RU2236252C2 - Аттенуированные вирусы с минус-цепью с измененной антагонистической в отношении интерферона активностью для применения в качестве вакцин и фармацевтических веществ - Google Patents
Аттенуированные вирусы с минус-цепью с измененной антагонистической в отношении интерферона активностью для применения в качестве вакцин и фармацевтических веществ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2236252C2 RU2236252C2 RU2001101426/15A RU2001101426A RU2236252C2 RU 2236252 C2 RU2236252 C2 RU 2236252C2 RU 2001101426/15 A RU2001101426/15 A RU 2001101426/15A RU 2001101426 A RU2001101426 A RU 2001101426A RU 2236252 C2 RU2236252 C2 RU 2236252C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- interferon
- attenuated
- influenza virus
- ifn
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 357
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 141
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title claims description 213
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title claims description 213
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims description 212
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 title claims description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 95
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 67
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 63
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 54
- 102000006381 STAT1 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 40
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 40
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 26
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 15
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 10
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 10
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims 6
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000010479 cellular ifn response Effects 0.000 abstract description 11
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 84
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 77
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 48
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 35
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 33
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 20
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 17
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 16
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 14
- 108010032038 Interferon Regulatory Factor-3 Proteins 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 13
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 101150094092 STAT1 gene Proteins 0.000 description 12
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 12
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 12
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 11
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 11
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 10
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 9
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 9
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 9
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 9
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 9
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 9
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 7
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 6
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 6
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 description 5
- 101710089751 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 108700032552 influenza virus INS1 Proteins 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- -1 sialyl oligosaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 4
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 4
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150076514 NS gene Proteins 0.000 description 3
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 3
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001011382 Homo sapiens Interferon regulatory factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000491226 Influenza A virus (A/WSN/1933(H1N1)) Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 2
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 2
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 2
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000034373 developmental growth involved in morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000724653 Borna disease virus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000712471 Dhori virus Species 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010073306 Exposure to radiation Diseases 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 101001082058 Homo sapiens Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108050000838 Influenza A virus NS1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102100027303 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 240000001068 Thogoto virus Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960001226 live attenuated influenza Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001855 preneoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000010472 type I IFN response Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- A61K39/17—Newcastle disease virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится в общем к аттенуированным РНК-вирусам с минус-цепью, имеющим нарушенную способность противодействовать клеточному интерферон-(ИФН)-ответу, и применению таких аттенуированных вирусов в вакцинных и фармацевтических композициях, также к развитию и применению ИФН-недостаточных систем для отбора таких аттенуированных вирусов. В частности, данное изобретение относится к аттенуированным вирусам гриппа, имеющим модификации, относящиеся к гену NS1, которые уменьшают или устраняют способность продукта гена NS1 противодействовать клеточному ИФН-ответу. Эти мутантные вирусы реплицируются in vivo, но демонстрируют уменьшенную патогенность и, следовательно, хорошо пригодны для применения в живых вирусных вакцинах и фармацевтических композициях. Преимущество изобретения заключается в разработке препаратов на основе аттенуированных вирусов, позволяющих обеспечить иммунный ответ, достаточный для удовлетворения последующих заражений. 23 н. и 27 з.п. ф-лы, 10 табл., 3 ил.
Description
Исследование, отраженное в данной заявке, поддерживалось, частично, грантом от Национального Института здравоохранения, и правительство может иметь определенные права в отношении данного изобретения.
Данная заявка является частичным продолжением заявки с регистрационным номером 60/117 683, поданной 29 января 1999 года; заявки с регистрационным номером 60/108 832, поданной 18 ноября 1998 года, и заявки с регистрационным номером 60/089 103, поданной 12 июня 1998 года, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном виде.
1. ВВЕДЕНИЕ
Данное изобретение относится в общем к аттенуированным РНК-вирусам с минус-цепью, имеющим нарушенную способность противодействовать клеточному интерферон-(ИФН)-ответу, и применению таких аттенуированных вирусов в вакцинных и фармацевтических композициях. Данное изобретение относится также к развитию и использованию ИФН-недостаточных систем для отбора, идентификации и размножения таких аттенуированных вирусов.
В конкретном варианте, данное изобретение относится к аттенуированным вирусам гриппа, имеющим модификации, относящиеся к гену NS1, которые уменьшают способность продукта гена NS1 противодействовать клеточному ИФН-ответу. Эти мутантные вирусы реплицируются in vivo, но демонстрируют уменьшенную патогенность и, следовательно, хорошо пригодны для применения в живых вирусных вакцинах и фармацевтических композициях.
2. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2.1 ВИРУС ГРИППА
Семейства вирусов, содержащие оболочку и одноцепочечную РНК негативного (негативно-смыслового) генома, классифицируются на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и вирус болезни Borna), или группы, имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae, описанное подробно ниже и используемое здесь в примерах, включает в себя вирусы гриппа, вирусы типов А, В и С, а также вирусы Thogoto и Dhori и вирус инфекционной анемии лосося.
Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового кора (спирального нуклеокапсида), содержащего геном в виде одноцепочечной РНК, и наружной липопротеиновой оболочки, выстланной внутри белком матрикса (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из 8 молекул (семь для гриппа С) линейных, имеющих отрицательную полярность, одноцепочечных РНК, которые кодируют десять полипептидов, в том числе: белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ2, РВ1 и РА) и нуклеопротеин (NP), которые образуют нуклеокапсид; белки мембраны матрикса (M1, M2); два поверхностных гликопротеина, которые выступают из липидсодержащей оболочки: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA); неструктурный белок (NS1) и белок ядерного транспорта (NEP). Транскрипция и репликация этого генома имеет место в ядре, а сборка происходит через почкование на плазматической мембране. Эти вирусы могут рекомбинировать гены во время смешанных инфекций.
Вирусы гриппа адсорбируются через НА к сиалилолигосахаридам в гликопротеинах и гликолипидах клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона в молекуле НА происходит конформационное изменение в клеточной эндосоме, которое облегчает слияние мембран, запуская декапсидацию вируса. Нуклеокапсид мигрирует в ядро, где транскрибируется вирусная мРНК. Вирусная мРНК транскрибируется по уникальному механизму, в котором вирусная эндонуклеаза отщепляет кэпированный 5'-конец от клеточных гетерологичных мРНК, который затем служит в качестве праймеров для транскрипции вирусных РНК-матриц вирусной транскриптазой. Транскрипты терминируются в сайтах, расположенных на расстоянии 15-22 оснований от концов их матриц, где олиго(U)-последовательности действуют в качестве сигналов для присоединения поли(А)-трактов. Из полученных таким образом восьми вирусных РНК-молекул шесть являются моноцистронными матрицами, которые транслируются непосредственно в белки, представляющие НА, NA, NP и белки вирусной полимеразы, РВ2, РВ1 и РА. Два других транскрипта подвергаются сплайсингу, причем каждый дает две мРНК, которые транслируются в различных рамках считывания с образованием M1, M2, NS1 и NEP. Другими словами, восемь вирусных сегментов РНК кодируют десять белков: девять структурных и один неструктурный. Гены вируса гриппа и их белковые продукты суммированы в таблице 1.
Геном вируса гриппа А содержит восемь сегментов одноцепочечной РНК отрицательной полярности, кодирующих один неструктурный и девять структурных белков. Неструктурный белок NS1 находится в избытке в инфицированных вирусом гриппа клетках, но не детектировался в вирионах. NS1 является фосфопротеином, обнаруживаемым в ядре в начале инфекции, а также в цитоплазме на более поздних стадиях вирусного цикла (King et al., 1975, Virology 64: 378). Исследования с чувствительными к температуре (ts) мутантами гриппа, несущими повреждения в гене NS, предполагают, что белок NS1 является транскрипционным и посттранскрипционным регулятором механизмов, при помощи которых этот вирус способен ингибировать экспрессию генов клетки-хозяина и стимулировать синтез вирусных белков. Подобно многим другим белкам, которые регулируют посттранскрипционные процессы, белок NS1 взаимодействует со специфическими последовательностями и структурами РНК. Сообщалось, что белок NS1 связывается с различными типами РНК, в том числе: vPHK, поли-А, snPHK U6, 5'-нетранслируемым районом как вирусных мРНК, так и dsPHK (Qiu et al., 1995, RNA 1: 304; Qiu et al., 1994, J.Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J.Gen. Virol. 73:3325-9. Экспрессия белка NS1 из кДНК в трансфицированных клетках была связана с несколькими эффектами: ингибированием ядерно-цитоплазматического транспорта мРНК, ингибированием сплайсинга пре-мРНК, ингибированием полиаденилирования мРНК хозяина и стимуляцией трансляции вирусной мРНК (Fortes et al., 1994, EMBO J. 13: 704; Enami, et al., 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69:2427; Lu, et al., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433; Nemeroff et al., 1998, Mol. Cell. 1: 1991; Chen, et al., 1994, EMBO J. 18: 2273-83).
2.2 АТТЕНУИРОВАННЫЕ ВИРУСЫ
Инактивированные вирусные вакцины получают “уничтожением” вирусного патогена, например, нагреванием или обработкой формалином, так чтобы он не был способен к репликации. Инактивированные вакцины имеют ограниченную применимость, так как они не обеспечивают долгосрочного иммунитета и, следовательно, дают ограниченную защиту. Альтернативный подход к получению вирусных вакцин включает в себя применение аттенуированных живых вирусных вакцин.
Аттенуированные вирусы способны к репликации, но не являются патогенными и, следовательно, обеспечивают долгосрочный иммунитет и дают большую защиту. Однако общепринятые способы получения аттенуированных вирусов включают в себя случайное выделение мутантов с измененным спектром литического действия (круга хозяев), многие из которых является чувствительными к температуре; например, вирус пассируют через неприродных хозяев и отбирают потомство вирусов, которое является иммуногенным, но еще не патогенным.
Общепринятым субстратом для выделения и выращивания вирусов гриппа для целей получения вакцин являются яйца кур с развивающимися эмбрионами. Вирусы гриппа обычно выращивают в течение 2-4 дней при 37°С в 10-11-дневных яйцах. Хотя большая часть первичных изолятов вирусов гриппа А и В человека растет лучше в амниотическом мешке эмбрионов, после 2-3 пассажей вирусы становятся адаптированными к росту в клетках аллантоисной полости, которая доступна снаружи яйца (Murphy B.R. and R.G.Webster, 1996. Orthomyxoviruses, p.1397-1445. In Fields Virology, Lippincott-Raven P.A.).
Технология рекомбинантных ДНК и способы генной инженерии, теоретически, могли бы предоставить превосходный подход к получению аттенуированного вируса, так как могли бы быть целенаправленно сконструированы специфические мутации в вирусном геноме. Однако генетические изменения, требующиеся для аттенуации вирусов, не являются известными или предсказуемыми. Обычно, попытки использования технологии рекомбинантных ДНК к конструированию вирусных вакцин были в основном направлены на получение субъединичных вакцин, которые содержат только белковые субъединицы патогена, участвующие в иммунном ответе, экспрессируемые в рекомбинантных вирусных векторах, таких как вирус коровьей оспы или бакуловирус. Не так давно, способы рекомбинантных ДНК были использованы в попытке получить делеционные мутанты герпесвируса или полиовирусы, которые имитируют аттенуированные вирусы, обнаруживаемые в природе, или известные мутанты с измененным спектром литического действия (т.е. мутанты, расширяющие круг хозяев). До 1990 года РНК-вирусы с минус-цепью не поддавались сайт-специфическим манипуляциям вообще и, следовательно, не могли быть генетически сконструированными.
Аттенуированные живые вирусы гриппа, полученные до сих пор, не могут быть способными к супрессии интерферонового ответа в хозяине, в котором они реплицируются. Таким образом, хотя эти вирусы являются выгодными, поскольку они являются иммуногенными, но не патогенными, их трудно размножать в общепринятых субстратах для целей приготовления вакцин. Кроме того, аттенуированные вирусы могут обладать свойствами вирулентности, которые являются такими слабыми, что не позволят хозяину обеспечить иммунный ответ, достаточный для удовлетворения последующих заражений.
3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к аттенуированным РНК-вирусам с минус-цепью, имеющим ослабленную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу, и применению таких вирусов в вакцинных и фармацевтических композициях. Эти мутантные вирусы с нарушенной антагонистической в отношении ИФН активностью являются аттенуированными - они являются инфекционными, могут реплицироваться in vivo с обеспечением субклинических уровней инфекции и не являются патогенными. Таким образом, они являются идеальными кандидатами для живых вирусных вакцин. Кроме того, аттенуированные вирусы могут индуцировать сильный ИФН-ответ, который имеет другие биологические последствия in vivo, обеспечивая защиту против последующих инфекционных заболеваний, и/или индуцируя противоопухолевые ответные реакции. Таким образом, аттенуированные вирусы могут быть использованы фармацевтически, для предупреждения или лечения других инфекционных заболеваний, рака у индивидуумов с высоким риском в отношении рака и/или заболеваний, излечиваемых посредством ИФН.
РНК-вирусы с минус-цепью, используемые в соответствии с данным изобретением, включают в себя как сегментированные, так и несегментированные вирусы; предпочтительные варианты включают в себя, но не ограничиваются ими, вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус везикулярного стоматита (VSV) и вирус парагриппа (PIV). Вирусы, используемые в данном изобретении, могут быть выбраны из природно встречающихся штаммов, вариантов или мутантов; мутагенизированных вирусов (например, генерируемых экспонированием мутагенами, повторяемыми пассированиями и/или перепрививками в непермиссивных хозяевах); вирусных рекомбинантов (реассортантов) (в случае сегментированных вирусных геномов) и/или генетически сконструированных вирусов (например, с использованием способов "обратной генетики"), имеющих желательный фенотип, т.е. нарушенную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу. Мутант или генетически сконструированный вирус может быть выбран на основе различающегося роста в ИФН-недостаточных системах в сравнении с ИФН-компетентными системами. Например, могут быть выбраны вирусы, которые растут в ИФН-недостаточной системе, но не в ИФН-компетентной системе (или растут хуже в ИФН-компетентной системе).
Аттенуированный вирус, выбранный таким образом, может быть сам использован в качестве активного ингредиента в вакцинных или фармацевтических композициях. Альтернативно, аттенуированный вирус может быть использован в качестве вектора или "каркаса" рекомбинантно полученных вакцин. Для этой цели, способ "обратной генетики" может быть использован для конструирования мутаций или введения чужеродных эпитопов в аттенуированный вирус, который может служить в качестве "родительского" штамма. Таким путем, могут быть сконструированы вакцины для иммунизации против вариантов штаммов или, альтернативно, против полностью отличающихся инфекционных агентов или антигенов заболеваний. Например, может быть сконструирован аттенуированный вирус для экспрессии нейтрализующих эпитопов других предварительно выбранных штаммов. Альтернативно, эпитопы вирусов, иных, чем РНК-вирусы с минус-цепью, могут быть встроены в этот аттенуированный мутантный вирус (например, gp160, gp120 или gp41 ВИЧ). Альтернативно, в этот вирус могут быть встроены эпитопы невирусных инфекционных патогенов (например, паразитов, бактерий, гибков). Еще в одной альтернативе, могут быть приготовлены противораковые вакцины, например, встраиванием опухолевых антигенов в аттенуированный вирусный каркас.
В конкретном варианте, включающем в себя РНК-вирусы с сегментированными геномами, способы реаранжировки (вирусной рекомбинации) могут быть использованы для переноса аттенуированного фенотипа из родительского сегментированного РНК-вирусного штамма (природного мутанта, мутагенизированного вируса или генетически сконструированного вируса) в отличающийся вирусный штамм (вирус дикого типа, природный мутант, мутагенизированный вирус или генетически сконструированный вирус).
Аттенуированные вирусы, индуцирующие сильные ИФН-ответы в хозяевах, могут быть также использованы в фармацевтических композициях для профилактики или лечения других вирусных инфекций или излечиваемых ИФН заболеваний, таких как рак. В этом отношении тропизм аттенуированного вируса может быть изменен для нацеливания вируса на желательные, являющиеся мишенями орган, ткань или клетки in vivo или ex vivo. С использованием этого подхода ИФН-ответ может быть индуцирован локально, в сайте-мишени, что позволяет таким образом избежать или минимизировать побочные эффекты системного введения ИФН. Для этой цели аттенуированный вирус может быть сконструирован для экспрессии лиганда, специфического для рецептора этих являющихся мишенями органа, ткани или клетки.
