. 바람직하게, 감염시 세포 농도는 2.3 x 106 개 세포/ml, 4.5 x 106 개 세포/ml 또는 5 x 106 개 세포(cells)/ml 이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 감염시 세포 농도는 4.5 x 106 개 세포/ml 이고, 감염전 배지 교체가 수행되지 않는다. 본 발명의 추기의 구체예에서, 감염시 세포 농도는 2.3 x 106 개 세포/ml 이고, 감염전 새로운 PEM 배지를 이용한 1:2 희석이 수행된다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 감염시 세포 농도는 5 x 106 cells/ml 이고, 감염전 배지의 완전한 교체가 수행된다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 영구 인간 세포는 4 mM 글루타민 및 4 mM 피루베이트가 첨가된 PEM 배지에서 1 리터 바이오반응기 STR (Sartorius)에서 배양되는데, 이때 초기 세포 농도는 5 x 105 cells/ml 이고, 2.1 x 106 cells/ml의 세포 농도에서 0.025의 MOI 값의 인플루엔자 바이러스로서 감염되고, 감염전 배지 교체가 수행되지 않는다. 바람직하게, 감염은 3 x 10-5 U/ml의 최종 농도의 트립신의 존재하에 수행된다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 영구 인간 세포는 PEM 배지에서 1 리터 바이오반응기 STR (Sartorius)에서 배양되는데, 이때 초기 세포 농도는 8 x 105 cells/ml 이고, 감염은 0.025의 MOI 값으로 나타낸 양의 인플루엔자 바이러스를 이용하여 수행되고, 감염전 배지 교체가 수행된다. 바람직하게, 감염은 3 x 10-5 U/ml의 최종 농도의 트립신의 존재하에 수행된다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 구체예에서, 영구 인간 세포는 4 mM 글루타민, 4 mM 피루베이트 및 20 mM 글루코스가 첨가된 PEM 배지에서 1 리터 Wave 바이오반응기(Wave Biotech AG)에서 배양되고, 초기 세포 농도는 5 x105 cells/ml 이고, 감염전의 세포 농도는 2.1 x 106 cells/ml 이고, 0.025의 MOI 값으로 표시되는 양의 인플루엔자 바이러스를 이용하여 감염되고, 감염전 배지 교체가 수행되지 않는다. 바람직하게, 감염은 3 x 10-5 U/ml의 최종 농도의 트립신의 존재하에 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 영구 인간 세포는 진탕 플라스크에서 4 mM 글루타민 및 4 mM 피루베이트가 첨가된 PEM 배지에서 배양되는데, 이때 1 x 10-6 U/cell의 트립신 농도의 존재하에서 0.025의 MOI 값으로 표시되는 양의 인플루엔자 바이러스를 이용한 세포 감염전에 배지 교체가 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 영구 인간 세포는 진탕 플라스크에서 4 mM 글루타민 및 4 mM 피루베이트가 첨가된 PEM 배지에서 배양되는데, 이때 1 x 10-5 U/cell의 트립신 농도의 존재하에서 0.025의 MOI로 표시되는 양의 인플루엔자 바이러스를 이용한 세포 감염 전에 1:1 배지 교체가 수행된다.
인플루엔자 단백질 및 인플루엔자 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 제조에 있어서, 인플루엔자 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 갖는 배양된 인간 세포가 배양된 다음, 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 인플루엔자 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 알려진 방법을 이용하여 분리 및 정제된다.
추가의 바람직한 구체예에 있어서, 바이러스 입자를 이용한 감염시 또는 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 분자를 이용한 형질감염시 본 발명에 따른 방법에서 인간 세포는 중간의 대수 증식기(mid-exponential growth phase)와 정체기(stationary growth phase) 사이에 있는 세포이다. 세포 농도가 시간에 대하여 표시되는 대표적인 증식 곡선은 S자형 곡선 형상을 갖는다. 이는 이른바 유도기(lag phase)에서 시작된 다음, 대수 증식기 및 정지기로 이어진다. 이러한 경우에 있어서 중간의 대수 증식기는 대표적인 증식 곡선의 첫 번째 굴곡 지점에 해당하는데, 상기 굴곡 지점은 곡선의 형상이 오목에서 볼록으로 또는 볼록에서 오목으로 변화하는 증식 곡선상의 지점이다. 정지기는 증식 곡선이 평탄역에 도달하는 때 개시되므로, 세포수가 일정하게 유지된다.
본 발명에 의해 제공되는 인플루엔자 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조되는 핵산은 핵산 면역에 사용될 수 있거나 이른바 DNA 백신으로 사용될 수 있다. 핵산 면역에 있어서, 면역원성 항원, 즉 인간에서 면역 반응을 유도하는 항원이 접종된다. 이러한 면역원성 항원은 DNA 또는 RNA에 의해 암호화되거나, 발현 카세트 또는 백신으로 존재하거나, 유전자 생성물에 대한 면역 반응을 유도하도록 바이러스 벡터내로 도입된다. DNA 백신은 DNA 또는RNA 형태, 선형 또는 고리형 플라스미드 또는 발현 카세트 형태와 같은 여러 가지 전달 시스템의 형태로 제공될 수 있는데, 이들은 프로모터, 폴리아데닐화 부위, 복제 기원 등과 같은 발현에 필요한 요소들을 구비한다. DNA의 투여의 경우, 이는 보통 아쥬반트를 갖거나 갖지않는 완충액에 존재하거나, 나노 입자에 결합되거나, 아쥬반트 함유 화합물에 존재하거나, 바이러스 또는 박테리아 벡터에 도입된다. DNA 백신은 체액 및 세포 매개 면역 모두를 유도한다. DNA 백신의 이점은 항원이 천연 형태로 존재하므로, 면역이 개선되다는 것이다. DNA 백신의 또 다른 이점은 약독화 생백신과 비교하여 감염성이 없고 다시 독성화될 수 없다는 것이다.
DNA 또는 RNA 형태의 DNA 백신의 투여, 또는 입자에 결합되는 플라스미드 또는 선형 DNA 플라스미드의 투여는 주사 또는 유전자 총을 이용하여 수행될 수 있다. 여기서, 예를 들어 주사용 DNA 백신은 식염 용액 또는 완충 식염 용액에 존재한다.
인플루엔자 단백질을 암호화하는 본 발명의 방법에 의해 제조된 핵산, 인플루엔자 단백질 및 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 타입 A 및/또는 B 및/또는 C에 대한 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 바이러스계 백신은 인플루엔자에 대한 면역 목적으로 사용될 수 있는 것으로, 인플루엔자 바이러스의 모든 단백질, 펩티드, 또는 이의 일부분 외에도, 이러한 단백질, 펩티드, 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산뿐 아니라, 인플루엔자 바이러스 입자 그 자체, 인플루엔자 외피 단백질을 비롯한 재조합 인플루엔자 바이러스 단백질, 서브 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자(VLP), VLP-복합체, 및/또는 이들의 일부분을 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 단백질은 인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 변종인 A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007, A/Brisbane/59/2007, B/Florida/4/2006, 돼지 인플루엔자 (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) 또는 말 인플루엔자 (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))의 단백질 또는 유도체이다.
