TW201211257A - Permanent human cell line for influenza virus preparation - Google Patents

Description

201211257 四、 指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明：無。 五、 本案若有化學續，請揭錢能齡㈣特徵的化 jfe Ο #**> 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關借助永久人i . ^ , . ^ ^ , K久人平膜細胞（Amni〇zytenzeUe) 氟備奴感病毒型疫苗的方沐 方法以及水久人羊膜細胞在製偌 流感病毒型疫苗中的用途。 【先前技術】 接種疫苗是衛生部門敕 , P門知取的最重要的措施以防止因每 年的流感疫情引起的疾 ^ ^ ^ i 、’。疫田的成功使用取決於是否能 伙穩疋和容易處理的央 此 種材料如殺死的病毒二:Γ能快地獲得足夠大量的接 對於與許多人和動物發展和它們的充足供應 生產的延誤和定量損 鬥甲疋至關重要的。由於疫苗 pa M m L· ^ 在與疾病爆發抗爭時很能會出現 問題。因此，最近的努 兄 作疫苗。 刀疋在細胞培養液中培養病毒以用 到目前為止，所霜1 製備的。必須證實這流感疫苗是在畔化的雞胚蛋中 、Ρ未被某些病毒和細菌污染。這 201211257 a所謂的無特異性病原（SPF)，， 已證t 雞卵均可市售獲得。雖然 已-實了雞卵非常適用於動物和 在疫苗生產方面具有一些劣 甚二—疋雞卵 苗兩I一#i 因為生產母劑量的常規疫 生：用的雜广所以在例如出現大規模流行病時，疫苗 2用的雞即需求量則很高。馨於雞㈣供應有限，需要 平的時間皁備足夠量的雞即…卜，還存在對雞 致病性的流感亞型’因而在大規模流行病的情況 出現雞即供應短缺。另外，生產過程是非常昂貴和 '在雞印中生產疫苗的另一個缺點是這些疫苗通常 匕3雞蛋| ’在—些患者身上可能會出現過敏反應。此外， 不同於天然存在病毒的亞群的可能選擇需要備選的宿主細 胞系統。 相比雞印，基於細胞培養的用於流感疫苗生產的細胞 總是可以獲得的。它們可以深减儲存，並且在任何需要的 時候短時間解;東所需量以及進行繁殖。因此可以在任何需 要的時間點開始疫苗的生產。在出人意料的高需求或意想 不到的新病毒株大規模傳播的情況中，可以短期提供相應 的疫苗。 借助細胞培養的生產過程實現了在限定的受控條件下 於封閉標準化系統中生產用作疫苗的病毒。成品流感疫苗 由於觉控的生產方法而無需添加抗生素就可以獲得。由於 實現了完全不依賴雞卵製備細胞培養_流感疫苗，如此製備 的疫苗不包含蛋清，從而不會由於雞蛋清的不耐受而在患 者中引起過敏反應。 201211257 目前主要有以下三個細胞系用於製備流感疫苗：人 PER· C6 細胞、狗腎細胞（Madin Darby Canine Kidney)(MDCl〇 和長尾猴-腎細胞（Vero)。此外，目前開發了鴨-視網膜_ 細胞系（AGE1. CR)和胚胎鳥類（embryonale Vogel )-幹細胞 系。在哺乳動物細胞中製備疫苗雖然可以替代基於雞印製 備疫苗，但是這些細胞的生長需要血清和/或附著在固定的 載體上。所述這些加劇了在所述細胞中製備疫苗的難度並 增加了成本，這是因為出於安全原因考慮必須完全分離血 清’並且在固定載體上的生長是受限的，從而導致產量較 在哺乳動物細胞中製備疫苗的一個優勢在於，在細胞 培養基中分離和複製病毒不會導致偏離臨床野生型的表型 的傳代-依賴性選擇。因此病毒糖蛋白凝血素在自然形式中 表達，從而具有改善的特異性和親和性，並因此在人中實 現了細胞-介導的免疫力，其中病毒通過病毒糖蛋白凝血素 實現了在將被感染的細胞上的附著並整合入細胞。 因此，本發明的目的是提供改善的永久人細胞系用於 製備流感病毒型疫苗。 ' 該目的通過申請專利範圍中限定的主題得以實現 【發明内容】 本發明提供-種流感病毒型疫苗的製備方法，其 a)使流感病毒接觸永久人羊膜細胞，b)培養所述永、:· 膜細胞，c)實現流感病毒的表達，以及 σ養基中分離 4 201211257 所述流感病毒。 本發明更提供一種流感病毒型疫苗的 _万法，其包 括：a)使編碼流感病毒-蛋白的核酸分子接觸欠久人、 細胞，b)培養所述永久人羊膜細胞’ 〇實現編碼流感~4$ 蛋白的核酸分子的複製和/或流感病毒—蛋白的表達以及〇 從培養基甲分離編碼流感-蛋白的核酸分子和/或流感病毒 -蛋白。 本發明再提供一種永久人羊膜細胞在製備流感病毒型 疫苗中的用途。 本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例 僅用於進一步揭露本發明之技術内容，不應藉以限制本案 的發明範疇。 【實施方式】 在此使用的術語“流感病毒，’理解為正黏病毒 (Orthomyxoviren)的成員’其可以感染人和動物。在本文 中流感病毒區分為類型A、B和C。流感-A-病毒和流感-B-病毒歸為一類。流感—C-病毒由於其具有的7個基因片段而 區別於"il感-A-病毒和流感-B-病毒，流感-A-病毒和流感 B病毋為8個基因片段。另外，流感—A -病毒和流感-B-病毒分別編碼凝血素（ΗΑ)和神經氨酸苷酶（ΝΑ)，而流感-C-病毒則編碼結合了兩種性質的表面蛋白，凝血素—酯酶-融 合蛋白（HEF)。基於凝血素- (Η1-Η15)和神經氨酸苷酶 -(Ν1-Ν9)分子的序列，流感-a-病毒將進一步細分為亞型。 201211257 在此使用的術語“流感病毒-蛋白，’理解為蛋白戋流 感病毒的衍生物。流感病毒的衍生物通常為可以用作免卢 目的的流感病毒的蛋白或其一部分。流感病毒蛋白或衍生 物包括病毒包膜蛋白或其部分。具體地’流感病毒_蛋白包 括流感-A-蛋白、流感-B-蛋白或流感_c_蛋白，例如凝血素 (HA)、神經氨酸苷酶（NA)、核蛋白（NP)、基質蛋白（mi)和 (M2)、聚合酶蛋白（PB1)、（PB2)和（pA)和非結構蛋白（nsi) 和（NS2)和其部分。流感病毒-蛋白的部分包括流感—A—蛋 白、流感-B-蛋白或流感-C-蛋白的一種或多種表位。表位 可以是CD4+ Τ'細胞-表位，其表示這樣的一種肽，該肽包 含類MHC-類-II的結合基序以及通過贴^類七分子在抗 原表現的細胞的表面上表現，或者是CD8+ τ_細胞-表位， 其表示這樣的一種肽，該肽包含類〇^類_丨的結合基序 (Bindemotif)以及通過MHC_類_丨分子在抗原呈遞的細胞 表面上表現。例如允許算法模型、MHC_結合試驗 (Bindetest)、電腦模擬（/73 Si.7/c〇)抗原_鐾定方法和χ射 線晶體學方法允許鑒定可以連接多種MHC —分子的抗原。 在此使用的術語“疫苗”理解為生物學或基因技術製 備的抗原，其包括蛋白、蛋白_亞單位（Untereinheiten)、 肽、糖類、脂類、核酸、死亡或減弱病毒，其在本文中可 以有關整個的病毒顆粒或病毒顆粒部分或它們的組合。抗 原可以有至少一個表位例如τ_細胞_表位和/或8_細胞一表 位。所述抗原由免疫受體例如τ_細胞_受體或Β_細胞—受體 識別。使用疫苗後冑特異性激活針對某種病#的免疫系 201211257 統。這裏利用了免疫系統的反應，當存在病毒或它的特異 抗原時將引起免疫響應。這導致形成抗體和特異性τ_辅助 、.’田胞，其可以針對各種疾病提供持久的保護，根據不同的 病毒保護作用可以持續幾年或—輩子m括活疫苗或 死疫苗。活疫苗包含例如減毒的但還具有繁殖能力的病 毒其不此致病。而死疫苗的病毒則已被殺死或它僅包含 病毒的片段（抗原）。病毒的滅活（殺死）例如通過化學物質 例如曱醛、/3 -丙内酯和補骨脂素（Ps〇raien)實現。病毒包 膜被保存下來。也有類毒素疫苗，其僅包含病毒毒素的生 物失活組分（類毒素）（例如破傷風類毒素），這也屬於死疫 苗。具體地，死疫苗可以有關片段疫苗（Spaltiinpfst〇ff)， 其包含病毒包膜蛋白的片段。病毒包膜的破壞或分裂可以 例如通過/月潔劑或強有機溶劑實現。另外還可以用化學物 質使病毒失活或殺死病毒。另外還屬於死疫苗的有亞單位 疫苗（untereinheitimpfst〇f fe)，其包含病毒的具體成 刀，例如凝血素-蛋白和神經氨酸苷酶_蛋白。 在此使用的術語“流感病毒型疫苗（Inf luenzavirus_ basierter Impfstoff)”理解為所有的蛋白、肽或它們的 刀以及編碼流感病毒的這些蛋白、肽或它們的部分的 核酸，以及流感病毒顆粒本身，重組流感病毒_蛋白，包括 机感包膜蛋白、亞病毒顆粒，病毒樣顆粒（vu)，的 複合物’和/或它們的部分’其可以用於免疫目的對抗流感。 在此使用Hϋ劑”理解為可以調節抗原的免疫 原性的物質°輔劑例如礦物鹽、角Ϊ稀混合物、胞壁醯肽、 201211257 皂甙衍生物、分枝杆菌細胞壁製劑、破定的乳液、單鱗酸 類脂-A(M〇n〇Ph〇sph〇ryl-liPid —A)、黴菌酸（Myk〇ls如r〇_ 衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、qu i 1 A、霍亂一 毒素B的亞早位、聚碟腈（Polyphosphazene)和它的衍生 物、免疫刺激複合物、細胞因子輔劑、MF 5 9-輔劑、脂質輔 劑、粘膜輔劑、確定的細菌-外毒素、確定的寡核苷酸和 PLG 〇 在此使用的術語“羊膜細胞”理解為在羊水中存在且 月b夠通過羊水穿刺得到的所有細胞β該細胞要麼源於羊 膜’要麼源於與羊膜液接觸的胎組織。記載了基於形態學 心準區分的二大類羊膜細胞：成纖維樣細胞（F _細胞）、上 皮樣細胞（Ε-細胞）和羊水細胞（Amn iotic Fluid Cells， AF-細胞）（Hohn 等人，Pediat. Res. 8:746-754，1 974)。 AF-細胞是主導的細胞類型。 在此使用的術語“永久細胞系，，理解為這樣的細胞： 該細胞在遺傳上被改變’從而能夠在適合的培養條件下在 細胞培養液中永久持續生長。這種細胞也可稱為永生化細 胞。 在此使用的術語“原代細胞，’理解為通過直接從生物 體或組織提取所得到的並且經培養（丨n ku 11ur)的細胞。原 代細胞僅有非常有限的壽命。 在此使用的術語“轉染，，理解為所有適合於將所述核 酸引入到細胞中的方法。作為實例可指出經典的磷酸鈣 法、電穿孔、任何形式的脂質體體系及這些方法的組合。 201211257 在此使用的術肖“ CAP”理解為通過用腺病毒功能基 因E1A和E1B永生化原代人羊膜細胞而產生的永久人羊膜 細胞細胞系。 在此使用的術語“CAP-T”理解為另外用含有·SV4〇大 T-抗原序列的核酸分子所穩定轉染的CAp_細胞。 本發明的主題有關流感病毒型疫苗的製備方法，其包 括以下步驟： (i )使流感病毒接觸永久人細胞， (i i)培養所述永久人細胞， (i i i)實現流感病毒的表達，以及 (IV)從培養基中分離所述流感病毒。 在本發明方法中’在適合細胞生長的條件（例如溫度、 培養基、pH-值）下培養永久人細胞。有關溫度、培養基、 pH-值和其他的生長參數的條件是本領域技術人員已知 的’或者可以通過一般的方法獲知。當培養液實現了理想 的生長密度（Wachstumsdichte)時，將流感病毒用於細胞感 木。病毒需要幾天的時間在細胞的内部進行繁殖。在該繁 殖過程期間’大部分細胞死亡且病毒將釋放在培養基中。 通過例如離心分離含病毒的溶液和細胞碎片。之後通過例 如層析检從培養基溶液中分離出病毒且體積得以減小。這 之後’病毒可以通過例如化學方法被滅活。然後進行病毒 裂解°經過進一步的淨化和濃縮步驟，由此得到病毒株的 抗原濃縮物。 在—優選的實施方案中，流感病毒株A/PR/8/34、A/ 201211257

Uruguay/716/2007 ' A/Brisbane/59/2007 ' B/Florida/4/ 2006、豬流感（A/Swine (H1N2) Bakun^1832/00)或馬流感 (A/Equine，A/Newmarket/1/93 (H3N8))用於感染永久人細 胞0 在又一優選的實施方案中，感染永久人細胞用的流感 病毒預先在細胞上進行適應性處理（adapt ieren)，這裏優 選以上所列出的流感病毒。這樣的適應性處理優選歷經四 次傳代實現。優選在293SFMII-培養基或PEM-培養基中實 現bit感病毒的適應性。 本發明的又一主題有關流感病毒型疫苗的製備方法， 其包括以下步驟： (i)使編碼流感病毒-蛋白的核酸分子接觸永久人細 胞， (i i)培養該永久人細胞， (i i i)實現編碼流感-蛋白的核酸分子的複製和/或流 感-蛋白的表達，以及 (1 v)從培養基中分離編碼流感—蛋白的核酸分子和/或 流感病毒-蛋白。 在一優選的實施方案中’本發明方法中所使用的永久 人細胞有關永久人羊膜細胞。 在本發明的一優選實施方案中，永久人細胞在振蕩瓶 或生物反應器、優選STR—生物反應器或Wave_生物反應器 中進行培養。永久人細胞可以在多種培養基中培養，優選 在293SFMII-培養基或PEM_培養基中培養。另外可以向培 10 201211257 養基中加入丙酮酸鹽、穀氨醯胺、葡萄糖或其他的氨基酸。 培養基優選包含4mM或l〇mM丙酮酸鹽以及其他的氨基酸。 在本發明的又-優選實施方案中，培養時振蕩瓶中的 永久人細胞的開始細胞數目為5 χ 1〇5細胞/ml，更優選8 χ 105 細胞 / m 1。 在本發明的又一優選實施方案中，感染時間點時的培 養液的pH-值範圍為7.丨至7_8,更優選為73至75,還 更優選為7.3至7.5。 在本發明的又一優選實施方案中’在流感病毒感染永 久人細胞之前完全改變培養基或用培養基進行1:2_稀釋。 在本發明的一優選實施方案中，用於感染永久人細胞 的流感病毒胰蛋白酶濃度為i χ 1〇-4 細胞、i x 1〇_5 D/ 細胞、3 X 10 5 u/細胞、5 χ 1〇-5 u/細胞或 i x 1〇_6 u/ 細胞。當在感染永久人細胞之前培養基不改變時，流感病 毒感染細胞時的胰蛋白酶濃度優選為1 X 1〇-4 W細胞。當 在感染永久人細胞之前用培養基進行了丨：2_稀釋時，流感 病毒感染細胞時的胰蛋白酶濃度優選為5 χ丨〇_5 W細胞。 當在感染永久人細胞之前培養基完全改變時，流感病毒感 染細胞時的胰蛋白酶濃度優選為5 χ 1〇-6 W細胞。 在本發明的一優選實施方案中，用於感染永久人細胞 的病毒量的範圍以Μ0Ι-(複合感染）值給出為〇〇〇1至 0. 3。在本發明的一優選實施方案中，用於感染永久人細胞 的病毒罝的範圍以Μ0Ι-(複合感染）值給出為〇.25、0.1、 0. 06、0. 025或〇. 〇〇25。在用流感病毒A/PR/8/34感染永 11 201211257 久人細胞且在感染之前培養基不改變時，優選使用的病毒 量、以Μ0Ι-值給出、為〇. 25，以及在用流感病毒八/ Brisbane/59/2007感染永久人細胞且在感染之前培養基不 改變時，優選使用的病毒量、以M0I_值給出、為〇 . 1。在 用流感病毒A/PR/8/34感染永久人細胞且在感染之前捭養 基改變時，優選使用的病毒量、以M〇I_值給出、為〇. 1或 0. 25，以及在用流感病毒A/Brisbane/59/2〇〇7感染永久人 細胞且在感染之前培養基改變時，優選使用的病毒量、以 MOI-值給出、為0.06或〇 25，以及在用流感病毒 F1〇rida/4/2G()6感染永久人細胞且在感染之前培養基改變 時，優選使用的病毒量、以M〇I_值給出、為〇1、〇.〇25 或 0. 0025 。

在-優選實施方案中’在培養時的感染時間點，振蕩 航中的細胞數範_丨x 1()6至6 χ 1()6細胞/ιη卜感染時 間點時的細胞數優選為2_3,1〇6細胞/ml、45xi〇6細胞 /ml或5 X 1〇6細胞/mle在本發明的一優選實施方案中， 在感染時間點時的細胞數為45 χ 1〇6細胞/mi且在感染前 不改變培養基。在本發明的又—優選實施方案中，在感染 時間點時的細胞數為2. 3 XlQ6細胞⑽以及在感染前用新 鮮的培養基進行1:2_稀釋。在本發明的又—優選實施 方案中，在感染的時間點時的細胞數為5χΐ〇6細胞Μ且 在感染前完全改變培養基Q 在本發明的特別優選實施方案中，永久人細胞在！升 生物反應器STR(Sart〇rius)中於包含_穀氨醯胺和㈣ 12 201211257 開始細胞數為5 X 、為0. 025的流感 丙酮酸鹽的PEM-培養基中進行培養，其中 10細胞/ ml且用病毒量 '以Μ0Ι-值給出 病毒感染細胞數為2. 1 X 1〇6細胞/ml且在感染前培養基不 改變。感染優選在存在的胰蛋白酶的最終濃度為3 χ U/ml時實現。 在本發明的特別優選實施方案中，.永久人細胞在】升 生物反應器STR(Sartorius)中於PEM-培養基中進行培 養，其中開始細胞數為8 x 1〇5細胞/ml且用病毒量以 M0I-值給出、為0.025的流感病毒感染細胞且在感染前改 變培養基。感染優選在存在的胰蛋白酶的最終濃度為3X 1 (Γ5 U/ml時實現。 在本發明的又一特別優選實施方案中，永久人細胞在 1升振蕩瓶式反應器(Wave Biotech AG)中於包含械榖氨 醯胺、4mM丙酮酸鹽和20mM葡萄糖的PEM_培養基中進行培 養，其中開始細胞數為5 x 1〇5細胞/Ifll以及感染之前的： 胞數為2.1 X 1〇6細胞/ml且用病毒量、以Μ〇ι—值給出、 為0.025的流感病毒感染細胞以及在感染前培養基不改 變。感染優選在存在的胰蛋白酶的最後濃度為3χ 時實現。 在本發明的一優選實施方案中，永久人細胞在振蕩瓶 中於包含4mM縠氨醯胺和4mM丙酮酸鹽的PEM_培養基中進 行培養’ S中在存在的騰蛋白酶—濃度& 1 χ 1()_6…細胞 時用病毒量、以Μ0Ι-值給出、為〇 〇25的流感病毒感染細 胞之前改變培養基。 13 201211257 在本發明的一優選實施方案中，永久人細胞在振蕩瓶 中於包含4mM榖氨醯胺和4mM丙酮酸鹽的PEM_培養基中進 行培養，其中在存在的胰蛋白酶-濃度為1χ l〇_5 W細胞 時用病毒量 '以Μ0Ι-值給出、為0.025的流感病毒感染細 胞之前進行1 : 1-培養基改變。 在製備流感-蛋白和編碼流感_蛋白的核酸分子時，將 用編碼流感-蛋白的核酸分子轉染所培養的人細胞，然後使 用已知的方法分離和淨化流感病毒-蛋白或編碼流感-蛋白 的核酸分子。 在又一優選的實施方案中，在本發明方法中，在用病 毒顆粒感染的時間點或用編碼流感病毒_蛋白或其部分的 核酸分子的轉染時間點時’人細胞處於中間指數生長期 (miUier exponentieU Wachstumsphase)和靜止生長期令 或處於中間指數生長期和靜止生長期之間。細胞數目在時 間上的典型生長曲線顯示為s形曲線。該曲線開始為所謂 的停滞期Uag-Phase)，之後為對數期或指數期以及平穩 期。中間指數生長期在本文中相應於典型生長曲線的第— 個轉折點，其中轉折點是生長曲線上的-個點，在這一點 上曲線的形狀從凹轉變成凸或從凸轉變成凹。當生長曲線 達到平臺且因此細胞數目保持穩定時開始了平穩期。 通過本發明方法製備的編碼流感-蛋白的核酸可以用 於核酸-免疫作用或所謂❼勝疫苗。在核酸_免疫作用 中，接種免疫抗原’即誘發人體產生免疫響應的抗原。這 些免疫抗原將通過DNA或職進行編碼以及作為表達盒或 14 201211257 表達載體存在或整合入病毒載體中，以誘導對基因產物的 免疫響應。DNA-疫苗可以以不同的給藥體系存在，例如， 作為DNA或RNA，以線性或圓形質粒或表達盒 (Expressionskassetten)的形式，其中這些裝配了表達所 需的元素，例如啟動子、聚腺苷酸化位點、複製起點等。 在給藥DNA時，所述這些主要存在於包含輔劑或不包含輔 劑的緩衝液中或連接納米顆粒或整合入包含輔劑的化合物 或病毒或細菌載體中。而八_疫苗不僅可以引起人的免疫性 而且可以引起細胞-介導的免疫性。DNA_疫苗的一個優勢在 於抗原以它們的天_式進行表達且因此引起改進的免疫 作用。DNA-疫苗的另一優勢在於與減毒的活疫苗不同，⑽a — 疫苗是非感染性的且可以不再是有毒的。 以DNA或RNA形式連結在顆粒上的質粒或線性職-片 段的DNA-疫苗的給藥可以通過注射或借助基因搶實現。直 中注射用的疫苗可以置於例如生理鹽水或緩衝生理鹽 、、、馬化感其《的极毆、流感- 贫白和流感病毒可以用你 用作對抗流感病毒_類型一A和厂 和/或-C的疫苗。 一 通過本發明方法製備 IL执病毒型疫苗包括所有的蛋 白、肽或它們的部分，以及 蛋 ^ 及編碼&感病毒的蛋白、肽戋它 蛋自 # A, rV' 身、重組流感病毒〜 蛋白，其包括流感、包膜蛋白、 (VLP^ , viP ^ 扃毒顆粒，病毒樣顆粒 (VLP)，VLP的複合物，和 J。丨分，其可以用於免 15 201211257 疫目的對抗流感。 通過本發明方法製備的流感-蛋白優選有關蛋白或流 感病毒的衍生物’優選流感病毒株A/PR/8/34、A/Uruguay/ 716/2007 、 A/Brisbane/59/2007 、 B/Florida/4/2006 、豬 流感（A/Swine (H1N2) Bakum/1 832/OO)或馬流感（A/Equine A/Newmarket/1/93 (H3N8))。 通過常規方法分離和淨化通過本發明方法製備的編碼 流感病毒-蛋白或它的部分的核酸且對於本領域技術人員 而言是已知的。 通過本發明方法製備的流感病毒_蛋白的分離和淨化 借助本領域技術人員已知的方法實現。蛋白的製備首先取 決於其來源。區別對待細胞内和細胞外蛋白。當蛋白位於 ”’田胞體的内部時’則首先需要通過例如剪切力或滲透力 (〇議lyse)破壞細胞。之後例如通過離心來分離不溶材料 如細胞膜和細胞壁。以標準方式進行的離心用於分離細 胞、細胞器和蛋白。就分籬能六t & θ 就刀離此力方面而言，更有效的方法 疋脈衝電泳（Pulselektr〇ph〇rese)。 上、、 災刀雖了其他的細朐 成为之後還有必要分離多種大蛋白、 ^ _ 肽和氦基酸。蛋白的 刀離可以通過一維或二維凝膠電 4毛細管電泳實現。右 氰基酸和肽領域，則使用例如色詳 、 仕 Λ r . a ，如親和力_，離子 乂換（IEC)和反相色譜法（RPC)。 φ ^ ^ ^ 的存在以及分離的必 要性或蛋白酶的滅活不利於淨化 出在A L # 用。不必從細胞中提取 出存在於細胞外基質中的蛋白，但b 取 成分之後，細胞外基質十的蛋白 二離了所有的不溶 】疋非常稀釋的且其數量 16 201211257 通常顯著低於細胞内蛋白。 使用本領域技術人員已知的方法分離和淨化通過本發 明方法製備的流感病毒-顆粒。這些方法的實例例如密度梯 度-差速-或區帶離心作用。 本發明方法中所使用的永久人細胞通過原代人細胞的 永生化作用產生。原代人細胞通過直接取自有機體或來自 有機體和保存在培養液中的組織而獲得。優選這樣的原代 人細胞’其可以通過細胞-轉染因子進行表達從而很好地轉 化至永久人細胞系，特別是羊膜細胞、胚胎視網膜細胞 (embryonale Ret inaze 1 len)還有神經細胞起源的胚胎細 胞（embryonale Zellen neuronalen Ursprungs)。 細胞-轉染因子可以是SV40的T-抗原（基因庫登錄編 號（Acc. Nr.)J02400)、HPV的Ε6-和Ε7-基因產物（例如 HPV16，基因庫登錄編號K02718)和人腺病毒的E1A-和 E1B-基因產物（例如人腺病毒血清型_5，基因庫登錄編號 X02996)。通過人腺病毒的E1和Ε1Α_^σ E1B_基因產物的核 酸序列的表達轉染原代細胞以進行永生化作用。在通過自 然獲得的HPV進行表達時，E6和E7可以由RNA-轉錄物表 達。同樣的適用於天然存在的腺病毒的ElA和E1B的表達。 細胞-轉染因子例如腺病毒E卜功能基因作用於永生化作用 或轉化且因此作用於細胞的長期可培養性 (Kultivierbarkeit) ° 細胞-轉染因子的表達可以在同源（homologen)啟動子 或轉錄末端因子（Termination selemente)的控制下實現， 17 201211257 例如自然E1A-啟動子和腺病毒E1A_功能基因的表達用的 自然E1A-聚腺苷酸化位點。用於轉染的各病毒基因組的核 @文分子片段例如用於轉染的腺病毒基因組的核酸分子片段 包含所謂的功能基因，例如E1A、E1B。然而細胞_轉染因 子的表達也可以在非同源（heterologer)、不是天然存在的 具有所用編碼區域的啟動子或轉錄物末端因子的控制下實 現。作為非同源啟動子可以是例如CMV-(巨細胞病毒 (Cytomegalievirus)-)啟動子（Makrides， 9_26 in:

Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) ' EF-1a -啟動子（Kim 等，Gene 91:21 7-223，1 990)、CAG-啟動子（人 巨細胞極早期啟動子和具有内含子的改性雞冷—Akt i n啟 動子的混合啟動子（Hybridpromotor))(Niwa等，Gene 108:193-199，1991)、人或鼠pgk-(磷酸甘油酸激酶-)啟 動子（Adra 等，Gene 60:65-74，1987)、RSV-(勞氏肉瘤病 毒-）啟動子（Makrides，9-26 in: Makrides (Hrsg. )，Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam， 2003)或 SV40-(猿猴病毒 40-)啟動子 (Makrides, 9-26 in： Makrides (Hrsg. ), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam，2003)。作為聚腺苷酸化位點可以使用例如 SV40大T-抗原（基因庫登錄編號J02400)的聚腺苷酸化序 列或人G-CSF-(粒細胞集落刺激因子，granulocyte colony stimulating factor)基因（Mizushima und Nagata, Nucl. 18 201211257 . Acids Res· 18:5322，1 990)的聚腺苷酸化序列。 通過用含有編碼E1A和E1B的核酸序列的核酸分子轉 染原代人細胞，該細胞得以永生化。用於原代人細胞永生 化的核酸分子含有E1A-和E1B-核酸序列，該核酸序列優選 源自人腺病脅，特別是人血清型5。在優選的實施方式中， 用於永生化的核酸分子，除編碼E1A和E1B的核酸序列外， 還含有編碼腺病毒ρίχ-功能基因的核酸序列。該WX—多 肽，一種病毒結構蛋白，作為轉錄激活物作用於各種病毒 和細胞啟動子例如胸苷激酶啟動子和万—珠蛋白_啟動子。 如果重組多肽的編碼序列在上述啟動子的控制下時，在細 胞中額外表達的ρ IX-多肽的轉錄激活作用可以在本發明製 備的細胞系中提高重組多肽的表達速率。作為實例的序列 可見基因庫登錄編號Χ02996中。特別地，核酸分子包括人 腺病毒血清型-5的核苷酸1至4344、505至3522或核苦 酸 505 至 4079 。 在一優選實施方案中’用於永生化原代細胞具體是羊 膜細胞的核酸分子包含腺病毒血清型5核苷酸序列的核脊 酸505至核苷酸4079。在又一特別優選的實施方案中，用 於永生化原代細胞具體是羊膜細胞的核酸分子包含腺病毒 血清型-5-核苷酸序列的核苷酸505至核苷酸3522。在又 一特別優選的實施方案中，用於永生化原代細胞具體是羊 膜細胞的核酸分子包含腺病毒血清型-5-核苷酸序列的核 苷酸1至核苷酸4344，其相應於ΗΕΚ293-細胞中的腺病毒 DNA(Louis 等，Virology 233:423-429， 1997)。另外，永 19 201211257 生化的人細胞可以表達病毒複製因子。這些複製因子可以 ，’σ至通過轉染引入的核酸分子的複製起點（丨，“複製 的起點”）且由此開始了附加型核酸分子的複製。細胞中的 核酸分子的附加型複製，特別是質粒_DNA的附加型複製使 得被轉染的核酸分子的拷貝數目大大增加且從而增強了在 該分子上編碼的重組多肽的表達及其經若干細胞分裂的接 收。這樣的病毒複製因子是例如猿猴病毒40(SV40)的T-抗原，其在結合在核酸分子上的稱作SV40-複製起點（SV40 or 1，複製的起點）序列上以後，例如質粒_dna，開始其複 製。艾伯斯坦-巴爾-病毒(Ebstein_Bar卜Virus)蛋白 EBNA-K艾伯斯坦巴爾病毒核抗原-丨）識別稱作的複 製起點和催化攜帶ori_P的核酸分子的染色體外複製。猿 猴病毒4〇(SV40)的τ_抗原不僅用作複製因子激活複製，而 且也對-些病毒和細胞基因的轉錄起激活的作用⑽，

John and Khoury, George, 1985, Molecular and Cellular —V〇1. 5, 6, P· 1391 t0 1399)。 在本發明方法中使用的永生化人細胞特別是永生化人 羊膜細胞。在—優選實施方案中，本發明方法中使用的永 ^化人細胞表達了漏的大T-抗原或艾伯斯坦H病 毋⑽）核抗原歷―1)。在-特別優選的實施方案中， 在本發明方法中使用的永生化人羊膜-細胞表達了別〇的 大Τ抗原或艾伯斯扭- 彳、 巴爾-病毒（ΕΒΌ核抗原 1 在又-特別優選的實施方案尹，在本發明方 法中使用的永生化人細胞，特 J疋手膜—細胞在CAG-、RSy- 20 201211257 或CMV-啟動子的控制下表達了 SV40的大T-抗原。 在本發明方法中使用的永久人羊膜細胞具體記載在專 利ΕΡ 1230354和ΕΡ 1948789中。在一特別優選的實施方 案中，本發明方法中使用的永久人羊膜細胞有關CAP或 CAP-T ° 在CAP-細胞的情況中，用質粒轉染原代羊膜細胞，該 質粒包含鼠pgk啟動子、包含Ad5-序列nt. 505-3522的 總E卜區、SV40的3’接頭（Spleifi)-和聚腺苷酸化信號和 Ad5(nt. 3485-4079)的pIX-區。這些質粒已詳細記載在Ep 1 948 789 中。 為了製備CAP-T-細胞，用質粒轉染CAP-細胞，該質粒 包含SV40的T-抗原的表達盒（側接有SV40的内含子 (flankiert von einem Intron aus SV40))和聚腺苷酸化 位點。另外’質粒可以包含CAG-啟動子（包含CMV-增強子 和雞/3-Aktin啟動子的混合啟動子）（Niwa等人，Genel〇8: 193-199，1991)、RSV-啟動子（源自勞氏肉瘤病毒的啟動 子）（基因庫登錄編號DQ075935)或CMV-啟動子（人巨細胞 病毒早期啟動子）（SEQ IDN0:5)。為了生成穩定的細胞系， 貝粒包含具有泛素啟動子（Ubi quit inpromotor) (pUB/ Bsd， Invitr〇gen #V512-20)的滅菌素（Blasticidin)-表達盒。 另外’在本發明提供的方法中，人細胞，特別是羊膜 細胞，可以在懸浮液中生長。此外，在本發明方法中，人 細胞，特別是羊膜細胞，可以在不含血清的培養基中培養。 本發明的又一主題是永久人細胞，特別是羊膜細胞， 21 201211257 在製備流感病毒型疫苗中的用途。 在一優選實施方案中，用於製備流感病毒型疫苗的永 久人羊膜細胞有關CAP-或CAP-Τ-細胞。 通過本發明方法製備的流感病毒型疫苗可以是流感病 毒和/或流感病毒-蛋白或編碼流感—蛋白的核酸分子。疫苗 可以腸胃外注射給藥。這襄分為皮内的、皮下的或肌内的 庄射。皮内/主射可以通過疫苗接種搶（Impfpistole)或刺血 針實現。肌内注射可以在上臂、大腿或臀部肌肉處實現。 另外’疫苗可以口服或經鼻給藥。疫苗可以例如給藥於人 和動物。 通過本發明方法製備的流感病毒型疫苗可以不僅通過 主動免疫而且通過被動免疫賦予對抗一種或多種流感病毒 的抵抗力。在主動免疫時，疫苗在使用之後用於特異激活 人和動物針對確定的病毒的免疫系統。這裏利用免疫系統 的反應’在存在病毒或其特異病原時引起免疫響應。這導 致形成抗體和特異T-輔助細胞，其可以針對各種疾病提供 持久的保護，根據不同的病毒保護作用可以持續幾年或一 輩子。 通過本發明方法製備的流感病毒型疫苗可以例如有關 活疫苗或死疫苗。活疫苗包含例如減毒的但還具有繁殖能 力的病毒，其不能致病。而死疫苗的病毒則已被殺死或它 僅包含病毒的片段（抗原）。病毒的滅活（殺死）例如通過化 學物質/物質組合例如曱醛、/5 -丙内酯和補骨脂素實現。 病毒包膜被保存下來。也有類毒素疫苗，其僅包含病毒毒 22 201211257 素的生物失活組分（類毒素）（例如破傷風類毒素），這也屬 於死疫苗。具體地，死疫苗可以有關片段疫苗 (Spaltimpfstoff) ’其包含病毒包膜蛋白的片段。病毒包 膜的破壞（为裂）可以例如通過清潔劑或強有機溶劑實現。 另外還可以用化學物質使病毒失活（殺死）病毒。另外還屬 於死疫釦的有亞單位疫苗（Un t e r e i nhe i t i mp f s t 〇 f f e)，其 包含特疋的病毒成分，例如凝血素_和神經氨酸苷酶_蛋白。 在被動免疫時，通過本發明方法製備的流感病毒型疫 田向已經獲彳寸被誘發的抗血清的宿主（例如哺乳動物）給 藥，以及向感染了至少一種流感病毒的接受者給藥。 另外，向疫苗中加入一種或多種添加劑，如穩定劑、 中和劑、載體和保存劑，用於給藥。此外，甲醛、硫柳汞 (Thiomersal)、磷酸|呂、Azeton和苯酌也屬於這些物質。 另外，可以向疫苗中加入輔劑以強化疫苗的效用。這些所 謂的輔劑本身應該盡可能不具有藥效且具體地用作助溶劑 (I^sungsvermittlei·)、乳液或它們的混合物。輔劑是例如 礦物鹽、角鯊烯混合物、胞壁醯肽、皂甙衍生物、分枝杆 菌細胞壁裝劑、特疋的乳液、單填酸類脂_A、黴菌酸 (Mykolsaure)-衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、 Quil A、霍亂-毒素B的亞單位、聚磷腈和它的衍生物、免 疫刺激複合物、細胞因子輔劑、MF59_輔劑、脂質輔劑、枯 膜輔劑、確定的細菌-外毒素、確定的寡核苷酸和pLG。 下文實施例闡述了本發明，並且並不理解為限制性 的。如果沒有另外注明，則使用的是分子生物學標準方法， 23 201211257 例如 Sambrook 等，1989， Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auf1 age, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 中所 記載的。 實施例1:永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5在PEM-或 293SFMII-培養基中的培養試驗 永久羊膜細胞系 CAP-1D5在 100ml不含血清的 293SFMII-培養基（Invitrogen)或 PEM-培養基（Invitrogen) 中於37°C、8% C〇2和1 OOrpm時進行培養。作為對照，在 100ml振蕩瓶中於100ml不含血清的SMIF8-培養基中使用 永久犬腎細胞系 MDCK.SUS2(Madin Darby Canine Kidney, 在懸浮液中適應生長）（Lohr等人，2010， 28(38):6256-64)。 在時間點0 P培#的鏢始淼；)以及分別在24小時的時 間間隔上測定活細胞數、死細胞數、細胞系的存活率以及 pH-值、培養基中的葡萄糖、乳糖、穀氨醯胺、銨、谷氨酸 以及丙酮酸鹽的濃度（生物化學多參數分析系統）（Lohr等， hccke，2009，27(37)，4975-4982 ; Genzel 等，知p/ Microbiol Biotechnol., 2010 ,88(2):461-75)° 永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5在293SFMII-以及PEM- 培養基中的活細胞數以及MDCK. SUS2-細胞的活細胞數從培 養開始時候每毫升培養液約2 X 105細胞就顯示了相似的 曲線以及在168小時後實現的活細胞數為約每毫升2 X 1 〇6 細胞。MDCK. SUS2-細胞的活細胞數從1 92小時起減小至每 24 201211257 毫升9 x l〇5細胞且至生長曲線開始後的24〇小時保持穩 定。在293SFMII-培養基中的永久羊膜細胞細胞系cAp_1D5 的活細胞數在216小時時才減小至每毫升培養液2 χ 1〇5 細胞的初始值’而在ΡΕΜ培養基中的CAp_lD5_細胞的活細 胞數保持穩定為每毫升培養液約2 5 χ 1〇6細胞直到24〇 小時，且在312小時後才達到2 χ i 〇5細胞的活細胞數的 初始值。 在2 93SFMII-培養基和pEM-培養基中的CAp_1D5_細胞 的存活率以及MDCK. SUS2-細胞的存活率在生長曲線開始時 和直到1 68小時時在80%和90%之間。在PEM-培養基中的 CAP-1D5-細胞的存活率至240小時保持為80%，之後減小 且在312小時後顯示為ι〇%。在293SFMII_培養基中的 CAP-1 D5-細胞的存活率在168小時後就緩慢減小以及在 21M、時後顯示為約10%e MDCK別82_細胞的存活率在168 小時後連續減小且在240小時後達到約45%。 MDCK.SUS2-細胞的培養液的pH-值保持超過240小時 的相對穩定’其介於7.7和7.6之間。而在293SFMII -培 養基以及PEM-培養基中的CAP-1D5-細胞的培養液的pjf-值 (開始時為7. 4)在240小時（293SFMII-培養基）和312小時 (P E Μ -培養基）後持續減小至ρ Η 6. 4。 在CAP-1D5-細胞的各培養液的293SFMII-培養基和 ΡΕΜ-培養基中的乳糖-濃度從小於5mM的開始濃度直到24〇 小時增加至30 - 35mM。在MDCK.SUS2-細胞的培養液中，乳 糖-丨辰度以較小強度增加，但是2 4 0小時時達到與c A P -1D 5 _ 25 201211257 細胞的培養液類似的值。在293SFMII_培養基和pEM—培養 基中的CAP-1D5-細胞的培養液以及MDCK.SUS2-細胞的培 養液的硝萄糖-濃度從培養開始時的2〇至2 5mM減小至小於 10mM’其中在293SFMII-培養基中的CAP-1D5-細胞培養液 顯示了最強的降低。 在2 93SFMII-培養基以及pEM —培養基中的CAP_1D5一細 胞培養液中的銨-濃度的增加顯示了非常相似的曲線（從 〈〇. 5增加至4-5mM)。而在MDCK. SUS2-細胞的培養液中的 铵-濃度顯著更強地增加（至7mM)。在293SFMII-培養基以 及PEM-培養基中的CAP-1D5-細胞培養液中的穀氨醯胺-濃 度的減小的曲線也是非常相似的，其中在PEM_培養基中的 培養液顯不了最強的降低。 MDCK. SUS2 -細胞培養液顯示了最大的谷氨酸-濃度且 該濃度僅少量增加。在PEM-培養基中的CAP-1D5-細胞培養 液中的谷氨酸-濃度在培養開始時高於在29 3SFMII-培養基 中的濃度且持續增加。在MDCK. SUS2-細胞的培養液中的丙 酮酸鹽-濃度自144小時起減小至〇。而在PEM_培養基和 293SFMII-培養基中的CAP-1D5-細胞的培養液中的丙酮酸 鹽在48小時時就消耗了。 因此顯示了 CAP-1D5-細胞在PEM-培養基中比在 293SFMII-培養基中更好地生長，PEM-培養基中的CAP-1D5- 細胞顯示了最強的葡萄糖消耗和最強的乳糖-形成。自1 92 小時起的葡萄糖限制可以解釋為在PEM-培養基中的 CAP-1D5-細胞的細胞數的突降（Einbruch)。為了優化 26 201211257 CAP-1D5-細胞在PEM_培養基或293SFMII_培養基中的培養 液的培養條件，pH_值的穩定、丙酮酸鹽和穀氨醯胺的添加 以及葡萄糖可以是相關的。 貫施例2 :用未經適應的病毒的病毒感染 針對用未經適應的病毒進行的感染試驗，羊膜細胞系 CAP-1D5 在 55ml 不含血清的 293SFMII-培養基（Invitrogen) 和 PEM-培養基（invitr〇gen)中於 37〇c、8% c〇2 ' 1〇〇rpm 時 在振蕩瓶中培養。犬腎細胞系MDCK. SUS2(Madin Darby Can i ne K i dney，在懸浮液中適應）用作對照。 分別列在表1中的細胞密度用病毒B/Fl〇rida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control)或 A/PR/8/34CH1N1)(RKI, Robert-Koch-Institut)進行感染，其中培養基不改變以及 加入5 X 1(T6 U/mL·胰蛋白酶。所生成的病毒顆粒量通過滴 定凝血素（HA，根據標準方法進行的凝血素測試）確定（表 示為 logHA-單位/1〇〇^1;表2〇〇8; Biologicals 36(3): 145-61)。在表1中還列出了該時間點 上的各培養基的pH~~值。 表1:通過非適應性病毒在培養基不改變時進行的病毒感染試驗的概況 細胞培養基病毒 在I時的pH HA, 1D5 1D5 293SFM PEM B/Florida B/Florida 2. 70E+06 2.40E+06 6.6 6.6 0.87 0 1D5 293SFM A/PR/8/34 2. 70E+06 6.6 1.19 1D5 PEM A/PR/8/34 2.50E+06 6.6 0 MDCKsus SMIF8 B/Florida 1.50E+06 7.5 0 MDCKsus SMIF8 A/PR/8/34 1. 60E+06 7.7 1.84 hpi:感染後的小時數 27 201211257 對於永久羊膜細胞系CAP-1D5，在PEM-培養基中培養 時’用病毒 B/Florida/4/2006(B/Florida)和用病毒 A/PR/8/34感染時均未能證實病毒顆粒的產生。在293SFM-培養基中A/PR/8/34(HlNl)的最大HA-值小於MDCK. SUS2實 現的最大HA-值。在CAP-1D5的所有感染的情況中的最大 HA時的pH-值是可比較的（pH6. 6) ’但是顯著小於感染的 MDCK. SUS2-細胞（pH7. 7)。 因此’在所測試的條件下，僅在使用病毒B/F1 ori da 時’永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5發生感染。在永久犬腎 細胞系 MDCK.SUS2(Madin Darby Canine Kidney)的情況 中，則僅在使用病毒A/PR/8/34 (HI Nl)時證實發生了感染。 以下實驗將測試是否可以通過在CAP-1D5-細胞上進行病毒 的預先的適應實現更好的感染從而獲得更高的病毒產率。 實施例3:在振蕩瓶中於PEM-和293SFMII-培養基中在 CAP-1D5-細胞上的病毒適應性 在振蕩瓶中於PEM-培養基和293SFMII-培養基中通過 歷經四代感染CAP-1D5實現流感病毒A/PR/8/34CH1N1) (RKI， Robert-Koch-1 nstitut) ' A/Uruguay/71 6/2007 (H3N2)(NYMC X-175C, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control)或 B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Contro 1)的病毒適應性。每次感染前改變 培養基。每代期間的病毒產量通過滴定凝血素（1 og HA-單 位/100" 1)和半數組織培養感染量（Tissue Culture 28 201211257

Infectious Doses。Assay)(TCID5〇，病毒數/ml)進行定量 (Genzel and Reichl， Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing in Methods in Biotechnology: Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols ； Eds. R. Portner ； HUMANA Press Inc., Totowa，New Jersey, 2007，457-473 ; Kalbfuss 等，2008 ; Biologicals 36(3):145-61)。 不僅在PEM-培養基中而且在293SFMII-培養基中，被 流感病毒 A/PR/8/34CH1N1)和 A/Uruguay/71 6/2007 (H3N2) 感染的CAP-1D5-細胞在四代後顯示了顯著增加的病毒滴 度。被流感病毒B/Florida/4/2006感染的CAP-1D5-細胞 不僅在293SFMII-培養基中的培養時而且在PEM-培養基中 的培養時在第二代中顯示了顯著增加的病毒滴度。被流感 病毒 A/PR/8/34CH1N1)或 A/Uruguay/716/2007(H3N2)感染 的CAP-1D5-細胞不僅在PEM-培養基中而且在293SFMII-培 養基中的HA-值的滴定也顯示了可比較的增加。 除了適應後病毒滴度增加’隨著每次傳代病毒的複製 更快且病毒滴度最終顯著增加。總體而言，相比較PEM-培 養基而言，293SFMII-培養基中實現了略微增加的病毒滴 度。 實施例4: CAP-1D5-和MDCK.SUS2-細胞被適應性流感病毒 A/PR/8/34感染的M0I (複合感染）-依賴性 通過經適應的流感病毒 A/PR/8/34CH1N1 ; RKI， Robert-Koch- Inst i tut)，在3個不同的M0I (複合感染）數 29 201211257 值以及每個宿主細胞的病毒顆粒數為〇. 〇〇25、〇. 〇25和 0.25時檢查MOI-依賴性。在振蕩瓶中，永久羊膜細胞 CAP-1D5在293SFMII-培養基或PEM-培養基以及永久犬腎 細胞MDCK.SUS2在SMIF8-培養基中用適應性流感病毒 A/PR/8/34的不同MOI進行感染。在感染時，額外預先改 變培養基’其具有幾乎恒定的pH-值，約pH = 7_ 5 ^接著， 在96小時之後的活細胞數以及在U4小時之後的病毒顆粒 量（log HA-單位/ΙΟΟμΙ)通過根據標準方法的凝血素測試 的凝血素滴定進行測定。 在293SFM-培養基中的CAP_1D5_細胞培養液以及在 SMIF8-培養基中的MDCK. SUS2-細胞培養液中的活細胞數的 曲線以及所形成的病毒顆粒量的曲線未顯示關卜值的依賴 性。在兩個培養液中的病毒滴度增加且超過2. 5 1叫 單位/100" 1。PEM-培養基中的cap_1D5—細胞培養液在所 有二個M0I-值時顯示了更小的病毒顆粒量（約2 〇 單位/100//1)。在？£1«-培養基中的（^?_1])5-細胞培養液的 活細胞數相應地大於48小時保持穩定且為lxl〇6細胞/ml 以及之後減小至小於lxl〇4細胞/m卜與此相反，在293sfm— 培養基中的CAP-1D5-細胞培養液的活細胞數以及 MDCK. SUS2-細胞培養液中的活細胞數在96小時後從i X 細胞/ml持續減小至小於i χ i〇4細胞/ml。在所有的培養 液中，在M0I為〇. 〇〇25時可見病毒複製略微減緩，其通過 與M0I值更大時相比在時間上1〇g HA_單位增加有所減緩 得以證實。 30 201211257 實施例5:在1L容量中感染（經A/PR/8/34適應）培養 CAP-1D5-細胞在1升生物反應器中於包含4mM榖氨醯 胺和4mM丙酮酸鹽的PEM-培養基令且在85rpm、ρΗ = 7. 2和 用純氧在氧分壓p(h為40%時進行培養。開始細胞數為5 χ 1 05 細胞 / mL。 在114小時的生長和細胞數為2. 4 X 1〇6細胞/mi後， CAP-1D5-細胞被流感病毒a/PR/8/34(經適應的：在PEM中， 第四代，1·78 X 10病毒/mL)感染。預先不改變培養基， 但疋加入80ml PEM-培養基，以及谷氨酸鹽和丙酮酸鹽的 最終濃度分別為2mM。MO I值為〇· 〇25且加入最終濃度為1 X 1 0 5 U/mL的胰蛋白酶。240小時後，相隔24小時測定活 細胞數、死細胞數和細胞系的存活率以及培養基中的pH_ 值、葡萄糖、乳糖、榖氨醯胺、銨、谷氨酸和丙酮酸鹽的 濃度。