Данное изобретение основано, частично, на открытии заявителей, что NS1 вируса гриппа дикого типа действует в качестве антагониста ИФН в том смысле, что NS1 ингибирует опосредованный ИФН ответ инфицированных вирусом клеток-хозяев. Было обнаружено, что вирусные мутанты, недостаточные по активности NS1, являются сильнодействующими индукторами клеточного ИФН-ответа и демонстрируют аттенуированный фенотип in vivo; т.е. эти мутантные вирусы реплицируются in vivo, но имеют пониженные патогенные эффекты. Не желая связывать себя с какой-либо теорией или с каким-либо объяснением, как действует данное изобретение, авторы изобретения считают, что аттенуированные признаки вирусов данного изобретения предположительно обусловлены их способностью индуцировать сильный клеточный ИФН-ответ и их ослабленной способностью противодействовать ИФН-ответу хозяина. Однако эти полезные признаки аттенуированных вирусов данного изобретения не могут приписываться только действиям на клеточный опосредованный интерфероном ответ. В самом деле, изменения в других активностях, ассоциированных с NS1, могут вносить вклад в желательный аттенуированный фенотип.
Показано, что мутантные вирусы гриппа с ослабленной антагонистической активностью в отношении ИФН реплицируются in vivo, давая титры, которые являются достаточными для индукции иммунологических ответов и ответов цитокинов. Например, вакцинация аттенуированным вирусом гриппа уменьшала вирусный титр в животных, которых затем заражали вирусом гриппа дикого типа. Аттенуированные вирусы гриппа продемонстрировали также антивирусную и противоопухолевую активность. Предварительное инфицирование аттенуированным вирусом гриппа ингибировала репликацию других штаммов вируса гриппа дикого типа и других вирусов (таких как вирус Sendai), суперинфицированных в яйцах с развивающимися эмбрионами. Инокуляция аттенуированного вируса гриппа в животных, инъецированных опухолевыми клетками, уменьшала число образованных очагов патологии. Поскольку известно, что вирус гриппа индуцирует CTL-ответ (ответ цитотоксических Т-лимфоцитов), аттенуированный вирус является очень привлекательным кандидатом для противораковых вакцин.
Мутации, которые уменьшают, но не уничтожают полностью антагонистическую в отношении ИФН активность вируса, являются предпочтительными для вакцинных композиций - такие вирусы могут быть выбраны для выращивания как в общепринятых, так и в нестандартных субстратах, и для получения промежуточной вирулентности. В частности, авторы изобретения показали, что мутант с укороченным на С-конце NS1 реплицируется до высоких титров в ИФН-недостаточных субстратах, таких как 6- и 7-дневные развивающиеся куриные эмбрионы, а также в аллантоисной мембране 10-дневных развивающихся куриных с эмбрионов, общепринятом субстрате для вируса гриппа, который не допускает роста мутантов вируса гриппа, в которых делетирован весь ген NS1 (называемых здесь также "нокаут"-мутантами). Однако репликация мутанта с укороченным на С-конце NS1 является сниженной в яйцах с 12-дневными развивающимися эмбрионами. Этот подход впервые позволяет генерирование и идентификацию живых аттенуированных вирусов с минус-цепью, которые имеют измененную, но не устраненную антагонистическую в отношении ИФН активность и которые способны расти в субстратах, пригодных для получения вакцин. Этот подход обеспечивает также впервые эффективную систему отбора/идентификации для вируса гриппа или других вирусов, содержащих мутации, которые придают им измененную, но не устраненную, антагонистическую в отношении интерферона активность.
Данное изобретение относится также к применению ИФН-недостаточных систем для размножения аттенуированных вирусов, которые не могут быть выращены в общепринятых системах, используемых в настоящее время для получения вакцин. Термин "ИФН-недостаточные системы" в применении здесь относится к ситемам, таким как, например, клетки, клеточные линии и животные, такие как мыши, куры, индейки, кролики, крысы и т.д., которые не продуцируют ИФН или продуцируют низкие уровни ИФН, не отвечают или отвечают менее эффективно на ИФН и/или являются недостаточными в активности антивирусных генов, индуцируемых интерфероном. Для этой цели авторы изобретения идентифицировали или сконструировали ряд ИФН-недостаточных систем, которые могут быть использованы, в том числе, но не только, яйца с развивающимися эмбрионами на ранней стадии, ИФН-недостаточные клеточные линии (такие как клетки VERO или генетически сконструированные клеточные линии, такие как STAT1-нокауты). Альтернативно, яйца с развивающимися эмбрионами или клеточные линии могут быть предварительно обработаны соединениями, которые ингибируют ИФН-систему (в том числе лекарственными средствами, антителами, антисмысловыми нуклеиновыми кислотами, рибозимами и т.д.). Еще один вариант включает в себя применение яиц, недостаточных по ИФН-системе, например, яиц, продуцируемых STAT1-негативными птицами, в частности, домашней птицей, включая, но не ограничиваясь трансгенными курами, утками или индейками.
4. ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг.1. Вирус delNS1 ингибирует репликацию вируса гриппа А дикого типа в яйцах. Яйца с десятидневными развивающимися куриными эмбрионами инокулировали указанными БОЕ вируса delNS1. Спустя восемь часов эти яйца инфицировали 103 БОЕ вируса WSN. После двух дней инкубации при 37°С аллантоисную жидкость собирали и титры вируса WSN определяли методом бляшек в клетках MDBK. Результаты представляют среднее для двух яиц.
Фиг.2. Индукция антивирусного ответа в яйцах с развивающимися эмбрионами вирусом delNS1. Яйца с десятидневными развивающимися эмбрионами инокулировали ЗФР (необработанные) или 2×104 БОЕ вируса delNS1 (delNS1-обработанные). Спустя восемь часов эти яйца инфицировали теперь 103 БОЕ вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1), вируса гриппа A/PR8/34 (H+N1), вируса гриппа А/Х-31 (H3N2), вируса гриппа B/Lee/40 или вируса Sendai. После двух дней инкубации аллантоисную жидкость собирали и титры вирусов определяли при помощи метода гемагглютинации. Результаты являются средними величинами для двух яиц.
Фиг.3. Клетки CV1 трансфицировали плазмидой, экспрессирующей IRF-3, слитый с зеленым флуоресцентным белком (GFP). Это делает возможным определение локализации IFR-3 в клетках при помощи флуоресцентной микроскопии. В некоторых случаях, экспрессирующую NS1 плазмиду котрансфицировали с экспрессирующей IRF-3 плазмидой в указанных соотношениях. Спустя 24 ч после трансфекции клетки инфицировали при высокой множественности заражения (МЗ) PR8 (WT) или вирусом delNS1, как указано. Спустя 10 ч после инфицирования клетки анализировали флуоресцентной микроскопией в отношении локализации IRF-3-GFP. Показан процент клеток, обнаруживших исключительно цитоплазматическую локализацию (Цит) и как цитоплазматическую, так и ядерную локализации IRF-3 (Ядро+Цит).
5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к генерированию, селекции и идентификации аттенуированных РНК-вирусов с минус-цепью, которые имеют ухудшенную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу, и применению таких вирусов в вакцинных и фармацевтических композициях.
Эти вирусы могут иметь сегментированный или несегментированный геномы и могут быть выбраны из природно встречающихся штаммов, вариантов или мутантов; мутагенизированных вирусов (например, посредством УФ-облучения, действия мутагенов и/или пассирования); вирусных рекомбинантов (реассортантов) (для вирусов с сегментированными геномами); и/или генетически сконструированных вирусов. Например, мутантные вирусы могут быть получены природной изменчивостью, экспонированием УФ-излучению, экспонированию химическим мутагенам, пассированием в непермиссивных хозяевах, реаранжировкой (рекомбинацией) (т.е. совместным инфицированием аттенуированного сегментированного вируса с другим штаммом, имеющим желательные антигены), и/или генетической инженерией (например, с использованием "обратной генетики"). Вирусы, отобранные для использования в данном изобретении, имеют дефектную антагонистическую в отношении ИФН активность и являются аттенуированными; т.е. они являются инфекционными и могут реплицироваться in vivo, но дают только низкие титры, приводящие к субклиническим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие аттенуированные вирусы являются идеальными кандидатами для живых вакцин.
В предпочтительном варианте, аттенуированные вирусы, выбранные для применения в данном изобретении, должны быть способны к индукции сильного ИФН-ответа в хозяине - признака, который способствует генерированию сильной иммунной реакции при использовании в качестве вакцины и который имеет другие биологические последствия, что делает эти вирусы применимыми в качестве фармацевтических агентов для предупреждения и/или лечения других вирусных инфекций или опухолеобразования в индивидуумах с высоким риском или других заболеваний, которые могут лечиться интерфероном.
Данное изобретение основано, частично, на ряде открытий и наблюдений, сделанных заявителями при работе с мутантами вируса гриппа. Однако, эти принципы могут быть аналогично применены и экстраполированы к другим сегментированным и несегементированным РНК-вирусам с минус-цепью, в том числе, но не ограничиваясь, к парамиксовирусам (вирусу Sendai, вирусу парагриппа, вирусу эпидемического паротита, вирусу Ньюкаслской болезни), морбилливирусу (вирусу кори, вирусу чумы собачьих и вирусу чумы крупного рогатого скота); пневмовирусу (респираторно-синцитиальному вирусу и бычьему респираторному вирусу) и рабдовирусу (вирусу везикулярного стоматита и вирусу бешенства).
Во-первых, ИФН-ответ является важным для вирусной инфекции in vivo. Авторы изобретения обнаружили, что рост вируса гриппа дикого типа A/WSN/33 в ИФН-недостаточных мышах (мышах STAT1-/-) приводил к пан-органной инфекции (инфекции всех органов); т.е. вирусная инфекция не ограничивалась легкимми, как это имеет место у мышей дикого типа, которые генерируют ИФН-ответ (статья Garcia-Sastre, et al., 1998, J.Virol. 72:8550, включенная здесь в качестве полной ссылки). Во-вторых, авторы изобретения установили, что мутант вируса гриппа с делецией всего гена NS1 (т.е. с NS1-"нокаутом") не мог расти до высоких титров в ИФН-компетентных клетках-хозяевах и мог размножаться только в ИФН-недостаточных хозяевах. Вирус с нокаутом NS1 продемонстировал аттенуированный фенотип (т.е. он был летальным в ИФН-недостаточных мышах STAT-/-, но не в мышах дикого типа), и было обнаружено, что он является сильным индуктором ИФН-ответов в клетках-хозяевах (статья Garcia-Sastre, et al., 1998, J.Virology 252: 324-330, включенная здесь в качестве полной ссылки). Предынкубация с мутантным вирусом с NS1-нокаутом снижала титры вируса гриппа дикого типа и других вирусов (например, вируса Sendai), суперинфицированных в яйцах с развивающимися эмбрионами. В другом эксперименте, инфекция мутантным вирусом гриппа с NS1-нокаутом уменьшала образование очагов заболевания в животных, инокулированных опухолевыми клетками. Таким образом, вирус гриппа с NS1-нокаутом демонстрировал представляющие интерес биологические свойства. Однако, мутантные вирусы с NS1-нокаутом не могли бы размножаться в общепринятых системах для получения вакцин. Для преодоления этой проблемы авторы изобретения использовали и разработали ИФН-недостаточные системы, которые позволяют получать разумные выходы аттенуированного вируса.
Кроме того, авторы изобретения сконструировали делеционные мутанты NS1, которые не делегируют полный ген. Неожиданным образом было обнаружено, что эти NS1-мутанты проявляют "промежуточный" фенотип - этот вирус может быть выращен в общепринятых хозяевах для размножения вируса гриппа (хотя рост его происходит лучше в ИФН-недостаточных системах, которые дают более высокие титры). Наиболее важным является то, что эти делеционные мутанты являются аттенуированными in vivo и индуцируют сильный ИФН-ответ. Вакцинация мутантами с укороченным NS1 приводила к низким титрам вируса в животных, зараженных затем вирусом дикого типа, и давала защиту против заболевания.
Данное изобретение относится также к субстратам, предназначенным для выделения, идентификации и роста вирусов для целей получения вакцин. В частности, описаны интерферон-недостаточные субстраты для эффективного выращивания мутантов вируса гриппа. В соответствии с данным изобретением, интерферон-недостаточным субстратом является субстрат, который является дефектным в его способности продуцировать или отвечать на интерферон. Субстрат данного изобретения может быть использован для роста любого числа вирусов, которые могут требовать интерферон-недостаточной среды выращивания. Такие вирусы могут включать в себя, при этом не ограничиваясь ими, парамиксовирусы (вирус Sendai, вирус парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус Ньюкаслской болезни), морбилливирус (вирус кори, вирус чумы собачьих и вирус чумы крупного рогатого скота); пневмовирус (респираторно-синцитиальный вирус и бычий респираторный вирус) и рабдовирус (вирус везикулярного стоматита и вирус бешенства).
Данное изобретение относится также к применению аттенуированного вируса данного изобретения в вакцинах и фармацевтических препаратах для человека и животных. В частности, аттенуированные вирусы могут быть использованы в качестве вакцин против широкого круга вирусов и/или антигенов, в том числе, но не только, антигенов вариантов штамма, отличающихся вирусов или других инфекционных патогенов (например, бактерий, паразитов, грибков), или опухолеспецифических антигенов. В другом варианте, аттенуированные вирусы, которые ингибируют репликацию вирусов и образование опухолей, могут быть использованы для профилактики или лечения инфекции (вирусных или невирусных патогенов) или образования опухоли или лечения заболеваний, для которых ИФН является терапевтически эффективным агентом. Многие способы могут быть использованы для введения живых аттенуированных вирусных препаратов человеку или животному для индукции иммунного или подходящего медиируемого цитокинами ответа. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, интраназальный, внутритрахеальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный пути. В предпочтительном варианте, аттенуированные вирусы данного изобретения готовят для интраназальной доставки.
5.1 ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННОЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ В ОТНОШЕНИИ ИФН АКТИВНОСТЬЮ
Любой мутантный вирус или штамм, который имеет уменьшенную антагонистическую в отношении ИФН активность, может быть выбран и использован в соответствии с данным изобретением. В одном варианте, могут быть выбраны природно встречающиеся мутанты или варианты или спонтанные мутанты, которые имеют ухудшенную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу. В другом варианте, мутантные вирусы могут быть получены экспонированием вируса мутагенами, таким как ультрафиолетовое излучение или химические мутагены, или множественными пассированиями и/или перепрививанием в непермиссивных хозяевах. Скрининг в дифференциальной системе роста может быть использован для селекции на мутанты, имеющие ухудшенную антагонистическую в отношении ИФН функцию. Для вирусов с сегментированными геномами, этот аттенуированный фенотип может быть перенесен другому штамму, имеющему желательный антиген для рекомбинации (т.е. посредством совместного инфицирования аттенуированного вируса и этого желательного штамма и отбора на вирусные рекомбинанты, проявляющие оба фенотипа).
В другом варианте, могут быть введены мутации в РНК-вирус с минус-цепью, такой как вирус гриппа, RSV, NDV, VSV и PIV, с использованием подходов "обратной генетики". Таким путем природные или иные мутации, которые придают аттенуированный фенотип, могут быть введены в вакцинные штаммы. Например, могут быть сконструированы делеции, инсерции или замены кодирующего региона гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность (такого как NS1 вируса гриппа). Делеции, замены или вставки в некодирующей области гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность, также обсуждаются. Для этой цели могут быть сконструированы мутации в сигналах, ответственных за транскрипцию, репликацию, полиаденилирование и/или упаковку гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность. Например, в вирусе гриппа такие модификации могут включать в себя, но не ограничиваются ими: замену некодирующих регионов гена вируса гриппа А некодирующими регионами гена вируса гриппа В (Muster, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5177), замены пар оснований в некодирующих регионах гена вируса гриппа (Fodor, et al., 1998, J.Virol. 72: 6283), мутации в районе промотора гена вируса гриппа (Piccone, et al., 1993, Virus Res. 28: 99; Li, et al., 1992, J.Virol. 66: 4331), замены и делеции в сегменте остатков уридина на 5'-конце гена вируса гриппа, влияющего на полиаденилирование (Luo, et al., 1991, J.Virol. 65: 2861; Li, et al., J. Virol. 1994, 68(2): 1245-9). Такие мутации, например, в отношении промотора, могли бы отрицательно регулировать экспрессию гена, ответственного за антагонистическую в отношении ИФН активность. Мутации в вирусных генах, которые могут регулировать экспрессию гена, ответственного за ИФН-антагонистическую активность, находятся также в объеме вирусов, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением.
Данное изобретение относится также к мутациям в сегементе гена NS1, которые не приводят к измененной ИФН-антагонистической активности или ИФН-индуцирующему фенотипу, а скорее приводят к измененным вирусным функциям и аттенуированному фенотипу, например, измененному ингибированию ядерного экспорта поли(А)-содержащей мРНК, измененному ингибированию сплайсинга пре-мРНК, измененному ингибированию активации PKR путем связывания dsPHK, измененному влиянию на трансляцию вирусной РНК и измененному ингибированию полиаденилирования мРНК хозяина (например, см. Krug in Textbook of Influenza, Nicholson et al., Ed. 1998, 82-92, и цитированные в этой статье ссылки).