본 발명의 방법에 따라 제조되는, 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산의 분리 및 정제는 당업자에게 알려져 있는 통상의 방법을 이용하여 수행된다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 바이러스 단백질의 분리 및 정제는 당업자에게 알려진 통상의 방법을 이용하여 수행된다. 단백질의 정제는 처음에는 이의 기원에 의존한다. 세포내 단백질과 세포외 딘백질 사이의 구별이 이루어진다. 단백질이 세포체 내에 위치하는 경우, 예를 들어 전단력 또는 삼투압 용해를 통해 세포를 파쇄하는 것이 우선 필요하다. 이후, 세포막 및 세포벽과 같은 불용성 물질의 분리가 예를 들어 원심분리를 통해 수행된다. 원심분리는 세포, 세포 소기관 및 단백질의 분리를 위한 디폴트(default)에 의해 사용된다. 분리능의 측면에서 더욱 효과적인 방법은 펄스 전기영동(pulse electrophoresis)이다. 또한, 다른 세포 성분의 분리 후, 여러가지 크기의 단백질, 펩티드 및 아미노산을 분리할 필요성이 여전히 존재한다. 단백질의 분리는 일차원 또는 이차원적 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동에 의해 수행될 수 있다. 아미노산 및 펩티드의 분야에서는, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피(IEC) 또는 역상 크로마토그래피(RPC)와 같은 크로마토그래피 방법이 사용된다. 지질의 존재 및 프로테아제의 제거 또는 불활성화의 필요성은 정제에 불리하다. 세포외 기질에 존재하는 단백질은 세포로부터 추출될 필요가 없지만, 모든 불용성 물질의 분리후, 세포내 단백질보다 아주 작은 양으로 고도로 희석된다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 바이러스 입자의 분리 및 정제를 위하여, 당업자에게 알려진 방법이 사용된다. 이러한 방법의 예로는 밀도구배 편차 또는 띠 원심분리법이 있다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 영구 인간 세포는 초대배양 인간세포의 불멸화를 통해 얻어진다. 초대배양 세포는, 유기체로부터 직접 추출 또는 유기체로부터 추출되어 배양된 조직으로부터 추출을 통해 얻어진다. 바람직한 것은 세포 형질전환 인자와의 발현을 통해 영구 인간 세포주로 잘 전환되는 초대 배양 인간 세포, 특히 양막세포, 배아 망막 세포 및 신경 기원의 배아 세포이다.
세포 형질전환 인자로는 SV40(Genbank Acc. No. J02400)의 T-항원, HPV (예를 들어, HPV 16, Genbank Acc. No. K02718)의 E6 및 E7 유전자 생성물, 및 인간 아데노바이러스(예를 들어, 인간 아데노바이러스 혈청형-5, Genbank Acc. No. X02996)의 E1A 및 E1B 유전자 생성물이 있다. 그 초대배양 세포는 E1A 및 E1B 유전자 생성물에 대한 두 개의 핵산 서열을 이용하여 인간 아데노바이러스 E1의 발현을 통해 불멸화를 위해 형질감염된다. 천연 HPV에 의한 발현의 경우, E6 및 E7은 RNA 전사체로부터 발현될 수 있다. 이는 천연 아데노바이러스의 E1A 및 E1B의 발현의 경우에도 마찬가지이다. 아데노바이러스의 E1 유전자 기능과 같은 세포 형질전환 인자는 불멸화 또는 형질전환을 유발하므로, 세포의 장기 배양성을 제공한다.
상기 형질전환 인자의 발현은 상동성 프로모터 및 전사 종결 요소, 예를 들어, 아데노바이러스의 E1A 유전자 기능의 발현을 위한 천연 E1A 폴리아데닐화 부위 및 천연 E1A 프로모터의 조절하에서 수행될 수 있다. 이는 E1A, E1B와 같은 유전자 기능을 함유하는 예를 들어 아데노바이러스 게놈의 각각의 바이러스 게놈 단편의 형질감염에 사용되는 핵산 분자를 이용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 세포 형질전환 인자의 발현은 천연 프로모터나 전사 종결 요소를 이용하지 않고 이종 프로모터들의 조절하에서 수행될 수도 있다. 예를 들어, CMV (cytomegalovirus) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Eds.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003), EF-1 α 프로모터(Kim et al, Gene 91st :217-223, 1990), CAG 프로모터(인간 시토매갈로바이러스의 즉시 초기 인핸서와 초기 인트론을 갖는 변형된 닭의 β-악틴 프로모터의 혼성 프로모터)(Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991), 인간 또는 쥐의 pgk (포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터(Adra et al, Gene 60:65-74, 1987.), RSV (라우스 육종 바이러스) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003), 또는 SV40 (원숭이 바이러스 40) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)가 이종 프로모터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, SV40 Large T 항원(Genbank Acc. No. J02400) 또는 인간 G-CSF (과립구 집락 자극 인자) 유전자(Mizushima and Nagata, Nucl. Acids Res 18:5322 , 1990)의 폴리아데닐화 서열이 폴리아데닐화 부위로 사용될 수 있다.
E1A 및 E1B를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 이용한 초대배양 인간 세포의 형질감염을 통해, 그 세포가 불멸화된다. 초대배양 인간 세포의 불멸화에 사용되는 핵산 분자는 인간 아데노바이러스, 특히 인간 아데노바이러스 혈청형-5로부터 바람직하게 유래되는 E1A 및 E1B-핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 불멸화에 사용되는 핵산 분자는 E1A 및 E1B 암호화 핵산 서열 외에도, 아데노바이러스의 pIX 유전자 기능을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 pIX 폴리펩티드는 티미딘 키나아제 및 베타-글로빈 프로모터와 같은 몇몇 바이러스 및 세포 프로모터에서 전사 활성화인자로 작용하는 바이러스 구조 단백질이다. 상기 세포에서 추가로 발현되는 pIX 폴리펩티드의 전사 활성화 효과는, 재조합 폴리펩티드의 암호화 서열이 상기 프로모터들 중 어느 하나의 조절하에 있는 경우, 본 발명에 따른 세포주의 제조에서 재조합 폴리펩티드의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 예시적인 서열이 Genbank Acc. No. X02996에 기재되어 있다. 특히, 상기 핵산 분자는 인간 아데노바이러스 혈청형-5의 뉴클레오티드 1 내지 4344, 505 내지 3522 또는 뉴클레오티드 505 내지 4079를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 핵산 분자는 초대배양 세포, 특히 양막세포의 불멸화를 위하여 아데노바이러스 혈청형-5의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 505 내지 뉴클레오티드 4079를 포함한다. 추가의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 핵산 분자는 초대배양 세포, 특히 양막세포의 불멸화를 위해 아데노바이러스 혈청형-5의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 505 내지 뉴클레오티드 3522를 포함한다. 또 다른 특히 바람직한 구체예에서, 상기 핵산 분자는 초대배양 세포, 특히 양막세포의 불멸화를 위해 아데노바이러스 혈청형-5의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 4344를 포함하는데, 이러한 서열은 HEK 293 세포의 아데노바이러스 DNA에 해당한다(Louis et al, Virology 233rd: 423-429, 1997). 또한, 상기 불멸화 인간 세포는 바이러스 복제 인자를 발현할 수 있다. 이러한 복제 인자는 형질감염에 의해 도입된 핵산 분자의 복제 기원에 결합하여 에피솜 핵산 분자의 복제를 개시할 수 있다. 핵산 분자, 특히 플라스미드 DNA의 세포내로의 에피솜 복제는 전달된 핵산 분자의 복제수의 강한 증가를 유발하여 이러한 분자 상에서 암호화된 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키고 많은 세포 분열 동안에도 이를 유지시킨다. 이러한 바이러스 복제 인자는 예를 들어, 플라스미드 DNA와 같은 핵산 분자 상에 SV40 복제 기원으로 나타낸 서열(SV40 ori, 복제 기원)에의 결합 후 그의 복제를 개시하는 원숭이 바이러스40 (SV40)의 T 항원이다. Epstein-Barr 바이러스 EBNA-1 단백질(Ebstein Barr 바이러스 핵 항원-1)은 ori-P으로 나타내는 복제 기원을 인식하고 ori-P를 갖는 핵산 분자의 염색체외 복제를 촉매한다. 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 T-항원은 복제 인자로서 복제를 활성화하는 외에도, 몇몇 바이러스 및 세포 유전자의 전사를 활성화하는 효과를 갖는다(Brady, John and Khoury, George, 1985, Molecular and Cellular Biology, vol 5, no. 6, p. 1391 to 1399).
