ES2400445T3 - Virus atenuados con cadena de polaridad negativa con actividad antagonista de interferón alterada para uso como vacunas y productos farmacéuticos - Google Patents

Virus atenuados con cadena de polaridad negativa con actividad antagonista de interferón alterada para uso como vacunas y productos farmacéuticos Download PDF

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Peter Palese
Adolfo Garcia-Sastre
Thomas Muster
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Mount Sinai School of Medicine
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Abstract

Uso de un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para la fabricación de un medicamentopara uso en prevenir o tratar una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto, en donde el genomadel virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de unacepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidosde la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepadel virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácidoN terminal es el número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidaddeteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular, y en donde el virus de la gripe atenuado modificadopor ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 dela cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe B.

Description

Virus atenuados con cadena de polaridad negativa con actividad antagonista de interferón alterada para uso como vacunas y productos farmacéuticos.
1. Introducción
La presente invención se refiere, en general, al uso de virus de la gripe atenuados que tienen un capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón (IFN) celular.
La invención se refiere al uso de virus de la gripe atenuados que tienen modificaciones en el gen NS1 que disminuyen o eliminan la capacidad del producto del gen NS1 de antagonizar la respuesta al IFN celular. Los virus mutantes se replican in vivo, pero demuestran una patogenicidad reducida y, por tanto, son muy adecuados para uso en vacunas de virus vivos y formulaciones farmacéuticas.
2. Fundamento de la invención 2.1 El virus de la gripe
Las familias de virus que contienen RNA monocatenario con envolvente del genoma de sentido negativo se clasifican en grupos que tienen genomas no segmentados (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae y virus de la enfermedad de Borna) o los que tienen genomas segmentados (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae). La familia Orthomyxoviridae, descrita con detalle más adelante, y empleada en los ejemplos de la presente memoria, incluye los virus de la gripe, tipos A, B y C, así como los virus de Thogoto y de Dhori y el virus de la anemia infecciosa de los salmones.
Los viriones de la gripe consisten en un núcleo de ribonucleoproteína interno (una nucleocápsida helicoidal) que contiene el genoma de RNA monocatenario, y una envolvente de lipoproteína externa revestida en el interior por una proteína de la matriz (M1). El genoma segmentado del virus de la gripe A consiste en ocho moléculas (siete para el virus de la gripe C) de RNA monocatenarios de polaridad negativa, lineales que codifican diez polipéptidos, que incluyen: las proteínas RNA-polimerasas dependientes de RNA (PB2, PB1 y PA) y la nucleoproteína (NP) que forman la nucleocápsida; las proteínas membranales de la matriz (M1, M2); dos glicoproteínas de superficie que sobresalen de la envolvente que contiene lípidos: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA); la proteína no estructural (NS1) y la proteína de exportación nuclear (NEP). La transcripción y replicación del genoma tiene lugar en el núcleo y el ensamblaje ocurre por medio gemación en la membrana plasmática. Los virus pueden intercambiar genes durante las infecciones mixtas.
El virus de la gripe adsorbe por medio de la HA los sialiloligosacáridos de las glicoproteínas y los glicolípidos de la membrana celular. Después de la endocitosis del virión, ocurre un cambio conformacional en la molécula de HA dentro del endosoma celular lo que facilita la fusión de las membranas, desencadenando así el des-revestimiento. La nucleocápsida migra al núcleo en donde se transcribe el mRNA viral. El mRNA viral se transcribe por un mecanismo único en el cual la endonucleasa viral escinde el extremo 5' protegido de los mRNA heterólogos celulares que luego sirven como cebadores para la transcripción de los moldes de los RNA virales por la transcriptasa viral. Los transcritos terminan en sitios situados en 15 a 22 bases desde de los extremos de sus moldes, en donde las secuencias de oligo(U) actúan como señales para la adición de tramos de poli(A). De las ocho moléculas de RNA virales, así producidas, seis son mensajes monocistrónicos que son traducidos directamente a las proteínas que representan HA, NA, NP y las proteínas polimerasas virales, PB2, PB1 y PA. Los otros dos transcritos experimentan empalme, proporcionando cada uno dos mRNA que se traducen en diferentes marcos de lectura para producir M1, M2, NS1 y NEP. En otras palabras, los ocho segmentos de RNA virales codifican diez proteínas: nueve estructurales y una no estructural. Un resumen de los genes del virus de la gripe y sus productos proteínicos se muestra en la Tabla I siguiente.
TABLA 1 SEGMENTOS DE RNA DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA GRIPE Y ASIGNACIONES DE CODIFICACIÓNa
Segmento
Longitudb (nucleótidos) Polipéptido codificadoc Longitudd (aminoácidos) Moléculas por virión Comentarios
1
2341 PB2 759 30-60 Componente de RNA transcriptasa; unión de la protección del RNA celular del hospedante.
2
2341 PB1 757 30-60 Componente de RNA transcriptasa; Iniciación de la transcripción.
3
2233 PA 716 30-60 Componente de RNA transcriptasa.
4
1778 HA 566 500 Hemaglutinina; trímero; glicoproteína de la envolvente; media la unión a las células.
5
1565 NP 498 1000 Nucleoproteína; asociada con RNA; componente estructural de RNA transcriptasa.
6
1413 NA 454 100 Neuraminidasa; tetrámero; glicoproteína de la envolvente.
7
1027 M1 252 3000 Proteína de la matriz; reviste el interior de la envolvente.
M2
96 ? Proteína estructural de la membrana plasmática; mRNA empalmado.
8
890 NS1 230 - Proteína no estructural; función desconocida
NEP
121 ? Proteína de exportación nuclear; mRNA empalmado
a Adaptado de R. A. Lamb and P. W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry, Volume 52, 467-506. b Para la cepa A/PR/8/34. c Determinado por métodos bioquímicos y genéticos d Determinada por análisis de secuencias de nucleótidos y secuenciación de proteínas
El genoma del virus de la gripe A contiene ocho segmentos de RNA monocatenario de polaridad negativa, que codifican una proteína no estructural y nueve proteínas estructurales. La proteína no estructural NS1 es abundante en 5 células infectadas con el virus de la gripe, pero no ha sido detectada en viriones. NS1 es una fosfoproteína encontrada en el núcleo tempranamente durante la infección y también en el citoplasma en tiempos más tardíos del ciclo viral (King et al., 1975, Virology 64:378). Estudios con virus mutantes de la gripe sensibles a la temperatura (ts) que llevan lesiones en el gen NS sugirieron que la proteína NS1 es un regulador transcripcional y post-transcripcional de los mecanismos por los cuales el virus es capaz de inhibir la expresión de genes de la célula hospedante y estimular 10 la síntesis de proteínas virales. Igual que otras muchas proteínas que regulan los procesos post-transcripcionales, la proteína NS1 interactúa con secuencias y estructuras de RNA específicas. Se ha descrito que la proteína NS1 se une a diferentes especies de RNA que incluyen: vRNA, poli-A, U6 snRNA, región no traducida en 5' de de los mRNA virales y dsRNA (Qiu et al., 1995, RNA 1:304; Qiu et al., 1994, J. Virol. 68:2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen. Virol. 73:3325-9. La expresión de la proteína NS1 a partir de cDNA en células transfectadas ha sido asociada con diversos
15 efectos: inhibición del transporte nucleo-citoplásmico de mRNA, inhibición del empalme de pre-mRNA, inhibición de la poliadenilación del mRNA del hospedante y estimulación de la traducción del mRNA viral (Fortes, et al., 1994, EMBO J. 13:704; Enami, et al., 1994, J. Virol. 68:1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol. 69:2427; Lu, et al., 1994, Genes Dev. 8:1817; Park, et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433; Nemeroff et al., 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen, et al., 1994, EMBO J. 18:2273-83).
20 2.2 Virus atenuados
Las vacunas de virus inactivados se preparan "matando" el patógeno viral, por ejemplo, por calor o tratamiento con formalina, de modo que no sea capaz de replicación. Las vacunas inactivadas tienen una utilidad limitada porque no proporcionan inmunidad de larga duración y, por tanto, confieren una protección limitada. Una propuesta alternativa para producir vacunas de virus implica el uso vacunas de virus vivos atenuados. Los virus atenuados son capaces
25 de replicación pero no son patógenos y, por tanto, proporcionan una inmunidad de mayor duración y confieren mayor protección. Sin embargo, los métodos convencionales para producir virus atenuados implican el aislamiento al azar de mutantes de la gama del hospedante, muchos de los cuales son sensibles a la temperatura; por ejemplo, el virus se somete a pases a través de hospedantes no naturales, y se seleccionan los virus de la progenie que son inmunógenos, pero no patógenos.
Un sustrato convencional para aislar y hacer crecer virus de la gripe para fines vacunales son los huevos de pollo embrionados. Los virus de la gripe se hacen crecer típicamente durante 2-4 días a 37ºC en huevos de 10-11 días. Aunque la mayoría de los aislados primarios humanos de los virus de la gripe A y B crecen mejor en el saco amniótico de los embriones, después de 2 a 3 pases los virus llegan a adaptarse a crecer en las células de la cavidad alantoidea, que es accesible desde el exterior del huevo (Murphy, B. R., and R. G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses pp. 1397-1445. En Fields Virology. Lippincott-Raven P. A.).
La tecnología del DNA recombinante y las técnicas de ingeniería genética, en teoría, proporcionarían una propuesta superior para producir un virus atenuado, puesto que se podrían producir deliberadamente por ingeniería genética mutaciones específicas en el genoma viral. Sin embargo, las alteraciones genéticas requeridas para la atenuación de virus ni se conocen ni son predecibles. En general, los intentos de usar la tecnología del DNA recombinante para obtener por ingeniería genética vacunas virales ha sido dirigida principalmente a la producción de vacunas subunitarias que solamente contienen las sub-unidades de proteínas del patógeno implicado en la respuesta inmunitaria, expresadas en vectores virales recombinantes, tales como el virus de la viruela de las vacas baculovirus. Más recientemente, las técnicas del DNA recombinante han sido utilizadas en un intento de producir mutantes por deleción de herpesvirus o poliovirus que mimetizan los virus atenuados encontrados en la naturaleza o mutantes de la gama del hospedante conocidos. Hasta 1990, los virus de RNA de cadena negativa no eran susceptibles en absoluto de manipulación específica de sitios, y por tanto, no podían ser modificados por ingeniería genética.
El trabajo de Egorov A. et al., (Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells, Journal of Virology, The American Society for Microbiology, vol. 72, nº 8, August 1998, páginas 64376441) describe un sistema genético inverso para rescatar mutantes por deleción específicos de NS1, es decir, NS1/124, NS1/80 y NS1/38, en los virus de la gripe A. Egorov et al., describen los virus de la gripe A que contienen 124, 80 y 38 aminoácidos en el extremo N-terminal de NS1.
Los virus de la gripe vivos atenuados producidos hasta ahora podrían no ser capaces de suprimir la respuesta al interferón en el hospedante en el que se replican. Por tanto, aunque estos virus son beneficiosos porque son inmunógenos y no patógenos, son difíciles de propagar en sustratos usuales para los fines de preparación de vacunas.
Además, los virus atenuados pueden poseer características de virulencia que son tan suaves que no permitan al hospedante provocar una respuesta inmunitaria suficiente para cumplir con las pruebas de virulencia subsiguientes.
3. Sumario de la invención
La presente invención se refiere al uso de virus de la gripe atenuados modificados por ingeniería genética que tienen una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al IFN celular, y al uso de dichos virus en formulaciones de vacunas y farmacéuticas. Los virus mutantes con una actividad antagonista de IFN deteriorada están atenuados – son infecciosos, pueden replicarse in vivo para proporcionar niveles sub-clínicos de infección y no son patógenos. Por tanto, son los candidatos ideales para vacunas de virus vivos. Además, los virus atenuados pueden inducir una fuerte respuesta al IFN que tiene otras consecuencias biológicas in vivo, confiriendo protección contra enfermedades infecciosas subsiguientes. Por tanto, los virus atenuados se pueden usar farmacéuticamente, para la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas sensibles al interferón..
Los virus de la gripe usados de acuerdo con la invención incluyen tanto virus segmentados como no segmentados. Los virus usados en la invención se pueden seleccionar de cepas, variantes o mutantes de origen natural; virus mutagenizados (por ejemplo, generados por exposición a mutágenos, pases repetidos y/o pase en hospedantes no permisivos); virus con intercambio genético (en el caso de genomas virales segmentados); y/o virus modificados por ingeniería genética (por ejemplo, usando técnicas de "genética inversa") que tienen el fenotipo deseado – es decir, una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al IFN celular. El virus de la gripe mutante o modificado por ingeniería genética se puede seleccionar en base a su crecimiento diferencial en sistemas deficientes en IFN frente a sistemas competentes en IFN. Por ejemplo, pueden seleccionarse los virus que crecen en un sistema deficiente en IFN, pero no en un sistema competente en IFN (o que crecen peor en un sistema competente en IFN).
Los virus atenuados así seleccionados se pueden usar por sí mismos como el ingrediente activo en vacunas o formulaciones farmacéuticas. Alternativamente, el virus atenuado se puede usar como vector o "cadena principal" de las vacunas producidas recombinantemente. Para este fin, puede usarse la técnica de la "genética inversa" para introducir por ingeniería genética mutaciones o introducir epítopos extraños en el virus atenuado, que serviría como la cepa "parental". De este modo, pueden diseñarse vacunas para la inmunización contra variantes de cepas, o alternativamente, contra agentes infecciosos o antígenos patógenos completamente diferentes. Por ejemplo, el virus atenuado puede ser modificado por ingeniería genética para expresar epítopos neutralizantes de otras cepas preseleccionadas. Alternativamente, pueden ser construidos en el virus mutante atenuado epítopos de virus distintos de los virus de RNA de cadena negativa (por ejemplo, gp160, gp120 o gp41 del VIH). Alternativamente, en el virus pueden ser introducidos por ingeniería genética epítopos de patógenos infecciosos no virales (por ejemplo, parásitos, bacterias, hongos). En otra alternativa más, se pueden preparar vacunas contra el cáncer, por ejemplo modificando por ingeniería genética antígenos tumorales en la cadena principal del virus atenuado.
En una realización particular que implica los virus de la gripe con genomas segmentados, se pueden usar técnicas de intercambio genético para transferir el fenotipo atenuado de una cepa de virus de RNA segmentado parental (un mutante natural, un virus mutagenizado o un virus modificado por ingeniería genética) a una cepa viral diferente (un virus de tipo natural, un mutante natural, un virus mutagenizado o un virus modificado por ingeniería genética).
Los virus de la gripe atenuados, que inducen fuertes respuestas al IFN en hospedantes, se pueden usar también en formulaciones farmacéuticas para la profilaxis o tratamiento de infecciones sensibles al interferón. A este respecto, el tropismo del virus atenuado puede ser alterado para dirigir el virus a un órgano, tejido o células dianas deseados in vivo o ex vivo. Usando esta propuesta la respuesta al IFN puede ser inducida localmente en el sitio diana, evitando o minimizando de este modo los efectos secundarios de los tratamientos sistémicos con IFN. Para este fin, el virus atenuado puede ser modificado por ingeniería genética para expresar un ligando específico para un receptor del órgano, tejido o células dianas.
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los solicitantes (los inventores de las solicitudes prioritarias) de que la NS1 del virus de la gripe de tipo natural actúa como un antagonista del IFN, porque la NS1 inhibe la respuesta mediada por IFN de células hospedantes infectadas por el virus. Se encontró que los mutantes virales deficientes en actividad de NS1 eran potentes inductores de la respuesta al IFN celular, y mostraron un fenotipo atenuado in vivo; es decir, los virus mutantes se replican in vivo, pero tiene efectos patógenos reducidos. Aunque no se pretende vincularse a ninguna teoría o explicación sobre cómo actúa la invención, las características atenuadas de los virus se deben presumiblemente a su capacidad para inducir fuertes respuestas al IFN celular, y su capacidad deteriorada para antagonizar la respuesta al IFN del hospedante. Sin embargo, las características beneficiosas de los virus atenuados pueden ser no solo atribuibles a los efectos de la respuesta al interferón celular. De hecho, las alteraciones en otras actividades asociadas a la NS1 pueden contribuir al fenotipo atenuado deseado.
Se demostró que los virus mutantes de la gripe con actividad antagonista de IFN deteriorada se replican in vivo generando títulos que son suficientes para inducir respuestas inmunológicas y de citoquinas. Por ejemplo, la vacunación con virus de la gripe atenuado redujo el título viral en animales que posteriormente fueron inoculados con virus de la gripe de tipo natural. Los virus de la gripe atenuados demostraron también actividad antiviral y antitumoral. La infección previa con virus de la gripe atenuados inhibió la replicación de otras cepas de virus de la gripe de tipo natural y otros virus (tal como el virus de Sendai) super-infectados en huevos embrionados. La inoculación de virus de la gripe atenuados en animales inyectados con células tumorales redujo el número de focos formados. Debido a que se sabe que el virus de la gripe induce una respuesta de los CTL (linfocitos T citotóxicos), el virus atenuado es un candidato muy atractivo para vacunas contra el cáncer.
Para formulaciones de vacuna se prefieren mutaciones que disminuyan, pero no supriman, la actividad antagonista del IFN de los virus – tales virus pueden ser seleccionados para crecimiento tanto en sustratos convencionales como no convencionales, y para virulencia intermedia. En particular, los inventores han demostrado que un mutante por truncamiento del extremo C-terminal de NS1 se replica con títulos elevados en sustratos deficientes en IFN, tales como huevos de pollo embrionados de 6 y 7 días, así como en la membrana alantoidea de huevos de pollo embrionados de 10 días, el sustrato usual para el virus de la gripe que no permite el crecimiento de mutantes del virus de la gripe en los cuales está suprimido el gen NS1 completo (también denominados mutantes "inactivados”). Sin embargo, la replicación del mutante por truncamiento del extremo C-terminal de NS1 está disminuida en huevos de pollo embrionados de 12 días. Esta propuesta permite, por primera vez, la generación e identificación de virus vivos de la gripe atenuados que tienen alterada, pero no suprimida, la actividad antagonista de IFN y que son capaces de crecer en sustratos adecuados para la preparación de vacunas. Esta propuesta permite también, por primera vez, un sistema de selección e identificación para virus de la gripe u otros que contienen mutaciones que confieren actividad antagonista de interferón alterada, pero no suprimida.
Los virus atenuados que no pueden crecer en sistemas convencionales usados actualmente para la producción de vacunas pueden ser propagados en sistemas deficientes en IFN. La expresión "sistemas deficientes en IFN", tal como se usa en la presente memoria se refiere a sistemas, por ejemplo, células, líneas celulares y animales, tales como ratones, pollos, pavos, conejos, ratas, etc., que no producen IFN o producen bajos niveles de IFN, no responden o responden menos eficazmente al IFN y/o son deficientes en actividad de los genes antivirales inducidos por el IFN. Para este fin, los inventores han identificado o diseñado cierto número de sistemas deficientes en IFN que pueden ser usados, incluyendo, aunque sin limitación: huevos embrionados de pocos días, líneas celulares deficientes en IFN (tales como células VERO o líneas celulares modificadas por ingeniería genética, tales como las que tienen inactivado el gen STAT1). Alternativamente, los huevos embrionados o las líneas celulares pueden ser tratados previamente con compuestos que inhiben el sistema del IFN (incluyendo fármacos, anticuerpos, secuencias antisentido, ribozimas, etc.). Un ejemplo implica el uso de huevos deficientes en el sistema del IFN, por ejemplo, huevos producidos por aves negativas al STAT1, especialmente aves de corral, incluyendo, aunque sin limitación: pollos, patos o pavos transgénicos.
4. Descripción de las figuras de los dibujos
Fig. 1. El virus delNS1 inhibe la replicación del virus de la gripe A de tipo natural en huevos. Huevos de pollo embrionados de 10 días fueron inoculados con las UFP (unidades formadoras de placas) indicadas del virus delNS1. Ocho horas más tarde, los huevos fueron infectados con 103 UFP del virus WSN. Después de dos días de incubación a 37ºC, se recogió el líquido alantoideo y se determinaron los títulos del virus WSN por ensayo en placas en células MDBK. Los resultados son el valor medio de dos huevos.
Fig. 2. Inducción de una respuesta antiviral en huevos embrionados por el virus delNS1. Se inocularon huevos de pollo embrionados de diez días con PBS (no tratados) o con 2x104 UFP del virus delNS1 (tratados con delNS1). Ocho horas más tarde, los huevos fueron entonces infectados con 103 UFP del virus de la gripe A/WSN/33 (H1N1), virus de la gripe A/PR8/34 (H+N1), virus de la gripe A/X-31 (H3N2), virus de la gripe B/Lee/40 o virus de Sendai. Después de dos días de incubación, se recogió el líquido alantoideo y se determinaron los títulos del virus por un ensayo de hemaglutinación. Los resultados son el valor medio de dos huevos.
Fig. 3. Se transfectaron células CV1 con un plásmido que expresa IRF-3 fusionada a la proteína fluorescente verde (GFP). Esto permitió determinar la localización de IRF-3 en el interior de las células por microscopía de fluorescencia. En algunos casos, se co-transfectó un plásmido de expresión de NS1 con el plásmido de expresión de IRF-3 en las relaciones indicadas. 24 horas después de la transfección las células fueron infectadas a una alta multiplicidad de infección (abreviadamente moi por la expresión inglesa multiplicity of infection) con el virus PR8(WT) o con el virus delNS1 como se ha indicado. 10 horas después de la infección, las células se analizaron en un microscopio de fluorescencia para la localización del IRF-3-GFP. Se indican los porcentajes de células que mostraban una localización citoplásmica exclusiva (CYT) y localizaciones tanto citoplásmicas como nucleares de IRF-3 (Nuc+Cyt).
5. Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a la generación, selección e identificación de virus de la gripe atenuados que tienen una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al IFN celular y al uso de dichos virus en formulaciones de vacunas y farmacéuticas.
En particular, la invención se refiere a un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética, en donde el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácido N-terminal es el número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular, para uso en tratar o prevenir una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto, y en donde el virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de la cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe
B.
La invención se refiere también al uso de un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para la fabricación de un medicamento para uso en prevenir o tratar una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto, en donde el genoma del virus atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácido Nterminal es el número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular y en donde el virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de la cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe B.
Los virus tienen genomas segmentados y se pueden seleccionar de cepas variantes o mutantes de origen natural; virus mutagenizados (por ejemplo, por exposición a irradiación UV, mutágenos, y/o pases); virus con intercambio genético; y/o virus modificados por ingeniería genética. Por ejemplo, los virus mutantes pueden ser generados por variación natural, exposición a irradiación UV, exposición a mutágenos químicos, por pases en hospedantes no permisivos, por intercambio genético (es decir, por co-infección de un virus segmentado atenuado con otra cepa que tiene los antígenos deseados) y/o por modificación por ingeniería genética (por ejemplo, usando "genética inversa"). Los virus seleccionados para uso en la invención tienen actividad antagonista de IFN defectuosa y están atenuados; es decir, son infecciosos y pueden replicarse in vivo, pero solo generan bajos títulos dando como resultado niveles de infección sub-clínicos que no son patógenos. Dichos virus atenuados son candidatos ideales para vacunas vivas.
En una realización preferida, los virus de la gripe atenuados seleccionados para uso en la invención deben ser capaces de inducir una fuerte respuesta al IFN en el hospedante -- una característica que contribuye a la generación de una fuerte respuesta inmunitaria cuando se usan como vacuna, y que tiene otras consecuencias biológicas que hacen que los virus sean útiles como agentes farmacéuticos para la prevención y/o tratamiento de otras infecciones virales u otras enfermedades que se tratan con IFN.
La invención se basa, en parte, en cierto número de descubrimientos y observaciones realizados por los inventores cuando trabajaban con mutantes del virus de la gripe. Sin embargo, los principios pueden ser aplicados y extrapolados análogamente a otros virus de RNA de cadena negativa segmentados y no segmentados incluyendo, aunque sin limitación: paramixovirus, (virus de Sendai, virus de la parainfluenza, virus de paperas, virus de la enfermedad de Newcastle), morbilivirus (virus del sarampión, virus del moquillo canino y virus de la peste del ganado); neumovirus (virus sincitial respiratorio y virus respiratorio bovino); y rhabdovirus (virus de la estomatitis vesicular y lyssavirus).
Primeramente, la respuesta al IFN es importante para contener la infección viral in vivo. Los inventores encontraron que el crecimiento del virus de la gripe de tipo natural A/WSN/33 en ratones deficientes en IFN (ratones STAT1 -/-) dio como resultado una infección pan-orgánica; es decir, la infección viral no estaba confinada a los pulmones como la está en los ratones de tipo natural que generan una respuesta al IFN (García-Sastre, et al., 1998, J. Virol. 72:8550). En segundo lugar, los inventores establecieron que la NS1 del virus de la gripe actúa como un antagonista del IFN. Los inventores descubrieron que un mutante del virus de la gripe con el gen NS1 completo suprimido (es decir, un gen NS1 "inactivado") no fue capaz de crecer con títulos altos en células hospedantes competentes en IFN, y solo podía propagarse en hospedantes deficientes en IFN. El virus con el gen NS1 inactivado demostró un fenotipo atenuado (es decir, fue letal en ratones STAT1 -/- deficientes en IFN, pero no en ratones de tipo natural) y se encontró que era un inductor potente de respuestas al IFN en células hospedantes (García-Sastre, et al., 1998, Virology 252:324-330). La infección previa con el virus mutante con el gen NS1 inactivado redujo los títulos del virus de la gripe de tipo natural y de otros virus (por ejemplo, el virus de Sendai) super-infectados en huevos embrionados. En otro experimento, la infección con el virus de la gripe mutante con el gen NS1 inactivado redujo la formación de focos en animales inoculados con células tumorales. Por tanto, el virus de la gripe con el gen NS1 inactivado demostró interesantes propiedades biológicas. Sin embargo, los virus mutantes con el gen NS1 inactivado no podía propagarse en sistemas convencionales para la producción de vacuna. Para superar este problema, los inventores usaron y desarrollaron sistemas deficientes en IFN que permiten la producción de rendimientos razonables de virus atenuados.
Además, los inventores diseñaron mutantes por deleción de NS1, que no suprimen el gen completo. Sorprendentemente, se encontró que estos mutantes NS1 presentaban un fenotipo "intermedio" -- el virus puede crecer en hospedantes convencionales usados para propagar el virus de la gripe (aunque el crecimiento es mejor en sistemas deficientes en IFN que proporcionan títulos mayores). Más importantemente, los mutantes por deleción están atenuados in vivo e inducen una fuerte respuesta al IFN. La vacunación con los mutantes truncados de NS1 del virus de la gripe dio como resultado bajos títulos de virus en animales subsiguientemente inoculados con virus de tipo natural, y confirieron protección contra la enfermedad.
Dentro del contexto de la presente invención se usan también sustratos diseñados para el aislamiento, identificación y crecimiento de virus para fines vacunales. En particular, se describen sustratos deficientes en interferón para el crecimiento eficiente de mutantes del virus de la gripe. De acuerdo con la presente invención, un sustrato deficiente en interferón es uno defectuoso en su capacidad de producir o responder al interferón. El sustrato de la presente invención se puede usar para el crecimiento de cualquier número de virus que puedan requerir un ambiente de crecimiento deficiente en interferón. Dichos virus pueden incluir, aunque sin limitación: paramixovirus (virus de Sendai, virus de la parainfluenza, virus de las paperas, virus de la enfermedad de Newcastle), morbilivirus (virus del sarampión, virus del moquillo canino y virus de la peste del ganado); neumovirus (virus sincitial respiratorio y virus respiratorio bovino); rhabdovirus (virus de la estomatitis vesicular y lyssavirus).
La invención se refiere también al uso del virus atenuado de la invención en vacunas y preparaciones farmacéuticas para seres humanos o animales. En particular, los virus atenuados pueden ser usados como vacuna contra una amplia gama de virus y/o antígenos, incluyendo aunque sin limitación: antígenos de variantes de cepas, virus diferentes u otros patógenos infecciosos (por ejemplo, bacterias, parásitos, hongos). En otra realización, los virus atenuados, que inhiben la replicación viral y la formación de tumores, se pueden usar para la profilaxis o tratamiento de infecciones sensibles al interferón (patógenos virales o no virales). Se pueden usar muchos métodos para introducir las formulaciones de virus vivos atenuados en un sujeto humano o animal para inducir una respuesta inmunitaria o de citoquinas apropiada. Estos métodos incluyen, aunque sin limitación: vías intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. En una realización preferida, los virus atenuados de la presente invención se formulan para ser administrados por vía intranasal.
5.1 Generación de mutantes con actividad antagonista de IFN alterada
Se puede seleccionar cualquier virus o cepa mutante que tenga una actividad antagonista de IFN disminuida para uso de acuerdo con la invención. En un ejemplo, se pueden seleccionar mutantes o variantes de origen natural o mutantes espontáneos que tengan una capacidad deteriorada de antagonizarla la respuesta al IFN celular. En otra realización, los virus mutantes pueden ser generados exponiendo el virus a mutágenos, tales como irradiación ultravioleta o mutágenos químicos, o por múltiples pases y/o pase en hospedantes no permisivos. Se puede usar cribado en un sistema de crecimiento diferencial para seleccionar los mutantes que tengan la función antagonista del IFN deteriorada. Para virus con genomas segmentados, el fenotipo atenuado puede ser transferido a otra cepa que tenga un antígeno deseado por intercambio de genético (es decir, por co-infección del virus atenuado y la cepa deseada, y selección de virus con intercambio genético que presenten ambos fenotipos).
En otro ejemplo, la mutaciones pueden ser obtenidas por ingeniería genética en un virus de RNA de cadena negativa, tal como virus de la gripe, RSV, NDV, VSV y PIV, usando propuestas de "genética inversa". De este modo se pueden obtener por ingeniería genética mutaciones naturales o de otro tipo que confieran el fenotipo atenuado en cepas vacunales. Por ejemplo, se pueden obtener por ingeniería genética deleciones, inserciones o sustituciones de la región codificante del gen responsable de la actividad antagonista de IFN (tal como el NS1 del virus de la gripe). También se contemplan deleciones, sustituciones o inserciones en la región no codificante del gen responsable de la actividad antagonista del IFN. Para este fin, se pueden obtener por ingeniería genética mutaciones en las señales responsables de la transcripción, replicación, poliadenilación y/o empaquetamiento del gen responsable de la actividad antagonista del IFN. Por ejemplo, en el virus de la gripe, dichas modificaciones pueden incluir aunque sin limitación: sustitución de las regiones no codificantes de un gen del virus de la gripe A por regiones no codificantes de un gen del virus de la gripe B (Muster, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5177), cambios de pares de bases en las regiones no codificantes de un gen del virus de gripe (Fodor, et al., 1998, J. Virol. 72:6283), mutaciones en la región promotora de un gen del virus de la gripe (Piccone, et al., 1993, Virus Res. 28:99; Li, et al., 1992, J. Virol. 66:4331), sustituciones y deleciones en el tramo de residuos de uridina en el extremo 5' de un gen de un virus de la gripe que afecta a la poliadenilación (Luo, et al., 1991, J. Virol. 65:2861; Li, et al., J. Virol. 1994, 68(2):1245-9). Dichas mutaciones, por ejemplo en el promotor, podrían sub-regular la expresión del gen responsable de la actividad antagonista de IFN. Las mutaciones en genes virales que puedan regular la expresión del gen responsable de la actividad antagonista del IFN están también dentro del alcance de los virus que pueden usarse de acuerdo con la invención.
La presente memoria describe mutaciones en el segmento del gen NS1 que pueden no dar como resultado una actividad antagonista del IFN alterada o un fenotipo inductor de IFN, sino que en lugar de ello dar como resultado funciones virales alteradas y un fenotipo atenuado, por ejemplo, inhibición alterada de la exportación nuclear de mRNA que contiene poli(A), inhibición alterada de empalmes de pre-mRNA, inhibición alterada de la activación de PKR por secuestro del dsRNA, efecto alterado sobre la traducción del RNA viral e inhibición alterada de la poliadenilación de mRNA del hospedante (por ejemplo, véase Krug en la obra Textbook of Influenza, Nicholson et al., Ed. 1998, 82-92, y las referencias citadas en dicho texto).
La técnica de la genética inversa implica la preparación de los RNA virales recombinantes sintéticos que contienen las regiones no codificantes del RNA del virus de cadena negativa que son esenciales para el reconocimiento por las polimerasas virales y para el empaquetamiento de las señales necesarias para generar un virión maduro. Los RNA recombinantes se sintetizan a partir de un molde de DNA recombinante y se reconstituyen in vitro con complejo de polimerasa viral purificado para formar ribonucleoproteínas (RNP) recombinantes que pueden usarse para transfectar células. Se consigue una transfección más eficiente si las proteínas polimerasas virales están presentes durante la transcripción de los RNA sintéticos ya sea in vitro o in vivo. Las RNP recombinantes sintéticas pueden ser rescatadas en partículas del virus infeccioso. Las técnicas anteriores están descritas en la patente de EE.UU. Nº
5.166.057 concedida el 24 de noviembre de 1992; en la patente de EE.UU. Nº. 5.854.037 concedida el 29 de diciembre de 1998; en la publicación de patente europea EP 0702085A1, publicada el 20 de febrero de 1996; en las publicaciones de patentes internacionales PCT WO97/12032 publicada el 3 de abril de 1997; WO96/3462 publicada el 7 de noviembre de 1996; en la publicación de patente europea EP-A780475; WO 99/02657 publicada el 21 de enero de 1999; WO 98/53078 publicada el 26 de noviembre de 1998; WO 98/02530 publicada el 22 de enero de 1998; WO 99/15672 publicada el 1 de abril de 1999; WO 98/13501 publicada el 2 de abril de 1998; WO 97/06270 publicada el 20 de febrero de 1997; y EPO 780475A1 publicada el 25 de junio de 1997.
Los virus atenuados generados por la propuesta de genética inversa se pueden usar en las formulaciones vacunales y farmacéuticas descritas en la presente memoria. Las técnicas de genética inversa se pueden usar también para introducir por ingeniería genética mutaciones adicionales en otros genes virales importantes para la producción de vacunas – es decir, los epítopos de variantes de cepas vacunales útiles pueden ser introducidos por ingeniería genética en los virus atenuados. Alternativamente, los epítopos completamente extraños, incluyendo los antígenos derivados de otros patógenos virales o no virales pueden ser introducidos por ingeniería genética en la cepa atenuada. Por ejemplo, antígenos de virus no relacionados, tales como antígenos parásitos del VIH (gp160, gp120, gp41) (por ejemplo, del virus de la malaria), antígenos bacterianos o fúngicos, pueden ser introducidos por ingeniería genética en la cepa atenuada. Alternativamente, los epítopos que alteran el tropismo del virus in vivo pueden ser introducidos por ingeniería genética en los virus atenuados quiméricos de la invención.
En una realización alternativa, se puede usar una combinación de técnicas de genética inversa y técnicas de intercambio genético para modificar por ingeniería genética virus atenuados que tengan los epítopos deseados en virus de RNA segmentados. Por ejemplo, un virus atenuado (generado por selección natural, mutagénesis o por técnicas de genética inversa) y una cepa que lleva el epítopo vacunal deseado (generado por selección natural, mutagénesis
5 o por técnicas de genética inversa) puede ser co-infectado en hospedantes que permitan el intercambio genético de los genomas segmentados. Se pueden seleccionar luego los productos de los intercambios genéticos que presenten tanto el fenotipo atenuado como el epítopo deseado.
En otra realización, el virus que ha de ser mutado es un virus de DNA (por ejemplo, el virus de la viruela de las vacas, adenovirus, baculovirus) o un virus de RNA de cadena positiva (por ejemplo, el poliovirus). En tales casos, se
10 pueden usar los métodos de DNA recombinante que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véanse las patentes de EE.UU. Nº 4.769.330 de Paoletti y Nº 4.215.051 de Smith).
Cualquier virus puede ser modificado por ingeniería genética de acuerdo con la presente invención, incluyendo, aunque sin limitación, las familias que se recogen en la Tabla 2 siguiente.
TABLA 2 FAMILIAS DE VIRUS DE SERES HUMANOS Y ANIMALES
CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS
FAMILIA DE VIRUS
dsDNA Con envolvente Sin envolvente
Poxviridae Irididoviridae Herpesviridae Adenoviridae Papovaviridae Hepadnaviridae
ssDNA Sin envolvente
Parvoviridae
dsRNA Sin envolvente
Reoviridae Birnaviridae
ssRNA Con envolvente Con genoma de sentido positivo Sin etapa de DNA en la replicación Con etapa de DNA en la replicación Con genoma de sentido negativo Con genoma no segmentado Con genoma segmentado Sin envolvente
Togaviridae Flaviviridae Coronaviridae Virus de la hepatitis C Retroviridae Paramyxoviridae Rhabdoviridae Filoviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae Picornaviridae Caliciviridae
Abreviaturas usadas: ds = bicatenario; ss = monocatenario; con envolvente = que poseen una bicapa lipídica exterior derivada de la membrana de la célula hospedante; genoma de sentido positivo = para los virus de RNA, los genomas que están compuestos de secuencias de nucleótidos que se traducen directamente en los ribosomas, = para virus de DNA, genomas que están compuestos de secuencias de nucleótidos que son las mismas que las del mRNA; genoma de sentido negativo = genomas que están compuestos de secuencias de nucleótidos complementarias a la cadena de sentido positivo.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a virus de la gripe modificados por ingeniería genética que contienen deleciones y/o truncamientos del producto génico NS1. Los mutantes de NS1 de los virus de gripe A y B son particularmente preferidos. En una propuesta, se retienen porciones de la región amino terminal del producto génico NS1, mientras que se suprimen porciones de la región C-terminal del producto génico NS1. Las mutaciones específicas deseadas pueden obtenerse por ingeniería genética por medio de inserción, deleción o mutación de ácidos nucleicos en el codón apropiado. En particular, las proteínas NS1 truncadas tienen 1-60 aminoácidos, 1-70 aminoácidos, 1-90 aminoácidos (el aminoácido N-terminal es 1), y preferiblemente 90 aminoácidos; 1-100 aminoácidos, y preferiblemente 99 aminoácidos; 1-110 aminoácidos; 1-120 aminoácidos; o 1-130 aminoácidos, del producto génico NS1 de tipo natural.
La presente invención se refiere también a cualquier virus de la gripe modificado por ingeniería genética en el cual el producto génico NS1 ha sido modificado por truncamiento o modificación de la proteína NS1 mencionada en la presente memoria que confiere a los virus mutantes los siguientes fenotipos: la capacidad de los virus de crecer hasta altos títulos en sustratos no convencionales, tales como huevos de pollo de 6-7 días, o la capacidad de los virus de inducir una respuesta al interferón del hospedante. Para los virus de la gripe A, estos incluyen, aunque sin limitación: virus que tienen dichos truncamientos en NS1.
La presente invención incluye el uso de virus de la gripe A o B mutantes de origen natural que tienen el fenotipo atenuado, así como cepas de virus de la gripe modificadas por ingeniería genética para contener dichas mutaciones responsables del fenotipo atenuado. Los virus de la gripe A, incluyen, aunque sin limitación: virus que tienen una NS1 de 124 aminoácidos (Norton et al., 1987, Virology 156:204-213). Los virus de la gripe B, incluyen, aunque sin limitación: virus que tienen un mutante por truncamiento de NS1 que comprende 110 aminoácidos derivados del extremo N-terminal (B/201) (Norton et al., 1987, Virology 156:204-213) y virus que tienen un mutante por truncamiento de NS1 que comprenden 89 aminoácidos derivados del extremo N-terminal (B/AWBY-234) (Tobita et al., 1990, Virology 174:314-19). La presente memoria describe el uso de mutantes de origen natural análogos a NS1/38, NS1/80, NS1/124 (Egorov, et al., 1998, J. Virol. 72(8):6437-41), así como los mutantes de origen natural, A/Turkey/ORE/71, B/201 o B/AWBY-234.
Los virus de la gripe atenuados pueden ser modificados adicionalmente por ingeniería genética para expresar antígenos de otras cepas vacunales (por ejemplo, usando genética inversa o intercambio genético). Alternativamente, los virus de la gripe atenuados pueden ser modificados por ingeniería genética, usando genética inversa o intercambio genético con virus modificados por ingeniería genética, para expresar epítopos completamente extraños, por ejemplo, antígenos de otros patógenos infecciosos, o antígenos diana. Puesto que el segmento NS del RNA es el más corto entre los ocho RNA virales, es posible que el segmento NS del RNA tolere mayores inserciones de secuencias heterólogas que otros genes virales. Además, el segmento NS del RNA dirige la síntesis de ocho niveles de proteínas en las células infectadas, lo que sugiere que sería un segmento ideal para inserciones de antígenos extraños. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención, puede ser usado uno cualquiera de los ocho segmentos de los virus de la gripe para la inserción de secuencias heterólogas. Por ejemplo, cuando se desee la presentación de antígenos de superficie, se pueden usar los segmentos que codifican proteínas estructurales, por ejemplo, HA o NA.
5.2 Sistema de selección basado en restricción del hospedante
En el contexto de esta invención, se usan métodos de selección de virus que tienen el fenotipo deseado, es decir, virus que tienen poca o ninguna actividad antagonista del IFN, independientemente de si se han obtenido de variantes naturales, variantes espontáneas (es decir, variantes que evolucionan durante la propagación del virus), variantes naturales mutagenizadas, virus con intercambio genético y/o virus modificados por ingeniería genética. Dichos virus pueden ser mejor cribados en ensayos de crecimiento diferencial que comparan el crecimiento en sistemas hospedantes deficientes en IFN frente a sistemas hospedantes competentes en IFN. Se seleccionan los virus que demuestran mejor crecimiento en sistemas deficientes en IFN frente a sistemas competentes en IFN; preferiblemente se seleccionan los virus que crecen hasta alcanzar títulos de al menos un log mayor en sistemas deficientes en IFN en comparación con un sistema competente en IFN.
[0046] Alternativamente, los virus puede ser cribados usando sistemas de ensayo con IFN por ejemplo, sistemas de ensayo basados en la transcripción en los cuales la expresión de un gen indicador es controlada por un promotor sensible al IFN. Puede medirse la expresión del gen indicador en células infectadas frente a no infectadas para identificar virus que inducen eficientemente una respuesta al IFN, pero que no son capaces de antagonizar la respuesta al IFN. En una realización preferida, sin embargo, se usan los ensayos de crecimiento diferencial para seleccionar virus que tienen el fenotipo deseado, puesto que el sistema hospedante usado (competente en IFN frente a deficiente en IFN) aplica la presión de selección apropiada.
Por ejemplo, se puede comparar el crecimiento de virus (medido por su título) en una variedad de células, líneas celulares o sistemas de modelos animales que expresan IFN y los componentes de la respuesta al IFN, frente a células, líneas celulares o sistemas de modelos animales deficientes en IFN o componentes de la respuesta al IFN. Para este fin, se puede comparar el crecimiento de virus en líneas celulares como las células VERO (que son deficientes en IFN) frente al crecimiento en células MDCK (que son competentes en IFN). Alternativamente, las líneas celulares deficientes en IFN pueden ser derivadas y establecidas de animales criados o modificados por ingeniería genética para que sean deficientes en el sistema del IFN (por ejemplo, ratones mutantes STAT1 -/-.). Puede medirse el crecimiento del virus en dichas líneas celulares, en comparación con el crecimiento en células competentes en IFN derivadas, por ejemplo, de animales de tipo natural (por ejemplo, ratones de tipo natural). Incluso en otra realización, las líneas celulares que son competentes en IFN y que se sabe soportan el crecimiento del virus de tipo natural pueden modificarse por ingeniería genética para que sean deficientes en IFN (por ejemplo, inactivando los genes STAT1, IRF3, PKR, etc.). Se pueden usar métodos que son bien conocidos en la técnica para la propagación de virus en líneas celulares (véanse, por ejemplo, los ejemplos de trabajo que se facilitan más adelante). Se puede comparar el crecimiento del virus en la línea celular competente en IFN estándar frente al crecimiento del virus en la línea celular modificada por ingeniería genética deficiente en IFN.
También se pueden usar sistemas animales. Por ejemplo, para el virus de la gripe, se puede comparar el crecimiento en huevos embrionados de pocos días deficientes en IFN, por ejemplo, aproximadamente de 6 a aproximadamente 8 días, con el crecimiento en huevos competentes en IFN de más días, por ejemplo, de aproximadamente 10 a 12 días. Para este fin, se pueden usar métodos muy conocidos en la técnica para la infección y propagación en huevos (por ejemplo, véanse los ejemplos de trabajo que se facilitan más adelante). Alternativamente, puede compararse el crecimiento en ratones STAT1 -/- deficientes en IFN con el crecimiento en ratones de tipo natural competentes en IFN. Incluso en otra alternativa, se pueden comparar el crecimiento en huevos embrionados deficientes en IFN producidos, por ejemplo, por un ave de corral transgénica STAT1 -/- con el crecimiento en huevos competentes en IFN producidos por un ave de corral de tipo natural.
Para fines de cribado, sin embargo, se pueden usar sistemas transitorios deficientes en IFN en lugar de sistemas manipulados por ingeniería genética. Por ejemplo, el sistema hospedante se puede tratar con compuestos que inhiban la producción de IFN y/o componentes de la respuesta al IFN (por ejemplo, fármacos, anticuerpos contra IFN, anticuerpos contra el receptor de IFN, inhibidores de PKR, moléculas antisentido y ribozimas, etc.). El crecimiento de virus se puede comparar en controles no tratados competentes en IFN frente a sistemas tratados deficientes en IFN. Por ejemplo, huevos de más días que son competentes en IFN pueden ser tratados previamente con dichos fármacos antes de la infección con el virus que se ha de cribar. El crecimiento se compara con el conseguido en los huevos de control no tratado de los mismos días.
Los métodos de cribado usados en la presente invención proporcionan un cribado sencillo y fácil para identificar virus mutantes con actividad antagonista de IFN suprimida por la incapacidad del virus mutante de crecer en ambientes sensibles al IFN, comparada con la capacidad del virus mutante de crecer en ambientes deficientes en IFN. Los métodos de cribado de la invención se pueden usar también para identificar virus mutantes con actividad antagonista de IFN alterada, pero no suprimida, midiendo la capacidad del virus mutante de crecer tanto en ambientes sensibles al IFN, por ejemplo, huevos embrionados de 10 días o células MDCK como en ambientes deficientes en IFN, por ejemplo, huevos embrionados de 6 a 7 días o células Vero. Por ejemplo, los virus de la gripe que muestran al menos un log menor del título en huevos de 10 días frente a huevos de 6-7 días se considerarán deteriorados en su capacidad de inhibir la respuesta al IFN. En otro ejemplo, los virus de la gripe que muestran al menos un log menor del título en huevos de 12 días (que provocan una alta respuesta al IFN) frente a huevos de 10 días (que provocan una respuesta moderada al IFN) se consideran parcialmente deteriorados en su capacidad de antagonizar la respuesta al IFN, y se consideran candidatos atractivos para vacunas.
Los métodos de selección de la invención abarcan también la identificación de los virus mutantes que inducen respuestas al IFN.
De acuerdo con los métodos de selección de la invención, la inducción de respuestas al IFN puede ser medida analizando los niveles de expresión de IFN o la expresión de genes diana o genes indicadores inducida por IFN después de la infección con el virus mutante o la activación de transactivadores implicados en la expresión del IFN y/o la respuesta al IFN.
Incluso en otra realización de los sistemas de selección de la invención, la inducción de las respuestas al IFN se puede determinar midiendo el estado fosforilado de los componentes de la vía del IFN después de la infección con el virus mutante de ensayo, por ejemplo, IRF-3, que se fosforila en respuesta al RNA bicatenario. En respuesta al IFN de tipo I, Jak1 quinasa y TyK2 quinasa, subunidades del receptor de IFN, STAT1 y STAT2 son rápidamente fosforiladas en tirosinas. Por tanto, para determinar si el virus mutante induce respuestas a IFN, células tales como las células 293, se infectan con el virus mutante de ensayo y después de la infección, se lisan las células. Los componentes de la vía del IFN, tales como Jak1 quinasa o TyK2 quinasa, son inmunoprecipitados de los lisados de las células infectadas, usando sueros policlonales o anticuerpos específicos, y se determina el estado fosforilado de las tirosinas de la quinasa por ensayos de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-fosfotirosina (por ejemplo, véase Krishnan et al., 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305). Un aumento del estado fosforilado de cualquiera de los componentes de la vía del IFN después de la infección con el virus mutante indicaría inducción de las respuestas al IFN por el virus mutante.
Incluso en otra realización, los sistemas de selección de la invención comprenden medir la capacidad de unión de secuencias de DNA específicas o la translocación de factores de transcripción inducida en respuesta la infección viral, por ejemplo, IRF3, STAT1, STAT2, etc. En particular, STAT1 y STAT2 son fosforiladas y translocadas desde el citoplasma al núcleo en respuesta al IFN de tipo I. La capacidad de unir secuencias de DNA específicas o la translocación de factores de transcripción puede medirse por métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, ensayos de desplazamiento en gel por electromovilidad, tinción de células etc.
Incluso en otra realización de los sistemas de selección de la invención, la inducción de las respuestas al IFN se puede determinar midiendo la activación transcripcional dependiente de IFN después de infección con el virus mutante de ensayo. En esta realización, se puede analizar la expresión de genes que se sabe que son inducidos por IFN, por ejemplo, Mx, PKR, 2,5-oligoadenilato-sintetasa, complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de la clase I, etc., por métodos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, transferencias de Northern, transferencias de Western, PCR, etc.). Alternativamente, las células de ensayo, tales como células embrionarias de riñón humanas
o células de sarcoma osteogénico humano, se modifican por ingeniería genética para expresar transitoria o constitutivamente genes indicadores, tales como el gen indicador de luciferasa o el gen indicador de cloranfenicoltransferasa (CAT) bajo el control de un elemento de respuesta estimulado por interferón, tal como el promotor estimulado por IFN del gen ISG-54K (Bluyssen et al., 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402). Las células se infectan con el virus mutante de ensayo y el nivel de expresión del gen indicador se compara con el de las células no infectadas o células infectadas con el virus de tipo natural. Un aumento del nivel de expresión del gen indicador después de la infección con el virus de ensayo indicaría que el virus mutante de ensayo está induciendo una respuesta al IFN.
Incluso en otra realización, los sistemas de selección de la invención comprenden medir la inducción de IFN determinando si un extracto de la célula o huevo infectado con el virus mutante de ensayo es capaz de conferir actividad protectora contra la infección viral. Más específicamente, grupos de huevos de pollo embrionados de 10 días se infectan con el virus mutante de ensayo o el virus de tipo natural. Aproximadamente 15 a 20 horas después de la infección, se recoge el líquido alantoideo y se analiza su actividad de IFN determinando la dilución más alta con actividad protectora contra la infección por VSV en células de cultivo de tejidos, tales como células CEF.
