SK19072000A3 - VAKCINA¬Ní PROSTRIEDOK, FARMACEUTICKí PROSTRIEDOK A ICH POU¦ITIE - Google Patents

VAKCINA¬Ní PROSTRIEDOK, FARMACEUTICKí PROSTRIEDOK A ICH POU¦ITIE Download PDF

Info

Publication number
SK19072000A3
SK19072000A3 SK1907-2000A SK19072000A SK19072000A3 SK 19072000 A3 SK19072000 A3 SK 19072000A3 SK 19072000 A SK19072000 A SK 19072000A SK 19072000 A3 SK19072000 A3 SK 19072000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
virus
interferon
attenuated
host system
viruses
Prior art date
Application number
SK1907-2000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK288200B6 (sk
Inventor
Peter Palese
Adolfo Garcia-Sastre
Thomas Muster
Original Assignee
The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK19072000(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of filed Critical The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of
Publication of SK19072000A3 publication Critical patent/SK19072000A3/sk
Publication of SK288200B6 publication Critical patent/SK288200B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Vakcinačný prostriedok, farmaceutický prostriedok a ich použitie
Oblasť techniky
Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka oslabených negatívnych jednovláknových RNA vírusov, ktoré majú poškodenú schopnosť antagonizovať bunkovú interferónovú (IFN) odpoveď, a použitia takto oslabených vírusov vo vakcinačných a farmaceutických prostriedkoch. Vynález sa týka aj vývoja a použitia IFN-deficientných systémov na selekciu, identifikáciu a množenie takto oslabených vírusov.
Hlavné uskutočnenie vynálezu sa týka oslabených influenza vírusov, ktoré majú modifikácie NS1 génu, ktoré zmenšujú alebo eliminujú schopnosť produktu NS1 génu antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. Mutantné vírusy sa replikujú in vivo, ale majú zníženú patogenicitu, a preto sú vhodné na použitie v živých vírusových vakcínach a farmaceutických prostriedkoch.
Táto prihláška je pokračovaním časti prihlášky s poradovým číslom 60/117683 podanej 29. januára 1999; prihlášky s poradovým číslom 60/108832 podanej 18. novembra 1998; a prihlášky s poradovým číslom 60/089103 podanej 12 júna, 1998, ktoré sú tu všetky kompletne začlenené ich citáciou.
Práca reflektovaná touto prihláškou, bola čiastočne podporená grantom od National Institutes of Health a vláda môže mať určité práva na vynález.
Doterajší stav techniky
Influenza vírus
Vírusové čeľade obsahujúce obalené jednovláknové RNA s negatívnymsense genómom sú rozdelené do skupiny, v ktorej sú vírusy s nesegmentovaným genómom (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae a vírus ochorenia Borna), alebo vírusy so segmentovaným genómom (Orthomyxovirídae, Bunyaviridae a
Arenavirídae). Ako príklad tu bola použitá Orthomyxovirídae čeľaď, ktorá je
-2podrobne opísaná nižšie, a zahŕňa influenza vírusy typu A, B a C, ako aj Thogoto a Dhori vírusy a vírus infekčnej lososej anémie.
Influenza virióny pozostávajú z vnútorného ribonukleoproteínového jadra (závitnicovitý nukleokapsid) obsahujúceho jednovlákový RNA genóm, a vonkajšieho lipoproteínového obalu, ktorý je vo vnútri spojený matricovým proteínom (M1). Segmentovaný genóm influenza A vírusu pozostáva z ôsmych molekúl (sedem influenza C) lineárnych, jednovláknových RNAs s negatívnou polaritou, ktoré kódujú desať polypeptidov zahŕňajúc: RNA závislé RNA polymerázové proteíny (PB2, PB1 a PA) a nukleoproteín (NP), ktorý vytvára nukleokapsid; matricové membránové proteíny (M1, M2); dva povrchové glykoproteíny, ktoré vyčnievajú z obalu obsahujúceho lipidy: hemaglutinín (HA) a neuramidázu (NA); neštruktúrny proteín (NS1) a jadrový exportný proteín (NEP). Transkripcia a replikácia genómu sa uskutočňuje v jadre a zostavenie nastáva pučaním na plazmatickej membráne. Počas zmiešanej infekcie si vírusy môžu preusporiadať gény.
Influenza vírus sa adsorbuje prostredníctvom HA na sialyloligosacharidy v bunkových membránových glykoproteínoch a glykolipidoch. Po endocytóze viriónu nastáva konformačná zmena v HA molekule vo vnútri bunkového endozómu, ktorý uľahčuje membránovú fúziu, a tak sa spúšťa odbaľovanie. Nukleokapsid migruje do jadra, kde sa transkribuje vírusová mRNA. Vírusová mRNA sa transkribuje unikátnym mechanizmom, pri ktorom vírusová endonukleáza odštiepi 5'-koniec s čiapočkou od bunkových heterológnych mRNAs, ktoré potom slúžia ako primery na transkripciu vírusových RNA templátov vírusovou transkriptázou. Transkripty končia v mieste 15. až 22. bázy od konca ich templátov, tam, kde oligo(U) sekvencie slúžia ako signály na pridanie poly(A) pásov. Z ôsmych takto vyrobených RNA molekúl je šesť monocistronickými poslami, ktoré sa translatujú priamo do proteínov predstavujúcich HA, NA, NP a vírusové polymerázové proteíny, PB2, PB1 a PA. Ďalšie dva transkripty sa zostrihávajú za vzniku dvoch mRNAs, ktoré sú translatované v odlišných čítacích rámcoch, čím vznikajú M1, M2, NS1 a NEP. Inak povedané, osem vírusových RNA segmentov kóduje desať proteínov: deväť štrukturálnych a jeden neštrukturálny. Zhrnutie influenza vírusových génov a ich proteínových produktov je uvedené v tabuľke I, nižšie.
··
-3Tabuľka I
Influenza vírusové genómové RNA segmenty a kódované proteíny3 ··
Segment Dlžkab (nukleotidy) Kódovaný polypeptid,. Dížkad (aminok.) Molekuly/ virión Poznámky
1 2341 PB2 759 30-60 Zložka RNA transkriptázy; viazanie hostiteľskej bunkovej RNA čiapočky
2 2341 PB1 757 30-60 Zložka RNA transkriptázy; iniciácia transkripcie
3 2233 PA 716 30-60 Zložka RNA transkriptázy
4 1778 HA 566 500 Hemaglutinln; trimér; obalový glykoproteín; sprostredkúva pripojenie na bunky
5 1565 NP 498 1000 Nukleoproteín; spojený s RNA; štrukturálna zložka RNA transkriptázy
6 1413 NA 454 100 Neuraminidáza; tetramér, obalový glykoproteín
7 1027 M1 252 3000 Matricový proteín; leží vo vnútri obalu
M2 96 ? Štrukturálny proteín v plazmatickej membráne; zostrihaná mRNA
8 890 NS1 230 Neštrukturálny proteín; neznáma funkcia
NEP 121 ? Jadrový exportný proteín; zostrihaná mRNA
a Adaptované podľa R.A. Lamb a P.W. Choppin (1983); Annual Review of
Biochemistry, Zv. 52, 467-506 b pre A/PR/8/34 kmeň c Stanovéné biochemickými a genetickými postupmi d Stanovené analýzou nukleotidovej sekvencie a sekvenovaním proteínu
-4• ·· ·· · ·· ···· · · ·· · · · • ··· ··· ···· · • · · · · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ···
Influenza A vírusový genóm obsahuje deväť segmentov jednovláknovej RNA s negatívnou polaritou, ktoré kódujú jeden neštrukturálny a deväť štrukturálnych proteínov. Neštrukturálny proteín NS1 sa vo veľkom množstve nachádza v bunkách infikovaných influenza vírusom, ale nebol detekovaný vo viriónoch. NS1 je fosfoproteín, ktorý sa nachádza v jadre hneď na začiatku infekcie a aj v cytoplazme v neskoršej fáze vírusového cyklu (King a ďalší, 1975, Virology 64: 378). Štúdie s tepelne senzitívnymi (ts) influenza mutantami majúcimi lézie v NS géne naznačili, že NS1 proteín je transkripčný a post-transkripčný regulátor mechanizmov, prostredníctvom ktorých je vírus schopný inhibovať hostiteľskú bunkovú génovú expresiu a stimulovať vírusovú proteínovú syntézu. Podobne ako mnohé iné proteíny, ktoré regulujú posttranskripčné procesy, interaguje NS1 proteín so špecifickými RNA sekvenciami a štruktúrami. Bolo zverejnené, že NS1 proteín sa viaže na odlišné RNA druhy vrátane: vRNA, poly-A, U6 snRNA, 5' netranslatovanú oblasť ako vírusové mRNAs a ds RNA (Qiu a ďalší, 1995, RNA 1: 304; Qiu a ďalší, 1994, J. Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J Gen Virol. 73: 3325-9. Expresia NS1 proteínu z cDNA v transfekovaných bunkách bola spojená s niekoľkými účinkami: inhibícia nukleo-cytoplazmatického transportu mRNA, inhibícia pre-mRNA zostrihu, inhibícia polyadenylácie hostiteľskej mRNA a stimulácia translácie vírusovej mRNA (Fortes, a ďalší, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami a ďalší, 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, a ďalší, 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu, a ďalší, 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, a ďalší, 1995, J. Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff a ďalší, 1998, Mol. Celí. 1:1991; Chen, a ďalší, 1994, EMBO J. 18:2273-83).
Oslabené vírusy
Inaktivované vírusové vakcíny sa pripravujú usmrtením vírusového patogénu, napr. zahriatím alebo ošetrením s formalínom, aby nebol schopný replikácie. Inaktivované vakcíny majú obmedzené využitie, pretože neposkytujú dlhotrvajúcu imunitu a preto zaručujú len obmedzenú ochranu. Alternatívny prístup na výrobu vírusových vakcín zahŕňa použitie oslabených živých vírusových vakcín.
Oslabené vírusy sú schopné sa replikovať, ale nie sú patogénne, a teda poskytujú dlhšie trvajúcu imunitu a zaručujú väčšiu ochranu. Avšak bežné spôsoby na výrobu
-5·· ·· * 99
9 9 · 99 9 9 9 oslabených vírusov zahŕňajú šancu izolovať mutanty so zmeneným rozsahom hostiteľov, z ktorých mnohé sú citlivé na zmenu teploty; napr. vírus sa pasážuje na neprirodzených hostiteľoch a selektuje sa potomstvo vírusov, ktoré je imunogénne a nie je patogénne.
Bežným substrátom na izoláciu a pestovanie influenza vírusov na vakcinačné účely sú kuracie vajcia s embryami. Influenza vírusy typicky rastú 2 až 4 dni pri 37 °C v 10 až 11 dňových vajciach. Hoci väčšina ľudských primárnych izolátov influenza A a B vírusov rastie lepšie v amniotickej dutine embryí, po 2 alebo 3 pasážach sa vírusy prispôsobia rastu v bunkách alantoickej dutiny, ktorá je prístupná z vonkajšej strany vajec (Murphy, B.R., a R.G. Webster, 1996. Orthomyxoviruses str. 1397-1445. V In Fields Virology. Lippincott-Raven P.A.).
Technológia rekombinantnej DNA a techniky genetického inžinierstva by teoreticky poskytli vynikajúci prístup na výrobu oslabených vírusov, pretože by mohli byť do vírusového genómu premyslene zavedené mutácie. Avšak genetické zmeny potrebné na oslabenie vírusov nie sú známe, alebo sa nedajú predpokladať. Vo všeobecnosti smerovali pokusy použiť techniku rekombinantnej DNA k navrhnutiu vírusových vakcín na produkciu podjednotkových vakcín, ktoré obsahujú len proteínové podjednotky patogénu, ktoré sa podieľajú na imunitnej odpovedi, pričom tieto podjednotky sú exprimované v rekombinantných vírusových vektoroch, ako napríklad vírusoch kiahní alebo bakulovírusoch. V súčasnosti sa použili techniky rekombinantnej DNA v pokuse vyprodukovať herpes vírusové delečné mutanty alebo poliovírusy, ktoré napodobujú oslabené vírusy nachádzajúce sa v prírode alebo známe mutanty meniace rozsah hostiteľov. Do roku 1990 nebolo vôbec možné pre negatívne vláknité RNA vírusy použiť miestne špecifickú manipuláciu, takže nemohli byť menené genetickým inžinierstvom.
V takejto miere oslabené živé influenza vírusy nemohli byť schopné suprimovať interferónovú odpoveď v hostiteľovi, v ktorom sa replikujú. Preto, hoci tieto vírusy sú užitočné pretože sú imunogénne a nie sú patogénne, je ťažké ich množiť na substrátoch, ktoré sú bežné na výrobu vakcín. Navyše, oslabené vírusy môžu mať také slabé virulenčné vlasnosti, že neumožnia hostiteľovi zostaviť
-6imunitnú odpoveď dostatočnú na vysporiadanie sa s následnými vyzývacími infekciami.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je vakcinačný prostriedok, ktorý obsahuje: oslabený negatívny jednovláknový RNA vírus majúci interferón antagonistický fenotyp, ktorý a) je zodpovedný za oslabenie a b) umožňuje oslabenému vírusu rásť s vysokými titrami v interferón-deficientných hostiteľských systémoch v porovnaní s rastom v interferón-kompetentných hostiteľských systémoch, keď sa množí v rovnakých podmienkach; a fyziologicky prijateľný excipient.
Vynález sa týka oslabených negatívnych jednovláknových RNA vírusov, ktoré majú poškodenú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď, a použitia takýchto vírusov vo vakcínach a farmaceutických prostriedkoch. Mutantné vírusy s poškodenou IFN antagonistickou aktivitou sú oslabené, sú infekčné, môžu sa replikovať in vivo, aby poskytli subklinickú úroveň infekcie, a nie sú patogénne. Preto sú ideálnymi kandidátmi pre živé vírusové vakcíny. Navyše, oslabené vírusy môžu indukovať masívnu IFN odpoveď, ktorá má iné biologické následky in vivo, ktoré poskytujú ochranu proti následným infekčným ochoreniam a/alebo indukujú protinádorové odpovede. Preto je možné oslabené vírusy použiť farmaceutický na prevenciu alebo liečbu iných infekčných ochorení, rakoviny u jedincov s vysokým rizikom a/alebo ochorení, ktoré je možné liečiť prostredníctvom IFN.
Negatívne jednovláknové RNA vírusy používané podľa vynálezu zahŕňajú tak segmentované, ako aj nesegmentované vírusy. Výhodné uskutočnenia zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na influenza vírus, respiračný syncytiálny vírus (RSV), vírus Newcastelskej choroby (NDV), vírus vezikulárnej stomatitídy (VSV) a parainfluenza vírus (PIV). Vírusy použité vo vynáleze môžu byť vybrané z prirodzene sa vyskytujúcich kmeňov, variantov alebo mutantov; z mutovaných vírusov (napr. generovaných vystavením vírusov mutantom, opakovaným pasážovaním vírusov v nepermisívnych hostiteľoch); vírusov s preusporiadanými génmi (v prípade segmentovaných vírusových genómov); a/alebo vírusov získaných
-7genetickým inžinierstvom (napr. použitím techník reverznej genetiky), ktoré majú požadovaný fenotyp tzn. poškodenú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. Mutantné vírusy alebo vírusy pripravené prostredníctvom genetického inžinierstva je možné vybrať na základe odlišného rastu v IFN deficientných systémoch versus IFN kompetentných systémoch. Selektované môžu byť napríklad vírusy, ktoré rastú v IFN deficientnom systéme, ale nerastú v IFN kompetentnom systéme (alebo rastú horšie v IFN kompetentnom systéme).
Takto vybraný oslabený vírus môže byť použitý, ako taký, ako účinná zložka vakcín alebo farmaceutických prostriedkov. Alternatívne môže byť oslabený vírus použitý ako vektor alebo kostra rekombinantne produkovaných vakcín. Na tento účel je možné použiť techniky reverznej genetiky, aby sa zaviedli mutácie alebo cudzie epitopy do oslabených vírusov, ktoré by slúžili ako rodičovský kmeň. Týmto spôsobom je možné navrhnúť vakcíny na imunizáciu proti kmeňovým variantom alebo alternatívnym spôsobom proti úplne odlišnými infekčným činidlám alebo chorobným antigénom. Oslabené vírusy môžu byť napríklad navrhnuté tak, aby exprimovali neutralizujúce epitopy iných vopred vybraných druhov. Alternatívne môžu byť do oslabeného mutantného vírusu zabudované epitopy iných ako negatívnych jednovláknových RNA vírusov (napr. gp160, gp120 alebo gp41 HIV vírusu). Alternatívne môžu byť do vírusu zavedené epitopy nevírusových infekčných patogénov (napr. parazitov, baktérií, plesní). Ako ešte iná alternatíva môžu byť pripravené rakovinové vakcíny, napr. zavedením nádorových antigénov do oslabenej vírusovej kostry.
V hlavnom uskutočnení zahŕňajúcom RNA vírusy so segmentovanými genómami, je možné použiť techniky preskladania na prenos oslabeného fenotypu z rodičovského segmentovaného RNA vírusového kmeňa (prirodzený mutant, mutovaný vírus alebo vírus skonštruovaný technikami genetického inžinierstva) do odlišného vírusového kmeňa (vírus divého typu, prirodzený mutant, mutovaný vírus alebo vírus skonštruovaný technikami genetického inžinierstva).
Oslabené vírusy, ktoré indukujú masívne IFN odpovede v hostiteľoch, môžu byť použité aj vo farmaceutických prostriedkoch na prevenciu alebo liečbu iných vírusových infekcií alebo ochorení, ktoré je možné liečiť prostredníctvom IFN, ako
-8• ···· ·· · · ·· • · · ·· • ··· · ·· • · ·· ··· ···· napríklad rakoviny. V tomto ohľade je možné zmeniť tropizmus oslabeného vírusu tak, aby vírus smeroval do požadovaného cieľového orgánu, tkaniva alebo buniek, in vivo alebo ex vivo. Použitím tohto prístupu je možné indukovať IFN odpoveď lokálne, v cieľovom mieste, a tak vylúčiť alebo minimalizovať vedľajšie účinky systémových IFN ošetrení. Na tento účel je možné navrhnúť oslabené vírusy na expresiu Ugandu špecifického pre receptor cieľového orgánu, tkaniva alebo cieľových buniek.
Mutácie, ktoré zmenšujú, ale nerušia IFN antagonistickú aktivitu vírusu, sú výhodné pre vakcínové prostriedky Takéto vírusy môžu byť selektované tak, že rastú tak na bežných, ako aj nebežných substrátoch, a tak, aby boli stredne virulentné. Hlavné je, že prihlasovatelia demonštrovali, že mutant NS1 skrátený na C-konci sa replikuje s vysokými titrami v IFN deficientných substrátoch, ako napríklad v 6 a 7 dňových kuracích vajciach s embryami, ako aj v alantoickej membráne 10 dňových kuracích vajec s embryami, čo je bežný substrát pre influenza vírus, ktorý neumožňuje rast influenza vírusových mutantov, v ktorých je deletovaný celý NS1 gén (tu označované aj ako knockout mutanty). Avšak replikácia mutantu NS1 skráteného na C-konci je redukovaná v 12 dňových vajciach s embryami. Tento prístup po prvý krát umožňuje generovanie a identifikáciu živých oslabených negatívnych jednovláknových RNA vírisov, ktoré majú zmenenú, ale nie zrušenú IFN antagonistickú aktivitu, a ktoré sú schopné rásť v substrátoch vhodných na prípravu vakcín. Tento prístup tiež po prvý krát poskytuje účinný selekčný identifikačný systém pre influenza a iné vírusy, ktoré obsahujú mutácie spôsobujúce zmenu, ale nie zrušenie interferónovej antagonistickej aktivity.
Vynález sa týka aj použitia IFN deficientných systémov na šírenie oslabených vírusov, ktoré nemôžu rásť v bežných teraz používaných systémoch na produkciu vakcín. Výraz IFN-deficientné systémy, ako je tu používaný, znamená systémy, napr. buniek, bunkových línií a zvierat, ako napríklad myší, kurčiat, moriek, králikov, potkanov, atď, ktoré neprodukujú IFN alebo produkujú nízke hladiny IFN, neodpovedajú alebo odpovedajú menej účinne na IFN a/alebo sú deficientné v aktivite antivírusových génov indukovaný prostredníctvom IFN. Na
-9·· ·· ··· • · · · ·· ·· • · · · · ·· ··· e · · · · ·· • · · · ·· ·· ·· ····· tento účel prihlasovatelia identifikovali alebo navrhli množstvo IFN-deficientných systémov, ktoré môžu byť použité, vrátane, ale bez obmedzenia, mladých embryotických vajec, IFN-deficientných bunkových línií (ako napríklad VERO bunky alebo geneticky skonštruované bunkové línie, ako napríklad STAT1 knockouty). Alternatívne je možné embryotické vajcia alebo bunkové línie vopred ošetriť so zlúčeninami, ktoré inhibujú IFN systém (zahŕňajúc liečivá, protilátky, antisense, ribozýmy, atď.). Ešte ďalšie uskutočnenie zahŕňa použitie vajec deficientných v IFN systéme, napr. vajec produkovaných STAT1 negatívnymi vtákmi, hlavne hydinou vrátane, ale bez obmedzenia, transgénnych kurčiat, kačíc alebo moriek.
Vynález sa týka generovania, selekcie a identifikácie oslabených negatívnych jednovlákonových RNA vírusov, ktoré majú poškodenú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď, a použitia takýchto vírusov vo vakcínových a farmaceutických prostriedkoch.
Vírusy môžu mať segmentované alebo nesegmentované genómy a môžu byť vybrané z prirodzene sa vyskytujúcich kmeňov, variantov alebo mutantov; mutovaných vírusov (napr. vystavením UV žiareniu, mutagénom a/alebo pasážovaním); vírusov s preskupenými génmi (vírusy so segmentovanými genómami); a/alebo geneticky skonštruovaných vírusov. Mutované vírusy môžu byť generované napríklad prirodzenými variáciami, vystavením UV žiareniu, vystavením chemickým mutagénom, pasážovaním v nepermisívnych hostiteľoch, preskupovaním (tzn. spoločnou infekciou oslabeného segmentovaného vírusu s iným kmeňom, ktorý má požadované antigény) a/alebo genetickým inžinierstvom (napr. použitím reverznej genetiky). Vírusy vybrané na použitie vo vynáleze majú defektnú IFN antagonistickú aktivitu a sú oslabené; tzn. sú infekčné a môžu sa replikovať in vivo, ale generujú len nízke titre, ktorých výsledkom sú subklinické úrovne infekcie, ktoré nie sú patogénne. Takto oslabené vírusy sú ideálnymi kandidátmi pre živé vakcíny.
Vo výhodnom uskutočnení by mali byť oslabené vírusy vybrané na použitie vo vynáleze schopné indukovať masívnu IFN odpoveď v hostiteľovi --, čo je znak, ktorý sa podieľa na generovaní silnej imunitnej odpovede, keď sa použije ako vakcína, a ktorý má ďalšie biologické následky, ktoré robia vírusy užitočné ako farmaceutické činidlá na prevenciu a/alebo liečbu iných vírusových infekcii alebo
-10nádorov u jedincov s vysokým rizikom alebo iných ochorení, ktoré sú liečiteľné s IFN.
Vynález je čiastočne založený na množstve objavov a pozorovaní, ktoré urobili prihlasovatelia, keď pracovali s influenza vírusovými mutantami. Avšak princípy je možné analogicky aplikovať a extrapolovať na iné segmentované a nesegmentované negatívne jednovlákové RNA vírusy vrátane, ale bez obmedzenia na, paramyxovírusy (Sendai vírus, parainfluenza vírus, príušnice, vírus Newcastelskej choroby), morbilivírusy (vírus osýpok, vírus psinky, vírus dobytčieho moru); pneumovírusy (respiračný syncytiálny vírus a hovädzí respiračný vírus); a rabdovírusy (vírus vezikulárnej stomatitídy a lyssavírus).
Za prvé, je dôležité, aby IFN odpoveď zahŕňala in vivo vírusovú infekciu. Prihlasovatelia zistili, že rast divého typu influenza vírusu A/WSN/33 v IFNdeficientných myšiach (STAT1-/- myši) vedie k pan-orgánovej infekcii; tzn. vírusová infekcia nebola obmedzená na pľúca, ako je tomu pri divom type myši, ktorá generuje IFN odpoveď (Garcia-Sastre, a ďalší, 1998, J.Virol. 72:8550, pričom táto publikácia je tu komplet zahrnutá jej citáciou). Za druhé, prihlasovatelia stanovili, že NS1 influenza vírus funguje ako IFN antagonista. Prihlasovatelia vyskúmali, že influenza vírusový mutant, ktorý má deletovaný celý NS1 gén (tzn. NS1 knockout) nebol schopný rásť vo vysokých titoch v IFN-kompetentných hostiteľských bunkách a bolo ho možné množiť len v IFN-deficientných hostiteľoch. NS1 knockoutové vírusy demonštrovali oslabený fenotyp (tzn. boli letálne v IFN deficientných STAT1/- myšiach, ale neboli letálne v divom type myší) a zistilo sa, že sú účinným induktorom IFN odpovedí v hostiteľských bunkách (Garcia-Sastre, a ďalší, 1998, J.Virol. 252:324-330, pričom táto publikácia je tu komplet zahrnutá jej citáciou). Predchádzajúca infekcia s NS1 knockoutovým mutantným vírusom redukovala titre divého typu influenza vírusu a iných vírusov (napr. Sendai), ktoré boli superinfikované do embryotických vajec. V inom experimente infekcia s NS1 knockout mutantným influenza vírusom redukovala vytváranie ohnísk v zvieratách, ktorým boli inokulované nádorové bunky. Takže NS1 knockout influenza vírus demonštroval zaujímavé biologické vlastnosti. Avšak NS1 knockout mutantné vírusy nemohli byť množené v bežných systémoch na produkciu vakcín. Aby sa prekonal
-11 tento problém, prihlasovatelia použili a vyvinuli IFN-deficientný systém, ktorý umožňuje produkciu značných výťažkov oslabených vírusov.
Okrem toho prihlasovatelia navrhli delečné mutanty NS1, ktoré nemali deletovaný celý gén. Prekvapujúco sa zistilo, že tieto NS1 mutanty vykazujú intermediálny fenotyp --, teda, že vírus môže rásť v bežných hostiteľoch používaných na množenie influenza vírusu (hoci rast je lepší v IFN-deficientných systémoch, v ktorých sú dosiahnuté vyššie titre). Dôležitejšie je, že delečné mutanty sú oslabené in vivo a indukujú masívnu IFN odpoveď. Výsledkom vakcinácie s influenza vírusovými mutantami so skráteným NS1 boli nízke titre vírusu v zvieratách, ktoré boli následne infikované divým typom vírusu, a poskytnutie ochrany proti chorobe.
Predložený vynález sa týka aj substrátov navrhnutých na izoláciu, identifikáciu a pestovanie vírusov na vakcinačné účely. Opísané sú najmä interferón deficientné substráty na účinný rast influenza vírusových mutantov. V súlade s predloženým vynálezom je interferón-deficientný substrát neschopný produkovať alebo odpovedať na interferón. Substrát podľa predloženého vynálezu môže byť použitý na pestovanie akéhokoľvek množstva vírusov, ktoré môžu potrebovať interferón-deficientné rastové prostredie. Takéto vírusy zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na paramyxovírusy (Sendai vírus, parainfluenza vírus, príušnice, vírus Newcastelskej choroby), morbilivírusy (vírus osýpok, vírus psinky, vírus dobytčieho moru); pneumovírusy (respiračný syncytiálny vírus a hovädzí respiračný vírus); a rabdovírusy (vírus vezikulárnej stomatitídy a lyssavírus).
Vynález sa týka aj použitia oslabeného vírusu podľa vynálezu vo vakcínach a farmaceutických prostriedkoch pre ľudí alebo zvieratá. Oslabené vírusy môžu byť použité najmä ako vakcíny proti širokému rozsahu vírusov a/alebo antigénov vrátane, ale bez obmedzenia na antigény kmeňových variantov, odlišné vírusy alebo iné infekčné patogény (napr. baktérie, parazity, plesne) alebo nádorovo špecifické antigény. V inom uskutočnení môžu byť oslabené vírusy, ktoré inhibujú vírusovú replikáciu a vytváranie nádora, použité na profylaxiu alebo liečbu infekcie (vírusovými alebo nevírusovými patogénmi) alebo vytvárania nádora alebo liečbu chorôb, pri ktorých je terapeuticky užitočný IFN. Na zavedenie živých oslabených
-12• ·· • · · · ·· • · · ·· • ··· · ·· • · ·· ····· ·· vírusových prípravkov do ľudského alebo živočíšneho subjektu na indukciu imunitnej alebo príslušnej cytokínovej odpovede je možné použiť množstvo metód. Tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na intranazálne, intratrachiálne, orálne, intradermálne, intramuskulárne, intraperitoneálne, intravenózne a subkutánne spôsoby. Vo výhodnom uskutočnení sú oslabené vírusy podľa predloženého vynálezu formulované na intranazálne podanie.
Generovanie mutantov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou
Akýkoľvek mutantný vírus alebo kmeň, ktorý má zníženú IFN antagonistickú aktivitu, môže byť vybraný a použitý podľa vynálezu. V jednom uskutočnení môžu byť prirodzene sa tak, že majú poškodenú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. V inom uskutočnení môžu byť generované mutantné vírusy vystavením vírusu mutanénom, ako napríklad ultrafialovému žiareniu alebo chemickým mutagénom alebo viacnásobným pasážam a/alebo pasážam na nepermisívnych hostiteľoch. Na selekciu tých mutantov, ktoré majú poškodenú IFN antagonistickú funkciu, môže byť použitý skríning v odlišnom pestovacom systéme. Pri vírusoch so segmentovanými genómami môže byť oslabený fenotyp prenesený na iný kmeň, ktorý má požadovaný antigén, preusporiadanim (tzn. spoločnou infekciou oslabeného vírusu a požadovaného kmeňa a selekciou na preusporiadané vírusy majúce oba fenotypy).
V ďalšom uskutočnení môžu byť mutácie zavádzané do negatívneho jednovláknového RNA vírusu, ako napríklad influenza, RSV, NDV, VSV a PIV, použitím prístupov reverznej genetiky. Týmto spôsobom je možné do vakcínových kmeňov zaviesť prirodzené alebo iné mutácie, ktorých následkom je oslabený fenotyp. Napríklad je možné zaviesť delécie, inzercie alebo substitúcie kódujúcej oblasti génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu (ako napríklad do NS1 v influenza víruse). Do úvahy sa berú aj delécie, substitúcie alebo inzercie v nekódujúcej oblasti génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu. Za týmto účelom je možné zaviesť mutácie v signáloch zodpovedných za transkripciu, replikáciu, polyadenyláciu a/alebo skladanie génu zodpovedného za IFNantagonistickú aktivitu. Napríklad v influenza víruse môžu takéto modifikácie
-13·· ·· · ·· · • · · · ·· · · ·· ·· ··· · · · ··· ··· · ♦ · · · • · · · · · · • ·· ·· ··· ·· ··· zahŕňať, ale nie sú obmedzené na: substitúcie nekódujúcich oblasti influenza A vírusového génu nekódujúcimi oblasťami influenza B vírusového génu (Muster a ďalší, 1991, Prac. Natl Acad. Sci. USA, 88:5177), výmena bázových párov v nekódujúcich oblastiach influenza vírusového génu (Fodor a ďalší, 1998, J Virol. 72:6283), mutácie v promótorovej oblasti influenza vírusového génu (Piccone a ďalší, 1993, Virus Res. 28:99; Li a ďalší, 1992, J. Virol. 66:4331), substitúcie a delécie v sekvencií uridínových zvyškov na 5’ konci influenza vírusového génu ovplyvňujúce polyadenyláciu (Luo a ďalší, 1991, J. Virol. 65:2861; Li a ďalší, J. Virol, 1994, 68(2):1245-9). Takéto mutácie, napríklad v promótora, by mohli znížiť expresiu génu zodpovedného za IFN antagonictickú aktivitu. Vírusy s mutáciami vo vírusových génoch, ktoré môžu regulovať expresiu génu zodpovedného za IFN antagonistickú aktivitu, sú tiež zahrnuté do rozsahu vírusov, ktoré môžu byť použité podľa vynálezu.
Predložený vynález sa týka aj mutácií NS1 génového segmentu, ktorých výsledkom nemusí byť zmenená IFN antagonistická aktivita alebo IFN-indukujúci fenotyp, ale ktorých výsledkom sú zmenené vírusové funkcie a oslabený fenotyp, napr. zmenená inhibícia jadrového exportu poly(A)-obsahujúcej mRNA, zmenená inhibícia pre-mRNA zostrihu, zmenená inhibícia aktivácie PKR prostredníctvom sekvestrovania dsRNA, zmenený účinok na transláciu vírusovej RNA a zmenená inhibícia polyadenylácie hostiteľskej mRNA (pozri napr. Krug v Textbook of Influenza, Nicholson a ďalší, vyd. 1998, 82-92 a tam citované publikácie).
Technika reverznej genetiky zahŕňa prípravu syntetických, rekombinantných, vírusových RNAs, ktoré obsahujú nekódujúce oblasti negatívnej jednovláknovej vírusovej RNA, ktoré sú nevyhnutné na rozoznanie vírusovými polymerázami a pre baliace signály potrebné na generovanie zrelého viriónu. Rekombinantné RNAs sa syntetizujú z rekombinantného DNA templátu a in vitro sa rekonštituujú s purifikovaným vírusovým polymerázovým komplexom, aby sa vytvorili rekombinantné ribonukleoproteíny (RNPs), ktoré môžu byť použité na transfekciu buniek. Účinnejšia transfekcia sa dosiahne, keď sú polymerázové proteíny prítomné počas transkripcie syntetických RNAs buď in vitro, alebo in vivo. Syntetické rekombinantné RNPs môžu byť pohltené do infekčných vírusových častíc. Vyššie uvedené techniky
- 14• ·· ·· · ·· ·· · · ···· · · · • «·· · · · · · · · • · · · · « ♦ ·· ·· ·· ··· ·· sú opísané v US patente č. 5166057 vydanom 24. novembra 1992, v US patente č. 5854037 vydanom 29. decembra 1998, vo zverejnenej európskej patentovej prihláške EP 0702085A1 zverejnenej 20. februára 1996, v US prihláške vynálezu č. 09/152845, v medzinárodnej prihláške vynálezu PCT WO97/12032 zverejnenej 3. apríla 1997; vo WO96/34625 zverejnenej 7. novembra 1996; v európskej prihláške vynálezu EP-A780475; vo WO 99/02657 zverejnenej 21. januára 1999; vo WO 98/53078 zverejnenej 26. novembra 1998; vo WO 98/02530 zverejnenej 22. januára 1998; vo WO 99/15672 zverejnenej 1. apríla 1999; vo WO 98/13501 zverejnenej 2. apríla 1998; vo WO 97/06270 zverejnenej 2O.februára 1997; a v EPO 78047SA1 zverejnenej 25. júna 1997, pričom všetky publikácie sú tu komplet zahrnuté ich citáciou.
Oslabené vírusy generované postupom reverznej genetiky môžu byť použité v tu opísaných vakcínach a farmaceutických prostriedkoch. Techniky reverznej genetiky môžu byť použité aj na zavedenie ďalších mutácií do iných vírusových génov dôležitých pre produkciu vakcín --, tzn., že do oslabených vírusov je možné vniesť epitopy užitočných vakcínových kmeňových variantov. Alternatívne je do oslabeného kmeňa možné zaviesť úplne cudzie epitopy, vrátane antigénov odvodených od iných vírusových alebo nevírusových patogénov. Do oslabeného kmeňa je možné zaviesť napríklad antigény nepríbuzných vírusov, ako HIV (gp160, gp120, gp41), antigény parazitov (napr. malárie), bakteriálne alebo plesňové antigény alebo nádorové antigény. Alternatívne môžu byť do chimérnych oslabených vírusov podľa vynálezu zavedené epitopy, ktoré menia tropizmus vírusu in vivo.
V alternatívnom uskutočnení je možné použiť kombináciu techník reverznej genetiky a techniky preusporiadania na skonštruovanie oslabených vírusov, ktoré majú požadované epitopy v segmentovaných RNA vírusoch. Napríklad oslabeným vírusom (generovaným prirodzenou selekciou, mutagenézou alebo technikami reverznej genetiky) a kmeňom nesúcim požadovaný vakcínový epitop (generovaným prirodzenou selekciou, mutagenézou alebo technikami reverznej genetiky) sa môžu zároveň infikovať hostitelia, ktorý umožňujú preusporiadanie
-15segmentovaných genómov. Vírusy s preusporiadaným genómom, ktoré majú tak
e ·· ·· · ·· ·
• · · • · ·· • · • ·
• · · • · • • ·
• ··· • · · • • · ·
• · • · • • ·
·· ·· ·· ··· ·· • ·
oslabený fenotyp, ako aj požadovaný epitop, sa potom môžu selektovať.
V ďalšom uskutočnení je vírusom, ktorý sa má mutovať, DNA vírus (napr.
vírus kiahní, adenovirus, bakulovírus) alebo pozitívny jednovláknový RNA vírus (napr. poliovírus). V takých prípadoch je možné použiť techniky rekombinantnej
DNA, ktoré sú v oblasti dobre známe (napr. US patent č. 4769330 v mene Paoletti,
US patent č. 4215051 v mene Smith, pričom oba sú tu kompletne zahrnuté ich citáciou).
Podľa predloženého vynálezu môže byť skonštruovaný akýkoľvek vírus vrátane, ale bez obmedzenia na čeľade uvedené v tabuľke 2 nižšie.
Tabuľka 2
Čeľade ľudských a živočíšnych vírusov
Vlastnosti vírusu
Vírusová čeľaď dsDNA obalené
Poxviridae
Irididoviridae
Herpesviridae neobalené
Adenovirídae
Papovaviridae
Hepadinaviridae ssDNA neobalené
Parvoviridae dsRNA neobalené
Reoviridae
Bimaviridae
ssRNA
obalené pozitívny-sense genóm bez DNA kroku v replikácii Togaviridae Flaviviridae Coronaviridae Vírus hepatitídy C
DNA krok v replikácii Retroviridae
negatívny-sense genóm nesegmentovaný genóm Paramyxoviridae Rhabdoviridae Filoviridae
segmentovaný genóm Orthomyxovirídae Bunyaviridae Arenaviridae
Picomaviridae
Calicivirídae neobalené
Použité skratky:
ds = dvojvláknová; ss = jednovláknová; obalené = majúce vonkajšiu lipidovú dvojvrstvu vzniknutú z hostiteľskej bunkovej membrány; pozitívny-sense genóm = pre RNA vírusy, genómy, ktoré sú zložené z nukleotidových sekvencií priamo translatovaných na ribozómoch, = pre DNA vírusy, genómy, ktoré sú zložené z nukleotidových sekvencií, ktoré sú rovnaké ako mRNA; negatívny-sense genóm = genómy, ktoré sú zložené z nukleotidových sekvencií komplementárnych s pozitívnym-sense vláknom.
- 17• ·· ·· ··· ···· · · ·· ·· · ····«· ·· • ····· · · · ·· • · · · · ·· ··· ·· ·· ····· ·
Vo výhodnom uskutočnení sa predložený vynález týka geneticky skonštruovaných influenza vírusov obsahujúcich delécie a/alebo skrátenia NS1 génového produktu. Výhodné sú najmä NS1 mutanty influenza A a B. V jednom prístupe sa časti aminokoncovej oblasti NS1 génového produktu zachovávajú, zatiaľ čo časti C-koncovej oblasti NS1 génového produktu sú deletované. Do príslušného kodónu je možné zaviesť špecifické požadované mutácie prostredníctvom inzercie, delécie alebo mutovania nukleovej kyseliny. Skrátené NS1 proteíny majú najmä aminokyseliny 1 až 60, aminokyseliny 1 až 70, aminokyseliny 1 až 80, aminokyseliny 1 až 90 (N-koncová aminokyselina je 1), a výhodne 90 aminokyselín; aminokyseliny 1 až 100; aminokyseliny 1 až 120; alebo aminokyseliny 1 až 130 a výhodne 124 aminokyselín divého typu NS1 génového produktu.
Predložený vynález sa týka aj akéhokoľvek geneticky skonštruovaného influenza vírusu, v ktorom bol NS1 génový produkt modifikovaný skrátením alebo modifikáciou NS1 proteínu, čoho následkom sú nasledujúce fenotypy mutovaných vírusov: schopnosť vírusov rásť s vysokými titrami na nie bežných substrátoch, ako napríklad 6 až 7 dňových kuracích vajciach, alebo schopnosť vírusov indukovať hostiteľskú interferónovú odpoveď. Pre influenza A vírusy tieto modifikácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: vírusy, ktoré majú skrátené NS1.
Predložený vynález zahŕňa použitie prirodzene sa vyskytujúcich influenza vírusov A alebo B, ktoré majú oslabený fenotyp, ako aj influenza vírusových kmeňov skonštruovaných tak, aby mali mutácie zodpovedné za oslabený fenotyp. Pre influenza A vírusy, tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: vírusy majúce NS1 s dĺžkou 124 aminokyselín (Norton a ďalší, 1987, Virology 156:204-213, pričom táto publikácia je tu komplet zahrnutá jej citáciou). Pre influenza B vírusy, tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: vírusy obsahujúce NS1 skracujúcu mutáciu zahŕňajúc 127 aminokyselín odvodených od N-konca (B/201) (Norton a ďalší, 1987, Virology 156:204-213, pričom táto publikácia je tu komplet zahrnutá jej citáciou), a vírusy obsahujúce NS1 skracujúcu mutáciu zahŕňajúc 90 aminokyselín odvodených od Nkonca (B/AWBY-234) (Tobita a ďalší, 1990, Virology 174:314-19, pričom táto publikácia je tu komplet zahrnutá jej citáciou). Predložený vynález zahŕňa použitie
-18·· ·· · ·· ·· ···· · · · • · · · · ·· ··· · · · · · ·· • · · · ·· ·· ·· ··· ·· · prirodzene sa vyskytujúcich analógov k NS1/38, NS1/80, NS1/124 (Egorov a ďalší, 1998, J. Virol. 72(8):6437-41), ako aj prirodzene sa vyskytujúcich mutantov A/Turkey/ORE/71, B/201 alebo B/AWBY-234.
Oslabený influenza vírus môže byť ďalej skonštruovaný tak, že exprimuje antigény iných vakcinačných kmeňov (napr. použitím reverznej genetiky alebo preusporiadania). Alternatívne môžu byť oslabené influenza vírusy skonštruované použitím reverznej genetiky alebo preusporiadavania s geneticky skonštruovanými vírusmi, aby exprimovali úplne cudzie epitopy, napri. antigény iných infekčných patogénov, nádorových antigénov alebo smerovacích antigénov. Keďže NS RNA segment je najkratší spomedzi ôsmych vírusových RNAs, je možné, že NS RNA bude tolerovať dlhšie inzercie heterológnych sekvencií ako iné vírusové gény. Navyše NS RNA segment riadi syntézu vysokých hladín proteínu v infikovaných bunkách, z čoho vyplýva, že by bol ideálnym segmentom na inzercie cudzích antigénov. Avšak podľa predloženého vynálezu môže byť na inzerciu heterológnych sekvencií použitý ktorýkoľvek z ôsmych segmentov influenza vírusov. Napríklad tam, kde je želateľná prezentácia antigénu na povrchu, je možné použiť segmenty kódujúce štrukturálne proteíny, napr. HA alebo NA.
Selekčný systém založený na reštrikcii hostiteľa
Vynález zahŕňa spôsoby selekcie vírusov, ktoré majú požadovaný fenotyp, tzn. vírusov, ktoré majú nízku alebo žiadnu IFN antagonistickú aktivitu, či už sú získané z prirodzených variantov, spontánnych variantov (tzn. variantov, ktoré sa vyvinuli počas množenia vírusu), mutovaných prirodzených variantov, vírusov s preusporiadaným genómom a/alebo geneticky skonštruovaných vírusov. Takéto vírusy môžu byť najlepšie skrínované v rozlišovacích rastových testoch, ktoré porovnávajú rast v IFN-deficientom versus IFN kompetentom hostiteľskom systéme. Vírusy, ktoré lepšie rastú v IFN-deficientných systémoch ako v IFN kompetentných systémoch sa selektujú. Výhodne sa vyberajú vírusy, ktoré rastú v titroch, ktoré sú najmenej o jeden log vyššie v IFN-deficientných systémoch ako v IFNkompetentnom systéme.
- 19Alternativne sa vírusy môžu skrínovať použitím IFN testovacích systémov, napr. systémoch založených na transkripcii v ktorých sa kontroluje expresia reporterového génu prostredníctvom IFN responzívneho promótora. Je možné merať expresiu reporterového génu v infikovaných versus neinfikovaných bunkách, aby sa identifikovali vírusy, ktoré účinne indukujú IFN odpoveď, ale ktoré nie sú schopné antagonizovať IFN odpoveď. Vo výhodnom uskutočnení sú však na výber vírusov s požadovaným fenotypom používané rozlišovacie rastové testy, pretože použitý hostiteľský systém (IFN-kompetentný versus IFN-deficientný) poskytuje príslušný selekčný tlak.
Napríklad, rast vírusu (meraný prostredníctvom titra) je možné porovnávať v rôznych bunkách, bunkových líniách alebo živočíšnych modelových systémoch, ktoré exprimujú IFN a zložky IFN odpovede, versus v bunkách, bunkových líniách alebo živočíšnych modelových systémoch, ktoré nezahŕňajú IFN alebo zložky IFN odpovede. Za týmto účelom je možné porovnávať rast vírusu v bunkovej línii, ako napríklad VERO bunkách (ktoré sú IFN deficientné) s rastom v MDCK bunkách (ktoré sú IFN-kompetentné). Alternatívne je možné IFN-deficientné bunkové línie odvodiť a založiť zo živočíšnych plemien alebo je ich možné geneticky skonštruovať tak, aby boli deficientné v INF systéme (napr. STAT1 -/- mutantné myši). Je možné merať rast vírusu v takýchto bunkových líniách v porovnaní s rastom v IFNkompetentných bunkách odvodených napríklad od divého typu zvieraťa (napr. od divého typu myší). V ešte inom uskutočnení je možné manipulovať s bunkovými líniami, ktoré sú IFN-kompetentné a je o nich známe, že podporujú rast divého typu vírusu, tak, aby boli IFN-deficientné (napr. knockoutovaním STAT1, IRF3, PKR, atď.). Je možné použiť techniky, ktoré sú dobre známe v oblasti množenia vírusov v bunkových líniách (pozri napríklad nižšie uvedené príklady). Je možné porovnať rast vírusu v štandardnej IFN kompetentnej bunkovej línii a IFN deficientnej geneticky skonštruovanej bunkovej línii.
Použité môžu byť aj živočíšne systémy. Napríklad pre influenza vírus je možné porovnávať rast v mladých IFN-deficientných emryotických vajciach, napr. približne 6 až 8 dňových, s rastom v starších IFN-kompetentných vajciach, napr. približne 10 až 12 dňových. Na tento účel je možné použiť techniky, ktoré sú dobre
-20• ·· ·· · ·· · ·· · · · · ·· · ··· • · e · · · · ·· • ··· · · · ···· · • · · · · · ·· ··· ·· ·· ··· ·· ··· známe v oblasti infekcie a množenia vo vajciach (pozri napríklad nižšie uvedené príklady). Alternatívne je možné porovnávať rast v IFN-deficientných STAT1 -/myšiach s rastom v IFN-kompetentných myšiach divého typu. Ešte inou alternatívou môže byť porovnávanie rastu v IFN-deficientných embryotických vajciach produkovaných napríklad STAT1 -/- transgénnou hydinou s rastom v IFN-kompetentných vajciach produkovaných divým typom hydiny.
Avšak namiesto geneticky manipulovaných systémov môže byť na účely skríningu použitý prechodný IFN-deficientný systém. Napríklad hostiteľský systém môže byť ošetrený zlúčeninami, ktoré inhibujú IFN produkciu a/alebo produkciu zložiek IFN odpovede (napr. chemickými látkami, protilátkami proti IFN, protilátkami proti IFN-receptoru, inhibítormi PKR, antisense molekulami a ribozýmami, atd’.). Rast vírusu v IFN-kompetentných neošetrených kontrolách môže byť porovnaný s rastom vírusu v IFN-deficientných ošetrených systémoch. S takýmito chemikáliami je napríklad možné ošetriť pred infekciou vírusov, ktoré majú byť skrínované, staršie vajcia, ktoré sú IFN-kompetentné. Rast je porovnávaný s rastom dosiahnutým v neošetrených kontrolných rovnako starých vajciach.
Spôsoby skríningu podľa vynálezu poskytujú jednoduchý a ľahký skríning na identifikáciu mutantných vírusov so zrušenou IFN antagonistickou aktivitou, prostredníctvom neschopnosti mutantného vírusu rásť v IFN-responzívnych prostrediach, v porovnaní so schopnosťou mutantného vírusu rásť v IFNdeficientných prostrediach. Spôsoby skríningu podľa vynálezu môžu byť použité aj na identifikáciu mutantných vírusov so zmenenou, ale nie zrušenou, IFN antagonistickou aktivitou prostredníctvom merania schopnosti mutantného vírusu rásť tak v IFN-responzívnom prostredí, napr. desaťdňových embryotických vajciach alebo MDCK bunkách, ako aj v IFN-deficientnom prostredí, napr. 6- až 7-dňových embryotických vajciach alebo Vero bunkách. Napríklad influenza vírusy, ktoré majú najmenej o jeden log nižšie titre v 10-dňových vajciach v porovnaní s titrami v 6- až 7-dňových vajciach, budú považované za vírusy s poškodenou schopnosťou inhibovať IFN odpoveď. V inom príklade sú influenza vírusy, ktoré majú najmenej o jeden log nižší titer v 12-dňových vajciach (ktoré vykazujú vysokú IFN odpoveď) v porovnaní s titrom v 10-dňových vajciach (ktoré vykazujú miernu IFN odpoveď)
-21 • ·· ·· ··· ·· · · · · ·· ·· ······ ·· • ··· · · · · · ·· • · · · · ·· ··· ·· ·· ····· považované za vírusy s čiastočne poškodenou schopnosťou antagonizovať IFN odpoveď a sú považované za atraktívnych vakcinových kandidátov.
Spôsoby selekcie podľa vynálezu zahŕňajú aj identifikáciu tých mutantných vírusov, ktoré indukujú IFN odpovede. V súlade so selekčnými metódami podľa vynálezu je možné indukciu IFN odpovedí merať testovaním úrovne IFN expresie alebo úrovne expresie cieľových génov alebo reportérových génov indukovanej prostredníctvom IFN po infekcii s mutantnými vírusmi alebo aktiváciou transaktivátorov podieľajúcich sa na IFN expresii a/alebo IFN odpovedi.
V ešte inom uskutočnení selekčných systémov podľa vynálezu je možné stanoviť indukciu IFN odpovedí meraním stavu fosforylácie zložiek IFN dráhy po infekcii s testovaným mutantným vírusom, napr. IRF-3, ktorý je fosforylovaný ako odpoveď na dvojvlákonú RNA. Ako odpoveď na IFN typu I sa rýchlo fosforylujú na tyrozínoch Jak1 kináza a TyK2 kináza, podjednotky IFN receptora STAT1 a STAT2. Takže na stanovenie toho, či mutantný vírus indukuje IFN odpovede, sa bunky, ako napríklad 293 bunky, infikujú s testovaným mutantným vírusom a po infekcii sa lyžujú. Z infikovaných bunkových lyzátov sa imunoprecipitujú zložky IFN dráhy, ako napríklad Jak1 kináza alebo TyK2 kináza, použitím špecifických polyklonálnych sér alebo protilátok, a stav tyrozínovej fosforylácie kinázy sa stanoví imunoblotovým testom s anti-fosfotyrozínovou protilátkou (pozri napr. Krishnan a ďalší, 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305). Zosilnený fosforylovaný stav akejkoľvek zložky IFN dráhy po infekcii s mutantným vírusom by indikoval, že mutantný vírus indukoval IFN odpovede.
V ešte inom uskutočnení zahŕňajú selekčné systémy podľa vynálezu meranie schopnosti viazať špecifické DNA sekvencie alebo schopnosti premiestňovať transkripčné faktory indukovanej ako odpoveď na vírusovú infekciu, napr. IRF3, STAT1, STAT2, atď. Ako odpoveď na IFN typu I sú fosforylované a premiestňované z cytoplazmy do jadra najmä STAT1 a STAT2. Schopnosť viazať špecifické DNA sekvencie alebo premiestňovať transkripčné faktory je možné merať technikami, ktoré sú pre priemerného odborníka v oblasti známe, napr. testom posunu elektromobility v géli, bunkovým farbením atď.
V ešte inom uskutočnení selekčných systémov podľa vynálezu je možné stanoviť indukciu IFN odpovedí meraním IFN-závislej transkripčnej aktivácie po infekcii s testovaným mutantným vírusom. V tomto uskutočnení je možné analyzovať expresiu génov, o ktorých je známe, že sú indukované prostredníctvom IFN, napr. Mx, PKR, 2-5-oligoadenylátsyntetázy, hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) triedy I, atď., technikami známymi pre priemerného odborníka v oblasti (napr. northern blotmi, western blotmi, PCR, atď.). Alternatívne sa skonštruujú testovacie bunky, ako napríklad ľudské embryotické obličkové bunky alebo bunky ľudského osteogenického sarkómu, tak, aby prechodne alebo konštitutívne exprimovali reporterové gény, ako napríklad luciferázový reporterový gén alebo chloramfenikol transferázový (CAT) reporterový gén, pod kontrolou interferónom stimulovaného responzívneho elementu, ako napríklad IFNstimulovaného promótora ISG-54K génu (Bluyssen a ďalší, 1994, Eur. J. Biochem. 220:395-402). Bunky sa infikujú s testovacím mutantným vírusom a porovnáva sa úroveň expresie reporterového génu s úrovňou expresie génu v neinfikovaných bunkách alebo v bunkách infikovaných s divým typom vírusu. Zo zvýšenia úrovne expresie reporterového génu po infekcii s testovaným vírusom by vyplývalo, že testovaný mutantný vírus indukuje IFN odpoveď.
V ešte inom uskutočnení zahŕňajú selekčné systémy podľa vynálezu meranie IFN indukcie prostredníctvom stanovenia toho, či extrakt z buniek alebo vajec infikovaných s testovaným mutantným vírusom je schopný poskytnúť ochrannú aktivitu proti vírusovej infekcii. Konkrétnejšie, skupiny 10-dňových embryotických kuracích vajec sa infikujú s testovaným mutantným vírusom alebo vírusom divého typu. Približne 15 až 20 hodín po infekcii sa odoberie alantoická tekutina a testuje sa na IFN aktivitu stanovením najvyššieho riedenia s ochrannou aktivitou proti VSV infekcii v tkanivovej kultúre buniek, ako napríklad v CEF bunkách.
Množenie vírusu v interferón deficientných pestovacích substrátoch
Vynález zahŕňa aj spôsoby a IFN-deficientné substráty na pestovanie a izoláciu prirodzene sa vyskytujúcich alebo skonštruovaných mutantných vírusov, ktoré majú zmenenú IFN antagonistickú aktivitu. IFN-deficientné substráty, ktoré
-23môžu byť použité na podporu rastu oslabených mutantných vírusov zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na prirodzene sa vyskytujúce bunky, bunkové línie, živočíchy alebo embryotické vajcia, ktoré sú IFN deficientné, napr. Vero bunky, mladé embryotické vajcia; rekombinantné bunky alebo bunkové línie, ktoré sú skonštruované tak, aby boli IFN-deficientné, napr. IFN-deficientné bunkové línie odvodené od STAT1 knockoutových myší alebo iných podobne skonštruovaných transgénnych živočíchov; embryotické vajcia získané od IFN deficientných vtákov, najmä hydiny (napr. kuriat, kačíc, moriek), vrátane hydiny, ktorá je šľachtená tak, aby bola IFN-deficientná alebo transgénnych vtákov (napr. STAT1 knockoutov). Alternatívne môžu byť hostiteľský systém, bunky, bunkové línie, vajcia alebo zvieratá geneticky skonštruované tak, aby exprimovali transgény kódujúce inhibítory IFN systému, napr. dominantne negatívne mutanty ako STAT1, ktorému chýba DNA viažuca doména, antisense RNA, ribozýmy, inhibítory produkcie IFN, inhibítory IFN signalizácie a/alebo inhibítory antivírusových génov indukovaných prostredníctvom IFN. Treba zdôrazniť, že živočíchy, ktoré sú šľachtené alebo geneticky konštruované tak, aby boli IFN deficientné, budú do istej mieri imunologický oslabené, a mali by byť udržiavané v kontrolovanom prostredí bez choroboplodných zárodkov. Takže príslušné merania (vrátane použitia antibiotík v strave) by mali byť uskutočňované tak, aby sa obmedzilo riziko vystavenia transgénnych IFN deficientných živočíchov infekčným agensom, ako napríklad hejná šľachtených sliepok, kačíc, moriek, atď. Alternatívne je možné ošetriť hostiteľský systém, napr. bunky, bunkové línie, vajcia alebo živočíchov, so zlúčeninou, ktorá inhibuje IFN produkciu a/alebo IFN dráhu, napr. liečivami, protilátkami, antisense molekulami, ribozýmovými molekulami, ktorých cieľom je STAT1 gén a/alebo antivírusovými génmi indukovanými prostredníctvom IFN.
V súlade s predloženým vynálezom zahŕňajú nezrelé embryotické kuracie vajcia, ktoré sú prirodzene mladšie ako desaťdňové, výhodne šesť až deväťdňové vajcia; a vajcia, ktoré umelo napodobujú nezrelé vajcia mladšie ako desať dni, následkom zmien v inkubačných teplotách; ošetrenia liečivami; alebo následkom iných zmien, ktoré vedú k retardovanému vývinu vajec, takže IFN systém vajca nie je tak kompletne vyvinutý ako systém v 10- až 12-dňových vajciach.
-24Prirodzené IFN deficientné substráty
V jednom uskutočnení sa predložený vynález týka pestovania prirodzene sa vyskytujúcich a skonštruovaných mutantných vírusov v nezvyčajných substrátoch, ako napríklad v nezrelých embryotických vajciach, ktoré ešte nemajú vyvinutý IFN systém. Nezrelé embryotické vajcia sa normálne nepoužívajú na pestovanie vírusu, pretože sú krehké a majú menší alantoický objem. Predložený vynález zahŕňa pestovanie mutantných vírusov v embryotických vajciach mladších ako 10 dní; výhodne pestovanie mutantného vírusu v 8-dňových embryotických vajciac a najvýhodnejšie v 6- až 8-dňových vajciach.
Geneticky skonštruované IFN deficientné substráty
Predložený vynález sa týka spôsobov pestovania a izolácie mutovaných vírusov, ktoré majú zmenenú IFN antagonistickú aktivitu v geneticky skonštruovanom IFN deficientnom substráte. Predložený vynález zahŕňa transgénne vtáky, v ktorých je mutovaný gén potrebný pre IFN systém, napr. STAT1, ktoré môžu znášať IFN deficientné vajcia. Predložený vynález ďalej zahŕňa transgénne vtáky, ktoré exprimuju dominantne negatívne transkripčné faktory, napr. STAT1 bez DNA viažucej domény, ribozýmy, antisense RNA, inhibítory IFN produkcie, inhibítory IFN signalizácie a inhibítory antivírusových génov indukovaných ako odpoveď na IFN. Výhodou použitia vajec od IFN-deficientných transgénnych vtákov je to, že je možné na pestovanie vírusu použiť bežné 10 dňové vajcia, ktoré sú stabilnejšie a majú väčší objem, keďže sú väčšie. V ešte inom uskutočnení je možné geneticky skonštruovať bunkové línie tak, aby boli IFN deficientné. Predložený vynález zahŕňa bunkové línie, v ktorých je mutovaný gén esenciálny pre IFN syntézu, IFN dráhu a/alebo antivírusový gén (gény) indukované prostredníctvom IFN, napr. STAT1.
Vynález poskytuje rekombinantné bunkové línie alebo živočíchy, najmä vtáky, v ktorých je jeden alebo viacero génov esenciálnych pre IFN dráhu, napr.
gén interferónového receptora, STAT1, atď., prerušený, tzn. je knockoutovaný.
Rekombinantným živočíchom môže byť akýkoľvek živočích, ale vo výhodnom uskutočnení je ním vták, napr. kurča, morka, sliepka, kačka atď. (pozri napr. Sang,
1994, Trends Biotechnol. 12:415; Perry a ďalší, 1993, Transgenic Res. 2:125;
-25·· ·· ··· • · · · ·· ·· • · · · · ·· ··· · · · · · ·· • · · · ·· ·· ·· ·····
Stern, C.D., 1996, Curr Top Microbiol Immunol 212:195-206; a Shuman, 1991, Experientia 47: 897, ako zhrnutie týkajúce sa produkcie transgénnych vtákov, pričom každá z uvedených publikácii je tu komplet zahrnutá jej citáciou. Takáto bunková línia alebo živočích môžu byť generované akoukoľvek v oblasti známou metódou na prerušenie génu na chromozóme bunky alebo živočícha. Takéto techniky zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na pronukleárnu mikroinjekciu (Hope & Wagner, 1989, US patent č. 4873191); retrovírusom sprostredkovaný génový transfer do zárodočných línií (Van der Putten a ďalší, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); zacielenie génu v embryotických kmeňových bunkách (Thompson a ďalší, 1989, Celí 56:313); elektroporáciu embryí (Lo, 1983, Mol Celí. Biol. 3:1803); spermaticky sprostredkovaný génový transfer (Lavitrano a ďalší, 1989, Celí 57:717); atď. Takéto techniky sú zhrnuté v Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171, pričom táto publikácia je tu komplet zahrnutá jej citáciou.
STAT1 knockoutového živočícha je možné vyprodukovať najmä homologickou rekombináciou medzi STAT1 génom v jeho chromozóme a exogénnym STAT1 génom, ktorý bol upravený na biologicky neaktívny (výhodne zavedením heterológnej sekvencie, napr. génu antibiotikovej rezistencie). Spôsoby homologickej rekombinácie na prerušenie génu v myšacom genóme sú opísané napríklad v Capechi (1989, Science 244:1288) a Mansour a ďalší (1988, Náture 336:348).
V stručnosti, celý alebo časť STAT1 genomického klonu sa izoluje z genomickej DNA z rovnakých druhov ako knockoutovaná bunka alebo živočích. STAT1 genomický kloň je možné izolovať akýmkoľvek spôsobom na izolovanie genomických klonov známym v oblasti (napr. prehľadávanie genomickej knižnice sondou odvodenou od STAT1 sekvencie, ako napríklad od sekvencií poskytnutých v Meraz a ďalší, 1996, Celí 84:431, Durbin a ďalší, 1996, Celí 84:443 a tam citované publikácie). Keď sa izoluje genomický kloň, celý, alebo jeho časť sa zavedie do rekombinantného vektora. Výhodne časť klonu zavádzaná do vektora obsahuje najmenej časť exónu STAT1 génu, tzn. obsahuje STAT1 proteín kódujúcu sekvenciu. Potom sa do STAT1 génového exónu zavedie sekvencia, ktorá nie je
-26• ···· ·· · · ·· • · · ·· • ··· · ·· • · ·· ··· ···· homologická so STAT1 sekvenciou, výhodne pozitívny selekčný marker, ako napríklad gén kódujúci antibiotikovú rezistenciu. Selekčný marker je výhodne operačne spojený s promótorom, výhodnejšie s konštitutívnym promótorom. Nehomologická sekvencia je zavádzaná hocikde do STAT1 kódujúcej sekvencie, kde bude narušovať STAT1 aktivitu, napr. do polohy, pre ktorú sa demonštrovalo, že v nej bodové alebo iné mutácie inaktivujú STATÍ proteínovú funkciu. Napríklad, ale bez obmedzenia, nehomologická sekvencia môže byť zavedená do sekvencie kódujúcej časť STATÍ proteínu, ktorá zahŕňa celú alebo časť kinázovej domény (napr. nukleotidová sekvencia kódujúca najmenej 50, 100, 150, 200 alebo 250 aminokyselín kinázovej domény).
Pozitívnym selektovateľným markerom je výhodne gén neomycínovej rezistencie (neo gén) alebo gén hygromycínovej rezistencie (hygro gén). Promótorom môže byť akýkoľvek promótor známy v oblasti; napríklad promótor fosfoglycerát kinázy (PGK) (Adra a ďalší, 1987, Gene 60:65-74), Polil promótor (Soriano a ďalší, 1991, Celí 64:693-701) alebo MC1 promótor, ktorý je syntetickým promótorom skonštruovaným na expresiu v zárodočných bunkách odvodených od embrya (Thomas & Capecchi, 1987, Celí 51:503-512). Použitie selektovateľného markera, ako napríklad génu antibiotikovej rezistencie, umožňuje selekciu buniek, do ktorých bol zavedený cieľový vektor (napríklad expresia neo génového produktu poskytuje rezistenciu voči G418 a expresia hygro génového produktu poskytuje rezistenciu voči hygromycínu).
Vo výhodnom uskutočnení je mimo STATÍ genomického klonového inzertu zavedený negatívny selektovateľný marker na paralelný selekčný krok na indikáciu homologickej, na rozdiel od nehomologickej, rekombinácie vektora. Takýmto negatívnym selektovateľným markerom môže byť napríklad gén HSV tymidín kinázy (HSV-ŕk), ktorého expresia robí bunky citlivými voči ganciklovírusu. Negatívny selektovateľný marker je výhodne pod kontrolou promótora, ako napríklad, ale bez obmedzenia na PGK promótora, Polil promótora alebo MC1 promótora.
Keď nastane homologická rekombinácia, časti vektora, ktoré sú homologické so STATÍ génom, ako aj nehomologický inzert vo vnútri STATÍ génových sekvencií, sa začlenia do STATÍ génu v chromozóme a zvyšok vektora sa stratí.
-27• ·· ·· · ·· · ·· · · · ·· · · ·· ······ · · · • ··· ··· · · · · · • ··· · · · ··· ·· ·· ··· ·· ···
Takže, keďže negatívny selektovateľný marker je mimo oblasti homológie so STAT1 génom, bunky, v ktorých nastala homologická rekombinácia (alebo v ich predkovi), nebudú obsahovať negatívny selektovateľný marker. Napríklad, ak je negatívnym selektovateľným markerom HSV-ŕk gén, bunky, v ktorých nastala homologická rekombinácia, nebudú exprimovať tymidín kinázu a prežijú vystavenie ganciklovírusu. Tento postup umožňuje selekciu buniek, v ktorých prebehla homologická rekombinácia, od buniek, v ktorých neprebehla homologická rekombinácia, a v ktorých je pravdepodobné, že do genómu bol zabudovaný aj negatívny selektovateľný marker spolu so STAT1 sekvenciami a pozitívnym selektovateľným markerom. Takže bunky, v ktorých prebehla nehomologická expresia, budú najpravdepodobnejšie exprimovať tymidín kinázu a budú citlivé voči ganciklovírusu.
Keď sa pripraví zameriavací vektor, linearizuje sa reštrikčným enzýmom, ktorý má len jedno štiepne miesto v zameriavacom vektore, a linearizovaný vektor sa zavedie do zárodočnej bunky odvodenej od embrya (ES) (Gossler a ďalší, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069) akoukoľvek metódou známou v oblasti, napríklad elektroporáciou. Ak zameriavací vektor obsahuje pozitívny selektovateľný marker a negatívny selektovateľný marker na paralelenú selekciu, ES bunky, v ktorých nastala homologická rekombinácia, sa môžu selektovať inkubovaním v selektívnom médiu. Napríklad, ak sú selektovateľnými markermi gén neo rezistencie a HSV-ŕk gén, bunky sa vystavia G418 (napr. približne 300 pg/ml) a ganciklovírusu (napr. približne 2 μΜ).
Na potvrdenie toho, že prerušené STAT1 sekvencie sa homologicky rekombinovali do STAT1 génu v genóme ES buniek, je možné použiť akúkoľvek techniku známu v oblasti genotypingu, napríklad, ale bez obmedzenia na Southern blot analýzu alebo polymerázovú reťazovú reakciu. Pretože reštrikčná mapa STAT1 genomického klonu je známa a sekvencia STAT1 kódujúcej sekvencie je známa (pozri Meraz a ďalší, 1996, Celí 84:431; Durbin a ďalší, 1996, Celí 84:443-450, a všetky tam uvedené citácie), je možné stanoviť veľkosť konkrétneho reštrikčného fragmentu alebo PCR amplifikačného produktu generovaného z DNA tak
-28• ·· ·· ··· ·· · · · · ·· ·· ··· ····· • ··· · · · · ·· · • · · · · ·· ··· ·· ·· ····· prerušených, ako aj neprerušených alel. Takže testovaním reštrikčných fragmentov alebo PCR produktu, ktorých veľkosť sa líši medzi prerušeným a neprerušeným STAT1 génom, je možné stanoviť, či nastala homologická rekombinácia s prerušeným STAT1 génom.
ES bunky s prerušeným STAT1 lokusom sa môžu zaviesť do blastocytov mikroinjekciou a potom je možné implantovať blastocyty do maternice pseudogravidných myši použitím rutinných techník. Živočíchy, ktoré sa vyvinú z implantovaných blastocytov sú chimérne v prerušenej alele. Chimérni samčekovia sa môžu krížiť so samičkami, a tento kríženec môže byť navrhnutý tak, aby zárodočný prenos alely bol spojený s prenosom určitej farby srsti. Zárodočný prenos alely sa môže potvrdiť Southern blotingom alebo PCR analýzou, ako je opísané vyššie, genomickej DNA izolovanej z tkanivových vzoriek.
Prechodné IFN deficientné substráty
Bunky, bunkové línie, živočíchy alebo vajcia je možné vopred ošetriť so zlúčeninami, ktoré inhibujú IFN systém. Podľa predloženého vynálezu je možné na predošetrenie hostiteľov použiť zlúčeniny, ktoré inhibujú syntézu IFN alebo aktivitu alebo expresiu zložiek IFN systému, napr. zlúčeniny, ktoré inhibujú syntézu IFN, aktivitu IFN, IFN receptor, iné ciele v IFN signálnej prenosnej dráhe, alebo inhibujú aktivitu antivírusových génov indukovaný prostredníctvom IFN. Príklady zlúčenín, ktoré môžu byť použité zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, molekuly nukleovej kyseliny, protilátky, peptidy, antagonisty IFN receptora, inhibítory STAT1 dráhy, inhibítory PKR, atď. V súlade s predloženým vynálezom zahŕňajú molekuly nukleovej kyseliny antisense molekuly, ribozýmy a trojzávitnicové molekuly, ktorých cieľom sú gény kódujúce esenciálne zložky IFN systému, napr. STAT1. Molekuly nukleovej kyseliny zahŕňajú aj nukleotidy kódujúce dominantne negatívne mutanty zložiek IFN systému; napr. pred infekciou s vírusovým mutantom je možné transfekovať bunky s DNA kódujúcou skrátený, signalizačné nekompetentný mutant IFN receptora.
Dominantne-negatívnymi mutantnami, ktoré môžu byť použité podľa predloženého vynálezu na inhibiciu IFN dráhy, zahŕňajú kináza deficientné verzie
-29• ·· ·· · ·· ···· ···· · · · • ··· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ··
Jak1, TyK2 alebo transkripčné faktory, ktorým chýbajú DNA viažuce domény STAT1 a STAT2 (pozri napr. Krishnan a ďalší, 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298305).
Vakcinačné prostriedky
Vynález zahŕňa vakcinačné prostriedky obsahujúce oslabené negatívne jednovláknové RNA vírusy, ktoré majú poškodenú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď, a vhodný excipient. Vírus použitý vo vakcinačnom prostriedku môže byť vybraný z prirodzene sa vyskytujúcich mutantov alebo variantov, mutovaných vírusov alebo geneticky skonštruovaných vírusov. Oslabené kmene segmentovaných RNA vírusov je možné generovať aj technikami preusporiadavania alebo použitím kombinácie prístupu reverznej genetiky a techník preusporiadavania. Prirodzene sa vyskytujúce varianty zahŕňajú vírusy izolované z prírody, ako aj spontánne sa vyskytujúce varianty generované počas množenia vírusu, ktoré majú poškodenú schopnosť antagonizovať bunkovú IFN odpoveď. Oslabený vírus môže byť samotný použitý ako účinná zložka vakcinačného prostriedku. Alternatívne je možné použiť oslabený vírus ako vektor alebo kostru rekombinantné produkovaných vakcín. Na tento účel je možné použiť rekombinantné techniky, ako napríklad reverznú genetiku (alebo pre segmentované vírusy kombinácie reverznej genetiky a techník preusporiadavania) na skonštruovanie mutácií alebo na zavedenie cudzích antigénov do oslabeného vírusu používaného vo vakcinačnom prostriedku. Týmto spôsobom je možné navrhnúť vakcíny na imunizáciu proti kmeňovým variantom alebo alternatívne proti úplne iným infekčným činidlám alebo antigénom ochorení.
V skutočnosti je možné zaviesť do vírusov podľa vynálezu na použitie vo vakcínach akúkoľvek heterológnu génovú sekvenciu. Výhodne je možné exprimovať vo vírusoch celé alebo časti epitopov, ktoré indukujú ochrannú imunitnú odpoveď voči ktorémukoľvek z rôznych patogénov alebo antigénov, ktoré sa viažu na neutralizujúce protilátky. Napríklad, heterológne génové sekvencie, ktoré je možné zaviesť do vírusov podľa vynálezu na použitie vo vakcínach, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na epitopy vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV), ako napríklad
-30• ···· ·· · · ·· · • e · ·· • ··· · ·· • · ·· ··· ···· · gp120; povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBsAg); glykoproteíny herpes vírusu (napr. gD, gE); VP1 poliovírusu; antigénové determinanty nevírusových patogénov, ako napríklad baktérií a parazitov, pričom bolo vymenovaných len zopár. V inom uskutočnení je možné exprimovať celé alebo časti imunoglobulínových génov. Napríklad, do vírusov podľa vynálezu je možné zaviesť variabilné oblasti antiidiotypických imunoglobulinov, ktoré napodobujú takéto epitopy. V ešte inom uskutočnení je možné exprimovať antigény asociované s nádorom.
Je možné pripraviť buď živú rekombinantnú vírusovú vakcínu, alebo inaktivovanú rekombinantnú vírusovú vakcínu. Výhodná môže byť živá vakcína, pretože jej rozmnožovanie v hostiteľovi vedie k pretrvávajúcim stimulom podobného druhu a rozsahu ako pri prirodzených infekciách, a preto poskytuje podstatnú, dlhotrvajúcu imunitu. Produkcia takýchto živých rekombinantných vírusových vakcínových prostriedkov sa môže uskutočňovať použitím bežných metód zahŕňajúcich množenie vírusu v bunkovej kultúre alebo v alantoickej dutine kuracieho embrya a následne purifikáciu.
Vakcínové prostriedky môžu zahŕňať geneticky skonštruované negatívne jednovláknové RNA vírusy, ktoré majú mutácie v NS1 alebo analogickom géne, vrátane ale bez obmedzenia na influenza mutanty opísané nižšie v príkladoch so skráteným NS1. Môžu byť pripravené aj použitím prirodzených variantov, ako napríklad A/turkey/Ore/71 prirodzeného variantu influenza A, alebo B/201 a B/AWBY-234, ktoré sú prirodzenými variantami influenza B. Keď sa pripravuje vo forme živej vírusovej vakcíny, mal by byť použitý rozsah od približne 104 pfu do približne 5x106 pfu na dávku.
Na podanie vyššie opísaných vakcínových prostriedkov je možné použiť mnohé spôsoby, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na intranazálne, intratracheálne, orálne, intradermálne, intramuskulárne, intraperitoneálne, intravenózne a subkutánne podanie. Výhodné môže byť podávať vírusový vakcinačný prostriedok prirodzenou cestou infekcie patogénu, pre ktorý je vakcína navrhnutá, alebo prirodzenou cestou infekcie rodičovského oslabeného vírusu. Keď sa použije živý influenza vírusový vakcínový prostriedok, môže byť výhodné podávať prostriedok prirodzenou cestou pre infekciu influenza vírusom. Výhodné môže byť
-31 • · · · · · 1 ··· ·· ·· ··· ·· využiť schopnosť influenza vírusu indukovať masívnu sekrečnú a bunkovú imunitnú odpoveď. Napríklad infekcia respiračného traktu influenza vírusmi môže indukovať silnú sekrečnú imunitnú odpoveď napríklad v urogenitálnom systéme spolu so súčasnou ochranou proti konkrétnemu agensu, ktorý spôsobuje chorobu.
Vakcína podľa predloženého vynálezu obsahujúca 104 až 5x106 pfu mutantných vírusov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou, by mohla byť podávaná raz. Alternatívne, vakcína podľa predloženého vynálezu obsahujúca 104 až 5x106 pfu mutantných vírusov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou, by mohla byť podávaná dvakrát alebo trikrát s 2 až 6 mesačnými intervalmi medzi dávkami. Alternatívne, vakcína podľa predloženého vynálezu obsahujúca 104 až 5x106 pfu mutantných vírusov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou, by mohla byť podávaná tak často ako je potrebné, živočíchovi, výhodne cicavcovi a najvýhodnejšie človeku.
Farmaceutické prostriedky
Predložený vynález zahŕňa farmaceutické prostriedky obsahujúce mutantné vírusy so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou na použitie ako anti-vírusové činidlá alebo anti-nádorové činidlá alebo ako činidlá proti IFN-senzitívnym ochoreniam. Farmaceutické prostriedky majú využitie ako antivirusové profylaktické činidlá a môžu byť podávané jedincom, u ktorých je riziko, že budú infikovaní, alebo, ktorí sú podozriví z toho, že boli vystavený vírusu. Napríklad, v prípade, že by dieťa prišlo domov zo školy, kde bolo vystavené niekoľkým spolužiakom s chrípkou, rodič by podal antivírusový farmaceutický prostriedok podľa vynálezu sebe, dieťaťu a ďalším členom rodiny, aby zabránil vírusovej infekcii a následnému ochoreniu. Ošetrený môžu byť aj ľudia, ktorí cestujú do častí sveta, kde prevažujú určité infekčné ochorenia (napr. hepatitída A, malária, atď.).
Alternatívne môžu byť farmaceutické prostriedky používané na liečbu nádorov alebo na prevenciu vytvárania nádorov, napr. u pacientov, ktorí majú rakovinu alebo u pacientov s vysokým rizikom vývinu neoplaziem alebo rakoviny.
Napríklad pacienti s rakovinou môžu byť liečený, aby sa predišlo ďalšej tumorogenéze. Alternatívne je možné ošetriť jedincov, ktorí boli alebo ktorí sú
-32• ·· ·· ··· ···· ······· ··· »···· • ··· · · · · · · · • · · · ·· · ··· ·· ·· ····· · podozriví, že boli vystavený karcinogénom. Možné je ošetrovať jedincov, ktorí sa zúčastnili na enviromentálnom čistení, a mohli byť vystavený znečisťovacím látkam (napr. azbestu). Alternatívne je možné jedincov, o ktorých sa predpokladá, že budú vystavený žiareniu, ošetriť pred vystavením a po vystavení (napr. pacienti, ktorí sú vystavovaný vysokým dávkam žiarenia, alebo ktorí musia brať karcinogénne lieky).
Použitie oslabených vírusov podľa vynálezu ako protinádorových činidiel je založené na objave prihlasovateľov, že oslabený influenza vírusový mutant obsahujúci deléciu vo svojom IFN-antagonistickom géne je schopný redukovať vytváranie nádoru v myšiach. Protinádorové vlastnosti vírusov podľa vynálezu môžu aspoň čiastočne súvisieť s ich schopnosťou indukovať IFN a IFN odpovede. Alternatívne môžu protinádorové vlastnosti oslabených vírusov podľa vynálezu súvisieť s ich schopnosťou špecificky rásť a usmrcovať nádorové bunky, z ktorých o mnohých je známe, že sú deficientné v IFN systéme. Bez ohľadu na molekulový mechanizmus (mechanizmy) zodpovedný za protinádorové vlastnosti, môžu byť oslabené vírusy podľa vynálezu použité na liečbu nádorov alebo na predchádzanie vytváraniu nádorov.
Predložený vynález ďalej zahŕňa mutantné vírusy so zmeneným IFNantagonistickým fenotypom, ktoré sú nasmerované do špecifických orgánov, tkanív a/alebo buniek v tele, aby indukovali lokálne terapeutické alebo profýlaktické účinky. Výhodou takéhoto prístupu je, že IFN-indukujúce vírusy podľa vynálezu sú nasmerované do špecifických miest, napr. do lokality nádora, aby sa IFN indukoval miestne špecifickým spôsobom, aby sa získal liečebný účinok, a nie aby sa indukoval IFN systémovo, čo by mohlo mať toxické účinky.
Mutantné IFN-indukujúce vírusy podľa vynálezu môžu byť skonštruované použitím tu opísaných spôsobov na expresiu proteínov alebo peptidov, ktoré by smerovali vírusy na konkrétne miesto. Vo výhodnom uskutočnení by boli IFNindukujúce vírusy nasmerované na miesta nádorov. V takom uskutočnení môžu byť mutantné vírusy skonštruované tak, aby exprimovali antigénové kombinačné miesto protilátky, ktorá rozoznáva nádorový špecifický antigén, a tak by bol IFN-indukujúci vírus smerovaný do nádora. V ešte inom uskutočnení, v ktorom cieľový nádor exprimuje hormónový receptor, ako napríklad nádory prsníka alebo vaječníkov,
-33ktoré exprimujú estrogénové receptory, môže byť IFN-indukujúci vírus skonštruovaný tak, aby exprimoval príslušný hormón. V ešte inom uskutočnení, v ktorom cieľový nádor exprimuje receptor rastového faktora, napr. VEGF, EGF alebo PDGF, môže byť IFN-indukujúci vírus skonštruovaný tak, aby exprimoval príslušný rastový faktor alebo jeho časť (časti). Takže v súlade s vynálezom môžu byť IFN-indukujúce vírusy skonštruované tak, aby exprimovali akýkoľvek cieľový génový produkt, vrátane peptidov, proteínov, ako napríklad enzýmov, hormónov, rastových faktorov, antigénov alebo protilátok, ktorý bude slúžiť na nasmerovanie vírusu na miesto, kde je potrebný antivírusový, antibakteriálny, antimikrobiálny alebo protinádorový účinok.
Spôsoby podávania zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na intradermálny, intramuskulárny, intraperitoneálny, intravenózny, subkutánny, intranazálny, epidurálny a orálny spôsob. Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu môžu byť podávané akýmkoľvek bežným spôsobom, napríklad infúziou alebo bolusovou injekciou, absorpciou cez epiteliálne alebo mukokutánne náplaste (napr. sliznicou úst, rekta alebo tenkého čreva, atď.) a môžu byť podávané spolu s inými biologicky účinnými činidlami. Podávanie môže byť systémové alebo lokálne. Okrem toho vo výhodnom uskutočnení môže byť želateľné podávať farmaceutické prostriedky podľa vynálezu akýmkoľvek vhodným spôsobom do pľúc. Použité môže byť aj pulmonárne podávania, napr. použitím inhalátora alebo nebulizéra a prostriedkom s činidlom vytvárajúcim aerosól.
V špecifickom uskutočnení môže byť želateľné podávať farmaceutické prostriedky podľa vynálezu lokálne, do oblasti, kde je potrebná liečba. To je možné dosiahnuť napríklad, ale bez obmedzenia, lokálnou infúziou počas chirurgického zákroku, miestnou aplikáciou, napr. spolu s obviazaním rany po chirurgickom zákroku, injekciou, cez kateter, čípkom alebo prostredníctvom implantátu, ktorý je porózny, neporózny alebo zo želatínového materiálu vrátane membrán, ako sialastikových membrán, alebo vlákien. V jednom uskutočnení sa podanie môže udiať priamou injekciou do miesta (alebo pôvodného miesta) malígneho nádora alebo do miesta neoplastického alebo preneoplastického tkaniva.
-34• ·· ·· · ·· ··· ···· · · · • ··· · · · · · · · • · · · · · · ·· ·· ·· ··· ·· ·
V ešte inom uskutočnení sa farmaceutický prostriedok môže podávať systémom riadeného uvoľňovania. V jednom uskutočnení môže byť použitá pumpa (pozri Langer, vyššie; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald a ďalší, 1980, Surgery 88:507; Saudek a ďalší, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). V inom uskutočnení môžu byť použité polymérne materiály (pozri Medical Applications of Controlled Release, Langer a Wise (vyd.), CRC Preš., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Biovailability, Drug Product Design and Performance, Smolen a Balí (vyd.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; pozri aj Leby a ďalší, 1985, Science 228:190; Durin a ďalší, 1989, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard a ďalší, 1989, J. Neurosurg. 71:105). V ešte inom uskutočnení je možné umiestniť systém na riadené uvoľňovanie do blízkosti cieľa prostriedku, tzn. do pľúc, a tak je potrebná len čas systémovej dávky (pozri napr. Goodson, 1984, v Medical Applications of Controlled Release, vyššie, zv. 2, str. 115-138). Iné systémy na riadené uvoľňovanie sú diskutované v zhrnutí od Langer (1990, Science 249: 1527-1533).
Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu obsahujú terapeuticky účinné množstvo oslabeného vírusu a farmaceutický prijateľný nosič. V konkrétnom uskutočnení znamená výraz farmaceutický prijateľný to, že látka bola schválená regulérnou inštitúciou federálnej alebo národnej vlády alebo je uvedená v US Farmakopei alebo v inej všeobecne uznávanej farmakopei na použitie pre živočíchy a najmä pre ľudí. Výraz nosič znamená riedidlo, adjuvans, excipient alebo vehikulum, s ktorým sa môže farmaceutický prostriedok podávať. Ako kvapalné nosiče, najmä pre injekčné podávané roztoky je možné využiť aj fyziologické roztoky a vodnú dextrózu a glycerolové roztoky. Vhodné farmaceutické excipienty zahŕňajú škrob, glukózu, laktózu, sacharózu, želatínu, slad, ryžu, fluór, kriedu, silikagél, stearát sodný, glycerol monostearát, mastenec, chlorid sodný, sušené odstredené mlieko, glycerol, propylén, glykol, voda, etanol a podobne. Tieto prostriedky môžu byť formulované ako čipky. Orálne prostriedky môžu obsahovať štandardné nosiče, ako farmaceutické stupne manitolu, laktózu, škrob, stearát horečnatý, sacharín sodný, celulózu, uhličitan horečnatý, atď. Príklady vhodných farmaceutických nosičov sú opísané v Remington’s Pharmaceutical Sciences od
-35• ·· ·· ··· ···· ······· ··· · · ··· * ··· · · · · · · · • · · · ·· · ··· ·· ·· ····· ·
E.W. Martina. Takéto prostriedky budú obsahovať terapeuticky účinné množstvo liečiva, výhodne v purifikovanej forme, spolu s vhodným množstvom nosiča, tak, aby sa poskytla forma na správne podanie pacientovi. Formulácia by mala byť vhodná na spôsob podania.
Množstvo farmaceutického prostriedku podľa vynálezu, ktoré bude účinné na liečbu konkrétnej choroby alebo stavu, bude závisieť na povahe choroby alebo stavu, a môže byť stanovené štandardnými klinickými technikami. Okrem toho môžu byť voliteľne využité in vitro testy na pomoc identifikácie optimálneho rozsahu dávky. Presná dávka, ktoré sa má použiť vo formulácii, bude závisieť aj od spôsobu podania a od závažnosti ochorenia alebo poruchy, a mala by byť určená v súlade s posúdením praktického lekára a na základe konkrétnych okolností pri každom pacientovi. Avšak vhodná dávka na podanie je vo všeobecnosti v rozsahu približne 104 až 5x106 pfu a môže byť podávaná raz alebo viac krát s intervalmi tak často, ako je to potrebné. Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu obsahujú 104 až 5x10® pfu mutantných vírusov so zmenenou IFN antagonistickou aktivitou a môžu sa podávať intranazálne, intratracheálne, intramuskulárne alebo subkutánne. Účinné dávky môžu byť extrapolované z dávkovo závislých kriviek odvodených na základe in vitro testov alebo na základe živočíšnych modelových testovacích systémov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1. DeINSI vírus inhibuje replikáciu divého typu influenza A vírusu vo vajciach. Desaťdňové embryotické kuracie vajcia sa inokulovali s uvedeným pfu deINSI vírusu. O osem hodín sa vajcia infikovali s 103 pfu WSN vírusu. Po dvoch dňoch inkubovania pri 37 °C sa odobrala alantoická tekutina a stanovili sa WSN vírusové titre plakovým testom v MDBK bunkách. Výsledky sú priemerom dvoch vajec.
Obrázok 2. Indukcia antivírusovej odpovede v embryotických vajciach deINSI vírusom. Desaťdňové embryotické kuracie vajcia sa inokulovali s PBS (neošetrené) alebo s 2x104 pfu deINSI vírusu (ošetrené s deINSI). O osem hodín
-36·· ·· · ·· ·· ···· · · · • ·· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· sa vajcia infikovali s 103 pfu influenza A/WSN/33 (HIN1) vírusom, A/PR8/34 (H+N1) vírusom, influenza A/X-31 (H3N2) vírusom, influenza B/Lee/40 vírusom alebo
Sendai vírusom. Po dvoch hodinách inkubovania sa odobrala alantoická tekutina a stanovili sa vírusové titre hemaglutinačným testom. Výsledky sú priemerom dvoch vajec.
Obrázok 3. CV1 bunky sa transfekovali plazmidom exprimujúcim IRF-3 fúzovaným so zeleným fluorescenčným proteínom (GFP). To umožnilo stanoviť lokalizáciu IRF-3 vo vnútri buniek fluorescenčnou mikroskopiou. V niektorých prípadoch sa s IRF-3 kotransfekoval NS1 expresný plazmid v uvedených pomeroch. 24 hodín po transfekcii sa bunky infikovali s vysokým moi s PR8 (WT) lebo s deINSI vírusom, ako je uvedené. 10 hodín po infekcii sa bunky analyzovali vo fluorescenčnom mikroskope na zistenie lokalizácie IRF-3-GRP. Uvedené je percento buniek vykazujúcich len cytoplazmatickú lokalizáciu (CYT), ako aj cytoplazmatickú a jadrovú lokalizáciu IRF-3 (Nuc+Cyt).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Generovanie a charakterizácia mutantnov influenza A vírusu so skráteným NS1
Materiál a metódy
Influenza A/PR/8/34 (PR8) vírus sa množil v 10-dňových embryotických kuracích vajciach pri 37 °C. Influenza A vírus 25A-1, preusporiadaný vírus obsahujúci NS segment z na chlad adaptovaného kmeňa A/Leningrad/134/47/57 a zvyšné gény z PR8 vírusu (Egorov a ďalší, 1994,Vopr. Virusol. 39:201-205; Shaw a ďalší, 1996, v Options of the control of influenza III, vyd. Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) str. 433-436), sa pestoval vo Vero bunkách pri 34 °C. 25A-1 vírus je citlivý na teplotu v cicavčích bunkách a používal sa ako pomocný vírus na zhromažďovanie NS1/99 transfektantových vírusov. Vero bunky a MDCK bunky udržiavané v minimálnom esenciálnom médiu (MEM) obsahujúcom 1 gg/ml trypsínu
-37• ··· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· (Difco Laboratories, Detroid, Michigan) sa používali na pestovanie influenza vírusov. Vero bunky sa používali aj na selekciu, purifikáciu plakov a titráciu NS1/99 vírusu. MDCK bunky sa udržiavali v DMEM (Dulbeccovo minimálne esenciálne médium) obsahujúcom 10% teplom inaktivované fetálne teľacie sérum. Vera bunky sa pestovali v AIM-V médiu (Life Technologies, Grand Island, NY).
Plazmid pT3NS1/99, ktorý obsahuje 99 aminokyselinovú na C-konci skrátenú formu NS1, sa pripravil nasledovne. Najprv sa pPUC19-T3/NS PR8, obsahujúci kompletný NS gén PR8 vírusu ohraničený T3 RNA polymerázovým promótorom a BpuAI reštrikčným miestom, amplifikoval reverznou PCR (Ochman a ďalší, 1988, Genetics 120:621-623) použitím príslušných primérov. Získaná cDNA obsahujúca skrátený NS1 gén sa fosforylovala, ošetrila sa Klenowovým fragmentom, ligovala sa sama zo sebou a množila sa v E. coli kmeni TG1. Konštrukt získaný po purifikácii sa označil pT3NS1/99 a skontroloval sa sekvenovaním. Plazmidy na expresiu NP, PB1, PB2 a PA proteínov PR8 vírusu (pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2 a pHMG-PA) už boli opísané (Pleschka a ďalší, 1996, J. Virol. 70:4188-4192). pPOLINS-RB sa vyrobil substituovaním CAT otvoreného čítacieho rámca pPOLI-CAT-RT (Pleschka a ďalší, 1996, J. Virol. 70:4188-4192) vo vnútri RT-PCR produktu odvodeného od kódujúcej oblasti NS génu influenza A/WSN/33 (WSN) vírusu. Tento plazmid exprimuje NS-špecifický vírusový RNA segment WSN vírusu pod kontrolou skráteného ľudského promótora pre polymerázu I.
Generovanie NS1/99 vírusu sa uskutočnilo transfekciou ribonukleoproteínu (RNP) (Luytjes a ďalší, 1989, Celí 59:1107-1113). RNPs sa vytvorili T3 RNA polymerázovou transkripciou z pT3NS1/99, ktorý bol linearizovaný s BpuAI, v prítomnosti purifikovaného nukleoproteínu a polymerázy influenza 25A-1 vírusu (Enami a ďalší, 1991, J. Virol. 65:2711-2713). RNP komplexy sa transfekovali do Vero buniek, ktoré sa predtým infikovali s 25A-1 vírusom. Transfekované bunky sa inkubovali 18 hodín pri 37 °C a supernatant sa dvakrát pasážoval vo Vero bunkách pri 40 °C a plaky sa purifikovali trikrát vo Vero bunkách pokrytých agarovým zalievacím médiom pri 37 °C. Izolovaný NS1/99 vírus sa analyzoval prostredníctvom RT-PCR použitím špecifických primérov. Transfektantové vírusy divého typu sa
-38• ··· ··· ···· · • · · · · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ··· generovali nasledovne: Vero bunky na 35-mm platniach sa transfekovali plazmidmi pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA a pPOLI-NS-RB, ako už bolo opísané (Pleschka a ďalší, 1996, J. Virol. 70:4188-4192). Dva dni po transfekcii sa bunky infikovali s 5 x 10“ pfu del1NS1 vírusu a inkubovali sa ďalšie dva dni pri 37 °C. Bunkový supernatant sa pasážoval raz v MDCK bunkách a dvakrát v kuracích embryotických vajciach. Transfektantové vírusy sa klonovali limitujúcim riedením vo vajciach. Genomická RNA z purifikovaného NS1/99 transfektatnového vírusu sa analyzovala polyakrylamidovou gélovou elektroforézou, ako už bolo opísané (Zheng a ďalší, 1996, Virology 217:242-251). Expresia skráteného NS1 proteínu NS1/99 vírusom sa skontrolovala imunoprecipitáciou značených infikovaných bunkových extraktov použitím králičieho polyklonálneho antiséra proti NS1.
Alantoické dutiny embryotických kuracích 6-, 10- a 14-dňových vajec sa inokulovali s približne 103 pfu PR8, NS1/99 alebo deINSI (v ktorom je deletovaný celý NS1 gén) vírusmi, inkubovali sa pri 37 °C dva dni a vírusy nachádzajúce sa v alantoickej tekutine sa titrovali hemaglutinačným (HA) testom.
Skupiny 5 BALB/c myší (Taconic Farms) sa intranazálne inokulovali s 5 x 10® pfu, 1,5 x 105 pfu alebo 5 x 103 pfu divého typu A/PR/8/34 (PR8) alebo NS1/99 vírusu. Inokulácie sa uskutočňovali v anestéze použitím 50 μΙ MEM obsahujúceho príslušné množstvo pfu príslušného vírusu. Zvieratá sa denne monitorovali a usmrtili sa, keď sa pozorovali extrémy. V nasledujúcom experimente sa všetky myši, ktoré prežili, infikovali o štyri týždne neskôr dávkou 100LD50 divým typom PR8 vírusu. Všetky postupy boli v súlade s NIH regulami na starostlivosť a použitie laboratórnych živočíchov.
Oslabovanie influenza A vírusov NS1 deléciami
Prihlasovatelia predtým ukázali, že influenza A vírus, v ktorom sa deletoval NS1 gén (deINSI vírus), je schopný rásť s titrami približne 107 pfu/ml v bunkách deficientných v produkcii interferónu typu I (IFN), ako napríklad Vero bunkách. Avšak tento vírus mal poškodenú schopnosť replikovať sa a spôsobiť ochorenie u myší (Garcia-Sastre a ďalší, 1998, Virology 252:324). Na rozdiel od toho, deINSI ·· · ·· • · ·· · · ·
-39··· · · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ··· vírus bol schopný rásť v a usmrcovať STAT1 -/- myši. Tieto výsledky demonštrovali, že NS1 proteín influenza A vírusu je virulentným faktorom, ktorý sa podieľa na inhibícii hostiteľských antivírusových odpovedí, ktoré sú sprostredkované IFN typu I. Nasledujúce» experimety sa uskutočňovali tak, aby sa stanovilo, či by bolo možné generovať influenza vírusy s virulentnými vlastnosťami v strede medzi vlastnosťami divého typu vírusu a vlastnosťami deINSI vírusu, deletovaním častí NS1 génu, a či by niektoré z týchto vírusov mohli mať optimálne vlastnosti na to, aby boli použité ako živé oslabené vakcíny proti influenza vírusom, tzn. stabilitu a príslušnú rovnováhu medzi oslabením, imunogénnosťou a rastom v substrátoch vhodných na prípravu vakcín, akými sú napríklad embryotické kuracie vajcia.
Na otestovanie tejto hypotézy sa generoval influenza A/PR/8/34 (PR8) vírus, v ktorom bol NS1 gén modifikovaný tak, aby riadil expresiu skráteného NS1 proteínu obsahujúceho len 99 aminokyselín na amino-konci, ktoré sa nachádzajú aj v rámci 230 aminokyselín divého typu NS1 proteínu. Tento vírus (NS1-99) sa získal RNP transfekciou umelo skonštruovaného NS génu použitím jedného 25A-1 pomocného vírusu, ako už bolo opísané (Garcia-Sastre a ďalší, 1998, Virology 252:324). Analýza NS1 expresie vo vírusom infikovaných bunkách odhalila skrátenú povahu NS1 proteínu NS1-99 vírusu.
Analyzovala sa schopnosť deINSI, NS1-99 a divého typu PR8 vírusov rásť v embryotických kuracích vajciach rôzneho veku. Základ tohto experimentu pochádza zo skutočnosti, že schopnosť embryotických vajec syntetizovať a odpovedať na IFN typu I po príslušnom stimule je závislá na veku. V skutočnosti tak IFN indukovateľnosť, ako aj responzívnosť začína približne v 10. dni a potom sa exponenciálne zvyšuje s vekom (Sekellick a ďalší, 1990, In Vitro Celí. Dev. Biol. 26:997; Sekellick & Marcus, 1985 J. Interferon Res. 5:657). Takže použitie rôzne starých vajec predstavuje unikátny systém na testovanie schopnosti rôznych vírusov inhibovať IFN odpovede. 6-, 10- a 14-dňové vajcia sa inokulovali približne 103 pfu PR8, NS199 alebo deINSI vírusov, inkubovali sa pri 37 °C 2 dni a vírusy nachádzajúce sa v alantoickej tekutine sa titrovali hemaglutinačným (HA) testom. Ako je uvedené v tabuľke 3, zatiaľ čo divý typ vírusu rástol s podobnými HA titrami v 6-, 10- aj 14dňových vajciach, deINSI sa replikoval s detegovateľným HA titrom len v 6-dňových
-40vajciach. Na rozdiel od toho, NS1-99 vírus sa správal na rozhraní medzi správaním deINSI vírusu a správaním divého typu vírusu, a bol schopný rásť s HA titrami, ktoré sú podobné titrom pre divý typ vírusu v 10-dňových vajciach, ale nie v 14dňových vajciach.
Tabuľka 3
Replikácia vírusu v embryotických kuracích vajciach
Vírus Hemaglutinačný titer1
6-dňové vajcia 10-dňové vajcia 14-dňové vajcia
WTPR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 n.d.3 2,048 <2
deINSI 64 <2 <2
1 titre predstavujú najvyššie riedenie s hemaglutinačnou aktivitou 2 divý typ influenza A/PR/8/34 vírusu 3 nestanovené
Vlastnosti oslabenia NS1-99 vírusu sa potom stanovili v myšiach. Za týmto účelom sa skupiny 5 BALB/c myší intranazálne infikovali 5x10® pfu, 1,5 x 10® alebo 1,5 x 103 pfu divého typu PR8 alebo NS1-99 vírusu. Myši sa potom monitorovali z hľadiska prežívania tri týždne. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4. NS1-99 vírus mal LD50 najmenej o tri log vyššie ako divý typ vírusu.
Tabuľka 4
Oslabenie NS1-99 vírusu v myšiach
Vírus Prežívajúce jedince
5 x 106 1,5 x 105 1,5 x 103
WTPR81 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5
1 divý typ influenza vírusu A/PR/8/34
Príklad 2
Generovanie a charakterizácia mutantov influenza B vírusu so skráteným NS1
Materiál a metódy
Experimentálne detaily sú podobné ako v príklade 1. Dva mutanty influenza B vírusov, B/610B5B/201 (B/201) a B/BWBY-234, dlhé 127 aminokyselín a 90 aminokyselín (NS1 proteíny skrátené na C-konci) (Norton a ďalší, 1987 Virology 156:204; Tobita a ďalší, 1990 Virology 174:314) sa odvodili od koinfekčných experimentov v tkanivovej kultúre obsahujúcej B/Yamagata/1/73 (B/Yam) a A/Aichi/2/68 vírusy v prítomnosti anti-A (H3N2) vírusovej protilátky. Rast mutantných influenza vírusov v rôzne starých embryotických vajciach sa porovnával s rastom rodičovského vírusu B/Yam, ktorý obsahuje divý typ NS1 proteínu s dĺžkou 281 aminokyselín. 6-, 10-a 14-dňové vajcia sa inokulovali s približne 103 pfu B/Yam, B/201 alebo B/AWBY-234 vírusmi, inkubovali sa pri 35 °C 2 dni a vírusy nachádzajúce sa v alantoickej tekutine sa titrovali HA testom.
Ďalej sa stanovovali charakteristiky oslabenia B/201 a B/AWBY-234 vírusov v myšiach. Skupiny troch BALB/c myší sa intranazálne infikovali s 3x10® pfu divých typov B/Yam alebo B/201 vírusov a B/AWBY/234 mutantného vírusu a stanovila sa schopnosť týchto vírusov replikovať sa prostredníctvom merania vírusových titrov v pľúcach 3 dni po infekcii, pretože divý typ B/Yam neindukoval zjavné známky ochorenia v myšiach.
-42Výsledky
Tabuľka 5
Replikácia influenza B vírusu v embryotických kuracích vajciach
Vírus Hemaglutinačný titer
6-dňové vajcia 10-dňové vajcia 14-dňové vajcia
B/Yam 362 256 <2
B/201 32 <2 <2
B/AWBY-234 8 <2 <2
Výsledky rastu mutantného influenza B vírusu a influenza B vírusov divého typu v embryotických vajciach uvedené v tabuľke 5 demonštrujú, že tak ako v prípade influenza A vírusov, je skrátenie NS1 na C-konci v influenza B víruse zodpovedné za nižší replikačný výťažok v starších embryotických kuracích vajciach, ktoré vykazujú účinnú IFN odpoveď. Z tohto zistenia vyplýva, že NS1 influenza B vírusu sa tiež podieľa na inhibovaní IFN odpovedí v hostiteľovi, a že výsledkom delécii v NS1 géne influenza B vírusu je oslabený fenotyp.
Výsledky replikačných experimentov v myšiach sú uvedené v tabuľke 6. Titre B/201 vírusu a B/AWBY-234 vírusu boli približne o tri log nižšie ako titre B/Yam, z čoho vyplýva, že skrátenia NS1 karboxylovej terminálnej domény influenza B vírusu sú zodpovedné za oslabený fenotyp u myší.
Tabuľka 6
Replikácia influenza B vírusu v pľúcach myší
Vírus Titre v pľúcach 3 dni po infekcii (pfu/pľúca)
B/Yam 2x104 1x104 3x104
B/201 30 <10 60
B/AWBY-234 <10 40 <10
-43Príklad 8
Ochrana proti infekcii influenza vírusom divého typu u myši imunizovaných influenza A a B vírusmi obsahujúcimi delécie v ich NS1 proteíne
Aby sa stanovilo, či myši imunizované oslabenými influenza A a B vírusmi obsahujúcimi skrátené NS1 proteíny chránia proti vyzývacej infekcii s príslušnými vírusmi divého typu, uskutočnil sa nasledujúci experiment. BALB/c myši sa intranazálne imunizovali A/NS1-99 vírusom a o tri týždne neskôr sa infikovali 100 LD50 influenza vírusom divého typu A/PR/8/34. Imunizované zvieratá boli ochránené pred smrťou, zatiaľ čo kontrolné naivné myši po vyzývacej infekcii zomreli (tabuľka 7). V druhom experimente sa BALB/c myši intranazálne imunizovali s influenza B vírusmi B/201 alebo B/AWBY-234, ktoré exprimujú skrátené NS1 proteíny. O tri týždne neskôr sa myši infikovali 3 x 105 pfu influenza B/Yam/1/73 vírusom divého typu. Keďže tento kmeň influenza B vírusu neindukuje v myšiach symptómy ochorenia, stupeň ochrany sa stanovoval meraním vírusových titrov v pľúcach tri dni po infekcii. Zatiaľ čo naivné kontrolné zvieratá mali titre okolo 104 pfu/pľúca, vírusy sa nedetegovali v pľúcach imunizovaných zvierat (pozri tabuľku 8). Z týchto zistení vyplýva, že influenza A, ako aj influenza B vírusy obsahujúce modifikované NS1 gény sú schopné indukovať imunitnú odpoveď u myší, ktorá poskytuje úplnú ochranu proti následnej infekcii vírusom divého typu.
Tabuľka 7
Prežívanie myši imunizovaných influenza A/NS1-99 vírusom po vyzývacej infekcii so 100 LD50 influenza A/PR/8/34 vírusom divého typu
Imunizačná dávka A/NS1-99 vírusu Prežívajúce/celkový počet
5 x 106 pfu 3/3
1,5 x 105 pfu 4/4
PBS 0/5
-44·· ·· · ·· ·· ···· ··· • ··· ··· ···· · • · · · · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ···
Tabuľka 8
Titre v pľúcach myši imunizovaných influenza B/201 a B/AWBY-234 vírusom po infekcii s 3 x 105 pfu influenza B/Yamagata/73 vírusu divého typu
Imunizačná dávka Titre v pľúcach (pfu/pľúca)
3 x 105 B/201 <101, <101, <101, <101, <101,
3 x 105 B/AWBY-234 <101, <101, <101, <101, <101,
PBS 2,5x104, 1x104, 1,7x104, 3x104, 5x104,
Príklad 4
Indukcia interferónu typu I v embryotických vajciach infikovaných deINSI vírusom
Ďalej sa stanovovala schopnosť deINSI vírusu, influenza A vírusu bez NS1 génu, indukovať vylučovanie IFN typu I v embryotických kuracích vajciach. Za týmto účelom sa skupiny dvoch desaťdňových embryotických kuracích vajec infikovali s 5 x 103 pfu deINSI alebo PR8 vírusom divého typu. Osemnásť hodín po inkubovaní pri 37 °C sa odobrala alantoická tekutina a dialyzovala sa oproti kyslému pH cez noc, aby sa inaktivovali infekčné vírusy. Po ošetrení s kyslím pH sa vzorky dialyzovali oproti PBS a testovala sa ich IFN aktivita stanovením navyššieho riedenia s ochrannou aktivitou proti VSV infekcii (približne 200 pfu) v CEF bunkách. Z výsledkov uvedených v tabuľke 9 vyplýva, že pri absencii NS1 sú influenza A vírusy silnejšími induktormi IFN.
Tabuľka 9
Indukcia IFN vo vajciach
Vírus IFN (U/ml)
PR8 deINSI kontrola <16, <16
400, 400 <16, <16
-45Príklad 5
Antivírusová aktivita deINSI vírusu • ·· ·· · ·· ···· ···· ··· ··· ·· ·· ··· ·· ···
Výsledkom eliminácie IFN antagonistického (NS1) génu z influenza A vírusu môže byť vírus so schopnosťou indukovať vysoké hladiny IFN. Ak ide o taký prípad, bude deINSI interferovať s replikáciou IFN-senzitívnych vírusov. Aby sa otestovala táto možnosť, skúmali prihlasovatelia schopnosť deINSI vírusu inhibovať replikáciu A/WSN/33 (WSN) vírusu, bežne používaného laboratórneho kmeňa influenza vírusu, vo vajciach. Ako je možné vidieť na obrázku 1, ošetrenie len s 2 pfu deINSI vírusu bolo schopné znížiť konečné titre WSW vírusu v alentoickej tekutine a jeden log. Okrem toho, ošetrenie s 2 x 104 pfu deINSI vírusu viedlo prakticky ku úplnej eliminácii WSN replikácie vo vajciach. DeINSI vírus bol schopný interferovať s replikáciou aj iných influenza A vírusových kmeňov (H1N1 a H3N2), influenza B vírusov a rôznych iných vírusov, ako Sendai vírusu, vo vajciach (obrázok 2).
Povzbudený týmito výsledkami stanovovali prihlasovatelia ďalej schopnosť deINSI vírusu interferovať s replikáciou divého typu influenza vírusu v myšiach. Hoci ošetrenie s IFN typu I zabraňuje v tkanivovej kultúre replikácii influenza A vírusu in vitro, ošetrenie myší s IFN nebolo schopné inhibovať replikáciu influenza vírusov (Halier, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52). To platí pre väčšinu inbredných myší, okrem A2G myší. A2G myši, ako aj značný podiel myší divého typu (približne 75 %) obsahuje najmenej jednu neporušenú Mx1 alelu, zatiaľ čo väčšina laboratórnych kmeňov je Mx1 -/- (Halier, 1986, Current Top Microbiol Immunol 127:331-337). Mx1 proteín, ktorý je homologický z ľudským MxA proteínom (Aebi, 1989, Mol. Celí. Biol. 11:5062), je účinným inhibítorom influenza vírusovej replikácie (Halier, 1980, Náture 283:660). Tento proteín sa neexprimuje konštitutívne, ale jeho expresia je transkripčne indukovaná IFN typu I. Takže A2G myši môžu byť použité na testovanie schopnosti IFN-induktorov stimulovať antivírusovú odpoveď proti influenza A vírusom /Halier, 1981, Current Top Microbiol Immunol 92:25-52).
-46• ·· ·· · ·· · ·· · · · · ·· · · ·· ······ ··· • ··· ··· ···· · • ···· ··· ··· ·· ·· ··· ·· ···
Prihlasovatelia intranazálne infikovali osem štvortýždňových A2G myši s 5x106 pfu vysokopatogénneho influenza A/PR/8/34 vírusového izolátu (Halier, 1981, Current Top Microbioi Immunol 92:25-52). Polovica myší sa intranazálne ošetrila s 5x106 pfu deINSI 24 hodín pred PR8 infekciou. Ďalšie štyri myši sa ošetrili s PBS. Monitorovali sa zmeny telesnej hmotnosti a prežívanie. Tieto výsledky demonštrujú, že deINSI ošetrenie bolo schopné ochrániť A2G myši proti influenza vírusom indukovanej smrti a strate telesnej hmotnosti. Rovnaké ošetrenie nebolo účinné v Mx1 -/- myšiach, z čoho vyplýva, že mechanizmus vírusovej ochrany bol Mx1, tzn. sprostredkovaný IFN.
Príklad 6 Protinádorové vlastnosti deINSI vírusu v myšiach
Vychádzajúc z toho, že sa ukázalo, že IFN typu I a/alebo induktory IFN typu I majú protinádorové vlastnosti (Belardelli a Gresser, 1996 Immunology Today 17: 369-372; Qin a ďalší, 1998, Prac. Natl. Acad. Sci. 95:14411-14416), je možné, že ošetrenie nádorov s deINSI vírusom by mohlo sprostredkovať regresiu nádora. Alternatívne by deINSI vírus mohol mať onkolytické vlastnosti, tzn. mohol by byť schopný špecificky rásť v a usmrcovať nádorové bunky, z ktorých o mnohých je známe, že majú deficiencie v IFN systéme. Aby sa otestoval protinádorový účinok deINSI vírusu, uskutočnil sa ďalší experiment použitím hlodavčej karcinómovej bunkovej línie CT26.WT v myšacom nádorovom modeli pľúcnych metastáz (Restifo a ďalší, 1998 Virology 249:89-97). 5x105 CT26.WT buniek sa intravenózne injektovalo dvanástim 6-týždňovými BALB/c myšiam. Polovica myší sa intranazálne ošetrovala každých 24 hodín na 1., 2. a 3. deň po inokulácii s 106 pfu deINSI vírusu. Dvanásť dní po injektovaní nádora sa myši usmrtili a spočítali sa metastázy v pľúcach. Ako je ukázané v tabuľke 10, ošetrenie s deINSI sprostredkúva značnú regresiu hlodavčích pľúcnych metastáz.
-47·· ·· • · · · · ··· · · ·
Tabuľka 10
Protinádorový účinok deINSI vírusu v BALB/c myšiach injektovaných s CT26.WT nádorovými bunkami
Počet pľúcnych metastáz
ošetrené s PBS ošetrené s deINSI
Myš 1 >250 120
Myš 2 >250 28
Myš 3 >250 9
Myš 4 >250 6
Myš 5 >250 2
Myš 6 >250 1
Príklad 7 NS1 proteín inhibuje premiestňovanie IRF-3 počas infekcie influenza vírusom
Z tu opísaných výsledkov vyplýva, že NS1 proteín influenza vírusu je zodpovedný za inhibíciu IFN typu I odpovede proti vírusu, a že mutácie/delécie v tomto proteíne vedú k oslabeniu vírusov, kvôli zvýšeniu IFN odpovede počas infekcie. Je známe, že syntéza IFN typu I počas vírusovej infekcie môže byť spustená prostredníctvom dvojvláknovej RNA (dsRNA). IRF-3 je transkripčný faktor, ktorý sa zvyčajne nachádza v inaktívnej forme v cytoplazme cicavčích buniek. Dvojvláknová RNA indukuje fosforyláciu (aktiváciu) transkripčného faktora IRF-3, ktorá vedie k jeho premiestneniu do jadra, kde indukuje transkripciu špecifických génov, vrátane génov kódujúcich IFN typu I (Weaver a ďalší, 1998, Mol. Celí. Biol. 18:1359). Aby sa stanovilo, či NS1 influenza vírusu vplýva na IRF-3, monitorovala sa IRF-3 lokalizácia v CV1 bunkách infikovaných s divým typom vírusu PR8 alebo s deINSI influenza A vírusom. Obrázok 3 ukazuje, že premiestňovanie IRF-3 je minimálne v PR8-infikovaných bunkách (v menej ako 10 % buniek). Na rozdiel od toho sa v približne 90 % deINSI-infikovaných buniek dokázala jadrová lokalizácia
-48» ·· ·· · ·· · ·· · · · · ·· · · ·· ······ ··· • ··· · · · ···· · • ···· ··· ··· ·· ·· ··· ·· ···
IRF-3. Prekvapujúco bolo možné čiastočne inhibovať IRF-3 premiestňovanie v deINSI-infikovaných bunkách expresiou NS1 z plazmidu trans spôsobom. Výsledky demonštrujú, že NS1 influenza A vírusu je schopný inhibovať IRF-3 premiestnenie vo vírusom infikovaných bunkách. NS1 influenza vírusu pravdepodobne zabraňuje dsRNA-sprostredkovanej aktivácii IRF-3 prostredníctvom sekvestrovania dsRNA generovanej počas vírusovej infekcie, a tak inhibuje IFN syntézu.
Predložený vynález nie je obmedzený rozsahom opísaných špecifických uskutočnení, ktoré sú mienené len ako ilustrácie jednotlivých predmetov vynálezu, a akékoľvek funkčne ekvivalentné konštrukty vírusov spadajú do rozsahu tohto vynálezu. V skutočnosti budú pre priemerného odborníka v oblasti z vyššie uvedeného opisu a sprievodných obrázkov zrejmé rôzne modifikácie vynálezu okrem tých, ktoré sú tu ukázané a opísané. Takéto modifikácie spadajú do rozsahu pripojených nárokov.
Sú tu citované rôzne publikácie, ktorých opis je tu kompletne zahrnutý.

Claims (51)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Vakcinačný prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje oslabený negatívny jednovláknový RNA vírus majúci interferón antagonistický fenotyp, ktorý a) je zodpovedný za oslabenie a b) umožňuje oslabenému vírusu rásť s vysokými titrami v interferón-deficientných hostiteľských systémoch v porovnaní s rastom v interferón-kompetentných hostiteľských systémoch, keď sa množí v rovnakých podmienkach; a fyziologicky prijateľný excipient.
  2. 2. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že oslabený vírus je vybraný z prirodzene sa vyskytujúcich vírusov, mutovaných vírusov alebo vírusov s preusporiadanými génmi.
  3. 3. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že oslabený vírus je vybraný z geneticky skonštruovaných mutantov.
  4. 4. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že oslabeným vírusom je chimérny vírus, ktorý exprimuje epitop cudzieho patogénu.
  5. 5. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1,2,3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m , že oslabeným vírusom je influenza vírus.
  6. 6. Vakcinačný prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje influenza vírus, ktorý má mutáciu v NS1 géne zodpovednú za oslabený fenotyp, a fyziologicky prijateľný excipient.
  7. 7. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1,2,3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m , že oslabeným vírusom je respiračný syncytiálny vírus.
  8. 8. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1,2,3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m , že oslabeným vírusom je parainfluenza vírus.
    • ·· ·· · ·· · ··· · · ··· · ··· • ··· ··· ···· · • · · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ···
  9. 9. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1,2,3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m , že oslabeným vírusom je vírus vezikulárnej stomatitídy.
  10. 10. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa t ý m , že oslabeným vírusom je vírus Newcastelskej choroby.
  11. 11. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že interferón-deficientný hostiteľský systém je STAT1 negatívny a interferónkompetentný hostiteľský systém je STAT1 pozitívny.
  12. 12. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne 8-dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
  13. 13. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne 8-dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
  14. 14. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne 8-dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
  15. 15. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne 8dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
    • ·· ·· · ·· ···· · 9 ·· · ·· ····· 9 9 999
    999 99 99 999 99999
  16. 16. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1 alebo 11, vyznačujúci sa tý m , že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  17. 17. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  18. 18. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  19. 19. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  20. 20. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  21. 21. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 5, vy z n a č u j ú c i sa tým, že koncentrácia oslabeného influenza vírusu je približne 104 až približne 5 x 106 pfu na dávku.
    • ··· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ·
  22. 22. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia oslabeného influenza vírusu je približne 104 až približne 5x10® pfu na dávku.
  23. 23. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje oslabený negatívny jednovláknový RNA vírus majúci interferón antagonistický fenotyp, ktorý a) je zodpovedný za oslabenie a b) umožňuje oslabenému vírusu rásť s vysokými titrami v interferón-deficientných hostiteľských systémoch v porovnaní s rastom v interferón-kompetentných hostiteľských systémoch, keď sa množí v rovnakých podmienkach; a fyziologicky prijateľný excipient.
  24. 24. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že oslabený vírus je vybraný z prirodzene sa vyskytujúcich vírusov, mutovaných vírusov alebo vírusov s preusporiadanými génmi.
  25. 25. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, vyznačujúci sa t ý m , že oslabený vírus je vybraný z geneticky skonštruovaných mutantov.
  26. 26. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že oslabeným vírusom je chimérny vírus, ktorý exprimuje epitop cudzieho patogénu.
  27. 27. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, 24, 25 alebo 26 v y z n a čujúci sa t ý m , že oslabeným vírusom je influenza vírus.
  28. 28. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje influenza vírus, ktorý má mutáciu v NS1 géne zodpovednú za oslabený fenotyp, a fyziologicky prijateľný excipient.
  29. 29. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, 24, 25 alebo 26 v y z n a čujúci sa tým, že oslabeným vírusom je respiračný syncytiálny vírus.
    • ·· ·· · ·· ··· · · ··· · ·· φ φ φ φφφ φφ • ··· φ φ φ · ·· ·
    ΦΦ· ·· φφ ·Φ· ·· ···
  30. 30. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, 24, 25 alebo 26 v y z n a čujúci sa tým, že oslabeným vírusom je parainfluenza vírus.
  31. 31. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, 24, 25 alebo 26 vyznačujúci sa tým, že oslabeným vírusom je vírus vezikulárnej stomatitidy.
  32. 32. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, 24, 25 alebo 26 v y z n a čujúci sa tým , že oslabeným vírusom je vírus Newcastelskej choroby.
  33. 33. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, vyznačujúci sa tý m , že interferón-deficientný hostiteľský systém je STAT1 negatívny a interferónkompetentný hostiteľský systém je STAT1 pozitívny.
  34. 34. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 27, vyznačujúci sa t ý m , že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne
    8-dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
  35. 35. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 30, vyznačujúci sa t ý m , že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne 8-dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
  36. 36. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 31, vyznačujúci sa t ý m , že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne 8-dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
  37. 37. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 32, vyznačujúci sa t ý m , že interferón-deficientným hostiteľským systémom sú približne 6- až približne ·· ·· • · · · · ··· · · · • · · · · • · · • ·· ·
    8-dňové embryotické kuracie vajcia a interferón-kompetentným hostiteľským systémom sú približne 10- až približne 12-dňové embryotické kuracie vajcia.
  38. 38. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23 alebo 33, vyznačujúci sa tým, že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  39. 39. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 34, vyznačujúci sa tý m , že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  40. 40. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 35, vyznačujúci sa tý m , že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  41. 41. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 36, vyznačujúci sa t ý m , že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  42. 42. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 37, vyznačujúci sa t ý m , že titer oslabeného vírusu množeného v interferón-deficientnom hostiteľskom systéme je najmenej o jeden log vyšší ako titer oslabeného vírusu množeného v interferón-kompetentnom hostiteľskom systéme.
  43. 43. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 27, vyznačujúci sa tý m , že koncentrácia oslabeného influenza vírusu je približne 104 až približne 5 x 106 pfu na dávku.
    • ·· ·· · ·· ···· ···· ··· ··· · · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ···
  44. 44. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 28, vyznačujúci sa tý m , že koncentrácia oslabeného influenza vírusu je približne 104 až približne 5 x 106 pfu na dávku.
  45. 45. Oslabený influenza vírus, ktorý obsahuje modifikovaný NS1 gén a má zmenený interferón-antagonistický fenotyp.
  46. 46. Oslabený influenza vírus podľa nároku 45, v ktorom je NS1 gén modifikovaný alebo skrátený na karboxykonci.
  47. 47. Oslabený influenza vírus podľa nároku 45, v ktorom je NS1 gén modifikovaný na aminokonci.
  48. 48. Oslabený influenza vírus podľa nároku 45, ktorým je NS1/99.
  49. 49. Vakcinačný prostriedok podľa nároku 1 alebo 6 na použitie na očkovanie subjektu vyvolaním imunitnej odpovede.
  50. 50. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23 alebo 28 na použitie na predchádzanie infekčným chorobám indukciou bunkovej interferónovej odpovede.
  51. 51. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23 alebo 28 na použitie na liečenie alebo prevenciu nádorov u subjektu indukciou bunkovej interferónovej odpovede alebo onkolýzy.
SK1907-2000A 1998-06-12 1999-06-11 Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón SK288200B6 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8910398P 1998-06-12 1998-06-12
US10883298P 1998-11-18 1998-11-18
US11768399P 1999-01-29 1999-01-29
PCT/US1999/013144 WO1999064068A1 (en) 1998-06-12 1999-06-11 Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK19072000A3 true SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
SK288200B6 SK288200B6 (sk) 2014-06-03

Family

ID=27376229

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1907-2000A SK288200B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Použitie geneticky skonštruovaného oslabeného vírusu chrípky na liečbu alebo prevenciu infekčného ochorenia citlivého na interferón
SK50021-2008A SK288567B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie
SK50041-2015A SK288544B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený chimérny vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK50021-2008A SK288567B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie
SK50041-2015A SK288544B6 (sk) 1998-06-12 1999-06-11 Geneticky skonštruovaný oslabený chimérny vírus chrípky, vakcinačný prostriedok a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a ich použitie

Country Status (24)

Country Link
US (12) US6573079B1 (sk)
EP (4) EP2316923B1 (sk)
JP (7) JP4531255B2 (sk)
KR (2) KR100637937B1 (sk)
CN (1) CN1312725A (sk)
AT (1) ATE351901T1 (sk)
AU (2) AU771110B2 (sk)
BR (1) BR9911163A (sk)
CA (2) CA2334850C (sk)
CY (1) CY1113689T1 (sk)
CZ (2) CZ306637B6 (sk)
DE (1) DE69934885T2 (sk)
DK (4) DK1085904T3 (sk)
ES (4) ES2281177T3 (sk)
HU (1) HUP0102441A3 (sk)
IL (6) IL140264A0 (sk)
MX (2) MXPA00012402A (sk)
NO (1) NO20006328L (sk)
NZ (2) NZ509055A (sk)
PL (3) PL219128B1 (sk)
PT (1) PT1085904E (sk)
RU (1) RU2236252C2 (sk)
SK (3) SK288200B6 (sk)
WO (2) WO1999064570A1 (sk)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
EP2316923B1 (en) * 1998-06-12 2017-10-18 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Attenuated influenza viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals
AU4246900A (en) * 1999-04-15 2000-11-02 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
ES2260057T3 (es) 1999-09-17 2006-11-01 Wellstat Biologics Corporation Virus oncolitico.
RU2280690C2 (ru) * 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
WO2001077394A1 (en) 2000-04-10 2001-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) * 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
WO2002024876A2 (en) * 2000-09-25 2002-03-28 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
EP2338983B1 (en) 2001-02-14 2015-10-07 Anthrogenesis Corporation Renovation and repopulation of decellularized tissues and cadaveric organs by stem cells
US6715642B2 (en) 2001-05-22 2004-04-06 Access Business Group International Llc Method and apparatus for blending and dispensing liquid compositions
US7282599B2 (en) 2001-07-16 2007-10-16 Avir Green Hills Biotechnology Research Devlopment Trade Ag Dithiocarbamate antiviral agents and methods of using same
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
CN1993140A (zh) 2004-06-01 2007-07-04 纽约大学西奈山医学院 遗传工程猪流感病毒及其应用
WO2006088481A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PT2529747T (pt) 2005-12-02 2018-05-09 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
US9241998B2 (en) * 2007-05-21 2016-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic RSV activity
EP2048237A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
WO2010060921A1 (en) 2008-11-25 2010-06-03 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag METHOD FOR PRODUCTION OF pH STABLE ENVELOPED VIRUSES
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
AU2009333208A1 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Baxter Healthcare Sa Production of influenza vaccines
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
EP2393921B1 (en) 2009-02-05 2015-07-15 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
JP2012521786A (ja) 2009-03-30 2012-09-20 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
EP2424565A1 (en) 2009-04-27 2012-03-07 Novartis AG Adjuvanted vaccines for protecting against influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
JP2012531929A (ja) * 2009-07-06 2012-12-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド バイオプロセシング
IN2012DN00729A (sk) 2009-07-22 2015-06-19 Avir Green Hills Biotechnology
WO2011014504A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
WO2011014645A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza viruses and uses thereof
EP2459722B1 (en) 2009-07-31 2017-09-06 Seqirus UK Limited Reverse genetics systems
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
WO2011123495A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
US8597637B1 (en) 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
JP2013529913A (ja) 2010-06-02 2013-07-25 アヴィール グリーン ヒルズ バイオテクノロジー リサーチ ディベロプメント トレード アクチエンゲゼルシャフト Ｒｎａウィルスの作製のための方法及びヘルパーウィルス
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
US10131695B2 (en) 2011-09-20 2018-11-20 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
CA2895508A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
WO2014159990A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Yale University Interferon production using short rna duplexes
MD4655C1 (ro) 2013-03-14 2020-06-30 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virusurile bolii de Newcastle şi utilizarea acestora
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
CN107073099B (zh) 2014-02-27 2022-09-27 默沙东公司 用于治疗癌症的联合方法
JP2018504412A (ja) 2015-01-23 2018-02-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン
EA201791907A1 (ru) 2015-02-26 2018-02-28 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Бивалентная вакцина против вируса свиного гриппа
WO2017030997A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered ns1 protein function and related materials and methods
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
BR112018010499A8 (pt) 2015-11-24 2019-02-26 Commw Scient Ind Res Org método para replicar um vírus, vírus, método para produzir uma composição de vacina, composição de vacina, população de células in vitro, método para produzir uma população de células, e população de células
EP3380616A4 (en) * 2015-11-24 2019-11-06 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation MANUFACTURE OF VIRUSES IN BIRDS
US11266734B2 (en) 2016-06-15 2022-03-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
EP3559216A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 Blue Sky Vaccines GmbH Method for purifying virus
CN111511907A (zh) 2017-03-14 2020-08-07 加利福尼亚大学董事会 对病毒中免疫逃逸功能区域的全基因组鉴定
CA3058652A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
WO2019092084A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Blue Sky Vaccines Gmbh So3 chromatography for use in a method for virus purification
US20220160863A1 (en) 2019-01-24 2022-05-26 Blue Sky Vaccines Gmbh High growth influenza virus
WO2020163768A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
WO2022112595A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Bluesky Immunotherapies Gmbh Novel replication deficient influenza a virus inducing high levels of type i interferon
WO2022125789A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
WO2022261206A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) * 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US4693981A (en) 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
US5106619A (en) 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5766601A (en) * 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
ES2112335T3 (es) 1991-10-07 1998-04-01 Biogen Inc Procedimiento profilactico o terapeutico de enfermedades de la piel causadas por celulas que presentan antigenos por medio de inhibidores de la interaccion entre cd2 y lfa-3.
US6162432A (en) 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
DE69311764T2 (de) 1992-05-14 1998-02-05 Polymun Scient Immunbio Forsch Peptide, die Antikörper induzieren, die genetisch divergierende HIV-1 Isolationen neutralisieren
US7344722B1 (en) * 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
DK0702085T4 (da) 1994-07-18 2010-04-06 Conzelmann Karl Klaus Prof Dr Rekombinant infektiøs ikke-segmenteret negativ-strenget RNA-virus
US6300090B1 (en) * 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) * 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
ATE181112T1 (de) 1995-08-09 1999-06-15 Schweiz Serum & Impfinst Dem genom von minussträngigen rna-viren entsprechende cdna und verfahren zur herstellung von infektiösen minussträngigen rna-viren
US5840565A (en) * 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
JPH11512609A (ja) 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の生産
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
BR9710363A (pt) 1996-07-15 2000-01-11 Us Gov Health & Human Serv "vìrus sincicial respirátorio recombinante infeccioso isolado, partìcula do mesmo, processos para estimular o sistema imunológico de um indivìduo para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório e para produzir uma partìcula de vìrus sincicial respiratório recombinante, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante composição e ceta de vìrus sincicial respiratório recombinante"
CA2265554A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for attenuation in viruses of the order designated mononegavirales
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
US6030785A (en) 1997-03-05 2000-02-29 University Of Washington Screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis C virus replication
US5891705A (en) 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
BR9809456B1 (pt) 1997-05-23 2011-06-28 molécula isolada de polinucleotìdeo, composição de célula ou isenta de célula, partìcula de piv infeciosa, atenuada e imunogênica, e, composição imunogênica.
CA2295858C (en) 1997-07-11 2011-05-10 Yale University Rhabdoviruses with reengineered coats
JP2001517448A (ja) 1997-09-19 2001-10-09 アメリカン・サイアナミド・カンパニー 弱毒化呼吸合胞体ウイルス
WO1999064571A1 (en) * 1998-06-12 1999-12-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Interferon inducing genetically engineered attenuated viruses
EP2316923B1 (en) * 1998-06-12 2017-10-18 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Attenuated influenza viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
US6146642A (en) * 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
ATE353370T1 (de) 1999-07-14 2007-02-15 Sinai School Medicine In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren
RU2280690C2 (ru) * 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
WO2001077394A1 (en) 2000-04-10 2001-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
WO2002024876A2 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
US20080234175A1 (en) * 2002-11-13 2008-09-25 Montelione Gaetano T Process for Designing Inhibitors of Influenza Virus Structural Protein 1
CN1993140A (zh) 2004-06-01 2007-07-04 纽约大学西奈山医学院 遗传工程猪流感病毒及其应用
WO2006088481A2 (en) 2005-02-15 2006-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) * 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PT2529747T (pt) 2005-12-02 2018-05-09 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
US7507411B2 (en) * 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Also Published As

Publication number Publication date
IL140265A (en) 2008-06-05
EP1086207A1 (en) 2001-03-28
PL212316B1 (pl) 2012-09-28
US7494808B2 (en) 2009-02-24
EP1086207A4 (en) 2003-01-22
EP2316924A3 (en) 2014-03-19
ES2281177T3 (es) 2007-09-16
JP2014036654A (ja) 2014-02-27
AU4434599A (en) 1999-12-30
IL140264A0 (en) 2002-02-10
JP4837827B2 (ja) 2011-12-14
CN1312725A (zh) 2001-09-12
DK1085904T3 (da) 2013-02-25
US8765139B2 (en) 2014-07-01
IL140265A0 (en) 2002-02-10
US6573079B1 (en) 2003-06-03
US20050054074A1 (en) 2005-03-10
SK288544B6 (sk) 2018-03-05
WO1999064068A1 (en) 1999-12-16
US7588768B2 (en) 2009-09-15
SK288200B6 (sk) 2014-06-03
DE69934885D1 (de) 2007-03-08
PT1085904E (pt) 2013-03-05
AU4434399A (en) 1999-12-30
US20120258134A1 (en) 2012-10-11
US20160279227A1 (en) 2016-09-29
CZ306637B6 (cs) 2017-04-12
NZ509054A (en) 2004-01-30
US6852522B1 (en) 2005-02-08
DK1086207T3 (da) 2007-05-29
US20090203114A1 (en) 2009-08-13
NO20006328L (no) 2001-02-02
CZ20004635A3 (en) 2001-06-13
US20090053264A1 (en) 2009-02-26
EP2316923B1 (en) 2017-10-18
CA2334895C (en) 2016-01-19
DE69934885T2 (de) 2007-11-08
US20100158942A1 (en) 2010-06-24
PL200977B1 (pl) 2009-02-27
PL346212A1 (en) 2002-01-28
JP2002517470A (ja) 2002-06-18
KR20060080249A (ko) 2006-07-07
WO1999064570A1 (en) 1999-12-16
CA2334895A1 (en) 1999-12-16
US6669943B1 (en) 2003-12-30
EP1086207B1 (en) 2007-01-17
US9352033B2 (en) 2016-05-31
MXPA00012403A (es) 2003-05-15
US8057803B2 (en) 2011-11-15
NO20006328D0 (no) 2000-12-12
CZ302601B6 (cs) 2011-08-03
IL188362A0 (en) 2008-03-20
AU770619B2 (en) 2004-02-26
WO1999064068A9 (en) 2000-03-09
US9387240B2 (en) 2016-07-12
ES2650500T3 (es) 2018-01-18
JP2010142248A (ja) 2010-07-01
CA2334850A1 (en) 1999-12-16
KR20010052782A (ko) 2001-06-25
KR100637937B1 (ko) 2006-10-23
EP2316923A3 (en) 2014-04-09
RU2236252C2 (ru) 2004-09-20
IL140264A (en) 2008-03-20
HUP0102441A2 (hu) 2001-10-28
US20100233785A1 (en) 2010-09-16
JP5810134B2 (ja) 2015-11-11
ES2400445T3 (es) 2013-04-09
PL398576A1 (pl) 2012-10-08
WO1999064570A9 (en) 2000-03-09
NZ509055A (en) 2004-02-27
DK2316923T3 (en) 2018-01-08
JP2010099081A (ja) 2010-05-06
CY1113689T1 (el) 2016-06-22
DK2316924T3 (en) 2018-01-02
JP5829655B2 (ja) 2015-12-09
HUP0102441A3 (en) 2004-10-28
EP1085904A4 (en) 2004-12-29
EP2316924B1 (en) 2017-10-11
US20140341948A1 (en) 2014-11-20
JP4531255B2 (ja) 2010-08-25
US20040109877A1 (en) 2004-06-10
EP2316923A2 (en) 2011-05-04
EP1085904A1 (en) 2001-03-28
PL219128B1 (pl) 2015-03-31
JP5081220B2 (ja) 2012-11-28
SK288567B6 (sk) 2018-06-01
JP2013226154A (ja) 2013-11-07
ES2653557T3 (es) 2018-02-07
EP2316924A2 (en) 2011-05-04
IL189766A0 (en) 2008-08-07
CA2334850C (en) 2013-11-26
ATE351901T1 (de) 2007-02-15
JP2002517229A (ja) 2002-06-18
MXPA00012402A (es) 2003-07-14
EP1085904B1 (en) 2012-11-28
JP2011050384A (ja) 2011-03-17
AU771110B2 (en) 2004-03-11
BR9911163A (pt) 2002-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9387240B2 (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change of owner's name

Owner name: MOUNT SINAI SCHOOL OF MEDICINE, NEW YORK, NY, US

Effective date: 20110926

MK4A Patent expired

Expiry date: 20190611