MXPA00012403A - Virus atenuados, de cepas negativas, con actividad antagonista del interferon alterada, para uso como vacuna y compuestos farmaceuticos. - Google Patents

Virus atenuados, de cepas negativas, con actividad antagonista del interferon alterada, para uso como vacuna y compuestos farmaceuticos.

Info

Publication number
MXPA00012403A
MXPA00012403A MXPA00012403A MXPA00012403A MXPA00012403A MX PA00012403 A MXPA00012403 A MX PA00012403A MX PA00012403 A MXPA00012403 A MX PA00012403A MX PA00012403 A MXPA00012403 A MX PA00012403A MX PA00012403 A MXPA00012403 A MX PA00012403A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
virus
attenuated
interferon
viruses
host system
Prior art date
Application number
MXPA00012403A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Palese
Original Assignee
Ity Of The New York Mount Sina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MXPA00012403(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ity Of The New York Mount Sina filed Critical Ity Of The New York Mount Sina
Publication of MXPA00012403A publication Critical patent/MXPA00012403A/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La presente invencion se refiere, en general, a los virus con RNA, de cepa negativa, atenuados, que tienen capacidad alterada para antagonizar la respuesta celular del interferon (IFN), y al uso de estos virus atenuados en vacunas y formulaciones farmaceuticas. La invencion tambien se refiere al desarrollo y uso de los sistemas deficientes de IFN par la seleccion de estos virus atenuados. En particular, la invencion se refiere a los virus de influenza atenuados que tienen modificaciones para el gen NSI que disminuye o elimina la capacidad del producto del gen NSI para antagonizar la respuesta celular del IFN. Los virus mutantes se replican in vivo, pero demuestran patogenicidad reducida, y por tanto, son muy adecuados para vacunas de virus vivos y formulaciones farmaceuticas.

Description

atenuados teniendo modif caciones para el gen NSl que disminuye o elimina la caoacidad del producto del gen NSl para antagonizar la respuesta celular del IFN. Los virus mutantes se replican in vivo, pero demuestran patogenicidad reducida y, por tanto, son muy adecuados para uso en vacunas de virus vivos, y formuladones farmacéuticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 2.1 VIRUS DE INFLUENZA Las familias de virus que contienen RNA monocatenario, encapsulados del genoma de sentido negativo están clasificados en grupos que tienen genomas no segmentados (virus paramyxoviridae, rhabdoviiridae, filoviridae y Borna Desease) o aquellos que tienen genomas segmentados (orthomyxoviridae, bunyavi idae y arenaviridae) . La familia orthomyxoviridae, descrita con detalle más adelante, y utilizados en los ejemplos de la presente, incluye los virus de influenza tipos A, B y C, asi como los virus Thogoto y Dhori y el virus infeccioso de anemia de salmón. Los viriones de influerza consisten en un núcleo interno de ribonucleoproteina una nucleocápside helicoidal) conteniendo el genoma de RNA monocatenario, y una envoltura de lipoproteina externa revestida por dentro por una proteina matriz (Ml) . El genoma segmentado del virus de influenza A consiste en ocho moléculas (siete para influenza C) de RNA monocatenarios, lineales, de polaridad negativa los cuales codifican diez polipéptidos, que incluyen: las proteinas RNA polimerasa dependaientes de RNA (PB2, PB1 y PA) y la nucleoproteina (NP) que forma la nucleocápside; las proteinas de la membrana de la matriz (Ml, M2); dos glucoproteinas de superfi :ie que se proyectan desde la envoltura que contiene lipidos: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) ; la prcteina no estructural (NSl) y la proteina de exportación nuclear (NEP) . La transcripción y replicación del genoma toma lugar en el núcleo y el ensamble ocurre mediante la forma ion de brotes o yemas en la membrana plasmática. Los virus pueden rearreglar los genes durante las infecciones copfinadas. El virus de influenza : e adsorbe a través de la HA a los sialiloligosacáridos en las glucoproteinas y glucolipidos de la membrana celular. Desjpues de la endocitosis del virion, ocurre un cambio de confo >rmación en la molécula de HA dentro del endosoma celular lo cual facilita la fusión de la membrana, activando asi el desnudamiento. La nucleocápside migra al núcleo donde se transcribe el mRNA viral. El mRNA viral se transcribe medianl e un mecanismo único en el cual la endonucleasa viral desdobla el extremo 5' terminal coronado de los mRNA heterólogos celulares que entonces sirven como cebadores óara la transcripción de las plantillas de RNA viral mediante la transcriptasa viral. Los transcritos terminan en les sitios de 15 a 22 bases desde los extremos de sus plantillas, donde las secuencias oligo (U) actúan como señales para la adición de los trechos de poli (A) . De las ocho moléculas de RNA viral asi producidas, seis son mensajes monocistrónicos que son traducidos directamente en las proteinas que representan HA, NA, NP y las proteinas polimerasa virales, PB2, PB2 y PA. Los otros dos transcritos sufren empalme, cada uno produciendo dos mRNA que son traducidos en diferentes marcos de lectura para producir Ml, M2, NSl y NEP. En otras palabras, los ocho segmentos de RNA viral codifican para diez proteinas: nueve estructurales y una no estructural. Un resumen de los genes del virus de influenza y sus productos proteicos se muestra en la Tabla I siguiente.
TABLA I SEGMENTOS DE RNA DEL GENOMA DEL VIRUS DE INFLUENZA Y ASIGNACIONES CODIFICANTES3 Segmento Longitud Polipéptidoc Lorigitudd Moléculas Comentarios (nucleótidos) codificado (amirpácicbs) por virion 2341 PB2 759 30-60 Componente RNA transcriptasa; unión al casquete del RNA de la célula hospedera 2341 PB1 757 30-60 Componente RNA transcriptasa; iniciación de la transcripción 2233 PA 716 30-60 Componente RNA transcriptasa 1778 HA 566 500 Hemaglutinina; trímero; glucoproteína de envoltura; media la unión a las células 1565 NP 498 1000 Nucleoproteína; asociada con RNA; componente estructural de RNA transcriptasa 1413 NA 454 100 Neuraminidasa; tetrámero; glucoproteína de envoltura 1027 Mi 22 3000 Proteína matriz; reviste dentro de la envoltura 96 ? Proteína estructural en membrana plasmática; mRNA empalmado 890 NSi 230 Proteína no estructural; función desconocida NEP 121 ? Proteína de exportación nuclear; mRNA empalmado a Adaptado de R . A. Larrfc y P . . Choppin ( 1983 ) , Annual Review of Biochemistry, vol men 52 , 467 -506. b Para la cepa A/PR/8 /34 c Determinado por método: bioquímicos y genéticos d Determinado por anális is de la secuencia de nucleótidos y secuenciación de proteinaÉ3.
El genoma del virus de influenza A contiene ocho segmentos de RNA monocajtenario de polaridad negativa, codificantes para una proteina no estructural y nueve proteinas estructurales, La proteina no estructural NSl es abundante en las célula : infectadas con el virus de influenza, pero no ha sido detectada en viriones. La NSl es una fosfoproteina que se encuentra en el núcleo temprano durante la infección y tairjbién en el citoplasma en tiempos tardíos del ciclo viral ( King y col., 1975, Virology 64: 378). Estudios con mutantes de influenza sensibles a la temperatura (ts) portando lesiones en el gen de NS sugirieron que la prcteina NSl es un regulador transcripcional y post-transcripcional de los mecanismos mediante los cuales el virus puede inhibir la expresión génica de las células hospederas y estimular la síntesis de proteina viral. Como mucha otras proteinas que regulan los procesos post-transcripci -onales, la proteina NSl interactúa con secuencias y estructuras de RNA especificas. Se ha reportado que la proteina NSl se une a diferentes especies de RNA incluidos: vRNA, poli-A, U6 snRNA, la región no traducida 5' de los mRNA virales y los ds RNA (Qiu y col., 1995, RNA 1: 304; Qiu y col., 1994, J. Viol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J Gen Virol. 73: 3325-9. La expresión de la proteina NSl a partir de cDNA en células transfectadas ha sido asociada con algunos efectos: la inhibición del transporte de núcleo-citoplásmico de mRNA, la inhibición del empalme pre-mRNA, la inhioición de la poliadenilación de mRNA hospedero y la estimulación de la traducción del mRNA viral (Fortes, y col., 1994 ; EMBO J. 13: 704; Enami, y col., 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, y col., 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu y col., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, y col., 1995, J. Biol. Ch m. 270, 28433; Nemeroff y col., 1998, Mol. Cell. 1: 1991; Chen, y col., 1994, EMBO J. 18: 2273-83) . 2.2 VIRUS ATENUADOS Las vacunas de virus nactivados se preparan "matando" el patógeno viral, por ejempío, mediante calentamiento o por tratamiento con formalina, de modo que no sea capaz de replicación. Las vacunas inactivadas tienen utilidad limitada porque no proporc onan inmunidad de larga duración y, por tanto, producen protección limitada. Un método alternativo para producir vacunas de virus incluye el uso de vacunas de virus vivos at ¡nuados. Los virus atenuados son capaces de replicación pero no son patogénicos, y, por tanto, proporcionan inmunidad de larga duración y producen mayor protección. No obstante, los métodos tradicionales para producir virus atenuados incluye el aislamiento oportuno de mutantes de rango de hospedero [sic] , muchos de los cuales son sensibles a la temperatura; por ejemplo, se pasan los virus a través 3e hospederos no naturales, y se seleccionan los virus de la progenie que sean inmunogénicos, pero no patógenos. Un sustrato tradiciona . para aislar y hacer crecer virus de influenza para propósit >s de vacunas son los huevos con embriones de pollo. Los virus de influenza por lo común crecen durante 2-4 37°C en huevos de 10 a 11 dias. Aunque la mayor parte de los aisladfs primarios humanos de virus de influenza A y B crecen mejor en el saco amniótico de los embriones, después de 2 a ; pasos los virus se adaptan para crecer en las células de . ' a cavidad alantóica, la cual es accesible desde el exterio: del huevo (Murphy, B. R. , y R. G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses p. 1397-1445. En Fields Virology, Lippincott-Raven A.) La tecnología del DNA recombinante y las técnicas de ingeniería genética, en teoria, podrían producir un método superior para producir un virus atenuado dado que mutaciones especificas podrían ser diseñadas de manera deliberada en el genoma viral. No obstante, no se conocen ni son predecibles las alteraciones genéticas necesarias para la atenuación de los virus. En general, los intentos para utilizar la tecnología del DNA recombinante para diseñar vacunas virales se ha dirigido principalm nte a la producción de vacunas subunitarias que contienen solo las subunidades de proteina del patógeno involucrado eh la respuesta inmune, expresadas en vectores virales recombi .nantes como el virus de vacuna o baculovirus. En fechas más recientes, las técnicas del DNA recombinante han sido utilizadas en un intento para producir mutantes por deleción del virus de herpes o poliovirus que simulan virus atenuados que se encuentran en la naturaleza o los mutantes de rango de hospedero conocidos. Hasta 1990, los virus de NRA de hebra negativa [sic] no fueron manejables para manipulación especifica del sitio, y por tanto no podian ser genéticamentíe manipulados. Los virus de influenza vivos, atenuados, producidos hasta entonces no serian fapaces de suprimir la respuesta del interferón en el hospejiero en el cual se replican. Por tanto, aunque estos virus son benéficos porque son inmunogénicos y no patógenos, es difícil su propagación en sustratos tradicionales pa a los propósitos de fabricación de vacunas. Además, los virus atenuados pueden poseer caracteristicas de virulenóia que son tan moderadas que no permiten al hospedero montar una respuesta inmune suficiente para satisfacer los desafioí posteriores . 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los virus de RNA de hebra negativa, atenuados teniendo una capacidad deteriorada para antagonizar la respuesta celular del IFN, y el uso de estos virus en formuladones de vacunas y composiciones farmacéuticas. Los virue mutantes con una actividad deteriorada antagonista del IFN son atenuados —son infecciosos, pueden replifarse m vivo para proporcionar niveles de infección sube],inicos, y no son patógenos. Por tanto, son candidatos i -deales para vacunas de virus vivos. Además, los virus atenuado pueden inducir una respuesta de IFN robusta que tiene otra; consecuencias biológicas in vivo produciendo protección Óontra enfermedades infecciosas subsiguientes y/o induci :ndo respuestas antitumor. Por tanto, los virus atenuados pueden tener un uso farmacéutico, para la prevención o tratamiento de otras enfermedades infecciosas, cáncer en ndividuos de alto riesgo y/o enfermedades que puedan ser tratadas con IFN. Los virus de RNA de heora negativa utilizados de acuerdo con la invención incluyen virus segmentados y no segmentados; las modalidades preferidas incluyen, pero no se limitan a virus de influenza, virus sincitial respiratorio (RSV) , virus de la enifermedad de Newcastle (NDV) , virus de estomatitis vesicular (VSV y virus de parainfluenza (PIV). Los virus utilizados en la invención pueden ser seleccionados a partir de cepas naturales, variantes o mutantes; los virus mutagenizados (por ejemplo, generados mediante la exposición a mutágenos, pasajes repetidos y/o pasaje en hospederos no permisivos) ; rearreglantes (en el caso de genomas vira es segmentados) ; y/o virus genéticamente manipulados (por ejemplo, utilizando las técnicas de "genética inversa") teniendo el fenotipo deseado —es decir, una capacidad deteriorada para antagonizar la respuesta celular del IFN. El virus mutante o genéticamente manipulado puede ser seleccionado con base en el crecimiento diferencial en sistemas deficientes de IFN contra sistemas competentes en IFN. Por ej fmplo, los virus que crecen en un sistema deficiente de IFN, pero no en un sistema competente de IFN (o que crecen menos bien en un sistema competente de IFN) pueden ser los selecci Ónados . Los virus atenuados asi seleccionados pueden utilizarse como el ingrediente active > en formulaciones de vacunas o composiciones farmacéuticas. De otro modo, es posible utilizar virus atenuados como el vector o "esqueleto" de vacunas producidas en form recombinante. Para este fin, es posible utilizar la técnica de la "genética inversa" para manipular mutaciones o int roducir epitopes extraños en el virus atenuado, el cual seüjrviria como la cepa "precursora". En este sentido, las vacunas pueden ser diseñadas para inmunización contra variantes de cepas, o en la alternativa, contra agentes infeccios ?s completamente diferentes o antigenos de enfermedades. Por ejemplo, el virus atenuado puede ser manipulado para expresar epitopes neutralizantes de otras cepas preseleccionada?s. De otro modo, los epitopes de virus diferentes de lo: virus de RNA de hebra negativa pueden ser construidos en el virus mutante atenuado (por ejemplo, gpl60, gpl20, o gp41 del VIH) . De otro modo, epitopes de patógenos inf cciosos no virales (por ejemplo parásitos, bacterias, hong s) pueden ser manipulados en el virus. En todavía otra a.lternativa, es posible preparar vacunas contra cáncer, por ejemplo, manipulando antigenos de tumor en el esqueleto viral atenuado. En