CN103168100A - 用于制备流感病毒的永久人细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及借助永久人羊膜细胞制备基于流感病毒的疫苗的方法，以及永久人羊膜细胞在制备基于流感病毒的疫苗中的用途。

Description

用于制备流感病毒的永久人细胞系
本发明涉及借助永久人羊膜细胞(Amniozytenzelle)制备基于流感病毒的疫苗的方法，以及永久人羊膜细胞在制备基于流感病毒的疫苗中的用途。
接种疫苗是卫生部门采取的最重要的措施以防止因每年的流感疫情引起的疾病。疫苗的成功使用取决于是否能从稳定和容易处理的来源中尽可能快地获得足够大量的接种材料如杀死的病毒。疫苗的快速发展和它们的充足供应对于与许多人和动物疾病的斗争是至关重要的。由于疫苗生产的延误和定量损失，在与疾病爆发抗争时很能会出现问题。因此，最近的努力是在细胞培养液中培养病毒以用作疫苗。
到目前为止，所获得的流感疫苗是在孵化的鸡胚蛋中制备的。必须证实这些鸡卵未被某些病毒和细菌污染。这些所谓的“无特异性病原(SPF)”鸡卵均可市售获得。虽然已证实了鸡卵非常适用于动物和人病毒的繁殖，但是鸡卵在疫苗生产方面具有一些劣势。因为生产每剂量的常规疫苗需要一个鸡卵，所以在例如出现大规模流行病时，疫苗生产用的鸡卵需求量则很高。鉴于鸡卵的供应有限，需要提前约一年的时间准备足够量的鸡卵。此外，还存在对鸡而言高度致病性的流感亚型，因而在大规模流行病的情况下可能出现鸡卵供应短缺。另外，生产过程是非常昂贵和费时的。在鸡卵中生产疫苗的另一个缺点是这些疫苗通常包含鸡蛋清，在一些患者身上可能会出现过敏反应。此外，不同于天然存在病毒的亚群的可能选择需要备选的宿主细胞系统。
相比鸡卵，基于细胞培养的用于流感疫苗生产的细胞总是可以获得的。它们可以深冻储存，并且在任何需要的时候短时间解冻所需量以及进行繁殖。因此可以在任何需要的时间点开始疫苗的生产。在出人意料的高需求或意想不到的新病毒株大规模传播的情况中，可以短期提供相应的疫苗。
借助细胞培养的生产过程实现了在限定的受控条件下于封闭标准化系统中生产用作疫苗的病毒。成品流感疫苗由于受控的生产方法而无需添加抗生素就可以获得。由于实现了完全不依赖鸡卵制备细胞培养-流感疫苗，如此制备的疫苗不包含蛋清，从而不会由于鸡蛋清的不耐受而在患者中引起过敏反应。
目前主要有以下三个细胞系用于制备流感疫苗：人PER.C6细胞、狗肾细胞(Madin Darby Canine Kidney)(MDCK)和长尾猴-肾细胞(Vero)。此外，目前开发了鸭-视网膜-细胞系(AGE1.CR)和胚胎鸟类(embryonale Vogel)-干细胞系。在哺乳动物细胞中制备疫苗虽然可以替代基于鸡卵制备疫苗，但是这些细胞的生长需要血清和/或附着在固定的载体上。所述这些加剧了在所述细胞中制备疫苗的难度并增加了成本，这是因为出于安全原因考虑必须完全分离血清，并且在固定载体上的生长是受限的，从而导致产量较小。
在哺乳动物细胞中制备疫苗的一个优势在于，在细胞培养基中分离和复制病毒不会导致偏离临床野生型的表型的传代-依赖性选择。因此病毒糖蛋白凝血素在自然形式中表达，从而具有改善的特异性和亲和性，并因此在人中实现了细胞-介导的免疫力，其中病毒通过病毒糖蛋白凝血素实现了在将被感染的细胞上的附着并整合入细胞。
因此，本发明的目的是提供改善的永久人细胞系用于制备基于流感病毒的疫苗。
该目的通过权利要求书中限定的主题得以实现。
下列示意性示出阐述了本发明。
图1A至G示意性示出了，于100ml振荡瓶中在293SFMII-培养基中的永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5(●)、在PEM-培养基中的永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5(▲)和在SMIF8-培养基中的永久犬肾细胞系MDCK.SUS2(狗肾细胞)(◆)的培养期间的不同参数的曲线。图1A比较示意性示出了三个细胞系的活细胞数的曲线，图1B示意性示出了细胞系的死细胞数的曲线以及图1C示意性示出了细胞系的存活率的曲线。图1D至G示意性示出了pH-值(D)、葡萄糖浓度(亮标示)和乳糖浓度(暗标示)(E)、谷氨酰胺(Gln)浓度(亮标示)和铵浓度(暗标示)(F)和谷氨酸(Glu)浓度(亮标示)和丙酮酸盐浓度(暗标示)(G)的曲线。
图2示出了柱形图，其给出了在293SFMII-和PEM-培养基中，流感-病毒株A/PR/8/34(H1N1)和A/Uruguay/716/2007(H3N2)的4个传代对CAP-1D5-细胞的病毒滴度(Virustiter)，其作为TCID50-值测量。缩写：A/PR293:流感-病毒株A/PR/8/34(H1N1)对CAP-1D5-细胞，在293SFMII培养基中；A/PR PEM:流感-病毒株A/PR/8/34(H1N1)对CAP-1D5-细胞，在PEM培养基中；A/Urug293:流感-病毒株A/Uruguay/716/2007(H3N2)对CAP-1D5-细胞，在293SFMII培养基中；A/Urug PEM:流感-病毒株A/Uruguay/716/2007(H3N2)对CAP-1D5-细胞，在PEM；TCID50-值是感染50%宿主细胞所需的病毒滴度(以病毒数/ml计)。
图3A至F示意性示出了在293SFMII-(A,B)和PEM-培养基(C,D)中培养永久羊膜细胞CAP-1D5以及在SMIF8-培养基(E,F)中培养永久犬肾细胞MDCK.SUS2时在细胞被流感病毒-病毒株A/PR/8/34感染后以log HA-(凝血素)单位/100μl表示的病毒颗粒(Virenpartikeln)量和活细胞数的曲线，其中使用了不同的病毒量，其以MOI(复合感染)值给出：MOI:0.0025(△)；MOI:0.025(□)；MOI:0.25(○)。MOI(复合感染)反映了感染性颗粒对靶细胞的数目关系。
图4A至D示意性示出了在1L的生物反应器中于PEM-培养基中培养永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5时的不同参数，其中在114小时后通过流感病毒A/PR/8/34(适应的(adaptiert))发生感染，其中以MOI给出病毒量为0.025。在图4A中示意性示出了活细胞数(▲)、死细胞数(△)和细胞的存活率(▲)的曲线。图4B示意性示出了培养基中的病毒颗粒数目(▲)以及谷氨酸盐浓度(△)和丙酮酸盐浓度(●)，其中病毒颗粒数目以log HA-(凝血素)单位/100μl给出。图4C示意性示出了pH-值(△)的曲线以及图4D示意性示出了感染度(以TCID50/ml表示)。TCID50-值以病毒数/ml反映了感染50%宿主细胞所需的病毒滴度。
图5A和B示意性示出了柱状图，其反映了历经四次传代(über4Passagen)的流感-病毒株A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、猪流感(A/Swine(H1N2)Bakum/1832/00)和马流感(A/Equine,A/Newmarket/1/93(H3N8))在293SFMII-和PEM-培养基中对CAP-1D5-细胞所测量的病毒滴度，其表示为log HA-单位/100μl(A)或TCID50-值(B)。缩写：A/Bris293:流感-病毒株A/Brisbane/59/2007对CAP-1D5-细胞，在293SFMII培养基中；A/Bris PEM:流感-病毒株A/Brisbane/59/2007对CAP-1D5-细胞，在PEM培养基中；B/Flor293:流感-病毒株B/Florida/4/2006对CAP-1D5-细胞，在293SFMII培养基中；B/FlorPEM:流感-病毒株B/Florida/4/2006对CAP-1D5-细胞，在PEM培养基中；Schw293:流感-病毒株A/Swine(H1N2)Bakum/1832/00对CAP-1D5-细胞，在293SFMII中；Schw PEM:流感-病毒株A/Swine(H1N2)Bakum/1832/00对CAP-1D5-细胞，在PEM培养基中；Pferd293:流感-病毒株A/Equine,A/Newmarket/1/93(H3N8)对CAP-1D5-细胞，在293SFMII培养基中；PferdPEM:流感-病毒株A/Equine,A/Newmarket/1/93(H3N8)对CAP-1D5-细胞，在PEM培养基中；TCID50-值是以病毒数/ml计的感染50%宿主细胞所需的病毒滴度。
图6A和B示意性示出了在振荡瓶中于100ml PEM-培养基中培养永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5时的活细胞数-浓度和pH-值的，其中开始细胞数为5x105细胞/ml以及培养基另外包含4mM丙酮酸盐(◆)或开始细胞数目为8x105细胞/ml以及培养基另外包含4mM丙酮酸盐(▲)或开始细胞数目为8x105细胞/ml以及培养基另外包含10mM丙酮酸盐以及其他的氨基酸(●)。
图7A至C示意性示出了测量为log HA-单位/100μl培养液的病毒滴度的曲线，其中CAP-1D5-细胞被经适应的流感病毒株A/PR/8/34感染。在感染前，或者培养基不改变(A)、或者用PEM-培养基进行1:2-稀释或者培养基完全改变。图7A示出了CAP-1D5-细胞培养液在培养基不改变时的病毒滴度的曲线，其中感染时使用的不同胰蛋白酶浓度为1x10-4U/细胞(◆)、3x10-5U/细胞(▲)和5x10-5U/细胞(■)。图7B示意性示出了用PEM-培养基进行1:2-稀释的CAP-1D5-细胞培养液的病毒滴度的曲线，其中感染时使用的不同胰蛋白酶浓度为1x10-4U/细胞(◆)、3x10-5U/细胞(▲)和5x10-5U/细胞(■)。图7C示意性示出了培养基完全改变时的CAP-1D5-细胞培养液的病毒滴度的曲线，其中在感染时或者不使用胰蛋白酶(*)或者使用不同胰蛋白酶浓度为1x10-4U/细胞(▲)、1x10-5U/细胞(◆)、5x10-5U/细胞(■)和1x10-6U/细胞(x)。
图8A至F示意性示出了已被流感病毒A/PR/8/34、A/Brisbane/59/2007或B/Florida/4/2006感染的CAP-1D5-细胞培养液的病毒滴度，其中在感染前培养基改变(A至C)或培养基不改变(D至F)。用流感病毒株A/PR/8/34和B/Florida/4/2006实现感染，其中病毒量(以MOI-值表示)分别为0.25、0.025和0.0025。用流感病毒株A/Brisbane/59/2007实现感染，其中MOI-值分别为0.1、0.025和0.0025。MOI(复合感染)反映了感染性颗粒对靶细胞的数目关系。
图9A和B示意性示出了感染了经适应的流感病毒A/PR/8/34且在1L-容量的STR-(Sartorius)(B16,B26和MDCK)或振荡瓶式反应器(Wave Biotech公司)(Wave)中培养的CAP-1D5-细胞培养液(B16,B26和Wave)和犬肾细胞-MDCK.SUS2培养液(MDCK)的活细胞数-浓度和病毒滴度的曲线(Verlauf)。在培养液B26和Wave的情况中，在感染前培养基发生改变。
图10A至C示意性示出了所测量的CAP-1D5-细胞培养液的病毒滴度(以log HA-单位/100μl表示)、活细胞数和pH-值的曲线，所述CAP-1D5-细胞培养液感染了经适应的流感病毒A/PR/8/34且在振荡瓶中于100mlPEM-培养基中进行培养。在感染前，或者发生293SFMII-培养基(□)或PEM-培养基(◇)的1:1-培养基改变(亮标示)，或者发生293SFMII-培养基(■)或PEM-培养基(◆)的培养基完全改变(暗标示)。
在此使用的术语“流感病毒”理解为正黏病毒(Orthomyxoviren)的成员，其可以感染人和动物。在本文中流感病毒区分为类型A、B和C。流感-A-病毒和流感-B-病毒归为一类。流感-C-病毒由于其具有的7个基因片段而区别于流感-A-病毒和流感-B-病毒，流感-A-病毒和流感-B-病毒为8个基因片段。另外，流感-A-病毒和流感-B-病毒分别编码凝血素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)，而流感-C-病毒则编码结合了两种性质的表面蛋白，凝血素-酯酶-融合蛋白(HEF)。基于凝血素-(H1-H15)和神经氨酸苷酶-(N1-N9)分子的序列，流感-A-病毒将进一步细分为亚型。
在此使用的术语“流感病毒-蛋白”理解为蛋白或流感病毒的衍生物。流感病毒的衍生物通常为可以用作免疫目的的流感病毒的蛋白或其一部分。流感病毒蛋白或衍生物包括病毒包膜蛋白或其部分。具体地，流感病毒-蛋白包括流感-A-蛋白、流感-B-蛋白或流感-C-蛋白，例如凝血素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)和(M2)、聚合酶蛋白(PB1)、(PB2)和(PA)和非结构蛋白(NS1)和(NS2)和其部分。流感病毒-蛋白的部分包括流感-A-蛋白、流感-B-蛋白或流感-C-蛋白的一种或多种表位。表位可以是CD4+T-细胞-表位，其表示这样的一种肽，该肽包含类MHC-类-II的结合基序以及通过MHC-类-II分子在抗原表现的细胞的表面上表现，或者是CD8+T-细胞-表位，其表示这样的一种肽，该肽包含类MHC-类-I的结合基序(Bindemotif)以及通过MHC-类-I分子在抗原呈递的细胞表面上表现。例如允许算法模型、MHC-结合试验(Bindetest)、电脑模拟(in silico)抗原-鉴定方法和X射线晶体学方法允许鉴定可以连接多种MHC-分子的抗原。
在此使用的术语“疫苗”理解为生物学或基因技术制备的抗原，其包括蛋白、蛋白-亚单位(Untereinheiten)、肽、糖类、脂类、核酸、死亡或减弱病毒，其在本文中可以涉及整个的病毒颗粒或病毒颗粒部分或它们的组合。抗原可以有至少一个表位例如T-细胞-表位和/或B-细胞-表位。所述抗原由免疫受体例如T-细胞-受体或B-细胞-受体识别。使用疫苗后将特异性激活针对某种病毒的免疫系统。这里利用了免疫系统的反应，当存在病毒或它的特异抗原时将引起免疫响应。这导致形成抗体和特异性T-辅助细胞，其可以针对各种疾病提供持久的保护，根据不同的病毒保护作用可以持续几年或一辈子。疫苗包括活疫苗或死疫苗。活疫苗包含例如减毒的但还具有繁殖能力的病毒，其不能致病。而死疫苗的病毒则已被杀死或它仅包含病毒的片段(抗原)。病毒的灭活(杀死)例如通过化学物质例如甲醛、β-丙内酯和补骨脂素(Psoralen)实现。病毒包膜被保存下来。也有类毒素疫苗，其仅包含病毒毒素的生物失活组分(类毒素)(例如破伤风类毒素)，这也属于死疫苗。具体地，死疫苗可以涉及片段疫苗(Spaltimpfstoff)，其包含病毒包膜蛋白的片段。病毒包膜的破坏或分裂可以例如通过清洁剂或强有机溶剂实现。另外还可以用化学物质使病毒失活或杀死病毒。另外还属于死疫苗的有亚单位疫苗(Untereinheitimpfstoffe)，其包含病毒的具体成分，例如凝血素-蛋白和神经氨酸苷酶-蛋白。
在此使用的术语“基于流感病毒的疫苗(Influenzavirus-basierterImpfstoff)”理解为所有的蛋白、肽或它们的部分，以及编码流感病毒的这些蛋白、肽或它们的部分的核酸，以及流感病毒颗粒本身，重组流感病毒-蛋白，包括流感-包膜蛋白、亚病毒颗粒，病毒样颗粒(VLP)，VLP的复合物，和/或它们的部分，其可以用于免疫目的对抗流感。
在此使用的术语“辅剂”理解为可以调节抗原的免疫原性的物质。辅剂例如矿物盐、角鲨烯混合物、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝杆菌细胞壁制剂、确定的乳液、单磷酸类脂-A(Monophosphoryl-lipid-A)、霉菌酸
Figure BDA00003056512600061
衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱-毒素B的亚单位、聚磷腈(Polyphosphazene)和它的衍生物、免疫刺激复合物、细胞因子辅剂、MF59-辅剂、脂质辅剂、粘膜辅剂、确定的细菌-外毒素、确定的寡核苷酸和PLG。
在此使用的术语“羊膜细胞”理解为在羊水中存在且能够通过羊水穿刺得到的所有细胞。该细胞要么源于羊膜，要么源于与羊膜液接触的胎组织。记载了基于形态学标准区分的三大类羊膜细胞：成纤维样细胞(F-细胞)、上皮样细胞(E-细胞)和羊水细胞(Amniotic Fluid Cells,AF-细胞)(Hohn等人,Pediat.Res.8:746-754,1974)。AF-细胞是主导的细胞类型。
在此使用的术语“永久细胞系”理解为这样的细胞：该细胞在遗传上被改变，从而能够在适合的培养条件下在细胞培养液中永久持续生长。这种细胞也可称为永生化细胞。
在此使用的术语“原代细胞”理解为通过直接从生物体或组织提取所得到的并且经培养(in Kultur)的细胞。原代细胞仅有非常有限的寿命。
在此使用的术语“转染”理解为所有适合于将所述核酸引入到细胞中的方法。作为实例可指出经典的磷酸钙法、电穿孔、任何形式的脂质体体系及这些方法的组合。
在此使用的术语“CAP”理解为通过用腺病毒功能基因E1A和E1B永生化原代人羊膜细胞而产生的永久人羊膜细胞细胞系。
在此使用的术语“CAP-T”理解为另外用含有SV40大T-抗原序列的核酸分子所稳定转染的CAP-细胞。
本发明的主题涉及基于流感病毒的疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
(i)使流感病毒接触永久人细胞，
(ii)培养所述永久人细胞，
(iii)实现流感病毒的表达，以及
(iv)从培养基中分离所述流感病毒。
在本发明方法中，在适合细胞生长的条件(例如温度、培养基、pH-值)下培养永久人细胞。涉及温度、培养基、pH-值和其他的生长参数的条件是本领域技术人员已知的，或者可以通过一般的方法获知。当培养液实现了理想的生长密度(Wachstumsdichte)时，将流感病毒用于细胞感染。病毒需要几天的时间在细胞的内部进行繁殖。在该繁殖过程期间，大部分细胞死亡且病毒将释放在培养基中。通过例如离心分离含病毒的溶液和细胞碎片。之后通过例如层析柱从培养基溶液中分离出病毒且体积得以减小。这之后，病毒可以通过例如化学方法被灭活。然后进行病毒裂解。经过进一步的净化和浓缩步骤，由此得到病毒株的抗原浓缩物。