Способ обратной генетики включает в себя получение синтетических рекомбинантных вирусных РНК, которые содержат некодирующие районы вирусной РНК с минус-цепью, которые являются существенными для узнавания вирусными полимеразами и для упаковки сигналов, необходимых для генерирования зрелого вириона. Эти рекомбинантные РНК синтезируют из рекомбинантной ДНК-матрицы и воспроизводят in vitro с очищенным вирусным полимеразным комплексом с получением рекомбинантных рибонуклеопротеинов (РНП), которые могут быть использованы для трансфекции клеток. Более эффективная трансфекция достигается, если белки вирусной полимеразы присутствуют во время транскрипции синтетических РНК либо in vitro, либо in vivo. Синтетические рекомбинантные РНП могут быть спасены введением в инфекционные вирусные частицы. Вышеупомянутые способы описаны в патенте США №5166057, выданном 24 ноября 1992 года; в патенте США №5854037, выданном 29 декабря 1998 года; в Европейской патентной публикации ЕР 0702085А1, опубликованной 20 февраля 1996 года; в патентной заявке США с регистрационным номером 09/152845; в Международных патентных публикациях РСТ WO 97/12032, опубликованной 3 апреля 1997 года; WO 96/34625, опубликованной 7 ноября 1996 года; в Европейской патентной публикации ЕР-А780475; WO 99/02657, опубликованной 21 января 1999 года; WO 98/53078, опубликованной 26 ноября 1998 года; WO 98/02530, опубликованной 22 января 1998 года; WO 99/15672, опубликованной 1 апреля 1999 года; WO 98/13501, опубликованной 2 апреля 1998 года; WO 97/06270, опубликованной 20 февраля 1997 года, и ЕРО 780 47SA1, опубликованной 25 июня 1997 года, каждая из которых включена здесь в виде полной ссылки.
Аттенуированные вирусы, генерируемые подходом обратной генетики, могут быть использованы в вакцинных и фармацевтических композициях, описанных здесь. Способы обратной генетики могут быть использованы для конструирования дополнительных мутаций для других вирусных генов, важных для получения вакцин - т.е. эпитопы ценных вариантов вакцинных штаммов могут быть введены генной инженерией в аттенуированный вирус. Альтернативно, полностью чужеродные эпитопы, в том числе антигены, полученные из других вирусных или невирусных патогенов, могут быть введены генной инженерией в аттенуированный штамм. Например, в аттенуированный штамм могут быть введены генной инженерией антигены неродственных вирусов, таких как ВИЧ (gp160, gp120, gp41), антигены паразитов (например, малярии), бактериальные или грибковые антигены или опухолевые антигены. Альтернативно, эпитопы, изменяющие тропизм вируса in vivo, могут быть введены генной инженерией в химерные аттенуированные вирусы данного изобретения.
В альтернативном варианте, комбинация способов обратной генетики и способов реаранжировки (вирусной рекомбинации) могут быть использованы для конструирования аттенуированных вирусов, имеющих желательные эпитопы в сегментированных РНК-вирусах. Например, аттенуированный вирус (полученный естественным отбором, посредством мутагенеза или при помощи способов обратной генетики) и штамм, несущий желательный вакцинный эпитоп (полученный естественным отбором, посредством мутагенеза или при помощи способов обратной генетики), могут быть коинфицированы в хозяев, которые разрешают рекомбинацию сегментированных геномов. Рекомбинантные вирусы, которые проявляют как аттенуированный фенотип, так и желательный эпитоп, могут быть затем отобраны.
В другом варианте, вирус, который должен быть мутирован, является ДНК-вирусом (например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом, бакуловирусом) или плюс-цепью РНК-вируса (например, полиовируса). В таких случаях, могут быть использованы способы рекомбинантных ДНК, которые хорошо известны в данной области (например, см. патент США №4769330, выданный Paoletti, патент США №4215051, выданный Smith, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки в полном виде).
Любой вирус может быть сконструирован в соответствии с данным изобретением, в том числе вирусы семейств, представленных в таблице 2.
Используемые аббревиатуры: ds = двухцепочечная; ss = одноцепочечная; заключенные в оболочку = обладающие наружным липидным бислоем, образованным из мембраны клетки-хозяина; позитивный смысловой геном = для РНК-вирусов, геномы, которые составлены из нуклеотидых последовательностей, которые непосредственно транслируются на рибосомах, = для ДНК-вирусов, геномы, которые составлены из нуклеотидных последовательностей, которые являются теми же самыми, что и мРНК; негативный смысловой геном = геномы, которые составлены из нуклеотидных последовательностей, комплементарных позитивной-смысловой цепи.
В предпочтительных вариантах, данное изобретение относится к генетически сконструированным вирусам гриппа, содержащим делеции и/или усечения продукта гена NS1. NS1-мутанты вирусов гриппа А и В являются особенно предпочтительными. В одном подходе, части аминоконцевого района продукта гена NS1 являются сохраненными, тогда как части С-концевого района продукта гена NS1 делетированы. Специфические желательные мутации могут быть сконструированы посредством вставки, делеции или мутации нуклеиновой кислоты в подходящем кодоне. В частности, укороченные NS1-белки имеют 1-60 аминокислот, 1-70 аминокислот, 1-80 аминокислот, 1-90 аминокислот (N-концевой аминокислотой является аминокислота 1), и предпочтительно 90 аминокислот; 1-100 аминокислот и предпочтительно 99 аминокислот; 1-120 аминокислот; или 1-130 аминокислот и предпочтительно 124 аминокислоты продукта гена NS1 дикого типа.
Данное изобретение относится также к любому сконструированному с использованием генной инженерии вирусу гриппа, в котором продукт гена NS1 был модифицирован укорачиванием или модификацией белка NS1, которая придает мутантным вирусам следующие фенотипы: способность этих вирусов расти до высоких титров в нестандартных субстратах, таких как 6-7-дневные куриные яйца, или способность этих вирусов индуцировать ответную реакцию хозяина в виде интерферонов. В случае вирусов гриппа А, они включают в себя, но не ограничиваются ими, вирусы, имеющие укороченные NS1.
Данное изобретение включает в себя применение природно встречающихся мутантов вирусов гриппа А или В, имеющих аттенуированный фенотип, а также штаммов вируса гриппа, сконструированных для содержания таких мутаций, ответственных за аттенуированный фенотип. В случае вирусов гриппа А, они включают в себя, но не ограничиваются ими: вирусы, имеющие NS1 из 124 аминокислот (Norton et al., 1987, Virology 156: 204-213, включенный здесь в качестве ссылки во всей своей полноте). В случае вирусов гриппа В, они включают в себя, но не ограничиваются ими: вирусы, имеющие укороченный мутантный NS1, содержащий 127 аминокислот, полученных из N-конца (В/201) (Norton et al., 1987, Virology 156: 204-213, включенный здесь в качестве ссылки во всей своей полноте), и вирусы, имеющие укороченный мутантный NS1, содержащий 90 аминокислот, полученных из N-конца (B/AWBY-234) (Tobita et al., 1990, Virology 174: 314-19, включенный здесь в качестве полной ссылки). Данное изобретение включает в себя применение природно встречающихся мутантов, аналогичных NS1/38, NS1/80, NS1/124 (Egorov, et al., 1998, J.Virol. 72 (8): 6437-41), а также природно встречающихся мутантов, A/Turkey/ORE/71, В/201 или B/AWBY-234.
Аттенуированный вирус гриппа может быть дополнительно сконструирован для экспрессии антигенов других вакцинных штаммов (например, с использованием обратной генетики или рекомбинации (реаранжировки)). Альтернативно, аттенуированные вирусы гриппа могут быть сконструированы с использованием обратной генетики или рекомбинации с генетически сконструированными вирусами, для экспрессии полностью чужеродных эпитопов, например, антигенов других инфекционных патогенов, опухолевых антигенов или нацеливающих антигенов. Поскольку РНК-сегмент NS является самым коротким среди восьми сегментов вирусных РНК, возможно, что РНК NS будет выдерживать более длинные вставки гетерологичных последовательностей, чем другие вирусные гены. Кроме того, РНК-сегмент NS регулирует синтез высоких уровней белка в инфицированных клетках, что позволяет предположить, что он мог бы быть идеальным сегментом для инсерций чужеродных антигенов. Однако, в соответствии с данным изобретением, любой из восьми сегментов вирусов гриппа может быть использован для встраивания гетерологичных последовательностей. Например, если желательно представление (презентация) поверхностного антигена, могут быть использованы сегменты, кодирующие структурные белки, например, НА или NA.
5.2 СИСТЕМЫ СЕЛЕКЦИИ НА ОСНОВЕ РЕСТРИКЦИИ ХОЗЯИНА
Данное изобретение включает в себя способы селекции вирусов, которые имеют желательный фенотип, т.е. вирусов, которые имеют низкую ИФН-антагонистическую активность или не имеют ИФН-антагонистической активности, полученных из природных вариантов, спонтанных вариантов (т.е. вариантов, которые эволюционировали во время развития вирусов), мутагенизированных природных вариантов, рекомбинантных вирусов (образованных рекомбинацией между вирусами) и/или генетически сконструированных вирусов. Такие вирусы могут быть лучше всего подвергнуты скринингу в анализах различающегося роста, в которых сравнивают рост в ИФН-недостаточных и ИФН-компетентных системах-хозяевах. Вирусы, которые демонстрируют лучший рост в ИФН-недостаточных системах в сравнении с ИФН-компетентными системами, отбирают; предпочтительно отбирают вирусы, которые растут до титров, по меньшей мере на один log более высоких в ИФН-недостаточных системах в сравнении с ИФН-компетентной системой.
Альтернативно, вирусы могут быть подвергнуты скринингу с использованием тест-систем ИФН, например, транскрипции, на основе тест-систем, в которых экспрессия репортерного гена регулируется ИФН-чувствительным промотором. Экспрессия репортерного гена в инфицированных клетках в сравнении с неинфицированными клетками может измеряться для идентификации вирусов, которые эффективно индуцируют ИФН-ответ, но которые неспособны противодействовать ИФН-ответу. Однако, в предпочтительном варианте для отбора вирусов, имеющих желательный фенотип, используют тесты дифференциального (различающегося) роста, так как используемая система-хозяин (ИФН-компетентная в сравнении с ИФН-недостаточной) накладывет соответствующее давление на отбор.
Например, рост вируса (измеряемый титром) может быть сравнен в различных клетках, клеточных линиях или модельных системах животных, которые экспрессируют ИФН и компоненты ИФН-ответа, в сравнении с клетками, клеточными линиями или модельными системами животных, недостаточных в отношении ИФН или компонентов ИФН-ответа. Для этой цели можно сравнивать рост вируса в клеточных линиях клеток VERO (которые являются ИФН-недостаточными) с ростом вируса в клетках MDCK (которые являются ИФН-компетентными). Альтернативно, ИФН-недостаточные клеточные линии могут быть произведены и получены из животных, выведенных или полученных с использованием генной инженерии для того, чтобы они были недостаточными по ИФН-системе (например, мутант мышей STAT1-/-). Может быть измерен рост вируса в таких клеточных линиях, в сравнении с ИФН-компетентными клетками, полученными, например, из животных дикого типа (например, мышей дикого типа). Еще в одном варианте, клеточные линии, которые являются ИФН-компетентными и о которых известно, что они поддерживают рост вируса дикого типа, могут быть сконструированы таким образом, что они будут ИФН-недостаточными (например, посредством нокаута STAT1, IRF3, PKR и т.д.). Могут быть использованы способы, которые хорошо известны в данной области для размножения вирусов в клеточных линиях (см., например, рабочие примеры infra). Можно сравнивать рост вируса в стандартной ИФН-компетентной клеточной линии и рост вируса в ИФН-недостаточной генетически сконструированной клеточной линии.
Могут быть также использованы системы животных. Например, для гриппа, рост в молодых, ИФН-недостаточных яйцах с развивающимися эмбрионами, например, приблизительно 6-8-дневных, может сравниваться с ростом в ИФН-компетентных яйцах "большего возраста", например, приблизительно 10-12-дневных. Для этой цели, могут быть использованы способы, хорошо известные в данной области для инфицирования и размножения в яйцах (например, см. рабочие примеры infra). Альтернативно, рост в ИФН-недостаточных мышах STAT1-/- может сравниваться с ростом в ИФН-компетентных мышах дикого типа. Еще в одном альтернативном варианте, рост в ИФН-недостаточных яйцах с развивающимися эмбрионами, продуцируемыми, например, STAT1-/- трансгенной домашней птицей, можно сравнивать с ростом в ИФН-компетентных яйцах, продуцируемых домашней птицей дикого типа.
Однако, для целей скрининга, могут использоваться временно ИФН-недостаточные системы вместо генетически сконструированных систем. Например, система-хозяин может быть обработана соединениями, которые ингибируют продуцирование ИФН или компонентов ИФН-ответа (например, лекарственными средствами, антителами против ИФН, антителами против рецептора ИФН, ингибиторами PKR, антисмысловыми молекулами и рибозимами и т.д.). Рост вируса можно сравнивать в ИФН-компетентных необработанных контролях против ИФН-недостаточных обработанных систем. Например, яйца с развивающимися эмбрионами "большего возраста", которые являются ИФН-компетентными, могут быть предобработаны такими лекарственными средствами перед инфицированием подлежащим скринингу вирусом. Рост сравнивают с ростом, достигаемым в необработанных контрольных яйцах с развивающимися эмбрионами того же самого возраста.
Способы скрининга данного изобретения обеспечивают простой и легкий скрининг для идентификации мутантных вирусов с устраненной ИФН-антагонистической активностью по неспособности мутантного вируса расти в средах с ИФН-ответом (ИФН-компетентных средах), в сравнении со способностью этого мутантного вируса расти в ИФН-недостаточных средах. Способы скрининга данного изобретения могут быть также использованы для идентификации мутантных вирусов с измененной, но не с устраненной ИФН-антагонистической активностью путем измерения способности мутантного вируса расти как в среде с ИФН-ответом, например, в яйцах с 10-дневными развивающимися эмбрионами или клетках MDCK, так и в ИФН-недостаточных средах, например, в яйцах с 6-7-дневными развивающимися эмбрионами или клетках Vero. Например, вирусы гриппа, обнаруживающие по меньшей мере на один log более низкие титры в 10-дневных яйцах против 6-7-дневных яиц, будут считаться вирусами, ухудшенными в их способности ингибировать ИФН-ответ. В другом примере, вирусы гриппа, обнаруживающие по меньшей мере на один log более низкий титр в 12-дневных яйцах (которые устанавливают высокий ИФН-ответ) против 10-дневных яиц (которые устанавливают умеренный ИФН-ответ), считаются частично ухудшенными в их способности противодействовать ИФН-ответу и рассматриваются в качестве привлекательных вакцинных кандидатов.
Способы отбора данного изобретения включают в себя также идентификацию мутантных вирусов, которые индуцируют ИФН-ответы. В соответствии со способами отбора данного изобретения, индукция ИФН-ответов может быть измерена определением уровней экспрессии ИФН или экспрессии генов-мишеней или репортерных генов, индуцированных ИФН, после инфицирования мутантным вирусом или активацией трансактиваторами, участвующими в экспрессии ИФН и/или ИФН-ответной реакции.
Еще в одном варианте систем селекции данного изобретения индукция ИФН-ответов может быть определена измерением фосфорилированного состояния компонентов пути ИФН после инфекции испытуемым мутантным вирусом, например, состояния компонента IRF-3, который фосфорилируется в ответ на двухцепочечную РНК. В ответ на ИФН типа I, киназа Jakl и киназа TyK2, субъединицы рецептора ИФН, STAT1 и STAT2, быстро фосфорилируются по тирозину. Таким образом, чтобы определить, индуцирует ли мутантный вирус ИФН-ответы, клетки, такие как клетки 293, инфицируют испытуемым мутантным вирусом и после инфицирования эти клетки лизируют.
Компоненты пути ИФН, такие как киназа Jakl и киназа TyK2, осаждают иммунопреципитацией из лизатов инфицированных клеток с использованием специфических поликлональных сывороток или антител и тирозин-фосфорилированное состояние киназы определяют иммуноблоттингом с антителом против фосфотирозина (например, см. Krishnan et al., 1997, Eur. J.Biochem. 247: 298-305). Состояние повышенного фосфорилирования любого из компонентов ИФН-пути после инфекции мутантным вирусом указывало бы на индукцию ИФН-ответов мутантным вирусом.
Еще в одном варианте, системы селекции данного изобретения включают в себя измерение способности связывать специфические последовательности ДНК или транслокации факторов транскрипции, индуцируемой в ответ на вирусную инфекцию, например, IRF3, STAT1, STAT2 и т.д. В частности, STAT1 и STAT2 фосфорилируются и транслоцируются из цитоплазмы в ядро в ответ на ИФН типа I. Способность связывать специфические последовательности ДНК или транслокация факторов транскрипции могут быть измерены способами, хорошо известными специалистам в данной области, например, тестами смещения электромобильности в геле, окрашиванием клеток и т.д.
Еще в одном варианте систем селекции данного изобретения, индукция ИФН-ответов может быть определена измерением ИФН-зависимой активации транскрипции после инфекции испытуемым мутантным вирусом. В этом варианте, экспрессия генов, о которых известно, что они индуцируются ИФН, например, Mx, PKR, 2-5-олигоаденилатсинтетазы, главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и т.д., может анализироваться способами, известными специалистам с квалификацией в данной области (например, нозерн-блоттингом, вестерн-блоттингом, ПЦР и т.д.). Альтернативно, тест-клетки, такие как клетки почек эмбриона человека или клетки остеогенной саркомы человека, конструируют с использованием генной инженерии для временной (преходящей) или конститутивной экспрессии репортерных генов, таких как репортерный ген люциферазы или репортерный ген хлорамфениколтрансферазы (CAT), под контролем элемента стимулируемого интерфероном ответа, такого как ИФН-стимулируемый промотор гена ISG-54K (Bluyssen et al., 1994, Eur. J.Biochem. 220: 395-402). Клетки инфицируют испытуемым мутантным вирусом и уровень экспрессии репортерного гена сравнивают с уровнем в неинфицированных клетках или клетках, инфицированных вирусом дикого типа. Увеличение уровня экспрессии репортерного гена после инфекции испытуемым вирусом указывало бы, что испытуемый мутантный вирус индуцирует ИФН-ответ.
В другом варианте, системы селекции данного изобретения включают в себя измерение индукции ИФН путем определения, способен ли экстракт из клеток или яйца, инфицированных испытуемым мутантным вирусом, придавать защитную активность против вирусной инфекции. Более конкретно, группы куриных яиц с 10-дневными развивающимися эмбрионами инфицируют испытуемым мутантным вирусом или вирусом дикого типа. Приблизительно через 15-20 ч после инфекции аллантоисную жидкость собирают и тестируют на активность ИФН путем определения наивысшего разведения с защитной активностью против VSV-инфекции в клетках культуры ткани, таких как клетки CEF.
5.3 РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСА В ИНТЕРФЕРОН-НЕДОСТАТОЧНЫХ
СУБСТРАТАХ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ
Данное изобретение включает в себя также способы и ИФН-недостаточные субстраты для выращивания и выделения природно встречающихся или полученных генной инженерией мутантных вирусов, имеющих измененную ИФН-антагонистическую активность. ИФН-недостаточные субстраты, которые могут быть использованы для поддержания роста аттенуированных мутантных вирусов, включают в себя, но не ограничиваются ими, природно встречающиеся клетки, клеточные линии, животных или яйца с развивающимися эмбрионами; рекомбинантные клетки или клеточные линии, которые сконструированы таким образом, чтобы они были ИФН-недостаточными, например, ИФН-недостаточные клеточные линии, полученные из мышей с STAT1-нокаутом или других подобным образом полученных трансгенных животных; яйца с развивающимися эмбрионами, полученные из ИФН-недостаточных птиц, в частности, домашней птицы (например, кур, уток, индеек), в том числе стад птиц, которых разводили, чтобы они были ИФН-недостаточными, или трансгенных птиц (например, со STAT1-нокаутами). Альтернативно, эта система-хозяин, например, клетки, клеточные линии, яйца или животные, могут быть получены с использованием генной инженерии для экспрессии трансгенов, кодирующих ингибиторы ИФН-системы, например, доминантно-негативные мутанты, такие как STAT1, не имеющий ДНК-связывающего домена, антисмысловая РНК, рибозимы, ингибиторы образования ИФН, ингибиторы передачи сигнала ИФН и/или ингибиторы антивирусных генов, индуцируемых ИФН. Должно быть понятно, что животные, которых разводили или получали генной инженерией для того, чтобы они были ИФН-недостаточными, будут иметь в некоторой степени ослабленный иммунитет и должны содержаться в контролируемой, не допускающей заболеваний среде. Таким образом, должны быть приняты меры (в том числе применение добавляемых в рацион антибиотиков) для ограничения риска экспонирования инфекционным агентам трансгенных ИФН-недостаточных животных, таких как поголовья (стада) разводимых кур, уток, индеек и т.д. Альтернативно, эта система-хозяин, например, клетки, клеточные линии, яйца или животные, могут быть обработаны соединением, которое ингибирует образование ИФН и/или путь ИФН, например, лекарственными средствами, антителами, антисмысловыми молекулами, молекулами рибозимов, нацеленными на ген STAT1, и/или антивирусные гены, индуцированные ИФН.
Согласно данному изобретению, незрелые куриные яйца с развивающимися эмбрионами представляют собой яйца, которые, как само собой разумеется, являются яйцами до 10-дневного возраста, но еще не 10-дневными, предпочтительно шестидевятидневные; и яйца, которые искусственно имитируют незрелые яйца до возраста 10 дней, но еще не 10-дневные, в результате изменений условий роста, например, изменениями температур инкубации; обработкой лекарственными средствами или любым другим изменением, которое приводит к получению яиц с замедленным развитием, так что система ИФН яйца не развивается полностью в сравнении с 10-12-дневными яйцами.
5.3.1 ПРИРОДНЫЕ ИФН-НЕДОСТАТОЧНЫЕ СУБСТРАТЫ
В одном варианте, данное изобретение относится к выращиванию природно встречающихся и полученных генной инженерией мутантных вирусов в нестандартных субстратах, таких как незрелые яйца с развивающимися эмбрионами, которые еще не развили ИФН-систему. Незрелые яйца с развивающимися эмбрионами обычно не применяют для выращивания вируса вследствие их ослабленного состояния и меньшего аллантоисного объема. Данное изобретение включают в себя выращивание мутантных вирусов в яйцах с развивающимися эмбрионами с возрастом менее 10 дней; предпочтительно выращивание мутированного вируса в яйцах с 8-дневными развивающимися эмбрионами и наиболее предпочтительно в 6-8-дневных яйцах.
Данное изобретение включает в себя также способы выращивания и выделения мутированных вирусов, имеющих измененную ИФН-антагонистическую активность, в клетках и клеточных линиях, которые природно не имеют ИФН-пути или имеют недостаточный ИФН-путь или имеет недостаточность в системе ИФН, например, низкие уровни экспрессии ИФН, в сравнении с клетками дикого типа. В конкретном предпочтительном варианте, данное изобретение относится к способам выращивания мутированных вирусов, имеющих измененную антагонистическую в отношении ИФН активность, в клетках Vero.
5.3.2 ПОЛУЧЕННЫЕ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИЕЙ ИФН-НЕДОСТАТОЧНЫЕ СУБСТРАТЫ
Данное изобретение относится к способам выращивания и выделения мутированных вирусов, имеющих измененную антагонистическую в отношении ИФН активность, в полученном генной инженерией ИФН-недостаточном субстрате. Данное изобретение включает в себя трансгенных птиц, в которых ген, существенный для ИФН-системы, является мутированным, например, STAT1, которые могли бы откладывать яйца, которые являются ИФН-недостаточными. Кроме того, данное изобретение включает в себя трансгенных птиц, которые экспрессируют доминантно-негативные факторы транскрипции, например, STAT1, не имеющий ДНК-связывающего домена, рибозимы, антисмысловые РНК, ингибиторы продуцирования ИФН, ингибиторы антивирусных генов, индуцируемых в ответ на ИФН. Выгодность использования яиц от ИФН-недостаточной птицы заключается в том, что обычные яйца 10-дневного возраста могут быть использованы для выращивания вируса, так как они являются более стабильными и имеют больший объем вследствие их большего размера. Еще в одном варианте, могут быть получены генной инженерией клеточные линии, которые являются ИФН-недостаточными. Данное изобретение включает в себя клеточные линии, в которых ген, существенный для синтеза ИФН, пути ИФН и/или антивирусного гена (генов), индуцированных ИФН, являются мутированными, например, STAT1.
Данное изобретение обеспечивает рекомбинантные клеточные линии или животных, в частности, птиц, в которых один или несколько генов, существенных для пути ИФН, например, рецептора интерферона, STAT1 и т.д., были разрушены, т.е. являются "нокаутированными"; рекомбинантное животное может быть любым животным, но в предпочтительном варианте оно является птицей, например, цыпленком, индейкой, взрослой курицей, уткой и т.д. (см., например, Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry, et al., 1993, Transgenic Res. 2: 125; Stern, C.D., 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212: 195-206 и Shuman, 1997, Experientia 47: 897 в отношении обзоров, касающихся получения птичьих трансгенных животных, каждый их которых включен здесь в качестве сссылки во всей полноте). Такие клеточная линия или животное могут быть получены любым способом, известным в данной области для разрушения гена на хромосоме клетки или животного. Такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, микроинъекцию пронуклеуса (Норре & Wagner, 1989, патент США №4873191); опосредованный ретровирусом перенос гена в клетки зародышевой линии (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152); направленную доставку генов в эмбриональных стволовых клетках (Thompson et al., 1989, Cell 56: 313); электропорацию эмбрионов (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803) и опосредованный сперматозоидами перенос генов (Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717) и т.д. В отношении обзора таких способов см. Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171, включенный здесь в качестве ссылки во всей полноте.
В частности, животное с нокаутом STAT1 может быть получено стимуляцией гомологичной рекомбинации между геном STAT1 в его хромосоме и экзогенным геном STAT1, который был сделан биологически неактивным (предпочтительно встраиванием гетерологичной последовательности, например, гена устойчивости к антибиотику). Способы гомологичной рекомбинации для разрушения генов в геноме мышей описаны, например, Capecchi (1989, Science 244: 1288) и Mansour et al. (1988, Nature 336: 348).
Вкратце, весь геномный клон STAT1 или его часть выделяют из геномной ДНК из того же самого вида, к которому относятся клетка или животное с нокаутом гена. Геномный клон STAT1 может быть выделен любым способом, известным в данной области для выделения геномных клонов (например, зондированием геномной библиотеки зондом, произведенным из последовательности STAT1, таким как последовательности, представленные в работах Meraz et al., 1996, Cell 84: 431; Durbin et al., 1996, Cell 84: 443 и цитированных в ней ссылках). После выделения геномного клона весь этот клон или его часть вводят в рекомбинантный вектор. Предпочтительно, часть этого клона, вводимая в вектор, содержит по меньшей мере часть экзона гена STAT1, т.е. содержит кодирующую белок STAT1 последовательность. Затем последовательность, не гомологичную этой последовательности STAT1, предпочтительно маркер позитивного отбора, такой как ген, кодирующий устойчивость к антибиотику, вводят в экзон гена STAT1. Предпочтительно, этот селектируемый маркер функционально (оперативно) связан с промотором, более предпочтительно с конститутивным промотором. Негомологичную последовательность вводят в любом месте в кодирующей последовательности STAT1, в котором она будет нарушать активность STAT1, например, в положении, в котором, как было продемонстрировано, точковые мутации или иные мутации инактивируют функцию белка STAT1. Например, но не в качестве органичения, негомологичная последовательность может быть встроена в кодирующую последовательность для части белка STAT1, содержащую весь киназный домен или его часть (например, нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере 50, 100, 150, 200 или 250 аминокислот киназного домена).
Позитивный селектируемый маркер представляет собой предпочтительно ген устойчивости к неомицину (ген nео) или ген устойчивости к гигромицину (ген hygro). Промотор может быть любым промотором, известным в данной области; например, этот промотор может быть промотором фосфоглицераткиназы (PGK) (Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74), промотором PolII (Soriano et al., 1991, Cell 64: 693-701) или промотором МС1, который является синтетическим промотором, сконструированным для экспрессии стволовых клеток, происходящих из эмбриона (Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512). Применение селектируемого маркера, такого как ген устойчивости к антибиотику, делает возможным отбор клеток, которые включили нацеливающий вектор (например, экспрессия продукта гена nео придает устойчивость к G418, а экспрессия продукта гена hygro придает устойчивость к гигромицину).
В предпочтительном варианте, негативный селектируемый маркер для стадии "противоотбора" (негативного отбора) на гомологичную (в противоположность негомологичной) рекомбинацию вектора встраивают вне вставки геномного клона STAT1. Например, таким негативным селектируемым маркером является ген тимидинкиназы HSV (HSV-tk), экспрессия которого делает клетки чувствительными к ганцикловиру. Предпочтительно, негативный селектируемый маркер находится под контролем промотора, такого как, но не ограничиваясь ими, промотор PGK, промотор PolII или промотор МС1.
Когда имеет место гомологичная рекомбинация, части вектора, которые являются гомологичными гену STAT1, а также негомологичная вставка в последовательностях гена STAT1 включаются в ген STAT1 в хромосоме, а оставшаяся часть вектора теряется. Таким образом, поскольку негативный селектируемый маркер находится вне региона гомологии с геном STAT1, клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация (или их потомство), не будут содержать негативного селектируемого маркера. Например, если негативным селектируемым маркером является ген HSV-tk, клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация, не будут экспрессировать тимидинкиназу и будут выдерживать воздействие ганцикловиром. Эта процедура позволяет отбирать клетки, в которых произошла гомологичная комбинация, в сравнении с негомологичной рекомбинацией, в которой, по-видимому, негативный селектируемый маркер также встраивается в геном вместе с последовательностями STAT1 и позитивным селектируемым маркером. Таким образом, клетки, в которых произошла негомологичная рекомбинация, наиболее вероятно, экспрессируют тимидинкиназу и являются чувствительными к ганцикловиру.
После приготовления нацеливающего вектора его линеаризуют рестриктазой, для которой в этом нацеливающем векторе имеется уникальный сайт, и этот линеаризованный вектор вводят в полученные из эмбриона стволовые клетки (ES) (Gossler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069) любым способом, известным в данной области, например, электропорацией. Если нацеливающий вектор содержит позитивный селектируемый маркер и негативный противоселектируемый маркер, клетки ES, в которых произошла гомологичная рекомбинация, могут быть отобраны инкубированием в селективных средах. Например, если селектируемыми маркерами являются ген устойчивости neo и ген HSV-tk, на клетки воздействуют G418 (например, приблизительно 300 мкг/мл) и ганцикловиром (например, приблизительно 2 мкМ).
Любой способ, известный в данной области для генотипирования, например, но не только, блоттинг по Саузерну или полимеразная цепная реакция, может быть использован для подтверждения, что нарушенные последовательности STAT1 гомологично рекомбинировались в ген STAT1 в геноме клеток ES. Поскольку рестрикционная карта геномного клона STAT1 известна и последовательность нуклеотидов кодирующей последовательности STAT1 известна (см. Meraz et al., 1996, Cell 84: 431; Durbin et al., 1996, Cell 84: 443-450 и все цитированные в них ссылки), может быть определен размер конкретного фрагмента рестрикции или продукта ПЦР-амплификации, генерируемых из ДНК как из нарушенных, так и из ненарушенных аллелей. Таким образом, посредством анализа на рестрикционный фрагмент или ПЦР-продукт, размер которого различается между нарушенным и ненарушенным геном STAT1, можно определить, произошла ли гомологичная рекомбинация, разрушающая ген STAT1.
Клетки ES с нарушенным локусом STAT1 могут быть затем введены в бластоцисты микроинъекцией и затем эти бластоцисты могут быть имплантированы в матки псевдобеременных мышей при помощи рутинных способов. Животные, которые развиваются из имплантированных бластоцист, являются химерными в отношении нарушенного аллеля. Химерные самцы могут быть скрещены с самками, и это скрещивание может быть построено таким образом, что перенос аллеля в клетки зародышевой линии связан с переносом определенной окраски шерстного покрова. Передача аллеля в гаплоидные клетки может быть подтверждена блоттингом по Саузерну или ПЦР-анализом, как описано выше, геномной ДНК, выделенной из проб ткани.
5.3.3 ВРЕМЕННЫЕ ИФН-НЕДОСТАТОЧНЫЕ СУБСТРАТЫ
Клетки, клеточные линии, животные или яйца могут быть предобработаны соединениями, которые ингибируют ИФН-систему. Согласно данному изобретению, соединения, которые ингибируют синтез ИФН или активность или экспрессию компонентов ИФН-системы, могут быть использованы для предварительной обработки хозяев, например, соединения, которые ингибируют синтез ИФН, активность ИФН, рецептор ИФН, другие мишени в пути трансдукции сигнала ИФН, или соединения, которые ингибируют активность антивирусных генов, индуцируемых ИФН. Примеры соединений, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, включают в себя, но не ограничиваются ими, молекулы нуклеиновых кислот, антитела, пептиды, антагонисты рецептора ИФН, ингибиторы пути STAT1, ингибиторы PKR и т.д. В соответствии с данным изобретением, молекулы нуклеиновых кислот включают в себя антисмысловые молекулы, рибозимы и молекулы с тройной спиралью, которые действуют на гены, кодирующие существенные компоненты ИФН-системы, например, STAT1. Эти молекулы нуклеиновых кислот включают в себя также нуклеотиды, кодирующие доминантно-негативные мутанты компонентов ИФН-системы; например, перед инфицированием вирусным мутантом клетки могут быть трансфицированы ДНК, кодирующей укороченный, некомпетентный в передаче сигнала мутант рецептора ИФН.
Доминантно-негативные мутанты, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением для ингибирования ИФН-пути, включают в себя дефектные по киназе версии факторов транскрипции Jakl, TyK2 или STAT1 (см., например, Krishnan et al., 1997, Eur. J.Biochem. 247: 298-305).
5.4. ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ
Данное изобретение включает в себя вакцинные композиции, содержащие аттенуированные РНК-вирусы с минус-цепью, имеющие ослабленную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу, и подходящий наполнитель. Вирус, используемый в вакцинной композиции, может быть выбран из природно встречающихся мутантов или вариантов, мутагенизированных вирусов или генетически сконструированных вирусов. Аттенуированные штаммы сегментированных РНК-вирусов могут быть также получены посредством способов рекомбинации или с использованием комбинации методов обратной генетики и способов рекомбинации. Природно встречающиеся варианты включают в себя вирусы, выделенные из природы, а также спонтанные встречающиеся варианты, генерируемые во время размножения вирусов, имеющие нарушенную способность противодействовать клеточному ИФН-ответу. Этот аттенуированный вирус может сам быть использован в качестве активного ингредиента в вакцинной композиции. Альтернативно, аттенуированный вирус может быть использован в качестве вектора или "каркаса" полученных рекомбинантным способом вакцин. Для этой цели, рекомбинантные способы, такие как обратная генетика (или, для сегментированных вирусов, комбинации обратной генетики и способов рекомбинации) могут быть использованы для конструирования мутаций или введения чужеродных антигенов в аттенуированный вирус, используемый в вакцинной композиции. Таким путем могут быть сконструированы вакцины для иммунизации против вариантов штаммов или, альтернативно, против совершенно отличающихся агентов или антигенов заболевания.
В сущности, любая последовательность гетерологичного гена может быть введена генной инженерией в вирусы данного изобретения для использования в вакцинах. Предпочтительно, эпитопы, которые индуцируют защитную иммунную реакцию на любой из множества патогенов, или антигены, которые связывают нейтрализующие антитела, могут быть экспрессированы этими вирусами или в виде части этих вирусов. Например, последовательности гетерологичных генов, которые могут быть встроены в вирусы данного изобретения для использования в вакцинах, включают в себя, но не ограничиваются ими, эпитопы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такие как gp120; поверхностный антиген вируса гепатита В (НВsАg); гликопротеины вируса герпеса (например, gD, gE); VP1 полиовируса; антигенные детерминанты невирусных патогенов, таких как бактерии и паразиты, среди прочих. В другом варианте, могут экспрессироваться все гены иммуноглобулинов или их части. Например, вариабельные области антиидиотипических иммуноглобулинов, которые имитируют такие эпитопы, могут быть встроены в вирусы данного изобретения. Еще в одном варианте, могут быть экспрессированы ассоциированные с опухолями антигены.
Может быть приготовлена либо живая рекомбинантная вирусная вакцина, либо инактивированная рекомбинантная вирусная вакцина. Живая вакцина может быть предпочтительной, так как размножение в хозяине приводит к пролонгированному стимулу того же типа и диапазона, которые встречаются в природных инфекциях, и, следовательно, придают существенный, долгосрочный иммунитет. Получение таких живых рекомбинантных вирусных вакцинных композиций может выполняться с использованием общепринятых способов, включающих в себя размножение вируса в культуре клеток или в аллантоисе куриного эмбриона с последующей очисткой.
Вакцинные композиции могут включать в себя генетически сконструированные РНК-вирусы с минус-цепью, которые имеют мутации в гене NS1 или аналогичном гене, в том числе, но не ограничивающиеся ими, мутанты гриппа с укороченным NS1, описанные в рабочих примерах infra. Они могут быть также приготовлены с использованием природных вариантов, таких как природный вариант A/turkey/Ore/71 вируса гриппа А или В/201 и B/AWBY-234, которые являются природными вариантами гриппа В. При приготовлении в виде живой вирусной вакцины следует использовать диапазон от около 104 БОЕ до около 5×106 БОЕ на дозу.
Многие способы могут быть использованы для введения вакцинных композиций, описанных выше, они включают в себя, но не ограничиваются ими, интраназальный, внутритрахеальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный пути введения. Может быть предпочтительным введение вирусной вакцинной композиции через природный путь инфицирования патогена, для которого предназначена данная вакцина, или через природный путь инфицирования родительского аттенуированного вируса. При использовании живой вирусной вакцины гриппа, она может быть предпочтительно введена через природный путь инфекции вируса гриппа. Способность вируса гриппа индуцировать сильную секреторную и клеточную иммунную ответную реакцию, может быть выгодно использована. Например, инфекция дыхательных путей вирусами гриппа может индуцировать сильный секреторный иммунный ответ, например, в мочеполовой системе, с сопутствующей защитой против конкретного вызывающего данное заболевание агента.
Вакцина данного изобретения, содержащая 104-5×106 БОЕ мутантных вирусов с измененной ИФН-антагонистической активностью, могла бы вводиться один раз. Альтернативно, вакцина данного изобретения, содержащая 104-5×106 БОЕ мутантных вирусов с измененной ИФН-антагонистической активностью, могла бы вводиться два или три раза с интервалом 2-6 месяцев между дозами. Альтернативно, вакцина данного изобретения, содержащая 104-5×106 БОЕ мутантных вирусов с измененной ИФН-антагонистической активностью, могла бы вводиться так часто, как это необходимо для животного, предпочтительно млекопитающего и более предпочтительно человека.
5.5 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
Данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, содержащие мутантные вирусы с измененной ИФН-антагонистической активностью, для применения в качестве антивирусных агентов или противоопухолевых агентов или агентов против ИФН-чувствительных заболеваний. Эти фармацевтические композиции применимы в качестве антивирусных профилактических веществ и могут вводиться индивидууму с риском получения инфекции, или, как ожидается, с риском экспонирования вирусу. Например, в случае, когда ребенок приходит домой из школы, где он общался с несколькими одноклассниками, имеющими грипп, родитель мог бы сам ввести антивирусную фармацевтическую композицию этому ребенку и другим членам семьи для предупреждения вирусной инфекции и последующей болезни. Люди, путешествующие в разных частях света, где преобладает определенное инфекционное заболевание (например, вирус гепатита А, малярия и т.д.), могли бы также вводить такую композицию.
Альтернативно, эти фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения опухолей или предупреждения образования опухолей, например, у пациентов, которые имеют рак, или у пациентов, которые имеют высокий риск развития неоплазм или рака. Например, пациентам с раком можно вводить эту композицию для предотвращения дальнейшего онкогенеза. Альтернативно, композиции могут вводиться субъектам, которые соприкасаются с канцерогенами или в отношении которых ожидается, что они могут быть подвергнуты воздействию канцерогенов; индивидуумам, принимающим участие в очистке окружающей среды, которые могут быть подвергнуты воздействию загрязнителями среды (например, асбесту). Альтернативно, композиция может быть введена индивидуумам, которые подвергаются радиации, перед воздействием и после воздействия облучения (например, пациентам, подвергающимся высокой радиации, или пациентам, которые должны принимать канцерогенные лекарственные средства).
Применение аттенуированных вирусов данного изобретения в качестве противоопухолевых агентов основано на открытии авторов изобретения, что аттенуированный мутант вируса гриппа, содержащий делецию в его гене антагониста ИФН, способен уменьшать образование опухолей у мышей. Противоопухолевые свойства аттенуированных вирусов данного изобретения могут быть по меньшей мере частично связаны с их способностью индуцировать ИФН и ИФН-ответы. Альтернативно, противоопухолевые свойства аттенуированных вирусов данного изобретения могут быть связаны с их способностью специфически расти в опухолевых клетках и убивать опухолевые клетки, многие из которых, как известно, являются недостаточными в отношении ИФН-системы. Независимо от молекулярного механизма (механизмов), ответственных за эти противоопухолевые свойства, аттенуированные вирусы данного изобретения могут быть использованы для лечения опухолей или для предупреждения образования опухолей.
Кроме того, данное изобретение включает в себя мутантные вирусы с измененным ИФН-антагонистическим фенотипом, которые нацелены на специфические органы, ткани и/или клетки в теле для локальной индукции терапевтических или профилактических эффектов. Одним из преимуществ такого подхода является то, что ИФН-индуцирующие вирусы данного изобретения нацелены на специфические сайты, например, местоположения опухоли, для индукции ИФН предпочтительнее сайтспецифическим образом, чем для системной индукции ИФН, которая может иметь токсические эффекты.
Мутантные ИФН-индуцирующие вирусы данного изобретения могут быть сконструированы с использованием описанных здесь способов для экспрессии белков или пептидов, которые могли бы нацеливать эти вирусы на конкретный сайт. В предпочтительном варианте, ИФН-индуцирующие вирусы могли бы быть нацелены на сайты опухоли. В таком варианте, мутантные вирусы могут быть сконструированы для экспрессии антигенсвязывающего центра антитела, который узнается опухолеспецифическим антигеном, что приводит к нацеливанию ИФН-индуцирующего вируса на опухоль. Еще в одном варианте, в котором опухоль-мишень экспрессирует рецептор гормона, такая как опухоли молочной железы или яичника, которые экспрессируют рецепторы эстрогена, ИФН-индуцирующий вирус может быть сконструирован для экспрессии соответствующего гормона. Еще в одном варианте, в котором опухоль-мишень экспрессирует рецептор для фактора роста, например, VEGF, EGF или PDGF, может быть сконструирован ИФН-индуцирующий вирус для экспрессии подходящего фактора роста или его части (частей). Таким образом, в соответствии с данным изобретением, могут быть сконструированы ИФН-индуцирующие вирусы для экспрессии любого генного продукта-мишени, в том числе пептидов, белков, таких как ферменты, гормоны, факторы роста, антигены или антитела, функцией которых будет нацеливание вируса на участок (сайт), в котором требуется антивирусная, антибактериальная, антимикробная или противораковая активность.
Способы введения включают в себя, но не ограничиваются ими, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути введения. Фармацевтические композиции данного изобретения могут вводиться любым пригодным путем, например, инфузией или болюс-инъекцией, поглощением через эпителиальные и кожно-слизистые выстилки (например, слизистую оболочку полости рта, ректальную и кишечную слизистую оболочку и т.д.) и могут вводиться вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. Кроме того, в предпочтительном варианте может быть желательным введение фармацевтических композиций данного изобретения в легкие любым пригодным для этого путем. Может быть использовано также легочное введение, например, с использованием ингалятора или распылителя и композиции с образующим аэрозоль агентом.
В конкретном варианте, может быть желательным введение фармацевтических композиций данного изобретения локально к зоне, нуждающейся в лечении; это может быть достигнуто, например, местным нанесением, например, вместе с раневой повязкой после хирургии, посредством инъекции, при помощи катетера, с использованием суппозитория или с использованием имплантата, причем указанный имплантат является пористым, непористым или студенистым материалом, в том числе мембранами, такими как сиаластические мембраны, или волокнами. В одном варианте, введение может быть прямой инъекцией в месте (или в бывшем месте) злокачественной опухоли или неопластической или пре-неопластической ткани.
Еще в одном варианте, эта фармацевтическая композиция может быть доставлена в системе регулируемого высвобождения. В одном варианте, может быть использован насос (см. Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N.Engl. J.Med. 321: 574). В другом варианте, могут быть использованы полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J.Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; см. также Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., 1989, J.Neurosurg. 71: 105). Еще в одном варианте, система регулируемого высвобождения может быть помещена вблизи от мишени для композиции, а именно, легкого, что требует только части системной дозы (см., например, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp.115-138). Другие системы регулируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (1990, Science 249: 1527-1533).
Фармацевтические композиции данного изобретения содержат терапевтически эффективное количество аттенуированного вируса и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте, термин "фармацевтически приемлемый" обозначает одобренный органом контроля Федерального правительства или Правительства штата или занесенный в Фармакопею США или другие признанные фармакопеи для применения в животных и, более конкретно, в человеке. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которыми вводят фармацевтическую композицию. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина могут быть также использованы в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, высушенное сепарированное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций длительного высвобождения и т.п. Эти композиции могут быть приготовлены в виде суппозитория. Пероральная композиция может включать в себя стандартные носители, такие как имеющие фармацевтическую чистоту маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.д. Примеры пригодных фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences", by E.W.Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество терапевтического вещества, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, так чтобы обеспечить форму для правильного введения пациенту. Форма композиции должна подходить для способа введения.
Количество фармацевтической композиции данного изобретения, которое будет эффективным в лечении конкретного нарушения или состояния, будет зависеть от характера нарушения или состояния и может быть определено стандартными клиническими способами. Кроме того, могут быть необязательно использованы тесты in vitro для облегчения определения оптимальных диапазонов доз. Точная доза для использования в композиции будет также зависеть от способа введения и серьезности заболевания или нарушения и должна быть определена в соответствии с оценкой лечащего врача и из обстоятельств каждого пациента. Однако, подходящие диапазоны доз для введения составляют обычно около 104-5×106 БОЕ и дозы могут вводиться один раз или несколько раз с необходимыми интервалами. Фармацевтические композиции данного изобретения, содержащие 104-5×106 БОЕ мутантных вирусов с измененной ИФН-антагонистической активностью, могут вводиться интраназально, внутритрахеально, внутримышечно или подкожно. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или модельных систем животных.
6. ПРИМЕР: ГЕНЕРИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ С УКОРОЧЕННЫМ MS1 ВИРУСА ГРИППА А
6.1 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Вирус гриппа A/PR/8/34 (PR8) размножали в яйцах с 10-дневными развивающимися эмбрионами при 37°С. Вирус гриппа А 25А-1, рекомбинантный вирус, содержащий NS-сегмент из адаптированного к холоду штамма А/Ленинград/134/47/57, а остальные гены из вируса PR8 (Egorov et al., 1994, Vopr. Virusol. 39: 201-205; Shaw et al., 1996, in Option of the control of influenza III, eds. Brown, Hampson Webster (Elsevier Scienxe) pp.433-436), выращивали в клетках Vero при 34°С. Вирус 25А-1 является чувствительным к температуре в клетках млекопитающего и его использовали в качестве хелперного вируса для спасения трансфектантного вируса NS1/99. Клетки Vero и клетки MDCK, поддерживаемые в минимальной основной среде (MEM), содержащей 1 мкг/мл трипсина (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), использовали для выращивания вируса гриппа. Клетки Vero использовали также для отбора, очистки методом бляшек и титрования вируса NS1/99. Клетки MDCK поддерживали в DMEM (минимальной основной среде Дульбекко), содержащей 10% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку. Клетки Vero выращивали в среде AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
Плазмиду pT3NS1/99, которая содержит усеченную на С-конце форму NS1 из 99 аминокислот, получали следующим образом. Сначала pPUC19-T3/NS PR8, содержащую полный ген NS вируса PR8, фланкированный промотором РНК-полимеразы Т3 и сайтом рестрикции BpuAI, амплифицировали с использованием обратной ПЦР (Ochman et al., 1988, Genetics 120: 621-623) с применением подходящих праймеров. Полученную таким образом кДНК, содержащую усеченный ген NS1, фосфорилировали, обрабатывали фрагментом Кленова, самолигировали и размножали в штамме TG1 Е. coli. Конструкция, полученная после очистки, была названа pT3NS1/99 и ее подтверждали секвенированием. Плазмиды для экспрессии белков NP, PB1, РВ2 и РА вируса PR8 (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2 и pHMG-PA) описаны ранее (Pleschka et al., 1996, J.Virol. 70: 4188-4192). pPOLI-NS-RB получали замещением открытой рамки считывания CAT pPOLI-CAT-RT (Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70: 4188-4192) продуктом RT-PCR (ПЦР с обратной транскриптазой), полученным из кодирующего района гена NS вируса (WSN) гриппа A/WSN/33. Эта плазмида экспрессирует NS-специфический сегмент вирусной РНК вируса WSN под контролем промотора укороченной полимеразы I человека.
Получение вируса NS1/99 проводили посредством трансфекции рибонуклеопротеина (РНП) (Luytjes et al., 1989, Cell 59: 1107-1113). РНП получали посредством транскрипции РНК-полимеразой Т3 из pT3NS1/99, линеаризованной BpuAI, в присутствии очищенного нуклеопротеина и полимеразы вируса гриппа 25А-1 (Enami, et al., 1991, J.Virol. 65: 2711-2713). РНП-комплексы трансфицировали в клетки Vero, которые предварительно инфицировали вирусом 25А-1. Трансфицированные клетки инкубировали в течение 18 ч при 37°С и супернатант пассировали дважды в клетках Vero при 40°С и очищали методом бляшек три раза в клетках Vero, покрытых агаровым покрытием, при 37°С. Выделенный вирус NS1/99 анализировали RT-PCR (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров. Трансфектантный вирус дикого типа получали следующим образом: клетки Vero в чашках 35 мм трансфицировали плазмидами pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA и pPOLI-NS-RB, как описано ранее (Pleschka et al., 1996, J.Virol. 70: 4188-4192). Через 2 дня после трансфекции клетки инфицировали 5×104 БОЕ вируса delNS1 и инкубировали еще два дня при 37°С. Клеточный супернатант пассировали один раз в клетках MDCK и дважды в яйцах с развивающимися эмбрионами. Трансфектантные вирусы клонировали лимитирующим разведением в яйцах. Геномную РНК из очищенного трансфектантного вируса NS1/99 анализировали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, как описано ранее (Zheng et al., 1996, Virology 217: 242-251). Экспрессию укороченного белка NS1 вирусом NS1/99 подтверждали иммунопреципитацией экстрактов меченых инфицированных клеток с использованием кроличьих поликлональных антисывороток против NS1.
Аллантоисную полость куриных яиц с развивающимися эмбрионами в возрасте 6, 10 и 14 дней инокулировали приблизительно 103 БОЕ вирусов PR8, NS1/99 или delNS1 (в котором был делетирован весь ген NS1), инкубировали при 37°С в течение двух дней и вирусы, присутствующие в аллантоисной жидкости, титровали с использованием метода гемагглютинации (НА).
Группам из 5 мышей BALB/c (Taconic Farms) инокулировали интраназально 5×106 БОЕ, 1,5×105 БОЕ или 5×105 БОЕ вируса A/PR/8/34 (PR8) дикого типа или вируса NS1/99. Инокуляции проводили под анестезией с использованием 50 мкл MEM, содержащей подходящее число бляшкообразующих единиц соответствующего вируса. Животных подвергали ежедневному мониторингу и умерщвляли, когда наблюдали in extremis (предсмертное состояние). В следующем эксперименте всех выживших мышей заражали спустя четыре недели дозой 100 LD50 вируса PR8 дикого типа. Все процедуры соответствовали руководящим указаниям Национального института здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных.
6.2 РЕЗУЛЬТАТЫ: АТТЕНУАЦИЯ ВИРУСОВ ГРИППА А ПОСРЕДСТВОМ ДЕЛЕЦИЙ NS1
Заявители показали ранее, что вирус гриппа А, в котором делетирован ген NS1 (вирус delNS1), способен расти до титров приблизительно 107 БОЕ/мл в клетках, недостаточных по продуцированию интерферона (ИФН) типа I, таких как клетки Vero. Однако этот вирус является ухудшенным в его способности реплицироваться и вызывает заболевание в мышах (Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252: 324). В противоположность этому, вирус delNS1 был способен расти в мышах STAT1-/- и вызывать их гибель. Эти результаты показали, что белок NS1 вируса гриппа является фактором вирулентности, участвующим в ингибировании антивирусных ответов хозяина, опосредованных ИФН типа I. Следующие эксперименты проводили для определения, можно ли генерировать вирусы гриппа со свойствами вирулентности, промежуточными между вирусом дикого типа и вирусом delNS1, делетированием частей гена NS1 и могут ли некоторые из этих вирусов иметь оптимальные характеристики для использования их в качестве живых аттенуированных вакцин против вирусов гриппа, т.е. иметь стабильность и подходящий баланс между аттенуацией, иммуногенностыо и ростом в субстратах, пригодных для получения вакцин, таких как куриные яйца с развивающимися эмбрионами.
Для испытания этой гипотезы, генерировали вирус гриппа A/PR/8/34 (PR8), в котором ген NS1 был модифицирован таким образом, чтобы направлять экспрессию укороченного белка NS1, содержащего только 99 аминокислот на амино-конце всего белка NS1 дикого типа из 230 аминокислот. Этот вирус (NS1/99) получали трансфекцией РНП синтетически сконструированного гена NS с использованием хелперного вируса 25А-1, как описано ранее (Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252: 324). Анализ экспрессии NS1 в инфицированных вирусом клетках выявил укороченный характер белка NS1 вируса NS1-99.
Анализировали способность вирусов delNS1, NS1-99 и вируса PR8 дикого типа расти в куриных яйцах с развивающимися эмбрионами. Обоснование этого эксперимента исходит из того факта, что способность яиц с развивающимися эмбрионами синтезировать ИФН типа I и отвечать на него под действием подходящего стимула является зависимой от возраста. Действительно, как индуцируемость ИФН, так и реагирование на ИФН начинаются в возрасте приблизительно 10 дней и затем экспоненциально увеличиваются с возрастом (Sekellick et al., 1990, In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 997; Sekellick and Marcus, 1985 J.Interferon Res. 5: 657). Таким образом, применение яиц разного возраста представляет уникальную систему для испытания способности различных вирусов ингибировать ИФН-ответы. Яйца в возрасте 6, 10 и 14 дней инокулировали приблизительно 103 БОЕ вирусов PR8, NS1-99 или delNS1, инкубировали при 37°С в течение 2 дней и вирусы, присутствующие в аллантоисной жидкости, титровали с использованием метода гемагглютинации (НА). Как показано в таблице 3, в то время как вирус дикого типа рос до одинаковых НА-титров в яйцах с развивающимися эмбрионами 6-, 10- и 14-дневного возраста, delNS1 реплицировался только до детектируемого НА-титра в 6-дневных яйцах. В противоположность этому, вирус NS1-99 обнаружил промежуточное поведение между вирусом delNS1 и вирусом дикого типа и был способен расти до титров, меньших, чем титры вируса дикого типа в 10-дневных яйцах, но не в 14-дневных яйцах.
Затем на мышах определяли характеристики аттенуации вируса NS1-99. Для этой цели группы из 5 мышей BALB/c инфицировали интраназально 5×106 БОЕ, 1,5×105 БОЕ или 1,5×103 БОЕ вируса дикого типа PR8 или вируса NS1-99. Затем мышей подвергали мониторингу в течение 3 недель на выживание. Результаты приведены в таблице 4. Вирус NS1-99 имел LD50 по меньшей мере на три log более высокую, чем LD50 вируса дикого типа.
7. ПРИМЕР: ГЕНЕРИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ С УКОРОЧЕННЫМ NS1 В ВИРУСЕ ГРИППА В
7.1 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Экспериментальные подробности сходны с подробностями в разделе 6.1. Два мутантных вируса гриппа В, В/610В5В/201 (В/201) и B/AWBY-234, длиной 127 аминокислот и 90 аминокислот (укороченные на С-конце белки NS1), соответственно (Norton et al., 1987, Virology 156: 204; Tobita et al., 1990, Virology 174: 314), получали из экспериментов с коинфицированием в культуре ткани с использованием вирусов B/Yamagata/1/73 (B-Yam) и A/Aichi/2/68 в присутствии антитела против вируса A(H3N2). Рост этих мутантных вирусов гриппа в яйцах с развивающимися эмбрионами разного возраста сравнивали с ростом родительского вируса B/Yam, который обладает белком NS1 дикого типа из 281 аминокислоты. Яйца в возрасте 6, 10 и 14 дней инокулировали приблизительно 103 БОЕ вирусов B-Yam, B/201 или B/AWBY-234, инкубировали при 35°С в течение 2 дней и вирусы, присутствующие в аллантоисной жидкости, титровали с использованием НА-теста.
Далее, характеристики аттенуации вирусов B/201 и B/AWBY-234 определяли в мышах. Группы из 3 мышей BALB/c инфицировали интраназально 3×105 БОЕ вируса дикого типа B/YAM или мутантных вирусов B/201 и B/AWBY/234 и способность этих вирусов реплицироваться определяли измерением вирусных титров в легких в день 3 после инфекции, так как вирус дикого типа B/YAM не индуцировал видимых признаков заболевания в мышах.
7.2 РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты роста мутантных вирусов и вируса дикого типа гриппа В в куриных яйцах с развивающимися эмбрионами, показанные в таблице 5, демонстрируют, что, как и в случае вирусов гриппа А, карбокси-концевое усечение NS1 вируса гриппа В является ответственным за более низкий выход репликации в куриных яйцах с развивающимися эмбрионами большего возраста, которые устанавливают эффективный ИФН-ответ. Это открытие показывает, что NS1 вируса гриппа В также участвует в ингибировании ИФН-ответов в хозяине и что делеции на гене NS1 вируса гриппа В приводят к аттенуированному фенотипу.
Результаты из экспериментов по репликации в мышах приведены в таблице 6. Титры вирусов В/201 и B/AWBY-234 были приблизительно на 3 log более низкими, чем титры B/Yam, указывая на то, что усечения карбокси-концевого домена NS1 вируса гриппа В являются ответственными за аттенуированный фенотип в мышах.
8. ЗАЩИТА ПРОТИВ ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГРИППА ДИКОГО ТИПА В МЫШАХ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ВИРУСАМИ ГРИППА А И В, СОДЕРЖАЩИМИ ДЕЛЕЦИИ В ИХ БЕЛКАХ NS1
Для определения, были ли мыши, иммунизированные аттенуированными вирусами гриппа А и В, содержащими укороченные белки NS1, защищены против заражения соответствующими им вирусами дикого типа, проводили следующий эксперимент. Мышей BALB/c иммунизировали интраназально вирусом A/NS1-99, а спустя три недели их инфицировали 100 LD50 вируса гриппа дикого типа A/PR/8/34. Иммунизированные животные были защищены от летального исхода, тогда как контрольные неиммунизированные мыши погибали после заражения (см. таблицу 7). Во втором эксперименте, мышей BALB/c иммунизировали интраназально вирусами гриппа В/201 или B/AWBY-234, экспрессируюшими укороченные белки NS1. Спустя три недели этих мышей заражали 3х105 БОЕ вируса дикого типа B/Yam/1/73. Поскольку этот штамм вируса гриппа В не индуцирует симптомы заболевания у мышей, степень защиты определяли измерением вирусных титров в легких в день 3 после заражения. В то время как неиммунизированные контрольные животные имели титры около 104 БОЕ/легкое, в легких иммунизированных животных не были обнаружены вирусы (см. таблицу 8). Эти открытия предполагают, что вирус гриппа А, а также вирус гриппа В, содержащие модифицированные гены NS1, способны индуцировать иммунный ответ в мышах, который является полностью защитным против последующего заражения вирусом дикого типа.
9. ПРИМЕР: ИНДУКЦИЯ ИНТЕРФЕРОНА ТИПА I В ЯЙЦАХ С РАЗВИВАЮЩИМИСЯ ЭМБРИОНАМИ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ delNS1
Затем определяли способность вируса delNS1, вируса гриппа А, не имеющего гена NS1, индуцировать секрецию ИФН типа I в куриных яйцах с развивающимися эмбрионами. Для этой цели группы из двух куриных яиц с развивающимися 10-дневными эмбрионами инфицировали 5×103 БОЕ вирусов delNS1 или PR8 дикого типа. После восемнадцати часов постынкубации при 37°С аллантоисную жидкость собирали и диализовали против кислого рН в течение ночи для инактивации инфекционных вирусов. После обработки кислым рН пробы диализовали против ЗФР и их испытывали на активность ИФН определением наивысшего разведения с защитной активностью против инфекции VSV (приблизительно 200 БОЕ) в клетках CEF. Результаты, приведенные в таблице 9, показывают, что в отсутствие NS1 вирусы гриппа А являются более сильными индукторами ИФН.
10. ПРИМЕР: АНТИВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ВИРУСА delNS1
Элиминация гена-антагониста (NS1) ИФН из вируса гриппа А может приводить к получению вируса со способностью индуцировать высокие уровни ИФН. Если это имеет место, то вирус delNS1 будет "мешать" репликации ИФН-чувствительных вирусов. Для испытания этой возможности авторы изобретения исследовали способность вируса delNS1 ингибировать репликацию вируса гриппа A/WSN/33, обычно используемого лабораторного штамма вируса гриппа, в яйцах. Как можно видеть на фиг.1, обработка всего лишь 2 БОЕ вируса delNS1 была способна уменьшать конечные титры вируса WSN в аллантоисной жидкости на один log. Кроме того, обработка 2×104 БОЕ вируса delNS1 приводила к практически полному подавлению репликации WSN в яйцах. Вирус delNS1 был также способен препятствовать репликации в яйцах других штаммов вируса гриппа A (H1N1 и H3N2), вируса гриппа В и отличающегося вируса, такого как вирус Sendai (фиг.2).
Воодушевленные этими результатами, авторы изобретения определили затем способность вируса delNS1 противодействовать репликации вируса гриппа дикого типа в мышах. Хотя обработка ИФН типа I в культуре ткани предотвращает репликацию вируса гриппа A in vitro, обработка мышей ИФН не была способна ингибировать репликацию вирусов гриппа (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25-52). Это является верным для большинства инбредных штаммов мышей, за исключением мышей A2G. Мыши A2G, а также значительная часть диких мышей (приблизительно 75%) содержат по меньшей мере один интактный аллель М×1, тогда как большинство лабораторных животных являются М×1-/- (Haller, 1986, Current Top Microbiol Immunol 127: 331-337). Белок Mx1, который является гомологом белка М×А человека (Aebi, 1989, Mol. Cell. Biol. 11: 5062), является сильным ингибитором репликации вируса гриппа (Haller, 1980, Nature 283: 660). Этот белок не экспрессируется конститутивно, но его экспрессия транскрипционно индуцируется ИФН типа I. Таким образом, мыши A2G могут быть использованы для испытания способности ИФН-индукторов стимулировать антивирусный ответ против вирусов гриппа A (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25-52).
Авторы изобретения инфицировали интраназально восемь 4-недельных мышей A2G 5×106 БОЕ высокопатогенного вирусного изолята гриппа A/PR/8/34 (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25-52). Половина мышей получала интраназальную обработку 5×106 БОЕ delNS1 при -24 часах относительно инфицирования PR8. Остальных четырех мышей обрабатывали ЗФР. Проводили мониторинг изменений веса и выживания. Эти результаты показывают, что обработка delNS1 была способна защищать мышей A2G против индуцированных вирусом гриппа смерти и потери веса. Та же самая обработка не была эффективной в мышах М×1-/-, что указывало на то, что механизм защиты от вируса был опосредован М×1, т.е. ИФН.
11. ПРИМЕР: ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА ВИРУСА delNS1 В МЫШАХ
При условии, что ИФН типа I и/или индукторы ИФН типа I, как было показано, обладают противоопухолевыми активностями (Belardelli and Gresser, 1996, Immunology Today 17: 369-372; Qin et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14411-14416), возможным является то, что обработка опухолей вирусом delNS1 сможет медиировать регресс (обратное развитие) опухолей. Альтернативно, вирус delNS1 может иметь онколитические свойства, т.е. он может быть способным специфически расти в опухолевых клетках и убивать опухолевые клетки, многие из которых, как известно, являются недостаточными в отношении ИФН-системы. Для испытания противоопухолевой активности вируса delNS1 проводили следующий эксперимент с использованием линии мышиной карциномы CT26. WT в мышиной модели опухоли для легочного метастазирования (Restifo et а1., 1998, Virology, 249: 89-97). 5×105 клеток CT26. WT инъецировали внутривенно в двенадцать 6-недельных мышей BALB/c. Половину этих мышей обрабатывали интраназально 106 БОЕ вируса delNS1 каждые 24 ч при днях 1, 2 и 3 после инокуляции. Спустя двенадцать дней после инъекции опухоли мышей умерщвляли и подсчитывали число легочных метастазов. Как показано в таблице 10, обработка delNS1 опосредовала значимый регресс метастазов в легких мышей.
12. ПРИМЕР: БЕЛОК NS1 ИНГИБИРУЕТ ТРАНСЛОКАЦИЮ IRF-3 ВО ВРЕМЯ ИНФЕКЦИИ ВИРУСА ГРИППА
Результаты, описанные здесь, предполагают, что белок NS1 вируса гриппа является ответственным за ингибирование ответа ИФН типа I против этого вируса и что мутации/делеции в этом белке приводят к аттенуированным вирусам вследствие усиленного ИФН-ответа по время инфекции. Известно, что синтез ИФН типа I во время вирусной инфекции может запускаться двухцепочечной РНК (dsPHK). IRF-3 является фактором транскрипции, который обычно обнаруживается в неактивной форме в цитоплазме клеток млекопитающих. Двухцепочечная РНК индуцирует фосфорилирование (активацию) фактора транскрипции IRF-3, приводя к его транслокации в ядро, где он индуцирует транскрипцию специфических генов, кодирующих ИФН типа I (Weaver et al., 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 1359). Для определения, действует ли NS1 вируса гриппа на IRF-3, локализацию IRF-3 в клетках CV1, инфицированных PR8 дикого типа или вирусом гриппа A delNS1, подвергали мониторингу. Фиг. 3 показывает, что транслокация IRF-3 является минимальной в PR8-инфицированных клетках (в менее чем 10% клеток). В противоположность этому, приблизительно 90% deINS1-инфицированных клеток обнаружили ядерную локализацию IRF-3. Поразительным образом, можно было частично ингибировать транслокацию IRF-3 в delNS1-инфицированных клетках экспрессией NS1 из плазмиды в трансположении. Эти результаты показывают, что белок NS1 вируса гриппа А способен ингибировать транслокацию IRF-3 в инфицированных вирусом клетках. Вероятно, NS1 вируса гриппа предотвращает опосредованную delNS1 активацию IRF-3 связыванием dsPHK, генерируемой во время вирусной инфекции, приводя таким образом к ингибированию синтеза ИФН.
Данное изобретение не должно ограничиваться в его объеме описанными характерными вариантами, которые приведены в качестве отдельных иллюстраций индивидуальных аспектов данного изобретения, и любые конструкции или вирусы, которые являются функционально эквивалентными, находятся также в объеме данного изобретения. Действительно, разнообразные модификации данного изобретения, кроме представленных и описанных здесь, будут очевидными для специалистов в данной области из приведенного выше описания и сопутствующих чертежей. Имеется в виду, что такие модификации находятся в объеме прилагаемой формулы изобретения.
Здесь цитируются многочисленные ссылки, описания которых включены в качестве полных ссылок
Claims (54)
1. Генетически сконструированный аттенуированный вирус гриппа, имеющий измененный в отношении интерферона антагонистический фенотип, причем указанный вирус содержит мутацию в гене NS1, которая является ответственной за аттенуацию и позволяет аттенуированному вирусу расти до более высоких титров в интерферон-недостаточной системе-хозяине в сравнении с интерферон-компетентной системой-хозяином при размножении в одинаковых условиях.
2. Аттенуированный вирус гриппа по п.1, где аттенуированный вирус является химерным вирусом, который экспрессирует эпитоп чужеродного патогена.
3. Аттенуированный вирус гриппа по п.1, где аттенуированный вирус является химерным вирусом, который экспрессирует опухолевый антиген.
4. Анттенуированный вирус гриппа по п.1, где аттенуированный вирус является химерным вирусом, который экспрессирует гетерологичную последовательность.
5. Аттенуированный вирус гриппа по п.1, где интерферон-недостаточная система-хозяин является куриным яйцом с развивающимся эмбрионом в возрасте приблизительно 6-8 дней, а интерферон-компетентная система-хозяин является куриным яйцом с развивающимся эмбрионом в возрасте приблизительно 10-12 дней.
6. Аттенуированный вирус гриппа по п.1, где интерферон-недостаточная система-хозяин является STAT1-отрицательной, а интерферон-компетентная система-хозяин является STAT1-положительной.
7. Аттенуированный вирус гриппа по п.1, где титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-недостаточной системе-хозяине, является по меньшей мере на один log большим, чем титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-компетентной системе-хозяине.
8. Вакцинная композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа по п.1 и физиологически приемлемый наполнитель.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа по п.1 и физиологически приемлемый наполнитель.
10. Вакцинная композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа, имеющий измененный антагонистический в отношении интерферона фенотип, причем указанный вирус содержит мутацию в гене NS1, которая является ответственной за аттенуацию и позволяет аттенуированному вирусу расти до более высоких титров в интерферон-недостаточной системе-хозяине в сравнении с интерферон-компетентной системой-хозяином при размножении в одинаковых условиях.
11. Вакцинная композиция по п.8 или 10, в которой концентрация аттенуированного вируса гриппа составляет от приблизительно 104 до приблизительно 5·106.
12. Вакцинная композиция по п.8 или 10, где интерферон-недостаточная система-хозяин является STAT1-отрицательной, а интерферон-компетентная система-хозяин является STAT1-положительной.
13. Вакцинная композиция по п.8 или 10, где титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-недостаточной системе-хозяине, является по меньшей мере на один log большим, чем титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-компетентной системе-хозяине.
14. Вакцинная композиция по п.8 или 10, где аттенуированный вирус гриппа является химерным вирусом, который экспрессирует гетерологичную последовательность.
15. Вакцинная композиция по п.8 или 10, где аттенуированный вирус гриппа является химерным вирусом, который экспрессирует чужеродный патоген.
16. Вакцинная композиция по п.8 или 10, где аттенуированный вирус гриппа является химерным вирусом, который экспрессирует опухолевый антиген.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа, который имеет измененный в отношении интерферона антагонистический фенотип, причем указанный вирус содержит мутацию в гене NS1, которая является ответственной за аттенуацию и позволяет аттенуированному вирусу расти до более высоких титров в интерферон-недостаточной системе-хозяине в сравнении с интерферон-компетентной системой-хозяином при размножении в одинаковых условиях, и физиологически приемлемый наполнитель.
18. Фармацевтическая композиция по п.9 или 17, в которой концентрация аттенуированного вируса составляет от приблизительно 104 до приблизительно 5·106.
19. Фармацевтическая композиция по п.9 или 17, где интерферон-недостаточная система-хозяин является STAT1-отрицательной, а интерферон-компетентная система-хозяин является STAT1-положительной.
20. Фармацевтическая композиция по п.9 или 17, где титр аттенуированного вируса гриппа, размножавшегося в интерферон-недостаточной системе-хозяине, является по меньшей мере на один log большим, чем титр аттенуированного вируса гриппа, размножавшегося в интерферон-компетентной системе-хозяине.
21. Фармацевтическая композиция по п.9 или 17, где аттенуированный вирус гриппа является химерным вирусом, который экспрессирует гетерологичную последовательность.
22. Фармацевтическая композиция по п.9 или 17, где аттенуированный вирус гриппа является химерным вирусом, который экспрессирует чужеродный патоген.
23. Фармацевтическая композиция по п.9 или 17, где аттенуированный вирус гриппа является химерным вирусом, который экспрессирует опухолевый антиген.
24. Способ вакцинации субъекта, где указанный способ включает введение композиции по пп.8, 10, 14, 15 или 16 субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования иммунного ответа.
25. Способ предупреждения или лечения инфекционного заболевания у субъекта, где указанный способ включает введение композиции по пп.9, 17, 21 или 22 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования интерферон-опосредуемой клеточной реакции.
26. Способ лечения или предупреждения опухоли у субъекта, где указанный способ включает введение композиции по пп.9, 17, 21 или 23 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования интерферон-опосредуемой клеточной реакции или онколиза.
27. Аттенуированный химерный вирус гриппа, который экспрессирует гетерологическую последовательность, где указанный вирус имеет интерферон-антагонистический фенотип, содержащий мутацию в гене NS1, который (а) является ответственным за аттенуацию и (b) позволяет аттенуированному вирусу расти до более высоких титров в интерферон-недостаточной системе-хозяине при размножении в одинаковых условиях; и где указанный вирус не имеет полной делеции гена NS1.
28. Аттенуированный вирус гриппа, содержащий модифицированный ген NS1 и измененный интерферон-антагонистический фенотип, где аттенуированный вирус гриппа представляет собой NS1/99.
29. Аттенуированный вирус гриппа, содержащий ген NS1, модифицированный на амино-конце, где указанный вирус имеет измененный интерферон-антагонистический фенотип.
30. Аттенуированный вирус гриппа, содержащий ген NS1, модифицированный на карбокси-конце, где указанный вирус имеет измененный интерферон-антагонистический фенотип.
31. Аттенуированный вирус гриппа по пп.27, 29 или 30, где аттенуированный вирус является генетически сконструированным.
32. Аттенуированный химерный вирус гриппа по п.27, где гетерологичная последовательность представляет собой эпитоп чужеродного патогена.
33. Аттенуированный химерный вирус гриппа по п.27, где гетерологичная последовательность представляет собой опухолевый антиген.
34. Генетически сконструированный аттенуированный вирус гриппа, где вирус аттенуирован мутацией в гене NS1, состоящей из делеции нуклеотидов, кодирующих все аминокислотные остатки, за исключением аминокислотных остатков 1-130, аминокислотных остатков 1-120, аминокислотных остатков 1-100, аминокислотных остатков 1-99, аминокислотных остатков 1-70 или аминокислотных остатков 1-60, и где N-концевая аминокислота является номером 1 и мутация в гене NS1 придает измененный интерферон-антагонистический фенотип.
35. Вакцинная композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа по любому из пп.27, 28, 30 или 34 и физиологически приемлемый наполнитель.
36. Фармацевтическая композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа по любому из пп.27, 28, 30 или 34 и физиологически приемлемый наполнитель.
37. Вакцинная композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа по п.32 или 33 и физиологически приемлемый наполнитель.
38. Фармацевтическая композиция, содержащая аттенуированный вирус гриппа по п.32 или 33 и физиологически приемлемый наполнитель.
39. Вакцинная композиция по п.35, в которой концентрация аттенуированного вируса гриппа составляет от приблизительно 104 до приблизительно 5·106.
40. Вакцинная композиция по п.35, в которой интерферон-недостаточная система-хозяин является STAT1-отрицательной, а интерферон-компетентная система-хозяин является STAT1-положительной.
41. Вакцинная композиция по п.35, в которой титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-недостаточной системе-хозяине, является по меньшей мере на один log большим, чем титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-компетентной системе-хозяине.
42. Фармацевтическая композиция по п.36, в которой концентрация аттенуированного вируса гриппа составляет от приблизительно 104 до приблизительно 5·106.
43. Фармацевтическая композиция по п.36, в которой интерферон-недостаточная система-хозяин является STAT1-отрицательной, а интерферон-компетентная система-хозяин является STAT1- положительной.
44. Фармацевтическая композиция по п.36, в которой титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-недостаточной системе-хозяине, является по меньшей мере на один log большим, чем титр аттенуированного вируса, размножавшегося в интерферон-компетентной системе-хозяине.
45. Способ вакцинации субъекта, где способ включает введение композиции по п.35 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования иммунного ответа.
46. Способ предупреждения или лечения инфекционного заболевания у субъекта, где способ включает введение композиции по п.36 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования интерферон-опосредуемой клеточной реакции.
47. Способ лечения или предупреждения опухоли у субъекта, где способ включает введение композиции по п.36 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования интерферон-опосредуемой клеточной реакции или онколиза.
48. Способ вакцинации субъекта, где способ включает введение композиции по п.37 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования иммунного ответа.
49. Способ предупреждения или лечения инфекционного заболевания у субъекта, где способ включает введение композиции по п.38 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования интерферон-опосредуемой клеточной реакции.
50. Способ лечения или предупреждения опухоли у субъекта, где способ включает введение композиции по п.38 указанному субъекту, и где указанная композиция представлена в дозе, эффективной для индуцирования интерферон-опосредуемой клеточной реакции или онколиза.
Приоритет по пунктам:
12.06.1998 по пп.1-4, 6, 10, 12, 14-17, 19, 21-23, 32-33, 40, 43;
18.11.1998 по пп.5, 27-28, 30, 31;
11.06.1999 по пп.7-9, 11, 13, 18, 20, 24-26, 29, 35-39, 41-42, 44-50;
29.01.1999 по п.34.
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8910398P | 1998-06-12 | 1998-06-12 | |
US60/089,103 | 1998-06-12 | ||
US10883298P | 1998-11-18 | 1998-11-18 | |
US60/108,832 | 1998-11-18 | ||
US11768399P | 1999-01-29 | 1999-01-29 | |
US60/117,683 | 1999-01-29 | ||
USPCTUS99/13144 | 1999-06-11 | ||
PCT/US1999/013142 WO1999064570A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2001101426A RU2001101426A (ru) | 2002-11-20 |
RU2236252C2 true RU2236252C2 (ru) | 2004-09-20 |
Family
ID=27376229
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2001101426/15A RU2236252C2 (ru) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Аттенуированные вирусы с минус-цепью с измененной антагонистической в отношении интерферона активностью для применения в качестве вакцин и фармацевтических веществ |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (12) | US6573079B1 (ru) |
EP (4) | EP2316923B1 (ru) |
JP (7) | JP4837827B2 (ru) |
KR (2) | KR100637937B1 (ru) |
CN (1) | CN1312725A (ru) |
AT (1) | ATE351901T1 (ru) |
AU (2) | AU770619B2 (ru) |
BR (1) | BR9911163A (ru) |
CA (2) | CA2334895C (ru) |
CY (1) | CY1113689T1 (ru) |
CZ (2) | CZ306637B6 (ru) |
DE (1) | DE69934885T2 (ru) |
DK (4) | DK2316924T3 (ru) |
ES (4) | ES2653557T3 (ru) |
HU (1) | HUP0102441A3 (ru) |
IL (6) | IL140265A0 (ru) |
MX (2) | MXPA00012402A (ru) |
NO (1) | NO20006328L (ru) |
NZ (2) | NZ509054A (ru) |
PL (3) | PL212316B1 (ru) |
PT (1) | PT1085904E (ru) |
RU (1) | RU2236252C2 (ru) |
SK (3) | SK288200B6 (ru) |
WO (2) | WO1999064570A1 (ru) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7780962B2 (en) | 1997-10-09 | 2010-08-24 | Wellstat Biologics Corporation | Treatment of neoplasms with RNA viruses |
US20030044384A1 (en) | 1997-10-09 | 2003-03-06 | Pro-Virus, Inc. | Treatment of neoplasms with viruses |
US7470426B1 (en) | 1997-10-09 | 2008-12-30 | Wellstat Biologics Corporation | Treatment of neoplasms with viruses |
US6573079B1 (en) | 1998-06-12 | 2003-06-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
EP1390046A4 (en) * | 1999-04-15 | 2005-04-20 | Wellstat Biologics Corp | TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES |
US8147822B1 (en) | 1999-09-17 | 2012-04-03 | Wellstat Biologics Corporation | Oncolytic virus |
NZ517573A (en) | 1999-09-17 | 2004-02-27 | Pro Virus Inc | Sequences of the oncolytic virus strain vesicular stromatitis virus (VSV) |
EP1259629B1 (en) * | 2000-03-02 | 2005-07-20 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Recombinant influenza a viruses |
WO2001077394A1 (en) | 2000-04-10 | 2001-10-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents |
DE10020505A1 (de) | 2000-04-26 | 2001-10-31 | Conzelmann Karl Klaus | RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort |
AU2002223560B2 (en) * | 2000-09-25 | 2006-06-29 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh | Live influenza vaccine and method of manufacture |
MX348185B (es) | 2001-02-14 | 2017-06-02 | Anthrogenesis Corp | Placenta de mamíferos postparto, su uso y células madres placentales extraídas de ella. |
JP2005505505A (ja) | 2001-05-22 | 2005-02-24 | アクセス ビジネス グループ インターナショナル リミテッド ライアビリティ カンパニー | 液体成分を配合しかつ分取するための方法および装置 |
CN1549709A (zh) * | 2001-07-16 | 2004-11-24 | ����ɯ�ס����ڵ��ɿ� | 一类抗病毒化合物在制造用于治疗或预防在呼吸道中病毒感染的制剂中的应用 |
US7037707B2 (en) * | 2003-09-04 | 2006-05-02 | St. Jude Children's Research Hospital | Method for generating influenza viruses and vaccines |
ES2694123T3 (es) * | 2004-06-01 | 2018-12-18 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos |
US8137676B2 (en) * | 2005-02-15 | 2012-03-20 | Mount Sinai School Of Medicine | Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof |
AT502275B8 (de) * | 2005-08-08 | 2007-08-15 | Greenhills Biotechnology Res D | Immunantwort-induzierende zusammensetzungen |
PT2251034T (pt) | 2005-12-02 | 2018-05-22 | Icahn School Med Mount Sinai | Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações |
EP1911836A1 (en) | 2006-10-12 | 2008-04-16 | AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH | Medium supplement for virus production |
US7860646B2 (en) * | 2007-04-16 | 2010-12-28 | The Boeing Company | Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments |
WO2008144067A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Board Of Regents, University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity |
EP2045323A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Linear expression constructs for production of influenza virus particles |
EP2048237A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-15 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences |
EP2072058A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Modified influenza virus |
US8108138B2 (en) * | 2008-10-02 | 2012-01-31 | The Boeing Company | Optimal vehicle router with energy management system |
EA024262B1 (ru) | 2008-11-25 | 2016-09-30 | Нанотерапьютикс Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА ГРИППА, СТАБИЛЬНОГО ПРИ НИЗКИХ pH |
EP2233568A1 (en) | 2009-03-19 | 2010-09-29 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG | Novel method for generation of RNA virus |
US9884105B2 (en) * | 2008-12-16 | 2018-02-06 | Ology Bioservices, Inc. | Production of viral vaccine |
EP2233152A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-29 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | High growth reassortant influenza A virus |
US8935174B2 (en) * | 2009-01-16 | 2015-01-13 | The Boeing Company | Analyzing voyage efficiencies |
WO2010091262A1 (en) | 2009-02-05 | 2010-08-12 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof |
EP2413962A1 (en) | 2009-03-30 | 2012-02-08 | Mount Sinai School of Medicine | Influenza virus vaccines and uses thereof |
DE102010018462A1 (de) | 2009-04-27 | 2011-04-07 | Novartis Ag | Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza |
WO2010144797A2 (en) | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Vaccine Technologies, Incorporated | Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof |
CA2767207A1 (en) * | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Bioprocessing |
CN102648000A (zh) | 2009-07-22 | 2012-08-22 | 阿维尔绿山生物技术研究发展贸易股份公司 | 新的流感病毒 |
US9217157B2 (en) | 2009-07-27 | 2015-12-22 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Recombinant influenza viruses and uses thereof |
JP5845180B2 (ja) | 2009-07-30 | 2016-01-20 | モウント シナイ スクール オフ メディシネ | インフルエンザウイルス及びそれらの使用 |
CA2769673A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Novartis Ag | Reverse genetics systems |
EP2295543A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-16 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for the preparation of an influenza virus |
KR20130075732A (ko) | 2010-03-30 | 2013-07-05 | 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 | 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 |
US8597637B1 (en) | 2010-05-18 | 2013-12-03 | Weidong Zhang | Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus |
US20130183740A1 (en) * | 2010-06-02 | 2013-07-18 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Novel method for generation of rna virus |
US9044499B1 (en) | 2010-06-22 | 2015-06-02 | Weidong Zhang | NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment |
US8377901B2 (en) * | 2010-07-07 | 2013-02-19 | The University Of Manitoba | Target host factors for treating viral infection |
CN102021149B (zh) * | 2010-07-27 | 2013-04-24 | 张卫东 | 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用 |
CN102021148A (zh) * | 2010-07-27 | 2011-04-20 | 张卫东 | 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用 |
EP2758075B1 (en) | 2011-09-20 | 2023-05-03 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
US9157746B2 (en) | 2011-11-16 | 2015-10-13 | The Boeing Company | Vessel routing system |
AU2013362935B2 (en) | 2012-12-18 | 2018-10-04 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
CN103330723A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-10-02 | 艾克星(武汉)生物医药科技有限公司 | 基因工程呼吸道合胞病毒(△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途 |
US10947543B2 (en) | 2013-03-13 | 2021-03-16 | Yale University | Interferon production using short RNA duplexes |
WO2014159960A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof |
BR112015021414B1 (pt) | 2013-03-14 | 2020-11-10 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | vírus da doença newcastle e seus usos |
WO2015127501A1 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Viralytics Limited | Combination method for treatment of cancer |
US10736956B2 (en) | 2015-01-23 | 2020-08-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccination regimens |
EP3261664A1 (en) | 2015-02-26 | 2018-01-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Bivalent swine influenza virus vaccine |
WO2017030997A1 (en) * | 2015-08-14 | 2017-02-23 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Respiratory syncytial virus having altered ns1 protein function and related materials and methods |
EA037571B1 (ru) * | 2015-11-06 | 2021-04-15 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" | Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний |
RU2628690C2 (ru) * | 2015-11-06 | 2017-08-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' | Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний |
RU2660562C2 (ru) * | 2016-03-30 | 2018-07-06 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" | Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе |
MX2018006373A (es) * | 2015-11-24 | 2018-11-09 | Commw Scient Ind Res Org | Produccion de virus en cultivos celulares. |
WO2017088017A1 (en) * | 2015-11-24 | 2017-06-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Production of viruses in avian eggs |
WO2017218624A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof |
WO2018115308A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Blue Sky Vaccines Gmbh | Method for purifying virus |
CN111511907A (zh) | 2017-03-14 | 2020-08-07 | 加利福尼亚大学董事会 | 对病毒中免疫逃逸功能区域的全基因组鉴定 |
US11254733B2 (en) | 2017-04-07 | 2022-02-22 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof |
JOP20190256A1 (ar) | 2017-05-12 | 2019-10-28 | Icahn School Med Mount Sinai | فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها |
WO2019092084A1 (en) | 2017-11-08 | 2019-05-16 | Blue Sky Vaccines Gmbh | So3 chromatography for use in a method for virus purification |
CN113853215A (zh) | 2019-01-24 | 2021-12-28 | 蓝天免疫疗法有限责任公司 | 高生长流感病毒 |
US20230060867A1 (en) * | 2019-02-07 | 2023-03-02 | Duke University | Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same |
KR102370100B1 (ko) * | 2019-02-15 | 2022-03-07 | 아이디바이오 주식회사 | 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신 |
JP7222552B2 (ja) * | 2020-01-30 | 2023-02-15 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 豚デルタコロナウイルスの増殖方法 |
CN116888139A (zh) * | 2020-11-30 | 2023-10-13 | 蓝天免疫疗法有限责任公司 | 诱导高水平i型干扰素的新型复制缺陷型甲型流感病毒 |
WO2022125789A1 (en) * | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Yale University | Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections |
EP4351623A1 (en) | 2021-06-09 | 2024-04-17 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Gene combination as a broad spectrum antiviral |
CN115896035B (zh) * | 2022-12-22 | 2024-04-16 | 苏州沃美生物有限公司 | 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用 |
Family Cites Families (53)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4071618A (en) * | 1974-09-03 | 1978-01-31 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Process for preparing virus disease live vaccines |
US4215051A (en) | 1979-08-29 | 1980-07-29 | Standard Oil Company (Indiana) | Formation, purification and recovery of phthalic anhydride |
JPS57136528A (en) * | 1981-02-09 | 1982-08-23 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of viral vaccine |
US4873191A (en) | 1981-06-12 | 1989-10-10 | Ohio University | Genetic transformation of zygotes |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
JPS5939831A (ja) | 1982-08-27 | 1984-03-05 | Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン |
US4693981A (en) * | 1983-12-20 | 1987-09-15 | Advanced Genetics Research Institute | Preparation of inactivated viral vaccines |
US5106619A (en) * | 1983-12-20 | 1992-04-21 | Diamond Scientific Co. | Preparation of inactivated viral vaccines |
JPS60202827A (ja) * | 1984-03-28 | 1985-10-14 | Chibaken | 弱毒痘そうワクチン株 |
US5786199A (en) | 1989-08-28 | 1998-07-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
US5166057A (en) | 1989-08-28 | 1992-11-24 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand rna virus expression-systems |
US5854037A (en) | 1989-08-28 | 1998-12-29 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
US5840520A (en) | 1989-08-28 | 1998-11-24 | Aviron | Recombinant negative strand RNA virus expression systems |
US5766601A (en) * | 1990-08-08 | 1998-06-16 | University Of Massachusetts Medical Center | Cross-reactive influenza a immunization |
US6162432A (en) * | 1991-10-07 | 2000-12-19 | Biogen, Inc. | Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction |
EP0607332B1 (en) | 1991-10-07 | 1997-12-17 | Biogen, Inc. | Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the cd2/lfa-3 interaction |
DE570357T1 (de) | 1992-05-14 | 1994-07-28 | Polimun Scientific Immunbiologische Forschungsgesellschaft Mbh, Wien | Peptide, die Antikörper induzieren, die genetisch divergierende HIV-1 Isolationen neutralisieren. |
US7344722B1 (en) * | 1993-06-29 | 2008-03-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Cold-adapted influenza virus |
ATE257175T1 (de) | 1994-07-18 | 2004-01-15 | Conzelmann Karl Klaus Prof Dr | Rekombinantes infektiöses nicht-in-segmente- geteiltes, negativ-strange-rns-virus |
US6300090B1 (en) * | 1994-07-29 | 2001-10-09 | The Rockefeller University | Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells |
US6146873A (en) * | 1994-11-10 | 2000-11-14 | Baxter Aktiengesellschaft | Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media |
US7153510B1 (en) | 1995-05-04 | 2006-12-26 | Yale University | Recombinant vesiculoviruses and their uses |
DE69510207T3 (de) | 1995-08-09 | 2007-02-15 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren |
US5840565A (en) | 1995-08-22 | 1998-11-24 | The Regents Of The University Of California | Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture |
JPH11512609A (ja) | 1995-09-27 | 1999-11-02 | アメリカ合衆国 | クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性RSウイルス(respiratory syncytial virus)の生産 |
GB9605808D0 (en) * | 1996-03-20 | 1996-05-22 | Isis Innovation | CFTR gene regulator |
EP2112220A3 (en) | 1996-07-15 | 2010-01-06 | The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services | Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
AU4427897A (en) | 1996-09-27 | 1998-04-17 | American Cyanamid Company | 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales |
US6330090B1 (en) * | 1997-02-14 | 2001-12-11 | Photonetics | Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer |
EP0975809A4 (en) | 1997-03-05 | 2002-10-30 | Univ Washington | EXAMINATION PROCEDURE FOR DETECTING AGENTS FOR SELECTIVE INHIBITION OF HCV REPLICATION |
US5891705A (en) * | 1997-04-08 | 1999-04-06 | Pentose Pharmaceuticals, Inc. | Method for inactivating a virus |
US6884414B1 (en) * | 1997-04-30 | 2005-04-26 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents |
AU7797798A (en) | 1997-05-23 | 1998-12-11 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
PT1012244E (pt) | 1997-07-11 | 2007-08-21 | Univ Yale | ''rabdovírus com revestimentos remanipulados'' |
CN1273603A (zh) | 1997-09-19 | 2000-11-15 | 美国氰胺公司 | 减毒的呼吸道合胞病毒 |
US6573079B1 (en) * | 1998-06-12 | 2003-06-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
DK1098961T3 (da) * | 1998-06-12 | 2008-05-26 | Andrej Y Dr Egorov | Gensplejsede svækkede vira, der inducerer interferon |
US6146642A (en) * | 1998-09-14 | 2000-11-14 | Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines |
US6544785B1 (en) * | 1998-09-14 | 2003-04-08 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses |
AT407958B (de) * | 1999-02-11 | 2001-07-25 | Immuno Ag | Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation |
ATE353370T1 (de) | 1999-07-14 | 2007-02-15 | Sinai School Medicine | In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren |
EP1259629B1 (en) | 2000-03-02 | 2005-07-20 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Recombinant influenza a viruses |
WO2001077394A1 (en) | 2000-04-10 | 2001-10-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents |
DE10020505A1 (de) | 2000-04-26 | 2001-10-31 | Conzelmann Karl Klaus | RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort |
AU2002223560B2 (en) | 2000-09-25 | 2006-06-29 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh | Live influenza vaccine and method of manufacture |
AUPR343601A0 (en) * | 2001-02-28 | 2001-03-29 | Dickins, Philip | Trenching machine |
CA2505949A1 (en) * | 2002-11-13 | 2004-05-27 | Rutgers, The State University | Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1 |
ES2694123T3 (es) * | 2004-06-01 | 2018-12-18 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos |
US8137676B2 (en) | 2005-02-15 | 2012-03-20 | Mount Sinai School Of Medicine | Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof |
US20070116717A1 (en) * | 2005-08-01 | 2007-05-24 | Shneider Alexander M | Influenza vaccine compositions and methods |
AT502275B8 (de) * | 2005-08-08 | 2007-08-15 | Greenhills Biotechnology Res D | Immunantwort-induzierende zusammensetzungen |
PT2251034T (pt) | 2005-12-02 | 2018-05-22 | Icahn School Med Mount Sinai | Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações |
US7507411B2 (en) * | 2006-06-23 | 2009-03-24 | University Of Saskatchewan | Attenuated influenza NS1 variants |
-
1999
- 1999-06-11 US US09/332,286 patent/US6573079B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 EP EP10181977.9A patent/EP2316923B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 DK DK10181856.5T patent/DK2316924T3/en active
- 1999-06-11 AU AU44345/99A patent/AU770619B2/en not_active Expired
- 1999-06-11 SK SK1907-2000A patent/SK288200B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 DK DK99927443T patent/DK1086207T3/da active
- 1999-06-11 NZ NZ509054A patent/NZ509054A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 MX MXPA00012402A patent/MXPA00012402A/es active IP Right Grant
- 1999-06-11 ES ES10181977.9T patent/ES2653557T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 DK DK99927445.9T patent/DK1085904T3/da active
- 1999-06-11 IL IL14026599A patent/IL140265A0/xx active IP Right Grant
- 1999-06-11 JP JP2000553560A patent/JP4837827B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 PL PL386473A patent/PL212316B1/pl unknown
- 1999-06-11 EP EP99927443A patent/EP1086207B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 EP EP10181856.5A patent/EP2316924B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 WO PCT/US1999/013142 patent/WO1999064570A1/en active Application Filing
- 1999-06-11 EP EP99927445A patent/EP1085904B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 HU HU0102441A patent/HUP0102441A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1999-06-11 AT AT99927443T patent/ATE351901T1/de active
- 1999-06-11 ES ES10181856.5T patent/ES2650500T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 CZ CZ2011-316A patent/CZ306637B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 NZ NZ509055A patent/NZ509055A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 KR KR1020007014088A patent/KR100637937B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 SK SK50041-2015A patent/SK288544B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 IL IL14026499A patent/IL140264A0/xx active IP Right Grant
- 1999-06-11 DE DE69934885T patent/DE69934885T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 AU AU44343/99A patent/AU771110B2/en not_active Ceased
- 1999-06-11 CZ CZ20004635A patent/CZ302601B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 PL PL398576A patent/PL219128B1/pl unknown
- 1999-06-11 MX MXPA00012403A patent/MXPA00012403A/es active IP Right Grant
- 1999-06-11 ES ES99927445T patent/ES2400445T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 JP JP2000553136A patent/JP4531255B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 PT PT99927445T patent/PT1085904E/pt unknown
- 1999-06-11 ES ES99927443T patent/ES2281177T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 CA CA2334895A patent/CA2334895C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 RU RU2001101426/15A patent/RU2236252C2/ru active IP Right Revival
- 1999-06-11 CA CA2334850A patent/CA2334850C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 BR BR9911163-2A patent/BR9911163A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 PL PL346212A patent/PL200977B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 US US09/332,288 patent/US6669943B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 WO PCT/US1999/013144 patent/WO1999064068A1/en active Application Filing
- 1999-06-11 CN CN99809582A patent/CN1312725A/zh active Pending
- 1999-06-11 KR KR1020067011483A patent/KR20060080249A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-06-11 DK DK10181977.9T patent/DK2316923T3/en active
- 1999-06-11 SK SK50021-2008A patent/SK288567B6/sk not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-11-28 US US09/724,419 patent/US6852522B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-12 IL IL140265A patent/IL140265A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-12-12 NO NO20006328A patent/NO20006328L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-12-12 IL IL140264A patent/IL140264A/en not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-11-14 US US10/713,732 patent/US7588768B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-20 US US10/945,718 patent/US7494808B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-12-24 IL IL188362A patent/IL188362A0/en not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-02-26 IL IL189766A patent/IL189766A0/en unknown
- 2008-04-22 US US12/148,798 patent/US8057803B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-02-02 US US12/364,243 patent/US9352033B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-02-23 US US12/391,172 patent/US20100233785A1/en not_active Abandoned
- 2009-06-08 US US12/480,410 patent/US20100158942A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-16 JP JP2009285467A patent/JP5081220B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-02-12 JP JP2010029288A patent/JP2010142248A/ja active Pending
- 2010-09-29 JP JP2010218868A patent/JP2011050384A/ja active Pending
-
2011
- 2011-09-30 US US13/250,846 patent/US8765139B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-02-15 CY CY20131100144T patent/CY1113689T1/el unknown
- 2013-06-26 JP JP2013133432A patent/JP5810134B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2013-08-16 JP JP2013169102A patent/JP5829655B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-05-22 US US14/285,339 patent/US9387240B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-06-08 US US15/176,721 patent/US20160279227A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BEATRICE ST., WAGNER R.R. Immunogenecity in mice of temperature-sensitive mutants of vesicular stomatitis virus: early appearance in bronchial secretions of an interferonlike inhibitor, J.Gen. Virol., 1980, Apr., 47(2), pp. 529-533. NORTON G.P. et al. Infectious influenza A and В Virus variants with long carboxyl terminal deletions in the NSI polypeptides. Virology, 1987, v.156, pp.207-213. Butterfield W.K. et al. Vaccination for fowl plaque, Am. J. Vet., Res., 1978, Apr., 39(4), pp. 671-674. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2236252C2 (ru) | Аттенуированные вирусы с минус-цепью с измененной антагонистической в отношении интерферона активностью для применения в качестве вакцин и фармацевтических веществ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050612 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |