CN114767843B - 一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗以腮腺炎病毒为活载体表达新型冠状病毒表面的糖蛋白、新型冠状病毒表面糖蛋白的功能亚基或者新型冠状病毒表面糖蛋白功能亚基的受体蛋白；所述疫苗可以作为二联苗进行使用，同时预防腮腺炎病毒和SARS‑CoV‑2。

Description

一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗
技术领域
本发明涉及一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，属于生物医药技术领域。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2是目前已知的第7种可感染人类的冠状病毒。相较于SARS病毒和流行性流感病毒，SARS-CoV-2的人际传播速度更快（R0=2.5）、潜伏期更长（4-12），以及由于上呼吸道病毒载量高导致患者发病后具有强传染性。临床症状主要以发热、干咳、乏力为主；重症多发生呼吸困难，快速进展为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，甚至出现代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等，严重危害人体健康。现阶段，关于新型冠状病毒无特效药，全球紧锣密鼓的进行疫苗研发，主要集中在灭活疫苗、mRNA疫苗、载体疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗等。
流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒（Mumps virus，MuV）引起的一种急性呼吸道传染病。其主要临床症状为发热、腮腺非化脓性肿痛；部分病例还会继发无菌性脑膜炎、胰腺炎、睾丸炎等；症状严重者可导致伤残或者死亡。流行性腮腺炎在我国属于法定管理的丙类传染病。本病尚缺乏特效药物，抗生素治疗没有明显效果。当前，疫苗的预防接种仍然是该病的唯一有效的预防和控制手段。
为了减轻接种负担，接种疫苗时通常倾向于使用联合疫苗。目前，尚未有同时预防SARS-CoV-2和腮腺炎病毒的联用疫苗，而预防SARS-CoV-2和腮腺炎病毒的疫苗接种量又十分巨大。因此，亟需研发同时预防SARS-CoV-2和腮腺炎病毒的联用疫苗。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗以腮腺炎病毒为活载体表达新型冠状病毒表面的糖蛋白；
或者，所述疫苗以腮腺炎病毒为活载体表达新型冠状病毒表面糖蛋白的功能亚基；
或者，所述疫苗以腮腺炎病毒为活载体表达新型冠状病毒表面糖蛋白功能亚基的受体蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述糖蛋白为S蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述S蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述功能亚基为S1亚基。
在本发明的一种实施方式中，所述S1亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述S1亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述受体蛋白为RBD蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述RBD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述糖蛋白的基因插入在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间。
在本发明的一种实施方式中，编码所述功能亚基的基因插入在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间。
在本发明的一种实施方式中，编码所述受体蛋白的基因插入在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间。
在本发明的一种实施方式中，所述腮腺炎病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V202182。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗以腮腺炎病毒为活载体表达新型冠状病毒表面的糖蛋白、新型冠状病毒表面糖蛋白的功能亚基或者新型冠状病毒表面糖蛋白功能亚基的受体蛋白；所述疫苗可以作为二联苗进行使用，同时预防腮腺炎病毒和SARS-CoV-2。
进一步地，所述疫苗以腮腺炎病毒为活载体表达新型冠状病毒表面RBD蛋白，并且，编码所述RBD蛋的基因插入在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间；与其他插入位点相比，此设置下，额外插入的基因既不会影响腮腺炎病毒的生长特性，也不会影响腮腺炎病毒的免疫原性，并且，此设置可显著提高RBD蛋白在腮腺炎病毒中的表达量，提高疫苗对新型冠状病毒的免疫效果。
进一步地，所述疫苗以腮腺炎病毒减毒株QS-F46（保藏编号为CCTCC No:V202182）为活载体；研究发现，与其他腮腺炎病毒毒株（例如，腮腺炎病毒毒株QS-F）相比，腮腺炎病毒减毒株QS-F46的毒性明显降低，并且，其可以较好的适应鸡胚成纤维细胞，满足国内的疫苗生产要求，同时，研究发现，腮腺炎病毒减毒株QS-F46的复制特性能够随着其在鸡胚成纤维细胞中传代次数的增长而提高，有利于疫苗的大规模生产，另外，腮腺炎病毒减毒株QS-F46为F基因型，能够更好的适应中国的流行毒株。
生物材料保藏
一株腮腺炎病毒减毒株QS-F46（F基因型），所述腮腺炎病毒减毒株QS-F46（F基因型）已于2021年11月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V202182，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
一株重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2），所述重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）已于2020年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V202073，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：疫苗基因组架构模式。
图2：pAC-rMuV-CoV-RBD全长克隆经酶切后的凝胶电泳检测结果。
图3：病毒感染细胞的Western-Blot结果。
图4：病毒感染细胞的间接免疫荧光结果。
图5：不同病毒在Vero细胞上的复制特性。
图6：不同代次重组病毒QS-F46-RBD（SARS-CoV-2）在CEF细胞上的生长特性。
图7：小鼠的免疫程序。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的缓冲液如下：
PBS缓冲液：先称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
CBS缓冲液：先取1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至9.6，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.05M、pH 9.6的CBS缓冲液。
PBST缓冲液：取0.5mL吐温20溶于1000mL 0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液中，即得PBST缓冲液。
实施例1：一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗
本实施例提供了一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗以腮腺炎病毒减毒株QS-F46（腮腺炎病毒减毒株QS-F46为腮腺炎病毒毒株QS-F传46代减毒所得，腮腺炎病毒毒株QS-F的保藏编号为CCTCC No:V202182，记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中，腮腺炎病毒减毒株QS-F46的保藏编号为CCTCC No:V202182）为活载体表达新型冠状病毒的（氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示）RBD蛋白，其中，编码所述RBD蛋白的基因插入在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间（疫苗基因组架构模式见图1）。
所述疫苗的制备方法包括如下步骤：
1、pAC-rMuV-CoV-RBD全长克隆的构建
合成DNA片段F1、F2和F3；以F1和F2为模板，以F1-S-F、F2-S-RBD-R为引物，进行融合PCR，得到DNA片段F1+F2；使用限制性内切酶Xma I和Sap I（购自Takara公司）对重组质粒pAC-rMuV（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）进行酶切，得到线性化的重组质粒pAC-rMuV；将F1+F2、F3和线性化的重组质粒pAC-rMuV进行同源重组，得到pAC-rMuV-CoV-RBD全长克隆（使用的扩增引物见表1）。
使用限制性内切酶Xma I和Sap I（购自Takara公司）对pAC-rMuV-CoV-RBD全长克隆进行酶切后，使用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行鉴定，鉴定结果见图2。
如图2所示，pAC-rMuV-CoV-RBD全长克隆经酶切后得到了长度分别为16232bp和2774bp的两个片段。
2、病毒拯救
将BSR细胞（购自中检院）以8*105个的接种量接种于含有2000 μL/孔 DMEM培养基（购自Gibco公司）的六孔板中，于37℃下培养24 h后，选择细胞汇合度80~90%的细胞孔用于病毒拯救；将7 μg pAC-rMuV-CoV-RBD全长克隆、1.5 μg辅助质粒pcDNA3.1-N（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）、0.2 μg pcDNA3.1-P（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）和1.0 μg pcDNA3.1-L（记载于公开号为CN111019910A的专利申请文本中）与12 μL LipofectamineTM 2000转染试剂（购自Invitrogen公司）混合后，添加至700 μL DMEM培养基中，得到混合液；将混合液于室温（25℃）下孵育20 min，得到质粒转染试剂混合物；用PBS缓冲液洗涤病毒拯救细胞孔中的BSR细胞3次，洗涤结束后，将质粒转染试剂混合物以700 μL/孔的添加量加入病毒拯救细胞孔中，于37℃孵育6 h，孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤病毒拯救细胞孔中的BSR细胞3次，洗涤结束后，将病毒拯救细胞孔中的质粒转染试剂混合物更换为含2%（v/v）胎牛血清（购自Gibco公司）、1%（v/v）青霉素-链霉素双抗（购自Gibco公司）的DMEM培养基，于34℃培养4 d，培养结束后，将Vero细胞以转染细胞：Vero细胞=1：1的数量比添加至病毒拯救细胞孔中，于37℃继续培养10 d，直至细胞出现明显的融合病灶。
收集病毒拯救细胞孔中的细胞上清，并使用Western-Blot和间接免疫荧光对感染病毒的细胞进行鉴定，鉴定结果见图3~4。
由图3~4可知，RBD蛋白能够在细胞中正常表达，即表达RBD蛋白的重组病毒rMuV-CoV-RBD构建成功，将其正式命名为重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2），并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V202073。此重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）即为以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，其可作为腮腺炎病毒和新型冠状病毒的双联疫苗进行疫苗接种。
表1 扩增引物
Figure 449749DEST_PATH_IMAGE002
实验例1：重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）的性能验证
实验一：将Vero细胞（购自ATCC）以8×105个的接种量提前铺板至含有2000 μL/孔DMEM培养基（购自Gibco公司）的六孔板中，于37℃下培养至细胞长满单层；培养结束后，以亲本病毒rMuV（即腮腺炎病毒减毒株QS-F46）为对照，将实施例1制得的重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）以0.01MOI的接种量接种至长成单层的Vero细胞（六孔细胞培养板），于37℃下吸附感染1h后，用移液枪吸去DMEM培养基，并在六孔板中以2000 μL/孔的添加量加入含2%（v/v）胎牛血清的细胞维持液（所述细胞维持液为购自Gibco公司的DMEM培养基），于34℃下进行培养，分别于接种病毒1d、2d、3d、4d、5d、6d收集培养上清，进行病毒滴度测定（病毒滴度测定方法参见药典三部），并绘制多步生长曲线，分析不同病毒在生长动力学上是否存在差异，分析结果如图5所示。
实验二：将孵化9~11日龄的鸡胚（购自浙江立华公司），去头去内脏，使用剪刀剪成1.5mm3的组织块后，以5mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶（购自Gibco公司，货号：27250018），于37℃下消化20min，消化后进行吹打，制备成浓度为2.0×106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液；以腮腺炎病毒毒株QS-F和腮腺炎病毒减毒株QS-F46为对照，以未经传代的实施例1制得的重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）作为P0，将P0以0.01MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有P0的细胞悬液以2000 μL/孔的添加量添加至六孔板中，于34℃下培养24h进行第一次传代，重复此操作十次，得到传代十次的重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）；以传代十次的重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）作为P10，将P0和P10以0.01MOI的接种量分别接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有P0和P10的细胞悬液分别以2000 μL/孔的添加量添加至六孔板中，于34℃下培养24h；培养结束后，先用移液枪吸去上清，再用PBS缓冲液洗涤细胞2次，然后以2000μL/孔的添加量将含2（v/v）%胎牛血清（购自Sigma）的DMEM培养基添加至六孔板中，于34℃下继续培养，分别于接种病毒后2d、3d、4d、5d、6d和8d收集培养上清，进行病毒滴度测定（病毒滴度测定方法参见药典三部），并绘制多步生长曲线，分析重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）的体外复制特性，分析结果如图6和表2所示。
实验三：取小鼠20只（所用小鼠为购自北京维通利华实验动物技术有限公司的SPF级Balb/c雌性小鼠、鼠龄6~8周、体重16~18g）随机分成2组，每组10只，2组分别为A组和B组，按照图7所示免疫程序用实施例1制得的重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）进行接种，接种剂量为106CCID50/只，每组接种方式均为腹腔注射，每次1000 μL，免疫14 d后，以相同剂量加强免疫一次，在二免14 d后，再次进行加强免疫；在最后一次免疫14 d后采集血清，通过微量中和法测定小鼠血清中腮腺炎病毒特异性中和抗体的滴度，并且，通过ELISA法测定小鼠血清中RBD蛋白ELISA抗体的滴度，测定结果如表3~4所示。
其中，微量中和法的具体步骤如下：
将待检血清于56℃灭活30 min后，用含2%（v/v）胎牛血清的DMEM作为血清稀释液（（购自Gibco公司）进行2倍倍比稀释至1：128，得到不同稀释度的血清；取50 μL每个稀释度的血清与50 μL亲本病毒rMuV（即腮腺炎病毒毒株QS-F46，病毒含量为100 CCID50）混合后，于37℃下中和作用1 h，得到混合液；将Vero细胞以2×104个的接种量接种至混合液中后，于34℃、5%（v/v）CO2的培养箱中培养7d；培养结束后，根据病变结果按照Reed/Muench法计算血清中腮腺炎病毒特异性中和抗体的滴度；
ELISA法的具体步骤如下：
（1）包被：将商品化RBD蛋白（购自金斯瑞生物技术有限公司）用CBS缓冲液稀释4000倍后，以每孔50μL的添加量加入96孔酶标板中，4℃孵育16h；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗板5次；
（2）封闭：将含1%（v/v）BSA的PBST缓冲液以每孔200μL的添加量加入步骤（1）获得的酶标板中，于37℃封闭2h后弃去孔内液体；封闭结束后，使用PBST缓冲液洗板5次；
（3）加样：用含1%（v/v）BSA的PBST缓冲液将血清稀释至4000倍后，以每孔100μL的添加量加入步骤（2）获得的酶标板中，37℃避光孵育40min；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤5次；
（4）一抗：用含1%（v/v）BSA的PBST缓冲液将羊抗鼠IgG（购自博士德生物公司）稀释至3000倍后，以每孔100μL的添加量加入步骤（3）获得的酶标板中，37℃避光孵育30min；孵育结束后，使用PBST缓冲液洗涤5次；
（5）显色：将TMB显色液（购自碧云天生物公司）以每孔100μL的添加量加入步骤（4）获得的酶标板中，37℃避光孵育15min；
（6）终止：将浓度为2mol/L的硫酸溶液以每孔50 μL的添加量加入步骤（5）获得的酶标板中，置于酶标仪450nm读数。
由图5可知，重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）和亲本病毒rMuV在生长动力学上没有差异，表明RBD蛋白的表达不影响腮腺炎病毒的生长特性。
由图6和表2可知，对照组QS-F和QS-F46传10代后进行生长特性比较，结果表明QS-F和QS-F46亦能够在感染后5~6D病毒载量达到高峰（约7.000~7.125 lgCCID50/mL），QS-F46的生长特性略优于QS-F；重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）在鸡胚成纤维细胞适应10代后与P0代进行生长特性的比较，结果表明，随着在鸡胚上的传代适应，P10的复制特性得到明显提升，其能够在感染后5~6D病毒载量达到高峰（7.125 lgCCID50/mL），与QS-F46相当，即重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）可以进行大规模的生产，具有良好的复制特性。
由表3可知，重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）表现出与rMuV相当的腮腺炎病毒抗体效价，且由于MMR为计划免疫，当机体内存在较低水平的腮腺炎病毒时，重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）仍能够产生有效的抗腮腺炎病毒抗体，即插入RBD蛋白对腮腺炎病毒的免疫原性没有显著影响。
由表4可知，重组疫苗免疫小鼠3次以后，其对RBD蛋白的ELISA效价达到了1:10240，表明重组病毒QS-F-RBD（SARS-CoV-2）能够在小鼠体内产生针对RBD蛋白的特异性免疫反应。
表2 不同病毒的体外复制特性
Figure 898048DEST_PATH_IMAGE004
表3 重组病毒免疫后的腮腺炎病毒特异性中和抗体滴度
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表4 重组病毒免疫后的RBD蛋白ELISA抗体滴度
Figure DEST_PATH_IMAGE008
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京赛尔富森生物科技有限公司
<120> 一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
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Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
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Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 2
<211> 3822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
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cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
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<210> 3
<211> 686
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
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435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
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Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
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Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
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Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
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Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
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Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
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Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser
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<210> 4
<211> 2061
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
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cctcggcggg cacgtagtta a 2061
<210> 5
<211> 268
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Pro Asn
1 5 10 15
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
20 25 30
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
35 40 45
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
85 90 95
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
100 105 110
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
115 120 125
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
130 135 140
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
145 150 155 160
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
165 170 175
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
180 185 190
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
195 200 205
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val
210 215 220
Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser
225 230 235 240
Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp
245 250 255
Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu
260 265
<210> 6
<211> 807
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agcctaatat tacaaacttg 60
tgcccttttg gtgaagtttt taacgccacc agatttgcat ctgtttatgc ttggaacagg 120
aagagaatca gcaactgtgt tgctgattat tctgtcctat ataattccgc atcattttcc 180
acttttaagt gttatggagt gtctcctact aaattaaatg atctctgctt tactaatgtc 240
tatgcagatt catttgtaat tagaggtgat gaagtcagac aaatcgctcc agggcaaact 300
ggaaagattg ctgattataa ttataaatta ccagatgatt ttacaggctg cgttatagct 360
tggaattcta acaatcttga ttctaaggtt ggtggtaatt ataattacct gtatagattg 420
tttaggaagt ctaatctcaa accttttgag agagatattt caactgaaat ctatcaggcc 480
ggtagcacac cttgtaatgg tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat 540
ggtttccaac ccactaatgg tgttggttac caaccataca gagtagtagt actttctttt 600
gaacttctac atgcaccagc aactgtttgt ggacctaaaa agtctactaa tttggttaaa 660
aacaaatgtg tcaatttcaa cttcaatggt ttaacaggca caggtgttct tactgagtct 720
aacaaaaagt ttctgccttt ccaacaattt ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct 780
gtccgtgatc cacagacact tgagtaa 807
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ccccaaataa tggactttgc acccgggggc tacccattga ta 42
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tagagactag tggcaataaa acaagaaaaa caaacatggc ttgcccggaa agaaacacg 59
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ttttattgcc actagtctct agtcagccta atattacaaa cttgtgccct tttggtg 57
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttactcaagt gtctgtggat cacggacagc atcagtagtg 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtgatccaca gacacttgag taaattactg acatggtcag actacc 46
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<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tgctagttca tctaaataca gtgtaggctc ttcaccggag ctgaatgaca cat 53

Claims (2)

1.一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗以腮腺炎病毒减毒株为活载体表达新型冠状病毒表面糖蛋白功能亚基的RBD蛋白；编码所述RBD蛋白的基因插入在腮腺炎病毒基因组的NP片段和P/V片段之间；所述腮腺炎病毒减毒株的保藏编号为CCTCC No:V202182。
2. 如权利要求1所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
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