5.3 Propagación de virus en sustratos de crecimiento deficiente en interferón
En el contexto de la invención también se usan métodos y sustratos deficientes en IFN para el crecimiento y aislamiento de virus mutantes de origen natural o modificados por ingeniería genética que tienen actividad antagonista de IFN alterada. Los sustratos deficientes en IFN que se pueden usar para soportar el crecimiento de los virus mutantes atenuados incluyen, aunque sin limitación: células de origen natural, líneas celulares, animales o huevos embrionados que son deficientes en IFN, por ejemplo, células Vero, huevos embrionados de pocos días; células recombinantes o líneas celulares que están modificadas por ingeniería genética para que sean deficientes en IFN, por ejemplo, líneas celulares deficientes en IFN derivadas de ratones con el gen STAT1 inactivado u otros animales transgénicos modificados similarmente por ingeniería genética; huevos embrionados obtenidos de aves deficientes en IFN, especialmente aves de corral (por ejemplo, pollos, patos, pavos) incluyendo bandadas que son criadas para que sean aves deficientes en IFN o transgénicas (por ejemplo, con el gen STAT1 inactivado). Alternativamente, el sistema hospedante, las células, las líneas celulares, los huevos o los animales pueden ser modificados por ingeniería genética para expresar transgenes que codifican inhibidores del sistema del IFN, por ejemplo, mutantes dominantes negativos, tales como STAT1 que carece del dominio de unión al DNA, RNA antisentido, ribozimas, inhibidores de la producción del IFN, inhibidores de la señalización del IFN, y/o inhibidores de genes antivirales inducidos por IFN. Debe reconocerse que los animales que se crían o modifican por ingeniería genética para que sean deficientes en IFN estarán algo inmunocomprometidos, y deben mantenerse en un ambiente controlado libre de enfermedad. Por tanto, deben tomarse medidas apropiadas (incluyendo el uso de antibióticos en la dieta) para limitar el riesgo de exposición a agentes infecciosos de animales transgénicos deficientes en IFN, tales como bandadas de gallinas, patas, pavas ponedoras, etc. Alternativamente, el sistema hospedante, por ejemplo, las células, las líneas celulares, los huevos o los animales pueden ser tratados con un compuesto que inhiba la producción del IFN y/o la vía del IFN por ejemplo, fármacos, anticuerpos, moléculas antisentido, moléculas de ribozima que se dirijan al gen STAT1, y/o genes antivirales inducidos por IFN.
De acuerdo con la presente invención, la expresión huevos embrionados de pollo inmaduros significa huevos que, naturalmente, de hasta menos de diez días, preferiblemente huevos de seis a nueve días; y huevos que artificialmente mimetizan huevos inmaduros de hasta menos de 10 días, como resultado de alteraciones en las condiciones del crecimiento, por ejemplo, cambios en las temperaturas de incubación; tratamiento con fármacos; o cualquier otra alteración que dé como resultado un huevo con un desarrollo retardado, tal que el sistema del IFN del huevo no esté completamente desarrollado en comparación con el de los huevos de 10 a 12 días.
5.3.1 Sustratos deficientes en IFN natural
La presente invención describe el crecimiento de virus mutantes de origen natural y modificados por ingeniería genética en sustratos no convencionales, tales como huevos embrionados inmaduros que todavía no han desarrollado un sistema del IFN. Los huevos embrionados inmaduros no se usan normalmente para el crecimiento de virus debido a su frágil condición y menor volumen alantoideo. La presente invención comprende hacer crecer virus mutantes en huevos embrionados de menos de 10 días; preferiblemente hacer crecer virus mutados en huevos embrionados de 8 días y más preferiblemente, en huevos de 6 a 8 días.
La presente invención describe también métodos de crecimiento y aislamiento de virus mutados que tienen actividad antagonista del IFN alterada en células y líneas celulares que naturalmente no tienen una vía del IFN o tienen una vía deficiente en IFN o tienen una deficiencia en el sistema del IFN, por ejemplo, bajos niveles de expresión del IFN en comparación con células de tipo natural. La presente invención describe métodos de hacer crecer virus mutados que tienen una actividad antagonista del IFN alterada en células Vero.
5.3.2 Sustratos deficientes en IFN modificados por ingeniería genética.
La presente invención describe métodos de crecimiento y aislamiento de virus mutados que tienen actividad antagonista del IFN alterada en un sustrato deficiente en IFN modificado por ingeniería genética. La presente invención describe aves transgénicas en las que está mutado un gen esencial para el sistema del IFN, por ejemplo, STAT1, que pondrían huevos deficientes en IFN. La presente invención describe además aves transgénicas que expresan factores de transcripción dominantes negativos, por ejemplo, STAT1 que carece del dominio de unión al DNA, ribozimas, RNA antisentido, inhibidores de la producción del IFN, inhibidores de la señalización del IFN e inhibidores de genes antivirales inducidos en respuesta al IFN. La ventaja de utilizar huevos de aves transgénicas deficientes en IFN es que se pueden usar huevos de 10 días convencionales para desarrollar el virus que son más estables y tienen un mayor volumen debido a su mayor tamaño. Las líneas celulares pueden ser modificadas por ingeniería genética para que sean deficientes en IFN. La presente invención describe líneas celulares en las que están mutados un gen esencial para la síntesis del IFN, la vía del IFN y/o uno o varios genes antivirales inducidos por IFN, por ejemplo, STAT1.
La invención proporciona líneas celulares o animales recombinantes, en particular aves, en los que está interrumpido uno o más genes esenciales para la vía del IFN, por ejemplo, receptor de interferón, STAT1, etc., es decir, es un gen "inactivado"; el animal recombinante puede ser cualquier animal, pero en una realización preferida es un ave, por ejemplo, pollo, pavo, gallina, pato, etc., (véanse, por ejemplo, Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12:415; Perry, et al., 1993, Transgenic Res. 2:125; Stern, C.D., 1996, Curr .Top. Microbiol. Immunol. 212:195-206; y Shuman, 1991, Experientia 47:897 para revisiones de la producción de productos transgénicos aviares). Dicho animal o línea celular puede ser generado por cualquier método conocido en la técnica para interrumpir un gen en el cromosoma del animal o de la célula. Dichas técnicas incluyen, aunque sin limitación, microinyección pronuclear (Hoppe & Wagner, 1989, Patente de EE.UU. No. 4.873.191); transferencia de genes mediada por retrovirus a líneas germinales (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); direccionamiento de genes en células madre embrionarias (Thompson et al., 1989, Cell 56:313); electropermeabilización de embriones (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803); y transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717); etc. Para una revisión de dichas técnicas, véase Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171.
En particular, un animal con STAT1 inactivado se puede producir promoviendo la recombinación homóloga entre un gen STAT1 en su cromosoma y un gen STAT1 exógeno que ha sido biológicamente inactivado (preferiblemente por inserción de una secuencia heteróloga, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Métodos de recombinación homóloga para interrupción de genes en el genoma de ratón están descritos, por ejemplo, por Capecchi (1989, Science 244:1288) y Mansour et al. (1988, Nature 336:348).
En resumen, se aísla todo o una porción de un clon genómico STAT1 del DNA genómico de la misma especie que la célula o el animal inactivado. El clon genómico STAT1 se puede aislar por cualquier método conocido en la técnica para el aislamiento de clones genómicos (por ejemplo, sondando una genoteca de DNA genómico con una sonda derivada de una secuencia de STAT1, tales como las secuencias proporcionadas por Meraz et al., 1996, Cell 84:431; Durbin et al. 1996, Cell 84:443 y las referencias allí citadas). Una vez aislado el clon genómico, se introduce todo o una porción del clon en un vector recombinante. Preferiblemente, la porción del clon introducida en el vector contiene al menos una porción de un exón del gen STAT1, es decir, contiene una secuencia que codifica la proteína STAT1. A continuación, se introduce en el exón del gen STAT1 una secuencia no homóloga a la secuencia de STAT1, preferiblemente un marcador seleccionable positivo, tal como un gen que codifica un gen de resistencias a antibióticos. El marcador seleccionable está de preferencia unido operativamente a un promotor, más preferiblemente a un promotor constitutivo. La secuencia no homóloga se introduce en cualquier lugar de la secuencia codificadora de STAT1 interrumpiendo la actividad de STAT1, por ejemplo, en una posición en la que se ha demostrado que mutaciones puntuales u otras mutaciones inactivan la función de la proteína STAT1. Por ejemplo, aunque sin limitación, la secuencia no homóloga se puede insertar en la secuencia codificadora de la porción de la proteína STAT1 que contiene todo o una porción del dominio de quinasa (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica al menos 50, 100, 150, 200 o 250 aminoácidos del dominio de quinasa).
El marcador seleccionable positivo es preferiblemente un gen de resistencia a la neomicina (gen neo) o un gen de resistencia a la higromicina (gen hygro). El promotor puede ser cualquier promotor conocido en la técnica; por ejemplo, el promotor puede ser promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK) (Adra et al., 1987, Gene 60:65-74), el promotor Pol II (Soriano et al., 1991, Cell 64:693-701) o el promotor MC1, que es un promotor sintético diseñado para su expresión en células madre derivadas de embriones (Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51:503-512). El uso de un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a antibióticos, permite la selección de células que tienen incorporado el vector de dirección (por ejemplo, la expresión del producto del gen neo confiere resistencia al G418 y la expresión del producto del gen hygro confiere resistencia a la higromicina).
Un marcador seleccionable negativo para una etapa de contraselección para recombinación homóloga, en oposición a no homóloga, del vector se inserta fuera del inserto del clon genómico STAT1. Por ejemplo, dicho marcador seleccionable negativo es el gen de timidina quinasa de HSV (HSV-tk), cuya expresión hace que las células sean sensibles al ganciclovir. El marcador seleccionable negativo está preferiblemente bajo el control de un promotor, tal como, aunque sin limitación, el promotor PGK, el promotor Pol II o el promotor MC1.
Cuando tiene lugar una recombinación homóloga, las porciones del vector que son homólogas al gen STAT1, así como el inserto no homólogo dentro de las secuencias del gen STAT1, se incorporan en el gen STAT1 en el cromosoma y se pierde el resto del vector. Por consiguiente, puesto que el marcador seleccionable negativo está fuera de la región de homología con el gen STAT1, las células en las que ha tenido lugar la recombinación homóloga (o su progenie), no contendrán el marcador seleccionable negativo. Por ejemplo, si el marcador seleccionable negativo es el gen HSV-tk, las células en las que ha tenido lugar la recombinación homóloga no expresaran la timidina quinasa y sobrevivirán expuestas al ganciclovir. Este procedimiento permite la selección de células en las que ha tenido lugar la recombinación homóloga, en comparación con la recombinación no homóloga en la que es probable que el marcador seleccionable negativo se incorpore también al genoma junto con las secuencias de STAT1 y el marcador seleccionable positivo. Por consiguiente, las células en las que ha tenido lugar una recombinación no homóloga expresarían más probablemente la timidina quinasa y serían sensibles al ganciclovir.
Una vez preparado el vector de dirección, se linealiza con una enzima de restricción para la que existe un sitio único en el vector de dirección y el vector linealizado se introduce en las células madre (ES) no humanas derivadas de embriones (Gossler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069) por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por electropermeabilización. Si el vector de dirección incluye un marcador seleccionable positivo y un marcador contraseleccionable negativo, las células ES en las que ha tenido lugar la recombinación homóloga se pueden seleccionar por incubación en medios selectivos. Por ejemplo, si los marcadores seleccionables son el gen neo y el gen HSV-tk, las células se exponen a G418 (por ejemplo, aproximadamente 300 μg/ml) y a ganciclovir (por ejemplo, aproximadamente 2 μM).
Se puede utilizar cualquier técnica conocida para la genotipificación, por ejemplo, aunque sin limitación, análisis por transferencia de Southern o reacción en cadena de la polimerasa, para confirmar que las secuencias de STAT1 interrumpidas se han recombinado homólogamente en el gen STAT1 en el genoma de las células ES. Debido a que son conocidos el mapa de restricción del clon genómico STAT1 y la secuencia codificadora de STAT1 (véanse, Meraz et al., 1996, Cell 84:431; Durbin et al., 1996, Cell 84: 443-450 y todas las referencias allí citadas), se puede determinar el tamaño de un fragmento de restricción particular o de un producto de amplificación por PCR generado a partir de DNA tanto de los alelos interrumpidos como no interrumpidos. Por tanto, valorando un fragmento de restricción o un producto de PCR, se puede determinar la diferencia de tamaño entre el gen STAT1 interrumpido y no interrumpido, siempre que se haya realizado una recombinación homóloga para interrumpir el gen STAT1.
Las células ES con el locus STAT1 se pueden introducir a continuación en blastocistos por microinyección y a continuación los blastocistos se pueden implantar en los úteros de ratones seudopreñadas usando técnicas habituales. El animal que se desarrolla a partir de los blastocistos implantados es quimérico en cuanto a los alelos interrumpidos. Los machos quiméricos se pueden cruzar con hembras y este cruce se puede diseñar de forma que la trasmisión de la línea germinal del alelo esté relacionada con la transmisión de un cierto color de pelaje. La transmisión de la línea germinal del alelo se puede confirmar por transferencia de Southern o análisis por PCR, como se ha descrito antes, del DNA genómico aislado de muestras de tejidos.