在一优选的实施方案中，流感病毒株A/PR/8/34、A/Uruguay/716/2007、A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、猪流感(A/Swine(H1N2)Bakum/1832/00)或马流感(A/Equine,A/Newmarket/1/93(H3N8))用于感染永久人细胞。
在又一优选的实施方案中，感染永久人细胞用的流感病毒预先在细胞上进行适应性处理(adaptieren)，这里优选以上所列出的流感病毒。这样的适应性处理优选历经四次传代实现。优选在293SFMII-培养基或PEM-培养基中实现流感病毒的适应性。
本发明的又一主题涉及基于流感病毒的疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
(i)使编码流感病毒-蛋白的核酸分子接触永久人细胞，
(ii)培养该永久人细胞，
(iii)实现编码流感-蛋白的核酸分子的复制和/或流感-蛋白的表达，以及
(iv)从培养基中分离编码流感-蛋白的核酸分子和/或流感病毒-蛋白。
在一优选的实施方案中，本发明方法中所使用的永久人细胞涉及永久人羊膜细胞。
在本发明的一优选实施方案中，永久人细胞在振荡瓶或生物反应器、优选STR-生物反应器或Wave-生物反应器中进行培养。永久人细胞可以在多种培养基中培养，优选在293SFMII-培养基或PEM-培养基中培养。另外可以向培养基中加入丙酮酸盐、谷氨酰胺、葡萄糖或其他的氨基酸。培养基优选包含4mM或10mM丙酮酸盐以及其他的氨基酸。
在本发明的又一优选实施方案中，培养时振荡瓶中的永久人细胞的开始细胞数目为5x105细胞/ml，更优选8x105细胞/ml。
在本发明的又一优选实施方案中，感染时间点时的培养液的pH-值范围为7.1至7.8，更优选为7.3至7.5，还更优选为7.3至7.5。
在本发明的又一优选实施方案中，在流感病毒感染永久人细胞之前完全改变培养基或用培养基进行1:2-稀释。
在本发明的一优选实施方案中，用于感染永久人细胞的流感病毒胰蛋白酶浓度为1x10-4U/细胞、1x10-5U/细胞、3x10-5U/细胞、5x10-5U/细胞或1x10-6U/细胞。当在感染永久人细胞之前培养基不改变时，流感病毒感染细胞时的胰蛋白酶浓度优选为1x10-4U/细胞。当在感染永久人细胞之前用培养基进行了1:2-稀释时，流感病毒感染细胞时的胰蛋白酶浓度优选为5x10-5U/细胞。当在感染永久人细胞之前培养基完全改变时，流感病毒感染细胞时的胰蛋白酶浓度优选为5x10-6U/细胞。
在本发明的一优选实施方案中，用于感染永久人细胞的病毒量的范围以MOI-(复合感染)值给出为0.001至0.3。在本发明的一优选实施方案中，用于感染永久人细胞的病毒量的范围以MOI-(复合感染)值给出为0.25、0.1、0.06、0.025或0.0025。在用流感病毒A/PR/8/34感染永久人细胞且在感染之前培养基不改变时，优选使用的病毒量、以MOI-值给出、为0.25，以及在用流感病毒A/Brisbane/59/2007感染永久人细胞且在感染之前培养基不改变时，优选使用的病毒量、以MOI-值给出、为0.1。在用流感病毒A/PR/8/34感染永久人细胞且在感染之前培养基改变时，优选使用的病毒量、以MOI-值给出、为0.1或0.25，以及在用流感病毒A/Brisbane/59/2007感染永久人细胞且在感染之前培养基改变时，优选使用的病毒量、以MOI-值给出、为0.06或0.25，以及在用流感病毒B/Florida/4/2006感染永久人细胞且在感染之前培养基改变时，优选使用的病毒量、以MOI-值给出、为0.1、0.025或0.0025。
在一优选实施方案中，在培养时的感染时间点，振荡瓶中的细胞数范围为1x106至6x106细胞/ml。感染时间点时的细胞数优选为2.3x106细胞/ml、4.5x106细胞/ml或5x106细胞/ml。在本发明的一优选实施方案中，在感染时间点时的细胞数为4.5x106细胞/ml且在感染前不改变培养基。在本发明的又一优选实施方案中，在感染时间点时的细胞数为2.3x106细胞/ml以及在感染前用新鲜的PEM-培养基进行1:2-稀释。在本发明的又一优选实施方案中，在感染的时间点时的细胞数为5x106细胞/ml且在感染前完全改变培养基。
在本发明的特别优选实施方案中，永久人细胞在1升生物反应器STR(Sartorius)中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸盐的PEM-培养基中进行培养，其中开始细胞数为5x105细胞/ml且用病毒量、以MOI-值给出、为0.025的流感病毒感染细胞数为2.1x106细胞/ml且在感染前培养基不改变。感染优选在存在的胰蛋白酶的最终浓度为3x10-5U/ml时实现。
在本发明的特别优选实施方案中，永久人细胞在1升生物反应器STR(Sartorius)中于PEM-培养基中进行培养，其中开始细胞数为8x105细胞/ml且用病毒量、以MOI-值给出、为0.025的流感病毒感染细胞且在感染前改变培养基。感染优选在存在的胰蛋白酶的最终浓度为3x10-5U/ml时实现。
在本发明的又一特别优选实施方案中，永久人细胞在1升振荡瓶式反应器(Wave Biotech AG)中于包含4mM谷氨酰胺、4mM丙酮酸盐和20mM葡萄糖的PEM-培养基中进行培养，其中开始细胞数为5x105细胞/ml以及感染之前的细胞数为2.1x106细胞/ml且用病毒量、以MOI-值给出、为0.025的流感病毒感染细胞以及在感染前培养基不改变。感染优选在存在的胰蛋白酶的最后浓度为3x10-5U/ml时实现。
在本发明的一优选实施方案中，永久人细胞在振荡瓶中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸盐的PEM-培养基中进行培养，其中在存在的胰蛋白酶-浓度为1x10-6U/细胞时用病毒量、以MOI-值给出、为0.025的流感病毒感染细胞之前改变培养基。
在本发明的一优选实施方案中，永久人细胞在振荡瓶中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸盐的PEM-培养基中进行培养，其中在存在的胰蛋白酶-浓度为1x10-5U/细胞时用病毒量、以MOI-值给出、为0.025的流感病毒感染细胞之前进行1:1-培养基改变。
在制备流感-蛋白和编码流感-蛋白的核酸分子时，将用编码流感-蛋白的核酸分子转染所培养的人细胞，然后使用已知的方法分离和净化流感病毒-蛋白或编码流感-蛋白的核酸分子。
在又一优选的实施方案中，在本发明方法中，在用病毒颗粒感染的时间点或用编码流感病毒-蛋白或其部分的核酸分子的转染时间点时，人细胞处于中间指数生长期(mittler exponentiell Wachstumsphase)和静止生长期中或处于中间指数生长期和静止生长期之间。细胞数目在时间上的典型生长曲线显示为S形曲线。该曲线开始为所谓的停滞期(lag-Phase)，之后为对数期或指数期以及平稳期。中间指数生长期在本文中相应于典型生长曲线的第一个转折点，其中转折点是生长曲线上的一个点，在这一点上曲线的形状从凹转变成凸或从凸转变成凹。当生长曲线达到平台且因此细胞数目保持稳定时开始了平稳期。
通过本发明方法制备的编码流感-蛋白的核酸可以用于核酸-免疫作用或所谓的DNA-疫苗。在核酸-免疫作用中，接种免疫抗原，即诱发人体产生免疫响应的抗原。这些免疫抗原将通过DNA或RNA进行编码以及作为表达盒或表达载体存在或整合入病毒载体中，以诱导对基因产物的免疫响应。DNA-疫苗可以以不同的给药体系存在，例如，作为DNA或RNA，以线性或圆形质粒或表达盒(Expressionskassetten)的形式，其中这些装配了表达所需的元素，例如启动子、聚腺苷酸化位点、复制起点等。在给药DNA时，所述这些主要存在于包含辅剂或不包含辅剂的缓冲液中或连接纳米颗粒或整合入包含辅剂的化合物或病毒或细菌载体中。DNA-疫苗不仅可以引起人的免疫性而且可以引起细胞-介导的免疫性。DNA-疫苗的一个优势在于抗原以它们的天然形式进行表达且因此引起改进的免疫作用。DNA-疫苗的另一优势在于与减毒的活疫苗不同，DNA-疫苗是非感染性的且可以不再是有毒的。
以DNA或RNA形式连结在颗粒上的质粒或线性DNA-片段的DNA-疫苗的给药可以通过注射或借助基因枪实现。其中注射用的DNA-疫苗可以置于例如生理盐水或缓冲生理盐水中。
通过本发明方法制备的编码流感-蛋白的核酸、流感-蛋白和流感病毒可以用作对抗流感病毒-类型-A和/或-B和/或-C的疫苗。
通过本发明方法制备的基于流感病毒的疫苗包括所有的蛋白、肽或它们的部分，以及编码流感病毒的蛋白、肽或它们的部分的核酸，以及流感病毒颗粒本身、重组流感病毒-蛋白，其包括流感-包膜蛋白、亚病毒颗粒，病毒样颗粒(VLP)，VLP的复合物，和/或它们的部分，其可以用于免疫目的对抗流感。
通过本发明方法制备的流感-蛋白优选涉及蛋白或流感病毒的衍生物，优选流感病毒株A/PR/8/34、A/Uruguay/716/2007、A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、猪流感(A/Swine(H1N2)Bakum/1832/00)或马流感(A/Equine,A/Newmarket/1/93(H3N8))。
通过常规方法分离和净化通过本发明方法制备的编码流感病毒-蛋白或它的部分的核酸且对于本领域技术人员而言是已知的。
通过本发明方法制备的流感病毒-蛋白的分离和净化借助本领域技术人员已知的方法实现。蛋白的制备首先取决于其来源。区别对待细胞内和细胞外蛋白。当蛋白位于细胞体的内部时，则首先需要通过例如剪切力或渗透力(Osmolyse)破坏细胞。之后例如通过离心来分离不溶材料如细胞膜和细胞壁。以标准方式进行的离心用于分离细胞、细胞器和蛋白。就分离能力方面而言，更有效的方法是脉冲电泳(Pulselektrophorese)。在分离了其他的细胞成分之后还有必要分离多种大蛋白、肽和氨基酸。蛋白的分离可以通过一维或二维凝胶电泳或毛细管电泳实现。在氨基酸和肽领域，则使用例如色谱方法，如亲和力-，离子交换(IEC)和反相色谱法(RPC)。脂质的存在以及分离的必要性或蛋白酶的灭活不利于净化作用。不必从细胞中提取出存在于细胞外基质中的蛋白，但是在分离了所有的不溶成分之后，细胞外基质中的蛋白则是非常稀释的且其数量通常显著低于细胞内蛋白。
使用本领域技术人员已知的方法分离和净化通过本发明方法制备的流感病毒-颗粒。这些方法的实例例如密度梯度-差速-或区带离心作用。
本发明方法中所使用的永久人细胞通过原代人细胞的永生化作用产生。原代人细胞通过直接取自有机体或来自有机体和保存在培养液中的组织而获得。优选这样的原代人细胞，其可以通过细胞-转染因子进行表达从而很好地转化至永久人细胞系，特别是羊膜细胞、胚胎视网膜细胞(embryonaleRetinazellen)还有神经细胞起源的胚胎细胞(embryonale Zellen neuronalenUrsprungs)。
细胞-转染因子可以是SV40的T-抗原(基因库登录编号(Acc.Nr.)J02400)、HPV的E6-和E7-基因产物(例如HPV16,基因库登录编号K02718)和人腺病毒的E1A-和E1B-基因产物(例如人腺病毒血清型-5,基因库登录编号X02996)。通过人腺病毒的E1和E1A-和E1B-基因产物的核酸序列的表达转染原代细胞以进行永生化作用。在通过自然获得的HPV进行表达时，E6和E7可以由RNA-转录物表达。同样的适用于天然存在的腺病毒的E1A和E1B的表达。细胞-转染因子例如腺病毒E1-功能基因作用于永生化作用或转化且因此作用于细胞的长期可培养性(Kultivierbarkeit)。
细胞-转染因子的表达可以在同源(homologen)启动子或转录末端因子(Terminationselemente)的控制下实现，例如自然E1A-启动子和腺病毒E1A-功能基因的表达用的自然E1A-聚腺苷酸化位点。用于转染的各病毒基因组的核酸分子片段例如用于转染的腺病毒基因组的核酸分子片段包含所谓的功能基因，例如E1A、E1B。然而细胞-转染因子的表达也可以在非同源(heterologer)、不是天然存在的具有所用编码区域的启动子或转录物末端因子的控制下实现。作为非同源启动子可以是例如CMV-(巨细胞病毒(Cytomegalievirus)-)启动子(Makrides,9-26in:Makrides(Hrsg.),Gene Transferand Expression in Mammalian Cells,Elsevier,Amsterdam,2003)、EF-1α-启动子(Kim等,Gene91:217-223,1990)、CAG-启动子(人巨细胞极早期启动子和具有内含子的改性鸡β-Aktin启动子的混合启动子(Hybridpromotor))(Niwa等,Gene108:193-199,1991)、人或鼠pgk-(磷酸甘油酸激酶-)启动子(Adra等,Gene60:65-74,1987)、RSV-(劳氏肉瘤病毒-)启动子(Makrides,9-26in:Makrides(Hrsg.),Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells,Elsevier,Amsterdam,2003)或SV40-(猿猴病毒40-)启动子(Makrides,9-26in:Makrides(Hrsg.),Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells,Elsevier,Amsterdam,2003)。作为聚腺苷酸化位点可以使用例如SV40大T-抗原(基因库登录编号J02400)的聚腺苷酸化序列或人G-CSF-(粒细胞集落刺激因子,granulocytecolony stimulating factor)基因(Mizushima und Nagata,Nucl.Acids Res.18:5322,1990)的聚腺苷酸化序列。
通过用含有编码E1A和E1B的核酸序列的核酸分子转染原代人细胞，该细胞得以永生化。用于原代人细胞永生化的核酸分子含有E1A-和E1B-核酸序列，该核酸序列优选源自人腺病毒，特别是人血清型5。在优选的实施方式中，用于永生化的核酸分子，除编码E1A和E1B的核酸序列外，还含有编码腺病毒pIX-功能基因的核酸序列。该pIX-多肽，一种病毒结构蛋白，作为转录激活物作用于各种病毒和细胞启动子例如胸苷激酶启动子和β-珠蛋白-启动子。如果重组多肽的编码序列在上述启动子的控制下时，在细胞中额外表达的pIX-多肽的转录激活作用可以在本发明制备的细胞系中提高重组多肽的表达速率。作为实例的序列可见基因库登录编号X02996中。特别地，核酸分子包括人腺病毒血清型-5的核苷酸1至4344、505至3522或核苷酸505至4079。
在一优选实施方案中，用于永生化原代细胞具体是羊膜细胞的核酸分子包含腺病毒血清型5核苷酸序列的核苷酸505至核苷酸4079。在又一特别优选的实施方案中，用于永生化原代细胞具体是羊膜细胞的核酸分子包含腺病毒血清型-5-核苷酸序列的核苷酸505至核苷酸3522。在又一特别优选的实施方案中，用于永生化原代细胞具体是羊膜细胞的核酸分子包含腺病毒血清型-5-核苷酸序列的核苷酸1至核苷酸4344，其相应于HEK293-细胞中的腺病毒DNA(Louis等,Virology233:423-429,1997)。另外，永生化的人细胞可以表达病毒复制因子。这些复制因子可以结合至通过转染引入的核酸分子的复制起点(ori,“复制的起点”)且由此开始了附加型核酸分子的复制。细胞中的核酸分子的附加型复制，特别是质粒-DNA的附加型复制使得被转染的核酸分子的拷贝数目大大增加且从而增强了在该分子上编码的重组多肽的表达及其经若干细胞分裂的接收。这样的病毒复制因子是例如猿猴病毒40(SV40)的T-抗原，其在结合在核酸分子上的称作SV40-复制起点(SV40ori,复制的起点)序列上以后，例如质粒-DNA，开始其复制。艾伯斯坦-巴尔-病毒(Ebstein-Barr-Virus)蛋白EBNA-1(艾伯斯坦巴尔病毒核抗原-1)识别称作ori-P的复制起点和催化携带ori-P的核酸分子的染色体外复制。猿猴病毒40(SV40)的T-抗原不仅用作复制因子激活复制，而且也对一些病毒和细胞基因的转录起激活的作用(Brady,John and Khoury,George,1985,Molecularand Cellular Biology,Vol.5,No.6,p.1391to1399)。
在本发明方法中使用的永生化人细胞特别是永生化人羊膜细胞。在一优选实施方案中，本发明方法中使用的永生化人细胞表达了SV40的大T-抗原或艾伯斯坦-巴尔-病毒(EBV)核抗原-1(EBNA-1)。在一特别优选的实施方案中，在本发明方法中使用的永生化人羊膜-细胞表达了SV40的大T-抗原或艾伯斯坦-巴尔-病毒(EBV)核抗原-1(EBNA-1)。在又一特别优选的实施方案中，在本发明方法中使用的永生化人细胞，特别是羊膜-细胞在CAG-、RSV-或CMV-启动子的控制下表达了SV40的大T-抗原。
在本发明方法中使用的永久人羊膜细胞具体记载在专利EP1230354和EP1948789中。在一特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的永久人羊膜细胞涉及CAP或CAP-T。
在CAP-细胞的情况中，用质粒转染原代羊膜细胞，该质粒包含鼠pgk启动子、包含Ad5-序列nt.505-3522的总E1-区、SV40的3'接头(Spleiβ)-和聚腺苷酸化信号和Ad5(nt.3485-4079)的pIX-区。这些质粒已详细记载在EP1948789中。
为了制备CAP-T-细胞，用质粒转染CAP-细胞，该质粒包含SV40的T-抗原的表达盒(侧接有SV40的内含子(flankiert von einem Intron aus SV40))和聚腺苷酸化位点。另外，质粒可以包含CAG-启动子(包含CMV-增强子和鸡β-Aktin启动子的混合启动子)(Niwa等人,Gene108:193-199,1991)、RSV-启动子(源自劳氏肉瘤病毒的启动子)(基因库登录编号DQ075935)或CMV-启动子(人巨细胞病毒早期启动子)(SEQ ID NO:5)。为了生成稳定的细胞系，质粒包含具有泛素启动子(Ubiquitinpromotor)(pUB/Bsd,Invitrogen#V512-20)的灭菌素(Blasticidin)-表达盒。
