CN110680912A

CN110680912A - H3n2和h3n8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110680912A
Application number: CN201910916381.0A
Authority: CN
Inventors: 孙怡朋; 刘金华; 陈明月
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: CN110680912B

Abstract

本发明公开了H3N2和H3N8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用。本发明提供了一种犬流感病毒疫苗，包括疫苗抗原，所述疫苗抗原为如下1)或2)：1)由A/canine/Quanzhou/1224‑1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180和H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；2)由A/canine/Quanzhou/1224‑1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180拯救获得的重组H3N2流感病毒和由H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原。本发明H3N2和H3N8亚型犬流感全病毒二价灭活疫苗及重组病毒(H3N2/PR8+H3N8/PR8)二价灭活疫苗对于不同分支的H3N2亚型犬流感病毒和H3N8亚型犬流感病毒均具有良好的保护作用。

Description

H3N2和H3N8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于疫苗生产领域，涉及H3N2和H3N8亚型犬流感全病毒二价灭活苗及重组病毒(H3N2/PR8+H3N8/PR8)二价灭活苗的制备，尤其涉及H3N2和H3N8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用。

背景技术

目前接种疫苗是我国防控动物疫病的主要手段。其中灭活疫苗的使用可以追溯到1945年，1945年，全病毒灭活疫苗在美国开始使用并进行了临床效力观察。因其保留了流感病毒全部抗原成分，在免疫原性和安全性方面较好，不会出现变异和毒力回复现象，且制备工艺简单，成品易于储存，被广泛应用于禽类流感大流行的预防。目前应用最广的是利用鸡胚增殖病毒并通过化学处理生产灭活的流感疫苗。而重组病毒技术是利用反向遗传操作技术，将疫苗毒株的HA和NA基因与PR8病毒内部基因进行人工重组，拯救获得H3N2/PR8和H3N8/PR8，可有效突破疫苗毒株在鸡胚和MDCK上增殖能力差的限制。

自2006年首次在中国华南地区分离到4株H3N2亚型犬流感病毒感染病例以来，该病毒在我国犬群中广泛流行，2009年2-12月份，广州地区临床疑似病例中犬流感病毒病原学调查的阳性率为2.8％，血清学调查阳性率为6.9％。2009—2010年，在浙江、江苏、北京、辽宁等地也相继分离到禽源H3N2亚型犬流感病毒，该病毒与中国华南及韩国H3N2亚型犬流感病毒高度同源。2010-2018年吉林、黑龙江、河北、河南、广西、贵州等地也报道了犬群中犬流感病毒血清学阳性的结果，其中贵州地区在2018年首次报道其农村犬群和城市犬群中均检测到H3N2犬流感病毒血清学阳性结果。以上结果表明，犬流感病毒的传播范围仍在不断扩大，由沿海到内陆，目前可能已广泛存在于我国大部分地区。

犬作为人类重要的伴侣动物，犬中的流感病毒可能通过人-犬的亲密接触而增加感染人的机会；并且由于动物源流感病毒与人流感病毒的抗原性不同，一旦犬流感病毒能有效感染人，而人体又缺乏相应抗体很可能会发生病毒迅速流行。因此，犬流感病毒对公共卫生构成了潜在威胁。2017年就有报道称在采集的78份人血清(有犬流感阳性犬接触史的人)中，1份为H3N2犬流感病毒阳性，该结果充分验证了犬流感病毒对公共卫生的潜在威胁。

2016-2018年在对犬流感病毒的流行病学监测中发现2016-2018年新分离毒株8基因片段都位于与韩国、美国近期(2013年-2015年)流行毒株亲缘关系最近的新分支。该分支完全取代2015年之前流行于中国的犬流感病毒，且在抗原性方面新分支毒株与15年之前流行于我国的分离株相比有较大差异，形成新抗原群C群。提示目前流行于我国的犬流感病毒主要为新分支毒株且抗原性与我国早期毒株相比也已发生明显变化。

因此，为有效控制犬流感病毒在犬群中的传播速度，应采用接种疫苗的手段来有效防控。而中国到目前为止，仍未有相关疫苗上市。

发明内容

为了通过寻找交叉免疫反应好的新分支H3N2犬流感病毒作为疫苗候选毒株，与H3N8犬流感病毒制成全病毒二价灭活苗或重组病毒二价灭活苗，以期有效防控犬流感病毒对犬群的感染，进而消除犬流感病毒对公共卫生安全的潜在威胁。本发明提供如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种犬流感病毒疫苗。

本发明提供的犬流感病毒疫苗，包括疫苗抗原，所述疫苗抗原为如下1)或2)或3)或4)：

1)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCCNO.18180和H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；

2)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCCNO.18180拯救获得的重组H3N2流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原；

3)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCCNO.17589和所述H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；

4)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCCNO.17589拯救获得的重组H3N2流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原。

上述疫苗中，所述H3N8亚型犬流感病毒株为A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)。

上述疫苗中，所述1)所示疫苗抗原按照如下方法制备：将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180和所述H3N8亚型犬流感病毒株混合后，灭活，得到全病毒二价灭活苗；

所述3)所示疫苗抗原按照如下方法制备：将A/canine/Beijing/0528-147/2017147(H3N2)CGMCC NO.17589和所述H3N8亚型犬流感病毒株混合后，灭活，得到全病毒二价灭活苗。

上述疫苗中，

所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述H3N8亚型犬流感病毒株的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述混合的体积比均为1:1。

若病毒含量低于10⁸EID₅₀/ml时可使用超滤浓缩机进行浓缩。

在本发明的实施例中，所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCCNO.17589和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180的病毒滴度均为10^8.5EID₅₀/ml；所述H3N8亚型犬流感病毒株的病毒滴度为10⁸EID₅₀/ml；所述混合的体积比均为1:1。

上述疫苗中，所述2)按照如下方法制备：将由所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N2-2018流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N8流感病毒混合后，灭活，得到重组二价灭活苗；

所述4)按照如下方法制备：将由所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N2-2017流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N8流感病毒混合后，灭活，得到重组二价灭活苗。

上述疫苗中，所述重组H3N2-2018流感病毒为将所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)CGMCC NO.18180病毒株的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因分别替换PR8流感病毒(在本发明的实施例中，该病毒为A/Puerto Rico/8/34(H1N1)高产病毒)的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒；

所述重组H3N2-2017流感病毒为将所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589病毒株的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因分别替换所述PR8流感病毒的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒；

所述重组H3N8流感病毒为将所述H3N8亚型犬流感病毒株的HA蛋白和NA蛋白编码基因分别替换所述PR8流感病毒的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒。

上述疫苗中，

所述重组H3N2-2018流感病毒或所述重组H3N2-2017流感病毒的病毒滴度均不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述H3N8亚型犬流感病毒株的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；所述混合的体积比为1:1。

在本发明的实施例中，所述重组H3N2-2018流感病毒或所述重组H3N2-2017流感病毒的病毒滴度的病毒滴度为10^9.5EID₅₀/ml；所述重组H3N8流感病毒的病毒滴度为10⁸EID₅₀/ml；混合的体积比均为1:1。

上述疫苗中，所述疫苗还包括佐剂。

本发明另一个目的是提供一种制备犬流感病毒疫苗的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

A、按照上述的疫苗中的方法制备全病毒二价灭活苗抗原或重组病毒二价灭活苗抗原；

B、将所述全病毒二价灭活苗抗原或重组病毒二价灭活苗抗原加入佐剂，制备得到犬流感病毒疫苗。

上述疫苗在制备具有如下1)或2)功能产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)预防犬流感病毒；

2)提高犬流感病毒感染机体后机体的抗体含量。

H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147，其保藏号为CGMCC NO.17589也是本发明保护的范围；

或H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，其保藏号为CGMCC NO.18180也是本发明保护的范围；

或所H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147或所述H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147在制备权利要求1-8所述的疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

犬流感病毒为H3N2犬流感病毒或H3N8犬流感病毒，在本发明的实施例中举例为犬流感老分支毒株362(A/canine/Beijing/362/2009,H3N2)、新分支毒株159(A/canine/Xian/0601-159/2017，H3N2)、147(A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2)1109(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018,H3N2)及H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8)、(A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8)。

灭活疫苗能够应用的前提是必需保证病毒的产量及稳定性。同时灭活疫苗对不同分支犬流感病毒的有效免疫保护效力也是疫苗评价的重要组成部分。为此，通过在鸡胚中连续传代来评价病毒的稳定性，并通过免疫犬攻毒保护试验来评价其免疫效力。研究发现，病毒在鸡胚中连续传至15代时仍能保持稳定的血凝效价，表明该病毒稳定性好。疫苗对犬的免疫攻毒保护试验结果证实，疫苗免疫后能够迅速(一次免疫后2周)产生针对不同分支H3N2犬流感病毒和H3N8犬流感病毒感染的抵抗力如抑制免疫动物排毒及降低病毒在免疫动物组织中的复制能力。结果表明，所研制的犬流感病毒灭活苗具有稳定和免疫效果好的特点，为犬流感病毒的防控奠定了基础。

本发明将交叉免疫反应好的H3N2毒株和H3N8毒株通过鸡胚传代的方法将病毒在鸡胚中连续传代培养，当效价达到2⁷左右时，继续传代至15代，选择所有代次血凝效价均比较稳定的毒株作为候选毒株，再进行如下方法：方法一：是将两种病毒的全病毒进行灭活再等比例混合并辅以佐剂制成全病毒二价灭活苗；方法二：利用反向遗传技术将疫苗毒株的HA和NA基因与PR8病毒内部基因进行人工重组，拯救获得H3N2/PR8和H3N8/PR8，然后再将两种病毒在鸡胚中培养，收获病毒后将两种病毒进行灭活并等比例混合辅以佐剂制成重组病毒二价灭活苗。疫苗免疫攻毒保护试验结果证实，这两种疫苗均能够有效保护H3N2和H3N8犬流感病毒对比格犬的感染。

本发明所用的疫苗候选株可在鸡胚中稳定繁殖；H3N2和H3N8亚型犬流感全病毒二价灭活疫苗及重组病毒(H3N2/PR8+H3N8/PR8)二价灭活疫苗的保护性研究表明这两种疫苗对于不同分支的H3N2亚型犬流感病毒和H3N8亚型犬流感病毒均具有良好的保护作用，可有效抵抗新分支毒株H3N2对犬群的感染，降低犬流感病毒对公共卫生安全的威胁。

A/canine/Beijing/0528-147/2017 147病毒株于2019年4月29日，保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.17589，分类命名为H3N2亚型犬流感病毒。

A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018 1109病毒株于2019年08月07日，保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.18180，分类命名为H3N2亚型犬流感病毒。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)记载在如下文献中：Wang C,Wang Q,Hu J,etal.A Multiplex RT-PCR Assay for Detection and Differentiation of Avian-OriginCanine H3N2,Equine-Origin H3N8,Human-Origin H3N2,and H1N1/2009CanineInfluenza Viruses[J].Plos One,2017,12(1):e0170374.。

