CN105263516A - 流感病毒疫苗及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了嵌合流感血凝素(HA)多肽，包含其的组合物，包含其的疫苗，以及其应用方法。

Description

流感病毒疫苗及其用途
本发明是在由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的第AI070469、AI086061和HHSN266200700010C号政府资助下进行的。政府在本发明中享有一定权益。
1.介绍
本文提供了嵌合流感病毒血凝素(hemagglutinin)多肽和包含其的组合物、包含其的疫苗、以及其应用方法。
2.背景
流感病毒是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的被膜RNA病毒(Palese和Shaw(2007)Orthomyxoviridae：TheVirusesandTheirReplication，第5版，Fields'Virology，B.N.Fields、D.M.Knipe和P.M.Howley编，WoltersKluwerHealth/LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，USA，p1647-1689)。甲型流感病毒的天然宿主主要为禽类，但是甲型流感病毒(包括那些禽类来源的)也能够感染并导致人类和其它动物宿主(蝙蝠、犬类、猪、马、海洋哺乳动物和鼬科动物)的疾病。例如，在亚洲流行的H5N1甲型禽流感病毒已在中国和印度尼西亚的猪群中被发现，并已经将其宿主范围扩展至包括了通常认为不易受甲型流感影响的猫、豹和虎(CIDRAP-AvianInfluenza:AgriculturalandWildlifeConsiderations)。动物中流感病毒感染的发生可能潜在地引发人类大流行性流感毒株。
甲型和乙型流感病毒是主要的人类病原体，其导致呼吸疾病，严重程度的范围从亚临床感染至可能导致死亡的原发性病毒性肺炎不等。感染的临床效果随着流感毒株的毒力和宿主的接触(exposure)、病史、年龄和免疫状态而变化。季节性流感导致的累积发病率和死亡率本质上是由于相对高的罹患率所致。在正常季节，流感可能导致全球3百万-5百万的危重病例和高达500,000例的死亡(WorldHealthOrganization(2003)Influenza:Overview；2003年3月)。在美国，流感病毒每年感染约10-15％的人口(Glezen和CouchRB(1978)InterpandemicinfluenzaintheHoustonarea,1974-76.NEnglJMed298:587-592；Fox等人(1982)InfluenzavirusinfectioninSeattlefamilies,1975-1979.II.Patternofinfectionininvadedhouseholdsandrelationofageandpriorantibodytooccurrenceofinfectionandrelatedillness.AmJEpidemiol116:228-242)，并与约30,000例死亡有关(ThompsonWW等人(2003)MortalityAssociatedwithInfluenzaandRespiratorySyncytialVirusintheUnitedStates.JAMA289:179-186；Belshe(2007)Translationalresearchonvaccines:influenzaasanexample.ClinPharmacolTher82:745-749)。
除了每年的流行外，流感病毒还是罕见大流行病的诱因。例如，甲型流感病毒能导致如1918、1957、1968和2009年发生的那些大流行病。由于缺少针对主要病毒抗原血凝素(HA)的预形成免疫，大流行性流感可能在一年中影响超过50％的人口并经常导致比流行性感冒更为严重的疾病。一个显著的例子是1918年的流行病，其中估计有5千万-1亿人口死亡(Johnson和Mueller(2002)UpdatingtheAccounts:GlobalMortalityofthe1918-1920“Spanish”InfluenzaPandemicBulletinoftheHistoryofMedicine76:105-115)。自从20世纪90年代后期高致病性H5N1禽流感病毒的出现以来(Claas等人(1998)HumaninfluenzaAH5N1virusrelatedtoahighlypathogenicavianinfluenzavirus.Lancet351:472-7)，有担心认为其可能是下一代大流行性病毒。此外，H7和H9毒株是新流行病的候选者，因为这些毒株有时候会感染人类。
防范流感病毒感染的一个有效方式是通过接种疫苗；然而，目前的免疫接种手片段依赖于获得流行毒株和疫苗中所包括的分离物之间的良好匹配。由于多个因素的组合，这一匹配通常难以达到。首先，流感病毒经常发生变化：每3-5年甲型流感病毒的优势株就会被一个变体所替代，所述变体经过了充分抗原飘移以躲避现存的抗体应答。从而疫苗制剂中所包括的分离物必须根据每年世界卫生组织(WHO)协作中心的集中监测努力来进行选择。其次，为了允许疫苗生产和分配的时间充足，必须在流感季节起始前约6个月选择毒株。常常，疫苗株选择委员会的预测是不准确的，这导致疫苗效力的大幅下降。
甲型流感病毒新亚型进入人群的可能性也对目前的疫苗接种策略提出了一个重大挑战。由于不可能预测何种流感病毒亚型和毒株会导致下一次流行病，目前，毒株特异性片段无法被用于制备大流行性流感疫苗。
3.发明概述
在一个方面，本文提供了能诱导针对流感病毒保守HA干域的交叉保护性免疫应答的嵌合流感血凝素(HA)多肽。本文提供的嵌合流感HA多肽包含一个稳定的(例如，正确形成的)HA干域和一个与该干域异源的球状HA头域(即该头域和干域源自流感病毒的不同毒株和/或亚型)。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H1亚型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H5亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH5/1嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海(Quinghai)/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在具体的实施方式中，本文提供的cH5/1嵌合流感血凝素多肽的来自H1亚型流感病毒的血凝素干域是来自于群体的大部分对其未感染(naive)的H1亚型。在某些实施方式中，本文提供的cH5/1嵌合流感血凝素多肽的来自H1亚型流感病毒的血凝素干域来自即将到来的H1N1疫苗株，例如，在2013、2014、2015、2016、2017、2018、2019、2020、2021、2022、2023、2024、2025、2026、2027、2028、2029、2030、2031、2032、2032、2033、2034或2035年使用的H1N1疫苗株。
在一个具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽不包含A/波多黎各/8/34(“PR8”)HA的干域且不包含A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H3亚型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H5亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH5/3嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯(Perth)/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在具体的实施方式中，本文提供的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的来自H3亚型流感病毒的血凝素干域是来自于群体的大部分对其未感染(naive)的H3亚型。在某些实施方式中，本文提供的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的来自H3亚型流感病毒的血凝素干域来自即将到来的H3N2疫苗株，例如，在2013、2014、2015、2016、2017、2018、2019、2020、2021、2022、2023、2024、2025、2026、2027、2028、2029、2030、2031、2032、2032、2033、2034或2035年使用的H3N2疫苗株。
在一个具体实施方式中，本文提供的cH5/3嵌合流感血凝素多肽不包含A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域且不包含A/佩斯/16/2009(H3)HA的干域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H3亚型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H7亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH7/3嵌合流感血凝素多肽”)。
在一个具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科(Jalisco)/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达(Alberta)/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域(或A/维多利亚/361/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域(或A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域(或A/印第安纳/10/2011(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域(或A/佩斯/16/2009(H3N2)样流感病毒HA的干域)且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在具体的实施方式中，本文提供的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的来自H3亚型流感病毒的血凝素干域是来自于群体的大部分对其未感染(naive)的H3亚型。在某些实施方式中，本文提供的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的来自H3亚型流感病毒的血凝素干域来自即将到来的H3N2疫苗株，例如，在2013、2014、2015、2016、2017、2018、2019、2020、2021、2022、2023、2024、2025、2026、2027、2028、2029、2030、2031、2032、2032、2033、2034或2035年使用的H3N2疫苗株。
在一个具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽不包含A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽不包含A/佩斯/16/2009(H3)的干域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自乙型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H5亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH5/B嵌合流感血凝素多肽”)。
在一个具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班(Brisbane)/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域(或A/越南/1203/2004(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域(或A/印度尼西亚/5/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/安徽/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域(或A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域(或A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域(或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)样流感病毒HA的球状头域)。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自乙型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H7亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH7/B嵌合流感血凝素多肽”)。
在一个具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域(或A/荷兰/219/03(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/504/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域(或A/加拿大/444/04(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域(或A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域(或A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域(或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)样流感病毒HA的球状头域)。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自乙型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自不同乙型流感病毒株的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cB/B嵌合流感血凝素多肽”)。
在一个具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域(或B/Lee/1940样流感病毒HA的球状头域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域(或B/马来西亚/2506/2004样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA的球状头域(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域(或B/Lee/1940样流感病毒的球状头域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域(或B/佛罗里达/4/2006样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA的球状头域(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域(或B/Lee/1940样流感病毒的球状头域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域(或B/威斯康星/1/2010样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA的球状头域(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒的球状头域)。
在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域(或B/Lee/1940样流感病毒的球状头域)。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域(或B/布里斯班/60/2008样流感病毒HA的干域)且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA的球状头域(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒的球状头域)。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H3亚型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H4亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH4/3嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH4/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/09HA的干域(或A/佩斯/16/09样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH4/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/09HA的干域(或A/佩斯/16/09样流感病毒HA的干域)且cH4/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸭/捷克/56的球状头域(或A/鸭/捷克/56样流感病毒HA的球状头域)。
在具体的实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素多肽是可溶的，例如，可溶于组合物，例如，本文描述的组合物。用于产生可溶性嵌合流感血凝素多肽的示例性方法描述于下文6.6.1.2节。
当设计前述嵌合流感HA多肽时，应注意保持得到的蛋白质的稳定性。在这点上，在某些实施方式中，针对包含甲型流感病毒干域的嵌合流感血凝素多肽，推荐保持图1中识别为Ap和Aq的半胱氨酸残基，因为它们有助于HA茎域(stalk)的稳定性，如下文5.1节更详细讨论的那样。例如，为了最佳稳定性，优选“交换(swap)”整个HA球状域(在图1所示Ap和Aq半胱氨酸残基之间)，因为得到的构象将与天然结构最为接近。类似的，包含乙型流感病毒干域的嵌合流感血凝素多肽可以利用从中获得嵌合流感血凝素多肽球状头域的甲型流感病毒球状头域中存在的半胱氨酸(参见，例如，图36)。
在另一方面，本文提供了包含一种、两种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的免疫原性组合物(例如，疫苗制剂)。在某些实施方式中，本文提供的免疫原性组合物(例如，疫苗制剂)可以包含本文描述的嵌合流感血凝素多肽、含有本文描述的嵌合流感血凝素多肽的流感病毒(例如，活病毒或灭活病毒)或工程化为编码本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组；或含有本文描述的嵌合流感血凝素多肽或工程化为编码本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组的载体或细胞。在某些实施方式中，本文提供的免疫原性组合物可以包含(i)本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH5/B嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH7/B嵌合流感血凝素多肽或本文描述的cHB/B嵌合流感血凝素多肽；(ii)本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的组合；或本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的组合；(iii)本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽和任一种本文描述的cH5/B、cH7/B或cB/B嵌合流感血凝素多肽的组合；或(iv)本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽和任一种本文描述的cH5/B、cH7/B或cB/B嵌合流感血凝素多肽的组合。
在一个具体实施方式中，本文提供了包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的疫苗制剂。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含本文描述的嵌合流感血凝素多肽之一的单价疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含两种本文描述的嵌合流感血凝素多肽(即，两种不同的嵌合流感血凝素多肽)的二价疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含三种本文描述的嵌合流感血凝素多肽(即，三种不同的嵌合流感血凝素多肽)的三价疫苗。
本文提供的疫苗制剂可以包含任何形式的本文描述的嵌合流感血凝素多肽。例如，本文提供的疫苗制剂可以包含包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的亚单位疫苗(例如，包含嵌合流感血凝素多肽，例如，可溶性嵌合流感血凝素多肽的组合物)；表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的活流感病毒(例如，减毒活流感病毒)；包含编码一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组的活流感病毒(例如，减毒活流感病毒)；包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的灭活流感病毒；包含编码一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组的灭活流感病毒；含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的病毒/病毒样颗粒(“VLP”)；裂解病毒疫苗，其中所述病毒表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽和/或包含编码一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组；表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的病毒表达载体(例如，非流感病毒表达载体)；和表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的细菌表达载体。
本文描述的疫苗制剂能够针对嵌合流感血凝素多肽HA干域引发高潜力和广泛中和性的抗体。该“通用性”疫苗可被用于诱导和/或增强跨流感病毒亚型的交叉保护性免疫应答。
在另一方面，本文提供了针对流感病毒疾病或感染免疫对象的方法，包括对对象施用包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的组合物。在某些实施方式中，用包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的第一组合物对对象进行初免(prime)，并随后用含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或与本文描述的疫苗制剂相同或不同的组合物进行增强(boost)(例如，含有不同嵌合流感血凝素(HA)多肽的组合物；含有相同嵌合流感血凝素(HA)多肽但处于不同环境中的组合物(例如，第一组合物包含含有嵌合流感血凝素(HA)多肽的亚单位疫苗，不同组合物包含含有相同嵌合流感血凝素(HA)多肽的病毒载体)或包含处于不同环境中的不同嵌合流感血凝素(HA)多肽的组合物)。对象可用含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的组合物增强一次或多次。在某些实施方式中，当对象被增强多次时，第一和第二增强采用包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的不同组合物，且每次增强包含一种与用于初免对象的含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的组合物不同的组合物。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种针对流感病毒免疫对象(例如，人类对象)的方法，包括对对象施用第一剂量的有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、本文描述的载体、本文描述的免疫原性组合物或本文描述的疫苗制剂，并在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、本文描述的载体、本文描述的免疫原性组合物或本文描述的疫苗制剂，其中(i)第一和第二剂量中的嵌合流感血凝素(HA)多肽或载体、免疫原性组合物或疫苗制剂的嵌合流感血凝素(HA)多肽相同或不同(例如，第一剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域不同于第二剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域)；和/或(ii)两种剂量中施用的免疫原性组合物或载体或疫苗制剂的类型相同或不同。在某些实施方式中，该方法包括在对象接受第二剂量之后30天至6个月对对象施用第三剂量的有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、本文描述的载体、本文描述的免疫原性组合物或本文描述的疫苗制剂，其中(i)嵌合流感血凝素(HA)多肽或载体、免疫原性组合物或疫苗制剂的嵌合流感血凝素(HA)多肽与第一和/或第二剂量中的嵌合流感血凝素(HA)多肽相同或不同；和(ii)两种剂量中施用的免疫原性组合物或载体或疫苗制剂的类型相同或不同。在某些实施方式中，两种、三种或多种嵌合流感血凝素(HA)多肽作为第一、第二、和/或第三剂量的部分施用，其中每种嵌合HA多肽的剂量彼此不同。在一些实施方式中，第一、第二、和/或第三剂量的载体、免疫原性组合物或疫苗制剂包含两种、三种或多种嵌合流感血凝素(HA)多肽，其中载体、免疫原性组合物或疫苗制剂中的每种嵌合流感血凝素(HA)多肽以彼此不同的剂量施用(例如，第一剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域不同于第二剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域，等等)。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种针对流感病毒免疫1-5岁人类对象的方法，包括对对象施用第一剂量的有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、本文描述的载体、本文描述的免疫原性组合物或本文描述的疫苗制剂，并在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、本文描述的载体、本文描述的免疫原性组合物或本文描述的疫苗制剂，其中(i)第一和第二剂量中的嵌合流感血凝素(HA)多肽或载体、免疫原性组合物或疫苗制剂的嵌合流感血凝素(HA)多肽相同或不同(例如，第一剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域不同于第二剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域)；和/或(ii)两种剂量中施用的免疫原性组合物或载体或疫苗制剂的类型相同或不同。在某些实施方式中，该方法包括在对象接受第二剂量之后30天至6个月对对象施用第三剂量的有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、本文描述的载体、本文描述的免疫原性组合物或本文描述的疫苗制剂，其中(i)嵌合流感血凝素(HA)多肽或载体、免疫原性组合物或疫苗制剂的嵌合流感血凝素(HA)多肽与第一和/或第二剂量中的嵌合流感血凝素(HA)多肽相同或不同；和(ii)两种剂量中施用的免疫原性组合物或载体或疫苗制剂的类型相同或不同。在某些实施方式中，两种、三种或多种嵌合流感血凝素(HA)多肽作为第一、第二、和/或第三剂量的部分施用，其中每种嵌合HA多肽的剂量彼此不同。在一些实施方式中，第一、第二、和/或第三剂量的载体、免疫原性组合物或疫苗制剂包含两种、三种或多种嵌合流感血凝素(HA)多肽，其中载体、免疫原性组合物或疫苗制剂中的每种嵌合流感血凝素(HA)多肽以彼此不同的剂量施用(例如，第一剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域不同于第二剂量中施用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域，等等)。
在另一方面，本文提供了含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的试剂盒。本文提供的试剂盒可以进一步包含一种或多种额外组分，例如在试剂盒中提供一种特异性结合一种或多种嵌合流感血凝素(HA)多肽的抗体。
工作实施例(例如，第6节，实施例)特别显示了编码含有HA干域并展示异源HA球状头域的嵌合流感HA多肽的构建体的产生，以及来自这些构建体的稳定的嵌合HA多肽的产生，其与干域和头域二者的抗体能交叉反应。工作实施例还显示了这些构建体在对象中针对流感病毒的多种不同毒株和亚型产生保护性免疫应答中的用途，即，这些实施例表明本文描述的嵌合流感HA多肽可被用作通用流感疫苗。
3.1术语
在用于指示氨基酸位点时，术语“大约”或“约”指序列中的特定氨基酸位点或者在N端方向或C端方向该氨基酸位点的5、4、3、2或1个残基之内的任何氨基酸。
在与数字联用时，如本文使用的术语“大约”或“约”指所指示数字的1、5或10％之内的任何数字。在某些实施方式中，术语“约”涵盖了所列举的精确数字。
在核酸序列的上下文中如本文使用的术语“片段”指包含来自亲代序列的一部分连续核苷酸的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，该术语指来自亲代序列的5-15、5-25、10-30、15-30、10-60、25-100、150-300或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一实施方式中，该术语指亲代序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、450或475个连续核苷酸的核苷酸序列。
在氨基酸序列的上下文中如本文使用的术语“片段”指包含来自亲代序列的一部分连续氨基酸的氨基酸序列。在一个具体实施方式中，该术语指来自亲代序列的2-30、5-30、10-60、25-100、150-300或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在另一实施方式中，该术语指亲代序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175或200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
如本文使用的术语“疾病”和“紊乱”可互换地用于指对象的病况。在具体的实施方式中，术语“疾病”指由细胞或对象中病毒的存在或由病毒侵入细胞或对象所导致的病理状况。在某些实施方式中，病况是对象的疾病，其严重性通过施用免疫原性组合物在对象中诱导免疫应答而降低。
在对对象给药治疗剂的上下文中，如本文使用的术语“有效量”指具有预防性和/或治疗性效果的治疗剂的数量。在某些实施方式中，在对对象给药治疗剂的上下文中“有效量”指足以获得1种、2种、3种、4种或更多下述效果的治疗剂的量：(i)减少或改善流感病毒感染、疾病或与之有关的症状的严重程度；(ii)减少流感病毒感染、疾病或与之有关的症状的持续时间；(iii)防止流感病毒感染、疾病或与之有关的症状的进展；(iv)导致流感病毒感染、疾病或与之有关的症状的衰退；(v)防止流感病毒感染、疾病或与之有关的症状的发展或发作；(vi)防止流感病毒感染、疾病或与之有关的症状的复发；(vii)减少或防止流感病毒从一个细胞至另一细胞、一个组织至另一组织或一个器官至另一器官的传播；(ix)防止或减少流感病毒从一个对象向另一对象的传播；(x)减少流感病毒感染相关的器官衰竭；(xi)减少对象的住院治疗；(xii)减少住院长度；(xiii)增加患有流感病毒感染或相关疾病的对象的存活率；(xiv)消除流感病毒感染或相关疾病；(xv)抑制或减少流感病毒复制；(xvi)抑制或减少流感病毒进入宿主细胞；(xviii)抑制或减少流感病毒基因组复制；(xix)抑制或减少流感病毒蛋白质的合成；(xx)抑制或减少流感病毒颗粒的装配；(xxi)抑制或减少流感病毒颗粒从宿主细胞中的释放；(xxii)减少流感病毒滴度；和/或(xxiii)增强或改进另一治疗的预防或治疗效果。
在某些实施方式中，有效量不会导致对流感病毒疾病的完全保护，而是产生与未治疗对象相比流感病毒更低的滴度或减少的数量。在某些实施方式中，该有效量导致与未治疗对象相比0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或更多的流感病毒滴度降低。在一些实施方式中，该有效量导致与未治疗对象相比流感病毒滴度降低大约1个log或更多、大约2个log或更多、大约3个log或更多、大约4个log或更多、大约5个log或更多、大约6个log或更多、大约7个log或更多、大约8个log或更多、大约9个log或更多、大约10个log或更多、1-3个log、1-5个log、1-8个log、1-9个log、2-10个log、2-5个log、2-7个log、2个log-8个log、2-9个log、2-10个log3-5个log、3-7个log、3-8个log、3-9个log、4-6个log、4-8个log、4-9个log、5-6个log、5-7个log、5-8个log、5-9个log、6-7个log、6-8个log、6-9个log、7-8个log、7-9个log或8-9个log。流感病毒滴度、数量或总负担降低的益处包括但不限于较轻的感染症状、较少的感染症状和感染相关疾病的长度减少。
“血凝素”和“HA”指本领域技术人员已知的任何血凝素。在某些实施方式中，所述血凝素是流感血凝素，例如甲型流感血凝素、乙型流感血凝素或丙型流感血凝素。典型的血凝素包含本领域技术人员已知的域，包括信号肽(本文可选的)、干域、球状头域、腔域(本文可选的)、跨膜域(本文可选的)和胞质域(本文可选的)。在某些实施方式中，血凝素包括单一多肽链，例如HA0。在某些实施方式中，血凝素包括四聚连接的多于一条多肽链，例如HA1和HA2。本领域技术人员将认可未成熟的HA0可被裂解以释放信号肽(大约20个氨基酸)，产生成熟血凝素HA0。血凝素HA0可在另一位点被裂解以产生HA1多肽(大约320个氨基酸，包括球状头域和一部分干域)和HA2多肽(大约220个氨基酸，包括干域剩余部分、腔域、跨膜域和胞质域)。在某些实施方式中，血凝素包含信号肽、跨膜域和胞质域。在某些实施方式中，血凝素缺少信号肽，即血凝素是成熟血凝素。在某些实施方式中，血凝素缺少跨膜域或胞质域或两者。如本文使用的术语“血凝素”和“HA”涵盖了由翻译后加工修饰的血凝素多肽，例如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接糖基化)、蛋白酶裂解和脂修饰(例如S-棕榈酰化)。
如本文使用的术语“嵌合流感病毒血凝素多肽”、“嵌合流感病毒HA多肽”、“嵌合血凝素多肽”和“嵌合流感血凝素多肽”指包含流感病毒血凝素干域和流感病毒血凝素球状头域的流感血凝素，其中该流感病毒血凝素头域与流感病毒血凝素干域异源(即，嵌合流感病毒血凝素多肽的球状头域来自与嵌合流感病毒血凝素多肽的干域不同的流感病毒株或亚型)。
“HA1N端干片段(stemsegment)”指对应于流感血凝素HA1多肽干域氨基端部分的多肽片段。在某些实施方式中，HA1N端干片段包括大致对应于HA1域的氨基酸HA1N-term至Ap的氨基酸残基。HA1N-term是本领域技术人员认可的HA1的N端氨基酸。Ap是HA1N端干片段中的半胱氨酸残基，其与HA1C端干片段的半胱氨酸残基形成或能够形成二硫键。图1中鉴定了甲型流感血凝素多肽中的残基Ap。示例性的HA1N端干片段是本文描述的。在某些实施方式中，HA1N端干片段包括大致对应于H3血凝素HA1氨基酸1-52的氨基酸残基。注意，在此编号系统中，1指成熟HA0蛋白质的N端氨基酸，从该位点去除信号肽。本领域技术人员将很容易地可以确认对应于其他流感HA多肽的HA1N端干片段的氨基酸残基，例如，对应于H1血凝素HA1的HA1N端干片段的氨基酸残基(参见，例如，图1)。
“HA1C端干片段”指对应于流感血凝素HA1多肽干域羧基端部分的多肽片段。在某些实施方式中，HA1C端干片段包括大致对应于HA1域的氨基酸Aq至HA1C-term的氨基酸残基。HA1C-term是本领域技术人员认可的HA1的C端氨基酸。图1中鉴定了甲型流感血凝素多肽中的残基Aq。示例性的HA1C端干片段是本文描述的。在某些实施方式中，HA1C端干片段包括大致对应于H3血凝素HA1氨基酸277-346的氨基酸残基。注意，在此编号系统中，1指成熟HA0蛋白质的C端氨基酸，从该位点去除信号肽。本领域技术人员将很容易地可以确认对应于其他流感HA多肽的HA1C端干片段的氨基酸残基，例如，对应于H1血凝素HA1的HA1C端干片段的氨基酸残基(参见，例如，图1)。
“HA2”指对应于本领域技术人员已知的流感血凝素多肽HA2域的多肽域。在某些实施方式中，HA2包括干域、腔域、跨膜域和胞质域(参见，例如，Scheiffle等人，2007，EMBOJ.16(18):5501-5508，其内容全文引入作为参考)。在某些实施方式中，HA2包括干域、腔域和跨膜域。在某些实施方式中，HA2包括干域和腔域；在这些实施方式中，HA2可以是可溶性的。在某些实施方式中，HA2包括干域；在这些实施方式中，HA2可以是可溶性的。
在多肽、核酸或病毒的上下文中，如本文使用的术语“异源”分别指在自然界通常不会发现的或在自然界通常与目标多肽、核酸或病毒无关的多肽、核酸或病毒。例如，“异源多肽”可以指源自不同病毒的多肽，例如，不同的流感毒株或亚型或无关的病毒或不同的种。在具体的实施方式中，当用于本文描述的嵌合流感病毒血凝素球状头域的上下文时，术语异源指与通常不会被发现与之相关的流感HA干域有关的流感HA球状头域(例如，HA的头域和干域在自然界将不会被一起发现)。
在对对象施用两种或多种治疗的上下文中，如本文使用的术语“组合的”指多于一种治疗的使用(例如，多于一种预防剂和/或治疗剂)。术语“组合的”的使用不受对对象施用治疗顺序的限制。例如，第一治疗(例如，第一预防或治疗剂)可以在对对象施用第二治疗之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、与之同时或在其之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。
如本文使用的术语“感染”表示在细胞或对象中被病毒侵入、病毒增殖和/或病毒存在。在一个实施方式中，感染是“活性”感染，即，其中病毒正在细胞或对象内复制。这种感染的特征是病毒从初始被病毒感染的细胞、组织和/或器官向其它细胞、组织和/或器官的传播。感染也可以是潜伏感染，即其中病毒不在复制。
如本文使用的术语“流感病毒疾病”指由细胞或对象中存在的流感病毒(例如，甲型流感或B病毒)或细胞或对象被流感病毒侵入所导致的病理状态。在具体的实施方式中，该术语指由流感病毒导致的呼吸疾病。
如本文使用的短语“IFN缺陷系统”或“IFN-缺陷基质”指例如细胞、细胞系和动物(如猪、小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠等等)的系统，其不生产IFN或生产低水平的IFN(即，当在相同条件下与IFN有活性(competent)的系统相比IFN表达减少5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多)，不应答或更低效地应答IFN，和/或在由IFN诱导的一种或多种抗病毒基因活性方面有缺陷。
当用于“流感样病毒”的上下文时，如本文使用的术语“样”指表示与所指的病毒不同分离物的流感病毒，其中所述不同分离物的氨基酸序列或所述不同分离物的HA的氨基酸序列与所指的流感病毒的氨基酸序列或所指的流感病毒的HA的氨基酸序列相同或几乎相同；和/或针对所述不同分离物的免疫应答会赋予对所指的流感病毒的完全保护，反之亦然。在某些实施方式中，具有与所指流感病毒氨基酸序列几乎相同的氨基酸序列的流感病毒分离物具有与所指流感病毒氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，代表“流感样病毒”的流感病毒分离物包含与所指流感病毒HA的氨基酸序列几乎相同的氨基酸序列的HA，例如，流感样病毒的HA具有与所指流感病毒HA的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列。
如本文使用的，数学术语“log”指log10。
如本文使用的指示流感病毒毒株或亚型(例如，H1亚型)的短语“群体的大部分对其未感染”指可能大于50％的人群未接触的流感病毒株或亚型。在具体的实施方式中，短语“群体的大部分对其未感染”指可能至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的人群未接触的流感病毒株或亚型。
如本文使用的短语“感染复数”或“MOI”是每个被感染细胞的感染性病毒颗粒的平均数。MOI通过用加入的感染性病毒颗粒的数量(加入的mlxPFU/ml)除以加入的细胞数(加入的mlx细胞/ml)来确定。
如本文使用的术语“核酸”意为包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸可以是单链或双链的。
如本文使用的术语“多肽”指如本领域技术人员已知的由酰胺键连接的氨基酸聚合物。如本文使用的，术语多肽可以指由共价酰胺键连接的单一多肽链。该术语还可以指由非共价键反应例如离子接触、氢键、范德华接触和疏水接触连接的复合多肽链。本领域技术人员将认可该术语包括被修饰的多肽，例如通过翻译后加工例如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接糖基化)、蛋白酶裂解和脂修饰(例如S-棕榈酰化)。
在对对象给予治疗以防止流感病毒疾病的上下文中，如本文使用的术语“防止”和“预防”指一种或多种由治疗或联合治疗的施用导致的预防/有益效果。在一个具体实施方式中，在对对象施用治疗以防止流感病毒疾病的上下文中，如本文使用的术语“防止”和“预防”指一种或多种如下所述的由治疗或联合治疗的施用导致的预防/有益效果：(i)抑制流感病毒疾病或与其症状的发展或发作；(ii)抑制流感病毒疾病或与之有关的症状的复发；和(iii)减少或抑制流感病毒的感染和/或复制。
当用于从天然来源例如细胞中获得的多肽(包括抗体)的上下文时，如本文使用的术语“纯化的”和“分离的”指基本上不含来自天然来源的污染材料的多肽，所述污染处理例如土壤颗粒、矿物、环境化学物质和/或来自天然来源的细胞材料，例如但不限于细胞中存在的细胞碎片、细胞壁材料、膜、细胞器、大多数核酸、碳水化合物、蛋白质和/或脂质。从而，分离的多肽包括具有细胞材料和/或污染材料少于约30％、20％、10％、5％、2％或1％(干重)的多肽制备物。当用于化学合成的多肽(包括抗体)的上下文时，如本文使用的术语“纯化的”和“分离的”指基本上不含化学前体或其它多肽合成中涉及的化学物质的多肽。在一个具体实施方式中，嵌合流感血凝素(HA)多肽是化学合成的。在另一具体实施方式中，流感血凝素干域多肽、流感血凝素头域多肽和/或嵌合流感血凝素多肽是分离的。
在病毒的上下文中，如本文使用的术语“复制”、“病毒复制”和“病毒复制”指一个或多个或所有阶片段的病毒生命周期，其导致病毒繁殖。病毒生命周期的步骤包括但不限于病毒附着至宿主细胞表面、穿透或进入宿主细胞(例如，通过受体介导的内吞作用或膜融合)、脱壳(病毒衣壳被去除并被病毒酶或宿主酶降解从而释放病毒基因组核酸的过程)、基因组复制、病毒信使RNA(mRNA)合成、病毒蛋白质合成和用于基因组复制的病毒核糖核蛋白复合物装配、病毒颗粒装配、病毒蛋白质的翻译后修饰和通过裂解或出芽从宿主细胞释放并获得含有嵌入的病毒糖蛋白的磷脂包膜。在一些实施方式中，术语“复制”、“病毒复制”和“病毒复制”指病毒基因组的复制。在其它实施方式中，术语“复制”、“病毒复制”和“病毒复制”指病毒蛋白质的合成。
如本文使用的术语“干域多肽”、“HA干域”、“流感病毒血凝素干域多肽”和“HA茎域”指包括或含有一种或多种组成了流感血凝素的干域的多肽链的多肽。干域多肽可以是单一多肽链、双多肽链或多重多肽链。一般，干域多肽是单一多肽链(即对应于血凝素HA0多肽的干域)或双多肽链(即对应于连接血凝素HA2多肽的血凝素HA1多肽的干域)。在具体的实施方式中，干域多肽源于甲型流感H1或H3流感病毒血凝素或乙型流感流感病毒血凝素。
如本文使用的术语“流感病毒血凝素头域多肽”、“流感病毒血凝素头域”、“HA球状头域”和“HA头域”指流感血凝素多肽的球状头域。例如，对于甲型流感病毒，球状头域一般是被理解为存在于HA分子的HA1部分中的两个关键半胱氨酸残基之间。对于多种甲型流感病毒这些半胱氨酸残基在图1中被标识为“Ap”和“Aq”。
如本文使用的术语“对象”或“患者”可交换地被用于指动物(例如，鸟类、爬行动物和哺乳动物)。在一个具体实施方式中，对象是鸟。在另一实施方式中，对象是哺乳动物，包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴、黑猩猩和人类)。在某些实施方式中，对象是非人类动物。在一些实施方式中，对象是农场动物或宠物。在另一实施方式中，对象是人类。在另一实施方式中，对象是人类婴儿。在另一实施方式中，对象是人类儿童。在另一实施方式中，对象是人类成人。在另一实施方式中，对象是上年纪的人类。在另一实施方式中，对象是成熟前的人类婴儿。
如本文使用的术语“成熟前的人类婴儿”指胎龄小于37周出生的人类婴儿。
如本文使用的术语“人类婴儿”指新生儿至1岁的人类。
如本文使用的术语“人类儿童”指1岁-18岁的人类。
如本文使用的术语“人类成人”指18岁或更大的人类。
如本文使用的术语“上年纪的人类”指65岁或更大的人类。
如本文使用的术语“季节性流感病毒株”指对象群在季节的基础上接触的流感病毒毒株。在具体的实施方式中，术语季节性流感病毒株指甲型流感病毒毒株。在具体的实施方式中，术语季节性流感病毒株指属于H1或H3亚型的流感病毒毒株，即，目前持续存在于人类对象群中的两个亚型。在其它实施方式中，术语季节性流感病毒株指乙型流感病毒毒株。
如本文使用的术语“治疗”和“疗法”可以指任何可被用于预防或治疗病毒感染或其相关疾病或症状的规程、方法、化合物、组合物、制剂和/或试剂。在某些实施方式中，术语“治疗”和“疗法”指生物治疗、支持治疗和/或其它本领域技术人员已知可用于预防或治疗病毒感染或其相关疾病或症状的治疗。在一些实施方式中，术语“治疗”指(i)编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸、(ii)嵌合流感血凝素(HA)多肽或(iii)包含编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸或包含嵌合流感血凝素(HA)多肽的载体或组合物。在一些实施方式中，术语“治疗”指特异性结合嵌合流感病毒血凝素多肽的抗体。
如本文使用的术语“治疗”和“处理”在对对象施用治疗(剂)以治疗流感病毒疾病或感染的上下文中指获得治疗或联合治疗的有益的或治疗的效果。在具体的实施方式中，该术语指从施用治疗或联合治疗中获得以下效果的1种、2种、3种、4种、5种或更多种：(i)减少或改善流感病毒感染或疾病或与之有关的症状的严重程度；(ii)减少流感病毒感染或疾病或与之有关的症状的持续时间；(iii)流感病毒感染或疾病或与之有关的症状的衰退；(iv)减少流感病毒的滴度；(v)减少与流感病毒感染或其相关疾病有关的器官衰竭；(vi)减少对象的住院治疗；(vii)减少住院长度；(viii)增加对象的存活率；(ix)消除流感病毒感染或其相关疾病或症状；(x)抑制流感病毒感染或疾病或其相关症状的发展；(xi)防止流感病毒从一个细胞、组织、器官或对象传播至另一细胞、组织、器官或对象；(xii)抑制或减少流感病毒进入宿主细胞；(xiii)抑制或减少流感病毒基因组复制；(xiv)抑制或减少流感病毒蛋白质合成；(xv)抑制或减少流感病毒颗粒从宿主细胞中的释放；和/或(xvi)增强或改善另一治疗的疗效。
如本文使用的，在一些实施方式中，在病毒的上下文中短语“野生型”指天然流行、流通并产生典型疾病爆发的病毒种类。在其它实施方式中，在病毒的上下文中术语“野生型”指亲代病毒。
4.附图简述
图1显示了由CLUSTALW进行的17个流感病毒血凝素亚型(分别为SEQIDNOS:1-16和35)的代表性序列的序列比对。指示为Ap的残基是HA1N端干片段的半胱氨酸残基，其与指示为Aq的残基——HA1C端干片段的一个半胱氨酸残基——形成或能够形成二硫键。指示为Bq的残基代表本文描述的HA1C端短干片段的接近的N端氨基酸。指示为Cq的残基代表本文描述的HA1C端长干片段的接近的N端氨基酸。指示为Cp的残基代表本文描述的HA1N端长干片段的接近的C端氨基酸。
图2提供了具有保守H1茎域和来自不同亚型HA的不同球状头域的嵌合HA的图解。
图3提供了一种新型流感疫苗和诊断工具平台以诱导和分析抗体和反应血清。A)嵌合HA的表达。包含A/PR/8/34HA的茎域和A/加利福尼亚/4/09的球状头域的嵌合HA(嵌合HA)以及野生型HA(PR8-HA和CAL09-HA)和GFP对照在293T细胞中表达。上部的蛋白质印迹用PR8-特异性抗体(PY102)探测，下方的点用Cal09特异性抗体(39C2)探测。B)A中表达的HA构建体的示意图。嵌合HA由A/PR/8/34HA茎域和2009A/加利福尼亚/04/09球状头域组成。
图4提供了嵌合HA的图解。A)嵌合HA的基础结构。球状头域可以很方便地在二硫键Cys52-Cys277处进行交换。B)顺序施用包括完全保守的茎域和变化的球状头域的嵌合HA的初免-加强方案。
图5描述了具有H1HA的茎域和H3HA的球状头域的嵌合HA的产生。包含A/PR/8/34HA茎域和HK/68球状头域的嵌合HA(嵌合H3)以及野生型HA(PR8-HA和HK68HA)在293T细胞中表达。上部的蛋白质印迹用PR8-特异性抗体探测，下方的点用H3特异性抗体探测。
图6显示了A/香港/1/1968(H3)、A/佩斯/16/2009(H3)、A/PR/8/34(H1)、A/Cal/4/09(H1)、A/越南/1203/04(H5)和A/野鸭/亚伯达/24/01(H7)血凝素蛋白质序列的序列对比。Cys52和Cys277氨基酸残基被特别标出(基于H3编号)。黑色暗影表示保守氨基酸。黑色波浪线表示HA球状头域区域。指示了HA1和HA2的起始点。呈现了A/香港/1/1968(H3)、A/佩斯/16/2009(H3)、A/PR/8/34(H1)、A/Cal/4/09(H1)、A/越南/1203/04(H5)和A/野鸭/亚伯达/24/01(H7)每一种的从N端至HA的Cys52的氨基酸序列，分别对应于SEQIDNOs.23-28。呈现了从A/香港/1/1968(H3)、A/佩斯/16/2009(H3)、A/PR/8/34(H1)、A/Cal/4/09(H1)、A/越南/1203/04(H5)和A/野鸭/亚伯达/24/01(H7)每一种的HA的Cys277至C端的氨基酸序列，分别对应于SEQIDNOs.29-34。
图7显示了嵌合血凝素的图解。(A)嵌合PR8-cH1HA的构造图。通过用A/加利福尼亚/4/09(H1)HA的球状头域交换A/PR/8/34(H1)HA的位于Cys52和Cys277之间的球状头域构建了嵌合HA。得到的嵌合HA具有A/PR/8/34(H1)HA的茎域区域和A/加利福尼亚/4/09(H1)HA的球状头域，命名为PR8-cH1。(B)不同野生型和嵌合HA的折叠结构图解，例如野生型PR8HA、嵌合PR8-cH1HA、嵌合PR8-cH5HA、野生型佩斯HA和嵌合佩斯-cH7HA(从左至右)。全长HA结构下载自蛋白质数据库(PDB)：PR8HA(PDBID1RU7)和佩斯HA(由HK68HA，PDBID1MQN代表)。最终图像用PyMol(DelanoScientific)产生。
图8显示了嵌合HA构建体的表面表达和功能性分析。(A)在瞬时转染细胞中评价了嵌合HA构建体的表面表达。转染后24h，胰蛋白酶化293T细胞并通过流式细胞术分析了嵌合HA蛋白质的细胞表面表达。在上图中，将模拟转染的细胞(左方阴影区域)与PR8HA转染的细胞(右)或PR8-cH1(右)或PR8-cH5(右)转染的细胞进行了比较。在下图中，将模拟转染的细胞(左方阴影区域)与佩斯和佩斯-cH7构建体(右)转染的细胞进行了比较。(B)用荧光素酶编码的假型颗粒表达性嵌合HA感染MDCK细胞。荧光素酶分析中产生的相对光单位(RLU)表明假型颗粒表达性嵌合HA能够进入细胞。
图9描述了负载嵌合血凝素的重组病毒的产生。(A)重组病毒蛋白质印迹分析。制备了模拟感染或用指示的病毒(16hpi)以2倍MOI感染的MDCK细胞提取物，并用抗体进行了探测：抗-A/PR8/HA(H1)(PY102)、抗-A/Cal/09/HA(H1)(29C1)、抗-A/VN/HA(H5)(M08)、抗-H3/HA(12D1)、抗-H7(NR-3125)、抗-A/NP(HT103)和作为内部载荷对照的抗-GAPDH。(B)使用抗体：抗-A/NP(HT103)、抗-A/H1HA(6F12)、抗-A/PR8/HA(PY102)、抗-A/Cal/09/HA(29C1)、抗-A/VN/HA(M08)、抗-H3/HA(12D1)和抗-A/H7病毒(NR-3152)进行的重组病毒感染MDCK细胞的免疫荧光分析。
图10描述了重组病毒的生长动力学和噬菌斑表型。(A)10天大的具胚蛋用野生型或重组病毒感染，每只蛋100pfu，监控感染后72小时病毒生长。(B)通过噬菌斑分析评价了重组病毒的噬菌斑表型。用野生型或重组病毒感染MDCK细胞并在感染后48小时用针对A/NP的抗体(HT103)免疫染色以显示噬菌斑表型。
图11描述了对转染嵌合H6血凝素的细胞的免疫荧光分析。用1μg的pCAGGS质粒表达性嵌合H6血凝素感染293T细胞。将接受了DNA(A)、Cal/09感染(B)、DNA和Cal/09感染(C)或Cal/09裂解疫苗(D)的动物血清加至转染的细胞并在与AlexaFluor594-缀合的抗-小鼠IgG孵育后通过荧光显微镜可视化。
图12显示DNA初免和嵌合病毒加强对受到致命流感病毒攻击的动物给予了保护。对动物用单独的DNA、单独的嵌合H9病毒、DNA初免和嵌合H9病毒加强或灭活的PR8病毒进行处理。然后用鼻部徐徐滴入5x104PFU的PR8病毒攻击小鼠，监控14天的动物体重。
图13显示了由ELISA确定的茎域特异性抗体与cH6蛋白质的反应性。
图14描述了嵌合HA(cHA)蛋白质的图示(A)和MDCK细胞中的cHA表达(B)。嵌合HA(cHA)蛋白质和重组嵌合病毒。(A)cHA的图示。球状头域定义为残基C52和C277之间的中间氨基酸序列(H3编号)。用此二硫键作为头和茎域之间的分界，外部的HA头被引入上文的异源茎域。茎域被定义为HA1和HA2亚单位的剩余部分。CT，胞质尾区；SP，信号肽；TM，跨膜域。全长HA结构下载于蛋白质数据库(PDB)：PR8(H1)HA(PDBID1RU7)和A/珍珠鸡/香港/WF10/99HA[用A/猪/香港/9/98(H9；PDBID1JSD)表示]。最终图像用PyMol(DelanoScientific)产生。由于尚未发表H6HA的结构，PR8HA的头折叠图像被用于cH6/1构建体。(B)免疫荧光确定cHA的表达。用WTPR8或cH9/1N3病毒感染MDCK细胞或其被模拟感染。使用PR8病毒头和茎域特异性的抗体以及具有H9反应性的抗体确认cHA的表达。(放大倍数：40×)
图15显示感染流行性H1N1病毒的成人患者具有高滴度的与HA茎域具有反应性的中和抗体。pH1N1感染的成人(n＝9)、未感染pH1N1的儿童(n＝5)和未感染pH1N1病毒的成人(n＝11)血清与cH6/1蛋白质的反应性(A)，cH9/1蛋白质；(B)，HA2蛋白质的LAH(抗-LAH抗体被用作阳性对照)；(C)，H5HA蛋白质(对H5HA产生的小鼠多克隆血清被用作阳性对照且pan-H3抗体12D1被用作阴性对照；(D)(13)，或H3HA蛋白质(12D1被用作阳性对照和对H5HA产生的小鼠多克隆血清被用作阴性对照；(E).用ELISA对所有进行了评价；数据点表示用SE的平均滴度或合并样品的反应性。
图16显示感染流行性H1N1病毒的成人患者具有高滴度的HA茎域特异性中和抗体(A和B)。来自pH1N1感染的血清(n＝14)和未感染pH1N1的成人(n＝5)分别混合并纯化来自两种混合物的全IgG。通过使用cH9/1N3病毒的噬斑减少分析评价了茎域抗体的中和能力。数据点代表了两个实验的均值和SE。用抗-H9抗体G1-26免疫染色噬斑。(B)显示了沿着上部显示的四个血清稀释的噬斑减少。(C)假型颗粒中和分析检测了人-纯化IgG制备物(来自感染pH1N1的成人和未感染pH1N1的成人的血清)的中和抗体活性。全IgG浓度为50、10和2μg/mL。作为阳性对照，使用了茎域-特异性单克隆抗体6F12。
图17显示了cH6/1和cH9/1蛋白的表达和功能。A)2μgcH6/1和cH9/1蛋白的考马斯凝胶。M，标记蛋白。(B)杆状病毒表达的cHA蛋白的蛋白质印迹分析。泳道1，cH6/1蛋白；泳道2，cH9/1蛋白；泳道3，WTPR8HA；泳道4，WTH3HA。用已知与PR8病毒的茎域(兔多克隆抗-HA2)或H3病毒(小鼠mAb12D1)和H6的球状头域(山羊多克隆抗-H6)或H9病毒(小鼠mAbG1-26)反应的抗体探测斑点，以确认杆状病毒表达的cHA的身份。mAb12D1与HA0和HA2(H3蛋白质制备物被裂解，得到两条不同的带)两者均反应。(C)cH9/1N3重排病毒的噬斑分析。重排cH9/1N3病毒噬斑表型与WTPR8病毒产生的噬斑相似。用PY102和抗-H9抗体G1-26对噬斑进行免疫染色。
图18显示针对流感病毒HA茎域的单克隆抗体结合并中和cHA。(A)茎域抗体C179被用于通过ELISA测试与cH6/1杆状病毒-表达的蛋白质的反应性。C179以剂量依赖的方式与cH9/1反应。(B)茎域抗体C179被用于通过ELISA测试与cH9/1杆状病毒-表达的蛋白质的反应性。C179以剂量依赖的方式与cH9/1反应(C和D)。抗体6F12中和cH9/1N3病毒复制。6F12被用于通过噬斑减少分析来评价茎域-特异性单克隆抗体中和cH9/1N3病毒的能力。D显示了使用5个稀释的mAb6F12(100、20、4、0.8和0.16μg/mL)的cH9/1N3病毒噬斑减少。噬斑用抗-H9抗体G1-26免疫染色。
图19描述了嵌合血凝素的图示。图19A显示了野生型和cH1/1病毒的图表。通过用A/加利福尼亚/4/09(H1)HA的球状头域交换位于PR8(H1)HA的Cys52和Cys277之间的球状头域构建了嵌合HA。得到的嵌合HA具有A/PR/8/34(H1)HA的茎域区域与A/加利福尼亚/4/09(H1)HA的球状头域并被命名为cH1/1。图19B显示了不同的野生型和嵌合HA折叠结构的理论示意图。从左至右：野生型PR8HA、嵌合cH1/1HA、嵌合cH5/1HA、野生型佩斯HA、嵌合cH7/3HA和嵌合cH5/3HA。
图20描述了比较本研究中使用的H1、H3、H5和H7HA的氨基酸同一性的表。用ClustalW计算了氨基酸同一性百分比(排除了信号肽)。对全长HA以及球状头域和茎域比较了氨基酸同一性百分比。灰条表示100％同一性。
图21显示了嵌合HA构建体的表面表达。在瞬时转染或感染的细胞中评价了嵌合HA构建体的表面表达。转染后48h，胰蛋白酶化293T细胞并通过流式细胞术分析了嵌合HA蛋白质的细胞表面表达。在上图中，将模拟转染的细胞(灰)与PR8HA转染的细胞(黑线)或cH1/1(黑线)或cH5/1(黑线)转染的细胞进行了比较。在中间图中，将模拟转染的细胞(灰)与佩斯/09、cH7/3(黑线)和cH5/3构建体(黑线)转染的细胞进行了比较。在下图中，用表达佩斯/09、cH7/3和cH5/3的重组病毒感染了MDCK细胞。感染后12h，使用流式细胞术分析了不同HA的细胞表面表达。
图22显示了嵌合HA进入MDCK细胞的能力。用荧光素酶编码的假型颗粒表达性嵌合HA转导MDCK细胞。荧光素酶分析中产生的相对光单位(RLU)表明假型颗粒表达性嵌合HA能够进入细胞。
图23显示了用表达重组cHA的病毒感染的细胞的蛋白质印迹分析。制备了以2倍MOI模拟感染或感染所示病毒的MDCK细胞的提取物并用抗体在16hpi探测：抗-A/PR8/HA(H1)(PY102)、抗-A/Cal/09/HA(H1)(29E3)、抗-A/VN/HA(H5)(mAb#8)、抗-H3/HA(12D1)、抗-H7(NR-3152)、抗-A/NP(HT103)和抗-GAPDH作为载荷对照。
图24描述了使用抗体：抗-A/NP(HT103)、抗-A/H1HA(6F12)、抗-A/PR8/HA(PY102)、抗-A/Cal/09/HA(29E3)、抗-A/VN/HA(mAb#8)、抗-H3/HA(12D1)和抗-A/H7病毒(NR-3152)进行的感染重组病毒的MDCK细胞的免疫荧光分析。
图25描述了野生型和重组病毒的生长动力学和噬菌斑表型。(A)10天大的具胚蛋用野生型或重组病毒感染，每只蛋100pfu，监控感染后72小时病毒生长。数据点代表实验重复的均值和标准差。(B)通过噬菌斑分析评价了重组病毒的噬菌斑表型。用野生型或重组病毒感染MDCK细胞。在感染后48小时固定细胞并用针对A/NP的抗体(HT103)免疫染色以显示噬菌斑表型。
图26描述了茎域-特异性单克隆抗体能中和表达cHA的病毒和假型颗粒。通过噬斑减少分析或假型颗粒抑制分析评价了mAb(KB2)中和表达cHA的病毒或假型颗粒的能力。用表达cHA的病毒或假型颗粒在指示量(ug/mL)的mAb或无抗体的存在下感染或转化MDCK细胞。噬斑形成或荧光素酶活性被用作读数(readout)来确定受mAb抑制的程度。mAb以剂量依赖的方式中和cH1/1(黑方块)和cH5/1(黑三角)病毒复制，在浓度100ug/mL以上100％抑制。数据点代表实验重复的均值和标准差。(B)mAb还以剂量依赖的方式抑制cH1/1(黑方块)和cH5/1(黑三角)假型颗粒的进入，在4ug/mL以上完全抑制。数据点代表实验重复的均值和标准差。假型抑制分析独立进行。
图27显示用cHA构建体进行连续免疫接种引发HA茎域-特异性抗体并提供免于致死剂量攻击的保护。用20μg的cH9/1蛋白添加佐剂滴鼻和腹膜内给药初免小鼠。3周后，用20μgcH6/1蛋白添加佐剂滴鼻和腹膜内给药对小鼠进行加强。作为对照，用BSA或给定的灭活FM1病毒肌肉注射以相似方式对小鼠进行初免和加强。最后一次免疫后3周使动物流血并用5LD50的A/蒙默斯堡/1/1947(FM1)病毒进行攻击。(A)用cH5/1N1病毒包被ELISA板以评价通过免疫接种引发的茎域反应性程度(BSA+BSA是该图的基线)。(B)将小鼠每天称重14天以评价对攻击的保护。(C)KaplanMeier曲线描述了攻击后的生存率。cH9/1+cH6/1免疫的小鼠具有统计学上比BSA对照更高的生存率(p＝.0003)。
图28显示用cH6/1进行免疫引发了茎域-特异性免疫力，其介导对cH9/1N1病毒攻击的保护。对动物接种YAM-HA病毒以模拟优先感染流感病毒或针对流感病毒免疫接种。3周后，用cH6/1或BSA添加佐剂滴鼻和腹膜内给药免疫动物。对照动物接种野生型B/山行县/16/1988并以相似方式肌肉内接种BSA或给定的灭活cH9/1N1病毒。免疫后3周使动物流血并用250LD50cH9/1N1病毒进行攻击。(A)将动物称重8天以评价对攻击的保护。在第3-5天，YAM-HA+cH6/1动物显示比YAM-HA+BSA群(cohort)在统计学上更小的体重损失(p<.05)。(B)KaplanMeier曲线描述了存活率。在YAM-HA+cH6/1组中发现了与YAM-HA+BSA群(p＝.038)以及未感染和WTYAM+BSA动物(p<.0001)相比统计学上不同的存活率。YAM-HA+BSA群的存活率与WT-YAM+BSA群在统计学上并无不同(p＝0.058)。(C)ELISA板用cH5/1N1病毒包被以评价通过免疫接种引发的茎域反应性程度。(D)描述了使用cH5/1病毒的噬斑减少分析结果。(E)使动物免疫、流血并收获总IgG用于基于H5的假型颗粒进入抑制分析。抑制百分比被评价为与对照相比荧光素酶表达的降低。
图29显示用cH6/1免疫接种保护小鼠不受致命H5流感病毒攻击。对动物接种YAM-HA病毒以模拟优先感染流感病毒或针对流感病毒免疫接种。3周后，用cH6/1或BSA添加佐剂滴鼻和腹膜内给药免疫动物。对照动物接种野生型B/山行县/16/1988并以相似方式肌肉内接种BSA或给定的灭活cH5/1N1病毒。使动物流血并用10LD50的PR8背景中的2:6H5重排病毒(参见，例如，Steel等人，2009，JVirol83:1742-1753)进行攻击。(A)KaplanMeier曲线描述了存活率。当比较YAM-HA+cH6/1组和YAM-HA+BSA群(p＝.06)时，存活率的不同获得了统计学上的显著性。(B)接种YAM-HA的动物和用cH6/1免疫的动物中的存活长度比用BSA免疫的动物(p＝0.037)以及未感染和WTYAM/BSA对照(p<0.001)平均更长。(C)ELISA板用cH5/1N1病毒包被以评价通过免疫接种引发的茎域反应性程度。针对最大体重减轻％用1:50血清稀释进行了标绘。确定有一个值是异常值并从分析中删除。对于线性回归，R2＝0.56且p＝.02。
图30显示用cHA免疫接种引发茎域-特异性免疫力，其介导针对H1N1病毒攻击的保护。(A-F)用编码cH9/1的DNA对动物进行初免并随后用cH6/1进行免疫接种并用cH5/1可溶性蛋白(n＝10)或BSA(n＝5)进行加强，而阳性对照小鼠肌肉内接受灭活病毒(n＝5)。(A)用FM1病毒免疫接种和攻击动物；每天对小鼠称重并将体重减轻随时间的变化显示为初始重量的变化百分比。(B)描述(A)中被攻击的小鼠存活的图。(C)用pH1N1病毒免疫接种和攻击动物；每天对小鼠称重并将体重减轻随时间的变化显示为初始重量的变化百分比。(D)描述(C)中被攻击的小鼠存活的图。(E)用PR8病毒免疫接种和攻击动物；每天对小鼠称重并将体重减轻随时间的变化显示为初始重量的变化百分比。(F)描述(E)中被攻击的小鼠存活的图。(G)如上面A-F和下面H-I所述免疫接种的动物并用5LD50的A/FM/1/1947(A、B)、10LD50的A/荷兰/602/2009(C、D)或5LD50的A/PR/8/1934(E、F、H、I)攻击的动物的血清对H1HA的反应性。(H)动物被如上A-F(方块，n＝4)所述进行免疫接种或为未感染免疫(三角，n＝3)，而阳性对照小鼠肌肉内接受灭活PR8病毒(X标记，n＝5)。用PR8病毒攻击前耗尽CD8T细胞。每天对小鼠称重并将体重减轻随时间的变化显示为初始重量的变化百分比。(I)描述(H)中被攻击的小鼠存活的图。(J)如A-F的描述对动物免疫接种。纯化总IgG用于基于H2的假型颗粒进入抑制分析。抑制百分比被评价为与对照相比荧光素酶表达的降低。Fab片段CR6261被用作阳性对照。
图31.野生型HA和表达构建体的图解。(A)未裂解的全长流感病毒血凝素。信号肽是最左边的组分，HA胞外域是中间组分和跨膜-和膜内域是最右边的组分。(B)具有三聚域的表达构建体。跨膜-和膜内域在位点V503(H3编号)用凝血酶裂解位点(左起第三组分)、T4三聚域(左起第四组分)和6组氨酸标签(6xhis标签，左起第五组分)交换。(C)无三聚域的表达构建体。跨膜-和膜内域分别在氨基酸位点509(H1、H2和H5)或508(H3)(H3编号)用6组氨酸标签(6xhis标签，最右边的组分)交换。
图32.三聚域的引入影响重组HA中寡聚物的稳定性和形成。(A)通过还原性、变性SDS-PAGE进行的具有和不具有三聚域的重组HA的分析。与三聚域一起表达(+)的重组HA显示了比不与三聚域一起表达(-)的HA更高的稳定性。未裂解的HA(HA0)和裂解产物(HA1/降解产物；HA2)用箭头标出。(B)交联HA的还原性、变性SDS-PAGE。不同种类的HA在斑点(blot)中标出。用H表示高分子多聚体，T表示三聚体，D表示二聚体，M表示单体。(C)左图(方块1-4)：来自用抗-六组氨酸-标签抗体探测的B的还原的、变性的和交联的第1组HA的蛋白质印迹分析。右图(最右边的方块)：SDS-PAGE上分析的具有BS3的交联对照(IgG)。不同种类(全抗体、重链、轻链)由箭头标出。在每个图左侧标出了标记谱带的分子量。
图33.茎域-反应性抗体与重组PR8(H1)和Cal09(H1)HA的结合。(A)茎域-反应性抗体C179、CR6261和6F12和头-反应性抗体PY102和PR8抗血清与无(w/oT4三聚域，三角线)或有(w/T4三聚域，方块线)三聚域的重组可溶性PR8HA的结合。(B)茎域-反应性抗体C179、CR6261和6F12和头-反应性抗体7B2和Cal09抗血清与无(w/oT4三聚域，三角线)或有(w/T4三聚域，方块线)三聚域的重组可溶性Cal09HA的结合。
图34.茎域-反应性抗体与重组JAP57(H2)和VN04(H5)HA的结合。(A)茎域-反应性抗体C179和CR6261和头-反应性抗体8F8和H2抗血清与无(w/oT4三聚域，三角线)或有(w/T4三聚域，方块线)三聚域的重组可溶性JAP57HA的结合。(B)茎域-反应性抗体C179和CR6261和头-反应性抗体mAb#8和H5抗血清与无(w/oT4三聚域，三角线)或有(w/T4三聚域，方块线)三聚域的重组可溶性VN04HA的结合。
图35.茎域-反应性抗体与第2组HA的结合。(A)茎域-反应性抗体12D1和CR8020和头-反应性抗体XY102和H3抗血清与无(w/oT4三聚域，三角线)或有(w/T4三聚域，方块线)三聚域的重组可溶性HK68HA的结合。(B)茎域-反应性抗体12D1和CR8020和H3抗血清与无(w/oT4三聚域，三角线)或有(w/T4三聚域，方块线)三聚域的重组可溶性Wisc05HA的结合。
图36描述了包含乙型流感病毒(B/佛罗里达/4/2006)的干域和H5亚型甲型流感病毒(A/越南/1203/2004)的球状头域的一种示例性的嵌合流感病毒血凝素多肽(SEQIDNO：21)。
图37显示基于HA茎域的免疫接种策略提供了针对不同H3N2病毒攻击的广泛保护。(A)免疫接种策略的图示(显示了每种抗原的单体形式)。(B-E)用编码cH4/3HA的质粒DNA免疫接种动物，并随后用重组可溶性cH5/3加强，之后是cH7/3蛋白加强(灰三角，尖头朝下；n＝9或10只动物)。阳性-对照动物接受包含匹配的攻击毒株的灭活疫苗(灰圆圈；n＝5只动物)。仅初免的动物(灰三角，尖头朝上；n＝5只动物)接受DNA初免，继而接受两次无关蛋白加强。未感染动物(黑方块；n＝5只动物)被用作针对攻击的额外对照。(B)用Phil82(H3N2)病毒攻击下的体重减轻曲线。(C)Phil82攻击下的Kaplan-Meier存活曲线。(D)X-31(H3N2)病毒攻击下观察到的发病率。(E)X-31(H3N2)攻击后的存活曲线。对于两种攻击实验而言免疫接种(cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3)的存活率都比对照(cH4/3DNA-BSA-BSA)组高度显著(P分别＝0.0008和0.0001)。(F和G)肺滴定实验以进一步检测疫苗在小鼠模型中针对不致命病毒的保护宽度。用5X104PFU的H3N2变体(F)或1X105PFU的人H3N2A/怀俄明/03/03(G)感染免疫接种的动物(BcH7/3-cH5/3-cH4/3)和对照动物(Bwt-BSA-BSA)。感染后第3天，收获两组动物的肺并均质化，并检测了50％组织培养感染剂量(TCID50)。
图38显示了用cHA构建体免疫接种能够加强茎域-反应性抗体的先在滴度至保护水平。(A-G)为了模拟人群中存在的对茎域的先存免疫力，将动物亚致命感染表达cH7/3HA的重组乙型流感病毒。然后，用重组可溶性cH5/3(或全长H3HA用于cH5/3N1-攻击的动物)并随后用cH4/3蛋白(暗灰三角，尖头朝下；n＝10动物)对其进行加强。阳性-对照动物接受含有匹配攻击毒株的灭活疫苗(暗灰圆圈；n＝5只动物)。仅初免的动物(暗灰三角，尖头朝上；n＝5只动物)接受重组乙型流感初免和随后的两次无关蛋白加强。额外的对照组感染野生型乙型流感病毒并随后接受两次无关蛋白加强(浅灰三角，尖头朝下；n＝5)或是未感染的(黑方块；n＝5)。(B-D)病毒攻击后的体重减轻曲线。(B)作为代替攻击毒株的表达来自最近的人H3N2分离物的HA茎域的小鼠-病原性cH5/3N1病毒被用于检测针对同时期茎域的效力，因为现代人H3N2分离物在小鼠中并非病原性的。X-31(H3N2；来自A/香港/1/68的HA和NA)(C)和Phil82(H3N2)(D)病毒感染下的体重减轻；(E)A/cH5/3N1攻击后的Kaplan-Meier存活曲线；(F)Phil82(H3N2)攻击后的存活曲线；(G)X-31(H3N2)攻击后的存活曲线。统计学分析显示了与BcH7/3-cH5/3-cH4/3和BcH7/3-BSA-BSA组相比时对所有攻击的高显著性(P＝0.082、P<0.0001和P<0.0001)。
图39显示所引发的抗-茎域应答针对多种H3N2毒株是交叉反应性的，包括最近的疫苗株。所引发的抗-茎域应答针对多种H3N2毒株是交叉反应性的，包括最近的疫苗株。(A-E)从cHA构建体(暗灰三角，尖头朝下，cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3)免疫接种的动物、仅初免的动物(暗灰三角，尖头朝上)或未感染动物(黑方块)收集的血清对Phil82(H3N2，全病毒)(A)、X-31病毒(H3N2；表达A/香港/1/68病毒的HA和NA)(B)、H3N8病毒(C)、当前的流感疫苗株Vic11(H3N2，病毒)(D)或佩斯09蛋白(H3)(E)的ELISA反应性。(F-H)从cHA构建体免疫接种的动物(暗灰三角，尖头朝下，B/cH7/3病毒-cH5/3蛋白-cH4/3蛋白)、仅初免的动物(暗灰三角，尖头朝上)、感染野生型乙型流感病毒并随后接受两次BSA加强的对照动物(浅灰三角，尖头朝下)或未感染动物(黑方块)收集的血清对Vic11H3N2(F)或Phil82H3N2(G)或X-31H3N2(H)病毒的ELISA反应性。
图40显示由cHA免疫接种策略引发的抗-H3HA茎域抗体的宽度延伸至第2组HA的其它成员，包括最近的中国H7N9病毒。(A)修改图37中显示的免疫接种流程以确保抗-H7球状-头域抗体在本系列实验中观察到的效果中不被涉及。使动物接受相同的初免(编码cH4/3HA的DNA)和第一次加强(cH5/3蛋白)，但是第二次加强被替换为H3蛋白(cH4/3DNA-cH5/3-H3；灰三角，尖头朝上，n＝10只动物)。阳性-对照动物接受灭活RheaH7病毒疫苗(灰圆圈，n＝5)。仅初免的动物(灰三角，尖头朝上，n＝5只动物)接受DNA初免之后两次无关蛋白加强。未感染动物(黑方块，n＝5只动物)被用作额外对照。(B)RheaH7(H7N1)病毒攻击下的体重减轻曲线。(C)Kaplan-Meier存活曲线。疫苗对死亡数提供了良好保护(P＝0.0088，cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3相对于对照cH4/3DNA-BSA-BSA)。(D、E)来自免疫接种的动物(灰三角，尖头朝下，cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3)、对照动物(灰三角，尖头朝上，cH4/3DNA-BSA-BSA)或未感染小鼠(黑方块)的血清对RheaH7病毒(D)或由近期的上海13H7N9(E)病毒表达的HA蛋白的ELISA反应性。(F)使接受疫苗(BcH7/3-cH5/3-cH4/3)和对照(Bwt-BSA-BSA)的小鼠感染1X105PFU的H10N7病毒，在感染后第3天检测到免疫接种的小鼠肺部病毒TCID50降低20倍。(G)从免疫接种cH4/3DNA-cH5/3-H3的小鼠收集的血清识别多种第2组HA蛋白。用编码各自HA的质粒转染MDCK细胞并随后用0.5％多聚甲醛固定16h。通过免疫荧光测定了接受疫苗的小鼠血清的反应性。从未感染动物收集的血清被用作阴性对照。小鼠(FBE9[未发表，内部产生])和人类(FI6)(Corti等人，2011，Science333:850-856.)单克隆抗-茎域抗体被用作阳性对照。
图41显示在体内和体外嵌合HA免疫接种引发的多克隆应答指向茎域并中和病毒感染。(A)针对第1组HA蛋白(H1)的ELISA显示由cHA疫苗(暗灰三角，尖头朝下，B/cH7/3-cH5/3-cH4/3)引发的交叉反应性应答不指向HA蛋白受体结合位点的保守部分。(B)来自用cHA构建体免疫接种的动物(暗灰三角，尖头朝下，B/cH7/3-cH5/3蛋白-cH4/3蛋白)、仅初免的动物(浅灰三角，尖头朝上，B/cH7/3-无关蛋白-无关蛋白)、载体对照(浅灰三角，尖头朝下，Bwt-无关蛋白-无关蛋白)和未感染动物(黑方块)的鼻腔洗液的ELISA反应性。(C)免疫接种的(B/cH7/3病毒-cH5/3蛋白-cH4/3蛋白)、未感染的、仅初免的(B/cH7/3病毒-BSA-BSA)和载体对照(Bwt病毒-BSA-BSA)的动物血清中的抗体同种型。(D)来自cHA-免疫接种的动物(暗灰三角，尖头朝下，B/cH7/3-cH5/3-cH4/3)、载体对照(浅灰三角，尖头朝下，Bwt-无关蛋白-无关蛋白)和未感染动物(黑方块)的血清的Vic11(H3)假型颗粒中和分析。X轴上显示了倒数血清稀释。H3茎域-反应性单克隆抗体(12D1)被用作阳性对照(灰圆圈)，初始浓度为123μg/ml。(E)来自被免疫接种的动物(暗灰三角，尖头朝下，BcH7/3-cH5/3-cH4/3，n＝5只动物)、载体对照(浅灰三角，尖头朝下，Bwt-BSA-BSA，n＝5只动物)、未感染动物(黑方块，n＝5只动物)和阳性-对照动物(接受灭活Phil82病毒疫苗，n＝5只动物)的血清的被动转移攻击实验(Phil82H3N2病毒)。显示了Kaplan-Meier存活曲线(对BcH7/3-cH5/3-cH4/3相比Bwt-BSA-BSA组P<0.026)。
图42显示了选择的第2组流感病毒血凝素成员的种系发生，描述了由疫苗引发的应答宽度。蛋白序列从GenBank下载，使用Mega5.1版中的ClustalW算法进行多重比对。使用FigTree软件和邻接方法构建系统树。比例尺表示5％的氨基酸变化。阳性测试的cHA-免疫接种的小鼠对各毒株的交叉保护/交叉反应性作为插入在毒株名称后标出(免疫荧光[IF]，攻击，ELISA和肺部滴度)。未标出的毒株名称没有测试。
图43显示了用H3基于茎域的cHA免疫接种保护小鼠免受H7N9病毒的攻击。(A)免疫接种方案的图示。结构基于蛋白数据库结构#1RU7。(B-G)中的小鼠接受编码cH4/3蛋白的DNA初免(H4头组合H3茎域)并随后用cH5/3(H5头在H3茎域上部)和全长H3蛋白加强。最后一次免疫后4周用H7N9病毒攻击动物。(B-D)显示了体重减轻曲线，(E-G)显示了存活曲线。(C和D)中的虚线显示了(B)中显示的'PICi.n.+i.m.'组的最高平均体重减轻(第7天)。(B)和E(PICi.n.+i.m.)中显示的小鼠随后用cH4/3和cH5/3蛋白通过滴鼻和肌肉内在作为佐剂的polyI:C的存在下进行加强。(C)和(F)中的动物接受相同的蛋白作为加强但是仅通过肌肉内接受免疫(PICi.m.)。(D)和(G)中的小鼠仅用水包油佐剂进行肌肉内免疫(OIWi.m.)。对照组的动物接受BSA和各佐剂并通过各途径接受BSA。用灭活的匹配攻击病毒肌肉内免疫接种阳性对照动物(相同的组与所有三个实验条件进行比较)。
图44描述了水包油(OIW)佐剂的制备和特征。(A)OIW佐剂制备流程。OIW乳液以20-40mL的规模制备。将Span-85溶于角鲨烯，聚山梨醇酯80溶于去离子水并随后混合柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液。组合油和水相级分并通过漩涡混入粗乳液，其随后在12,000psi通过LV1微射流机(Microfluidics，Westwood，MA)。收集洗脱液并再次通过，共5次通过微射流机，以产生稳定和均质的乳液。最后一次通过用0.22μm滤膜过滤并填充至无菌玻璃瓶中。(B)通过在MalvernNano3ZS上进行动态光散射确定微射流制备的OIW佐剂的颗粒大小。所显示的大小是来自2个独立制备的批次的Z均粒径。这些制备物被认为是单形的，因为在最后通过微射流机和无菌过滤后的多分散性的范围为8-11％。
图45表明用H3基于茎域的cHA的免疫接种在小鼠中诱导了针对H7血凝素的高抗体滴度。(A)cHA免疫接种的小鼠针对H7(A/上海/1/13)HA的IgG末端滴度。使用不成对t检验计算了单侧p值。(B)通过不同途径和用不同佐剂免疫接种的小鼠的血清中针对H7HA的免疫球蛋白同种型分布。该分析在1:200稀释度下进行。
5.发明详述
在一个方面，本文提供了诱导针对流感病毒保守HA干域的交叉保护性免疫应答的嵌合流感血凝素(HA)多肽。本文提供的嵌合流感HA多肽包含一个稳定的HA干域和一个与该干域异源的球状HA头域(即该头域和干域源自流感病毒的不同毒株和/或亚型)。
在另一方面，本文提供了包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的组合物(例如，包含本文描述的可溶性嵌合流感血凝素多肽的组合物，包含本文描述的嵌合流感血凝素多肽的病毒，包含工程化改造编码本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒，包含本文描述的嵌合流感血凝素多肽的表达载体，包含工程化改造编码本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组的表达载体，编码本文描述的嵌合流感血凝素多肽的核酸，等等)。
在另一方面，本文提供了包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的疫苗制剂。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含本文描述的嵌合流感血凝素多肽之一的单价疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含两种本文描述的嵌合流感血凝素多肽(即，两种不同的嵌合流感血凝素多肽)的二价疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含三种本文描述的嵌合流感血凝素多肽(即，三种不同的嵌合流感血凝素多肽)的三价疫苗。本文提供的疫苗制剂可以包括，例如，包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的亚单位疫苗(例如，包含嵌合流感血凝素多肽的组合物，例如，可溶性嵌合流感血凝素多肽)；表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的活流感病毒(例如，减毒活流感病毒)；包含编码一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组的活流感病毒(例如，减毒活流感病毒)；表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的灭活流感病毒；包含编码一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组的灭活流感病毒；包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的病毒/病毒样颗粒(“VLP”)；裂解病毒疫苗，其中所述病毒表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽和/或包含编码一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的基因组；表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的病毒表达载体(例如，非流感病毒表达载体)；和表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的细菌表达载体。
本文描述的疫苗制剂能够针对嵌合流感血凝素多肽HA干域引发高潜力和广泛中和性的抗体。该“通用性”疫苗可被用于诱导和/或增强跨流感病毒亚型的交叉保护性免疫应答。
在另一方面，本文提供了针对流感病毒疾病或感染免疫对象的方法，包括对对象施用含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的组合物。
在另一方面，本文提供了包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的疫苗制剂的试剂盒。本文提供的试剂盒可进一步包含一种或多种额外组分，例如，特异性结合试剂盒中提供的一种或多种嵌合流感血凝素(HA)多肽的抗体。
5.1嵌合流感病毒血凝素多肽
本文提供了包含或包括流感病毒血凝素球状头域多肽和流感病毒血凝素干域多肽的嵌合流感病毒血凝素多肽，其中所述流感病毒血凝素头域多肽与所述流感病毒血凝素干域多肽是异源的(例如，流感病毒血凝素球状头域多肽和流感病毒血凝素干域多肽源自不同流感病毒血凝素亚型)。嵌合流感病毒血凝素多肽的干域和球状头域可基于甲型流感病毒血凝素干域和球状头域(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14，15、H16、H17和H18)和/或乙型流感病毒血凝素干域和球状头域。
全长流感血凝素通常包含HA1域和HA2域。干域由两个HA1域片段和大部分或全部HA2域形成。两个HA1域片段在初级序列中由球状头域分隔开(参见，例如，图1中用Ap和Aq指出的残基之间的氨基酸残基)。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽保留了该结构。也就是说，在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽包含稳定的干结构，其由HA1域和HA2域和将两个HA1域片段分开(在初级序列中)的球状头域组成，其中所述球状头域相对于由HA1域和HA2域的其它片段形成的干域而言是异源的。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H1亚型流感病毒的血凝素干域和(ii)来自H5亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH5/1嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/1嵌合流感血凝素多肽的干域是A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)HA的干域(或A/加利福尼亚/4/2009样流感病毒HA的干域)且cH5/1嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H3亚型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H5亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH5/3嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在一个具体实施方式中，本文提供的cH5/3嵌合流感血凝素多肽不包含A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽不包含A/佩斯/16/2009(H3)HA的干域。
在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH5/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H3亚型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H7亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH7/3嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/维多利亚/361/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)的干域HA且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/印第安纳/10/2011(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/2009(H3N2)HA的干域且cH7/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在一个具体实施方式中，本文提供的cH7/3嵌合流感血凝素多肽不包含A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/3嵌合流感血凝素多肽不包含A/佩斯/16/2009(H3)HA的干域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自乙型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H5亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH5/B嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/越南/1203/2004(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/印度尼西亚/5/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/安徽/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH5/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH5/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)HA的球状头域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自乙型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H7亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH7/B嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/荷兰/219/03(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/504/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/加拿大/444/04(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cH7/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cH7/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)HA的球状头域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自乙型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自不同乙型流感病毒株的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cB/B嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/马来西亚/2506/2004HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒)的球状头域。
在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/佛罗里达/4/2006HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒)的球状头域。
在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/威斯康星/1/2010HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒)的球状头域。
在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/Lee/1940HA的球状头域。在另一具体实施方式中，cB/B嵌合流感血凝素多肽的干域是B/布里斯班/60/2008HA的干域且cB/B嵌合流感血凝素多肽的球状头域是B/海豹/荷兰/1/99HA(或B/海豹/荷兰/1/99样流感病毒)的球状头域。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含(i)来自H3亚型流感病毒的血凝素的干域和(ii)来自H4亚型流感病毒的血凝素的球状头域(本文中有时称为“cH4/3嵌合流感血凝素多肽”)。在一个具体实施方式中，cH4/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/09HA的干域(或A/佩斯/16/09样流感病毒HA的干域)。在另一具体实施方式中，cH4/3嵌合流感血凝素多肽的干域是A/佩斯/16/09HA的干域(或A/佩斯/16/09样流感病毒HA的干域)且cH4/3嵌合流感血凝素多肽的球状头域是A/鸭/捷克/56的球状头域(或A/鸭/捷克/56样流感病毒HA的球状头域)。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽是单体的。在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽是多聚体的。在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽是三聚体的。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含信号肽。通常，信号肽在多肽表达和翻译过程中或之后被裂解以产生成熟嵌合流感病毒血凝素多肽。在某些实施方式中，本文还提供了缺少信号肽的成熟嵌合流感病毒血凝素多肽。在本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含信号肽的实施方式中，信号肽可以基于任何本领域技术人员已知的流感病毒信号肽。在某些实施方式中，信号肽基于甲型流感信号肽。在某些实施方式中，信号肽基于选择以下组的甲型流感血凝素的信号肽：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18(参见，例如，Tong等人，2013，PLoSPath，9(10)：e1003657，Doi:10.1371/journal.ppat.1003657中甲型流感病毒血凝素H18的例子)。在某些实施方式中，信号肽可以是任何本领域技术人员认为有用的信号肽。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含腔域(luminaldomain)。在本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含腔域的实施方式中，腔域可以基于本领域技术人员已知的任何流感腔域。在某些实施方式中，腔域基于甲型流感腔域。在某些实施方式中，腔域基于选自以下组的甲型流感血凝素的腔域：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18。在某些实施方式中，腔域可以是本领域技术人员认为有用的任何腔域。在某些实施方式中，腔域来自与干域相同的血凝素。在某些实施方式中，腔域来自干域HA2亚单位的流感病毒株或亚型。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含跨膜域。在本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含跨膜域的实施方式中，跨膜域可以基于本领域技术人员已知的任何流感跨膜域。在某些实施方式中，跨膜域基于甲型流感跨膜域。在某些实施方式中，跨膜域基于选自以下组的甲型流感血凝素的跨膜域：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18。在某些实施方式中，跨膜域可以是本领域技术人员认为有用的任何跨膜域。在某些实施方式中，跨膜域来自与干域相同的血凝素。在某些实施方式中，跨膜域来自干域HA2亚单位的流感病毒株或亚型。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含胞质域。在本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽包含胞质域的实施方式中，胞质域可以基于本领域技术人员已知的任何流感胞质域。在某些实施方式中，胞质域基于甲型流感胞质域。在某些实施方式中，胞质域基于选自以下组的甲型流感血凝素的胞质域：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18。在某些实施方式中，胞质域可以是本领域技术人员认为有用的任何胞质域。在某些实施方式中，胞质域来自与干域相同的血凝素。在某些实施方式中，胞质域来自干域HA2亚单位的流感病毒株或亚型。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽进一步包含一种或多种多肽域。有用的多肽域包括利于纯化、折叠和裂解多肽一部分的域。例如，His标签(His-His-His-His-His-His，SEQIDNO:17)、FLAG表位或其它纯化标签可有利于本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽的纯化。在一些实施方式中，His标签具有序列(His)n，其中n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。来自噬菌体T4fibritin的foldon或三聚域可以有利于本文提供的多肽的三聚化。在一些实施方式中，三聚域包含野生型GCN4pII三聚七重复单元或修饰的GCN4pII三聚七重复单元，其允许形成三聚或四聚的卷曲螺旋。参见，例如，Weldon等人，2010，PLoSONE5(9)：e12466。foldon域可以具有本领域技术人员已知的任何foldon序列(参见，例如，Papanikolopoulou等人，2004，J.Biol.Chem.279(10):8991-8998，其内容在此全文引入作为参考)。例子包括GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQIDNO:18)。foldon域可用于方便本文提供的可溶性多肽三聚化。裂解位点可用于方便多肽一部分裂解，例如纯化标签或foldon域或两者的裂解。有用的裂解位点包括凝血酶裂解位点，例如具有序列LVPRGSP(SEQIDNO:19)的位点。在某些实施方式中，裂解位点是由烟草蚀纹病毒酶(TEV)蛋白酶识别的裂解位点(例如，氨基酸序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)(SEQIDNO:20))。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素多肽是可溶的多肽。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的流感血凝素干域多肽保留了在图1的流感血凝素多肽中识别为Ap和Aq的半胱氨酸残基，即，在图1的流感血凝素多肽中识别为Ap和Aq的半胱氨酸残基被保留在本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽中。从而，在某些实施方式中，在本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的初级序列中：(i)流感血凝素干域多肽的N端片段终止于图1中识别为Ap的半胱氨酸残基，(ii)流感血凝素干域多肽的C端片段始于图1中识别为Aq的半胱氨酸残基；和(iii)流感血凝素头域多肽(与流感血凝素干域多肽异源)位于流感血凝素干域多肽N端和C端片段之间。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1N端干片段并不准确终止于Ap(例如，H3血凝素的HA1亚单位的Cys52)，而是终止于与Ap在序列和结构上邻近的残基。例如，在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1N端干片段终止于Ap-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1N端干片段终止于范围Ap-1-Ap-3、Ap-3-Ap-5、Ap-5-Ap-8、Ap-8-Ap-10。例如，终止于Ap-10的HA1N端干片段将终止于H3血凝素的Lys42。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1N端干片段终止于Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、Ap+10。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1N端干片段终止于范围Ap+1-Ap+5、Ap+5-Ap+10。HA1N端干片段的末端应当被选择与HA1C端干片段末端和流感血凝素头域多肽相连从而得到的嵌合流感病毒血凝素多肽能够形成与野生型流感血凝素相似的三维结构。在这些实施方式中，流感血凝素头域多肽(与流感血凝素干域多肽异源)在初级序列上位于流感血凝素干域多肽的N端和C端片段之间。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1C端干片段并不准确起始于Aq(例如，H3血凝素的HA1亚单位的Cys277)，而是在序列和结构上邻近Aq的残基。例如，在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1C端干片段起始于约Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq-5、Aq-6、Aq-7、Aq-8、Aq-9、Aq-10。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1C端干片段起始于范围Aq-1-Aq-5、Aq-5-Aq-10。例如，终止于Aq-10的HA1C端干片段将起始于H3血凝素的异亮氨酸262。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1C端干片段起始于Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、Aq+10。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1C端干片段起始于范围Aq+1-Aq+3、Aq+3-Aq+5、Aq+5-Aq+8、Aq+8-Aq+10。HA1N端干片段的末端应当被选择与HA1C端干片段起始点和流感血凝素头域多肽相连从而得到的嵌合流感病毒血凝素多肽能够形成与野生型流感血凝素相似的三维结构。在这些实施方式中，流感血凝素头域多肽(与流感血凝素干域多肽异源)在初级序列上位于流感血凝素干域多肽的N端和C端片段之间。
在一个实施例中，本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1N端干片段可以在血凝素氨基酸位点45-48(使用H3编号)的任一位点处终止，嵌合流感病毒血凝素多肽的HA1C端干片段可以在血凝素氨基酸位点282-287(使用H3编号)的任一位点处起始；且异源的头域可以在任一氨基酸位点46-49起始且在任一氨基酸位点284-289终止(使用H3编号)。
在某些实施方式中，当本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的干域源于乙型流感病毒时，HA1N端干片段可终止于，例如，HA(以初级氨基酸序列计)的氨基酸35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50且HA1C端干片段可起始于例如HA(以初级氨基酸序列计)的氨基酸280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299或300。从而嵌合流感病毒血凝素多肽的球状头域将被插入至乙型流感病毒干域的HA1N端干片段和HA1C端干片段之间。例如，在流感病毒B/香港/8/73(PDB:2RFT:GenBank:M10298.1)的HA中，HA1N端干片段始于氨基酸DRICT(SEQIDNO:22)，“D”是第1位，并终止于氨基酸位点42(以初级氨基酸序列计)；且HA1C端干片段始于氨基酸位点288(以初级氨基酸序列计)并继续至HA的C端终点。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽可被缀合至异源蛋白，例如，具有或不具有热休克蛋白的主要组织相容性复合物(MHC)(例如，Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90或Hsp100)。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽可被缀合至免疫调节分子，例如能靶向嵌合流感血凝素(HA)多肽的蛋白以免疫细胞例如B细胞(例如，C3d)或T细胞。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽可被缀合至刺激固有免疫系统的蛋白例如1型干扰素、α、β或γ干扰素、集落刺激因子例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配体(CD40L)和药物可诱导的CD40(iCD40)。
本领域技术人员将理解本文提供的嵌合流感病毒血凝素多肽可根据本领域技术人员已知的和认为适合的任何技术进行制备，包括本文描述的技术。在某些实施方式中，嵌合流感病毒血凝素多肽是分离的。
5.2编码嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的核酸
本文提供了编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的核酸。由于遗传密码的简并性，在此任何编码本文描述的嵌合流感血凝素的核酸均被涵盖在内。在某些实施方式中，使用对应于编码HA1N端干片段、HA1C端干片段、HA2域、腔域、跨膜域和/或胞质域的天然产生的流感病毒核酸或能够与之杂交的核酸来生产本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
本文还提供了能够与编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的核酸杂交的核酸。在某些实施方式中，本文提供了能够与编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸片段杂交的核酸。在其它实施方式中，本文提供了能够与编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的全长核酸杂交的核酸核酸。核酸杂交条件的一般参数描述于Sambrook等人，MolecularCloning-ALaboratoryManual(第二版)，第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)和Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，第2卷，CurrentProtocolsPublishing，NewYork(1994)。可以在高严谨条件、中严谨条件或低严谨条件下进行杂交。本领域技术人员将理解低、中和高严谨条件要视全部相互作用的多种因素而定，并还依赖于所采用的核酸。例如，高严谨条件可包括核酸解链温度5℃内的温度、低盐浓度(例如，低于250mM)和高共溶剂浓度(例如，1-20％的共溶剂，例如，DMSO)。另一方面，低严谨条件可包括低于核酸解链温度超过10℃的温度、高盐浓度(例如，大于1000mM)和不使用共溶剂。
在一些实施方式中，分离了编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸。在某些实施方式中，“分离的”核酸指与核酸的天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。换句话说，分离的核酸可包含与其在自然界无关的异源核酸。在其它实施方式中，“分离的”核酸，例如cDNA分子，在通过重组技术生产时可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。术语“基本上不含细胞材料”包括核酸的制备物，其中将核酸与其从中分离或重组表达的细胞的细胞组分进行分离。从而，基本上不含细胞材料的核酸包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的其它核酸的核酸制备物。术语“基本上不含培养基”包括其中培养基代表了少于约50％、20％、10％或5％的制备物体积的核酸制备物。术语“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括其中将核酸从核酸合成中涉及的化学前体或其它化学物质分离的制备物。在具体的实施方式中，该核酸制备物除目标核酸外具有少于约50％、30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。
此外，本文提供了编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的个体组分的核酸，例如，本文提供了编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域、HA1N端干片段、HA1C端干片段和/或HA2域的核酸。编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的组分的核酸可使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术进行组装以产生本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
5.3嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的表达
本文提供了载体，包括表达载体，其含有编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)。在一个具体实施方式中，该载体是能够引导编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸表达的表达载体。表达载体的非限制性例子包括但不限于质粒和病毒载体，例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和杆状病毒。表达载体还可以不受限制地包括转基因动物和非哺乳动物细胞/生物体，例如，被工程化改造以进行哺乳动物N-连接糖基化的哺乳动物细胞/生物体。
在一些实施方式中，本文提供了编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的组分的表达载体。该载体可被用于在一种或多种宿主细胞中表达所述组分且所述组分可使用本领域技术人员已知的技术进行分离并与接头缀合。
表达载体以适于核酸在宿主细胞中表达的形式含有编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸。在一个具体实施方式中，表达载体包括一种或多种基于待使用表达的宿主细胞选择的调控序列，其可操作地连接至待表达的核酸。在表达载体中，“可操作地连接”意为表示目标核酸以允许核酸表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)的方式被连接至调控序列。调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列包括引导核酸在多种宿主细胞中组成型表达的那些、只引导核酸在某些宿主细胞中表达的那些(例如，组织特异性调控序列)和引导核酸在特定试剂刺激下进行表达的那些(例如，可诱导调控序列)。本领域技术人员将会认可表达载体的设计可基于一些因素，例如待转化宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等等。术语“宿主细胞”意为包括用核酸转化或转染的特定对象细胞以及这种细胞的后代或潜在的后代。由于在传代或核酸整合入宿主细胞基因组的过程中可能发生突变或环境影响，这种细胞的后代可以与转化或转染核酸的亲代细胞不相同。