另外，在本发明提供的方法中，人细胞，特别是羊膜细胞，可以在悬浮液中生长。此外，在本发明方法中，人细胞，特别是羊膜细胞，可以在不含血清的培养基中培养。
本发明的又一主题是永久人细胞，特别是羊膜细胞，在制备基于流感病毒的疫苗中的用途。
在一优选实施方案中，用于制备基于流感病毒的疫苗的永久人羊膜细胞涉及CAP-或CAP-T-细胞。
通过本发明方法制备的基于流感病毒的疫苗可以是流感病毒和/或流感病毒-蛋白或编码流感-蛋白的核酸分子。疫苗可以肠胃外注射给药。这里分为皮内的、皮下的或肌内的注射。皮内注射可以通过疫苗接种枪(Impfpistole)或刺血针实现。肌内注射可以在上臂、大腿或臀部肌肉处实现。另外，疫苗可以口服或经鼻给药。疫苗可以例如给药于人和动物。
通过本发明方法制备的基于流感病毒的疫苗可以不仅通过主动免疫而且通过被动免疫赋予对抗一种或多种流感病毒的抵抗力。在主动免疫时，疫苗在使用之后用于特异激活人和动物针对确定的病毒的免疫系统。这里利用免疫系统的反应，在存在病毒或其特异病原时引起免疫响应。这导致形成抗体和特异T-辅助细胞，其可以针对各种疾病提供持久的保护，根据不同的病毒保护作用可以持续几年或一辈子。
通过本发明方法制备的基于流感病毒的疫苗可以例如涉及活疫苗或死疫苗。活疫苗包含例如减毒的但还具有繁殖能力的病毒，其不能致病。而死疫苗的病毒则已被杀死或它仅包含病毒的片段(抗原)。病毒的灭活(杀死)例如通过化学物质/物质组合例如甲醛、β-丙内酯和补骨脂素实现。病毒包膜被保存下来。也有类毒素疫苗，其仅包含病毒毒素的生物失活组分(类毒素)(例如破伤风类毒素)，这也属于死疫苗。具体地，死疫苗可以涉及片段疫苗(Spaltimpfstoff)，其包含病毒包膜蛋白的片段。病毒包膜的破坏(分裂)可以例如通过清洁剂或强有机溶剂实现。另外还可以用化学物质使病毒失活(杀死)病毒。另外还属于死疫苗的有亚单位疫苗(Untereinheitimpfstoffe)，其包含特定的病毒成分，例如凝血素-和神经氨酸苷酶-蛋白。
在被动免疫时，通过本发明方法制备的基于流感病毒的疫苗向已经获得被诱发的抗血清的宿主(例如哺乳动物)给药，以及向感染了至少一种流感病毒的接受者给药。
另外，向疫苗中加入一种或多种添加剂，如稳定剂、中和剂、载体和保存剂，用于给药。此外，甲醛、硫柳汞(Thiomersal)、磷酸铝、Azeton和苯酚也属于这些物质。另外，可以向疫苗中加入辅剂以强化疫苗的效用。这些所谓的辅剂本身应该尽可能不具有药效且具体地用作助溶剂
Figure BDA00003056512600161
、乳液或它们的混合物。辅剂是例如矿物盐、角鲨烯混合物、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝杆菌细胞壁制剂、特定的乳液、单磷酸类脂-A、霉菌酸
Figure BDA00003056512600162
-衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱-毒素B的亚单位、聚磷腈和它的衍生物、免疫刺激复合物、细胞因子辅剂、MF59-辅剂、脂质辅剂、粘膜辅剂、确定的细菌-外毒素、确定的寡核苷酸和PLG。
下文实施例阐述了本发明，并且并不理解为限制性的。如果没有另外注明，则使用的是分子生物学标准方法，例如Sambrook等,1989,Molecularcloning:A Laboratory Manual2.Auflage,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York中所记载的。
实施例1:永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5在PEM-或293SFMII-培养基 中的培养试验
永久羊膜细胞系CAP-1D5在100ml不含血清的293SFMII-培养基(Invitrogen)或PEM-培养基(Invitrogen)中于37°C、8%CO2和100rpm时进行培养。作为对照，在100ml振荡瓶中于100ml不含血清的SMIF8-培养基中使用永久犬肾细胞系MDCK.SUS2(Madin Darby Canine Kidney,在悬浮液中适应生长)(Lohr等人,Vaccine,2010,28(38):6256-64)。
在时间点0(=培养的开始点)以及分别在24小时的时间间隔上测定活细胞数、死细胞数、细胞系的存活率以及pH-值、培养基中的葡萄糖、乳糖、谷氨酰胺、铵、谷氨酸以及丙酮酸盐的浓度(生物化学多参数分析系统)(Lohr等,Vaccine,2009,27(37),4975-4982；Genzel等,Appl Microbiol Biotechnol.,2010,88(2):461-75)。
永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5在293SFMII-以及PEM-培养基中的活细胞数以及MDCK.SUS2-细胞的活细胞数从培养开始时候每毫升培养液约2x105细胞就显示了相似的曲线以及在168小时后实现的活细胞数为约每毫升2x106细胞。MDCK.SUS2-细胞的活细胞数从192小时起减小至每毫升9x105细胞且至生长曲线开始后的240小时保持稳定。在293SFMII-培养基中的永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5的活细胞数在216小时时才减小至每毫升培养液2x105细胞的初始值，而在PEM培养基中的CAP-1D5-细胞的活细胞数保持稳定为每毫升培养液约2.5x106细胞直到240小时，且在312小时后才达到2x105细胞的活细胞数的初始值。
在293SFMII-培养基和PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞的存活率以及MDCK.SUS2-细胞的存活率在生长曲线开始时和直到168小时时在80%和90%之间。在PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞的存活率至240小时保持为80%，之后减小且在312小时后显示为10%。在293SFMII-培养基中的CAP-1D5-细胞的存活率在168小时后就缓慢减小以及在216小时后显示为约10%。MDCK.SUS2-细胞的存活率在168小时后连续减小且在240小时后达到约45%。
MDCK.SUS2-细胞的培养液的pH-值保持超过240小时的相对稳定，其介于7.7和7.6之间。而在293SFMII-培养基以及PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞的培养液的pH-值(开始时为7.4)在240小时(293SFMII-培养基)和312小时(PEM-培养基)后持续减小至pH6.4。
在CAP-1D5-细胞的各培养液的293SFMII-培养基和PEM-培养基中的乳糖-浓度从小于5mM的开始浓度直到240小时增加至30–35mM。在MDCK.SUS2-细胞的培养液中，乳糖-浓度以较小强度增加，但是240小时时达到与CAP-1D5-细胞的培养液类似的值。在293SFMII-培养基和PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞的培养液以及MDCK.SUS2-细胞的培养液的葡萄糖-浓度从培养开始时的20至25mM减小至小于10mM，其中在293SFMII-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液显示了最强的降低。
在293SFMII-培养基以及PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液中的铵-浓度的增加显示了非常相似的曲线(从<0.5增加至4-5mM)。而在MDCK.SUS2-细胞的培养液中的铵-浓度显著更强地增加(至7mM)。在293SFMII-培养基以及PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液中的谷氨酰胺-浓度的减小的曲线也是非常相似的，其中在PEM-培养基中的培养液显示了最强的降低。
MDCK.SUS2-细胞培养液显示了最大的谷氨酸-浓度且该浓度仅少量增加。在PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液中的谷氨酸-浓度在培养开始时高于在293SFMII-培养基中的浓度且持续增加。在MDCK.SUS2-细胞的培养液中的丙酮酸盐-浓度自144小时起减小至0。而在PEM-培养基和293SFMII-培养基中的CAP-1D5-细胞的培养液中的丙酮酸盐在48小时时就消耗了。
因此显示了CAP-1D5-细胞在PEM-培养基中比在293SFMII-培养基中更好地生长，PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞显示了最强的葡萄糖消耗和最强的乳糖-形成。自192小时起的葡萄糖限制可以解释为在PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞的细胞数的突降(Einbruch)。为了优化CAP-1D5-细胞在PEM-培养基或293SFMII-培养基中的培养液的培养条件，pH-值的稳定、丙酮酸盐和谷氨酰胺的添加以及葡萄糖可以是相关的。
实施例2:用未经适应的病毒的病毒感染
针对用未经适应的病毒进行的感染试验，羊膜细胞系CAP-1D5在55ml不含血清的293SFMII-培养基(Invitrogen)和PEM-培养基(Invitrogen)中于37°C、8%CO2、100rpm时在振荡瓶中培养。犬肾细胞系MDCK.SUS2(MadinDarby Canine Kidney,在悬浮液中适应)用作对照。
分别列在表1中的细胞密度用病毒B/Florida/4/2006(NIBSC,TheNational Institute for Biological Standards and Control)或A/PR/8/34(H1N1)(RKI,Robert-Koch-Institut)进行感染，其中培养基不改变以及加入5x10-6U/mL胰蛋白酶。所生成的病毒颗粒量通过滴定凝血素(HA,根据标准方法进行的凝血素测试)确定(表示为log HA-单位/100μl；表1)(Kalbfuss等,2008；Biologicals36(3):145-61)。在表1中还列出了该时间点上的各培养基的pH-值。
表1:通过非适应性病毒在培养基不改变时进行的病毒感染试验的概况
在0hpi*时的活细
Figure BDA00003056512600181
hpi:感染后的小时数
对于永久羊膜细胞系CAP-1D5，在PEM-培养基中培养时，用病毒B/Florida/4/2006(B/Florida)和用病毒A/PR/8/34感染时均未能证实病毒颗粒的产生。在293SFM-培养基中A/PR/8/34(H1N1)的最大HA-值小于MDCK.SUS2实现的最大HA-值。在CAP-1D5的所有感染的情况中的最大HA时的pH-值是可比较的(pH6.6)，但是显著小于感染的MDCK.SUS2-细胞(pH7.7)。
因此，在所测试的条件下，仅在使用病毒B/Florida时，永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5发生感染。在永久犬肾细胞系MDCK.SUS2(Madin DarbyCanine Kidney)的情况中，则仅在使用病毒A/PR/8/34(H1N1)时证实发生了感染。以下实验将测试是否可以通过在CAP-1D5-细胞上进行病毒的预先的适应实现更好的感染从而获得更高的病毒产率。
实施例3:在振荡瓶中于PEM-和293SFMII-培养基中在CAP-1D5-细胞 上的病毒适应性
在振荡瓶中于PEM-培养基和293SFMII-培养基中通过历经四代感染CAP-1D5实现流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(RKI,Robert-Koch-Institut)、A/Uruguay/716/2007(H3N2)(NYMC X-175C,NIBSC,The National Institutefor Biological Standards and Control)或B/Florida/4/2006(NIBSC,The NationalInstitute for Biological Standards and Control)的病毒适应性。每次感染前改变培养基。每代期间的病毒产量通过滴定凝血素(log HA-单位/100μl)和半数组织培养感染量(Tissue Culture Infectious Dose50Assay)(TCID50,病毒数/ml)进行定量(Genzel and Reichl,Vaccine production-state of the art and futureneeds in upstream processing in Methods in Biotechnology:Animal CellBiotechnology-Methods and Protocols；Eds.R.HUMANA Press Inc.,Totowa,New Jersey,2007,457-473；Kalbfuss等,2008；Biologicals36(3):145-61)。
不仅在PEM-培养基中而且在293SFMII-培养基中，被流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和A/Uruguay/716/2007(H3N2)感染的CAP-1D5-细胞在四代后显示了显著增加的病毒滴度。被流感病毒B/Florida/4/2006感染的CAP-1D5-细胞不仅在293SFMII-培养基中的培养时而且在PEM-培养基中的培养时在第二代中显示了显著增加的病毒滴度。被流感病毒A/PR/8/34(H1N1)或A/Uruguay/716/2007(H3N2)感染的CAP-1D5-细胞不仅在PEM-培养基中而且在293SFMII-培养基中的HA-值的滴定也显示了可比较的增加。
除了适应后病毒滴度增加，随着每次传代病毒的复制更快且病毒滴度最终显著增加。总体而言，相比较PEM-培养基而言，293SFMII-培养基中实现了略微增加的病毒滴度。
实施例4:CAP-1D5-和MDCK.SUS2-细胞被适应性流感病毒A/PR/8/34 感染的MOI(复合感染)-依赖性
通过经适应的流感病毒A/PR/8/34(H1N1；RKI,Robert-Koch-Institut)，在3个不同的MOI(复合感染)数值以及每个宿主细胞的病毒颗粒数为0.0025、0.025和0.25时检查MOI-依赖性。在振荡瓶中，永久羊膜细胞CAP-1D5在293SFMII-培养基或PEM-培养基以及永久犬肾细胞MDCK.SUS2在SMIF8-培养基中用适应性流感病毒A/PR/8/34的不同MOI进行感染。在感染时，额外预先改变培养基，其具有几乎恒定的pH-值，约pH=7.5。接着，在96小时之后的活细胞数以及在144小时之后的病毒颗粒量(log HA-单位/100μl)通过根据标准方法的凝血素测试的凝血素滴定进行测定。
在293SFM-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液以及在SMIF8-培养基中的MDCK.SUS2-细胞培养液中的活细胞数的曲线以及所形成的病毒颗粒量的曲线未显示MOI-值的依赖性。在两个培养液中的病毒滴度增加且超过2.5log HA-单位/100μl。PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液在所有三个MOI-值时显示了更小的病毒颗粒量(约2.0log HA-单位/100μl)。在PEM-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液的活细胞数相应地大于48小时保持稳定且为1x106细胞/ml以及之后减小至小于1x104细胞/ml。与此相反，在293SFM-培养基中的CAP-1D5-细胞培养液的活细胞数以及MDCK.SUS2-细胞培养液中的活细胞数在96小时后从1x106细胞/ml持续减小至小于1x104细胞/ml。在所有的培养液中，在MOI为0.0025时可见病毒复制略微减缓，其通过与MOI值更大时相比在时间上log HA-单位增加有所减缓得以证实。
实施例5:在1L容量中感染(经A/PR/8/34适应)培养
CAP-1D5-细胞在1升生物反应器中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸盐的PEM-培养基中且在85rpm、pH=7.2和用纯氧在氧分压pO2为40%时进行培养。开始细胞数为5x105细胞/mL。
在114小时的生长和细胞数为2.4x106细胞/ml后，CAP-1D5-细胞被流感病毒A/PR/8/34(经适应的：在PEM中,第四代,1.78x107病毒/mL)感染。预先不改变培养基，但是加入80ml PEM-培养基，以及谷氨酸盐和丙酮酸盐的最终浓度分别为2mM。MOI值为0.025且加入最终浓度为1x10-5U/mL的胰蛋白酶。240小时后，相隔24小时测定活细胞数、死细胞数和细胞系的存活率以及培养基中的pH-值、葡萄糖、乳糖、谷氨酰胺、铵、谷氨酸和丙酮酸盐的浓度。另外，从感染的时间点(114小时)起，测定log HA-单位/100μl和TCID50-值(Genzel and Reichl,Vaccine production-state of the art andfuture needs in upstream processing in Methods in Biotechnology:Animal CellBiotechnology-Methods and Protocols；Eds.R.
