MX2013001772A - Linea celular de amniocitos humanos permanente para la produccion de virus de influenza. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza mediante células de amniocitos humanos permanentes, así como al uso de una célula de amniocitos humanos permanente para la producción de una vacuna que tiene como base un virus de influenza.

Description

LINEA CELULAR DE AMNIOCITOS HUMANOS PERMANENTE PARA LA PRODUCCION DE VIRUS E INFLUENZA DESCRIPCION PE LA INVENCION La presente invención se refiere a un método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza mediante células de amnipcitps humanos permanentes, así como al uso de una célula de amniocito humano permanente para la producción de una vacuna que tiene como base un virus de influenza.

La vacunación protectora constituye la medida más importante en el sector salud para evitar enfermedades que son ocasionadas por la epidemia de influenza anual. El uso exitoso de vacunas depende $e que se puedan unir a disposición lo más rápido posible cantidades suficientemente grandes de material para vacunas, por ejemplo virus exterminados de fuentes estables y fácilmente manipulables . El rápido desarrollo de vacunas y su suficiente disponibilidad son decisivos en el combate de muchas enfermedades humanas y animales. En virtud de los retrasos en la producción de vacunas y las mermas cuantitativas se pueden presentar problemas en el combate de las apariciones de la enfermedad. En consecuencia, los esfuerzos más recientes se concentran en el cultivo de virus en cultivo celular para el uso como vacunas.

Ref.: 239247 Hasta ahora las vacunas de influenza obtenibles se producen en huevos de gallina incubados . Estos huevos de gallina tienen que estar comprobadamente libres de determinadas contaminaciones virales y bacterianas. Estos denominados huevos de gallina libres de patógenos específicos (SPF, por sus siglas en inglés) se obtienen comercialmente . A pesar de que los huevos de gallina comprobaron ser muy adecuados en la multiplicación de virus animales y humanos, tienen algunas desventajas en la producción de vacunas. En virtud de que para la producción de una dosis de una vacuna convencional se requiere en cada caso de un huevo de gallina, existe por ejemplo en el caso de una pandemia una elevada necesidad de huevos de gallina para la producción de vacunas. En virtud de la limitada disponibilidad de huevos de gallina se debe contar con un precurso de aproximadamente un año para el suministro de huevos de gallina en una cantidad suficiente. Además existen subtipos de influenza que son altamente patógenos para gallinas, de manera que en el caso de una pandemia se podrían presentar cuellos de botella en el suministro de huevos de gallina. Además el proceso de producción es muy intensivo en costos y toma mucho tiempo. Una desventaja adicional de la producción de vacunas en huevos de gallina es que la mayoría de las veces las vacunas no están exentas de albúmina de gallina y por consiguiente se pueden producir reacciones alérgicas en algunos pacientes. No por último, la posible selección de subpoblación que difiere del virus de origen natural requiere de sistemas de células huésped alternativos.

Contrariamente a los huevos de gallina, las células para la producción de vacunas de gripe que tienen como base un cultivo celular siempre están disponibles. Se almacenan ultra-congeladas y en todo momento se pueden descongelar y multiplicar a corto plazo en la cantidad necesaria en caso de requerirse. Por lo tanto es posible comenzar en cualquier momento deseado con la producción de vacunas . En el caso de un requerimiento inesperadamente alto o también si se propagan inesperadamente nuevas cepas de virus es posible poner a disposición a corto plazo una vacuna correspondiente.

El proceso de producción mediante cultivo celular permite la producción de virus como vacunas en un sistema cerrado estandarizado en condiciones controladas definidas. En virtud del proceso de producción controlado, la vacuna de gripe lista no requiere la adición de antibióticos. En virtud de que la producción de las vacunas de influenza en cultivo celular se efectúa totalmente independiente de huevos de gallina, la vacuna producida de esta manera no tiene albúmina de gallina y por consiguiente no puede desencadenar reacciones alérgicas debidas a intolerancias de albúmina de gallina.

Actualmente se usan para la producción de vacuna de influenza principalmente las tres líneas celulares siguientes, las células PER.C6 humanas, las células Madin Darby Canine Kidney (MDCK) y las células de riñon de primate cercopithecus (Vero) . Adicionalmente se desarrollan actualmente una línea celular de retina de pato (AGE1.CR) y líneas de células primitivas de ave embrionales . Es cierto que la producción de vacunas en células de mamíferos constituye una alternativa a la producción de vacunas que tienen como base los huevos de gallina, pero sin embargo estas células requieren de suero y/o la adhesión sobre un soporte sólido para su multiplicación. Esto dificulta y por consiguiente encarece la producción de las vacunas en estas células, ya que por motivos de seguridad es necesario separar completamente el suero y la multiplicación en soportes sólidos es limitado y con ello conduce a rendimientos menores .

Una ventaja de la producción de vacunas en células de mamíferos consiste en que el aislamiento y la replicación del virus en el cultivo celular no se produce una selección de un fenotipo dependiente de pasajero que difiere del tipo salvaje clínico. Por este motivo la glucoproteína viral hemaglutinina, por vía de la cual se efectúa la adhesión a la célula que se deberá infectar y la integración del virus en la célula, se debería expresar en una forma nativa y mediante ello tener una mejor especificidad y avidez y · por consiguiente permitir una inmunidad mediada por célula en el humano .

Por este motivo la invención tiene por objeto proporcionar líneas celulares humanas permanentes mejoradas para la producción de vacunas que tienen como base el virus de influenza.

Este problema se resuelve mediante el objeto definido en las reivindicaciones.

Las figuras explican la invención.

Figuras 1A a 1G muestra esquemáticamente el desarrollo de diferentes parámetros durante el cultivo de la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 en medio 293SFMII (·) , la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 en medio PEM (T) y la línea celular de riñon canino permanente MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney) en medio SMIF8 (¦) en matraces vibratorios de 100 mi. En la figura 1A se representa gráficamente el desarrollo del número de células vivas el comparativo de las tres líneas celulares, en la figura IB el desarrollo del número de células muertas de las líneas celulares y en la figura 1C el desarrollo de la tasa de supervivencia de las líneas celulares. Las figuras ID a 1G muestran esquemáticamente el desarrollo del valor pH (Fig. ID) , de la concentración de glucosa (símbolos claros) y lactosa (símbolos oscuros) (Fig. 1E) , de la concentración de glutamina (Gln) (símbolos claros) y amonio (símbolos oscuros) (Fig. 1F) yx la concentración del ácido glutámico (Glu) (símbolos claros) y piruvato (símbolos oscuros) (Fig. 1G) .

Figura 2 muestra un diagrama de columnas que reproduce los índices de virus medidos como valor TCID50 mediante 4 pasadas de las cepas de influenza A/PR/8/34 (H1N1) y A/Uruguay/716/2007 (H3N2) en células CAP-1D5 en medio 293SFMII y PEM. Abreviaturas: A/PR 293: cepa de influenza A/PR/8/34 (H1N1) en células CAP-1D5 en medio 293SFMII; A/PR PEM: cepa de influenza A/PR/8/34 (H1N1) n células CAP-ID5 en medio PEM; A/Urug 293: cepa de influenza A/Uruguay/716/2007 (H3N2) en células CAP- ID5 en medio 293SFMII; A/TJrug PEM : cepa de influenza A/Uruguay/716/2007 (H3N2) en células CAP-1D5 en medio PEM; el valor TCID50 es el índice viral en número de virus/ml que se requiere para infectar 50% de las células huésped.

Figuras 3A a 3F muestran esquemáticamente el desarrollo de la cantidad de partículas de virus indicado como unidades log HA (hemaglutinina) /100 µ? y del númerp de células vivas al cultivar las células de amniocitos permanentes CAP- ID5 en medio 293SFMII (Figuras 3A, 3B) y PEM (Figuras 3C; 3D) , así como de las células de riñon canino permanentes MDCK.SUS2 en medio SMIF8 (Figuras 3E, 3F) tras la infección de las células con la cepa de virus de influenza A/PR/8/34 con el uso de diferentes cantidades de virus indicadas como valores MOI (multiplicidad de infección, por SUS siglas en inglés) : MOI: 0.0025 (?) ; MOI : 0.025 (?) . MOI : 0.25 (?) . MOI reproduce la relación de número de partículas infecciosas a células objetivo.

Figuras 4A a 4D muestran esquemáticamente el desarrollo de diferentes parámetros durante el cultivo de la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 en medio PEM en el bioreactor de 1 litro, siendo que la infección tiene lugar con el virus de influenza A/PR/8/34 (adaptado) tras 114 h con una cantidad de virus indicada como MOI de 0.025. En la figura 4A se representa el desarrollo esquemático del número de células vivas (A) , número de células muertas (?) y de la tasa de supervivencia (A) de las células. En la figura 4B está indicada la cantidad de partículas de virus como unidades log HA (hemaglutinina) /100 µ? (A), representada esquemáticamente la concentración de glutamato (?) y piruvato (·) en el medio. La figura 4C muestra esquemáticamente el desarrollo del valor H (?) y a la figura 4D el desarrollo de la tendencia a la infección (en TCID50/ml) . El valor TCID50 es el índice viral en número de virus/ml que se requiere para infectar 50% de las células huésped.

Figuras 5A y 5B muestran diagramas de columna que reproducen el índice viral medido como unidades log HA /100 µ? (Fig. 5A) o valor TCID50 (Fig. 5B) mediante 4 pasadas de las cepas de influenza A/Brisbane/59/2007 , B/Florida/4/2006 , influenza porcina (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) e influenza equina (A/Equine, A/Newmarket/l/93 (H3N8)) en células CAP-1D5 en medio 293SFMII y PEM. Abreviaturas: A/Bris 293: cepa de influenza A/Brisbane/59/2007 en células CAP-1D5 en medio 293SFMII; A/Bris PEM: cepa de influenza A/Brisbane/59/2007 en células CAP-1D5 en medio PEM; B/Flor 293: cepa de influenza B/Florida/4/2006 en células CAP-1D5 en medio 293SFMII; B/Flor PEM: cepa de influenza B/Florida/4/2006 en células CAP- ID5 en medio PEM; Schw 293: cepa de influenza A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00 en células CAP-1D5 en medio 293SFMII; Schw PEM: cepa de influenza A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00 en células CAP-1D5 en medio PEM; Pferd 293: cepa de influenza A/Equine, A/Newmarket/l/93 (H3N8) en células CAP-ID5 en medio 293SFMII; Pferd PEM: cepa de influenza A/Equine, A/Newmarket/l/93 (H3N8) en células CAP- ID5 en medio PEM; el valor TCID50 es el índice viral en número de virus/ml que se requiere para infectar 50% de las células huésped.