表达载体可被涉及用于本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的表达，其使用原核(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体，参见，例如，Treanor等人，2007，JAMA，297(14):1577-1582，在此全文引入作为参考)，酵母细胞，植物细胞，藻类或哺乳动物细胞)。酵母宿主细胞的例子包括但不限于裂殖酵母(S.pombe)、酿酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母(P.pastoris)以及下文的例子。哺乳动物宿主细胞的例子包括但不限于CrucellPer.C6细胞、Vero细胞、CHO细胞、VERY细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或WI38细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是骨髓瘤细胞，例如，NS0细胞、45.6TG1.7细胞、AF-2克隆9B5细胞、AF-2克隆9B5细胞、J558L细胞、MOPC315细胞、MPC-11细胞、NCI-H929细胞、NP细胞、NS0/1细胞、P3NS1Ag4细胞、P3/NS1/1-Ag4-1细胞、P3U1细胞、P3X63Ag8细胞、P3X63Ag8.653细胞、P3X63Ag8U.1细胞、RPMI8226细胞、Sp20-Ag14细胞、U266B1细胞、X63AG8.653细胞、Y3.Ag.1.2.3细胞和YO细胞。昆虫细胞的非限制性例子包括Sf9、Sf21、Ao/Tn38、HighFive、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和家蚕(Bombyxmori)。在一个具体实施方式中，哺乳动物细胞培养系统(例如中国仓鼠卵巢或幼仓鼠肾细胞)被用于表达嵌合流感血凝素(HA)多肽。在另一实施方式中，植物细胞培养系统被用于表达嵌合流感血凝素(HA)多肽。对于植物细胞和利用植物细胞培养系统生产蛋白的方法，参见，例如，美国专利号7,504,560；6,770,799；6,551,820；6,136,320；6,034,298；5,914,935；5,612,487；和5,484,719和美国专利申请公开号2009/0208477、2009/0082548、2009/0053762、2008/0038232、2007/0275014和2006/0204487。在具体的实施方式中，植物细胞培养系统不用于表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在某些实施方式中，植物(例如，烟草属(Nicotiana)植物)可被工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)。在具体的实施方式中，使用本领域已知方法通过农杆菌渗入过程对植物工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。例如，编码目标基因如编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸被引入农杆菌(Agrobacterium)菌株中。然后该菌株在液体培养基中生长，对得到的细菌进行洗涤并悬浮于缓冲溶液中。然后将植物暴露于(例如，通过注射或浸入)含有编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的农杆菌，从而农杆菌转化目标基因至一部分植物细胞。然后嵌合流感血凝素(HA)多肽被植物瞬时表达并使用本领域已知和本文描述的方法可进行分离。(对于特别的例子参见Shoji等人，2008，疫苗，26(23):2930-2934；和D’Aoust等人，2008，J.PlantBiotechnology，6(9):930-940)。在一个具体实施方式中，所述植物是烟草植物(例如，烟草(Nicotianatabacum))。在另一具体实施方式中，所述植物是烟草植物的相关植物(例如，本氏烟(Nicotianabenthamiana))。在另一具体实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽在大豆物种中表达。在另一具体实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽在玉米物种中表达。在另一具体实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽在稻类物种中表达。
在其它实施方式中，藻类(例如，莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii))可被工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽，例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(参见，例如，Rasala等人，2010，PlantBiotechnologyJournal(2010年3月7日在线出版))。
在某些实施方式中，用于表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的植物被工程化改造以表达N-糖基化系统的组分(例如，细菌或哺乳动物N-糖基化系统)，即，所述植物能够进行N-糖基化。
可被用于表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的植物细胞和利用植物细胞培养系统生产蛋白的方法描述于，例如，美国专利号5,929,304；7,504,560；6,770,799；6,551,820；6,136,320；6,034,298；5,914,935；5,612,487；和5,484,719，美国专利申请公开号2009/0208477、2009/0082548、2009/0053762、2008/0038232、2007/0275014和2006/0204487以及Shoji等人，2008，Vaccine，26(23):2930-2934和D’Aoust等人，2008，J.PlantBiotechnology，6(9):930-940(其在此全文引入作为参考)。
包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸的宿主细胞可进行分离，例如细胞在对象体外或与未转染/未转化的宿主细胞分离(即，分开)。在某些实施方式中，细胞被工程化改造以表达编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸。
表达载体可通过常规转化或转染技术被引入宿主细胞中。这些技术包括但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染和电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可发现于Sambrook等人，1989，MolecularCloning-ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，NewYork和其它实验室手册。在某些实施方式中，宿主细胞用含有编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸的表达载体进行瞬时转染。在其它实施方式中，宿主细胞用含有编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸的表达载体进行稳定转染。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是根据使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合入其基因组。为了鉴定和选择这些整合体，一般将编码可选择标记的核酸(例如，用于抗生素抗性)与目标核酸一起引入宿主细胞。可选择标记的例子包括那些赋予药物耐受性的，例如G418、潮霉素和氨甲喋呤。用引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择进行鉴定(例如，包括了可选择标记基因的细胞将会生存，而其它细胞会死亡)。
作为使用宿主细胞重组表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的替代品，含有编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸的表达载体可在体外使用例如T7启动子调控序列和T7聚合酶进行转录和翻译。在一个具体实施方式中，偶联的转录/翻译系统，例如Promega或包含转录和翻译必需组分的细胞裂解物或细胞提取物可被用于产生本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
一旦生产了本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽，其即可通过本领域已知的任何用于分离和纯化蛋白质的方法进行分离或纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和、特别是通过对特异性抗原或与抗原有关的“标签”的亲和力(例如，HIS标签、strep标签/strepII标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶标签、myc标签、HA标签)、通过蛋白A和色谱法(例如，体积柱层析、疏水作用层析(HIC)、反相色谱法、模拟移动床色谱法、体积排阻层析、整料层析、对流相互作用介质层析、凝集素层析))、离心、差异溶解度、超滤、沉淀或通过任何其它分离或纯化蛋白的标准技术。在具体的实施方式中，本文描述的分离/纯化的嵌合流感血凝素(HA)多肽是可溶的，例如，使用本领域技术人员已知的任何方法例如本文描述的方法使之可溶(参见，例如，第6.6.1.2节)。
本文提供了用于生产本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的方法。在一个实施方式中，该方法包括在合适的培养基中培养含有编码所述多肽的核酸的宿主细胞，从而生产该多肽。在一些实施方式中，该方法进一步包括从培养基或宿主细胞中分离多肽。
5.4流感病毒载体
在一个方面，本文提供了含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的流感病毒。在一个具体实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽被引入流感病毒的病毒粒子内。流感病毒可缀合至使病毒靶向特定细胞类型例如免疫细胞的部分。在一些实施方式中，流感病毒的病毒粒子除本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽之外还整合或表达异源多肽。所述异源多肽可以是具有免疫增强活性的多肽，或者使流感病毒靶向特定细胞类型的多肽，例如结合至特定细胞类型上的抗原的抗体或结合特定细胞类型上的特定受体的配体。
含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的流感病毒可通过使用本领域技术人员已知的技术在病毒粒子生产过程中反式(intrans)提供嵌合流感血凝素(HA)多肽进行生产，例如反向遗传学和无辅助质粒拯救(helper-freeplasmidrescue)。可选的，包含工程化改造以在易受病毒感染的细胞中表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的亲代流感病毒(其中血凝素功能反式提供)的复制将产生含有嵌合流感血凝素(HA)多肽的后代流感病毒。
在另一方面，本文提供了包含工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的基因组的流感病毒。在一个具体实施方式中，亲代流感病毒基因组被工程化改造以编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽，其被后代流感病毒表达。在另一具体实施方式中，亲代流感病毒基因组被工程化改造以编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽，其被表达并整合入后代流感病毒的病毒粒子。从而，由亲代流感病毒复制得到的后代流感病毒含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。亲代流感病毒的病毒粒子可能在其中整合了含有来自相同或不同流感病毒种类、亚型或毒株的干域或头域的嵌合流感血凝素(HA)多肽。可选的，亲代流感病毒的病毒粒子可能在其中整合了能够功能性替代一种或多种流感病毒血凝素多肽活性的部分(例如，流感病毒血凝素的受体结合和/或膜融合活性)。在某些实施方式中，流感病毒血凝素多肽的一种或多种活性由融合蛋白提供，所述融合蛋白包含(i)与流感病毒异源的多肽的胞外域融合至(ii)流感病毒血凝素多肽的跨膜域或跨膜域和胞质域。在一个具体实施方式中，亲代流感病毒的病毒粒子可能在其中整合了一种融合蛋白，包含(i)流感病毒以外的感染剂的受体结合/膜融合多肽胞外域融合至(ii)流感病毒血凝素的跨膜域或跨膜域和胞质域。关于提供流感病毒血凝素多肽的一种或多种活性的融合蛋白和经工程化改造表达该融合蛋白的流感病毒的生产方法的描述，参见，例如，2007年7月7日公开的国际专利申请公开号WO2007/064802和美国专利申请公开号2012/0122185；其在此分别全文引入作为参考。
在某些实施方式中，工程化改造以表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的流感病毒包含神经氨酸酶(NA)或其片段，其与嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域所源自的来源(例如，流感病毒株或亚型)相同。在某些实施方式中，工程化改造以表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的流感病毒包含神经氨酸酶(NA)或其片段，其与嵌合流感血凝素多肽的球状头域所源自的来源(例如，流感病毒株或亚型)相同，其中该球状头域与嵌合流感血凝素多肽HA1和/或HA2亚单位的干域是异源的。在某些实施方式中，工程化改造以表达一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素多肽的流感病毒包含神经氨酸酶(NA)或其片段，其与嵌合流感血凝素多肽HA干域所源自的来源(例如，流感病毒株或亚型)相同。
在一些实施方式中，亲代流感病毒的病毒粒子在其中整合了一种异源多肽。在某些实施方式中，亲代流感病毒基因组被工程化改造以编码异源多肽和嵌合流感血凝素(HA)多肽，其由后代流感病毒表达。在具体的实施方式中，嵌合流感血凝素(HA)多肽、异源多肽或两者被引入后代流感病毒的病毒粒子。
异源多肽可以是使流感病毒靶向特定细胞类型的多肽，例如结合至特定细胞类型上的抗原的抗体或结合特定细胞类型上的特定受体的配体。在一些实施方式中，靶向性多肽替代了病毒的靶向细胞识别功能。在一个具体实施方式中，异源多肽使流感病毒靶向该流感病毒天然感染的同一细胞类型。在其它具体实施方式中，异源多肽使后代流感病毒靶向免疫细胞，例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方式中，异源多肽识别并结合抗原提呈细胞的细胞特异性标志物，例如树突细胞(例如，如CD44)。在一个实施方式中，异源多肽是使病毒靶向树突细胞的DC-SIGN。在另一实施方式中，异源多肽是使病毒靶向免疫细胞的抗体(例如，单链抗体)，其可与来自领域多肽的跨膜域融合从而其被整合入流感病毒病毒粒子。在一些实施方式中，抗体是CD20抗体、CD34抗体或针对DEC-205的抗体。工程化改造病毒以表达具有靶向功能的多肽的技术是本领域已知的。参见，例如，Yang等人，2006，PNAS103：11479-11484和美国专利申请公开号20080019998，公开日2008年1月24日，和美国专利申请公开号20070020238，公开日2007年1月25日，其各自内容在此全文引入作为参考。
在另一实施方式中，异源多肽是病毒附着蛋白。其附着蛋白可被用于本方面的病毒的非限制性例子是选自以下组的病毒：拉沙热病毒、乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒(NDV)、反转录病毒如人免疫缺陷病毒、蜱传脑炎病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、甲病毒例如塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、和奥拉病毒(其包括表面糖蛋白如E1、E2和E3)、博尔纳病病毒、汉坦病毒、泡沫病毒和SARS-CoV病毒。
在一个实施方式中，可使用黄病毒表面糖蛋白，例如登革热病毒(DV)E蛋白。在一些实施方式中，使用了来自甲病毒科的Sindbis病毒糖蛋白(K.S.Wang,R.J.Kuhn,E.G.Strauss,S.Ou,J.H.Strauss,J.Virol.66,4992(1992))。在某些实施方式中，异源多肽源自NDVHN或F蛋白；人免疫缺陷病毒(HIV)gp160(或其产物，例如gp41或gp120)；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；疱疹病毒糖蛋白(例如，gD，gE)；或脊髓灰质炎病毒的VP1。
在另一实施方式中，异源多肽源自任何本领域已知的非病毒靶向系统。在某些实施方式中，使用了非病毒病原体蛋白例如胞内细菌或原生动物。在一些实施方式中，细菌多肽由例如衣原体、立克次氏体、Coxelia、李斯特菌、布鲁氏菌、或军团菌提供。在一些实施方式中，原生动物多肽由例如疟原虫种、利什曼原虫、弓形虫或克氏锥虫提供。其它示例性的靶向系统描述于Waehler等人，2007，“Engineeringtargetedviralvectorsforgenetherapy”，NatureReviewsGenetics8：573-587，其在此全文引入。
在某些实施方式中，流感病毒表达的异源多肽具有免疫激发(免疫刺激)活性。免疫激发多肽的非限制性例子包括但不限于刺激分子、细胞因子、趋化因子、抗体和其它试剂例如Flt-3配体。具有免疫激发活性的多肽的具体例子包括：1型干扰素、α、β或γ干扰素、集落刺激因子例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配体(CD40L)和药物可诱导的CD40(iCD40)(参见，例如，Hanks,B.A.等人，2005，NatMed11:130-137，其在此全文引入作为参考)。
由于甲型流感和乙型流感病毒基因组包括8个单链的、反义的片段(丙型流感病毒包括7个单链的、反义的片段)，亲代流感病毒基因组可重组片段和本领域技术人员已知的技术进行工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(及任何其它多肽，例如异源多肽)，例如反向遗传学和无辅助质粒拯救。在一个实施方式中，重组片段包含编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸以及正确复制、转录和包装vRNAs所必需的3’和5’整合信号(Fujii等人，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA100:2002-2007；Zheng等人，1996，Virology217:242-251，二者均在此全文引入作为参考)。在一个具体实施方式中，重组片段使用来自与亲代流感病毒不同或相同的类型、亚型或毒株流感病毒片段的3’和5’非编码和/或非翻译序列。在一些实施方式中，重组片段包含流感病毒血凝素多肽的3’非编码区域，流感病毒血凝素多肽的未翻译区域和流感病毒血凝素多肽的5’非编码区域。在具体的实施方式中，重组片段包含流感病毒HA片段的3’和5’非编码和/或非翻译序列，其与嵌合流感血凝素(HA)多肽的HA1N端干片段、HA1C端干片段、球状头域和/或HA2的种类、亚型或毒株是相同的种类、亚型或毒株。在某些实施方式中，编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的重组片段可替代亲代流感病毒的HA片段。在一些实施方式中，编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的重组片段可替代亲代流感病毒的NS1基因。在一些实施方式中，编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的重组片段可替代亲代流感病毒的NA基因。可被用于表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的示例性的流感病毒株包括AnnArbor/1/50、A/AnnArbor/6/60、A/波多黎各/8/34、A/南达科塔/6/2007、A/乌拉圭/716/2007、A/加利福尼亚/07/2009、A/佩斯/16/2009、A/布里斯班/59/2007、A/布里斯班/10/2007、A/伦宁格拉德/134/47/57、B/布里斯班/60/2008、B/山行县/1/88、A/巴拿马/2007/99、A/怀俄明/3/03和A/WSN/33。
在一些实施方式中，流感病毒血凝素基因片段编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在具体的实施方式中，流感病毒血凝素基因片段和至少一种其它流感病毒基因片段包含包装信号，其使得流感病毒血凝素基因片段和至少一种其它基因片段在重组流感病毒复制过程中一起分开(segregate)(参见，Gao&Palese2009，PNAS106:15891-15896；国际申请公开号WO11/014645；和美国专利申请公开号2012/0244183)。
在一些实施方式中，亲代流感病毒基因组可使用双顺反重组片段被工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。双顺反技术通过使用内核糖体进入位点(IRES)序列允许多个蛋白编码序列工程化为单一mRNA。IRES序列引导核糖体内部募集至RNA分子并允许以不依赖帽的方式的下游翻译。简而言之，一个蛋白的编码区域被插入第二蛋白的开放式阅读框(ORF)。该插入由IRES和正确表达和/或起作用所必需的任何未翻译信号序列侧面攻击(flanked)。该插入不能破坏第二蛋白的ORF、多聚腺苷酸化或转录启动子(参见，例如，García-Sastre等人，1994，J.Virol.68:6254-6261和García-Sastre等人，1994Dev.Biol.Stand.82:237-246，其各自在此全文引入作为参考)。还参见，例如，美国专利号6,887,699，美国专利号6,001,634，美国专利号5,854,037和美国专利号5,820,871，其在此分别全文引入作为参考。按照本发明可以使用本领域已知的或本文描述的任何IRES(例如，BiP基因的IRES，GenBank数据库登录号HUMGRP78的核苷酸372-592；或脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES，GenBank数据库登录号CQ867238.的核苷酸1430-2115)。从而，在某些实施方式中，亲代流感病毒被工程化改造以含有双顺反RNA片段，其表达嵌合流感血凝素(HA)多肽和另一多肽，例如由亲代流感病毒表达的基因。在一些实施方式中，亲代流感病毒基因是HA基因。在一些实施方式中，亲代流感病毒基因是NA基因。在一些实施方式中，亲代流感病毒基因是NS1基因。
本领域技术人员已知的技术可被用于产生含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的流感病毒和含有工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的流感病毒。例如，反向遗传学技术可被用于产生该流感病毒。简而言之，反向遗传学技术一般涉及含有负链的病毒RNA的非编码区域的合成重组病毒RNA的制备，其对于病毒聚合酶识别和产生成熟病毒粒子所需的包装信号是必需的。从重组DNA模板合成重组RNA并在体外与纯化的病毒聚合酶复合物重建以形成重组核糖核蛋白(RNP)，其可被用于转染细胞。如果在体外或体内合成RNA的转录过程中存在病毒聚合酶蛋白，则能获得更有效的转染。合成的重组RNP可被拯救(rescue)入感染性病毒颗粒。前述技术描述于1992年11月24日授权的美国专利号5,166,057；1998年12月29日授权的美国专利号5,854,037；1996年2月20日公开的欧洲专利公开EP0702085A1；美国专利申请系列号09/152,845；1997年4月3日公开的国际专利公开PCTWO97/12032；1996年11月7日公开的WO96/34625；欧洲专利公开EPA780475；1999年1月21日公开的WO99/02657；1998年11月26日公开的WO98/53078；1998年1月22日公开的WO98/02530；1999年4月1日公开的WO99/15672；1998年4月2日公开的WO98/13501；1997年2月20日公开的WO97/06270；和1997年6月25日公开的EPO780475A1，其各自在此全文引入作为参考。
可选的，无辅助(helper-free)质粒技术可被用于产生含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的流感病毒和含有工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的流感病毒。简而言之，使用PCR用包括独特的限制性位点的引物扩增病毒片段的全长cDNA，其允许将PCR产物插入质粒载体(Flandorfer等人，2003，J.Virol.77:9116-9123；Nakaya等人，2001，J.Virol.75:11868-11873；二者均在此全文引入作为参考)。设计质粒载体从而准确的负(vRNA向)转录被表达。例如，可设计质粒载体以将PCR产物置于截短的人类RNA聚合酶I启动子和δ肝炎病毒核酶序列之间，从而从聚合酶I启动子产生准确的负(vRNA向)转录。包含各病毒片段的分离的质粒载体以及包含必需的病毒蛋白的表达载体可被转染入细胞中，导致产生重组病毒颗粒。在另一例子中，可以使用表达病毒基因组RNA和编码必需的病毒蛋白的mRNA两者的质粒载体。无辅助(helper-free)质粒技术的详细描述参见，例如，国际公开号WO01/04333；美国专利号6,951,754，7,384,774，6,649,372和7,312,064；Fodor等人，1999，J.Virol.73:9679-9682；Quinlivan等人，2005，J.Virol.79:8431-8439；Hoffmann等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA97:6108-6113；Neumann等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA96:9345-9350；Enami和Enami，2000，J.Virol.74(12):5556-5561；和Pleschka等人，1996，J.Virol.70(6):4188-4192，其在此全文引入作为参考。
本文描述的流感病毒可在任何允许病毒生长至使得它们能够按照本文描述的方法使用的滴度的基质中繁殖。在一个实施方式中，该基质允许病毒生长至与决定对应野生型病毒的滴度可比的滴度。在某些实施方式中，该基质是生物学上与流感病毒相关或与HA功能所源自的病毒相关的基质。在一个具体实施方式中，由于例如NS1基因突变的减毒流感病毒可在IFN缺陷基质中繁殖。例如，合适的IFN-缺陷基质可以是在产生或应答干扰素方面有缺陷的基质，或IFN缺陷基质可被用于任何数量的可能需要干扰素缺陷生长环境的病毒生长的基质。参见，例如，2003年6月3日授权的美国专利号6,573,079，2005年2月8日授权的6,852,522、和2009年2月24日授权的7,494,808，其全部内容在此分别全文引入作为参考。在一个具体实施方式中，病毒繁殖于具胚蛋中(例如，鸡蛋)。在一个具体实施方式中，病毒繁殖于8天大、9-天大、8-10天大、10天大、11-天大、10-12天大或12天大的具胚蛋中(例如，鸡蛋)。在某些实施方式中，病毒繁殖于MDCK细胞、Vero细胞、293T细胞或其它本领域已知的细胞系中。在某些实施方式中，病毒繁殖于具胚蛋来源的细胞。
本文描述的流感病毒可通过本领域技术人员已知的任何方法分离和纯化。在一个实施方式中，病毒一般通过熟知的净化流程，例如，如梯度离心和柱层析，从细胞培养物中去除并从细胞组分中分离，并可根据需要使用本领域技术人员熟知的流程进行进一步纯化，例如，噬斑分析。
在某些实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自甲型流感病毒。在某些实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自两种或多种甲型流感病毒亚型或毒株。
在一些实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自乙型流感病毒。在某些实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自两种或多种乙型流感病毒亚型或毒株。在其它实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自组合的甲型流感和乙型流感病毒亚型或毒株。
在一些实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自丙型流感病毒。在某些实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自两种或多种丙型流感病毒亚型或毒株。在其它实施方式中，用于如本文描述的用途的流感病毒、或流感病毒多肽、基因或基因组片段获得自或源自组合的丙型流感病毒和甲型流感病毒和/或乙型流感病毒亚型或毒株。
在某些实施方式中，本文提供的流感病毒具有减毒的表型。在具体的实施方式中，减毒的流感病毒基于甲型流感病毒。在其它实施方式中，减毒的流感病毒基于乙型流感病毒。在其它实施方式中，减毒的流感病毒基于丙型流感病毒。在其它实施方式中，减毒的流感病毒可以包含来自甲型流感、乙型流感和/或丙型流感病毒的一种或多种毒株或亚型的基因或基因组片段。在一些实施方式中，减毒的骨架病毒包含来自甲型流感病毒和乙型流感病毒的基因。
在具体的实施方式中，流感病毒的减毒是期望的，从而该病毒至少部分保留感染性并能在体内复制，但是只产生低的滴度，导致亚临床水平的非病原性感染。该减毒的病毒特别适于本文描述的实施方式，其中该病毒或其免疫原性组合物被给予对象以诱导免疫应答。流感病毒的减毒可根据本领域已知的任何方法来完成，例如，如选择由化学突变产生的病毒突变体、通过基因工程突变基因组、选择含有减弱功能的片段的重排病毒或选择条件病毒突变体(例如，冷-适应的病毒)。可选的，可以将天然产生的减毒流感病毒用作流感病毒骨架用于流感病毒载体。
在一个实施方式中，流感病毒可通过将亲代流感病毒HA基因替换为本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽来至少部分减毒。在一些实施方式中，流感病毒可通过工程化流感病毒以表达突变的NS1基因来至少部分减毒，所述基因损害病毒拮抗细胞干扰素(IFN)应答的能力。可被引入流感病毒NS1基因的突变种类的例子包括缺失、取代、插入及其组合。可在NS1基因和/或NS1基因的调控元件的任何位置(例如，N端、C端或其间某个位置)引入一种或多种突变。在一个实施方式中，减毒流感病毒包含在流感病毒NS1基因中具有突变的基因组，导致包括5个、优选的10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基从NS1的C端缺失或5-170、25-170、50-170、100-170、100-160或105-160个氨基酸残基从C端缺失。在另一实施方式中，减毒的流感病毒包含在流感病毒NS1基因中具有突变的基因组，从而其编码氨基酸残基1-130、氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-95、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-83、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65或氨基酸残基1-60的NS1蛋白，其中N端氨基酸是1号。NS1突变和包含突变NS1的流感病毒的例子参见，例如，美国专利号6,468,544和6,669,943；和Li等人，1999，J.Infect.Dis.179:1132-1138，其各自在此全文引入作为参考。
在另一实施方式中，可通过如文献所述突变病毒的NA或M基因来将流感病毒至少部分减毒。
5.5非流感病毒载体
在一个方面，本文提供了含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的非流感病毒。在一个具体实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽被整合至非流感病毒的病毒粒子中。在一个具体实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽由纯化的(例如，噬斑纯化的)或分离的病毒所包含/表达。非流感病毒可被缀合至使病毒靶向特定细胞类型(例如免疫细胞)的部分。在一些实施方式中，非流感病毒的病毒粒子在其中整合或表达除本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽之外的异源多肽。异源多肽可以是具有免疫引发活性的多肽或使非流感病毒靶向特定细胞类型的多肽，例如识别特定细胞类型上的抗原的抗体或结合特定细胞类型上的特定受体的配体。这些异源多肽的例子见上文5.4节。
包含/表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的非流感病毒可使用本领域技术人员已知的技术产生。可通过使用本领域技术人员已知的技术在病毒粒子生产过程中反向提供嵌合流感血凝素(HA)多肽来产生包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的非流感病毒。可选的，包含工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的亲代非流感病毒在易受病毒感染的细胞(其中血凝素功能反向提供)中的复制将产生含有嵌合流感血凝素(HA)多肽的后代病毒。
任何病毒类型、亚型或毒株，包括但不限于，天然产生的毒株、变体或突变株、诱变的病毒、重排和/或基因修饰的病毒可被用作非流感病毒载体。在一个具体实施方式中，亲代非流感病毒不是天然产生的病毒。在另一具体实施方式中，亲代非流感病毒是遗传工程改造的病毒。在某些实施方式中，优选包膜的病毒用于表达本文描述的膜结合的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在一个示例性实施方式中，非流感病毒载体是新城疫病毒(NDV)。在另一个实施方式中，非流感病毒载体是牛痘病毒。在另一个实施方式中，非流感病毒载体是杆状病毒(如，例如，BacMam[Invitrogen])。在其他示例性、非限制性实施方式中，非流感病毒载体是腺病毒、腺相关病毒(AAV)、乙型肝炎病毒、逆转录病毒(如，例如，γ逆转录病毒如小鼠干细胞病毒(MSCV)基因组或鼠白血病病毒(MLV)，例如莫洛尼鼠白血病病毒、致癌反转录病毒或慢病毒)、甲病毒(例如，委内瑞拉马脑炎病毒)、弹状病毒(如水泡性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒)、痘病毒(如，例如，牛痘病毒、MVA-T7载体或禽痘)、偏肺病毒、麻疹病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)或泡沫病毒。参见，例如，Lawrie和Tumin，1993，Cur.Opin.Genet.Develop.3，102-109(逆转录病毒载体)；Bett等人，1993，J.Virol.67，5911(腺病毒载体)；Zhou等人，1994，J.Exp.Med.179，1867(腺相关病毒载体)；Dubensky等人，1996，J.Virol.70，508-519(痘病毒科的病毒载体，包括牛痘病毒和禽痘病毒和甲病毒属病毒载体例如源自Sindbis和塞姆利基森林病毒的那些)；美国专利号5,643,576(委内瑞拉马脑炎病毒)；WO96/34625(VSV)；Ohe等人，1995，HumanGeneTherapy，6，325-333；Woo等人，WO94/12629；Xiao&Brandsma，1996，NucleicAcids.Res.，24，2630-2622(乳头瘤病毒)；以及Bukreyev和Collins，2008，CurrOpinMolTher.，10:46-55(NDV)，其各自在此全文引入作为参考。
在一个具体实施方式中，非流感病毒载体是NDV。任何NDV类型、亚型或毒株都可作为骨架被工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽，包括，但不限于，天然产生的毒株、变体或突变株、诱变的病毒、重排和/或基因修饰的病毒。在一个具体实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是天然产生的毒株。在某些实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是裂解毒株。在其它实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是非裂解毒株。在某些实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是缓发型毒株。在一些实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是中发型毒株。在其它实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是速发型毒株。NDV毒株的具体例子包括但不限于73-T毒株、Ulster毒株、MTH-68毒株、Italien毒株、Hickman毒株、PV701毒株、HitchnerB1毒株、LaSota毒株、YG97毒株、MET95毒株和F48E9毒株。在一个具体实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是HitchnerB1毒株。在另一具体实施方式中，作为骨架用于基因工程改造的NDV是LaSota毒株。
在一个实施方式中，用作非流感病毒载体骨架的NDV被工程化改造以表达修饰的F蛋白，其中F蛋白的裂解位点被替换为包含一个或两个额外精氨酸残基的位点，允许突变体裂解位点被普遍表达的弗林家族蛋白酶所激活。表达该修饰的F蛋白的NDV的具体例子包括但不限于rNDV/F2aa和rNDV/F3aa。关于将突变引入NDVF蛋白以产生具有突变裂解位点的修饰的F蛋白的描述，参见，例如，Park等人(2006)“Engineeredviralvaccineconstructswithdualspecificity:AvianinfluenzaandNewcastledisease.”PNASUSA103：8203-2808，其在此全文引入作为参考。
在一个实施方式中，非流感病毒载体是痘病毒病毒。痘病毒载体可以基于对疫苗载体提供合适序列的痘病毒科的任何成员，特别是牛痘病毒或鸟痘病毒(如，例如金丝雀痘、禽痘等等)。在一个具体实施方式中，痘病毒载体是牛痘病毒载体。合适的牛痘病毒包括但不限于哥本哈根(VC-2)毒株(Goebel等人，Virol，179：247-266，1990；Johnson等人，Virol.，196：381-401，1993)、修饰的哥本哈根毒株(NYVAC)(美国专利号6,265,189)，WYETH毒株和修饰的安卡拉(MVA)毒株(Antoine等人，Virol.，244：365-396，1998)。其它合适的痘病毒包括禽痘毒株例如ALVAC和TROVAC载体，其提供期望的性质且为高度减毒的(参见，例如，美国专利号6,265,189；Tartaglia等人，InAIDSResearchReviews，Koff等人编辑，第3卷，MarcelDekker，N.Y.，1993；和Tartaglia等人，1990，ReviewsinImmunology10：13-30，1990)。
工程化改造非流感病毒以表达流感多肽的方法是本领域熟知的，如减毒、繁殖和分离和纯化该病毒的方法一样。关于NDV载体的这些技术参见，例如，国际公开号WO01/04333；美国专利号7,442,379、6,146,642、6,649,372、6,544,785和7,384,774；Swayne等人(2003)，AvianDis.，47:1047-1050；和Swayne等人(2001)，J.Virol.，11868-11873，其各自在此全文引入作为参考。关于痘病毒的这些技术参见，例如，Piccini等人，MethodsofEnzymology，153：545-563，1987；国际公开号WO96/11279；美国专利号4,769,330；美国专利号4,722,848；美国专利号4,769,330；美国专利号4,603,112；美国专利号5,110,587；美国专利号5,174,993；EP83286；EP206920；Mayr等人，Infection3：6-14，1975；以及Sutter和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89：10847-10851，1992。在某些实施方式中，非流感病毒是减毒的。
选择非流感病毒载体、特别是用于对对象给药的组合物的示例性的考虑因素是安全、低毒、稳定、细胞种类特异性和免疫原性，特别是非流感病毒载体表达的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的抗原性。
5.6病毒样颗粒和病毒体
本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)可被合并入病毒样颗粒(VLP)载体，例如，纯化的/分离的VLP。VLP一般包含通常源自病毒结构蛋白的病毒多肽。在一些实施方式中，VLP不能复制。在某些实施方式中，VLP可能缺少病毒的完整基因组或包含病毒的一部分基因组。在一些实施方式中，VLP不能感染细胞。在一些实施方式中，VLP在其表面表达本领域技术人员已知的或本文描述的一种或多种病毒(例如，病毒表面糖蛋白)或非病毒(例如，抗体或蛋白)靶向部分。在一些实施方式中，VLP包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽和病毒结构蛋白，例如HIVgag。在一个具体实施方式中，VLP包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽和HIVgag多肽。
已经基于几种病毒描述了用于生产和表征重组产生的VLP的方法，包括流感病毒(Bright等人(2007)Vaccine，25:3871)、人乳头瘤病毒1型(Hagnesee等人(1991)J.Virol.67:315)、人类乳头瘤病毒16型(Kirnbauer等人Proc.Natl.Acad.Sci.，(1992)89:12180)、HIV-1(Haffer等人，(1990)J.Virol.64:2653)和甲型肝炎(Winokur(1991)65:5029)，其各自在此全文引入。用于表达含NDV蛋白的VLP的方法提供自Pantua等人(2006)J.Virol.80:11062-11073和2009年3月12日公开的美国专利申请公开号20090068221，其各自全文引入。在一个具体实施方式中，包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的VLP使用杆状病毒产生。在其它实施方式中，包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的VLP使用293T细胞产生。
在具体的实施方式中，VLP，例如，包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的VLP，在细胞中表达(例如，293T细胞)。在某些实施方式中，VLP在表达包含唾液酸的表面糖蛋白的细胞中表达。按照这些实施方式，在神经氨酸苷酶存在下培养细胞(例如，细菌神经氨酸苷酶病毒)。在某些实施方式中，VLP，例如，包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的VLP，在不表达包含唾液酸的表面糖蛋白的细胞中表达。
在一个具体实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽可被合并入病毒体。含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的病毒体可以使用本领域技术人员已知的技术生产。例如，可以通过破坏纯化的病毒、提取基因组和用病毒蛋白(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)和再装配颗粒以形成含病毒蛋白的脂质颗粒来生产病毒体。
5.7细菌载体
在一个具体实施方式中，细菌可被工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)。表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的合适的细菌包括但不限于李斯特菌(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigellasp.)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、大肠杆菌(E.coli)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、乳杆菌(Lactobacillus)、弯曲杆菌(Campylobacter)、乳球菌(Lactococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、和土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)。在一个具体实施方式中，工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的细菌是减毒的。用于产生工程化改造以表达异源多肽的细菌的技术是本领域已知的并可被应用于本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的表达。参见，例如，2008年10月9日公开的美国专利申请公开号20080248066和2007年9月6日公开的美国专利申请公开号20070207171，其各自在此全文引入作为参考。在某些实施方式中，本文使用的细菌载体具有进行N-连接糖基化的能力，例如，这些细菌天然具有N-糖基化机制(例如，弯曲杆菌)或被基因工程化改造以具备N-糖基化机制。
5.8针对嵌合流感血凝素(HA)多肽的抗体的产生
本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)、编码该多肽的核酸或包含该核酸的载体或本文描述的多肽可被用于引发针对流感的中和抗体，例如，针对流感病毒血凝素多肽的茎域区域。在一个具体实施方式中，嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸的载体或本文描述的多肽可被给予非人类对象(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠，等等)以诱导包括抗体产生的免疫应答，所述抗体可使用本领域技术人员已知的技术进行分离(例如，免疫亲和层析、离心、沉淀等等)。
在某些实施方式中，针对本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的人抗体可使用能够产生人抗体的非人类对象(例如，转基因小鼠)产生。例如，人抗体可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但能表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选的，除了人重链和轻链基因之外，还可将人可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞域。可与通过同源重组引入人类免疫球蛋白基因座分开或同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能化。特别的，JH区域的纯合缺失防止了内源性抗体生产。修饰的胎盘干细胞被扩大并微注射至囊胚中以产生嵌合小鼠。然后喂养嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。转基因小鼠怀有(harbored)的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排并随后经历类别转换和体细胞突变。从而，使用该技术，有可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于这种生产人抗体的技术的综述，参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，13:65-93(1995)。关于这种生产人抗体和人类单克隆抗体的技术和生产此种抗体的流程的详细描述，参见，例如，PCT公开WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；欧洲专利号0598877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，其在此全文引入作为参考。例如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)、Genpharm(SanJose，Calif.)和Medarex，Inc.(Princeton，N.J.)可定制提供针对选定抗原的人抗体。此外，非人类对象可以移植人周边血白细胞、脾细胞或骨髓(例如，三源杂交瘤技术XTL)，从而产生结合本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的人抗体。
可选的，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽可被用于从抗体库中筛选抗体。例如，分离的嵌合流感血凝素(HA)多肽可以固定化于固体支持物(例如，硅胶、树脂、衍生的塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、聚苯乙烯珠、氧化铝凝胶或多糖、磁珠)，并筛选用于结合抗体。作为替代，抗体可以固定于固体支持物并筛选结合于分离的嵌合流感血凝素(HA)多肽。诸如淘选分析、ELISA、表面等离子体共振，或本领域中已知的其它抗体筛选分析的任何筛选分析都可以用来筛选结合嵌合流感血凝素(HA)多肽的抗体。筛选的抗体文库可以是市售抗体库、体外生成的库或通过从感染流感的个体中鉴别和克隆或分离的抗体获得的库。在具体的实施方式中，该抗体库从流感病毒爆发的幸存者中产生。抗体文库可以根据本领域已知的方法产生。在一个具体的实施方式中，抗体库通过克隆抗体和在噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库中使用它们而产生。
可使用本领域已知的或本文描述的生物学分析针对本文描述的方法中鉴别的抗体检测其中和活性和自身反应性的缺失。在一个实施方式中，从非人类动物或抗体库中分离的抗体中和来自多于一种流感亚型的血凝素多肽。在一些实施方式中，使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或编码该核酸或多肽的载体引发或鉴定的抗体中和流感H3病毒。在一些实施方式中，使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸或多肽的载体引发或鉴定的抗体中和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16或更多种流感病毒的亚型或毒株。在一个实施方式中，中和抗体中和一种或多种甲型流感病毒和一种或多种乙型流感病毒。在具体实施方式中，中和抗体不是或不结合与CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(由杂交瘤FERMBP-4517产生；TakaraBio，Inc.(Otsu，Shiga，Japan)出售的克隆)和/或AI3C(FERMBP-4516)相同的表位；或以下文献中描述的任何其它抗体：EkiertDC等人，(2009)AntibodyRecognitionofaHighlyConservedInfluenzaVirusEpitope.Science(发表于2009年2月26日的ScienceExpress)；Kashyap等人，(2008)CombinatorialantibodylibrariesfromsurvivorsoftheTurkishH5N1avianinfluenzaoutbreakrevealvirusneutralizationstrategies.ProcNatlAcadSciUSA105:5986-5991；Sui等人，(2009)Structuralandfunctionalbasesforbroad-spectrumneutralizationofavianandhumaninfluenzaAviruses.NatStructMolBiol16:265-273；美国专利号5,589,174、5,631,350、6,337,070和6,720,409；国际申请号PCT/US2007/068983，公开为国际公开号WO2007/134237；国际申请号PCT/US2008/075998，公开为国际公开号WO2009/036157；国际申请号PCT/EP2007/059356，公开为国际公开号WO2008/028946；和国际申请号PCT/US2008/085876，公开为国际公开号WO2009/079259。在其它实施方式中，中和抗体不是Wang等人(2010)“BroadlyProtectiveMonoclonalAntibodiesagainstH3InfluenzaVirusesfollowingSequentialImmunizationwithDifferentHemagglutinins,”PLOSPathogens6(2):1-9中描述的抗体。在具体实施方式中，中和抗体不使用IgVH1-69片段。在一些实施方式中，中和抗体与抗原的相互作用并不唯一地由重链介导。
使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸或多肽的载体引发或鉴定的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合血凝素多肽的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，针对使用本文描述的方法引发或鉴别的抗体的抗-Id抗体)和上述任一的表位结合片段。
使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸或多肽的载体引发或鉴定的抗体可被用于诊断免疫分析、被动免疫治疗和产生抗独特型抗体。在用于被动免疫治疗之前可修饰抗体，例如，可将抗体嵌合化或人源化。关于嵌合和人源化抗体的产生参见，例如，美国专利号4,444,887和4,716,111；和国际公开号WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741，其在此分别全文引入作为参考。此外，抗体中和血凝素多肽的能力和抗体对多肽的特异性可在被动免疫治疗中使用抗体之前进行测试。
使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸或多肽的载体引发或鉴定的抗体可被用于监控治疗效果和/或疾病进展。为此目的可以使用本领域已知的任何免疫分析系统，包括但不限于，使用如放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“三明治”免疫分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫辐射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析和免疫电泳分析等技术的竞争性和非竞争性分析系统，仅举几例。
使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸或多肽的载体引发或鉴定的抗体可被用于产生抗独特型抗体。然后抗独特型抗体可反过来被用于免疫，以产生结合流感特定抗原例如血凝素多肽中和表位的抗体亚群(Jerne，1974、Ann.Immunol.(Paris)125c:373；Jerne等人，1982，EMBOJ.1:234，在此全文引入作为参考)。使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸或包含该核酸或多肽的载体引发或鉴定的抗体可被用于设计模拟表位。然后模拟表位可反过来被用于免疫，以产生结合流感特定抗原例如血凝素多肽中和表位的抗体亚群(Jerne，1974、Ann.Immunol.(Paris)125c:373；Jerne等人，1982，EMBOJ.1:234，在此全文引入作为参考)。
5.9用嵌合流感血凝素(HA)多肽刺激细胞
在另一方面，本文提供了在体外用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)刺激细胞的方法。该细胞，例如，树突细胞，可被用于体外产生针对嵌合流感血凝素(HA)多肽的抗体或其自身可通过本领域已知的继承转移技术被给予对象。关于继承转移技术的描述参见，例如，2008年1月24日公开的美国专利申请公开号20080019998，其在此全文引入作为参考。在某些实施方式中，当在体外用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽刺激的细胞被给予对象时，所述细胞不是哺乳动物细胞(例如，CB-1细胞)。
在一个非限制性实施例中，工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的载体，例如，流感病毒载体，可被用于产生树突细胞(DC)，其表达嵌合流感血凝素(HA)多肽并显示针对流感病毒血凝素多肽的免疫刺激性质。这些DC可被用于扩展记忆T细胞，是T细胞的强力刺激物，包括嵌合流感血凝素(HA)多肽-特异性细胞毒性T淋巴细胞克隆。参见Strobel等人，2000，HumanGeneTherapy，11:2207-2218，其在此全文引入作为参考。
本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽可以以允许多肽接触靶细胞(例如，DC)并将多肽递送至靶细胞的任意方式递送至靶细胞。在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽被递送至如本文描述的对象。在一些此种实施方式中，接触该多肽的细胞可进行分离和繁殖。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽在体外递送至靶细胞。本领域技术人员已知的技术可被用于将多肽递送至靶细胞。例如，靶细胞可在组织培养盘、管或其它容器中与多肽接触。多肽可被悬浮在培养基中并加入组织培养盘、管或其它容器的孔。含有多肽的培养基可在细胞铺板之前或在细胞已经铺板之后添加。靶细胞优选的用多肽孵育足够长的时间以允许多肽接触细胞。在某些实施方式中，细胞用多肽孵育约1小时或更多、约5小时或更多、约10小时或更多、约12小时或更多、约16小时或更多、约24小时或更多、约48小时或更多、约1小时至约12小时、约3小时至约6小时、约6小时至约12小时、约12小时至约24小时或约24小时至约48小时。在嵌合流感血凝素(HA)多肽在病毒中的某些实施方式中，靶细胞的接触包括用病毒感染细胞。
靶细胞可来自任何任何物种，包括，例如，人、小鼠、大鼠、兔和豚鼠。在一些实施方式中，靶细胞是从健康对象或待治疗对象中获得的DC。在某些实施方式中，靶细胞是从其中需要刺激针对多肽的免疫应答的对象中获得的DC。从对象中获得细胞的方法是本领域熟知的。
5.10组合物
本文描述的核酸、载体、多肽、细菌、抗体、和/或细胞(在此有时称为“活性物质”)可被整合至组合物中。在一个具体实施方式中，组合物是药物组合物，例如免疫原性组合物(例如，疫苗制剂)。本文提供的药物组合物可以是允许所述组合物被给予对象的任何形式。在一个具体实施方式中，药物组合物适于兽药和/或人类给药。组合物可被用于预防或治疗流感病毒疾病的方法。
在一个实施方式中，药物组合物包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)，并混合药学上可接受的载体。在另一实施方式中，药物组合物包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的核酸，并混合药学上可接受的载体。在另一实施方式中，药物组合物包含包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的核酸的表达载体，并混合药学上可接受的载体。在另一实施方式中，药物组合物包含含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的流感病毒或非流感病毒，并混合药学上可接受的载体。在另一实施方式中，药物组合物包含具有工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的基因组的流感病毒或非流感病毒，并混合药学上可接受的载体。在另一实施方式中，药物组合物包含含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的病毒样颗粒或病毒体，并混合药学上可接受的载体。在另一实施方式中，药物组合物包含表达或工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的细菌，并混合药学上可接受的载体。在另一实施方式中，药物组合物包含用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，第5.1节描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)刺激的细胞，并混合药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，除了利用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的治疗剂外，药物组合物可以包含一种或多种其它治疗剂。
如本文使用的术语“药学上可接受的”表示由联邦或州政府管理机构批准的或列在美国药典或其它通常被认可的药典中用于动物特别是人类的。术语“载体”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或溶媒。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。合适的药物载体的例子描述于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences”。制剂应适合给药方式。
在一个具体实施方式中，药物组合物配制成适于以期望路径向对象施用。例如，该药物组合物可以配制为适合于肠胃外、口服、皮内、经皮、结肠直肠、腹膜内和直肠施用。在一个具体的实施方式中，药物组合物可以配制成用于静脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、经皮或经肺给药。在一个具体的实施方式中，药物组合物被配制为用于鼻内给药。在另一具体实施方式中，药物组合物被配制用于肌内给药。
在某些实施方式中，可生物降解的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇(PEG化)、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、聚交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸，可以用作载体。在一些实施方式中，活性物质与增加对化合物的保护、使之免于快速从体内消除的载体一起配制，所述载体例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。制备这类制剂的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。脂质体或胶束也可以用作药学可接受的载体。根据本领域技术人员已知的方法，例如美国专利号4,522,811中描述的，可以制备这些载体。在某些实施方式中，药物组合物包含一种或多种佐剂。
在具体的实施方式中，本文描述的免疫原性组合物是单价制剂，例如，包含本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH5/B嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cH7/B嵌合流感血凝素多肽、本文描述的cHB/B嵌合流感血凝素多肽或本文描述的cH4/3嵌合流感血凝素多肽的单价制剂。
在其它具体实施方式中，本文描述的免疫原性组合物是多价制剂，例如，二价和三价制剂。在一个实例中，多价制剂包含多于一种表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的载体。在某些实施方式中，多价制剂可以包含使用单一载体表达的本文描述的一种或多种不同的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在某些实施方式中，多价制剂包含不同嵌合流感血凝素多肽，其中每种嵌合流感血凝素多肽包含相同的流感血凝素球状头域和不同的流感血凝素干域。不同流感血凝素干域可以来自不同的流感病毒株、亚型或组。例如，二价制剂可以包含两种嵌合流感血凝素多肽，其中这两种嵌合流感血凝素多肽包含相同的流感血凝素球状头域和来自两种不同流感病毒的不同的流感血凝素干域。在另一实例中，三价制剂可以包含三种嵌合流感血凝素多肽，其中该三种嵌合流感血凝素多肽包含相同的流感血凝素球状头域和来自三种不同流感病毒的不同的流感血凝素干域。在具体的实施方式中，本文提供的二价疫苗制剂可以包含本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的组合；或本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的组合。在具体的实施方式中，本文提供的三价疫苗制剂可以包含(i)本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽和任一种本文描述的cH5/B、cH7/B或cB/B嵌合流感血凝素多肽的组合；或(ii)本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽和本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽和任一种本文描述的cH5/B、cH7/B或cB/B嵌合流感血凝素多肽的组合。在某些实施方式中二价或三价疫苗制剂包含本文描述的cH4/3嵌合流感血凝素多肽。
在某些实施方式中，本文描述的药物组合物另外包含防腐剂，例如，汞衍生的硫柳汞。在一个具体实施方式中，本文描述的药物组合物包含0.001％至0.01％的硫柳汞。在其它实施方式中，本文描述的药物组合物不含防腐剂。在一个具体实施方式中，在本文描述的药物组合物的制造过程中使用硫柳汞且该硫柳汞在药物组合物生产后通过纯化步骤去除，即，药物组合物含有痕量硫柳汞(纯化后<0.3μg汞每剂量；该药物组合物被认为是不含硫柳汞的产品)。
在某些实施方式中，本文描述的药物组合物另外包含卵蛋白(例如，卵清蛋白或其它卵蛋白)。本文描述的药物组合物中的卵蛋白量范围可以是约0.0005至约1.2μg的卵蛋白对应1ml的药物组合物。在其它实施方式中，本文描述的药物组合物不含卵蛋白。
在某些实施方式中，本文描述的药物组合物另外包含一种或多种抗微生物剂(例如，抗生素)，包括但不限于庆大霉素、新霉素、多粘菌素(例如，多粘菌素B)和卡那霉素、链霉素。在其它实施方式中，本文描述的药物组合物不含任何抗生素。
在某些实施方式中，本文描述的药物组合物另外包含用于失活病毒的一种或多种组分，例如，福尔马林或甲醛或去垢剂例如脱氧胆酸钠、辛苯聚醇9(TritonX-100)和辛苯聚醇10。在其它实施方式中，本文描述的药物组合物不含任何用于失活病毒的组分。
在某些实施方式中，本文描述的药物组合物另外包含明胶。在其它实施方式中，本文描述的药物组合物不含明胶。
在某些实施方式中，本文描述的药物组合物另外包含一种或多种缓冲液，例如，磷酸盐缓冲液和磷酸蔗糖谷氨酸盐缓冲液。在其它实施方式中，本文描述的药物组合物不含缓冲液。
在某些实施方式中，本文描述的药物组合物另外包含一种或多种盐，例如，氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸一钠和铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)、或这些铝盐的混合物)。在其它实施方式中，本文描述的药物组合物不含盐。
在具体的实施方式中，本文描述的药物组合物是低添加剂流感病毒疫苗，即，药物组合物不含一种或多种流感病毒疫苗中通常发现的添加剂。低添加剂流感疫苗已有描述(参见，例如，国际申请号PCT/IB2008/002238，公开为国际公开号WO09/001217，其在此全文引入作为参考)。
本文描述的药物组合物可与给药说明书一起装在容器、包裹或分散器中。
本文描述的药物组合物可在使用前储存，例如，药物组合物可冷冻储存(例如，在约-20℃或约-70℃下)；冷藏条件储存(例如，约4℃下)；或室温储存(对于无冷藏储存含流感疫苗组合物的方法参见国际申请号PCT/IB2007/001149，公开为国际公开号WO07/110776，其在此全文引入作为参考)。
在某些实施方式中，当本文描述的药物组合物的活性物质是工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的细胞时，药物组合物中的细胞不是哺乳动物细胞(例如，CB-1细胞)。
5.10.1亚单位疫苗
在一个具体实施方式中，本文提供了包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的亚单位疫苗。在一些实施方式中，亚单位疫苗包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽和一种或多种表面糖蛋白(例如，流感病毒神经氨酸苷酶)、其它靶向部分或佐剂。在具体的实施方式中，亚单位疫苗包含本文描述的单一嵌合流感血凝素(HA)多肽。在其它实施方式中，亚单位疫苗包含两种、三种、四种或更多本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在具体的实施方式中，亚单位疫苗中使用的嵌合流感血凝素(HA)多肽不是膜结合的，即，是可溶的。
本文提供的亚单位疫苗包含有效量的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在某些实施方式中，本文提供的亚单位疫苗包含约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150μg的一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在某些实施方式中，本文提供的亚单位疫苗包含约5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140或140-150μg的一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在一个具体实施方式中，本文提供的单价亚单位疫苗包含7.5μg-90μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在另一具体实施方式中，本文提供的二价亚单位疫苗包含7.5μg-90μg的本文描述的第一嵌合流感血凝素(HA)多肽和7.5μg-90μg的本文描述的第二嵌合流感血凝素(HA)多肽。在另一具体实施方式中，本文提供的三价亚单位疫苗包含7.5μg-90μg的本文描述的第一嵌合流感血凝素(HA)多肽、7.5μg-90μg的本文描述的第二嵌合流感血凝素(HA)多肽和7.5μg-90μg的本文描述的第三嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在某些实施方式中，本文提供了每剂量包含约10μg至约60μg的一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、约0.001％至0.01％硫柳汞、约0.1μg至约1.0μg鸡卵蛋白、约1.0μg至约5.0μg多粘菌素、约1.0μg至约5.0μg新霉素、约0.1μg至约0.5μg的β丙内酯和约.001至约.05％w/v的壬基酚聚氧乙烯醚的亚单位疫苗。
在一个具体实施方式中，本文提供的亚单位疫苗包含或包括0.5ml的剂量，其每剂量包含45μg本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、≤1.0μg的汞(来自硫柳汞)、≤1.0μg鸡卵蛋白(即，卵清蛋白)、≤3.75μg多粘菌素和≤2.5μg新霉素。在一些实施方式中，本文提供的亚单位疫苗另外包含或包括不多于0.5μg的β丙内酯和不多于0.015％w/v的壬基酚聚氧乙烯醚。在一些实施方式中，0.5ml剂量的亚单位疫苗包装于预填充注射器。
在一个具体实施方式中，本文提供的亚单位疫苗包括5.0ml多剂量药瓶(0.5ml每剂量)，其每剂量包含45μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、25.0μg的汞(来自硫柳汞)、≤1.0μg鸡卵蛋白(即，卵清蛋白)、≤3.75μg多粘菌素和≤2.5μg新霉素。在一些实施方式中，本文提供的亚单位疫苗另外包含或包括不多于0.5μg的β丙内酯和不多于0.015％w/v的壬基酚聚氧乙烯醚。
在一个具体实施方式中，使用在具胚蛋中繁殖的流感病毒制备亚单位疫苗(即，亚单位疫苗的组分(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)分离自具胚蛋中繁殖的病毒)。在另一具体实施方式中，使用不在具胚蛋中繁殖的流感病毒制备亚单位疫苗(即，亚单位疫苗的组分(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)不分离自具胚蛋中繁殖的病毒)。在另一具体实施方式中，使用在哺乳动物细胞中繁殖的流感病毒制备亚单位疫苗，例如，永生化的人细胞(参见，例如，国际申请号PCT/EP2006/067566，公开为国际公开号WO07/045674，其在此全文引入作为参考)、犬肾细胞例如MDCK细胞(参见，例如，国际申请号PCT/IB2007/003536，公开为国际公开号WO08/032219，其在此全文引入作为参考)、Vero细胞、PerC.6细胞或鸭细胞例如EB66细胞(即，亚单位疫苗的组分(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)分离自哺乳动物细胞中繁殖的病毒)。在另一具体实施方式中，使用表达载体制备本文提供的亚单位疫苗中的嵌合流感血凝素(HA)多肽，例如，病毒载体、植物载体或细菌载体(即，亚单位疫苗中的嵌合流感血凝素(HA)多肽获得自/分离自表达载体)。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的单价亚单位疫苗。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽)的单价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/3嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽)的单价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH7/3嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽)单价的亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/B嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH5/B嵌合流感血凝素多肽)的单价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH7/B嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH7/1嵌合流感血凝素多肽)的单价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cB/B嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的B/B嵌合流感血凝素多肽)的单价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH4/3嵌合流感病毒血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH4/3嵌合流感血凝素多肽)的单价亚单位疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的二价亚单位疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含两种嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗，其中该两种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且两种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自两种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自两种不同的流感毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽和cH5/3嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽和cH7/3嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽和cH5/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽和cH7/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽和cB/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/3嵌合流感血凝素多肽和cH7/3嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/3嵌合流感血凝素多肽和cH5/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/3嵌合流感血凝素多肽和cH7/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/3嵌合流感血凝素多肽和cB/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH7/3嵌合流感血凝素多肽和cH5/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH7/3嵌合流感血凝素多肽和cH7/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH7/3嵌合流感血凝素多肽和cB/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/B嵌合流感血凝素多肽和cH7/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/B嵌合流感血凝素多肽和cB/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH7/B嵌合流感血凝素多肽和cB/B嵌合流感血凝素多肽的二价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含本文描述的cH4/3嵌合血凝素多肽的二价亚单位疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了三价亚单位疫苗，其包含含有和/或包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的病毒。在某些实施方式中，本文提供了一种包含三种嵌合流感血凝素多肽的三价亚单位疫苗，其中该三种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且三种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自三种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自三种不同流感病毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽、cH5/3嵌合流感血凝素多肽和cH5/B嵌合流感血凝素多肽的三价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽、cH5/3嵌合流感血凝素多肽和cH7/B嵌合流感血凝素多肽的三价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽、cH5/3嵌合流感血凝素多肽和cB/B嵌合流感血凝素多肽的三价亚单位疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽、cH7/3嵌合流感血凝素多肽和cH5/B嵌合流感血凝素多肽的三价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽、cH7/3嵌合流感血凝素多肽和cH7/B嵌合流感血凝素多肽的三价亚单位疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含cH5/1嵌合流感血凝素多肽、cH7/3嵌合流感血凝素多肽和cB/B嵌合流感血凝素多肽的三价亚单位疫苗。在某些实施方式中，三价亚单位疫苗包含本文描述的cH4/3嵌合流感血凝素。
在一个具体实施方式中，本文提供的亚单位疫苗不包含含有A/越南/1203/2004(H5)球状头域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽。在另一具体实施方式中，本文提供的亚单位疫苗不包含含有A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽。
在一个具体实施方式中，本文提供的亚单位疫苗不包含含有A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)球状头域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽。在另一具体实施方式中，本文提供的亚单位疫苗不包含含有A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽。
5.10.2活病毒疫苗
在一个实施方式中，本文提供了包含含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的活病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在另一实施方式中，本文提供了包含被工程化改造以编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的活病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)，所述病毒由施用所述组合物的对象中产生的后代病毒表达。在具体的实施方式中，嵌合流感血凝素(HA)多肽是膜结合的。在其它具体实施方式中，嵌合流感血凝素(HA)多肽不是膜结合的，即，其是可溶的。在具体实施方式中，该活病毒是流感病毒，例如上文5.4节描述的。在其它实施方式中，该活病毒是非流感病毒，例如上文5.5节描述的。在一些实施方式中，该活病毒是减活的。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含两种、三种、四种或更多活病毒，其含有或被工程化改造以表达两种、三种、四种或更多不同的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在某些实施方式中，本文提供了每剂量包含约105至约1010荧光聚焦单位(FFU)的含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽减毒活流感病毒、约0.1至约0.5mg谷氨酸一钠、约1.0至约5.0mg水解猪明胶、约1.0至约5.0mg精氨酸、约10至约15mg蔗糖、约1.0至约5.0mg磷酸氢二钾、约0.5至约2.0mg磷酸二氢钾和约0.001至约0.05μg/ml硫酸庆大霉素的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在一些实施方式中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为含单一0.2ml剂量的预填充喷雾剂。
在一个具体实施方式中，本文提供了每剂量包含106.5-107.5FFU的含有一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽减毒活流感病毒、0.188mg谷氨酸一钠、2.0mg水解猪明胶、2.42mg精氨酸、13.68mg蔗糖、2.26mg磷酸氢二钾、0.96mg磷酸二氢钾和<0.015μg/ml硫酸庆大霉素的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在一些实施方式中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为含单一0.2ml剂量的预填充喷雾剂。
在一个具体实施方式中，在活病毒被用于本文描述的免疫原性组合物之前在具胚蛋中繁殖含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的活病毒。在另一具体实施方式中，在活病毒被用于本文描述的免疫原性组合物之前不在具胚蛋中繁殖含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的活病毒。在另一具体实施方式中，在活病毒被用于本文描述的免疫原性组合物之前在哺乳动物细胞中繁殖含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的活病毒，例如，永生化的人细胞(参见，例如，国际申请号PCT/EP2006/067566，公开为国际公开号WO07/045674，其在此全文引入作为参考)、犬肾细胞例如MDCK细胞(参见，例如，国际申请号PCT/IB2007/003536，公开为国际公开号WO08/032219，其在此全文引入作为参考)、Vero细胞、PerC.6细胞或鸭细胞例如EB66细胞。
包含用于对对象施用的活病毒的免疫原性组合物可以是优选的，因为对象中病毒的增殖可能导致与天然发生的感染相似种类和量级的刺激延长，从而赋予实质的、长期的免疫力。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的单价活病毒疫苗。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽)的基因组的病毒的单价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽)的基因组的病毒的单价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽)的基因组的病毒的活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH5/B嵌合流感血凝素多肽)的基因组的病毒的单价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的cH7/1嵌合流感血凝素多肽)的基因组的病毒的单价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽(例如，第5.1节描述的B/B嵌合流感血凝素多肽)的基因组的病毒的单价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素的基因组的病毒的单价活病毒疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了包含含有和/或包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含两种嵌合流感血凝素多肽的二价活病毒疫苗，其中该两种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且两种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自两种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自两种不同的流感毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价活病毒疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了包含含有和/或包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含三种嵌合流感血凝素多肽的三价活病毒疫苗，其中该三种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且三种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自三种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自三种不同流感病毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价活病毒疫苗。
在一个具体实施方式中，活病毒疫苗一部分的嵌合流感血凝素多肽在活病毒表面发现和/或表达(例如，活流感病毒表面)。
在一个具体实施方式中，本文提供的活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/越南/1203/2004(H5)球状头域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。在另一具体实施方式中，本文提供的活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。
在一个具体实施方式中，本文提供的活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)球状头域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。在另一具体实施方式中，本文提供的活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。
5.10.3灭活病毒疫苗
在一个实施方式中，本文提供了包含含有本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的灭活病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在具体的实施方式中，嵌合流感血凝素(HA)多肽是膜结合的。在具体实施方式中，灭活病毒是流感病毒，例如上文5.4节描述的。在其它实施方式中，灭活病毒是非流感病毒，例如上文5.5节描述的。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含两种、三种、四种或更多灭活病毒，其含有两种、三种、四种或更多不同的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在某些实施方式中，灭活病毒免疫原性组合物包含一种或多种佐剂。
本领域技术人员已知的技术可被用于灭活含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的病毒。常规方法使用福尔马林、加热或去垢剂用于灭活。参见，例如，美国专利号6,635,246，其在此全文引入作为参考。其它方法包括描述于美国专利号5,891,705；5,106,619和4,693,981的那些，其在此全文引入作为参考。
在某些实施方式中，本文提供了包含灭活流感病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)，从而每剂量的免疫原性组合物包含约7.5μg至约90μg或约15至约60μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、约1.0至约5.0mg氯化钠、约20至约100μg磷酸二氢钠、约100至约500μg磷酸氢二钠、约5至约30μg磷酸二氢钾、约5至约30μg氯化钾和约.5至约3.0μg氯化钙。在一些实施方式中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为单一的0.25ml或单一的0.5ml剂量。在其它实施方式中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为多剂量制剂。
在某些实施方式中，本文提供了包含灭活流感病毒的免疫原性组合物(例如，疫苗)，从而每剂量的免疫原性组合物包含约7.5μg至约90μg或约15至约60μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、约0.001％至0.01％硫柳汞、约1.0至约5.0mg氯化钠、约20至约100μg磷酸二氢钠、约100至约500μg磷酸氢二钠、约5至约30μg磷酸二氢钾、约5至约30μg氯化钾和约0.5至约3.0μg氯化钙每剂量。在一些实施方式中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为单一的0.25ml或单一的0.5ml剂量。在其它实施方式中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为多剂量制剂。
在一个具体实施方式中，本文提供的免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为单一的0.25ml剂量并包含22.5μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、2.05mg氯化钠、40μg磷酸二氢钠、150μg磷酸氢二钠、10μg磷酸二氢钾、10μg氯化钾和0.75μg氯化钙每剂量。
在一个具体实施方式中，本文提供的免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为单一的0.5ml剂量并包含45μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、4.1mg氯化钠、80μg磷酸二氢钠、300μg磷酸氢二钠、20μg磷酸二氢钾、20μg氯化钾和1.5μg氯化钙每剂量。
在一个具体实施方式中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为多剂量制剂，其包含或包括5.0ml的疫苗(0.5ml每剂量)且包含24.5μg的汞(来自硫柳汞)、45μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、4.1mg氯化钠、80μg磷酸二氢钠、300μg磷酸氢二钠、20μg磷酸二氢钾、20μg氯化钾和1.5μg氯化钙每剂量。
在一个具体实施方式中，在灭活病毒被灭活并随后用于本文描述的免疫原性组合物之前在具胚蛋中繁殖含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的灭活病毒。在另一具体实施方式中，在灭活病毒被灭活并随后用于本文描述的免疫原性组合物之前不在具胚蛋中繁殖含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的灭活病毒。在另一具体实施方式中，在灭活病毒被灭活并随后用于本文描述的免疫原性组合物之前在哺乳动物细胞中繁殖含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的灭活病毒，例如，永生化的人细胞(参见，例如，国际申请号PCT/EP2006/067566，公开为国际公开号WO07/045674，其在此全文引入作为参考)、犬肾细胞例如MDCK细胞(参见，例如，国际申请号PCT/IB2007/003536，公开为国际公开号WO08/032219，其在此全文引入作为参考)、Vero细胞、PerC.6细胞或鸭细胞例如EB66细胞。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的单价灭活病毒疫苗。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽)的单价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽)的单价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽)的单价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH5/B嵌合流感血凝素多肽)的单价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH7/1嵌合流感血凝素多肽)的单价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的B/B嵌合流感血凝素多肽)的单价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH4/3嵌合流感血凝素多肽)的单价灭活病毒疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了包含含有和/或包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含两种嵌合流感血凝素多肽的二价灭活病毒疫苗，其中该两种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且两种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自两种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自两种不同的流感毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价灭活病毒疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了包含含有和/或包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含三种嵌合流感血凝素多肽的三价灭活病毒疫苗，其中该三种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且三种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自三种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自三种不同流感病毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价灭活病毒疫苗。
在一个具体实施方式中，灭活病毒疫苗一部分的嵌合流感血凝素多肽在灭活病毒表面上发现和/或表达(例如，灭活流感病毒表面)。
在一个具体实施方式中，本文提供的灭活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/越南/1203/2004(H5)球状头域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。在另一具体实施方式中，本文提供的灭活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。
在一个具体实施方式中，本文提供的灭活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)球状头域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。在另一具体实施方式中，本文提供的灭活病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。
5.10.4裂解病毒疫苗
在一个实施方式中，包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的免疫原性组合物是裂解病毒疫苗。在一些实施方式中，裂解病毒疫苗含有两种、三种、四种或更多不同的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在某些实施方式中，嵌合流感血凝素(HA)多肽是/曾是膜结合的。在某些实施方式中，裂解病毒疫苗包含一种或多种佐剂。
用于产生裂解病毒疫苗的技术是本领域技术人员已知的。作为非限制性的实例，可使用去垢剂破碎的灭活颗粒来制备流感病毒裂解疫苗。可适宜用于按照本文描述的方法的裂解病毒疫苗的一个例子是用于肌肉内使用的流感病毒疫苗(带状纯化的，亚病毒粒子)，其被配制为由具胚蛋中繁殖的流感病毒所制备的无菌悬液。收获含病毒流体并用甲醛灭活。使用连续流离心在线性蔗糖密度梯度溶液中浓缩并纯化流感病毒。然后使用非离子表面活性剂辛苯聚醇-9，(X-100——UnionCarbide，Co.的注册商标)对病毒进行化学破碎，产生“裂解病毒”。然后通过化学手段进一步纯化裂解病毒并悬浮于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。
在某些实施方式中，本文提供了包含约7.5μg至约90μg或10μg至约60μg的一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、约0.01至约1.0mg辛苯聚醇-10(TRITON)、约0.5至0.5mgα-生育酚氢琥珀酸酯、约0.1至1.0mg聚山梨醇酯80(吐温80)、约0.001至约0.003μg氢化可的松、约0.05至约0.3μg硫酸庆大霉素、约0.5至约2.0μg鸡卵蛋白(卵清蛋白)、约25至75μg甲醛和约25至75μg脱氧胆酸钠的裂解病毒疫苗。
在一个具体实施方式中，本文提供的裂解病毒疫苗包含或包括0.5ml剂量，其包含45μg的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、≤0.085mg辛苯聚醇-10(TRITON≤0.1mgα-生育酚氢琥珀酸酯、≤.415mg聚山梨醇酯80(吐温80)、≤0.0016μg氢化可的松、≤0.15μg硫酸庆大霉素、≤1.0鸡卵蛋白(卵清蛋白)、≤50μg甲醛和≤50μg脱氧胆酸钠。在一些实施方式中，0.5ml剂量亚单位疫苗被包装在预填充注射器中。
在一个具体实施方式中，使用在具胚蛋中繁殖的流感病毒制备裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，使用不在具胚蛋中繁殖的流感病毒制备裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，使用哺乳动物细胞中繁殖的流感病毒制备裂解病毒疫苗，例如，永生化的人细胞(参见，例如，国际申请号PCT/EP2006/067566，公开为国际公开号WO07/045674，其在此全文引入作为参考)、犬肾细胞例如MDCK细胞(参见，例如，国际申请号PCT/IB2007/003536，公开为国际公开号WO08/032219，其在此全文引入作为参考)、Vero细胞、PerC.6细胞或鸭细胞例如EB66细胞。
在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的单价裂解病毒疫苗。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽)的单价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽)的单价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽)的单价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH5/B嵌合流感血凝素多肽)的单价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH7/1嵌合流感血凝素多肽)的单价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的B/B嵌合流感血凝素多肽)的单价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒(例如，第5.1节描述的cH4/3嵌合流感血凝素多肽)的单价裂解病毒疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了包含含有和/或包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含两种嵌合流感血凝素多肽的二价裂解病毒疫苗，其中该两种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且两种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自两种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自两种不同的流感毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的二价裂解病毒疫苗。
在具体的实施方式中，本文提供了包含含有和/或包含编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。在某些实施方式中，本文提供了一种包含三种嵌合流感血凝素多肽的三价裂解病毒疫苗，其中该三种嵌合流感血凝素多肽包含来自流感病毒的相同的流感血凝素球状头域且三种嵌合流感血凝素多肽的每一种包含来自三种不同流感病毒的不同流感血凝素干域。在某些实施方式中，流感血凝素干域来自三种不同流感病毒株、亚型或组。在一个具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH5/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cH7/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒、含有和/或包含编码cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒和含有和/或包含编码cB/B嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。在另一具体实施方式中，本文提供了一种包含含有和/或包含编码cH4/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒的三价裂解病毒疫苗。
在一个具体实施方式中，本文提供的裂解病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/越南/1203/2004(H5)球状头域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。在另一具体实施方式中，本文提供的裂解病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH5/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。
在一个具体实施方式中，本文提供的裂解病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)球状头域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。在另一具体实施方式中，本文提供的裂解病毒疫苗不包含含有和/或包含编码含A/佩斯/16/2009(H3)干域的cH7/3嵌合流感血凝素多肽的基因组的病毒。
5.10.5佐剂
在某些实施方式中，本文描述的组合物包含佐剂或与佐剂组合施用。用于与本文描述的组合物组合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同时或之后施用。在一些实施方式中，术语“佐剂”是指一种化合物，当其结合或作为本文描述的组合物的一部分施用时会增加、增强和/或加强对本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的免疫应答，但当该化合物单独施用时不会产生对多肽的免疫应答。在一些实施方式中，佐剂产生对多肽的免疫应答，且不产生过敏或其它不良反应。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，包括，例如，淋巴细胞募集、B和/或T细胞的刺激和巨噬细胞的刺激。
在某些实施方式中，佐剂增加对嵌合流感血凝素(HA)多肽的内源性应答而不会导致会影响应答的定性形式的多肽构象变化。佐剂的具体例子包括但不限于铝盐(alum)(例如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(吐温80；ICLAmericas，Inc.)、咪唑化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857，公开为国际公开号WO2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858，公开为国际公开号WO2007/109813)、Matrix-M(iscanova)、MVA(theJennerInstitute，Oxford)、ISCOMATRIX(CSLBehring)、AddaVax(Invivogen)、polyI:C(Invivogen)，来自Sendai病毒Cantell毒株缺损干扰RNA体外转录的RNA发夹和皂苷，例如QS21(参见Kensil等人，VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach(Powell&Newman编，PlenumPress，NY，1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方式中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是水包油乳剂(如角鲨烯或花生油)，其任选地与免疫刺激剂，如单磷酰脂质A组合(参见Stoute等，N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))。另一佐剂是CpG(BioworldToday，1998年11月15日)。这样的佐剂可以与或不与其它特异性免疫刺激剂如MPL或3-DMP、QS21、聚合的或单体氨基酸如聚谷氨酸或聚赖氨酸或在上文第5.4节中所述的其它免疫增强剂一起使用。在另一个实施方式中，佐剂是一种物理佐剂，如微针和微针贴剂。在另一个实施方式中，佐剂是Toll样受体(TLR)刺激分子如鞭毛蛋白(McSorley等人，2002，J.Immunol.169:3914-3919)。应当理解的是，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的不同制剂可以包含不同佐剂或可以包含相同的佐剂。
5.11预防和治疗用途
在一个方面，本文提供了在对象中利用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物(例如，疫苗制剂)诱导免疫应答的方法。在一个具体实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素(HA)多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或其免疫原性组合物(例如，其疫苗制剂)。在另一实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用有效量的编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸或其免疫原性组合物。在另一实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用有效量的含有或表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的病毒载体或其免疫原性组合物。在又一实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用有效量的用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽刺激的细胞或其药物组合物。在某些实施方式中，用于该方法的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽是源自哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞的纯化的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在一个具体实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用本文描述的亚单位疫苗(参见第5.10.1节)。在另一实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用本文描述的活病毒疫苗(参见第5.10.2节)。在具体实施方式中，活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用本文描述的灭活病毒疫苗(参见第5.10.3节)。在另一实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用本文描述的裂解病毒疫苗(参见第5.10.4节)。在另一实施方式中，用于在对象中诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用本文描述的病毒样颗粒疫苗(参见第5.6节)。在另一实施方式中，用于诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用本文描述的病毒体(参见第5.6节)。在另一实施方式中，用于诱导针对流感病毒血凝素多肽的免疫应答的方法包括对有需要的对象施用表达或工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的细菌或其组合物(参见第5.7节)。在某些实施方式中，用于该方法的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽是源自哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞的纯化的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在一些实施方式中，利用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由流感病毒的亚型或毒株导致的流感病毒感染。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由流感病毒相同亚型内的一种或多种毒株导致的流感病毒感染。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由流感病毒相同亚型的多种毒株导致的流感病毒感染。
在一些实施方式中，利用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由(i)H1N1和H1N2亚型；(ii)H1N1和H3N1亚型；(iii)H1N2和H3N2亚型；和/或(iv)(i)-(iii)和乙型流感的任意组合导致的流感病毒感染。
在某些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于一个HA组(例如，第1组，其包含H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18)而不是其他HA组(例如，第2组，其包含H3、H4、H7、H10、H14和H15)的流感病毒亚型导致的流感病毒感染。例如，诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于包括下述的HA组的流感病毒：H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5和/或H2导致的流感病毒感染。可选的，诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于包括下述的HA组的流感病毒：H3、H4、H14、H10、H15和/或H7导致的流感病毒感染。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由一种、两种、三种、四种或五种流感病毒亚型导致的流感病毒感染。在某些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种流感病毒亚型导致的流感病毒感染。在一个具体实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于H1HA组的一种、两种或多种流感病毒毒株和/或属于H2HA组的一种、两种或多种流感病毒毒株导致的流感病毒感染。在另一具体实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于H1HA组的一种、两种或多种流感病毒毒株；属于H3HA组的一种、两种或多种流感病毒毒株；和/或一种、两种或多种乙型流感病毒毒株导致的流感病毒感染。
在一些实施方式中，利用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由H1N1和H2N2亚型两者导致的流感病毒感染。在其它实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答不能有效预防和/或治疗由H1N1和H2N2亚型两者导致的流感病毒感染。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由H1N1、H2N2和H3N2亚型导致的流感病毒感染。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由H3N2亚型导致的流感病毒感染。在其它实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答不能有效预防和/或治疗由H3N2亚型导致的流感病毒感染。
在某些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于一个HA组而不是其它HA组的流感病毒亚型导致的流感病毒疾病。例如，诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于包括下述的HA组的流感病毒导致的流感病毒疾病：H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5和/或H2。可选的，诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由属于包括下述的HA组的流感病毒导致的流感病毒疾病：H3、H4、H14、H10、H15和/或H7。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由流感病毒的1、2、3、4或5种亚型的任一种导致的流感病毒疾病。在某些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种流感病毒亚型的任一种导致的流感病毒感染流感病毒疾病。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由流感病毒相同亚型的一种或多种毒株导致的流感病毒疾病。
在一些实施方式中，由本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效减少由流感病毒疾病/感染产生的症状。流感病毒疾病/感染的症状包括但不限于身体疼痛(特别是关节和咽喉)、发热、恶心、头痛、眼睛受刺激、乏力、咽喉痛、红眼或皮肤和腹部疼痛。
在一些实施方式中，由本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效减少罹患流感病毒疾病/感染的对象的住院治疗。在一些实施方式中，由本文描述的活性物质或组合物(例如，疫苗制剂)诱导的免疫应答能有效减少罹患流感病毒疾病/感染的对象的住院治疗时间。
在另一方面，本文提供了利用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物(例如，疫苗制剂)来预防和/或治疗对象中的流感病毒感染的方法。在一个实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒感染的方法包括对有需要的对象施用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体或前述任一种组合物。在一个具体实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒感染的方法包括对有需要的对象施用本文描述的亚单位疫苗、活病毒疫苗、灭活病毒疫苗、裂解病毒疫苗或病毒样颗粒疫苗。
在另一方面，本文提供了利用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体或用该多肽刺激的细胞或本文描述的组合物(例如，疫苗制剂)预防和/或治疗对象中的流感病毒感染的方法。在一个具体实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用有效量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或其免疫原性组合物。在另一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用有效量的编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸或其免疫原性组合物。在另一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用有效量的含有或表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的病毒载体或其免疫原性组合物。在又一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用有效量的用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽刺激的细胞或其药物组合物。
在一个具体实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用本文描述的亚单位疫苗。在另一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用本文描述的活病毒疫苗。在具体实施方式中，活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用本文描述的灭活病毒疫苗。在另一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用本文描述的裂解病毒疫苗。在另一实施方式中，预防或治疗流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用本文描述的病毒样颗粒疫苗。在另一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用本文描述的病毒体。在另一实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用表达或工程化改造以表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的细菌或其组合物。
在一个具体实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对其对象施用多价疫苗(例如，二价或三价疫苗)，其中该多价疫苗包含两种或多种嵌合流感血凝素多肽。在某些实施方式中，对对象施用第二多价疫苗(例如，二价或三价疫苗)作为加强，其中该第二多价疫苗包含两种或多种嵌合流感血凝素多肽，且其中该第二多价疫苗不同于第一多价疫苗。在一个具体实施方式中，对于嵌合流感血凝素多肽的血凝素球状头域而言，第二多价疫苗的嵌合流感血凝素多肽不同于第一多价疫苗的嵌合流感血凝素多肽。在某些实施方式中，第二多价疫苗的嵌合流感血凝素多肽的血凝素干域与第一多价疫苗的嵌合流感血凝素多肽的血凝素干域相同。
在另一方面，本文提供了通过施用本文描述的中和抗体预防和/或治疗对象中的流感病毒疾病的方法(参见第5.9节)。在一个具体实施方式中，预防或治疗对象中的流感病毒疾病的方法包括对有需要的对象施用有效量的本文描述的中和抗体或其药物组合物。在具体实施方式中，中和抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，中和抗体不是CR8114、CR8020(Ekiert等人，2011.Science.333(6044):843-850)、FI6(Corti等人，2011.Science.333(6044)850-856,DOI:10.1126/science.1205669)、乙型流感病毒茎域mAbs3A2、10C4或5A7(Yasugi等人，2013.PLoSPathog.9(2):e1003150)、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(FERMBP-4517)、AI3C(FERMBP-4516)或EkiertDC等人(2009)AntibodyRecognitionofaHighlyConservedInfluenzaVirusEpitope.Science(发表于2009年2月26日的ScienceExpress)；Kashyap等人(2008)CombinatorialantibodylibrariesfromsurvivorsoftheTurkishH5N1avianinfluenzaoutbreakrevealvirusneutralizationstrategies.ProcNatlAcadSciUSA105:5986-5991；Sui等人(2009)Structuralandfunctionalbasesforbroad-spectrumneutralizationofavianandhumaninfluenzaAviruses.NatStructMolBiol16:265-273；美国专利号5,589,174、5,631,350、6,337,070和6,720,409；国际申请号PCT/US2007/068983，公开为国际公开号WO2007/134237；国际申请号PCT/US2008/075998，公开为国际公开号WO2009/036157；国际申请号PCT/EP2007/059356，公开为国际公开号WO2008/028946；和国际申请号PCT/US2008/085876，公开为国际公开号WO2009/079259中描述的任何其他抗体。在其它实施方式中，中和抗体不是Wang等人(2010)“BroadlyProtectiveMonoclonalAntibodiesagainstH3InfluenzaVirusesfollowingSequentialImmunizationwithDifferentHemagglutinins,”PLOSPathogens6(2):1-9中描述的抗体。
在某些实施方式中，本文提供的用于在对象(例如，人类或非人动物)中预防或治疗流感病毒疾病或感染的方法导致由本领域技术人员已知的和本文描述的体内和体外分析检测的对象中流感病毒复制的减少。在一些实施方式中，流感病毒的复制减少了大约1log或更多、大约2个log或更多、大约3个log或更多、大约4个log或更多、大约5个log或更多、大约6个log或更多、大约7个log或更多、大约8个log或更多、大约9个log或更多、大约10个log或更多、1-3个log、1-5个log、1-8个log、1-9个log、2-10个log、2-5个log、2-7个log、2个log-8个log、2-9个log、2-10个log3-5个log、3-7个log、3-8个log、3-9个log、4-6个log、4-8个log、4-9个log、5-6个log、5-7个log、5-8个log、5-9个log、6-7个log、6-8个log、6-9个log、7-8个log、7-9个log或8-9个log。
5.11.1联合治疗
在多种实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞或中和抗体可以联合一种或多种其它疗法(例如，抗病毒、抗细菌或免疫调节疗法)对对象施用。在一些实施方式中，本文描述的药物组合物(例如，免疫原性组合物)可以联合一种或多种疗法对对象施用。所述一种或多种其它疗法可以在流感病毒疾病的治疗或预防中有益处或可以改善流感病毒疾病相关症状或病况。在一些实施方式中，该一种或多种其它疗法是镇痛药、抗发热药或缓解或有助于呼吸的疗法。在某些实施方式中，以短于5分钟的间隔、短于30分钟的间隔、1小时的间隔、以约1小时的间隔、以约1至约2小时的间隔、以约2小时至约3小时的间隔、以约3小时至约4小时的间隔、以约4小时至约5小时的间隔、以约5小时至约6小时的间隔、以约6小时至约7小时的间隔、以约7小时至约8小时的间隔、以约8小时至约9小时的间隔、以约9小时至约10小时的间隔、以约10小时至约11小时的间隔、以约11小时至约12小时的间隔、以约12小时至18小时的间隔、18小时至24小时的间隔、24小时至36小时的间隔、36小时至48小时的间隔、48小时至52小时的间隔、52小时至60小时的间隔、60小时至72小时的间隔、72小时至84小时的间隔、84小时至96小时的间隔或96小时至120小时的间隔施用该疗法。在具体的实施方式中，两种或多种疗法在相同患者就诊时施用。
本领域技术人员熟知的任何抗-病毒剂都可用于联合本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或药物组合物。抗病毒剂的非限制性实例包括蛋白质、多肽、肽、融合蛋白抗体、核酸分子、有机分子、抑制和/或减少病毒附着到其受体、病毒内化进入细胞、病毒复制或病毒从细胞释放的无机分子和小分子。特别的，抗病毒剂包括但不限于：核苷类似物(例如，齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、三氟胸苷、和利巴韦林)、膦甲酸、金刚烷胺、帕拉米韦、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、α-干扰素和其它干扰素、AZT、扎那米韦和奥塞米韦其它抗病毒剂包括流感病毒疫苗，例如，(GlaxoSmithKline)、(MedImmune公司疫苗)、(ChironCorporation)、(GlaxoSmithKline)、(CSLBiotherapiesInc.)、(Novartis)或(AventisPasteur)。
在具体的实施方式中，抗-病毒剂是病毒抗原特异性的免疫调节剂。在具体实施方式中，病毒抗原是除血凝素多肽之外的流感病毒多肽。在其它实施方式中，病毒抗原是流感病毒血凝素多肽。
本领域技术人员已知的任何抗-细菌剂可被用于联合本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或药物组合物。抗菌剂的非限制性实例包括阿米卡星、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、两性霉素-B、氨苄西林、氨苄西林舒巴坦、安普霉素、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、青霉素、卡泊芬净、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢地尼、头孢吡肟、头孢克肟、头孢甲肟、头孢哌酮、头孢哌酮舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢泊-克拉维酸、头孢泊肟舒巴坦、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢噻呋、头孢、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、氟苯尼考、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、氯唑西林、粘菌素、复方新诺明(甲氧苄氨嘧啶/磺胺)、达巴万星、达福普汀/奎奴普汀、达托霉素、地贝卡星、双氯西林、多尼培南、强力霉素、恩诺沙星、厄他培南、红霉素、氟氯西林、氟康唑、氟胞嘧啶、磷霉素、夫西地酸、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、庆大霉素、亚胺培南、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、氯碳头孢、Mecillnam(氮脒青霉素)、美罗培南、甲硝唑、美洛西林、美洛西林舒巴坦、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、培氟沙星、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、利福平、罗红霉素、司帕沙星、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、舒巴坦、磺胺甲恶唑、替考拉宁、特拉万星、泰利霉素、替莫西林、四环素、替卡西林、替卡西林-克拉维酸、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶、曲伐沙星、泰乐菌素、万古霉素、维及霉素和伏立康唑。
在一些实施方式中，联合治疗包括用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或本文描述的一种或多种表达载体进行主动免疫和用使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽产生和/或鉴别的一种或多种中和抗体进行被动免疫。在一些实施方式中，联合治疗包括用一种或多种本文描述的表达载体免疫和用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽刺激的细胞的施用(例如，通过继承转移)。
在一些实施方式中，联合治疗包括施用本文描述的两种或多种不同表达载体。
在一些实施方式中，联合治疗包括用诱导针对一个HA组(例如，第1组)中的一种、两种、三种或多种HA亚型的免疫应答的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)进行的主动免疫联合诱导针对其它HA组(例如，第2组)中的一种、两种、三种或多种HA亚型的免疫应答的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)。
在一些实施方式中，联合治疗包括用两种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽进行主动免疫。
5.11.2患者群体
在某些实施方式中，本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物可被施用至未感染对象，即，并未患有由流感病毒感染导致的疾病的对象或之前没有且目前没有感染流感病毒感染的对象。在一个实施方式中，本文描述的活性物质或组合物被施用至具有获得流感病毒感染风险的未感染对象。在一个实施方式中，本文描述的活性物质或组合物被施用至并未患有由特异性流感病毒感染导致的疾病的对象或之前没有且目前没有感染特异性流感病毒感染的对象，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽诱导针对所述特异性流感病毒的免疫应答。本文描述的活性物质或组合物还可以对感染和/或已被感染流感病毒或另一流感病毒类型、亚型或毒株的对象施用，嵌合流感血凝素(HA)多肽诱导针对所述病毒的免疫应答。
在某些实施方式中，本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物被施用至经诊断患有流感病毒感染的患者。在一些实施方式中，本文描述的活性物质或组合物在症状呈现或症状变严重之前(例如，患者需要住院治疗之前)被施用至感染流感病毒的患者。在一些实施方式中，本文描述的活性物质或组合物被施用至感染或被诊断患有与活性物质或组合物所来源的嵌合流感血凝素(HA)多肽头域的流感病毒不同类型的流感病毒的患者。
在某些实施方式中，本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物被施用至可能被或正在被与嵌合流感血凝素(HA)多肽头域属于相同的HA组的流感病毒感染的患者。在某些实施方式中，本文描述的活性物质或组合物被施用至可能被或正在被与嵌合流感血凝素(HA)多肽头域的亚型相同的流感病毒感染的患者。
在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的对象是动物。在某些实施方式中，该动物是鸟。在某些实施方式中，该动物是犬。在某些实施方式中，该动物是猫。在某些实施方式中，该动物是马。在某些实施方式中，该动物是牛。在某些实施方式中，该动物是哺乳动物，例如，马、猪、小鼠或灵长类，优选人类。
在某些实施方式中，待施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的对象是人类成人。在某些实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的对象是大于50岁的人类成人。在某些实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的对象是老年人类对象。
在某些实施方式中，待施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的对象是人类儿童。在某些实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的对象是人类婴儿。在某些实施方式中，施用本文描述的活性物质或组合物的对象不是小于6个月大的婴儿。在一个具体实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的对象是2岁或更小的人类。在另一具体实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的对象是5岁或更小的人类。在另一具体实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的对象是1-5岁的人类。
在具体的实施方式中，待施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的对象是任何年龄大于6个月的婴儿或儿童和任何年龄超过50岁的成人。在其它实施方式中，对象是怀孕的个体。在另一实施方式中，对象是可能或将要在流感季节(例如，一般的，北半球的11月到4月)怀孕的个体。在具体的实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的对象是1、2、3、4、5、6、7或8周之前生产的女性。
在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的人类对象是具有增加的流感病毒感染或由流感病毒感染导致的疾病风险的任何个体(例如，免疫功能低下或免疫缺陷的个体)。在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的人类对象是与具有增加的流感病毒感染或由流感病毒感染导致的疾病风险的个体(例如，免疫功能低下或免疫抑制的个体)密切接触的任何个体。
在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的人类对象是受任何状况影响的个体，所述状况增加流感病毒感染或并发症或流感病毒感染导致的疾病的易感性。在其它实施方式中，本文描述的活性物质或组合物被施用至对象，其中流感病毒感染具有增加该个体感染的或对其具有风险的另一病况的并发症的潜力。在具体实施方式中，增加流感病毒并发症易感性或流感病毒对其增加病况相关的并发症的这些病况是，例如，影响肺部的疾病，如囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、哮喘或细菌感染(例如，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、和沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatus)引起的感染)；心血管疾病(例如，先天性心脏疾病、充血性心脏衰竭、冠状动脉疾病)；内分泌紊乱(如糖尿病)、神经和神经元发育病况(例如，脑、脊髓、外周神经和肌肉紊乱(如脑性麻痹、癫痫(癫痫症)、中风、智力障碍(例如，精神发育迟缓)、肌营养不良、脊髓损伤))。
在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的人类对象是住在福利院的个体，例如疗养院。在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的人类对象在福利院例如疗养院工作或在其中度过大量时间。在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的人类对象是卫生保健工作者(例如，医生或护士)。在一些实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的人类对象是吸烟者。在一个具体实施方式中，待施用本文描述的活性物质或组合物的人类对象是免疫低下或免疫抑制的。
此外，具有增加的发展流感并发症风险的可施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的对象包括：可向具有患并发症的高风险的那些个体传输流感病毒的任何个体，例如，如，高风险的个体家庭成员，包括住户，其中包括年龄小于6个月的婴儿、会与年龄小于6个月的婴儿接触的个体或会与住在养老院或其他长期护理设施的个体接触的个体；患有肺、心脏或循环的长期性疾病的个体；患有代谢性疾病(如糖尿病)的个体；患有肾脏疾病的个体；患有血液系统疾病(包括贫血或镰状细胞病)的个体；免疫系统虚弱的个体(包括药物治疗、恶性肿瘤如癌症、器官移植或HIV感染引起的免疫抑制)；接受长期阿司匹林治疗的儿童(因此其如果感染流感的话具有较高的机会发展Reye综合征)。
在其它实施方式中，施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的对象包括6个月或更大的健康个体，其：计划前往流感疫情可能发生的外国及地区，例如，如，作为热带和南半球的四月到九月；作为有组织的大旅游团的一部分旅游，其中可能包括来自世界上流感病毒流行的地区的人；参加学校或大学并住在宿舍里，或居住在机构环境中；或希望减少患流感疾病的风险。
在一些实施方式中，施用本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的对象禁忌包括流感免疫接种所禁忌的任何个体，例如：小于6个月的婴儿；和对蛋类、蛋类产品或免疫原性制剂生产中使用的其他组分有过敏反应(会导致呼吸困难的过敏反应，其通常伴随着休克)的个体。在某些实施方式中，当由于免疫原性制剂生产中使用的一种或多种组分(例如，由于蛋类或蛋类产品的存在)导致本文描述的活性物质或组合物的施用是禁忌的时，可采用不含导致施用活性物质或组合物成为禁忌的组分的方式生产活性物质或组合物(例如，活性物质或组合物可以不使用蛋类或蛋类产品进行生产)。
在一些实施方式中，对一种或多种下述患者群体不施用活病毒疫苗可能是可取的：老人；婴儿小于6个月大；怀孕的个体；婴儿小于1岁；儿童小于2岁；儿童小于3岁；儿童小于4岁；儿童小于5岁；成人小于20岁；成人小于25岁；成人小于30岁；成人小于35岁；成人小于40岁；成人小于45岁；成人小于50岁；老人超过70岁；老人超过75岁；老人超过80岁；老人超过85岁；老人超过90岁；老人超过95岁；接受阿司匹林或含阿司匹林药物的儿童和青少年(2-17岁)，因为在此年龄组的与阿司匹林和野生型流感病毒感染有关的并发症；有哮喘或其它反应性呼吸道疾病历史的个体；患有可能使其倾向于严重流感感染的慢性潜伏性医疗状况的个体；具有Guillain-Barre综合征历史的个体；患有伴随着发烧的急性重大疾病的个体；或中等或严重生病的个体。对于这些个体，施用本文描述的灭活病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、病毒体、病毒样颗粒或非病毒载体可能是优选的。在某些实施方式中，优选施用活病毒疫苗的对象可包括健康儿童和2-17岁的青少年，和18-49岁的健康成人。
在某些实施方式中，免疫原性制剂包含不与其它活-病毒疫苗同时给予的活病毒载体。
5.12给药方式
5.12.1递送途径
本文描述的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物可通过多种途径递送至对象。这些途径包括但不限于鼻内、气管内、口服、皮内、肌内、腹膜内、经皮、静脉内、眼结膜和皮下途径。在一些实施方式中，组合物被配制用于局部给药，例如，用于应用到皮肤上。在具体的实施方式中，给药途径是经鼻，例如作为鼻喷雾剂的一部分。在某些实施方式中，组合物被配制用于肌内给药。在一些实施方式中，组合物被配制用于皮下给药。在某些实施方式中，组合物不配制用于通过注射施用。在对活病毒疫苗的具体实施方式中，疫苗被配制用于通过注射之外的途径给药。
在所述抗原是病毒载体、病毒样颗粒载体或细菌载体的情况下，例如，可以优选通过载体来源的骨架病毒或细菌的天然感染途径引入免疫原性组合物。可选的，优选通过多肽来源的流感病毒的天然感染途径引入本文所述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。抗原，特别是病毒载体，诱发剧烈分泌和细胞免疫应答的能力可方便地使用。例如，由病毒载体感染呼吸道可能诱导强分泌的免疫应答，例如在泌尿生殖系统中，并伴随针对流感病毒的保护。此外，在一个优选实施方式中，可能希望通过任何合适的途径引入药物组合物至肺部。肺部给药也可以采用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化剂的制剂用作喷雾剂。
在一个具体实施方式中，亚单位疫苗肌肉内给药。在另一实施方式中，活流感病毒疫苗滴鼻给药。在另一实施方式中，灭活流感病毒疫苗或裂解流感病毒疫苗肌肉内给药。在另一实施方式中，病毒样颗粒或其组合物肌肉内给药。
在一些实施方式中，在体外用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽刺激的细胞可使用本领域技术人员已知的技术被引入(或再引入)至对象中。在一些实施方式中，细胞可被引入至真皮中、真皮下或周边血流中。在一些实施方式中，引入对象的细胞优选是来自该对象的细胞，以避免不利的免疫应答。在其它实施方式中，还可以使用来自具有相似免疫背景的捐献者宿主的细胞。也可使用其它细胞，包括设计为避免不利免疫原性应答的那些。
5.12.2给药剂量和频率
在治疗和/或预防流感病毒感染或流感病毒疾病中有效的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物的量将依赖于疾病的性质，并可通过标准临床技术确定。
制剂中使用的精确剂量也将取决于给药途径，和由它引起的感染或疾病的严重性，并应根据医生的判断和各对象的情况来决定。例如，有效剂量还可根据给药方式、靶位点、患者的生理状态(包括年龄、体重、健康)、所述患者是否是人或动物、施用的其它药物，和治疗是预防性的或治疗性的而变化。通常，患者是人类，但也可治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量被最优滴定以最优化安全性和有效性。
在某些实施方式中，使用体外分析来帮助确定最佳剂量范围。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统的剂量应答曲线外推。
编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的核酸的示例性剂量范围为每患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg核酸，例如，DNA。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(例如，以裂解病毒疫苗和亚单位疫苗提供)的示例性剂量范围为每公斤患者体重约0.5μg至1.0μg、1.0μg至2.0μg、2.0μg至5.0μg、5.0μg至10μg、15μg至25μg、25μg至50μg、50μg至100μg、100μg至500μg或500μg至1.0mg的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在其它实施方式中，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的示例性剂量范围为每剂量约0.5μg至1.0μg、1.0μg至2.0μg、2.0μg至5.0μg、5.0μg至10μg、15μg至25μg、25μg至50μg、50μg至100μg、100μg至500μg、250μg至500μg、500μg至1.0mg或750μg至1mg嵌合流感血凝素(HA)多肽，并可对对象施用一次、两次、三次或多于三次，按照需要进行间隔。
感染性病毒载体的剂量可在每剂量10-100或更多个病毒粒子之间变化。在一些实施方式中，合适的病毒载体剂量是102、5x102、103、5x103、104、5x104、105、5x105、106、5x106、107、5x107、108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011、5x1011或1012pfu，并可对对象施用一次、两次、三次或多于三次，按照需要进行间隔。
在某些实施方式中，VLP的示例性剂量范围为约0.01μg至约100mg、约0.1μg至约100mg、约5μg至约100mg、约15μg至约50mg、约15μg至约25mg、约15μg至约10mg、约15μg至约5mg、约15μg至约1mg、约15μg至约100μg、约15μg至约75μg、约5μg至约50μg、约10μg至约50μg、约15μg至约45μg、约20μg至约40μg或约25至约35μg每公斤患者体重。
在一个实施方式中，灭活疫苗被配制从而其含有约5μg至约50μg、约10μg至约50μg、约15μg至约100μg、约15μg至约75μg、约15μg至约50μg、约15μg至约30μg、约20μg至约50μg、约25μg至约40μg、约25μg至约35μg的嵌合流感血凝素(HA)多肽。
在某些实施方式中，活性物质，即本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞或组合物每次作为单一剂量给予对象。例如，之前接触过流感的对象(例如，较老的对象)可不需要多次给药本文描述的活性物质或其组合物，而是通过用本文描述的活性物质或其组合物免疫一次即可能足以被免疫。可选的，之前接触过流感的对象(例如，较老的对象)可能需要多次给药本文描述的活性物质或其组合物，但是可能比未感染的对象(即，之前未接触流感的对象)需要较少的所述给药以变得充分免疫接种。从而，在某些实施方式中，未感染对象可能需要用本文描述的活性物质或其组合物进行第一免疫(例如，初免)，然后用本文描述的活性物质或其组合物进行一次、两次或多次额外的免疫(例如，加强)。
在一个具体实施方式中，当对象被连续施用多于一次本文描述的活性物质或其组合物(例如，作为免疫方案的一部分)，在连续给药(即，第一次给药后发生的给药)中使用的活性物质或其组合物的嵌合流感血凝素(HA)多肽不同于第一次给药中使用的活性物质或其组合物的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在具体的实施方式中，在连续给药中使用的活性物质或其组合物的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含与第一次给药中使用的活性物质或其组合物的嵌合流感血凝素(HA)多肽不同的球状头域，但是包含与第一次给药中使用的活性物质或其组合物的嵌合流感血凝素(HA)多肽相同的HA干域，但是包含相同的HA干域。在具体的实施方式中，在连续给药中使用的活性物质或其组合物的嵌合流感血凝素(HA)多肽包含与第一次给药中使用的活性物质或其组合物的嵌合流感血凝素(HA)多肽不同的球状头域和不同的HA干域。
在某些实施方式中，活性物质或组合物(例如，包含活性物质的组合物)作为单一被施用至对象，随后在3至6周后施用第二剂量。在某些实施方式中，活性物质或组合物作为单一被施用至对象，随后在3至6周后施用第二剂量，然后在3至6周后施用第三剂量。在某些实施方式中，第二次和/或第三次给药可利用不同的活性物质或组合物。在具体的实施方式中，施用的活性物质或组合物中每种嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域彼此不同，例如，第一次和第二次或第一次、第二次和第三次给药各使用不同活性物质或组合物，其中至少所施用的每种活性物质或组合物中的嵌合流感血凝素(HA)多肽的球状头域不同。按照这些实施方式，加强接种可在第二次接种后例如，3-6个月，6-9个月或6-12个月的间隔被施用至对象。在某些实施方式中，加强接种可利用不同的活性物质或组合物。在某些实施方式中，第一(初免)给药包含全长血凝素或其片段(或其编码核酸)，且第二(加强)给药包含施用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽(或其编码核酸、包含其的VLP或表达其的病毒或细菌)。在一些实施方式中，相同的活性物质或组合物的施用可重复进行，且给药可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在某些实施方式中，活性物质或组合物每年一次作为单一剂量给予对象。
在对儿童给药的具体的实施方式中，以至少一个月的间隔给予的两个剂量的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物被给予儿童。在对成人给药的具体的实施方式中，给予单一剂量。在另一实施方式中，以至少一个月的间隔给予的两个剂量的活性物质或组合物被给予成人。在另一实施方式中，年幼儿童(6个月-9岁)可在第一次以间隔1个月的两个剂量给予活性物质或组合物。在一个具体实施方式中，在其免疫接种第一年仅接受一个剂量的儿童应当在下一年接受两个剂量。在一些实施方式中，对于第一次给药流感疫苗(例如，本文描述的免疫原性制剂)的2-8岁儿童，优选间隔4周给予两个剂量。在某些实施方式中，对于6-35个月大的儿童，相比超过3岁的对象可以优选的0.5ml剂量而言可优选一半剂量(0.25ml)。
在一个具体实施方式中，对于对人类婴儿给药，两个剂量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或其组合物和/或一种或多种本文描述的核酸、载体、VLP或病毒体被给予婴儿，其中第一剂量中所用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的流感病毒血凝素头域来自与第二剂量中所用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的流感病毒血凝素头域不同的毒株或亚型。第一和第二次给药可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
在一个具体实施方式中，，对于对人类婴儿给药，三个剂量的本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或其组合物和/或一种或多种本文描述的核酸、载体、VLP或病毒体被给予婴儿，其中第一、第二和第三剂量中所用的嵌合流感血凝素(HA)多肽的流感病毒血凝素头域来自流感病毒的不同毒株或亚型。第一、第二和第三次给药可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
在具体实施方式中，活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽、编码该多肽的核酸、包含或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)、用该多肽刺激的细胞)或组合物在秋天或冬天给予对象，即，在每个半球的流感季节之前或之间。在一个实施方式中，对儿童在季节初期给予其第一剂量，例如，北半球9月底或10月初，从而第二剂量可在流感季节高峰之前给予。
对于用抗体进行被动免疫(例如，使用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽产生和/或鉴别的抗体)，剂量范围为约0.0001-100mg/kg和更常见的0.01-5mg/kg患者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内或换句话说，对于一名70kg的患者为70mg或700mg或分别在70-700mg范围内。示例性的治疗方案需要每隔两周给药一次或一月一次或每隔3-6个月一次，为期一年或几年或间隔几年。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体同时给药，在该情况下给药的每种抗体的剂量落入所示范围内。通常在多个时机给予抗体。单一剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。还可以通过检测患者中针对嵌合流感血凝素(HA)多肽的抗体的血液水平所示采用不规则间隔。
5.13生物学分析
5.13.1检测嵌合流感病毒血凝素多肽活性的分析
用于检测嵌合流感血凝素(HA)多肽在本文公开的载体中表达的分析可以使用任何本领域已知的分析进行。例如，对整合入病毒载体的分析包括生长病毒、通过蔗糖垫(cushion)离心纯化病毒颗粒和随后使用本领域熟知的方法通过免疫分析(例如蛋白质印迹)来分析嵌合流感血凝素(HA)多肽的表达。用于确定血凝素多肽是否是嵌合的的方法是本领域技术人员已知的和本文描述的。
在一个实施方式中，通过测试其特异性结合针对流感病毒血凝素多肽，例如多肽的茎域区域的中和抗体的能力使用本领域已知的任何抗体-抗原相互作用分析方法对本文公开的嵌合流感血凝素(HA)多肽分析了正确折叠和功能。使用的中和抗体的例子包括，例如，Ekiert等人，2009，ScienceExpress，2009年2月26日；Kashyap等人，2008，ProcNatlAcadSciUSA105：5986-5991；Sui等人2009，NatureStructuralandMolecularBiology，16:265-273；Wang等人，2010，PLOSPathogens6(2):1-9；美国专利号5,589,174，5,631,350，6,337,070和6,720,409；国际申请号PCT/US2007/068983，公开为国际公开号WO2007/134237；国际申请号PCT/US2008/075998，公开为国际公开号WO2009/036157；国际申请号PCT/EP2007/059356，公开为国际公开号WO2008/028946；和国际申请号PCT/US2008/085876，公开为国际公开号WO2009/079259中描述的中和抗体。这些抗体特别包括CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(FERMBP-4517)、AI3C(FERMBP-4516)、CR8114、CR8020(Ekiert等人，2011.Science.333(6044)：843-850)、FI6(Corti等人，2011.Science.333(6044)850-856，DOI:10.1126/science.1205669)、乙型流感病毒茎域mAbs3A2、10C4或5A7(Yasugi等人，2013.PLoSPathog.9(2):e1003150)。
在另一实施方式中，通过使用本领域已知的任何方法(例如，如，NMR、X-射线晶体学方法或二级结构预测方法，例如，圆二色性)测定嵌合流感血凝素(HA)多肽的结构或构象来对本文公开的嵌合流感血凝素(HA)多肽分析其正确折叠。
5.13.2检测使用嵌合流感病毒血凝素多肽产生的抗体的活性的分析
本文描述的抗体可以本领域技术人员已知的多种方式进行表征(例如ELISA、表面等离子共振展示(BIAcore)、蛋白质印迹、免疫荧光、免疫染色和/或微中和分析)。在一些实施方式中，分析了抗体特异性结合嵌合流感血凝素(HA)多肽或包含所述多肽的载体的能力。该分析的进行可在溶液中(例如，Houghten，1992，Bio/Techniques13:412421)、在珠上(Lam，1991，Nature354:8284)、在芯片上(Fodor，1993，Nature364:555556)、在细菌上(美国专利号5,223,409)、在孢子上(美国专利号5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、在质粒上(Cull等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89:18651869)或在噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science249:386390；Cwirla等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA87:63786382；和Felici，1991，J.Mol.Biol.222:301310)(这些文献的每一篇都在此全文引入作为参考)。
抗体与嵌合流感血凝素(HA)多肽的特异性结合和与其它抗原的交叉反应性可采用本领域已知的任何方法进行评价。可被用于分析特异性结合和交叉反应性的免疫分析包括但不限于使用如放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“三明治”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫辐射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析等技术的竞争性和非竞争性分析系统，仅举几例。这些分析是常规和本领域熟知的(参见，例如，Ausubel等人编辑，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology，第1卷，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，其在此全文引入作为参考)。
抗体与嵌合流感血凝素(HA)多肽的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离速率可通过竞争性结合分析来确定。竞争性结合分析的一个例子是放射免疫分析，包括标记的抗原(例如，3H或125I)与目的抗体在增加量的未标记抗原的存在下进行孵育，和结合于标记抗原的抗体的检测。抗体对嵌合的流感血凝素(HA)多肽的亲和力和结合解离速率可以通过来自Scatchard作图分析的数据来确定。与第二抗体的竞争也可以通过使用放射免疫分析来确定。在这种情况下，嵌合流感血凝素(HA)多肽与缀合标记化合物(例如，3H或125I)的测试抗体在增加量的未标记第二抗体存在下一起孵育。
在某些实施方式中，抗体的结合亲和力和速率常数使用KinExA3000系统(SapidyneInstruments，Boise，ID)检测。在一些实施方式中，表面等离子共振(例如，BIAcore动力学)分析被用于测定抗体与流感病毒血细胞凝集素多肽结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽从芯片上的结合和解离，所述芯片在其表面上固定化嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的抗体。一个典型的BIAcore动力学研究涉及将含有0.005％吐温-20HBS的缓冲液中的不同浓度的250μL抗体试剂(mAb，Fab)注射至传感器芯片表面上，其上已固定嵌合流感血凝素(HA)多肽。流速保持恒定在75μL/min。解离数据按照需要收集15分钟或更长的时间。在各注射/解离周期后，采用简短的、1分钟脉冲的稀释的酸，典型地为10-100mMHCl将结合的抗体从流感病毒血凝素多肽表面除去，虽然其他再生剂被用作环境保证(warrant)。更具体地，为了检测关联速率kon和离解速率koff，的速率的测定中，将多肽通过使用标准胺偶联化学，即EDC/NHS方法(EDC＝N-二乙基氨基)-碳二亚胺)直接固定在传感器芯片表面。简要地，制备了多肽的10mM醋酸钠、pH4或pH5的5-100nM溶液，并使之经过EDC/NHS活化的表面，直到大约30-50RU值(worth)的多肽被固定。在此之后，用注射1M的Et-NH2“盖帽”关闭未反应的活性酯。在相同的固定化条件下制备不含多肽的空白表面以供参比目的。一旦制备了合适的表面，即在HBS/吐温-20中制备每种抗体试剂的合适的稀释系列，并通过被串联连接的两种多肽和参照细胞表面。取决于平衡结合常数KD的估计值，被制备的抗体浓度的范围发生变化。如上所述，结合的抗体在每个注射/解离周期后用适当的再生剂除去。
抗体的中和活性可以利用本领域技术人员公知的任何分析方法进行分析。可以使用本领域技术人员已知的技术对本文描述的抗体分析它们抑制流感病毒或者包含嵌合流感血凝素(HA)多肽的任何其他组合物(例如，VLP、脂质体或去垢剂提取物)结合其宿主细胞受体(即唾液酸)的能力。例如，表达流感病毒受体的细胞可以与包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的组合物在抗体存在或不存在下接触，抗体的抑制抗原结合的能力可以通过例如，流式细胞术或闪烁分析进行检测。包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或抗体的组合物可以用可检测化合物如放射性标记(例如，32P、35S和125I)或荧光标记(例如，异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺)进行标记，以能够检测包含本文所述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的组合物和细胞受体之间的相互作用。可选的，抗体抑制本文中所描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽与其受体结合的能力可以在无细胞分析法中确定。例如，包含本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的组合物可与抗体接触，抗体抑制包含嵌合流感血凝素(HA)多肽的组合物结合细胞受体的能力可以被确定。在一个具体的实施方式中，抗体被固定在固体支持物上，包含流感病毒血细胞凝集素多肽的组合物用可检测的化合物标记。可选的，包含本文所述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的组合物被固定在固体支持物上，抗体用可检测的化合物标记。在某些实施方式中，抗体抑制本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽结合细胞受体的能力通过评估抗体相对于对照(例如，已知抑制嵌合流感血凝素(HA)多肽结合细胞受体的抗体)结合抑制的百分率来确定。
在其它实施方式中，适合用于本文描述的方法的抗体不抑制流感病毒受体结合，但仍在本文描述的分析中发现是中和的。在一些实施方式中，适合用于按照本文描述的方法的抗体在本领域已知的或本文描述的分析中减少或抑制病毒-宿主膜融合。
在一个实施方式中，病毒-宿主膜融合在体外进行分析，其中使用含报告子的流感病毒和能够被病毒感染的宿主细胞。如果报告子活性与阴性对照(例如，报告子在对照抗体存在下或不存在抗体下的活性)相比被抑制或减少，则该抗体抑制融合。
在一个实施方式中，病毒-宿主膜融合使用细胞融合模型系统检测。在示例性的细胞融合分析中，细胞(例如，HeLa细胞)被转染编码本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的质粒并在抗体存在下接触和暴露于允许嵌合流感血凝素(HA)多肽融合功能的缓冲液中(例如，pH5.0缓冲液)。如果抗体与阴性对照(例如，在对照抗体存在下或不存在抗体下的合胞体形成)相比减少或抑制合胞体形成，则该抗体是中和的。
在其它实施方式中，使用体外的基于脂质体的分析对病毒-宿主膜融合进行了分析。在一个示例性的分析中，宿主细胞受体被重构至含有报告子一半的脂质体中。本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽被重构至另一系列的含有报告子另一半的脂质体中。当两种脂质体群一起混合时，通过报告子的重构，例如，可通过色度法检测到的酶反应检测到融合。如果报告子活性与在不存在抗体或存在对照抗体的分析中的报告子活性相比被减少或抑制，则抗体抑制融合。在某些实施方式中，抗体抑制融合的能力通过评价抗体存在下的融合百分比相对于对照存在下的融合百分比来确定。
5.13.3检测受刺激细胞活性的分析
可以对按照本文描述的方法刺激的细胞分析目标多核苷酸或基因的整合、转录和/或表达、整合的基因的拷贝数和整合的位置。该分析可在任何时间进行，且可以通过任何本领域已知的方法进行。在其它实施方式中，用本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽对靶细胞的成功刺激通过使用本领域已知的或本文描述的方法检测针对嵌合流感血凝素(HA)多肽的中和抗体的产生来确定。
在某些实施方式中，可以通过任何本领域已知的或本文描述的方法对施用受刺激细胞例如DC的对象分析其细胞位置、载体递送的编码嵌合流感血凝素(HA)多肽的多核苷酸或基因的表达、免疫应答的刺激(例如，嵌合流感血凝素(HA)多肽的中和抗体的产生)和/或监控与流感病毒感染或其相关疾病有关的症状。
报告子分析可被用于确定本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的靶向特异性。例如，可从对象获得混合的骨髓细胞群并在体外培养。可以对混合的骨髓细胞群施用嵌合流感血凝素(HA)多肽，并可在培养的细胞中分析与fl嵌合流感血凝素(HA)多肽有关的报告子基因的表达。在一些实施方式中，混合细胞群中至少约50％、更优选至少约60％、70％、80％或90％、更加优选至少约95％的受刺激细胞是树突细胞。
5.13.4抗病毒活性分析
本文描述的抗体或其组合物可在体外评价其抗病毒活性。在一个实施方式中，对抗体或其组合物在体外检测了其对于流感病毒生长的影响。流感病毒的生长可通过任何本领域已知的或本文描述的方法评价(例如在细胞培养中)。在一个具体实施方式中，细胞感染0.0005和0.001、0.001和0.01、0.01和0.1、0.1和1或1和10的MOI或0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10的MOI并用补充的无血清培养基孵育。通过血凝素噬斑或本文描述的任何其它病毒分析在上清液中测定病毒滴度。病毒滴度可被评价的细胞包括但不限于EFK-2细胞、Vero细胞、MDCK细胞、原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人类上皮细胞系和HeLa细胞。体外分析包括在体外培养的细胞中使用本领域熟知的或本文描述的方法检测改变的病毒复制(如通过例如噬斑形成检测)或病毒蛋白的产生(如通过例如蛋白质印迹分析检测)或病毒RNA(如通过例如RT-PCR或RNA印迹分析检测)。
在一个非限制性实施例中，单层的靶哺乳动物细胞系被感染不同量(例如，3噬斑形成单位(pfu)或5pfu的倍数)的病毒(例如，流感)并随后在各种稀释度的抗体(例如，0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml或10μg/ml)存在或不存在下培养。感染的培养物在感染后48小时或72小时收获，并在合适的靶细胞系(例如，Vero细胞)上通过本领域已知的标准噬斑分析滴定。
在一个血凝集分析的非限制性实施例中，使细胞接触抗体，并同时或随后感染病毒(例如，MOI为1)，将病毒在允许病毒复制的条件下孵育(例如，20-24小时)。优选的抗体在整个感染过程中都存在。然后通过血凝集分析使用0.5％鸡红血细胞测定了病毒复制和病毒颗粒释放。参见，例如，Kashyap等人，PNASUSA105：5986-5991。在一些实施方式中，如果一种化合物减少至少2个孔的HA的病毒复制(其大致等于病毒滴度减少75％)，则其被认为是病毒复制抑制剂。在具体的实施方式中，在此分析中病毒滴度抑制或减少50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多或95％或更多。在其它具体实施方式中，抑制剂导致对象中的流感病毒滴度减少大约1个log或更多、大约2个log或更多、大约3个log或更多、大约4个log或更多、大约5个log或更多、大约6个log或更多、大约7个log或更多、大约8个log或更多、大约9个log或更多、大约10个log或更多、1-3个log、1-5个log、1-8个log、1-9个log、2-10个log、2-5个log、2-7个log、2个log-8个log、2-9个log、2-10个log3-5个log、3-7个log、3-8个log、3-9个log、4-6个log、4-8个log、4-9个log、5-6个log、5-7个log、5-8个log、5-9个log、6-7个log、6-8个log、6-9个log、7-8个log、7-9个log或8-9个log。流感病毒滴度的log-减少可与阴性对照相比较、与另一治疗相比较或与抗体给药前患者中的滴度相比较。
5.13.5细胞毒性分析
本领域熟知的很多分析方法可被用于评价接触活性物质或其组合物之后的细胞或细胞系的活力(感染或未感染的)，并从而测定化合物或组合物的细胞毒性。例如，细胞增殖可以通过检测溴脱氧尿苷(BrdU)引入(参见，例如，Hoshino等人，1986，Int.J.Cancer38，369；Campana等人，1988，J.Immunol.Meth.107:79)、(3H)胸苷引入(参见，例如，Chen，J.，1996，Oncogene13:1395-403；Jeoung，J.，1995，J.Biol.Chem.270:1836773)、通过直接细胞计数或通过检测转录、翻译中的变化或已知基因例如原癌基因(例如，fos、myc)的活性或细胞周期标志物(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)进行分析。该蛋白和mRNA和活性的水平可通过本领域熟知的任何方法测定。例如，可以使用抗体，包括可商购的抗体通过已知的免疫诊断方法例如ELISA、蛋白质印迹或免疫沉淀对蛋白质进行定量。可以使用本领域公知和常规的技术，例如使用Northern分析、RNase保护或聚合酶链式反应结合反转录来定量mRNA。细胞活力可以通过使用台盼蓝染色法或本领域中已知的其他细胞死亡或生存的标志物进行评价。在一个具体的实施方式中，细胞ATP的水平被测量以确定细胞活力。
在具体的实施方式中，在为期三天和七天时间内使用本领域中的分析标准，如测量细胞内ATP水平的CellTiter-Glo分析试剂盒(Promega)测定细胞活力。细胞ATP的减少是细胞毒性作用的指示物。在另一具体实施方式中，细胞活力可以在中性红摄取分析中测量。在其他实施方式中，对形态学变化的视觉观察可以包括放大、粒度、边缘参差不齐的细胞、薄膜状的外观、圆形(rounding)、从孔表面脱离或其他变化。按照观察到的细胞毒性程度，对这些变化给出T(100％毒性)、PVH(部分有毒-非常重-80％)、PH值(部分有毒-重-60％)、P(部分有毒-40％)、PS(部分有毒-轻-20％)、或0(无毒性0％)的指示。50％细胞抑制性(细胞毒性)的浓度(IC50)由这些数据的回归分析确定。
在一个具体的实施方式中，在细胞毒性分析中使用的细胞是动物细胞，包括原代细胞和细胞系。在一些实施方式中，细胞是人细胞。在某些实施方式中，细胞毒性在一种或多种下述细胞系中评价：U937，人单核细胞系；原代外周血单核细胞(PBMC)；Huh7，人肝母细胞瘤细胞系；293T，人胚肾细胞系；和THP-1，单核细胞。在某些实施方式中，细胞毒性在一种或多种下述细胞系中评价：MDCK、MEF、Huh7.5、Detroit或人气管上皮(HTBE)细胞。
可以在动物模型中对活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)或其组合物的体内毒性进行测试。例如，用于测试活性物质活性的本文描述的和/或其它本领域已知的动物模型也可以用来确定这些化合物的体内毒性。例如，对动物施用一定浓度范围的活性物质。接着，对动物随时间监测致死率、体重减轻或体重未增加和/或血清标志物的水平，其可以指示组织损伤(例如，肌酸磷酸激酶水平作为一般组织损伤的指标，谷氨草酸转氨酶或丙酮酸转氨酶的水平作为可能的肝损伤的指标)。这些体内分析也可适于测试各种给药模式和/或治疗方案以及剂量的毒性。
活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的毒性和/或药效可通过标准药学方法在例如用于确定LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(群体的50％治疗有效的剂量)的细胞培养物或实验动物中确定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比率LD50/ED50。表现出大的治疗指数的活性物质是优选的。虽然可以使用显示出毒性副作用的活性物质，但是应当小心设计靶向此类试剂至受影响组织的部位的递送系统，以便最小化对未感染细胞的潜在损害，并由此减少副作用。
从细胞培养分析和动物研究获得的数据可用于配制一系列的人用活性物质的剂量。这些药剂的剂量优选处于循环浓度范围包括具有很少或没有毒性的ED50的范围内。剂量可以在此范围内根据所使用的剂型和利用的施用途径而变化。对于在本文中所描述的方法中使用的任何活性物质，有效剂量可以最初从细胞培养试验估计。剂量可以在动物模型中配制，以达到如在细胞培养中确定的包括IC50的循环血浆浓度范围(即，实现了半最大抑制症状的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更准确地确定在人类中有用的剂量。血浆中的水平可以被测量，例如通过高效液相色谱法。关于剂量确定的附加信息在本文中提供。
此外，本领域技术人员已知的任何分析都可被用于评价本文描述的活性物质和组合物的预防和/或治疗应用，例如，通过检测病毒感染或其相关的病况或症状。
5.13.6体内抗病毒活性
活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)和其组合物可在体内测定在人类中使用之前所需的治疗或预防活性。例如，体内测定法可用于确定是否优选施用活性物质或其组合物和/或另一种治疗。例如，为了评估活性物质或组合物在防止流感病毒疾病中的用途，该组合物可以在动物感染流感病毒前进行给药。可选的或另外，活性物质或其组合物可以在该动物感染流感病毒的同时施用给动物。为了评估活性物质或组合物在治疗流感病毒感染或相关疾病中的用途，化合物或组合物可在用流感病毒感染动物后给药。在一个具体的实施方式中，活性物质或其组合物超过一次施用至所述动物。
活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)和其组合物可以在动物模型系统中测试其抗病毒活性，所述动物模型系统包括但不限于，大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、雪貂、山羊、绵羊、狗、兔、豚鼠等。在一个具体的实施方式中，活性物质及其组合物在小鼠模型系统中测试。这种模型系统被广泛地使用，并且对本领域技术人员而言是熟知的。在一个具体的实施方式中，活性物质及其组合物在小鼠模型系统中测试。用于流感病毒的动物模型的非限制性例子在本节中提供。
通常，使动物感染流感病毒，并同时或随后用活性物质或其组合物或安慰剂治疗。可选的，用活性物质或其组合物或安慰剂治疗动物，并随后用流感病毒感染。从这些动物中获得的样品(例如，血清、尿、痰、精液、唾液、血浆或组织样品)可用于通过本领域中公知的方法检测病毒复制，例如，检测改变的病毒滴度(如通过例如噬斑形成检测)、病毒蛋白的产生(如通过例如蛋白质印迹分析检测)或病毒RNA的产生(如通过例如RT-PCR或RNA印迹分析检测)。对于组织样品中病毒的定量，组织样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆，澄清的匀浆的稀释液在37℃下吸附1小时至单层细胞(例如，Vero细胞、CEF或MDCK细胞)。在其他试验中，在感染后进行组织病理学评价，优选对已知病毒靶向感染的器官进行评价。病毒免疫组织化学可使用病毒特异性单克隆抗体进行。
活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)或其组合物对病毒毒性的效果还可使用体内分析进行测定，其中评价了给药活性物质或其组合物的受感染对象中的病毒滴度、给药活性物质或其组合物的受感染对象的存活长度、给药活性物质或其组合物的受感染对象中的免疫应答、给药活性物质或其组合物的受感染对象中的症状的数量、时间和/或严重程度和/或给药活性物质或其组合物的受感染对象中一种或多种症状发生前的时间周期。本领域技术人员已知的技术可被用于检测所述效果。在某些实施方式中，活性物质或其组合物导致与未治疗对象相比0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或更多的流感病毒滴度减少。在一些实施方式中，活性物质或其组合物导致与未治疗对象相比流感病毒滴度减少大约1个log或更多、大约2个log或更多、大约3个log或更多、大约4个log或更多、大约5个log或更多、大约6个log或更多、大约7个log或更多、大约8个log或更多、大约9个log或更多、大约10个log或更多、1-3个log、1-5个log、1-8个log、1-9个log、2-10个log、2-5个log、2-7个log、2个log-8个log、2-9个log、2-10个log3-5个log、3-7个log、3-8个log、3-9个log、4-6个log、4-8个log、4-9个log、5-6个log、5-7个log、5-8个log、5-9个log、6-7个log、6-8个log、6-9个log、7-8个log、7-9个log或8-9个log。
已描述了被开发用于检测针对流感病毒的抗病毒剂的流感病毒动物模型，例如白鼬、小鼠、豚鼠、松鼠、猴、猕猴和鸡。参见，例如，Sidwell等人，AntiviralRes.，2000，48:1-16；LowenA.C.等人，PNAS.，2006，103：9988-92；和McCauley等人，AntiviralRes.，1995，27:179-186和Rimmelzwann等人，AvianDiseases，2003，47:931-933。对于流感的小鼠模型，可被用于分析对流感感染的小鼠施用的活性物质的抗病毒活性的参数的非限制性例子包括肺炎相关死亡、血清α1酸性糖蛋白的增加、动物体重、通过血凝素的肺病毒分析、通过噬斑测定法的肺病毒分析和肺部组织病理学变化。进行统计分析以计算显著性(例如，0.05或更小P值)。
在其它分析中，在动物模型对象感染后进行组织病理学评价。可检测鼻甲和气管的上皮变化和上皮下发炎。对肺部可检查大、中、小和细支气管中的细支气管上皮细胞变化和细支气管周炎症。还评价肺泡的炎症变化。将中细支气管分为0至3+个等级，如下：0(正常：由中等至高的柱状上皮细胞填满，具有纤毛顶端边界和基底核假复层；最少的炎症)；1+(上皮层外形为柱状且平坦，只略有增加的增殖；在许多细胞上仍然可见纤毛)；2+(上皮细胞层显著改变，其范围从衰减到显著的增殖；细胞排列紊乱及管腔边界轮廓层不规则)；3+(上皮层显著破坏和混乱，管腔中可见坏死细胞；一些细支气管衰减且其他处于显著的反应性增生)。
气管分为0至2.5+的如下等级：0(正常：由中等至高的柱状上皮细胞填满，具有纤毛顶端边界、核基底和假复层。顶端边界和核之间细胞质明显。偶然有鳞状细胞小病灶)；1+(上皮细胞层的焦点鳞状化生)；2+(很多上皮细胞层的弥漫性鳞状上皮化生，纤毛可为明显灶性)；2.5+(弥漫性鳞状上皮化生，极少数纤毛明显)。
使用病毒特异性单克隆抗体(例如NP-、N-或HN特异性单克隆抗体)进行病毒免疫组织化学。染色分为0至3+的等级，如下：0(无感染的细胞)；0.5+(少数感染的细胞)；1+(少感染的细胞，如广泛分离的单个细胞)；1.5+(少数感染的细胞，如广泛分离的单个细胞和小簇)；2+(中等数量的受感染细胞，通常影响皮层衬细支气管的部分或者在肺泡中的小的亚小叶簇的邻近细胞)；3+(众多感染的细胞，影响细支气管的大部分上皮层，或在肺泡中的大亚小叶簇众扩散)。
在一个实例中，诱导肺部损伤和导致病毒感染的动物模型中的感染的能力与使用野生型病毒和模拟病毒进行了比较。肺部损伤可通过视觉检查健康的肺叶的百分比来评价。免疫后(p.i.)5天通过静脉内给药戊巴比妥使动物安乐死，并将它们的肺完全去除。通过视觉估计每个肺叶表面受肉眼可见损伤影响的百分比。百分比被平均以获得每个动物的7个肺叶的平均值。在其他试验中，可以测试鼻拭子以确定病毒负载或滴度。可以在尸体解剖中取出鼻拭子以确定感染后的病毒负载。
在一个实施方式中，在组织样品中进行病毒定量。例如，组织样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆，澄清的匀浆稀释液在37℃下吸附1小时至单层细胞(例如，MDCK细胞)。然后用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.01％DEAE-葡聚糖、0.1％NaHCO3和1％琼脂的最小必需培养基溶液覆盖受感染的单层。将板温育2到3天，直到噬斑可以被可视化。如下进行组织培养感染剂量(TCID)分析，以从PR8感染的样品中滴定病毒。将96孔板的细胞(例如，MDCK细胞)的汇合单层与在培养基中的澄清组织匀浆物的对数稀释物一起孵育。接种后二到三天，通过血凝集分析(HA分析)评价了每个孔中0.05毫升的等分试样的病毒生长。
5.13.6.1.1人类中的分析
在一个实施方式中，调节流感病毒复制的活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)或其组合物在受感染的人类对象中进行评价。根据该实施方式，活性物质或其组合物对人类对象施用，且活性物质或组合物对病毒复制的影响通过例如分析生物样品(例如，血清或血浆)中的病毒或病毒核酸的水平进行测定。改变病毒复制的活性物质或其组合物可通过比较用对照治疗的对象或对象的组中的病毒复制水平和用活性物质或其组合物治疗的对象或对象的组中的病毒复制水平来进行鉴定。可选的，病毒复制的改变可通过比较施用活性物质或其组合物前后的对象或对象的组中的病毒复制水平来进行鉴定。可使用本领域技术人员已知的技术获得生物样品和分析mRNA或蛋白表达。
在另一实施方式中，在受感染的对象中评价了活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)或其组合物对流感病毒感染/疾病相关的一种或多种症状的严重程度的影响。根据该实施方式，对患有流感病毒感染的人类对象施用活性物质或其组合物或对照，并测定活性物质或组合物对病毒感染的一种或多种症状的效果。减少一种或多种症状的活性物质或其组合物可通过比较用对照治疗的对象和用活性物质或组合物治疗的对象来鉴定。在一个具体实施方式中，施用活性物质(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)或其组合物导致减少由流感病毒疾病或感染导致的人或人群的住院治疗。在另一具体实施方式中，施用活性物质或其组合物导致流感病毒疾病或感染的人或人群对呼吸/喘息辅助工具的需求减少。在另一具体实施方式中，施用活性物质或其组合物导致流感病毒疾病或感染的人或人群的疾病长度减少。在另一具体实施方式中，施用活性物质或其组合物导致由例如整体或肺部体积描记法评价的肺容量的改进(例如，增加)。在另一实施方式中，活性物质或其组合物被施用至健康人类对象并监控其作为疫苗的效果(例如，对象被监控流感病毒感染症状的发生；流感病毒感染对象的能力；和/或一种或多种流感病毒感染相关症状的减少/缺失)。熟悉感染性疾病的内科医生所知晓的技术可被用于测定活性物质或其组合物是否减少流感病毒疾病相关的一种或多种症状。
5.14在对象中评价抗体
在另一方面，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或表达本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽的病毒可被用于评价对象(例如，未感染对象或免疫的/免疫接种的对象)或对象群对流感病毒血凝素多肽(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的抗体应答。在具体的实施方式中，嵌合流感病毒血凝素多肽或表达嵌合流感病毒血凝素多肽的病毒可被用于在对象或对象群中评价干特异性抗体的存在。
在一个具体实施方式中，评价了被免疫/免疫接种流感病毒血凝素多肽(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或表达本文描述的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的病毒)的对象或对象群的抗体应答，以鉴定对象或对象群中茎域-特异性抗体的类型。该评价可允许鉴定替代标记/端点，其在测定针对施用本文描述的流感病毒HA多肽(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽或表达本文描述的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的病毒)的临床应答中是重要的。在该方法中，来自对象或对象群的生物样品例如血液可被分离并直接检测抗体的存在，或可被处理(例如，以获得血清)并随后检测抗体存在。该抗体检测可利用本领域已知的分析，例如，ELISA。
在另一具体实施方式中，评价了未感染对象或未感染的对象群(即，未被免疫/免疫接种流感病毒HA多肽(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)或表达流感病毒HA多肽(例如，本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽)的病毒)的抗体谱以测定所述对象或对象群是否具有针对多种流感病毒株或亚型的球状头域-特异性和/或干特异性抗体。该评价可允许产生适于对所述对象或对象群给药的嵌合流感血凝素(HA)多肽或表达嵌合流感血凝素(HA)多肽的病毒。该评价可确定对患者的免疫策略。
在另一具体实施方式中，本文提供了一种评价/检测特异性针对一种特定流感病毒株或亚型的干域的抗体在对象中存在的方法，包括在体外用本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽接触来自所述对象的生物样品(例如，血液、血清)，其中所述嵌合流感病毒血凝素多肽包含来自目标毒株或亚型的干域。在另一具体实施方式中，本文提供了一种评价/检测特异性针对一种特定流感病毒株或亚型的干域的抗体在对象中存在的方法，包括在体外用表达/含有本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽的病毒接触来自所述对象的生物样品(例如，血液、血清)，其中所述嵌合流感病毒血凝素多肽包含来自目标毒株或亚型的干域。
5.15试剂盒
本文提供了一种药物包装或试剂盒，其包含一个或多个装有本文描述的药物/免疫原性组合物的一种或多种组分的容器，例如一种或多种本文提供的活性物质。可选的，与该容器有关的可以是调节药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机关规定形式的通知，该通知反映了政府机关对人类给药的制造、使用或销售的批准。
本文涵盖的试剂盒可按照本文描述的方法使用。在一个实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文描述的活性物质，优选一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在某些实施方式中，试剂盒包含本文描述的疫苗，例如，裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、灭活流感病毒疫苗或活流感病毒疫苗，其中所述疫苗包含一种或多种本文描述的嵌合流感血凝素(HA)多肽。在一个具体实施方式中，本文提供了试剂盒，其包含本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽和使用该嵌合流感病毒血凝素多肽评价对象中的抗体存在的说明书。在另一具体实施方式中，本文提供了试剂盒，其包含本文描述的嵌合流感病毒血凝素多肽，用于分析样品中HA干域特异性抗体存在的方法。
在一个具体实施方式中，本文提供的试剂盒包含本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)、本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)、本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)、本文描述的cH5/B嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)、本文描述的cH7/B嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)、本文描述的cHB/B嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)或本文描述的cH4/3嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞。
在另一具体实施方式中，本文提供的试剂盒包含组合的本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)和本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)；或组合的本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)和本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)。
在另一具体实施方式中，本文提供的试剂盒包含组合的本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)和本文描述的cH5/3嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸，含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)和任一种本文描述的cH5/B、cH7/B或cB/B嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)。
在另一具体实施方式中，本文提供的试剂盒包含组合的本文描述的cH5/1嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)和本文描述的cH7/3嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)和任一种本文描述的cH5/B、cH7/B或cB/B嵌合流感血凝素多肽(或编码该多肽的核酸、含有或表达该多肽的载体(例如，病毒载体或细菌)或用该多肽刺激的细胞)。
6.实施例
6.1实施例1:嵌合流感病毒血凝素多肽
本实施例描述了嵌合流感病毒血凝素多肽和用于在对象中诱导高水平的交叉中和的HA茎域抗体的方法，包括施用所述嵌合流感病毒血凝素多肽。如本实施例所述，产生了嵌合流感病毒血凝素，其通过流感病毒和工程化改造以表达该嵌合流感病毒血凝素的细胞成功表达。如抗体对嵌合流感病毒血凝素干域和头域二者均能识别所证明的，嵌合流感病毒血凝素成功地以其正确构象回收。
图2描述了嵌合流感病毒血凝素(HA)，包括流感病毒H1亚型的干/茎域和其它流感病毒亚型(H2、H3和H5)的异源球状头域。按照图2所示策略，产生了一种流感病毒，其包含由H1N1(PR8-H1N1)流感病毒的干域和2009流行性H1HA(Cal/09)的球状头域组成的嵌合HA。两种病毒的HA的球状头域非常不同(～70％氨基酸同一性)，而干域是高度保守的，但仍然相异(～89％氨基酸同一性)。如图3所示，表达了相同亚型中具有相同干域和非常不同的HA头域的嵌合HA。
此外，在293T细胞中表达了由A/PR/8/34HA茎域和HK/68(嵌合H3)球状头域组成的嵌合HA和野生型HA(PR8-HA和HK68HA)。图5显示还可能表达具有相同干域(来自H1亚型HA)和来自不同亚型(H3)的球状头域的稳定的嵌合HA。
从而，设计了完全共享HA干域但是在其球状头域方面非常不同的HA免疫原。用这些构建体的重复免疫将导致高水平的针对HA普通干域的交叉中和抗体。从而，改进的免疫策略使用具有恒定的干/茎域和变化的球状头域的嵌合HA，以诱导强烈的交叉中和抗-干域抗体。例如，来自A/PR/8/34的H1HA的恒定干域可与来自不同的第1组HA(H1、H2、H5、H9)的球状头域一起使用以形成重组灭活病毒、重组减毒病毒或重组HA的组(图4)。基于例如X31病毒的H3HA的干域组合H3、H4和H7球状头域的第2组HA的类似组可通过第2组HA通用疫苗的基础。可以在流感病毒疫苗骨架例如PR/8或冷适应流感病毒上拯救重组病毒，通过标准技术生长并用作灭活或减毒疫苗。重组HA可在能够进行哺乳动物样糖基化(MIMICSf9)的昆虫细胞中表达，或通过瞬时转染例如293T或Vero细胞并随后可在C端His标签的帮助下通过Ni螯合层析纯化。其它策略可包括使用表达嵌合HA或其它载体的DNA疫苗，所述其它载体例如腺病毒载体，其表达嵌合HA。
6.2实施例2：表达嵌合流感病毒血凝素多肽的病毒
本实施例描述了涵盖多种来自不同血凝素亚型的球状头域和茎域组合的几种功能性嵌合流感病毒血凝素以及表达这些嵌合血凝素的重组流感病毒，其与野生型流感病毒具有相似的生长性质。
6.2.1材料和方法
6.2.1.1细胞和病毒
293T和MDCK细胞获得自美国模式培养物保藏所(ATCC，Manassas，VA)并被保存在Dulbecco最小必需培养基(DMEM)中或补充10％胎牛血清(HyClone；ThermoScientific)和青-链霉素(Gibco，Invitrogen)的MEM(Gibco，Invitrogen)中。
所有A/PR/8/34重组病毒在37℃下在10天大的具胚蛋中生长2天。
6.2.1.2质粒构建
采用在先描述的适于构建反向遗传学质粒产生重组病毒的策略构建了编码不同嵌合血凝素(参见，例如，Fodor等人，1999，JVirol73:9679-9682；和Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。简而言之，采用含有SapI位点的引物通过PCR扩增嵌合HA的不同片段，用SapI酶切并通过多片段连接克隆至含有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子的pDZ载体的SapI位点(参见，例如Quinlivan等人，2005，JVirol79:8431-8439)。
6.2.1.3流式细胞分析
为了评价细胞表面上血凝素蛋白的水平，用1μg合适的质粒按照生产商的说明使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染293T细胞。转染后24h，对细胞胰蛋白酶化并重悬于含2％FBS的PBS中，然后用1/1000稀释度的针对H1HA的单克隆抗体(mAb)6F12或1/400/1000稀释度的针对H3HA的mAb12D1(参见Wang等人，2010，PLoSPathog6:e1000796)对其染色。在BeckmanCoulterCytomicsFC500流式细胞仪上对染色细胞计数，并使用FlowJo软件分析结果。
6.2.1.4假型颗粒的产生和进入分析
假型颗粒产生的流程采用在先的研究(参见，例如，Evans等人，2007，Nature446:801-805；和Sui等人，2011，ClinInfectDis52:1003-1009)。简而言之，用编码(i)含有期望报告子(V1-GLuc)的原病毒、(ii)HIVGag-Pol、(iii)不同嵌合血凝素蛋白和(iv)甲型流感PR8神经氨酸苷酶(NA)的四种质粒共转染293-T细胞。转染后72h收集上清并随后过滤(0.45μm孔径)。使用假型颗粒的所有转导和感染分析在1μg/ml聚凝胺(Sigma，St.Louis，MO)的存在下进行(参见Sui等人，2011，ClinInfectDis52:1003-1009)。
通过用具有含G-Luc报告子的不同嵌合血凝素的假型颗粒感染MDCK细胞进行进入分析。感染后24小时，用新鲜培养基洗涤细胞三次去除假型颗粒接种物中存在的G-Luc蛋白。感染后48小时进行荧光素酶分析(参见Evans等人，2007，Nature446:801-805)。
6.2.1.5重组嵌合甲型流感病毒的拯救
甲型流感病毒从质粒DNA中的拯救如在先的描述进行(参见，例如，Fodor等人，1999，JVirol73:9679-9682；和Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。为了产生重组野生型(rWT)PR8病毒，使用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)用1μg的8种pDZPR8的每一种拯救质粒共转染293T细胞。表达不同嵌合HA的病毒以相同方式产生，但是将HA质粒替换为对应的嵌合质粒以回收对应的嵌合病毒。转染后6h，将培养基替换为含0.3％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM、10mMHEPES和1.5μg/mlTPCK(L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮)处理的胰蛋白酶。转染后24小时，用含病毒的上清接种至8天大的具胚蛋中。37℃孵育2天后收获尿囊液并通过鸡红血细胞的血凝集和通过MDCK细胞中的噬斑形成分析病毒的存在。
6.2.1.6病毒生长动力学分析
为了分析重组病毒的复制特征，用100pfu每种分别的病毒接种10天大的具胚蛋。感染后0、9、24、48和72h(hpi)收获尿囊液并随后分析病毒生长。尿囊液中存在的病毒滴度通过MDCK细胞上的噬斑分析测定。
6.2.1.7噬斑的免疫染色
用针对甲型流感NP蛋白的mAb(HT103)免疫染色可视化噬斑。
6.2.1.8蛋白质印迹和间接免疫荧光分析
在37℃下将汇合的MDCK细胞的12孔板的一个孔感染指示的重组流感病毒(感染复数[MOI]为2)或模拟感染磷酸缓冲盐溶液(PBS)1h。感染后12h(hpi)，在1X蛋白上载缓冲液中裂解细胞，如在先描述的(参见，例如，Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。通过使用针对A/NP(HT103)、A/PR8/HA(PY102)、A/Cal/09/HA(29C1)、A/VN/HA(M08)(20)、A/H3/HA(12D1)的mAbs的蛋白质印迹分析对减少的细胞裂解物进行分析。对佩斯-cH7的检测使用针对A/FPV/Dutch/27(H7)病毒的山羊多克隆血清NR-3152，所述病毒获得自BEIResources。抗-甘油醛3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)mAb上载对照抗体来自Abcam。对所有目标蛋白使用增强的化学发光蛋白检测系统(PerkinElmerLifeSciences，Boston，MA)进行可视化。
对于免疫荧光分析，对15-mm盖玻片上的汇合的单层MDCK细胞感染重组病毒，MOI为2。在15hpi，固定细胞并用甲醇-丙酮(比率1:1)在-20℃渗透处理20min。在含0.1％吐温20的PBS中用1％牛血清白蛋白封闭后，将细胞与如上所述的针对A/NP(HT103)、A/H1/HA(6F12)、A/PR8/HA(PY102)、A/Cal/09/HA(29C1)、A/VN/HA(M08)(20)、A/H3/HA(12D1)和A/H7病毒(NR-3152)的抗体孵育1h。用含0.1％吐温20的PBS洗涤3次后，将细胞与AlexaFluor594-缀合的抗-小鼠免疫球蛋白G(IgG；Invitrogen，Carlsbad，CA)或AlexaFluor594-缀合的抗-山羊免疫球蛋白G(IgG，Invitrogen，Carlsbad，CA)孵育1h。最后洗涤3次后，用OlympusIX70显微镜对感染的细胞进行荧光显微分析。
6.2.2结果
6.2.2.1嵌合血凝素的产生
为了获得关于形成Cys52-Cys277二硫键的半胱氨酸残基保守性的信息，产生了H1、H3、H5和H7亚型的甲型流感病毒HA序列的比对(参见图6)。HA1亚单位的序列比HA2亚单位的序列保守性差，这主要是由于球状头域上免疫显性抗原位点的存在。更保守的HA2链包含将HA分子锚定至病毒包膜的茎域区域。比对显示Cys52和Cys277和朝向两端的氨基酸在选定的亚型中是保守的。从而，血凝素序列N端至Cys52和C端至Cys277被定义为茎域(图6)。插入序列在本实施例中被认为是头域。
首先产生了含有流行性H1Cal/09HA球状头域和来自PR8(H1)HA的茎域区域的嵌合血凝素构建体(PR8-cH1)(图7A)。还产生了含有来自VN1203(H5)HA的球状头域和来自PR8(H1)HA的茎域的嵌合HA(PR8-cH5)(图7B)。由于所有16种亚型的流感HA被分为两种系统发生组(第1组和第2组)(参见，例如，Sui等人，2009，NatStructMolBiol16:265-273)，且H1和H5HA均属于第1组，应用相似策略产生了含有A/亚伯达/24/01(H7)头域和A/佩斯/16/2009(H3)HA茎域的嵌合HA(佩斯-cH7)(图7B)。H7和H3都是第2组系统发生组的成员(参见，例如，Sui等人，2009，NatStructMolBiol16:265-273)。
接下来检测了是否不同的嵌合HA构建体被表达并运送至细胞表面。在用PR8和H3茎域特异性抗体分别进行表面染色后进行了瞬时转染的293T细胞的荧光激活细胞分类仪(FACS)分析(图8A)。如图8A所示，检测到了所有三种嵌合构建体的表达。该检测表明嵌合HA通过高尔基复合体至细胞表面的运输未被打断。
接下来通过用含嵌合HA、野生型甲型流感PR8NA和基于HIV的荧光素酶的逆转录病毒HA-假型颗粒感染MDCK细胞检测了不同嵌合HA的进入特性。通过荧光素酶读数检测了由嵌合HA蛋白介导的进入效率。对于PR8-cH5和佩斯-cH7嵌合HA和对应的野生型蛋白观察到假型颗粒-介导的荧光素酶递送的可比较的水平(图8B)。与其它HA构建体相比，PR8-cH1HA显示了较低的荧光素酶水平。
6.2.3含嵌合血凝素的重组流感病毒的产生。
在上述结果的教导下，确定了嵌合HA在全病毒颗粒的背景下是否是功能性的并最终将允许仅表达嵌合HA的重组甲型流感病毒的拯救。使用以前公开的流程(参见，例如，Fodor等人，1999，JVirol73:9679-9682；和Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)，成功产生了含有所有不同嵌合HA的病毒。得到的病毒被噬斑纯化，在10天大的具胚蛋中扩增，并对嵌合片段进行RT-PCR分析和测序。在所有情况中，发现病毒具有期望的嵌合HA片段且不含其它HA片段。
进一步通过受感染细胞的蛋白质印迹和间接免疫荧光显示了嵌合病毒的鉴定(图9A和9B)。MDCK细胞被感染rWTA/PR8、野生型A/佩斯、PR8-cH1、PR8-cH5和佩斯-cH7病毒(图9A和9B)。使用针对Cal/09HA(29C1)或VN/04HA(M08)的抗体在对应的样品中分别检测到PR8-cH1和PR8-cH5嵌合HA蛋白(参见Steel等人，2009，JVirol83:1742-1753)(图9A)。使用panH3茎域mAb12D1(参见Wang等人，2010，PLoSPathog6:e1000796)，观察到佩斯cH7-HA和野生型佩斯HA之间可比较的表达水平。当使用抗-H7抗体(NR-3152)时仅对佩斯-cH7感染样品观察到阳性条带。
对于免疫荧光研究，感染条件与蛋白质印迹分析的条件相似。受感染的细胞用对应的抗体染色，如图9B中所示。所有受感染的细胞显示期望的HA表达和A/NP蛋白表达(图9B)。
6.2.4重组病毒的复制特性
在10天大的具胚蛋中37℃下评价了病毒的生长性质(图8A)。包括了rWTPR8病毒用于表达嵌合HA的重组病毒的生长动力学的比较。关于PR8-cH5病毒，观察到与PR8病毒相似的复制模式。对于佩斯-cH7病毒，在9hpi与rWTPR8病毒相比有2倍的病毒滴度减少。然而，在48hpi其达到与野生型病毒(1X109PFU/ml)相似的峰值滴度。与rWTPR8病毒相比PR8-cH1病毒被减弱，如在所有时间点的滴度减少所示。然而，即使是这种嵌合病毒也达到了可观的峰值滴度，大约108PFU/ml。还在MDCK细胞中评价了每种嵌合病毒的噬斑表型。所有病毒都形成可比较的大小的噬斑，如图8B所示。这些结果确认了嵌合HA构建体在体内正确折叠并是生物学功能性的。
6.2.5结论
通过利用划分头域和茎域的界限的保守二硫键Cys52-Cys277开发了一种新的产生具有含不同HA球状头域的嵌合HA蛋白的流感病毒的策略。从而，通过将亲代头域取代为另一HA的头域，产生了一系列具有相同的茎域但是不同的球状头域的嵌合HA。该设计在多个亚型中进行了测试，包括PR8茎域与Cal/09和VNH5球状头域。此外，H7球状头域被置于H3茎域上。这些构建体覆盖了流感HA蛋白的两种系统发生组。每种构建体都在细胞表面表达并保留融合活性，如图7所示。含有嵌合HA的重组病毒的产生进一步验证了HA正确折叠并保留生物学功能。
6.3实施例3：嵌合流感病毒血凝素多肽的诊断应用和用嵌合流感病 毒血凝素多肽免疫接种小鼠
本实施例显示嵌合流感病毒血凝素多肽可被用于诊断目的，且表达嵌合流感病毒血凝素多肽的病毒可被用于疫苗。
6.3.1材料和方法
6.3.1.1细胞和质粒
293T和MDCK细胞获得自ATCC并分别被保存在Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)和最小必需培养基(均来自Gibco)中，其中均补充10％胎牛血清(HyClone)和100单位/ml的青霉素-100μg/ml的链霉素(Pen/Strep，Gibco)。补充10％胎牛血清的TNM-FH(Sigma-Aldrich)和HycloneSFX昆虫培养基(ThermoScientific)被用于Sf9和BTI-TN5B1-4(HighFive)细胞培养。
使用相似技术产生了具有茎域A/波多黎各/8/1934(PR8)的嵌合血凝素构建体，其包含来自A/野鸭/瑞典/81/02(“cH6”)病毒或A/珍珠鸡/香港/WF10/99(“cH9”)病毒的球状头域。对于嵌合H6构建体，通过PCR扩增了不同的组分并使用在先描述的克隆策略克隆至pDZ质粒(参见，例如，Fodor等人，1999，JVirol73:9679-82；和Hai等人，2008，JournalofVirology82:10580-90)。简而言之，采用含有SapI位点的引物通过PCR扩增嵌合血凝素(cHA)的不同组分，用SapI酶切并克隆至pDZ质粒的SapI位点。对于杆状-转移质粒的产生，通过PCR扩增cH6，用BamHI和NotI酶切并在框架中克隆至修饰的pBacPAK8(Gentech)杆状-转移载体，后者具有C端T4噬菌体foldon和6-his标签(参见Meier等人，2004，JMolBiol344:1051-69)。所有质粒的序列通过Sanger测序确认。
6.3.1.2重组cH9病毒的拯救
为了拯救重组疫苗病毒，使用了8种反向遗传学质粒，其编码7个PR8的野生型病毒片段和cH9的vRNA和mRNA，如在先描述的(Fodor等人，1999，JVirol73:9679-82；和Pleschka等人，1996，JVirol70:4188-92)。简而言之，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)用1μg的8种质粒的每一种转染293T细胞。转染后12小时，将培养基替换为含0.3％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM、10mMHEPES和1.5μg/mlTPCK(L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮)处理的胰蛋白酶。转染后2天，用含病毒的上清接种至10天大的具胚蛋中。37℃孵育2天后收获尿囊液并通过鸡红血细胞的血凝集分析病毒的存在。然后在10天大的蛋中在37℃孵育48小时繁殖拯救的cH9病毒。通过噬斑分析滴定病毒悬液，如在先描述的(参见，例如，Steel等人，2009，JournalofVirology83:1742-53)。cH9的序列通过反转录PCR产物测序确认。
6.3.1.3重组杆状病毒产生、蛋白表达和纯化
为了产生携带cH6的重组杆状病毒(rBV)，按照生产商的说明用CellfectinII(Invitrogen)将质粒和BaculogoldDNA(BDBioschiences)共转染至Sf9细胞。在TNM-FH培养基(GeminiBioproducts，WestSacramento，CA)中生长的Sf9细胞中扩增重组杆状病毒，滴度通过噬斑分析测定，如在先描述的(参见，例如，Steel等人，2009，JournalofVirology83:1742-53)。
在HyCloneSFX昆虫细胞培养基(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)中生长的HighFive细胞(参见Krammer等人，2010，MolBiotechnol45:226-34)在500ml摇瓶中用表达cH6的rBV感染，感染复数(MOI)为10，细胞密度为1x106细胞/ml。细胞在感染后96小时收获并通过2000xg室温低速离心10分钟与上清液分离。为了纯化cH6蛋白，上清液被收集并在4℃与Ni-NTA树脂(Qiagen)一起孵育2小时。将悬浮液上载至柱子上并用洗涤缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8)洗涤2次。蛋白以0.5ml的步骤用洗脱缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8)洗脱，用Bradford试剂检测蛋白含量，并混合含蛋白的级分。通过SDS-PAGE、Coomassie染色和蛋白质印迹检测蛋白的纯度和身份。用Bradford试剂测定蛋白浓度。
6.3.1.4小鼠实验
对所有流程，对小鼠腹膜内注射0.1mL氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(1.5mg氯胺酮和0.3mg甲苯噻嗪)进行麻醉。
在BALB/c小鼠(CharlesRiverLaboratories)中通过用10倍系列稀释的流感病毒感染4只小鼠的组，测定了小鼠50％致死剂量(LD50)。在两周的时间内监控体重。损失大于25％体重的小鼠被认为已经达到了实验的终点，进行安乐死。通过Reed和Meunch的方法计算LD50值(参见Reed和Meunch，1938，Am.J.Hyg.27:493-497)。
对于评价A/加利福尼亚/04/09(Cal/09)病毒感染后干域抗体的产生的实验，首先对8-10周大的雌性BALB/c小鼠肌肉内施用80μg的编码PR8病毒全长HA的表达质粒，并伴随着电刺激的应用，如在先描述的(TriGrid递送系统，IchorMedicalSystems)(参见，例如，Luxembourg等人，2007，ExpertOpiniononBiologicalTherapy7:1647-64)。三周后，对小鼠滴鼻50μl体积半致死剂量的104PFUCal/09进行加强。对照动物肌内注射接受单独的DNA或单独的Cal/09病毒或2009-2010疫苗(Cal/09裂解疫苗)。加强后三周或在对照动物的等价时间点，使小鼠流血并收获血清以通过免疫荧光检测的cH6的反应性，如下所述。
对于检测cH9病毒作为疫苗构建体的效力的实验，对PR8全长DNA如上所述进行给药。初免后三周，逐渐滴鼻注入103PFU的cH9病毒对小鼠进行接种。对照动物肌肉内接受单独的DNA或单独的Cal/09病毒或纯化的灭活PR8病毒。加强后三周或在对照动物的等价时间点，鼻腔接种5x104LD50的PR8病毒对小鼠进行攻击。攻击后14天内对小鼠称重。损失多于初始体重27.5％的动物被安乐死并评分为死亡。
6.3.1.5免疫荧光以确认嵌合血凝素的表达
对汇合的单层293T细胞感染1μg的pDZcH6质粒。感染后48小时，用含0.1％吐温20的PBS中的1％牛血清白蛋白对细胞进行固定和封闭。然后用合并自上述四个实验组(单独的PR8DNA、单独的Cal/09、单独的PR8DNA和单独的Cal/09感染或Cal/09裂解疫苗)的每一种的动物血清孵育细胞。用含0.1％吐温20的PBS洗涤3次后，将细胞与AlexaFluor488-缀合的抗-小鼠IgG(Invitrogen)孵育1小时。用OlympusIX70显微镜对感染的细胞进行荧光显微分析。
6.3.1.6ELISA
用50ml的杆状病毒-表达的cH6包被96孔ELISA板(Nunc，MaxiSorp)，并在4℃孵育过夜。用3％的牛奶/PBS封闭板并随后用PBS/0.1％吐温(PBST)洗涤。来自免疫接种的小鼠的血清在PBS中系列稀释并加至板上，然后在37℃孵育1小时。然后用PBST洗涤板并与1:2500稀释的辣根过氧化物酶连接的抗-小鼠IgG(GEHealthcare)一起孵育。在用PBST另外洗涤后，加入SigmafastOPD基质(Sigma)。反应用3MH2SO4终止并在490nm进行光密度检测。
6.3.2结果
6.3.2.1嵌合流感病毒血凝素多肽可被用于诊断应用
产生了包含来自H6流感病毒亚型的血凝素的球状头域和来自PR8病毒的血凝素的干/茎域的嵌合血凝素构建体以作为分析工具用于分析免疫小鼠针对H6干域的抗体生产。因为免疫的小鼠进接触H1病毒的球状头域，实验动物中产生的抗体将仅对嵌合H6血凝素(cH6)具有反应性，如果其被引导针对其H1干域。
如图11A和11D所示，使用单独的DNA或流行性裂解疫苗的治疗没有在免疫接种的小鼠中引发任何干域反应性抗体。相反，单独的Cal/09感染产生了干域反应性抗体(图11B)，虽然没有达到由DNA电穿孔和感染所引发的程度(图11C)。交叉反应性H1干域抗体，C179，被用作感染的对照(图11E)。如期望的，PY102，一种针对PR8球状头域的抗体，没有与转染的cH6HA发生反应(图11F)。
如图13所示，cH6嵌合流感病毒血凝素多肽作为工具检测干域抗体结合的用途通过ELISA进行了确认。
6.3.2.2嵌合流感病毒血凝素多肽可被用于疫苗
如图12所示，免疫接种灭活PR8病毒的动物受到针对致死剂量攻击的保护，而仅接受DNA的动物在攻击后5天完全屈服于感染。仅接受cH9病毒的动物也没有受到针对感染的保护，仅具有25％的存活率。相反，首先用DNA初免然后用cH9病毒加强的动物受到针对攻击的保护，其存活率与免疫接种灭活病毒制备物的动物在统计学上相同。
6.4实施例4:感染2009流行性H1N1流感病毒引发的血凝素茎域抗 体
本实施例描述了用于研究干域特异性抗体的嵌合流感病毒血凝素多肽。使用这些多肽确定，感染2009流行性H1N1病毒引发针对血凝素干域的病毒-中和抗体滴度加强。除了嵌合流感病毒血凝素多肽，还描述了可用于检测传统的血凝集-抑制分析中没有检测的流感病毒-中和抗体的分析。
6.4.1材料和方法
6.4.1.1细胞和质粒
293T和MDCK细胞获得自ATCC并分别被保存在Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)和最小必需培养基(均来自Gibco)中，其中均补充10％胎牛血清(HyClone)和100单位/ml的青霉素-100μg/ml的链霉素(Pen/Strep，Gibco)。补充10％胎牛血清的TNM-FH培养基(Sigma-Aldrich)和HycloneSFX昆虫培养基(ThermoScientific)被用于Sf9和BTI-TN5B1-4(HighFive)细胞培养。
使用在先描述的方法产生了具有A/波多黎各/8/1934(PR8)茎域的嵌合血凝素(cHA)构建体，其包含来自A/野鸭/瑞典/81/02(cH6/1)病毒或A/珍珠鸡/香港/WF10/99(cH9/1)病毒的球状头域(Hai等人，2008，JVirol82，10580；Fodor等人，1999，JVirol73，9679)。简而言之，采用含有SapI位点的引物通过PCR扩增嵌合血凝素(cHA)的不同组分，用SapI酶切并克隆至pDZ质粒的SapI位点(Quinlivan等人，2005，JVirol79，8431)。对于杆状-转移质粒的产生，通过PCR扩增cH6/1和cH9/1，用BamHI和NotI酶切并在框架中克隆至修饰的pFastBac(Invitrogen)杆状-转移载体，后者具有C端T4噬菌体foldon和6-his标签(Meier等人，2004，JMolBiol344，1051)。所有质粒的序列通过Sanger测序确认。
6.4.1.2重组杆状病毒产生、蛋白表达和纯化
为了产生重组cH6/1和cH9/1蛋白，按照生产商的说明用杆状-转移载体转化大肠杆菌菌株DH10Bac(Invitrogen)。挑选呈现正确表型的DH10Bac菌落，使之生长并使用PlasmidMidiKit(Qiagen)制备杆粒。
按照生产商的说明用CellfectinII(Invitrogen)将携带cH6/1或cH9/1基因的杆粒转染至Sf9细胞。在TNM-FH培养基(GeminiBioproducts，WestSacramento，CA)中生长的Sf9细胞中扩增重组杆状病毒，滴度通过噬斑分析测定(MethodsMolBiol388，77)。
在HyCloneSFX昆虫细胞培养基(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)中生长的HighFive细胞在500ml摇瓶中用表达cH6/1或cH9/1的重组杆状病毒感染，感染复数(MOI)为10，细胞密度为1x106细胞/ml(Krammer等人，2010，MolBiotechnol45，226)。细胞在感染后96小时收获并通过2000g室温低速离心10分钟与上清液分离。为了纯化cHA蛋白，上清液被收集并在4℃与Ni-NTA树脂(Qiagen)一起孵育2小时。将悬浮液上载至柱子上并用洗涤缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8)洗涤3X。蛋白以0.5ml的步骤用洗脱缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8)洗脱，用Bradford试剂检测蛋白含量，并混合含蛋白的级分。在PBS中对合并的级分进行缓冲液更换并使用10kD分子量截留的AmiconUltra离心过滤器单元(Millipore)在浮筒式转头中进行浓缩。通过SDS-PAGE、Coomassie染色和蛋白质印迹检测蛋白的纯度和身份。以下抗体被用于确认cHA的表达：抗-H6山羊抗血清(BEI，#NR-663)、G1-26(抗-H9，小鼠；BEI#NR-9485)、3951(兔，抗-HA2PR8)(Graves等人，1983，Virology126，106)、PY102(抗-PR8头域，小鼠)和12D1(抗-H3茎域，小鼠)(Wang等人，2010，PLoSPathog6，e1000796)。最终蛋白浓度用Bradford试剂测定。
6.4.1.3表达重组cHA的病毒的拯救
为了拯救表达cH9/1的重组疫苗病毒，使用了编码6个PR8野生型病毒片段的vRNA和mRNA的反向遗传学质粒以及编码来自A/野鸭/亚伯达/24/01病毒和cH9/1的N3NA的质粒，如在先描述的(Hai等人，2008，JVirol82，10580；Fodor等人，1999，JVirol73，9679，27)。简而言之，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)用1μg的8种质粒的每一种转染293T细胞。转染后12小时，将培养基替换为含0.3％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM、10mMHEPES和1.5μg/mlTPCK(L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮)处理的胰蛋白酶/mL(SigmaT1426)。转染后2天，用含病毒的上清接种至10天大的具胚蛋中。37℃孵育2天后收获尿囊液并通过鸡红血细胞的血凝集分析病毒的存在。然后在10天大的蛋中在37℃孵育48小时繁殖拯救的cH9/1病毒。通过对MDCK细胞在TPCK胰蛋白酶存在下进行噬斑分析滴定病毒悬液，如在先描述的(Steel等人，2009，JVirol83，1742)。cH9/1的序列通过反转录PCR产物测序确认。
6.4.1.4免疫荧光确认嵌合血凝素的表达
对汇合的单层MDCK细胞感染cH9/1N3病毒，MOI为2。感染后48小时，用含0.1％吐温20的PBS中的1％牛血清白蛋白对细胞进行固定和封闭。然后用小鼠mAbs：抗-NP抗体HT103、PY102、抗-H9(BEINR#9485)或pan-H1茎域-特异性抗体(6F12)孵育细胞。用含0.1％吐温20的PBS洗涤3次后，将细胞与AlexaFluor488-缀合的抗-小鼠IgG(Invitrogen)孵育1小时。用OlympusIX70显微镜对感染的细胞进行荧光显微分析。
6.4.1.5人血清样品
按照机构手册收集和使用人血清样品。从三种患者群收集血清：未感染pH1N1的成人、未感染pH1N1的儿童和pH1N1病毒感染的成人。症状感染的第一个3周内从感染pH1N1的患者收集血清。对于使用混合血清的实验，混合相等体积的每种样品产生混合池(pool)。通过Wrammert等人通过RT-PCR和通过血清学分析进行感染的确认(Wrammert等人，2011，JExpMed208，181-193)。
6.4.1.6血凝素抑制分析
首先通过胰蛋白酶-加热-高碘酸盐处理或通过RDE处理对收集的血清进行灭活以去除血凝集非特异性抑制剂(Coleman，Dowdle，1969，BullWorldHealthOrgan41，415(1969)。进行了血凝集抑制(HI)分析以检测与cH9/1N3和A/鸭/法国/MB42/76(H6HA)(Desselberger等人，1978，ProcNatlAcadSciUSA75，3341(Jul，1978))病毒的反应性，如在先描述的(Lowen等人，2009，JVirol83，2803)。如果对1:10血清稀释液未观察到HI活性则样品被认为是阴性的。
6.4.1.7ELISA
用PBS稀释的50ul杆状病毒-表达的cH6/1、cH9/1或全长血凝素(H5HA，BEINR#660；H3HA，BEINR#15171)蛋白或H1序列(PR8)长α螺旋(LAH)(Wang等人，2010，ProcNatlAcadSciUSA107，18979)包被96孔ELISA板(QiagenHisSorb或NuncImmulon2)，并在4℃孵育过夜。用0.5％牛奶/2％山羊血清/PBS封闭板并随后用PBS/0.1％吐温(PBST)洗涤3X。单克隆抗体、来自人类对象的血清和小鼠血清作为对照在PBS中系列稀释并加至板上，然后在室温孵育1小时。然后用PBST洗涤板3X并与1:5000稀释的偶联至碱性蛋白酶(AP)的山羊抗-人IgG[Fc](MeridianLifeScience)或抗-小鼠AP(Invitrogen)另外孵育1小时。然后用PBST洗涤3X，加入磷酸对硝基苯酯(Sigma)。10分钟后用NaOH终止反应并在405nm进行光密度检测。
6.4.1.8噬斑减少分析
首先对来自感染和未感染(未感染pH1N1病毒的)的成人患者的血清进行混合并上载至蛋白G琼脂糖(GEHealthcare)重力流柱上用于纯化IgG蛋白。用PBS洗涤柱。用0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱多克隆抗体。立即加入1:10比例的2MTris-HCl缓冲液(pH10)以回复pH。在PBS中对洗脱液进行缓冲液更换并使用50kD分子量截留的AmiconUltra离心过滤器单元(Millipore)在浮筒式转头中进行浓缩。在NanoDrop2000分光光度计上使用A280方法检测蛋白浓度。使用在纯化的IgG制备物中显示缺少HI活性的多个病毒毒株通过HI检测对非特异性血清抑制剂的去除进行确认(数据未显示)。茎域-反应性抗体的中和能力如在先描述的进行评价(Wang等人，2010，PLoSPathog6，e1000796)。首先将病毒稀释至能够产生100个噬斑形成单位每细胞的浓度。然后将来自混合血清的不同浓度的IgG与病毒在室温下共孵育1小时。接种MDCK细胞的6孔板用PBS洗涤并随后用200ul病毒-IgG混合物感染。在37℃下孵育45分钟后，将病毒和IgG从细胞中吸走，对每个孔加入含有合适抗体浓度和TPCK胰蛋白酶的琼脂覆盖。37℃下将板孵育2天。通过免疫染色使用抗-H9抗体G1-26可视化噬斑(Bouvier等人，2008，JVirol82，10052)。
6.4.1.9假型颗粒中和分析
假型颗粒产生的流程采用在先的研究(Evans等人，2007，Nature446，801)。简而言之，用编码(i)含有期望报告子(V1-GLuc)的原病毒、(ii)HIVGag-Pol、(iii)嵌合cH9/1血凝素蛋白和(iv)乙型流感/山行县/16/88神经氨酸苷酶(NA)(Tscherne等人，2010，JVirolMethods163，336)的四种质粒共转染293-T细胞。V1-GLuc质粒编码荧光素酶蛋白，其从细胞中分泌并可在细胞上清液中检测。转染后48h收集上清并随后过滤(0.45μm孔径)以纯化cH9/1颗粒制备物。然后将颗粒(以经测定在感染后能在线性范围内给出荧光素酶活性的数量)与不同浓度(50μg/ml、10μg/ml和2μg/ml)的纯化的人IgG孵育，并加至MDCK细胞。感染进行6小时，然后洗涤细胞并将新鲜上清液放置覆盖细胞。使用假型颗粒的所有转导和感染分析在1μg/ml聚凝胺(Sigma，St.Louis，MO)的存在下进行(Tscherne等人，2010，JVirolMethods163，336)。感染后48小时进行荧光素酶分析。
6.4.2结果
6.4.2.1基于嵌合血凝素的试剂的开发
产生了嵌合血凝素(cHA)构建体作为分析工具用于评价人血清中茎域抗体的存在。通过利用C52和C277之间存在的划分HA茎域和头域界限的二硫键，表达质粒被工程化从而在PR8病毒HA的茎域上部编码H6或H9血凝素球状头域(图14A)。推测含有茎域抗体的人血清样品将可能对H6或H9病毒的血凝集抑制(HI)活性呈阴性(由于之前缺乏对这些病毒亚型的接触)，但将对cH6/1或cH9/1构建体具有反应性，因为之前接触了H1血凝素茎域。这些工具，重组表达的cHA蛋白和表达cHA的病毒，可被用于评价人血清样品中茎域抗体的相对量，并检测由那些茎域-特异性抗体介导的任何中和活性。
为了产生cH6/1且cH9/1蛋白用于分析实验，在杆状病毒表达系统中产生了编码嵌合HA的质粒并表达为可溶性蛋白。对2μg总蛋白的Coomassie染色表明了这些制备物的高纯度(图17A)。cH9/1轻微延迟的迁移被认为是cH9/1头域上占据的糖基化位点的数量增加的结果。使用与HA的各部分反应的抗体进行蛋白质印迹分析对cHA蛋白进行了进一步表征。如图17B所示，只有cH6/1、cH9/1和PR8的全长HA与PR8茎域特异性的兔多克隆抗血清反应。针对H6、H9和PR8头域单克隆抗体确认了嵌合构建体在PR8茎域上部表达外源头域。H3蛋白被用作阴性对照且仅在使用pan-H3抗体12D1(Wang等人，2010，PLoSPathog6，e1000796)时被检测到。
表达嵌合分子的重组病毒也被拯救用于检测中和茎域抗体。因为上世纪所有的人流感病毒都具有编码的N1或N2亚型的NA，推理认为cH9/1N3重排病毒的拯救将允许评价茎域-特异性抗体的中和能力，而不会检测任何(N1或N2)神经氨酸苷酶抗体活性。使用反向遗传学的cH9/1N3病毒(表达H1茎域和H9球状头域HA和N3亚型神经氨酸苷酶)进行了拯救，并在具胚蛋中生长至高滴度。该病毒的噬斑分析表型与PR8野生型病毒相似(图14C)。为了确认病毒传代后H9头域的存在，用cH9/1N3病毒感染细胞。然后用小鼠mAbG1-26，一种H9亚型血凝素蛋白特异性抗体来探测受感染的细胞。pan-H1茎域特异性抗体，6F12，被用于检测野生型PR8和cH9/1N3病毒感染的细胞(图14B)。
6.4.2.2茎域特异性抗体结合并中和cHA
为了确认cH6/1和cH9/1蛋白能够被用作工具检测干域抗体，首先用已知与HA茎域反应的抗体验证了这些cHA的使用。事实上，通过ELISA发现小鼠mAbC179，一种与H1HA茎域反应的抗体(Okuno等人，1993，JVirol67，2552)，以剂量依赖的方式结合至杆状病毒表达的cH6/1和cH9/1蛋白(图18A和B)。
接下来确认了cH9/1N3病毒的复制会否被单克隆抗体6F12抑制，所述抗体具有针对H1流感病毒的中和活性(数据未显示)。在噬斑减少分析中抗体6F12能够以剂量依赖的方式结合并中和cH9/1N3病毒(图18C和D)，在浓度高于4μg/ml下观察到百分百的抑制。这些结果证实了嵌合蛋白和重组cH9/1N3病毒能够被用于检测具有中和活性的茎域抗体的假设。
6.4.2.3感染pH1N1的患者具有高滴度的结合并中和cHA的抗体
在使用cH6/1且cH9/1可溶性蛋白定量患者血样中的茎域-反应性抗体之前，对血清检测了针对表达这两种HA亚型的病毒的HI活性。使用A/鸭/法国/MB42/76(H6)和cH9/1N3病毒，确认了收集的所有成人和儿童血清样品都是HI阴性的(结果未显示)。
接下来，通过ELISA检测了血清与cH6/1和cH9/1蛋白的反应性。从未感染pH1N1病毒的成人和儿童对象收集的血清对任一蛋白均呈现很少的反应性。然而，从感染pH1N1流感病毒的患者收集的血清显示了对两种cHA构建体的增加的结合，将感染pH1N1的血清混合池与未感染的成人和儿童的相比，其IgG反应性有大于30倍的差异(与产生相当的光密度读数的稀释相比)(图15A和B)。从而可以推理，考虑到阴性HI数据，与cHA蛋白的反应性发生于茎域。
使用混合的人血清样品，还检测了与一部分HA干域——长α螺旋(LAH)结合的IgG。之前显示这些IgG介导小鼠中的保护性免疫(Wang等人，2010，ProcNatlAcadSciUSA107，18979)。感染pH1N1的患者的血清含有对H1LAH的抗体反应性，而未接触流行性病毒的患者具有最低的LAH-特异性血清抗体(图15C)。
H5血凝素亚型与H1HA处于相同的系统发生组并共享非常相似的茎域结构(Ekiert等人，2009，Science324，246)。有趣的是，接触pH1N1的患者具有加强的与H5蛋白反应的血清抗体特异性(图15D)，而不具有任何针对同源H5亚型病毒的血清HI活性(数据未显示)。这一结果表明接触pH1N1病毒可能赋予了一定程度的由茎域-特异性抗体介导的抗-H5免疫力。
重要的是，感染pH1N1的患者不具有特异性针对H3血凝素蛋白的加强的血清抗体(H3与H1和H5HA处于不同的系统发生组)(图15E)。该结果显示pH1N1感染的患者血清中增强的茎域-特异性抗体滴度不是通常免疫刺激的作用；相反，H1茎域抗体特异性被流行性病毒毒株感染选择性增强。
接下来评价了人类样品中发现的这些茎域反应性抗体是否具有中和能力。来自感染和未感染的成人的血清样品被混合并纯化了总IgG，以去除结合血凝素头域的非特异性抑制剂(例如：含唾液酸分子和外源凝集素)。使用这些纯的IgG制备物，达到了在抗体浓度高于55.5μg/mL总血清IgG下对噬斑形成的完全抑制(图16A和B)。根据ELISA数据，当比较来自感染pH1N1的血清和未感染的成人的血清时，观察到中和能力的大约30倍的差异。使用mAb6F12作为标准，能够对由6F12和多克隆人IgG制备物介导的中和活性之间进行比较。通过比较产生对cHA病毒100％中和的6F12和人IgG的浓度，估计来自感染pH1N1的患者的总人IgG的7％在近30天中含有中和茎域抗体。
最终，使用假型颗粒感染分析评价了茎域反应性抗体的中和能力，所述分析具有病毒进入宿主细胞时产生的荧光素酶活性读数。表达cH9/1蛋白的假型颗粒与纯化的人IgG孵育，并通过对颗粒进入的抑制检测了中和活性，所述抑制导致细胞上清液中缺失荧光素酶活性(参见方法)。与噬斑减少分析一致，假型颗粒分析也显示了总IgG浓度超过10μg/ml下颗粒的100％中和(图16C)。
6.4.3结论
开发了以嵌合血凝素蛋白和表达那些嵌合蛋白的病毒的形式出现的新型分析工具，其允许在还包括结合血凝素蛋白球状头域的抗体的制备物中选择性检测茎域-特异性抗体。这些新型血凝素构建体具有恒定的H1亚型茎域，以及来自不同血凝素亚型的球状头域(例：H1茎域和H6头域)。这是通过利用血凝素蛋白(19)半胱氨酸52和277之间存在的二硫键完成的，以用不同HA亚型的序列替换插入序列。
使用这些嵌合血凝素(cHA)构建体显示与未感染pH1N1病毒的成人和儿童对照相比，具有确定的pH1N1病毒感染的一小群人产生了高滴度的茎域特异性中和抗体。这些发现支持了在对pH1N1感染的应答中产生的血凝素茎域反应性抗体可能有助于灭绝季节性H1N1病毒的假设，所述病毒在2009的流感大流行前流行。
6.5实施例5:表达嵌合血凝素流感的病毒：源自不同亚型和种系发 生组的球状头域和茎域
本实施例描述了几种功能性嵌合流感病毒血凝素，其涵盖了来自不同血凝素亚型和不同种系发生组的多种球状头域和茎域组合，以及表达这些嵌合血凝素的重组流感病毒，其具有与野生型流感病毒相似的生长性质。这些嵌合重组病毒具有与野生型流感病毒相似的生长性质，并可被用作试剂来在病毒学和免疫学分析中检测域-特异性抗体。
6.5.1材料和方法
6.5.1.1细胞和病毒
293T和MDCK细胞获得自美国模式培养物保藏所(ATCC)并被保存在Dulbecco最小必需培养基(DMEM)或MEM(Gibco，Invitrogen)中，其中补充10％胎牛血清(HyClone；ThermoScientific)和青-链霉素(Gibco，Invitrogen)。A/波多黎各/8/1934(PR8)和A/佩斯/16/2009(佩斯/09)野生型(由AlexanderKlimov，CDC友好地提供)和重组病毒在37℃下10天大的无特异性病原体的具胚鸡蛋(CharlesRiver)中生长2天。
6.5.1.2质粒构建。
采用在先描述的相似策略构建了编码不同嵌合血凝素的质粒(参见，例如，Fodor等人，1999，JVirol73:9679-9682；和Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。简而言之，采用含有SapI位点的引物通过PCR扩增嵌合HA的不同片段，用SapI酶切并通过多片段连接克隆至双义表达载体pDZ载体的SapI位点，所述载体中vRNA转录被人类RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子控制且mRNA/cRNA转录被鸡β-肌动蛋白聚合酶II启动子控制(参见，例如，Quinlivan等人，2005，JVirol79:8431-8439)。我们衷心感谢DanielPerez(UniversityofMaryland)的H7HA质粒(GenbankID：DQ017504)。编码A/波多黎各/8/1934(PR8)基因的质粒按照之前描述的使用(Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。
6.5.1.3核苷酸序列登录号
本研究中所用的所有构建的cHA基因已被保藏在流感研究数据库中，登录号为IRD-RG-684014、IRD-RG-684022、IRD-RG-684030和IRD-RG-684038。嵌合cH1/1、cH5/1、cH7/3和cH5/3分别列举为A/波多黎各/8-RGcH1-1/34、A/波多黎各/8-RGcH5-1/34、A/佩斯/16-RGcH7-3/09和A/佩斯/16-RGcH5-3/09。
6.5.1.4流式细胞分析
为了评价血凝素蛋白在细胞表面的表达水平，按照生产商的说明用Lipofectamine2000(Invitrogen)对293T细胞转染合适的质粒或用表达cHA的重组病毒转染MDCK细胞。转染后48h，对293T细胞胰蛋白酶化并重悬于含2％FBS的PBS中，然后用针对H1HA的单克隆抗体(mAb)6F12(5μg/ml)——我们实验室产生的mAb，对第1组HA茎域具有广泛反应性(数据未显示)——或针对H3HA的mAb12D1(5μg/mL)(参见Wang等人，2010，PLoSPathog6:e1000796)对其染色。感染后12h，通过胰蛋白酶消化将MDCK细胞重悬并用mAb12D1染色。在BeckmanCoulterCytomicsFC500流式细胞仪上对染色细胞进行分析，并使用FlowJo软件分析结果。
6.5.1.5假型颗粒的产生和进入分析
假型颗粒产生的流程采用在先的研究(参见，例如，Evans等人，2007，Nature446:801-805和Tscherne等人，2010，JVirol方法163:336-43)。简而言之，我们用编码(i)含有期望报告子(V1-Gaussia荧光素酶)(Evans等人，2007，Nature446:801-805)的原病毒、(ii)HIVGag-Pol(Evans等人，2007，Nature446:801-805)、(iii)嵌合血凝素蛋白和(iv)B/山行县/16/88病毒神经氨酸苷酶(NA)的四种质粒共转染293-T细胞。转染后72h收集上清并随后过滤(0.45μm孔径)。通过血凝集分析评价了假型病毒样颗粒(VLP)的存在。在接种MDCK细胞前将不同VLP制备物调整为相同的4个血凝单位。使用假型颗粒的所有下述分析在1μg/ml聚凝胺(Sigma)的存在下进行以增加转导效率(参见，例如，Evans等人，2007，Nature446:801-805和Tscherne等人，2010，JVirolMethods163:336-43)。
通过用表达不同嵌合血凝素并具有含Gaussia荧光素酶报告子的假型颗粒转导MDCK细胞进行进入分析。转导后24小时，用新鲜培养基洗涤细胞三次去除接种物中存在的任何残留的Gaussia荧光素酶蛋白。转导后48小时进行荧光素酶分析(Evans等人，2007，Nature446:801-805)。
6.5.1.6重组嵌合甲型流感病毒的拯救
甲型流感病毒从质粒DNA中的拯救如在先的描述进行(参见，例如，Fodor等人，1999，JVirol73:9679-9682；和Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。为了产生重组野生型(rWT)PR8病毒，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)用1μg的8种pDZPR8拯救质粒共转染293T细胞。野生型HA质粒被替换为编码期望嵌合HA的质粒以产生表达cHA的重组病毒。转染后6h，将培养基替换为含0.3％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM、10mMHEPES和1.5μg/mlTPCK(L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮)处理的胰蛋白酶(Sigma)。转染后24小时，用含病毒的上清接种至8天大的具胚蛋中。37℃孵育2天后收获尿囊液并通过鸡红血细胞的血凝集分析病毒的存在。通过MDCK细胞中的噬斑分析滴定病毒悬液，如在先描述的(Fodor等人，1999，JVirol73:9679-9682、Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。
6.5.1.7病毒生长动力学分析
为了分析重组病毒的复制特征，用100个噬斑形成单位(pfu)的野生型或表达cHA的重组病毒接种10天大的具胚蛋。感染后0、9、24、48和72h(hpi)收获尿囊液并随后分析病毒生长。尿囊液中存在的病毒滴度通过MDCK细胞上的噬斑分析如上测定。
6.5.1.8噬斑免疫染色
通过用针对甲型流感核蛋白(NP)的mAbHT103免疫染色可视化噬斑，其中使用之前描述的流程(Bouvier等人，2008，JournalofVirology82:10052-8；和Steel等人，2009，JVirol83:1742-53)。
6.5.1.9蛋白质印迹和间接免疫荧光分析
在37℃下使汇合的MDCK细胞感染指示的重组流感病毒(感染复数[MOI]为2)或模拟感染磷酸缓冲盐溶液(PBS)1h。在12hpi，在1XSDS上载缓冲液中裂解细胞，如在先描述的(参见，例如，Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。通过使用针对甲型流感病毒核蛋白(NP)(HT103)、PR8HA头域(PY102)、Cal/09HA头域(29E3)、VN/04HA头域(mAb#8)和12D1(一种与HA茎域反应的pan-H3抗体)的单克隆抗体(mAbs)的蛋白质印迹分析对减少的细胞裂解物进行分析。为了检测H7头域，使用了多克隆山羊血清NR-3152(针对A/FPV/荷兰/27(H7)病毒，BEIResources)。抗-甘油醛3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)抗体(Abcam)被用作上载对照。对蛋白使用增强的化学发光蛋白检测系统(PerkinElmerLifeSciences)进行可视化。
对于免疫荧光分析，对15-mm盖玻片上的汇合的单层MDCK细胞感染重组病毒，MOI为2。在15hpi，固定细胞并用甲醇-丙酮(比率1:1)在-20℃渗透处理20min。在含0.1％吐温20的PBS中用1％牛血清白蛋白封闭后，将细胞与如上所述的抗体以及mAb6F12孵育1h。用含0.1％吐温20的PBS洗涤3次后，将细胞与AlexaFluor594-缀合的抗-小鼠IgG(Invitrogen)或AlexaFluor594-缀合的抗-山羊IgG(Invitrogen)孵育1h。最后洗涤3次后，用OlympusIX70显微镜对感染的细胞进行荧光显微分析。
6.5.1.10噬斑减少分析
噬斑减少分析如在先描述进行(参见Wang等人，2010，PLoSPathog6:e1000796)。大约60-80pfu由PR8茎域上部的Cal/09或VN/04球状头域组成的表达cHA的重组病毒与或不与不同浓度(100、20、4、0.8、0.16和0.032ug/ml)的mAbKB2——我们实验室产生的一种广泛中和抗-HA茎域抗体(数据未显示)——在室温下总共240uL的体积中一起孵育60分钟。6孔板中的汇合MDCK细胞层用PBS洗涤两次并随后与抗体-病毒混合物在37℃下孵育40分钟后。在吸走接种物后，对每个孔加入补充上述浓度的抗体或不补充抗体的TPCK胰蛋白酶的琼脂覆盖。37℃下将板孵育2天。通过免疫染色用抗-甲型流感NP抗体HT103可视化噬斑(Bouvier等人，2008，JournalofVirology82:10052-8；和Steel等人，2009，JVirol83:1742-53)。
6.5.1.11假型颗粒中和分析
假型颗粒产生的流程与上述相同，其中使用了包含VN/04(H5)或Cal/09(H1)头域和PR8(H1)茎域与乙型流感/山行县/16/88病毒NA的cHA构建体。然后将颗粒与不同浓度的mAbKB2以100-0.032μg/mL的5倍稀释进行孵育。然后，将这些混合物加至MDCK细胞。转染持续6小时，然后洗涤细胞并将新鲜培养基置于覆盖细胞。使用假型颗粒的所有转导在1μg/ml聚凝胺(Sigma，St.Louis，MO)的存在下进行(Tscherne等人，2010，JVirolMethods163:336-43)。转导后48小时进行荧光素酶分析以测定进入被mAbKB2封闭的程度。
6.5.2结果：
6.5.2.1嵌合血凝素的产生
为了观察形成Cys52-Cys277二硫键的半胱氨酸残基是否保守，在本研究中使用了H1、H3、H5和H7亚型的甲型流感病毒HA序列的比对。因为这些半胱氨酸残基在第1组和第2组HA的两种HA亚型中都是高度保守的，Cys52-Cys277二硫键被用作头域和茎域的分界点。通过将Cys52和Cys277之间的序列定义为头域，该分子的剩余部分定义为茎域，很合理地可以将构建体制成编码来自多种HA亚型的新型头域和茎域的组合(图19A和B)。
血凝素亚型茎域区域之间存在的氨基酸同一性程度进一步促使我们认为头域的交换是可能的。在所有亚型中观察到比头域更高百分比的氨基酸同一性(图20)。
所有16个流感HA亚型被分类为两种系统发生组(Palese和Shaw，2006，Orthomyxoviridae:thevirusesandtheirreplication，Fieldsvirology，第5版，1647–1690)。因为在一个特定组的茎域区域观察到更高的氨基酸同一性百分比(图20)以及因为含有来自第1组病毒头域和茎域的一种cHA病毒已被成功产生(Pica等人，2012，PNAS109:2573-8)，进行了产生组内cHA的尝试。对于第1组，产生了编码流行性H1Cal/09HA或VN/04球状头域与PR8(H1)HA茎域区域的两种嵌合血凝素构建体(分别为cH1/1和cH5/1)(图19B)。采用相似策略产生了表达来自不同的第2组流感毒株头域和茎域的嵌合HA：头域来自Alb/01(H7，第2组)和茎域来自佩斯/09(H3，第2组)HA(cH7/3)(图19B)。最终，评价了头域和茎域是否能够被交换以制备含有VN/05HA(H5，第1组)头域位于佩斯/09HA(H3，第2组)茎域上部的组间嵌合HA(cH5/3)(图19B)。
在构建这些质粒后，进行试验检测了是否不同的嵌合HA构建体能够像野生型HA一样被表达并运送至细胞表面。在用H1和H3茎域特异性抗体分别进行表面染色后进行了瞬时转染的293T细胞的荧光激活细胞分类仪(FACS)分析。使用该方法，检测到了所有四种嵌合构建体的细胞表面表达(图21)。然而，与野生型PR8HA相比，对cH1/1构建体检测到较少的表面蛋白表达，这可能是由于与Cal/09HA头域有关的内在特征或该嵌合DNA构建体较低的转染效率。此外，应注意对cH7/3和cH5/3构建体的细胞表面表达模式存在不同。这种“双峰”表达模式仅在转染条件下观察到，且是可复制的。对表达cH7/3或cH5/3的重组病毒的感染没有检测(图21)。从而，这些数据表明cHA可通过高尔基体复合物转运至细胞表面。
接下来，使用含荧光素酶报告子并在颗粒表面表达cHA和野生型B/山行县/16/88病毒NA的逆转录病毒假型颗粒检测了不同cHA通过转导MDCK细胞的进入特性。通过荧光素酶读数检测了由cHA蛋白介导的进入效率。对cH5/1、cH7/3和cH5/3嵌合HA以及对应的野生型蛋白观察到可比较的假型颗粒-介导的荧光素酶表达水平(图22)。编码cH1/1HA的颗粒表达与其它HA构建体相比较低的荧光素酶，这能是由于cH1/1在产生的细胞系中的较低表达从而导致较少的HA三聚体每颗粒或cH1/1HA较低效率的进入性质。还可能是在将假型颗粒标准化为4个血凝单位时，由于结合至红血细胞的不同导致实际的假型颗粒数量可能发生变化。
6.5.2.2含嵌合血凝素的重组流感病毒的产生
因为已确定我们的cHA构建体被有效表达并转运至细胞表面，因此进行研究以评价编码cHA的重组流感病毒能否被拯救。使用以前公开的流程(参见，例如，Fodor等人，1999，JVirol73:9679-9682；和Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)，成功产生了含有不同cHA的病毒。得到的病毒被噬斑纯化，在10天大的具胚蛋中扩增，并对嵌合片段进行RT-PCR分析和测序。在所有情况中，发现病毒具有期望的嵌合HA片段且不含其它HA片段(数据未显示)。
cHA在拯救的病毒中的存在进一步通过蛋白质印迹(图23)和受感染的细胞的间接免疫荧光(图24)进行了确定。MDCK细胞被感染rWTPR8，野生型佩斯/09、cH1/1、cH5/1、cH7/3和cH5/3病毒。使用与Cal/09(H1)HA(29E3)(Medina等人，2010，NatureCommunications1:28)或VN/04(H5)HA(mAb#8)(Steel等人，2009，JVirol83:1742-53)的头域反应的抗体在对应的样品中分别检测了cH1/1和cH5/1嵌合HA蛋白(参见Steel等人，2009，JVirol83:1742-1753)(图9A)。使用panH3抗-茎域mAb12D1(参见Wang等人，2010，PLoSPathog6:e1000796)，观察到cH7/3、cH5/3和野生型佩斯HA之间可比较的表达水平。野生型佩斯HA在凝胶上显示了较慢的迁移，这可能是由于球状头域中更高数量的糖基化位点。通过对cH7/3或cH5/3感染样品分别使用抗-H7多克隆(NR-3152)或抗-H5单克隆抗体(mAb#8)确认了在H3茎域上部表达了正确的HA头域。在两种情况下均检测到阳性条带。
对于免疫荧光研究，感染条件与蛋白质印迹分析所使用的相似。受感染的细胞用对应的抗体染色，如用于图23的。所有受感染的细胞显示了期望的嵌合和野生型HA和甲型流感病毒NP的表达(图24)。
6.5.2.3重组病毒的复制特性
在10天大的具胚蛋中37℃下评价了野生型和重组病毒的生长性质(图25A)。包括了rWTPR8病毒用于表达嵌合HA的重组病毒的生长动力学的比较。cH5/1和cH5/3病毒显示了与PR8病毒可比较的复制动力学。cH7/3病毒在48hpi生长至与rWTPR8相似的峰值滴度(1X109PFU/mL)，虽然在9hpi存在比rWTPR8病毒的病毒滴度2个log的减少。与rWTPR8病毒相比，cH1/1病毒被减弱，如所有时间点的病毒滴度减少所示。然而，cH1/1病毒达到了可观的峰值滴度大约108PFU/mL。佩斯/09野生型病毒在具胚蛋中生长至可比较的峰值滴度(数据未显示)。
还在MDCK细胞中评价了每种嵌合病毒的噬斑表型。所有病毒形成了可比较大小的噬斑，如图25B所示。这些数据一起验证了嵌合HA构建体正确折叠并具有生物学功能。
6.5.2.4茎域特异性抗体能够中和表达cHA的病毒和假型颗粒
最终，对茎域-特异性抗体检测了中和我们新产生的表达cHA的重组病毒的能力。在mAbKB2、具有广泛的第1组反应性的HA-茎域特异性抗体或无抗体存在下进行了噬斑减少分析。结果显示mAbKB2和以剂量依赖的方式和相似的效果中和所有表达cHA的病毒。在100ug/mL下，mAbKB2能够以100％的效果完全中和cH1/1和cH5/1病毒，在低至4ug/mL的浓度下具有一些中和活性(图26A)。
为了验证这些结果，用mAbKB2假型颗粒进行了抑制分析。将表达cH1/1或cH5/1和乙型流感病毒NA的假型颗粒在mAbKB2或无抗体的存在下加至MDCK细胞。转导后48小时，收集上清液并分析荧光素酶活性。如预期的，mAbKB2在高于4ug/mL的浓度下以剂量依赖的方式封闭了cH1/1和cH5/1假型颗粒的进入。虽然与噬斑减少分析中使用的浓度相比，较低浓度的mAbKB2即足以抑制假型颗粒的进入，但是由于假型颗粒表面HA三聚体假定的较低引入，这是一个预期的结果，(Corti等人，2010，TheJournalofClinicalInvestigation120:1663-73)。在涉及整病毒相对假型颗粒的分析中，该mAb不同中和能力的现象已经在其它研究中被认可(Corti等人，2010，TheJournalofClinicalInvestigation120:1663-7321；Sui等人，2009，NatureStructural&MolecularBiology16:265-73)。
6.5.3结论
通过利用划分头域和茎域的界限的保守二硫键Cys52-Cys277开发了一种新的产生具有含不同HA球状头域的嵌合HA蛋白的流感病毒的策略。从而，通过将亲代头域取代为另一HA的头域，产生了一系列具有相同的茎域但是不同的球状头域的嵌合HA。该设计在多个亚型中进行了测试，包括PR8茎域与Cal/09和VNH5球状头域。此外，H7球状头域被置于H3茎域上。这些构建体覆盖了流感HA蛋白的两种系统发生组。每种构建体都在细胞表面表达并保留融合活性。含有嵌合HA的重组病毒的产生进一步验证了HA正确折叠并保留生物学功能。
6.6实施例6：嵌合血凝素构建体作为通用流感疫苗
本实施例显示了可通过免疫接种嵌合血凝素(cHA)构建体、含独特血凝素头域和茎域组合的蛋白引发的茎域-特异性免疫应答的保护效力。
6.6.1材料和方法
6.6.1.1细胞和病毒
293T和MDCK细胞获得自ATCC并被保存在Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)和最小必需培养基(均来自Gibco)中，其中均补充10％胎牛血清(HyClone)和100单位/ml的青霉素-100μg/ml的链霉素(Pen/Strep，Gibco)。
流感病毒A/蒙默斯堡/1/1947(FM1)和A/荷兰/602/2009在小鼠肺部传代并随后在10天大的具胚蛋中生长48小时。去除多元裂解位点的低致病性A/越南/1203/04(VN04):PR82:6重排病毒(参见，例如，Steel等人，2009，JVirol83:1742-1753)和B/山行县/16/1988病毒分别在37℃下在10天大的具胚蛋中生长48小时或在33℃下生长72小时。
如上所述和如在先描述的通过反向遗传学系统产生重组流感病毒(参见，例如，Quinlivan等人，2005，JVirol79:8431-8439)。以如在先描述的相似方式拯救了cH9/1N1病毒，一种表达H1茎域(来自PR8病毒)上部H9病毒HA球状头域的病毒，和cH5/1(H5头域(VN04)、H1茎域)N1病毒(参见，例如，Pica等人，2012，PNASUSA109:2573-2578)。为了产生YAM-HA病毒，B/山行县/16/1988(WTYAM)HA的胞外域被替换为A/波多黎各/8/1934病毒HA的对应的域(参见，例如，Hai等人，2011，Journalofvirology85:6832-6843)。在之前的研究中构建了编码其它7种WTYAM病毒片段的反向遗传学质粒(参见，例如，Hai等人，2008，JVirol82:10580-10590)。拯救后，表达cHA的重组病毒在37℃下在10天大的具胚蛋中繁殖48小时。YAM-HA病毒在33℃下在8天大的具胚蛋中生长72小时。
在TPCK胰蛋白酶的存在下在MDCK细胞(ATCC)上滴定了重组和野生型病毒，如上所述。在ELISA分析中，cH5/1N1病毒在30％蔗糖垫上部分纯化。cH9/1N1、cH5/1N1和FM1病毒通过梯度离心纯化并用PBS稀释(1:4000)的甲醛灭活作为阳性对照疫苗。
6.6.1.2cH6/1和cH9/1蛋白构建体的产生
使用杆状病毒表达系统产生了可溶性cH6/1和cH9/1蛋白，如上所述和如在先描述的(参见，例如，Pica等人，2012，PNASUSA109:2573-2578)。简而言之，首先产生了杆状转移载体，然后将杆粒转染至Sf9细胞。然后用重组杆状病毒感染HighFive细胞，MOI为10。感染后96h上清液被收集并在4℃与Ni-NTA树脂(Qiagen)一起孵育2小时以纯化His-标记的重组cHA蛋白。将悬浮液上载至柱子上并用洗涤后，在pH8的洗脱缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl，250mM咪唑)中洗脱。在PBS中对合并的级分进行缓冲液更换并使用10kD分子量截留的AmiconUltra离心过滤器单元(Millipore)在浮筒式转头中进行浓缩。通过SDS-PAGE、Coomassie染色和蛋白质印迹检测蛋白的纯度和身份。用Bradford试剂测定终蛋白浓度。
6.6.1.3动物
允许动物随意接受食物和水并置于12小时的光/暗循环。对所有鼻内流程，对6-8周大的雌性BALB/c小鼠(JacksonLaboratories)腹膜内(IP)注射0.1mL的氯胺酮/甲苯噻嗪(0.15mg氯胺酮和0.03mg甲苯噻嗪)进行麻醉。
6.6.1.4免疫接种和攻击实验
对未感染的6-8周大雌性BALB/c小鼠免疫接种cH9/1蛋白，在佐剂R848(Invitrogen)的存在下鼻内接种(10ug)，用MF59样佐剂Addavax(Invitrogen)腹膜内接种(10ug)。初免后三周用cH6/1蛋白或BSA(BioRad)对动物进行加强。也通过鼻内(10ug)和腹膜内(10ug)进行加强免疫接种，虽然用polyI:C作为佐剂(Invitrogen)。50ul体积的灭活FM1病毒(1ug)被肌肉内施用作为阳性对照。加强后三周，使动物流血并收获血清，并用5个LD50的FM1病毒攻击动物。攻击后对体重监控14天。
在其它实验中，对动物用编码质粒DNA的cH9/1(80ug，TriGrid递送系统；IchorMedicalSystems)初免并随后在三周后用cH6/1或cH9/1(对照)蛋白加强，其与polyI:C一起鼻内(10ug)和肌肉内(10ug)施用。三周后用cH5/1或cH9/1(对照)蛋白重复加强。对照动物也用编码DNA的cH9/1进行DNA电穿孔，但是用BSA加强两次(与治疗组方式相似)。阳性对照动物肌肉内接受灭活FM1或PR8病毒(1μg)或1μg的pH1N1单价裂解疫苗(BEI)。然后在加强后3-5周用5个LD50的PR8或FM1或10个LD50的pH1N1病毒攻击动物。用于CD8+T细胞去除的动物在攻击前48和24小时用300μg的抗-CD8+T细胞抗体进行处理(参见，例如，M.L.Salem,2000,Int.J.Immunopharmacol.22:707)(来自杂交瘤系2.43，购自ATCC)并用5个LD50的PR8病毒攻击。攻击后对体重监控14天。对所有病毒使用20％的截止(cutoff)。
对于其它实验，对小鼠接种YAM-HA或WTYAM病毒并随后在三周后在polyI:C的存在下肌肉内和腹膜内免疫接种BSA或cH6/1蛋白。未感染动物作为另外的对照。免疫接种后3-5周使所有动物流血并用250LD50的cH9/1N1病毒或10LD50的去除PR8背景中的多元裂解位点的2:6重排H5病毒进行攻击(参见，例如，Steel等人，2009，JVirol83:1742-1753)。以50ul的体积肌肉内施用甲醛-灭活的cH9/1N1病毒(1ug)和cH5/1N1病毒作为合适的病毒攻击的阳性对照。根据机构指导线，如果动物在攻击后损失多于其30％的初始体重则进行安乐死。对较低致病性的cH9/1N1和A/荷兰/602/2009病毒使用20％的截止(cutoff)。对于使用这些两种病毒的攻击，使用了更严谨的剂量以鉴别所有对照(250或10LD50)的死亡或实质的体重损失。
6.6.1.5酶联免疫吸附测定
用PBS中稀释至5ug/mL的部分纯化的cH5/1N1病毒过夜包被Immulon4HBX(ThermoScientific)板。用含3％脱脂奶粉的0.1％吐温20-PBS(TPBS)封闭板1小时，并随后与含1％奶粉的TPBS中系列稀释的小鼠血清室温孵育1小时。洗涤3次后，将板与偶联至碱性蛋白酶(AP)的抗-小鼠IgG(γ-链特异性，Invitrogen)孵育1小时。然后用PBST洗涤板3次，用对硝基苯酚磷酸盐(PNPP)底物(Zymed)发展，用0.5MNaOH终止并在405nm的光密度进行读数。对于所有实验使用了Synergy4(BioTek)酶标仪。
通过ELISA如上所述检测了茎域-特异性抗体滴度。PR8抗原被用于包被ELISA板以定量茎域-特异性反应。为了检测免疫接种的小鼠中茎域-特异性抗体的中和能力，血清被合并，并纯化了总血清IgG。
表达H5HA的假型颗粒被用于假型颗粒进入分析，如在先描述的(参见，例如，Hai等人，2012，J.Virol.86:5774-5781和N.Pica等人，2012，PNAS109:2573-2578)。在进入时，假型颗粒表达荧光素酶报告子。IgG对该进入的抑制被定量为与非IgG处理的对照相比的表达百分比。因为动物未接触H5球状头域，这些分析确定了免疫接种中和病毒产生的茎域-特异性抗体的程度。单克隆抗体CR6261和纯化的来自野生型乙型流感感染的小鼠的IgG被用作对照。
6.6.1.6噬斑减少中和分析(PRNA)
在室温下用60-80噬斑形成单位(pfu)的病毒(cH9N1甲型流感病毒)在摇床上预孵育mAb的稀释物1小时。然后使用病毒和纯化的IgG混合物在37℃下在12孔的形式中一式两份感染单层MDCK细胞1小时，每10分钟进行间断摇动。用对应的IgG稀释液补充琼脂糖覆盖。感染后2天(dpi)，用4％PFA/1XPBS固定单层细胞30分钟。在室温下用5％NF-牛奶/1XPBS固定细胞30分钟，并相应在室温下与H9特异性单克隆抗体(5μg/mL)孵育1小时。缀合至HRP的抗-小鼠二抗以1:1000稀释被用作第二抗体。使用TrueBlue过氧化物酶底物(KPLInc.)可视化噬斑，用自来水终止反应。对每个抗体计数噬斑抑制百分比相对mAb组无计算。
6.6.1.7统计学检验
使用单侧学生T检验进行统计学分析(Prism4，GraphPad)。对于图29C，所有值被标绘为平均值与均值的标准差。存活率的差异用对数秩意义检验的KaplanMeier存活分析进行计算。
对于P值分析，P值为0.05或以下被认为是统计学显著的。如果变量被确定为统计学上不同的，则使用Welch校正。P值为0.05或以下被认为是统计学显著的。在图29C中当用茎域血清反应性比上最大体重损失时，按照Iglewicz和Hoaglin的方法有一个值被检测为离群值(修饰的Z-分数>均值之上3.5个标准差)(参见Iglewicz,B.a.H.,D.1993，第16卷：Howtodetectandhandleoutliers.E.Mykytka编辑，TheASQCBasicReferencesinQualityControl:StatisticalTechniques.AmericanSocietyofQualityControl)，并被从分析中省略。
6.6.2结果
6.6.2.1用cHA构建体顺序免疫接种引发HA茎域-特异性抗体并针对致死流感攻击提供保护
推测表达来自具有不同抗原性的病毒的球状头域的构建体能够刺激针对HA茎域的多克隆应答。为了验证这一点，首先对小鼠免疫接种cH9/1可溶性蛋白和佐剂，其中HA的茎域来自A/波多黎各/8/1934(PR8)病毒，头域来自H9分离物。初免后三周，用第二可溶性cHA，cH6/1(头域来自H6病毒，茎域来自PR8病毒)加强小鼠，目的是刺激针对分子茎域的体液应答。(免疫接种灭活FM1病毒的小鼠作为阳性对照)。加强后三周，使小鼠流血以评价对H1茎域的血清反应性，并随后用适于小鼠的A/FortMounmoth/1/1947(FM1)病毒进行攻击。如图27A所示，免疫接种的小鼠产生针对HA茎域的血清抗体应答。用FM1攻击后，动物损失了可观的量的体重(图27B)，虽然在第7天后90％的总存活都发生恢复(图27C)。虽然小鼠仅被暴露于H9和H6病毒的球状头域，我们确定了所有小鼠都是对FM1病毒HI阴性的，并从而确认了由免疫接种引发的保护是茎域特异性免疫应答的结果。从而，用基于PR8的cHA进行免疫接种提供了茎域-特异性免疫力，其在面对FM1病毒攻击时具有保护性。
6.6.2.2cH6/1蛋白免疫接种引发介导针对cH9/1N1病毒攻击的保护的茎域-特异性免疫力
虽然通过施用两种不同的可溶性cHA构建体产生了针对茎域的抗体应答，但是在FM1攻击之后观察到实质程度的病态。由于小鼠在免疫学上未感染流感病毒，可能需要多次暴露于流感病毒并随后引入抗原性不同的头域以诱导针对HA茎域的高血清抗体滴度。增加的血凝素茎域特异性血清抗体滴度刺激也可能需要感染并可以解释为何使用单独的cHA蛋白进行的初免和加强未能观察到强力保护。
为了刺激针对病毒血凝素的免疫应答，单不针对其它病毒蛋白产生保护性免疫，构建了表达来自PR8病毒(YAM-HA)的HA的胞外域的重组B/山行县/16/1988病毒(参见，例如，Hai等人，2011，Journalofvirology85:6832-6843)。用YAM-HA接种小鼠以模拟之前暴露于流感病毒并随后在3周后免疫接种BSA或cH6/1蛋白。作为额外的对照，小鼠被感染野生型B/山行县/16/1988(WTYAM)病毒并免疫接种BSA。然后使用表达cH9/1(H9头域，H1茎域)的甲型流感病毒作为攻击病毒，以确定地表明仅针对HA茎域的免疫应答的保护性质。又一次，因为动物接触了来自H1和H6病毒的球状头域，用表达cH9/1HA的病毒进行攻击后看到的保护看上去主要是针对H1茎域的免疫。
如图28A所示，YAM-HA暴露之后接受cH6/1蛋白疫苗的动物在PR8背景下被完全保护免受250LD50的表达cH9/1的病毒攻击。与免疫接种BSA的动物相比，免疫接种cH6/1可溶性蛋白的动物在统计学上在第3、4和5天损失较少的体重。这一体重损失的保护导致与免疫接种BSA的群相比，免疫接种cH6/1组中增加的存活(p＝0.038；图28B)。未感染动物和接种WTYAM的动物未受到针对感染的保护，表明其它免疫接种组中看到的任何保护都不是病毒复制的结果，而是对H1茎域的特异性应答。因为动物接触了来自H1和H6病毒的球状头域且对cH9/1病毒攻击是HI阴性的，我们相信在此看到的保护是针对H1茎域的免疫的结果。
要注意HA茎域特异性的单克隆抗体已经从感染或免疫接种季节性H1N1病毒的个体中进行了分离(参见，例如，Corti等人，2010，TheJournalofclinicalinvestigation120:1663-1673；Corti等人，2011，Science333:850-856；Ekiert等人，2011，Science333:843-850；Sui等人，2009，NatStructMolBiol16:265-273；Throsby等人，2008，PLoSOne3:e3942)且未感染pH1N1病毒的个体中已经鉴别了茎域滴度，虽然是低水平的(参见，例如，Pica等人，2012，PNASUSA109:2573-2578)。从而，不奇怪YAM-HA接种的动物能够产生一定程度的茎域滴度。然而，免疫接种cH6/1构建体使血清茎域滴度增加了4倍(产生相当量的OD值的倒数稀释)(图28C)并保护动物免于实质上的体重损失和死亡(图28A和28B)。免疫接种cH6/1构建体引发茎域-特异性IgG的生产，其以100％的效能中和病毒(YAM-HA+BSA)(图28D)，而来自仅进行初免的动物的血清表现出略微大于背景的中和水平(YAM-HA+BSA)。事实上，接种YAM-HA并随后免疫接种BSA的动物与接种WTYAM病毒并免疫接种BSA的动物具有统计学上相似的存活率(p＝0.058)。相反，使用cH6/1蛋白作为疫苗产生了100％的攻击存活率，与接种WTYAM的动物相比这是一个高度显著的比率(p<.0001)。与接种YAM-HA和免疫接种BSA的小鼠相比存活率也增加了(p＝0.038)。这些差异在假型颗粒进入分析中没有反映，因为来自YAM-HA+BSA小鼠和YAM-HA+cH6/1小鼠的IgG以相似的效率抑制了编码H5HA的假型颗粒的进入(图28E)。重点要注意后一分析仅检测了抗体阻碍假型颗粒进入的能力。因此，在此分析中将不会检测进入下游的茎域-抗体和/或其与受感染的(免疫)细胞的相互作用的效果。这可以解释为何在两个组中未观察到中和方面的差异，也未反映体内的发现。然而，由这些感染过程引发的抗体是茎域特异性的和广泛中和的。因为攻击病毒仅编码来自H1病毒的茎域，可以推论所看到的保护是通过cH6/1免疫接种刺激的宿主针对HA茎域免疫应答的结果。
6.6.2.3免疫接种cH6/1蛋白保护小鼠免于致死性H5流感病毒攻击
接下来确认了免疫接种cH6/1蛋白是否能够保护小鼠免受H5病毒攻击。如上所述对小鼠接种和免疫并用10LD50的2:6重排病毒攻击，所述病毒在在PR8背景中表达A/越南/1203/2004病毒的HA和NA(参见，例如，Steel等人，2009，JVirol83:1742-1753)。如预期的，未感染动物和接种WTYAM病毒的动物没有受到针对攻击的保护并在第8天屈服于感染。接种YAM-HA病毒和免疫接种BSA的动物被边缘性地保护免于攻击，存活率为40％。当动物免疫接种cH6/1蛋白时看到了增加的保护，存活率90％。两种疫苗组之间存活率的差异达到了统计学显著(p＝0.06)，虽然免疫接种cH6/1蛋白的小鼠存活了统计学上更久的时间(p＝0.037)(图29A和29B)。当比较HA茎域反应性和在H5攻击后的监控周期内最大％体重损失时，检测到反相关的关系，其中具有更高血清茎域滴度的动物倾向于在攻击后损失较少的体重(图429C)，这支持了cH6/1能够加强基于HA-茎域的免疫力的观点。
使用具有免疫接种的小鼠免疫学未感染和HI阴性的的HA球状头域的攻击病毒，结果表明免疫接种后针对攻击的保护单独基于对HA茎域的免疫应答。为了排除针对受体结合位点的交叉反应性抗体可能在此处看到的保护中发挥作用的可能性，对所有小鼠检测了HI并发现其对于它们各自的攻击病毒都是HI阴性的。
6.6.2.4免疫接种cHA引发介导针对H1N1病毒攻击的保护的茎域-特异性免疫力
已在人类血清中检测到茎域-特异性抗体(参见，例如，图15A和15B；M.Thorsby等人，2008，PLoSOne3:e3942，D.C.Ekiert等人，2009，Science324:246-251，D.C.Ekiert等人，2011，Science333:843-850，J.Wrammert等人，2011，J.Exp.Med.208:181-193和N.Pica等人，2012，PNAS109:2573-2578)。因为之前接触过流感病毒HA可能对于茎域特异性免疫应答的强力产生是关键性的，我们确认了是否小鼠中已存在的针对流感病毒的免疫可以被概括(recapitulated)。我们推测其将会更有效地保护免于病毒攻击后的发病。为了达到这一点，用编码cH9/1的DNA表达载体初免小鼠(参见，例如，J.Steel等人，2010，MBio1(1)，pii:e00018-10)，然后用可溶性cH6/1蛋白加强，随后用cH5/1蛋白(H5头域，H1茎域)加强，最终用一系列H1N1病毒攻击(图30A-30F)。感染FM1(图30A和30B)、A/荷兰/602/2009(pH1N1)(图30C和30D)和PR8病毒(图30E和30F)后，所有cHA-免疫接种的动物被保护免受攻击，并显示了仅有最少量的体重损失，如果有的话。相反，用cH9/1DNA初免后接受BSA的阴性对照动物损失了可观的体重，并且除了一只动物外，其它均在第9天屈服于感染(图30A-30F)。在每个攻击实验中的cHA-免疫接种的动物的存活率均显著不同于对照(图30B、30D和30F)。为了确认所引发的保护是茎域-特异性体液免疫的结果，所有小鼠被ELISA确认为对每种攻击病毒是HI阴性的，虽然血清能够结合H1HA(图30G)，确认了我们的免疫接种流程生产茎域特异性抗体。因为可能针对HA茎域中的表位的CD8T细胞可能在此看到的保护中发挥作用(参见，例如，M.Tamura等人，J.Virol.72:9404-9406)，对小鼠免疫接种并通过在PR8攻击之前施用单克隆抗体2.43去除CD8T细胞(M.L.Salem，2000，Int.J.Immunopharmacol.22:707-718)。该去除不会影响体重损失或存活率表现，其牵涉免疫接种引发的保护中的体液应答(图30H和30I)。从而，针对HA茎域而非头域的适应性体液免疫应答提供了针对三种不同的H1N1病毒的保护。
为了进一步验证基于cHA的免疫接种流程能诱导具有针对其它亚型的中和能力的茎域-特异性抗体，测试了来自免疫接种的小鼠的纯化的IgG阻碍含H2HA假型颗粒的进入的能力。因为假型颗粒在进入后表达荧光素酶报告子基因，通过在细胞上清液中缺失荧光素酶活性检测了中和活性(R.Hai等人，2012，J.Virol.86:5774-5781和N.Pica等人，2012，PNAS109:2573-2578)。与攻击后看到的保护一致，从免疫接种的小鼠中纯化的IgG以剂量依赖的方式和与CR6261——被用作阳性对照的具有HA茎域特异性的单克隆抗体相似的效力抑制假型颗粒进入(图30J)。从而，该免疫接种流程引发了具有广泛特异性的茎域抗体，能够中和如H2的其它第1组HA。
6.6.3结论
本实施例显示了可通过免疫接种嵌合HA引发的茎域-特异性免疫应答的保护效果。结果表明针对HA茎域的免疫应答足以保护免于病毒攻击，且该免疫接种流程提供了异亚型保护。可在人类中开发相似策略以提供针对广泛流感病毒的保护，而不必进行每年接种和增加的流行性准备。
6.7实施例7：羧端三聚域稳定了可溶性重组血凝素基质茎域上的构 象表位
本实施例显示羧端三聚域对于重组可溶性流感病毒血凝素上茎域表位的结构完整性是重要的。
6.7.1材料和方法
6.7.1.1细胞
Sf9昆虫细胞(ATCC#CRL-1711)生长于补充10％FBS(AtlantaBiologicals)、0.1％PluronicF68(Sigma)和青-链霉素抗生素(Gibco)混合物的TMN-FH培养基(GeminiBio-Products)中。BTI-TN-5B1-4细胞(HighFive-ViennaInstituteofBiotechnology亚克隆)生长于补充青-链霉素抗生素(Gibco)混合物的HyCloneSFX无血清培养基(FisherScientific)。
6.7.1.2克隆和产生重组杆状病毒
H1毒株A/波多黎各/8/34(PR8)、A/加利福尼亚/04/09(Cal09)、H2毒株A/Japan/305/57(JAP57)、H3毒株A/香港/1/68(HK68)、A/威斯康星/67/05(Wisc05)和H5毒株A/越南/1203/04(VN04–多元裂解位点被去除；参见Steel等人，2009，JVirol83：1742-1753)的HA编码序列通过聚合酶链式反应从pCAGGS质粒扩增并使用BamHI或StuI和NotI限制性内切酶(NEB)克隆入修饰的pFastBac载体(Invitrogen)。克隆了两个系列的构建体，无三聚域和有三聚域的HA：无三聚域HA构建体被设计为HA的C端跨膜域和胞内域被替换为六组氨酸-标签(H1的HA序列终止于I509，H2和H5于V509，H3于G508；H3编号)；另一系列的构建体，具有三聚域的HA，也缺失C端跨膜域和胞内域(HA序列终止于V503-H3编号)但除了C端六组氨酸-标签之外还包含凝血酶裂解位点和一个T4foldon三聚域(参见，例如，Meier等人，2004，JMolBiol344：1051-1069)(图31)。按照生产商的说明将产生的重组pFastBac克隆转化至DH10Bac细菌(Invitrogen)并用PureLinkPlasmidFilterMidiprep试剂盒(Invitrogen)制备了重组杆粒。使用CellfectinII(Invitrogen)将重组杆粒转化如Sf9细胞用于重组杆状病毒的拯救。所有序列通过Sanger测序进行确认。
6.7.1.3蛋白表达、纯化和表征
在Sf9细胞中将杆状病毒扩增至第3代储液并随后用于在HyCloneSFX无血清培养基(FisherScientific)中以1x106细胞/ml感染BTI-TN-5B1-4(HighFive)细胞，感染复数为10。在1000ml摇瓶中28℃下表达96小时。96小时后，通过低速离心(5000g，4℃，20min)澄清上清液并与Ni-NTA(Qiagen)树脂(3ml浆液对应250ml培养上清)一起室温(RT)孵育两小时。然后使树脂-上清液混合物穿过10ml聚丙烯柱(Qiagen)。用15ml洗涤缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl、20mM咪唑，pH8)对保留的树脂洗涤4次，用洗脱缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl，300mM咪唑，pH8)洗脱蛋白。使用30kDa截留量的AmiconUltracell(Millipore)离心单元浓缩洗脱物，并将缓冲液替换为pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。使用QuickstartBradfordDyeReagent(Bio-Rad)用牛血清白蛋白标准曲线对蛋白浓度进行定量。蛋白纯度、完整性和身份用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(4-20％聚丙烯酰胺-MiniPROTEANTGX凝胶，Bio-Rad)、Coomassie染色和蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)进行评价。三聚和/或多聚的程度通过HA与二-[磺基琥珀]辛二酸盐(BS3-FisherScientific)的交联按照生产商的建议进行检测。简而言之，在25倍摩尔过量的BS3交联剂存在下将3μg的HA在30μl的PBS中孵育。在室温下孵育混合物30分钟，随后通过加入1MTris-HCl缓冲液(pH8)至终浓度50mM对BS3进行淬灭。然后进行了SDS-PAGE和/或采用小鼠抗-his第一抗体(Sigma)和抗-小鼠辣根过氧化物酶(SantaCruzBiotechnology)或碱性磷酸酶(SantaCruzBiotechnology)缀合的第二抗体的蛋白质印迹分析。
6.7.1.4酶联免疫吸附测定
用浓度5μg/ml的含或不含三聚域的重组HA在包被缓冲液(0.1MNa2CO3/NaHCO3，pH9.2，50μl/孔)中4℃下过夜包被Immunolon4HBX(FisherScientific)板。然后在室温下用含1％吐温20(TBPS)和3％脱脂奶粉的PBS(pH7.4)封闭板1小时。封闭后，用TPBS洗涤板一次，并随后用三倍稀释的单克隆抗体或血清(在含1％奶粉的TPBS中100μl每孔–单克隆抗体起始浓度30μg/ml；血清1:100稀释)室温孵育1小时。然后用100μl的TPBS洗涤板三次并用辣根过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG(SantaCruzBiotechnology)或抗-人Fab第二抗体(Sigma)额外孵育1小时，稀释度1:3000(50μl每孔)。再洗涤3次后，使用SigmaFASTOPD基质(Sigma)(100μl/well)对板进行发展，用3MHCl(50μl/孔)终止并在490nm的吸光度下用Synergy4(BioTek)酶标仪读数。对得到的读数用仅用第二抗体孵育的孔的值进行背景扣除。
对于稳定性研究，来自PR8病毒具有三聚域的HA在4℃或-80℃下储存60天并进行1次(标准)、2次、3次或4次冻融循环。使用PY102和C179单克隆抗体比较了头域和于茎域结合抗体的稳定性。在ELISA中抗体-HA组合进行了一式三份，除了在稳定性研究中使用了一式两份。
6.7.2结果
6.7.2.1C端三聚域稳定了HA并诱导了三聚体的形成
在杆状病毒表达系统中以可溶性形式表达了具有或不具有C端T4噬菌体三聚域的多种第1组和第2组HA的胞外域(图31)。感染后96小时收获蛋白并通过C端六组氨酸标签使用Ni-NTA柱纯化。使用超滤离心柱浓缩纯化的蛋白，通过SDS-PAGE和Coomassie染色评价蛋白完整性和杂质，并用Bradford试剂定量。基于氨基酸序列和杆状病毒表达的无多元裂解位点的全长HA通常是未裂解的这一事实，HA的胞外域将具有期望分子量为大约60kDa每单体(或180kDa每三聚体)，不考虑糖基化。无三聚域的Cal09(H1)、JAP57(H2)和VN04(无多元裂解位点的H5)HA看起来部分被裂解为HA1和HA2，如除未裂解的HA的60kDa条带(HA0)之外的大约40kDa(HA1)和25kDa(HA2)的条带的存在所示。根据具有三聚域的Cal09、JAP57和VN04HA的非还原的变性SDS-PAGE中独有的60kDa条带的存在，可以假设这些蛋白主要以未裂解的HA0进行表达(图32A)。另外，无三聚域Wisc05(H3)HA的制备物显示了40kDa的降解产物，其在用抗-茎域抗体(12D1)探测时具有反应性。从而该物质可能是非特异性裂解产物。具有三聚域的Wisc05HA仅显示为HA0条带(图32A)。PR8和HK68HA表现得非常稳定(以HA0呈现)，甚至在缺少三聚域的情况下。
使用BS3——最近用于显示HA的三聚化的亲水性化学交联剂——交联含或不含T4三聚域的HA(参见，例如，Weldon等人，2010，PLoSOne5)。交联后，将样品在还原性的变性上载染料中稀释并溶于还原性的变性SDS-PAGE凝胶。无三聚域的第1组HA形成高分子量寡聚物，其几乎不进入电泳胶，主要保留在浓缩胶中(图32B和32C)。对VN04和JAP57检测到最强的表型；其它第1组HA也形成了额外的三聚体(大约230kDa)、二聚体(130-150kDa)和单体(60kDa)(图32B和32C)。具有三聚域的第1组HA主要形成三聚体，其在SDS-PAGE凝胶上跑至大约230kD并在电泳胶中形成确定的条带。然而，它们还形成了二聚体(大约130-150kDa，Cal09最强)和单体(60kDa)。第2组HA表现不同：HK68HA主要形成三聚体并在某种程度上形成二聚体，而不管三聚域的存在。在不存在三聚域时Wisc05HA主要显示了二聚化，而具有T4域的HA大多三聚化。
6.7.2.2C端三聚域强力增强茎域-反应性抗体与HA基质的结合
评价了一系列广泛反应性的中和抗体与HA构建体的反应性以确定这些抗体与含或不含三聚域的HA基质的不同结合。本实验中使用了茎域-特异性抗体mAbC179、小鼠mAb6F12、人mAbCR6261(均为第1组特异性)；和小鼠mAb12D1和人mAbCR8020(均为第2组特异性)。本实验中还使用了最近被分离并表征为具有对H1和H5Has的反应性的四种其它茎域-反应性抗体，KB2、BD3、GG3和IB11。作为对照，使用了已知能结合HA球状头域的毒株特异性抗体。作为另外的对照，使用了感染半致死流感病毒株(PR8、Cal09、H3、VN04)或免疫接种VLP(JAP57)的小鼠血清。抗体C179、CR6261和6F12对所检测的两种H1HA(Cal09和PR8)均表现出强的结合表型。应注意它们唯一结合具有三聚域的HA(图33A和33B)；对无三聚域的HA没有观察到结合。对其它四种茎域-反应性广泛中和H1-H5抗体观察到类似的结合特性。相反，头域-特异性抗体，例如7B2(Cal09)和PY102(PR8)，无论三聚域表达与否均与HA反应，使用Cal09或PR8感染的动物血清验证了这些发现＝(图33A和33B)。
该效果不是H1亚型特异性的——当检测C179和CR6261与含或不含三聚域的JAP57(H2)和VN04(H5)HA的结合时，观察到相似的表型，其中这些抗体仅与三聚化形式的蛋白反应(图34A和34B)。当评价这四种H1-H5抗体的反应性时观察到相同的结果。头域-特异性抗体8F8(JAP57)和mAb#8(VN04)或多克隆抗-H2或抗-H5血清同样好地识别两种形式的HA。
对于第2组HA-结合抗体出现了不同的模式。为了检测三聚域对茎域抗体与第2组HA的反应性的影响，使用了广泛反应性抗体CR8020和12D1。CR8020结合第2组HA中的构象表位，而12D1被认为能结合HA2亚单位长α螺旋(LAH)中的线性表位。CR8020与具有三聚域的HK68和Wisc05HA的结合相对于与无三聚域HA的结合大大增强(图35A和35B)。然而，缺少三聚域没有完全废除结合，如在第1组HA中所看到的那样。12D1没有区分具有或不具有三聚域的HA(图35)。
6.7.3结论
T4三聚域允许可溶性HA分子的成功三聚化并大大增强这些分子在杆状病毒表达后的稳定性。
6.8实施例8：表达包含H1流感病毒的干域和H5流感病毒的球状头 域的嵌合HA的流感病毒(CH5/1)
本实施例显示了表达包含H1流感病毒的干域和H5流感病毒的球状头域的嵌合HA的流感病毒的工程化和拯救(即，包含工程化改造以表达cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的流感病毒)。
通过在携带A/加利福尼亚/04/09的HA基因与A/越南/1203/04(H5)的球状头域的拯救质粒中替换球状头域密码子(53-276，H3编号)构建了用于拯救表达cH5/1嵌合流感血凝素多肽的流感病毒的质粒。构建体的序列通过Sanger测序进行确认，按照上述方法使用蛋白质印迹分析检测了在293T细胞中的表达。
使用上述实施例5中描述的方法产生了用于拯救的重组病毒。编码cH5/1Cal09HA的质粒被共转染至具有7种互补的拯救质粒的293T细胞，所述7种互补的拯救质粒编码甲型流感病毒的7种其它基因组片段(PR8骨架)。转染后1天收获上清液并直接接种至10天大的具胚蛋。接种后48小时将蛋冷冻至4℃和并收获尿囊液。通过血凝集分析评价病毒生长。来自阳性蛋的上清在MDCK细胞上噬斑化，挑去单一噬斑并在具胚蛋中再次繁殖。来自噬斑纯化的病毒的RNA被分离、逆转录并通过Sanger测序确认序列。病毒克隆的身份通过用严格的H1茎域-反应性抗体(6F12)和针对A/越南/1203/04(H5)的毒株特异性抗-头域抗体进行染色来证明，确认了包含工程化改造以表达含有A/加利福尼亚/04/09的HA基因和A/越南/1203/04(H5)的球状头域的cH5/1嵌合流感血凝素多肽的基因组的流感病毒的产生和分离。
6.9实施例9基于血凝素茎域的通用疫苗构成针对第2组甲型流感病 毒的保护
本实施例显示涉及施用包含H3血凝素(第2组)茎域的嵌合HA多肽的免疫接种策略在对象中诱导了广泛中和抗-茎域抗体，其与异源H3、H10、H14、H15和H7(来自一种新型中国H7N9病毒)血凝素具有高度交叉反应性。本实施例还显示这些抗-茎域抗体赋予了针对表达多种第3组血凝素、包括H7亚型的流感病毒的广泛保护。
6.9.1材料和方法
细胞和病毒。Madin-Darby犬肾细胞(MDCK；ATCCCCL-34)和人胚胎肾293T(ATCCCRL-11268)细胞购自美国模式培养物保藏所并分别生长于Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)(Gibco)和最小必需培养基(Gibco)。两种培养基均补充10％胎牛血清(FBS；HyClone)和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Pen-Strep；Gibco)。
通过基于质粒的反向遗传学如在先的描述产生了嵌合和重组流感病毒(Margine等人，2013，J.Virol.87:4728-4737；Hai等人，2012，J.Virol.86:5774–5781；Krammer等人，2013，J.Virol.87:6542–6550)。使病毒毒株A/维多利亚/361/11(H3N2；Vic11)、A/佩斯/16/09(H3N2；佩斯09)、A/菲律宾/2/82(H3N2；Phil82)、X-31(H3N2；6:2重排的A/波多黎各/8/34，具有来自A/香港/1/68的HA和NA)、A/美洲鸵/北卡罗来纳/39482/93(H7N1；RheaH7)、A/cH5/3N1(表达A/越南/1203/04的H5球状头域，佩斯09的H3茎域和A/波多黎各/8/34的NA和内在基因)、A/怀俄明/03/03(H3N2；WyoH3)、A/琵嘴鸭/阿拉斯加/7MP1708/07(H3N8)、A/野鸭/阿拉斯加内陆/10BM01929/10(H10N7)和B/cH7/3(在B/山行县/16/88背景下的A/佩斯/16/09的H3茎域上部表达A/野鸭/亚伯达/24/01的H7球状头域)在8或10天大的具胚蛋中37℃生长48h(对于甲型流感病毒)或33℃生长72h(对于乙型流感病毒)(Hai等人，2012，J.Virol.86:5774–5781；Hai等人，2011，J.Virol.85:6832–6843)。A/印第安纳/10/11(H3N2变体，H3N2v)在MDCK细胞上生长。在甲苯磺酰氨基苯乙基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶存在下的MDCK细胞上测定病毒滴度。通过蔗糖密度超速离心纯化Vic11、佩斯09、Phil82、X-31、RheaH7和A/cH5/3N1病毒用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。用作阳性对照的纯化的毒株制备物(Phil82、X-31、RheaH7和A/cH5/3N1)通过福尔马林处理进行灭活。所有病毒在2级生物安全条件下处理。表达cH5/3和cH7/3蛋白的病毒含有原始H3裂解位点，其与低致病性表型有关，并在A/波多黎各/8/34背景下被拯救，后者通常被认为对人类是安全的(Beare等人，1975，Lancetii:729–732)。利用的H7N1分离物在禽类中也显示了低致病性表型(Joseph等人，2007，J.Virol.81:10558:10566)。Sf9细胞(ATCCCRL-1711)被保持在补充10％FBS、1％PluronicF68(Sigma)和Pen-Strep(Gibco)的粉纹夜蛾培养基制剂Hink中(TNM-FH)(GeminiBio产品)。BTI-TN-5B1-4(HighFive)细胞(ATCCCRL-10859)生长于含Pen-Strep(Gibco)的HyCloneSFX无血清昆虫细胞培养基中(FisherScientific)。
重组蛋白表达。如其它位置的描述产生了用于表达cH4/3(A/鸭/捷克/56的H4球状头域组合佩斯09的H3茎域)、cH5/3(A/越南/1203/04的H5球状头域组合佩斯09的茎域)、cH7/3(A/野鸭/亚伯达/24/01的H7球状头域在佩斯09的H3茎域上部)和佩斯09HA的重组杆状病毒(Margine等人，2013，J.Virol.87:4728–4737；Krammer等人，2012，PLoSOne，7:e43603，doi:10.1371/journal.pone.0043603)并在Sf9细胞中繁殖。为了进行表达，用重组杆状病毒感染HighFive细胞，感染复数为大约10，转移至Fernbach烧瓶并在28℃下振动孵育。感染后96h通过低速离心(5,500相对离心力[RCF]，10min，4℃)收获培养上清液，并随后与Ni-次氮基三乙酸(NTA)树脂(Qiagen)在转动摇床中室温75rpm振荡孵育3h。然后使树脂-上清液混合物穿过10ml聚丙烯柱(Qiagen)。用洗涤缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl、20mM咪唑，pH8)洗涤4次，并用洗脱缓冲液(50mMNa2HCO3，300mMNaCl，300mM咪唑，pH8)洗脱。使用AmiconUltracell(Millipore；30-kDa分子量截留)离心单元浓缩洗脱物，并将缓冲液替换为磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH7.4)。纯化的蛋白的纯度、身份和完整性用SDS-PAGE和蛋白质印迹或ELISA进行评价，蛋白浓度用Bradford试剂(Bio-Rad)检测。用于ELISA的可溶性的A/佩斯/16/09H3、A/上海/1/13H7和A/PR/8/34H1HA以相似方式表达但作为与GCN4pII三聚基序和C端Strep-标签II的融合蛋白通过StrepTactin树脂(GEHealthcare)表达，以避免在评价由疫苗构建体诱导的茎域-反应性抗体的ELISA中使用时的背景信号(Krammer等人，2013，J.Virol.87:6542–6550)。
动物，免疫接种和攻击。用6-8周大雌性BALB/c小鼠(JacksonLaboratories)进行了所有的动物实验，并完全遵守MountSinaiInstitutionalAnimalCareandUseCommittee的IcahnSinaiSchoolofMedicine的指南。动物自由摄入食物和水并保持在12-h光暗循环中。对所有鼻内流程，对小鼠腹膜内施用0.1mL氯胺酮-甲苯噻嗪混合物(0.15mg/kg和0.03mg/kg)进行麻醉。
对于初始的实验，未感染的6-8周大BALB/c小鼠使用TriGrid递送系统通过体内电穿孔(IchorMedicalSystems)在左腓肠肌免疫接种编码cH4/3HA的DNA(Margine等人，2013，J.Virol.87:4728–4737；Krammer等人，2013，J.Virol.87:6542–6550；Steel等人，2010，mBio1(1):e00018–10.doi:10.1128/mBio.00018-10)。三周后，在肌肉内(i.m.)和鼻内(i.n.)用5μg蛋白配合5μgpoly(I·C)(Invivogen)佐剂在每个位置对动物进行加强(n＝9或10只动物每组)。仅初免的动物(n＝5每组)通过i.m.和i.n接受相同量的无关蛋白(牛血清白蛋白[BSA])，配合相同量的佐剂。3周后以同样方式但是用cH7/3蛋白施用第二加强。对于受到H7N1攻击的小鼠子集，cH7/3蛋白被替换为全长佩斯09H3蛋白。仅初免的动物再次接受对应的BSA免疫接种。攻击前3周，阳性-对照动物(n＝5每组)i.m.免疫接种1fl.g的灭活的匹配攻击病毒。未感染的小鼠(n＝5每组)被包括作为额外的阴性对照组。末次加强后4周，麻醉动物并感染5倍50％致死剂量(LD50)的Phil82、X-31或RheaH7病毒。每天监控体重，共14天，损失25％或更多初始体重的动物被评分为死亡并人工安乐死。初免前和攻击前通过下颌下流血收集血清样品。
对于第二组实验，未感染的6-8周大BALB/c小鼠鼻内感染亚致死剂量(106PFU)的表达cH7/3HA蛋白的重组乙型流感病毒载体(基于B/山行县/16/88)。对照动物接受相同剂量的野生型(wt)乙型流感病毒(Bwt)。然后用cH5/3蛋白(5μgi.n.+5μgi.m.，各自用5μg的poly(I·C)作为佐剂)对疫苗组中的小鼠进行加强，除了受cH5/3N1病毒攻击的动物以外；这些动物以相同的方式接受重组佩斯09全长H3HA替代cH5/3蛋白(n＝10每组)。仅初免的和载体对照的动物(n＝5每组)接受无关蛋白的加强作为替代(BSA；与疫苗组相同的数量、佐剂和给药途径)。最终，3周后使动物接受cH4/3蛋白的第二加强，如对第一加强的描述那样。再次的，仅初免的和载体对照的动物以相同的方式接受无关蛋白。未感染的小鼠(n＝5每组)被包括作为额外的阴性对照组。病毒攻击前3周，阳性-对照动物(n＝5每组)i.m.免疫接种1μg灭活的匹配攻击病毒。末次加强后4周，麻醉动物并用10LD50的Phil82或X-31或100LD50的cH5/3N1病毒攻击。每天监控体重，共14天，损失25％或更多初始体重的动物被评分为死亡并人工安乐死。初免前和攻击前通过下颌下流血收集血清样品。对于肺部滴定实验，按照如上所述免疫接种小鼠(cHA和Bwt-BSA-BSA组，n＝3小鼠每组)并随后感染5X104PFU的H3N2v或1X105PFU的H3N8、WyoH3或H10N7病毒。感染后3天收获肺部并匀浆，如在先描述的检测50％组织培养感染剂量(TCID50)(Miller等人，2013，J.Infect.Dis.207:98–105)。
对于被动转移实验，从(乙型流感承载的)疫苗组、阳性-对照组、载体对照组和未感染动物收集后一组实验的血清。然后通过腹膜内注射未感染小鼠(6-8周大，n＝5每组，300μl血清每小鼠)对每个组的血清进行转移，并在转移后2h用5LD50的Phil82病毒攻击小鼠。每天监控体重，共14天，损失30％或更多初始体重的动物被评分为死亡并安乐死。
ELISA。用在碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(pH9.4)中稀释的纯化的病毒(4μg/ml)或纯化的蛋白(2μg/ml)在4℃下过夜包被ELISA板(Immunolon4HBX)。室温下用含0.1％吐温20和3％脱脂奶粉的PBS(TPBS)封闭板1h。将小鼠血清预稀释1:100，以1:2的步骤在含1％脱脂奶粉的TPBS中系列稀释，并在室温下在板上孵育1h。在用TPBS(3X100μl/孔)进行大量洗涤后，在室温下将板与在含1％脱脂奶粉的TPBS中稀释的抗-小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的IgG(SantaCruz)一起孵育1h。再用TPBS洗涤3次后，使用邻苯二胺盐酸盐(SigmaFastOPD；Sigma)底物发展所述板。使用3MHCl终止反应，在490nm的光密度对板进行读数。
用相似的分析进行了洗鼻液中IgA的检测，除了使用1:500稀释的碱性磷酸酶(AP)-连接的抗-小鼠IgA抗体(SouthernBiotech)和孵育步骤在37℃下进行3h。使用同种型试剂盒(Invitrogen)用ELISA确定血清中的同种型分布，其包括收集每种亚型特异性的第二抗体和允许检测结合的AP-缀合的第三抗体。
假型颗粒中和分析。假型颗粒产生过程调整自在先的研究(Hai等人，2012，J.Virol.86:5774–5781；Evans等人，2007，Nature，446:801–805；Pica等人，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.109:2573–2578)。简而言之，用编码含有荧光素酶报告子基因、HIVGag-Pol、Vic11HA蛋白和乙型流感病毒B/山行县/16/88的神经氨酸苷酶的前病毒的四种质粒共转染293-T细胞。转染后48h收集培养上清液并通过0.45-μm孔径的过滤单元过滤去除细胞碎片。在加至MDCK细胞前用纯化的假型颗粒接种不同浓度的灭活小鼠血清。转导过程进行6h，然后洗涤细胞并用新鲜培养基覆盖细胞。转导过程在1μg/ml聚凝胺(Sigma，St.Louis，MO)的存在下进行。转导后48h读取荧光素酶活性。使用起始浓度123μg/ml的茎域-反应性单克隆抗体12D1(Wang等人，2010，PLoSPathog，6:e1000796.doi:10.1371/journal.ppat.1000796)作为阳性对照。
免疫荧光染色。对MDCK细胞转染表达来自A/安徽/1/13(H7N9)、A/上海/1/13(H7N9)、A/鸡/哈利斯科/12283/12(H7N3)、A/野鸭/Gurjev/263/82(H14N5)和A/曳尾鹱/西澳大利亚/2576/79(H15N9)的HA的质粒。对细胞转染对应的质粒。转染后16小时，用0.5％多聚甲醛固定细胞并用从免疫接种的动物(cH4/3DNA-cH5/3-H3)或未感染的动物收集的1:200稀释的血清进行染色。茎域-反应性抗体FI6(Corti等人，2011，Science，333:850–856)和FBE9(使用浓度均为10μg/ml)作为阳性对照，而从未感染的动物收集的血清被用作阴性对照。缀合至Alexa488的第二抗体被用于可视化蛋白的反应性。在LSM510Meta共聚焦显微镜上采集图像(CarlZeissMicroImagingGmbH，Jena，Germany)，放大倍数为X10。统计学检验、血凝素建模和系统发生分析。使用Prism4(GraphPad)进行了统计学分析。所有值被标绘为平均值与均值的标准差。存活率的差异用对数秩意义检验的KaplanMeier存活分析进行计算。P值为0.05或以下被认为是统计学显著的。为了产生野生型和嵌合血凝素模型，使用PyMol软件(DelanoScientific)对来自蛋白数据库(PDB)的结构进行了建模。对于cH4/3构建体的建模，使用了A/香港/1/68(HK68)(PBD标识符[ID]1MQN)的HA且H4头域用不同颜色进行了表示(尚无H4结构)。cH5/3HA用HK68HA(PBDID1MQN)的茎域和H5病毒(PBDID2FK0)的球状头域进行建模；cH7/3用HK68茎域和禽H7病毒(PDBID4DJ6)的头域进行建模。嵌合攻击病毒使用HK68(PBDID1MQN)的茎域结构和H5HA(PBDID4DJ6)的头域进行建模。使用ClustalW(EMBL-EBI)进行系统发生分析。从GenBank下载蛋白序列，使用Mega5.1版本的ClustalW算法进行多重比对。系统发生树使用FigTree软件和邻接法进行构建。
6.9.2结果
嵌合HA构建体提供针对不同的H3N2病毒攻击的广泛保护。为了在小鼠模型中诱导针对表达第2组HA的流感病毒的广泛保护，针对保守HA茎域的抗体被特别地加强。为此，构建了表达H3茎域组合多种头域的cHA分子的集合(Margine等人，2013，J.Virol.87:4728–4737；Hai等人，2012，J.Virol.86:5774–5781)。用编码cH4/3HA(表达H4球状头域和H3茎域)的质粒DNA肌肉内(i.m.)初免小鼠(图37A)。三周后，对小鼠通过i.m.和鼻内(i.n.)两种途径用可溶性cH5/3蛋白(H3茎域组合H5球状头域)进行加强。利用了两种系统以保证全身性和粘膜性免疫的诱导，因为两种应答对于针对流感病毒感染的保护而言都是重要的。3周后进行用cH7/3蛋白(H7球状头域位于H3茎域上部)的第二加强(图37A)。我们推测通过反复将动物暴露于表达常规的、无约束的(可溶的，非膜结合的)茎域的抗原，可以增强该区域的免疫原性，目前使用其的免疫接种策略仅诱导亚优势的应答(Wrammert等人，2008，Nature453:667–671；Margine等人，2013，J.Virol.87:4728–4737)。
对照动物或者仅接受DNA初免(仅初免的对照)，或匹配的灭活攻击病毒(阳性对照)或不感染。为了检测本疫苗保护免受流感相关发病和死亡的能力，对小鼠感染了两种不同的H3N2病毒。应注意所有cHA-免疫接种的动物针对对应的攻击毒株都是HI阴性的。在感染A/菲律宾/2/82病毒(Phil82)时，免疫接种的动物与阳性对照的无体重损失相比损失了最小量的体重，未发展临床症状，并被完全保护免于死亡(图37B和C)。然而，未感染动物快速损失体重并在第9天屈服于感染(未感染对照)。仅初免的对照还表现出快速的体重损失且仅有20％在病毒攻击中存活。对表达香港1968H3N2病毒的糖蛋白的病毒X-31的攻击观察到相似表现(图37D和E)。
之前的数据显示流感病毒亚致死感染是一种在小鼠和人类中诱导茎域-反应性抗体的方式(Margine等人，2013，J.Virol.87:4728–4737；Pica等人，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.109:2573–2578；Krammer等人，2012，J.Virol.86:10302–10307)。由于大多数人类个体在其一生中都会多次接触流感病毒，他们一般具有基线水平的茎域-反应性抗体。为了在小鼠模型中模拟此种预先存在的免疫力，拯救了表达cH7/3HA的乙型流感病毒而不是野生型乙型流感病毒HA。使用亚致死剂量的该病毒初免小鼠，然后以3周的间隔免疫接种cH5/3，然后接种cH4/3蛋白，均通过i.m.和i.n两者(图38A)。在用Phil82或X-31进行攻击时，动物表现出无疾病的临床迹象，以及与接受灭活匹配攻击毒株的阳性-对照动物可相比的体重损失(图38C、D、F和G)。感染亚致死的野生型乙型流感病毒并以相似方式免疫接种无关蛋白(BSA)的对照动物以及未感染小鼠和仅初免的对照快速损失体重并屈服于两种感染。接下来检测了茎域导向的免疫力保护免于更多最近的H3N2分离物的能力。由于当前的H3N2病毒在小鼠模型中是非致病性的，为此目的使用了表达最近的疫苗株A/佩斯/16/09(佩斯09)的H3茎域和A/PR/8/34(H1N1)的NA的cH5/3N1病毒(Hai等人，2012，J.Virol.86:5774–5781)。为了评价由茎域-反应性抗体赋予的所述保护(并排除H5-H5头域反应性抗体)，改变了针对这一子集的小鼠的免疫接种方案，施用了全长H3而不是cH5/3蛋白(图38A)。在用高剂量(100小鼠LD50[mLD50])的cH5/3N1病毒进行攻击时，观察到针对体重损失的强力保护，以及使免疫接种的动物免于死亡的完全保护。这表明基于HA茎域的疫苗效果达到了对抗当下的H3N2分离物(图38B和E)。为了测试不在小鼠模型中诱导死亡的另外的不同H3毒株，进行了肺部滴定实验。如上进行免疫接种的动物感染H3N2变体病毒(H3N2v)(CDC.July2012.MMWRMorb.Mortal.Wkly.Rep.61:561)——一种禽H3N8分离物(H3N8)——和人H3N2A/怀俄明/03/03毒株(WyoH3)。感染后第3天，免疫接种的动物的肺部滴度低(接近于检测限度)，而在从对照动物(Bwt-BSA-BSA)收集的肺中检测到高病毒滴度(图37F和G，数据未显示)。综上，这些数据清楚地显示了基于茎域的免疫接种策略能够在小鼠流感模型中针对异源和异亚型病毒提供强力保护。
免疫接种嵌合HA构建体诱导了广泛的全身性和粘膜性茎域导向的体液应答。进行了ELISA以表征由此免疫接种方案诱导的茎域导向的抗体应答。由于动物仅接触载体-表达的或重组的HA，而没有接触任何其它甲型流感蛋白，因此纯化的病毒能够被用作底物以检测抗-茎域应答。对来自两种免疫接种方案(乙型流感病毒载体或DNA初免)的血清检测了其对攻击毒株Phil82和X-31、以及当前的H3N2疫苗株A/维多利亚/361/11(Vic11)——一种H3N8毒株——和佩斯09的HA蛋白的反应性。虽然从未感染或仅接触DNA初免的动物收集的血清表现出低的背景水平的结合，在从免疫接种的小鼠收集的血清中存在针对所有5种病毒毒株的高反应性(图39A-E)。类似的，在用表达cHA的乙型流感病毒初免的动物血清中检测到高茎域导向的抗体滴度(图39F-H)。载体对照(野生型乙型流感病毒)和未感染动物再一次仅显示了背景反应性，而仅初免组(表达c7/3HA的乙型流感病毒)具有中间结合表型。最后一组的中间滴度被认为是复制病毒的结果(Margine等人，2013，J.Virol.87:4728–4737；Krammer等人，2012，J.Virol.86:10302–10307)。同种型分布显示由疫苗诱导的抗体应答谱是平衡的，IgG的主要部分为IgG1、IgG2a或IgG2b亚类(参见图41C)。
此外对于血清IgG滴度，评价了免疫接种的小鼠粘膜表面的分泌性IgA的水平。这在从接受疫苗的小鼠组中收集的洗鼻液中显示了对佩斯09H3HA的高反应性，而来自对照动物的洗鼻液不与底物反应(参见图41B)。虽然粘膜抗-茎域IgA抗体及其封闭病毒感染的能力尚未被正式鉴定，我们推测其对所观察到的保护有所贡献。
广泛反应性抗-球状头域抗体最近在文献中有所描述(Ekiert等人，2012，Nature489:526–532；Lee等人，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.109:17040-17045；Krause等人，2012，J.Virol.86:6334–6340)。虽然在自然界少见，但是这些抗体倾向于识别受体结合位点的保守区域并识别与系统发生亲缘关系不密切的多种球状头域。这些抗体与第1组和第2组HA头域两者的结合(例如，H1-H3结合)已有描述。为了评价基于cHA的免疫接种能否诱导这些抗体，进行了用全长H1HA作为底物的另外的ELISA(参见图41A)。cHA-免疫接种的动物血清不与此底物反应，表明cHA免疫接种不诱导可检测水平的广泛反应性抗-头域抗体。
诱导的广泛反应性抗体能够在体内和体外中和病毒。为了进一步检测由该免疫接种方案诱导的茎域抗体的体外交叉中和性质，进行了使用Vic11HA-假型颗粒的进入抑制分析。免疫接种的动物血清以剂量依赖的方式抑制假型颗粒的细胞进入(参见图41D)。相反，乙型流感病毒载体感染的对照动物和未感染小鼠的血清在本分析中未显示抑制活性。
进行了被动转移实验以显示在体内观察到的疫苗诱导的保护至少部分是由于血清中的中和抗体。来自免疫接种的、阳性-对照的、乙型流感病毒载体感染的或未感染的动物的血清被转移至未感染小鼠，后者随后被Phil82病毒攻击。接受来自免疫接种的或阳性-对照组的血清的小鼠被完全保护免于死亡，而接受来自任何一种阴性对照组的动物均没有存活(参见图41E)。这些结果显示茎域导向的体液应答足以保护小鼠免受致死剂量的攻击。
免疫接种嵌合HA构建体诱导基于茎域的异亚型免疫力。交叉中和多种第2组HA流感病毒的抗体在文献中已有描述(Wang等人，2010，PLoSPathog.6:e1000796.doi:10.1371/journal.ppat.1000796；Ekiert等人，2011，Science333:843–850)。为了检测针对异亚型H7N1病毒的保护并排除头域导向的抗体在观察到的保护中的任何牵涉，使用了上述DNA-蛋白-蛋白免疫接种方案，虽然将cH7/3HA蛋白替换为全长H3HA(图40A)。用禽H7N1A/美洲鸵/北卡罗来纳/39482/93毒株(RheaH7)攻击的免疫接种的和阳性-对照的动物均经历了相似的初始体重损失，大约为15％(图40B)。这可能是由于此实验性病毒攻击所需要的高数量的PFU/小鼠致死剂量所致。然而，来自两个组的小鼠迅速恢复体重且疫苗组显示了90％的存活率。然而，未感染的和仅初免的动物经历了严重的体重损失并分别表现出无存活或低(20％)存活。后一实验的结果显示了HA茎域导向的应答提供的免疫力的真正的异亚型性质(图40C)。为了进一步评价血清中存在的广泛中和抗体的水平，用纯化的H7N1攻击病毒以及来自新型中国H7N9病毒毒株的重组H7蛋白进行了ELISA(Gao等人，2013，N.Engl.J.Med.368:1888-1897)。对这些动物收集的血清中针对H7HA的高抗体滴度的检测强调了由H3茎域诱导应答的交叉反应性质(图40D和E，图41)。此外，用H10N7病毒进行了攻击实验，采用肺部滴度作为分析读数。免疫接种第3天的动物肺部滴度范围为103TCID50/ml，而模拟免疫接种的动物显示了10-100倍的更高滴度(图40F)。cHA-免疫接种的动物血清与表达欧亚和北美谱系H7HA、以及H14和H15HA的细胞的有效结合进一步证明了本免疫应答的交叉反应性质(图40G和42)。
6.9.3讨论
虽然抗-茎域抗体可在通过免疫接种或感染接触过流感病毒的人类中发现(Margine等人，2013，J.Virol.87:4728–4737；Sui等人，2011，Clin.Infect.Dis.52:1003–1009；Corti等人，2010，J.Clin.Invest.120:1663–1673)，他们的确看上去在自然界很少有，且这些抗体的体内水平似乎过于低下以至于不能提供保护。结果，能够加强这些广泛中和茎域反应性抗体的水平的疫苗可能导致针对流行性人流感病毒株以及潜在流行性的禽病毒如正在发生的中国H7N9毒株的通用保护(Gao等人，2013，N.Engl.J.Med.368:1888-1897)。基于HA茎域的保守性，可能该通用疫苗需要包括三种组分：第1组、第2组和基于乙型流感茎域的抗原。
顺序免疫接种表达H3茎域和多种球状头域的嵌合HA构建体的动物针对茎域发展了高滴度的交叉反应性抗体。这些抗体不仅能保护免于一系列H3N2毒株和H3N8病毒，还能针对禽H7N1和H10N7分离物的异亚型攻击提供强力保护，显示了跨越两种第2组表达HA的病毒的进化枝的宽度。鉴于与H3N2变体(H3N2v)病毒和从新英格兰麻斑海豹分离的H3N8病毒和其它动物传染性H3毒株(Baz等人，2013，J.Virol.87:6901–6910；CDC.July2012，MMWRMorb.Mortal.Wkly.Rep.61:561；Anthony等人，2012，mBio3(4):e00166–12.doi：10.1128/mBio.00166-12)、以及偶尔感染人类的表达H4、H7和H10的病毒(Runstadler等人，2013，Infect.Genet.Evol.17:162–187；Kayali等人，2011，PLoSOne6:e26818.doi:10.1371/journal.pone.0026818；Arzey等人，2012，Emerg.Infect.Dis.18:814–816；CDC.2012，MMWRMorb.Mortal.Wkly.Rep.61:726–727；Fouchier等人，2004.Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.101:1356–1361；Tweed等人，2004.Emerg.Infect.Dis.10:2196–2199)的流行潜力有关的生长，这一宽度是非常重要的。重要的是，该免疫接种策略还诱导针对来自正在出现的中国H7N9病毒的H7HA的高滴度的茎域-反应性抗体(Gao等人，2013，N.Engl.J.Med.368:1888-1897)。。
人类在其一生中都会多次接触流感病毒从而一般具有预先存在的茎域特异性记忆B细胞。为了在小鼠模型中模拟此种情形并有效增强预先存在的茎域-反应性抗体滴度，小鼠被通过亚致死感染表达H3茎域组合无关球状头域的重组乙型流感病毒来预先接触H3茎域。通过顺序免疫接种含相同茎域但不同头域的cHA构建体，茎域-反应性抗体的水平被有效加强，并保护小鼠免于一系列跨越1968-2009的H3N2流感病毒株的攻击。免疫接种的小鼠血清对大范围的H3N2病毒基质以及H7N1病毒和H7N9HA蛋白基质显示了良好的反应性。被H3N2v、H3N8和H10N7感染后，免疫接种的动物也显示了减少的肺部滴度。此外，血清表现出中和活性并能够在被动转移攻击实验中保护小鼠。这些发现阐述了该免疫接种策略引发的中和机理并表明了一种可能是基于病毒中和的抗体介导的机理是介导保护。CD8+和CD4+T细胞对保护的作用在这一点上不能被排除，虽然单独的血清转移足以保护免于攻击。已有猜测认为非中和交叉反应性抗-流感抗体诱导的增强的致病性是新型中国H7N9病毒在老年人中具有高致病性的一个可能的原因(Skowronski等人，2013，EuroSurveill.18:pii＝20465.http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx？ArticleId＝20465)。在具有高滴度的交叉中和抗体的cHA-免疫接种的动物中未观察到增强的致病性。事实上，这些动物被保护免于发病和死亡，病毒被更快速地清理。
设计本实验以显示针对表达第2组HA的病毒的保护可由茎域-反应性抗体单独介导。如本文描述的，人疫苗策略可以基于表达cHA结构组合功能性神经氨酸苷酶和流感病毒的所有内在蛋白的灭活或减毒病毒。将人类具有记忆应答的H3HA球状头域替换为人类所没有感染的“外来的”无关头域将会除了加强茎域-反应性抗体(Krammer等人，2013，J.Virol.87:6542–6550；Miller等人，2013，J.Infect.Dis.207:98–105；Pica等人，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.109:2573–2578；Li等人，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A。109:9047–9052；Wrammert等人，2011，J.Exp.Med.208:181–193；Thomson等人，2012，Front.Immunol.3:87)之外，还能够增强针对NA的抗体水平。此外，具有强T细胞表位的内在蛋白的存在还将会确保免疫应答的细胞臂(arm)被激活且可能有助于保护。这一疫苗将包括第1组、第2组和B茎域组分以确保针对所有流行性人流感病毒株以及潜在流行性亚型的广泛保护。由于大多数人，除了非常小的儿童之外，具有对流感病毒的预先存在的免疫力，包括低水平的HA茎域抗体，因此有可能免疫接种三价嵌合HA疫苗能够有效加强这些滴度至保护性水平。
6.10实施例10：基于H3茎域的嵌合血凝素流感病毒对受到H7N9攻 击的小鼠构成保护
本实施例显示使用不具有H7头域的嵌合HA构建体能够保护对象免于新型H7N9病毒。本实施例还显示基于与那些批准用于人类的佐剂相似的水包油佐剂对嵌合HA疫苗候选物使用良好。
为了研究粘膜应答对于保护的重要性，使用了诱导粘膜和全身免疫两者的实验性设置并与仅诱导全身免疫的进行比较。另外，对两种佐剂，polyI:C(PIC)——其之前已被成功用于在动物的组合cHA——和一般性的水包油(OIW)佐剂进行了比较(Ott等人，2000，TheAdjuvantMF59:A10-YearPerspective,p.211-228.O'HaganDT编辑，VaccineAdjuvants，第42卷，Springer)。后者与已被批准用于人类的佐剂相似(Ott等人，2000，TheAdjuvantMF59:A10-YearPerspective,p.211-228.O'HaganDT编辑，VaccineAdjuvants，第42卷，Springer)。
对动物(方块，N＝10每组，6-8周大雌性BALB/c小鼠)用表达cH4/3蛋白(A/鸭/捷克/56的H4头域位于A/佩斯/16/09的H3茎域上部)的DNA质粒通过使用TriGrid电穿孔设备(IchorMedicalSystems)进行肌肉内电穿孔进行初免(Margine等人，2013，JVirol87:10435-10446)(图43A)。应注意DNA免疫接种对于cHA免疫接种方案诱导广泛保护而言不是必须的。在早期研究中仅免疫接种蛋白(无DNA)得到了与免疫接种DNA初免可比较的结果(Goff等人，2013，PLoSOne8:e79194)。初免后三周，使动物接受重组cH5/3蛋白(A/越南/1203/04的H5头域位于A/佩斯/16/09的H3茎域上部)(Margine等人，2013，JVirol87:10435-10446)。一个组中的动物接受鼻内(i.n.)5μg的cH5/3蛋白和肌肉内(i.m.)5μg，用5μg的PIC(高分子量，Invivogen)作为佐剂(‘PICi.n.+i.m.’)。第二组仅接受i.m.给药PIC(共5μgHA)(‘PICi.m.’)，而第三组接受5ug的cH5/3蛋白与一般性的基于OIW的佐剂(‘OIWi.m.’)(图43A)。第二个三周后对所有小鼠用全长H3蛋白进行加强，其中分别使用相同的免疫接种途径、佐剂和免疫原数量(图43A)。所有用于免疫接种的重组蛋白在杆状病毒表达系统中表达，并具有C端T4foldon三聚域和六组氨酸标签以利于纯化(Krammer等人，2012，PLoSOne7:e43603)。如在先的描述制备了OIW佐剂(20mM柠檬酸，0.5％聚山梨醇酯80，pH6.5，0.5％span-85(脱水山梨糖醇三油酸酯)，4.3％角鲨烯)(Ott等人，2000，TheAdjuvantMF59:A10-YearPerspective,p.211-228.O'HaganDT编辑，VaccineAdjuvants，第42卷，Springer)(图44)。阳性对照(圆圈，n＝5)接受一次i.m.免疫接种福尔马林灭活的A/上海/1/13H7N9(SH1，用A/上海/1/13的HA和NA和A/波多黎各/8/34的内在基因6:2重排)全病毒制备物。阴性对照(三角，n＝4-5)接受模拟DNA免疫接种，随后用牛血清白蛋白(BSA)加强两次，后者以与其要比较的对应cHA免疫接种方案相同的数量和途径施用。最后一次免疫后4周，使动物流血并随后用10倍鼠致死剂量50(mLD50)的SH1病毒攻击。在14天的周期内监控体重，损失超过20％初始体重的小鼠进行安乐死。与PICi.m.组中的15％(图43C)相比，PICi.n.+i.m.组中的动物损失平均10％的初始体重(图43B)，表明感染部位的粘膜免疫力在保护中具有重要作用。此外，OIWi.m.组中的小鼠仅平均损失12％的初始体重(图43D)，其还反映在观察到的存活率中。所有PICi.m.+i.n.免疫接种的动物在攻击中存活(图43E)，比较而言仅70％的PICi.m.动物存活(图43F)。然而，OIWi.m.组中的存活率是100％(图43F)，表明使用OIW佐剂具有更好的保护效果。为了定量评价由三种不同免疫接种方案引发的H7HA抗体的滴度，使用重组SH1H7HA作为底物进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)。由于cHA-免疫接种的动物没有接触H7头域，我们推测任何观察到的针对H7的反应性都将主要来自于交叉反应性抗-茎域抗体。为了排除与六组氨酸标签或三聚域的结合，利用了使用GCNpII亮氨酸拉链三聚域和strep标签II表达的重组SH1H7HA(Krammer等人，2013，JVirol87:6542-6550；Weldon等人，2010，PLoSOne5.)。在从PICi.n.+i.m.免疫接种的动物收集的血清中检测到最高的终点滴度，然后是OIWi.m.动物(图45A)。接受PICi.m.疫苗的小鼠具有比OIWi.m.动物统计学上显著较低的滴度(p＝0.03)。这一终点滴度的区别与体重损失和存活率相关。抗体同种型分布可被佐剂强烈影响并可对抗体的保护效率具有高的影响。然而，在比较三种免疫接种方案时没有同种型谱方面的显著差异(图45B)。这表明——在仅i.m.免疫接种情况下——抗体滴度是保护的主要相关物。还在微-中和分析中检测了来自疫苗和对照组的血清，但是对于cHA免疫接种的组的结果是阴性的，可能是由于该分析中检测(1:20)的限制(数据未显示)。我们推测由i.n.免疫接种诱导的粘膜IgA抗体对保护具有实质贡献，因为通过两种途径免疫的动物显示了比仅肌肉内免疫接种的动物更低的发病率。PICi.n.+i.m.和PICi.m.两组之间体重损失的差异在第7天(p＝0.0383)和第8天(0.0136)是统计学上显著的(不成对t检验)。然而，应当注意这些动物也接受了两倍于仅i.m.动物的抗原。
总而言之，本实施例显示了用不具备H7头域的cHA构建体使用基于茎域的免疫方案可以保护小鼠免于新型H7N9病毒。进一步的，与被批准用于人类的佐剂相似的基于水包油的佐剂(Ott等人，2000，TheAdjuvantMF59:A10-YearPerspective,p.211-228.O'HaganDT编辑，VaccineAdjuvants，第42卷，Springer；O'Hagan等人，2013，ExpertRevVaccines12:13-30)对cHA疫苗候选物表现良好，表明该组合还可考虑用于人类的检测。提供通用流感病毒保护的基于HA茎域的疫苗可以替代毒株特异性季节性疫苗并进一步增强对潜在的流行性流感病毒株如H7N9的准备。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入，如同每个单独的出版物或专利申请具体和单独地通过引用并入本文。虽然对上述发明出于清楚理解的目的以说明和举例的方式进行了详细描述，但是对于本领域普通技术人员而言在本发明的教导下对本发明进行某些变化和修饰将是显而易见的，而不会脱离所附权利要求的精神或范围。

Claims (65)

1.一种嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，包含来自流感病毒A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)的HA的干域和来自H5亚型流感病毒的HA的球状头域。
2.权利要求1的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中所述H5亚型是流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)。
3.一种嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，包含来自流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域和来自H5亚型流感病毒的HA的球状头域。
4.权利要求3的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中所述H5亚型是A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的流感病毒HA。
5.一种嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，包含来自流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域和来自H7亚型流感病毒的HA的球状头域。
6.权利要求5的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中所述H7亚型是流感病毒A/荷兰/219/03(H7)、A/加拿大/504/04(H7)、A/加拿大/444/04(H7)、A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)、A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)、A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)。
7.一种嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，包含来自流感病毒B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/威斯康星/1/2010或B/布里斯班/60/2008的HA的干域和来自H5亚型流感病毒的HA的球状头域。
8.权利要求7的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中所述H5亚型是流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)。
9.一种嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，包含来自流感病毒B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/威斯康星/1/2010或B/布里斯班/60/2008的HA的干域和来自H7亚型流感病毒的HA的球状头域。
10.权利要求9的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中所述H7亚型是流感病毒A/荷兰/219/03(H7)、A/加拿大/504/04(H7)、A/加拿大/444/04(H7)、A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)、A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)、A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)。
11.一种嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，包含来自流感病毒B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/威斯康星/1/2010或B/布里斯班/60/2008的HA的干域和来自不同乙型流感病毒毒株的HA的球状头域。
12.权利要求11的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中所述不同乙型流感病毒毒株是B/Lee/1940或B/海豹/荷兰/1/99。
13.编码权利要求1-12任一项的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的核酸。
14.表达权利要求13的核酸的细胞。
15.包含工程化改造以表达权利要求13的核酸的基因组的病毒。
16.包含权利要求1-12任一项的多肽的病毒。
17.权利要求15的病毒，其中该病毒是流感病毒、VSV、NDV、腺病毒或杆状病毒。
18.权利要求16的病毒，其中该病毒是流感病毒、VSV、NDV、腺病毒或杆状病毒。
19.权利要求17的病毒，其是灭活或裂解的。
20.权利要求18的病毒，其是灭活或裂解的。
21.包含权利要求1-12任一项的多肽的病毒样颗粒。
22.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-12任一项的多肽。
23.一种免疫原性组合物，其包含权利要求15的病毒。
24.一种免疫原性组合物，其包含权利要求16的病毒。
25.一种免疫原性组合物，其包含权利要求17的病毒。
26.一种免疫原性组合物，其包含权利要求18的病毒。
27.一种免疫原性组合物，其包含权利要求21的病毒样颗粒。
28.一种免疫原性组合物，包含：
(i)第一嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中该多肽包含流感病毒A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)的HA的干域和流感病毒/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域；和
(ii)第二嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中该多肽包含(a)流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域；和(b)流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域。
29.一种免疫原性组合物，包含：
(i)第一嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中该多肽包含流感病毒A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)的HA的干域和流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域；和
(ii)第二嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中该多肽包含(a)流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域；和(b)流感病毒B/马来西亚/2506/2004的HA的球状头域和流感病毒A/荷兰/219/03(H7)、A/加拿大/504/04(H7)、A/加拿大/444/04(H7)、A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)、A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)、A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)的HA的球状头域。
30.权利要求28或29的免疫原性组合物，进一步包含第三嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中该多肽包含(a)流感病毒B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/威斯康星/1/2010；或B/布里斯班/60/2008的HA的干域；和(b)流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)、A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)、B/Lee/1940或B/海豹/荷兰/1/99的HA的球状头域。
31.一种免疫原性组合物，包含：
(i)第一病毒，包含工程化改造以表达编码嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第一核酸的基因组，其中该多肽包含流感病毒A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)的HA的干域和流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域；和
(ii)第二病毒，包含工程化改造以表达编码嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第二核酸的基因组，其中该多肽包含(a)流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域；和(b)流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域。
32.一种免疫原性组合物，包含：
(i)第一病毒，包含工程化改造以表达编码嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第一核酸的基因组，其中该多肽包含流感病毒A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)的HA的干域和流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域；和
(ii)第二病毒，包含工程化改造以表达编码嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第二核酸的基因组，其中该多肽包含(a)流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域；和(b)流感病毒B/马来西亚/2506/2004的HA的球状头域和A/荷兰/219/03(H7)、A/加拿大/504/04(H7)、A/加拿大/444/04(H7)、A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)、A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)、A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)的HA的球状头域。
33.权利要求31或32的免疫原性组合物，进一步包含第三病毒，其包含工程化改造以表达编码嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第三核酸的基因组，其中该多肽包含(a)流感病毒B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/威斯康星/1/2010；或B/布里斯班/60/2008的HA的干域；和(b)流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)、A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)、B/Lee/1940或B/海豹/荷兰/1/99的HA的球状头域。
34.一种免疫原性组合物，包含：
(i)包含第一嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第一病毒，其中该多肽包含流感病毒A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)的HA的干域和流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域；和
(ii)包含第二嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第二病毒，其中该多肽包含(a)流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域；和(b)流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域。
35.一种免疫原性组合物，包含：
(i)包含第一嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第一病毒，其中该多肽包含流感病毒A/加利福尼亚/4/2009(H1N1)的HA的干域和流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)或A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)的HA的球状头域；和
(ii)包含第二嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的第二病毒，其中该多肽包含(a)流感病毒A/维多利亚/361/2011(H3N2)、A/麻斑海豹/马萨诸塞/1/2011(H3N8)或A/印第安纳/10/2011(H3N2)的HA的干域；和(b)流感病毒A/荷兰/219/03(H7)、A/加拿大/504/04(H7)、A/加拿大/444/04(H7)、A/鸡/哈利斯科/CPA1/2012(H7)、A/野鸭/亚伯达/24/2001(H7)、A/美洲鸵/NC/39482/93(H7)或A/野鸭/荷兰/12/2000(H7)的HA的球状头域。
36.权利要求34或35的免疫原性组合物，进一步包含第三病毒，其包含第三嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中该多肽包含(a)流感病毒B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、B/威斯康星/1/2010；或B/布里斯班/60/2008的HA的干域；和(b)流感病毒A/越南/1203/2004(H5)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/斑头雁/青海/1A/2005(H5)、A/火鸡/土耳其/1/2005(H5)、A/大天鹅/蒙古/244/2005(H5)、B/Lee/1940或B/海豹/荷兰/1/99的HA的球状头域。
37.权利要求31-36任一项的免疫原性组合物，其中在免疫原性组合物中的每种病毒是流感病毒、VSV、NDV或腺病毒。
38.权利要求31-36任一项的免疫原性组合物，其中在免疫原性组合物中的每种病毒是灭活或裂解的。
39.权利要求37的免疫原性组合物，其中每种流感病毒是灭活或裂解的。
40.针对流感病毒免疫对象的方法，包括对对象施用有效量的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物。
41.针对流感病毒免疫对象的方法，包括对对象施用第一剂量的有效量的免疫原性组合物，并在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物是权利要求22-39任一项的组合物。
42.权利要求41的方法，进一步包括在对象接受第二剂量之后30天至6个月对对象施用第三剂量的有效量的免疫原性组合物。
43.针对流感病毒免疫对象的方法，包括对对象施用第一剂量的有效量的第一免疫原性组合物，并在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的第二免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物是权利要求22-39任一项的组合物，且其中第一免疫原性组合物中存在的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的球状头域不同于第二免疫原性组合物中存在的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的球状头域。
44.一种预防流感病毒疾病的方法，包括对对象施用有效量的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物。
45.一种治疗流感病毒感染或流感病毒疾病的方法，包括对对象施用有效量的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物。
46.权利要求40-45任一项的方法，其中所述对象是人类。
47.权利要求41或43的方法，其中所述对象是1-5岁大的人类对象。
48.权利要求41或43的方法，其中所述对象是老人对象。
49.权利要求40-48任一项的方法，其中所述免疫原性组合物肌肉内或鼻内给予对象。
50.权利要求1-12任一项的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中所述多肽是可溶的。
51.权利要求50的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽，其中该多肽包含三聚域。
52.用于针对流感病毒免疫对象的方法的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物。
53.用于针对流感病毒免疫对象的方法的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物，其中所述方法包括对对象施用第一剂量的有效量的免疫原性组合物和在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的免疫原性组合物。
54.权利要求53的免疫原性组合物，其中所述方法进一步包括在对象接受第二剂量之后30天至6个月对对象施用第三剂量的有效量的免疫原性组合物。
55.用于针对流感病毒免疫对象的方法的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物，其中所述方法包括对对象施用第一剂量的有效量的第一免疫原性组合物，并在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的第二免疫原性组合物，且其中第一免疫原性组合物中存在的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的球状头域不同于第二免疫原性组合物中存在的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的球状头域。
56.用于预防对象的流感病毒疾病的方法的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物。
57.用于治疗对象的流感病毒感染或流感病毒疾病的方法的权利要求22-39任一项的免疫原性组合物。
58.权利要求52-57任一项的免疫原性组合物，其中所述对象是人类。
59.权利要求22-39任一项的免疫原性组合物在制备针对流感病毒免疫对象的方法中使用的药物中的用途。
60.权利要求22-39任一项的免疫原性组合物在制备针对流感病毒免疫对象的方法中使用的药物中的用途，其中所述方法包括对对象施用第一剂量的有效量的免疫原性组合物并在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的免疫原性组合物。
61.权利要求60的用途，其中所述方法进一步包括在对象接受第二剂量之后30天至6个月对对象施用第三剂量的有效量的免疫原性组合物。
62.权利要求22-39任一项的免疫原性组合物在制备针对流感病毒免疫对象的方法中使用的药物中的用途，其中所述方法包括对对象施用第一剂量的有效量的第一免疫原性组合物，并在对象接受第一剂量之后30天至6个月对对象施用第二剂量的有效量的第二免疫原性组合物，且其中第一免疫原性组合物中存在的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的球状头域不同于第二免疫原性组合物中存在的嵌合流感病毒血凝素(HA)多肽的球状头域。
63.权利要求22-39任一项的免疫原性组合物在制备预防对象的流感病毒疾病的方法中使用的药物中的用途。
64.权利要求22-39任一项的免疫原性组合物在制备治疗对象的流感病毒感染或流感病毒疾病中使用的药物的方法中的用途。
65.权利要求59-64任一项的免疫原性组合物的用途，其中所述对象是人类。
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