另外’從感染的時間點（114小時）起，測定i〇g HA- 單位/100//1 和 TCIDse-值（Genzel and Reichl, Vaccine production - state of the art and future needs in upstresin processing in Methods in Biotechnology' Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols ； Eds. R. Pόrtπθr > HUMANA Press Inc. , Totows, New Jgtsgy 2007， 457-473 ; Kalbfuss 等，2008 ; Biologicals 36(3):145-61)。 CAP-1D5-細胞的活細胞數首先增加直至被流感病毒 A/PR/8/34感染，從6 X 105細胞/ml增加至2, 4 X 106細 胞/ml且在感染後又減小一些。CAP-1D5-細胞的存活率在 31 201211257 整個時間段上介於80%和90%之間且在240小時後才減小至 70%。培養液中的丙酮酸鹽-濃度在72小時内減小至〇，在 被流感病毒感染時所加入的丙酮酸鹽量在1 〇小時内也被 消耗。在整個時間段上谷氨酸鹽—濃度持續增加，且從約 ImM增加至約1. 8mM。培養液的pH-值在觀察時間段上在7.】 至7.4之間浮動。實現的最大TCIDw-滴度為2.4 X 1〇7病 毒/mL，最大HA-滴度為2· 2 log HA-單位/1〇〇μ1。 該生長試驗的結果顯示，由於加入丙酮酸鹽，未出現 葡萄糖限制（Glucose 1 i mi tier ung)，因此活細胞數未增加。 實施例6 :在50ml-Falcons於PEM-和293SFMII-培養基中 於CAP-1D5細胞上的病毒適應性 流感病毒 A/Brisbane/59/2007(HlNl-樣 HGR; IVR-148, NIBSC， The National Institute for Biological Standards and Control) ' B/Florida/4/2006(NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control)、豬流感（A/Swine(HlN2) Bakum/1832/00 ; IDT Biologika)和馬流感（A/Equine2(H3N8) ; A/Newmarket/l/ 93 ； NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control)的病毒適應性通過在 50ml Falcon-容器中於PEM-培養基和293SFMII-培養基中歷經 四代CAP-1D5的感染實現。在每次感染前改變培養基。每 代期間的病毒產量通過滴定凝血素（log HA-單位/ΙΟΟμΙ) 和半數組織培養感染量（TCIIho,病毒數/ml)進行定量 (Genzel and Reichl, Vaccine production _ state of the 32 201211257 art and future needs in upstream processing in Methods in Biotechnology： Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols'，Eds. R. Portner ； HUMANA Press Inc.,

Totowa， New Jersey, 2007， 457-473; Kalbfuss 等，2008 ; Biologicals 36(3):145-61)。 不僅在PEM-培養基中而且在293SFMII-培養基中，流 感病毒 A/Brisbane/59/2007 和 B/Florida/4/2006 對 CAP- iDS-細胞的感染在 4 代後的 病毒滴 度顯著增加， 其中在 2 9 3SFMII-培養基中的病毒滴度的增加更強烈。不僅在pem-培養基中而且在293SFMII-培養基中CAP-1D5-細胞被流感 病毒 A/Brisbane/59/200 7 或 B/Florida/4/2006 感染時的 HA-值的滴定也顯示了可比較的增加。不僅在PEM-培養基 中而且在293SFMII-培養基中用豬流感病毒感染CAP-1D5- 細胞引起了 HA-值的滴定的增加。 除了傳代後病毒滴度增加，隨著每次傳代病毒的複製 更快且病毒滴度最終顯著增加。總體而言，相比較四]^_培 養基而言’ 293SFMII-培養基中實現了略微增加的病毒滴 度。 實施例7 :開始細胞數增加時永久羊膜細胞細胞系 CAP-1D5的培養試驗 永久羊膜細胞系CAP-1D5在l〇〇ml PEM-培養基 (Invitrogen)中於 37°C、8% C〇2 和 185rpm 時進行培養。 開始細胞數為5 X 1〇5細胞/ml或8 X 1〇5細胞/ml。另外， 在開始細胞數增加的設置（Ansatzen)中加入最終濃度為 33 201211257 4mM或1 OmM的丙酮酸鹽和其他的氨基酸。 在時間點0 ~培#的鏢始，點J以及分別在24小時的時 間間隔上測定活細胞數、死細胞數、細胞系的存活率以及 pH-值、培養基中的葡萄糖、乳糖、榖氨醯胺、銨、谷氨酸 以及丙酮酸鹽的濃度（生物化學多參數分析系統）（L〇hr等， 2009，27(36)，4975-4982 ;GenZel 等，如p/ 2010 ,88(2):46卜75)。 通過開始細胞數的增加，從培養開始時的每毫升培養 液約5 X 1〇5細胞增加至每毫升pEM_培養基中的永久羊膜 細胞細胞系CAP-1D5培養液8 x 105細胞，在9〇小時後實 現每ml培養液1 x 106細胞的更大產量。從而在典型的感 染時間點（培養的初始點後約96小時至12〇小時）實現了每 毫升培養液5 - 6 X 1 〇6細胞的細胞數。 在典型的感染時間點（培養的初始點後約9 6小時至 120小時）時的培養液的pH_值位於6. 6 — 6. 8臨界範圍中。 感染時的pH-值優選為約7 2_7.4。 實把例8:騰蛋白酶活性的曲線和改變培養基或用培養基 進行1 : 2-稀釋對病毒滴度的影響 在該實驗中對病毒感染時的不同騰蛋白酶濃度的使用 和培養基改變或培養基的丨.2_ I丞的1 . Z稀釋對病毒滴度的影響進行 在振蕩瓶中，永久羊膜細胞系CAP_1D5在分 开金酿』-A ^ w ^ 丙酮鲅瓜和4_榖氨醯胺的1〇〇丨p 中且扁W。广〇 rtM培養基（Invur〇gen ⑽和185rpm時進行培養。在培養的開 34 201211257 始時間點時細胞系用CAP-1D5-細胞適應的A/PR/8/34-流 感病毒（H1N1 ; RKI，R〇bert-Koch-Institut)進行感染。當 在感染剛培養基不改變時，培養液中的細胞數在感染的時 間點時為4. 5 X 1〇6細胞/mi培養液，或當在感染前用PEM_ 培養基進行1:2 -稀釋時為2.3 X 1〇6細胞/ ml培養基，以 及當在感染前培養基完全改變時為5χΐ〇6細胞/m^另外， 在培養時不改變培養基以及用PEM-培養基進行1:2-稀釋 時，胰蛋白酶濃度為1 x 1〇-4 U/細胞、3 χ 1〇 — 5 U/細胞和 5x10 U/細胞。在培養基完全改變進行培養時，使用的 騰蛋白酶濃度為1 x 1〇-4 u/細胞、1 X 1〇·5 W細胞、5 X ι〇-5 11/細胞和1 X ι〇-6 υ/細胞或不使用胰蛋白酶。 與未改變培養基的培養液情況中的2.30 log ΗΑ相 比’ 用新鮮PEM-培養基進行丨：2_稀釋引起HA更早增加 (、'勺12小時，取代24小時）和更大的HA_ 2. 7〇 1〇g HA最 大值培養基兀全改變引起增加的值其大於3 "叫 PEM-培養基進行 在培養基不改變的培養液中以及用 1:2-稀釋的培養液中，lQg HA值顯示了非常相似的曲線， 其不依賴於胰蛋⑽濃度。在其t培養基完全改變的培養 液中騰蛋白酶浪度為j χ 1〇_5 ^細胞、5 X 5 W細胞 和1 X ΗΓ6 U/細胞時的1〇g Ηα_值的曲線是非常相似的。 不含胰蛋白酶的培養液中 單位/ ΙΟΟμΙ以及在使用了 養液中，log ΗΑ-值小於] !〇g HA-值只達到約2 1〇忌11入-1 X 1 ο'4 u /細胞的騰蛋白酶的培 log HA-單位 /ΙΟΟμΙ。 35 201211257 貫施例9 :在感染前改變培養基或不改變培養基時 CAP-1D5-細胞在PEM-培養基中被不同的經適應流感病毒株 感染的Μ0Ι-(複合感染）依賴性 通過實驗，研究Μ0Ι-值和病毒滴度（以每1〇〇μ1培養 液的log ΗΑ-單位表示）之間的依賴性，其中Μ0Ι-值即感染 用的病毒顆粒數和待感染的CAP-1D5-細胞之間的數值比。 為此’在振蕩瓶中，永久羊膜細胞系CAP-1D5在分別 包含4mM丙酮酸鹽和4mM榖氨醯胺的50ml PEM-培養基 (Invitrogen)中於 37°C、8% C〇2 和 185rpm 時進行培養。 檢查了感染前培養液的培養基不改變以及培養基改變時的 Μ0Ι -依賴性。使用了三種不同的適應的流感病毒株： A/PR/8/34(RKI, Robert-Koch-Institut) ' A/Brisbane/ 59/2007( IVR-148, NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control)和 B/Florida/4/2006 (NIBSC, The National Institute for Biological Standards and Control )。在50mL振蕩瓶中當接種時的細 胞濃度為4.9 X 106細胞/mL(培養基不改變）和5.0 X 1〇6 細胞/mL(培養基改變）時實現感染。當培養基不改變時，感 染在M0I-值為0.25或0.10(在A/Brisbane-流感病毒時）、 0.025和0.0025時實現，以及當培養基改變時’M0I-值為 0.10 或 0.06(在 A/Brisbane-流感病毒時）、0. 025 和 0. 0 0 25。胰蛋白酶活性在培養基不改變時為1 X 10—4 U/細 胞以及在培養基改變時為1 X 1(T6 U/細胞。之後，在超過 144小時後測定病毒顆粒量（log ΗΑ_單位/1〇〇μΐ) 36 201211257 ， （Kalbfuss 等，2008 ; Biol〇giCals 36⑶：145_61)。 改變培養基引起了更加一致的病毒複製結果。只有在 感染了流感病毒A/PR/8/34的細胞且培養基不改變時以及 在感染了流感病毒A/Brisbane的細胞且培養基改變時可 識別出較小的MOI-依賴性。通過改變培養基可以實現顯著 更大的log HA-值。在培養基不改變時的pH_值部分位於臨 界區域6.6至6.8中，以及在培養基改變時pH_值為 7. 3 - 7. 5 。 實施例10:在1L容量的STR-生物反應器和Wave_生物反 應器中通過感染（A/PR/8/34適應的）進行繼續培養 在設置中，CAP_1D5-細胞在1升生物反應器 STIKSartorius)中於包含4mM縠氨醯胺和4mM丙鲷酸鹽的 PEM-培養基中在12〇rpm、PH = 7.2和用純氧在氧分壓p〇2為 40%時進行培養。開始細胞數為5 X ι〇5細胞/mL。在72 75 小時的生長和細胞數為2.1 X 1〇6細胞/πα後，CAp_1D5_ 細胞被流感病毒A/PR/8/34(經適應的：在pEM中，第四代 2.01 X 1〇6病毒/mL)感染。在此預先不改變培養基。M〇I_ 值為0.025且加入的胰蛋白酶的最終濃度為3xi〇_5u/mL。 在另一設置（B26)中，CAP-1D5 —細胞在i升生物反應器 STR(Sart〇rius)中於 PEM_培養基中在 12〇rpin、ρΗ = 7. 4 7· 2 和用純氧在氧分壓p〇2為4〇%時進行培養。開始細胞數為8 xlO5細胞/mL。在92小時的生長後，CA卜1D5—細胞被流感 病毒A/PR/8/34C經適應的：在pEM中，第四代，3.75χ1〇6 病毒/mL)感染。預先完全改變培養基以及調節pH_值至 3Ί 201211257 7.6。Μ0Ι -值為0.025且加入的騰蛋白酶的最終濃度為3 χ 10-5 U/mL。 在第三設置（wave)中’CAP-1D5-細胞在1升Wave反應 器（Wave Biotech AG)中於包含4mM穀氨醯胺、4_丙酮酸 鹽和20mM葡萄糖的PEM-培養基中在振蕩頻率 (Wippfrequenz)為 13rpm、角度為 7°、ΡΗ = 7· 3-6. 9、用純 氧在氧分壓ρ〇2為40%和CCh-分壓為7. 5%時進行培養。開 始細胞數為5 χ 10細胞/mL。在72小時的生長後，CAP-1D5-細胞被流感病毒A/PR/8/34(經適應的：在pem中 第四代 1.87 χ 106細胞/ ml)感染。感染前的細胞數為2 1 χ i〇6 細胞/ml。預先不改變培養基。M0I-值為〇. 025且加入的胰 蛋白酶的最終濃度為3 χ 1〇-5 U/mL。 在第四設置_，MDCK. SUS2-細胞在1升生物反應器 STR(Sartorius)中於AEM-培養基中進行培養。開始細胞數 為5 χ 1 05細胞/mL。在118. 25小時的生長後，MDCK. SUS2-細胞被流感病毒A/PR/8/34感染（Lohr等，2010, 28(38):6256-64)。 測定19 2小時後的活細胞數和死細胞數，以及測定培 養基中的pH-值、葡萄糖、乳糖、榖氨醯胺、銨、谷氨酸 和丙酮酸鹽的濃度。另外，自感染的時間點起繼續測定log HA -單位/100// 1 和 TCID5。-值（Genzel andReichl，Vaccine production - state of the art and future needs in upstream processing in Methods in Biotechnology: Animal Cell Biotechnology - Methods and Protocols ； 38 201211257

Eds. R. Portner , HUMANA Press Inc. , Totowa, New Jersey, 2007， 457-473 ; Kalbfuss 等，2008 ; Biologicals 36(3):145-61)。 CAP-1D5-細胞在所有的三個設置中生長得更快和具有 更大的密度’相比較MDCK.SUS2-細胞而言。CAP-1D5-細胞 培養液中的病毒滴度達到的1〇g HA-單位/ΐ〇〇μι最大值為 約2. 5。MDCK. SUS2-細胞培養液的病毒滴度達到的1〇g ΗΑ_ 單位/ΙΟΟμΙ最大值為約3。CAP-1D5-細胞培養液中的病毒 滴度顯著更早增加，相比較MDCK. SUS2_細胞培養液中的病 毒滴度。 實施例11:在振蕩瓶中於PEM-或 293SFMII_培養基中且在 感染剛完全改變培養基或進行1 :丨_培養基改變病毒產量的 增加的培養試驗 為了優化在振蕩瓶中培養的CAP_1D5-細胞培養液中的 病毒產量，CAP-1D5-細胞在培養基293SFMII(Invitrogen) 和PEM(Invitrogen)中進行培養且進行1:1_培養基改變或 完全改變培養基。 在1 〇〇ml振蕩瓶中，永久羊膜細胞系cap-1D5在包含 4πιΜ榖氨醯胺和4mM丙酮酸鹽的5〇ml pEM_培養基中且在 37C，8% (：〇2和i〇〇rpm時進行培養。在M〇I為〇 〇25時用 適應的流感病毒A/PR/8/34感染細胞之前改變培養基。當 進行1.1 -培養基改變時，在感染細胞時使用的胰蛋白酶濃 度為1 X 1 〇_5 U/細胞。當完全改變培養基時，在感染細胞 時使用的胰蛋白酶濃度為1 X 10 — 6 U/細胞。不僅使用PEM- 39 201211257 培養基而且使用293SFMII-培養基實現培養基的改變。感 染時的細胞濃度為5 X 1〇6細胞/ml。 72小時後’借助標準方法測定活細胞數、存活率、pH_ 值以及通過凝血素滴定測定的log HA-單位/100 μ l(Lohr 等 ’ hcche，2009，27(36)，4975-4982 ; Genzel 等，知p/ 你！c’oWo/ 2010 ,88(2):461-75)。 相比較在其中進行了 1 :卜培養基改變的細胞培養液而 5，在用流感病毒a/PR/8/34感染之前培養基完全改變的 細胞培養液中的病毒滴度增加更快。另外，相比較其中繼 續進行了 1:1-培養基改變的細胞培養液而言，在用流感病 毒A/PR/8/34感染之前培養基完全改變的細胞培養液中的 病毒滴度實現了更高的最大病毒滴度。

在感染前培養基完全改變的細胞培養液的活細胞數在 小時後從5 X 1〇6細胞/ml急劇減小，從而在48小時後 =細胞數還有約2 X W細胞/lflbPEM_培養基和感染前進 仃了 1:1培養基改變的細胞培養液中的活細胞數減小的急 #度最j、在該情況中’在72小時後活細胞數還有約7 χ 105 細胞 / m 1。 在整個7 2小時的時間段内 值為7. 6至7. 2。 所有的細胞培養液中的pH_ 雖然本發明已以較佳眘竑办, 孕又佳實施例揭露如上’然其並非用以 限疋本發明，任何熟悉此項技蓺 、议《考在不脫離本發明之精 砷和範圍内，當可做些許更動 動。潤飾，因此本發明之保護 範圍當視錢之中請專利範圍所界定者為準。 40 201211257 【圖式簡單說明】 圖1A至G示意性示出了，於1〇〇ml振蕩瓶中在 2938[]〇1-培養基中的永久羊膜細胞細胞系（^15_11)5(#)、 在PEM-培養基中的永久羊膜細胞細胞系CAp_1D5(A)和在 SMIF8-培養基中的永久犬腎細胞系MDCK. SUS2(狗腎細 胞）（♦)的培養期間的不同參數的曲線。圖1A比較示意性 示出了三個細胞系的活細胞數的曲線，圖1B示意性示出了 細胞系的死細胞數的曲線以及圖1C示意性示出了細胞系 的存活率的曲線。圖1D至G示意性示出了 pH-值（D)、葡 萄糖濃度（亮標示）和乳糖濃度（暗標示）（E)、榖氨醯胺（G1 n) 濃度（亮標示）和銨濃度（暗標示）（F)和谷氨酸（Glu)濃度 (亮標示）和丙酮酸鹽濃度（暗標示）（G)的曲線。 圖2示出了柱形圖，其給出了在293SFMII-和PEM-培 養基中，流感-病毒株 A/PR/8/34CH1N1)和 A/Uruguay/716/ 2007(H3N2)的4個傳代對CAP-1D5-細胞的病毒滴度 (Virustiter)，其作為 TCIDso-值測量。縮寫：A/PR 293 :流 感-病毒株 A/PR/8/34(HlNl)對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養基中；A/PR PEM:流感-病毒株A/PR/8/34CH1N1)對 CAP-1D5-細胞，在PEM培養基中；A/Urug293:流感-病毒 株 A/Uruguay/716/2007(H3N2)對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養基中；A/UrugPEM:流感-病毒株 A/Uruguay/ 71 6/2007(H3N2)對 CAP-1D5-細胞，在 PEM; TCIDso-值是感 染50%宿主細胞所需的病毒滴度（以病毒數/ml計）。 41 201211257 圖3A至F示意性示出了在293SFMI I-(A，B)和PEM-培養基（C，D)中培養永久羊膜細胞CAP-1D5以及在SMIF8-培養基（E，F)中培養永久犬腎細胞MDCK.SUS2時在細胞被 流感病毒-病毒株A/PR/8/34感染後以log HA-(凝血素）單 位/100^11表示的病毒顆粒（^丨1_6叩31^11^111)量和活細胞數 的曲線’其中使用了不同的病毒量，其以Μ0Ι (複合感染） 值給出：MOI: 0.0025O) ; Μ0Ι: 0.025(_) ; Μ0Ι: 〇· 25(令）。Μ0Ι (複合感染）反映了感染性顆粒對靶細胞的數 目關係。 圖4A至D示意性示出了在1L的生物反應器中於PEM-培養基中培養永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5時的不同參 數’其中在114小時後通過流感病毒A/PR/8/34C適應的 (adaptiert))發生感染，其中以Μ0Ι給出病毒量為〇.〇25。 在圖4 A中示意性示出了活細胞數（▲)、死細胞數（△)和細 胞的存活率（/ )的曲線。圖4B示意性示出了培養基中的病 毒顆粒數目（▲)以及谷氨酸鹽濃度（△)和丙酮酸鹽濃度 (Ο，其中病毒顆粒數目以1 og HA-(凝血素）單位/1 〇〇μ 1給 出。圖4C示意性示出了 ρΗ_值（△)的曲線以及圖4D示意性 示出了感染度（以TCID5〇 /ml表示）。TCID5。-值以病毒數/ml 反映了感染50%宿主細胞所需的病毒滴度。 圖5A和B示意性示出了柱狀圖，其反映了歷經四次傳 代（iiber 4 Passagen)的流感 _ 病毒株 A/Brisbane/59/ 2007、B/Florida/4/2006、豬流感（A/Swine (H1N2) Bakum/ 1 832/00)和馬流感（A/Equine，A/Newmarket/1/93 (H3N8)) 42 201211257 在293SFMI卜和PEM-培養基中對CAP-1D5-細胞所測量的病 毒滴度，其表示為log HA-單位/ΙΟΟμΚΑ)或TCIDso-值（B)。 縮寫：A/Bris 293:流感-病毒株 A/Brisbane/ 59/2007 對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養基中；A/Bris PEM:流 感-病毒株 A/Brisbane/ 59/2007 對 CAP-1D5-細胞，在 PEM 培養基中；B/Flor 293:流感-病毒株 B/Florida/4/2006 對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養基中；B/Flor PEM:流 感-病毒株 B/Florida/4/2006 對 CAP-1D5-細胞，在 PEM 培 養基中；Schw 293:流感-病毒株 A/Swine (H1N2) Bakum/ 1832/00 對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 中；Schw PEM:流 感-病毒株 A/Swine (H1N2) Bakum/1 832/OO 對 CAP-1D5-細 胞’在PEM培養基中；Pferd 293:流感-病毒株A/Equine, A/Newmarket/1/93(H3N8)對 CAP-1D5-細胞，在 293SFMII 培養基中；Pferd PEM:流感-病毒株A/Equine， A/Newmarket/1/93(H3N8)對 CAP-1D5-細胞，在 PEM 培養基 中；TCIDs。-值是以病毒數/mi計的感染5〇%宿主細胞所需的 病毒滴度。 圖6A和B示意性示出了在振蕩瓶中於i〇〇ml PEM—培 養基中培養永久羊膜細胞細胞系CAP-1D5時的活細胞數-濃度和pH-值的’其中開始細胞數為5 x 1 〇5細胞/mi以及 培養基另外包含4mM丙酮酸鹽（♦)或開始細胞數目為8 χ 1 〇細胞/m 1以及培養基另外包含4mM丙酮酸鹽（▲)或開始 細胞數目為8 χ 1〇5細胞/mi以及培養基另外包含1〇mM丙 酮酸鹽以及其他的氨基酸（φ )。 43 201211257 圖7a至c示意性示出了測量為1 〇g ha-單位/1 〇〇μ 1培 養液的病毒滴度的曲線，其中CAp_1D5_細胞被經適應的流 感病毒株A/PR/8/34感染。在感染前，或者培養基不改變 (A)、或者用PEM-培養基進行1:2 —稀釋或者培養基完全改 I圖7A示出了 CAP-1D5-細胞培養液在培養基不改變時 的病毒滴度的曲線，其中感染時使用的不同胰蛋白酶濃度 為 1 X 1〇-4 U/細胞（♦)、3 Χ 1〇 — 5 u/細胞（▲)和 5 X 10-5 U/ 細胞（_)。圖7B示意性示出了用PEM_培養基進行1:2稀 釋的CAP-1D5-細胞培養液的病毒滴度的曲線，其中感染時 使用的不同胰蛋白酶濃度為！ x 1〇-4 W細胞（♦)、3 X 1〇·5 U/細胞（▲)和5 X ΙΟ·5 U/細胞（)。圖7C示意性示出了培 養基完全改變時的CAP-1D5-細胞培養液的病毒滴度的曲 線’其中在感染時或者不使用胰蛋白酶（X)或者使用不同胰 蛋白8#》辰度為1 X 10 U /細胞（▲)、1 X ίο-5 u /細胞（♦)、 5 X ΗΓ5 U/細胞（)和 1 X 1〇_6 U/細胞（x)。 圖8 A至F示意性示出了已被流感病毒A/pR/8/34、 A/Brisbane/59/2007 或 B/Florida/4/2006 感染的 CAP- iDS-細胞培養液的 病毒滴 度’其 中在感 染前培養基改 變 （A 至C)或培養基不改變（D至F)。用流感病毒株a/pr/8/34 和B/Florida/4/2006實現感染，其中病毒量（以M〇I—值表 示）分別為〇. 25、0. 025和0. 0025。用流感病毒株 A/Brisbane/59/2007實現感染’其中MOI-值分別為〇 1、 〇. 025和0· 0025。MOI (複合感染）反映了感染性顆粒對乾 細胞的數目關係。 44 201211257 圖9A和B示意性示出了感染了經適應的流感病毒 A/PR/8/34 且在 1 L-容量的 STR-(Sartorius) (B16，B26 和MDCK)或振蕩瓶式反應器（Wave Biotech公司）（Wave) 中培養的CAP-1D5-細胞培養液（B16, B26和Wave)和犬腎 細胞-MDCK.SUS2培養液（MDCK)的活細胞數-濃度和病毒滴 度的曲線（Verlauf)。在培養液B26和Wave的情況中，在 感染前培養基發生改變。 圖10A至C示意性示出了所測量的（^卜…卜細胞培養 液的病毒滴度（以log HA-單位/100 μ1表示）、活細胞數和 ΡΗ-值的曲線，所述CAP_1D5_細胞培養液感染了經適應的 机感病毒A/PR/8/34且在振蕩瓶中於1〇〇 mlpEM_培養基中 進订培養。在感染前，或者發生293SFMn_培養基（□)或 PEM-培養基（□)的1:卜培養基 货丞sc變（亮標不），或者發生 293SFMII-培養基（_)或pEM_培養 I丞（♦)的培養基完全改變 (暗標示）。 【主要元件符號說明】 Ml 〇 45

Claims (1)

1. 201211257 七、申請專利範圍： 1. 一種流感病毒型疫苗的製備方法，其包括： a )使流感病毒接觸永久人羊膜細胞， b )培養所述永久人羊膜細胞， c )實現流感病毒的表達，以及 d)從培養基中分離所述流感病毒。 2.—種流感病毒型疫苗的製備方法，其包括： a )使編碼流感病毒-蛋白的核酸分子接觸永久人羊膜 細胞， b) 培養所述永久人羊膜細胞， c) 實現編碼流感病毒-蛋白的核酸分子的複製和/或流 感病毒-蛋白的表達，以及 d) 從培養基中分離編碼流感_蛋白的核酸分子和/或流 感病毒-蛋白。 /·如中請專利範圍第i《2項所述的流感病毒型疫苗 的：備方法，丨中所述永久人羊膜細胞在與流感病毒或編 媽流感病毒-蛋白的核酸分子進行接觸的時間點處於指數 長/月和靜止生長期中或處於指數生長期和靜止生長期之 的製=請專利範圍…2項所述的流感病毒型疫苗 流感症直、中在步驟〇中從所述培養基中分離出所述 …冑過密度梯度-差速—離心或區帶離心實現。 .如申凊專利範圍第1或2項所& 的製備方、土 ^ 項所述的流感病毒型疫苗 方法’其中在步驟d)中從所述培養基中分離所述流 46 201211257 感病毒-蛋白通過電泳法或色譜法實現。 6. 如申請專利範圍第…項任一項所述的流感病毒 型疫苗的製備方法，其中所述永久人羊膜細胞表達腺病毒 基因產物E1A和E1B。 7. 如申請專利範圍第6項所述的流感病毒型疫苗的製 備方法，其中所述腺病毒基因產物Eu和⑽包括人腺病 毒血清型-5的核苦酸i至4344、505至3522或核苦酸5〇5 至 4079 。 8. 如申請專利範圍第項任一項所述的流感病毒 型疫苗的製備方法，其中所述永久人羊膜細胞表達腺病毒 基因產物Pix。 如申叫專利靶圍第1至8項任-項所述的流感病毒 :疫苗的製備方法，其令在接觸流感病毒或編碼流感病毒— 蛋白的核酸分子之前完全改變培養基或用培養基進行Η 的稀釋。 形 如申1專利範圍第1至9項任-項所述的流感病毒 艾田的製備方法，其中在接觸流感病毒或編碼流感病毒_ 蛋白的核酸分子時加入 t 1λ.5 龙田辰度為lxio—4 u/細胞、 :胎 U/細胞、3x10-5 U/細胞、5xl。-5 U/細胞或 lxl0，/ 細胞。 毒型1 如申請專利範圍第1至10項任一項所述的流感病 毒型疫苗的製備方法，其中 I 觸丨L感病毒時使用的病毒 量…0卜值給出，在的範圍。 H種永久人羊膜細胞在製備流感病毒型疫苗中的 41 201211257 用途 久人羊膜細胞帛12項所述的用途’其中所述永 、 達腺病毒基因產物E1A和E1B。 U.如中請專利範圍第12*13項所述的用途，其中所 4久人羊膜細胞表達腺病毒基因產物pIX。 15.如申清專利範圍第13項所述的用途，其中所述腺 病毒基因產物ElA和E1B包括人腺病毒血清型_5的核苷酸 1至4344、505至3522或核苷酸505至4079。 48