una modalidad partifular que incluye virus de RNA con genomas segmentados, es posible utilizar las técnicas de rearreglo para transferir el fenotipo atenuado desde una cepa de virus de RNA segmentado precursora (un mutante natural, un virus mutager.izado o un virus genéticamente manipulado) a una cepa de virus diferente (un virus tipo silvestre, un mutante natural, un virus mutagenizado o un virus genéticamente manipulado) . Los virus atenuados, que inducen respuestas robustas de IFN en hospederos, también pueden ser utilizados en formulaciones farmacéuticas para la profilaxis o tratamiento de otras infecciones viral* s, o enfermedades que puedan ser tratadas con IFN, como cáncer. En este sentido, el tropismo del virus atenuado puede ser alterado para elegir el virus para un órgano, tejido o células elegidas deseadas in vivo o ex vivo. Al utilizar este enfoque, la respuesta del IFN puede ser inducida localmente, en el sitio elegido, evitando asi o reduciendo al minimo los efectos colaterales de los tratamientos sistémicos con IFN. Para este fin, los virus atenuados pueden ser manipulados para expresar un ligando especifico para un receptor del órgano, tejido o células elegidas . La invención se basa, sn parte, en el descubrimiento de los solicitantes que el NS 1 del virus de influenza tipo silvestre funciona como un antagonista del IFN, en cuanto a que NSl inhibe la respuest i mediada por IFN de las células hospederas infectadas con el virus. Se encontró que los mutantes virales deficiente s para la actividad de NSl son inductores potentes de la respuesta celular del IFN, y demostraron un fenotipo a .enuado in vivo; es decir, los virus mutantes se replican in vivo, pero tienen efectos patogénicos reducidos Aunque no se pretende apegarse a ninguna teoría o explicadoon de la forma en que funciona la invención, las caracteristi :as atenuadas de los virus de la invención se supone que se debe a su capacidad para inducir una respuesta celular rrobusta del IFN, y su capacidad deteriorada para antagoni ar la respuesta del IFN del hospedero. No obstante, las caracteristicas benéficas de los virus atenuados de la invencion puede ser no solo atribuible a los efectos sobre la res; uesta celular del interferón. En realidad, las alteraciones en otras actividades asociadas con NSl pueden contribuir con el fenotipo atenuado deseado. Los virus de influenza mutantes con actividad antagonista del IFN det ;riorada según se demostró se replican en vivo generando títulos que son suficientes para inducir respuestas inmunolóí>ggicas y citocinas. Por ejemplo, la vacunación con virus de influenza atenuados reducen los títulos virales en animales que fueron posteriormente desafiados con virus de in luenza tipo silvestre. Los virus de influenza atenuados también demostraron actividad antiviral y antitumoral. La pre-infección con virus de influenza atenuados inhibió la replicación de otras cepas del virus de influenza tipo silvestre, y otros virus (como puede ser el virus de Sendai) superinfectados en huevos con embrión. La inoculación de la influenza atenuada en animales inyectados con células de tumor redujo el número de foci formados. Debido a que se sabe que el virus de influenza induce una respuesta del ?TL (linfocito T citotóxico) , el virus atenuado es un cand dato muy atractivo para vacunas contra cáncer. Las mutaciones que disminuyen pero no eliminan la actividad antagonista del IFN de los virus son preferidas para formulaciones de vacunas —estos virus pueden ser seleccionados para crecer en sustratos tradicionales y no tradicionales, y para viru .encia intermedia. En particular, los solicitantes han demostrado que un mutante por truncación en el C termínal NSl se replica a títulos superiores en sustratos deficientes de IFN, como puede ser en huevos de embriones de pollo de 6 y 7 dias, asi como en la membrana alantóica de huevos de embriones de pollo de 10 dias, el sustrato tradición,al para el virus de influenza que no permite el crecimiento de los mutantes del virus de influenza en el cual se deleciona todo el gen de NSl (también mencionados en la presente como mutantes "knockout") . No obstante, la replicación del mutante por truncación del C terminal NSl se disminuye en huevos de embriones de 12 dias. Este método permite, por primera vez, la generación e identificación de virus de RNA de hebra negativa, atenuados, vivos , que tienen alterada, pero no inhibida la actividad antagonista del IFN, y que pueden crecer en sustratos convenientes para la preparación de vacunas. Este método también permite por primera vez un sistema de identificación de la selección eficiente para los virus de influenza u otros que contengan mutaciones que confieran actividad antag nista del interferón alterada, pero no inhibida. La invención también se refiere al uso de sistemas deficientes de INF para prop¿agar los virus atenuados que no pueden crecer en los sisteínas tradicionales que actualmente se utilizan para la producción de vacunas . El término "sistemas deficientes de I FN como se utiliza en la presente se refiere a los sistema , por ejemplo, células, lineas celulares y animales, como pueden ser ratones, pollos, pavos, conejos, ratas, etc, que no producen IFN o que producen bajas concentradones de IFN, que no responden o responden con menos eficiencia a IFN, y/o que son deficientes en la actividad de genes antivirales inducida por IFN. Para este fin, lo, solicitantes han identificado y designado un número de los sistemas deficientes de IFN que pueden utilizarse, que incluye pero no se limita a huevos de embriones de pocos dias, lineas celulares deficientes de IFN (como pueden ser las células VERO : o lineas celulares genéticamente manipuladas como pueden ser los knockout STAT1) . De otro modo, lo: huevos de embriones o lineas celulares pueden ser pretratados con compuestos que inhiban el sistema del IFN (iríeluidos fármacos, anticuerpos, antisentido, ribozimas, te). Todavía otra modalidad incluye el uso de huevos déficientes en el sistema IFN, por ejemplo, huevos producidos por aves negativas de STAT1, especialmente las aves de corral, que incluye pero no se limita a pollos, patos o pavos transgénicos. 4. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. El virus detLNSl inhibe la replicación del virus de influenza A tipo silvestre en huevos. Huevos de embriones de pollo de diez dias fueron inoculados con las transfección las células fueron infectadas a una moi alta con PR8 (WT) o con virus jdelNSl según se indica. 10 horas después de la infección, las células fueron analizadas en un microscopio de fluorescencia para la ubicación de IRF-3-GFP. Se indican los porcentaje s de las células que muestran localización citoplásmica xclusiva (CYT) y localizaciones citoplásmica y nuclear de IRF-3 (Nuc+Cyt) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la generación, selección e identificación de virus de RNA de hebra negativa, atenuados que tienen una capacidad deteriorada para antagonizar la respuesta celular del IFN , y el uso de estos virus en vacunas y formulaciones farmacéutica . Los virus pueden tener genomas segmentados o no segmentados y pueden ser seleccionados de cepas naturales, variantes o mutantes; vi us mutagenizados (por ejemplo, mediante la exposición a radiación UV, mutágenos y/o pasajes) ; rearreglos (para virus con genomas segmentados) ; y/o virus genéticamente mar ipulados. Por ejemplo, los virus mutahtes pueden ser generados por variación natural, exposición a radiación UV, exposición a mutágenos quimicos, mediante el paso en hospederos no permisivos, mediante rearreglo (es decir, por co-infección de un virus segmentado, atenuado con o ra cepa que tenga los antigenos deseados) , y/o por manipulación genética (es decir, utilizando "genética inversa") . Los virus seleccionados para uso en la invención tienen actividad antagonista de IFN defectiva y están atenuados ; es decir, estos son infecciosos pero pueden replicarse in vivo, pero solo generan bajos títulos dando origen a niveles subclinicos de infección que no son patógenos. Estos virus atenuados son candidatos ideales para vacunas vivas En una modalidad preferida, los virus atenuados seleccionados para uso en -a invención deben ser capaces de inducir una respuesta de :FN robusta en el hospedero —una caracteristica que contribuye a la generación de una respuesta inmune fuerte cuando se usan como vacuna, y que tienen otras consecuencias biológicas que hacen a los virus útiles como agentes farmaféuticos para la prevención y/o tratamiento de otras infecciones virales, o la formación de tumores en individuos de alto riesgo, u otras enfermedades que son tratadas con IFN. La invención se asa, en parte, en algunos descubrimientos y observadones hechas por los solicitantes cuando trabajaban con mut ntes de virus de influenza. No obstante, los principios pueden ser aplicados de la misma manera y extrapolados a otros virus de RNA de hebra negativa segmentados y no segmentados que incluyen, pero no se limitan a: paramixovirus (virus de Sendai, virus de parainfluenza, paperas, vi|rus de enfermedad de Newcastle) , morbillivirus (virus de sarampión, virus de moquillo canino y virus de ictericia hematúrica) ; pneumovirus (virus sincitial respiratorio y virus respiratorio bovino) ; y rabdovirus (virus de estomatitis vesicular y lyssavirus) . Primero, la respuesta de IFN es importante para infección viral in vivo. Los solicitantes encontraron que el crecimiento del virus de influenza tipo silvestre A/WSN/33 en ratones deficientes de ]]FN (ratones STAT1-/-) dio origen a una infección pan-órgano; es decir, la infección viral no estuvo confinada a los ¡bulmones como en ratones tipo silvestre que generan una respuesta de IFN (Garcia-Sastre, y col., 1998, J. Virol. 72 f 8550, que se incorpora como referencia en la presente en su entereza) . En segundo lugar, los solicitantes establecieron que la NSl de virus de influenza funciona como un antagonista del IFN. Los solicitantes descubrieron que un mutante del virus de influenza delecionado en todo el gen de NSl (es decir, un 'knockout" NSl) no pudo crecer a títulos altos en células hospederas competentes de IE'N, y solo pudo ser propagado en hospederos deficientes de IFN. Los virus knockout de NSl demostraron un fenotipo atenuado (es decir, fue letal en ratones STAT1-/- deficientes de IFN, pero no en ratones tipo silvestre) y se encontró que es un inductor potencial de respuestas del IFN en células hospederas (Garcia-Sastre y origen a bajos títulos del virus en animales desafiados posteriormente con virus tipo silvestre, y proporcionó protección contra la enfe?rmedad. La presente invención también se refiere a los sustratos diseñados para el aislamiento, identificación y crecimiento de los virus para propósi os de vacuna. En particular, de describe los sustratos de1 ficientes de interferón para el crecimiento eficiente de mutantes del virus de influenza. De acuerdo con la presente invención, un sustrato deficiente de interferón es aquel que e defectivo en su capacidad para producir o responder al interferón. El sustrato de la presente invención puede utilizarse para el crecimiento de cualquier número de virus que pueda requerir un ambiente de crecimiento deficiente de interferón. Estos virus pueden incluir, pero no se lim:-tan a paramixovirus (virus de Sendai, virus de parainfluenza, paperas, virus de enfermedad de Newcastle) , morbillivirus (virus de sarampión, virus de moquillo canino y virus de ictericia hematúrica) ; pneumovirus (virus sinj:itial respiratorio y virus respiratorio bovino) ; rabdovijrus (virus de estomatitis vesicular y lyssavirus) . La invención también se refiere al uso de los virus atenuados de la invencic >n en vacunas y preparaciones farmacéuticas para humanos o animales. En particular, los virus atenuados pueden ser utilizados como vacunas contra una amplia gama de virus y/o antigenos, que incluye pero no se limita a los antigenos tie variantes de cepas, diferentes virus u otros patógenos infecciosos (por ejemplo, bacterias, parásitos, hongos), o antigenos específicos de tumor. En otra modalidad, los virus atenuados, que inhiben la replicación viral y la formación de tumor, pueden utilizarse para la profilaxis o tratamiento de infecciones (virales o patógenos no virales) o formación de tumor o tratamiento de enfermedades para las cuales el IFN es de beneficio terapéutico. Es posible utilizar algunos métodos para introducir las formulacionás de virus vivos atenuados a un humano o animal para inducir una respuesta inmune o la citocina adecuada. Estos incluyen, pero no se limitan a, las vias intranasal, intra raqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperiton al, intravenosa y subcutánea. En una modalidad preferida, los virus atenuados de la presente invención están formulados Para suministro intranasal. 5.1 GENERACIÓN DE MUTANTES CON ACTIVIDAD ANTAGONISTA DE IFN ALTERADA Cualquier virus mutante o cepa que tenga una actividad antagonista de IFN dismi uida puede ser seleccionado y utilizado de acuerdo con la invención. En una modalidad, los mutantes o variantes naturales, o los mutantes espontáneos pueden ser seleccionado: que tengan una capacidad deteriorada para antagoniza.r la respuesta celular del IFN. En otra modalidad, es posible generar virus mutantes exponiendo los virus a mutágenos, como puede ser la radiación ultravioleta o mútágenos quimicos, o por pasajes múltiples y/o pasaje en hospederos no permisivos. La detección en un sistema de crecimiento diferencial puede utilizarse para seleccionar aquellos mutantes que tengan función antagonista de IífN deteriorada. Para virus con genomas segmentados, el fenotipo atenuado puede ser transferido a otra cepa q e tenga un antigeno deseado por rearreglo (es decir, mediante la coinfección de virus atenuado y la cepa d€:seada, y la selección para rearreglantes mostrando ambos fenotipos) En otra modalidad, es posible manipular mutaciones en un virus de RNA de hebra negativa como pueden ser influenza, RSV, NDV, VSV y PIV, utilizando los enfoques de la "genética inversa". En este modo, las mutaciones naturales u otras que confieren el fenotipo atenuado pueden ser manipuladas en cepas de vacuna. Por fjemplo, es posible manipular deleciones, inserciones f sustituciones de la región codificante del gen responsable para la actividad antagonista de IFN (como puede ser la NSl de influenza) . Las deleciones, sustituciones o inserciones en la región no codificante del gen respone able de la actividad antagonista del IFN también se contemplan. Para este fin, es posible origen a una actividad antagonista de IFN alterada o un fenotipo inductor de IFN sino más bien da origen a funciones virales alteradas y un fenotipo atenuado, por ejemplo, la inhibición alterada de la exportación nuclear del mRNA que contenga poli (A) , la inhi lición alterada del empalme pre-mRNA, inhibición alterada de la activación de PKR secuestrando el dsRNA, efei to alterado en la traducción del RNA viral e inhibición alterada de la poliadenilación del mRNA hospedero (por ejemplo , véase Krug en el libro de texto de Influenza, Nicholson v col. Ed. 1998, 82-92, y las referencias mencionadas en éste) . La técnica la genética inversa incluye la preparación de los RNA virales recombinanties, sintéticos, que contienen las regiones no codificantes del RNA viral de hebra negativa que son esenciales para el reconocimiento por las polimerasas virales y para el empacado de señales