5.3.3 Sustratos deficientes en IFN transitorios
Las células, líneas celulares, animales o huevos se pueden tratar con compuestos que inhiban el sistema del IFN. De acuerdo con la presente invención, se pueden usar compuestos que inhiban la síntesis del IFN, o la actividad o la expresión de los componentes del sistema del IFN, para tratar previamente hospedantes, por ejemplo, compuestos que inhiban la síntesis del IFN, la actividad del IFN, el receptor del IFN, otras dianas en la vía de transducción de señales del IFN o que inhiban la actividad de los genes antivirales inducidos por IFN. Ejemplos de compuestos que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, moléculas de ácidos nucleicos, anticuerpos, péptidos, antagonistas del receptor del IFN, inhibidores de la vía de STAT1, inhibidores de PKR, etc. De acuerdo con la presente invención, las moléculas de ácidos nucleicos incluyen moléculas antisentido, ribozimas y moléculas de triple hélice que se dirigen a los genes que codifican componentes esenciales del sistema del IFN, por ejemplo, STAT1. Las moléculas de ácidos nucleicos abarcan también nucleótidos que codifican mutantes dominantes negativos de componentes del sistema del IFN; por ejemplo, antes de la infección con el mutante viral, las células se pueden transfectar con un DNA que codifica un mutante truncado incompetente para la señalización del receptor del IFN.
Los mutantes dominantes negativos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención para inhibir la vía del IFN incluyen versiones deficientes en quinasa de Jak1, TyK2 o factores de transcripción que carecen de los dominios de unión al DNA STAT1 y STAT2 (véase, por ejemplo, Krishnan et al., 1997, Eur. J. Biochem. 247:298305).
5.4 Formulaciones de vacunas
La invención abarca el uso de los virus descritos en la presente memoria o el uso de formulaciones de vacunas que comprenden los virus atenuados de la gripe que tienen una capacidad deteriorada para antagonizar la respuesta al IFN celular, y un excipiente adecuado. El virus usado en la formulación para vacunas se puede seleccionar entre mutantes o variantes de origen natural, virus mutagenizados o virus modificados por ingeniería genética. También se pueden generar cepas atenuadas de virus con RNA segmentado por medio de técnicas de intercambio genético o utilizando una combinación de métodos de genética inversa y de intercambio genético. Las variantes de origen natural incluyen virus aislados de la naturaleza así como variantes que surgen espontáneamente generadas durante la propagación del virus, que tienen una capacidad deteriorada para antagonizar la respuesta al IFN celular. El virus atenuado se puede usar él mismo como principio activo en las formulaciones de vacunas. Alternativamente, el virus atenuado se puede usar como el vector o la "cadena principal" de las vacunas producidas de modo recombinante. Para este fin, se pueden aplicar técnicas recombinantes, tales como genética inversa (o, para virus segmentados, combinaciones de las técnicas de genética inversa y de intercambio genético) para mutaciones realizadas por ingeniería genética o la introducción de antígenos extraños en el virus atenuado usado en la formulación para vacunas. De este modo, se pueden diseñar vacunas para inmunización contra las variantes de cepas o alternativamente contra agentes infecciosos o antígenos patógenos completamente diferentes.
Virtualmente, se puede construir cualquier secuencia génica heteróloga en los virus de la invención para su uso en vacunas. Preferiblemente, pueden ser expresados por los virus, o parte de ellos, epítopos que induzcan una respuesta inmunitaria protectora para cualquiera de una variedad de patógenos o antígenos que se unen a anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, secuencias génicas heterólogas que se pueden construir en los virus de la invención para su uso en vacunas incluyen, aunque sin limitación, epítopos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tal como gp120; antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg); las glicoproteínas del herpesvirus (por ejemplo, gD, gE); VP1 de poliovirus; determinantes antigénicos de patógenos no virales, tales como bacterias y parásitos, por citar sólo algunos. En otra realización, pueden ser expresados todos los genes de inmunoglobulinas o parte de ellos. Por ejemplo, pueden ser construidas, en los virus de la invención, regiones variables de inmunoglobulinas antiidiotípicas que imitan dichos epítopos. En la presente memoria se describe que pueden ser expresados antígenos asociados a tumores.
Se puede formular bien una vacuna viral recombinante viva o una vacuna viral recombinante inactivada. Se prefiere una vacuna viva debido a que la multiplicación en el hospedante conduce a un estímulo prolongado de similar clase y magnitud que la existente en las infecciones naturales y, por consiguiente, confiere una inmunidad sustancial duradera. La producción de dichas formulaciones de vacunas virales recombinantes vivas se puede realizar usando métodos convencionales que impliquen la propagación del virus en un cultivo celular o en la membrana alantoidea del embrión de pollo, seguido de purificación.
Las formulaciones de vacunas pueden incluir virus de la gripe modificados por ingeniería genética que tienen mutaciones en el gen NS1 o análogos incluyendo, aunque sin limitación, los virus mutantes de la gripe NS1 truncados descritos en los ejemplos de trabajo incluidos más adelante. También se pueden formular usando virus variantes naturales, tales como A/turkey/Ore/71 natural, variante de la gripe A o B/201 y B/AWBY-234, que son variantes naturales del virus de la gripe B. Cuando se formula como una vacuna viral viva, se debe usar un intervalo entre aproximadamente 104 UFP y aproximadamente 5×106 UFP por dosis.
Se pueden utilizar muchos métodos para administrar las formulaciones de vacunas antes descritas, incluyendo, aunque sin limitación, vías intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. Puede ser preferible administrar la formulación de vacuna viral por la vía de la infección natural del patógeno para el que se diseña la vacuna o por la vía de la infección natural del virus atenuado parental. Cuando se usa una preparación de vacuna del virus de la gripe vivo, puede ser preferible administrar la formulación por la vía de infección natural del virus de la gripe. Se puede usar ventajosamente la capacidad del virus de la gripe para inducir una enérgica respuesta inmunitaria celular y secretora. Por ejemplo, la infección de las vías respiratorias por virus de la gripe puede inducir una fuerte respuesta inmunitaria secretora, por ejemplo en el sistema urogenital, con protección simultánea contra un agente particular causante de la enfermedad.
Podría administrarse de una vez una vacuna para uso de la presente invención, que comprenda 104 -5x106 UFP de virus mutantes con la actividad antagonista del IFN alterada. Alternativamente, podría administrarse dos o tres veces, con un intervalo de 2 a 6 meses entre dosis, una vacuna de la presente invención, que comprenda 104 - 5x106 UFP de virus mutantes con la actividad antagonista del IFN alterada. Alternativamente, podría administrarse con la frecuencia necesaria a un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un ser humano, una vacuna de la presente invención, que comprenda 104 - 5×106 UFP de virus mutantes con la actividad antagonista del IFN alterada.
5.5 Composiciones farmacéuticas
La presente invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden virus mutantes con actividad antagonista del IFN alterada para usarse como agentes anti-virales o como agentes contra las enfermedades infecciosas sensibles al IFN. Las composiciones farmacéuticas tienen utilidad como agente profiláctico anti-viral y pueden administrarse a un individuo con riesgo de ser infectado por un virus o de estar expuesto a él. Por ejemplo, en el caso de un niño que llega a su casa desde la escuela donde ha estado expuesto a varios compañeros con gripe, los padre administrarían la composición farmacéutica anti-viral de la invención a ellos mismos, al niño y a otros miembros de la familia, para evitar la infección viral y las enfermedades subsiguientes. También pueden ser tratadas las personas que viajan a partes del mundo donde son prevalentes ciertas enfermedades infecciosas (por ejemplo, virus de la hepatitis A, malaria, etc.).
Alternativamente, la memoria describe también composiciones farmacéuticas que se utilizan para tratar tumores o evitar la formación de tumores, por ejemplo, en pacientes que tienen cáncer o los que tienen alto riesgo de desarrollar neoplasmas o cánceres. Por ejemplo, se pueden tratar pacientes con cáncer para evitar otras carcinogénesis. Alternativamente, se pueden tratar sujetos que están expuestos a carcinógenos o se espera que estén expuestos a ellos; se pueden tratar individuos implicados en la limpieza ambiental que pueden estar expuestos a contaminantes (por ejemplo, amianto). Alternativamente, se pueden tratar individuos que están expuestos a radiación antes y después de su exposición (por ejemplo, pacientes expuestos a alta dosis de radiación o que deben tomar fármacos carcinógenos).
Los inventores descubrieron también que un mutante del virus de la gripe atenuado que contenía una deleción en su gen antagonista del IFN es capaz de reducir la formación de tumores en ratones. Las propiedades antitumorales de la invención pueden estar relacionadas al menos parcialmente con su capacidad para inducir IFN y respuestas al IFN. Alternativamente, las propiedades antitumorales de los virus atenuados de la invención pueden estar relacionadas con su capacidad para crecer específicamente en las células tumorales y eliminarlas, muchas de las cuales se sabe que tienen deficiencias en el sistema del IFN.
La presente invención abarca además los virus mutantes con un fenotipo antagonista del IFN alterado que son dirigidos a órganos, tejidos y/o células específicos en el organismo con el fin de inducir localmente efectos terapéuticos
o profilácticos. Una ventaja de dicha propuesta es que los virus inductores del IFN de la invención son dirigidos a sitios específicos, para inducir IFN de manera específica del sitio para un efecto terapéutico en lugar de inducir sistémicamente IFN lo que puede tener efectos tóxicos.
Los virus mutantes inductores del IFN de la invención pueden ser modificados por ingeniería genética usando los métodos descritos en la presente memoria para expresar proteínas o péptidos que dirigirán los virus a un sitio particular. En la presente memoria se describe que los virus inductores del IFN serían dirigidos a sitios de tumores. En ese caso los virus mutantes pueden ser modificados por ingeniería genética para expresar el sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo que reconoce el antígeno específico del tumor, dirigiendo así al tumor el virus inductor del IFN. En la presente memoria también se describe que cuando el tumor diana expresa un receptor de hormonas, tales como los tumores de mama u ovarios que expresan receptores de estrógenos, el virus inductor del IFN puede ser modificado por ingeniería genética para expresar la hormona apropiada. En la presente memoria se describe además que cuando el tumor diana expresa un receptor de un factor de crecimiento, por ejemplo, VEGF, EGF o PDGF, el virus inductor del IFN se puede modificar por ingeniería genética para expresar el factor de crecimiento apropiado o sus porciones. Por consiguiente, de acuerdo con la invención, los virus inductores del IFN se pueden modificar por ingeniería genética para expresar cualquier producto génico diana, incluyendo péptidos, proteínas, tales como enzimas, hormonas, factores del crecimiento, antígenos o anticuerpos, que actuarán para dirigir el virus hasta un sitio que necesite actividad anti-viral, antibacteriana o anti-microbiana.
Los métodos de administración incluyen, aunque sin limitación: las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de un bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa bucal, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, en una realización preferida puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en los pulmones por cualquier vía adecuada. También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, utilizando un inhalador o nebulizador, y realizando la formulación con un agente aerosolizante.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente a la zona que necesita el tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo, aunque sin limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para heridas después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. En la presente memoria se describe que la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio antiguo) de un tumor maligno o tejido neoplásico o pre-neoplásico.
Incluso en otra realización, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede utilizar una bomba (véanse, Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos (véanse, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véanse también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Incluso en otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca de la diana de la composición, es decir, el pulmón, requiriendo por tanto sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada fueron revisados por Langer (1990, Science 249:1527-1533).
Las composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del virus atenuado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o recogido en la Farmacopea de EE.UU. u otras farmacopeas generalmente reconocidas para uso en animales y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente con el que se administra la composición farmacéutica. También se pueden emplear como vehículos líquidos soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares. Estas composiciones se pueden formular como un supositorio. La formulación oral puede incluir vehículos estándares, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son los descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por
E.W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo de manera que se obtenga la forma de administración apropiada al paciente. La formulación debe adaptarse a la forma de administración.
La cantidad de la composición farmacéutica de la invención que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o estado particular dependerá de la naturaleza del trastorno o estado y puede ser determinada por técnicas clínicas estándares. Además, se pueden emplear valoraciones in vitro para ayudar a identificar los intervalos óptimos de dosificación. La dosis precisa que se ha de emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para administración son generalmente alrededor de 104 - 5x106 UFP y se pueden administrar una vez o múltiples veces con intervalos tan frecuentes como sea necesario. Las composiciones farmacéuticas para uso de la presente invención comprenden 104 - 5x106 UFP de virus mutantes con la actividad antagonista del IFN alterada, y se pueden administrar intranasalmente, intratraquealmente, intramuscularmente o subcutáneamente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar de las curvas dosisrespuesta obtenidas de sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales.