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 불멸화 인간 세포는 특히 블멸화 인간 양막 세포이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 불멸화 인간 세포는 SV40의 거대 T 항원 또는 Epstein-Barr 바이러스(EBV) Nuclear Antigen 1 (EBNA-1)을 발현한다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 불멸화 인간 양막 세포는 SV40의 거대 T 항원 또는 Epstein-Barr 바이러스(EBV) Nuclear Antigen 1 (EBNA-1)을 발현한다. 또 다른 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 불멸화 인간 세포, 특히 양막 세포는 CAG SV40, RSV 또는 CMV 프로모터의 조절하에 SV40의 거대 T 항원을 발현한다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 영구 인간 양막세포는 특히 특허문헌 EP 1230354 및 EP 1948789에 기재되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 영구 인간 양막 세포는 CAP 또는 CAP-T 이다.
CAP 세포의 경우, 초대배양 세포는, Ad5의 pIX 영역(뉴클레오티드 3485 내지 4079), 및 SV40의 전체 E1 영역, 3 스플라이스 및 폴리아데닐화 시그날을 함유하는 쥐의 pgk 프로모터인 Ad5 서열의 뉴클레오티드 505-3522를 함유하는 플라스미드를 이용하여 형질감염되었다. 이러한 플라스미드는 EP 1 948 789호에 상세히 기재되어 있다.
CAP-T-세포의 제조를 위하여, CAP 세포는, SV40의 인트론 및 폴리아데닐화 부위가 측면에 위치한, SV 40의 T 항원에 대한 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 이용하여 형질감염되었다. 또한, 상기 플라스미드는 CAG 프로모터(CMV 인핸서 및 닭의 베타-악틴 프로모터로 구성된 혼성 프로모터)(Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991), RSV 프로모터(라우스 육종 바이러스 프로모터) (Genbank Acc Nr.DQ075935) 또는 CMV 프로모터(인간 시토메갈로바이러스의 초기 프로모터)(서열 번호: 5)를 함유한다. 안정한 세포주를 얻기 위하여, 상기 플라스미드는 유비퀴틴 프로모터(pUB/Bsd, Invitrogen # V512-20)를 갖는 블라스티시딘 발현 카세트를 함유한다.
또한, 본 발명은 인간 세포, 특히 양막 세포가 현탁 상태로 성장할 수 있는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 방법의 인간 세포, 특히 양막 세포는 무혈청 배지에서 배양될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조를 위한 영구 인간 세포, 특히 양막 세포의 용도이다.
바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스계 백신의 제조에 사용되는 영구 인간 양막 세포는 CAP 또는 CAP-T 세포이다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 바이러스계 백신은 인플루엔자 바이러스 및/또는 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 인플루엔자 단백질을 암호화하는 핵산 분자일 수 있다. 상기 백신은 주사기를 이용하여 비경구 투여될 수 있다. 구체적으로, 피내, 피하 또는 근육내 주사가 있다. 피내 주사는 백신접종 총 또는 란셋을 이용하여 수행할 수 있다. 근육내 주사는 상완, 허벅다리 또는 엉덩이에서 이루어질 수 있다. 또한, 상기 백신은 경구 또는 경비 투여될 수 있다. 상기 백신은 예를 들어 인간 또는 동물에게 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 바이러스계 백신은 능동 및 수동 면역을 통해 한 종 이상의 인플루엔자 바이러스에 대한 내성을 제공할 수 있다. 능동 면역을 위하여, 상기 백신은 특정 바이러스에 대한 인간 및 동물의 면역계의 특이적 활성화를 위해 사용된다. 여기서, 면역계의 반응은 바이러스 또는 이의 특이적 항원의 존재하에서 면역 반응을 유발하기 위해 사용된다. 이러한 반응에 의해, 항체 및 분화된 T-헬퍼 세포가 형성되어, 바이러스에 따라 수년 내지 일생 동안 지속될 수 있는 특정 질병에 대한 장기 지속적인 보호를 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 바이러스계 백신은 예를 들어 생독 백신 또는 사독 백신 일수 있다. 상기 생독 백신은 예를 들어, 바이러스를 재생할 수 있지만 질병을 유발할 수 없는 약독화 백신을 포함한다. 사독 백신의 경우, 이러한 바이러스는 불활화 바이러스이거나, 바이러스의 단편(항원)을 함유한다. 바이러스의 불활화는 예를 들어, 포름알데히드, 베타-프로피올로락톤 및 소랄렌과 같은 화학 물질을 이용하여 수행될 수 있다. 그 바이러스 외피는 그대로 유지된다. 또한, 사군 백신에도 포함되는 것으로, 바이러스의 독소 생물학적 불활성 부분(톡소이드, 예를 들어 파상풍 톡소이드)만을 함유하는 톡소이드 백신이 있다. 특히, 불활화 백신은 바이러스 외피 단백질의 단편으로 이루어지는 분할 백신일 수 있다. 바이러스 외피의 파괴 또는 분할은 예를 들어, 세제 또는 강한 유기 용매를 이용하여 이루어질 수 있다. 또한, 그 바이러스는 화학제로 불활화 및 사독화될 수 있다. 또한, 아단위 백신은 사독 백신의 일부인데, 이는 바이러스의 특정 성분, 예를 들어 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 단백질로 구성된다.
수동 면역의 경우, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 인플루엔자 바이러스계 백신은 숙주(예를 들어, 포유동물)에게 투여되고, 유도된 항혈청이 추출된 다음, 적어도 한 종의 인플루엔자 바이러스로 감염되는 수용자에게 투여된다.