Figure BDA00003056512600211
HUMANA Press Inc.,Totowa,New Jersey,2007,457-473；Kalbfuss等,2008；Biologicals36(3):145-61)。
CAP-1D5-细胞的活细胞数首先增加直至被流感病毒A/PR/8/34感染，从6x105细胞/ml增加至2,4x106细胞/ml且在感染后又减小一些。CAP-1D5-细胞的存活率在整个时间段上介于80%和90%之间且在240小时后才减小至70%。培养液中的丙酮酸盐-浓度在72小时内减小至0，在被流感病毒感染时所加入的丙酮酸盐量在10小时内也被消耗。在整个时间段上谷氨酸盐-浓度持续增加，且从约1mM增加至约1.8mM。培养液的pH-值在观察时间段上在7.1至7.4之间浮动。实现的最大TCID50-滴度为2.4x107病毒/mL，最大HA-滴度为2.2log HA-单位/100μl。
该生长试验的结果显示，由于加入丙酮酸盐，未出现葡萄糖限制(Glucoselimitierung)，因此活细胞数未增加。
实施例6:在50ml-Falcons于PEM-和293SFMII-培养基中于CAP-1D5 细胞上的病毒适应性
流感病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1-样HGR；IVR-148,NIBSC,TheNational Institute for Biological Standards and Control)、B/Florida/4/2006(NIBSC,The National Institute for Biological Standards and Control)、猪流感(A/Swine(H1N2)Bakum/1832/00；IDT Biologika)和马流感(A/Equine2(H3N8)；A/Newmarket/1/93；NIBSC,The National Institute for BiologicalStandards and Control)的病毒适应性通过在50ml Falcon-容器中于PEM-培养基和293SFMII-培养基中历经四代CAP-1D5的感染实现。在每次感染前改变培养基。每代期间的病毒产量通过滴定凝血素(log HA-单位/100μl)和半数组织培养感染量(TCID50,病毒数/ml)进行定量(Genzel and Reichl,Vaccineproduction-state of the art and future needs in upstream processing in Methodsin Biotechnology:Animal Cell Biotechnology-Methods and Protocols；Eds.R.
Figure BDA00003056512600221
HUMANA Press Inc.,Totowa,New Jersey,2007,457-473；Kalbfuss等,2008；Biologicals36(3):145-61)。
不仅在PEM-培养基中而且在293SFMII-培养基中，流感病毒A/Brisbane/59/2007和B/Florida/4/2006对CAP-1D5-细胞的感染在4代后的病毒滴度显著增加，其中在293SFMII-培养基中的病毒滴度的增加更强烈。不仅在PEM-培养基中而且在293SFMII-培养基中CAP-1D5-细胞被流感病毒A/Brisbane/59/2007或B/Florida/4/2006感染时的HA-值的滴定也显示了可比较的增加。不仅在PEM-培养基中而且在293SFMII-培养基中用猪流感病毒感染CAP-1D5-细胞引起了HA-值的滴定的增加。
除了传代后病毒滴度增加，随着每次传代病毒的复制更快且病毒滴度最终显著增加。总体而言，相比较PEM-培养基而言，293SFMII-培养基中实现了略微增加的病毒滴度。
实施例7:开始细胞数增加时永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5的培养试验
永久羊膜细胞系CAP-1D5在100ml PEM-培养基(Invitrogen)中于37°C、8%CO2和185rpm时进行培养。开始细胞数为5x105细胞/ml或8x105细胞/ml。另外，在开始细胞数增加的设置
Figure BDA00003056512600222
中加入最终浓度为4mM或10mM的丙酮酸盐和其他的氨基酸。
在时间点0(=培养的开始点)以及分别在24小时的时间间隔上测定活细胞数、死细胞数、细胞系的存活率以及pH-值、培养基中的葡萄糖、乳糖、谷氨酰胺、铵、谷氨酸以及丙酮酸盐的浓度(生物化学多参数分析系统)(Lohr等,Vaccine,2009,27(36),4975-4982；Genzel等,Appl Microbiol Biotechnol.,2010,88(2):461-75)。
通过开始细胞数的增加，从培养开始时的每毫升培养液约5x105细胞增加至每毫升PEM-培养基中的永久羊膜细胞细胞系CAP-1D5培养液8x105细胞，在90小时后实现每ml培养液1x106细胞的更大产量。从而在典型的感染时间点(培养的初始点后约96小时至120小时)实现了每毫升培养液5–6x106细胞的细胞数。
在典型的感染时间点(培养的初始点后约96小时至120小时)时的培养液的pH-值位于6.6-6.8临界范围中。感染时的pH-值优选为约7.2-7.4。
实施例8:胰蛋白酶活性的曲线和改变培养基或用培养基进行1:2-稀释 对病毒滴度的影响
在该实验中对病毒感染时的不同胰蛋白酶浓度的使用和培养基改变或培养基的1:2-稀释对病毒滴度的影响进行了研究。
在振荡瓶中，永久羊膜细胞系CAP-1D5在分别包含4mM丙酮酸盐和4mM谷氨酰胺的100ml PEM-培养基(Invitrogen)中且在37°C,8%CO2和185rpm时进行培养。在培养的开始时间点时细胞系用CAP-1D5-细胞适应的A/PR/8/34-流感病毒(H1N1；RKI,Robert-Koch-Institut)进行感染。当在感染前培养基不改变时，培养液中的细胞数在感染的时间点时为4.5x106细胞/ml培养液，或当在感染前用PEM-培养基进行1:2-稀释时为2.3x106细胞/ml培养基，以及当在感染前培养基完全改变时为5x106细胞/ml。另外，在培养时不改变培养基以及用PEM-培养基进行1:2-稀释时，胰蛋白酶浓度为1x10-4U/细胞、3x10-5U/细胞和5x10-5U/细胞。在培养基完全改变进行培养时，使用的胰蛋白酶浓度为1x10-4U/细胞、1x10-5U/细胞、5x10-5U/细胞和1x10-6U/细胞或不使用胰蛋白酶。
与未改变培养基的培养液情况中的2.30log HA相比，较用新鲜PEM-培养基进行1:2-稀释引起HA更早增加(约12小时，取代24小时)和更大的HA-2.70log HA最大值。培养基完全改变引起增加的HA-值，其大于3.0logHA。
在培养基不改变的培养液中以及用PEM-培养基进行1:2-稀释的培养液中，log HA-值显示了非常相似的曲线，其不依赖于胰蛋白酶浓度。在其中培养基完全改变的培养液中，胰蛋白酶浓度为1x10-5U/细胞、5x10-5U/细胞和1x10-6U/细胞时的log HA-值的曲线是非常相似的。不含胰蛋白酶的培养液中，log HA-值只达到约2log HA-单位/100μl以及在使用了1x10-4U/细胞的胰蛋白酶的培养液中，log HA-值小于1log HA-单位/100μl。
实施例9:在感染前改变培养基或不改变培养基时CAP-1D5-细胞在 PEM-培养基中被不同的经适应流感病毒株感染的MOI-(复合感染)依赖性
通过实验，研究MOI-值和病毒滴度(以每100μl培养液的log HA-单位表示)之间的依赖性，其中MOI-值即感染用的病毒颗粒数和待感染的CAP-1D5-细胞之间的数值比。
为此，在振荡瓶中，永久羊膜细胞系CAP-1D5在分别包含4mM丙酮酸盐和4mM谷氨酰胺的50ml PEM-培养基(Invitrogen)中于37°C、8%CO2和185rpm时进行培养。检查了感染前培养液的培养基不改变以及培养基改变时的MOI-依赖性。使用了三种不同的适应的流感病毒株：A/PR/8/34(RKI,Robert-Koch-Institut)、A/Brisbane/59/2007(IVR-148,NIBSC,The NationalInstitute for Biological Standards and Control)和B/Florida/4/2006(NIBSC,TheNational Institute for Biological Standards and Control)。在50mL振荡瓶中当接种时的细胞浓度为4.9x106细胞/mL(培养基不改变)和5.0x106细胞/mL(培养基改变)时实现感染。当培养基不改变时，感染在MOI-值为0.25或0.10(在A/Brisbane-流感病毒时)、0.025和0.0025时实现，以及当培养基改变时，MOI-值为0.10或0.06(在A/Brisbane-流感病毒时)、0.025和0.0025。胰蛋白酶活性在培养基不改变时为1x10-4U/细胞以及在培养基改变时为1x10-6U/细胞。之后，在超过144小时后测定病毒颗粒量(log HA-单位/100μl)(Kalbfuss等,2008；Biologicals36(3):145-61)。
改变培养基引起了更加一致的病毒复制结果。只有在感染了流感病毒A/PR/8/34的细胞且培养基不改变时以及在感染了流感病毒A/Brisbane的细胞且培养基改变时可识别出较小的MOI-依赖性。通过改变培养基可以实现显著更大的log HA-值。在培养基不改变时的pH-值部分位于临界区域6.6至6.8中，以及在培养基改变时pH-值为7.3–7.5。
实施例10:在1L容量的STR-生物反应器和Wave-生物反应器中通过感 染(A/PR/8/34适应的)进行继续培养
在设置(B16)中，CAP-1D5-细胞在1升生物反应器STR(Sartorius)中于包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸盐的PEM-培养基中在120rpm、pH=7.2和用纯氧在氧分压pO2为40%时进行培养。开始细胞数为5x105细胞/mL。在72.75小时的生长和细胞数为2.1x106细胞/ml后，CAP-1D5-细胞被流感病毒A/PR/8/34(经适应的:在PEM中,第四代,2.01x106病毒/mL)感染。在此预先不改变培养基。MOI-值为0.025且加入的胰蛋白酶的最终浓度为3x10-5U/mL。
在另一设置(B26)中，CAP-1D5-细胞在1升生物反应器STR(Sartorius)中于PEM-培养基中在120rpm、pH=7.4-7.2和用纯氧在氧分压pO2为40%时进行培养。开始细胞数为8x105细胞/mL。在92小时的生长后，CAP-1D5-细胞被流感病毒A/PR/8/34(经适应的:在PEM中,第四代,3.75x106病毒/mL)感染。预先完全改变培养基以及调节pH-值至7.6。MOI-值为0.025且加入的胰蛋白酶的最终浓度为3x10-5U/mL。
在第三设置(wave)中，CAP-1D5-细胞在1升Wave反应器(Wave BiotechAG)中于包含4mM谷氨酰胺、4mM丙酮酸盐和20mM葡萄糖的PEM-培养基中在振荡频率(Wippfrequenz)为13rpm、角度为7°、pH=7.3-6.9、用纯氧在氧分压pO2为40%和CO2-分压为7.5%时进行培养。开始细胞数为5x105细胞/mL。在72小时的生长后，CAP-1D5-细胞被流感病毒A/PR/8/34(经适应的:在PEM中,第四代,1.87x106细胞/ml)感染。感染前的细胞数为2.1x106细胞/ml。预先不改变培养基。MOI-值为0.025且加入的胰蛋白酶的最终浓度为3x10-5U/mL。
在第四设置中，MDCK.SUS2-细胞在1升生物反应器STR(Sartorius)中于AEM-培养基中进行培养。开始细胞数为5x105细胞/mL。在118.25小时的生长后，MDCK.SUS2-细胞被流感病毒A/PR/8/34感染(Lohr等,Vaccine,2010,28(38):6256-64)。
测定192小时后的活细胞数和死细胞数，以及测定培养基中的pH-值、葡萄糖、乳糖、谷氨酰胺、铵、谷氨酸和丙酮酸盐的浓度。另外，自感染的时间点起继续测定log HA-单位/100μl和TCID50-值(Genzel and Reichl,Vaccine production-state of the art and future needs in upstream processing inMethods in Biotechnology:Animal Cell Biotechnology-Methods and Protocols；Eds.R.HUMANA Press Inc.,Totowa,New Jersey,2007,457-473；Kalbfuss等,2008；Biologicals36(3):145-61)。
CAP-1D5-细胞在所有的三个设置中生长得更快和具有更大的密度，相比较MDCK.SUS2-细胞而言。CAP-1D5-细胞培养液中的病毒滴度达到的logHA-单位/100μl最大值为约2.5。MDCK.SUS2-细胞培养液的病毒滴度达到的log HA-单位/100μl最大值为约3。CAP-1D5-细胞培养液中的病毒滴度显著更早增加，相比较MDCK.SUS2-细胞培养液中的病毒滴度。
实施例11:在振荡瓶中于PEM-或293SFMII-培养基中且在感染前完全 改变培养基或进行1:1-培养基改变病毒产量的增加的培养试验
为了优化在振荡瓶中培养的CAP-1D5-细胞培养液中的病毒产量，CAP-1D5-细胞在培养基293SFMII(Invitrogen)和PEM(Invitrogen)中进行培养且进行1:1-培养基改变或完全改变培养基。
在100ml振荡瓶中，永久羊膜细胞系CAP-1D5在包含4mM谷氨酰胺和4mM丙酮酸盐的50ml PEM-培养基中且在37°C,8%CO2和100rpm时进行培养。在MOI为0.025时用适应的流感病毒A/PR/8/34感染细胞之前改变培养基。当进行1:1-培养基改变时，在感染细胞时使用的胰蛋白酶浓度为1x10-5U/细胞。当完全改变培养基时，在感染细胞时使用的胰蛋白酶浓度为1x10-6U/细胞。不仅使用PEM-培养基而且使用293SFMII-培养基实现培养基的改变。感染时的细胞浓度为5x106细胞/ml。
72小时后，借助标准方法测定活细胞数、存活率、pH-值以及通过凝血素滴定测定的log HA-单位/100μl(Lohr等,Vaccine,2009,27(36),4975-4982；Genzel等,Appl Microbiol Biotechnol.,2010,88(2):461-75)。
相比较在其中进行了1:1-培养基改变的细胞培养液而言，在用流感病毒A/PR/8/34感染之前培养基完全改变的细胞培养液中的病毒滴度增加更快。另外，相比较其中继续进行了1:1-培养基改变的细胞培养液而言，在用流感病毒A/PR/8/34感染之前培养基完全改变的细胞培养液中的病毒滴度实现了更高的最大病毒滴度。
在感染前培养基完全改变的细胞培养液的活细胞数在24小时后从5x106细胞/ml急剧减小，从而在48小时后活细胞数还有约2x104细胞/ml。PEM-培养基和感染前进行了1:1培养基改变的细胞培养液中的活细胞数减小的急剧程度最小，在该情况中，在72小时后活细胞数还有约7x105细胞/ml。
在整个72小时的时间段内所有的细胞培养液中的pH-值为7.6至7.2。

Claims (15)

1.基于流感病毒的疫苗的制备方法，其包括：
a)使流感病毒接触永久人羊膜细胞，
b)培养所述永久人羊膜细胞，
c)实现流感病毒的表达，以及
d)从培养基中分离所述流感病毒。
2.基于流感病毒的疫苗的制备方法，其包括：
a)使编码流感病毒-蛋白的核酸分子接触永久人羊膜细胞，
b)培养所述永久人羊膜细胞，
c)实现编码流感病毒-蛋白的核酸分子的复制和/或流感病毒-蛋白的表达，以及
d)从培养基中分离编码流感-蛋白的核酸分子和/或流感病毒-蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中所述永久人羊膜细胞在与流感病毒或编码流感病毒-蛋白的核酸分子进行接触的时间点处于指数生长期和静止生长期中或处于指数生长期和静止生长期之间。
4.根据权利要求1所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中在步骤d)中从所述培养基中分离出所述流感病毒通过密度梯度-差速-离心或区带离心实现。
5.根据权利要求2所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中在步骤d)中从所述培养基中分离所述流感病毒-蛋白通过电泳法或色谱法实现。
6.根据上述权利要求中任一项所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中所述永久人羊膜细胞表达腺病毒基因产物E1A和E1B。
7.根据权利要求4所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中所述腺病毒基因产物E1A和E1B包括人腺病毒血清型-5的核苷酸1至4344、505至3522或核苷酸505至4079。
8.根据上述权利要求中任一项所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中所述永久人羊膜细胞表达腺病毒基因产物pIX。
9.根据上述权利要求中任一项所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中在接触流感病毒或编码流感病毒-蛋白的核酸分子之前完全改变培养基或用培养基进行1:2的稀释。
10.根据上述权利要求中任一项所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中在接触流感病毒或编码流感病毒-蛋白的核酸分子时加入的胰蛋白酶浓度为1×10-4U/细胞、1×10-5U/细胞、3×10-5U/细胞、5×10-5U/细胞或1×10-6U/细胞。
11.根据上述权利要求中任一项所述的基于流感病毒的疫苗的制备方法，其中在接触流感病毒时使用的病毒量，以MOI-值给出，在0.001至0.3的范围。
12.永久人羊膜细胞在制备基于流感病毒的疫苗中的用途。
13.根据权利要求5所述的用途，其中所述永久人羊膜细胞表达腺病毒基因产物E1A和E1B。
14.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述永久人羊膜细胞表达腺病毒基因产物pIX。
15.根据权利要求6所述的用途，其中所述腺病毒基因产物E1A和E1B包括人腺病毒血清型-5的核苷酸1至4344、505至3522或核苷酸505至4079。
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