6. Ejemplo: generación y caracterización de los mutantes por truncamiento de NS1 del virus de la gripe A 6.1 Materiales y métodos
El virus de la gripe A/PR/8/34 (PR8) se propagó en huevos de pollo embrionados de 10 días a 37ºC. El virus de la gripe A 25A-1, un virus con intercambio genético que contiene el segmento NS de la cepa adaptada en frío A/Leningrad/134/47/57 y los genes restantes del virus PR8 (Egorov et al., 1994, Vopr. Virusol. 39:201-205; Shaw et al., 1996, en Options of the control of influenza III, eds. Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) pp. 433-436) se hizo crecer en células Vero a 34ºC. El virus 25A-1 es sensible a la temperatura en células de mamífero y se utilizó como virus auxiliar para la recuperación del virus transfectante NS1/99. Para el crecimiento del virus de la gripe se usaron células Vero y células MDCK mantenidas en medio esencial mínimo (MEM) que contenían 1 μg/ml de tripsina (Difco Laboratories, Detroid, Michigan). Se usaron también las células Vero para selección, purificación en placas y titulación del virus NS1/99. Las células MDCK se mantuvieron en DMEM (medio esencial mínimo de Dulbecco) que contenía 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor. Las células Vero se desarrollaron en medio AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
El plásmido pT3NS1/99, que contiene una forma truncada del C-terminal de 99 aminoácidos de NS1, se formó como sigue. En primer lugar, pPUC19-T3/NS PR8, que contenía el gen NS completo del virus PR8 flanqueado por el promotor de RNA polimerasa de T3 y el sitio de restricción BpuAI, se amplificó por PCR inversa (Ochman et al., 1988, Genetics 120:621-623) usando los cebadores apropiados. El cDNA obtenido que contenía por consiguiente el gen NS1 truncado se fosforiló, se trató con el fragmento Klenow, se autoligó y se propagó en la cepa TG1 de E. coli. La construcción obtenida después de purificación se denominó pT3NS1/99 y se verificó por secuenciación. Los plásmidos para expresión de las proteínas NP, PB1, PB2 y PA del virus PR8 (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2 y pHMG-PA) habían sido descritos anteriormente (Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70:4188-4192). pPOLI-NS-RB se formó sustituyendo el marco de lectura abierto CAT de pPOLI-CAT-RT (Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70:4188-4192) dentro del producto obtenido por RT-PCR derivado de la región codificadora del gen NS del virus de la gripe A/WSN/33 (WSN). Este plásmido expresa el segmento de RNA viral específico de NS del virus WSN bajo el control de un promotor truncado de polimerasa I humana.
La generación del virus NS1/99 se realizó por transfección de ribonucleoproteínas (RNP) (Luytjes et al., 1989, Cell 59:1107-1113). Las RNP se formaron por transcripción de RNA polimerasa de T3 desde pT3NS1/99 linealizado con BpuAI en presencia de nucleoproteína y polimerasa purificadas del virus de la gripe 25A-1 (Enami, et al., 1991, J. Virol. 65:2711-2713). Los complejos de RNP se transfectaron en células Vero que habían sido infectadas previamente con el virus 25A-1. Las células transfectadas se incubaron durante 18 horas a 37°C y el líquido sobrenadante se sometió a dos pases en células Vero a 40ºC y se purificó en placa tres veces en células Vero cubiertas con medios de revestimiento de agar-agar a 37°C. El virus NS1/99 aislado se analizó por RT-PCR usando cebadores específicos. El virus transfectante de tipo natural se generó como sigue: células Vero en cápsulas de 35 mm se transfectaron con plásmidos pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA y pPOLI-NS-RB, como había sido descrito anteriormente (Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70:4188-4192). Dos días después de la transfección, las células se infectaron con 5 x 104 UFP del virus delNS1 y se incubaron dos días más a 37°C. El líquido sobrenadante celular se sometió a un pase en células MDCK y a dos pases en huevos de pollo embrionados. Los virus transfectantes se clonaron por dilución limitante en huevos. El RNA genómico del virus transfectante NS1/99 purificado se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida, como había sido descrito anteriormente (Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251). La expresión de una proteína NS1 truncada por el virus NS1/99 se verificó inmunoprecipitando extractos de células infectadas marcadas usando un antisuero policlonal de conejo contra NS1.
Las cavidades alantoideas de huevos de pollo embrionados de 6, 10 y 14 días se inocularon con aproximadamente 103 UFP de virus PR8, NS1/99 o delNS1 (en los que se había suprimido el gen NS1 completo), se incubaron a 37°C durante dos días y los virus presentes en el líquido alantoideo se titularon mediante valoración por hemaglutinación (HA).
Grupos de 5 ratones BALB/c (Taconic Farms) se inocularon intranasalmente con 5 x 106 UFP, 1,5 x 105 UFP o 5 x 103 UFP de virus A/PR/8/34 (PR8) o NS1/99 de tipo natural. Las inoculaciones se realizaron con anestesia usando 50 μl de MEM que contenía el número apropiado de unidades formadoras de placas del virus apropiado. Se vigilaron diariamente los animales que se sacrificaron cuando se observaron que agonizaban. En un experimento subsiguiente, a todos los ratones supervivientes se les inoculó, cuatro semanas más tarde, una dosis de 100 DL50 de virus PR8 de tipo natural. Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las directrices del NIH sobre el cuidado y uso de los animales de laboratorio.
6.2 Resultados: atenuación del virus de la gripe A por deleciones en NS1
Los inventores han mostrado anteriormente que un virus de la gripe A en el que se suprimió el gen NS1 (virus delNS1) es capaz de crecer hasta títulos de aproximadamente 107 UFP/ml en células deficientes en la producción de interferón (IFN) de tipo I, tal como células Vero. Sin embargo, en este virus disminuyó su capacidad para replicarse y provocar enfermedades en ratones (Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252:324). Al contrario, el virus delNS1 podía crecer y provocar la muerte a ratones STAT1 -/-. Estos resultados demostraron que la proteína NS1 del virus de la gripe A es un factor de virulencia implicado en la inhibición de las respuestas antivirales del hospedante mediadas por IFN de tipo I. Se realizaron los siguientes experimentos para determinar si se podría generar virus de la gripe con características de virulencia intermedias entre el virus de tipo natural y el virus delNS1 suprimiendo porciones del gen NS1 y si alguno de estos virus podría tener características óptimas para ser utilizado como vacunas atenuadas vivas contra los virus de la gripe, es decir, estabilidad y un equilibrio apropiado entre atenuación, poder inmunógeno y crecimiento en sustratos adecuados para la preparación de vacunas, tales como huevos de pollo embrionados.
Con el fin de analizar esta hipótesis, se generó un virus de la gripe A/PR/8/34 (PR8) en el que se había modificado el gen NS1 con el fin de dirigir la expresión de una proteína NS1 truncada que sólo contuviera 99 aminoácidos en el amino terminal en común con los 230 aminoácidos de la proteína NS1 de tipo natural. Este virus (NS1-99) se obtuvo por transfección de RNP de un gen NS modificado por ingeniería genética de modo artificial usando el virus auxiliar 25A-1, como había sido descrito anteriormente (García-Sastre et al., 1998, Virology 252:324). El análisis de la expresión de NS1 en células infectadas por virus reveló la naturaleza truncada de la proteína NS1 del virus NS1-99.
Se analizó la capacidad de los virus delNS1, NS1-99 y PR8 de tipo natural para crecer en huevos de pollo embrionados de diferentes días. La justificación de este experimento procede de que la capacidad de los huevos embrionados para sintetizar y responder al IFN de tipo I bajo un estímulos apropiado depende de la edad. En efecto, tanto la inducibilidad como la sensibilidad al IFN comienzan a una edad de aproximadamente 10 días y a continuación aumentan exponencialmente con la edad (Sekellick et al., 1990, In Vitro Cell. Dev. Biol. 26:997; Sekellick & Marcus, 1985 J. Interferon Res. 5:657). Por consiguiente, el uso de huevos de diferentes edades representa un sistema único para analizar la capacidad de diferentes virus de inhibir respuestas al IFN. Se inocularon huevos de 6, 10 y 14 días con aproximadamente 103 UFP de virus PR8, NS1-99 o delNS1, se incubaron a 37°C durante 2 días y los virus presentes en el líquido alantoideo se titularon mediante valoración por hemaglutinación (HA). Como se muestra en la Tabla 3, mientras el virus de tipo natural creció hasta títulos de HA similares en huevos embrionados de 6, 10 y 14 días, delNS1 sólo se replicó hasta un título de HA detectable en huevos de 6 días. Al contrario, el virus NS1-99 mostró un comportamiento intermedio entre los virus delNS1 y de tipo natural y pudo desarrollarse hasta títulos de HA similares a los del virus de tipo natural en huevos de 10 días pero no en huevos de 14 días.
Tabla 3: Replicación del virus en huevos de pollo embrionados.
Título de hemaglutinación1 Virus Edad de los huevos: 6 días 10 días 14 días
PR8 WT2 2.048 4.096 1.071 NS1/99 N.D.3 2.048 <2 delNS1 64 <2 <2
1 Los títulos representan la mayor dilución con actividad hemaglutinante. 2 Virus de la gripe A/PR/8/34 de tipo natural. 3 No determinado.
continuación se determinaron en ratones las características de atenuación del virus NS1-99. Con este fin, se infectaron intranasalmente grupos de 5 ratones BALB/c con 5 x 106 UFP, 1,5 x 105 o 1,5 x 103 UFP de virus PR8 o NS1-99 de tipo natural. Se vigilaron a continuación los ratones durante 3 semanas para comprobar su supervivencia. Los resultados se recogen en la Tabla 4. El virus NS1-99 presentaba una DL50 al menos tres log mayor que la del virus de tipo natural.
Tabla 4. Atenuación del virus NS1-99 en ratones
Supervivientes Virus Dosis infectante (UFP): 5 x 106 1,5 x 105 5 x 103
PR8 WT1 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5
1 Virus de la gripe A/PR/8/34 de tipo natural.
10 7. Ejemplo: generación y caracterización de los mutantes por truncamiento de NS1 en el virus de la gripe B 7.1 Materiales y métodos
Los detalles experimentales son similares a los del Apartado 6.1. Se obtuvieron dos virus mutantes de la gripe B, B/610B5B/201 (B/201) y B/AWBY-234, con una longitud de 127 aminoácidos y 90 aminoácidos (proteínas NS1 truncadas en C-terminal), respectivamente (Norton et al., 1987 Virology 156:204; Tobita et al., 1990 Virology 174:314) 15 por experimentos de co-infección en cultivo tisular que implicaban los virus B/Yamagata/1/73 (B/Yam) y A/Aichi/2/68 en presencia de un anticuerpo anti-virus A (H3N2). El crecimiento de los virus mutantes de la gripo en huevos embrionados de diferentes días se comparó con el del virus parental B/Yam, que posee una proteína NS1 de tipo natural de 281 aminoácidos. Se inocularon huevos de 6, 10 y 14 días con aproximadamente 103 UFP de virus B/Yam, B/201 o B/AWBY-234, se incubaron a 35ºC durante 2 días y los virus presentes en el líquido alantoideo se titularon
20 mediante una valoración por HA.
Además, se determinaron en ratones las características de atenuación de los virus B/201 y B/AWBY-234. Grupos de tres ratones BALB/c se infectaron intranasalmente con 3x105 UFP de virus B/YAM o B/201 de tipo natural y de virus mutante B/AWBY/234 y se determinó la capacidad de estos virus para replicarse midiendo los títulos virales en pulmones 3 días después de la infección, puesto que el virus B/Yam de tipo natural no induce signos patógenos eviden
25 tes en ratones.
7.2 Resultados
Tabla 5: Replicación del virus de la gripe B en huevos de pollo embrionados.
Título de hemaglutinación Virus Edad de los huevos: 6 días 10 días 14 días
B/Yam 362 256 <2
B/201 32 <2 <2
B/AWBY-234 8 <2 <2
Los resultados del crecimiento de los virus de la gripe B de tipo natural y mutantes en huevos de pollo embrionados,
5 recogidos en la Tabla 5, demuestran que, como en el caso de los virus de la gripe A, un truncamiento en el carboxiterminal del NS1 del virus de la gripe B es responsable de una menor replicación en huevos de pollo embrionados de más días lo que provoca una respuesta eficaz al IFN. Este hallazgo indica que el NS1 del virus de la gripe B está también implicado en la inhibición de la respuesta al IFN del hospedante y que las deleciones en el gen NS1 del virus de la gripe B dan como resultado un fenotipo atenuado.
10 Los resultados de los experimentos de replicación en ratones se recogen en la Tabla 6. Los títulos de los virus B/201 y B/AWBY-234 tenían aproximadamente una magnitud tres log inferior a la de los títulos del virus B/Yam, lo que indica que los truncamientos del dominio del carboxi-terminal del NS1 del virus de la gripo B son responsables de un fenotipo atenuado en ratones.
Tabla 6. Replicación del virus de la gripe B en pulmones de ratones
Virus Títulos en el pulmón 3 días después de la infección (UFP/pulmón)
B/Yam 2x104 1x104 3x104
B/201 30 <10 60
B/AWBY-234 <10 40 <10
8. Protección frente a la infección por el virus de la gripe de tipo natural en ratones inmunizados con virus de la gripe A y B que contienen deleciones en sus proteínas NS1
Con el fin de determinar si ratones inmunizados con virus atenuados de la gripe A and B que contenían proteínas NS1 truncadas estaban protegidos frente a la inoculación con sus respectivos virus de tipo natural se realizó el si20 guiente experimento. Ratones BALB/c se inmunizaron intranasalmente con virus A/NS1-99 y tres semanas más tarde se infectaron con 100 DL50 del virus de la gripe A/PR/8/34 de tipo natural. Los animales inmunizados no murieron mientras que todos los ratones de control sin tratamiento previo murieron después de la inoculación (véase la Tabla 7). En un segundo experimento, ratones BALB/c fueron inmunizados intranasalmente con los virus de la gripe B, B/201 o B/AWBY-234, que expresan proteínas NS1 truncadas. Tres semanas más tarde se inocularon los ratones 25 con 3x105 UFP del virus de la gripe B/Yam/1/73 de tipo natural. Puesto que esta cepa del virus de la gripe B no induce síntomas patógenos en ratones, se determinó el grado de protección midiendo los títulos de los virus en los pulmones 3 días después de la inoculación. Mientras que los animales de control sin tratamiento previo tenían títulos de alrededor de 104 UFP/pulmón, no se detectaron virus en pulmones de animales inmunizados (véase la Tabla 8). Estos hallazgos sugieren que los virus de la gripe A así como los de la gripe B que contienen genes NS1 modifica
30 dos son capaces de inducir una respuesta inmunitaria en ratones que los protege totalmente de una inoculación de virus de tipo natural posterior.
Tabla 7. Supervivencia de ratones inmunizados con el virus de la gripe A/NS1-99 después de inoculación con 100 DL50 del virus de la gripe A/PR/8/34 de tipo natural.
Dosis inmunizante del virus A/NS1-99 Número de supervivientes /Número total
5x106 UFP 3/3
1,5x105 UFP 4/4
PBS 0/5
Tabla 8. Títulos en el pulmón de ratones inmunizados con los virus de la gripe B/201 y B/AWBY-234 después 5 de inoculación con 3x105 UFP del virus de la gripe B/Yamagata/73 de tipo natural.
Dosis inmunizante Títulos en el pulmón (UFP/pulmón)
3X105 UFP de B/201 <101, <101, <101, <101, <101
3X105 UFP de B/AWBY-234 <101, <101, <101, <101, <101
PBS 2,5x104, 1x104, 1,7x104, 3x104, 5x104
9. Ejemplo: inducción de interferón de tipo I en huevos embrionados infectados con virus delNS1
A continuación se determinó la capacidad del virus delNS1, un virus de la gripe A que carece del gen NS1, para inducir la secreción del IFN de tipo I en huevos de pollo embrionados. Con este fin, se infectaron grupos de dos 10 huevos de pollo embrionados de 10 días con 5x103 UFP de virus delNS1 o PR8 de tipo natural. Dieciocho horas después de incubación a 37°C, se recogió el líquido alantoideo y se dializó frente a una solución de pH ácido durante una noche, para inactivar los virus infecciosos. Después de tratamiento a pH ácido, se dializaron las muestras frente a PBS y se analizó su actividad del IFN determinando la mayor dilución con actividad protectora contra una infección por VSV (aproximadamente 200 UFP) en células CEF. Los resultados recogidos en la Tabla 9 indican que
15 en ausencia de NS1, los virus de la gripe A son mayores inductores del IFN.
Tabla 9. Inducción del IFN en huevos.
Virus IFN (U/ml)
PR8 <16, <16
delNS1 400, 400
Sin virus <16, <16
10. Ejemplo: actividad antiviral del virus delNS1
La eliminación del gen antagonista del IFN (NS1) del virus de la gripe A puede dar como resultado un virus con la
20 capacidad para inducir altos niveles de IFN. Si este es el caso, el virus delNS1 "interferirá" con la replicación de los virus sensibles al IFN. Con el fin de analizar esta posibilidad, los inventores investigaron la capacidad del virus delNS1 para inhibir la replicación en huevos del virus de la gripe A/WSN/33 (WSN), una cepa del virus de la gripe usada normalmente en el laboratorio. Como puede observarse en la Figura 1, el tratamiento con solamente 2 UFP del virus delNS1 era capaz de reducir en el líquido alantoideo en un log los títulos finales del virus WSN. Además, el
25 tratamiento con 2x104 UFP del virus delNS1 dio como resultado la anulación prácticamente completa de la replicación de WSN en huevos. El virus delNS1 también era capaz de interferir con la replicación en huevos de otras cepas de virus de la gripe A (H1N1 y H3N2), virus de la gripe B y un virus diferente, tal como el virus de Sendai (Figura 2).
Animados por estos resultados, los inventores determinaron entonces la capacidad del virus delNS1 para interferir con la replicación en ratones del virus de la gripe de tipo natural. Aunque el tratamiento con IFN de tipo I en cultivos 30 tisulares evita la replicación in vitro del virus de la gripe A, el tratamiento de ratones con IFN no es capaz de inhibir la replicación de los virus de la gripe (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52). Esto se cumple en la
mayorías de la cepas endogámicas de ratones, excepto en los ratones A2G. Los ratones A2G, así como una proporción significativa de ratones de tipo natural (aproximadamente 75%), contienen al menos un alelo Mx1 intacto, mientras que la mayoría de las cepas usadas en los laboratorios son Mx1 -/- (Haller, 1986, Current Top Microbiol Immunol 127:331-337). La proteína Mx1, que es homóloga a la proteína MxA humana (Aebi, 1989, Mol. Cell. Biol.
5 11:5062), es un potente inhibidor de la replicación de los virus de la gripe (Haller, 1980, Nature 283:660). Esta proteína no se expresa constitutivamente, pero su expresión es inducida transcripcionalmente por IFN de tipo I. Por consiguiente, los ratones A2G se pueden utilizar para analizar la capacidad de inductores de IFN para estimular una respuesta antiviral frente a los virus de la gripe A (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52).
Los inventores infectaron intranasalmente ocho ratones A2G de 4 semanas con 5x106 UFP de un aislado del virus
10 de la gripe A/PR/8/34 altamente patógeno (Haller, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52). La mitad de los ratones recibieron un tratamiento intranasal con 5x106 UFP de delNS1, 24 horas antes que la infección con PR8. Los otros cuatro ratones fueron tratados con PBS. Se vigilaron los cambios de peso y la supervivencia. Estos resultados demuestran que el tratamiento con delNS1 era capaz de proteger a los ratones A2G frente a la muerte inducida por los virus de la gripe y de la pérdida de peso. El mismo tratamiento no fue eficaz en ratones Mx1 -/-, lo que indicaba
15 que el mecanismo de protección viral era mediado en Mx1, es decir, por IFN.
11. Ejemplo: propiedades antitumorales del virus delNS1 en ratones
Dado que el IFN de tipo I y/o los inductores del IFN de tipo I han demostrado que tienen actividades antitumorales (Belardelli and Gresser, 1996 Immunology Today 17: 369-372; Qin et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1441114416), es posible que el tratamiento de tumores con el virus delNS1 pudiera mediar la regresión de tumores. Alter20 nativamente, el virus delNS1 podría tener propiedades oncolíticas, es decir, puede ser capaz de crecer específicamente en células tumorales y matarlas, muchas de las cuales se sabe que tienen deficiencias en el sistema del IFN. Con el fin de analizar la actividad antitumoral del virus delNS1, se realizó el siguiente experimentos usando la línea celular de carcinoma de múridos CT26.WT en un modelo de tumor de ratón para metástasis pulmonar (Restifo et al., 1998, Virology 249:89-97). Se inyectaron por vía intravenosa en doce ratones BALB/c de 6 semanas 5x105 células
25 CT26.WT. La mitad de los ratones se trataron intranasalmente con 106 UFP del virus delNS1 cada 24 horas 1, 2 y 3 días después de la inoculación. Doce días después de la inyección del tumor, se sacrificaron los ratones y se enumeraron las metástasis pulmonares. Como se muestra en la Tabla 10, el tratamiento con delNS1 produjo una regresión significativa de las metástasis pulmonares en múridos.
Tabla 10. Actividad antitumoral del virus delNS1 en ratones BALB/c inyectados con las células tumorales 30 CT26.WT.
Número de metástasis pulmonares
Tratados con PBS Tratados con delNS1
Ratón 1 >250 120
Ratón 2 >250 28
Ratón 3 >250 9
Ratón 4 >250 6
Ratón 5 >250 2
Ratón 6 >250 1
12. Ejemplo: la proteína NS1 inhibe la translocación del IRF-3 durante la infección con el virus de la gripe
Los resultados descritos en la presente memoria sugieren que la proteína NS1 del virus de la gripe es responsable de la inhibición de la respuesta al IFN de tipo I contra el virus y que las mutaciones/deleciones en esta proteína dan 35 como resultado virus atenuados debido a una mejor respuesta al IFN durante la infección. Se sabe que la síntesis del IFN de tipo I durante la infección viral puede ser provocada por el RNA bicatenario (dsRNA). El IRF-3 es un factor de transcripción que se encuentra generalmente en forma inactiva en el citoplasma de células de mamíferos. El RNA bicatenario induce la fosforilación (activación) del factor de transcripción IRF-3, dando como resultado su translocación al núcleo, donde induce la transcripción de genes específicos, incluyendo los genes que codifican el IFN de 40 tipo I (Weaver et al., 1998, Mol. Cell. Biol. 18:1359). Con el fin de determinar si el NS1 del virus de la gripe está actuando sobre el IRF-3, se vigiló la localización del IRF-3 en las células CV1 infectadas con el virus PR8 de tipo natural o con el virus delNS1 de la gripe A. La Figura 3 muestra que la translocación de IRF-3 es mínima en las células infectadas con PR8 (menos del 10% de las células). Por el contrario, aproximadamente el 90% de las células infec
tadas con delNS1 mostraron localización nuclear de IRF-3. Sorprendentemente, fue posible inhibir parcialmente la translocación del IRF-3 en las células infectadas por delNS1 mediante la expresión de NS1 en un plásmido en trans. Los resultados demuestran que el NS1 del virus de la gripe A es capaz de inhibir la translocación del IRF-3 en células infectadas por el virus. Es probable que el NS1 del virus de la gripe evite la activación mediada por el dsRNA del IRF-3 secuestrando el dsRNA generado durante la infección viral, dando así como resultado una inhibición de la síntesis del IFN.

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso de un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para la fabricación de un medicamento para uso en prevenir o tratar una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto, en donde el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácido N terminal es el número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular, y en donde el virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de la cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe B.
  2. 2.
    El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.
  3. 3.
    El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.
  4. 4.
    El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe B.
  5. 5.
    El uso de la reivindicación 1, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.
  6. 6.
    El uso de la reivindicación 1 o 3, en donde el virus de la gripe atenuado es NS1/99.
  7. 7.
    El uso de la reivindicaciones 1, 2, 3 o 5, en donde el virus de la gripe atenuado, cuyo genoma codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos, 1-120 aminoácidos, 1-110 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-99 aminoácidos, 1- 90 aminoácidos, 1-70 aminoácidos o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, es un virus de la gripe A.
  8. 8.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el virus de la gripe atenuado es un virus de la gripe B.
  9. 9.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad infecciosa es una infección viral.
  10. 10.
    El uso de la reivindicación 9, en donde la infección viral es una infección por virus de la gripe.
  11. 11.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración del virus de la gripe atenuado es aproximadamente 104 a aproximadamente 5x106 UFP.
  12. 12.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se formula para administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural u oral.
  13. 13.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el medicamento se formula para administración pulmonar.
  14. 14.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sujeto es un ser humano.
  15. 15.
    Un virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética, en donde el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, en donde el aminoácido N terminal es el
    número 1, y el virus de la gripe modificado por ingeniería genética tiene una capacidad deteriorada de antagonizar la respuesta al interferón celular para uso en tratar o prevenir una enfermedad infecciosa sensible al interferón en un sujeto, y en donde el virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética que codifica la proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de la cepa del virus de la gripe es un virus de la gripe B.
  16. 16.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de la reivindicación 15, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-120 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-110 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-100 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, 1-99 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-90 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.
  17. 17.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de la reivindicación 15, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-89 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe B.
  18. 18.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de la reivindicación 15, en el que el genoma del virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-70 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe.
  19. 19.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con las reivindicaciones 15, 16 o 18, en donde el virus de la gripe atenuado, cuyo genoma codifica una proteína NS1 truncada que tiene 1-130 aminoácidos, 1-120 aminoácidos, 1-110 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-99 aminoácidos, 1-90 aminoácidos, 1-70 aminoácidos o 1-60 aminoácidos de la proteína NS1 de una cepa del virus de la gripe, es un virus de la gripe A.
  20. 20.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde el virus de la gripe atenuado es un virus de la gripe B.
  21. 21.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el virus se formula para administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural u oral.
  22. 22.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el virus se formula para administración pulmonar.
  23. 23.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en donde la enfermedad infecciosa es una infección viral.
  24. 24.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la infección viral es una infección por virus de la gripe.
  25. 25.
    El virus de la gripe atenuado modificado por ingeniería genética para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, en donde el sujeto es un ser humano.
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