또한, 투여를 위하여, 상기 백신은 안정화제, 중화제, 담체 및 보존제와 같은 한 종 이상의 첨가제와 혼합된다. 이러한 물질로는 포름알데히드, 티메로살, 인산알루미늄, 아세톤 및 페놀이 있다. 또한, 상기 백신은 백신의 효과를 강화하기 위한 보조 물질과 혼합될 수 있다. 이러한 이른바 아쥬반트는 그 자체로는 약리학적 효과가 없으나 특히 가용성화제, 에멀션 또는 이의 혼합물로 작용한다. 아쥬반트의 예로는 무기염, 스쿠알란 혼합물, 무라밀 펩티드, 사포닌 유도체, 마이코박테리아 세포벽 제제, 특정 에멀션, 모노포스포릴 지질 A, 마이콜 산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B의 아단위체, 폴리포스파젠 및 이의 유도체, 면역 자극 복합체, 시토킨 아쥬반트, MF59 아쥬반트, 지질 아쥬반트, 점막 아쥬반트, 특정 박테리아 외독소, 특정 올리고펩티드, 및 PLG가 있다.
하기의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로서 제한으로 해석되지 않는다. 달리 나타내지 않는 경우, 다음 문헌[Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 기재된 바와 같은 표준 분자 생물학적 방법이 사용되었다.
실시예 1: PEM 또는 293 SFMII 배지에서 영구 양막 세포주 CAP -1 D5 를 이용한 배양 실험
영구 양막 세포주 CAP-1D5를, 37 ℃, 8% CO2 및 100 rpm에서 100 ml의 무혈청 293SFMII 배지 (Invitrogen) 또는 PEM 배지 (Invitrogen)에서 배양했다. 대조군으로, 영구 개 신장 세포주 MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney, 현탁액에서 증식에 적응됨)(Lohr et al., Vaccine, 2010, 28 (38) :6256-64)를, 100 ml 진탕 플라스크에서 100 ml 무혈청 SMIF8 배지에서 사용한다.
시간 0 (배양의 출발)에서 및 매 경우마다 24 시간 간격으로, 생존 세포 농도, 죽은 세포 농도, 세포주의 생존율을 측정하는 외에도, 생화학적 다중 파라미터 분석 시스템을 이용하여 pH 값, 배지내의 글루코스, 락토오스, 글루타민, 암모늄, 글루탐산 및 피루베이트의 농도를 측정했다(Lohr et al, Vaccine, 2009, 27 (37), 4975-4982; Genzel et al, Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 88 (2) :461-75).
그 결과는 도 1에서 나타낸다. 배양의 시작시 배지 ml 당 약 2 x 105 개 세포수에서 시작하여, 293SFMII 및 PEM 배지에서 영구 양막 세포주 CAP 1D5 및 MDCK.SUS2 세포의 생존 세포 농도는 유사한 추이를 나타냈고 168 시간 후 약 2 x 106 개 세포(cells)/ml의 생존 세포 농도가 달성되었다. 192 시간째에, MDCK.SUS2 세포의 생존 세포 농도는 9 x 105 cells/ml에 도달했고, 증식 곡선의 개시 후 240 h 시간까지 유지되었다. 293SFMII 배지에서 영구 양막 세포주 CAP-1D5의 생존 세포 농도는 216 시간째에 배양액 1 ml 당 2 x 105개 세포의 초기값에 도달했으나, CAP-1D5 세포의 생존 세포 농도는 PEM 배지에서 240 시간까지 배양액 1 ml 당 약 2.5 x 106 개 세포수(cells)로 안정하게 유지되었고, 312 시간 후. 2 x 105 개 세포수의 생존세포 농도 초기 값에 도달했다.
증식 곡선의 시작시에 그리고 168 시간 까지, 293SFMII 배지 및 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 생존율 및 MDCK.SUS2 세포의 생존율은 80 내지 90% 였다. 240 시간까지, PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 생존율은 80%로 유지된 다음 떨어졌고, 312 시간후 여전히 10%였다. 293SFMII 배지에서 CAP-1D5 세포의 생존율은 168 시간 이후에 이미 낮아졌고 216 시간 후 약 10% 였다. MDCK.SUS2 세포의 생존율은 일정하게 감소했고 168 시간후 정지하여 240 시간째에 약 45%에 도달했다.
MDCK.SUS2 세포의 pH 값은 7.7 내지 7.6에서 240 시간에 걸쳐서 비교적 안정했다. 그러나, 293SFMII 배지 및 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포 배양액의 pH 값은 초기 7.4에서 240 시간(293SFMII 배지) 및 312 시간(PEM 배지)후 pH 6.4로 감소했다.
락토오스 농도는 CAP-1D5 세포의 각각의 배양액의 293SFMII 배지 및 PEM 배지에서 5 mM 이하의 초기 농도로부터 240시간까지 30-35 mM로 증가했다. MDCK.SUS2 세포의 배양액에서, 락토오스 농도는 덜 강하게 증가하지만, 240 시간째에 CAP-1D5 세포 배지와 유사한 값에 도달했다. 글루코스 농도는 293SFMII 배지 및 PEM 배지에서 세포 배양의 시작시로부터 20 내지 25 mM 만큼 감소했고 MDCK.SUS2 세포 배양의 경우 10 mM 이하로 감소했고, 이때의 최대 감소값이 293SFMII 배지에서의 CAP-1D5 세포의 배양시에 기록되었다.
293SFMII 배지 및 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양시 암모늄 농도의 증가는 매우 유사한 추이를 나타냈다(<0.5 로부터 4-5 mM까지). 대조로, MDCK.SUS2 세포의 배양시 암모늄 농도는 아주 강하게 증가했다(7 mM까지). 글루타민 농도의 감소는 293SFMII 배지 및 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양시 매우 유사하였는데, 최대 감소는 PEM 배지에서 기록되었다.
글루탐산의 최대 농도는 MDCK.SUS2 배양의 경우였고 이는 단지 약간만 증가했다. 글루탐산 농도는 293SFMII 배지와 비교하여 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양시 더욱 높았고 꾸준히 증가했다. MDCK.SUS2 세포의 배양시 피루베이트 농도는 144 시간째로부터 0으로 감소했다. 그러나, 피루베이트는 PEM 배지 및 293SFMII 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양시 48 시간 전에 이미 소모되었다.
따라서,CAP-1D5 세포는 293SFMII 배지 보다는 PEM 배지에서 좋은 증식을 나타냈다. PEM 배지내의 CAP-1D5 세포는 가장 강한 글루코스 소모 및 가장 강한 락토오스 형성을 나타냈다. 192 시간째부터 글루코스의 제한은 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 세포수의 감소를 설명할 수 있었다. PEM 배지 및 293SFMII 배지에서 CAP-1D5 세포 배양의 배양 조건의 최적화를 통해, pH 값의 안정화, 피루베이트 및 글루타민의 첨가 및 글루코스의 첨가가 적절할 수 있었다.
실시예 2: 비적응형 바이러스를 이용한 바이러스 감염
비적응형 바이러스를 이용한 감염 실험을 위하여, 양막 세포주 CAP-1D5를. 진탕 플라스크에서 37 ℃, 8% CO2, 100 rpm에서 55 mL 무혈청 293SFMII 배지(Invitrogen) 및 PEM 배지에서 배양했다. 대조군의 경우, 개 신장 세포주 MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney, 현탁액에 적응화됨)를 사용했다.
