PL200977B1 - Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne - Google Patents

Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne

Info

Publication number
PL200977B1
PL200977B1 PL346212A PL34621299A PL200977B1 PL 200977 B1 PL200977 B1 PL 200977B1 PL 346212 A PL346212 A PL 346212A PL 34621299 A PL34621299 A PL 34621299A PL 200977 B1 PL200977 B1 PL 200977B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
ifn
attenuated
viruses
interferon
Prior art date
Application number
PL346212A
Other languages
English (en)
Other versions
PL346212A1 (en
Inventor
Peter Palese
Adolfo Garcia-Sastre
Thomas Muster
Original Assignee
Sinai School Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL200977(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sinai School Medicine filed Critical Sinai School Medicine
Publication of PL346212A1 publication Critical patent/PL346212A1/xx
Publication of PL200977B1 publication Critical patent/PL200977B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

1. Atenuowany wirus grypy obejmuj acy zmodyfikowany gen NS1, znamienny tym, ze wirusa grypy stanowi NS1/99. 2. Genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, znamienny tym, ze wirus atenuowany jest przez mutacj e w genie NS1 skutkuj ac a delecj a wszystkich reszt aminokwasowych za wyj atkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60, przy czym N ko ncowy aminokwas oznacza numer 1, i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w uk ladzie gospodarza z niedoborem interferonu do miana, które jest przynajmniej o jeden rz ad loga- rytmu wy zsze ni z miano atenuowanego wirusa wzrastaj acego w uk ladzie gospodarza kompetentnego pod wzgl edem interferonu w przypadku propagacji w takich samych warunkach. 3. Atenuowany wirus grypy wed lug zastrz. 2, znamienny tym, ze stanowi wirusa grypy A. PL PL PL PL PL

Description

Zgodnie z wynalazkiem opisano ogólnie atenuowane wirusy o ujemnej nici RNA o zaburzonej zdolności do antagonizacji odpowiedzi komórkowej na interferon (IFN) oraz zastosowania takich atenuowanych wirusów w szczepionkach oraz preparatach farmaceutycznych.
2. Tło wynalazku
2.1 Wirus grypy
Rodziny wirusów zawierające genom o ujemnej nici z jednoniciowym RNA w osłonce klasyfikuje się w grupach, mających genomy niesegmentowane (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae i choroby Borna) lub mające genomy segmentowane (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae i Arenaviridae). Rodzina Orthomyxoviridae, opisywana szczegółowo poniżej, i używana w niniejszych przykładach, obejmuje wirusy grypy, wirusy typu A, B i C, jak również wirusy Thogoto i Dhori oraz wirusa zakaźnej anemii łososi.
Wiriony grypy składają się z wewnętrznego rdzenia rybonukleoproteinowego (nukleokapsyd w postaci helisy), zawierającego genom o pojedynczej nici RNA, oraz zewnętrznej osłonki lipoproteinowej powleczonej wewnątrz białkiem matriksowym (M1). Segmentowany genom wirusa grypy A składa się z ośmiu cząsteczek (siedem dla grypy C), liniowych, o ujemnej polarności, o pojedynczych niciach RNA, które kodują dziesięć polipeptydów, włączając: białka polimerazy RNA zależne od RNA (PB2, PB1 i PA) oraz nukleoproteinę (NP), która tworzy nukleokapsyd; białka błony matriksowej (M1, M2); dwie glikoproteiny powierzchniowe, które wystają z osłonki zawierającej lipid: hemaglutyninę (HA) i jądrowe białko eksportowe (NEP). Transkrypcja i replikacja genomu ma miejsce w jądrze, a montowanie zachodzi poprzez składanie na błonie plazmatycznej. Wirusy mogą ulegać reasortacji w czasie mieszanych infekcji.
Wirus grypy adsorbuje się poprzez HA do sialilooligosacharydów w glikoproteinach i glikolipidach błony komórkowej. Po endocytozie wirionu, zachodzą zmiany konformacyjne w cząsteczce HA wewnątrz endosomu komórkowego, które ułatwiają fuzję błonową, stymulując w ten sposób pozbawienie osłonki. Nukleokapsyd migruje do jądra, gdzie mRNA wirusa ulega transkrypcji. Wirusowy mRNA ulega transkrypcji przez unikalny mechanizm, w którym endonukleazy wirusowe odcinają czapeczkowany koniec 5' z heterologicznych mRNA komórki, które następnie służą jako startery do transkrypcji matryc RNA wirusa przez transkryptazę wirusową. Terminacja transkryptu zachodzi w miejscach 15 do 22 zasad od końców ich matryc, gdzie sekwencje oligo(U) działają jako sygnały do dodawania śladów poli(A). Z ośmiu tak wytworzonych wirusowych cząsteczek RNA, sześć jest informacjami monocistronowymi, które ulegają translacji bezpośrednio do białek, reprezentujących HA, NA, NP i białka polimerazy wirusowej, PB2, PB1 i PA. Inne dwa transkrypty przechodzą splicing, po czym każdy daje dwa mRNA, które ulegają translacji w różnych ramkach odczytu, wytwarzając M1, M2, NS1 i NEP. Innymi słowy, osiem segmentów wirusowego RNA koduje dziesięć białek: dziewięć strukturalnych i jedno niestrukturalne. Omówienie genów wirusa grypy i ich produktów białkowych, pokazano w tabeli 1 poniżej.
T a b e l a 1: Segment RNA genomu wirusa grzęz i produkty kodowania
Segment Długość3 (nukleotydy) Kodowany polipeptyd0 Długośćd (aminokwasy) Cząsteczki na wirion Komentarz
1 2 3 4 5 6
1 2341 PB2 759 30-60 Składnik transkryptazy RNA; Wiązanie czapeczkowanego RNA komórki gospodarza
2 2341 PB1 757 30-60 Składnik transkryptazy RNA; inicjacja transkrypcji
3 2233 PA 716 30-60 Składnik transkryptazy RNA
PL 200 977 B1 cd. tabeli 1
1 2 3 4 5 6
4 1778 HA 566 500 hemaglutynina; trimer; glikoproteina osłonki; pośredniczy w przyłączaniu do komórek
5 1565 NP 498 1000 Nukleoproteina; związana z RNA; strukturalny składnik transkryptazy RNA
6 1413 NA 454 100 Neuraminidaza; tetramer; glikoproteina osłonki
7 1027 M1 252 300 Białko matrycowe, powleka wnętrze otoczki
M2 96 ? Strukturalne białko w błonie plazmatycznej; złożony mRNA
8 890 NS1 230 Białko niestrukturalne; funkcja nieznana
NEP 121 ? Jądrowe białko eksportowe; złożony mRNA
aDostosowane z R.A. Lamb i P.W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry, tom 52, 467-506 bDla szczepu A/PR/8/34
COkreślone w próbach biochemicznych i genetycznych dOkreślone w analizie sekwencji nukleotydowej i sekwencjonowaniu białka
Genom wirusa grypy A zawiera osiem segmentów RNA o pojedynczej nici o ujemnej polarności, kodujących jedno białko niestrukturalne i dziewięć strukturalnych. Białko niestrukturalne NS1 jest powszechne w komórkach zakażonych wirusem grypy, lecz nie zostało wykryte w wirionach. NS1 jest fosfoproteiną znajdującą się w jądrze wcześnie podczas zakażenia, a także w cytoplazmie w czasie późniejszym cyklu wirusowego (King i inni 1975, Virology 64: 378). Badania z mutantami grypy wrażliwymi na temperaturę (ts) z uszkodzeniami w genie NS, sugerowały, że białko NS1 jest regulatorem transkrypcyjnym i post-transkrypcyjnym mechanizmów, dzięki którym wirus jest zdolny do hamowania ekspresji genów komórki gospodarza i stymulacji syntezy białek wirusowych. Tak jak wiele innych białek, które regulują procesy post-translacyjne, białko NS1 oddziaływuje ze specyficznymi sekwencjami i strukturami RNA. Donoszono, że białko NS1 wiąże się z różnymi rodzajami RNA, łącznie z vRNA, poli-A, U6snRNA, regionem 5' nie podlegającym translacji, jak mRNA wirusa oraz dsRNA (Qiu i inni, 1995, RNA 1: 304; Qiu i inni 1994, J.Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J.Gen.Virol. 73: 3325-9. Ekspresję białka NS1 z cDNA w transfekowanych komórkach powiązano z kilkoma skutkami: hamowaniem transportu jądrowo-cytoplazmatycznego mRNA, hamowaniem splicingu pre-mRNA, hamowaniem poliadenylacji mRNA gospodarza i stymulacją translacji wirusowego mRNA (Fortes i inni, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami i inni, 1994, J.Virol. 68: 1432; de la Luna i inni 1995, J.Virol. 69:2427; Lu i inni, Genes Dev. 8: 1817; Park i inni, 1995, J.Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff i inni, 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen i inni, 1994, EMBO J. 18: 2273-83).
2.2 Wirusy atenuowane
Inaktywowane szczepionki wirusowe otrzymuje się przez „zabicie patogenu wirusowego np. przez traktowanie wysoką temperaturą lub formaliną tak, że nie jest on zdolny do replikacji. Inaktywowane szczepionki mają ograniczone wykorzystanie, ponieważ nie zapewniają długotrwałej odporności, a zatem zapewniają ograniczone zabezpieczenie. Alternatywnym podejściem wytwarzania szczepionek wirusowych jest stosowanie atenuowanych żywych szczepionek wirusowych. Atenuowane wirusy są zdolne do replikacji, lecz nie są patogenne, a zatem zapewniają dłużej trwającą odporność i większe zabezpieczenie. Jednakże, konwencjonalne metody wytwarzania atenuowanych wirusów obejmują przypadkową izolację szeregu mutantów gospodarza, z których wiele jest wrażliwych na temperaturę; np. wirusa pasażuje się przez nienaturalnego gospodarza i selekcjonuje wirusy potomne, które są immunogenne, a jeszcze niepatogenne.
Konwencjonalnym substratem do izolacji i hodowli wirusów grypy do celów wytwarzania szczepionek, są jaja kurze z zarodkami. Wirusy grypy zwykle rosną w ciągu 2-4 dni w temperaturze 37°C w jajach 10-11 dniowych. Mimo, że większość pierwotnych izolatów ludzkich wirusów grypy A i B ro4
PL 200 977 B1 śnie lepiej w worku owodniowym zarodków, po 2 do 4 pasażach wirusy dostosowują się do wzrostu w komórkach jamy omoczniowej, która jest dostępna z zewnątrz jaja (Murphy, B.R. i R.G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses, strona 1397-1445. W Fields Virology. Lippincott-Raven P.A).
Technologia rekombinacji DNA i techniki inżynierii genetycznej teoretycznie pozwalają na lepsze podejście do wytwarzania atenuowanego wirusa, ponieważ w genomie wirusa można celowo dokonać specyficznych mutacji. Jednakże, zmiany genetyczne wymagane do atenuacji wirusów nie są znane ani przewidywalne. Ogólnie, próby stosowania technologii rekombinacji DNA do wytwarzania szczepionek wirusowych dotyczą w większości produkcji szczepionek podjednostkowych, które zawierają tylko podjednostki białka patogenu, związanego z odpowiedzią immunologiczną, poddane ekspresji w rekombinowanych wektorach wirusowych, takich jak wirus krowianki lub bakulowirus. Ostatnio, wykorzystano techniki rekombinacji DNA w próbie wytworzenia mutantów delecyjnych herpeswirusa lub poliowirusów, które naśladują atenuowane wirusy znajdowane w naturze lub znane szeregi mutantów gospodarzy. Do 1990 r.; wirusy o ujemnej nici RNA nie były wcale podatne na manipulacje miejscowo-specyficzne, a więc nie mogły być genetycznie modyfikowane.
Atenuowane żywe wirusy grypy wytwarzane dotąd, mogły nie być zdolne do supresji odpowiedzi interferonowej u gospodarza, w którym replikują. Zatem, mimo, że wirusy te są odpowiednie, ponieważ są one immunogenne i niepatogenne, trudno je namnożyć w konwencjonalnych substratach do celów wytwarzania szczepionek. Ponadto, atenuowane wirusy mogą posiadać cechy wirulencji, które są łagodne i nie pozwalają gospodarzowi na wytworzenie odpowiedzi immunologicznej wystarczającej do obrony przed późniejszymi prowokacjami.
3. Omówienie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest atenuowany wirus grypy obejmujący zmodyfikowany gen NS1, charakteryzujący się tym, że wirusa grypy stanowi NS1/99.
Przedmiotem wynalazku jest również genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, charakteryzujący się tym, że wirus atenuowany jest przez mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60, przy czym N końcowy aminokwas oznacza numer 1, i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do miana, które jest przynajmniej o jeden rząd logarytmu wyższe niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnego pod względem interferonu w przypadku propagacji w takich samych warunkach.
Korzystnie wirus grypy stanowi wirus grypy A.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do około 8 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni.
Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki, charakteryzująca się tym, że zawiera atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja szczepionki jest skuteczna do zapobiegania chorobie zakaźnej u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja szczepionki, charakteryzująca się tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja szczepionki jest skuteczna do zapobiegania chorobie zakaźnej u podmiotu.
Korzystnie chorobę zakaźną stanowi zakażenie wirusem grypy.
Korzystniej atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy A.
Korzystnie zawiera dawkę skuteczną do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej.
Korzystnie stężenie atenuowanego wirusa wynosi około 104 do około 5x106 pfu.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do około 8 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni.
PL 200 977 B1
Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni.
Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
Korzystnie kompozycja przeznaczona jest do podawania donosowego, dotchawiczego, doustnego, śródskórnego, domięśniowego, śródotrzewnowego, dożylnego, lub podskórnego.
Korzystnie podmiotem jest człowiek.
Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia choroby zakaźnej u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia choroby zakaźnej u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia chorób, w których interferon przynosi korzyść terapeutyczną podmiotowi.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia chorób, w których interferon przynosi korzyść terapeutyczną podmiotowi.
Korzystnie chorobę zakaźną stanowi zakażeniem wirusem grypy.
Korzystnie atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy A.
Korzystnie kompozycja zawiera dawkę skuteczną do wzbudzenia komórkowej odpowiedzi interferonowej.
Korzystnie stężenie atenuowanego wirusa grypy wynosi około 104 do około 5x106 pfu.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do około 8 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni.
Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni.
Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem.
Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1 a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
Korzystnie jest przeznaczona jest do podawania śródskórnego, domięśniowego, śródotrzewnowego, dożylnego, podskórnego, donosowego, podtwardówkowego lub doustnego.
Korzystnie jest przeznaczona jest do podawania dopłucnego.
Korzystnie zawarta jest w układzie do kontrolowanego uwalniania.
Korzystnie podmiotem jest człowiek.
Zgodnie z wynalazkiem opisano atenuowane wirusy RNA o ujemnej nici, o zaburzonej zdolności do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki oraz zastosowania takich wirusów w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. W szczególności opisano atenuowane wirusy grypy zawierające zmodyfikowany gen NS1. Takie zmutowane wirusy z zaburzoną aktywnością antagonistyczną wobec IFN są atenuowane, czyli są zakaźne, mogą replikować in vivo zapewniając podkliniczny poziom infekcji, i nie są patogenne. Zatem, są one idealnymi kandydatami do żywych szczepionek wirusowych. Ponadto, atenuowane wirusy mogą indukować silną odpowiedź INF, która ma inne konsekwencje biologiczne in vivo, powodując zabezpieczenie przed późniejszymi chorobami zakaźnymi i/lub indukując odpowiedź przeciwnowotworową. Zatem, atenuowane wirusy można stosować farmaceutycznie do zapobiegania lub leczenia innych chorób zakaźnych, nowotworu u osób o wysokim ryzyku i/lub chorób leczonych przy użyciu IFN.
PL 200 977 B1
Wirusy stosowane w wynalazku, można selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję wobec mutagenów, powtórzone pasaże i/lub pasaże w gospodarzach niedozwolonych); reasortantów (w przypadku segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych (np. przy użyciu technik „genetyki odwrotnej) mających pożądany fenotyp, czyli zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki. Zmutowane lub genetycznie zmodyfikowane wirusy można selekcjonować na podstawie różnicowania wzrostu w układach z niedoborem IFN, względem układów kompetentnych pod względem IFN. Przykładowo, można selekcjonować wirusy, które rosną w układzie z niedoborem IFN, lecz nie rosną w układzie kompetentnym pod względem IFN (lub które rosną gorzej w układzie kompetentnym pod względem IFN).
Tak wyselekcjonowany atenuowany wirus może być stosowany sam jako składnik aktywny w szczepionce lub preparatach farmaceutycznych. Alternatywnie, atenuowany wirus może być stosowany jako wektor lub „szkielet szczepionek wytwarzanych w sposób rekombinacyjny. Jak dotąd, technikę „odwrotnej genetyki można stosować do wprowadzania mutacji lub obcych epitopów do atenuowanego wirusa, który służyłby jako szczep „rodzicielski. W ten sposób, można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów, lub alternatywnie, przeciw całkowicie innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym. Przykładowo, atenuowany wirus można zmodyfikować tak, by eksprymował epitopy neutralizujące innych wstępnie wyselekcjonowanych szczepów. Alternatywnie, w atenuowanego mutanta można wbudować epitopy wirusów innych niż wirusy RNA o ujemnej nici (np. gp160, gp120 lub gp41 HIV). Alternatywnie, w wirusa można wbudować epitopy zakaźnych niewirusowych patogenów (np. pasożytów, bakterii, grzybów). W jeszcze innej opcji, można wytworzyć szczepionki nowotworowe, np. przez wbudowanie antygenów nowotworowych do atenuowanego szkieletu wirusowego.
W szczególnej postaci realizacji, obejmującej wirusy RNA z genomami segmentowanymi, tzn. wirusa grypy, do przenoszenia atenuowanego fenotypu z rodzicielskiego szczepu wirusa o segmentowanym RNA (naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany) do różnych szczepów wirusowych (wirus dzikiego typu, naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany) można stosować techniki reasortacji.
Wirusy atenuowane, które indukują silne odpowiedzi IFN u gospodarza, można także stosować w preparatach farmaceutycznych do zapobiegania lub leczenia innych infekcji wirusowych lub chorób które można leczyć przy użyciu IFN, takich jak nowotwór. W takim przypadku można zmieniać tropizm atenuowanego wirusa tak, aby nakierować go na żądany narząd docelowy, tkankę lub komórki, in vivo lub ex vivo. Stosując to podejście, odpowiedź IFN można indukować miejscowo, w docelowym miejscu, unikając w ten sposób lub minimalizując skutki uboczne układowego traktowania IFN. W tym celu można zbudować atenuowanego wirusa do ekspresji liganda specyficznego pod względem receptora docelowego narządu, tkanki lub komórek.
Rozwiązania według wynalazku opierają się częściowo na stwierdzeniu, że NS1 wirusa grypy dzikiego typu działa jak antagonista IFN w taki sposób, że NS1 hamuje odpowiedź fy zależną od IFN komórek gospodarza zakażonych wirusem. Stwierdzono, że mutanty wirusowe z niedoborem aktywności NS1 są silnymi induktorami odpowiedzi komórkowej IFN, i przedstawiają atenuowany fenotyp in vivo; czyli zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz dają mniejsze skutki patogenne. Nie chcąc wiązać się jakąkolwiek teorią lub wytłumaczeniem działania wynalazku, cechy atenuacji wirusów według wynalazku są prawdopodobnie spowodowane ich zdolnością do indukcji silnej komórkowej odpowiedzi IFN oraz ich zaburzonej zdolności do antagonizowania odpowiedzi IFN gospodarza. Jednakże, korzystne cechy atenuowanych wirusów według wynalazku nie muszą być przypisywane jedynie wpływowi na komórkową odpowiedź IFN. W rzeczywistości, zmiany innych aktywności związanych z NS1 mogą nadawać żądany atenuowany fenotyp.
Wykazano, że zmutowany wirus grypy o zaburzonej aktywności antagonistycznej wobec IFN, replikuje in vivo, wytwarzając miana, które są wystarczające do indukcji odpowiedzi immunologicznej i cytokinowej. Przykładowo, szczepienie atenuowanym wirusem grypy zmniejszało miano wirusa u zwierząt, które później prowokowano wirusem grypy dzikiego typu. Atenuowane wirusy grypy przedstawiały także aktywność przeciwwirusową i przeciwnowotworową. Wstępna infekcja atenuowanym wirusem grypy hamowała replikację innych szczepów wirusa grypy dzikiego typu i innych wirusów (takich jak wirus Sendai) nadkażonych w jajach z zarodkami. Szczepienie atenuowanym wirusem grypy u zwierząt, którym, wstrzyknięto komórki nowotworowe, zmniejszyło liczbę utworzonych ognisk. Ze względu na to, że wirus grypy jak wiadomo indukuje odpowiedź CTL (cytotoksyczne limfocyty T),
PL 200 977 B1 atenuowany wirus jest bardzo atrakcyjnym kandydatem do szczepionek nowotworowych. Do szczepionek wirusowych zalecane są mutacje, które zmniejszają, lecz nie znoszą aktywności antagonistycznej IFN wirusa, takie wirusy można selekcjonować pod względem wzrostu zarówno w konwencjonalnych, jak i niekonwencjonalnych substratach, oraz pod względem wirulencji pośredniej. W szczególności, twórcy wynalazku wykazali, że mutant o skróconym C-terminalnie NS1 replikuje do wysokich mian w substratach z niedoborem IFN, takich jak 6 i 7-dniowe zarodki kurze, jak również w błonie omoczniowej 10-dniowych zarodków kurzych, substracie konwencjonalnym dla wirusa grypy, który nie pozwala na wzrost mutantów wirusa grypy, w których usunięto cały gen NS1 (przytaczanych także w niniejszym opisie jako mutanty „knockout). Jednakże, replikacja mutanta o skróconym końcu C NS1 jest mniejsza u 12-dniowych zarodków kurzych. Z zastosowaniem tego podejścia można wytwarzać i identyfikować żywe atenuowane wirusy RNA o ujemnej nici, ze zmienioną, lecz nie zniesioną aktywnością antagonistyczną wobec IFN i które są zdolne do wzrostu w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek. Podejście to pozwala także, po raz pierwszy, na układ skutecznej selekcji identyfikacji pod względem wirusów grypy, które zawierają mutacje nadające zmienioną lecz nie zniesioną aktywność antagonistyczną wobec interferonu.
Opisane układy z niedoborem IFN mogą być zastosowane do namnażania atenuowanych wirusów, które nie mogą być hodowane w układach konwencjonalnych stosowanych aktualnie przy wytwarzaniu szczepionek. Określenie „układy z niedoborem IFN jakie stosuje się w niniejszym opisie, odnosi się do układów, np. komórek, linii komórkowych i zwierząt, takich jak myszy, kurczęta, indyki, króliki, szczury itd., które nie wytwarzają IFN lub wytwarzają IFN na niskim poziomie, nie odpowiadających lub odpowiadających mniej skutecznie na IFN, i/lub mających braki w indukowanej przez IFN aktywności genów antywirusowych. W tym celu, twórcy wynalazku zidentyfikowali lub opracowali liczne układy z niedoborem IFN, które można stosować, włączając, lecz bez ograniczenia, młode zarodki kurze, linie komórkowe z niedoborem IFN (takie jak komórki VERO lub genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe, takie jak z wyłączeniem (knockout) STAT1). Alternatywnie, zarodki kurze lub linie komórkowe można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN (łącznie z lekami, przeciwciałami, antysensami, rybozymami, itd). Jeszcze inna postać realizacji może obejmować stosowanie jaj z niedoborem w układzie IFN np. jaj wytworzonych przez ptaki ujemne pod względem STAT1, zwłaszcza drób, włączając lecz bez ograniczenia kurczęta transgeniczne, kaczki lub indyki.
4. Opis rysunków
Figura 1. Wirus delNS1 hamuje replikację wirusa grypy A dzikiego typu w jajach. Jaja kurze z zarodkami w wieku dziesięciu dni zaszczepiono wskazanymi pfu wirusa delNS1. Osiem godzin później, jaja zakażono 103 pfu wirusa WSN. Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa WSN przez test łysinek w komórkach MDCK. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Figura 2. Indukcja odpowiedzi antywirusowej w zarodkach kurzych przez wirus delNS1. Jaja kurze z zarodkami w wieku dziesięciu dni zaszczepiono PBS (nietraktowane) lub 2x104 pfu wirusa delNS1 (traktowane delNS1). Osiem godzin później jaja ponownie zakażono 103 pfu wirusa grypy A/WSN/33 (H1N1), wirusa grypy A/PR8/34 (H+N1), wirusa grypy A/K-31 (H3N2), wirusa grypy B/Lee/40 lub wirusa Sendai. Po dwóch dniach inkubacji zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa przez test hemaglutynacji. Wyniki są średnią z dwóch jaj.
Figura 3. Komórki CVI transfekowano plazmidem, wykazującym ekspresję IRF-3 poddanego fuzji z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Pozwoliło to na określenie lokalizacji IRF-3 wewnątrz komórek, przez mikroskopię fluorescencyjną. W niektórych przypadkach, plazmid ekspresyjny NS1 kotransfekowano plazmidem ekspresyjnym IRF-3, we wskazanych stosunkach. 24 Godziny po transfekcji, komórki zakażano wirusem PR8 (WT) lub delNS1 przy wysokiej moi, zgodnie ze wskazaniami. 10 godzin po zakażeniu, komórki analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym pod względem lokalizacji IRF-3-GFP. Zaznaczono odsetek komórek wykazujących wyłącznie lokalizację cytoplazmatyczną (CYT) oraz komórek wykazujących lokalizację zarówno cytoplazmatyczną i jądrową IRF-3 (Nuc+Cyt).
5. Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisano wytwarzanie, selekcję i identyfikację atenuowanych wirusów RNA o ujemnej nici, o zaburzonej zdolności do antagonizowania odpowiedzi komórkowej IFN, oraz zastosowania takich wirusów w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych.
Wirusy mogą być selekcjonowane z występujących naturalnie szczepów, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję na promieniowanie UV, mutageny,
PL 200 977 B1 i/lub pasażowanie); reasortantów (w przypadku wirusów o segmentowanych genomach); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, wirusy zmutowane można wytworzyć przez naturalną zmienność, ekspozycję na promieniowanie UV, ekspozycję na mutageny chemiczne, przez pasażowanie w gospodarzach niedozwolonych, przez reasortację (czyli przez koinfekcję atenuowanego segmentowanego wirusa z innym szczepem, mającym żądane antygeny) i/lub przez genetyczne modyfikowanie (np. przy użyciu „genetyki odwrotnej (reverse genetics)). Wirusy selekcjonowane do stosowania w wynalazku, mają defektywną aktywność antagonizowania IFN i są atenuowane; czyli są one zakaźne i mogą replikować in vivo, lecz wytwarzają tylko niskie miana, wywołując poziom subkliniczny infekcji, który nie jest patogenny. Takie atenuowane wirusy są idealnymi kandydatami do żywych szczepionek.
W specyficznej postaci realizacji, atenuowane wirusy selekcjonowane do stosowania w wynalazku, powinny być zdolne do indukcji silnej odpowiedzi IFN u gospodarza, cechy, która przyczynia się do wywoływania silnej odpowiedzi immunologicznej przy stosowaniu jako szczepionki, i która ma inne konsekwencje biologiczne, które czynią wirusy użytecznymi jako środki farmaceutyczne do profilaktyki i/lub leczenia innych zakażeń wirusowych, lub powstawania nowotworu u osób z wysokim ryzykiem, lub innych chorób, które leczy się IFN.
Wynalazek opiera się częściowo na licznych stwierdzeniach i obserwacjach twórców wynalazku, dokonanych podczas pracy z mutantami wirusa grypy.
Po pierwsze, odpowiedź IFN jest istotna dla zakażeń wirusowych in vivo. Twórcy wynalazku stwierdzili, że wzrost dzikiego typu wirusa grypy A/WSN/33 u myszy z niedoborem IFN (myszy STAT1 -/-) spowodował zakażenie wielonarządowe; czyli zakażenie wirusowe nie ograniczało się tylko do płuc, jak to się dzieje u myszy dzikiego typu, u których powstaje odpowiedź IFN (Garcia-Sastre i inni, 1993, J.Virol. 72: 8550, którą załącza się w całości jako odniesienie). Po drugie, twórcy wynalazku stwierdzili, że NS1 wirusa grypy działa jako antagonista IFN. Twórcy wynalazku stwierdzili, że mutant wirusa grypy z delecją całego genu NS1 (czyli „knockout NS1) nie był zdolny do wzrostu do wysokich mian w komórkach gospodarza kompetentnych pod względem IFN, i mógł się namnażać tylko w gospodarzach z niedoborem IFN. Wirus z wyłączonym NS1 przedstawiał fenotyp atenuowany (czyli był on letalny u myszy STAT1-/- bez IFN, lecz nie był u myszy dzikiego typu) i stwierdzono, że jest on silnym induktorem odpowiedzi IFN w komórkach gospodarza (Garcia-Sastre i inni 1998, Virology, 252:324-330, którą załącza się w całości jako odniesienie). Wstępne zakażenie zmutowanym wirusem z wyłączeniem NS1 zmniejszało miana wirusów grypy dzikiego typu i innych (np. Sendai) nadkażonych w jajach kurzych z zarodkami. W innym doświadczeniu, zakażenie zmutowanym wirusem grypy z wyłączeniem NS1, zmniejszało tworzenie ognisk u zwierząt zaszczepionych komórkami nowotworowymi. Tak więc, wirus grypy z wyłączonym NS1 przedstawiał interesujące właściwości biologiczne. Jednakże, wirusy grypy z wyłączonym NS1 nie mogły się namnażać w konwencjonalnych układach do wytwarzania szczepionek. W celu przezwyciężenia tego problemu, twórcy wynalazku użyli i pracowali układy z niedoborem IFN, które pozwalają na wytwarzanie rozsądnych ilości atenuowanego wirusa.
Zgodnie z wynalazkiem opracowano mutanty delecyjne NS, które nie mają wydeletowanego całego genu. Niespodziewanie okazało się, że te mutanty NS1 wykazują „pośredni fenotyp, wirus może rosnąć w konwencjonalnych gospodarzach stosowanych do namnażania wirusa grypy (choć wzrost jest lepszy w układach z niedoborem IFN, które dają wyższe miana). Najistotniejsze jest to, że mutanty delecyjne są atenuowane in vivo i indukują silną odpowiedź IFN. Szczepienie mutantami wirusa grypy ze skróconym NS1, powodowało niskie miana wirusa u zwierząt później prowokowanych wirusem dzikiego typu, i powodowało zabezpieczenie przed chorobą.
Zgodnie z wynalazkiem opisano substraty z niedoborem interferonu do skutecznego hodowania mutantów wirusa grypy. Substratem z niedoborem interferonu może być taki substrat, który jest defektywny pod względem zdolności do wytwarzania lub odpowiedzi wobec interferonu. Substrat taki można stosować do hodowli każdej ilości wirusów, które mogą wymagać środowiska wzrostu nie zawierającego interferonu.
Atenuowane wirusy według wynalazku mogą być zastosowane w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych przeznaczonych dla ludzi i zwierząt. W szczególności, atenuowane wirusy można stosować jako szczepionki przeciw szerokiemu zakresowi wirusów lub innych patogenów zakaźnych (np. bakterii, pasożytów, grzybów) lub antygenów specyficznych wobec nowotworu. W innej postaci realizacji, atenuowane wirusy, które hamują replikację wirusową i tworzenie nowotworu, można stosować do profilaktyki lub leczenia infekcji (patogenów wirusowych lub niewirusowych) lub tworzenia nowotworu lub leczenia chorób, dla których zalecana jest terapia IFN. Można stosować wiele metod
PL 200 977 B1 wprowadzania żywych atenuowanych preparatów wirusowych do podmiotu ludzkiego lub zwierzęcego celem indukcji odporności lub odpowiedniej odpowiedzi cytokinowej. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przeskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. W zalecanej postaci realizacji, atenuowane wirusy według niniejszego wynalazku można preparować w postać do dostarczania donosowego.
5.1 Wytwarzanie mutantów o zmienionej aktywności W antagonistycznej wobec IFN
Można wyselekcjonować występujące naturalnie mutanty lub odmiany, albo mutanty spontaniczne, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi wobec IFN. Zmutowane wirusy można wytworzyć przez ekspozycję wirusa wobec i mutagenów, takich jak promieniowanie ultrafioletowe lub mutageny chemiczne, lub przez wielokrotne pasażowanie i/lub pasaż w niedozwolonym gospodarzu. Skrining w różnicującym układzie wzrostowym można stosować do selekcji pod względem tych mutantów, które mają zaburzoną funkcję antagonistyczną wobec IFN. W przypadku wirusów grypy o genomie segmentowanym, fenotyp atenuowany można przenieść do innego szczepu, mającego żądany antygen, przez reasortację (czyli koinfekcję atenuowanego wirusa i żądanego szczepu oraz selekcję reasortantów wykazujących oba fenotypy).
Do wirusa grypy można wprowadzić mutacje, stosując podejścia „genetyki odwrotnej. W ten sposób, mutacje naturalne lub inne, które nadają fenotyp atenuowany, można wbudować w szczepy do szczepionek. Przykładowo, można wbudować delecje, insercje lub substytucje regionu kodującego odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN (tak jak NS1 wirusa grypy).
Zgodnie z wynalazkiem zastosować można także mutacje w stosunku do segmentu genu NS1, które niekoniecznie wynikają ze zmiany aktywności antagonistycznej wobec IFN lub fenotypu indukującego IFN, lecz raczej wywołują zmiany funkcji wirusowych i fenotyp atenuowany np. zmianę inhibicji eksportu jądrowego mRNA zawierającego poli(A), zmianę inhibicji splicingu pre-mRNA, zmianę inhibicji aktywacji PKR przez sekwestrację dsRNA, zmianę wpływu na translację RNA wirusa i zmianę inhibicji poliadenylacji mRNA gospodarza (np. patrz Krug w Textbook of Influenza, Nicholson i inni, wydawca, 1998, 82-92 i odniesienia tam cytowane).
Technika odwrotnej genetyki obejmuje wytwarzanie syntetycznych rekombinowanych wirusów RNA, które zawierają regiony niekodujące ujemnej nici wirusa RNA, które są zasadnicze dla rozpoznania przez polimerazy wirusowe i dla sygnałów upakowania koniecznych do wytworzenia dojrzałego wirionu. Rekombinowane RNA syntetyzuje się z rekombinowanej matrycy DNA i odtwarza in vitro z kompleksem oczyszczonej polimerazy wirusowej, tworząc rekombinowane rybonukleoproteiny (RNP), które można stosować do transfekcji komórek. Skuteczniejszą transfekcję uzyskuje się jeśli białka polimerazy wirusowej są obecne podczas transkrypcji syntetycznego RNA albo in vitro, albo in vivo. Syntetyczne rekombinowane RNP można odtworzyć do zakaźnych cząstek wirusowych. Powyższe techniki opisano w opisie patentowym U.S nr 5,166,057 złożonym 25 listopada 1992; opisie patentowym U.S nr 5,854,037 złożonym 29 grudnia 1998; w europejskiej publikacji patentowej EP 0702085A1, opublikowanej 20 lutego 1996; w zgłoszeniu patentowym U.S numer 09/152,345; w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT WO97/12032 opublikowanym 3 kwietnia 1997; WO96/34625 opublikowanym 7 listopada 1996; w europejskiej publikacji patentowej EP-A780475; WO99/02625 opublikowanej 21 stycznia 1999; WO98/53078 opublikowanej 26 listopada 1998; WO98/02530 opublikowanej 22 stycznia 1998; WO99/15672 opublikowanej 1 kwietnia 1999; WO98/13501 opublikowanej 2 kwietnia 1998; WO97/06270 opublikowanej 20 lutego 1997; oraz EPO 780 47SA1 opublikowanej 25 czerwca 1997, z których wszystkie załącza się w całości jako odniesienie.
Atenuowane wirusy wytworzone z użyciem podejścia odwrotnej genetyki można stosować w opisanych tu szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. Techniki odwrotnej genetyki można także stosować do wprowadzania dodatkowych mutacji w innych genach wirusowych, istotnych dla produkcji szczepionki, to jest do atenuowanego wirusa można wbudować epitopy użytecznych odmian szczepów do szczepionek. Alternatywnie, do atenuowanego szczepu można wbudować całkiem obce epitopy, włączając antygeny pochodzące od innych patogenów wirusowych lub niewirusowych. Przykładowo, do atenuowanego szczepu można wbudować antygeny nie spokrewnionych wirusów, takich jak HIV (gp160, gp120, gp41), antygeny pasożytów (np. malarii), antygeny bakteryjne lub grzybowe albo antygeny nowotworowe. Alternatywnie, do atenuowanych wirusów według wynalazku można wbudować epitopy, które zmieniają tropizm wirusa in vivo.
W zamiennej postaci realizacji, do zbudowania atenuowanych wirusów mających żądane epitopy w wirusach o segmentowanym RNA, można użyć połączenie techniki odwrotnej genetyki i reasor10
PL 200 977 B1 tacji. Przykładowo, atenuowany wirus (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę odwrotnej genetyki) oraz szczep niosący żądany epitop szczepionki (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę odwrotnej genetyki), można koinfekować w gospodarzu, który pozwala na reasortację segmentowanych W genomów. Następnie można wyselekcjonować reasortanty, które wykazują zarówno fenotyp atenuowany jak żądany epitop.
W zalecanej postaci realizacji genetycznie zmodyfikowane wirusy grypy zawierają delecje i/lub skrócenia produktu genowego NS1. Szczególnie zalecane są mutanty NS1 grypy A i B. W jednym podejściu, części regionu aminoterminalnego produktu genowego NS1 są utrzymywane, podczas gdy region C-terminalny produktu genowego NS1, usuwa się. Specyficzne żądane mutacje można konstruować poprzez A insercję kwasu nukleinowego, delecje, lub mutację w odpowiednim kodonie. W szczególności, skrócone białka NS1 mają od 1-60 aminokwasów, 1-70 aminokwasów, 1-80 aminokwasów, 1-90 aminokwasów (aminokwas N-terminalny oznacza 1); od 1-100 aminokwasów; a korzystnie 99 aminokwasów; od 1-110 aminokwasów; od 1-120 aminokwasów; lub od 1-130 aminokwasów, a korzystnie 124 aminokwasy produktu dzikiego typu genu NS1.
Zgodnie z wynalazkiem w wirusie grypy produkt genowy NS1 może być zmodyfikowany przez skrócenie lub modyfikację białka NS1, co zmutowanym wirusom nadaje następujące fenotypy: zdolność wirusów do wzrostu do wysokich mian w substratach niekonwencjonalnych, takich jak jaja kurze z zarodkami w wieku 6-7 dni, lub zdolność wirusów do indukcji odpowiedzi interferonowej gospodarza. Dla wirusów grypy A, obejmują one, lecz bez ograniczenia: wirusy, mające skrócenia NS1.
Zgodnie z wynalazkiem mogą być zastosowane naturalnie występujące zmutowane wirusy grypy A lub B, mające fenotyp atenuowany, jak również szczepy wirusa grypy zmodyfikowane tak, aby zawierały takie mutacje odpowiedzialne za fenotyp atenuowany.
Atenuowany wirus grypy można ponadto zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję antygenów innych szczepów do szczepienia (np. przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji). Alternatywnie, atenuowany wirus grypy można przy użyciu odwrotnej genetyki lub reasortacji z genetycznie zbudowanymi wirusami zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję całkowicie obcych epitopów, np. antygenów innych patogenów zakaźnych, antygenów nowotworowych lub antygenów kierunkujących. Ponieważ segment RNA NS jest najkrótszy wśród ośmiu RNA wirusowych, możliwe jest, że RNA NS będzie tolerować dłuższe insercje sekwencji heterologicznych niż inne geny wirusowe. Ponadto, segment RNA NS kieruje syntezę dużych ilości białka w zakażonych komórkach, sugerując, że byłby to idealny segment do insercji obcych antygenów. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, każdy z ośmiu segmentów wirusów grypy można stosować do insercji sekwencji heterologicznych. Przykładowo, jeśli pożądana jest prezentacja antygenu powierzchniowego, można użyć segmenty kodujące białka strukturalne np. HA lub NA.
5.2 Układ selekcji oparty na restrykcji gospodarza
Zgodnie z wynalazkiem można selekcjonować wirusy, które posiadają żądany fenotyp, czyli wirusy, które posiadają niską lub brak aktywności antagonistycznej wobec IFN, otrzymane z naturalnych odmian, odmian spontanicznych (czyli odmian, które ewoluują podczas namnażania wirusa), mutagenizowanych naturalnych odmian, reasortantów i/lub genetycznie zmodyfikowanych wirusów. Takie wirusy można najlepiej przesiewać w testach wzrostu różnicującego, które porównują wzrost w układach z niedoborem IFN wzglądem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN. Wybiera się wirusy, które wykazują lepszy wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN; dogodnie, wybiera się wirusy, które rosną do mian co najmniej jeden logarytm wyższy w układach z niedoborem IFN w porównaniu z układem kompetentnym pod względem IFN.
Alternatywnie, wirusy można przesiewać przy użyciu układów testowych IFN, np. układów testowych opartych na transkrypcji, w których ekspresja genu reporterowego jest kontrolowana przez promotor odpowiadający na IFN. Ekspresję genu reporterowego w komórkach zakażonych względem niezakażonych można mierzyć w celu identyfikacji wirusów, które skutecznie indukują odpowiedź wobec IFN, lecz które są niezdolne do antagonizacji odpowiedzi IFN. Jednak w zalecanej postaci realizacji, stosuje się testy wzrostu różnicującego do selekcji wirusów, mających żądany fenotyp, ponieważ stosowany układ gospodarza (kompetentny pod względem IFN przeciwko niedoborowi IFN) stosuje odpowiednią presję selekcyjną.
Przykładowo, wzrost wirusa (mierzony przez miano) można porównać z różnymi komórkami liniami komórkowymi, lub zwierzęcych układach modelowych, które wykazują ekspresję IFN oraz składników odpowiedzi IFN. W tym celu, można porównać wzrost wirusa w liniach komórkowych, taPL 200 977 B1 kich jak linie VERO (które wykazują niedobór IFN) względem komórek MDCK (które są kompetentne pod względem IFN). Alternatywnie, można otrzymać i ustalić linie komórkowe z niedoborem IFN od zwierząt hodowanych lub genetycznie zmodyfikowanych, aby wykazywały niedobór w układzie IFN (np. zmutowane myszy STAT1 -/-). Można mierzyć wzrost wirusa w takich liniach komórkowych, w porównaniu z komórkami kompetentnymi pod względem IFN, otrzymanymi np. od zwierząt dzikiego typu (np. myszy dzikiego typu). W jeszcze innej postaci realizacji można zmodyfikować linie komórkowe, które są kompetentne pod względem IFN i wiadomo, że podtrzymują wzrost wirusa dzikiego typu tak, aby wykazywały niedobór IFN (np. przez wyłączenie STAT1, IRF3, PKR itd). Można stosować sposoby, które są dobrze znane w technice namnażania wirusów w liniach komórkowych (patrz np. przykłady działania poniżej). Można porównać wzrost wirusa w standardowej kompetentnej pod względem IFN linii komórkowej względem genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej z niedoborem IFN.
Można także stosować układy zwierzęce. Przykładowo dla grypy, można porównać wzrost w młodych jajach kurzych z zarodkami z niedoborem IFN, np. około 6 do 8-dniowych, ze wzrostem w starszych jajach z zarodkami, kompetentnych pod względem IFN, np. około 10 do 12 dniowych. W tym celu można stosować sposoby dobrze znane w technice dla zakażania i namnażania w jajach (np. patrz przykłady działania poniżej). Alternatywnie, można porównać wzrost u myszy z niedoborem IFN STAT1-/-, ze wzrostem u myszy dzikiego typu kompetentnych pod względem IFN. W jeszcze innej alternatywnej realizacji, można porównać wzrost w jajach kurzych z zarodkami z niedoborem IFN wytworzonych przez np. transgeniczny drób STAT1-/-, ze wzrostem w jajach kompetentnych pod względem IFN, wytworzonych przez drób dzikiego typu.
Jednak do celów skriningu można stosować układy krótkotrwałe z niedoborem IFN, zamiast układów zmodyfikowanych genetycznie. Przykładowo, układ gospodarza można traktować związkami, które hamują wytwarzanie IFN i/lub składników odpowiedzi IFN (np. leki, przeciwciała przeciwko IFN, przeciwciała przeciwko receptorowi IFN, inhibitory PKR, cząsteczki antysensowne i rybozymy, itd). Wzrost wirusa można porównać w nietraktowanych kontrolach kompetentnych pod względem IFN, względem układów traktowanych, z niedoborem IFN. Przykładowo, starsze jaja kompetentne pod względem IFN można wstępnie traktować takimi lekami przed zakażeniem przesiewanym wirusem. Wzrost porównuje się ze wzrostem uzyskanym w nietraktowanych jajach kontrolnych w tym samym wieku.
Opisane tu sposoby skriningu zapewniają prosty i łatwy przesiew w celu identyfikacji zmutowanych wirusów o zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez niezdolność zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku odpowiadającym na IFN, w porównaniu ze zdolnością zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku z niedoborem IFN. Opisane tu sposoby skriningu można także stosować do identyfikacji zmutowanych wirusów o zmienionej, lecz nie zniesionej, aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez pomiar zdolności zmutowanego wirusa do wzrostu zarówno w odpowiadających na IFN, np. 10-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach MDCK, jak i środowiskach z niedoborem IFN, np. 6 do 7-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach VERO. Przykładowo, wirusy grypy, wykazujące co najmniej jeden logarytm niższe miana w 10-dniowych zarodkach w stosunku do 6-7-dniowych zarodków, będą uważane za posiadające zakłóconą zdolność do hamowania odpowiedzi wobec IFN. W innym przykładzie, wirusy grypy, wykazujące co najmniej jeden logarytm mniejsze miano u 12-dniowych zarodków (które wykazują wysoką odpowiedź wobec IFN) w stosunku do 10-dniowych zarodków (które wykazują średnią odpowiedź wobec IFN) uznaje się za częściowo zakłóconą pod względem zdolności do antagonizacji odpowiedzi IFN i uznaje się za atrakcyjnych kandydatów do szczepionki.
Opisane tu sposoby selekcji obejmują także identyfikację tych zmutowanych wirusów, które indukują odpowiedzi wobec IFN. Zgodnie z opisanymi tu sposobami selekcji, indukcję odpowiedzi wobec IFN można mierzyć przez testowanie poziomu ekspresji IFN lub ekspresji genów docelowych lub genów reporterowych indukowanych przez IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem lub aktywacji transaktywatorów związanych z ekspresją IFN i/lub odpowiedzią IFN.
Indukcję odpowiedzi IFN można określać przez pomiar stanu fosforylacji składników szlaku IFN po zakażeniu testowanym zmutowanym wirusem, np. IRF-3, który jest ufosforylowany w odpowiedzi na podwójną nić RNA. W odpowiedzi na IFN typu I, następuje szybka fosforylacja tyrozyny kinazy Jaki i kinazy TyK2, podjednostek receptora IFN, STAT1 i STAT2. Tak więc, w celu określenia czy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN, komórki, takie jak komórka 293, zakaża się testowanym zmutowanym wirusem i po infekcji komórki poddaje się lizie. Składniki szlaku IFN, takie jak kinaza Jak1, lub kinaza TyK2 poddaje się immunoprecypitacji z lizatów zakażonych komórek, przy użyciu specyficznych surowic poliklonalnych lub przeciwciał, i określa stan fosforylacji tyrozyny kinazy przez testy odci12
PL 200 977 B1 sku immunologicznego z użyciem przeciwciała antyfosfotyrozynowego (np. patrz Krishnan i inni 1997., Eur. J.Biochem.247:298-305) Stan podniesionej fosforylacji jakiegokolwiek składnika szlaku IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem będzie wskazywać na indukcję odpowiedzi IFN przez zmutowanego wirusa.
Opisane tu układy selekcji obejmują pomiar zdolności do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcyjnych indukowanej w odpowiedzi na infekcję wirusową, np. IRF3, STAT1, STAT2 itd. W szczególności, STAT1 i STAT2 są ufosforylowane i translokowane z cytoplazmy do jądra w odpowiedzi na IFN typu I. Zdolność do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcyjnych można mierzyć technikami znanymi fachowcom, np. testami EMSA (Electromobility Shift Assay), barwieniem komórek itd.
Indukcję odpowiedzi IFN można określić przez pomiar aktywacji transkrypcji zależnej od IFN po zakażeniu testowym zmutowanym wirusem. Ekspresję genów, o których wiadomo, że są indukowane przez IFN, np. Mx, PKR, 2-5-oligoadenylanosyntetazy, głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I, itd., można analizować technikami znanymi fachowcom (np. hybrydyzacji typu Northern blot, Western blot, PCR itd.).
Alternatywnie, testowane komórki, takie jak ludzkie komórki zarodkowe nerek lub ludzkie komórki mięsaka kościotwórczego, modyfikuje się tak, aby wykazywały krótkotrwałą lub konstytutywną ekspresję genów reporterowych, takich jak gen reporterowy lucyferazy lub gen reporterowy transferazy chloramfenikolowej (CAT) pod kontrolą elementu odpowiedzi stymulowanej IFN, takiego jak promotor stymulowany IFN genu ISG-54K (Bluyssen i inni 1994, Eur.J.Biochem. 220:395-402). Komórki zakaża się testowym zmutowanym wirusem i poziom ekspresji genu reporterowego porównuje z komórkami niezakażonymi lub komórkami zakażonymi wirusem dzikiego typu. Zwiększenie poziomu ekspresji genu reporterowego po zakażeniu testowym wirusem będzie wskazywać, że testowy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN.
Opisane tu układy selekcji obejmują pomiar indukcji IFN przez określenie czy ekstrakt z komórek lub jaj zakażonych testowym zmutowanym wirusem jest zdolny do nadawania aktywności zabezpieczającej przeciw infekcji wirusowej.
Konkretniej, grupy 10-dniowych jaj kurzych z zarodkami zakaża się testowym zmutowanym wirusem lub wirusem dzikiego typu. Około 15 do 20 godzin po zakażeniu, zbiera się płyn omoczniowy i testuje pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przed infekcją VSV w komórkach hodowli tkankowej, takich jak komórki CEF.
5.3 Namnażanie wirusa w substratach wzrostowych z niedoborem interferonu
Do hodowli i izolacji zmodyfikowanych zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN zastosować można także sposoby i substraty z niedoborem IFN. Substraty z niedoborem IFN, które można stosować do podtrzymywania wzrostu atenuowanych zmutowanych wirusów obejmują, lecz bez ograniczenia, naturalnie występujące komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja z zarodkami, które wykazują niedobór IFN, np. komórki Vero, młode jaja z zarodkami; rekombinowane komórki lub linie komórkowe, które są tak zmodyfikowane, aby wykazywały niedobór IFN, np. linie komórkowe z niedoborem IFN pochodzące od myszy z wyłączeniem STAT1 lub innych podobnie zmodyfikowanych zwierząt transgenicznych; jaja z zarodkami otrzymane od ptaków z niedoborem IFN, zwłaszcza drobiu (np. kur, kaczek, indyków), łącznie ze stadem hodowanym tak, aby wykazywało niedobór IFN, lub ptaków transgenicznych (np. z wyłączeniem STAT1). Alternatywnie, układ komórek gospodarza, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można genetycznie zmodyfikować tak, aby wykazywały ekspresję transgenów, kodujących inhibitory układu IFN, np. dominujące mutanty ujemne, takie jak STAT1 bez domeny wiążącej DNA, antysensowny RNA, rybozymy, inhibitory wytwarzania IFN, inhibitory sygnału IFN i/lub inhibitory genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Należy pamiętać, że zwierzęta, które są hodowane lub genetycznie zmodyfikowane tak, aby wykazywały niedobór IFN, będą wykazywać nieco obniżoną odporność immunologiczną, i powinny być utrzymywane w kontrolowanym środowisku pozbawionym chorób. Tak więc powinny być przedsięwzięte odpowiednie pomiary (włączając stosowanie antybiotyków w W diecie), aby ograniczyć ryzyko ekspozycji na czynniki zakaźne zwierząt transgenicznych z niedoborem IFN, takich jak stada kur hodowlanych, kaczek indyków, itd. Alternatywnie, układ gospodarza, np. komórki, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można traktować związkiem, który hamuje wytwarzanie IFN i/lub szlak IFN, np. lekami, przeciwciałami, cząsteczkami antysensownymi, cząsteczkami rybozymowymi ukierunkowanymi na gen STAT1 i/lub genami antywirusowymi indukowanymi przez IFN.
Niedojrzałe jaja kurze z zarodkami obejmują jaja, które naturalnie są w wieku poniżej dziesięciu dni, korzystnie sześć do dziewięciu dni; oraz jaja, które sztucznie naśladują niedojrzałe jaja w wieku
PL 200 977 B1 poniżej dziesięciu dni, w wyniku zmian warunków wzrostu, np. zmian temperatury inkubacji, co powoduje, że jest opóźniony rozwój jaj a układ IFN jaja nie jest w pełni rozwinięty w porównaniu z jajami 10- do 12-dniowymi.
5.3.1 Naturalne substraty z niedoborem IFN
Naturalnie występujące i zmodyfikowane zmutowane wirusy według wynalazku można hodować w niekonwencjonalnych substratach, takich jak niedojrzałe jaja z zarodkami, które jeszcze, nie wykształciły układu IFN. Niedojrzałych jaj z zarodkami nie stosuje się zazwyczaj do hodowli wirusów, z powodu ich delikatności i mniejszej objętości omoczni. Zgodnie z wynalazkiem można hodować zmutowane wirusy według wynalazku w jajach z zarodkami w wieku poniżej 10 dni; dogodnie można hodować zmutowane wirusy w jajach z zarodkami w wieku 8 dni, najdogodniej w wieku 6 do 8 dni.
Zmutowane wirusy o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można hodować i izolować z komórek i linii komórkowych, które naturalnie nie posiadają szlaku IFN lub wykazują niedobór szlaku IFN lub niedobory w szlaku IFN, np. niski poziom ekspresji IFN w porównaniu z komórkami dzikiego typu. Zmutowane wirusy o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można hodować w komórkach Vero.
5.3.2 Genetycznie zmodyfikowane substraty z niedoborem IFN
Zmutowane wirusy o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można hodować i izolować z genetycznie zmodyfikowanego substratu z niedoborem IFN, takiego jak transgeniczne ptactwo, u którego zmutowano gen zasadniczy dla układu IFN, np. STAT1, które będą składać jaja z niedoborem IFN lub transgeniczne ptactwo, które wykazuje ekspresję dominujących ujemnych czynników transkrypcyjnych, np. bez domeny wiążącej DNA STAT1, rybozymy, antysensowny RNA, inhibitory wytwarzania IFN, inhibitory sygnalizacji IFN i inhibitory genów antywirusowych indukowanych w odpowiedzi na IFN. Zaleta stosowania jaj od transgenicznego ptactwa z niedoborem IFN jest taka, że do hodowli wirusa można stosować konwencjonalne 10-dniowe jaja, które są stabilniejsze i mają większą objętość z powodu większego rozmiaru. Linie komórkowe można genetycznie zmodyfikować tak, aby wykazywały niedobór IFN. Takie linie komórkowe obejmują linie komórkowe, w których zmutowano geny zasadnicze do syntezy IFN, szlaku IFN i/lub genu (genów) antywirusowego indukowanego przez IFN, np. STAT1.
Zgodnie z wynalazkiem atenuwowane wirusy mogą być hodowane i izolowane z rekombinowanych linii komórkowych lub zwierząt, w szczególności ptaków, u których jeden lub więcej genów zasadniczych dla szlaku IFN, np. receptor interferonowy STAT1 itd., został przerwany, czyli jest wyłączony; zwierzęciem rekombinowanym może być każde zwierzę, włącznie z ptakiem, np. kurczak, indyk, kura, kaczka itd. (patrz np. Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12:415; Perry i inni 1993, Trasgenic Res. 2:125; Stern, CD. 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212:195-206; oraz Shuman, 1991, Experimentia 47: 897 w celu przeglądu dotyczącego wytwarzania ptaków transgenicznych, które załącza się w całości jako odniesienie). Taką linię komórkową lub zwierzę można wytworzyć każdą metodą znaną w technice, do przerywania genu na chromosomie komórki lub zwierzęcia. Takie techniki obejmują, lecz bez ograniczenia, mikroinjekcję do przedjądrzy (Hoppe i Wagner, 1989, opis patentowy US nr 4, 873,191); przenoszenie genu za pośrednictwem retrowirusa do linii zarodkowych (Van der Putten i inni, 1985, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 82:6148-6152); celowanie genowe w zarodkowych komórkach macierzystych (Thompson i inni, 1989, Cell 56:313); elektroporację zarodków (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803); oraz przenoszenie genu za pośrednictwem nasienia (Lavitrano i inni, 1989, Cell 57:717); itd. Dla przeglądu takich technik, patrz Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl.Rev. Cytol. 115:171, które załącza się w całości jako odniesienie.
W szczególności zwierzę z wyłączeniem STAT1 można wytworzyć przez pobudzenie rekombinacji homologicznej między genem STAT1 w jego chromosomie i egzogennym genem STAT1, który unieczynniono biologicznie (przykładowo przez insercję sekwencji heterologicznej, np. genu oporności antybiotykowej). Metody rekombinacji homologicznej do przerywania genów w genomie myszy opisano np. w Capecchi (1989, Science, 244:1288) i Mansour i inni (1988, Naturę 336:348).
W skrócie, całość lub część klonu genomowego STAT1 izoluje się z genomowego DNA z tego samego gatunku, jak komórka lub zwierzę z wyłączeniem. Klon genomowy STAT1 można izolować każdą metodą znaną w technice do izolacji klonów genomowych (np. przez sondowanie biblioteki genomowej sondą pochodzącą od sekwencji STAT1, taką jak sekwencje dostarczone do wglądu przez Meraz i innych 1996, Cell 84: 431; Durbin i innych 1996, Cell 84:443 i odniesienia tam cytowane). Po wyizolowaniu klonu genomowego, całość lub część klonu wprowadza się do rekombinowanego wektora. W pewnym przypadku część klonu wprowadzanego do wektora może zawierać co najmniej
PL 200 977 B1 część egzonu genu STAT1, czyli zawiera sekwencję kodującą białko STAT1. Następnie do egzonu genu STAT1 wprowadza się sekwencję niehomologiczną do sekwencji STAT1, dogodnie dodatni marker selekcyjny, taki jak gen kodujący oporność antybiotykową. Marker selekcji jest dogodnie operacyjnie związany z promotorem, dogodniej promotorem konstytutywnym.
Sekwencję niehomologiczną wprowadza się w dowolnym miejscu w sekwencji kodującej STAT1, które będzie przerywać aktywność STAT1, np. w pozycji, w której mutacje punktowe lub inne mutacje inaktywują, jak przedstawiono, działanie białka STAT1. Przykładowo, lecz bez ograniczenia, sekwencję niehomologiczną można wprowadzić do sekwencji kodującej część białka STAT1, zawierającą całość lub część domeny kinazy (np. sekwencji kodującej co najmniej 50, 100, 150, 200 lub 250 aminokwasów domeny kinazy).
Dodatnim markerem selekcyjnym jest dogodnie gen oporności neomycynowej (gen neo) lub gen oporności higromycynowej (gen hygro). Promotorem może być każdy promotor znany w technice; np. promotorem może być promotor kinazy fosfoglicerynianowej (PGK) (Adra i inny, 1987, Gene 60:65-74), promotor PollII (Soriano i inni, 1991 Cell 64:693-701) lub promotor MC1, który jest promotorem syntetycznym przeznaczonym do ekspresji w zarodkowych komórkach macierzystych (Thomas i Capecchi, 1987, Cell 51:503-512). Zastosowanie markera selekcyjnego, takiego jak gen oporności antybiotykowej pozwala na selekcję komórek, do których wprowadzono wektor celujący (np. ekspresja produktu genu neo nadaje oporność na G418, a ekspresja produktu genu hygro nadaje oporność na higromycynę).
W zalecanej postaci realizacji, ujemny marker selekcyjny dla etapu selekcji rekombinacji homologicznej wektora, w przeciwieństwie do niehomologicznej, wprowadza się na zewnątrz insertu klonu genomowego STAT1. Przykładowo, takim ujemnym markerem selekcyjnym jest gen kinazy tymidynowej HSV (HSV-tk), którego ekspresja uwrażliwia komórki na gancyklowir. Ujemny marker selekcyjny znajduje się dogodnie pod kontrolą promotora, takiego jak, lecz bez ograniczenia, promotor PGK, promotor PollII lub promotor MC1.
Gdy nastąpi rekombinacja homologiczna, części wektora, która są homologiczne do genu STAT1, jak również nie homologiczny insert wewnątrz sekwencji genu STAT1, wprowadza się do genu STAT1 w chromosomie, a pozostałość wektora traci się. Tak więc, ponieważ ujemny marker selekcyjny znajduje się na zewnątrz regionu homologii z genem STAT1, komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna (lub ich potomstwo), nie będą zawierać ujemnego markera selekcyjnego. Przykładowo, jeśli ujemnym markerem selekcyjnym jest gen HSV-tk, komórki w których zaszła rekombinacja homologiczna, nie będą wykazywały ekspresji kinazy tymidynowej i przeżyją ekspozycję na gancyklowir. Procedura ta pozwala na selekcję komórek, w których zaszła rekombinacja homologiczna w porównaniu z rekombinacją niehomologiczną, w której prawdopodobnie ujemny marker selekcyjny jest także wprowadzony do genomu razem z sekwencjami STAT1 i dodatnim markerem selekcyjnym. Zatem, komórki, w których zaszła rekombinacja niehomologiczną, będą najprawdopodobniej wykazywać ekspresję kinazy tymidynowej i będą wrażliwe na gancyklowir.
Po wytworzeniu wektora celującego, linearyzuje się go z użyciem enzymu restrykcyjnego, dla którego istnieje unikalne miejsce w wektorze celującym, i linearyzowany wektor wprowadza się do komórek macierzystych (ES) pochodzących z zarodka (Gossler i inni 1986, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065-9069) jakąkolwiek metodą znaną w technice, np. przez elektroporację. Jeśli wektor celujący zawiera dodatni marker selekcyjny oraz ujemny, marker selekcji przeciwnej, komórki ES, w których zaszłą rekombinacja homologiczna, można wyselekcjonować przez inkubację w pożywkach selekcyjnych. Przykładowo, jeśli markery selekcyjne są genem oporności neo i genem HSV-tk, komórki są eksponowane na G418 (np. około 300 ąg/ml) i gancyklowir (np. około 2 μΜ).
W celu potwierdzenia, że przerwane sekwencje STAT1 rekombinowały homologicznie do genu STAT1 w genomie komórek ES, można stosować dowolny sposób znany w technice, do genotypowania, przykładowo, lecz bez ograniczenia, analizę hybrydyzacji typu Southern blot lub reakcję łańcuchową polimerazy. Ze względu na to, że mapa restrykcyjna klonu genomowego STAT1 jest znana i znane są sekwencje kodujące sekwencję STAT1 (patrz Meraz i inni 1996, Cell 84: 431; Durbin i inni 1996, Cell 84: 443-450, wszystkie cytowane tam odniesienia), można określić wielkość poszczególnych fragmentów restrykcyjnych lub produktów powielania PCR wytworzonych z DNA zarówno od przerwanych, jak i nieprzerwanych alleli. Zatem, testując pod względem fragmentu restrykcyjnego lub produktu PCR, wielkość, o jaką różnią się przerwany i nieprzerwany gen STAT1, można określić czy zaszła rekombinacja homologiczna przerywająca gen STAT1.
PL 200 977 B1
Następnie, komórki ES z przerwanym lokus STAT1 można wprowadzić do blastocyst przez mikroinjekcję, a potem blastocysty można wszczepić do macic myszy w ciąży rzekomej, stosując rutynowe techniki. Zwierzę, które rozwinie się z wszczepionej blastocysty, jest chimeryczne pod względem przerwanego allelu. Chimeryczne samce można krzyżować z samicami, i taką krzyżówkę można tak zaplanować, aby transmisja linii zarodkowej allelu łączyła się z transmisją pewnej barwy powlekającej. Transmisję linii zarodkowej allelu można potwierdzić przez hybrydyzację typu Southern blot lub analizę PGR, jak opisano powyżej, genomowego DNA wyizolowanego z próbek tkanek.
5.3.3 Krótkotrwałe substraty z niedoborem IFN
Komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja, można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN. Związki, które hamują syntezę IFN, lub aktywność albo ekspresję składników układu IFN, można stosować do wstępnego traktowania IFN gospodarza, np. związki które hamują syntezę IFN, aktywność IFN, receptor IFN, inne cele w szlaku przenoszenia sygnału IFN, lub które hamują aktywność genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Przykładami związków, które można stosować są, lecz bez ograniczenia, cząsteczki kwasu nukleinowego, przeciwciała, peptydy, antagoniści receptora IFN, inhibitory szlaku STAT1, inhibitory PKR itd. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują cząsteczki antysensowne, rybozymy i cząsteczki o potrójnej helisie, które celują w geny, kodujące zasadnicze składniki układu IFN, np. STAT1. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują także nukleotydy kodujące dominujące mutanty ujemne składników układu IFN; np. przed infekcją mutantem wirusowym, komórki można transfekować DNA, kodującym skrócony mutant receptora IFN niekompetentny pod względem sygnału.
Dominujące mutanty ujemne, które można stosować do hamowania szlaku IFN, obejmują wersje z niedoborem kinazy Jak1, TyK2 lub czynniki transkrypcyjne STAT1 oraz STAT2 bez domen wiążących DNA (patrz np. Krishman i inni 1997, Eur.J.Biochem. 247:298-305).
5.4 Preparaty szczepionki
Preparaty szczepionek mogą zawierać atenuowane wirusy RNA o ujemnej nici o zaburzonej zdolności do antagonizacji komórkowej odpowiedzi IFN, w szczególności atenuowane wirusy grypy ze zmodyfikowanym genem NS1 oraz odpowiedni nośnik. Wirus stosowany w preparacie szczepionki można wybrać spośród naturalnie występujących mutantów lub odmian, wirusów mutagenizowanych lub genetycznie zmodyfikowanych. Szczepy atenuowane wirusów o segmentowanym RNA można także wytworzyć przez techniki reasortacji lub stosując połączenie technik podejścia genetyki odwrotnej i reasortacji. Naturalnie występujące odmiany obejmują wirusy wyizolowane z natury, jak również odmiany występujące spontanicznie, wytworzone podczas namnażania wirusa, o zaburzonej zdolności do antagonizacji odpowiedzi komórkowej IFN. Atenuowany wirus można stosować sam jako składnik aktywny w preparacie szczepionki. Alternatywnie, atenuowany wirus można stosować jako wektor lub „szkielet szczepionek wytworzonych w sposób rekombinowany. W tym celu można stosować techniki rekombinacji, takie jak odwrotna genetyka (lub dla wirusów segmentowanych, połączenia genetyki odwrotnej i technik reasortacji), aby skonstruować mutacje lub wprowadzić obce antygeny do atenuowanego wirusa stosowanego w preparacie szczepionki. W ten sposób można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów lub alternatywnie, przeciw całkiem innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym.
W rzeczywistości, w wirusy według wynalazku można wbudować dowolną sekwencję genu heterologicznego, do stosowania w szczepionkach. Dogodnie, epitopy, które indukują zabezpieczającą odpowiedź immunologiczną wobec każdego z różnych patogenów, lub antygeny, które wiążą przeciwciała neutralizujące, mogą podlegać ekspresji przez wirusy lub ich część. Przykładowo, heterologiczne sekwencje genowe, które można skonstruować w wirusach według wynalazku do stosowania w szczepionkach, obejmują, lecz bez ograniczenia, epitopy ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), takie jak gp120; antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg); glikoproteiny wirusa opryszczki (np. gD, gE); VP1 poliowirusa; determinanty antygenowe patogenów niewirusowych, takich jak bakterie i pasożyty. W innej postaci realizacji, może zachodzić ekspresja całości lub części genów immunoglobulin. Przykładowo, do wirusów według wynalazku można skonstruować regiony zmienne immunoglobulin antyidiotypowych, które naśladują takie epitopy. W jeszcze innej postaci realizacji, może zachodzić ekspresja antygenów związanych z nowotworem.
Można opracowywać albo żywe rekombinowane szczepionki wirusowe, albo inaktywowane rekombinowane szczepionki wirusowe. Żywe szczepionki mogą być zalecane, ponieważ namnożenie w gospodarzu prowadzi do przedłużonego działania bodźca podobnego rodzaju i natężenia w stosunku do bodźca występującego przy naturalnych infekcjach, a zatem nadaje zasadniczą, długotrwałą
PL 200 977 B1 odporność. Wytwarzanie takich żywych rekombinowanych preparatów szczepionek wirusowych, można osiągnąć przez użycie konwencjonalnych metod obejmujących namnożenie wirusa w hodowli komórkowej lub omoczni zarodków kurzych, a następnie oczyszczenie.
Preparaty szczepionki mogą zawierać genetycznie zmodyfikowane wirusy RNA o ujemnej nici, które mają mutacje w genie NS1, włączając, lecz bez ograniczenia, mutanty grypy o skróconym NS1 opisane w poniższych przykładach. Po opracowaniu w postaci żywej szczepionki wirusowej, powinno się stosować zakres wynoszący około 104 pfu do około 5x106 pfu na dawkę.
Do wprowadzania preparatu szczepionki opisanej powyżej można stosować wiele metod, obejmują one lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przeskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Zalecane jest wprowadzanie preparatu szczepionki wirusowej poprzez naturalną drogę zakażenia patogenem, dla którego przeznaczona jest szczepionka, lub poprzez naturalną drogę zakażenia rodzicielskiego wirusa atenuowanego. Przy stosowaniu preparatu żywej szczepionki wirusowej, zalecane jest wprowadzenie preparatu poprzez naturalną drogę infekcji wirusem grypy. Dogodnie, można wykorzystać zdolność wirusa grypy do indukcji energicznej komórkowej odpowiedzi wydzielniczej i odpornościowej. Przykładowo, zakażenie dróg oddechowych wirusami grypy może indukować silną wydzielniczą odpowiedź immunologiczną, np. w układzie moczopłciowym, przy współistniejącym zabezpieczeniu przed szczególnymi czynnikami powodującymi chorobę.
Szczepionka według wynalazku może zawierać 104-5x106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN i można podać ją jednorazowo. Ewentualnie tego rodzaju szczepionkę można podawać dwukrotnie lub trzykrotnie, z przerwą od 2 do 6 miesięcy. Ewentualnie, szczepionkę według wynalazku, zawierającą 104-5x106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN można podawać tak często jak potrzeba, zwierzęciu, korzystnie ssakowi, a korzystniej człowiekowi.
5.5 Kompozycje farmaceutyczne
Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać zmutowane wirusy o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, w szczególności atenuowane wirusy grypy ze zmodyfikowanym genem NS1 i mogą być stosowane jako środki antywirusowe lub środki przeciwnowotworowe, lub jako środki przeciw chorobom, które można leczyć przy użyciu IFN. Kompozycje farmaceutyczne mogą być one zastosowane profilaktycznie przeciwwirusowo i można je podawać osobnikom zagrożonym zakażeniem lub którzy będą poddani ekspozycji na wirusa. Przykładowo, w przypadku dziecka wracającego do domu ze szkoły, w której kontaktowało się ono z kilkoma kolegami zarażonymi wirusem rodzice mogą podać antywirusową kompozycję farmaceutyczną sobie, dziecku i innym członkom rodziny, w celu zapobiegnięcia infekcji wirusowej i późniejszej chorobie. Leczeni mogą być także ludzie podróżujący do części świata, gdzie powszechne są pewne choroby zakaźne (np. wirus zapalenia wątroby typu A, malaria itd.).
Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne można stosować do leczenia nowotworów lub zapobiegania tworzenia nowotworu, np. u pacjentów, którzy mają raka lub u których istnieje wysokie ryzyko rozwinięcia nowotworu lub raka. Przykładowo, pacjenci z rakiem mogą być leczeni w celu zapobiegania dalszemu tworzeniu się nowotworu. Alternatywnie, leczone mogą być osoby, które są poddane lub mogą być poddane ekspozycji wobec substancji rakotwórczych; leczone mogą być osoby związane z oczyszczaniem środowiska, które mogą się stykać z zanieczyszczeniami (np. azbestem). Alternatywnie, osoby, które mają być poddane ekspozycji wobec promieniowania, można leczyć przed ekspozycją i po niej (np. pacjenci poddawani ekspozycji na wysokie dawki promieniowania lub którzy muszą brać leki rakotwórcze).
Zastosowanie atenuowanych wirusów według wynalazku jako środków przeciwnowotworowych opiera się na stwierdzeniu twórców wynalazku, że atenuowany mutant wirusa grypy z delecją w genie antagonizującym IFN, jest zdolny do zmniejszania tworzenia nowotworu u myszy. Tego rodzaju właściwości przeciwnowotworowe mogą być co najmniej częściowo związane z ich zdolnością do wzrostu w komórkach nowotworowych i zabijania ich, o których wiadomo, że wiele z nich ma niedobory w układzie IFN. Bez względu na mechanizm (mechanizmy) molekularne odpowiedzialne za właściwości przeciwnowotworowe, atenuowane wirusy według wynalazku można stosować do leczenia nowotworów lub do zapobiegania tworzeniu nowotworów.
Zmutowane wirusy o zmienionym fenotypie antagonistycznym wobec IFN mogą być ukierunkowane na konkretne narządy, tkanki i/lub komórki w organizmie, w celu indukcji miejscowego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Zaletą takiego podejścia jest to, że takie wirusy indukujące IFN są ukierunkowane na konkretne miejsca, np. lokalizacji nowotworu celem indukcji IFN w sposób miejPL 200 977 B1 scowo-specyficzny, raczej dla efektu terapeutycznego niż układowej indukcji IFN, która może mieć skutki toksyczne.
Zmutowane wirusy indukujące IFN według wynalazku można skonstruować stosując metody tu opisane do ekspresji białek lub peptydów, które nakierowywałyby wirusy do poszczególnych miejsc. W specyficznej postaci realizacji, wirusy indukujące IFN, mogą być ukierunkowane na nowotwory. W takiej postaci realizacji można zmodyfikować zmutowane wirusy tak, aby wykazywały ekspresję miejsca łączenia antygenu z przeciwciałem, które rozpoznaje antygen specyficzny dla nowotworu, kierując w ten sposób wirus indukujący IFN do nowotworu. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy nowotwór wykazuje ekspresję receptora hormonu, tak jak guzy sutka lub jajnika, które wykazują ekspresję receptorów estrogenowych, wirus indukujący IFN, można tak zmodyfikować, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego hormonu. W jeszcze innej postaci realizacji, jeśli docelowy nowotwór wykazuje ekspresję receptora czynnika wzrostu, np. VEGF, EGF lub PDGF, wirus indukujący IFN, można tak zmodyfikować, aby wykazywał ekspresję odpowiedniego czynnika wzrostu lub jego części. Zatem, wirusy indukujące IFN można tak zmodyfikować, aby wykazywały ekspresję każdego docelowego produktu genowego, włączając peptydy, białka, takie jak enzymy, hormony, czynniki wzrostu, antygeny lub przeciwciała, które będą ukierunkowywać wirus na miejsce potrzebujące aktywności antywirusowej, antybakteryjnej, antydrobnoustrojowej lub antynowotworowej.
Sposoby wprowadzania obejmują, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przezskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można podawać jakąkolwiek dogodną drogą, np. przez infuzję lub iniekcję w jednej dużej dawce, przez absorpcję przez nabłonek lub śluzówkę (np. śluzówkę jamy ustnej, odbytu i jelita, itd.), oraz można je podawać razem z innymi czynnikami biologicznie aktywnymi. Podawanie może być układowe lub miejscowe. Oprócz tego, w specyficznej postaci realizacji może być pożądane wprowadzanie kompozycji farmaceutycznych według wynalazku do płuc, każdą odpowiednią drogą. Podawanie dopłucne można także wykorzystać np. stosując inhalator lub nebulizator oraz preparat ze środkiem aerozolowym.
W specyficznej postaci realizacji może być pożądane podawanie kompozycji farmaceutycznych według wynalazku miejscowo do obszaru wymagającego leczenia; można to osiągnąć przykładowo przez infuzję miejscową podczas operacji, nałożenie na powierzchnię, np. w połączeniu z opatrunkiem na ranę po operacji, przez iniekcję, za pomocą cewnika, za pomocą czopka, lub za pomocą implantu, przy czym wymieniony implant może być materiałem porowatym, nieporowatym lub żelowym, włączając błony, takie jak błony sialastyczne lub włókna. W jednej postaci realizacji, podawanie może następować przez bezpośrednią iniekcję w miejscu (lub poprzednim miejscu) guza złośliwego lub nowotworowego lub tkanki przednowotworowej. W jeszcze innej postaci realizacji, kompozycję farmaceutyczną można dostarczać w układzie kontrolowanego uwalniania. W jednej postaci realizacji można stosować pompę (patrz Langer jak wyżej; Sefton, 1987 CRC Crit, Ref. Biomed.Eng. 14:201; Buchwalf i inni, 1980, Surgery 88: 507; Saudek i inni, 1989, N.Engl.J.Med. 321:574). W innej postaci realizacji, można stosować materiały polimeryczne (patrz Medical Applications of Controlled Release Langer i Wise (wydawcy), CRC Press., Boca Raton, Floryda (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen i Bali (wydawcy), Wiley, Nowy Jork (1984); Ranger i Peppas, 1983, J.Macromol.Sci.Rev. Macromol.Chem. 23:61; patrz także Levy i inni, 1985, Science, 228:190; During i inni, 1989, Ann.Neurol. 25:351 (1989(; Howard i inni, 1989, J.Neurosurg. 71:105). W jeszcze innej postaci realizacji, układ kontrolowanego uwalniania można umieścić w pobliżu miejsca docelowego kompozycji, czyli płuca, co wymaga podania jedynie frakcji dawki układowej (patrz np. Goodson, 1984, w Medical Application of Controlled Release, jak wyżej, tom 2, strony 115-138). Inne układy kontrolowanego uwalniania omówiono w przeglądzie Langera (1990, Science, 249:1527-1533).
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować terapeutycznie skuteczną ilość atenuowanego wirusa oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W konkretnej postaci realizacji określenie „farmaceutycznie dopuszczalny oznacza zaakceptowany przez federalną lub rządową agencję prawodawczą, lub wymieniony w Farmakopei amerykańskiej, albo innej generalnie uznawanej farmakopei do stosowania u zwierząt, a szczególnie u ludzi. Określenie „nośnik odnosi się do rozcieńczalnika, adiuwanta, zarobki lub podłoża, z którym podaje się kompozycję farmaceutyczną. Jako nośniki płynne można wykorzystać także roztwory soli i wodne roztwory dekstrozy i glicerolu, szczególnie do roztworów do wstrzyknięć. Odpowiednimi zarobkami farmaceutycznymi są skrobia, glukoza, laktoza, sacharoza, żelatyna, słód, ryż, mąka, kreda, żel krzemionkowy, stearynian sodowy, monostearynian glicerolu, talk, chlorek sodu, sproszkowane mleko odtłuszczone, glicerol, glikol propy18
PL 200 977 B1 lenowy, woda, etanol i temu podobne. Kompozycje te mogą przybierać postać roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, preparatów do opóźnionego uwalniania i temu podobnych. Kompozycje te można opracowywać w postaci czopków. Preparaty doustne mogą obejmować standardowe nośniki, takie jak farmaceutycznej czystości mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodowa sacharozy, celuloza, węglan magnezu, itd. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych opisano w „Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martina. Takie kompozycje będą zawierały terapeutycznie skuteczną ilość środka terapeutycznego, dogodnie w postaci oczyszczonej, razem z odpowiednią ilością nośnika, tak aby zapewnić postać do odpowiedniego podawania pacjentowi. Preparat powinien pasować do sposobu podawania.
Ilość kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, która będzie skuteczna w leczeniu poszczególnych schorzeń lub stanów, będzie zależeć od charakteru schorzenia lub stanu i można ją określić standardowymi technikami klinicznymi. Oprócz tego można ewentualnie wykorzystać testy in vitro, pomocne w identyfikacji optymalnych zakresów dawkowania. Dokładna dawka do wykorzystania w preparacie, będzie zależeć także od drogi podawania i ciężkości choroby lub schorzenia, i powinna być określona zgodnie z oceną lekarza oraz stanem każdego pacjenta. Jednakże odpowiednie zakresy dawkowania do podawania, wynoszą generalnie około 104-5x106 pfu i można je podawać raz lub wiele razy, z przerwami tak częstymi jak potrzeba. Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku, zawierające 104-5x106 pfu zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, można podawać donosowo, dotchawicznie, domięśniowo lub podskórnie. Skuteczne dawki można ekstrapolować z krzywych odpowiedzi na dawkę otrzymanych z układów testowych in vitro lub modelu zwierzęcego.
6. Przykład: Wytwarzanie i charakteryzacją mutantów o skróconym NS1 wirusa grypy typu A
6.1 Materiały i metody
Wirus grypy A/PR/8/34 (PR8) namnożono w 10-dniowych jajach kurzych z zarodkami w temperaturze 37°C. Wirus grypy A 25A-1, wirus reasortant, zawierający segment NS od przystosowanego do zimna szczepu A/Leningrad/134/47/57 i pozostałych genach z wirusa PR8 (Egorov i inni 1994, Vopr.Virusol. 39:201-205; Shaw i inni 1996,w Options of control of influenza III, wydawca Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) strony 433-436) hodowano w komórkach Vero w temperaturze 34°C. Wirus 25A-1 jest wrażliwy na temperaturę w komórkach ssaków i użyto go jako wirusa pomocniczego do uzyskania transfektanta wirusa NS1/99. Komórki Vero i komórki MDCK utrzymywane w minimalnej pożywce podstawowej (MEM), zawierającej 1 ng/ml trypsyny (Difco Laboratories, Detrcid, Michigan) użyto do hodowli wirusa grypy. Komórki Vero użyto także do selekcji, oczyszczania łysinek i mianowania wirusa NS1/99. Komórki MDCK utrzymywano w DMEM (minimalna pożywka podstawowa Dulbecco), zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą inaktywowaną gorącem. Komórki Vero hodowano w pożywce AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
W następujący sposób skonstruowano plazmid pT3NS1/99, który zawiera 99 aminokwasów ze skróceniem C-terminalnym NS1. Po pierwsze, pUC19-T3/NS PR3, zawierający kompletny gen NS z wirusa PR8 oskrzydlony przez promotor polimerazy RNA T2 oraz miejsce restrykcyjne BpuAI, powielono przez odwrotną PGR (Ochman i inni, 1998, Genetics 120:621-623) stosując odpowiednie startery. Otrzymany cDNA, zawierający w ten sposób skrócony gen NS1 poddano fosforylacji, traktowano polimerazą Klenową, poddano samoligacji i namnożono w szczepie TG1 E.coli. Konstrukcję otrzymaną po oczyszczeniu nazwano pT3NSl/99 i zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Plazmidy ekspresyjne białek NP, PB1, PB2 i PA wirusa PR8 (pHMG-NP, pHMG-PBl, pHMG-PB2 i pHMG-PA) opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J.Virol. 70: 4188-4192). Wykonano pPOLI-NS-RB przez substytucję otwartej ramki odczytu CAT pPOLl-NS-RT (Pleschka i inni, 1996, J.Virol. 70: 4188-4192) wewnątrz produkt RT-PCR otrzymanego od regionu kodującego genu NS wirusa grypy A/WSN/33 (WSN). Plazmid ten wykazuje ekspresję specyficznych dla NS segmentów RNA wirusa WSN pod kontrolą skróconego ludzkiego promotora polimerazy I.
Wytwarzanie wirusa NS1/99 przeprowadzono przez transfekcję rybonukleoproteiny (RNP)(Luythes i inni, 1989, Cell 59:1107-1113). RNP utworzono przez transkrypcję polimerazy RNA T3 z pT3NS1/99 linearyzowanego BpuAI w obecności oczyszczonej nukleoproteiny i polimerazy wirusa grypy 25A-1 (Enami i inni, 1991, J.Virol. 65:2711-2713). Kompleksy RNP transfekowano do komórek Vero, które wcześniej zakażono wirusem 25A-1. Transfekowane komórki inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C i supernatant pasażowano dwukrotnie w komórkach Vero w temperaturze 40°C i oczyszczono łysinki trzykrotnie w komórkach Vero pokrytych nadlewką agarową w temperaturze 37°C. Wyizolowany wirus NS1/99 analizowano przez RT-PCR stosując specyficzne startery.
PL 200 977 B1
Wirus transfekcyjny dzikiego typu transfekowano plazmidami pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA i pPOLI-NS-RB, jak opisano wcześniej (Pleschka i inni, 1996, J.Virol. 70: 4188-4192). Dwa dni po transfekcji, komórki zakażono 5x104 pfu wirusa delNS1 i inkubowano jeszcze dwa dni w temperaturze 37°C. Supernatant komórkowy pasażowano raz w komórkach MDCK i dwukrotnie w jajach kurzych z zarodkami. Wirusy transfekcyjne klonowano przez ograniczenie rozcieńczania w jajach. Genomowy RNA z oczyszczonego wirusa transfekcyjnego NS1/99 analizowano przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym, jak opisano poprzednio (Zheng i inni, 1996, Virology, 217:242-251). Ekspresję skróconego białka NS1 przez wirus NS1/99 weryfikowano przez immunoprecypitację znakowanych zakażonych ekstraktów komórkowych, przy użyciu króliczych poliklonalnych surowic odpornościowych przeciwko NS1.
Jamę omoczniową jaj kurzych z zarodkami w wieku 6, 10 i 14 dni, zaszczepiono około 103 pfu wirusów PR8, NS1/99 lub delNS1 (z delecją całego genu NS1), inkubowano w temperaturze 37°C przez dwa dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA).
Grupy 5 myszy BALB/c (Taconic Farms) zaszczepiono donosowo 5x106 pfu lub 5x5x103 pfu wirusa dzikiego typu A/PR/8/34 (PR8) lub NS1/99. Szczepienie przeprowadzono w znieczuleniu przy użyciu 50 μΙ MEM, zawierającej odpowiednią ilość jednostek tworzących łysinkę odpowiedniego wirusa. Zwierzęta monitorowano cały dzień i uśmiercono po zakończeniu obserwacji. W następnym doświadczeniu, wszystkie myszy które przeżyły sprowokowano cztery tygodnie później dawką 100 LD50 wirusa PR8 dzikiego typu. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki i używania zwierząt laboratoryjnych.
6.2 Wyniki: atenuacja wirusów grypy A przez delecje NS1
Twórcy wynalazku pokazali poprzednio, że wirus grypy A z delecją genu NS1 (wirus delNS1) jest zdolny do wzrostu do mian wynoszących około 107 pfu/ml w komórkach z niedoborem wytwarzania interferonu typu I (IFN), takich jak komórki Vero. Jednakże, wirus ten miał zaburzoną zdolność do replikacji i powodował chorobę u myszy (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology, 252:324). Dla kontrastu, wirus delNS1 był zdolny do wzrostu i zabijał myszy STAT1-/-. Wyniki ten pokazały, że białko NS1 wirusa grypy A jest czynnikiem wirulencji związanym z inhibicją odpowiedzi antywirusowych u gospodarza, za pośrednictwem IFN typu I. Przeprowadzono następujące doświadczenia w celu określenia czy można wytworzyć wirusy grypy z cechami wirulencji pośredniej między wirusami typu dzikiego i delNS1, przez delecję części genu NS1, i czy niektóre z tych wirusów mogłyby posiadać optymalne cechy do stosowania jako żywe atenuowane szczepionki przeciw wirusom grypy, czyli stabilność i odpowiednią równowagę między atenuacją, immunogennością i wzrostem w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek, takich jak jaja kurze z zarodkami.
W celu przetestowania tej hipotezy, wytworzono wirus grypy A/PR/8/34 (PR8), w którym modyfikowano gen NS1 w celu pokierowania ekspresją skróconego białka NS1, zawierającego tylko 99 aminokwasów przy końcu aminowym, wspólnie z 230 aminokwasami białka NS1 dzikiego typu. Wirus ten (NS1-99) otrzymano przez transfekcję RNP sztucznie zbudowanego genu NS przy użyciu wirusa pomocniczego 25A-1, jaki opisano poprzednio (Garcia-Sastre i inni, 1998, Virology, 252:324). Analiza ekspresji NS1 w komórkach zakażonych wirusem, ujawniła skrócony charakter białka NS1 wirusa NS1-99.
Analizowano zdolność wirusów delNS1, NS1-99 i PR8 dzikiego typu, do wzrostu w jajach kurzych z zarodkami w różnym wieku. Przesłanki dla tego doświadczenia pochodzą z faktu, że zdolność zarodków kurzych do syntetyzowania i odpowiedzi na IFN typu I w warunkach odpowiedniego bodźca, jest zależna od wieku. W rzeczywistości, zarówno możliwość indukowania IFN jak i odpowiedź, zaczyna się w wieku około 10 dni, a potem wyraźnie rośnie z wiekiem (Sekellick i inni 1990, In Vitro Cell Dev. Biol. 26:997; Sekellick i inni 1985, J.Interferon Res. 5: 657). Tak więc, stosowanie jaj w różnym wieku przedstawia unikalny system do testowania zdolności różnych wirusów do hamowania odpowiedzi IFN. Jaja w wteku 6 10 i 14 drn zaszczepiono okoto 103 pfu wirusów PR8, NS1- lub delNS1, inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test hemaglutynacji (HA). Jak ukazano w tabeli 3, podczas gdy wirus dzikiego typu rósł do podobnych mian HA w jajach z zarodkami 6, 10 i 14-dniowymi, delNS1 replikował do wykrywalnego miana HA tylko w jajach 6-dniowych. Dla kontrastu, wirus NS1-99 wykazywał zachowanie pośrednie między wirusami delNS1 i dzikiego typu, i był zdolny do wzrostu do mian HA podobnych do wirusa dzikiego typu w jajach 10-dniowych, lecz nie w jajach 14-dniowych.
PL 200 977 B1
T a b e l a 3: Replikacja wirusa w jajach kurzych z zarodkami.
Miano hemaglutynacji1
Wirus
Wiek jaj: 6 dni 10 dni 14 dni
WT PR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 N.D.3 2,048 <2
delNS1 64 <2 <2
Miana reprezentują najwyższe rozcieńczenie z aktywnością hemaglutynacji.
2 Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu 3 Nie określono.
Cechy atenuacji wirusa NS1-99 określono następnie u myszy. Do tego celu, grupy 5 myszy BALB/c zakażono donosowo 5x106 pfu, 1, 5x105 pfu lub 1, 5x103 pfu wirusa PR8 dzikiego typu lub NS1-99. Następnie myszy monitorowano przez 3 tygodnie pod względem przeżycia. Wyniki podano w tabeli 4. Wirus NS1-99 miał LD50 co najmniej trzy logarytmy wyższe od wirusa dzikiego typu.
T a b e l a 4: Atenuacja wirusa NS1-99 u myszy
Myszy, które przeżyły
Wirus 653
Dawka zakażająca (pfu): 5x10b 1 , 5x15s 1 , 5x10
WT PR81 //5 15 15
NS1-99 3/5 55 55 1 Wirus grypy A/PR/8/34 dzikiego typu.
7. Przykład: Wytwarzanie i charakteryzacja mutantów wirusa grypy typu B o skróconym NSl
7.1. Materiały i metody
Szczegóły doświadczalne są podobne do tych z sekcji 6.1. Dwa zmutowane wirusy grypy B B/610B5B/201 (B/201) oraz B/AWBY-234, o długości 127 aminokwasów i 90 aminokwasów (skrócone białka C-terminalne NS1), odpowiednio (Norton i inni, 1987 Virology 156:204; Tobita i inni 1990 Virology 174:314) otrzymano z doświadczeń koinfekcji w hodowli tkankowej, obejmującej wirusy B/Yamagata/1/73 (B/Yam) oraz A/Aichi/2/68, w obecności wirusa przeciwciała anty-A (H3N2). Wzrost zmutowanych wirusów grypy w jajach z zarodkami w różnym wieku, porównano z wirusem rodzicielskim B/Yam, który posiada dzikiego typu białko NS1 o 281 aminokwasach. Jaja w wieku 6, 10 i 14 dni zaszczepiono około 103 pfu wirusów B/Yam, B/201 lub B/AWBY-234, inkubowano w temperaturze 35°C przez 2 dni i wirusy obecne w płynie omoczniowym mianowano przez test HA.
Dodatkowo określono cechy atenuacji wirusów B/201 i B/AWBY-234 u myszy. Grupy trzech myszy BALB/c zakażono donosowo 3x105 pfu dzikiego typu B/Yam lub zmutowanymi wirusami B/201 i B/AWBY/234 i określono zdolność tych wirusów do replikacji, przez pomiar mian wirusów w płucach w 3 dniu po infekcji, ponieważ dzikiego typu B/Yam nie indukuje widocznych oznak choroby u myszy.
7.2 Wyniki
T a b e l a 5: Replikacja wirusa grypy typu B w jajach z zarodkami kurzymi.
Miano hemaglutynacji
Wirus
Wiek jaj: 6 dni 10 dni 14 dni
B/Yam 362 256 <2
B/201 32 <2 <2
B/AWBY-234 8 <2 <2
Wyniki wzrostu wirusów zmutowanych i dzikiego typu grypy typu B w jajach kurzych z zarodkami, ukazane w tabeli 5, pokazują, że jak w przypadku wirusów grypy A, karboksyterminalne skrócenie NS1 wirusa grypy B, jest odpowiedzialne za niższe wydajności replikacji w starszych jajach kurzych z zarodkami, ze skuteczną odpowiedzią IFN. Wskazuje to, że NS1 wirusa grypy B jest także związany z inhibicją odpowiedzi IFN u gospodarza, oraz że delecje w genie NS1 wirusa grypy B powodują fenotyp atenuowany.
PL 200 977 B1
Wyniki z doświadczeń replikacji u myszy podano w tabeli 6. Miana wirusowe B/201 i B/AWBY-234 były około trzy logarytmy niższe niż miana B/Yam, wskazując, że skrócenie domeny karboksyterminalnej NS1 wirusa grypy B odpowiada za fenotyp atenuowany u myszy.
T a b e l a 6. Replikacja wirusa grypy typu B w płucach myszy Wirus Miana w płucu w 3 dniu po infekcji (pfu/płuco)
B/Yam 2χ103 1χ104 3χ10'
B/201 30 <10 60
B/AWBY-234 <10 40 <10
8. Zabezpieczenie przed i nfekcją wirusem grypy dzikiego typu u myszy immunizowanych wirusami grypy typu A i B, z delecjami w białkach NS1
W celu określenia czy myszy immunizowane atenuowanymi wirusami grypy typu A i B, zawierającymi skrócone białka NS1, były zabezpieczone przed prowokacją odpowiednikami tych wirusów, ale dzikiego typu, przeprowadzono następujące doświadczenie. Myszy BALB/c immunizowano donosowo wirusem A/NS1-99 i trzy tygodnie później zakażono je 100 LD5o wirusem grypy A/PR/8/34 dzikiego typu. Immunizowane zwierzęta były zabezpieczone przed śmiercią, podczas gdy wszystkie kontrolne nietraktowane myszy padły po prowokacji (patrz tabela 7). W drugim doświadczeniu myszy BALB/c immunizowano donosowo wirusami grypy typu B B/201 lub B/AWBY-234, wykazującymi ekspresję skróconego białka NS1. Trzy tygodnie później myszy sprowokowano 3x105 pfu wirusa B/Yam/1/73 dzikiego typu. Ponieważ ten szczep wirusa grypy B nie indukuje objawów choroby u myszy, stopień zabezpieczenia określono przez pomiar mian wirusa w płucu w 3 dniu po prowokacji. Podczas gdy nietraktowane zwierzęta kontrolne miały miana około 104 pfu/płuco, nie wykryto wirusów w płucach zwierząt immunizowanych (patrz tabela 8). Sugeruje to, że wirusy grypy A, jak również grypy B, zawierające zmodyfikowane geny NS1 były zdolne do indukcji odpowiedzi odpornościowej u myszy, które są w pełni zabezpieczone przed późniejszą prowokacją wirusem dzikiego typu.
T a b e l a 7. Przeżycie myszy immunizowanych wirusem grypy A/NS1-99 po prowokacji 100 LD50 wirusa grypy A/PR/8/34 dzikiego typu.
Dawka immunizująca wirusa A/NS1-99 Liczba myszytktóre przeżyły/Całość
5χ106 pfu 3/3
1,5χ105 pfu 4/4
PBS 0/5
T a b e l a 8. Miana w płucu u myszy immunizowanych wirusami B/201 i B/AWBY-234 po prowokacji 3x105 pfu wirusa grypy B/Yamagata/73 dzikiego typu.
Dawka immunizująca Miana w płucu (ρ^ι/ρ^οο)
3χ105 pfu B/201 <101 t <101 t <101 t <101 t <101,
3χ105 pfu B/AWBY-234 <101 t <101 t <101 t <101 t <101,
PBS 2,5x104t 1x104 t 1,7x0O4t 3x0O4 t 5x10''
9. Przykład: indukcja interferonu typu I w jajach z zarodkami zakażonymi wirusem delNS1 Następnie określono zdolność wirusa delNS1, wirusa grypy A bez genu NS1, do indukcji sekrecji IFN typu I w jajach z kurzych zarodkami. Do tego celu, grupy dwóch 10-dniowych jaj kurzych z zarodkami zakażono 5x103 pfu wirusów delNS1 i dzikiego typu PR8. Osiemnaście godzin po inkubacji w temperaturze 37°C zebrano płyn omoczniowy i dializowano wobec kwasowego pH przez noc, aby inaktywować zakaźne wirusy. Po traktowaniu kwasowym pH, próbki dializowano wobec PBS i testowano pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przeciw infekcji VSV (około 200 pfu w komórkach CEF). Wyniki ukazane w tabeli 9 wskazują, że przy nieobecności NS1, wirusy grypy A są lepszymi induktorami IFN.
PL 200 977 B1
T a b e l a 9. Indukcja IFN w jajach.
Wirus IFN (U/ml)
PR8 <16, <16
delNS1 400, 400
pusta <16, <16
10. Przykład: Aktywność antywirusowa wirusa delNSI
Eliminacja genu antagonizmu IFN (NS1) z wirusa grypy A może powodować zdolność tego wirusa do indukcji wysokich poziomów IFN. Jeśli ma to miejsce w tym przypadku, wirus delNS1 będzie „zakłócał replikację wirusów wrażliwych na IFN. Aby przetestować tę możliwość, twórcy wynalazku prześledzili zdolność wirusa delNS1 do inhibicji replikacji wirusa grypy A/WSN/33 (WSN), powszechnie stosowanego szczepu laboratoryjnego wirusa grypy, w jajach. Jak widać w fig. 1, traktowanie tylko pfu wirusa delNS1 spowodowało redukcję ostatecznych mian wirusa WSN w płynie omoczniowym o jeden logarytm. Oprócz tego, traktowanie 2x104 pfu wirusa delNS1 spowodowało praktycznie kompletne ograniczenie replikacji WSN w jajach. Wirus delNS1 był także zdolny do zakłócania replikacji w jajach innych szczepów wirusa grypy typu A (H1N1 i H3N2), wirusa grypy typu B oraz innych wirusów, takich jak wirus Sendai (fig. 2).
Twórcy wynalazku określili następnie zdolność wirusa delNS1 do zakłócania replikacji wirusa grypy dzikiego typu u myszy. Mimo, że traktowanie IFN typu I hodowli tkankowej zapobiega replikacji in vitro wirusa grypy typu A, traktowanie myszy IFN nie jest w stanie zahamować replikacji wirusów grypy (Haller 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25052). Jest to prawda dla większości wsobnych szczepów myszy, z wyjątkiem myszy A2G. Myszy A2G, jak również znaczny udział dzikich myszy (około 75%) zawierały co najmniej jeden nieuszkodzony allel Mx1, podczas gdy większość szczepów laboratoryjnych było Mx1-/- (Haller, 1986 Current Top Microbiol Immunol 127:331-337). Białko Mx1, które jest homologiem ludzkiego białka MxA (Aebi 1989, Mol.Cell.Biol. 11:5062) jest silnym inhibitorem replikacji wirusa grypy (Haller 1980, Nature, 283:660). Białko to nie ulega konstytutywnej ekspresji, lecz jego ekspresja jest indukowana transkrypcyjnie przez IFN typu I. Tak więc, myszy A2G można użyć do testowania zdolności induktorów IFN do stymulacji odpowiedzi antywirusowej przeciwko wirusom grypy A (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25052).
Zgłaszający zakazili donosowo osiem 4-tygodniowych myszy A2G 5x106 pfu wysoko patogennego izolatu wirusowego A/PR/8/34 (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25052). Połowa myszy otrzymała donosowe leczenie 5x106 pfu delNS1 24 godziny przed infekcją PR8. Inne cztery myszy były traktowane PBS. Monitorowano zmiany masy ciała i przeżycie. Wyniki te pokazują, że traktowanie delNS1 umożliwiło zabezpieczenie myszy A2G przed śmiercią indukowaną wirusem grypy i utratą masy ciała. Takie samo traktowanie było nieskuteczne u myszy Mx1-/- wskazując, że w mechanizmie zabezpieczenia przed wirusem pośredniczył Mx1, czyli IFN.
11. Przykład: Właściwości przeciwnowotworowe wirusa delNS1 u myszy
Ze względu na to, że IFN typu I i/lub induktory IFN typu I okazały się posiadać aktywność przeciwnowotworową (Belardelli i Gresser, 1996, Immunology Today 17: 369-372; Qin i inni, 1998, Proc.Natl.Acad.Sci.95: 14411-14416) jest prawdopodobne, że traktowanie nowotworów wirusem delNS1 mogłoby pośredniczyć w regresji nowotworu. Alternatywnie, wirus delNS1 mógłby mieć właściwości onkolityczne, czyli mógłby być zdolny do specyficznego wzrostu i zabijania komórek nowotworowych, z których o wielu wiadomo, że posiadają niedobory układu IFN. Aby przetestować aktywność przeciwnowotworową wirusa delNS1, przeprowadzono następujące doświadczenie, przy użyciu mysiej linii komórkowej mięsaka CT26.WT w mysim nowotworowym modelu przerzutowania do płuc (Restifo i inni, 1998 Virology 249:89-97) 5x105 komórek CT26.wr wstrzyknięto dożylNe ^wunaskj 6-tygodniowym myszom BALB/c. Połowę z tych myszy traktowano donosowo 106 pfu wirusa delNS1 co 24 godziny w dniach 1,2 i 3 po zaszczepieniu. Dwanaście dni po wstrzyknięciu nowotworu, myszy uśmiercono i obliczono przerzuty płucne. Jak ukazano w tabeli 10, traktowanie delNS1 spowodowało istotną regresję mysich przerzutów płucnych.
PL 200 977 B1
T a b e l a 10. Aktywność przeciwnowotworowa wirusa delNSI u myszy BALB/c, którym wstrzyknięto komórki nowotworu CT26.WT.
Liczba przerzutów płucnych
Traktowanych PBS Traktowanych delNS1
Mysz 1 >250 120
Mysz 2 >250 28
Mysz 3 >250 9
Mysz 4 >250 6
Mysz 5 >250 2
Mysz 6 >250 1
12. Przykład: Białko NS1 hamuje translokację IFR-3 podczas infekcji wirusem grypy
Wyniki tu opisane sugerują, że białko NS1 wirusa grypy jest odpowiedzialne za inhibicję odpowiedzi IFN typu I przeciwko wirusowi, oraz że mutacje/delecje w tym białku powodują atenuację wirusów w związku ze wzmocnieniem odpowiedzi IFN typu I podczas infekcji. Wiadomo, że synteza IFN typu I podczas infekcji wirusowej może być stymulowana przez dwuniciowy RNA (dsRNA). IRF-3 jest czynnikiem transkrypcji, który zazwyczaj znajduje się w formie nieaktywnej w cytoplazmie komórek ssaków. Dwuniciowy RNA indukuje fosforylację (aktywację) czynnika transkrypcyjnego IRF-3 powodując jego translokację do jądra, gdzie indukuje transkrypcji specyficznych genów, włączając geny kodujące IFN typu I (Weaver i inni, 1998, Mol.Cell.Biol. 18:1359). Aby określić czy NS1 grypy działa na IRF-3, monitorowano lokalizację IRF-3 w komórkach CVI zakażonych dzikiego typu PR8 lub wirusem grypy A delNS1. Figura 3 ukazuje, że translokacja IRF-3 jest minimalna w komórkach zakażonych PR8 (w ponad 10% komórek). Przeciwnie, około 90% komórek zakażonych delNS1 wykazywało lokalizację jądrową IRF-3. Co zastanawiające, możliwa była częściowa inhibicja translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych delNS1, przez ekspresję NS1 z plazmidu w układzie trans. Wyniki pokazują, że NS1 wirusa grypy typu A jest zdolny do inhibicji translokacji IRF-3 w komórkach zakażonych wirusem. Prawdopodobnie wirus grypy NSl zapobiega aktywacji za pośrednictwem dsRNA IRF-3 przez sekwestrację dsRNA podczas infekcji wirusowej, powodując w ten sposób inhibicję syntezy IFN.

Claims (35)

1. Atenuowany wirus grypy obejmujący zmodyfikowany gen NS1, znamienny tym, że wirusa grypy stanowi NS1/99.
2. Genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirusgrypy, znamienny tym, że wirusatenuowany jest przez mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60, przy czym N końcowy aminokwas oznacza numer 1, i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do miana, które jest przynajmniej o jeden rząd logarytmu wyższe niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnego pod względem interferonu w przypadku propagacji w takich samych warunkach.
3. Atenuowany wirus grypy według zastrz. 2, znamienny tym, że stanowi wirusa grypy A.
4. Atenuowany wirus grypy według zastrz. 2, znamienny tym, że układ gospoda rza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do około 8 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni.
5. Atenuowany wirus grypy według zastrz. 2, znamienny tym, że układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni.
6. Atenuowany wirus grypy według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem.
PL 200 977 B1
7. Atenuowanywirus grypy wedługzastrz. 2, znamiennytym, że układgospodarzaz niedoborem interferonu jest ojemuy ysł względem STAT1, n ukłsł gdsysanran ksmydreurungs ysł względem iurnrfnrsuo jest asastni ysł względem STAT1.
8. Kc^mp^(^^y^y^j£3 ssczepionkh znamienna tym, że zawiera adenuowaneeo wirriss grrrpy okreńlouegs w anstra. 1, i fiajslsgicauie asyusacasluą anróbkę, yray caym ksmysaycjs sacaeyisuki jest skutecaus as adosbidgduid chsrsbie adkdźudj u ysamistu.
9. Kc^mp^(^^y^c^j£3 ssczepionkii znamienna tym, że zawieńz arenuowanedo winj^^ grrpy ο^οί5ΐοuegs w anstra. 2, i fiajslsgicauie asyusacasluą anróbkę, yray caym ksmysaycjs sacaeyisuki jest skutecaus as asosbidgsuis chsrsbie asksźuej u ysamistu.
10. Kompysayca zsacadiooni wadługzadtrz. ż zlbo ż, znamienaa tym, że zCcozSb zaSaSnązteuswi askseduid wirusem gryyy.
11. Komposayjazsacapieoni wadług zadtrz. 9, znamienna tym, ze zreńuowarιedo winj^^ zrypy stsuswi wirus gryyy A.
12. Kompozycja εζοζβρΐοηΚϊ według zas^z. 8 albo 9, znamienna tym, żet zawieta dawkę skutecauą as wabuaaeuis sayswieaai immuuslsgicauej.
13. Kompozaccj szczepiona według zasSz. 8 albo 9, znamienna tym, ze ssężenie aSenuowauegs wiruss wyussi sksłs 104 as sksłs 5x106 yfu.
14. Kompozaccj szczepiona według ζ3^γζ. 9, znamienna tym, żet ukkad go-podarza z niedobsrem iutdufdrsuu stsuswi jsjs a asrsakiem w wieku sksłs 6 as sksłs 8 łui, s ukłsa gssysasras ksmyeteutuegs ysa waglęaem iutdufdrsuu stsuswi jsjs a asrsakiem w wieku sksłs 10 as sksłs 12 aui.
15. Kompozycca szczepionki według zas^r. 14, znamienna tym, żet ja-a z zarodkkem ss^r^c^^i jsjs kurae a asrsakiem.
16. Kompozycja szczepiona według ζ3^γζ. 9, znamienna tym, żet ukkad go-podarza z niedobsrem iutdufdrsuu stsuswi jsjs a asrsakiem w wieku sksłs 6 łs 7 aui, s ukłsa gssysasras ksmyeteutuegs ysł waglęaem iutdufdrsuu stsuswi jsjs a asrsakiem w wieku 10 aui.
17. Kompozycca szczepionki według zas^r. 1 znamienna tym, żet j^Sj- z zarodkkem ss^r^c^^i jsjs kurae a asrsakiem.
18. Kompozycja szczepiona według ζ3^γζ. 9, znamienna tym, żet ukkad go-podanza z niedobsrem iutdufdrsuu jest ujemuy ysł waglęaem STAT1, s ukłsa gssysasras ksmyeteutuegs ysł waglęłem iutdufdrsuu jest asastui ysł waglęaem STAT1.
W. Komposayja zsccapior^ni wadługzastrz. 8 zlbb 9, znamienna tym, że j zo osaswsuis asussswegs, astchswicaegs, asustuegs, śróaskóruegs, asmięśuiswegs, śrółstraewuswegs, aseyluegs, lub ysaskóruegs.
20. Osmysaycjs sacaeyisuki weaług asstrz. 8 slbs ,, naaminaaa tyra, że ysamistem jest całswiek.
21. Osmy-zacca fsrmsceutyczns, zaarnieaaa tyii, że zswiera stduuswsnegs wirusa gryyy skreślsuegs w anstra, 1, i fiajslsgicauie asyusacasluą anróbkę, yray caym ksmysaycjs jest skutecaus łs lecaeuis chsrsby anksźuej u ysamistu.
22. Osmy-zyga fsrmaceutyczna, zaarnieaaa tyii, że zswiera stduuswsnegs wirusa gryyy skreślsuegs w anstra. 2, i fiajslsgicauie łsyusacasluą anróbkę, yray caym ksmysaycjs jest skutecaus łs lecaeuis chsrsby anksźuej u ysłmistu.
23. Osmy-zyga fsrmaceutyczna, zaarnieaaa tyii, że zswiera steuuowanegs wirusa gtyyy skreślsuegs w anstra, 1, i fiajslsgicauie łsyusacasluą anróbkę, yray caym ksmysaycjs jest skutecaus łs lecaeuis chsrób, w których iuterfersu yrayussi ksrayść ternyeutycauą ysłmistswi.
24. Osmy-zyga fsrmaceutyczna, zaarnieaaa tyrn, że zswiera steuuowanegs wirusa gtyyy skreślsuegs w anstra. 2, i fiajslsgicauie łsyusacasluą anróbkę, yray caym ksmysaycjs jest skutecaus łs lecaeuis chsrób, w których iuterfersu yrayussi ksrayść ternyeutycauą ysłmistswi.
25. Kompozy^j farmaceutyczna według zas^z. 21 albo 272, znamienna tym, żet cho-obę zaksźuą stsuswi ankneeuiem wirusem gryyy.
26. Komposayja farmascńtyycny wedługzastrz. ż2 zlbb ż2, znamienaatym, że a-eńugwanedo wiruss gryyy stsuswi wirus gryyy A.
27. Kompo-accj farmaceutyycny według zassrz. 21 albo 272, albo 23, albb 24, znamienna tym, ee aswiers łswkę skutecauą łs wabułaeuis ksmórkswej słyswiełai iuterfersuswej.
28. Kompo-accj farmaceutyycny według ζθ-^ζ. 22 albo 22, albb 23, albo 22, znamienna tym, ee stęeeuie nteuuswnuegs wiruss gryyy wyussi sksłs 104 łs sksłs 5x106 yfu.
2,. Kompozaccj farmaceutyccna według zassrz. 22 albo 24, znamienna tym, żet ukkad gospołsras a uiełsbsrem iuterfersuu stsuswi jsjs a asrsłkiem w wieku sksłs 6 łs sksłs 8 łui, s ukłsa gsPL 200 977 B1 spodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni.
30. Komppozcja farmaaeutyczna weełuu zzatrz. 22, znamienna tym, że j ajo z zzroddiem stanowi jajo kurze z zarodkiem.
31. Komppozcjo farmpaeutycena ww^e^^g szstra. 22 albo 22, snamienna tym, Se uułaa ggoppdarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni.
32. Komppozcjo farmpaeutycena weeług zzstra. 31, znamienna tym, że j oJo z zzrzdkiem stynowi jajo kurze z zarodkiem.
33. Komppozcjo farmpaeutycena weeług szstra. S2 albo 22, snamienria tym, Se uukaa ggoppdarza z niedoOorem interferonu jest ujemny pod względem STAT1 a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1.
34. Komppozcjo farmpaeutycenaweeług szstra. S1 slbo S2, slbo S2, slbo S2, snamierma tym, że przeznaczona jest do podawania śródskórnego, domięśniowego, śródotrzewnowego, dożylnego, podskórnego, donosowego, podtwardówkowego luo doustnego.
35. Komppozcjo farmpaeutycenaweeług szstra. S2 slbo S2, slbo S2, slbo S2, snnmiennn tym, że przeznaczona jest do podawania dopłuenego.
36. Komppozcjo farmpaeutycenaweeług szstra. S2 slbo 22, slbo S2, slbo S2, snnmiennn tym, że zawarta jest w układzie do kontrolowanego uwalniania.
37. Komppozcjo farmpaeutycenaweeług szstra. S1 slbo S2, slbo S3, slbo S2, snnmiennn tym, że podmiotem jest ezłowiek.
PL346212A 1998-06-12 1999-06-11 Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne PL200977B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8910398P 1998-06-12 1998-06-12
US10883298P 1998-11-18 1998-11-18
US11768399P 1999-01-29 1999-01-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL346212A1 PL346212A1 (en) 2002-01-28
PL200977B1 true PL200977B1 (pl) 2009-02-27

Family

ID=27376229

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386473A PL212316B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
PL398576A PL219128B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów
PL346212A PL200977B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386473A PL212316B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
PL398576A PL219128B1 (pl) 1998-06-12 1999-06-11 Genetycznie zmodyfikowane atenuowane chimerowe wirusy grypy, preparat szczepionki, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania oraz zastosowania takich wirusów

Country Status (24)

Country Link
US (12) US6573079B1 (pl)
EP (4) EP2316923B1 (pl)
JP (7) JP4837827B2 (pl)
KR (2) KR100637937B1 (pl)
CN (1) CN1312725A (pl)
AT (1) ATE351901T1 (pl)
AU (2) AU770619B2 (pl)
BR (1) BR9911163A (pl)
CA (2) CA2334895C (pl)
CY (1) CY1113689T1 (pl)
CZ (2) CZ306637B6 (pl)
DE (1) DE69934885T2 (pl)
DK (4) DK2316924T3 (pl)
ES (4) ES2653557T3 (pl)
HU (1) HUP0102441A3 (pl)
IL (6) IL140265A0 (pl)
MX (2) MXPA00012402A (pl)
NO (1) NO20006328L (pl)
NZ (2) NZ509054A (pl)
PL (3) PL212316B1 (pl)
PT (1) PT1085904E (pl)
RU (1) RU2236252C2 (pl)
SK (3) SK288200B6 (pl)
WO (2) WO1999064570A1 (pl)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US6573079B1 (en) 1998-06-12 2003-06-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses
EP1390046A4 (en) * 1999-04-15 2005-04-20 Wellstat Biologics Corp TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
NZ517573A (en) 1999-09-17 2004-02-27 Pro Virus Inc Sequences of the oncolytic virus strain vesicular stromatitis virus (VSV)
EP1259629B1 (en) * 2000-03-02 2005-07-20 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Recombinant influenza a viruses
WO2001077394A1 (en) 2000-04-10 2001-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
AU2002223560B2 (en) * 2000-09-25 2006-06-29 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
MX348185B (es) 2001-02-14 2017-06-02 Anthrogenesis Corp Placenta de mamíferos postparto, su uso y células madres placentales extraídas de ella.
JP2005505505A (ja) 2001-05-22 2005-02-24 アクセス ビジネス グループ インターナショナル リミテッド ライアビリティ カンパニー 液体成分を配合しかつ分取するための方法および装置
CN1549709A (zh) * 2001-07-16 2004-11-24 ����ɯ�ס����ڵ��ɿ� 一类抗病毒化合物在制造用于治疗或预防在呼吸道中病毒感染的制剂中的应用
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
ES2694123T3 (es) * 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
US8137676B2 (en) * 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PT2251034T (pt) 2005-12-02 2018-05-22 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
WO2008144067A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
EA024262B1 (ru) 2008-11-25 2016-09-30 Нанотерапьютикс Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА ГРИППА, СТАБИЛЬНОГО ПРИ НИЗКИХ pH
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
US9884105B2 (en) * 2008-12-16 2018-02-06 Ology Bioservices, Inc. Production of viral vaccine
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EP2413962A1 (en) 2009-03-30 2012-02-08 Mount Sinai School of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
DE102010018462A1 (de) 2009-04-27 2011-04-07 Novartis Ag Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
CA2767207A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing
CN102648000A (zh) 2009-07-22 2012-08-22 阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司 新的流感病毒
US9217157B2 (en) 2009-07-27 2015-12-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant influenza viruses and uses thereof
JP5845180B2 (ja) 2009-07-30 2016-01-20 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルス及びそれらの使用
CA2769673A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Novartis Ag Reverse genetics systems
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
US8597637B1 (en) 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
US20130183740A1 (en) * 2010-06-02 2013-07-18 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Novel method for generation of rna virus
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
AU2013362935B2 (en) 2012-12-18 2018-10-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
US10947543B2 (en) 2013-03-13 2021-03-16 Yale University Interferon production using short RNA duplexes
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
BR112015021414B1 (pt) 2013-03-14 2020-11-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai vírus da doença newcastle e seus usos
WO2015127501A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Viralytics Limited Combination method for treatment of cancer
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
EP3261664A1 (en) 2015-02-26 2018-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Bivalent swine influenza virus vaccine
WO2017030997A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered ns1 protein function and related materials and methods
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
MX2018006373A (es) * 2015-11-24 2018-11-09 Commw Scient Ind Res Org Produccion de virus en cultivos celulares.
WO2017088017A1 (en) * 2015-11-24 2017-06-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in avian eggs
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
WO2018115308A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Blue Sky Vaccines Gmbh Method for purifying virus
CN111511907A (zh) 2017-03-14 2020-08-07 加利福尼亚大学董事会 对病毒中免疫逃逸功能区域的全基因组鉴定
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
WO2019092084A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Blue Sky Vaccines Gmbh So3 chromatography for use in a method for virus purification
CN113853215A (zh) 2019-01-24 2021-12-28 蓝天免疫疗法有限责任公司 高生长流感病毒
US20230060867A1 (en) * 2019-02-07 2023-03-02 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
CN116888139A (zh) * 2020-11-30 2023-10-13 蓝天免疫疗法有限责任公司 诱导高水平i型干扰素的新型复制缺陷型甲型流感病毒
WO2022125789A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
EP4351623A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) * 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) * 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US4693981A (en) * 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
US5106619A (en) * 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5766601A (en) * 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
US6162432A (en) * 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
EP0607332B1 (en) 1991-10-07 1997-12-17 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the cd2/lfa-3 interaction
DE570357T1 (de) 1992-05-14 1994-07-28 Polimun Scientific Immunbiologische Forschungsgesellschaft Mbh, Wien Peptide, die Antikörper induzieren, die genetisch divergierende HIV-1 Isolationen neutralisieren.
US7344722B1 (en) * 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
ATE257175T1 (de) 1994-07-18 2004-01-15 Conzelmann Karl Klaus Prof Dr Rekombinantes infektiöses nicht-in-segmente- geteiltes, negativ-strange-rns-virus
US6300090B1 (en) * 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) * 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
US5840565A (en) 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
JPH11512609A (ja) 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の生産
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
EP2112220A3 (en) 1996-07-15 2010-01-06 The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
AU4427897A (en) 1996-09-27 1998-04-17 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
EP0975809A4 (en) 1997-03-05 2002-10-30 Univ Washington EXAMINATION PROCEDURE FOR DETECTING AGENTS FOR SELECTIVE INHIBITION OF HCV REPLICATION
US5891705A (en) * 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) * 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
AU7797798A (en) 1997-05-23 1998-12-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
PT1012244E (pt) 1997-07-11 2007-08-21 Univ Yale ''rabdovírus com revestimentos remanipulados''
CN1273603A (zh) 1997-09-19 2000-11-15 美国氰胺公司 减毒的呼吸道合胞病毒
US6573079B1 (en) * 1998-06-12 2003-06-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses
DK1098961T3 (da) * 1998-06-12 2008-05-26 Andrej Y Dr Egorov Gensplejsede svækkede vira, der inducerer interferon
US6146642A (en) * 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US6544785B1 (en) * 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
ATE353370T1 (de) 1999-07-14 2007-02-15 Sinai School Medicine In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren
EP1259629B1 (en) 2000-03-02 2005-07-20 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Recombinant influenza a viruses
WO2001077394A1 (en) 2000-04-10 2001-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
AU2002223560B2 (en) 2000-09-25 2006-06-29 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
CA2505949A1 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Rutgers, The State University Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1
ES2694123T3 (es) * 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
US8137676B2 (en) 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) * 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PT2251034T (pt) 2005-12-02 2018-05-22 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
US7507411B2 (en) * 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Also Published As

Publication number Publication date
BR9911163A (pt) 2002-01-15
US6669943B1 (en) 2003-12-30
EP1085904B1 (en) 2012-11-28
IL140264A0 (en) 2002-02-10
EP2316924B1 (en) 2017-10-11
NZ509054A (en) 2004-01-30
CY1113689T1 (el) 2016-06-22
IL140264A (en) 2008-03-20
PL398576A1 (pl) 2012-10-08
CA2334895C (en) 2016-01-19
JP5081220B2 (ja) 2012-11-28
DK2316924T3 (en) 2018-01-02
ES2281177T3 (es) 2007-09-16
EP1085904A1 (en) 2001-03-28
ES2400445T3 (es) 2013-04-09
KR100637937B1 (ko) 2006-10-23
KR20060080249A (ko) 2006-07-07
PL212316B1 (pl) 2012-09-28
US20160279227A1 (en) 2016-09-29
IL189766A0 (en) 2008-08-07
JP2013226154A (ja) 2013-11-07
US8765139B2 (en) 2014-07-01
US9352033B2 (en) 2016-05-31
US20040109877A1 (en) 2004-06-10
JP2002517470A (ja) 2002-06-18
US9387240B2 (en) 2016-07-12
NO20006328D0 (no) 2000-12-12
WO1999064068A9 (en) 2000-03-09
SK288567B6 (sk) 2018-06-01
KR20010052782A (ko) 2001-06-25
JP2011050384A (ja) 2011-03-17
DK1085904T3 (da) 2013-02-25
HUP0102441A3 (en) 2004-10-28
CA2334895A1 (en) 1999-12-16
WO1999064068A1 (en) 1999-12-16
AU4434399A (en) 1999-12-30
EP1086207A1 (en) 2001-03-28
CZ302601B6 (cs) 2011-08-03
IL188362A0 (en) 2008-03-20
PL346212A1 (en) 2002-01-28
PL219128B1 (pl) 2015-03-31
US8057803B2 (en) 2011-11-15
US20090203114A1 (en) 2009-08-13
DE69934885T2 (de) 2007-11-08
EP1086207A4 (en) 2003-01-22
CA2334850C (en) 2013-11-26
JP2010099081A (ja) 2010-05-06
IL140265A (en) 2008-06-05
SK288200B6 (sk) 2014-06-03
HUP0102441A2 (hu) 2001-10-28
DK1086207T3 (da) 2007-05-29
AU4434599A (en) 1999-12-30
US20100233785A1 (en) 2010-09-16
AU770619B2 (en) 2004-02-26
US7494808B2 (en) 2009-02-24
JP2002517229A (ja) 2002-06-18
NO20006328L (no) 2001-02-02
JP2010142248A (ja) 2010-07-01
ES2650500T3 (es) 2018-01-18
JP5829655B2 (ja) 2015-12-09
AU771110B2 (en) 2004-03-11
MXPA00012402A (es) 2003-07-14
US7588768B2 (en) 2009-09-15
US20100158942A1 (en) 2010-06-24
PT1085904E (pt) 2013-03-05
EP2316923A2 (en) 2011-05-04
ATE351901T1 (de) 2007-02-15
WO1999064570A1 (en) 1999-12-16
MXPA00012403A (es) 2003-05-15
SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
NZ509055A (en) 2004-02-27
CZ20004635A3 (en) 2001-06-13
US6573079B1 (en) 2003-06-03
EP2316924A3 (en) 2014-03-19
US20050054074A1 (en) 2005-03-10
JP2014036654A (ja) 2014-02-27
US20120258134A1 (en) 2012-10-11
EP1086207B1 (en) 2007-01-17
CA2334850A1 (en) 1999-12-16
ES2653557T3 (es) 2018-02-07
EP2316924A2 (en) 2011-05-04
IL140265A0 (en) 2002-02-10
EP2316923A3 (en) 2014-04-09
US20140341948A1 (en) 2014-11-20
CZ306637B6 (cs) 2017-04-12
US20090053264A1 (en) 2009-02-26
RU2236252C2 (ru) 2004-09-20
US6852522B1 (en) 2005-02-08
DE69934885D1 (de) 2007-03-08
DK2316923T3 (en) 2018-01-08
EP2316923B1 (en) 2017-10-18
SK288544B6 (sk) 2018-03-05
JP4531255B2 (ja) 2010-08-25
EP1085904A4 (en) 2004-12-29
WO1999064570A9 (en) 2000-03-09
JP5810134B2 (ja) 2015-11-11
JP4837827B2 (ja) 2011-12-14
CN1312725A (zh) 2001-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9387240B2 (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Legal Events

Date Code Title Description
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 382506

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1