实施例1、H3N2亚型犬流感病毒候选疫苗株的发现

1、新分支H3N2亚型犬流感病毒株的发现

新分支H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147分子鉴定结果：序列已上传GenBank，序列号：PB2(MK212678，2017/05/28)、PB1(MK212679，2017/05/28)、PA(MK212680，2017/05/28)、HA(MK212685，2017/05/28)、NP(MK212682，2017/05/28)、NA(MK212683，2017/05/28)、M(MK212684，2017/05/28)、NS(MK212681，2017/05/28)。

将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147病毒株于2019年4月29日，保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.17589，分类命名为H3N2亚型犬流感病毒。

新分支H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018分子鉴定结果如下：HA基因核苷酸序列为序列13，NA基因核苷酸序列为序列14，M基因核苷酸序列为序列15，NP基因核苷酸序列为序列16，NS基因核苷酸序列为序列17，PB1基因核苷酸序列为序列18，PB2基因核苷酸序列为序列19，PA基因核苷酸序列为序列20。

2、犬流感病毒候选疫苗株的筛选

为研究新分支H3N2亚型犬流感病毒H3N2 CIV的抗原性是否发生改变，根据分离年份及在进化树上的距离，选择了4株新分支H3N2亚型CIV(A/canine/Beijing/1228-9/2016(1228-9/16)、A/canine/Beijing/0512-137/2017(0512-137/17)、A/canine/Beijing/0527-147/2017(0527-147/17)和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(1224-1109/18))，与5株2009-2015年分离的H3N2亚型CIV的代表毒株(A/canine/Beijing/814/2009(814/09)、A/canine/Beijing/362/2009(362/09)、A/canine/Beijing/0110-2/2014(0110-2/14)、A/canine/Beijing/0118-256/2015(0118-256/15)和A/canine/Beijing/0120-265/2015(0120-265/15))分别用SPF鸡制备抗血清，并将制备的血清与22株北京地区2009-2018年分离到的H3N2CIV，进行交叉血抑(HI)实验，从而研究不同年份病毒与血清的反应特性。同时，利用抗原性演化图谱、系统进化树和抗原表位氨基酸位点比对等方法对H3N2 CIV的抗原性进行分析发现新分支毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147已形成了新的抗原群C群。

此外，值得关注的是18年A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018 1109病毒株又出现了新的抗原性变化，与新抗原群C群存在显著的抗原性差异，结果如表1所示。

表1

注：上述红色带下划线数字表示毒株与自身血清反应所得血抑效价；

蓝色毒株(1224-1109/18，表中最后一行)为抗原性发生变化的毒株。

根据抗原性分析结果挑选A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒作为H3N2亚型犬流感病毒候选疫苗株，A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)作为H3N8亚型犬流感病毒候选疫苗株。

3、犬流感病毒候选疫苗株血凝(HA)效价检测

待测鸡胚尿囊液：将所需病毒的病毒液分别做10^-1～10^-3稀释，经尿囊腔接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2m L/胚，37℃孵育，无菌收集48h～96h鸡胚尿囊液备用。

红细胞凝集实验按常规微量法(OIE Standards Commission,1996)进行，具体步骤如下：用100μL量程的微量移液器向血凝板中加入生理盐水25μL/孔，于第1孔中加入25μL待测鸡胚尿囊液，吹打混匀后吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μL。第12孔作为阴性对照。再吸取25μL 1％红细胞悬液依次加入各孔。置于微量振荡器上振荡1min，室温静置20-30min后观察结果。

待测鸡胚尿囊液分别为A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)鸡胚尿囊液、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)鸡胚尿囊液和A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液。

结果判定：将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。结果以++++、+++、++、+和-表示，判定以++++为终点。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原的红细胞凝集效价(HA效价)。

结果如下：

A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的HA效价为4log2；

A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的HA效价为4log2；

A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的HA效价为5log2。

实施例2、H3N2和H3N8犬流感病毒二价灭活苗的制备

(一)H3N2和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗的制备

1、疫苗病毒株的筛选

根据上述实施例1检测的效价，用于制备全病毒疫苗的候选毒株的HA效价太低，因此进行如下传代：

分别将疫苗候选病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)鸡胚尿囊液和A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液分别做10^-1～10^-3稀释，经尿囊腔接种9日龄～11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2m L/胚，37℃孵育。无菌收集48h～96h鸡胚尿囊液，用1％鸡红细胞血凝试验(HA)分别测定其血凝效价(HA)，将各株HA效价较高的各鸡胚尿囊液收取混合后用无菌生理盐水稀释10^-1～10^-3后继续接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔。反复传代，直至收获的病毒尿囊液HA效价稳定。经SPF鸡胚扩大培养，收集72h～96h鸡胚尿囊液，混合后测定其HA效价，A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)和A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的鸡胚尿囊液的HA效价均为7log2；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液的HA效价为7log2，作为疫苗种毒。

2、病毒EID₅₀测定

1)鸡胚的准备：将9-11日龄鸡胚置于暗室，用照蛋器观察，标记出每个鸡胚的气室，避开大血管标记；

2)病毒的倍比稀释：将上述1得到作为疫苗种毒的HA效价为7log2的A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)、HA效价为7log2的A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)以及HA效价为7log2的A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)从-80℃冰箱中取出，置于冰上自然融化。准备10个1.5mL的EP管，每管中加入900μL的双抗PBS。第一管中加入100μL病毒原液，充分混匀后吸出100μL至第二管，依次稀释到第十管，做好标记。置于冰上保存。

3)接种病毒：将标记好的鸡胚用75％的酒精消毒，将打孔器消毒后在气室上方和配体处打孔。将1mL注射器沿着胚体处小孔插入0.5cm，注入0.1mL上述2)稀释后的病毒液，每个稀释度的病毒液接种三个鸡胚，做好标记。石蜡封口。置于孵化箱孵育，每日照胚。

4)收获鸡胚：接毒后48-72h，将鸡胚置于4℃冰箱1h，防止鸡胚出血。用75％酒精消毒气室后，用镊子打开，吸取25μL的尿囊液至96孔血凝板，进行血凝试验，并记录结果。

按Reed-Muench法公式，计算半数感染量，10倍系列稀释的修正系数为1。

logEID₅₀＝高于50％感染率的病毒稀释度对数+相应距离比×稀释系数的对数

A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的定量结果为10^8.5EID₅₀/ml(ml是指含有病毒的尿囊液)；

A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的定量结果为10^8.5EID₅₀/ml(ml是指含有病毒的尿囊液)；

A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的定量结果为10⁸EID₅₀/ml。

3、灭活疫苗的制备

将1得到的作为疫苗种毒的HA效价为7log2的A/canine/Beijing/0528-147/2017147(H3N2)病毒(10^8.5EID₅₀/ml)鸡胚尿囊液或HA效价为7log2的A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒(10^8.5EID₅₀/ml)鸡胚尿囊液分别和HA效价为7log2的A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)(10⁸EID₅₀/ml)鸡胚尿囊液按照体积比1:1混匀，按常规方法用10％甲醛灭活，并使甲醛溶液的最终浓度达到0.1％，37℃灭活24h后，4℃保存备用，得到H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原、H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原。

灭活液检验包括无菌检验和灭活检验：

无菌检验：按现行《中国兽药典》进行检验，观察有无细菌生长；结果无细菌生长；

灭活检验：取10日龄SPF鸡胚6枚，尿囊腔接种灭活病毒液(灭活苗抗原)，每枚0.2ml，置37℃继续孵育，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚，对所有胚液分别测定血凝效价，均不应出现血凝现象，视为灭活完全；结果所有胚液均无血凝现象。

上述H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原、H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗抗原可作为疫苗抗原。

将上述2种疫苗抗原参考“兽用生物制品规程”方法制备油乳佐剂疫苗，得到H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗、H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗。

上述油乳佐剂疫苗为将矿物油佐剂与上述疫苗抗原按3∶2(体积比)的比例混合常规方法乳化。

(二)H3N2和H3N8犬流感病毒重组病毒二价灭活苗的制备

1、病毒RNA的提取和cDNA合成

1.1使用购自Magen公司的组织细胞RNA快速提取试剂盒(RaPure Total RNA Kit)对(一)中作为疫苗种毒的A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)鸡胚尿囊液、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)鸡胚尿囊液和A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)鸡胚尿囊液进行RNA的提取，操作方法如下：

(1)在1.5ml无RNA酶EP管中加入200μl病毒液(鸡胚尿囊液)，加入350μl RTLLysis Buffer，吹打混匀，再加入等体积的RNA Binding Buffer(已加无水乙醇)，移液枪吹打混匀；

(2)把HiPure RNA Mini Column吸附柱装在2ml收集管中，将混合液体转移至HiPure RNA Mini Column吸附柱中，每次转移小于700μl，12,000×g离心30-60秒；

(3)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，把剩余混合液体转移至HiPure RNA MiniColumn吸附柱中，12,000×g离心30-60秒；

(4)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，加入500μl Buffer RW1至吸附柱中。12,000×g离心30-60秒；

(5)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，加入500μl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中，12,000×g离心30-60秒；

(6)重复步骤(5)一次；

(7)弃去滤液，把吸附柱装回收集管，12,000×g离心2分钟；

(8)将吸附柱转移至1.5ml无RNA酶离心管中，加入50μl RNase Free Water至吸附柱膜中央，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟；

(9)弃去吸附柱，离心管中液体即为流感病毒的总RNA。

得到A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)以及A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的总RNA。

1.2cDNA合成

流感病毒RNA反转录所使用的通用引物Uni12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。

流感病毒反转录(RT)反应体系：

取11ul上述提取的流感病毒RNA加入到1.5ml的无RNA酶EP管中，依次再加入表中各成分，轻柔混匀，瞬离。反应条件：37℃1h。反转录产物即为cDNA。

2、病毒HA和NA基因的扩增

以上述各个病毒株的cDNA为模板，用下述HAd BsmBI-HA-1F/HA-875R和HA-759F/BsmBI-HA-1778R进行PCR扩增，得到各个病毒株的HA-1片段和HA-2片段；

再以HA-1片段和HA-2片段为模板，用HAd BsmBI-HA-1F和BsmBI-HA-1778R进行PCR扩增，得到HA融合片段；

以上述各个病毒株的cDNA为模板，用下述BsmBI-NA-1F/BsmBI-NA-1466R进行PCR扩增，得到各个病毒株的NA片段；

具体方法如下：

2.1用于反向遗传操作质粒构建的引物

HA

NA

BsmBI-NA-1F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT

BsmBI-NA-1466R TATTCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT

2.2PCR扩增出HA和NA基因片段，反应体系如下：

将依次加入上述成分，混匀并瞬离。

PCR扩增反应程序如下：

2.3将上述PCR产物1％凝胶电泳后，使用OMEGA公司生产琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的进行切胶回收，回收产物作为融合PCR的模板。

切胶回收方法如下：

(1)将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电压180V，电流180V，时间30min；

(2)电泳完成，在紫外灯下切下目的条带放入1.5mlEP管中；

(3)按凝胶重量：Bind buffer体积＝1：1的比例加入相应体积的Bind buffer，56℃溶解；

(4)将溶解后获的凝胶混合物转移至离心柱中，12,000×g离心1分钟，离心后弃掉滤液，每次转移体积少于700μl，直至混合液全部滤过柱子；

(5)取300μl Bind buffer加入离心柱中，12,000×g离心1分钟，离心后弃掉滤液；

(6)取700μl Wash buffer加入离心柱中，12,000×g离心1分钟，离心后弃掉滤液；

(7)重复步骤(6)一次；

(8)12,000×g空离2分钟，离心后弃掉滤液；

(9)将离心柱转移至1.5ml离心管中，在离心柱的膜中央加入30μl洗脱液，室温静止1分钟，12,000×g离心2分钟；

(10)弃掉离心柱，1.5ml离心管中的液体即为胶回收DNA产物，得到HA-1片段、HA-2片段和NA基因片段。

2.4将上步回收的HA-1片段、HA-2片段两份PCR产物混合使其互为模板，用引物BsmBI-HA-1F和BsmBI-HA-1778R配对，进行融合PCR扩增。

融合PCR扩增反应体系如下：

融合PCR产物，按上述切胶回收方法进行回收，得到HA基因片段；

3、基因片段和载体的酶切

将HA基因片段、NA基因片段和PHW2000载体(普如汀生物技术(北京)有限公司)用BsmBI酶切。酶切体系如下：

BsmBI酶切时间：1h。反应条件：55℃。

酶切产物的回收纯化

酶切后取5μl进行1％凝胶电泳，以确保片段酶切完全。用全氏金公司生产的DNA产物纯化试剂盒回收纯化酶切产物，方法如下：

(1)将酶切产物加入到1.5mlEP管中，加入5倍体积的溶液BB(Binding buffer),混匀后加入离心柱中(为提高纯化产量可以选择静置1分钟)，10000×g离心1分钟，弃去流出液；

(2)加入650μl溶液WB(wash buffer),10000×g离心1分钟，弃去流出液；

(3)10000×g空离2分钟，弃去流出液；

(4)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30μl-50μlEB(Elutionbuffer)(为提高产量可选择60-70℃预热EB)，室温静置1分钟，10000×g离心1分钟。

(5)弃去离心柱，在1.5mlEP管底部的液体即为洗脱出来的DNA。

得到酶切后HA、酶切后NA和酶切后PHW2000载体。

5、重组质粒的构建

重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)为将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的HA基因(序列1，编码的蛋白为序列2所示的HA蛋白)插入PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。

重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)为将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)的NA基因(序列3，编码的蛋白为序列4所示的NA蛋白)插入PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。

重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)为将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的HA基因(序列5，编码的蛋白为序列6所示的HA蛋白)插入PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。

重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)为将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)的NA基因(序列7，编码的蛋白为序列8所示的NA蛋白)插入PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。

重组质粒PHW2000-HA(H3N8)为将A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的HA基因(序列9，编码的蛋白为序列10所示的HA蛋白)插入PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。

重组质粒PHW2000-NA(H3N8)为将A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)的NA基因(序列11，编码的蛋白为序列12所示的NA蛋白)插入PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体。

具体方法如下：

使用NEB公司生产的T4 DNA连接酶将酶切后的目的基因和载体进行连接，通常按目的基因：载体＝1：3-1：8的比例进行连接，体系如下：

6、连接产物的转化

采用热激转化法，将上述5得到的重组质粒转入感受态大肠杆菌TransT1中，方法如下：

(1)解冻：从-80℃冰箱取出感受态TransT1细胞，置冰上使其融化；

(2)冰浴：在冰浴环境中，将10μl连接产物加入50μl TransT1细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；

(3)热激：42℃热激45s，然后再冰浴2min，注意在这个过程中不要摇动离心管；

(4)扩繁：加入37℃预热的LB培养基500μL，37℃，200rpm小摇1h(通常大肠杆菌20min繁殖一代)；

(5)集菌：将扩繁1h的大肠杆菌3500×g离心4分钟，吸弃部分上清，只留80-100μl上清将沉于管底的大肠杆菌重悬；

(6)涂板：将菌液吹打混匀，涂于预热的氨苄青霉素抗性的LB营养琼脂平板(LBA)平板上，37℃倒置平板过夜培养(14～18h)。

7、阳性重组质粒的筛选鉴定

大肠杆菌本身不具有氨苄青霉素抗性，在LBA平板上不生长，pHW2000载体质粒具有氨苄抗性，大肠杆菌内转入该质粒或者转入携带目的基因的重组质粒后也具有了氨苄抗性，可以在LBA平板上生长繁殖。因此，LBA平板上生长的菌落只有三种，即转入了pHW2000质粒的菌、转入了载体自连产物的菌和转入了携带目的基因的重组质粒的菌。因此，挑取LBA平板上的单克隆菌落进行PCR鉴定，得到1778bp或1446bp的为阳性克隆。具体方法如下：

(1)在高压灭菌的洁净1.5mlEP管中，加入500-600ml的LBA液体培养基；

(2)取转化后的平板，用无菌镊夹持小白枪头挑取单个菌落，连同白枪头一同放入EP管中；

(3)将挑取的单克隆菌落在37℃，200rpm摇床培养4-6h；

(4)4-6h后进行菌液PCR扩增，1％凝胶电泳鉴定；

(5)样本阳性菌液送北京博尚生物技术有限公司测序，以确保阳性克隆序列的正确性。

用于菌液鉴定的引物

HA

BsmBI-HA-1F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG

BsmBI-HA-1778R TATTCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT

NA

BsaI-NA-1F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT

BsaI-NA-1466R TATTCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT

菌液PCR体系：

阳性克隆分别为含有重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)的重组菌、含有重组质粒PHW2000-HA(H3N8)的重组菌和含有重组质粒PHW2000-NA(H3N8)的重组菌。

8、目的质粒的提取

使用Promega公司的去内毒素质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒，步骤参照产品说明书。质粒用Nanodrop2000进行核酸浓度的定量，将质粒分装保存于-80℃，供后续实验使用。得到重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)、重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)、重组质粒PHW2000-HA(H3N8)和重组质粒PHW2000-NA(H3N8)。

9、病毒的拯救与鉴定

重组H3N2-2017亚型犬流感病毒为将A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)CGMCC NO.17589病毒株的HA蛋白编码基因(序列1)和NA蛋白编码基因(序列3)分别替换PR8流感病毒的HA蛋白编码基因(GenBank号：V01088,1934)和NA蛋白编码基因(GenBank号：J02146,1934)，包装得到的病毒；

重组H3N2-2018亚型犬流感病毒为将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)专利保藏编号待定病毒株的HA蛋白编码基因(序列5)和NA蛋白编码基因(序列7)分别替换PR8流感病毒的HA蛋白编码基因(GenBank号：V01088,1934)和NA蛋白编码基因(GenBank号：J02146,1934)，包装得到的病毒；

重组H3N8亚型犬流感病毒为将H3N8亚型犬流感病毒株的HA蛋白编码基因(序列9)和NA蛋白编码基因(序列11)分别替换PR8流感病毒的HA蛋白编码基因(GenBank号：V01088,1934)和NA蛋白编码基因(GenBank号：J02146,1934)，包装得到的病毒。

具体如下：

9.1 6孔细胞板的准备

转染用的6孔板通常用293-T细胞(普如汀生物技术(北京)有限公司)进行铺板，有些实验室也用MDCK细胞和293-T的混合细胞。

细胞传代：在已长满单层293T细胞的75ml培养瓶中加入2ml胰酶，轻轻摇晃，使胰酶充分浸润覆盖细胞，弃去胰酶，于37℃5％CO ₂培养箱中静置消化1-2分钟，待细胞呈沙粒状完全下滑时，加入60ml含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM(相当于1传3传代)，吹打混匀。

293-T细胞铺板：将吹打混匀的293-T细胞铺6孔细胞板，2ml/孔。

混合细胞铺板：MDCK细胞(普如汀生物技术(北京)有限公司)与293-T细胞混合比例为1：2(细胞培养液体积比)，具体如下：一只75ml培养瓶已长满单层293-T细胞，胰酶消化后加入15ml培养基，一只75ml培养瓶已长满单层MDCK细胞，胰酶消化后加入15ml培养基，在6孔板中每孔加1ml 293T细胞和0.5ml MDCK细胞，摇晃均匀。

9.2质粒转染

6孔板细胞密度达到80％时，使用jetPRIME转染试剂(生产商：PolyplusTransfection出售公司：上海康稳生物科技有限公司，产品目录号：14Y0307J7)进行质粒转染。具体方法如下：

(1)标记好无菌1.5mlEP管；

(2)每个EP管加入200uL jetPRIME beffer；

(3)加入待拯救流感病毒的8个pHW2000质粒：(H3+N2+PR8(H1N1)内部片段或H3+N8+PR8(H1N1)内部片段)，每个质粒加500ng，涡旋震荡10s，瞬时离心；

上述8个pHW2000质粒为：重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2017)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2017)、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。

或上述8个pHW2000质粒为：重组质粒PHW2000-HA(H3N2-2018)、重组质粒PHW2000-NA(H3N2-2018)、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。

或上述8个pHW2000质粒为：重组质粒PHW2000-HA(H3N8)和重组质粒PHW2000-NA(H3N8)、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/PuertoRico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。

上述重组质粒、PHW2000-M(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。分别为将A/PuertoRico/8/34(H1N1)高产病毒(Ping J,Lopes T J S,Neumann G,et al.Development ofhigh-yield influenza B virus vaccine viruses[J].Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2016,113(51):201616530.)PR8流感病毒的M基因(GenBank号：V01099,1934)、NS基因(GenBank号：J02150,1934)、NP基因(GenBank号：J02147,1934)、PB1基因(GenBank号：J02151,1934)、PB2基因(GenBank号：V00603,1934)和PA基因(GenBank号：V01106,1934)分别插入PHW2000载体的BsmBI酶切位点得到的载体PHW2000-M(A/PuertoRico/8/34)、PHW2000-NS(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-NP(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB1(A/Puerto Rico/8/34)、PHW2000-PB2(A/Puerto Rico/8/34)和PHW2000-PA(A/Puerto Rico/8/34)。

(4)加入8uL转染试剂JetPRIME(通常转染试剂的量须根据转染质粒的量决定，约为质粒质量的2倍)，涡旋震荡10s，瞬时离心；

(5)将无菌EP管置于室温，静置10分钟；

(6)取出前一天已经铺好的6孔细胞板，将上述混合液直接加入到6孔板中，(该转染试剂不受血清和抗生素的影响)，加完后按上下左右方向轻轻的水平摇晃6孔板，使其在培养基中均匀分布，置于37℃5％CO ₂培养箱中静置培养；

(7)培养6h后，每孔加入含有双抗和TPCK胰酶的DMEM培养基1mL，胰酶终浓度为2ug/mL,双抗的终浓度为1％；

(8)收获病毒：6孔板置于37℃5％CO ₂培养箱中静置培养24-72h后，大约50％细胞发生病变脱落时即可收获病毒，若当下无鸡胚则将6孔板置于-80℃冰箱冻存。将转染后的细胞液吹打混匀，接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔(每个孔接种1枚鸡胚)，35℃孵育72h，收获尿囊液，测定其血凝活性。若无血凝活性，则盲传一代，放弃仍无血凝性的样本。

得到重组H3N2-2017亚型犬流感病毒、重组H3N2-2018亚型犬流感病毒和重组H3N8亚型犬流感病毒。

9.3重组H3N2亚型犬流感病毒和重组H3N8亚型犬流感病毒的滴度及效价检测

病毒滴度测定方法见“实施例2、H3N2和H3N8犬流感病毒二价灭活苗的制备”的病毒EID₅₀测定方法，病毒效价检测方法：红细胞凝集实验；

结果：重组H3N2-2017亚型犬流感病毒、重组H3N2-2018亚型犬流感病毒的效价HA均为：10log2,病毒滴度均为：10^9.5EID₅₀/ml。

重组H3N8效价HA：7log2,病毒滴度：10⁸EID₅₀/ml。

10、重组病毒灭活疫苗的制备

将上述9制备的重组H3N2-2017亚型犬流感病毒(10^9.5EID₅₀/ml；HA：10log2)、重组H3N2-2018亚型犬流感病毒(10^9.5EID₅₀/ml；HA：10log2)分别和重组H3N8亚型犬流感病毒(10⁸EID₅₀/ml；HA：7log2)鸡胚尿囊液按常规方法用0.1％甲醛灭活，检测，作为疫苗抗原。

疫苗的制备参考“兽用生物制品规程”方法，油乳佐剂疫苗为将矿物油佐剂与抗原按3∶2的比例混合常规方法乳化，得到H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗、H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗。

实施例2、H3N2犬流感病毒和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活疫苗及重组病毒灭活疫苗安全性评价

将50只BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只：

第1组滴鼻方式接种实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017147(H3N2)病毒的HA效价为7log2，10^8.5EID₅₀/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)；

第2组滴鼻方式接种实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒的HA效价为7log2，10^8.5EID₅₀/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)；

第3组滴鼻方式接种实施例1(二)制备的H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，10^9.5EID₅₀/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)；

第4组滴鼻方式接种实施例1(二)制备的H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，10^9.5EID₅₀/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)；

第5组为空白对照组(接入Gbico磷酸盐缓冲液PBS销售公司：上海根生生物科技有限公司)。

观察感染后14天内所有小鼠的临床症状。

结果为临床症状：五组小鼠14天内均状态良好，未出现死亡小鼠，临床表现无明显差异，表明制备的H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗及H3N2和H3N8重组病毒二价灭活疫苗安全性好。

实施例3、H3N2犬流感病毒和H3N8犬流感病毒二价灭活疫苗免疫原性和保护性评价

1、犬疫苗效力试验

1.1动物分组

将93只8周龄比格犬随机分为31组，HI检测均为H3亚型流感病毒抗体阴性：第1-1组，1-2组，1-3组，1-4组，1-5组和1-6组为H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗组；第2-1组，2-2组，2-3组，2-4组2-5组和2-6组为H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗组；第3-1组，3-2组，3-3组，3-4组3-5组和3-6组为H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗组；第4-1组，4-2组，4-3组，4-4组4-5组和4-6组为H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗二价灭活疫苗组；第5-1组，5-2组，5-3组，5-4组5-5组和5-6组为阴性对照组；第6组为空白对照组；监测整个试验阶段是否有H3亚型流感病毒的自然感染。

1.2免疫与攻毒

第1-1组，1-2组，1-3组，1-4组，1-5组和1-6组通过皮下注射实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Beijing/0528-147/2017 147)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)病毒的HA效价为7log2，10^8.5EID₅₀/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)，免疫2次，每次间隔14d；

第2-1组，2-2组，2-3组，2-4组、2-5组和2-6组通过皮下注射实施例1(一)制备的H3N2(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018)和H3N8犬流感病毒全病毒二价灭活苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)病毒的HA效价为7log2，10^8.5EID₅₀/ml；A/canine/Iowa/13628/2005(H3N8)病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)，免疫2次，每次间隔14d；

第3-1组，3-2组，3-3组，3-4组、3-5组和3-6组通过皮下注射实施例1(二)制备的H3N2-2017和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Beijing/0528-147/2017 147(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，10^9.5EID₅₀/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)，免疫2次，每次间隔14d；

第4-1组，4-2组，4-3组，4-4组、4-5组和4-6组通过皮下注射实施例1(二)制备的H3N2-2018和H3N8犬流感病毒的二价重组病毒灭活疫苗(剂量为0.5ml，其中A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018(H3N2)重组H3N2亚型犬流感病毒的HA效价为10log2，10^9.5EID₅₀/ml；重组H3N8亚型犬流感病毒的HA效价为7log2，10⁸EID₅₀/ml)，免疫2次，每次间隔14d。

第5-1组，5-2组，5-3组，5-4组、5-5组和5-6组和第6组犬均未注射疫苗。

2免后14d，第1-1、2-1、3-1、4-1和5-1组犬通过静脉注射2m L 10⁶EID₅₀的老分支毒株362(A/canine/Beijing/362/2009，H3N2)，第1-2、2-2、3-2、4-2和5-2组犬通过静脉注射2m L 10⁶EID₅₀的新分支毒株159(A/canine/Xian/0601-159/2017；H3N2)，第1-3、2-3、3-3、4-3和5-3组犬通过静脉注射2m L 10⁶EID₅₀新分支毒株1109(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，H3N2)；第1-4、2-4、3-4、4-4和5-4组犬通过静脉注射2m L 10⁶EID₅₀新分支毒株147(A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2)；

第1-5、2-5、3-5、4-5和5-5组犬通过静脉注射2m L 10⁶EID₅₀的H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8)；第1-6、2-6、3-6、4-6和5-6组犬通过静脉注射2m L10⁶EID₅₀的H3N8毒株(A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8)，攻毒前，各组犬均通过肌肉注射5-11mg/kg舒泰50(出售公司：北京佑宠生物科技有限公司及产品编号：WK001)。

第5-1组，5-2组，5-3组，5-4组5-5组和5-6组为阴性对照组(非免疫组)；第6组为空白对照组(非免疫且非攻毒组)。

以下H3N2毒株均为本实验室保存毒株；

362毒株Genbank号：PB2：(JX101382,2009/12/17)PB1：(JX101383,2009/12/17)PA：(JX101384,2009/12/17)HA：(JX101385,2009/12/17)NP：(JX101386,2009/12/17)NA：(JX101387,2009/12/17)M：(JX101388,2009/12/17)NS：(JX101389,2009/12/17)。

159毒株Genbank号：PB2：(MK212398,2017/06/01)PB1：(MK212399,2017/06/01)PA：(MK212400,2017/06/01)HA：(MK212405,2017/06/01)NP：(MK212402,2017/06/01)NA：(MK212403,2017/06/01)M：(MK212404,2017/06/01)NS：(MK212401,2017/06/01)。

H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005)为Genbank上传毒株，Genbank号：PB2：(CY067275,2005/9/30)PB1：(CY067276,2005/9/30)PA：(CY067277,2005/9/30)HA：(CY067278,2005/9/30)NP：(CY067279,2005/9/30)NA：(CY067280,2005/9/30)MP：(CY067281,2005/9/30)NS：(CY067282,2005/9/30))

1.3临床症状和体温的监测

攻毒后1d～14d，每日观察各组犬的临床症状，早晚监测各组犬的体温变化。

结果为：第1-1、2-1、3-1、4-1组第1-2、2-2、3-2、4-2组第1-4、2-4、3-4、4-4组、第1-5、2-5、3-5、4-5组和第1-6、2-6、3-6、4-6组犬在分别感染A/canine/Beijing/362/2009,H3N2、A/canine/Xian/0601-159/2017,H3N2、A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2犬流感病毒及A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8和A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8犬流感病毒后无明显临床症状且体温正常；而第1-3、2-3、3-3、4-3组犬在感染A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018,H3N2后只有第2-3和4-3组无明显临床症状且体温正常，1-3组和3-3组出现明显的临床症状与5-3组出现的临床症状相似，另外阴性对照组第5-1组、5-2组、5-3组、5-4组、5-5组和5-6组出现明显的临床症状，犬在攻毒后第2天开始精神沉郁，喜卧，而后攻毒犬出现眼鼻分泌物增多，流鼻涕，打喷嚏等。且第5-1组(攻362毒株)在攻毒后第8天体温达到最高39.6℃，第5-2组(攻159毒株)在攻毒后第5天体温达到最高40.2℃，第5-3组、1-3组和3-3组(攻1109毒株)在攻毒后第5天体温达到最高分别为40.4℃、40℃及40.2℃，第5-4组(攻147毒株)在攻毒后第5天体温达到最高40℃；第5-5组(攻115809H3N8毒株)在攻毒后第7天体温达到最高39.8℃，第5-6组(攻13628H3N8毒株)在攻毒后第7天体温达到最高39.4℃(实验开始前比格犬正常体温38.5℃-38.7℃，以上均为各组犬平均体温。)。

1.4病毒排毒检测

攻毒后1d～14d，每天采集各组犬的鼻咽拭子，通过鸡胚定量的方法检测每只犬的排毒情况。

结果为：攻毒后第1-1、2-1、3-1、4-1组、第1-2、2-2、3-2、4-2组、第1-4、2-4、3-4、4-4组以及第2-3、4-3组犬鼻咽拭子未检测到病毒。第5-1、5-2、5-3、5-4组、5-5组、5-6组及1-3、3-3组犬鼻咽拭子检测到病毒，排毒时长均为6天，并分别对以上排毒组采集的2,4,6天的犬鼻咽拭子进行了定量，第5-1组(362)第2天鼻咽拭子定量结果4.5EID₅₀/ml,第4天2.75EID₅₀/ml，第6天2.5EID₅₀/ml；第5-2组(159)第2天鼻咽拭子定量结果2.5EID₅₀/ml，第四天2.75EID₅₀/ml，第6天2.5EID₅₀/ml；第5-3组(1109)第2天鼻咽拭子定量结果3.5EID₅₀/ml，第四天3.75EID₅₀/ml，第6天3.5EID₅₀/ml；第5-4组(147)第2天鼻咽拭子定量结果2.5EID₅₀/ml，第四天2.75EID₅₀/ml，第6天2.5EID₅₀/ml；

第5-5组(115809H3N8毒株)第2天鼻咽拭子定量结果2.75EID₅₀/ml，第四天3.5EID₅₀/ml，第6天2.5EID₅₀/ml；第5-6组(13628H3N8毒株)第2天鼻咽拭子定量结果2.75EID₅₀/ml，第四天3.25EID₅₀/ml，第6天2.5EID₅₀/ml；第1-3组(1109)第2天鼻咽拭子定量结果2.75EID₅₀/ml，第四天3.25EID₅₀/ml，第6天2.5EID₅₀/ml；第3-3组(1109)第2天鼻咽拭子定量结果2.5EID₅₀/ml，第四天3.5EID₅₀/ml，第6天2.75EID₅₀/ml。

以上定量结果为每组三只犬的平均值。

1.5抗体检测

第1-1组、1-2组、1-3组、1-4组、1-5组和1-6组，第2-1组、2-2组、2-3组、2-4组、2-5组和2-6组，第3-1组、3-2组、3-3组、3-4组、3-5组和3-6组和第4-1组、4-2组、4-3组、4-4组、4-5组和4-6组犬在免疫0、7d、14d、21d、28d攻毒，0、3d、7d、9d、13d分别采血，制备血清，经RDE处理，通过HI检测抗体水平(请提供具体处理方法和抗体水平检测方法血清处理方法：血清：RDE＝1:3(体积比)置于37℃水浴锅中处理18-20h，然后再置于56℃水浴锅中处理30分钟，将RDE灭活。

抗体水平检测方法：血凝抑制实验。

第1-1组、1-2组、1-3组、1-4组、1-5组和1-6组结果(免疫A/canine/Beijing/0528-147/2017 147，H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:2log2,7d HI:5log2,9d HI:7log2,13d HI:8log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)；

第2-1组、2-2组、2-3组、2-4组、2-5组和2-6组结果(免疫A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:3log2,7d HI:6log2,9d HI:8log2,13d HI:10log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)；

第3-1组、3-2组、3-3组、3-4组、3-5组和3-6组结果(免疫A/canine/Beijing/0528-147/2017 147，H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:2log2,7d HI:4log2,9d HI:6log2,13d HI:8log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)；

第4-1组、4-2组、4-3组、4-4组、4-5组和4-6组结果(免疫A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗)：0d HI:0log2,3d HI:3log2,7d HI:5log2,9d HI:8log2,13d HI:10log2(以上均为免疫犬血抑效价平均值)。

上述结果表明，本发明的A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗、A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗与A/canine/Beijing/0528-147/2017 147H3N2和H3N8全病毒二价灭活疫苗、A/canine/Beijing/0528-147/2017 147H3N2和H3N8重组二价灭活病毒疫苗相比，前者(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018H3N2相关疫苗)可以更好的实现对犬流感老分支毒株362(A/canine/Beijing/362/2009,H3N2)和新分支毒株159(A/canine/Xian/0601-159/2017，H3N2)、147(A/canine/Beijing/0528-147/2017，H3N2)1109(A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018,H3N2)及H3N8毒株(A/canine/NewYork/115809/2005，H3N8)、(A/canine/Iowa/13628/2005，H3N8)的攻毒免疫保护。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业大学

<120> H3N2和H3N8亚型犬流感二价灭活苗及其制备方法与应用

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1700

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgaaaactg ttattgcttt aagctatatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcta 60

ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc gaacgggaca 120

atggtaaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccactga gctagtccaa 180

aactcctcaa cagggaaaat atgcaacaat ccccacaaga ttcttgatgg gagggactgc 240

acgctaatag atgccctact aggggaccca cactgtgacg tcttccaaaa tgagacatgg 300

gacctttttg tggaacgaag caatgctttt agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360

tatgcatccc tccgatccat agttgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420

ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgtaaaag gggacctgct 480

aatagtttct tcagtagatt gaattggtta actaaatcag gaaatacata tccagtgttg 540

aatgtgacta tgccaaacaa caacaatttc gacaaattat acatctgggg agttcatcac 600

ccaagcactg atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660

tctaccagga gaagccaaca gaccataatc ccaaacattg gatctagacc cttggtaagg 720

ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga catactggta 780

ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggatact tcaaaatgca cattgggaaa 840

agctcaataa tgagatcaga tgcacctatt gacacctgca tttccgaatg tatcaccccg 900

aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtaa acaagatcac atacggagca 960

tgtcccaaat atgttaagca aaacaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020

gaaaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080

gggatggtag acggttggta tggcttcaga caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140

gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaacagagtg 1200

attgaaaaaa cgaatgaaaa gttccatcaa attgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260

aggattcaag accttgaaag atacgttgaa gacacaaaaa tagatctttg gtcttacaat 1320

gccgagcttc ttgttacctt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380

aacaaattgt ttgaaaagac taggaggcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440

ggctgcttca aaatctacca caagtgtgac aatgcttgca tagaatcgat tagaaacgga 1500

acttatgacc ataacatata tagagatgag gcagtgaaca atcggttcca gatcaaaagt 1560

gttgagctaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620

tttttgcttt gcgttgtctt gctggggttc attatgtggg cctgcgcgaa aggcaacatt 1680

aggtgcaaca tttgcatttg 1700

<210> 2

<211> 566

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Phe Gly

1 5 10 15

Gln Asn Leu Leu Gly Asn Glu Asn Asn Ala Ala Thr Leu Cys Leu Gly

20 25 30

His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Met Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp

35 40 45

Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Thr

50 55 60

Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Lys Ile Leu Asp Gly Arg Asp Cys

65 70 75 80

Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln

85 90 95

Asn Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Asn Ala Phe Ser Asn

100 105 110

Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val

115 120 125

Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Thr Glu Gly Phe Thr Trp Ala

130 135 140

Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Pro Ala

145 150 155 160

Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Asn Thr

165 170 175

Tyr Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Asn Asn Phe Asp Lys

180 185 190

Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Gln Glu Gln Thr

195 200 205

Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Arg Arg

210 215 220

Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg

225 230 235 240

Gly Gln Ser Gly Arg Ile Ser Val Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly

245 250 255

Asp Ile Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly

260 265 270

Tyr Phe Lys Met His Ile Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala

275 280 285

Pro Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile

290 295 300

Pro Asn Glu Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala

305 310 315 320

Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met

325 330 335

Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

355 360 365

Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys

370 375 380

Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val

385 390 395 400

Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser

405 410 415

Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Arg Tyr Val Glu Asp Thr

420 425 430

Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Thr Leu Glu

435 440 445

Asn Gln Asn Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe

450 455 460

Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn

465 470 475 480

Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser

485 490 495

Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Val

500 505 510

Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Ser Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys

515 520 525

Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys

530 535 540

Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Ala Lys Gly Asn Ile

545 550 555 560

Arg Cys Asn Ile Cys Ile

565

<210> 3

<211> 1403

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgaacccaa atcaaaagat aatagcaata gggtctgtct ctctagccat tgcaacagta 60

tgtttcctct tacagattgc catcctagca acaactgtga cactgtactt caagcaaaat 120

gaatgcaaca tcccctcgaa cagtcaaata gtgccatgta aaccaatcat aatagaaagg 180

aacataacag aggtagtaca tttgaataat actaccatag aaaaagaaat ttgctccgta 240

gtgctagaat acaggaactg gtcgaaaccg cagtgtcaaa ttacaggatt tgctcctttc 300

tccaaggaca actcaatccg actctccgct ggtggggaca tctgggtaac aagggaacct 360

tatgtgtcat gcgaccccag caaatgttat cagtttgcac ttgggcaggg gaccacactg 420

aacaataaac actcaaacag cacaatacat gataggacct cttatcggac tcttttaatg 480

aatgaattgg gtgttccgtt tcatttggga accaaacaag tgtgcatagc atggtccagt 540

tcaagttgtc acgatgggaa agcatggtta catgtttgtg tcactggaga tgatagaaat 600

gcgactgcta gtttcgtgta taatggaatg cttgttgaca gtattggttc atggtctcga 660

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atgactgatg gaagtgcatc aggaagggct gatactagaa tactattcat cagagagggg 780

aaaattatcc atattagccc attgtcaggg agtgctcaac acatagagga atgttcctgt 840

tatccccaat atccaaatgt tagatgtgtt tgcagagaca attggaaggg ctccaatagg 900

cccgttatag atataaatat ggcagattat aacatcaatt ccagttatgt gtgttcagga 960

cttgttggcg atacaccaag gaatgatgat agctctagca gcagtaactg caaggatcct 1020

aataatgaga gagggaatcc aggagtgaag gggtgggcct ttgataatga taatgacgtt 1080

tggatgggga ggacaatcag caaagattta cgttcaggtt atgagacttt caaggtcatt 1140

ggtggctgga ccactgctaa ttccaagtca caggtcaata gacaagtcat agttgacaat 1200

aataactggt ctggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg tgttaatagg 1260

tgtttttatg tggagttgat aagaggaggg ccacaagaga ctagagtatg gtggacttca 1320

aatagcattg tcgtattttg tggtacttct ggtacctatg gaacaggctc atggcctgat 1380

ggggcgaata ttaacttcat gcc 1403

<210> 4

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Leu Gln Ile Ala Ile Leu Ala Thr Thr

20 25 30

Val Thr Leu Tyr Phe Lys Gln Asn Glu Cys Asn Ile Pro Ser Asn Ser

35 40 45

Gln Ile Val Pro Cys Lys Pro Ile Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu

50 55 60

Val Val His Leu Asn Asn Thr Thr Glu Lys Glu Ile Cys Ser Val Val

65 70 75 80

Leu Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe

85 90 95

Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Asp

100 105 110

Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Ser Lys Cys

115 120 125

Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Lys His Ser

130 135 140

Asn Ser Thr Ile His Asp Arg Thr Ser Tyr Arg Thr Leu Leu Met Asn

145 150 155 160

Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala

165 170 175

Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val Cys

180 185 190

Val Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala Ser Phe Val Tyr Asn Gly

195 200 205

Met Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Arg Asn Ile Leu Arg Thr

210 215 220

Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met

225 230 235 240

Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe Ile

245 250 255

Arg Glu Gly Lys Ile Ile His Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala Gln

260 265 270

His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Gln Tyr Pro Asn Val Arg Cys

275 280 285

Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Asp Ile

290 295 300

Asn Met Ala Asp Tyr Asn Ile Asn Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu

305 310 315 320

Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys

325 330 335

Lys Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala

340 345 350

Phe Asp Asn Asp Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp

355 360 365

Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Gly Gly Trp Thr Thr

370 375 380

Ala Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Asn Asn

385 390 395 400

Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys

405 410 415

Val Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Gly Pro Gln Glu

420 425 430

Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr

435 440 445

Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn

450 455 460

Phe Met

465

<210> 5

<211> 1691

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgaaaactg ttattgcttt aagctatatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcta 60

ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc aaacgggaca 120

atggtaaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccactga gctagtccaa 180

aactcctcaa cagggaaaat atgtaacaat ccccacaaga ttcttgatgg gaggaactgc 240

acgctaatag atgccctact aggggaccca cactgtgacg tcttccaaaa tgagacatgg 300

gacctttttg tggaacgaag caatgctttt agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360

tatgcatccc tccgatccat aattgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420

ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgtaaaag gggacctgat 480

aatagtttct tcagtagatt gaattggtta actaaatcaa gaaatacata tccagtgttg 540

aatatgacta tgccaaacaa caacaatttc gacaaattat acatctgggg agttcatcac 600

ccaagcactg atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660

tctaccagga gaagccaaca gaccataatc ccaaacattg gatctagacc cttggtaagg 720

ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga catactggta 780

ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggatact tcaaaataca cattgggaaa 840

agctcaataa tgagatcaga tgcacctatt gacacctgca tttccgaatg tatcaccccg 900

aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtaa acaagatcac atacggagca 960

tgtcccaaat atgttaagca aagcaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020

gaaaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080

gggatggtag acggttggta tggcttcaga caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140

gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaacagagtg 1200

attgaaaaaa cgaatgaaaa gttccatcaa attgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260

aggattcaag accttgaaag atacgttgaa gacacaaaaa tagatctttg gtcttacaat 1320

gccgagcttc ttgttgcctt agaaaaccag aacacaattg atttaactga ttcagaaatg 1380

aacaaattgt ttgaaaagac taggaggcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440

ggctgcttca aaatctacca caagtgtgac aatgcttgca tagaatcgat tagaaacgga 1500

acctatgacc ataacatata tagagatgag gcagtgaaca atcggttcca gatcaaaggt 1560

gttgagttaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620

tttttgcttt gtgttgtctt gctgggtttc attatgtggg cctgccagag aggcaatatt 1680

aggtgcaaca t 1691

<210> 6

<211> 563

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Ala Phe Gly

1 5 10 15

Gln Asn Leu Leu Gly Asn Glu Asn Asn Ala Ala Thr Leu Cys Leu Gly

20 25 30

His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Met Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp

35 40 45

Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Thr

50 55 60

Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Lys Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys

65 70 75 80

Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln

85 90 95

Asn Glu Thr Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Asn Ala Phe Ser Asn

100 105 110

Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Ile

115 120 125

Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Thr Glu Gly Phe Thr Trp Ala

130 135 140

Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp

145 150 155 160

Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Arg Asn Thr

165 170 175

Tyr Pro Val Leu Asn Met Thr Met Pro Asn Asn Asn Asn Phe Asp Lys

180 185 190

Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Gln Glu Gln Thr

195 200 205

Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Arg Arg

210 215 220

Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg

225 230 235 240

Gly Gln Ser Gly Arg Ile Ser Val Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly

245 250 255

Asp Ile Leu Val Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly

260 265 270

Tyr Phe Lys Ile His Ile Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala

275 280 285

Pro Ile Asp Thr Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile

290 295 300

Pro Asn Glu Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala

305 310 315 320

Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met

325 330 335

Arg Asn Val Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

355 360 365

Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys

370 375 380

Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val

385 390 395 400

Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser

405 410 415

Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Arg Tyr Val Glu Asp Thr

420 425 430

Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu

435 440 445

Asn Gln Asn Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe

450 455 460

Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn

465 470 475 480

Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser

485 490 495

Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Val

500 505 510

Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys

515 520 525

Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys

530 535 540

Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile

545 550 555 560

Arg Cys Asn

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atgaacccaa atcaaaagat aatagcaata gggtctgtct ctctagccat tgcaacagta 60

tgtttcctat tacagattgc catcctaaca acaactgtga cactgtactt caaacaaaat 120

gaatgcaaca tcccctcgaa cagtcaaata gtgccatgta aaccaatcat aatagaaagg 180

aacataacag aggtagtaca tttgaataat actaccatag aaaaagaaat ttgctccgta 240

gtgctagaat acaggaactg gtcgaaaccg cagtgtcaaa ttacaggatt tgctcctttc 300

tccaaggaca actcaatccg actctccgct ggtggggaca tttgggtaac aagagaacct 360

tatgtgtcat gcgaccccag caaatgttat cagtttgcac ttgggcaggg gaccacactg 420

aacaataaac actcaaacag cacaatacat gataggacct cttatcggac tcttttaatg 480

aatgaattgg gtgttccgtt tcatttggga accaaacaag tgtgtatagc atggtccagt 540

tcaagttgtc acgatgggaa agcatggtta catgtttgtg tcactggaga tgatagaaat 600

gcgactgcta gtttcattta taatggaatg cttgttgaca gtattggttc atggtctcga 660

aatatcctca gaactcaaga gtcagaatgt gtttgcatca atgggacttg tacagtagta 720

atgactgatg gaagtgcatc aggaagggct gatactagaa tattattcat cagagagggg 780

aaaattatcc atattagccc attgtcaggg agtgctcaac acatagagga atgttcctgt 840

tatccccaat atccaaatgt tagatgtgtt tgcagagaca attggaaggg ctccaatagg 900

cccgttatag atataaatat ggcagattat aacatcaatt ccagttatgt gtgttcagga 960

cttgttggcg atacaccaag gaatgatgat agctctagca gcagtaactg caaggatcct 1020

aataatgaga gaggaaatcc aggagtgaag gggtgggcct ttgataatga taatgacgtt 1080

tggatgggga ggacaatcag caaagattta cgttcaggtt atgagacttt caaggtcatt 1140

ggtggctgga ccactgctaa ttccaagtca caggtcaata gacaagtcat agttgacaat 1200

aataactggt ctggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg tgttaatagg 1260

tgtttttatg tggagttgat aagaggaggg ccacaagaga ctagagtatg gtggacttca 1320

aatagcattg tcgtattttg tggtacttct ggtacctatg gaacaggctc atggcctgat 1380

ggggcgaata ttaacttcat gcctatataa gctttcgcaa ttttagaaaa aaactcctt 1439

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<211> 477

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Leu Gln Ile Ala Ile Leu Thr Thr Thr

20 25 30

Val Thr Leu Tyr Phe Lys Gln Asn Glu Cys Asn Ile Pro Ser Asn Ser

35 40 45

Gln Ile Val Pro Cys Lys Pro Ile Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu

50 55 60

Val Val His Leu Asn Asn Thr Thr Glu Lys Glu Ile Cys Ser Val Val

65 70 75 80

Leu Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe

85 90 95

Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Asp

100 105 110

Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Ser Lys Cys

115 120 125

Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Lys His Ser

130 135 140

Asn Ser Thr Ile His Asp Arg Thr Ser Tyr Arg Thr Leu Leu Met Asn

145 150 155 160

Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala

165 170 175

Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val Cys

180 185 190

Val Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn Gly

195 200 205

Met Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Arg Asn Ile Leu Arg Thr

210 215 220

Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met

225 230 235 240

Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe Ile

245 250 255

Arg Glu Gly Lys Ile Ile His Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser Ala Gln

260 265 270

His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Gln Tyr Pro Asn Val Arg Cys

275 280 285

Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Asp Ile

290 295 300

Asn Met Ala Asp Tyr Asn Ile Asn Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu

305 310 315 320

Val Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys

325 330 335

Lys Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala

340 345 350

Phe Asp Asn Asp Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp

355 360 365

Leu Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Gly Gly Trp Thr Thr

370 375 380

Ala Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Asn Asn

385 390 395 400

Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys

405 410 415

Val Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Gly Pro Gln Glu

420 425 430

Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr

435 440 445

Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn

450 455 460

Phe Met Pro Ile Ala Phe Ala Ile Leu Glu Lys Asn Ser

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

atgaagacaa ccattatttt aatactactg acccattggg cctacagtca aaacccaatc 60

agtggcaata acacagccac actgtgtctg ggacaccatg cagtagcaaa tggaacattg 120

gtaaaaacaa tgagtgatga tcaaattgag gtgacaaatg ctacagaatt agttcagagc 180

atttcaatgg ggaaaatatg caacaaatca tatagaattc tagatggaag aaattgcaca 240

ttaatagatg caatgctagg agacccccac tgtgacgccc ttcagtatga gagttgggac 300

ctctttatag aaagaagcag cgctttcagc aattgctacc catatgacat ccctgactat 360

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agtttcttta gccgactgaa ttggctaaca aaatctggaa gctcttaccc cacattgaat 540

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caatcaggca ggataagcat atactggacc attgtaaaac ctggagatat cctaatgata 780

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tctgtaatga gatccgatgt acccatagac atttgtgtgt ctgaatgtat tacaccaaat 900

ggaagcatct ccaacgacaa gccattccaa aatgtgaaca aagttacata tggaaaatgc 960

cccaagtata tcaggcaaaa cactttaaag ctggccactg ggatgaggaa tgtaccagaa 1020

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atggttgatg ggtggtatgg gttccgatat caaaactctg aaggaacagg gcaagctgca 1140

gatctaaaga gcactcaagc agccattgac cagattaatg gaaagttaaa cagagtgatt 1200

gaaagaacca atgagaaatt ccatcaaata gagaaggaat tctcagaagt agaaggaaga 1260

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aaattatttg agaagactag acgccagtta agagaaaacg cagaagacat gggaggtgga 1440

tgtttcaaga tttaccacaa atgtgataat gcatgcattg aatcaataag aactgggaca 1500

tatgaccatt acatatacag agatgaagca ttaaacaacc gatttcagat caaaggtgta 1560

gagttgaaat caggctacaa agattggata ctgtggattt cattcgccat atcatgcttc 1620

ttaatttgcg ttgttctatt gggtttcatt atgtgggctt gccaaaaagg caacatcaga 1680

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 10

Met Lys Thr Thr Ile Ile Leu Ile Leu Leu Thr His Trp Ala Tyr Ser

1 5 10 15

Gln Asn Pro Ile Ser Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His

20 25 30

His Ala Val Ala Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Met Ser Asp Asp Gln

35 40 45

Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ile Ser Met Gly

50 55 60

Lys Ile Cys Asn Lys Ser Tyr Arg Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys Thr

65 70 75 80

Leu Ile Asp Ala Met Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Ala Leu Gln Tyr

85 90 95

Glu Ser Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Ser Ala Phe Ser Asn Cys

100 105 110

Tyr Pro Tyr Asp Ile Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val Ala

115 120 125

Ser Ser Gly Thr Val Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly

130 135 140

Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp

145 150 155 160

Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr

165 170 175

Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu

180 185 190

Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys

195 200 205

Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser

210 215 220

Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Glu Ser Arg Pro Leu Val Arg Gly

225 230 235 240

Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp

245 250 255

Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr

260 265 270

Phe Lys Leu Asn Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Val Pro

275 280 285

Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser

290 295 300

Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys

305 310 315 320

Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg

325 330 335

Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly

340 345 350

Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe

355 360 365

Arg Tyr Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser

370 375 380

Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile

385 390 395 400

Glu Arg Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu

405 410 415

Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys

420 425 430

Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn

435 440 445

Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ala Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu

450 455 460

Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Gly Gly

465 470 475 480

Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser Ile

485 490 495

Arg Thr Gly Thr Tyr Asp His Tyr Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn

500 505 510

Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp

515 520 525

Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val

530 535 540

Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg

545 550 555 560

Cys Asn Ile Cys Ile

565

<210> 11

<211> 1158

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

atgaatacta catgaataac actgaaccac tttgtgaggc ccaaggcttt gcaccatttt 60

ccaaagataa tggaatacga attgggtcga gaggccatgt ttttgtgata agagaacctt 120

ttgtatcatg ttcgccctca gaatgtagaa cctttttcct cacacagggt tcattactca 180

atgacaaaca ttctaacggc acaataaagg atcgaagccc gtataggact ttgatgagtg 240

tcaaaatagg gcaatcaccc aatgtatatc aagctaggtt tgaatcggtg gcatggtcag 300

caacagcatg ccatgatgga aaaaaatgga tgacagttgg agtcacaggg cccgacaatc 360

aagcaattgc agtagtgaac tatggaggtg ttccggttga tactattaat tcatgggcag 420

gggatatttt aagaacccaa gaatcatcat gcacctgcat taaaggagac tgttattggg 480

taatgactga tggaccggca aataggcaag ctaaatatag gatattcaaa gcaaaagatg 540

gaagagtaat tggacaaact gatataagtt tcaatggggg acacatagag gagtgttctt 600

gttaccccaa tgaagggaag gtggaatgca tatgcaggga caattggact ggaacaaata 660

gaccaattct ggtaatatct tctgatctat cgtacacagt tggatatttg tgtgctggca 720

ttcccactga cactcctagg ggagaggata gtcaattcac aggctcatgt acaagtcctt 780

tgggaaataa aggatacggt gtaaaaggct tcgggtttcg acaaggaact gacgtatggg 840

ccggaaggac aattagtagg acttcaagat caggattcga aataataaaa atcaggaatg 900

gttggacaca gaacagtaag gaccaaatca ggaggcaagt gattatcgat gacccaaatt 960

ggtcaggata tagcggttct ttcacattgc cggttgaact gacaaaaaag ggatgtttgg 1020

tcccctgttt ctgggttgaa atgattagag gtaaacctga agaaacaaca atatggacct 1080

ctagcagctc cattgtgatg tgtggagtag atcataaaat tgccagttgg tcatggcacg 1140

atggagctat tcttcccc 1158

<210> 12

<211> 385

<212> PRT

<213>Artificial sequence

<400> 12

Glu Tyr Tyr Met Asn Asn Thr Glu Pro Leu Cys Glu Ala Gln Gly Phe

1 5 10 15

Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Ile Gly Ser Arg Gly His

20 25 30

Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Ser Glu Cys

35 40 45

Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Asn Asp Lys His Ser

50 55 60

Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Val

65 70 75 80

Lys Ile Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ser Val

85 90 95

Ala Trp Ser Ala Thr Ala Cys His Asp Gly Lys Lys Trp Met Thr Val

100 105 110

Gly Val Thr Gly Pro Asp Asn Gln Ala Ile Ala Val Val Asn Tyr Gly

115 120 125

Gly Val Pro Val Asp Thr Ile Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg

130 135 140

Thr Gln Glu Ser Ser Cys Thr Cys Ile Lys Gly Asp Cys Tyr Trp Val

145 150 155 160

Met Thr Asp Gly Pro Ala Asn Arg Gln Ala Lys Tyr Arg Ile Phe Lys

165 170 175

Ala Lys Asp Gly Arg Val Ile Gly Gln Thr Asp Ile Ser Phe Asn Gly

180 185 190

Gly His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asn Glu Gly Lys Val Glu

195 200 205

Cys Ile Cys Arg Asp Asn Trp Thr Gly Thr Asn Arg Pro Ile Leu Val

210 215 220

Ile Ser Ser Asp Leu Ser Tyr Thr Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Ile

225 230 235 240

Pro Thr Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Ser Gln Phe Thr Gly Ser Cys

245 250 255

Thr Ser Pro Leu Gly Asn Lys Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe

260 265 270

Arg Gln Gly Thr Asp Val Trp Ala Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser

275 280 285

Arg Ser Gly Phe Glu Ile Ile Lys Ile Arg Asn Gly Trp Thr Gln Asn

290 295 300

Ser Lys Asp Gln Ile Arg Arg Gln Val Ile Ile Asp Asp Pro Asn Trp

305 310 315 320

Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Val Glu Leu Thr Lys Lys

325 330 335

Gly Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Lys Pro

340 345 350

Glu Glu Thr Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly

355 360 365

Val Asp His Lys Ile Ala Ser Trp Ser Trp His Asp Gly Ala Ile Leu

370 375 380

Pro

385

<210> 13

<211> 1691

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

atgaaaactg ttattgcttt aagctatatt ttctgcctgg cttttggtca gaatcttcta 60

ggaaatgaaa ataatgctgc aacactatgc ctgggacatc atgcagtgcc aaacgggaca 120

atggtaaaaa ctatcacaga cgatcaaatt gaggtgacca acgccactga gctagtccaa 180

aactcctcaa cagggaaaat atgtaacaat ccccacaaga ttcttgatgg gaggaactgc 240

acgctaatag atgccctact aggggaccca cactgtgacg tcttccaaaa tgagacatgg 300

gacctttttg tggaacgaag caatgctttt agcaattgtt acccttatga tgtaccagac 360

tatgcatccc tccgatccat aattgcatca tcaggcacat tggagttcat cactgaaggt 420

ttcacttggg caggagtaac tcaaaatgga ggaagcggtg cttgtaaaag gggacctgat 480

aatagtttct tcagtagatt gaattggtta actaaatcaa gaaatacata tccagtgttg 540

aatatgacta tgccaaacaa caacaatttc gacaaattat acatctgggg agttcatcac 600

ccaagcactg atcaagaaca aaccagcctg tatattcagg cctcaggaag agtcacagtc 660

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ggccaatctg gcagaataag cgtatattgg acaatagtca aacctggaga catactggta 780

ataaacagta atggaaacct aatcgctcct cgaggatact tcaaaataca cattgggaaa 840

agctcaataa tgagatcaga tgcacctatt gacacctgca tttccgaatg tatcaccccg 900

aacgggagca tccccaatga aaagcccttc caaaatgtaa acaagatcac atacggagca 960

tgtcccaaat atgttaagca aagcaccttg aaactggcaa caggaatgcg gaatgtccct 1020

gaaaggcaaa ccagaggcct gttcggcgca atagcaggct tcatagaaaa tggatgggaa 1080

gggatggtag acggttggta tggcttcaga caccaaaatt ccgaaggtac aggacaagca 1140

gcagacctta aaagcactca ggcagccatt gaccagatta atgggaaatt gaacagagtg 1200

attgaaaaaa cgaatgaaaa gttccatcaa attgaaaagg agttttccga agtagaaggg 1260

aggattcaag accttgaaag atacgttgaa gacacaaaaa tagatctttg gtcttacaat 1320

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aacaaattgt ttgaaaagac taggaggcaa ttgagggaaa atgctgaaga catgggcaat 1440

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acctatgacc ataacatata tagagatgag gcagtgaaca atcggttcca gatcaaaggt 1560

gttgagttaa agtctggata caaagactgg atcttgtgga tttcctttgc catatcatgc 1620

tttttgcttt gtgttgtctt gctgggtttc attatgtggg cctgccagag aggcaatatt 1680

aggtgcaaca t 1691

<210> 14

<211> 1439

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

atgaacccaa atcaaaagat aatagcaata gggtctgtct ctctagccat tgcaacagta 60

tgtttcctat tacagattgc catcctaaca acaactgtga cactgtactt caaacaaaat 120

gaatgcaaca tcccctcgaa cagtcaaata gtgccatgta aaccaatcat aatagaaagg 180

aacataacag aggtagtaca tttgaataat actaccatag aaaaagaaat ttgctccgta 240

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tccaaggaca actcaatccg actctccgct ggtggggaca tttgggtaac aagagaacct 360

tatgtgtcat gcgaccccag caaatgttat cagtttgcac ttgggcaggg gaccacactg 420

aacaataaac actcaaacag cacaatacat gataggacct cttatcggac tcttttaatg 480

aatgaattgg gtgttccgtt tcatttggga accaaacaag tgtgtatagc atggtccagt 540

tcaagttgtc acgatgggaa agcatggtta catgtttgtg tcactggaga tgatagaaat 600

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aatatcctca gaactcaaga gtcagaatgt gtttgcatca atgggacttg tacagtagta 720

atgactgatg gaagtgcatc aggaagggct gatactagaa tattattcat cagagagggg 780

aaaattatcc atattagccc attgtcaggg agtgctcaac acatagagga atgttcctgt 840

tatccccaat atccaaatgt tagatgtgtt tgcagagaca attggaaggg ctccaatagg 900

cccgttatag atataaatat ggcagattat aacatcaatt ccagttatgt gtgttcagga 960

cttgttggcg atacaccaag gaatgatgat agctctagca gcagtaactg caaggatcct 1020

aataatgaga gaggaaatcc aggagtgaag gggtgggcct ttgataatga taatgacgtt 1080

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aataactggt ctggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg tgttaatagg 1260

tgtttttatg tggagttgat aagaggaggg ccacaagaga ctagagtatg gtggacttca 1320

aatagcattg tcgtattttg tggtacttct ggtacctatg gaacaggctc atggcctgat 1380

ggggcgaata ttaacttcat gcctatataa gctttcgcaa ttttagaaaa aaactcctt 1439

<210> 15

<211> 952

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccatc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag ggaaaaacac cgatctcgag 120

gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctttaaccaa ggggatttta 180

ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

caaaatgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acaaggcagt caaactgtac 300

aggaagttga aaagagagat aacattccac ggggctaaag aagttgcact cagctattca 360

accggtgcac ttgccagttg tatgggtctc atatacaaca ggatgggaac agtgaccaca 420

gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccacc tgtgaacaga ttgctgattc acagcatcgg 480

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ttatcgtcgc cttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggag tgcctgagtc 900

tatgagggaa gagtatcggc aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg at 952

<210> 16

<211> 1487

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

atggcgtctc agggcaccaa acgatcgtat gaacagatgg aaactggtgg agaacgccag 60

aatgctaccg agataagagc atctgttggg cgaatggttg gtggcattgg gagattttac 120

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ataacaatag agagaatggt tctctctgca tttgatgaaa ggagaaacaa atacctggag 240

gaacatccca gtgcagggaa agacccgaag aaaactggag gtccaattta ccgaagaaga 300

gacgggaaat gggtgagaga gctggttctg tatgacaaag aagagatcag aagaatttgg 360

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gcagcagtaa aaggagtcgg gacaatggtg atggaactaa ttcggatgat aaagcgaggg 600

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cggtctgcac tcatcttgag aggatcagtg gcccataagt cctgcttgcc tgcttgtgtg 840

tacggacttg ccgtggccag tggatatgat tttgagaaag aagggtactc tctagttgga 900

atagatcctt tccgtctgct tcaaaacagc caggtcttca gtctcattag accaaatgag 960

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ctaagagtct caagtttcat cagaggaaca agggtaattc caagaggaca actatccacc 1080

agaggagttc aaattgcttc aaatgagaac atggaaaaaa tagactccag tactcttgaa 1140

ctgagaagca gatattgggc tataaggacc aggagtggag gaaacaccaa ccaacagaga 1200

gcatctgcag gacaaatcag tgtacagcca actttctcgg tacagagaaa tattcccttc 1260

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<210> 17

<211> 815

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

atggactcca atactgtgtc aagctttcag gtagactgct ttctttggca tgtccccaaa 60

cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120

aagtccctaa gaggaagagg cagcaccctt ggtctggaca ttgaaacagc tactcgtata 180

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ctggaaactc taatactact tagagctttc acaaacgaag gagcaattgt tggagaaatt 480

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ctcatcggag ggcttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaat tctacagaga 600

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acggcataga ttaaagatta cggaaaacag ctttgaacaa ataacattta tgcaagcctt 780

acgaactatt gcttgaggta gagcaagaga taaga 815

<210> 18

<211> 2271

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

atggatgtca atccgacttt acttttcttg aaagtggcag cacaaaatgc tataagtact 60

acattccctt atactggaga ccctccatac agccatggaa cagggacagg atacaccatg 120

gacacagtca atagaacaca tcaatactca gagaaaggaa aatggacaac aaacacagaa 180

actggagcac cccaactcaa tccaattgat ggaccactac ccgaggataa tgagccaagc 240

ggatatgcac aaacagattg tgtattggaa gcaatggctt tccttgaaaa gtcccaccca 300

gggatctttg aaaactcatg tattgaaacg atggaagttg ttcagcaaac aagagtggac 360

aaattgaccc aaggtcgcca gacctatgac tggacattga atagaaacca gccggctgca 420

actgctttgg ccaatactat agaggtcttc agatcgaacg gtctaacagc taatgaatcg 480

ggaagactaa tagatttcct taaggatgta atggaatcaa tggacaaaga agagatggag 540

ataacaacac atttccagaa aaaaagaaga gtaagagaca acatgaccaa gaaaatgata 600

acacagagga caatagggaa gaaaaagcag agactgaaca agaggaacta cataataaga 660

gcactgacat tgaacacaat gaccaaggat gcagaaagag gcaaattgaa gagacgggca 720

attgcaacac ccggaatgca gatcagagga ttcgtgtatt ttgttgaaac attagcgaga 780

agcatctgtg agaaacttga gcagtctgga ctccctgttg gagggaatga aaaaaaggct 840

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acaattactg gagacaatac caaatggaat gagaatcaaa atcctcggat gtttctagca 960

atgataacat acatcacaag aaaccaacct gaatggttta gaaatgtctt gagcattgcc 1020

cctataatgt tctcgaacaa aatggcaagg ttgggaaaag gatacatgtt cgagagtaag 1080

aacatgaaac tacgaacaca aataccagca gaaatgcttg caaacattaa cctgaaatac 1140

ttcaatgaat caacaagaaa gaaaatcgag aaaataagac ctctcttaat agatggcaca 1200

gcctcactga gccctggaat gatgatgggc atgttcaaca tgctgagtac agtcttagga 1260

gtctcaatct taaatcttgg acaaaaaagg tataccaaaa gcacatactg gtgggatgga 1320

ctccaatcct ccgatgattt cgccctcata gtgaatgcac caaatcatga ggggatacaa 1380

gcaggagtgg atagattcta taggatctgc aaactggttg ggatcaatat gagcaaaaag 1440

aaatcttaca taaatcggac aggaacattt gagttcacaa gctttttcta tcgctatgga 1500

tttgtagcca acttcagtat ggaactaccc agctttggag tatccggggt taacgagtca 1560

gctgacatga gcattggagt tacggtaata aagaacaata tgataaacaa tgatctagga 1620

ccagcaacag ctcagatggc ccttcagcta ttcatcaaag actacagata cacatatcgg 1680

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acgactacac actcatggat ccctaaaagg aaccgttcca ttctcaatac cagccaaagg 2040

ggaattcttg aagacgaaca gatgtaccag aagtgttgca atctatttga gaaatttttc 2100

cctagtagtt catacaggag gccggttgga atttccagta tggtggaagc catggtgtct 2160

agggcccaaa ttgatgcgcg aattgacttc gagtctggaa ggattaagaa agaagagttt 2220

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<211> 2271

<212> DNA

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<400> 19

atggaaagaa taaaagaatt aagagatcta atgtcgcagt cccgcactcg cgagatacta 60

acaaaaacca ctgtggacca catggccata atcaagaaat atacatcagg gagacaagag 120

aagaaccctg ctctcagaat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat cacagcagac 180

aagagaataa tggaaatgat tcctgaaagg aatgaacaag ggcagatact ttggagtaag 240

acaagtgacg ctggatcgga cagggtgatg gtgtctccct tagctgtaac ctggtggaac 300

aggaatgggc cgacgacaag tacagtccac tatccaaagg tttacaaaac atactttgag 360

aaggttgaaa ggttaaaaca tggaaccttc ggtcccgttc atttccgaaa ccaagttaaa 420

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gatgtcatca tggaggtcgt ttttccaaat gaagtgggag ctagaatatt gacatcagag 540

tcgcaattaa caataacaaa agagaagaaa gaagaactcc aaaattgtaa gattgctcct 600

ttaatggtgg catacatgtt ggaaagagaa ctggtccgca aaaccaggtt cctaccggta 660

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atcgccgcca gaaacattgt taggagagca acggtatcag cggatccact ggcatcactg 840

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aatccaactg aggaacaagc tgtggatata tgcaaggcag caatgggctt gaggatcagt 960

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acacaaggaa ccgagaaatt gacaataaca tactcatcat caatgatgtg ggagatcaac 1620

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aagattcagt ggtctcaaga ccccacggta ctgtacaata agatggagtt tgaaccgttc 1740

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aaagctaatg tactgatagg acaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg gaaacgggac 2220

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<210> 20

<211> 2167

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

atggaagact ttgtgagaca atgcttcaat ccaatgattg tcgagcttgc ggaaaaggca 60

atgaaagagt atggggaaga tccaaaaatc gaaaccaaca aattcgctgc aatatgcaca 120

catttggaag tctgtttcat gtattcggat ttccacttca ttgatgaacg aggcgaatca 180

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gagaagccta aatttctccc tgatttgtat gattacaagg agaaccgatt cattgaaatt 360

ggagtaacac ggagggaggt ccacatatac tacctagaaa aagccaacaa gataaaatct 420

gagaagacac acatccatat tttttcattc actggagaag agatggccac caaagcagac 480

tatactcttg atgaagagag ccgagcaaga ataaaaacca gactgttcac gataaggcaa 540

gaaatggcca gcagggggct atgggattcc tttcgtcagt ccgaaagagg cgaagagaca 600

attgaagaaa ggtttgaaat cgcaggaacc atgcgcaggc ttgccgacca aagtctccca 660

ccgaacttct ccagccttga aaattttaga gcctatgtaa atggatttga accgaacgga 720

tacattgatg gcaagctttc tcaaatgtct aaagaagtga acgccagaat tgaaccattt 780

ttgaaaacaa caccacgccc tcttaaatta cctgatgggc ctccctgcac ccaacggtca 840

aaattcttgc tgatggatgc tctgaaacta agcattgaag acccgagtca tgagggggag 900

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ttgcttaatg catcttggtt caactccttc ctcacacatg cactgaaata gttgtggcaa 2160

tgctact 2167

Claims

1.一种犬流感病毒疫苗，包括疫苗抗原，所述疫苗抗原为如下1)或2)或3)或4)：

1)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018CGMCC NO.18180和H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；

2)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018CGMCC NO.18180拯救获得的重组H3N2流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原；

3)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147CGMCC NO.17589和所述H3N8亚型犬流感病毒株组成的全病毒二价灭活苗抗原；

4)由H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147CGMCC NO.17589拯救获得的重组H3N2流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株拯救获得的重组H3N8亚型犬流感病毒株组成的重组病毒二价灭活苗抗原。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述H3N8亚型犬流感病毒株为A/canine/Iowa/13628/2005。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：

所述1)所示疫苗抗原按照如下方法制备：将A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018CGMCC NO.18180和所述H3N8亚型犬流感病毒株混合后，灭活，得到全病毒二价灭活苗；

所述3)所示疫苗抗原按照如下方法制备：将A/canine/Beijing/0528-147/2017147CGMCC NO.17589和所述H3N8亚型犬流感病毒株混合后，灭活，得到全病毒二价灭活苗。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：

所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018CGMCC NO.18180的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147CGMCC NO.17589的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述H3N8亚型犬流感病毒株的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述混合的体积比均为1:1。

5.根据权利要求1-4中任一所述的疫苗，其特征在于：

所述2)按照如下方法制备：将由所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018CGMCCNO.18180利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N2-2018流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N8流感病毒混合后，灭活，得到重组二价灭活苗；

所述4)按照如下方法制备：将由所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147CGMCCNO.17589利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N2-2017流感病毒和由所述H3N8亚型犬流感病毒株利用反向遗传操作技术拯救的重组H3N8流感病毒混合后，灭活，得到重组二价灭活苗。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于：

所述重组H3N2-2018流感病毒为将所述A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018CGMCCNO.18180病毒株的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因分别替换PR8流感病毒的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒；

所述重组H3N2-2017流感病毒为将所述A/canine/Beijing/0528-147/2017 147CGMCCNO.17589病毒株的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因分别替换所述PR8流感病毒的HA蛋白编码基因和NA蛋白编码基因，包装得到的病毒；

7.根据权利要求5或6所述的疫苗，其特征在于：

所述重组H3N8流感病毒的病毒滴度不低于10⁸EID₅₀/ml；

所述混合的体积比均为1:1。

8.根据权利要求1-7中任一所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括佐剂。

9.一种制备犬流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：

A、按照权利要求1-8所述的疫苗中的方法制备全病毒二价灭活苗抗原或重组病毒二价灭活苗抗原；

10.权利要求1-8所述的疫苗在制备具有如下1)或2)功能产品中的应用：

1)预防犬流感病毒；

2)提高犬流感病毒感染机体后机体的抗体含量；

H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147，其保藏号为CGMCCNO.17589；

或H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Quanzhou/1224-1109/2018，其保藏号为CGMCCNO.18180；

或所述H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147或所述H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Beijing/0528-147/2017 147在制备权利要求1-8所述的疫苗中的应用。