표 1에서 각각 나타낸 세포 밀도는 배지를 변화시키지 않거나 5 x 10-6 U/mL 트립신을 첨가하면서 바이러스 B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) 및 A/PR/8/34 (H1N1) (RKI, Robert-Koch-Institute )로 감염시켰다. 생성된 바이러스 입자의 양은 헤마글루티닌의 적정(HA, 표준 방법에 의한 헤마글루틴화 시험법) (표 1에서 log HA units/100 ml로 나타냄) (Kalbfuss et al, 2008;. Biologicals 36 (3) :145-61 )을 통해 측정했다. 또한, 표 1은 배지의 각각의 pH 를 나타낸다.
배지를 변화시키지 않은 감염시 비적응형 바이러스를 이용한 바이러스 감염 실험의 개요
세포 배지 바이러스 0 hpi * 에서 생존세포수/ mL 최대 HA 에서
pH 최대 H
ID5 293SFM B/FLORIDA 2.70E+06 6.6 0.87
ID 5 FEM B/FLORIDA 2.40E+06 6.6 0
ID 5 293SFM A/PR/8/34 2.70E+06 6.6 1.19
ID5 FEM A/PR/8/34 2.50E+06 6.6 0
MDCKsus SMIF8 B/FLORIDA 1.50E+06 7.5 0
MDCKsus SMIF8 A/PR/8/34 1.60E+06 7.7 1.84
· hpi: 감염후 시간
PEM 배지에서 배양시 영구 양막 세포주 CAP-1D5의 경우, 바이러스 입자의 생성은 바이러스 B/Florida/4/2006 (B/Florida)를 이용한 감염시에도 확인될 수 없었고 바이러스 A/PR/8/34를 이용한 감염시에도 확인될 수 없었다. 293SFM 배지에서 A/PR/8/34 (H1N1)에 대한 최대 HA 값은 MDCK.SUS2에서 도달된 최대 HA 값 미만이었다. 최대 HA에서의 pH는 CAP-1D5 에서 모든 감염의 경우 유사했지만(pH 6.6), 감염 MDCK.SUS2 세포의 경우(pH 7.7)보다 유의하게 낮았다.
따라서, 시험 조건하에서 영구 양막 세포주 CAP 1D5 의 감염은 바이러스 B/Florida의 경우에만 일어났다. 그러나, 영구 개 신장 세포 MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney)의 경우, 감염은 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)의 경우에만 검출되었다. 이후의 실험에서는, CAP-1D5 세포에 대한 바이러스의 사전 적응을 통해 개선된 감염 및 더욱 높은 바이러스 수율이 달성될 수 있는 지의 여부가 시험되었다.
실시예 3: 진탕 플라스크내 PEM 및 293 SFMII 배지에서 CAP -1 D5 세포에 대한 바이러스 적응
인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1) (RKI, Robert Koch Institute), A/Uruguay/716/2007 (H3N2) (NYMC X-175C, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) 및 B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control)의 바이러스 적응을, 진탕 플라스크내 PEM 및 293SFMII 배지에서 4계대에 걸쳐서 CAP-1D5의 감염을 통해 수행했다. 각각의 감염전, 배지를 교체시켰다. 각 계대 동안 바이러스 수율을 헤마글루티닌(log HA units/100 ml)의 적정 및 조직 배양 감염 투여50 분석(TCID50 바이러스수/ml)을 통해 측정했다(Genzel and Reichl, Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing in Methods of Biotechnology:Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Ed R. Portner, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2007, 457-473; Kalbfuss et al, 2008; Biological 36 (3) :145-61).
그 결과는 도 2에서 나타낸다. 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1) 및 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)를 이용한 CAP-1D5 세포의 감염 결과, PEM 및 293SFMII 배지에서의 것들은 4계대후 상당히 증가된 바이러스 역가를 나타냈다. 293SFMII 배지 및 PEM 배지에서의 배양시 인플루엔자 바이러스 B/Florida/4/2006를 이용한 CAP-1D5 세포의 감염은 두 번째 계대시 바이러스 역가의 유의적인 증가로 이어졌다. PEM 배지 및 293SFMII 배지에서 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1) 또는 A/Uruguay/716/2007 (H3N2)를 이용한 CAP-1D5 세포의 감염동안 HA 값의 적정은 유사한 증가를 나타냈다.
적응을 통한 바이러스 역가의 증가와 함께, 각 계대마다 바이러스의 복제가 빨라졌고 궁극적으로 유의하게 증가될 수 있었다. 일반적으로 PEM과 비교하여 293SFMII 배지의 바이러스 역가의 약간의 증가가 달성될 수 있는 것으로 보인다.
실시예 4: 적응형 인플루엔자 A/ PR /8/34를 이용한 CAP -1 D5 및 MDCK . SUS2 세포의 감염의 MOI (감염 다중도) 의존성
적응형 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1, RKI, Robert Koch Institute)를 이용하여, MOI-의존성을 3개의 MOI 값(0.0025, 0.025 및 0.25)에서 시험했고, 숙주 세포당 바이러스 입자의 수를 측정했다. 영구 양막 세포 CAP-1D5를 진탕 플라스크내 293SFMII 및 PEM 배지에서 여러가지 MOI의 적응형 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염시키고, 마찬가지로 MDCK.SUS2 SMIF8 배지에서 영구 개 신장 세포를 감염시켰다. 감염시, 대략 pH = 7.5의 거의 일정한 pH 값이 되도록 배지 교체를 실시했다. 96 시간에 걸쳐서, 생존 세포 농도를 측정하고, 표준 방법을 이용한 헤마글루틴화 시험에서 헤마글루티닌의 적정을 통해 144 시간에 걸쳐서 바이러스 입자의 양(log HA 단위수(units)/100 ㎕)을 측정했다.
293SFM 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양 및 SMIF8 배지에서 MDCK.SUS2 세포의 배양시 생존 세포 농도 및 형성된 입자의 양은 MOI 값에 의존성을 나타내지 않았다. 두 배양시 바이러스 역가는 약 2.5 log HA-단위수(units)/100 ml로 증가했다. PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양은 모든 세 MOI 값의 경우 더욱 낮은 양(약 2.0 log HA units/100 ml)의 바이러스 입자를 나타냈다. 유사하게, 48 시간 동안 PEM 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양시 생존 세포 농도는 1x106 개 세포/ml로 일정하게 유지된 다음, 1x104 개 세포/ml 미만으로 떨어졌다. 이와 비교하여, 293SFM 배지 및 MDCK.SUS2 배지에서 CAP-1D5 세포의 배양시 생존 세포 농도는 96 시간 후 1 x 106 개 세포/ml에서 1 x 104 개 세포/ml 미만으로 떨어졌다. 모든 배양에서, 더욱 높은 MOI 값과 비교하여 0.0025의 MOI에서 바이러스 복제의 약간의 지연(log HA 단위수의 시간 지연 증가)이 검출될 수 있었다.
실시예 5: 감염 (적응형 A/ PR /8/34)을 이용한 1 리터 규모 배양
85 rpm, pH = 7.2, 및 40% 순수산소의 부분압 pO2 에서 4 mM 글루타민 및 4 mM 피루베이트가 첨가된 PEM 배지에서 1 리터 바이오 반응기내에서 CAP-1D5 세포를 배양했다. 초기 세포 농도는 5 x 105 개 세포/mL였다.
114 시간의 증식후 2.4 x 106 개 세포/ml의 세포 농도에서, CAP-1D5 세포를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (적응형: PEM에서, 4차 계대, 1.78 x 107 viruses/mL)로 감염시켰다. 배지 변화는 수행하지 않았으나, 80 ml PEM 배지에 글루타민 및 피루베이트가 2 mM의 최종 농도로 첨가되었다. MOI 값은 0.025 였고, 1 x 10-5 U/mL의 최종 농도의 트립신이 첨가되었다. 240 시간에 걸쳐서 24 시간 간격으로, 생존 세포 농도, 죽은 세포 농도, 세포주의 생존률이 측정되었고, pH 값, 배지내 글루코스, 락토오스, 글루타민, 암모늄, 글루탐산 및 피루베이트의 농도가 측정되었다. 또한, 감염시(114 시간)부터, log HA-단위수(units)/100 ml 및 TCID50 값을 검출하였다(Genzel and Reichl, Vaccine production determined - state of the art and future needs in upstream processing in Biotechnology: Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Eds., R. Portner, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2007, 457-473; Kalbfuss et al, 2008; Biologicals 36 (3) :145-61).
그 결과는 도 4에서 나타낸다. CAP-1D5 세포의 생존 세포 농도는 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 이용한 감염시까지 6 x 105 개 세포/ml 에서 2.4 x 106 개 세포/ml로 증가했고 감염후 약간 감소했다. 전체 시간에 걸친 CAP-1D5 세포의 생존률은 80 내지 90% 였고, 240 시간후 70%로 떨어졌다. 배양시의 피루베이트 농도는 72 시간내에 0으로 감소했고, 인플루엔자 바이러스를 이용한 감염시에 첨가한 프루베이트의 양은 10 시간내에 소모되었다. 글루타메이트 농도는 전체 시간에 걸쳐서 약 1 mM 에서 약 1.8 mM로 일정하게 증가했다. 몇몇의 변화의 경우, 배양액의 pH 값은 7.1 내지 7.4로 관찰되었다. 달성된 최대 TCID50 역가는 2.4 x 107 개 바이러스/mL였고, 최대 HA 역가는 2.2 log HA-단위수/100 ㎕ 였다.
이러한 증식 실험의 결과는 피루베이트의 공급으로 인해 글루코스 제한이 발생하지 않았으므로, 생존 세포 농도가 저하되지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 6: 50 ml 팔콘 용기에서 PEM 및 293 SFMII 배지에서 CAP -1 D5 세포에 대한 바이러스 적응
PEM 및 293SFMII 배지에서 50 ml 팔콘 용기에서 4회 계대에서 CAP-1D5의 감염을 통해 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane/59/2007 (H1N1-like HGR; IVR-148, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control), B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control), 돼지 인플루엔자 (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00; IDT biologics) 및 말 인플루엔자(A/equine 2 (H3N8); A/Newmarket/1/93; NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control)의 바이러스 적응을 수행했다. 각각의 감염전, 배지를 변화시켰다. 각 계대 동안 바이러스 수율을, 헤마글루티닌의 적정(log HA units/100 ㎕) 및 조직 배양 감염성 투여50 분석(TCID50 virus count/ml)을 통해 정량했다(Genzel and Reichl, Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing in Methods in Biotechnology. Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Ed R. Portner, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2007, 457-473; Kalbfuss et al, 2008; Biologicals 36 (3):145-61).
그 결과는 도 5에서 나타낸다. PEM 배지 및 293SFMII 배지에서 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane/59/2007 및 B/Florida/4/2006를 이용한 CAP-1D5 세포의 감염은 4회의 계대후 바이러스 역가의 유의한 증가로 이어졌는데, 293SFMII 배지에서의 역가의 증가가 더욱 강했다. PEM 및 293SFMII 배지에서의 인플루엔자 바이러스 또는 A/Brisbane/59/2007 및 B/Florida/4/2006를 이용한 CAP-1D5 세포의 감염은 HA 값의 적정 농도의 유사한 증가를 나타냈다. 돼지 인플루엔자 바이러스를 이용한 CAP-1D5 세포의 감염은 PEM 및 293SFMII 배지에서 HA 값의 적정 농도의 증가로 이어졌다.
적응을 통한 바이러스 역가의 증가와 함께, 바이러스의 복제는 각 계대에서 더울 빨라졌고, 궁극적으로 그 바이러스 역가는 유의하게 증가될 수 있었다. 일반적으로 PEM 배지와 비교한 바이러스 역가의 약간의 증가가 293SFMII 배지에서 달성될 수 있는 것으로 보인다.
실시예 7: 증가된 초기 세포 농도에서 영구 양막 세포주 CAP -1 D5 를 이용한 배양 실험
영구 양막 세포주 CAP-1D5를, 37 ℃, 8% CO2 및 185 rpm에서 100 ml의 PEM 배지(Invitrogen)에서 배양했다. 초기 세포 농도는 각각 5 x 105 개 세포/ml 및 8 x 105 개 세포/ml였다. 또한, 증가된 초기 세포 농도를 갖는 배치에 피루베이트를 각각 4 mM 및 10 mM의 농도로 첨가하고, 다른 아미노산도 첨가했다.
시간 0 (배양의 시작) 및 각 경우마다 24 시간 간격으로, 생존 세포 농도, 죽은 세포 농도, 세포주의 생존율, pH 값, 및 배지에서 글루코스, 락토오스, 글루타민, 암모늄, 글루탐산 및 피루베이트의 농도를 생화학적 다중 파라미터 분석 시스템을 이용하여 측정했다(Lohr et al, Vaccine, 2009, 27 (36) 4975-4982; Genzel et al, Appl Microbial Biotechnol, 2010, 88 (2) :461-75).
그 결과는 도 6에서 나타낸다. PEM 배지에서 영구 양막 세포주 CAP-1D5의 초기 세포 농도를 배양 개시 시점의 배양액 1 ml당 약 5 x 105 개 세포에서 8 x 105 개 세포로 증가시킴으로써, 90 시간 후 배양액 1 ml당 1 x 106 개 세포의 추가의 수율이 있었다. 대표적인 감염 시기(배양 시작후 약 96 시간 내지 120 시간)에서, 배양액 1 ml 당 5 - 6 x 106 개 세포의 세포 농도가 도달되었다.
배양액의 pH 값은 대표적인 감염 시기(배양 시작후 약 96 시간 내지 120 시간)에 6.6 내지 6.8의 임계 범위에 있었다. 바람직하게, 감염시의 pH 값은 약 7.2 내지 7.4이어야 한다.
실시예 8: 바이러스 역가에 대한 트립신 활성의 변화의 효과 및 배지 교체 및 1:2 배지 희석의 효과
본 실험은 바이러스 감염시 여러가지 트립신 농도의 사용 및 배지 교체 및 1:2 배지 희석이 바이러스 역가에 어떠한 영향을 미치는 가를 조사하기 위한 것이었다.
진탕 플라스크에서 37 ℃, 8% CO 2 및 185 rpm으로 4 mM 피루베이트 및 글루타민이 첨가된 100 ml의 PEM 배지(Invitrogen)에서 영구 양막 세포주CAP-1D5를 배양했다. 상기 세포주는 배양의 시작시에 CAP-1D5 세포 적응형 A/PR/8/34 인플루엔자 바이러스(H1N1, RKI, Robert Koch Institute)로 감염시켰다. 배양시 세포의 수는 감염전 배지 교체가 없는 경우 배지 1 ml당 4.5 x 106 개 세포였고, 감염전 PEM 배지로 1:2로 희석한 경우 배지 1 ml당 2.3 x 106 개 세포였고, 감염전 배지를 완전히 교체한 경우 5 x 106 개 세포/ml였다. 또한, 배지 교환이 없는 배양 및 PEM 배지로 1:2로 희석한 배양에서는 1 x 10-4 U/cell, 3 x 10-5 U/cell, 및 5 x 10-5 U/cell의 트립신 농도가 이용되었다. 배지를 완전히 교체한 배양의 경우, 1 x 10-4 U/cell, 1 x 10-5 U/cell, 5 x 10-5 U/cell 및 1 x 10-6 U/cell의 트립신 농도를 이용하거나 트립신을 이용하지 않았다.
그 결과는 도 7에서 나타낸다. 새로운 PEM 배지를 이용한 1:2 희석은 배지 교환이 없는 배양의 2.30 log HA와 비교하여 HA- 2.70 log HA의 초기 증가(24 시간이 아닌 약 12 시간) 및 더욱 높은 최대 속도로 이어졌다. 완전한 배지 교체는 3.0 log HA를 초과하는 HA 값의 증가로 이어졌다.
배지 교환이 없는 배양 및 PEM 배지로 1:2로 희석한 배양의 경우, 트립신 농도에 상관없이 매우 유사한 log HA 값이 확인되었다. 완전한 배지 교환이 이루어진 배양의 경우, 1 x 10-5 U/cell, 5 x 10-5 U/cell 및 1 x 10-6 U/cell의 트립신 농도에서 log HA 값의 추이는 유사했다. 트립신이 없는 배양의 경우, log HA 값은 겨우 약 2 log HA-units/100 ㎕의 값에 도달했고, 1 x 104 U/cell 트립신이 감염에 사용된 배양의 경우, log HA 값은 1 log HA-unit/100 ㎕ 미만이었다.
실시예 9: 감염전 배지를 교환하거나 교환하지 않고 여러 가지 적응형 인플루엔자 바이러스 변종을 이용한 PEM 배지에서 CAP -1 D5 세포의 감염의 MOI (감염 다중도) 의존성
본 실험에서는, MOI 값, 즉 감염에 사용된 입자의 수와 감염될 CAP-1D5 세포의 수의 수치비와 바이러스 역가(배양액 100 ㎕ 당 log HA 단위수) 사이의 의존성을 조사했다.
따라서, 영구 양막 세포주 CAP-1D5를, 진탕 플라스크에서 37 ℃, 8% CO2 및 185 rpm으로 각각 4 mM의 피루베이트 및 글루타민이 첨가된 50 ml의 PEM 배지에서 배양했다. 감염전 배양의 배지를 교체하거나 교체하지 않고 MOI-의존성을 시험했다. 하기와 같은 세 종의 적응형 인플루엔자 변종을 사용했다: A/PR/8/34 (RKI, Robert Koch Institute), A/Brisbane/59/2007 (IVR-148, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) 및 B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control). 감염은 4.9 x 106 개 세포/mL (배지 교체 없음) 및 5.0 x 106 개 세포/mL (배지 교체함)의 세포 농도로 50 mL 진탕 플라스크에서 이루어졌다. 감염은 배지 교체가 수행되지 않은 경우 0.25 및 0.10 (A/Brisbane 인플루엔자 바이러스의 경우), 0.025 및 0.0025의 MOI 값에서 수행되었고, 배지 교체가 이루어진 경우 0.10 및 0.06 (A/Brisbane 인플루엔자 바이러스의 경우), 0.025 및 0.0025의 MOI 값에서 수행되었다. 배지 교체가 없는 경우, 트립신 활성은 1 x 104 U/cell 였고, 배지 교체가 있는 경우, 트립신 활성은 1 x 106 U/cell 였다. 그 후, 144 시간에 걸친 바이러스 입자의 양((log HA-Units/100 ㎕)을 측정했다(Kalbfuss et al, 2008; Biologicals 36 (3) :145-61).
그 결과는 도 8에서 나타낸다. 배지 교체의 실시는 바이러스 복제의 더욱 일관성있는 결과로 이어졌다. 낮은 MOI 의존성은 배지 교체가 없고 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염된 세포 및 배지 교체가 있고 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane로 감염된 세포에서만 볼 수 있었다. 배지 교체가 있는 경우, 상당히 더 높은 log HA 값이 도달될 수 있었다. 배지 교체가 없는 경우의 pH 값은 부분적으로 6.6 내지 6.8의 임계 범위에 있었고, 배지 교체가 있는 경우 7.3 내지 7.5의 범위에 있었다.
실시예 10: 감염 (A/ PR /8/34 적응형)을 이용한 STR 및 Wave 바이오반응기에서 1 리터 규모의 추가 배양
한 가지 접근 방법(B16)에 있어서, 120 rpm, pH = 7.2 및 40%의 순수 산소의 산소 부분압 pO2 에서 4 mM 글루타민 및 4 mM 피루베이트가 첨가된 PEM 배지에서 1 리터 바이오반응기 STR (Sartorius)에서 CPA-ID5 세포를 배양했다. 초기 세포 농도는 5 x 105 개 세포/mL였다. 72.75 시간 증식 및 2.1 x 106 개 세포/ml의 세포 농도 후, CAP-1D5 세포를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34(적응형: PEM에서, 4차 계대, 2.01 x 106 개 바이러스/mL)로 감염시켰다. 배지 교체는 이루어지지 않았다. MOI 값은 0.025였고, 3 x 10-5 U/mL의 최종 농도의 트립신을 첨가했다.
또 다른 접근 방법(B26)에 있어서, 120 rpm, pH = 7.4 내지 7.2 및 40%의 순수 산소의 산소 부분압으로 PEM 배지에서 1 리터 바이오반응기 STR (Sartorius)에서 CAP-1D5 세포를 배양했다. 초기 세포 농도는 8 x 105 개 세포/mL 였다. 92 시간 증식 후, CAP-1D5 세포(적응형: PEM, 4차 계대, 3.75 x 106 개 바이러스/ml)를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염시켰다. 사전에, 완전한 배지 교체를 실시했고, pH 값은 7.6으로 조정했다. MOI 값은 0.025 였고, 3 x 10-5 U/mL의 최종 농도의 트š긴을 첨가했다.