Figuras 6A y 6B muestran esquemáticamente el desarrollo de la concentración de número de células vivas y del valor pH en el cultivo de la línea celular de amniocitos permanente CAP- ID5 en 100 mi de medio PEM en el matraz vibratorio, siendo que el número de células inicial es de 5 x 105 células/ml y el medio contiene adicionalmente 4 mM de piruvato (¦) o el número de células inicial es de 8 x 105 células/ml y el medio contiene adicionalmente 4 mM de piruvato (?) 9 el número de células inicial es de 8 x 105 células/ml y el medio contiene adicionalmente 10 mM de piruvato además de aminoácidos adicionales (·) .

Figuras 7A a 7C muestran esquemáticamente el desarrollo del índice viral medidos en unidades log HÁ /100 µ? de cultivo, siendo que las células CAP-ID5 se infectaron con la cepa de influenza adaptada A/PR/8/34. Antes de la infección o bien no se llevó a cabo un cambio de medio (Fig. 7A) , o bien se efectuó una dilución 1:2 con medio PEM (Fig. 7B) o un cambio de medio completo. La figura 7A muestra el desarrollo esquemático del índice viral de cultivos celulares CAP-1D5 sin cambio de medio, siendo que en la infección se utilizaron diferentes concentraciones de tripsina de 1 x 10"4 U/célula (¦), 3 x 10-5 U/célula (A) y 5 x 10"5 U/célula (¦) . La figura 7B muestra el desarrollo esquemático del índice viral de cultivos celulares CAP-1D5 con una dilución 1:2 con medio PEM, siendo que en la infección se utilizaron diferentes concentraciones de tripsina de 1 x 10"4 U/célula (?) , 3 x 10"5 U/célula (A) y 5 x 10"5 U/célula (¦) . La figura 7C muestra el desarrollo esquemático del índice viral de cultivos celulares CAP-1D5 con cambio de medio completo, siendo que en la infección o bien no se utilizó tripsina (*) o diferentes concentraciones de tripsina de 1 x 10~4 U/célula (A), 1 x 10"5 U/célula (?) , 5 x 10"5 U/célula (¦) y 1 x 10'6 U/célula (X) .

Figuras 8A a 8F muestran esquemáticamente el desarrollo del índice viral en cultivos celulares CAP-1D5 que se infectaron con los virus de influenza A/PR/8/34, A/Brisbane/59/2007 o B/Florida/4/2006 , siendo que antes de la infección se efectuó un cambio de medio (Figuras 8A a 8C) o no (Figuras 8D a 8F) . La infección con la cepa de influenza A/PR/8/34 y B/Florida/4/2006 se efectuó en cada caso con cantidades de virus indicadas como valor MOI de 0.25, 0.025 y 0.0025. La infección con la cepa de influenza A/Brisbane/59/2007 se efectuó en cada caso con los valores MOI de 0.1, 0.025 y 0.0025. MOI reproduce la relación del número de partículas infecciosas a células de objetivo.

Figuras 9A y 9B muestran esquemáticamente el desarrollo de la concentración de número de células vivas y del índice viral de cultivos celulares CAP-1D5 (B16, B26 y Wave) y un cultivo (MDCK) de células de riñon canino MDCK.SUS2 que se infectaron con el virus de influenza adaptado A/PR/8/34 y que se cultivaron en la graduación de 1 litro en bioreactores STR (Sartorius) (B16, B26 y MDCK) o Wave (Wave Biotech AG) (Wave) . Antes de la infección tuvo lugar un cambio de medio en los cultivos B26 y Wave.

Figuras 10A a 10C muestran esquemáticamente el desarrollo del índice viral medido en unidades log HA /100 µ?, del número de células vivas y del valor pH de cultivos celulares CAP-1D5 que se infectaron con el virus de influenza adaptado A/PR/8/34 y se cultivaron en 100 mi de medio PEM en el matraz vibratorio. Antes de la infección tuvo lugar o bien un cambio de medio 1:1 (símbolos claros) con medio 293SFMII (?) o medio PEM (O) o un cambio de medio completo (símbolos oscuros) con medio 293SFMII (¦) o medio PEM (?) .

Por el concepto "virus de influenza" según se utiliza aquí se entienden miembros de los ortomixovirus que pueden infectar a humanos y animales. Se diferencian virus de influenza de los tipos A, B y C. Los virus de influenza A y B se reúnen en un género. Los virus de influenza C se diferencian en virtud de sus siete segmentos de genoma, en los virus e influenza A y B son oc segmentos de genoma. Además, los virus de influenza A y B codifican para respectivamente una hemoglutinina (HA) y una neuroaminidasa (NA) , en cambio los virus de influenza C codifican para una proteína superficial que reúne ambas propiedades, la proteína de fusión hemoglutinina-esterasa (HEF) . Los virus de influenza A se subdividen en subtipos con base en la secuencia de las moléculas de hemoglutinina (H1-H15) y neuroaminidasa (N1-N9) .

Por el concepto "proteína de virus de influenza" como según se usa aquí se entienden proteínas o derivados del virus de influenza. Un derivado del virus de influenza es típicamente una proteína o una parte de esta del virus de influenza que se puede utilizar para fines de inmunización.

Las proteínas o derivados del virus de influenza comprenden proteínas de la membrana del virus o partes de esta. En particular las proteínas de virus de influenza comprenden proteínas de influenza A, proteínas de influenza B o proteínas de influenza C, por ejemplo hemoglutinina (HA), neuro aminidasa (NA) , núcleo proteína (NP) , las proteínas de matriz (MI) y (M2) , las proteínas de polimerasa (PB1) , (PB2) y (PA) y las proteínas no estructurales (NS1) y (NS2) y partes de estas . Las partes de las proteínas de virus de influenza comprenden uno o varios epitopes de las proteínas de influenza A, proteínas de influenza B o proteínas de influenza C. Los epitopes pueden ser epitopes de células T CD4+ que representan péptidos que contienen un motivo de enlace de la clase MHC-clase-II y que se representa en la superficie de células que presentan antigeno mediante moléculas de la MHC-clase-II, o epitopes de células T CD8+ que representan péptidos que contienen un motivo de enlace de la clase MHC-clase-I y que se representa en la superficie de células que presentan antigeno mediante moléculas de la MHC-clase-I . Por ejemplo, los modelos algorítmicos permiten pruebas de enlace MHC procesos de identificación de antigeno in silico y procesos de cristalografía de rayos X permiten la identificación de antígenos que pueden enlazar diferentes moléculas MHC.

Por el concepto de "vacuna" como se utiliza aquí se entiende un antígeno producido en forma biológica o mediante técnica genética que comprende proteínas, subunidades de proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos, ácidos nucléicos, virus muertos o debilitados, siendo que en este caso se puede tratar de partículas de virus completas o partes de partículas de virus o de combinaciones de estas . El antígeno puede presentar al menos un epitope, por ejemplo un epitope de células T o células B. Este antígeno es reconocido por los receptores inmunológicos como receptor de células T o receptor de células B. La vacuna sirve tras la aplicación para activar selectivamente el sistema inmune con respecto a un virus determinado. Se aprovecha la reacción del sistema inmune de generar una respuesta inmune en el caso de existencia de virus o bien de sus antígenos específicos. Esto conduce a la formación de anticuerpos y células asistentes T especializadas que pueden ofrecer una protección prolongada contra la enfermedad respectiva que en función del virus puede durar de entre unos años hasta toda la vida. Las vacunas comprenden vacunas vivas o muertas . La vacuna viva contiene por ejemplo virus debilitados todavía capaces de reproducirse los cuales no pueden desencadenar la enfermedad. En cambio, en el caso de una vacuna muerta estos virus murieron o ya sólo contiene fracciones del virus (antígenos) . La desactivación (extinción) de los virus se efectúa por ejemplo mediante sustancias químicas, por ejemplo formaldehido, beta-propiolactona y psoralen. La membrana del virus se conserva. También existen vacunas toxoides que solamente contienen el componente biológicamente inactivo (toxoide) de la toxina (por ejemplo el toxoide de tétano) , que también se cuentan entre las vacunas. En particular, en el caso de la vacuna se puede tratar de una vacuna escindida que consta de fracciones de las proteínas de la membrana del virus. La destrucción o escisión de la membrana del virus se puede efectuar por ejemplo con detergentes o disolventes orgánicos fuertes. Adicionalmente también es posible desactivar o matar los virus con sustancias químicas. Además se cuentan entre las vacunas muertas las vacunas de subunidad que constan de componentes específicos del virus, por ejemplo proteínas de hemoglutinina y neuroaminidasa.

Por el concepto de "vacuna que tiene como base el virus de influenza" como se usa en este documento se entienden todas las proteínas, péptidos o sus partes, así como ácidos nucléicos que codifican para estas proteínas, péptidos o partes de estas del virus de influenza, así como las partículas de virus de influenza mismas, proteínas de virus de influenza recombinantes , inclusive proteínas de envoltura de influenza, partículas subvirales, partículas similares a virus (VLP, por sus siglas en inglés) , complejos VLP, y/o partes de estos, que se pueden usar para fines de inmunización contra influenza.

Por el concepto de "adyuvante" como se usa aquí se entienden sustancias que pueden modular la inmunogenidad del antígeno. Los adyuvantes son por ejemplo sales minerales, mezclas de escualeno, péptidos muramil, derivados de saponina, preparaciones de pared celular microbacterianas , determinadas emulsiones, monofosforil-lípido-A, derivados de ácido micólico, agentes tenso-activos de copolímero bloque no iónicos, quil A, subunidad de la toxina B de cólera, polifosfacenos y sus derivados, complejos inmunoestimulantes , adyuvantes de citocina, adyuvante MF59, adyuvantes lípidos, adyuvantes mucosales, determinadas exotoxinas de bacterias, determinados oligonucleótidos y PLG.

Por el concepto de "amniocitos" como se usa aquí se entienden células que están presentes en el líquido amniótico y que se pueden obtener mediante punción del líquido amniótico. Provienen o bien del amnios o del tejido fetal que está en contacto con el líquido amniótico que está en contacto con el líquido amniótico. Se describieron tres clases principales de amniocitos, que se diferencian en virtud de criterios morfológicos: células de tipo fibroblasto (células F) , células epiteloides (células E) y células de líquido amniótico (Amniotic Fluid Cells, células AF) (Hohn et al., Pediat. Res. 8:746-754, 1974). Las células AF son el tipo de célula predominante.