necesarias para generar un virion maduro. Los RNA recombinantes se sintetizan a partir del pNA recombinante plantilla y se reconstituyen in vi tro con el complejo polimerasa viral purificado para formar ribonucleoproteinas recombinantes (RNP) que pueden utilizarse para transfectar células. Se logra una transfección más eficiente si las proteinas polimerasa viral están pres entes durante la transcripción de los RNA sintéticos in vitro ó in vivo. Las RNP recombinantes, sintéticas pueden ser rescatadas en en los virus atenuados. De otro modo, epitopes completamente extraños, que incluyan antigenos provenientes de otros patógenos virales o no virales pueden ser manipulados en la cepa atenuada. Por ejemp]lo, los antigenos de virus no relacionados como VIH (gpl 60, gpl20, gp41) , antigenos de parásitos (por ejemplo, malaria) , antigenos bacterianos o micóticos o antigenos de tumor pueden ser manipulados en la cepa atenuada. De otro modo , los epitopes que alteran el tropismo de los virus in vi vo pueden ser manipulados en los virus atenuados quiméricos de la invención. En una modalidad alternativa, es posible utilizar una combinación de las técni as de genética inversa y las técnicas de rearreglo para manipular virus atenuados teniendo los epitopes deseados en los virus de RNA segmentado. Por ejemplo, un virus atenuado (generado mediante selección natural, mutagénesis o por las técnicas de genética inversa) y una cepa portadora del epitope de vacuna deseado (generado p r selección natural, mutagénesis o por técnicas de genética inversa) puede ser co-infectado en hospederos que permitan al rearreglo de los genomas segmentados. Los rearreg os que muestran el fenotipo atenuado y el epitope deseado pueden entonces ser seleccionados . En otra modalidad, el virus que va a ser mutado es un virus de DNA (por ejemplo, vacuna, adenovirus, baculovirus) o un virus de RNA de hebra positiva (por ejemplo, polio virus) . En tales casos, las técnicas de DNA recombinante que son bien conocidas en la técnica pueden utilizarse (por ejemplo, véase la Patente Estadounidense No. 4,769,330 de 5 Paoletti, Patente Estadounidense No. 4,215,051 de Smith, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su entereza) . Cualquier virus puede ser manipulado de acuerdo con la presente invención, incluidos pero no limitados las 10 familias que se establecen en la Tabla 2 siguiente. 15 20 •25 TABLA 2 FAMILIAS DE VIRUS HUMANOS Y ANIMALES CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS FAMILIA DE VIRUS dsDNA Poxvi ridae con envoltura Irididoviridae Herpesviridae Sin envoltura Adenoviridae Papo va vi ridae Hepadnaviridae ssDNA Parvoviridae sin envoltura dsRNA Reoviridae sin envoltura Birnaviridae ssRNA encapsulado genoma en sentido positivo sin paso de replicación del I )NA Togaviridae Flaviviridae Coronaviridae Virus de hepatitis C Paso de replicación del DNA Retro vi ridae Genoma en sentido negativo Paramyxoviridae Genoma no segmentado Rhabdoviridae Filoviridae Genoma segmentado Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae Sin envoltura Picornaviridae Caliciviridae Abreviaturas util- L zadas : ds = de doble hebra ; ss = una sola hebra ; con envoltura = que posee una bicapa lipidica externa proveniente de la membrana celular del hospedero ; genoma de sentido positivo = para x irus de RNA, genomas que están compuestos de secuencias de nucleót idos que se traducen directamente en 1 os riboson as , = para virus de DNA, genomas que están compuestos de s< ;cuencias de nucleótidos que son las mismas como el mRNA; genoma de sentido negativo = genomas que están compuestos de secuencias de nucleótidos complementarias a la hebra de sentido positivo. En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a los virus de in luenza genéticamente manipulados que contienen deleciones y/o truncaciones del producto del gen de NSl. Los mutantes de NSl de influenza A y B son particularmente preferidos En un método, porciones de la región amino terminal del producto del gen de NSl son retenidas mientras que las porciones de la región C terminal del producto del gen de NSl son delecionadas. Las mutaciones especificas, deseadas, puec sn ser manipuladas por medio de inserción, deleción o mutac ón de ácido nucleico en el codón adecuado. En particular, las proteinas de NSl truncadas tienen desde 1-60 amino; cidos, 1-70 aminoácidos, 1-80 aminoácidos, 1-90 aminoácicos (el aminoácido N terminal es 1), y de preferencia 90 aminoácidos; desde 1-100 aminoácidos y de preferencia 99 amino cidos; desde 1-110 aminoácidos, desde 1-120 aminoácidos; o desde 1-130 aminoácidos, y de preferencia 124 aminoácidos del producto del gen de NSl tipo silvestre . La presente invención también se refiere a cualquier virus de influenza genétic menté manipulado en el cual el producto del gen de NSl ha sido modificado por truncación o modificación de la proteina NSl que confiere en los virus mutantes los siguientes fenotipos: la capacidad de los virus para crecer a altos titul s en sustratos no tradicionales, como puede ser en huevo de pollo de 6-7 dias, o la capacidad de los virus 3ara inducir una respuesta del interferón del hospedero, Para virus de influenza A, estos incluyen, pero no se limitan a: virus que tengan truncaciones en NSl. La presente invencióh incluye el uso de virus de influenza A ó B mutantes naturales teniendo el fenotipo atenuado, asi como cepas de virus de influenza manipuladas para contener tales mutac: ones sensibles para el fenotipo atenuado. Para los virus de influenza a, estos incluyen, pero no se limitan a: vi rus que tengan una NSl de 124 aminoácidos (Norton y col., 1987, Virology 156: 204-213, que se incorpora como referencia en la presente en su entereza) . Para virus de influenza B, estos incluyen, pero no se limitan a: virus que tengan un mutante por truncación de NSl consistiendo en 127 aminoác:idos provenientes del N terminal (B/201) (Norton y col., 1987, Virology 156: 204-213, la cual se incorpora como referencia en la presente en su entereza) , y virus que tengan un mutante por truncación de NSl consistiendo en 90 aminoácidos provenientes del N-terminal (B/AWBY-234) (Tobita y col. , 1990, Virology 174: 314-19), la cual se incorpora como r :ferencia en la presente en su entereza) . La presente : nvención comprende el uso de mutantes naturales análogos para NS1/38, NS1/80, NS1/124, (Egorov y col., 1998, J. Virol. 72 (8): 5437-41) asi como los mutantes naturales A/Turkey/ORE/71, B/201 ó B/AWBY-234. El virus de influer za atenuado puede además ser manipulado para expresar antigenos de otras cepas de vacuna (por ejemplo utilizando la genética inversa o rearreglo) . De otro modo, los virus de influenza atenuados pueden ser manipulados utilizando genética inversa o rearreglo con virus genéticamente manipulados, para expresar epitopes completamente extraños, por ejemplo, antigenos de otros patógenos infecciosos, antigenos de tumor o antigenos de elección. Dado que el segmento de RNA de NS es el más corto entre los ocho RNA virale , es posible que el RNA de NS tolerará inserciones más grandes de secuencias heterólogas que otros genes virales Además, el segmento de RNA para NS dirige la síntesis de altas concentraciones de proteina en células infectadas, sugirie:ndo que seria un segmento ideal para inserciones de antigenos extraños. No obstante, de acuerdo con la presente invención, es posible utilizar cualquiera de los ocho segijnentos de los virus de influenza para la inserción de secuéncias heterólogas. Por ejemplo, donde se desea una present ción de antigeno superficial, es posible utilizar segment.os que codifiquen proteinas estructurales, por ejemplo EA ó NA. 5.2 SISTEMA DE SELECCIÓN CON BASE EN LA RESTRICCIÓN DEL HOSPEDERO La invención comprende los métodos para seleccionar virus que tengan el fenot .po deseado, es decir, virus que tengan baja o ninguna actividad antagonista de IFN, bien sea obtenidos a partir de variantes naturales, variantes espontáneas (es decir, variantes que se envuelvan durante la propagación del virus) , va.riantes naturales mutagenizadas, rearreglos y/o virus genét camente manipulados. Estos virus pueden ser mejor detectados en ensayos de crecimiento diferencial que compare el crecimiento en sistemas hospederos deficientes de I FN contra competentes en IFN. Se seleccionan los virus que demuestran mejor crecimiento en los sistemas deficientes de IFN contra sistemas competentes en IFN; de preferencia, se seleccionan virus que crezcan a títulos cuando menos un log mayor en sistemas deficientes de IFN en comparación con un si stema competente de IFN. De otro modo, los viru? pueden ser detectados utilizando sistemas de ensayo de IFN, por ejemplo, sistemas de ensayos basados en transcripción en los cuales se controla la expresión del gen reportero mediante un promotor sensible al IFN. La expresión del gen reportero en células no infectadas contra infectadas puede medirse para identificar los virus que inducen de manera efica una respuesta del IFN, pero que sean incapaces de antagonizar la respuesta del IFN. En una modalidad preferida, sin embargo, se utilizan ensayos de crecimiento diferencial para seleccionar virus que tengan fenotipo deseado, dado que el sistema hospedero utilizado (competente en IFN contra deficiente de IFN) se aplica a la presión de selección aidecuada Por ejemplo, el crecimtLento de los virus (medido por el titulo) puede ser comparado en diversas células, lineas celulares o sistemas de modelos animales que expresen el IFN y los componentes de la respuesta del IFN, contra células, lineas celulares o sistema de modelos animales deficientes de IFN o componentes de la respuesta del IFN. Para este fin, es posible comparar el erecimiento del virus en lineas de células como células VERO (que son deficientes de IFN) contra células MDCK (que son competentes en IFN) . De otro modo, lineas de células deficientes de IFN pueden ser obtenidas y establecidas de animales reproducidos o genéticamente manipulados p ira ser deficientes en el sistema IFN (por ejemplo, ratones mutantes STAT1-/-) . Se puede medir el crecimiento de los virus en estas lineas celulares, en comparación con células competentes en IFN provenientes, por ejemplo, de animales tipo silvestre (por ejemplo, ratones tipo silvestre) . En todavia otra modalidad, las lineas celulares que son competentes en IFN y conocidas por dar soporte al crecimiento de virus tipo silvestre pueden ser manipuladas para ser deficientes de IFN, (por ejemplo, mediante el knockout de STÍVT1, IRF3, PKR, etc.) Es posible utilizar las técnicas bien conocidas para la propagación de los virus en las lineas celulares (véase, por ejemplo, los ejemplos de trabajo infra) Se puede comparar el crecimiento del virus en la linea ce! lular competente en IFN normal contra la linea celular genéticamente manipulada deficiente de IFN. También es posible ut lizar sistemas de animales. Por ejemplo, para influenza, el crecimiento en huevos de embriones deficientes de IFN, por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproxim damente 8 dias, puede compararse con el crecimiento de huevo competentes en IFN de más dias, por ejemplo, aproximadament< 10 a 12 dias. Para este fin, es posible utilizar las técnicas bien conocidas para infección y propagación en huevos (por ejemplo, véase los ejemplos de trabajo infra) . De otro diodo, el crecimiento en ratones STAT1-/- deficientes de I FN puede compararse con ratones tipo silvestre competente s de IFN. En todavía otra alternativa, se puede comp¿ rar el crecimiento en huevos de embriones deficientes de I FN producidos por, por ejemplo, aves de corral transgénica? STAT1-/- con el crecimiento en huevos competentes de IFN producidos por aves de corral tipo silvestre . No obstante, para les propósitos de detección, es posible utilizar sistemas deficientes de IFN transitorios en huevos de embriones de 6 a 7 dias o células VERO. Por ejemplo, los virus de infli enza que muestran títulos cuando menos un log inferiores en huevos de 10 dias contra huevos de 6-7 dias serán consider¿ dos dañados en su capacidad para inhibir la respuesta de I FflvF . En otro ejemplo, los virus de influenza que muestran un titulo cuando menos un log menor en huevos de 12 dias (los cuales montan una respuesta de IFN alta) contra huevos de 10 ias (que montan una respuesta de IFN moderada) son considerados parcialmente dañados en su capacidad para antagonizai la respuesta del IFN, y se consideran candidatos atracl ivos para vacunas . Los métodos de selebción de la invención también comprenden la identificadon de aquellos virus mutantes que inducen respuestas del IFN De acuerdo con los métodos de selección de la invención, es posible medir la inducción de las respuestas del IFN ensajando los niveles de expresión de IFN o la expresión de 1 s genes elegidos o los genes reporteros inducidos por I FN después de la infección con el virus mutante o la activación de los transactivadores involucrados en la expresit n del IFN y/o la respuesta del IFN. En todavía otra modalidad de los sistemas de selección de la invención, es posiblí determinar la inducción de las respuestas del IFN midiende el estado fosforilado de los compuestos de la via del I FN después de la infección con el virus mutante de prueba, por ejemplo, IRF-3, que se fosforila en respuesta al RNA bicatenario. En la respuesta del IFN tipo I, la Jakl cinasa y TyK2 cinasa, subunidades del receptor de IFN, STAT1 y STAT2 son rápidamente tirosina fosforiladas. Asi pues, para determinar si el virus mutante induce respuestas del IFN, las células, como pueden ser las células 293, son infectadas con el virus mutante de prueba y después de la infección, las células son usadas. Los componentes de la via del IFN, como pueden ser la Jakl cinasa ó TyK2 cinasa, se .nmunoprecipitan a partir de los lisados de las células nfectadas, utilizando sueros o anticuerpos policlonales eepecificos, y el estado tirosina fosforilado de la cinasa se determina por ensayos de inmunoabsorción con un an icuerpo anti-fosfotirosina (por ejemplo, véase Krishnan y col., 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305) . Un estado fosforilado mejorado de cualquiera de los componentes de la via del IFN después de la infección con el virus mutante i 11dicaria la inducción de las respuestas del IFN mediante el virus mutante. En todavía otra modalicjiad, los sistemas de selección de la invención comprenden la medición de la capacidad para unir secuencias de DNA espe ificas o la translocación de los factores de transcripción inducidos en respuesta a la infección viral, por ejjemplo IRF3, STAT1, STAT2, etc. En particular, STAT1 y STAT2 son fosforilados y translocados desde el citoplasma al núcleo en respuesta del IFN tipo I. La capacidad para unir sec uencias de DNA especificas o la translocación de los factores de transcripción puede medirse mediante las técnicas conocidas para los expertos, por ejemplo, ensayos de electromovjilidad por desplazamiento del gel, tinción de células, etcétera. En todavía otra modal dad de los sistemas de selección de la invención, es posible determinar las respuestas del IFN midiendo la activación transcripcional dependiente del IFN después de la infecció?i con el virus mutante de prueba. En esta modalidad, la expresión de los genes, conocida por ser inducida por el IFN , por ejemplo, Mx, PKR, 2-5-oligoadenilatosintetasa, el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) clase I, etc, pueden ser analizados por las técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica (por ejemplo, northern blot, western blot, PCR, etcétera) . De otro modo, las células de prueba como las células de riñon embriónico humano o las células de sarcoma osteogénico humano, son manipuladas para expresar de manera transitoria o constitutiva genes reporteros como el gen reportero luciferasa o el gen reportero cloramfenicol transferasa (CAT) bajo el control de un elemento de respuesta estimulado por el interferón, como puejde ser el promotor estimulado por IFN del gen ISG-54K (Bluyss sn y col., 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395-402). Las células se infectan con el virus mutante de prueba y se compara el nivel de expresión del gen reportero con el de las células no infectadas o las células infectadas con el virus tipo silvestre. Un aumento en el nivel de expresión del gen reportero después de infección con el virus de prueba indicarla que el virus mutante de prueba esta induciendo una respuesta de IFN. En todavía otra modalidad, los sistemas de selección de la invención comprenden la medición de la inducción del IFN determinando si un extrac ;o de las células o el huevo infectado con el virus motante de prueba es capaz de conferir actividad protector :a contra la infección viral. Más especificamente, grupos de huevos de embriones de pollo de 10 dias se infectan con el virus mutante de prueba o el virus tipo silvestre. Aproximadamente 15 a 20 horas después de la infección, se cosecha el fluido alantóico y se prueba para la actividad del IFN determinando la dilución más alta con la actividad protectora contra infección por VSV en células de cultivos tisulare:s, como pueden ser las células CEF. 5.3 PROPAGACIÓN DEL VIRU¿ EN SUSTRATOS DE CRECIMIENTO DEFICIENTES DE INTERFERON La invención también comprende los métodos y los sustratos deficientes de IFN para el crecimiento y aislamiento de virus mutantes naturales o manipulados teniendo actividad antagonista de IFN alterada. Los sustratos deficientes de IFN que pueden ser utilizados para apoyar al crecimiento de los virus mutantes atenuados incluyen, pero no están limitados a células naturales, lineas celulares, animales o huevos de embriones que es deficiente de IFN, por ejemplo, células Vero, huevos de embriones de pocos dias; células recombinantes o lineas celulares que estén manipuladas para ser deficientes de IFN, por ejemplo, lineas celulares deficientes de IFN provenientes de ratones knockout STATl u otros animales transgénicos igualmente manipulados; huevos de embriones obtenidos de aves deficientes de IFN, especialmente aves de corral (por ejemplo, poli Los, patos, pavos) incluidas las bandadas que se reproducen para ser aves deficientes de IFN o transgénicas (por ejempl , knockout STATl) . De otro modo, el sistema hospedero, células, lineas celulares, huevos o animales pueden ser genéti :amente manipulados para expresar transgenes que codifiquen los inhibidores del sistema IFN, por ejemplo, mutantes dominante-negativos, como pueden ser STATl carente del dominio de unión al DNA, RNA antisentido, ribozimas, inhibidores de La producción de IFN, inhibidores de la producción de IFN, inhibidores de la señalización de IFN, y/o inhibidores de genes antivirales inducidos por IFN. Se debe reconocer que los animales que se reproducen o se manipulan genéticamente para ser deficientes de IFN serán algo inmunocomprometidos, y deben mantenerse en ambientes controlados libres de enfermedades. Asi pues, es necesario tomar medidas adecuadas (que incluya el uso de antibióticos en la dieta) para limitar el riesgo de exposición a agentes infecciosos de animales transgénicos, deficientes de IFN, como pueden ser las galliñas reproductoras, patos, pavos, etc. De otro modo, el sistema hospedero, por ejemplo, células, lineas celulares huevos o animales pueden ser tratados con un compuesto que inhiba la producción de IFN y/o la ruta de IFN, por ej emplo, medicamentos, anticuerpos, moléculas antisentido, molaculas de ribozimas eligiendo el gen STATl, y/o genes antivirales inducidos por IFN. De acuerdo con la presente invención, los huevos de embriones de pollo inmaduros comprenden huevos que según el curso de la naturaleza son de hasta, pero no todavía diez dias, de preferencia son huevos de seis a nueve dias; y huevos que imitan artific:-almente los huevos inmaduros de hasta, pero no todavía diez dias, como resultado de alteraciones en las condiciones del crecimiento. Por ejemplo, cambios en las temperaturas de incubación; tratamiento con medicamentos; u otra alteración que dé origen a un huevo con un desarrollo retardado, de modo que el sistema de IFN del huevo no se desarrolle completamente en comparación con los huevos de 10 a 12 dias. 5.3.2 SUSTRATOS DEFICIENTES DE IFN GENÉTICAMENTE MANIPULADOS La presente invención se refiere a los métodos de crecimiento y aislamiento de virus mutados teniendo actividad antagonista de IFN alterada en un sustrato deficiente de IFN genéticamente manipulado. La presente invención comprende tranegénicos aviarios que expresan factores de transcripción dominante-negativo, por ejemplo STATl carente del dominio de unión al DNA, ribozimas, RNA antisentido, inhibidores de la producción de IFN, inhibidores de la señalizacion de IFN e inhibidores de genes antivirales inducidos en respuesta del IFN. El beneficio de utilizar huevos de un avia rio transgénico deficiente de IFN es que es posible utilizar los huevos de 10 dias tradicionales para hacer crecer el virus los cuales son más estables si tienen un volumen mayor debido a su mayor tamaño. En todavía otra modalidad, las líneas celulares pueden ser genéticamente manipuladas para ser deficientes de IFN. La presente invención comprende líneas celulares en las cuales son mutados un gen sencial para la síntesis del IFN, para la ruta del IFN y/o < en (es) antiviral (es) inducido por IFN, por ejemplo STATl. La invención ofrece 1 íneas de células recombinantes o animales, en particular aviarias, en las cuales ha sido sometido a disrupción uno o más genes esenciales para la ruta del IFN, por ejemplo, el receptor del interferón, STATl, etc., es decir, es un "knockout"; el animal recombinante puede ser cualquier animal, pero en una modalidad preferida es una ave, por ejemplo, pollo, pavo, gallina, pato, etc. (véase, por ejemplo, Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry, y col., 1993, Transgenic Res. 2: 125; Stern, C. D., 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212: 195-206; y Shuman, 1991, Experientia 47: 897 para revisiones relacionadas con la producción de transgénicos aviarios cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente en su entereza) . pstas líneas celulares o animales pueden ser generados por cualquier método conocido en la técnica para la disrupción de un gen en el cromosoma de la célula o animal. Estas técriicas incluyen, pero no se limitan a la microinyección pronuclear (Hoppe & Wagner, 1989, Patente Estadounidense No. 4,873,191); transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten y col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152); elección del gen en células primordiales embriónicas (Thompson y col., 1989, Cell 56: 313); electroporación de embriones (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803); y transferencia génica mediada por esperma (Lavitrano y col., 1989, Cell 57: 717); etc. Para una revisión de estas técnicas véase Gordon, 1989, Transgenic Animáis, Intl. Rev. Cytol. 115: 171, la cual se incorpora como referencia en la presente en su entereza En particular, un animal knockout STATl puede ser producido promoviendo recombinación homologa entre un gen STATl en su cromosoma y un gen STATl exógeno que se haya vuelto biológicamente inac ivo (de preferencia mediante la inserción de una secuencia heteróloga, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) . Los métodos de recombinación homologa para la disrupcion de genes en el genoma de ratón están descritos, por ej I emplo, en Capecchi (1989, Science 244:1288) y Mansour y col., (1988, Nature 336: 348) . En resumen, todo o una porción de un clon genómico STATl se aisla del DNA genómico de la misma especie como la de la célula o animal knockout. El clon genómico STATl puede ser aislado por cualquier métoc.o conocido en la técnica para el aislamiento de clones genneo:t??cos (por ejemplo sondeando una biblioteca genómica con una sonda proveniente de una secuencia STATl como puedén ser aquellas secuencias proporcionadas en Meraz y col., 1996, Cell 84: 431; Durbin y col., 1996, Cell 84: 443, y las referencia mencionadas en éstas) . Una vez que se ai la el clon genómico, todo o una porción del clon se introduce en un vector recombinante. De preferencia, la porción de 1 clon inducida en el vector contiene cuando menos una porción de un exon del gen STATl, es decir, contiene una secijiencia codificante de la proteína STATl. Una secuencia no hom loga para la secuencia STATl, de preferencia un marcador s leccionable positivo, como puede ser un gen que codifique para un gen de resistencia a antibióticos, entonces se introduce en un exon del gen STATl. El marcador seleccionable de preferencia se liga de manera operante a un promotor, de mayor preferencia un promotor constitutivo. La ; ecuencia no homologa se introduce en cualquier parte en la secuencia codificante STATl que realizará la disrupción de la actividad STATl, por ejemplo, en una porción donde se ha demostrado mutaciones puntuales u otras mutaciones para ina tivar la función de la proteína STATl. Por ejemplo, pero n como limitación, la secuencia no homologa puede ser insertada en la secuencia codificante para la porción de la protí ína STATl que contiene todo o una porción del dominio ciñas ¡ (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica para cuando menos 50, 100, 150, 200 ó 250 aminoácidos del domin io cinasa) . El marcador seleccionable positivo de preferencia es un gen de resistencia a nefmicina (gen neo) o un gen de resistencia a higromicina (gen higro) . El promotor puede ser cualquier promotor conocído en la técnica; por ejemplo el promotor puede ser el prornotor fosfoglicerato cinasa (PGK) (Adra y col., 1987, Gene 60: 65-74), el promotor Pol II (Soriano y col., 1991. Cell 64: 693-701), o el promotor MCI, que es un promotor sintético diseñado para la expresión en células, primordiales obt nidas de embriones (Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512). El uso de un marcador seleccionable, como puede ser un gen de resistencia a antibióticos, permite la selección de células que han incorporado el vector de e .ección (por ejemplo, la expresión del producto del gen neo < onfiere resistencia a G418, y la expresión del producto del gen higro confiere resistencia a higromicina) . En una modalidad pre: erida, un marcador seleccionable negativo para un paso de contra selección para recombinación homologa, contraria a la no homologa, el vector se inserta fuera del inserto del clon genómico STATl. Por ejemplo, tal marcador seleccionable negativo es el gen de timidina cinasa de HSV (HSV-t?), la expre ion del cual hace a las células sensibles a ganciclovir EL marcador seleccionable negativo de preferencia esta bajo el control de un promotor como puede ser, pero no se limi a a el promotor PGK, el promotor PolII o el promotor MCI. Cuando ocurre recombinación homologa, las porciones del vector que son homologas ai gen STATl, así como el inserto no homólogo dentro de la 3 secuencias del gen STATl, se incorporan en el gen STATt del cromosoma, y se pierde el resto del vector. Así pues, dado que el marcador seleccionable negativo está fuera de la región de homología con el gen STATl, las células en las que ha ocurrido recombinación homologa (o su progenie) , no contendrán el marcador seleccionable negativo. Por ejemplo, si el marcador seleccionable negativo es 1 gen HSV- tk, las células en las cuales ha ocurrido rec :ombinación homologa no expresarán timidina cinasa y sobrsviiviran a la exposición al ganciclovir. Este proceduníento permite la selección de células en las cuales ha ocurrido recombinación homologa, en comparación con recombinación no homologa en la cual es muy probable que el marcador seleccionable negativo también sea incorporado en el genoma j unto con las secuencias STATl y el marcador seleccionable pos itivo. Así pues, las células en las que ha ocurrido recombinación no homologa muy probablemente expresarán tiimidina cinasa y serían sensibles a ganciclovir. Una vez que se prepara el vector de elección, éste es linearizado con una enzima de restricción para la cual hay un sitio único en el vector de elección, y el vector linearizado se introduce en las células primordiales provenientes de embrión ( ES ) (Gossler y col., 1986, Proc. Nati., Acad. Sci. USA 83: 9065-9069) por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por electroporación. Si el vector de elección incluye un marcador seleccionable positivo y un marcador contra seleccionable negativo, las células ES en las que ha ocurrido recombinación homologa pueden ser seleccionadas pár incubación en medio selectivo. Por ejemplo, si los marcadores seleccionables son el gen de resistencia a neo y el gen RSV- tk, las células se exponen a G418 (por ejemplo, aproxim damente 300 µg/ml) y ganciclovir (por ejemplo, aproximadamenjte 2 µM) . Cualquier técnica conocida para la determinación del genotipo, por ejemplo, pero no se limita a el análisis southern blot o la reacci.ón en cadena de la polimerasa, pueden utilizarse para confirmar que las secuencias STATl sometidas a disrupción se han recombinado homólogamente en el gen STATl en el genoma de las células ES. Debido a que se conoce el mapa de restriccion del clon genómico STATl y se conoce la secuencia de la £ ecuencia codificante STATl (véase Meraz y col., 1996, Cell 84 : 431; Durbin y col., 1996, Cell 84: 443-450, y todas las referencias mencionadas en éstas) , es posible determinar e 1 tamaño de un fragmento de restricción particular o i n producto de amplificación por PCR generado a partir de DNA de los alelos sometidos a disrupción y no sometidos a disrupción. Así pues, al ensayar para un fragmento de restricción o producto de la PCR, el tamaño de los cuales difiere entre el gen STATl sometido a disrupción y no sometido a disrupción, es posible determinar si ha ocurrido recombinacicon homologa para la disrupción del gen STATl. Las células ES con el locus STATl sometido a disrupción pueden entonces ser introducidas en blastocistos por microinyección y luego los blastocistos pueden ser implantados en los út ros de ratones seudopreñados utilizando las técnicas normales. El animal que se desarrolla a partir de 1 os blastocistos implantados son quiméricos para el alelo : ometido a disrupción. Los machos quiméricos pueden ser cru :ados con hembras, y esta cruza puede ser diseñada de mod que la transmisión de la línea germinal del alelo este vinculada con la transmisión de un cierto color de la capa. La transmisión de la línea germinal del alelo puede ser confirrrtada mediante el análisis southern blot o PCR, como ya se de cribió, del DNA genómico aislado de muestras de tejido. 5.3.3 SUSTRATOS DEFICIENTES DE IFN TRANSITORIOS Las células, lineas celulares, animales o huevos pueden ser pretratados con compuestos que inhiban el sistema del IFN. De acuerdo con la presente invención, los compuestos que inhiben la síntesis del IFN, o la actividad o la expresión de los componentes del sistema del IFN pueden utilizarse para pretratar hospederos, por ejemplo, compuestos que inhiban la síntesis del IFN, la actividad del IFN, el receptor del IFN, otros objetivos en la ruta de transducción de la señal de 1 IFN, .o que inhiban la actividad de los genes antivirales iaducidos por IFN. Los ejemplos de los compuestos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen pero no se limitan a, moléculas celular del IFN, y un < xcipiente conveniente. El virus utilizado en la formu ación de vacunas puede ser seleccionado de los mutantes naturales o variantes, virus mutagenizados o virus gen ticamente manipulados. Las cepas atenuadas de los virus de ftNA segmentados también pueden ser generadas por las técnicas de rearreglo o utilizando una combinación del método de cenética inversa y las técnicas de rearreglo. Las variantes naturales incluyen virus aislados de la naturaleza así como variantes que ocurren espontáneas generadas durante la propagación de los virus, teniendo una capacidad deteriorada para antagonizar la respuesta celular del IFN. El virus atenúado por sí mismo puede utilizarse como el ingrediente activo en la formulación de vacunas. De otro modo, es posible utilizar el virus atenuado como el vector o "esqueleto" de -as vacunas producidas en forma recombinante. Para este fin , las técnicas recombinantes como genética inversa (o, para virus fragmentados, combinaciones de genética inversa y la técnicas de rearreglo) pueden utilizarse para manipular mutaciones o inducir antígenos extraños en los virus atenuados utilizados en la formulación de vacunas. En este sentido, las vacunas pueden ser diseñadas para inmunización contra variantes de cepas, o en la alternativa, contra agentes infecciosos completamente diferentes o antígenos de e fermedad. En los virus de la nvencion para uso en vacuna es posible construir casi cualquier secuencia heteróloga de gen. De preferencia, los epitopes que inducen una respuesta inmune protectora para fualquiera de una variedad de patógenos, o los antígenos que se unen a anticuerpos neutralizantes pueden ser expresados por o como parte de los virus. Por ejemplo, las secuencias de genes heterólogas que pueden ser construidas en los virus de la invención para uso en vacunas incluyen, pero no se limitan a, epitopes del virus de inmunodeficienci humana (VIH) como puede ser gpl20; antígeno de superficie del virus de hepatitis B (HbsAg) ; las glucoproteínas del virus del herpes (por ejemplo, gD, gE) ; VP1 de poliovirus; determinantes antigénicos de patógenos no virales como bacterias y parásitos, por nombrar solc algunos. En otra modalidad, es posible expresar todo o porciones de los genes de inmunoglobulina. Por ej émplo, regiones variables de inmunoglobulinas anti-idiot ípicas que imitan tales epítopes pueden ser construidas en los virus de la invención. En todavía otra modalidad, es posible expresar antígenos asociados con tumor. Es posible formular un¿ vacuna viral recombinante viva o una vacuna viral recombinante inactivada. Una vacuna viva puede ser preferida porque la multiplicación en el hospedero da origen a un estímulo prolongado de clase y magnitud similar a la que ocurre e infecciones naturales, y o por tanto, confiere inmunidad substancial y de larga duración. La producción de estas formulaciones de vacunas de virus recombinantes vivos puede llevarse a cabo utilizando los métodos tradicionales que incluye la propagación del virus en cultivos celulares o en el alantoides de embriones de pollo seguidos por purificaeion. Las formulaciones de vacunas pueden incluir virus de RNA de cepa negativa genéti camente manipulados que tengan mutaciones en el gen de NS 1 o gen análogo que incluye pero no se limita a mutantes de influenza NSl truncados descritos en los ejemplos de trabajo infra. Estas también pueden ser formuladas utilizando variantes naturales, como puede ser la variante natural A/turkey/Cre/71 de influenza A, o B/201, y B/AWBY-234, las cuales son variantes naturales de influenza B. Cuando se formula como una vacuna de virus vivo, debe utilizarse un intervalo de aproximadamente 104 ufp a aproximadamente 5xl06 ufp p r dosis. Muchos métodos pueden utilizarse para introducir las formulaciones de vacunas ?ntes descritas, estos incluyen, pero no se limitan a las vías intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, i ntramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. Puede ser preferible introducir la formulación de vacuna de virus por una vía de infección natural del patógeno para 1 a cual se diseña la vacuna, o por la vía natural de infeccic n del virus atenuado precursor.
Cuando se utiliza una pr paración de vacuna de virus de influenza vivo, puede ser preferible introducir la formulación por la via nat ral de infección para el virus de influenza. La capacidad de virus de influenza para inducir una respuesta secretora e inmune celular vigorosa puede ser utilizada de manera' conveniente. Por ejemplo, la infección del tracto respiratorio por virus de influenza puede inducir una respuesta inmune secretora fuerte, por ejemplo en el sistema urogenital, con la protección concomitante contra un agente causal de enfermedad particular. Una vacuna de la presente invención, conteniendo 104 - 5xl06 ufp de virus mutantes con actividad antagonista de IFN alterada, puede administrarse una vez. De otro modo, una vacuna de la presente invención, conteniendo 104 - 5xl06 ufp de virus mutantes con acti idad antagonista de IFN alterada puede administrarse de dos a tres veces con un intervalo de dos a seis meses entre dosis. De otro modo, una vacuna de la presente invención, conteníendo de 10' 5x10 ufp de virus mutantes con actividad antagonista de IFN alterada, podría ser administrada con tanta frecuencia como sea necesario a un animal, de preferencia un mamífero, y de mayor preferencia a un ser humano., 5.5 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La presente invención comprende las composiciones farmacéuticas que contiene:n virus mutantes con actividad antagonista de IFN alterada para ser utilizados como agentes antivirales o agentes antitumor o como agentes contra enfermedades sensibles al IFN. Las composiciones farmacéuticas tienen utilidad como un profiláctico antiviral y pueden ser administradas a un individuo en riesgo de ser infectado o que se espera estará expuesto a un virus. Por ejemplo, en el caso de que un niño llegue a casa de la escuela donde se expuso a c.iferentes compañeros de clase con gripe, uno de los padre ; administraría una composición farmacéutica antiviral de la invención al niño u otros miembros de la familia para evitar la infección viral o la enfermedad subsiguiente. Las personas que viajan a partes del mundo donde prevalecen ciertas enfermedades infecciosas (por ejemplo, virus de hepatitis A, malaria, etc.) también pueden ser tratadas. De otro modo, es poí ible utilizar las composiciones farmacéuticas para tratar tumores o prevenir la formación de tumores, por ejemplo, en p acientes que tienen cáncer o en aquellos que están en alto riesgo de desarrollar neoplasmas o cáncer. Por ejemplo, pacientes con cáncer pueden ser tratados para prevenir otras tumorigénesis. De otro modo, individuos que están o se espera que estarán expuestos a carcinógenos pueden ser tratados; pueden tratarse individuos involucrados en limpieza ambiental que pueden estar expuestos a contaminantes por ejemplo asbestos). De otro modo, individuos que van a estar expuestos a radiación pueden ser tratados antes de la exposición o después de ésta (por ejemplo, pacientes expuestos a altas dosis de radiación o que deben tomar medicamenj os carcinogénicos) . El uso de virus atenuádos de la invención como agentes antitumorales se basa sn el descubrimiento de los solicitantes que un mutant del virus de influenza atenuado que contiene una deleción en su gen antagonista de IFN puede reducir la formación de tumores en ratones.. Las propiedades antitumorales de la invención pueden ser cuando menos parcialmente relacionadas con su capacidad para inducir IFN y respuestas del IFN. pe otro modo, las propiedades antitumor de los virus a enuados de la invención pueden estar relacionadas con su capacidad para crecer en y matar células de tumor, muchos de los cuales son conocidos por tener deficiencias en el sistema del IFN. No obstante, el (los) mecanismo (s) molecular responsable de las propiedades antitumorales, los virus atenuados de la invención deben utilizarse ara tratar tumores o prevenir la formación de tumores. La presente invención además comprende los virus mutantes con un fenotipo antagonista de IFN, alterado que se dirigen a órganos específi cos, tejidos y/o células en el cuerpo para inducir efectos terapéuticos o profilácticos en IFN pueden ser manipulados para expresar cualquier producto del gen elegido, incluidos los péptidos, proteínas, como pueden ser las enzimas, hfrmonas, factores de crecimiento, antígenos o anticuerpos, que funcionarán para dirigir el virus a un sitio en necesidad de actividad antiviral, antibacteriana, antimicrobiana o anticáncer, Los métodos de introduc ción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas por cua Iquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o por inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos, La administración puede ser sistémica o local. Además, en una modalidad preferida puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en los pulmónes mediante una vía conveniente, También puede emplearse ] a administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente pulverizador . En una modalidad especifica, puede ser deseable administrar las composiciónes farmacéuticas de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento; esto puede lograrse mediante, por ej emplo, y no como limitación la infusión local durante cirugia, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendajjíe para heridas después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas las membranas corno las membranas sialásticas o fibras. En una modalidad, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un tumor maligno o tejido neoplásico o preneoplásico. En todavía otra modal -dad, la composición farmacéutica puede se suministrada én un sistema de liberación controlada. En una modalidad, puede utilizarse una bomba (véase Langer, supra ; Seftpn, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald y co1., 1980, Surgery 88: 507; Saudek y col., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). En otra modalidad, es posible utilizar mater: ales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.)., Wiley, Nef/ York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. Macromol. Sci-. Re r . Macromol. Chem. 23: 61; véase también Levy y col., 1985, Science 228: 190; During y col., 1989, Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard y col., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). En todavía otra modalidad, es posible colocar un sistema de lib ración controlada en proximidad del objetivo de la c :omposición, es decir, el pulmón, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138). Otros sistemas de liberación óontrolada se describen en la revisión de Langer (1990, S ience 249: 1527-1533) . Las composiciones farme.céuticas de la presente invención contienen una cantidad terapéuticamente eficaz del virus atenuado, y un portador aceiptable para uso farmacéutico. En una modalidad específica, el término "aceptable para uso farmacéutico" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refi re a un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra la composición farmacéutica Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dext.rosa y glicerol también pueden emplearse como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables, Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidóf, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, arina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada anhidra, glicerol, propilen glicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones pueden tornar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de 1 beración prolongada y similares. Estas composiciones pueden estar formuladas como un supositorio. La formuladon oral puede incluir portadores normales como los grados f rmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc . Los ejemplos de los portadores farmacéuticos convenientes están descritos en "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad eficaz para uso terapéutico del terapéut. .co, de preferencia en forma purificada junto con una cantidad conveniente del portador para proporcionar la forma de administración adecuada para el paciente. La formulaci .ón debe adecuarse al modo de administración. La cantidad de la composición farmacéutica de la invención que será eficaz e n el tratamiento de un trastorno o padecimiento específico dependerá de la naturaleza del trastorno o padecimiento, y puede determinarse por las técnicas clínicas normales Además, los ensayos in vi tro pueden opcionalmente emplea :se para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa para ser empleada en la formula* :ión también dependerá de la vía de administración, y la seriedad de la enfermedad o padecimiento, y debe ser decidida de acuerdo con el juicio del médico y de cada circunstancia del paciente. No obstante, los intervalos de dosis adecuados para administración generalmente son aproximadamente 104 - 5xl06 ufp y pueden ser administiradas una vez, o múltiples veces con intervalos tan frecuentes como sea necesario. Las composiciones farmacéutica de la presente invención que contienen 104 - 5xl06 ufp de los virus mutantes con actividad antagonista de IFN alterada pueden ser administrados por vía intranasal, intratraqueal, intramuscular o subcutánea. Las dosis eficaces pueden ser extrapoladas a partir de curvas de dosis-respuesta provenientes de sistemas de prueba in vi tro o en modelos animales. 6. EJEMPLO: GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MUTANTES POR TRUNCACION DE NSl DE VIRUS DE INFLUENZA A 6.1 MATERIALES Y MÉTODOS El virus de influenza A/PR/8/34 (PR8) fue propagado en huevos de embriones de polio de 10 días a 37°C. El virus de influenza A 25A-1, un virús rearreglante que contiene el segmento NS proveniente de la cepa adaptada en frío A/Leningrad/134/47/57 y los genes restantes provenientes del virus PR8 (Egorov y col., 994, Vopr. Virusol. 39: 201-205; Shaw y col., 1996, en Opt: ons of the control of influenza III, eds. Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) pp. 433- 436) fue crecido en célula Vero a 34°C. El virus 25A-1 es sensible a la temperatura en células de mamífero, y fue utilizado como un virus cooperante para el rescate del virus transfectante NS1/99. Para el crecimiento del virus de influenza se utilizaron células Vero y células MDCK mantenidas en un medio esencial mínimo (MEM) conteniendo 1 µg/ml de tripsina (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) También se utilizaron células Vero para la selección, purificación en placas y titulación del virus NS1/99. Las células MDCK fueron mantenidas en DMEM (medio mínimo esencial de Dulbecco) conténiendo 10% de suero bovino fetal inactivado por calentamiento. Las células Vero fueron crecidas en medio AIM-V (?ife Technologies, Grand Island, NY) . El plásmido pT3NSl/99, que contiene una forma truncada C terminal 99 aminoácidos de la NSl fue preparado como sigue.
Primero, el pPUC19-T3/NS PR8, conteniendo el gen de NS completo del virus PR8 fianqueado por el promotor T3 RNA polimerasa y el virus de restricción BpuAI fue amplificado por PCR inversa (Ochman y cfl., 1988, Genetics 120: 621-623) utilizando los iniciadores adecuados. El cDNA obtenido así conteniendo el gen NSl truncado fue fosforilado, tratado con el fragmento de Klenow, autoligado y propagado en la cepa TG1 de E. coli . La construcción obtenida después de la cubiertas con medio de agar superpuesto a 37°C. El virus NS1/99 aislado fue analizado por RT-PCR utilizando iniciadores específicos El virus transfectante tipo silvestre fue generado como sigue: las células Vero en placas de 25 mm fueron transfectadas con plásmidos pHMG-NP, pHMG-PBl, pHMG-PB2, pHMG-PA y pPOLI-NS-RB, como ya se describió (Pleschka y col., 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). Dos días después del a infección, las células fueron incubadas con 5 x 104 ufp del virus delNSl e incubadas dos dias más a 37°C. El sobrenadante de las células fue pasado una vez en células MDCK y dos veces en huevos de embriones de pollo. Los virus transfectantces fueron clonados limitando la dilución en los huevós. El RNA genómico del virus transfectante NS1/99 p?|rificado fue analizado por electroforesis en gel de poliacrilamida, como ya se describió (Zheng y col., 996, Virology 217: 242-251). La expresión de una proteína NSl truncada por el virus NS1/99 fue verificada por extractos de células infectadas marcadas inmunoprecipitantes utiliza.ndo un antisuero policlonal de conejo contra NSl. La cavidad alantóica de los huevos con embriones de pollo, en edades de 6, 10 y 14 días fue inoculada con aproximadamente 103 ufp de yirus PR8, NS1/99 o delNSl (en los cuales todo el gen de NSl esta delecionado) , incubados a 37°C durante dos días, y os virus presentes en el fluido alantóico fueron titulados por ensayo de hemaglutinación (HA) . Grupos de cinco ratones BALB/c (Taconic Farms) fueron inoculados por via intranafal con 5 x 10° ufp, 1.5 x 105 ufp o 5 x 103 ufp de virus /pR/8/34 (PR8) tipo silvestre o NS1/99. Se realizaron -as inoculaciones con anestesia utilizando 50 µl de MEM conteniendo el número adecuado de unidades formadoras de p>lacas del virus adecuado. Los animales fueron supervisados diario, y sacrificados cuando fueron observados in extremis. En un experimento siguiente, todos los ratones sobrevivientes fueron desafiados cuatro semanas después con una dosis de 100 LD50 del virus PR8 tipo silvestre. Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con los lineamientos del NIH sobre el cuidado y uso de los animales de laboratorio. 6.2 RESULTADOS: ATENUACIÓN DE VIRUS DE INFLUENZA A POR DELECIONES EN NSl Los solicitantes ya demostraron que un virus de influenza A en el cual el gen de NSl fue delecionado (virus delNSl) puede crecer hast i títulos de aproximadamente 107 ufp/ml en células deficientes en la producción de interferón tipo I (IFN), como pueden ser las células Vero. No obstante, este virus fue deteriorado en su capacidad para replicarse y causar enfermedad en ratones (Garcia-Sastre y col., 1998, Virology 252: 324). Por el| contrario, el virus delNSl pudo crecer y matar ratonéis STATl-/-. Estos resultados demostraron que la proteíná NSl del virus de influenza A es un factor de virulencia involucrado en la inhibición de las respuestas antivirales del hospedero mediadas por el IFN tipo I. Se realizaron los siguientes experimentos para determinar si es posible generar virus de influenza con caracteristicas de viruler :.cia intermedia entre virus tipo silvestre y virus delNSl mediante la deleción de porciones del gen de NSl y si algunos de estos virus podrían tener características óptimas para ser utilizados como vacunas atenuadas vivas contra yirus de influenza, es decir, estabilidad equilibrio adecuado entre atenuación, inmunogenicidad y crecimiento en sustratos convenientes para la preparación de vacunáis, como pueden ser huevos de embriones de pollo. Para probar esta hipótesis, se generó un virus de influenza A/PR/8/34 (PR8) en el cual el gen de NSl había sido modificado para diricjir la expresión de una proteína NSl truncada conteniendo solo 99 aminoácidos en el amino terminal en común con los 230 aminoácidos de la proteína NSl tipo silvestre. Este vi rus (NS1-99) fue obtenido por transfección de RNP de un gen de NS artificialmente manipulado utilizando vi: us cooperador 25A-1, como se describió anteriormente (García-Sastre y col., 1998, Virology 252: 324). El anailisis de la expresión de NSl en células infectadas con vir•us reveló la naturaleza truncada de la proteína NSl del virus NS1-99. La capacidad de los virus delNSl, NS1-99 y PR8 tipo silvestre para crecer en huevos de embriones de pollo de diferentes edades fue anal.izada. El razonamiento para este experimento surge del hec:no de que la capacidad de los huevos de embriones para sintetizar y responder a IFN tipo I bajo un estímulo adecuado depende de la edad. De hecho, la inducibilidad y sensibilidad a IFN comienza en una edad de aproximadamente 10 días, y luego aumenta en forma exponencial con la edad (Sjekellick y col., 1990, In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 997 '; Sekellick & Marcus, 1985 J. Inferieron Res. 5: 657) Así pues, el uso de huevos de diferentes edades representa un sistema único para probar la capacidad de diferentes virus para inhibir las respuestas del IFN. Huevos de 6, 10 y 14 días de edad fueron inoculados con aproximadamente 103 ufp de virus PR8, NS1-99 o delNSl, incubados a 37°C durante des días, y los virus presentes en el fluido alantóico fueron titulados por el ensayo de hemaglutinación (HA) . Como se observa en la Tabla 3, aunque el virus tipo silvestre ereció a títulos de HA similares en huevos de embriones de 6, 10 y 14 días, el delNSl solo se replicó a un título de HA detectable en huevos de 6 días. Por el contrario, el virus NS1-99 mostró un comportamiento virus tipo silvestre, Tabla 4. Atenuación del virus NS1-99 en ratones Sobrevivientes Virus Dosis infectante (µfp 5 x 106 1.5 x 105 5 x 103 WT PR81 1/5 1/5 1/5 NS1/99 3/5 5/5 5/5 Virus de influenza A/PR/8/34 tipo silvestre EJEMPLO: GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MUTANTES POR TRUNCACION DE NSl EN VIRUS DE INFLUENZA B 7.1 MATERIALES Y MÉTODOS Los datos experimenta es son semejantes a los de la Sección 6.1. Dos virus mutantes de influenza B, B/610B5B/201 (B/201) y B/AWBY-234, de 12 7 aminoácidos y 90 aminoácidos de longitud (proteínas NS 1 truncadas C terminales), respectivamente, (Norton y col., 1987 Virology 156: 204; Tobita y col., 1990 Virology 174: 314) fueron obtenidos de experimentos de coinfección en cultivos tisulares incluyendo virus B/Yamagata/1/73 (B/Yam ) y A/Aichi/2/68 en presencia de anticuerpo anti-virus A ( H3N2 )' . El crecimiento de los virus mutantes de influenza en huevos de embriones de diferentes edades fueron comparados con el de un virus precursor B/Yam, el cual posee una proteína NSl de 281 aminoácidos tipo silvestre. Huevos de 6, 10 y 14 días fueron inoculados con aproximadamente 10 ufp de virus B/Yam, B/201 o B/AWBY-234, incubados a 35°C durante dfs días, y los virus presentes en el fluido alantóico fueron titulados por un ensayo de HA. Además se determinaron en ratones las características de atenuación de los virus B/ 201 y B/AWBY-234. Grupos de tres ratones BALB/c fueron infectados por vía intranasal con 3 x 105 ufp de virus mutantes B/YAM tipo silvestre o B/201 y B/AWBY/234, y se determinó la capacidad de estos virus para replicarse mediante la mee ición de los títulos virales en pulmones a los tres días dfspués de la infección dado que el virus B/Yam tipo silvestr : no induce signos aparentes de enfermedad en ratones. 7.2 RESULTADOS TABLA 5: Replicación del v|irus de influenza B en huevos de embriones de poll Título de hemaglutinación Virus Edad de los 6 días 10 días 14 días huevos : B/Yam 362 256 <2 B/201 32 <2 <2 B/AWBY-23' <2 <2 de influenza B/Yam/1/73 tipjo silvestre. En vista de que esta cepa del virus de infl enza B no induce síntomas de enfermedad en ratones, el grado de protección fue determinado midiendo títulos virales en pulmones al tercer día después del desafío, Aunque los animales control sin tratamiento tuvieron títulos alrededor de 104 ufp/pulmón, los virus no fueron detectados en los pulmones de los animales inmunizados (véase la Tabla 8). Estos- hallazgos sugieren que los virus de influenza A así como de influenza B conteniendo genes de NSl modificados pueden inducir una respuesta inmune en ratones que están completamente protegidos contra desafíos del virus tipo si l estre subsiguientes.
Tabla 7. Supervivencia de ratones inmunizados con virus de influenza A/NS1- 99 después del desafio con 100 LD50 del virus de influenza A/PR/8/34 tipo silvestre .
Dosis inmunizante de A/ virus NS1-99 No. de sobrevivientes /total 5xl06 ufp 3/3 1.5xl05 ufp 4/4 PBS 0/5 Tabla 8. Títulos en pulmón de ratones inmunizados con virus de influenza B/20: y B/AWBY-234 después del desafio con 3xl05 ufp de virus de influenza B/Yamagata/73 tipo silvestre .
Dosis inmunizante de A/virus NSl-99 Título en pulmón (ufp/pulmón) 3xl05 ufp de B/201 <10\ «IO1, <10x, <10\ ^O1 3xl05 ufp de B/AWBY-234 «CÍO1 PBS 2.5xl04, lxlO4, 1.7xl04, 3xl04, 5xl04 EJEMPLO: INDUCCIÓN DÉ INTERFERON TIPO I EN HUEVOS DE EMBRIÓN INFECTADOS CON VIRUS DELNS1 Después se determinó 1a capacidad del virus delNSl, un virus de influenza A carente de gen de NSl, para inducir secreción de IFN tipo I en huevos de embriones de pollo. Para este propósito, grupos de dos huevos de embriones de pollo de 10 días fueron infc ctados con 5xl03 ufp de los virus delNSl o PR8 tipo silvestre. 18 horas después de la incubación a 37°C, el flnido alantóico fue cosechado y dializado contra pH ácido durante la noche, para inactivar los virus infecciosos. Despues del tratamiento a pH ácido, las muestras fueron dializ das contra PBS, y estas fueron probadas para la actividad de IFN determinando la dilución más alta con actividad pro rectora contra infección por VSV (aproximadamente 200 ufp) en células CEF. Los resultados se muestran en la Tabla 9 e iHdican que en ausencia de NSl, los virus de influenza A son mayores inductores de IFN.
Tabla 9. Inducción de IFN en huevos Virus IFN (U/ml) PR8 <16, <16 delNSl 400, 400 simulado <16, <16 10. EJEMPLO: ACTIVIDAD ANTIVIRAL DEL VIRUS delNSl La eliminación del gen del antagonista de IFN (NSl) del virus de influenza A puedf dar origen a un virus con la capacidad para inducir altós niveles de IFN. Si este es el caso, el virus delNSl "int:erferirá" con la replicación de los virus sensibles al IFN Para probar esta posibilidad, los solicitantes investigaron la capacidad del virus delNSl para inhibir la replicación del virus de influenza A/WSN/33 (WSN) , una cepa del virus de influenza normalmente utilizada en el laboratorio, en huevos se puede observar en la Figura 1, el tratamiento de sol 2 ufp del virus delNSl pudo reducir los títulos 'final s del virus WSN en el fluido alantóico por un logaritmo. Además, el tratamiento con 2xl04 ufp del virus delNSl .io origen a una inhibición prácticamente completa de 1a replicación de WSN en huevos. El virus delNSl también putio interferir con la replicación en huevos de otras cepas de virus de influenza A (H1N1 y H3N2), virus de influenza B y un virus diferente como puede ser el virus Sendai (Figura 2). Animados por estos resultados, los solicitantes después determinaron la capacidad del virus delNSl para interferir con la replicación del virus de influenza tipo silvestre en ratones. Aunque el tratamiento con IFN tipo I en cultivos de tejidos evita la replicac .ón del virus de influenza A in vitro, el tratamiento de ratones con IFN no puede inhibir la replicación de los virus de influenza (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25-52) . Esto es cierto para la mayoría de las cepas endogáárnmiicas de ratones, excepto para los ratones A2G. Los ratones A2G, así como una proporción significativa de ratones ¡ilvestres (aproximadamente 75%), contienen cuando menos un alelo Mxl intacto, mientras que la mayor parte de las cepas de laboratorio -son Mxl -/- (Haller, 1986, Current Top Microbiol Immunol 127: 331-337). La proteína Mxl que es homologa de la proteína MxA humana (Aebi, 1989, Mol. Cell. B ol.. 11: 5062), es un inhibidor potente de la replicación del virus de influenza (Haller, 1980, Nature 283: 660) . Esta proteína no se expresa de manera constitutiva, sino que su expresión es inducida de manera transcripcional por EFN tipo I. Así pues, los ratones A2G pueden ser utilizados para probar la capacidad de los inductores de IFN para estimular una respuesta antiviral contra los virus de influe nza A (Haller, 1981 , Current Top Microbiol Immunol 92: 25-52; Los solicitantes infectaron por vía intranasal ocho ratones A2G de cuatro semanas de nacidos con 5xl06 ufp de un aislado de virus de influenza A/PR/8/34 altamente patógeno (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92: 25-52). La mitad de los ratones r reci ieron un tratamiento intranasal con 5xl06 ufp de delNSl a 4h con respecto a la infección de PR8. Los otros cuatro rat ones fueron tratados con PBS. Se supervisaron los cambios en los pesos corporales y la supervivencia. Estos re sultados demuestran que el tratamiento con delNSl pudo proteger a los ratones A2G contra la muerte inducida por el virus de influenza y la pérdida de peso corporal, EL mismo tratamiento no fue eficaz en ratones Mxl -/- indicaneo que el mecanismo de protección viral fue mediado por Mxl, s decir IFN. 11. EJEMPLO: PROPIEDADES ANTITUMORALES DEL VIRUS DELNS1 EN RATONES Dado que el IFN tipo I y/o los inductores de IFN tipo II han sido mostrados con actividades antitumorales (Belardelli y Gresser, 1996 Immunology Today 17: 369-372; Qin y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14411-14416), es posible que el tratamiento de tumore;s con virus delNSl podría mediar la regresión del tumor. De ftro modo, el virus delNSl podría tener propiedades oncolíticfas, es decir, puede ser capaz de crecer específicamente y matar células de tumor, muchos de los cuales son conocidos por tener deficiencias en el sistema IFN. Para probar 1 actividad antitumoral del virus delNSl, se realizó el siguiente experimento utilizando la línea celular de carcinoma de murino CT26.WT en un modelo de tumor de ratón para metastasis pulmonar (Restifo y col., 1998 Virology 249: 89-97) 5xl05 células CT26.WT fueron inyectadas por vía intravenosa en doce ratones BALB/c de seis semanas de nacidos, La mitad de los ratones fueron tratados por vía intranasal con 106 ufp del virus delNSl cada 24 horas en los días 1, 2 ; i 3 después de la inoculación. 12 días después de la inyección del tumor, los ratones fueron sacrificados y fueron enu eradas las metástasis de pulmón. Como se muestra en la Tab a 10, el tratamiento con delNSl medió una regresión significativa de metástasis pulmonares en murino.
Tabla 10. Actividad an i umbral del virus delNSl en ratones BALB/c inyectados con células de tumor CT26.WT No. de metástasis pulmonares Tratado con PBS Tratado con delNSl Ratón 1 >250 120 Ratón 2 >250 28 Ratón 3 >250 9 Ratón 4 >250 Ratón 5 >250 2 Ratón 6 >250 1 12. EJEMPLO: LA PROTEINA NSl INHIBE LA TRANSLOCACION DE IRF-3 DURANTE LA INFECCIÓN CON VIRUS DE INFLUENZA Los resultados que se describen en la presente sugieren que la proteína NSl del virus de influenza es responsable de la inhibición de la respuesta de IFN tipo I contra el virus, y que las mutaciones/deleciones en esta proteína dan origen a virus atenuados debido i una respuesta de IFN mejorada durante la infección. Se sabe que la síntesis de IFN tipo I durante la infección viral puede ser activada por el RNA bicatenario (dsRNA) . El IRF 3 es un factor de transcripción que normalmente se encuentra en una forma inactiva en el citoplasma de células de mamiífero. El RNA bicatenario induce la fosforilación (activad fm) del factor de transcripción IRF-3, originando su trans ocación al núcleo, donde induce la transcripción de los gehes específicos, que incluye los genes que codifican para el IFN tipo I (Weaver y col., 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 1359 Para determinar si la NSl de influenza está actuando sobre IRF-3, se comprueba la ubicación de IRF-3 en las células CV1 infectadas con virus de influenza A PR8 tipo silvestre o con delNSl. La Figura 3 muestra que la translocación de IRF-3 es mínima en células infectadas con PR8 (en menos de 10% de las células) . Por el contrario, aproximadamente 90% de las células infectadas con delNSl mostró localización nuclear de IRF-3 De modo impresionante, fue posible inhibir parcialmente la translocación de IRF-3 en células infectadas con delNSl expresando NSl desde un plásmido en trans. Los resultados demuestran que el NSl del virus de influenza A puede inhibir la translocación de IRF-3 en células infectadas con virus. Es muy probable que la NSl del virus de influenza impide la activación mediada por dsRNA de IRF-3 secuestrando el dsRNA generado durante la infección viral, dando origen así a una inhibición de la síntesis de IFN. La presente invención no debe ser limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas que se proponen como simples ilustraciones de los aspectos individuales de la invención, y cualquier construcción de virus que sea funcionalmente equivalente están dentro del alcance de esta invención. En realidad, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente serán evidentes para los ejipertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada y los dibujos anexos. Estas modificaciones están propuestas para entrar dentro del alcance de las cláusulas anexas . Algunas referencias se citan en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en sus enterezas.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una formulación de vacuna que contiene: un virus de RNA de hebra negativa, atenuado, teniendo un fenotipo antagonista del interferón que: (a) es responsable de la atenuación, y (b) permite a 1 virus atenuado crecer a títulos mayores en sistemas hospederos deficientes de interferón en comparación con los sistemas hospederos competentes de interferón, cuando se propaga bajo las mismas condiciones; y un excipiente aceptable para uso fisiológico, 2. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, en la cual el virus atenuado se selecciona de virus naturales, virus mutagenizados o rearr glantes. 3. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, en la cual los virus aitenuados se seleccionan de mutantes genéticamente manipulados. 4. La formulación de vacuna de la reivindicación 3, en la cual el virus atenuado s un virus quimérico que expresa un epítope de un patógeno e traño . 5. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 en la cual el virus a enuado es un virus de influenza. 6. Una formulación de vacuna que contiene un virus de influenza atenuado que tier e una mutación en el gen de NSl responsable del fenotipo atenuado, y un excipiente aceptable para uso fisiológico. 7. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 en la cual el viru atenuado es un virus sincitial respiratorio. 8. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 en la cual el virus atenuado es un virus de parainfluenza. 9. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, 2 , 3 ó 4 en la cual el -Hrus atenuado es un virus de estomatitis vesicular. 10. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4 en la cual el virus atenuado es virus de la enfermedad de Newcastle. 11. La formulación de vacuna de la reivindicación 1, en la cual el sistema hospealero deficiente de interferón es STATl negativo y el si stema hospedero competente de interferón es STATl positivo 12. La formulación de vacuna de la reivindicación 5, en la cual el sistema hospede] o deficiente de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproximadamente 6 a 8 días, y el sistema hospedero compet nte de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproximfdamente 10 a 12 días. 13. La formulación de vacuna de la reivindicación 8 en la cual el sistema hospedero deficiente de interferón es un huevo de embrión de pollo fe aproximadamente 6 a 8 días, y el sistema hospedero compet nte de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproximadamente 10 a 12 días. 14. La formulación de vacuna de la reivindicación 9 en la cual el sistema hospedero deficiente de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproximadamente 6 a 8 días, y el sistema hospedero competente de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproximadamente 10 a 12 días. 15. La formulación de vacuna de la reivindicación 10 en la cual el sistema hospede: 0 deficiente de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproximadamente 6 a 8 días, y el sistema hospedero competente de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproxim damente 10 a 12 días, 16. La formulación de vacuna de la reivindicación 1 u 11 en la cual el título de; 1 virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficient e de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hosj: >edero competente de interferón. 17. La formulación de vacuna de la reivindicación 12 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficiente de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero comfetente de interferón. 18. La formulación de vacuna de la reivindicación 13 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficiente de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el tít lo del virus atenuado propagado en el sistema hospedero competente de interferón. 19. La formulación de vacuna de la reivindicación 14 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficiente de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero competente de interferón. 20. La formulación de vacuna de la reivindicación 15 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficiente de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero competente de interferón. 21. La formulación de vacuna de la reivindicación 5, en la cual la concentración del virus de influenza atenuado es aproximadamente 104 a apjroximadamente 5xl06 ufp por dosis, 22. La formulación de vacuna de la reivindicación 6, en la cual la concentración del virus de influenza atenuado es aproximadamente 104 a aproxiradamente 5xl06 ufp por dosis, 23. Una formulación farmacéutica, que contiene: un virus de RNA de hebra egativa, atenuado, teniendo un fenotipo antagonista del interferón que: (a) es responsable de la atenuación, y (b) pe emite al virus atenuado crecer a títulos mayores en sistemas; hospederos deficientes de interferón en comparación con los sistemas hospederos competentes de interferón, < uando se propaga bajo las mismas condiciones; y un excipiente aceptable para uso fisiológico. 24. La formulación farmacéutica de la reivindicación 23, en la cual el virus atenuado se selecciona de virus naturales, virus mutagenizados o rearreglantes. 25. La formulación farmacéutica de la reivindicación 23, en la cual los virus atenuados se seleccionan de mutantes genéticamente manipulados. 26. La formulación farmacéutica de la reivindicación 25, en la cual el virus atenuado es un virus quimérico que expresa un epítope de un patógeno extraño. 27. La formulación farmacéutica de la reivindicación 23, 24, 25 ó 26 en la cual el virus atenuado es un virus de influenza . 28. Una formulación f rmacéutica que contiene un virus de influenza atenuado que tiene una mutación en el gen de NSl responsable del fenot.ipo atenuado, y un excipiente aceptable para uso fisiológico 29. La formulación farmacéutica de la reivindicación 23, 24, 25 ó 26 en la cual el virus atenuado es un virus sincitial respiratorio. 30. La formulación fa rmacéutica de la reivindicación 23, 24, 25 ó 26 en la cual el virus atenuado es un virus de parainfluenza . 31. La formulación farmacéutica de la reivindicación 23, 24, 25 ó 26 en la cual el virus atenuado es un virus de estomatitis vesicular. y el sistema hospedero competente de interferón es un huevo de embrión de pollo de aproximadamente 10 a 12 días. 38. La formulación farmacéutica de la reivindicación 23 ó 33 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficiente de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hosóedero competente de interferón. 39. La formulación farmacéutica de la reivindicación 34 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficiente de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hosóedero competente de interferón. 40. La formulación farmacéutica de la reivindicación 35 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficiente de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hosbedero competente de interferón. 41. La formulación farmacéutica de la reivindicación 36 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficientre de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero competente de interferón. 42. La formulación farmacéutica de la reivindicación 37 en la cual el título del virus atenuado propagado en el sistema hospedero deficientre de interferón es cuando menos un logaritmo mayor que el título del virus atenuado propagado en el sistema hosbedero competente de interferón. 43. La formulación farmacéutica de la reivindicación 27, en la cual la concentración del virus de influenza atenuado es aproximadamentf lO"1 a aproximadamente 5xl06 ufp por dosis 44. La formulación farmacéutica de la reivindicación 28, en la cual la concentración del virus de influenza atenuado es aproximadamentf 104 a aproximadamente 5xl06 ufp por dosis, 45. Un virus de influfnza atenuado que contiene un gen de NSl modificado y un fenotipo del antagonista del interferón alterado. 46. El virus de influ nza atenuado de la reivindicación 45, en el cual el gen de NSl es modificado o truncado en el carboxilo terminal 47. El virus de influfnza atenuado de la reivindicación 45, en el cual el gen de NSl es modificado en el amino terminal . 48. El virus de inflúenza atenuado de la reivindicación 45, el cual es NS1/99. 49. Un método para vacuñar a un individuo, que consiste en administrar la formulacifn de vacuna de la reivindicación 1 ó 6 al individuo a una dosis eficaz para producir una respuesta inmune. 50. Un método para a prevención de una enfermedad infecciosa en un individuo que consiste en administrar la formulación farmacéutica de la reivindicación 23 ó 28 al individuo a una dosis ef caz para inducir una respuesta celular del interferón. 51. Un método para el tratamiento o prevención de tumores en un individuo, que consiste en administrar la formulación farmacéutica de la reivindicación 23 ó 28 al individuo a una dosis ef caz para inducir una respuesta celular del interferón un oñcolisis .