세 번째 접근 방법에 있어서(wave), 13 rpm의 락킹 주파수(rocking frequency), 7°의 각도, pH = 7.3 내지 6.9, 40%의 순수산소의 산소 부분압pO2 및 7.5%의 CO2 부분압으로 4 mM 글루타민, 4 mM 피루베이트 및 20 mM 글루코스가 첨기된 PEM 배지를 갖는 1 리터 바이오반응기 Wave (Wave Biotech)에서 CAP-1D5 세포를 배양했다. 초기 세포 농도는 5 x 105 개 세포/mL였다. 72 시간 증식 후, CAP-1D5 세포(적응형: PEM, 4차 계대, 1.87 x 106 개 세포/ml)를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염시켰다. 감염전 세포 농도는 2.1 x 106 개 세포/ml 였다. 배지 교체는 실시하지 않았다. MOI 값은 0.025 였고, 트립신은 3 x 10-5 U/mL의 최종 농도로 첨가했다.
네 번째 접근 방법에 있어서는, MDCK.SUS2 세포를 AEM 배지를 이용하여 1 리터 바이오반응기 STR (Sartorius)에서 배양했다. 초기 세포 농도는 5 x 105 cells/mL 였다. 118.25 시간의 증식 후, MDCK.SUS2 세포를 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 감염시켰다(Lohr et al., Vaccine, 2010, 28 (38) :6256-64).
그 결과는 도 9에서 나타낸다. 192 시간에 걸쳐서, 생존 세포 농도 및 죽은 세포 농도를 측정하고, pH 값 및 배지에서 글루코스, 락토오스, 글루타민, 암모늄, 글루탐산 및 피루베이트의 농도도를 측정했다. 또한, 감염 시기로부터, log HA-단위수/100 ml 및 TCID50 값을 검출했다(Genzel and Reichl, Vaccine production determined - state of the art and future needs in upstream processing in Methods in Biotechnology: Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Eds R. Portner; Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2007, 457-473; Kalbfuss et al, 2008; Biologicals 36 (3) :145-61).
CAP-1D5 세포는 MDCK.SUS2 세포와 비교하여 세 개의 모든 접근 방법에서 더욱 빠르게 더욱 높은 밀도로 성장했다. CAP-1D5 세포 배양액의 바이러스 역가(log HA-단위수/100 ㎕)는 최대 약 2.5의 값에 도달했다. 세포 배양액 MDCK.SUS2의 바이러스 역가(log HA-단위수/100 ㎕)는 3의 최대값에 도달했다. CAP-1D5-세포 배양액의 바이러스 역가는 MDCK.SUS2 세포 배양액의 바이러스 역가와 비교하여 더욱 이른 시기에 증가했다.
실시예 11: 감염전 완전한 배지 교체 및 1:1 배지 교체의 경우 PEM 또는 293SFMII 배지를 이용한 진탕 플라스크에서 바이러스 수율을 증가시키기 위한 배양 실험
진탕 플라스크에서 배양되는 CAP-1D5-세포 배양시 바이러스 수율을 최적화하기 위하여, CAP-1D5 세포를 293SFMII (Invitrogen) 및 PEM (Invitrogen) 배지에서 배양하고 1:1 배지 교체 또는 완전한 배지 교체를 수행했다.
100 ml 진탕 플라스크에서 37 ℃, 8% CO 2 및 100 rpm으로 4 mM 글루타민 및4 mM 피루베이트가 첨가된 50 ml의 PEM 배지에서 영구 양막 세포주 CAP-1D5를 배양했다. 0.025의 MOI의 적응형 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34로 세포를 감염시키기 전, 배지 교체를 수행했다. 1:1 배지 교체가 수행된 경우, 1 x 10-5 U/cell의 트립신 농도를 세포 감염에 사용했다. 완전한 배지 교체가 이루어진 경우, 1 x 10-6 U/cell의 트립신 농도를 세포 감염에 사용했다. 배지 교체는 PEM 배지 및 293SFMII 배지를 이용하여 수행했다. 감염시 세포 농도는 5 x 106 cells/ml 였다.
그 결과는 도 10에서 나타낸다. 72 시간에 걸쳐서, 생존 세포 농도, 생존율, pH 값 및 log HA-units/100 ㎕를 표준 방법을 이용하여 헤마글루티닌의 적정을 통해 측정했다(Lohr et al., Vaccine, 2009, 27 (36), 4975 -4982; Genzel et al, Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 88 (2):461-75).
인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 이용한 감염전 완전한 배지 교환이 수행된 세포 배양액에서의 바이러스 역가는, 1:1 배지 교환이 이루어진 세포 배양액에서의 바이러스 역가보다 빠르게 증가했다. 또한, 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 이용한 감염전 완전한 배지 교체가 실시된 세포 배양액의 바이러스 역가는 1:1 배지 교환이 이루어진 세포 배양액의 바이러스 역가보다 더욱 높은 최고 바이러스 역가에 도달했다.
완전 배지 교환이 이루어진 감염전의 세포 배양액의 생존 세포 농도는 24 시간후 5 x 106 개 세포/ml로부터 감소하여, 48 시간 후 약 2 x 104 개 세포/ml가 되었다. 감염전 PEM 배지로 1:1 배지 교환이 이루어진 세포 배양액은 덜 강하게 감소했다. 이러한 경우, 72 시간 후 생존 세포 농도는 약 7 x 105 개 세포/ml였다.
72 시간의 전체 기간 동안 모든 세포 배양액의 pH 값은 7.6 내지 7.2 였다.

Claims (15)

  1. 인플루엔자 바이러스 백신의 제조 방법으로서,
    a) 영구 인간 양막 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고,
    b) 상기 영구 인간 양막 세포를 배양하고,
    c) 상기 인플루엔자 바이러스를 발현시키고,
    d) 상기 영구 인간 양막 세포를 포함하는 배지로부터 상기 인플루엔자 바이러스를 분리하는 것을 포함하고,
    상기 영구 인간 양막 세포는 아데노바이러스의 유전자 생성물인 E1A 및 E1B를 발현하는 것인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스를 이용한 감염시 상기 영구 인간 양막 세포는 대수 증식기에 있는 세포이거나 대수 증식기와 정체기의 사이에 있는 세포인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 d)에서 배지로부터 인플루엔자 바이러스의 분리는 밀도 구배 차별 또는 침강 원심분리를 통해 수행되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 아데노바이러스의 유전자 생성물인 E1A 및 E1B은 Genbank Acc. No. X02996에서 주어지는 인간 아데노바이러스 혈청형-5 서열의 뉴클레오티드 1 내지 4344, 505 내지 3522, 또는 505 내지 4079에 의해 암호화되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영구 인간 양막 세포는 아데노바이러스의 유전자 생성물인 아데노바이러스 단백질 IX(pIX)를 발현하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스를 이용한 감염시 1 x 10-4 U/cell, 1 x 10-5 U/cell, 3 x 10-5 U/cell, 5 x 10-5 U/cell 또는 1 x 10-6 U/cell의 농도의 트립신이 첨가되는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스를 이용한 감염시 0.001 내지 0.3의 범위의 MOI 값으로 표시되는 바이러스 양이 사용되는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 인간 인플루엔자 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스 또는 돼지 인플루엔자 바이러스인 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 바이러스 변종인 A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007, A/Brisbane/59/2007, B/Florida/4/2006, 돼지 인플루엔자 (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) 또는 말 인플루엔자 (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8))로부터 선택되는 것인 방법.
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