Por el concepto de "líneas celulares permanentes" como se usa en este documento se entienden células que están modificadas genéticamente de manera que con las condiciones de cultivo adecuadas se pueden seguir multiplicando permanentemente en el cultivo celular. Estas células también se denominan células inmortalizadas.

Por el concepto de "células primarias" como se usa en este documento se entienden células que se obtienen mediante extracción directa de un organismo o un tejido y se ponen en cultivo. Las células primarias solamente tienen una duración de vida muy limitada.

Por el concepto de "transfección" como se usa en este documento se entiende cada proceso que es adecuado para introducir el/los ácido (s) nucleico (s) en las células. Como ejemplo se mencionan el método de fosfato de calcio cl sico, electroporación, sistemas liposomales de cualquier tipo y combinaciones de estos métodos.

Por el concepto de "CAP" como se usa en este documento se entienden líneas celulares de amniocitos humanoss permanentes que mediante la inmortalización de amniocitos humanos primarios se generaron con funciones génicas adenovirales E1A y E1B.

Por el concepto de "CAP-T" como se utiliza en este documento se entienden células CAP que adicionalmente fueron transfectadas de manera estable con una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia del antígeno T de tamaño SV4O .

Un objeto de la presente invención se refiere a un método para la producción de una vacuna basada en el virus de influenza que comprende las etapas siguientes: (i) Hacer entrar en contacto un virus de influenza con una célula humana permanente, (ii) Cultivar la célula humana permanente, (iii) Permitir la expresión del virus de influenza, y (iv) Aislar el virus de influenza del medio.

En el método de conformidad con la invención se cultivan células humanas permanentes en condiciones (por ejemplo temperatura, medio, valor pH) que son adecuadas para la multiplicación de las células. Así, las condiciones con respecto a la temperatura, el medio, el valor pH y otros parámetros de multiplicación son conocidas por el experto o se pueden determinar con los procesos usuales . Cuando el cultivo alcanzó una densidad de multiplicación deseada se agregan los virus de influenza para infectar las células. Los virus requieren de varios días para multiplicarse dentro de las células. Durante este proceso de multiplicación muere una gran parte de las células y los virus son liberados dentro del medio. La solución que contiene virus se separa de los residuos celulares, por ejemplo mediante centrifugado. Entonces el virus se puede separar de la solución del medio por medio de por ejemplo una columna de cromatografía y reducir el volumen. A continuación los virus se pueden desactivar, por ejemplo mediante un proceso químico. Después de esto puede seguir una escisión de virus. Después de etapas de purificación y concentración adicionales se obtiene el concentrado de antígeno de la cepa de virus .

En una modalidad preferida, para la infección de las células humanas permanentes se usan las cepas de virus de influenza A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007 , A/Brisbane/59/2007 , B/Florida/4/2006, influenza porcina (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00 o influenza equina (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8) ) .

En otra modalidad preferida, los virus de influenza utilizados para la infección de las células humanas permanentes previamente se adaptan a las células, preferiblemente se trata en este aspecto de los virus de influenza listados en lo precedente. Una adaptación de este tipo se efectúa preferiblemente mediante 4 pasadas. Preferiblemente la adaptación de los virus de influenza se efectúa en medio 293SFMII o medio PEM.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un método para producir una vacuna basada en el virus de influenza que comprende las etapas siguientes : (i) Hacer entrar en contacto una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de virus de influenza con una célula humana permanente, (ii) Cultivar la célula humana permanente, (iii) Permitir la replicación de la molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de influenza y/o la expresión de la proteína de influenza, y (iv) Aislar del medio la molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de influenza y/o la proteína de virus de influenza.

En una modalidad preferida, en el caso de las células humanas permanentes utilizadas en el método de conformidad con la invención se trata de células de amniocitos humanos permanentes.

En una modalidad preferida de la presente invención, las células humanas permanentes se cultivan en matraces vibratorios o bioreactores , preferiblemente bioreactores STR o Wave . Las células humanas permanentes se pueden cultivar en diferentes medios, preferiblemente en medio 293SFMII o PEM. Adicionalmente es posible agregarle al medio piruvato, glutamina, glucosa y otros aminoácidos. Preferiblemente el medio contiene 4 mM o 10 mM de piruvato y otros aminoácidos .

En otra modalidad preferida de la presente invención, el número de células inicial de las células humanas permanentes es de 5 x 105 células/ml, más preferiblemente de 8 x 105 células/ml en el caso del cultivo en el matraz vibratorio.

En otra modalidad preferida de la presente invención, el valor pH del cultivo celular se encuentra en el momento de la infección en el intervalo de 7.1 a 7.8, más preferiblemente en el intervalo de 7.3 a 7.5, idealmente en el intervalo de 7.3 a 7.5.

En otra modalidad preferida de la presente invención, antes de la infección de las células humanas permanentes con virus de influenza se lleva a cabo un cambio de medio completo o una dilución 1:2 con medio.

En una modalidad preferida de la presente invención, para la infección de las células humanas permanentes con virus de influenza se usan concentraciones de tripsina de 1 x 10"4 U/célula, 1 x 10"5 U/célula, 3 x 10"5 U/célula, 5 x 10"5 U/célula o 1 x 10"6 U/célula. Si previamente a la infección de las células humanas permanentes no se efectúa un cambio de medio se usa preferiblemente una concentración de tripsina de 1 x 10"4 U/célula al infectar las células con virus de influenza. Si previamente a la infección de las células humanas permanentes se lleva a cabo una dilución 1:2 con medio, preferiblemente se usa una concentración de tripsina de 5 x 10"5 U/célula al infectar las células con el virus de influenza. Si previamente a la infección de las células humanas permanentes se lleva a cabo un cambio completo de medio, entonces preferiblemente se usa una concentración de tripsina de 5 x 10"6 U/célula al infectar las células con el virus de influenza.

En una modalidad preferida de la presente invención, para la infección de las células humanas permanentes se usa una cantidad de virus indicada como valor MOI en el intervalo de 0.001 a 0-3. En una modalidad preferida de la presente invención, para la infección de las células humanas permanentes se usa una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.25, 0.1, 0.06, 0.025 o 0.0025. En la infección de las células humanas permanentes con el virus de influenza A/PR/8/34 sin llevar a cabo un cambio de medio antes de la infección se usa preferiblemente una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.25, en la infección de las células humanas permanentes c n el virus de influenza A/Brisbane/59/2007 sin llevar a cabo un cambio de medio antes de la infección se usa una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.1. En la infección de las células humanas permanentes con el virus de influenza A/PR/8/34 en que se efectúa un cambio de medio antes de la infección se usa preferiblemente una cantidad de virus indicada como valor MQI de 0.1 o 0.25, en la infección de las células humanas permanentes con el virus de influenza A/Brisbane/59/2007 en que se efectúa un cambio de medio antes de la infección se usa una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.06 o 0.25, y en la infección de las células humanas permanentes con el virus de influenza B/Florida/4/2006 en que se efectúa un cambio de medio antes de la infección se usa una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.1, 0.025 o 0.0025.

En una modalidad preferida, el número de células en el momento de la infección se encuentra en un intervalo de 1 x 106 a 6 x 106 células/ml en el caso del cultivo en el matraz vibratorio. Preferiblemente el número de células al momento de la infección es de 2.3 x 106 células/ml, 4.5 x 106 células/ml o 5 x 106 células/ml. En una modalidad preferida de la presente invención el número de células en el momento de la infección es de 4.5 x 106 células/ml y antes de la infección no se efectúa un cambio de medio. En otra modalidad preferida de la presente invención el número de células en el momento de la infección es de 2.3 x 106 células/ml y antes de la infección se lleva a cabo una dilución 1:2 con medio PEM fresco. En otra modalidad preferida de la presente invención el número de células en el momento de la infección es de 5 x 106 células/ml y antes de la infección se lleva a cabo un cambio completo de medio.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, las células humanas permanentes se cultivan en el bioreactor STR (Sartorius) de 1 litro en medio PEM con 4 mM de glutamina y 4 mM de piruvato, siendo que el número de células inicial es de 5 x 105 células/ml y siendo que con un número de células de 2.1 x 106 células/ml se infecta con virus de influenza en una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.025 y antes de la infección no tiene lugar un cambio de medio. Preferiblemente la infección se efectúa en la presencia de tripsina en una concentración final de 3 x 10"5 U/ml.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, las células humanas permanentes se cultivan en el bioreactor STR (Sartorius) de 1 litro en medio PEM, siendo que el número de células inicial es de 8 x 105 células/ml y siendo que se infecta con virus de influenza utilizando una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.025 y previamente a la infección tiene lugar un cambio de medio. Preferiblemente la infección se efectúa en la presencia de tripsina en una concentración final 3 x 10"5 U/ml.

En otra modalidad particularmente preferida de la presente invención las células humanas permanentes se cultivan en el bioreactor Wave (Wave Biotech AG) de 1 litro en medio PEM con 4 mM de glutamina, 4 mM de piruvato y 20 mM de glucosa, siendo que el número de células inicial es de 5 x 105 células/ml y siendo que el número de células previamente a la infección es de 2.1 x 106 células/ml y se infecta con virus de influenza utilizando una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.025 y previamente a la infección no tiene lugar un cambio de medio. Preferiblemente la infección se efectúa en la presencia de tripsina en una concentración final 3 x 10"5 U/ml .

En una modalidad preferida de la presente invención las células humanas permanentes se cultivan en medio PEM con 4 mM de glutamina y 4 mM de piruvato en el matraz vibratorio, siendo que previamente a la infección de las células con virus de influenza se efectúa un cambio de medio utilizando una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.025 en la presencia de una concentración de tripsina de 1 x 10"6 /mi U/célula .

En una modalidad preferida de la presente invención las células humanas permanentes se cultivan en medio PEM con 4 mM de glutamina y 4 mM de piruvato en el matraz vibratorio, siendo que previamente a la infección de las células con virus de influenza se efectúa un cambio de medio 1:1 utilizando una cantidad de virus indicada como valor MOI de 0.025 en la presencia de una concentración de tripsina de 1 x 10"5 /mi U/célula.

En la producción de proteínas de influenza y moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína de influenza, las células humanas cultivadas se transfectan con moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína de influenza y a continuación la proteína de virus de influenza o las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína de influenza se aislan y purifican utilizando métodos conocidos.

En otra modalidad preferida las células humanas se encuentran en o entre la fase de multiplicación exponencial media y la fase de multiplicación estacionaria en el método de conformidad con la invención al momento de la infección con una partícula de virus o al momento de la transfección con una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de virus de influenza o una parte de este. Una curva de multiplicación típica en la que el número de células se aplica contra el tiempo tiene un desarrollo de curva sigmoidal. Comienza con lo que se llama una fase lag, seguida de la fase log o fase exponencial y la fase estacionaria. La fase de multiplicación exponencial media corresponde al primer punto de inversión de una curva de multiplicación típica, siendo que un punto de inversión es un punto en la curva de multiplicación en la que la forma del desarrollo de la curva varía de cóncavo a convexo o de convexo a cóncavo. La fase estacionaria comienza cuando la curva de multiplicación alcanza una meseta y por consiguiente el número de células permanece constante .

Los ácidos nucleicos que codifican para una proteína de influenza que se producen con el método de conformidad con la invención se pueden usar para la inmunización de ácidos nucleicos o como la denominada vacuna ADN. En la inmunización de ácidos nucleicos se inoculan antígenos inmunógenos, es decir antígenos que generan una respuesta inmune en el humano. Estos antígenos inmunógenos se codifican mediante ADN o ARN y están presentes como casetes de expresión o vectores de expresión o están integrados en vectores virales para inducir una respuesta inmune al producto génico. Las vacunas ADN pueden existir en diferentes sistemas de administración, por ejemplo como ADN o ARN, en forma de plasmidos o casetes de expresión lineales o circulares, siendo que estos están dotados con los elementos necesarios para la expresión, como por ejemplo promotor, sitios e poliadenilación, origen de replicación, etc. En una administración de ADN, esta se encuentra la mayoría de las veces en un regulador con o sin adyuvante o ligada a nanopartículas o en un compuesto que contiene adyuvante o integrada en un vector viral o bacteriano. Las vacunas ADN generan inmunidad tanto humoral como también mediada por célula. Una ventaja de la vacuna ADN es que el antígeno se expresa en su forma nativa y por consiguiente conduce a una mejor inmunización. Una ventaja adicional de la vacuna ADN es que al contrario de la vacuna viva debilitada no es infecciosa y tampoco se puede volver nuevamente virulenta.

La administración de la vacuna ADN en forma de ADN o ARN, plasmidos o fragmentos de ADN lineales que se acoplan a partículas, se puede efectuar mediante inyección o con la ayuda de una jeringa génica. La vacuna ADN para la inyección puede estar presente en una solución salina o salina regulada .

Los ácidos nucleicos que codifican para proteínas de influenza, proteínas de influenza y virus de influenza producidos de conformidad con la invención se pueden usar como vacuna contra el virus de influenza tipo A y/o B y/o C.

La vacuna que tiene como base el virus de influenza producida con el método de conformidad con la invención comprende todas las proteínas, péptidos o partes de estos, así como ácidos nucleicos que codifican para estas proteínas, peptidos o partes de estos del virus de influenza, así como partículas de virus de influenza mismas, proteínas de virus de influenza recombinantes , inclusive proteínas de influenza de la membrana, partículas subvirales, partículas similares a los virus (VLP) , complejos VLP, y/o partes de estos que se pueden usar con fines de inmunización contra la influenza.

En el caso de las proteínas de influenza producidas con el método de conformidad con la invención se trata preferiblemente de proteínas o derivados del virus de influenza, preferiblemente de las cepas de virus de influenza A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007, A/Brisbane/59/2007 , B/Florida/4/2006 , influenza porcina (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) e influenza equina (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8) ) .

El aislamiento y purificación de los ácidos nucleicos que codifican para una proteína de virus de influenza o parte de este que se producen con el método de conformidad con la invención se efectúa con los métodos convencionales y que son conocidos por el experto.

El aislamiento y purificación de las proteínas de virus de influenza que se producen con el método de conformidad con la invención se efectúa con los métodos que son conocidos por el experto. La preparación de las proteínas depende primero de su origen. Se diferencia entre proteínas intra y extra celulares. Si las proteínas se encuentran dentro de los cuerpos celulares primero se requiere una abertura de las células, por ejemplo mediante fuerzas de corte u osmosis. Tras esto se efectúa la separación del material insoluble, como por ejemplo membranas celulares y paredes celulares, por ejemplo mediante centrifugado. El centrifugado se usa de manera estándar para separar células, organulos de células y proteínas. Un método más efectivo en lo referente a la capacidad de separación es la electroforesis pulsada. Adicionalmente , después de la separación de los otros componentes celulares existe todavía la necesidad de la separación de proteínas, péptidos y aminoácidos de diferente tamaño. La separación de las proteínas se puede efectuar mediante electroforesis de gel o electroforesis capilar mono o bidimensional . En el ámbito de los aminoácidos y peptidos se usan por ejemplo procesos cromatográficos como cromatografía de afinidad, de intercambio de iones (IEC, por sus siglas en inglés) o de fase inversa (RPC, por sus siglas en inglés) . Resultan desfavorables para la depuración la presencia de lípidos y la necesidad de la separación o desactivación de proteasas. No es necesario extraer de las células las proteínas que están presentes en la matriz extracelular, pero tras la separación de tpdos los componentes insolubles se encuentran presentes muy diluidas y usualmente en cantidades notablemente menores que las proteínas intracelulares .

Para el aislamiento y la purificación de las partículas de virus de influenza producidas con el método de conformidad con la invención se usan procesos que son conocidos por el experto. Los ejemplos de estos procesos son el centrifugado de gradiente de densidad, diferencial o zonal .

Las células humanas permanentes utilizadas en el método de conformidad con la invención se producen mediante la inmortalización de células humanas primarias. Las células humanas primarias se obtienen mediante extracción directa del organismo o de un tejido tomado del organismo y se ponen en cultivo. Se prefieren aquellas células humanas primarias que se pueden transformar bien en líneas celulares humanas permanentes mediante la expresión con factores transformadores de célula, en particular amniocitos, células de retina embrionales asi como células embrionales de origen neuronal .

Los factores transformadores de célula pueden ser antígeno T de SV40 (Banco de Genes No. de Acceso J02400) , producto génico E6 y E7 de HPV (por ejemplo HPV16, Banco de Genes No. de Acceso K02718) y productos génico ElA y E1B de adenovirus humano (por ejemplo, adenovirus humano serotipo-5, Banco de Genes No. de Acceso X02996) . Para la inmortalización, las células primarias se transfectan mediante la expresión de El del adenovirus humano con las dos secuencias de ácido nucleico para los productos génico ElA y E1B. En la expresión mediante un HPV presente en forma natural es posible expresar E6 y E7 de un transcripto ARN. Lo mismo es aplicable para la expresión de ElA y E1B de un adenovirus existente en forma natural. Los factores transformadores de células como por ejemplo la función génico El adenoviral tienen por efecto la inmortalización o transformación y con ello la capacidad de cultivo duradero de las células.

La expresión de los factores transformadores de célula se puede efectuar con el control de un promotor homólogo y elementos de terminación de trascripción, por ejemplo el promotor ElA natural y el sitio de poliadenilación ElA natural para la expresión de la función génica ElA adenovirual. Esto se puede lograr si las moléculas de ácido nucleico utilizadas para la transfeccion contienen fragmentos del respectivo genoma viral, por ejemplo del genoma adenoviral con las funciones génicas mencionadas, por ejemplo E1A, E1B. Pero la expresión de los factores transformadores de célula también se puede efectuar con el control de promotores o elementos de terminación de transcripción heterólogos que no están presentes de manera natural con la regi n de codificación utilizada. Como promotores heterólogos pueden servir por ejemplo promotor CMV (citomegalovirus) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Editor) , Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) , promotor EF-lct (Kim et al., Gene 91:217-223, 1990), promotor CAG (un promotor híbrido del Immediate Early-Enhancer del citomegalovirus humano y un promotor ß-actina de gallina modificado con primer intrón) (Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991) , promotor pgk ( fosfoglicerincinasa) humano o murino (Adra et al., Gene 60:65-74, 1987), promotor RSV (Rous Sarkoma Virus) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Editor) , Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) o promotor SV40 (Simian Virus 40) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Editor) , Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) . Como sitios de poliadenilación pueden servir por ejemplo las secuencias de poliadenilación del antígeno T grande SV40 (Banco de Genes, No. de Acceso J02400) o del gen G-CSF humano (factor estimulador de colonias de granulocitos, granulocyte colony stimulatin factor) (Mizushima y Nagata, Nucí. Acids Res. 18 :5322, 1990) .

Las células se inmortalizan mediante la transfección de las células humanas primarias con la molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de ácido nucleico que codifican para E1A y E1B. La molécula de ácido nucleico utilizada para inmortalizar las células humanas primarias comprende secuencias de ácido nucleico E1A y E1B que provienen preferiblemente de adenovirus humanos, y en particular del adenovirus serotipo-5 humano. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico utilizada para inmortalizar comprende, además de las secuencias de ácido nucleico que codifican E1A y E1B, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la función génica pIX adenoviral. El polipéptido P9, una protelna estructural viral actúa como activador de la transcripción sobre diversos promoteres virales y celulares como por ejemplo el promotor timidinacinasa o el promotor beta-globina . El efecto activador de la transcripción del polipéptido P9 expresado adicionalmente en la célula puede provocar en las líneas celulares de producción de conformidad con la invención un aumento de las tasas de expresión del polipéptido recombinante en caso de que la secuencia que codifica del polipéptido recombinante se encuentra bajo el control de uno de los promotores precedentemente mencionados . Una secuencia ejemplar se encuentra en el Banco de Genes, No. de Acceso X02996. En particular las moléculas de ácido nucleico comprenden los nucleótidos 1 a 4344, 505 a 3522 o los nucleótidos 505 a 4079 del adenovirus serotipo-5 humano.

En una modalidad preferida la molécula de ácido nucléico para inmortalizar las células primarias, en particular los amniocitos, contiene la secuencia del nucleótido de adenovirus serotipo 5 de nucleótido 505 a nucleótido 4079. En otra modalidad particularmente preferida, la molécula de ácido nucléico para inmortalizar las células primarias, en particular los amniocitos, contiene la secuencia del nucleótido de adenovirus serotipo 5 de nucleótido 505 a nucleótido 3522. En otra modalidad particularmente preferida, la molécula de ácido nucléico para inmortalizar las células primarias, en particular los amniocitos, contiene la secuencia del nucleótido de adenovirus serotipo 5 de nucleótido 505 a nucleótido 4344, la cual corresponde al ADN aldenoviral en las células HEK293 (Louis et al., Virology 233:423-429, 1997). Además la célula humana inmortalizada puede expresar un factor de replicación viral. Este factor de replicación se puede ligar al origen de replicación (ori) de una molécula de ácido nucleico introducida mediante transfección y mediante ello iniciar la replicación de la molécula de ácido nucleico episomal. La replicación de episomal de moléculas de ácido nucleico, en particular de ADN plasmido en las células tiene por efecto una fuerte multiplicación del número de copias de las moléculas de ácido nucleico transferidas y mediante ello un aumento de la expresión de un polipéptido recombinante codificado sobre esta molécula así como su obtención a lo largo de muchas divisiones celulares. Un factor de replicación viral de este tipo es por ejemplo el antígeno T del virus 40 (SV40) de primate, que tras el enlace a una secuencia designada como origen de replicación SV40 (SV40 ori) inicia sobre la molécula de ácido nucleico, por ejemplo el ADN plasmido, su replicación. La proteína EBNA-1 de virus Ebstein-Barr identifica un origen de replicación denominado ori-P y cataliza la replicación extracromosomal de la molécula de ácido nucleico portadora de ori-P. El antígeno T del virus 40 (SV40) de primate como factor de replicación no sólo activa la replicación sino que también tiene un efecto activador sobre la transcripción de algunos genes virales y celulares (Brady, John y houry, George, 1985, Molecular y Cellular Biology, Vol. 5, No. 6, página 1391 a 1399) .

La célula humana inmortalizada utilizada en el método de conformidad con la invención es en particular una célula de amniocitos humanos inmortalizada. En una modalidad preferida, la célula humana inmortalizada utilizada en el método de conformidad con la invención expresa el antígeno T grande de SV40 o el antígeno 1 nuclear (EBNA-1) de virus de Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés) . En una modalidad particularmente preferida la célula de amniocitos humanos utilizada en el método de conformidad con la invención expresa el antígeno T grande de SV40 o el antígeno 1 nuclear (EBNA-1) de virus de Epstein-Barr (EBV) . En otra modalidad particularmente preferida, la célula humana inmortalizada, en particular célula de amniocitos, expresa el antígeno T grande de SV40 bajo el control del promotor CAG, RSV o CMV.

Los amniocitos humanos permanentes utilizados en el método de conformidad con la invención se describen en particular en las publicaciones de patente EP 1230354 y EP 1948789. En una modalidad particularmente preferida, en el caso de la célula de amniocitos humanos permanente utilizada en el método de conformidad con la invención se trata de CAP o CAP-T.

En el caso de las células CAP loe amniocitos primarios se transfectaron con un plasmido que contiene el promotor pgk murino, secuencias AD5 nucleótido 505-3522 que contiene toda la región El, la señal 31 de escisión y poliadenilación de SV40 y la región pIX de Ad5 (nucleótido 3485-4079) . Este plasmido ya se describió detalladamente en el documento EP 1 948 789.

Para la producción de las células CAP-T las células CAP se transfectaron con un plasmido que comprende el cásete de expresión para antígeno T de SV40 flanqueado por un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. El plasmido puede contener adicionalmente el promotor CAG (promotor híbrido que consta del realzador de CMV y el promotor ß-actina de gallina) (Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991), el promotor RSV (promotor de virus Rous Sarcoma) (Banco de Genes No. de Acceso DQ075935) o el promotr CMV (promotor prematuro del citomegalovirus humano) (SEQ ID No: 5) . Para generar líneas celulares estables, el plasmido contiene un cásete de expresión de blasticidina con el promotor de ubiquitina (pUB/Bsd, Invitrogen #V512-20) .

Adicionalmente a esto la invención también proporciona un método de conformidad con la invención en el cual la célula humana, en particular la célula de amniocitos se puede cultivar en suspensión. Además es posible cultivar la célula humana, en particular la célula de amniocitos en el método de conformidad con la invención en medio exento de suero.

Otro objeto de la presente invención es el uso de una célula humana permanente, en particular una célula de amniocitos para la producción de una vacuna que tiene como base el virus de influenza.

En una modalidad preferida, en el caso de la célula de amniocitos humanos permanente utilizada para la producción de la vacuna que tiene como base el virus de influenza se trata de una célula CAP o CAP-T.

La vacuna que tiene como base el virus de influenza producida con el método de conformidad con la invención puede ser un virus de influenza y/o una proteína de virus de influenza o una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de influenza. La vacuna se puede administrar en forma parenteral con una inyección. Se distinguen inyecciones intradérmicas , subcutáneas o intramusculares. La inyección intradérmica se puede efectuar con una jeringa o lanza de vacunación. La inyección intramuscular se puede efectuar en el brazo, en el muslo o en el músculo del glúteo. Además es posible administrar la vacuna en forma oral o nasal. La vacuna se puede administrar por ejemplo a humanos y animales.

La vacuna que tiene como base el virus de influenza producida con el método de conformidad con la invención puede proporcionar una resistencia contra uno o varios virus de influenza tanto mediante inmunización activa como también pasiva. En el caso de la inmunización activa, la vacuna sirve tras la aplicación para la activación específica del sistema inmune de humanos y animales en lo referente a un virus determinado. Se aprovecha la reacción del sistema inmune para generar una respuesta inmune en el caso de la existencia de virus o de sus antígenos específicos. Esto provoca la formación de anticuerpos y células T cooperadoras especializadas, que entonces proporcionan una protección de duración prolongada contra la enfermedad respectiva, la cual en función del virus puede durar desde algunos años hasta toda la vida.

En el caso de la vacuna que tiene como base el virus de influenza producida con el método de conformidad con la invención se puede tratar por ejemplo de una vacuna viva o una vacuna muerta. La vacuna viva contiene por ejemplo virus debilitados todavía capaces de multiplicarse, los cuales no pueden desencadenar la enfermedad. En cambio, en el caso de una vacuna muerta estos virus murieron o solamente contienen fragmentos del virus (antígenos) . La desactivación (extinción) de los virus se efectúa por ejemplo mediante sustancias/combinaciones de sustancias químicas, por ejemplo formaldehido, beta-propiolactona o psoralen. La membrana del virus queda conservada. También existen vacunas toxoides, las cuales únicamente contienen el componente biológicamente inactivo (toxoide) de la toxina de un virus (por ejemplo el toxoide de tétano) , las cuales se cuentan entre las vacunas muertas. En el caso de la vacuna muerta se puede tratar en particular de una vacuna escindida que consta de fragmentos de las proteínas de la membrana del virus. La destrucción (escisión) de la membrana del virus se puede efectuar por ejemplo con detergentes o disolventes orgánicos fuertes.

Adicionalmente también es posible desactivar (matar) los virus con sustancias químicas. Además se cuentan entre las vacunas muertas las vacunas de subunidad que constan de componentes específicos del virus, por ejemplo proteínas de hemoglutinina y neuroaminidasa .

En el caso de una inmunización pasiva, la vacuna que tiene como base el virus de influenza producida con en el método de conformidad con la invención se le administra a un huésped (por ejemplo, un mamífero) , se obtiene el antisuero generado y se le administra al receptor que está infectado con al menos un virus de influenza.

Adicionalmente, para la administración la vacuna se mezcla con una o varias sustancias complementarias, como estabilizadores, neutralizadores , vehículos y conservadores. Entre estas sustancias se cuentan, entre otras, formaldehido, tiomersal, fosfato de aluminio, acetona y fenol. Además es posible mezclar la vacuna con sustancias auxiliares para reforzar el efecto de la vacuna. Estos denominados adyuvantes de ser posible no debieran tener ellos mismos una actividad farmacológica y en particular servir como promotores para la disolución, emulsiones o mezclas de estos. Los adyuvantes son por ejemplo sales minerales, mezclas de escualeno, péptidos de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de membrana de microbacteria, determinadas emulsiones, monofosforil-lípido-A, derivados de ácido micólico, agentes tenso-activos no iónicos de copolimeros bloque, quil A, subunidad de la toxina B de cólera, polifosfátenos y sus derivados, complejos estimuladores de la inmunidad, adyuvantes de citocina, adyuvante MF59, adyuvantes de lípido, adyuvantes mucosales, determinadas exotoxinas bacterianas, determinados oligonucleótidos y PLG.

Los ejemplos siguientes explican la invención y no se deben considerar limitativos. En cuanto no se indique otra cosa se usan métodos biológicos moleculares estándar, como por ejemplo descrito por Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Ejemplo 1: pruebas de cultivo con la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 en medio PEM o 293SFMII La línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 se cultivó en 100 mi de medio 293SFMII (Invitrogen) o medio PEM (Invitrogen) exento de suero a 37°C, 8% de C02 y 100 rpm. Para el control se utilizó la línea celular de riñón canino permanente MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney, adaptada a cultivo en suspensión) (Lohr et al., Vaccine, 2010, 28 (38) : 6256-64) en 100 mi de medio SMIF8 exento de suero en matraz vibratorio de 100 mi.

En el momento 0 (= punto de inicio del cultivo) así como en cada caso en un lapso de 24 h se determinó el número de células vivas, el número de células muertas, la tasa de supervivencia de las líneas celulares así como el valor pH, la concentración de glucosa, lactosa, glutamina, amonio, ácido glutámico y piruvato en el medio (sistema de análisis bioquímico de parámetros múltiples) (Lohr et al., Vaccine, 2009, 27(37), 4975-4982; Genzel et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 88 (2) : 461-75) .

Los resultados se representan en las figuras 1A-1G. Los números de células vivas de la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 en medio 293SFMII, como también en medio PEM, así como también las células MDCK.STJS2, a partir de aproximadamente 2 x 105 células por mi de cultivo al principio del cultivo mostraron un desarrollo similar y tras 168 h alcanzaron un número de células vivas de aproximadamente 2 x 106 células por mi. El número de células vivas de las células MDCK.SUS2 decayó a partir de las 192 h a 9 x 105 células por mi y se mantuvo constante hasta 240 h después del inicio de la curva de multiplicación. El número de células vivas de la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 en medio 293SFMII decayó solamente a las 216 h al valor inicial de 2 x 105 células por mi de cultivo, en cambio el número de células vivas de las células CAP-1D5 en medio PEM se mantuvo estable hasta las 240 h en aproximadamente 2.5 x 106 células por mi de cultivo y solamente después de 312 h alcanzó el valor inicial de número de células vivas de 2 x 105 células.

La tasa de supervivencia de las células CAP-1D5 en medio 293SF II y medio PEM así como de las células MDC . SUS2 se encontró al principio de la curva de multiplicación y hasta las 168 h entre 80 y 90%. La tasa de supervivencia de las células CAP-1D5 en medio PEM se mantuvo hasta las 240 h en 80%, luego decayó y tras 312 h mostró todavía 10%. La tasa de supervivencia de las células CAP-1D5 en medio 293SFMII ya después de 168 h decayó lentamente y mostró aproximadamente 10% después de 216 h. La tasa de supervivencia de las células DCK.SUS2 disminuyó continuamente después de 68 h y alcanzó aproximadamente 45% después de 240 h.

El valor pH del cultivo de las células MDCK.SUS2 se mantuvo relativamente estable entre 7.7 y 7.6 durante 240 h. En cambio, el valor pH (al inicio 7.4) del cultivo de las células CAP-ID5 en el medio 293SFMII, así como también en el medio PEM disminuyó continuamente a pH 6.4 después de 240 h (medio 293SFMII) y 312 h (medio PEM) .

La concentración de lactosa aumentó desde las concentraciones iniciales inferiores a 5 mM en el medio 293 SFMII como también en el medio PEM del respectivo cultivo de las células CAP-ID5 a 30-35 mM hasta las 240 h. En el cultivo de las células MDCK. SUS2 la concentración de lactosa aumentó con menos intensidad, pero tras 240 h alcanzó un valor similar al del cultivo de las células CAP-1D5. La concentración de glucosa disminuyó de 20 a 25 mM al principio del cultivo de las células CAP-1D5 en el medio 293SFMII y en el medio PEM como también en el cultivo de las células MDCK. SUS2 a menos de 10 mM, siendo que la disminución más fuerte se registró en el cultivo de las células CAP-1D5 en el medio 293SFMII.

El aumento de la concentración de amonio en el cultivo de las células CAP-1D5 en el medio 293SFMII así como también en el medio PEM mostró un desarrollo muy similar (de < 0.5 a 4-5 mM) . Contrariamente a esto, la concentración de amonio en el cultivo de las células MDCK.SUS2 aumentó notablemente más (a 7 mM) . La disminución de la concentración de glutamina se desarrolló nuevamente de manera muy similar en el cultivo de las células CAP-1D5 en el medio 293SFMII, como también en el medio PEM, siendo que la mayor disminución se registro en el medio PEM.

La concentración más alta de ácido glutámico la presentó el cultivo de las células MDCK.SUS2, y estas solamente aumentó de manera insignificante. En el cultivo de las células CAP- ID5 en el medio PEM la concentración de ácido glutámico fue más alta en comparación con la del medio 293SFMII al principio del cultivo, y aumentó continuamente. La concentración de piruvato en el cultivo de las células MDCK.SUS2 disminuyó hasta cero después de 144 h. En cambio el piruvato ya se había consumido después de 48 h en los cultivos de las células CAP-1D5 en el medio PEM y en el medio 293SFMII.

Por consiguiente, las células CAP-1D5 muestran en el medio PEM una mejor multiplicación que en el medio 293SFMII. Las células CAP-1D5 muestran en el medio PEM el mayor consumo de glucosa y la mayor formación de lactosa. La limitación de la glucosa a partir de 192 h podría explicar el descenso del número de células de las células CAP-1D5 en el medio PEM. Para optimizar las condiciones de cultivo de los cultivos de las células CAP-1D5 en el medio PEM y el medio 293SFMII pudiera ser relevante la estabilización del valor pH, la adición de piruvato y glutamina, así como glucosa.

Ejemplo 2: Infección viral con virus no adaptados Para las pruebas de infección con virus no adaptados se cultivó la línea celular de amniocitos CAP-1D5 en 55 mi de medio 293SFMII (Invitrogen) y medio PEM (Invitrogen) exento de suero a 37 °C, 8% de C02 y 100 rpm en el matraz vibratorio. Para el control se utilizó la línea celular de riñón canino permanente MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney, adaptada a cultivo en suspensión) .

Las densidades celulares listadas respectivamente en la tabla 1 se infectaron con el virus B/Florida/4/2006 (NIBSC,. The National Institute for Biological Standards and Control) y A/PR/8/34 (H1N1) (RKI, Robert-Koch-Institut) sin cambio de medio y con la adición de 5 x 10"6 U/ml de tripsina. La cantidad de partículas de virus producidas se determinó mediante titulación de la hemoglutinina (HA, prueba de hemoglutinación de acuerdo a métodos estándar) (representado en unidades log HA/100 µ?; tabla 1) Kalbfuss et al., 2008; Biologicals 36(3): 145-61). Asimismo en la tabla 1 se enumeran los respectivos valores pH del medio en el momento. Tabla 1: Sumario de las pruebas de infección viral con virus no adaptados en infección sin cambio de medio * hpi: Horas después de la infección Para la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 cultivada en el medio PEM no se pudo comprobar la producción de partículas de virus ni con la infección con el virus B/Florida/4/2006 (B/Florida) ni con el virus A/PR/8/34. El valor HA máximo para A/PR/8/34 (H1N1) en medio 293SFMII se encontró por debajo del valor HA máximo alcanzado en MDCK. SUS2. El valor pH con HA máximo fue comparativo para todas las infecciones en CAP-ID5 (pH 6.6), pero sin embargo fue notablemente menor que en las células MDCK.SUS2 infectadas (pH 7.7) .

Por consiguiente, una infección de la línea celular de amniocitos permanente CAP-ID5 en las condiciones probadas solamente tuvo lugar con el virus B/Florida. En cambio, en el caso de la línea celular de riñon canino permanente MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney) solamente se pudo comprobar una infección para el virus A/PR/8/34. En los experimentos siguientes se debía probar si mediante una adaptación previa de los virus a las células CAP-1D5 era posible obtener una mejor infección y por consiguiente un mayor rendimiento de virus.

Ejemplo 3: Adaptación de virus a células CAP-ID5 en medio PEM y 293SFMII en el matraz vibratorio La adpatación de virus de los virus de influenza A/PR/8/34 (H1N1) (RKI , Robert-Koch-Institut) , A/Uruguay/716/2007 (H3N2) (NYMC X-175C, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) y B/Florida/4/2006 (NIBSC, The Natignal Institute for Biological Standards and Control) se efectuó mediante infección de CAP-1D5 mediante 4 pasadas en el matraz vibratorio en medio PEM y 293SFMII. Antes de cada infección se llevó acabo un cambio de medio. El rendimiento de virus durante las pasadas individuales se cuantificó mediante titulación de la hemoglutinina (unidades log HA/100 µ?) y mediante el ensayo Tissue Culture Infectious Dose50 (TCID50/ número de virus/ml) (dosis50 infecciosa en cultivo de tejido) (Genzel y Reichl, Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing en ethods in Biotechnology: Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Editores R. Pórtner, HUMANA Press Inc., Totowa, New Jersey, 2007, 457-473; Kalbfuss et al., 2008; Bilogicals 36 (3) : 145-61) .

Los resultados se representan en la figura 2. La infección de las células CAP-1D5 con el virus de influenza A/PR/8/34 (HlNl) y A/Uruguay/716/2007 (H3N2) condujo tanto en el medio PEM como también en el medio 293SFMII a índices de virus notablemente aumentados tras 4 pasadas. La infección de las células CAP-1D5 con el virus de influenza B/Florida/4/2006 condujo tanto con el cultivo en medio 293SFMII como también en el medio PEM a un notable aumento del índice viral en la segunda pasada. Un aumento comparable lo mostró también la titulación del valor HA en la infección de las células CAP- ID5 con el virus de influenza A/PR/8/34 (HlNl) y A/Uruguay/716/2007 (H3N2) tanto en el medio PEM como también en el medio 293SFMII. · Además de un aumento del índice viral por vía de la adaptación también se volvió más rápida la replicación del virus con cada pasada y finalmente se pudo incrementar notablemente el índice viral. En general parece ser que en el medio 293SFMII se obtienen índices de virus levemente mayores en comparación con el medio PEM.

Ejemplo 4: MOI en función de la infección de células CAP-1D5 y MDCK.SUS2 con el influenza adaptado A/PR/8/34 Ahora se verificó con el virus de influenza A/PR/8/34 (H1N1 RKI, Robert-Koch- Institut) la dependencia de MOI del número de partículas virales por célula huésped, con 3 diferentes valores para MOI 0.0025, 0.025 y 0.25. Las células de amniocitos permanentes CAP-1D5 se infectaron en medio 293SFMII y medio PEM y las células de riñon canino permanentes MDCK.SUS2 en medio SMIF8 en matraces vibratorios con diferentes MOI del virus de influenza A/PR/8/34 adaptado. Con la infección se llevó a cabo además un cambio de medio para mantener valores pH casi constantes alrededor de pH = 7.5. A continuación se determinó a lo largo de 96 h el número de células vivas y a lo largo de 114 h la cantidad de las partículas de virus (unidades log HA/100 µ?) mediante titulación de la hemoglutinina en la prueba de hemoglutinación de acuerdo a métodos estándar.

Los resultados se representan en las figuras 3A-3F. El desarrollo del número de células vivas, así como el desarrollo de la cantidad de partículas de virus formadas en el cultivo de las células CAP-1D5 en medio 293SFMII y el cultivo de las células MDCK. SUS2 en el medio SMIF8 no muestra dependencia de los valores MOI. El índice viral aumentó hasta más de 2.5 unidades log HA/100 µ? en ambos cultivos. El cultivo de las células CAP-1D5 en medio PEM tuvo para todos los tres valores MOI menores cantidades (aproximadamente 2.0 unidades log HA/100 µ?) de partículas de virus. De manera correspondiente con esto, el número de células vivas del cultivo de células CAP-1D5 en el medio PEM se mantuvo constante por 48 h en 1 x 106 células/ml y luego cayó a menos de 1 x 104 células/ml. Contrariamente a esto, el número de células vivas en los cultivos de células CAP-1D5 en el medio 293SFMII y del cultivo de las células MDCK.SUS2 disminuyó constantemente de 1 x 106 células/ml a por debajo de 1 x 104 células/ml después de 96 h. En todos los cultivos se observó con un MOI de 0.0025 un leve desaceleración de la replicación de virus, que se pudo comprobar mediante un aumento temporalmente retardado de las unidades log HA en comparación con los valores MOI más altos.

Ejemplo 5: Cultivo en la escala de 1 1 con infección (A/PR/8/34 adaptado) Las células CAP-1D5 se cultivaron con oxigeno puro en el bioreactor de 1 litro en medio PEM con 4 mM de glutamina y 4 mM de piruvato a 85 rpm, pH = 7.2 y una presión parcial de oxigeno p02 de 40%. El número de células inicial fue de 5 x 105 células/ml .

Después de 114 h de multiplicación y un número de células de 2.4 x 106 células/ml las células CAP-ID5 se infectaron con el virus de influenza A/PR/8/34 (adaptado: en PEM, 4. pasada, 1.78 x 107 virus/ml) . No se llevó a cabo un cambio de medio, pero se adicionaron 80 mi de medio PEM, así como glutamina y piruvato en una concentración final de respectivamente 2 mM. El valor MOI fue de 0.025 y se adicionó tripsina en una concentración final de 1 x 10"5 U/ml . A lo largo de 240 h se determinó en lapsos de respectivamente 24 h el número de células vivas, el número de células muertas, la tasa de supervivencia de las líneas celulares, así como el valor pH, la concentración de glucosa, lactosa, glutamina, amonio, ácido glutámico y piruvato en el medio. Además, a partir del momento de la infección (114 h) se determinaron las unidades log HA /100 µ? y los valores TCID50 (Genzel y Reichl, Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing en Methods in Biotechnology: Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Editores R. Pórtner, HUMANA Press Inc., Totowa, New Jersey, 2007, 457-473; Kalbfuss et al., 2008; Bilogicals 36(3): 145-61).

Los resultados están representados en la figura 4.

El número de células vivas de las células CAP-1D5 aumentó primero hasta la infección con el virus de influenza A/PR/8/34 de 6 x 105 células/ml a 2.4 x 106 células/ml, y tras la infección disminuyó de nuevo un poco. La tasa de supervivencia de las células CAP-1D5 se encontró a lo largo de todo el tiempo entre 80 y 90%, y solamente después de 240 h disminuyó a 70%. La concentración de piruvato en el cultivo disminuyó dentro de 72 h a cero, la cantidad de piruvato adicionada al momento de la infección con el virus de influenza se consumió igualmente dentro de 10 h. La concentración de glutamina aumentó durante todo el tiempo de manera continúa de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1.8 mM. El valor pH del cultivo fue de 7.1 a 7.4 durante el tiempo observado, salvo pocas fluctuaciones. El índice TCID50 máximo que se alcanzó se encontró en 2.4 x 107 virus/ml, el índice HA máximo se encontró en 2.2 unidades log HA/100 µ? .

Los resultados de este experimento muestran que en virtud de la alimentación de piruvato no se produjo una limitación de glucosa y por consiguiente el número de células vivas no se viene abajo.

Ejemplo 6: Adaptación de virus a células CAP-ID5 en medio PEM y 293SFMII en frascos de 50 mi La adaptación de virus de los virus de influenza A/Brisbane/59/2007 (similar H1N1 HGR: IVR-148, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) , B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) , influenza porcina (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00 ; IDT Biologika) e influenza equina (A/Equine 2 (H3N8) ; A/Newmarket/l/93 ; NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) se efectuó mediante la infección de CAP-1D5 mediante 4 pasadas en frasquitos de 50 mi en medio PEM y 293SFMII. Antes de cada infección se llevó a cabo un cambio de medio. El rendimiento de virus durante las pasadas individuales se cuantificó mediante titulación de la hemoglutinina (unidades log HA/100 µ?) y mediante el ensayo Tissue Culture Infectious Dose50 (TCID50, número de virus/ml) (dosis50 infecciosa en cultivo de tejido) (Genzel y Reichl, Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing en Methods in Biotechnology: Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Editores R. Pórtner, HUMANA Press Inc., Totowa, New Jersey, 2007, 457-473; Kalbfuss et al., 2008; Bilogicals 36(3): 145-61) .

Los resultados se representan en las figuras 5A-5B. La infección de las células CAP-1D5 con el virus de influenza A/Brisbane/59/2007 y B/Florida/4/2006 condujo después de 4 pasadas tanto en el medio PEM como también en el medio 293SFMII a índices de virus notablemente incrementados, siendo que el aumento del índice viral es mayor en el medio 293SFMII. Un aumento comparable lo mostró también la titulación del valor HA en la infección de las células CAP-1D5 con el virus de influenza A/Brisbane/59/2007 y B/Florida/4/2006, tanto en el medio PEM como también en el medio 293SFMII. La infección de las células CAP-1D5 con el virus de influenza porcina conduce a un aumento de la titulación del valor HA tanto en el medio PEM como también en el medio 293SFMII.

Además de un aumento del índice viral por vía de la adaptación, también con cada pasada la reivindicación del virus se volvió más rápida y finalmente se pudo aumentar notablemente el índice viral . En general parece ser que en el medio 293SFMII se obtienen índices de virus levemente mayores en comparación con el medio PEM.

Ejemplo 7: Pruebas de cultivo con la línea celular de amniocitos permanente CAP-ID5 con mayor número inicial de células La línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 se cultivó en 100 mi de medio PEM (Invitrogen) a 37 °C, 8% de C02 y 185 rpm. El número inicial de células fue de 5 x 105 células/ml y 8 x 105 células/ml. Adicionalmente, en las preparaciones con un mayor número inicial de células se adicionaron piruvato en una concentración final de 4 mM y de 10 mM y aminoácidos adicionales.

En el momento 0 (= punto de inicio del cultivo) así como en cada caso en un lapso de 24 h se determinó el número de células vivas, el número de células muertas, la tasa de supervivencia de las líneas celulares así como el valor pH, la concentración de glucosa, lactosa, glutamina, amonio, ácido glutámico y piruvato en el medio (sistema de análisis bioquímico de parámetros múltiples) (Lohr et al., Vaccine, 2009, 27(37), 4975-4982; Genzel et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 88 (2 ): 461-75) .

Los resultados se representan en las figuras 6A-6B.

Mediante el aumento del número inicial de células de aproximadamente 5 x 105 células por mi de cultivo al principio del cultivo a 8 x 105 células por mi de cultivo de la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 en medio PEM se obtuvo un rendimiento mayor de 1 x 10s células por mi de cultivo después de 90 h. En el momento típico de la infección (aproximadamente 96 h a 120 h después del punto inicial del cultivo) se obtuvo con esto un número de células de 5-6 x 10e células por mi de cultivo.

En el momento típico de la infección (aproximadamente 96 h a 120 h después del punto inicial del cultivo) el valor pH del cultivo se encontró en un intervalo más bien crítico de 6.6-6.8. Preferiblemente el valor pH se debiera encontrar en aproximadamente 7.2-7.4 al infectar.

Ejemplo 8: Efectos de la variación de la actividad de tripsina y de llevar a cabo un cambio de medio y una dilución 1:2 con medio sobre el índice viral El presente experimento fue para investigar como el uso de diferentes concentraciones de tripsina en la infección del virus y un cambio de medio, o una dilución 1:2 del medio, afectará el titulo del virus.

La línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 se cultivó en 100 mi de medio PEM (Invitrogen) con respectivamente 4 m de piruvato y glutamina a 37°C, 8% de C02 y 185 rpm en el matraz vibratorio. La línea celular se infectó en el momento del inicio del cultivo con virus de influenza A/PR/8/34 (H1N1; RKI, Robert-Koch- Institut) adaptado a las células CAP-1D5. En el momento de la infección el número de células en el cultivo fue de 4.5 x 106 células/ml de cultivo en el caso de no haber tenido lugar un cambio de medio antes de la infección, y 2.3 x 106 células/ml de cultivo en el caso de haberse efectuado una dilución 1:2 con medio PEM antes de la infección, y 5 x 106 células/ml en el caso de haberse efectuado un cambio completo de medio antes de la infección. Además, en los cultivos sin cambio de medio y con una dilución 1:2 con medio PEM se utilizaron concentraciones de tripsina de 1 x 10~4 U/célula, 3 x 10"5 U/célula y 5 x 10"5 U/célula. En los cultivos con cambio completo de medio se usaron concentraciones de tripsina de 1 x 10"4 U/célula, 1 x 10"5 U/célula, 5 x 10"5 U/célula y 1 x 10"6 U/célula o nada de tripsina.

Los resultados se representan en las figuras 7A-7C.

La dilución 1:2 con medio PEM fresco conduce a un aumento prematuro del HA (aproximadamente 12 h en lugar de 24 h) y a mayores valores máximos del HA- 2.70 log HA en comparación con 2.30 log HA de los cultivos en los que no se efectuó un cambio de medio. Un cambio de medio completo condujo a mayores valores HA que se encuentran por arriba de 3.0 log HA.

En los cultivos sin cambio de medio y con una dilución 1:2 con medio PEM, los valores log HA muestran un desarrollo muy similar independientemente de la concentración de tripsina. En los cultivos en los que se llevó a cabo un cambio de medio completo el desarrollo de los valores log HA es muy similar en el caso de las concentraciones de tripsina 1 x 10"5 U/célula, 5 x 10"5 U/célula y 1 x 10"6 U/célula. En el cultivo sin tripsina el valor log HA únicamente alcanzó un valor de aproximadamente 2 unidades log HA /100 µ?, y en el cultivo en el que se usó 1 x 10"4 U/célula de tripsina para la infección, el valor log HA estuvo por debajo de 1 unidad log HA /100 µ?.

Ejemplo 9: Dependencia de MQI de la infección de células CAP-ID5 en medio PEM con diferentes cepas de virus de influenza adaptadas con y sin realización de un cambio de medio antes de la infección Con el presente experimento se investigó la dependencia entre el valor MOI, es decir la relación numérica del número de partículas de virus utilizadas para la infección y el número de las células CAP-1D5 a ser infectadas y el índice viral (en unidades log HA por 100 µ? de cultivo) .

Para este propósito, la línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 se cultivó en 50 mi de medio PEM (Invitrogen) o respectivamente 4 mM de piruvato y glutamina a 37 °C, 8% de C02 y 185 rpm en el matraz vibratorio. La dependencia de MOI se verificó tanto sin cambio de medio y con cambio de medio del cultivo antes de la infección. Se utilizaron tres diferentes cepas de influenza adaptadas: A/PR/8/34 (RKI , Robert-Koch-Institut) , A/Brisbane/59/2007 (IVR-148, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) y B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control) . La infección se efectuó en el matraz vibratorio de 50 mi con una concentración de células al infectar de 4.9 x 106 células/ml (sin cambio de medio) y 5.0 x 10e células/ml (con cambio de medio). La infección se efectuó a valores MOI de 0.25 y 0.10 (en el caso de virus de influenza A/Brisbane) , 0.025 y 0.0025 si no se efectuó cambio de medio y a valores MOI de 0.10 y 0.06 (en el caso de virus de influenza A/Brisbane), 0.025 y 0.0025 en caso de haberse efectuado un cambio de medio. La actividad de tripsina fue de 1 x 10"4 U/célula sin cambio de medio y de 1 x 10"s U/célula con cambio de medio. A continuación se determinó a lo largo de 144 h la cantidad de partículas de virus (unidades log HA /100 µ?) (Kalbfuss et al., 2008: Biologicals 36(3): 145-61).

Los resultados se representan en las figuras 8A-8F. El efectuar un cambio de medio conduce a resultados más consistentes en la replicación de virus. Una reducida dependencia de OI solamente se puede identificar en las células infectadas con el virus de influenza A/PR/8/34 sin cambio de medio y en las células infectadas con el virus de influenza A/Brisbane con cambio de medio. Con el cambio de medio es posible obtener valores log HA notablemente mayores. Los valores pH se encuentran sin cambio de medio parcialmente en el intervalo crítico entre 6.6 y 6.8, y con cambio de medio en 7.3-7.5.

Ejemplo 10: Cultivo continuado a escala de 1 1 en biorectores STR y Wave con infección (A/PR/8/34 adaptado) En una preparación (B16) las células CAP-1D5 se cultivaron con oxigeno puro en el bioreactor STR de 1 litro (Sartorius) en medio PEM con 4 mM de glutamina y 4 mM de piruvato a 120 rpm, pH = 7.2 y una presión parcial de oxigeno p02 de 40%. El número inicial de células fue de 5 x 105 células/ml. Después de 72.75 h de multiplicación y un número de células de 2.1 x 106 células/ml, las células CAP-1D5 se infectaron con virus de influenza A/PR/8/34 (adaptado: en PEM, 4. pasada, 2.01 x 106 virus/ml) . No se llevó a cabo cambio de medio. El valor MOI fue de 0.025 y se adicionó tripsina en una concentración final de 3 x 10"5 U/ml .

En una preparación adicional (B26) las células CAP-1D5 se cultivaron con oxigeno puro en el bioreactor STR de 1 litro (Sartorius) en medio PEM a 120 rpm, pH = 7.4-7.2 y una presión parcial de oxigeno p02 de 40%. El número inicial de células fue de 8 x 105 células/ml. Después de 92 h de multiplicación las células CAP-1D5 se infectaron con virus de influenza A/PR/8/34 (adaptado: en PEM, 4. pasada, 3.75 x 106 virus/ml) . Previamente se llevó a cabo un cambio completo de medio y el valor pH se ajustó en 7.6. El valor MOI fue de 0.025 y se adicionó tripsina en una concentración final de 3 x 10"5 U/ml.

En una tercera preparación (wave) las células CAP-1D5 se cultivaron con oxigeno puro en el bioreactor Wave de 1 litro (Wave Biotech AG) en medio PEM con 4 mM de glutamina y 4 mM de piruvato y 20 mM de glucosa con una frecuencia de agitación de 13 rpm, con un ángulo de 7o, pH = 7.3-6.9 y una presión parcial de oxigeno p02 de 40% y una presión parcial de C02 de 7.5%. El número inicial de células fue de 5 x 105 células/ml. Después de 72 h de multiplicación las células CAP-1D5 se infectaron con virus de influenza A/PR/8/34 (adaptado: en PEM, 4. pasada, 1.87 x 106 virus/ml). El número de células antes de la infección fue de 2.1 x 106 células/ml. No se llevó a cabo un cambio de medio. El valor MOI fue de 0.025 y se adicionó tripsina en una concentración final de 3 x 10"5 U/ml.

En una cuarta preparación se cultivaron células MDCK.SUS2 en el bioreactor STR de 1 litro (Sartorius) en medio AEM. El número inicial de células fue de 5 x 105 células/ml. Después de 118.25 h de multiplicación las células MDCK.SUS2 se infectaron con virus de influenza A/PR/8/34 (Lohr et al., Vaccine, 2010, 28 (38 ): 6256-64) .

Los resultados están representados en las figuras 9A-9B. A lo largo de 192 h se determinó el número de células vivas y el número de células muertas, así como el valor pH, la concentración de glucosa, lactosa, glutamina, amonio, ácido glutámico y piruvato en el medio. Además, a partir del momento de la infección se determinaron las unidades log HA /100 µ? y los valores TCID50 (Genzel y Reichl, Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing en Methods in Biotechnology : Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols, Editores R. Pórtner, HUMANA Press Inc., Totowa, New Jersey, 2007, 457-473; Kalbfuss et al., 2008; Bilogicals 36(3): 145-61).

Las células CAP-1D5 se multiplican en todas las tres preparaciones más rápido y con mayor densidad en comparación con las células MDCK.SUS2. Los índices de virus en los cultivos celulares CAP- ID5 alcanzan como máximo un valor de aproximadamente 2.5 para las unidades log HA /100 µ?. El índice viral del cultivo celular MDCK.SUS2 alcanza como máximo, un valor de aproximadamente 3 para las unidades log HA /100 µ? . Los índices de virus en los cultivos celulares CAP-1D5 aumentan de manera notablemente más prematura en comparación con el índice viral en el cultivo celular MDCK. SUS2.

Ejemplo 11: Prueba de cultivo para aumentar el rendimiento de virus en el matraz vibratorio en medio PEM o 293SFMII con cambio de medio completo o 1:1 antes de la infección Para optimizar el rendimiento de virus en los cultivos celulares CAP-1D5 que se cultivan en matraces vibratorios, las células CAP y D5 se cultivaron en los medios 293SFMII (Invitrpgen) y PE (Invitrogen) y se llevó a cabo un cambio de medio 1:1 o un cambio completo de medio.

La línea celular de amniocitos permanente CAP-1D5 se cultivó en 50 mi de medio PEM con 4 mM de glutamina y 4 mM de piruvato a 37°C, 8% de C02 y 100 rpm en el matraz vibratorio de 100 mi. Antes de infectar las células con el virus de influenza A/PR/8/34 con un MOI de 0.025 se llevó a cabo un cambio de medio. Si se efectúa un cambio de medio 1:1, al infectar las células se utiliza tripsina en una concentración de 1 x 10"5 U/célula. Si se lleva a cabo un cambio un cambio completo de medio, al infectar las células se utiliza tripsina en una concentración de 1 x 1Q~6 y/célula. El cambio de medio se efectuó tanto con medio PEM como también con medio 293SFMII. La concentración de células al infectar fue de 5 x 106 células/ml.

Los resultados están representados en las figuras 10A-10C. A lo largo de 72 h se determinó el número de células vivas, la tasa de supervivencia, el valor pH, así como las unidades log HA /100 µ? mediante titulación de la hemoglutinina mediante procesos estándar (Lohr et al., Vaccine, 2009, 27(37), 4975-4982; Genzel et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 88 (2) :461-75) .

El índice viral aumentó más rápido en los cultivos celulares en los cuales previamente a la infección con el virus de influenza A/PR/8/34 se llevó a cabo un cambio completo de medio en comparación con los cultivos celulares en los que se llevó a cabo un cambio de medio 1:1. Además, los índices virales de los cultivos celulares en los que previamente a la infección con el virus de influenza A/PR/8/34 se llevó a cabo un cambio completo de medio alcanzaron un índice viral máximo más alto en comparación con los cultivos celulares en los que se llevó a cabo un cambio de medio 1:1.

El número de células vivas de los cultivos celulares con cambio de medio completo previo a la infección disminuyó de 5 x 106 células/ml abruptamente después de 24 h, de manera que después de 48 h ya fue sólo de aproximadamente 2 x 104 células/ml. El cultivo celular con medio PEM y cambio de medio 1:1 antes de la infección fue el que disminuyó menos, en este caso el número de células vivas después de 72 h fue todavía de aproximadamente 7 x 105 células/ml.

El valor pH en todos los cultivos celulares se encontró entre 7.6 y 7.2 durante todo el tiempo de 72 h.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza, que comprende a) infectar una célula de amniocitos humanos permanente con un virus de influenza, b) cultivar la célula de amniocitos humanos permanente, c) expresar el virus de influenza y d) aislar el virus de influenza del medio, caracterizado porque la célula de amniocitos humanos permanente expresa los productos génicos adenovirales E1A y E1B.

2. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula de amniocitos humanos permanente se encuentra en o entre la fase de multiplicación exponencial y la fase de multiplicación estacionaria al momento de que se infecta.

3. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el aislamiento del virus de influenza del medio en la etapa d) se efectúa mediante centrifugado de gradiente de densidad, diferencial o zonal.

4. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los productos génicos adenovirales E1A y E1B comprenden los nucleótidos 1 a 4344, 505 a 3522 o los nucleótidos 505 a 4079 del adenovirus humano serotipo-5.

5. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la célula de amniocitos humanos permanente expresa el producto génico adenoviral pIX.

6. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque antes de infectar con el virus de influenza tiene lugar un cambio completo de medio o una dilución 1:2 con medio.

7. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al infectar con un virus de influenza se adiciona una concentración de tripsina de 1 x 10"4 U/célula, 1 x 10"5 U/célula, 3 x 10"5 U/célula, 5 x 10"5 U/célula o 1 x 10"5 U/célula.

8. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al infectar con un virus de influenza se utiliza una cantidad de virus indicada como valor MOI en el intervalo de 0.001 a 0.3.

9. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el virus de influenza es un virus de influenza humano, un virus de influenza equino o un virus de influenza porcino.

10. Método para producir una vacuna que tiene como base un virus de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el virus de influenza se selecciona de las cepas de virus de influenza A/PR/8/34, A/Uruguay/716/2007 , A/Brisbane/59/2007 , B/Florida/4/2006 , influenza porcina (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/00) o influenza equina (A/Equine, A/Newmarket/l/93 (H3N8) ) .

11. Uso de una célula de amniocitos humanos permanentes para la producción de una vacuna que tiene como base un virus de influenza, en donde la célula de amniocitos humanos permanente expresa los productos génicos adenovirales E1A y'ElB.