MXPA00012403A 1998-06-12 1999-06-11 Virus atenuados, de cepas negativas, con actividad antagonista del interferon alterada, para uso como vacuna y compuestos farmaceuticos. MXPA00012403A (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8910398P 1998-06-12 1998-06-12
US10883298P 1998-11-18 1998-11-18
US11768399P 1999-01-29 1999-01-29
PCT/US1999/013144 WO1999064068A1 (en) 1998-06-12 1999-06-11 Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA00012403A true MXPA00012403A (es) 2003-05-15

Family

ID=27376229

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA00012403A MXPA00012403A (es) 1998-06-12 1999-06-11 Virus atenuados, de cepas negativas, con actividad antagonista del interferon alterada, para uso como vacuna y compuestos farmaceuticos.
MXPA00012402A MXPA00012402A (es) 1998-06-12 1999-06-11 Metodos y substratos deficientes de interferon, novedosos, para la propagacion de virus.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA00012402A MXPA00012402A (es) 1998-06-12 1999-06-11 Metodos y substratos deficientes de interferon, novedosos, para la propagacion de virus.

Country Status (24)

Country Link
US (12) US6573079B1 (es)
EP (4) EP2316923B1 (es)
JP (7) JP4837827B2 (es)
KR (2) KR100637937B1 (es)
CN (1) CN1312725A (es)
AT (1) ATE351901T1 (es)
AU (2) AU771110B2 (es)
BR (1) BR9911163A (es)
CA (2) CA2334850C (es)
CY (1) CY1113689T1 (es)
CZ (2) CZ306637B6 (es)
DE (1) DE69934885T2 (es)
DK (4) DK1086207T3 (es)
ES (4) ES2650500T3 (es)
HU (1) HUP0102441A3 (es)
IL (6) IL140264A0 (es)
MX (2) MXPA00012403A (es)
NO (1) NO20006328L (es)
NZ (2) NZ509054A (es)
PL (3) PL219128B1 (es)
PT (1) PT1085904E (es)
RU (1) RU2236252C2 (es)
SK (3) SK288544B6 (es)
WO (2) WO1999064570A1 (es)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
DK1086207T3 (da) 1998-06-12 2007-05-29 Sinai School Medicine Hidtil ukendte fremgangsmåder og inteferon-deficiente substrater til opformering af vira
EP1390046A4 (en) * 1999-04-15 2005-04-20 Wellstat Biologics Corp TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES
CA2386920C (en) 1999-09-17 2012-01-24 Pro-Virus, Inc. Oncolytic virus
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
RU2280690C2 (ru) * 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) * 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
DK1358319T3 (da) 2000-09-25 2009-10-05 Polymun Scient Immunbio Forsch Levende influenzavaccine og fremgangsmåde til fremstilling heraf
KR101012952B1 (ko) 2001-02-14 2011-02-08 안트로제네시스 코포레이션 산후 포유류의 태반, 이의 용도 및 태반 줄기세포
WO2002094423A1 (en) 2001-05-22 2002-11-28 Access Business Group International Llc Method and apparatus for blending and dispensing liquid compositions
DK1406607T3 (da) 2001-07-16 2006-04-10 Greenhills Biotechnology Res D Anvendelse af en klasse antivirale forbindelser til at fremstille et stof til at behandle eller forhindre en virusinfektion i luftvejene
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
EP3332803B1 (en) * 2004-06-01 2021-09-08 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof
US8137676B2 (en) 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
NZ595736A (en) * 2005-12-02 2013-05-31 Sinai School Medicine Chimeric viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
US9241998B2 (en) * 2007-05-21 2016-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic RSV activity
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
CA2744354C (en) 2008-11-25 2018-10-02 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Method for production of ph stable enveloped viruses
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
WO2010077986A2 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Baxter International Inc. Production of viral vaccine
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
WO2010117786A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2010125461A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for protecting against influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
CA2767207A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing
ES2557315T3 (es) 2009-07-22 2016-01-25 Baxalta GmbH Nuevo virus de la gripe
US9217157B2 (en) 2009-07-27 2015-12-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant influenza viruses and uses thereof
WO2011014645A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza viruses and uses thereof
KR20120039047A (ko) 2009-07-31 2012-04-24 노파르티스 아게 역유전학 시스템
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
US8597637B1 (en) * 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
CA2801268A1 (en) * 2010-06-02 2011-12-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Novel method for generation of rna virus
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
AU2012312529B2 (en) 2011-09-20 2018-01-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
WO2014099931A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
WO2014159990A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Yale University Interferon production using short rna duplexes
CN111218429A (zh) 2013-03-14 2020-06-02 西奈山伊坎医学院 新城疫病毒及其用途
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
EP3110443A4 (en) 2014-02-27 2017-11-15 Viralytics Limited Combination method for treatment of cancer
CA2974699A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
AU2016222962B2 (en) 2015-02-26 2020-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Bivalent swine influenza virus vaccine
US10947512B2 (en) 2015-08-14 2021-03-16 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered NS1 protein function and related materials and methods
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
JP7189017B2 (ja) 2015-11-24 2022-12-13 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 細胞培養におけるウイルスの生産
US10907133B2 (en) 2015-11-24 2021-02-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in avian eggs
BR112018075032A2 (pt) 2016-06-15 2019-03-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai proteínas de hemaglutinina do vírus influenza e seus uso
WO2018115308A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Blue Sky Vaccines Gmbh Method for purifying virus
US11944679B2 (en) 2017-03-14 2024-04-02 The Regents Of The University Of California Genome-wide identification of immune evasion functions in a virus
EP3606555A4 (en) 2017-04-07 2021-08-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
US11339377B2 (en) 2017-11-08 2022-05-24 Bluesky Immunotherapies Gmbh SO3 chromatography for use in a method for virus purification
US20220160863A1 (en) 2019-01-24 2022-05-26 Blue Sky Vaccines Gmbh High growth influenza virus
WO2020163768A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
US20240108713A1 (en) * 2020-11-30 2024-04-04 Bluesky Immunotherapies Gmbh Novel replication deficient influenza a virus inducing high levels of type i interferon
US20240035035A1 (en) * 2020-12-09 2024-02-01 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
EP4351623A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) * 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) * 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US5106619A (en) * 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
US4693981A (en) * 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5766601A (en) 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
JPH07502496A (ja) 1991-10-07 1995-03-16 バイオゲン　インコーポレイテッド Ｃｄ２／ｌｆａ−３相互作用の阻害剤を用いる抗原提示細胞による皮膚障害の予防または治療の方法
US6162432A (en) * 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
EP0570357B1 (en) 1992-05-14 1997-06-25 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Peptides that induce antibodies which neutralize genetically divergent HIV-1 isolates
US7344722B1 (en) 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
EP0702085B2 (en) 1994-07-18 2010-01-13 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Recombinant infectious non-segmented negative strand RNA virus
US6300090B1 (en) 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DK0780475T4 (da) 1995-08-09 2006-10-23 Schweiz Serum & Impfinst Fremgangsmåde til fremstilling af infektiöse negativ-streng RNA-virus
US5840565A (en) * 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
US6264957B1 (en) 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
KR100658491B1 (ko) 1996-07-15 2006-12-18 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클론닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된 호흡기 세포 융합 바이러스 백신의 생산
CN1232504A (zh) 1996-09-27 1999-10-20 美国氰胺公司 在单链负义病毒目病毒内引起减毒的3'基因组启动子区和聚合酶基因中的突变
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
CA2283379A1 (en) 1997-03-05 1998-09-11 Michael G. Katze Novel screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis c virus replication
US5891705A (en) * 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
AU7797798A (en) 1997-05-23 1998-12-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
CA2295858C (en) 1997-07-11 2011-05-10 Yale University Rhabdoviruses with reengineered coats
EP1015594A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 American Cyanamid Company Attenuated respiratory syncytial viruses
DE69937999T2 (de) * 1998-06-12 2009-01-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Interferon induzierende genetisch veränderte attenuierte viren
DK1086207T3 (da) 1998-06-12 2007-05-29 Sinai School Medicine Hidtil ukendte fremgangsmåder og inteferon-deficiente substrater til opformering af vira
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
EP1194580B2 (en) 1999-07-14 2010-08-25 Mount Sinai School of Medicine of New York University In vitro reconstitution of segmented negative-strand rna viruses
RU2280690C2 (ru) 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
DK1358319T3 (da) 2000-09-25 2009-10-05 Polymun Scient Immunbio Forsch Levende influenzavaccine og fremgangsmåde til fremstilling heraf
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
CA2505949A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rutgers, The State University Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1
EP3332803B1 (en) 2004-06-01 2021-09-08 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof
US8137676B2 (en) 2005-02-15 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
NZ595736A (en) * 2005-12-02 2013-05-31 Sinai School Medicine Chimeric viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof
US7507411B2 (en) 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Also Published As

Publication number Publication date
JP4531255B2 (ja) 2010-08-25
WO1999064068A9 (en) 2000-03-09
WO1999064570A1 (en) 1999-12-16
JP5810134B2 (ja) 2015-11-11
KR20060080249A (ko) 2006-07-07
SK288544B6 (sk) 2018-03-05
CN1312725A (zh) 2001-09-12
US9387240B2 (en) 2016-07-12
US6852522B1 (en) 2005-02-08
US6669943B1 (en) 2003-12-30
US20090053264A1 (en) 2009-02-26
US8057803B2 (en) 2011-11-15
PL219128B1 (pl) 2015-03-31
EP1085904A1 (en) 2001-03-28
EP2316924B1 (en) 2017-10-11
SK288567B6 (sk) 2018-06-01
DK2316923T3 (en) 2018-01-08
US20120258134A1 (en) 2012-10-11
ES2653557T3 (es) 2018-02-07
JP2010142248A (ja) 2010-07-01
DE69934885T2 (de) 2007-11-08
IL140264A0 (en) 2002-02-10
SK288200B6 (sk) 2014-06-03
KR20010052782A (ko) 2001-06-25
JP5829655B2 (ja) 2015-12-09
PL212316B1 (pl) 2012-09-28
EP2316923A3 (en) 2014-04-09
US9352033B2 (en) 2016-05-31
IL188362A0 (en) 2008-03-20
WO1999064570A9 (en) 2000-03-09
PT1085904E (pt) 2013-03-05
ES2400445T3 (es) 2013-04-09
HUP0102441A2 (hu) 2001-10-28
BR9911163A (pt) 2002-01-15
AU4434399A (en) 1999-12-30
CZ306637B6 (cs) 2017-04-12
KR100637937B1 (ko) 2006-10-23
CA2334850A1 (en) 1999-12-16
US7588768B2 (en) 2009-09-15
IL140265A0 (en) 2002-02-10
DK2316924T3 (en) 2018-01-02
IL189766A0 (en) 2008-08-07
IL140264A (en) 2008-03-20
US20100233785A1 (en) 2010-09-16
CZ20004635A3 (en) 2001-06-13
US20100158942A1 (en) 2010-06-24
MXPA00012402A (es) 2003-07-14
AU771110B2 (en) 2004-03-11
AU770619B2 (en) 2004-02-26
ES2281177T3 (es) 2007-09-16
CZ302601B6 (cs) 2011-08-03
NZ509055A (en) 2004-02-27
NO20006328L (no) 2001-02-02
ATE351901T1 (de) 2007-02-15
CY1113689T1 (el) 2016-06-22
RU2236252C2 (ru) 2004-09-20
CA2334850C (en) 2013-11-26
EP1086207B1 (en) 2007-01-17
DE69934885D1 (de) 2007-03-08
CA2334895A1 (en) 1999-12-16
EP2316924A2 (en) 2011-05-04
EP1086207A1 (en) 2001-03-28
JP2002517470A (ja) 2002-06-18
US20160279227A1 (en) 2016-09-29
HUP0102441A3 (en) 2004-10-28
JP2002517229A (ja) 2002-06-18
CA2334895C (en) 2016-01-19
JP2011050384A (ja) 2011-03-17
EP1085904A4 (en) 2004-12-29
US20040109877A1 (en) 2004-06-10
US6573079B1 (en) 2003-06-03
EP2316923A2 (en) 2011-05-04
JP2013226154A (ja) 2013-11-07
IL140265A (en) 2008-06-05
ES2650500T3 (es) 2018-01-18
EP1085904B1 (en) 2012-11-28
DK1085904T3 (da) 2013-02-25
JP4837827B2 (ja) 2011-12-14
WO1999064068A1 (en) 1999-12-16
NZ509054A (en) 2004-01-30
NO20006328D0 (no) 2000-12-12
US7494808B2 (en) 2009-02-24
EP2316924A3 (en) 2014-03-19
EP2316923B1 (en) 2017-10-18
PL200977B1 (pl) 2009-02-27
JP2014036654A (ja) 2014-02-27
SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
US20140341948A1 (en) 2014-11-20
JP2010099081A (ja) 2010-05-06
US20050054074A1 (en) 2005-03-10
DK1086207T3 (da) 2007-05-29
US20090203114A1 (en) 2009-08-13
PL346212A1 (en) 2002-01-28
US8765139B2 (en) 2014-07-01
JP5081220B2 (ja) 2012-11-28
AU4434599A (en) 1999-12-30
PL398576A1 (pl) 2012-10-08
EP1086207A4 (en) 2003-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9387240B2 (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration