MD4655C1 - Virusurile bolii de Newcastle şi utilizarea acestora - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la metode de tratament al cancerului, care includ administrarea virusurilor bolii de Newcastle (NDV) în combinaţie cu un antagonist al proteinei morţii celulare programate 1 (PD1), care reprezintă un anticorp şi se leagă specific la PD1 şi blochează legarea PD1 cu liganzii săi nativi. De asemenea, invenţia include administrarea unui NDV hibrid în combinaţie cu un antagonist al PD1, în care NDV hibrid conţine un genom ambalat cu conţinut de o secvenţă de nucleotide, care codifică o citokină, în care citokina este exprimată de virus şi antagonistul PD1 reprezintă un anticorp, care se leagă specific la PD1 şi blochează legarea PD1 cu liganzii săi nativi.

Description

Prezenta invenţie se referă la virusurile himerice ale bolii de Newcastle, proiectate pentru a exprima un agonist al semnalului costimulator al unei celule imune şi la compoziţii cuprinzând aceste virusuri. Sunt descrise, de asemenea, virusuri himerice ale bolii de Newcastle, proiectate pentru a exprima un antagonist al semnalului inhibitor al unei celule imune şi compoziţii cuprinzând aceste virusuri. Virusurile himerice ale bolii de Newcastle şi compoziţiile sunt utile în tratamentul cancerului. În plus, prezenta invenţie se mai referă la metode pentru tratarea cancerului, care prevăd administrarea virusurilor bolii de Newcastle în combinaţie cu un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune şi/sau cu un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune.

Virusul bolii de Newcastle (NDV) este un membru al genului Avulavirus din familia Paramyxoviridae, care s-a demonstrat că infectează numeroase specii aviare (Alexander D.J. Newcastle disease, Newcastle disease virus - an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 1988, p. 1-22). NDV are un genom de ARN monofilar în sens negativ şi nu este supus recombinării cu genomul gazdă sau cu alte virusuri (Alexander D.J. Newcastle disease, Newcastle disease virus - an avian paramyxovirus. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 1988, p. 1-22). ARN genomic conţine gene în ordinea 3'-NP-PMF-HN-L-5', descrise mai detaliat în continuare. Doua proteine suplimentare, V şi W, sunt produse de NDV din gena P cu mARNs alternativi, generaţi de redactarea ARN. ARN genomic, de asemenea, conţine o secvenţă lider la capătul 3'.

Elementele structurale ale virionului includ învelişul virusului, care este un strat dublu de lipide, derivate din membrana celulelor plasmatice. Glicoproteina hemaglutinina-neuraminidaza (HN) iese din înveliş, ceea ce permite virusului să conţină atât activităţi de hemaglutinină (de exemplu, de cuplare a receptorului/fusogenice), cât şi activităţi de neuraminidază. Glicoproteina de fuziune (F), care, de asemenea, interacţionează cu membrana virală, se sintetizează iniţial ca un precursor inactiv, apoi scindată post-translaţional produce două polipeptide disulfurice cuplate. Proteina activă F este implicată în penetrarea NDV în celulele gazdă prin facilitarea fuziunii învelişului viral cu membrana plasmatică a celulei gazdă. Proteina matrice (M) este implicată în asamblarea virală şi interacţionează cu atât cu membrana virală, precum şi cu proteinele nucleocapsidei.

Principala subunitate proteică a nucleocapsidei este proteina nucleocapsidei (NP), care conferă capsidei simetrie elicoidală. În asociere cu nucleocapsida sunt proteinele P şi L. Fosfoproteina (P), care este supusă fosforilării, se presupune ca joaca un rol de reglementare în transcripţie, şi, astfel, poate fi implicată în metilare, fosforilare şi poliadenilare. Gena L, care codifică polimeraza ARN dependentă de ARN, este necesară pentru sinteza ARN viral împreună cu proteina P. Proteina L, care ocupă aproape jumătate din capacitatea de codificare a genomului viral, este cea mai mare dintre proteinele virale şi are un rol important atât în transcriere, cât şi în replicare. Proteina V a demonstrat că inhibă interferonul alfa şi contribuie la virulenţa NDV (Huang et al. Newcastle disease virus v protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist. Journal of virology, no 77, 2003, p. 8676-8685).

NDV natural a fost raportat ca fiind un agent oncolitic eficient într-o varietate de modele de tumori la animale [1], (Zamarin et al. Mol. Ther. no 17, 2009, p. 697; Elankumaran et al. J. Virol. no 84, 2010, p. 3835; Schirrmacher et al. Methods Mol. Biol. no 542, 2009, p. 565; Bart et al. Nat. New Biol. no 245, 1973, p. 229). Tulpinile de NDV, întâlnite în natură, au fost utilizate în multiple studii clinice pentru tratamentul cancerelor umane avansate [2], (Sinkovics J.G. and Horvath J.C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. J. Clin. Virol. no 16, 2000, p. 1-15; Hotte et al. An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701. Clin. Cancer Res., no 13, 2007, p. 977-985; Freeman et al. Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme. Mol. Ther., no 13, 2006, p. 221-228; Pecora et al. Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J. Clin. Oncol., no 20, 2002, p. 2251-2266; Csatary et al. MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas. J. Neurooncol, no 67, 2004, p. 83-93). Cu toate acestea, succesul tulpinilor native de NDV în cercetările clinice privind cancere umane avansate, au fost doar nesemnificativ [3], (Freeman et al. Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme. Mol. Ther., no 13, 2006, p. 221-228; Pecora et al. Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J. Clin, Oncol., no 20, 2002, p. 2251-2266). Astfel, persistă o necesitate de terapii bazate pe NDV, utile în tratamentul cancerului, în special, al cancerului avansat.

Intr-un aspect prezenta invenţie se referă la virusuri himerice ale bolii de Newcastle (NDV) proiectate pentru a exprima un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune. Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat care codifică un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune, în care agonistul este exprimat. Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat care codifică un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, în care antagonistul este exprimat.

Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat care codifică un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune şi o proteină F mutantă care cauzează fusogenitatea înaltă a NDV, în care agonistul şi proteină F mutantă sunt exprimate. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care cuprind un genom ambalat, care codifică un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune şi o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant, în care agonistul şi proteina F mutantă sunt exprimate. Într-o variantă de realizare NDV himerice, care exprimă proteina F mutantă, au o activitate fusogenică mai înaltă, comparativ cu virusul corespunzător care exprimă omologul proteinei F fără mutaţiile la locusul de clivaj. Într-o altă realizare specifică, proteina F modificată este încorporată în virion.

Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune şi o proteină F mutantă care cauzează fuzogenitatea înaltă a NDV, în care antagonistul şi proteina F mutantă sunt exprimate. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică antagonistul unui semnal inhibitor al unei celule imune şi o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant, în care antagonistul şi proteina F mutantă sunt exprimate. Într-o variantă de realizare NDV himerice, care exprimă proteina F mutantă, au o activitate fusogenică mai înaltă, comparativ cu virusul corespunzător, care exprimă omologul proteinei F fără mutaţiile la locusul de clivaj. Într-o altă variantă de realizare proteina F modificată este încorporată în virion.

Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune şi o citokină (de exemplu, interleukina (IL -2)), în care agonistul şi citokina sunt exprimate. Într-o altă formă de realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune, o citokină (de exemplu, IL-2) şi proteina F mutantă, care cauzează fusogenitatea extrem de înaltă a NDV, în care agonistul, citokina şi proteina F mutantă sunt exprimate. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică un agonist al unui semnal co-stimulator al unei celule imune, o citokină (de exemplu, IL-2) şi o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant, în care agonistul, citokina şi proteina F mutantă sunt exprimate. Într-o variantă de realizare NDV himerice, care exprimă proteina F mutantă cu locusul de clivaj mutant, sunt extrem de fusogenice. Într-o altă realizare specifică proteina F mutantă este încorporată în virion.

Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune şi o citokină (de exemplu, IL-2), în care antagonistul şi citokina sunt exprimate. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, o citokină (de exemplu, IL-2) şi o proteină F mutantă, care cauzează fusogenitatea extrem de înaltă a NDV, în care antagonistul, citokina şi proteina F mutantă sunt exprimate. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat, care codifică un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, o citokină (de exemplu, IL-2) şi o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant, în care antagonistul, citokina şi proteina F mutantă sunt exprimate. Într-o variantă de realizare NDV himerice, care exprimă proteina F mutantă cu locusul de clivaj mutant, sunt extrem de fusogenice. Într-o altă realizare specifică proteina F mutantă este încorporată în virion.

Într-o variantă de realizare agonistul semnalului co-stimulator al unei celule imune este un agonist al unui receptor co-stimulator, exprimat de o celulă imună. Exemplele specifice de receptori co-stimulatori includ: receptorul pentru factorul de necroză tumorală indus de glucocorticoizi (GITR), costimulatorul inductibil al celulelor T (ICOS sau CD278), OX40 (CD134), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), CD40, CD226, molecula celulei T citotoxice şi reglatoare (CRTAM), receptorul morţii 3 (DR3), receptorul pentru limfotoxină-beta (LTBR), activatorul transmembranar şi interactorul CAML (TACI), receptorul pentru factorul de activare al celulelor B (BAFFR) şi proteina de maturare a celulelor B (BCMA). Într-o variantă de realizare agonistul unui receptor co-stimulator exprimat într-o celulă imună este un anticorp (sau un fragment de legare cu antigenul al acestuia) sau un ligand care se leagă specific cu receptorul costimulator. Într-o realizare anticorpul este un anticorp monoclonal. Într-o altă realizare anticorpul este un fragment sc-Fv. Într-o realizare concretă anticorpul este un anticorp bispecific, care se leagă la doi receptori pe o celulă imună. Într-o realizare anticorpul bispecific se leagă la un receptor pe o celulă imună şi la un alt receptor pe o celulă canceroasă. În unele realizări concrete anticorpul este un anticorp uman sau umanizat. În anumite realizări ligandul sau anticorpul este o proteină himerică, care conţine proteină F al NDV sau un fragment al acesteia, sau proteina HN a NDV sau un fragment al acesteia. Metode de generare ale unor astfel de proteine himerice sunt cunoscute în domeniu (US 2012-0122185; Murawski et al. J. Virol., no 84, 2010, p. 1110-1123). În anumite realizări ligandul sau anticorpul este exprimat ca o proteină himerică F sau proteină F de fuziune a NDV, în care proteina himerică F sau proteina F de fuziune a NDV conţine domeniile sau fragmentele citoplasmatice şi transmembranare ale acestora ale glicoproteinei F a NDV şi domeniul extracelular conţine ligandul sau anticorpul. În unele realizări ligandul este exprimat ca o proteină HN himerică sau proteină HN de fuziune a NDV, în care proteina HN himerică sau proteina HN de fuziune a NDV conţine domeniile transmembranare şi extracelulare sau fragmente ale acestora ale glicoproteinei HN a NDV şi domeniul extracelular conţine ligandul sau anticorpul. Într-o realizare specifică, ligandul sau anticorpul este exprimat ca o proteină himerică, cum este descris în secţiunea 7, exemplul 2, prezentat în continuare.

Într-o variantă concretă de realizare antagonistul unui semnal inhibitor al unei celule imune este un antagonist al receptorului inhibitor exprimat de o celulă imună. Exemplele specifice de receptori inhibitori includ: antigenul 4 asociat cu limfocitele T citotoxice (CTLA 4 sau CD52), proteina 1 a morţii celulare programate (PD1 sau CD279), atenuatorul limfocitelor B şi T (BTLA), receptorul pentru analogul imunoglobulinei celulei killer ( KIR), gena 3 de activare a limfocitelor (LAG3), proteina 3 a membranei celulelor T (TIM3), receptorul pentru adenozină A2a (A2aR), imunoreceptorul celulelor T cu imunoglobulină şi domeniile ITIM (TIGIT), receptorul 1 pentru analogul imunoglobulinei asociat cu leucocite (LAIR1) şi CD160. Într-o variantă concretă de realizare antagonistul unui receptor inhibitor exprimat de o celulă imună este un anticorp (sau un fragment de legare cu antigenul al acestuia) care se leagă specific la receptorul costimulator. Într-o realizare anticorpul este un anticorp monoclonal. Într-o altă formă de realizare, anticorpul este fragmentul sc-Fv. În realizările specifice anticorpul este un anticorp uman sau umanizat. Într-o altă variantă de realizare antagonistul unui receptor inhibitor este un receptor solubil sau un anticorp (sau un fragment de legare cu antigenul al acestuia), care se leagă specific la un ligand al receptorului inhibitor. În anumite realizări anticorpul este o proteină himerică care conţine proteina F a NDV sau un fragment al acesteia, sau proteina HN a NDV sau un fragment al acesteia (US 2012-0122185; Park et al. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA, no 103, 2006, p. 8203-2808; Murawski et al. J. Virol., no 84, 2010, p. 1110-1123). În anumite realizări anticorpul este exprimat ca o proteină himeră F sau o proteină F de fuziune a NDV, în care proteina himerică F sau proteina F de fuziune a NDV conţine domeniile citoplasmatice şi transmembranare sau fragmente ale acestora ale glicoproteinei F a NDV şi domeniul extracelular conţine anticorpul. În unele variante anticorpul este exprimată ca o proteină HN himerică sau proteină HN de fuziune a NDV, în care proteina HN himerică sau proteina HN de fuziune a NDV conţine domeniile transmembranare şi intracelulare sau fragmente ale acestora ale glicoproteinei HN a NDV şi domeniul extracelular conţine anticorpul.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode pentru propagarea NDV descrise aici (de exemplu, NDV himerice descrise aici). NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice, conform prezentei invenţii) pot fi propagate în orice celulă, subiect, ţesut sau organ susceptibil la o infecţie cu NDV. Într-o realizare NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice, conform prezentei invenţii) pot fi propagate într-o linie celulară. Într-o altă realizare NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, NDV himerice, conform prezentei invenţii) pot fi propagate în celule canceroase. Într-o altă realizare NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, NDV, conform prezentei invenţii) pot fi propagate într-un ou embrionat. În anumite realizări prezenta invenţie se referă la celule, ţesuturi sau organe izolate infectate cu NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, NDV himeric, conform prezentei invenţii) (de exemplu, secţiunea 5.4 prezentată în continuare, pentru exemple de celule animale şi de ouă infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii)). În unele variante de realizări prezenta invenţie se referă la celule canceroase izolate infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii). În anumite realizări prezenta invenţie se referă la liniile celulare infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii). În alte exemple de realizare prezenta invenţie se referă la ouă embrionate infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii).

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la compoziţii care conţin un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii). Într-o variantă concretă de realizare prezenta invenţie se referă la compoziţii farmaceutice cu conţinut de un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii) şi un purtător farmaceutic acceptabil. Într-o altă variantă de realizare prezenta invenţie se referă la compoziţii farmaceutice care conţin celulele canceroase infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii) şi un purtător farmaceutic acceptabil. În unele realizări concrete celulele canceroase au fost tratate cu radiaţii gamma înainte de încorporare în compoziţia farmaceutică. În alte variante de realizare celulele canceroase au fost tratate cu radiaţii gamma înainte de infectare cu NDV (de exemplu, cu NDV himeric). În alte exemple de realizare celulele canceroase au fost tratate cu radiaţii gamma după infectare cu NDV (de exemplu, cu NDV himeric). Într-o altă realizare sunt prezentate compoziţii farmaceutice cu conţinut de concentrat proteic din celulele canceroase lizate, infectate cu NDV (de exemplu, celulele canceroase infectate cu NDV himeric) şi un purtător farmaceutic acceptabil.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode de producere a compoziţiilor farmaceutice cu conţinut de un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii). Într-o realizare o metodă pentru producerea unei compoziţii farmaceutice prevede: (a) propagarea NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, NDV himeric, conform prezentei invenţii) într-o linie celulară care este susceptibilă la o infecţie cu NDV şi (b) colectarea descendenţilor virusului, în care virusul este crescut în cantităţi suficiente şi în condiţii suficiente pentru ca virusul să nu fie contaminat, astfel încât descendenţii virusului să fie potriviţi pentru formularea într-o compoziţie farmaceutică. Într-o altă variantă de realizare o metodă pentru producerea unei compoziţii farmaceutice prevede: (a) propagarea NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, NDV himeric, conform prezentei invenţii) într-un ou embrionat şi (b) colectarea descendenţilor virusului, în care virusul este crescut în cantităţi suficiente şi în condiţii suficiente pentru ca virusul să nu fie contaminat, astfel încât descendenţii virusului să fie potriviţi pentru formularea într-o compoziţie farmaceutică.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului utilizând un NDV himeric, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric descris în secţiunea 5.2 în continuare) sau o compoziţie cu conţinut de un astfel de NDV himeric. Într-o variantă concretă de realizare o metodă pentru tratarea cancerului prevede infectarea unei celule de cancer de la un subiect cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, cu un NDV himeric descris în secţiunea 5.2 în continuare) sau cu o compoziţie a acestuia. Într-o altă variantă de realizare o metodă pentru tratarea cancerului constă în administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui NDV himeric, conform prezentei invenţii (de exemplu, a unui NDV himeric descris în secţiunea 5.2 în continuare) sau a unei compoziţii a acestuia. În unele variante concrete de realizare o cantitate eficientă de un NDV himeric, conform prezentei invenţii (de exemplu, de un NDV himeric, descris în secţiunea 5.2 în continuare) sau de o compoziţie care cuprinde o cantitate eficientă de un NDV himeric, conform prezentei invenţii, este administrată unui subiect pentru tratarea cancerului. În unele variante concrete de realizare NDV himeric conţine un genom, genomul conţine un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune (de exemplu, un agonist al receptorului costimulator al unei celule imune) şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune (de exemplu, un antagonist al unui receptor inhibitor al unei celule imune). În anumite realizări genomul NDV conţine, de asemenea, o proteină F mutantă. În anumite realizări pentru tratarea cancerului la un subiect sunt administrate două sau mai multe NDV himerice.

Într-o altă variantă de realizare a prezentei invenţii o metodă pentru tratarea cancerului constă în administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a celulelor canceroase infectate cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii (de exemplu, cu un NDV himeric descris în secţiunea 5.2 în continuare) sau de compoziţie a acestuia. În unele variante de realizare celulele canceroase au fost tratate cu radiaţii gamma înainte de administrare la un subiect sau de încorporare în compoziţie. Într-o altă variantă de realizare o metodă pentru tratarea cancerului constă în administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui concentrat proteic sau a fragmentelor de membrană plasmatică de la celulele canceroase infectate cu un NDV himeric (de exemplu, cu un NDV himeric descris în secţiunea 5.2 în continuare) sau a unei compoziţii ale acestora. În unele variante de realizare a prezentei invenţii NDV himeric conţine un genom, genomul conţinând un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune (de exemplu, un agonist al receptorului costimulator al unei celule imune) şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune (de exemplu, un antagonist al unui receptor inhibitor al unei celule imune). În anumite realizări genomul NDV conţine, de asemenea, o proteină F mutantă.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului utilizând un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric cum este descris în secţiunea 5.2 în continuare) sau o compoziţie care conţine un asemenea NDV în combinaţie cu una sau mai multe alte terapii. Într-o realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului care prevăd administrarea la un subiect a unui NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric, cum este descris în secţiunea 5.2.1 în continuare) şi una sau mai multe alte terapii. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului, care prevăd administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente de un NDV, conform prezentei invenţii, sau de o compoziţie cu conţinut de o cantitate eficientă de un NDV, conform prezentei invenţii, şi una sau mai multe alte terapii. NDV şi una sau mai multe alte terapii pot fi administrate subiectului concomitent sau succesiv. În anumite realizări NDV şi una sau mai multe alte terapii sunt administrate în aceeaşi compoziţie. În alte realizări NDV şi una sau mai multe alte terapii sunt administrate în diferite compoziţii. NDV şi una sau mai multe alte terapii pot fi administrate subiectului prin aceleaşi căi sau prin căi diferite de administrare.

Orice tip sau tulpină de NDV pot fi utilizate într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, incluzând, dar nefiind exhaustive, tulpini, variante sau mutanţi nativi, virusuri mutagenizate, reasortante şi/sau virusuri modificate genetic. Într-o realizare concretă NDV, utilizat într-o combinaţie cu una sau mai multe alte terapii, este o tulpină nativă. Într-o altă variantă de realizare NDV, utilizat în combinaţie cu una sau mai multe alte terapii, este un NDV himeric. Într-o variantă de realizare a prezentei invenţii NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând o citokină (de exemplu, IL-2, IL-7, IL-15, IL-17, IL-21 sau). În realizările specifice citokina este exprimată în celule infectate cu NDV himeric. Într-o variantă de realizare NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând un antigen tumoral. În realizările specifice antigenul tumoral este exprimat în celulele infectate cu NDV himeric. Într-o variantă de realizare NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând o moleculă proapoptotică sau o moleculă antiapoptotică. În realizările specifice molecula proapoptotică sau antiapoptotică este exprimată în celulele infectate cu NDV himeric.

Într-o altă variantă de realizare NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune (de exemplu, un agonist al receptorului costimulator al unei celule imune) şi/sau un antagonist al un semnal inhibitor al unei celule imune (de exemplu, un antagonist al unui receptor inhibitor al unei celule imune). În variantele concrete de realizare agonistul şi/sau antagonistul sunt exprimaţi în celulele infectate cu NDV himeric. În anumite realizări genomul NDV conţine, de asemenea, o proteină F mutantă. În anumite realizări una sau mai multe terapii, folosite în combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, este una sau mai multe alte terapii descrise în secţiunea 5.6.4 în continuare. În realizările particulare acea una sau mai multe terapii, folosite în combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, este un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune (de exemplu, secţiunea 5.6.4.1 în continuare). Exemple de agonişti ai unui semnal costimulator al unei celule imune şi de antagonişti ai unui semnal inhibitor al unei celule imune sunt prezentate, de exemplu, în secţiunea 5.2.1 în continuare. Într-o variantă de realizare antagonistul unui semnal inhibitor al unei celule imune este anticorpul anti-CTLA-4, descris în secţiunile 6 şi 7 în continuare. Într-o altă realizare specifică antagonistul unui semnal inhibitor al unei celule imune este anticorpul anti-PD-1 sau un anticorp anti-PD-L1 descris în secţiunea 7 în continuare. Într-o altă variantă concretă de realizare agonistul unui semnal costimulator al unei celule imune este ligandul ICOS, descris în secţiunile 6 şi 7 în continuare.

Terminologia

Aşa cum este utilizat aici, termenul "aproximativ" sau "circa", când este utilizat în conjuncţie cu un număr, se referă la orice număr constituind 1,5 sau 10% din numărul de referinţă.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "agonist (agonişti)" se referă la o moleculă (molecule) care se leagă la o altă moleculă şi induce (induc) o reacţie biologică. Într-o variantă de realizare un agonist este o moleculă care se leagă la un receptor de pe o celulă şi declanşează unul sau mai multe căi de transducţie a semnalului. De exemplu, un agonist include un anticorp sau un ligand, care se leagă la un receptor de pe o celulă şi induce una sau mai multe căi de transducţie a semnalului. În anumite realizări anticorpul sau ligandul se leagă la un receptor de pe o celulă şi induce una sau mai multe căi de transducţie a semnalului. În alte exemple de realizare agonistul facilitează interacţiunea ligandului nativ cu receptorul nativ.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "antagonist (antagonişti)" se referă la o moleculă (molecule) care inhibă acţiunea unei alte molecule fără a provoca un răspuns biologic ca atare. Într-o variantă de realizare un antagonist este o moleculă care se leagă la un receptor de pe o celulă şi blochează sau diminuează activitatea biologică a unui agonist. De exemplu, un antagonist include un anticorp sau un ligand care se leagă la un receptor de pe o celulă şi blochează sau diminuează legarea ligandului nativ la celula fără a induce una sau mai multe căi de transducţie a semnalului. Un alt exemplu de un antagonist include un anticorp sau un receptor solubil, care concurează cu receptorul nativ pe celulele pentru legare la ligandul nativ, şi, astfel, blocând sau atenuând una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, indus atunci când receptorul nativ se leagă la ligandul nativ.

Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii "anticorp" şi "anticorpi" se referă la molecule, care conţin un locus de legare a antigenului, de exemplu, imunoglobuline. Anticorpii includ, dar nefiind exhaustivi, anticorpi monoclonali, anticorpi bispecifici, anticorpi multispecifici, anticorpi umani, anticorpi umanizaţi, anticorpi sintetici, anticorpi himerici, anticorpi policlonali, anticorpi cu un singur domeniu, anticorpi camelizaţi, fragmente Fv dintr-un singur lanţ (scFv), anticorpi dintr-un lanţ unic, fragmente Fab, fragmente F(ab'), fragmente Fv(sdFv) bispecifice legate prin disulfură, intracorpi şi anticorpi antiidiotipici (anti-ld) (inclusiv, de exemplu, anticorpi anti-ld şi anticorpi anti-anti-ld la anticorpi), precum şi fragmente din oricare din anticorpii menţionaţi legaţi prin epitop. În particular, anticorpii includ molecule de imunoglobulină şi fragmente active imunologic de molecule de imunoglobulină. Molecule de imunoglobulină pot fi de orice tip (de exemplu, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA şi IgY), clasă (de exemplu, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 şi lgA2) sau subclasă. Într-o variantă de realizare anticorpul este un anticorp uman sau umanizat. Într-o altă realizare concretă anticorpul este un anticorp monoclonal sau un fragment scFv. În anumite realizări anticorpul este un anticorp monoclonal uman sau umanizat sau un fragment scFv. În alte exemple de realizare anticorpul este un anticorp bispecific. În anumite realizări anticorpul bispecific se leagă specific la un receptor costimulator al unei celule imune sau la un receptor inhibitor al sistemului imunitar şi la un receptor pe o celulă canceroasă. În unele variante anticorpul bispecific se leagă în mod specific la doi receptori ai celulelor imune, de exemplu, la doi receptori costimulatori pe celulele imune, doi receptori inhibitori pe celulele imune sau la un receptor costimulator pe celulele imune şi un receptor inhibitor pe celulele imune.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "derivat" în contextul proteinelor sau polipeptidelor se referă la: (a) o polipeptidă care este, cel puţin, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, sau 99% sau 40% până la 65%, 50% până la 90%, 65% până la 90%, 70% până la 90%, 75% la 95%, 80% până la 95%, sau 85% până la 99% identică cu o polipeptidă nativă; (b) o polipeptidă codificată cu o secvenţă de acid nucleic care este, cel puţin, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , 98%, sau 99% sau de 40% până la 65%, 50% până la 90%, 65% până la 90%, 70% până la 90%, 75% până la 95%, 80% până la 95%, sau 85% până la 99% identică cu o secvenţă de acid nucleic care codifică o polipeptidă nativă; (c) o polipeptidă care conţine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sau mai mult, sau 2 la 5, 2 până la 10, 5 până la 10, 5 până la 15, 5 până la 20, 10 până la 15 sau 15 până la 20 mutaţii aminoacide (adică, adiţii, deleţii şi/sau substituţii), comparativ cu o polipeptidă nativă; (d) o polipeptidă codificată cu secvenţa de acid nucleic, care poate hibridiza în condiţii de hibridizare de stringenţă înaltă, moderată sau tipică la o secvenţă de acid nucleic, care codifică o polipeptidă nativă; (e) o polipeptidă codificată cu o secvenţă de acid nucleic care poate hibridiza în condiţii de hibridizare de stringenţă înaltă, moderată sau tipică cu o secvenţă de acid nucleic, care codifică un fragment dintr-o polipeptidă nativă constând din cel puţin 10 aminoacizi adiacenţi, cel puţin 12 aminoacizi adiacenţi, cel puţin 15 aminoacizi adiacenţi, cel puţin 20 de aminoacizi adiacenţi, cel puţin 30 de aminoacizi adiacenţi, cel puţin 40 de aminoacizi adiacenţi, cel puţin 50 de aminoacizi adiacenţi, cel puţin 75 de aminoacizi adiacenţi, cel puţin 100 de aminoacizi adiacenţi, cel puţin 125 de aminoacizi adiacenţi, cel puţin 150 de aminoacizi adiacenţi sau 10 până la 20, 20 până la 50, 25 până la 75, 25 până la 100, 25 până la 150, 50 până la 75, 50 până la 100, 75 până la 100, 50 până la 150, 75 până la 150, 100 până la 150, sau 100 până la 200 aminoacizi adiacenţi; sau (f) un fragment al unei polipeptide native. Derivaţii includ, de asemenea, o polipeptidă care conţine secvenţa de aminoacid al unei forme mature native de o polipeptidă de mamifer şi o secvenţă aminoacidă de peptidă de semnalizare heteroloagă. Adiţional, derivaţii includ polipeptide care au fost modificate chimic, de exemplu, prin glicosilare, acetilare, pegilare, fosforilare, amidare, de obţinere a derivaţilor cu grupe de protecţie/de blocare cunoscute, clivaj proteolitic, legătura la un ligand celular sau la un alt fragment proteic, etc. În continuare derivaţii includ polipeptide, care conţin unul sau mai mulţi aminoacizi neclasici. Într-o realizare, un derivat este izolat. În variantele concrete de realizare derivatul păstrează una sau mai multe funcţii ale polipeptidelor native din care a fost derivat.

Procentul de identitate poate fi determinat folosind orice metodă cunoscută de către specialiştii în domeniu. Într-o variantă de realizare procentul de identitate se determină utilizând programul "Best Fit" sau "Gap" din Sequence Analysis Software Package (Versiunea 10; Genetics Computer Group, Inc., Universitatea din Wisconsin Biotehnology Center, Madison, Wisconsin). Informaţiile cu privire la condiţiile de hibridizare (de exemplu, condiţii de stringenţă moderată şi tipică) au fost deja publicate (Park et al. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA, no 103, 2006, p. 8203-2808) (de exemplu, paragrafele 72…73).

Aşa cum este utilizat aici, termenul "fragment", reprezentând un fragment dintr-un agent proteic (de exemplu, o proteină), se referă la un fragment constituit din 8 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 10 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 15 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 20 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 25 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 50 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 75 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 100 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 150 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi, 200 sau mai mulţi aminoacizi adiacenţi sau conţinând 10 până la 300 aminoacizi adiacenţi, 10 până la 200 aminoacizi adiacenţi, 10 până la 250 aminoacizi adiacenţi, 10 până la 150 aminoacizi adiacenţi, 10 până la 100 aminoacizi adiacenţi, 10 până la 50 aminoacizi adiacenţi, 50 până la 100 aminoacizi adiacenţi, 50 până la 150 aminoacizi adiacenţi, 50 până la 200 aminoacizi adiacenţi, 50 până la 250 aminoacizi adiacenţi, 50 până la 300 aminoacizi adiacenţi, 25 până la 50 aminoacizi adiacenţi, 25 până la 75 aminoacizi adiacenţi, 25 până la 100 aminoacizi adiacenţi sau 75 până la 100 aminoacizi adiacenţi ai unui agent proteic. Într-o variantă de realizare un fragment dintr-un agent proteic păstrează una sau mai multe din funcţiile agentului proteic - cu alte cuvinte, acesta este un fragment funcţional. De exemplu, un fragment dintr-un agent proteic păstrează capacitatea de a interacţiona cu o altă proteină şi/sau de a induce, amplifica sau activa una sau mai multe căi de transducţie a semnalului.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "fragment funcţional", în contextul unui agent proteic, se referă la o porţiune dintr-un agent proteic, care păstrează una sau mai multe activităţi sau funcţii ale agentului proteic. De exemplu, un fragment funcţional al unui receptor inhibitor poate menţine capacitatea de a se lega la unul sau mai mulţi dintre liganzii săi. Un fragment funcţional dintr-un ligand al unui receptor costimulator poate păstra capacitatea de a se lega la receptor şi/sau de a amplifica sau de a activa una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, mediate prin legarea ligandului la receptorul său costimulator.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "heterolog" se referă o entitate care în natură nu este întâlnită, ceea ce se leagă (de exemplu, se codifică şi/sau se exprimă cu genomul) cu un NDV nativ.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "persoană umană în vârstă" se referă la o fiinţă umană de 65 ani sau mai în vârstă.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "persoană umană adultă" se referă la un om care este de 18 ani sau mai în vârstă.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "copil uman" se referă la o fiinţă umană cu vârstă de la 1 an până la 18 ani.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "copil mic" se referă la o fiinţă umană cu vârstă de la 1 an până la 3 ani.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "bebeluş" se referă la un nou-născuţii până la 1 an.

În anumite realizări, termenii "extrem de fusogenic" şi "creşterea activităţii fusogenice", etc., aşa cum este utilizat aici, se referă la o creştere a abilităţii NDV de a forma sinciţiu implicând un număr mare de celule. Într-o variantă de realizare celulele infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii, care este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă, au o capacitate crescută de a forma sinciţiu, comparativ cu celulele infectate cu virusul parental din care virusul este derivat, virusul parental având proteina F fără mutaţii. Într-o altă realizare specifică, aproximativ 10% până la circa 25%, aproximativ 25% până la aproximativ 50%, aproximativ 25% până la aproximativ 75%, aproximativ 50% până la aproximativ 75%, aproximativ 50% până la circa 95% sau aproximativ 75% până la aproximativ 99%, sau aproximativ 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, sau 99% şi mai multe din celulele infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii, care este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă, formează sinciţiu, comparativ cu numărul de celule care formează sinciţiu şi sunt infectate cu virusul parental de la care virusul himeric este derivat şi care are o proteină F fără mutaţii. În anumite realizări sinciţiul este cuantificat microscopic prin numărarea numărului de nuclee per sinciţiu după o anumită perioadă de timp (de exemplu, de circa 8 ore până la aproximativ 12 oră, de aproximativ 12 ore până la aproximativ 24 ore, de aproximativ 24 ore până la circa 36 ore sau de aproximativ 36 ore până la aproximativ 48 ore).

Aşa cum este utilizat aici, termenul "antagonist al interferonului" se referă la un agent care reduce sau inhibă răspunsul imun celular de interferon. Într-o realizare un antagonist de interferon este un agent proteic, care reduce sau inhibă răspunsul imun celular de interferon. Într-o variantă de realizare un antagonist de interferon este o proteină sau o polipeptidă virală, care reduce sau inhibă răspunsul celular de interferon.

Într-o variantă concretă de realizare a prezentei invenţii un antagonist de interferon este un agent care reduce sau inhiba expresia şi/sau activitatea interferonului. Într-o realizare antagonistul de interferon reduce sau inhibă expresia şi/sau activitatea IFN de tip I. Într-o altă realizare antagonistul de interferon reduce sau inhibă expresia şi/sau activitatea IFN de tip II. Într-o altă realizare antagonistul de interferon reduce sau inhibă expresia şi/sau activitatea IFN de tip III. Într-o variantă de realizare antagonistul de interferon reduce sau inhibă expresia şi/sau activitatea fie a IFN-α, sau IFN-β, sau a ambelor. Într-o altă realizare specifică antagonistul de interferon reduce sau inhibă expresia şi/sau activitatea IFN-Γ. Într-o altă realizare antagonistul de interferon reduce sau inhibă expresia şi/sau activitatea unui, a doi sau a toţi IFN-α, IFN-β şi IFN-Γ.

În anumite variante de realizare expresia şi/sau activitatea IFN-α, IFN-β şi/sau IFN-Γ într-un ou embrionat sau în celule este redusă cu un antagonist de interferon aproximativ de 1 până la aproximativ 100 de ori, aproximativ de 5 până la aproximativ 80 de ori, aproximativ de 20 până la aproximativ 80 de ori, aproximativ de 1 până la aproximativ 10 de ori, aproximativ de 1 până la aproximativ 5 de ori, aproximativ de 40 până la aproximativ 80 de ori sau de 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 , 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 sau 100 de ori, comparativ cu expresia şi/sau activitatea IFN-α, IFN-β şi/sau IFN-Γ într-un ou embrionat de control sau într-o celulă care nu exprimă sau nu contactează cu astfel de antagonist de interferon, măsurată prin metodele descrise aici sau cunoscute de specialiştii în domeniu. În alte exemple de realizare expresia şi/sau activitatea IFN-α, IFN-β şi/sau IFN-Γ într-un ou embrionat sau în celule la utilizarea unui antagonist al interferonului este redusă cel puţin cu 20% până la 25%, cel puţin cu 25% până la 30%, cel puţin cu 30% până la 35%, cel puţin cu 35% până la 40%, cel puţin cu 40% până la 45%, cel puţin cu 45% până la 50%, cel puţin cu 50% până la 55%, cel puţin cu 55% până la 60%, cel puţin cu 60% până la 65%, cel puţin cu 65% până la 70%, cel puţin cu 70% până la 75%, cel puţin cu 75% până la 80%, cel puţin cu 80% până la 85%, cel puţin cu 85% până la 90%, cel puţin cu 90% până la 95%, cel puţin cu 95% până la 99% sau cu 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% sau 99%, comparativ cu expresia şi/sau activitatea IFN-α, IFN-β şi/sau IFN-Γ intr-o ou de control embrionat sau într-o celulă care nu exprimă sau nu contactează cu astfel de antagonist de interferon, măsurată prin metodele descrise aici sau cunoscute de specialiştii în domeniu.

Aşa cum sunt utilizate aici expresiile "sisteme IFN deficitare" sau "substraturi deficiente de IFN" se referă la sisteme, de exemplu, celule, linii celulare şi animale, cum ar fi şoareci, găini, curcani, iepuri, şobolani, cai, etc., care nu produc una, două sau mai multe tipuri de IFN, sau nu produc nici un fel de IFN, sau produc niveluri reduse de unul, două sau mai multe tipuri de IFN, sau produc niveluri reduse de orice tip de IFN (de exemplu, o reducere a expresiei de orice IFN cu 5…10%, 10…20%, 20…30%, 30…40%, 40…50%, 50…60%, 60…70%, 70…80%, 80…90% sau mai mult, în comparaţie cu sistemele competente de IFN în aceleaşi condiţii), nu răspund sau răspund mai puţin eficient la unul, două sau mai multe tipuri de IFN, sau nu răspund la orice tip de IFN, au un răspuns întârziat la unul, două sau mai multe tipuri de IFN şi/sau sunt deficitare în activitatea genelor antivirale indusă de unul, două sau mai multe tipuri de IFN, sau indusă cu orice tip de IFN.

Aşa cum este utilizat aici, termenii "legături imunospecifice" "identificatori imunospecifici," "legături specifice" şi "identificatori specifici" sunt termeni similari în contextul anticorpilor şi se referă la molecule care se leagă specific la un antigen (de exemplu, epitop sau un complex imunitar), cum este înţeles de către un specialist în domeniu. O moleculă, care se leagă specific la un antigen se poate lega la alte peptide sau polipeptide cu afinitate mai redusă, determinată prin, de exemplu, imunoteste (de exemplu, ELISA), rezonanţa suprafeţei plasmonului (de exemplu, BIAcore®), testul KinEx (folosind, de exemplu, un instrument KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID)), sau prin alte analize cunoscute în domeniu. Într-o variantă de realizare molecule care se leagă în mod specific la un antigen, se leagă la antigen cu o constantă de disociere (de exemplu, Ka), care este de cel puţin 2 log, 2,5 log, 3 log, 3,5 log, 4 log sau mai mare decât Ka, atunci când moleculele se leagă la alt antigen. Într-o altă variantă de realizare moleculele care se leagă specific la un antigen nu reacţionează încrucişat cu alte proteine.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "anticorp monoclonal" este un termen în domeniu şi, în general, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie de anticorpi omogeni sau substanţial omogeni şi fiecare anticorp monoclonal va recunoaşte în mod tipic un singur epitop (de exemplu, o singură conformaţie epitop) pe antigen.

Aşa cum este utilizat aici, fraza "multiplicitatea infecţiei" sau "MOI" este numărul mediu de virus per celulă infectată. MOI se determină prin împărţirea numărului de virus adăugat (ml adăugate x Pfu) la numărul de celule adăugate (ml adăugate x celule/ml).

Aşa cum este utilizat aici, termenul "ligand nativ" se referă la orice ligand natural care se leagă la un receptor natural. Într-o variantă de realizare ligandul este un ligand de mamifer. Într-o altă realizare specifică ligandul este un ligand uman.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "polipeptidă (polipeptide) nativă (native)" în contextul proteinelor sau polipeptidelor se referă la orice secvenţă aminoacidă naturală, inclusiv la forme imature sau precursoare şi mature ale unei proteine. Într-o variantă de realizare polipeptida nativă este o proteină sau polipeptidă umană.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "receptor nativ" se referă la orice receptor natural care se leagă la un ligand natural. Într-o variantă de realizare receptorul este un receptor de mamifer. Într-o altă realizare specifică receptorul este un receptor uman.

Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii "subiect" sau "pacient" sunt utilizaţi interschimbabil. Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii "subiect" şi "subiecţi" se referă la un animal. În unele variante de realizare subiectul este un mamifer, inclusiv care nu este primat (de exemplu, cămilă, măgar, zebră, bovină, cal, pisică, câine, şobolan şi şoarece), precum şi un primat (de exemplu, maimuţă, cimpanzeu şi om). În unele variante de realizare subiectul este un mamifer non-uman. În anumite realizări subiectul este un animal de companie (de exemplu, câine sau pisica) sau animale de fermă (de exemplu, cal, porc sau vacă). În alte exemple de realizare subiectul este o fiinţă umană. În anumite realizări mamiferul (de exemplu, uman) este de vârstă de 0 până la 6 luni, 6 până la 12 luni, 1 până la 5 ani, 5 până la 10 de ani, 10 până la 15 de ani, 15 până la 20 de ani, 20 până la 25 de ani, 25 până la 30 de ani, 30 până la 35 de ani, 35 până la 40 de ani, 40 până la 45 de ani, 45 până la 50 de ani, 50 până la 55 de ani, 55 până la 60 de ani, 60 până la 65 de ani, 65 până la 70 de ani, 70 până la 75 de ani, 75 până la 80 de ani, 80 până la 85 de ani, 85 până la 90 de ani, 90 până la 95 de ani sau 95 până la 100 de ani. În realizările specifice subiectul este un animal care nu este aviar.

Aşa cum sunt utilizaţi aici termenii "a trata" şi "tratare", în contextul administrării unui tratament, se referă la un tratament/terapie de la care un subiect primeşte un efect benefic, cum ar fi reducerea, descreşterea, atenuarea, diminuarea, stabilizarea, remisia, suprimarea, inhibarea sau stoparea dezvoltării sau progresiei cancerului, sau unui simptom al acestuia. În anumite realizări tratamentul/terapia rezultă la un subiect cu cel puţin unul sau mai multe dintre următoarele efecte: (i) reducerea sau ameliorarea severităţii cancerului şi/sau a unui simptom asociat cu acesta; (ii) reducerea duratei unui simptom asociat cu cancerul; (iii) prevenirea reapariţiei unui simptom asociat cu cancerul; (iv) regresia cancerului şi/sau a unui simptom asociat cu acesta; (v) reducerea spitalizări unui subiect; (vi) reducerea duratei de spitalizare; (vii) creşterea supravieţuirii unui subiect; (viii) inhibarea progresiei cancerului şi/sau a unui simptom asociat cu acesta; (ix) consolidarea sau îmbunătăţirea efectului terapeutic al altei terapii; (x) reducerea sau eliminarea cancerului în populaţia de celule; (xi) reducerea creşterii unei tumori sau a unui neoplasm; (xii) micşorarea dimensiunilor tumorii; (xiii) reducerea în formarea unei tumori; (xiv) eradicarea, eliminarea sau controlul cancerului primar, regional şi/sau metastatic; (xv) reducerea numărului sau mărimii metastazelor; (xvi) reducerea mortalităţii; (xvii) creşterea ratei de supravieţuire a pacienţilor fără cancer; (xviii) creşterea supravieţuirii fără recidive; (xix) creşterea numărului de pacienţi în remisie; (xx) reducerea ratei de spitalizare; (xxi) menţinerea dimensiunilor tumorii şi lipsa creşterii tumorii sau măririi în dimensiuni a tumorii cu cel puţin 5% sau 10% după administrarea unei terapii, măsurată prin metode uzuale disponibile pentru un specialist în domeniu, cum ar fi RMN, raze roentgen şi CAT Scan; (xxii) prevenirea dezvoltării sau debutului cancerului şi/sau unui simptom asociat cu acesta; (XXIII) prelungirea duratei de remisiuni la pacienţi; (xxiv) reducerea numărului de simptome asociate cu cancerul; (XXV) creşterea supravieţuirii fără simptome a pacienţilor cu cancer şi/sau (XXVI) limitarea sau reducerea metastazelor. În unele realizări tratamentul/terapia administrată de un subiect nu vindecă cancerul, dar previne progresia sau agravarea bolii. În anumite realizări tratamentul/terapia administrată de un subiect nu împiedică instalarea/dezvoltarea cancerului, dar poate preveni instalarea simptomelor de cancer.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "în combinaţie", în contextul administrării terapiei (terapiilor) la un subiect, se referă la utilizarea a mai mult decât o terapie. folosirea termenului "în combinaţie" nu restricţionează ordinea în care terapiile sunt administrate la un subiect. o primă terapie poate fi administrată înainte (de exemplu, cu 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 oră, 2 ore, 4 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore, 1 săptămâni, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 8 săptămâni sau 12 săptămâni înainte de), concomitent cu, sau după (de exemplu, cu 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 oră , 2 ore, 4 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni, 4 săptămâni, 5 săptămâni, 6 săptămâni, 8 săptămâni sau 12 săptămâni după) administrarea unei a doilea terapii la un subiect.

Aşa cum sunt utilizaţi aici termenii "terapii" şi "terapie" se pot referi la orice protocol (protocoale), metodă (metode) şi/sau agent (agenţi) care poate (pot) fi utilizat (utilizaţi) în tratamentul cancerului. În anumite realizări termenii "terapii" şi "terapie" se referă la terapia biologică, terapia de susţinere, terapia hormonală, chimioterapie, imunoterapie şi/sau alte terapii utile în tratamentul cancerului. Într-o variantă de realizare terapia include terapia adjuvantă. De exemplu, folosind o terapie în combinaţie cu o terapie medicamentoasă, terapie biologică, chirurgie şi/sau o terapie de susţinere. În anumite realizări termenul "terapie" se referă la un NDV himeric, conform prezentei invenţii. În alte exemple de realizare termenul "terapie" se referă la un agent care nu este un NDV himeric.

Invenţia se explică prin desenele din fig. 1-fig. 47, care reprezintă:

Fig. 1, infecţia cu NDV amplifică expresia MHC I, MHC II şi ICAM-1 in vitro pe suprafaţa celulelor B16-F10 infectate (24 ore după infectare).

Fig. 2A-2E, tratamentul intratumoral cu NDV conduce la infiltrarea cu macrofagi, celule NK, celule efectoare CD8 şi CD4 şi reduce frecvenţa Treg. A) schema de studiu generală. B) total CD45 + infiltrate. C) total de celule imune de infiltrate. D) Sectoarele punctiforme reprezentative ale citometriei în flux corespunzătoare subpopulaţiilor CD4FoxP3+ şi FoxP3-. E) Raporturile Teff/Treg şi CD8/Treg.

Fig. 3A-3C, terapia cu NDV prezintă efecte benefice asupra micromediului tumorii în tumorile la distanţă. A) CD4FoxP3 şi FoxP3-. B) Numărul absolut de celule CD4 efectoare, Treg şi CD8 per gram de tumoare. C) Raporturile Teff/Treg şi CD8/Treg.

Fig. 4A-4C, limfocitele care infiltrează tumorile la distanta stimulează expresia markerilor de activare, liză şi proliferare. Sectoarele de expresie reprezentative pe celulele efectoare CD4 (stânga) şi procentele de conţinut corespunzătoare în celulele efectoare CD4, CD8, Treg (dreapta) sunt afişate pentru A) CD44, B) Granzima B şi C) Ki-67.

Fig. 5A-5D, monoterapia cu NDV reţine creşterea tumorilor la distanţă şi oferă o anumită protecţie împotriva relansării tumorii. Tumorile din flancurile bilaterale au fost stabilite, cum este arătat în fig. 2A, şi animalele au fost tratate şi s-a estimat supravieţuirea lor. A) Creşterea tumorilor (tratate) din flancul drept. B) Creşterea tumorilor (netratate) din flancul stâng. C) Supravieţuirea totală. Numerele din dreptunghiuri indică procentul animalelor fără tumori. D) Supravieţuirea la animalele vindecate de melanom B16-F10 tratate cu NDV, care în a 75 zi au fost reinfectate cu celule de melanom B16-F10. Rezultatele reprezentative din două experimente diferite cu câte 10 şoareci în grupă.

Fig. 6A-6B, limfocite care infiltrează tumoarea atât din tumoarea tratată, cât şi cea netratată activează CTLA-4 ca răspuns la terapia cu NDV. A) Sectoarele punctiforme reprezentative ale expresiei CTLA-4 în CD8, CD4 efectoare şi Treg în tumorile din dreapta (tratate). B) Sectoarele punctiforme reprezentative ale expresiei CTLA-4 în CD8, CD4 efectoare şi Treg în tumorile din stânga (netratate).

Fig. 7A-7C, terapia asociată cu NDV şi blocatori ai CTLA-4 îmbunătăţeşte efectul anti-tumoral în tumorile injectate şi în tumorile la distanţă. Tumorile B16 bilaterale în flancuri au fost instalate şi animalele au fost tratate aşa cum s-a arătat în fig. 2A cu sau fără anticorpi 9H10 anti-CTLA-4. A) Creşterea tumorilor tratate. B) Creşterea tumorilor la distanţă. Numerele în dreptunghiuri reprezintă procentul şoarecilor fără tumori. C) Supravieţuirea pe termen lung. Rezultatele reprezentative din 2 experimente diferite cu câte 10 şoareci în grupă.

Fig. 8, terapia asociată cu NDV şi anticorpi anti-CTLA-4 este eficientă sistemic împotriva tumorilor de prostată non-virus-permisive TRAMP. Flancul drept (ziua a 12) şi stâng (ziua a 3) tumorile TRAMP au fost instalate şi animalele au fost tratate cu NDV aşa cum este arătat în fig. 2A cu sau fără anticorpi anti-CTLA-4 sistemici. Este prezentă creşterea tumorilor pe stânga (netratate). Numerele din dreptunghiuri indică procentele de animale fără tumori.

Fig. 9A-9C, infecţia cu NDV amplifică exprimarea PD-L1 în tumorile B16-F10. A) Exprimarea PD-L1 pe suprafaţa celulelor B16-F10 infectate cu NDV timp de 24 ore. B) Exprimarea PD-L1 pe suprafaţa celulelor B16-F10 tratate cu supernatant, inactivat cu UV, din celulele B16-F10 infectate. C) Activarea PD-L1 pe suprafaţa celulelor tumorale izolate din tumorile injectate şi din tumorile îndepărtate de la animalele tratate ca în fig. 2A (2 imagini stângi - segmentele reprezentative de citometrie în flux, imaginea din dreapta - mediile calculate de la 5 şoareci din grupă).

Fig. 10A-10F, terapia combinată cu NDV şi anticorpi anti-PD-1 este eficientă sistemic împotriva melanomului B16 şi conduce la creşterea infiltraţiei cu celule T cu expresia crescută a markerilor de activare. A) Supravieţuirea totală. Animalele au fost tratate, aşa cum s-a arătat în fig. 2A, cu sau fără anticorp anti-PD-1. B) Numărul absolut de celule efectoare CD45, CD3, CD8, CD4 în tumori. C) Conţinutul procentual relativ de celule T reglatoare în limfocitele care infiltrează tumoarea. DE) Limfocitele care infiltrează tumoarea din tumorile indepărtate care au fost izolate şi colorate pentru expresia ICOS (D) şi Granzimei B (E). F) Limfocitele care infiltrează tumoarea au fost restimulate cu celule dendritice încărcate cu lizate tumorale şi evaluate pentru expresia gamma IFN prin colorarea citokinei intracelulare.

Fig. 11, terapia combinată cu NDV şi CTLA-4 induce activarea celulelor efectoare ICOS şi CD4 in tumorile îndepărtate şi ganglionii limfatici care drenează tumoarea (TDLN).

Fig. 12A-12D, generarea şi evaluarea in vitro a virusului NDV-ICOSL. A) Schema constructului genomic viral. B) Exprimarea ICOSL pe suprafaţa celulelor B16-F10 infectate timp de 24 de ore (histograma reprezentativă, la stânga şi media din 3 probe pentru fiecare grupă, dreapta). C) Activitatea citolitica a NDV în celulele B16-F10 infectate determinate prin analiza LDH. D) Replicarea NDV recombinant în celulele B16-F10.

Fig. 13A-13C, terapia combinată cu NDV-mICOSL şi anti-CTLA-4 protejează şoarecii de tumoarea provocată contralateral şi rezultă cu supravieţuirea animalelor pe termen lung. Animalele au fost provocate cu o doză mai mare de tumoare şi tratate cu NDV aşa cum este arătat în fig. 2A cu sau fără anticorp anti-CTLA-4 sistemic. Este prezentată creşterea tumorii pe stânga (neinjectate). B) Supravieţuirea pe termen lung. Numerele în dreptunghi indică procentul de animale protejate de tumori. Datele colectate din 3 experimente diferite cu câte 5…10 şoareci din grupă. C) La şoarecii trataţi cu terapie combinată, în locul tumorilor anterioare au dezvoltat vitiligo, dar nu sistemic.

Fig. 14A-14B, terapia combinată cu NDV-mICOSL şi anticorpi anti-CTLA-4 protejează şoarecii de tumoarea provocată contralateral şi rezultă cu supravieţuirea animalelor pe termen lung în modelul de carcinom de colon CT26. Animalele au fost provocate cu o doză mai mare de tumoare şi tratate cu NDV aşa cum este arătat în fig. 2A cu sau fără anticorp anti-CTLA-4 sistemic. Este prezentată creşterea tumorii pe stânga (neinjectată). Numerele în dreptunghiuri indică procentul de animale protejate de tumori. B) Supravieţuirea pe termen lung. Experimentul reprezentativ cu câte 5…10 şoareci în grupă (A) şi date colectate din 2 experimente diferite cu câte 5…10 şoareci în grupă (B).

Fig. 15A-15C, tratamentul cu NDV conduce la infiltrarea tumorii B16 la distanţă cu macrofagi, celule NK, celule efectoare CD8 şi CD4 şi reduce frecvenţa Treg. A) Totalul de infiltrate cu CD45+, CD3+, CD8+, CD4+ FoxP3-(Teff) şi CD4+ FoxP3+ (Treg). B) Raporturile Teff/Treg şi CD8/Treg. C) Totalul de celule macrofage, infiltrate cu celule NK şi NKT.

Fig. 16A-16B, limfocitele care infiltrează tumorile B16 la distanţa amplifică expresia markerilor de activare, liză şi proliferare. Sectoarele reprezentative de expresie a Ki-67, Granzimei B (GRB) şi ICOS (A) şi conţinutul procentual corespunzător de celule efectoare CD4 şi celule CD8 (B).

Fig. 17, limfocitele care infiltrează tumora de la animalele tratate secretă gama IFN ca răspuns la stimularea cu DC încărcate cu lizate B16-F10. Sunt prezentate sectoarele punctiforme reprezentative.

Fig. 18A-18B, animalele, la care s-a administrat tratament combinat, sunt protejate de altă tumoare provocată. A) Melanomul B16-F10, ziua a 120 de provocare repetată cu 1x105 celule. B) Carcinomul de colon CT26, ziua a 90 de provocare repetată cu 1x106 celule. Rezultatele reprezentative din două experimente diferite cu câte 10 şoareci în grupă.

Fig. 19A-19B, proteina himerică recombinantă ICOSL-F este eficientă în expresia pe suprafaţă. A) Reprezentarea schematică a proteinei himerice. B) Expresia proteinei de fuziune himerică ICOSL-FTM pe suprafaţa celulelor transfectate.

Fig. 20A-20D, infecţia cu NDV este limitată de tumoarea injectată. A) NDV-Fluc recombinant s-a fost administrat intratumoral (IT) sau intravenos (IV) la animalele de linia Balb/C purtând tumori CT26 şi imaginile dobândite în următoarele 72 de ore. B) NDV-Fluc s-a administrat la şoarecii din linia C57BL/6 purtători de melanom B16-F10 bilateral şi animalele au fost monitorizate timp de 120 de ore. Sunt prezentate imaginile luminiscente reprezentative. C) Cuantificarea luminescenţei de pe locul tumorii normalizate până după luminescenţa de fond. D) Aria sub curbă (AUC) calculată în baza datelor de pe grafice (C). Datele arată rezultate reprezentative în 1 din 3 experimente independente cu 3…5 şoareci/grup. *** p <0,001.

Fig. 21A-21F, infecţia cu NDV creşte infiltrarea tumorii cu leucocite în tumorile injectate cu virus. Animalele au fost tratate conform schemei descrise în fig. 22A. Tumorile au fost excizate în a 15 zi şi TIL au fost marcate şi analizate prin citometrie în flux. A) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual de celule CD45+ şi CD3+ care infiltrează tumoarea. B) Numărul absolut de celule CD45+/g de tumoare. C) Numărul absolut de celule imune naturale/g de tumoare. D) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual de celule CD4+FoxP3+(Treg) şi CD4+FoxP3-(T conv). E) Numărul absolut de celule obişnuite şi reglatorii CD4+ şi celule CD8+/g de tumoare. F) Raporturile calculate Tconv/Treg şi CD8+/Treg în tumori. Datele reprezintă rezultatele cumulate din 3 experimente independente cu 3…5 şoareci/grupă. Este prezentată valoarea medie +/-SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001.

Fig. 22A-22M, NDV amplifică infiltrarea limfocitelor în tumorile la distanţă şi încetineşte creşterea tumorii. A) Schema de tratament. B) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual al celule CD45+ şi CD3+ care infiltrează tumoarea. C) Numărul absolut de celule CD45+/g de tumoare. D) Numărul absolut de celule imune naturale/g de tumoare. E) Secţiunile histologice de tumoare din tumorile la distanţă au fost colorate cu H&E (imaginile superioare) sau marcate pentru vizualizare CD3 şi FoxP3 (imaginile inferioare) şi analizate microscopic. Zonele, notate cu săgeţi, indică zone de necroză şi de infiltrate inflamatorii. Liniile de scară sunt egale cu 200 µm. F) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual al celulelor CD4+FoxP3+(Treg) şi CD4+FoxP3- (Tconv). G) Numărul absolut de celule obişnuite şi reglatoare CD4+ şi de celule CD8+/g de tumoare, calculat în baza citometriei în flux. H) Procentul relativ de Treg din celulele CD45+. I) Rapoartele calculate Tconv/Treg şi CD8+/Treg. (J, K) Activarea ICOS, Granzimei B şi Ki-67 pe celulele Tconv (J) şi CD8+ (K) care infiltrează tumoarea. L) Creşterea tumorilor injectate cu NDV şi tumorilor la distanţă. M) Supravieţuirea generală a animalelor. Datele reprezintă rezultatele cumulate din 3 (B-K) sau 2 (L-M) experimente independente cu n = 3…5 per grupă. Este prezentată valoarea medie +/- SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001.

Fig. 23A-23E, terapia cu NDV amplifică infiltrarea limfocitelor în tumoare în modelul de melanom bilateral de lăbuţă. Animalele cu melanom de lăbuţă bilateral au fost tratate în conformitate cu programul descris în fig. 22A. Tumorile la distanţă au fost excizate în ziua a 15 şi TĪL au fost marcate şi analizate prin citometrie în flux. A) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual de celule CD45+ şi CD3+ care infiltrează tumoarea. B) Sectoarele reprezentative de citometrie în flux pentru conţinutul procentual de celule CD4+FoxP3+ şi CD4+FoxP3-. C) Numărul absolut de celule obişnuite şi reglatoare CD4+ şi celule CD8+/g de tumoare. D, E) Activarea ICOS, Granzimei B şi Ki-67 pe limfocitele CD8+ (D) şi Tconv (E) care infiltrează tumoarea. Datele arată rezultatele reprezentative pentru 1 din 2 experimente independente cu 5 şoareci/grup. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001.

Fig. 24A-24I, NDV induce infiltrarea limfocitelor adoptiv transferate specifice pentru tumoare şi contribuie la inflamaţia tumorii. A) Schema de tratament. B) Imagini luminiscente reprezentative de la animalele tratate cu NDV şi limfocite adoptiv transferate TRP1-Fluc. C) Cuantificarea luminescenţei medii din locurile tumorii. D) Aria de sub curbă (AUC) calculată din datele din grafice (C). E) Numărul absolut de limfocite Pmel din tumorile la distanţă, calculat în baza citometriei în flux. F) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual al celulelor CD45+ şi CD3+ infiltrate în tumorile îndepărtate la animalele tratate, conform schemei de tratament din imaginea (A). G) Schema experimentului de transfer de ser de la animalele tratate intratumoral cu o singură injecţie de NDV sau PBS. H) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual de celule CD45+ şi CD3+ în tumorile injectate infiltrate cu ser. I) Numărul absolut de subpopulaţii de celule indicate în tumorile injectate cu ser, calculat în baza citometriei în flux. Datele pentru imaginile B-E reprezintă 1 din 3 experimente cu n = 4…5 în grupă. Datele pentru imaginile G-I reprezintă datele colectate din 2 experimente independente cu n = 5 în grupă. Este prezentată valoarea medie +/-SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001.

Fig. 25, administrarea intratumoral a NDV oferă protecţie de tumoare reprovocată. La animalele vindecate de melanom B16-F10 cu NDV în ziua a 75 au fost injectate 1x105 celule de melanom B16-F10, fiind monitorizate pentru creşterea tumorii şi eutanaziate atunci când dimensiunea tumorilor a atins 1000 mm3. Este prezentată supravieţuirea generală a animalelor. Datele prezintă rezultatele cumulate în 1 din 2 experimente independente cu 10 şoareci/grupă. **** p <0,0001.

Fig. 26A-26B, limfocitele CD8+, care infiltrează tumoarea, activează CTLA-4 ca răspuns la terapia cu NDV. Sectoarele punctiforme reprezentative (stânga) şi rezultatele cumulate (dreapta) ale expresiei CTLA-4 în celulele CD8+ în tumorile tratate cu NDV (A) şi în tumorile la distanţă (B). Rezultatele reprezentative în 1 din 3 experimente cu 3 şoareci în grupă. * p <0,05.

Fig. 27A-27K, NDV şi blocatorii CTLA-4 sinergic amplifică respingerea tumorilor locale şi la distanţă. A) Schema de tratament. B) Creşterea (flancul drept) tumorilor B16-F10 tratate cu virus. C) Creşterea (flancul stâng) tumorilor B16-F10 la distanţă. D) Supravieţuirea pe termen lung în modelul cu B16-F10. E) Animalelor, care au supravieţuit, în ziua a 90 le-au fost injectate 1x105 celule B16-F10 în flancul drept şi a fost monitorizată supravieţuirea lor. Datele reprezintă rezultatele cumulate din 3 experimente cu n = 6…11 în grupă. F) Creşterea tumorilor TRAMP C2 tratate cu virus (flancul drept) şi la distanţă (flancul stâng). G) Supravieţuirea pe termen lung în modelul TRAMP C2. H) Sensibilitatea in vitro a celulelor B16-F10 şi TRAMP C2 la liza mediată cu NDV la diferite multiplicităţi ale infecţiei (MOI). I-K) Activarea MHC I, MHC II, CD80 şi CD86 în celulele B16-F10 şi TRAMP C2 infectate cu NDV. Sunt prezentate sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru celulele B16-F10 (I) şi semnificaţiile medii calculate ale intensităţii fluorescenţei medii (IFM) pentru celulele B16-F10 (J) şi TRAMP C2 (K). Este prezentată valoarea medie +/- SEM. Datele reprezintă rezultatele în 1 din 3 (BE) sau în 1 din 2 (F, G) experimente independente cu n = 5…10 în grupă. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001.

Fig. 28A-28E, efectul sistemic antitumoral este limitat de tipul tumorii injectate. A) Animalele au fost injectate în flancul drept cu melanom B16-F10, carcinom de colon MC38 sau PBS şi în flancul stâng cu celule B16-F10 şi tratate conform schemei. B, C) Creşterea tumorilor la distanta (B) şi supravieţuirea generală (C) la animalele care au primit B16-F10 pe flancul drept sau fără tumori pe flancul drept. Datele prezintă rezultatele reprezentative în 1 din 2 experimente independente cu 5…10 şoareci/grupă. D, E) Creşterea tumorilor la distanţă (D) şi supravieţuirea generală (E) la animalele care au primit pe dreapta tumori B16-F10 sau MC38. Datele reprezintă rezultatele în 1 din 2 experimente independente cu n = 10 în grupă. ** p <0,01; **** p <0,0001.

Fig. 29A-29E, terapia asociată cu NDV şi anti-CTLA-4 îmbunătăţeşte infiltrarea tumorii cu celule naturale şi adaptive ale sistemului imun. Animalele au fost tratate cu terapie combinată cum este arătat în fig. 27A. Tumorile au fost prelevate în ziua a 15 şi analizate pentru infiltrarea celulelor imune prin citometrie în flux. A) Numărul absolut de celule CD45+/g de tumoare. B) Numărul absolut de celule CD11b+ şi NK 1.1+/g de tumoare. C) Numărul absolut de celule CD4+ şi CD8+ obişnuite şi reglatorii/g de tumoare. D) Procentul relativ de Treg în celulele CD45+. E) Rapoartele calculate Tconv/Treg şi CD8+/Treg. Datele reprezintă rezultatele cumulate din 4 experimente independente cu 3…5 şoareci/grup. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0.0001.

Fig. 30A-30J, terapia asociată cu NDV şi blocatori CTLA-4 induce schimbări inflamatorii în tumorile la distanţă. Animalele au fost tratate, conform schemei din fig. 27A. Tumorile au fost prelevate în ziua a 15 şi analizate pentru prezenţa infiltrării celulelor imune. A) Secţiunile histologice ale tumorii din tumorile la distanţă au fost colorate cu H&E (imaginile superioare) sau pentru CD3 şi FoxP3 (imaginile inferioare) şi analizate prin microscopia cu lumină şi fluorescentă, respectiv. Zonele, notate cu săgeţi, indică necroză şi infiltrate inflamatorii. Liniile de scară sunt egale cu 200 µm. B) Numărul absolut de celule CD45+ şi CD3+ care infiltrează tumoarea/g de tumoare calculat în baza citometriei în flux. C) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual de celule CD4+ şi CD8+ care infiltrează tumoarea în populaţia de celule CD45+. D) Numărul absolut de Tconv, Treg şi celule CD8+/g de tumoare. E) Procentul relativ de celule Treg care infiltrează tumoarea în celulele CD45+. F) Rapoartele calculate Tconv/Treg şi CD8+/Treg. G-I) Activarea ICOS, Granzimei B şi Ki-67 în limfocitele CD8+ şi Tconv care infiltrează tumoarea. Sunt prezentate sectoarele reprezentative ale citometriei în flux (imaginile superioare) şi rezultatele cumulate (imaginile inferioare). J) TĪL au fost restimulate cu DC, cu lizate tumorale activate B16-F10 şi sinteza IFNΓ a fost determinată prin colorarea intracelulară a citokinelor. Sunt prezentate sectoarele reprezentative ale citometriei în flux (imaginea din stânga) şi rezultatele cumulate (imaginea din dreapta). Datele reprezintă rezultatele cumulate din 5 (A-I) sau 2 (J) experimente independente cu n = 3…5 în grupă. Este prezentată valoarea medie +/- SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0,0001.

Fig. 31, anticorpii la CD8, CD4 şi NK1.1 reduc numărul de celulele respective in vivo. Anticorpii de depleţie au fost injectaţi cum se discută în materiale şi metode în continuare. Probele de sânge s-au colectat în ziua a 5 şi examinate prin citometria în flux pentru celulele CD4+, CD8+ şi NK cu anticorpi neîncrucişaţi. Colorarea pozitivă este reprezentată cu linii orizontale. Sunt prezentate sectoarele reprezentative în 1 din 2 experimente independente cu 5 şoareci/grupă.

Fig. 32A-32F, activitatea antitumorală a terapiei combinate cu NDV depinde de celulele CD8+ şi NK şi de interferonii de tip I şi de tip II. A-C) Animalele au fost tratate cum s-a descris în fig. 27A cu sau fără folosirea anticorpilor pentru celulele CD4+, CD8+, NK sau IFNΓ. A) Creşterea tumorilor injectate. B) Creşterea tumorilor la distanţă. C) Supravieţuirea pe termen lung. D-F) Şase şoareci IFNAR-/- sau de aceeaşi vârstă C57BL au fost trataţi cum s-a descris în fig. 3A şi au fost monitorizaţi pentru creşterea tumorii. D) Creşterea tumorilor injectate. E) Creşterea tumorilor la distanţă. F) Supravieţuirea pe termen lung. Datele pentru toate imaginile reprezintă rezultatele cumulate din 2 experimente independente cu n = 3…10/grupă. * p <0,05, ** p <0,01; *** p <0,001; **** p <0.0001.

Fig. 33A-33B, terapia cu NDV conduce la activarea PD-L1 în tumori şi în leucocitele care infiltrează tumoarea. A). Expresia PD-L1 pe celulele B16-F10 infectate in vitro (imaginea stângă) şi in vivo, în tumorile injectate cu virus şi în tumorile la distanţă. În stânga, histogramele reprezentative ale citometriei în flux; în dreapta, valorile medii ale intensităţii fluorescenţei mediane (MFI) pentru expresia PD-L1 pe celulele B16-F10 din tumori. B) Expresia PD-L1 pe suprafaţa leucocitelor, care infiltrează tumoarea, izolate din tumorile la distanţă. În stânga: histograme reprezentative ale citometriei în flux, în dreapta: mediile calculate MFI pentru fiecare subpopulaţie de celule.

Fig. 34A-34D, terapia combinată cu NDV şi anticorpi de blocare a PD-1 conduce la o mai bună eficacitate antitumorală pe modelul de melanom B16 bilateral în flancuri. A) Schema de tratament. B) Creşterea tumorii din flancul drept (injectate cu NDV). C) Creşterea tumorii din flancul stâng (la distanţă). D) Supravieţuirea generală.

Fig. 35A-35D, terapia combinată cu NDV şi anticorpi de blocare a PD-L1 conduce la o eficienţă antitumorală mai înaltă pe modelul de melanom B16 bilateral în flancuri. A) Schema de tratament. B) Creşterea tumorii din flancul drept (injectate cu NDV). C) Creşterea tumorii din flancul stâng (la distanţă). D) Supravieţuirea generală..

Fig. 36A-36E, terapia asociată cu NDV şi anticorpi anti-PD-1 rezultă cu creşterea infiltraţiei tumorii la distanţă cu celulele T efectoare, dar nu reglatoare. A) Sectoarele reprezentative ale de citometriei în flux pentru conţinutul procentual al celulelor CD4+ şi CD8+ în tumori. B) Sectoarele reprezentative ale de citometriei în flux pentru conţinutul procentual al celulelor Tconv (CD4+FoxP3-) şi Treg (CD4+FoxP3+). C) Numărul absolut de subpopulaţii de celule T/g de tumoare, calculat în baza citometriei în flux. D) Conţinutul procentual relativ de Treg din celulele T CD4 +. E) Rapoartele calculate pentru Tconv/Treg şi CD8/Treg.

Fig. 37A-37B, TĪL din tumorile la distanţă la animalele tratate cu combinaţie de NDV şi anticorpi anti-PD-1 activează expresia markerilor de liză şi de proliferare. A) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux pentru conţinutul procentual de celule Tconv şi CD8+, pozitive pentru Granzima B şi Ki67. B) Conţinutul procentual de celule T Tconv şi CD8+, pozitive pentru Granzima B şi Ki67.

Fig. 38A-38C, NDV induce infiltrarea imună a tumorii şi activarea ICOS pe celulele CD4 şi CD8 în tumorile injectate cu virus şi în tumorile la distanţă. A) Schema de tratament. B) Exprimarea ICOS pe celulele CD4+ FoxP3- şi CD8+, care infiltrează tumoarea, izolate din tumorile injectate cu NDV (flancul drept). Sunt prezentate sectoarele reprezentative ale citometriei în flux (superior) şi valorile intensităţii fluorescenţei mediane (MFI) (inferior). C) Exprimarea ICOS pe celulele CD4+FoxP3- şi CD8+, care infiltrează tumoarea, izolate din tumorile la distanţă (flancul stâng). Sunt prezentate sectoarele reprezentative ale citometriei în flux (superior) şi valorile intensităţii fluorescenţei mediane (MFI) (inferior).

Fig. 39A-39D, generarea şi evaluarea in vitro a virusului NDV-ICOSL. A) Schema constructului genomic viral. B) Exprimarea ICOSL pe suprafaţa celulelor B16-F10 infectate timp de 24 de ore (histograma reprezentativă, la stânga şi valoarea medie din 3 probe pentru fiecare grupă, dreapta). C) Activitatea citolitica a NDV în celulele infectate B16-F10, determinată prin analiza LDH. D) Replicarea NDV recombinant în celulele B16-F10.

Fig. 40A-40F, NDV-ICOSL cauzează întârzierea creşterii tumorilor la distanţă şi induce infiltrarea cu limfocite a tumorii. Tumorile B16-F10 bilaterale pe flancuri, descrise mai sus, şi animalele au fost tratate cu 4 injecţii intratumorale de virus indicat în tumoarea dreaptă. A) Creşterea tumorilor injectate cu virus. B) Creşterea tumorilor la distanţă. C) Supravieţuirea generală. D) Numărul absolut de leucocite, care infiltrează tumoarea din dreapta (injectate cu virus). E) Numărul absolut de leucocite, care infiltrează tumoarea din stânga (la distanţă). F) Procentul relativ de Treg în tumorile la distanţă.

Fig. 41A-41E, terapia combinată cu NDV-ICOSL şi blocatori ai CTLA-4 rezultă cu rejecţia tumorilor injectate şi tumorilor la distanţă în modelul B16-F10 şi protejează împotriva reprovocării tumorii. A) Schema de tratament. B) Creşterea tumorilor injectate cu virus (dreapta). C) Creşterea tumorilor la distanţă (stânga). D) Supravieţuirea generală. E) Animalele care au supravieţuit în ziua a 90 au fost reprovocate pe flancul drept cu 2x105 celule B16-F10.

Fig. 42a-42e, terapia combinată cu NDV-ICOSL şi blocatori de CTLA-4 rezultă cu rejecţia tumorilor injectate şi tumorilor la distanţă în modelul CT26. A) Schema de tratament. B) Creşterea tumorilor injectate cu virus (dreapta). C) Creşterea tumorilor la distanţă (stânga). D) Supravieţuirea generală. E) Animalele care au supravieţuit în ziua a 90 au fost reprovocate pe flancul drept cu 2x105 celule CT26.

Fig. 43a-43j, terapia combinată cu NDV-ICOSL şi anticorpi anti-CTLA-4 conduce la amplificarea infiltrării tumorii cu celule naturale şi adaptive ale sistemului imun. Animalele cu tumori B16-F10 bilaterale pe flanc au fost tratate în conformitate cu schema descrisă în fig. 41a. În ziua a 15 animalele au fost sacrificate şi tumorile la distanţă au fost prelevate pentru analiza TIL. A) Sectoarele reprezentative ale citometriei în flux, care arată conţinutul de celule CD45+ şi CD3+ în toată populaţia de celule tumorale. Numărul absolut de celule Cd45+ (B), Cd11b+ (C) şi Nk1.1+ (D)/gram de tumoare a fost calculat în baza datelor citometriei în flux. E) Numărul absolut de Cd3+, Cd8+, Cd4+ Foxp3- (Cd4eff) şi Cd4+Foxp3+ (Treg)/gram de tumoare. F) Procentul relativ de Treg din totalul de celule CD45+. G) Rapoartele calculate efector/Treg. H, I, J) Procentul relativ de celule efectoare Cd8+ Şi Cd4+, care infiltrează tumoarea, pozitive pentru ICOS, Granzima B şi Ki67, respectiv.

Fig. 44A-44C, diagrama schematică pentru virusurile NDV recombinante generate adiţional, care exprimă proteine imunostimulatoare himerice şi native. A) Diagrama proteinelor himerice ale superfamiliei receptorilor TNF (GITRL, OX40L, 4-1BBL, CD40L) fuzionate la HN NDV în regiunea intracelulară şi transmembranară HN la capătul N terminal (imaginea superioară). Imaginea inferioară prezintă diagrama proteinelor himerice ale superfamiliei receptorilor pentru imunoglobulină cu domeniile extracelulare anti-CD28scfv şi ICOSL, fuzionate la regiunea intracelulară şi transmembranară a F la C terminal. B) Lungimea domeniului intracelular-transmembranar (HN şi F) şi domeniului extracelular al fiecărei dintre proteinele himerice descrise. C) Diagrama schematică a locusului de inserţie al transgenei şi lista cu toate NDV recombinante, care exprimă liganzi imunostimulatori, generaţi prin această strategie.

Fig. 45A-45C, confirmarea eliminării NDV recombinant. A) Testul de hemaglutinare demonstrează activitatea de hemaglutinare pozitivă în godeurile pentru NDV-HN-GITRL, NDV-aCD28scfv-F, NDV-HN-OX40L, NDV-HN-CD40L, NDV-IL15 şi NDV- IL21. B) Locaţiile primerului pentru confirmarea inserţiei genei în virusurile salvate cu RT-PCR. C) RT-PCR pe ARN izolat din virusurile salvate.

Fig. 46, celulele B16-F10 infectate cu NDV recombinante exprima liganzi pe suprafaţă. Celulele B16-F10 au fost infectate cu NDV recombinante indicate cu MOI, egal cu 2, şi peste 18 ore au fost analizate pentru exprimarea ligandului de suprafaţă prin citometria în flux. Sunt prezentate sectoarele reprezentative ale citometriei în flux.

Fig. 47, NDV-HN-4-1BBL induce creşterea infiltrării cu celule imune a tumorii la distanţă. Animalele cu melanoame B16 bilaterale pe flanc au fost tratate intratumoral pe un singur flanc cu virusul indicat anterior. După 3 tratamente animalele au fost eutanaziate şi limfocitele, care infiltrează tumoarea, din tumorile la distanţă au fost analizate prin citometria în flux. Este prezentat numărul total de celule CD3, CD4+FoxP3+ (Treg), CD4+FoxP3- (Tconv), CD8, NK şi CD11b, care infiltrează tumoarea/gram de tumoare.

Într-un aspect prezenta invenţie se referă la virusuri himerice ale bolii de Newcastle (NDV), proiectate pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune. Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat care codifică un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, în care agonistul este exprimat. Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom ambalat care codifică un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, în care antagonistul este exprimat.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode de propagare a NDV descrise aici (de exemplu, NDV himerice descrise aici). NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice descrise aici) pot fi propagate în orice celulă, subiect, ţesut, organ sau animal susceptibil de o infecţie cu NDV.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la compoziţii care conţin un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric descris aici). Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă la compoziţii farmaceutice care conţin un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric descris aici) şi un purtător farmaceutic acceptabil. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la compoziţii farmaceutice care conţin celulele canceroase infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris aici) şi un purtător farmaceutic acceptabil. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la compoziţii farmaceutice care conţin concentrat proteic din celulele canceroase lizate, infectate cu NDV (de exemplu, celulele canceroase infectate cu NDV himeric) şi un purtător farmaceutic acceptabil.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode pentru producerea compoziţiilor farmaceutice cu conţinut de un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris aici). Într-o realizare o metodă pentru producerea unei compoziţii farmaceutice prevede: (a) propagarea NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, a unui NDV himeric descris aici) într-o linie celulară, care este susceptibilă la o infecţie cu NDV şi (b) colectarea progeniturii virusului, în care virusul este crescut în cantităţi suficiente şi în condiţii suficiente ca virus necontaminat, astfel încât progenitura virusului este potrivită pentru formularea într-o compoziţie farmaceutică. Într-o altă realizare o metodă pentru producerea unei compoziţii farmaceutice prevede: (a) propagarea NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, a unui NDV himeric descris aici) într-un ou embrionat şi (b) colectarea progeniturii virusului, în care virusul este crescut în cantităţi suficiente şi în condiţii suficiente ca virus necontaminat, astfel încât progenitura virusului este potrivită pentru formularea într-o compoziţie farmaceutică.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului folosind un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris în continuare) sau o compoziţie conţinând un astfel de NDV himeric. Într-o variantă de realizare o metodă pentru tratarea cancerului prevede infectarea celulelor de cancer la un subiect care necesită aceasta cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric descris în continuare) sau cu o compoziţie a acestuia. Într-o altă variantă de realizare o metodă pentru tratarea cancerului constă în administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris în continuare) sau a unei compoziţii a acestuia. Într-o variantă concretă de realizare o cantitate eficientă de un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, de un NDV himeric descrisă în continuare) sau de o compoziţie cu conţinut de o cantitate eficientă de un NDV himeric, conform prezentei invenţii, este administrată unui subiect pentru tratarea cancerului. În realizările specifice NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune (de exemplu, un agonist al receptorului costimulator al unei celule imune) şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune (de exemplu, un antagonist al unui receptor inhibitor al unei celule imune), în care agonistul şi/sau antagonistul sunt exprimate cu NDV. În anumite realizări genomul NDV conţine, de asemenea, o proteină F mutantă. În anumite realizări pentru tratarea cancerului la un subiect se administrează două sau mai multe NDV himerice.

Într-o altă variantă de realizare o metodă pentru tratarea cancerului constă în administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unor celule canceroase infectate cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris în continuare) sau a compoziţiei acestuia. În realizările specifice celulele canceroase au fost tratate cu radiaţii gamma înainte de administrare la un subiect sau de încorporare în compoziţie. Într-o altă variantă de realizare o metodă pentru tratarea cancerului constă în administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui concentrat proteic sau a fragmentelor de membrane de plasmă de la celulele canceroase infectate cu un NDV himeric (de exemplu, cu un NDV himeric descris în continuare) sau cu o compoziţie a acestuia. În realizările specifice NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune (de exemplu, un agonist al receptorului costimulator al unei celule imune) şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune (de exemplu, un antagonist al unui receptor inhibitor al unei celule imune), în care agonistul şi/sau antagonistul este exprimat cu NDV. În anumite realizări genomul NDV conţine, de asemenea, o proteină F mutantă, care este exprimată cu NDV.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului folosind un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris în continuare) sau o compoziţie care conţine un astfel de NDV în combinaţie cu unul sau mai multe alte terapii. Într-o realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului care prevăd administrarea la un subiect a unui NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, a unui NDV himeric descris în continuare) şi a unei sau mai multe alte terapii. Într-o altă realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului care prevăd administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente de un NDV, conform prezentei invenţii, sau de o compoziţie conţinând o cantitate eficientă de un NDV, conform prezentei invenţii şi una sau mai multe alte terapii. NDV şi una sau mai multe alte terapii pot fi administrate subiectului concomitent sau succesiv. În anumite realizări NDV şi una sau mai multe alte terapii sunt administrate în aceeaşi compoziţie. În alte realizări NDV şi una sau mai multe alte terapii sunt administrate în diferite compoziţii. NDV şi una sau mai multe alte terapii pot fi administrate subiectului pe aceleaşi căi sau pe căi diferite.

Într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, poate fi utilizat orice tip sau tulpină de NDV inclusiv, dar nefiind exhaustive, tulpini native, variante sau mutante, virusuri mutagene, reasortate şi/sau virusuri modificate genetic. Într-o variantă de realizare NDV utilizat într-o combinaţie cu una sau mai multe alte terapii este o tulpină nativă. Într-o altă formă de realizare NDV utilizat în combinaţie cu unul sau mai multe alte terapii este un NDV himeric. Într-o variantă de realizare NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând citokine (de exemplu, IL-2, IL-7, IL-15, IL-17 sau IL-21). În realizările specifice NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând un antigen tumoral. În realizările specifice antigenul tumoral este exprimat în celulele infectate cu NDV himeric. Într-o altă variantă concretă de realizare NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând o moleculă proapoptotică (de exemplu, Bax, Bak, Bad, BID, Bcl-xS, Bim, Noxa, Puma, AIF, FasL şi TRAIL) sau o moleculă antiapoptotică (de exemplu, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 şi XIAP). În realizările specifice molecula proapoptotică sau molecula antiapoptotică este exprimată în celulele infectate cu NDV himeric. Într-o altă variantă de realizare NDV himeric conţine un genom ambalat, genomul conţinând un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune (de exemplu, un agonist al receptorului costimulator al unei celule imune) şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune (de exemplu, un antagonist al unui receptor inhibitor al unei celule imune). În realizările specifice agonistul şi/sau antagonistul sunt exprimate în celulele infectate cu NDV himeric. În anumite realizări genomul NDV conţine, de asemenea, o proteină F mutantă, un antigen tumoral, un antagonist heterolog de interferon, o moleculă proapoptotică şi/sau o moleculă antiapoptotică. În anumite realizări una sau mai multe terapii, folosite în combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, reprezintă una sau mai multe alte terapii descrise în continuare. În realizări particulare una sau mai multe terapii, folosite în combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, reprezintă un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune. De exemplu, în continuare sunt prezentate exemple de agonişti ai unui semnal costimulator al unei celule imune şi de antagonişti ai semnal inhibitor al unei celule imune. Într-o variantă de realizare antagonistul unui semnal inhibitor al unei celule imune este anticorpul anti-CTLA-4, descris în continuare. Într-o altă realizare specifică agonistul unui semnal costimulator al unei celule imune este ligandul ICOS, descris în continuare.

Virusul bolii de Newcastle

Într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, poate fi utilizat orice tip sau tulpină de NDV, inclusiv, dar nefiind exhaustive, tulpini native, variante sau mutante, virusuri mutagene, reasortate şi/sau virusuri modificate genetic. Într-o variantă de realizare NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină nativă. În anumite realizări NDV este o tulpină litică. În alte realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină nelitică. În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină lentogenică. În unele variante de realizare NDV este o tulpină mezogenică. În alte realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină velogenică. Exemplele specifice de tulpini NDV includ, dar nefiind exhaustive, tulpina 73-T, tulpina NDV HUJ, tulpina Ulster, tulpina MTH-68, tulpina Italien, tulpina Hickman, tulpina PV701, tulpina Hitchner B1 (de exemplu, Genbank nr. AF309418 sau NC_002617), tulpina La Sota (de exemplu, Genbank nr. AY845400), tulpina YG97, tulpina MET95, tulpina Roakin şi tulpina F48E9. Într-o variantă de realizare NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este tulpina Hitchner B1. într-o altă realizare specifică NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină B1 identificată în Genbank cu nr. AF309418 sau NC_002617. Într-o altă realizare specifică NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este NDV identificat în colecţia ATCC cu nr. VR2239. Într-o altă realizare specifică NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este tulpina La Sota.

Într-o altă variantă de realizare NDV, utilizate într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, nu sunt patogene aviare, fiind apreciate printr-o metodă cunoscută specialiştilor. În anumite realizări NDV, utilizat într-o terapie combinată, nu este patogen, fapt confirmat la evaluarea prin injecţie intracraniană a virusului la puii de 1 zi, la care evoluţia bolii şi moartea se produce timp de 8 zile. În unele realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, are un indice de patogenitate intracraniană mai mic de 0,7; mai mic de 0,6; sub 0,5; mai mic de 0,4; mai mic de 0,3; sub 0,2 sau mai mic de 0,1. În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, are un indice de patogenitate intracraniană zero.

În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină mezogenică modificată genetic, astfel încât să nu fie patogenă la păsări, fiind evaluata prin tehnici cunoscute unui specialist în domeniu. În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină velogenică modificată genetic, astfel încât să nu fie patogenă la păsări, fiind evaluata prin tehnici cunoscute unui specialist în domeniu.

În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, exprimă o proteină F mutantă. Într-o variantă de realizare NDV utilizat într-o terapie combinată exprimă o proteină F mutantă extrem de fusogenică şi capabilă să formeze sinciţiu. Într-o altă realizare specifică proteina F mutantă este încorporată în virion.

Într-o realizare un genom al unui NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant. Într-o variantă de realizare NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă în care locusul de clivaj al proteinei F este transferat pentru a produce o secvenţă aminoacidă polibazică, care permite proteinei să fie scindată de proteaze intracelulare, ceea ce face virusul mai eficient în intrarea în celule şi formarea de sinciţiu. Într-o altă realizare specifică NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă, în care locusul de clivaj al proteinei F este înlocuit cu unul care conţine unul sau două reziduuri de arginină suplimentare, ceea ce permite de a activa locul de clivaj mutant de proteaze exprimate ubicuitar din familia furina. Exemplele specifice de NDV, care exprimă această proteină F mutantă includ, dar nefiind exhaustive, rNDV/F2aa şi rNDV/F3aa. O descriere a mutaţiilor introduse într-o proteină F de NDV pentru a produce o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant este prezentată în literatura de specialitate (Park et al. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA, no 103, 2006, p. 8203-2808). În unele realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu mutaţia aminoacidă L289A. În realizările specifice proteina F mutantă L289A posedă una, două sau trei reziduuri de arginină în locusul de clivaj. În anumite realizări proteina F mutantă este de la un alt tip sau tulpină de NDV, decât NDV de bază. În unele variante proteina F mutantă este adiţională la proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă înlocuieşte proteina F a NDV de bază.

În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este atenuat astfel încât NDV rămâne, cel puţin parţial, infecţios şi poate replica in vivo, dar nu generează decât titruri reduse la nivele subclinice de infecţie, care sunt nepatogene (Khattar et al. J. Virol., no 83, 2009, p. 7779-7782). Într-o realizare specifică, NDV este atenuat prin deleţia proteinei V. Astfel de NDV atenuate pot fi adaptate special pentru realizări, în care virusul este administrat la un subiect în scopul de a acţiona ca un imunogen, de exemplu, ca un vaccin viu. Virusurile pot fi atenuate prin orice metodă cunoscută în domeniu.

În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, nu conţine o secvenţă care codifică proteina V a NDV. În alte realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, exprimă o proteină V mutantă (Elankumaran et al. J. Virol., no 84 (8), 2010, p. 3835-3844). În anumite realizări o tulpină mezogenică sau velogenică de NDV, utilizată într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, exprimă o proteină V mutantă (Elankumaran et al. J. Virol., no 84 (8), 2010, p. 3835-3844).

În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV descris în literatura de brevet (US 7442379 B2 2008.10.28; US 6451323 B1 2002.09.17; US 6146642 A 2000.11.14). În realizările specifice NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este construit genetic pentru a codifica şi exprima o peptidă sau o proteină heteroloagă. În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV himeric cunoscut specialistului în domeniu sau un NDV, conform prezentei invenţii (în continuare). În unele realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV himeric conţinând un genom proiectat pentru a exprima un antigen tumoral (exemple de antigeni tumorali sunt prezentate în continuare). În anumite realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV himeric conţinând un genom proiectat pentru a exprima un antagonist heterolog de interferon (exemple de antagonişti heterologi de interferon sunt prezentate în continuare). În unele realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV himeric descris în literatura de brevet (US 2012-0122185). În unele realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV himeric conţinând un genom proiectat pentru a exprima o citokină, cum ar fi, de exemplu, IL-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17 , IL-21, IL-22, IFN-gamma, GM-CSF şi TNF-alfa. În unele realizări NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV himeric conţinând un genom proiectat pentru a exprima IL-2, IL-15 sau IL-21. Într-o variantă de realizare NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este un NDV himeric conţinând un genom proiectat pentru a exprima o citokină cum este descris în exemplul 2 prezentat aici.

Virusul himeric al bolii de newcastle

Intr-un aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele killer naturale (NK). În unele variante agonistul şi/sau antagonistul este încorporat în virion. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK. Într-o altă realizare specifică un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK. Cu alte cuvinte, NDV serveşte drept "bază" proiectată pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele killer naturale (NK). Exemplele specifice de agonişti ai semnalelor costimulatoare, precum şi exemple specifice de antagonişti ai semnalelor inhibitoare sunt prezentate în continuare.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o proteină F mutantă. Într-o realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o proteină F mutantă. Într-o altă variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele sau celulele NK, şi o proteină F mutantă. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă este foarte fusogenică şi abilă să formeze sinciţiu. Într-o altă realizare specifică proteina F mutantă este încorporată în virion. În anumite realizări genomul unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, conţinând o secvenţa care codifică proteina V a NDV.

Într-o realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant. Într-o variantă de realizare NDV este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă, în care locusul de clivaj al proteinei F este mutant pentru a produce o secvenţă de aminoacid polibazică, care permite proteinei să fie scindată de proteaze intracelulare, ceea ce face virusul mai eficient în ceea ce priveşte intrarea în celule şi formarea de sinciţiu. Într-o altă realizare specifică NDV este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă în care locusul de clivaj al proteinei F este înlocuit cu unul care conţine unul sau două reziduuri de arginină suplimentare, ceea ce permite activarea locusului de clivaj mutant de către proteaze exprimate ubicuitar din familia furinei. Exemplele specifice de NDV care exprimă această proteină F mutantă includ, dar nefiind exhaustive, rNDV/F2aa şi rNDV/F3aa. În literatura de specialitate sunt descrise mutaţiile introduse într-o proteină F a NDV pentru a produce o proteină F mutantă cu un locus de clivaj mutant (Park et al. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. PNAS USA, no 103, 2006, p. 8203-2808). În unele variante de realizare NDV himeric este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu mutaţia aminoacidă L289A. În anumite realizări proteina F mutantă este de la un alt tip sau tulpină de NDV, decât NDV de bază. În realizările specifice proteina mutantă F L289A posedă în locus de clivaj una, două sau trei reziduuri de arginină. În unele variante proteina F mutantă este adiţională la proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă înlocuieşte proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă este încorporată în virion.

În unele variante genomul unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, conţinând o secvenţă care codifică proteina V a NDV mutant (Elankumaran et al. J. Virol., no 84 (8), 2010, p. 3835-3844). În alte realizări genomul unui NDV proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK nu conţin o secvenţă care codifică proteina V a NDV. În anumite realizări baza parentală a NDV himeric este o tulpină de NDV mezogenică sau velogenică, care este proiectată pentru a exprima o proteină V mutantă (Elankumaran et al. J. Virol., no 84 (8), 2010, p. 3835-3844).

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o citokină. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o citokină. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o citokină. Exemplele specifice de citokine includ, dar nefiind exhaustive, interleukina (IL) -2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, gamma interferon (IFN), GM-CSF şi factorul de necroză tumorală (TNF) alfa.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK , o proteină F mutantă şi o citokină (de exemplu, IL-2, IL-7, IL-9, IL-15, IL-17, IL-21, IL-22, IFN-gamma, GM-CSF şi TNF alfa). Într-o variantă de realizare proteina F mutantă sunt extrem de fusogenică. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă are un locus de clivaj mutant (cum se descrie aici). În unele variante proteina F mutantă conţine mutaţia aminoacidă L289A. În unele variante de realizare NDV himeric este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu mutaţia aminoacidă L289A. În anumite realizări proteina F mutantă este de la un alt tip sau tulpină de NDV, decât NDV de bază. În realizările specifice, proteina F mutantă L289A posedă în locusul de clivaj una, două sau trei reziduuri de arginină. În unele variante proteina F mutantă este adiţională la proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă înlocuieşte proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă este încorporată în virion.

În anumite aspecte prezenta invenţie se referă la NDV himeric, care conţine un genom proiectat pentru a exprima o citokină, cum ar fi, de exemplu, IL-7, IL-15, IL-21 sau o altă citokină descrisă aici sau cunoscută de către specialiştii în domeniu. În continuare sunt prezentate exemple de NDV himerice modificate pentru a exprima citokine, precum şi metode de producere a unor astfel de NDV himerice.

Într-un alt aspect sunt descrise NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima (i) un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune şi (ii) un antigen tumoral. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi un antigen tumoral. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi un antigen tumoral.

Antigenele tumorale includ antigene asociate tumorii şi antigene specifice tumorale. Exemplele specifice de antigeni tumorali includ, dar nefiind exhaustive, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1,-GAGE 2, N-acetilglucozaminiltransferază-V, p-15, gp100, MART-1/MelanA, TRP -1 (gp75), tirozinază, kinaza 4 dependentă de ciclină, β-catenină, MUM-1, CDK4, HER-2/neu, papilomavirus-E6 uman, papilomavirus E7 uman, CD20, antigen carcinoembrionar (CEA), receptorul factorului de creştere epidermal, MUC-1, caspază-8, CD5, mucină-1, Lewisx, CA-125, p185HER2, IL-2R, FAP-α, tenascină, antigene asociate unei metaloproteinaze şi CAMPATH-1. Alte exemple includ, dar nefiind exhaustive, antigenul pan-carcinomului KS 1/4, antigenul carcinomului ovarian (CA125), fosfataza acidă prostatică, antigenul prostatic specific, antigenul p97 asociat cu melanomul, antigenul gp75 al melanomului, antigenul cu greutate moleculară mare al melanomului (HMW-MAA), antigenul de membrană specific prostatic, CEA, antigenul epitelial polimorfic mucinic, antigenul globulei de grăsime a laptelui, antigenele asociate cu tumorile colorectale (cum ar fi: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 şi LEA), antigenul-38.13 al limfomului Burkitt, CD19, antigenul-CD20 al limfomului B, CD33, antigenele specifice melanomului (cum ar fi gangliozida GD2, gangliozida GD3, gangliozida GM2, gangliozida GM3), antigenul de suprafaţă celulară de tip transplant specific tumoral (TSTA) (cum ar fi antigenele tumorale induse viral, inclusiv antigenul T al ADN al virusurilor tumorii şi antigenele de înveliş ale ARN al virusurilor tumorii), antigenul oncofetal al fetoproteinei alfa, cum ar fi CEA de colon, antigenul oncofetal al tumorii de vezică urinară, antigenul de diferenţiere (cum ar antigenul L6 şi L20 al carcinomului pulmonar uman), antigenele de fibrosarcom, antigenul-Gp37 al leucemiei celulelor T, neoglicoproteină, sfingolipide, antigene de cancer mamar (cum ar fi EGFR (receptorul factorului de creştere epidermică), antigenul HER2 (p185.sup.HER2) şi epitopul HER2 neu), mucină epitelială polimorfă (PEM), antigenul-APO-1 limfocitelor umane maligne, antigenul de diferenţiere (cum ar fi am antigenul găsit în eritrocitele fetale, endodermul primar, antigenul I găsit în eritrocitele adulte, embrionii preimplantaţi, I (Ma) constatat în adenocarcinoamele gastrice, M18, M39 determinat în epiteliul glandei mamare, SSEA-1 depistat in celulele mieloide, VEP8, VEP9, MyL, VIM-D5,D.sub.156-22 depistate în cancerul colorectal, TRA-1-85 (grupa de sânge H), C14 depistat în adenocarcinomul de colon, F3 depistat în adenocarcinomul pulmonar, AH6 depistat în cancerul gastric, Y haptenă, Le.sup.y depistat în celulele de carcinom embrional, TL5 (grupa de sânge A), receptorul EGF determinat în celulele A431, seriile E1 (grupa de sânge B) constatate în cancerul pancreatic, FC10.2 depistat în celulele de carcinom embrional, antigenul adenocarcinomului gastric, CO-514 (grupa de sânge Lea) constatat în adenocarcinom, NS-10 depistat în adenocarcinoame, CO-43 (grupa de sânge Leb), G49 găsit în receptorul EGF a celulelor A431, MH2 (grupa de sânge ALeb/Ley) constatat în adenocarcinom de colon, 19,9 depistat în mucinele cancerului de colon, cancerului gastric, T5A7 depistat în celulele mieloide, R24 găsit în celulele de melanom, 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2 şi M1:22:25:8 depistate în celulele de carcinom embrional şi SSEA-3 şi SSEA-4 depistate în etapa embrională de la 4 până la 8 celule), peptida din receptorul celulelor T derivate dintr-o celulă de limfom al celulelor T cutanat, proteina C-reactivă (CRP), antigenul-50 al cancerului (CA-50), antigenul 15-3 (CA15-3) al cancerului asociat cu cancerul mamar, antigenul-19 (-CA 19) al cancerului şi antigenul-242 al cancerului asociat cu cancere gastro-intestinale, antigenul asociat cu carcinomul (CAA), cromogranină A, antigenul mucinei epiteliale (MC5), antigenul specific epiteliului uman (E1A), antigenul Lea, antigenul melanomului, antigenele 100, 25 şi 150 asociate cu melanomul, antigenul asociat cu carcinomul similar mucinei, proteina legată de rezistenţa multidrog (MRPm6), proteina legată de rezistenţa multidrog (MRP41), proteina oncogenă Neu (C-erbB-2), enolaza neuron-specifică (NSE), P-glicoproteina (produsul genei mdr1), antigenul legat de rezistenţă multidrog, P170, antigenul legat de rezistenţa multidrog, antigenului specific prostatic (PSA), CD56 şi NCAM.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, o proteină F mutantă şi un antigen tumoral. Într-o realizare concretă proteina F mutantă este extrem de fusogenică. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă are un locus de clivaj mutant (cum este descris aici). În unele variante proteina F mutantă conţine mutaţia aminoacidă L289A. În unele variante de realizare NDV himeric este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu mutaţia aminoacidă L289A. În anumite realizări proteina F mutant este de la un alt tip sau tulpină de NDV, decât NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă L289A posedă una, două sau trei reziduuri de arginină în locusul de clivaj. În unele variante proteina F mutantă este adiţională la proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă înlocuieşte proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă este încorporată în virion.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima (i) un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune şi (ii) un antagonist heterolog de interferon. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi un antagonist heterolog de interferon . Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi un antagonist heterolog de interferon (US 2012-0058141).

Antagoniştii interferonului pot fi identificaţi folosind orice metodă cunoscută de către specialiştii în domeniu (US 6635416 B2 2003.10.21; US 7060430 B2 2006.06.13; US 7442527 B2 2008.10.28). Într-o variantă de realizare antagonistul heterolog de interferon este o proteină virală. Astfel de proteine virale pot fi obţinute sau derivate din orice virus şi virusul poate infecta orice specie (de exemplu, virusul poate infecta oameni sau mamiferele neumane). Exemplele de antagonişti heterologi de interferon includ, dar nefiind exhaustive, proteina W a virusului Nipah, proteina V a Nipah, proteina VP35 a virusului Ebola, proteina E3L a virusului Vaccinia, proteina NS1 a virusului gripal, proteina NS2 a virusului sinciţial respirator (RSV), proteină ICP34.5 a virusului herpes simplex (VHS) de tip 1, proteaza NS3-4 a virusului hepatitei C, proteinele celulare dominant-negative care blochează inducerea sau răspunsul imunităţii înnăscute (de exemplu, STAT1, MyD88, IKK şi TBK) ş reglatori celulari ai răspunsului imun înnăscut (de exemplu, proteinele SOCS, proteinele PIAS, proteinele CYLD, proteina IkB, proteina Atg5, proteina Pin1, proteina IRAK-M şi UBP43) (US 2012-0058141).

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, o proteină F mutantă şi un antagonist heterolog de interferon. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă este extrem de fusogenică. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă are un locus de clivaj mutant (cum este descris aici). În unele variante proteina F mutantă conţine mutaţia aminoacidă L289A. În unele variante de realizare NDV himeric este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu mutaţia aminoacidă L289A. În anumite realizări proteina F mutantă este de la un alt tip sau tulpină de NDV, decât NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă L289A posedă una, două sau trei reziduuri de arginină în locusul de clivaj. În unele variante proteina F mutantă este adiţională la proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă înlocuieşte proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă este încorporată în virion.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o moleculă proapoptotică. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o moleculă proapoptotică. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o moleculă proapoptotică. Exemplele specifice de molecule proapoptotice includ, dar nefiind exhaustive, Bax, Bak, Bad, BID, Bcl-xS, Bim, Noxa, Puma, AIF, FasL şi TRAIL.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, o proteină F mutantă şi o moleculă proapoptotică. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă este extrem de fusogenică. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă are un locus de clivaj mutant (cum este descris aici). În unele variante proteina F mutantă conţine mutaţia aminoacidă L289A. În unele variante de realizare NDV himeric este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu mutaţia aminoacidă L289A. În anumite realizări proteina F mutantă este de la un alt tip sau tulpină de NDV, decât NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă L289A posedă una, două sau trei reziduuri de arginină în locusul de clivaj. În unele variante proteina F mutantă este adiţională la proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă înlocuieşte proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă este încorporată în virion.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi o moleculă antiapoptotică. Într-o variantă de realizare un genom al unei NDV este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele sau celule NK, şi o moleculă antiapoptotică. Într-o variantă de realizare un genom al unui NDV este proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele sau celulele NK, şi o moleculă antiapoptotică. Exemplele specifice de molecule antiapoptotice includ, dar nefiind exhaustive, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 şi XIAP.

Într-un alt aspect prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, o proteină F mutantă şi o moleculă antiapoptotică. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă este extrem de fusogenică. Într-o variantă de realizare proteina F mutantă are un locus de clivaj mutant (cum este descris aici). În unele variante proteina F mutantă conţine mutaţia aminoacidă L289A. În unele variante de realizare NDV himeric este proiectat pentru a exprima o proteină F mutantă cu mutaţie aminoacidă L289A. În anumite realizări proteina F mutantă este de la un alt tip sau tulpină de NDV, decât NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă L289A posedă una, două sau trei reziduuri de arginină în locul de clivaj. În unele variante proteina F mutantă este adiţională la proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă înlocuieşte proteina F a NDV de bază. În realizările specifice proteina F mutantă este încorporată în virion.

În anumite aspecte prezenta invenţie se referă la NDV himerice, care conţin un genom proiectat pentru a exprima o moleculă proapoptotică. În anumite aspecte prezenta invenţie se referă la NDV himerice care conţin un genom proiectat pentru a exprima o moleculă antiapoptotică. Exemplele de molecule proapoptotice şi moleculele antiapoptotice sunt prezentate în continuare.

Orice tip sau tulpină de NDV poate fi folosită în calitate de bază, care este proiectată pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi în anumite realizări proiectată pentru a exprima o citokină, un antigen tumoral, un antagonist heterolog de interferon, o moleculă proapoptotică, moleculă antiapoptotică şi/sau o proteină mutantă F, incluzând, dar nefiind exhaustive, tulpini native, variante sau mutante, virusuri mutagene, reasortate şi/sau virusuri modificate genetic. Într-o variantă de realizare NDV utilizat într-o terapie combinată, conform prezentei invenţii, este o tulpină nativă. În anumite realizări NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică, este o tulpină litică. În alte exemple de realizare NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică, este o tulpină nelitică. În anumite realizări NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică, este o tulpină mezogenică. În anumite realizări NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică, este o tulpină velogenică. Exemplele specifice de tulpini de NDV includ, dar nefiind exhaustive, tulpina 73-T, tulpina NDV HUJ, tulpina Ulster, tulpina MTH-68, tulpina Italien, tulpina Hickman, tulpina PV701, tulpina Hitchner B1, tulpina La Sota (de exemplu, Genbank nr. AY845400), tulpina YG97, tulpina MET95, tulpina Roakin şi tulpina F48E9. Într-o variantă de realizare NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică este tulpina Hitchner B1. Într-o altă realizare specifică NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică este tulpina B1 identificată prin Genbank nr. AF309418 sau NC_002617. Într-o altă realizare specifică, NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică este NDV identificat în colecţia ATCC cu nr. VR2239. Într-o altă realizare specifică, NDV, care serveşte drept bază pentru ingineria genetică, este tulpina La Sota.

În anumite realizări este dezirabilă atenuarea sau atenuarea suplimentară a NDV himeric astfel, încât NDV himeric rămâne, cel puţin parţial, infecţios şi poate replica in vivo, dar nu generează decât titruri reduse rezultând cu nivele subclinice de infecţie, care nu sunt patogene (Khattar et al. J. Virol., no 83, 2009, p. 7779 -7782). Într-o variantă de realizare NDV este atenuat prin deleţia proteinei V. Astfel de NDV himerice atenuate pot fi adaptate special pentru realizări, în care virusul este administrat la un subiect în scopul de a acţiona ca un imunogen, de exemplu, ca vaccin viu. Virusurile pot fi atenuate prin orice metodă cunoscută în domeniu.

În anumite realizări un NDV himeric, conform prezentei invenţii, exprimă aici una, două, trei sau mai multe sau toate dintre genele următoare şi suicidale: (1) un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune; (2) un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune; (3) o citokină; (4) un antigen tumoral; (5) un antagonist heterolog al interferonului; (6) o moleculă proapoptotică; (7) o moleculă antiapoptotică şi/sau (8) o proteină F mutantă. În realizările specifice, adiţional la expresia unui agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau unui antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi în anumite realizări o proteină F mutantă şi o citokină, un NDV himeric este proiectat pentru a exprima o genă de suicid (de exemplu, timidin kinaza) sau altă moleculă care inhibă replicarea sau funcţia NDV (o genă care face NDV sensibil la un antibiotic sau la un agent antiviral). În unele variante, adiţional la expresia unui agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau unui antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T sau celulele NK, şi în anumite realizări, o proteină F mutantă şi o citokină, un NDV himeric este proiectat pentru a codifica locurile ţintă ale microARN ţesutului specific (miARN) (de exemplu, locurile ţintă pentru miR-21, miR-184, miR-133a/133B, miR-137 şi/sau miR-193a ai moleculelor de microARN).

În anumite realizări tropismul NDV himeric este alterat. Într-o variantă de realizare tropismul virusului este modificat prin modificarea locusului de clivaj al proteinei F pentru a fi recunoscută de către proteazele cu specificitate tisulară sau cu specificitate tumorală, cum ar fi metaloproteazele matriciale (MMP) şi urokinaza. În alte exemple de realizare tropismul virusului este modificat prin introducerea de loci ţintă pentru molecule de miARN cu specificitate tisulară. În anumite realizări proteina HN a NDV este modificată pentru ca să fie recunoscută de receptorul specific tumoral.

În anumite realizări NDV himeric exprimă una sau mai multe dintre genele următoare sub formă de o proteină de fuziune sau proteină himerică: (1) un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune; (2) un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune; (3) o citokină; (4) un antigen tumoral; (5) un antagonist heterolog al interferonului; (6) o moleculă proapoptotică; (7) o moleculă antiapoptotică şi/sau (8) o proteină F mutantă. În realizările specifice proteina de fuziune sau proteina himerică conţine domeniile transmembranare şi citoplasmatice sau fragmente ale acestora de proteină F sau proteină HN a NDV şi un domeniu extracelular care conţine una dintre moleculele la care se face referire anterior (US 2012-0122185; WO 2007/064802 A1 2007.06.07).

În aceste realizări agonistul unui semnal costimulator şi/sau antagonistul unui semnal inhibitor al unei celule imune poate fi inserat în genomul NDV de bază între două unităţi de transcripţie. Într-o variantă de realizare agonistul unui semnal costimulator şi/sau antagonistul unui semnal inhibitor al unei celule imune este inserat în genomul NDV de bază între unităţile M şi P de transcripţie sau între unităţile HN şi L de transcripţie. În conformitate cu alte exemple de realizare prezentate, citokina, antigenul tumoral, antagonistul heterolog al interferonului, molecula proapoptotică, molecula antiapoptotică şi/sau proteina F mutantă sunt inserate în genomul NDV de bază între două sau mai multe unităţi de transcripţie (de exemplu, între unităţile M şi P transcripţie sau între unităţile HN şi L de transcripţie).

Agenţii de stimulare a celulelor imune

NDV himerice, conform prezentei invenţii, pot fi proiectate pentru a exprima orice agonist al unui semnal costimulator şi/sau orice antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T, celulele NK sau celula prezentatoare de antigen (de exemplu, o celulă dendritică sau macrofag), cunoscute specialiştilor în domeniu. În realizările specifice agonistul şi/ sau antagonistul este un agonist al unui semnal costimulator uman a unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor uman al unei celule imune. În anumite realizări agonistul unui semnal costimulator este un agonist al unei molecule costimulatoare (de exemplu, receptor costimulator) aflate pe celulele imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T (de exemplu, CD4+ sau CD8+ limfocitele T), celulele NK şi/sau celulele prezentatoare de antigen (de exemplu, celulele dendritice sau macrofagele). Exemplele specifice de molecule costimulatoare includ: receptorul factorului de necroză tumorală indusă de glucocorticoid (GITR), costimulatorul inductibil al celulelor T (ICOS sau CD278), OX40 (CD134), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), CD40, alfa limfotoxina (alfa LT), LIGHT (omologul limfotoxinei, prezintă expresie inductibilă şi concurează cu glicoproteina D a virusului herpes simplex pentru HVEM, un receptor exprimat de limfocitele T), CD226, molecula de celule T citotoxice şi reglatoare (CRTAM), receptorul 3 al morţii (DR3), receptorul pentru limfotoxină-beta (LTBR), activatorul transmembranar şi interactorul CAML (TACI), receptorul pentru factorul de activare a celulelor B (BAFFR) şi proteina de maturare a celulelor B (BCMA). În realizările specifice agonistul este un agonist al unui receptor costimulator uman al unei celule imune. În anumite realizări agonistul unui receptor costimulator nu este un agonist al ICOS. În unele variante antagonistul este un antagonist al unei molecule inhibitoare (de exemplu, receptor inhibitor) aflat pe celulele imune, cum ar fi, de exemplu, limfocitele T (de exemplu, CD4+ sau CD8+ T-limfocite), celulele NK şi/sau celulele prezentatoare de antigen (de exemplu, celule dendritice sau macrofagele). Exemplele specifice de molecule inhibitoare includ: antigenul 4 citotoxic asociat cu limfocite T (CTLA 4 sau CD52), proteina 1 programată de moarte celulară (PD1 sau CD279), atenuatorul de limfocite B şi T (BTLA), receptorul pentru celulele killer similar imunoglobulinei( KIR), gena 3 de activare a limfocitelor (LAG3), proteina 3 a membranei celulelor T (TIM3), CD160, receptorul pentru adenozină A2a (A2aR), imunoreceptorul pentru celulele T cu domeniile de imunoglobulina şi ITIM (TIGIT), receptorul 1 similar imunoglobulinei asociat cu leucocitele (LAIR1) şi CD160. În realizările specifice antagonistul este un antagonist al unui receptor inhibitor uman al unei celule imune.

Într-o variantă de realizare agonistul unui receptor costimulator este un anticorp sau un fragment de legare a antigenului acestuia, care se leagă specific la receptorul costimulator. Exemplele concrete de receptori costimulatori includ: GITR, ICOS, OX40, CD27, CD28, 4-1BB, CD40, LT alfa, LIGHT, CD226, CRTAM, DR3, LTBR, TACI, BAFFR şi BCMA. În anumite exemple de realizare anticorpul este un anticorp monoclonal. In alte exemple de realizare anticorpul este un fragment sc-Fv. Într-o variantă de realizare anticorpul este un anticorp bispecific, care se leagă la doi receptori pe o celulă imună. În alte variante anticorpul bispecific se leagă la un receptor pe o celulă imună şi la alt receptor pe o celulă canceroasă. În realizările specifice anticorpul este un anticorp uman sau umanizat. În unele realizări anticorpul este exprimat ca o proteină himerică cu proteina F a NDV sau cu un fragment al acesteia, sau cu proteina HN a NDV sau cu un fragment al acesteia (US 2012-0122185). Într-o variantă de realizare proteina himerică este proteina F himerică descrisă în continuare. Metodele, prezentate în continuare, pentru a genera proteina himerică ICOSL-F şi proteina himerică CD28-F pot fi utilizate pentru a genera şi alte proteine himerice F sau proteine HN himerice.

Într-o altă formă de realizare agonistul unui receptor costimulator este un ligand al receptorului costimulator. În anumite realizări ligandul este un fragment dintr-un ligand nativ. Exemplele specifice de liganzi nativi includ: ICOSL, B7RP1, CD137L, OX40L, CD70, mediatorul de intrare a virusului herpesului (HVEM), CD80 şi CD86. Secvenţele nucleotidice, care codifică liganzii nativi, precum şi secvenţele de aminoacizi ai liganzilor nativi sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, secvenţele de nucleotide şi aminoacizi ale liganzilor următori pot fi identificate în baza de date GenBank cu următoarele numere de înregistrare: B7RP1 (de asemenea, cunoscut ca ICOSL) - uman: NM_015259.4, NP_056074.1; murin: NM_015790.3, NP_056605.1; CD137L- uman: NM_003811.3, NP_003802.1; murin: NM_009404.3, NP_033430.1; OX40L- uman: NM_003326.3, NP_003317.1; murin: NM_009452.2, NP_033478.1; CD70 - uman: NM_001252.3, NP_001243.1; murin: NM_011617.2, AAD00274.1; CD80 - uman: NM_005191.3, NP_005182.1; murin: NM_009855.2, NP_033985.3 şi CD86 - uman: NM_005191.3, CAG46642.1; murin: NM_019388.3, NP_062261.3. În alte realizări, ligandul este un derivat al unui ligand nativ. În unele realizări ligandul este o proteină de fuziune care conţine cel puţin o porţiune din ligandul nativ sau un derivat al ligandului nativ, care se leagă specific la receptorul co-stimulator, şi o secvenţă de aminoacid heteroloagă. În realizările specifice proteina de fuziune conţine cel puţin o porţiune de ligand nativ sau un derivat al ligandului nativ care se leagă specific la receptorul costimulator şi porţiunea Fc a unei imunoglobuline sau un fragment al acesteia. Un exemplu de o proteină fuziune ligand este ligandul 4-1BB fuzionat la fragmentul Fc al imunoglobulinei (Meseck M. et al. J. Immunother., no 34, 2011, p. 175-182). În unele realizări ligandul este exprimat ca o proteină himerică cu proteina F a NDV sau cu un fragment al acesteia, sau cu proteina HN a NDV sau cu un fragment al acesteia. Într-o variantă de realizare proteina este proteina HN himerică descrisă în continuare.

Metodele, descrise în continuare, pentru a genera proteina himerică HN-GITRL, proteina himerică HN-OX40-L, proteina himerică HN-4-1BBL şi/sau proteina himerică HN-CD40L pot fi utilizate pentru a genera alte proteine himerice F sau proteine himerice HN.

Într-o altă variantă de realizare antagonistul unui receptor inhibitor este un anticorp (sau un fragment de legare a antigenului) sau un receptor solubil care se leagă specific la ligandul nativ pentru receptorul inhibitor şi blochează legarea ligandului nativ la receptorul inhibitor şi transducţia unui semnal(e) inhibitor (inhibitoare). Exemplele specifice de liganzi nativi pentru receptorii inhibitori includ: PDL-1, PDL-2, B7-H3, H4-B7, HVEM, Gal9 şi adenozină. Exemplele specifice de receptori inhibitori, care se leagă la un ligand nativ, includ: CTLA-4, PD-1, BTLA, KIR, LAG3, TIM3 şi A2aR.

În realizările specifice antagonistul unui receptor inhibitor este un receptor solubil care se leagă specific la ligandul nativ pentru receptorul inhibitor şi blochează legarea ligandului nativ la receptorul inhibitor şi transducţia unui semnal(e) inhibitor (inhibitoare). În anumite variante de realizare receptorul solubil este un fragment dintr-un receptor nativ inhibitor sau un fragment dintr-un derivat al unui receptor nativ inhibitor, care se leagă specific la ligandul nativ (de exemplu, domeniul extracelular al unui receptor nativ inhibitor sau un derivat al unui receptor inhibitor). În unele variante de realizare receptorul solubil este o proteină de fuziune, care conţine cel puţin o porţiune a receptorului nativ inhibitor sau un derivat al receptorului nativ inhibitor (de exemplu, domeniul extracelular al receptorului nativ inhibitor sau un derivat al receptorului inhibitor nativ) şi o secvenţă de aminoacid heteroloagă. În realizările specifice proteina de fuziune conţine cel puţin o porţiune a receptorului nativ inhibitor sau un derivat al receptorului inhibitor nativ şi fragmentul Fc al unei imunoglobuline sau un fragment al acesteia. Un exemplu de o proteină de fuziune a receptorului solubil este proteina de fuziune LAG3-lg (Huard B. et al. Eur. J. Immunol., no 25, 1995, p. 2718-2721).

În realizările specifice antagonistul unui receptor inhibitor este un anticorp (sau un fragment de legare a antigenului), care se leagă specific la ligandul nativ pentru receptorul inhibitor şi blochează legarea ligandului nativ la receptorul inhibitor şi transducţia unui semnal(e) inhibitor (inhibitoare). În anumite exemple de realizare anticorpul este un anticorp monoclonal. În alte exemple de realizare anticorpul este un fragment scFv. În realizările particulare anticorpul este un anticorp uman sau umanizat. Un exemplu specific de un anticorp la ligandul inhibitor este anticorpul anti-PD-L1 (Iwai Y. et al. PNAS, no 99, 2002, p. 12293-12297).

Într-o altă realizare antagonistul unui receptor inhibitor este un anticorp (sau un fragment de legare a antigenului) sau un ligand care se leagă la receptorul de inhibare, dar nu transduce un semnal(e) inhibitor (inhibitoare). Exemplele specifice de receptori inhibitori includ: CTLA-4, PD1, BTLA, KIR, LAG3, TIM3 şi A2aR. În anumite exemple de realizare anticorpul este un anticorp monoclonal. În alte exemple de realizare anticorpul este un fragment scFv. În realizările particulare anticorpul este un anticorp uman sau umanizat. Un exemplu specific de un anticorp la receptorul inhibitor este anticorpul anti-CTLA-4 [30]. Un alt exemplu de un anticorp la receptorul inhibitor este anticorpul anti-PD-1 (Topalian S.L. NEJM, no 28, 2012, p. 3167-3175).

În anumite realizări NDV himeric, conform prezentei invenţii, este proiectat ca să exprime antagonistul CTLA-4, cum ar fi, de exemplu, Ipilimumab sau Tremelimumab. În anumite realizări NDV, conform prezentei invenţii, este proiectat ca să exprime un antagonist PD1, cum ar fi, de exemplu, MDX-1,106 (BMS-936558), MK3475, CT-011, AMP-224 sau MDX-1105. În anumite realizări un NDV himeric, conform prezentei invenţii, este proiectat pentru a exprima un antagonist LAG3, cum ar fi, de exemplu, IMP321. În anumite realizări, un NDV himeric al prezentei invenţii este proiectat pentru a exprima un anticorp (de exemplu, un anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia de legare a antigenului, sau un fragment scFv) care se leagă la B7-H3, cum ar fi, de exemplu, MGA271. În realizările specifice un NDV himeric, conform prezentei invenţii, este proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, descrise în continuare. În realizările specifice NDV, conform prezentei invenţii, este proiectat pentru a exprima anti-CD28 scvFv, ICOSL, CD40L, OX40L, CD137L, GITRL şi/sau CD70.

În anumite realizări un agonist al unui semnal costimulator al unei induce celule imune induce (de exemplu, în mod selectiv) una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse prin legarea unui receptor costimulator la ligandul său. În realizările concrete ale prezentei invenţii un agonist al receptorului costimulator induce una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului costimulator la unul sau la mai mulţi dintre liganzii săi cu cel puţin 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% sau 99% mai puternică, sau în intervalul de la 25% până la 50%, 25% până la 75%, 50% până la 75%, 50% până la 95%, 75% până la 95% sau 75% până la 100% mai puternică, comparativ cu una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului induse prin legarea receptorului costimulator la unul sau mai mulţi dintre liganzii săi în absenţa agonistului. În variantele concrete de realizare a prezentei invenţii un agonist al receptorului costimulator: (i) induce una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului costimulator la un anumit ligand cu cel puţin 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% sau 99% mai puternică, sau în intervalul de la 25% până la 50%, 25% până la 75%, 50% până la 75 %, 50% până la 95%, 75% până la 95% sau 75% până la 100% mai puternică, în raport cu una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, induse prin legarea receptorului costimulator la ligandul particular în absenţa agonistului; şi (ii) nu induce sau induce una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului costimulator la unul sau mai mulţi liganzi cu cel mult 20%, 15%, 10%, 5%, sau 2%, sau în intervalul de la 2% până la 5%, 2% până la 10%, 5% până la 10%, 5% până la 15%, 5% până la 20%, 10% până la 15%, sau 15% până la 20%, în raport cu unul sau mai multe căi de transducţie a semnalului, induse prin legarea receptorului costimulator la unul sau mai mulţi asemenea liganzi în absenţa agonistului.

În anumite realizări un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune activează sau amplifică (de exemplu, în mod selectiv activează sau amplifică) una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea unui receptor costimulator la ligandul său. În realizările specifice un agonist al receptorului costimulator activează sau amplifică una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului costimulator la unul sau mai mulţi dintre liganzii săi, cu cel puţin 25%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% sau 99% mai puternic, sau în intervalul de la 25% până la 50%, 25% până la 75%, 50% până la 75%, 50% până la 95%, 75% până la 95% sau 75% până la 100% mai puternic, în raport cu una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, induse prin legarea receptorului costimulator la unul sau mai mulţi dintre liganzii săi în absenţa agonistului. În realizările specifice un agonist al receptorului costimulator: (i) un agonist al unui semnal costimulator activează sau amplifică una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului costimulator la un anumit ligand, cu cel puţin 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% sau 99% mai puternic, sau în intervalul de la 25% până la 50%, 25% până la 75%, 50% până la 75%, 50% până la 95%, 75% până la 95% sau 75% până la 100% mai puternic, în raport cu una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, induse prin legarea receptorului costimulator la un anumit ligand în absenţa agonistului şi (ii) nu activează sau nu amplifică, sau activează sau amplifică una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului costimulator la unu sau mai mulţi alţi liganzi, cu cel mult 20%, 15%, 10%, 5% sau 2%, sau în intervalul de la 2% până la 5%, 2% până la 10%, 5% până la 10%, 5% până la 15%, 5% până la 20%, 10% până la 15% sau 15% până la 20%, în raport cu una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului costimulator la unul sau mai mulţi de alţi astfel de liganzi în absenţa agonistului.

În unele variante de realizare un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune inhibă sau reduce (de exemplu, în mod selectiv) una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea unui receptor inhibitor la ligandul său. În realizările specifice un antagonist al unui receptor inhibitor inhibă sau reduce una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului inhibitor la unul sau mai mulţi liganzi, cu cel puţin 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% sau 99% mai puternic, sau în intervalul de la 25% până la 50%, 25% până la 75%, 50% până la 75%, 50% până la 95%, 75% până la 95% sau 75% până la 100% mai puternic, în raport cu una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, induse prin legarea receptorului inhibitor la unul sau mai mulţi liganzi ai săi în absenţa antagonistului. În realizările specifice un antagonist al unui receptor inhibitor: (i) inhibă sau reduce una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului inhibitor la un anumit ligand, cu cel puţin 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% sau 99% mai puternic, sau în intervalul de la 25% până la 50%, 25% până la 75%, 50% până la 75%, 50% până la 95%, 75% până la 95% sau 75% până la 100% mai puternic, în raport cu una sau mai multe căi de transducţie a semnalului, induse prin legarea receptorului inhibitor la un ligandul anumit în absenţa antagonistului şi (ii) nu inhibă sau nu reduce, sau inhibă sau reduce una sau mai multe dintre căile de transducţie a semnalului, induse de legarea receptorului inhibitor la unul sau mai mulţi liganzi cu cel mult 20%, 15%, 10%, 5% sau 2%, sau în intervalul de la 2% până la 5%, 2% până la 10%, 5% până la 10%, 5% până la 15%, 5% până la 20%, 10% până la 15% sau 15% până la 20%, în raport cu una sau mai multe căi de transducţie a semnalului indus prin legarea receptorului inhibitor la unul sau mai mulţi de alţi astfel de liganzi în absenţa antagonistului.

În variantele concrete de realizare a prezentei invenţii un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune induce, activează şi/sau amplifică una sau mai multe activităţi, funcţii sau răspunsuri imune. Una sau mai multe activităţi, funcţii sau răspunsuri pot fi sub formă, de exemplu, formarea de anticorpi (răspuns umoral) sau un răspuns imun celular, de exemplu, secreţia de citokine (de exemplu, interferon gamma), activitatea celulelor-helper sau citotoxicitatea celulară. Într-o realizare exprimarea unui marker de activare pe celulele imune (de exemplu, CD44, Granzima sau Ki-67), expresia unui receptor costimulator pe celulele imune (de exemplu, ICOS, CD28, OX40 sau CD27), expresia unui ligand pentru un receptor costimulator (de exemplu, B7HRP1, CD80, CD86, OX40L sau CD70), secreţia de citokine, infiltrarea tumorii cu celule imune (de exemplu, limfocite T, limfocite B şi/sau celule NK), producerea anticorpilor, funcţia efectoare, activarea celulelor T, diferenţierea celulelor T, proliferarea celulelor T, diferenţierea celulelor B, proliferarea celulelor B şi/sau proliferarea celulelor NK este indusă, activată şi/sau îmbunătăţită în urma contactului cu un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau cu un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune. Într-o altă variantă de realizare infiltrarea şi proliferarea tumorii cu celule supresoare derivate din mieloid (MDSC), infiltrarea, activarea şi proliferarea în tumoare a Treg, numărul de MDSC şi de Treg în sângele periferic sunt inhibate în urma contactului cu un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau cu un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune.

Proiectarea NDV

NDV, conform prezentei invenţii, pot fi generate folosind tehnica genetică inversă. Tehnologia genetică inversă implică prepararea ARN virali recombinanţi sintetici, care conţin regiunile necodificatoare ale filamentului cu sens negativ al ARN viral, care este esenţial pentru recunoaşterea de polimerazele virale şi pentru semnalele de ambalare, necesare pentru a genera un virion matur. ARN recombinanţi sunt sintetizaţi dintr-o matrice de ADN recombinant şi reconstituiţi in vitro cu complex de polimerază virală purificată pentru a forma ribonucleoproteine recombinante (RNP), care pot fi utilizate pentru a transfecta celule. O transfecţie mai eficientă se obţine atunci când proteinele polimerazei virale sunt prezente în timpul transcripţiei ARN sintetice atât in vitro, cât şi in vivo. RNP recombinante sintetice pot fi salvate în particule virale infecţioase. Metodele menţionate sunt descrise în literatura de specialitate (US 5166057 A 1992.11.24; US 5854037 A 1998.12.29; US 6146642 A 2000.11.14; EP 0702085 A1 1996.02.20; US 09152845; WO 9712032 A1 1997.04.03; WO 96/34625 A1 1996. 11.07; EP 0780475 B2 2006.07.19; WO 99/02657 A1 1999.01.21; WO 98/53078 A1 1998.11.26; WO 98/02530 A1 1998.01.22; WO 99/15672 A1 1999. 04.01; WO 98/13501 A1 1998. 04.02; WO 97/06270 A1 1997. 02.20; EP 780475 A1 1997.06.25).

Tehnologia cu plasmidă fără helper poate fi, de asemenea, utilizată pentru a proiecta NDV, conform prezentei invenţii. Succint, un ADNc complet al unui NDV (de exemplu, tulpina Hitchner B1) este construit, inserat într-un vector plasmidă şi proiectat sa conţină un locus unic de restricţie între două unităţi de transcripţie (de exemplu, genele P şi M ale NDV sau genele HN şi L ale NDV). O secvenţă de nucleotide care codifică o secvenţă aminoacidă heteroloagă (de exemplu, o secvenţă nucleotidică care codifică un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune) poate fi inserată în genomul viral la locusul de restricţie unic. Alternativ, o secvenţă de nucleotide care codifică o secvenţă aminoacidă heteroloagă (de exemplu, o secvenţă de nucleotide care codifică un agonist al unui semnal costimulator şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune) poate fi proiectată într-o unitate de transcripţie NDV atâta timp, cât inserarea nu afectează capacitatea virusului de a infecta şi reproduce. Unicul segment este poziţionat între un promotor T7 şi ribozima virusului hepatitei delta pentru a produce o transcriere cu sens negativ precisă de la polimeraza T7. Vectorul plasmidă şi vectorii de expresie, conţinând proteine virale necesare, sunt transfectaţi în celule, ceea ce conduce la producerea de particule virale recombinante (WO 0104333 A1 2001.01.18; US 7442379 B2 2008.10.28; US 6146642 A 2000.11.14; US 6649372 B1 2003.11.18; US 6544785 B1 2003.04.08; US 7384774 B2 2008.06.10; Swayne et al. Avian Dis., no 47, 2003, p.1047-1050; Swayne et al. J. Virol. 2001, p. 11868-11873).

Metodele pentru producerea unui NDV himeric, care exprimă un anticorp, sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, tehnica pentru generarea unui NDV recombinant, care exprimă o IgG completă de la două transgene (Puhler et al. Gene Ther., no 15(5), 2008, p. 371-283).

Tehnologiile bicistronice de producere a mai multe proteine dintr-un singur ARNm sunt cunoscute specialiştilor în domeniu. Tehnicile bicistronice permit proiectarea secvenţelor de codificare ale mai multor proteine într-un singur ARNm prin utilizarea secvenţelor IRES. Secvenţele IRES direcţionează recrutarea internă a ribozomilor la molecula de ARN şi permit translaţia în aval în cap într-un mod independent. Succint, o regiune de codificare a unei proteine este inserată în ORF a unei a doua proteine. Inserţia este flancată de secvenţele IRES şi orice secvenţă de semnal netranslată, necesară pentru exprimarea corectă şi/sau funcţia corespunzătoare. Inserţia nu trebuie să perturbeze cadrul de citire deschis, semnalele de poliadenilare sau promotorii transcripţionali ai proteinei a doua (García-Sastre et al. J. Virol., no 68, 994, p. 6254-6261; García-Sastre et al. Dev. Biol. Stand., no 82, 1994, p. 237-246).

Propagarea NDV

NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) pot fi propagate în orice substrat, care permite virusului să crească la titruri care permit utilizarea virusurilor, conform prezentei invenţii. Într-o realizare substratul permite NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) să crească la titruri comparabile cu cele determinate pentru virusurile de tip sălbatic corespunzătoare.

NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) pot fi cultivate în celule (de exemplu, celulele aviare, celule de pui, etc.), care sunt sensibile la infecţia cu virusuri, ouă embrionate (de exemplu, ouă de pui sau oua de prepeliţă) sau animale (de exemplu, păsări). Astfel de metode sunt bine cunoscute specialiştilor în domeniu. Într-o variantă de realizare NDV prezentei invenţii (de exemplu, NDV himerice) pot fi propagate în celule canceroase, de exemplu, celule de carcinom (de exemplu, celule de cancer mamar şi celule de cancer de prostată), celule de sarcom, celule de leucemie, celule de limfom şi celule de tumori germinogene (de exemplu, celulele de cancer testicular şi celule de cancer ovarian). Într-o altă realizare specifică NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, NDV himerice), pot fi propagate în linii celulare, de exemplu, linii de celule canceroase, cum ar fi celulele HeLa, celulele MCF7, celulele THP-1, celulele U87, celulele DU145, celulele Lncap şi celulele T47D. În anumite realizări celulele sau liniile celulare (de exemplu, celulele canceroase sau liniile celulare de cancer) sunt obţinute şi/sau derivate de la o fiinţă (fiinţe) umană (umane). Într-o altă variantă de realizare NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) sunt propagate în celule de pui sau ouă embrionate. Celulele de pui reprezentative includ, dar nefiind exhaustive, fibroblaste de embrion de pui şi celule renale de embrion de pui. Într-o variantă de realizare NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) sunt propagate în celule Vero. Într-o altă realizare specifică NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) sunt propagate în celulele canceroase în conformitate cu metodele descrise în continuare. Într-o altă realizare specifică NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) sunt reproduse în ouă de găină sau ouă de prepeliţă. În anumite realizări un virus NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric) este propagat iniţial în ouă embrionate şi apoi propagat în celule (de exemplu, într-o linie celulară).

NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) pot fi cultivate în ouă embrionate, de exemplu, de 6 până la 14 de zile, de 6 până la 12 de zile, de 6 până la 10 zile, de 6 până la 9 zile, de 6 până la 8 zile sau de 10 până la 12 zile. Ouăle imature sau imature embrionate pot fi folosite pentru a propaga NDV prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice). Ouăle embrionate imature cuprind ouă, care au mai puţin de zece zile, de exemplu, ouă de 6 până la 9 zile sau de 6 până la 8 zile, care sunt deficiente de IFN. Ouăle embrionate imature cuprind, de asemenea, ouă cu imitare artificială a imaturităţii pana la, dar mai puţin de zece zile, ca urmare a modificării condiţiilor de creştere, de exemplu, a schimbări temperaturilor de incubare; a tratări cu medicamente sau a oricărei alte modificări care are drept rezultat un ou cu o dezvoltare retardată, astfel încât sistemul IFN nu este dezvoltat complet, comparativ cu ouăle de zece până la douăsprezece zile. NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) pot fi propagate în diferite locaţii din oul embrionat, de exemplu, în cavitatea alantoidiană (US 6852522 B1 2005.02.08; US 7494808 B2 2009.02.24).

Pentru izolarea virusului, NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) pot fi îndepărtate din cultura de celule şi separate de componentele celulare, de obicei prin metode bine cunoscute de purificare, de exemplu, cum ar fi centrifugarea cu gradient şi cromatografia pe coloană, şi pot fi purificate suplimentar, dacă este dezirabil, folosind metode bine cunoscute specialiştilor în domeniu, de exemplu, analiza formării petelor.

Compoziţii şi căi de administrare

Prezenta invenţie se referă la utilizarea NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) în compoziţii. De asemenea, prezenta invenţie se mai referă la utilizarea în compoziţii a fragmentelor de membrană plasmatică din celulele infectate cu NDV sau celulele canceroase întregi, infectate cu NDV. Într-o variantă de realizare compoziţiile sunt compoziţii farmaceutice, cum ar fi formulări imunogene (de exemplu, formulări de vaccin). Compoziţiile pot fi utilizate în metodele de tratare a cancerului.

Într-o realizare a prezentei invenţii o compoziţie farmaceutică conţine un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) în amestec cu un purtător farmaceutic acceptabil. În unele realizări compoziţia farmaceutică conţine adiţional unul sau mai mulţi agenţi profilactici sau terapeutici, cum ar agenţii descrişi în continuare. Într-o variantă de realizare o compoziţie farmaceutică conţine o cantitate eficientă dintr-un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, NDV himerice) şi, opţional, unul sau mai mulţi agenţi profilactici şi terapeutici adiţionali într-un purtător farmaceutic acceptabil. În unele realizări NDV (de exemplu, un NDV himeric) este singurul ingredient activ inclus în compoziţia farmaceutică.

Într-o altă variantă de realizare o compoziţie farmaceutică (de exemplu, un vaccin oncolizat) conţine un concentrat proteic sau un preparat de fragmente de membrană plasmatică din celulele canceroase, infectate cu NDV, într-un amestec cu un purtător farmaceutic acceptabil. În unele realizări compoziţia farmaceutică conţine adiţional unul sau mai mulţi agenţi profilactici sau terapeutici, cum ar fi agenţii descrişi în continuare. Într-o altă formă de realizare o compoziţie farmaceutică (de exemplu, un vaccin cu celule integre) conţine celulele canceroase, infectate cu NDV, într-un amestec cu un purtător farmaceutic acceptabil. În unele realizări compoziţia farmaceutică conţine adiţional unul sau mai mulţi agenţi profilactici sau terapeutici, cum ar fi agenţii descrişi în continuare.

Compoziţiile farmaceutice, conform prezentei invenţii, pot fi sub orice formă care permite administrarea acestei compoziţii la un subiect. Într-o variantă de realizare compoziţiile farmaceutice sunt potrivite pentru administrare veterinară şi/sau umană. Cum este utilizat în prezentul context, termenul "farmaceutic acceptabil" înseamnă aprobat de către o agenţie de reglementare federală sau guvernamentală de stat sau înregistrat în Farmacopeea S.U.A. sau alte farmacopei în general recunoscute pentru utilizare la animale şi în special la oameni. Termenul "purtător" se referă la un diluant, adjuvant, excipient sau vehicul cu care se administrează compoziţia farmaceutică. Soluţiile saline şi soluţiile apoase de dextroză şi de glicerol pot fi, de asemenea, folosite ca purtători lichizi, în particular, pentru soluţii injectabile. Excipienţii adecvaţi includ amidon, glucoză, lactoză, sucroză, gelatină, malţ, orez, făină, cretă, silicagel, stearat de sodiu, glicerol monostearat, talc, clorură de sodiu, lapte praf degresat, glicerol, propilenă, glicol, apă, etanol, etc. Exemple de purtători farmaceutici adecvaţi sunt descrise în ("Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin). Formularea trebuie să se potrivească modului de administrare.

Într-o variantă de realizare compoziţiile farmaceutice sunt formulate pentru a fi potrivite pentru calea de administrare la un subiect. De exemplu, compoziţia farmaceutică poate fi formulată pentru a fi potrivită pentru administrare parenterală, intravenoasă, intraarterială, intrapleurală, inhalatoare, intraperitoneală, orală, intradermică, colorectală, intraperitoneală, intracraniană şi administrare intratumorală. Într-o variantă de realizare compoziţia farmaceutică poate fi formulată pentru administrare intravenoasă, intraarterială, orală, intraperitoneală, intranazală, intratraheală, intrapleurală, intracraniană, subcutanată, intramusculară, topică, pulmonară sau administrare intratumorală.

Utilizări anticancer şi alte utilizări

Într-un aspect un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) poate fi utilizat în tratamentul cancerului. Într-o realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului, care prevăd administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau o compoziţie a acestuia. Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă o metodă pentru tratarea cancerului, care prevede administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unei cantităţi eficiente de NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau de o compoziţie a acestuia.

În realizări specifice un NDV himeric, proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, sau o compoziţie a acestuia este administrat unui subiect pentru tratarea cancerului. În alte variante specifice un NDV himeric, proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, sau o compoziţie a acestuia este administrată unui subiect pentru tratarea cancerului. În anumite realizări un NDV himeric, proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, şi o proteină F mutantă sau o compoziţie a acestuia se administrează unui subiect pentru tratarea cancerului. În anumite realizări un NDV himeric, proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, şi o proteină F mutantă sau o compoziţie a acestuia se administrează unui subiect pentru tratarea cancerului.

Un NDV himeric (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus), conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin din celule de cancer integre, utilizat într-o metodă pentru tratarea cancerului, pot fi utilizate ca orice linie de terapie (de exemplu, ca prima, a doua, a treia, a patra sau a cincea linie de terapie).

În anumite realizări un NDV himeric al prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) este singurul ingredient activ administrat pentru a trata cancerul. În realizările specifice un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) este singurul ingredient activ într-o compoziţie administrată pentru tratarea cancerului.

NDV himeric (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau o compoziţie a acestuia pot fi administrate la un subiect local sau sistemic. De exemplu, NDV himeric (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau o compoziţie a acestuia pot fi administrate la un subiect parenteral (de exemplu, intravenos, intraarterial sau subcutanat), intratumoral, intrapleural, intranazal, intraperitoneal, intracranian, oral, rectal, prin inhalare, intramuscular, topic sau intradermic. Într-o realizare specifică, NDV himeric este administrat prin artera hepatică, de exemplu, prin injectarea în artera hepatică, care poate fi efectuată prin radiologia intervenţională sau prin plasarea unei pompe de perfuzie arterială. Într-o altă realizare specifică NDV himeric este administrat intraoperator, laparoscopic sau endoscopic. Într-o variantă de realizare administrarea intraperitoneală a NDV himeric este realizată prin injectare directă, infuzie printr-un cateter sau injectare în timpul laparoscopiei.

În anumite realizări metodele, conform prezentei invenţii, includ tratamentul cancerului, pentru care nici un tratament nu este disponibil. În unele realizări un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau o compoziţie a acestuia se administrează unui subiect pentru tratarea cancerului ca o alternativă la alte terapii convenţionale.

Într-o realizare prezenta invenţie se referă la o metodă pentru tratarea cancerului, care prevede administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau a unei compoziţii a acestuia şi una sau mai multe terapii, cum este descris în continuare. Într-o realizare particulară una sau mai multe terapii sunt administrate la un subiect în combinaţie cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau cu o compoziţie a acestuia pentru tratarea cancerului. Într-o variantă de realizare terapiile adiţionale se utilizează în prezent, au fost utilizate sau sunt cunoscute ca fiind utile în tratarea cancerului. Într-o altă variantă de realizare un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) sau o compoziţie a acestuia se administrează unui subiect în combinaţie cu o terapie de susţinere, o terapie de ameliorare a durerii sau o altă terapie care nu are un efect terapeutic asupra cancerului. Într-o variantă de realizare una sau mai multe terapii administrate în combinaţie cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) este una sau mai multe dintre terapiile descrise în continuare. În anumite realizări un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) şi una sau mai multe terapii adiţionale sunt administrate în aceeaşi compoziţie. În alte exemple de realizare un NDV himeric şi una sau mai multe terapii adiţionale se administrează în diferite compoziţii.

În anumite realizări două, trei sau mai multe NDV (inclusiv unul, două sau mai multe NDV himerice, conform prezentei invenţii, cum ar fi unul, două sau mai multe dintre NDV himerice descrise mai sus) sunt administrate la un subiect pentru tratarea cancerului. Două sau mai multe NDV himerice, utilizate în conformitate cu metodele descrise aici, care prevăd administrarea a două, trei sau mai multe NDV la un subiect pentru tratarea cancerului, pot fi NDV himerice native sau NDV himerice proiectate, care au fost proiectate pentru a exprima secvenţa aminoacidă heteroloagă ( de exemplu, o citokină). Primul şi al doilea NDV himeric poate fi parte a aceleiaşi compoziţii farmaceutice sau a diferite compoziţii farmaceutice. În anumite realizări primul NDV himeric şi al doilea NDV himeric se administrează pe aceeaşi cale de administrare (de exemplu, ambele sunt administrate intratumoral sau intravenos). În alte exemple de realizare primul NDV himeric şi al doilea NDV himeric se administrează pe căi diferite de administrare (de exemplu, unul este administrat intratumoral, iar celălalt se administrează intravenos).

În realizările specifice primul NDV himeric, proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, este administrat unui pacient pentru tratarea cancerului în combinaţie cu un al doilea NDV himeric, proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune. În alte exemple de realizare specifice primul NDV himeric, proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, este administrat în combinaţie cu un al doilea NDV himeric, proiectat pentru a exprima unul, două sau mai multe dintre următoarele: o citokină (de exemplu, IL-2), un antagonist heterolog de interferon, un antigen tumoral, o moleculă proapoptotică şi/sau o molecula antiapoptotică. Într-o variantă de realizare primul NDV himeric, al doilea NDV himeric sau ambele exprimă o proteină F mutantă, care amplifică activitatea fusogenică a NDV himeric. Într-o altă realizare specifică primul NDV himeric, al doilea NDV himeric sau ambele exprima o proteină F mutantă cu o mutaţie în locusul de clivaj (cum este descris aici).

În realizările specifice o primă compoziţie (de exemplu, o compoziţie farmaceutică), conţinând primul NDV himeric, proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune, este administrată unui pacient pentru tratarea cancerului în combinaţie cu o a doua compoziţie (de exemplu, o compoziţie farmaceutică), conţinând al doilea NDV himeric, proiectat pentru a exprima un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune. În alte exemple de realizare specifice o primă compoziţie (de exemplu, o compoziţie farmaceutică), conţinând primul NDV himeric, proiectat pentru a exprima un agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau un antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune, este administrată în combinaţie cu o a doua compoziţie (de exemplu, o compoziţie farmaceutică), conţinând al doilea NDV himeric, proiectat pentru a exprima unul, două sau mai multe dintre următoarele: o citokină (de exemplu, IL-2), un antagonist heterolog de interferon, un antigen tumoral, o moleculă proapoptotică şi/sau o molecula antiapoptotică. Într-o variantă de realizare primul NDV himeric, al doilea NDV himeric sau ambele exprima o proteina F mutant, care amplifică activitatea fusogenică a NDV himeric. Într-o altă realizare specifică primul NDV himeric, al doilea NDV himeric sau ambele exprima o proteină F mutantă cu o mutaţie în locusul de clivaj (cum este descris aici).

Într-un alt aspect un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) poate fi utilizat în combinaţie cu una sau mai multe terapii, cum ar fi cele descrise în continuare, în tratamentul cancerului. Într-o realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului, care prevăd administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) sau a unei compoziţii a acestuia şi una sau mai multe terapii adiţionale, cum ar fi cele descrise aici în continuare. Într-o realizare concretă a prezentei invenţii se prevede o metodă pentru tratarea cancerului, care cuprinde administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unei cantităţi eficiente dintr-un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) sau de o compoziţie a acestuia şi o cantitate eficientă de una sau mai multe terapii, cum ar fi cele descrise în continuare. În anumite realizări un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) şi una sau mai multe terapii adiţionale, cum este descris în continuare, se administrează în aceeaşi compoziţie. În alte exemple de realizare un NDV (de exemplu, un NDV descris mai sus) şi una sau mai multe terapii adiţionale se administrează în diferite compoziţii.

NDV, utilizat în combinaţie cu una sau mai multe terapii, poate fi administrat sistemic sau local. De exemplu, NDV sau o compoziţie a acestuia se poate administra la un subiect parenteral (de exemplu, intravenos, intraarterial sau subcutanat), intratumoral, intrapleural, intranazal, intraperitoneal, intracranian, oral, rectal, prin inhalare, intramuscular, topic sau intradermic. Într-o variantă de realizare NDV este administrat prin artera hepatică, de exemplu, prin injectarea în artera hepatică, care se poate realiza prin radiologia intervenţională sau prin plasarea unei pompe de perfuzie arterială. Într-o altă realizare specifică NDV este administrat intraoperator, laparoscopic, sau endoscopic. Într-o variantă de realizare administrarea intraperitoneală a NDV este realizată prin injectarea directă, printr-un cateter de perfuzie sau prin injectare în timpul laparoscopiei.

Un NDV (de exemplu, un NDV descris mai sus), conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule canceroase integre în combinaţie cu una sau mai multe terapii, cum ar fi cele descrise aici în continuare, se pot utiliza ca orice linie de terapie (de exemplu, prima, a doua, a treia, a patra sau a cincea linie de terapie) pentru tratarea cancerului, în conformitate cu o metodă a prezentei invenţii.

Într-un alt aspect celule canceroase integre, infectate cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) pot fi utilizate pentru a trata cancerul. Într-o variantă de realizare un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) poate fi pus în contact cu o celulă canceroasă sau cu o populaţie de celule canceroase şi cu celulele canceroase infectate sau cu populaţie de celule canceroase şi poate fi administrat la un subiect pentru tratarea cancerului. Într-o realizare celulele canceroase sunt supuse radiaţiei gamma înainte de infectare cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus). Într-o altă formă de realizare celulele canceroase sunt supuse la radiaţii gamma după infectare cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus). Într-o variantă particulară celulele canceroase sunt tratate înainte de a fi administrate la un subiect, astfel încât celulele canceroase nu se pot multiplica în subiect. Într-o variantă de realizare celulele canceroase nu se pot multiplica în subiect şi virusul nu poate infecta subiectul. Într-o realizare, celulele canceroase sunt supuse radiaţiei gamma înainte de a fi administrate subiectului. Într-o altă formă de realizare celulele canceroase sunt tratate cu ultrasunet înainte de administrarea la un subiect. Într-o altă formă de realizare celulele canceroase sunt tratate cu mitomicină C înainte de administrare la un subiect. Într-o altă formă de realizare celulele canceroase sunt tratate prin congelare şi decongelare înainte de administrare la un subiect. Într-o altă formă de realizare celulele canceroase sunt tratate cu un tratament termic înainte de administrare la un subiect. Celulele canceroase pot fi administrate local sau sistemic la un subiect. De exemplu, celulele canceroase pot fi administrate la un subiect parenteral (de exemplu, intravenos sau subcutanat), intratumoral, intranazal, oral, prin inhalare, intrapleural, topic sau intradermic. Într-o variantă de realizare celulele canceroase sunt administrate la un subiect intratumoral sau în piele (de exemplu, intradermic). Celulele canceroase utilizate pot fi autologe sau alogene. Într-o variantă de realizare baza unui NDV himeric este o tulpină nelitică. Celulele canceroase pot fi administrate la un subiect în monoterapie sau în combinaţie cu un tratament adiţional. Celulele canceroase sunt, de preferinţă, într-o compoziţie farmaceutică. În anumite realizări celulele canceroase sunt administrate în combinaţie cu una sau mai multe terapii, cum ar fi cele descrise în continuare. În anumite realizări celulele canceroase şi una sau mai multe terapii adiţionale sunt administrate în aceeaşi compoziţie. În alte exemple de realizare celulele canceroase şi una sau mai multe terapii adiţionale sunt administrate în diferite compoziţii.

Într-un alt aspect celule canceroase integre, infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) pot fi utilizate în combinaţie cu una sau mai multe terapii, descrise aici în continuare, în tratamentul cancerului. Într-o realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului, care prevăd administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a celulelor canceroase integre, infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) în combinaţie cu una sau mai multe terapii adiţionale descrise aici în continuare. Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă la o metodă pentru tratarea cancerului, care prevede administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unei cantităţi eficiente de celule canceroase integre, infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV descris mai sus) în combinaţie cu o cantitate eficientă de una sau mai multe terapii adiţionale descrise în continuare. În anumite realizări celulele canceroase integre, infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) şi una sau mai multe terapii adiţionale, descrise în continuare, se administrează în aceeaşi compoziţie. În alte exemple de realizare celulele canceroase integre, infectate cu un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) şi una sau mai multe terapii adiţionale se administrează în diferite compoziţii.

Într-un alt aspect un concentrat de proteină sau un preparat de membrană plasmatică de la celule canceroase lizate, infectate cu un NDV himeric (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) se pot utiliza în tratamentul cancerului. Într-o realizare un preparat de membrană plasmatică, cuprinzând fragmente de celulele canceroase infectate cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, poate fi utilizat pentru a trata cancerul. Într-o altă variantă de realizare un concentrat de o proteină din celulele canceroase, infectate cu un NDV himeric, conform prezentei invenţii, poate fi utilizat pentru a trata cancerul. Pentru a produce concentratul de proteină sau preparatul de membrană plasmatică se pot utiliza metode bine cunoscute unui specialist în domeniu. Într-o variantă de realizare un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) poate fi pus în contact cu o celulă canceroasă sau cu o populaţie de celule canceroase şi cu celulele canceroase infectate sau cu o populaţie de celule canceroase lizate, utilizând metode cunoscute unui specialist în domeniu, pentru a obţine concentrat proteic sau fragmente de membrana plasmatică a celulelor canceroase, infectate cu NDV, şi concentratul proteic sau fragmentele de membrană plasmatică a celulelor canceroase, infectate cu NDV, pot fi administrate la un subiect pentru tratarea cancerului. Concentratul proteic sau fragmentele de membrană plasmatică pot fi administrate la un subiect local sau sistemic. De exemplu, concentratul proteic sau fragmentele de membrană plasmatică pot fi administrate la un subiect parenteral, intratumoral, intranazal, intrapleural, oral, prin inhalare, topic sau intradermic. Într-o variantă de realizare un astfel de concentrat proteic sau de preparat de membrană plasmatică se administrează la un subiect intratumoral sau în piele (de exemplu, intradermic). Celulele canceroase, utilizate pentru a produce concentratul de proteină sau preparatul de membrană plasmatică, pot fi autologe sau alogene. Într-o variantă de realizare baza NDV himeric este o tulpină litică. Concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică poate fi administrat în monoterapie sau în combinaţie cu o terapie adiţională. Concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică este, de preferinţă, într-o compoziţie farmaceutică. În anumite realizări concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică se administrează în combinaţie cu una sau mai multe terapii, cum ar fi cele descrise în continuare. În anumite realizări concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică şi una sau mai multe terapii adiţionale se administrează în aceeaşi compoziţie. În alte realizări concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică şi una sau mai multe terapii adiţionale se administrează în diferite compoziţii.

Într-un alt aspect concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică din celule canceroase lizate infectate cu un NDV (de exemplu, un NDV descris mai sus) poate fi utilizat în combinaţie cu una sau mai multe terapii adiţionale, cum ar fi cele descrise în continuare, în tratamentul cancerului. Într-o realizare prezenta invenţie se referă la metode pentru tratarea cancerului, care prevăd administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unui concentrat proteic sau a unui preparat de membrană plasmatică din celule canceroase lizate, infectate cu un NDV (de exemplu, un NDV descris mai sus) în combinaţie cu una sau mai multe terapii adiţionale, cum ar fi cele descrise în continuare. Într-o variantă de realizare prezenta invenţie se referă la o metodă pentru tratarea cancerului, care prevede administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unei cantităţi eficiente dintr-un concentrat de proteine sau de un preparat de membrană plasmatică din celule canceroase lizate, infectate cu un NDV (de exemplu, un NDV descris mai sus) în combinaţie cu o cantitate eficientă de una sau mai multe terapii adiţionale, cum ar fi cele descrise în continuare. În anumite realizări concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică şi una sau mai multe terapii adiţionale se administrează în aceeaşi compoziţie. În alte realizări concentratul proteic sau preparatul de membrană plasmatică şi una sau mai multe terapii adiţionale se administrează în diferite compoziţii.

Într-un alt aspect NDV himerice, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) pot fi utilizate pentru a produce anticorpi, care pot fi folosiţi în analize imunologice diagnostice, imunoterapia pasivă şi în generarea anticorpilor antiidiotipici. De exemplu, un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus) poate fi administrat la un subiect (de exemplu, la un şoarece, şobolan, porc, cal, măgar, pasăre sau la o fiinţă umană) pentru a genera anticorpi, care pot fi apoi izolaţi şi utilizaţi, de exemplu, în teste de diagnostic, imunoterapie pasivă şi pentru generarea de anticorpi antiidiotipici. În anumite realizări un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) este administrat la un subiect (de exemplu, un şoarece, şobolan, porc, cal, măgar, pasăre sau la o fiinţă umană) în combinaţie cu una sau mai multe terapii suplimentare, cum ar fi cele descrise în continuare, pentru a genera anticorpi, care pot fi apoi izolaţi şi folosiţi, de exemplu, în analize diagnostice, imunoterapie pasivă şi pentru generarea de anticorpi antiidiotipici. Anticorpii generaţi pot fi izolaţi prin metode standard cunoscute în domeniu (de exemplu, cromatografia de imunoafinitate, centrifugarea, precipitarea, etc.) şi utilizaţi în analize imunologice de diagnostic, imunoterapia pasivă şi generarea de anticorpi antiidiotipici.

În anumite realizări anticorpii izolaţi de la subiecţii, care au administrat un NDV himeric, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric descris mai sus), sau izolaţi de la subiecţii, care au administrat un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV descris mai sus) în combinaţie cu una sau mai multe terapii, cum ar fi cele descrise în continuare, sunt utilizaţi pentru a evalua exprimarea proteinelor NDV, unei peptide sau proteine heterologe exprimate cu un NDV himeric, sau ambelor. Orice sistem de imunotestare cunoscut în domeniu poate fi utilizat în acest scop, inclusiv, dar nefiind exhaustive, sistemele competitive şi necompetitive de testare folosind aşa metode, cum ar fi testul de radioimunitate, ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), imunotestul "sandwich", reacţiile de precipitare, reacţiile de precipitare difuză în gel, testele de imunodifuzie, testele de aglutinare, testele de fixare a complementului, analizele imunoradiometrice, metodele imunologice prin fluorescenţă, testele imunologice pentru proteina A şi testele de imunoelectroforeză, enumerând doar câteva.

Pacienţii

În unele variante de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric), conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect care suferă de cancer. În alte exemple de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric), conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect predispus sau susceptibil la cancer. În unele variante de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect diagnosticat cu cancer. Exemplele specifice de tipuri de cancer sunt descrise în continuare. Într-o realizare subiectul are cancer metastatic. Într-un alt exemplu de realizare subiectul are stadiul 1, stadiul 2, stadiul 3 sau stadiul 4 de cancer. Într-o altă formă de realizare subiectul este în remisie. Într-o altă formă de realizare subiectul are o recurenţă a cancerului.

În anumite realizări un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un om în vârstă de 0 până la 6 luni, în vârstă de 6 până la 12 luni, în vârstă de 6 până la 18 luni, în vârstă de 18 la 36 de luni, de 1 până la 5 ani, de 5 până la 10 ani, de 10 până la 15 ani, de 15 până la 20 de ani, de 20 până la 25 de ani, de 25 până la 30 de ani, de 30 până la 35 de ani, de 35 până la 40 de ani, de 40 până la 45 de ani, de 45 până la 50 de ani, de 50 până la 55 de ani, de 55 până la 60 de ani, de 60 până la 65 de ani, de 65 până la 70 de ani, de 70 până la 75 de ani, de 75 până la 80 de ani, de 80 până la 85 de ani, de 85 până la 90 de ani, de 90 până la 95 de ani sau de 95 până la 100 de ani. În unele variante de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un copil mic. În alte exemple de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un copil de vârstă precoce. În alte exemple de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un copil. În alte exemple de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la o persoană adultă. În alte realizări un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la o persoană în vârstă.

În anumite realizări un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect într-o stare de imunodeficienţă sau într-o stare imunosupresivă sau cu un risc de a deveni imunodeficient sau imunosupresiv. În anumite realizări un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect care a primit sau se recuperează după un tratament imunosupresiv. În anumite realizări un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect care are sau prezintă risc de dezvoltare a unui cancer. În anumite realizări subiectul este, va fi sau a suportat o intervenţie chirurgicală, chimioterapie şi/sau radioterapie. În anumite realizări pacientul a suportat o intervenţie chirurgicală pentru a elimina tumoarea sau neoplasmul. În realizările specifice pacientul administrează un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, după o intervenţie chirurgicală pentru a elimina o tumoare sau un neoplasm. În altă variantă pacientul administrează un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, înainte de a fi supus rezecţiei unei tumori sau unui neoplasm. În anumite realizări un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect care are, va avea sau au avut un transplant de ţesut, un organ transplantat sau o transfuzie.

În unele variante de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un pacient care s-a dovedit a fi refractar la alte terapii, decât NDV himeric sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, dar nu mai administrează aceste terapii. Într-o variantă de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre, sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un pacient care s-a dovedit a fi refractar la chimioterapie. Într-o realizare cancerul refractar la o terapie înseamnă, că cel puţin o parte semnificativă din celulele canceroase nu sunt ucise şi/sau diviziunea celulară nu este stopată. Pentru a determina dacă celulele canceroase sunt refractare se poate utiliza orice metodă cunoscută în domeniu fie în vivo, sau in vitro, apreciind efectul unei terapii asupra celulelor canceroase, folosind semnificaţiile de "refractar", acceptate în domeniu, în acest context . Într-o anumită variantă pacientul refractar este un pacient refractar la o terapie standard. În anumite realizări un pacient cu cancer este refractar la o terapie în cazul, în care tumoarea sau neoplasmul nu a fost semnificativ eradicat şi/sau simptomele nu au fost ameliorate semnificativ. Pentru a determina dacă un pacient este refractar se poate utiliza orice metodă cunoscută în domeniu fie in vivo, sau in vitro, estimând, astfel, eficienţa unui tratament de cancer, folosind semnificaţiile de "refractar", acceptate în domeniu, în acest context.

În anumite realizări pacientul care urmează a fi tratat, conform metodelor prezentei invenţii, este un pacient deja tratat cu antibiotice, antivirale, antifungice sau altă terapie biologică/imunoterapie sau terapie anticanceroasă. Printre aceşti pacienţi sunt pacienţi refractari şi pacienţi de vârstă prea fragedă pentru terapiile convenţionale. În unele realizări subiectul care administrează un NDV (de exemplu, un NDV himeric), un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, anterior nu a administrat NDV himeric sau o compoziţie, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre sau o terapie combinată.

În unele variante de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un pacient pentru a preveni debutul cancerului la un pacient cu risc de a dezvolta cancer. În unele variante compuşii sunt administraţi la un pacient cu reacţii adverse la terapiile convenţionale.

În unele realizări subiectul care administrează un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, anterior nu a primit tratament. În alte exemple de realizare un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, se administrează la un subiect care a administrat un tratament, anterior administrări NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau compoziţiei, sau vaccinului oncolizat, sau vaccinului cu celule integre sau terapiei combinate. În unele variante de realizare subiectul administrează un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, având experienţa unor efecte secundare adverse la tratamentul anterior sau având un tratament anterior întrerupt din cauza nivelurilor inacceptabile de toxicitate pentru subiect.

Doze şi frecvenţa administrării

Cantitatea de NDV sau de o compoziţie a acestuia, de un vaccin oncolizat, sau de un vaccin cu celule integre, eficientă în tratamentul cancerului, va depinde de originea cancerului, calea de administrare, starea generală de sănătate a subiectului, etc. şi urmează a fi stabilită de medical curant. Metodele clinice standard, cum ar fi testele in vitro, pot fi folosite opţional pentru a identifica intervalele optime de dozare. Cu toate acestea, intervalele de dozare adecvate de un NDV pentru administrare sunt, în general, de aproximativ 102, 5x102, 103, 5x 03, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011 or 1012 pfu şi cel mai preferabile de aproximativ 104 până la aproximativ 1012, 106 până la 1012, 108 până la 1012, 109 până la 1012 sau 109 până la 1011 şi pot fi administrate la un subiect o dată, de două ori, de trei, de patru sau mai multe ori cu intervale de câte ori este necesar. Dozele de vaccinuri oncolizate pentru administrare constituie: 0,001 mg, 0,005 mg, 0,01 mg, 0,05 mg. 0,1 mg. 0,5 mg, 1,0 mg, 2,0 mg. 3.0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 10,0 mg, 0,001 mg până la 10,0 mg, 0,01 mg până la 1,0 mg, 0,1 mg până la 1 mg şi 0,1 mg până la 5,0 mg şi pot fi administrate la un subiect o dată, de două ori, de trei sau mai multe ori cu intervale de câte ori este necesar. Dozele de vaccinuri cu celule integre pentru administrare constituie 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011 sau 1012 celule şi pot fi administrate la un subiect o dată, de două ori, de trei sau de mai multe ori cu intervale de câte ori este necesar. În anumite realizări subiectului se administrează doze, similare cu cele, care în prezent sunt utilizate în studiile clinice ale NDV, vaccinurilor oncolizate sau vaccinurilor celulare integre. Dozele eficiente pot fi extrapolate din curbele doză-răspuns derivate din sistemele de testare in vitro sau cu model de animale.

În anumite variante de realizare a prezentei invenţii un NDV (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia se administrează unui subiect într-o singură doză, urmată de o a doua doză la 1 până la 6 săptămâni, 1 până la 5 săptămâni, 1 până la 4 săptămâni, 1 până la 3 săptămâni, 1 până la 2 săptămâni mai târziu. În conformitate cu aceste realizări, rapelurile pot fi realizate la un interval de 6 până la 12 luni după a două inoculare. În anumite realizări un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect într-o singură doză, urmată de o a doua doză la 1 până la 6 săptămâni, 1 până la 5 săptămâni, 1 până la 4 săptămâni, 1 până la 3 săptămâni, 1 până la 2 săptămâni mai târziu.

În anumite realizări administrarea aceluiaşi NDV (de exemplu, himeric NDV) sau a unei compoziţii a acestuia, a vaccinului oncolizat sau a vaccinului cu celule integre poate fi repetată şi administrarea pot fi realizată cel puţin peste 1 zi, 2 zile, 3 zile, 5 zile, 6 zile, 7 zile, 10 zile, 14 zile, 15 zile, 21 zile, 28 zile, 30 zile, 45 zile, 2 luni, 75 zile, 3 luni, sau cel puţin peste 6 luni. În alte variante administrarea aceluiaşi NDV (de exemplu, himeric NDV) sau a unei compoziţii a acestuia, a vaccinului oncolizat sau a vaccinului cu celule integre poate fi repetată şi administrarea pot fi realizată cel puţin peste 1 până la 14 zile, 1 până la 7 zile, 7 până la 14 zi, 1 până la 30 zile, 15 până la 30 zile, 15 până la 45 zile, 15 până la 75 zile, 15 până la 90 zile, 1 până la 3 luni, 3 până la 6 luni, 3 până la 12 luni sau 6 până la 12 luni. În unele variante primul NDV (de exemplu, primul NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia se administrează unui subiect urmat de administrarea unui al doilea NDV (de exemplu, al doilea NDV himeric) sau unei compoziţii a acestuia. În anumite realizări primul şi al doilea NDV (de exemplu, primul şi al doilea NDV himeric) sau compoziţiile acestora se pot administra la interval de cel puţin 1 zi, 2 zile, 3 zile, 5 zile, 6 zile, 7 zile, 10 zile, 14 zile, 15 zile, 21 zile, 28 zile, 30 zile, 45 zile, 2 luni, 75 zile, 3 luni, sau de cel puţin 6 luni. În alte exemple de realizare primul şi al doilea NDV (de exemplu, primul şi al doilea NDV himeric) sau compoziţiile acestora se pot administra la interval de 1 până la 14 zile, de 1 până la 7 zile, 7 până la 14 zile, de 1 până la 30 zile, 15 până la 30 de zile, 15 până la 45 zile, 15 până la 75 zile, 15 până la 90 de zile, 1 până la 3 luni, 3 până la 6 luni, 3 până la 12 luni sau 6 până la 12 luni.

În anumite realizări un NDV sau o compoziţie a acestuia, sau un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect în combinaţie cu una sau mai multe terapii adiţionale, cum ar fi o terapie descrisă în continuare. Dozele de alte una sau mai multe terapii adiţionale va depinde de diferiţi factori, inclusiv, de exemplu, de terapie, de originea cancerului, calea de administrare, starea generală de sănătate a subiectului, etc. şi trebuie luată în funcţie de hotărârea unui medic. În realizările specifice doza de cealaltă terapie constituie doza şi/sau frecvenţa de administrare a terapiei recomandate pentru tratament la utilizare ca agent unic şi se utilizează în conformitate cu metodele prezentei invenţii. În alte realizări doza de cealaltă terapie este o doză mai mică şi/sau se administrează mai puţin frecvent, decât cele recomandate pentru terapia la utilizare ca agent unic şi se utilizează în conformitate cu metodele prezentei invenţii. Dozele recomandate pentru terapiile aprobate pot fi găsite în Physician's Desk Reference.

În anumite realizări un NDV sau o compoziţie a acestuia, sau un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect simultan cu administrarea unei sau mai multor terapii adiţionale. În alte exemple de realizare un NDV sau o compoziţie a acestuia, sau un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect la fiecare 3 până la 7 zile, 1 până la 6 săptămâni, 1 până la 5 săptămâni, 1 până la 4 săptămâni, 2 până la 4 săptămâni, 1 până la 3 săptămâni sau 1 până la 2 săptămâni şi una sau mai multe terapii adiţionale (cum ar fi cele descrise în continuare) se administrează la fiecare 3 până la 7 zile, 1 până la 6 săptămâni, 1 până la 5 săptămâni, 1 până la 4 săptămâni, 1 până la 3 săptămâni sau 1 până la 2 săptămâni. În anumite realizări un NDV sau o compoziţie a acestuia, sau un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect la fiecare 1 până la 2 săptămâni şi una sau mai multe terapii adiţionale (cum ar fi cele descrise în continuare) se administrează la fiecare 2 până la 4 săptămâni. În unele variante de realizare un NDV sau o compoziţie a acestuia, sau un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect în fiecare săptămână şi una sau mai multe terapii adiţionale (cum ar fi cele descrise în continuare) se administrează o dată la 2 săptămâni.

Tipurile de cancer

Exemplele specifice de cancer, care pot fi tratate în conformitate cu metodele prezentei invenţii includ, dar nefiind exhaustive: leucemiile, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, leucemia acută, leucemia limfocitară acută, leucemia mielocitară, cum ar fi, leucemia mieloblastică, promielocitică, mielomonocitică, monocitară şi eritroleucemia şi sindromul mielodisplazic; leucemiile cronice, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, leucemia mielocitică cronică (granulocitară), leucemia limfocitară cronică, leucemia cu celule păroase; policitemia vera; limfoamele, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, boala Hodgkin, boala non-Hodgkin; mieloamele multiple, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, mielomul multiplu inactiv (numit, de asemenea, mielom multiplu mocnit), mielomul nesecretor, mielomul osteosclerotic, leucemia cu celule placancer, placancercitomul solitar şi placancercitomul extramedular; macroglobulinemia Waldenström; gamapatia monoclonală de geneză nedeterminată; gamapatia monoclonală benignă; boala lanţului greu; sarcoamele osoase şi ale ţesutului conjunctiv, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, sarcomul osos, osteosarcomul, condrosarcomul, sarcomul Ewing, tumoarea cu celule gigante maligne, fibrosarcomul osos, hordomul, sarcomul periostal, sarcoamele ţesuturilor moi, angiosarcomul (hemangiosarcomul), fibrosarcomul, sarcomul Kaposi, leiomiosarcomul, liposarcomul, limfangiosarcomul, neurilemomul, rabdomiosarcomul, sarcomul sinovial; tumorile cerebrale, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, gliomul, astrocitomul, gliomul trunchiului cerebral, ependimomul, oligodendrogliomul, tumoarea nonglială, glioblastomul multiform, neurinomul acustic, craniofaringiomul, meduloblastomul, meningiomul, pineocitomul, pineoblastomul, limfomul cerebral primar; cancerul mamar incluzând, dar nefiind exhaustiv, carcinomul ductal, adenocarcinomul, carcinomul lobular (celule de cancer), carcinomul intraductal, cancerul mamar medular, cancer mamar mucinos, cancerul mamar tubular, cancerul mamar papilar, boala Paget şi cancerul mamar inflamator; cancerul adrenal cum ar fi, dar nefiind exhaustive, feocromocitomul şi carcinomul adrenocortical; cancerul tiroidian, cum ar fi, dar nefiind exhaustiv, cancerul tiroidian papilar sau folicular, cancerul tiroidian medular şi cancerul tiroidian anaplazic; cancerul pancreatic cum ar fi, dar nefiind exhaustiv, insulinomul, gastrinomul, glucagonomul, vipomul, tumoarea secretoare de somatostatină şi carcinoide sau tumoarea celulelor insulare; cancerele pituitare cum ar fi, dar nefiind exhaustive, boala Cushing, tumoare secretoare de prolactină, acromegalia şi diabetul insipid; cancerele de ochi, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, melanomul ocular, cum ar fi, melanomul irisului, melanomul coroidian şi melanomul corpului ciliar şi retinoblastomul; cancerele vaginale, cum ar fi carcinomul cu celule scuamoase, adenocarcinomul şi melanomul; cancerul vulvar, cum ar fi carcinomul cu celule scuamoase, melanomul, adenocarcinomul, carcinomul bazocelular, sarcomul şi boala Paget; cancerul de col uterin, cum ar fi, dar nefiind exhaustiv, carcinomul cu celule scuamoase şi adenocarcinomul; cancerul uterin, cum ar fi, dar nefiind exhaustiv, carcinomul endometrial şi sarcomul uterin; cancerul ovarian, cum ar fi, dar nefiind exhaustiv, carcinomul ovarian epitelial, tumoarea borderline, tumoarea celulelor germinative şi tumoarea stromală; cancerul esofagian, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, cancerul scuamos, adenocarcinomul, carcinomul adenoid chistic, carcinomul mucoepidermoid, carcinomul adenoscuamos, sarcomul, melanomul, placancercitomul, carcinomul verucos şi carcinomul cu celule “în bob de ovăz” (celule canceroase); cancerul gastric, cum ar fi, dar nefiind exhaustiv, adenocarcinomul, cancer vegetant (polipoid), ulcerat, cu răspândire superficială, cu răspândire difuză, limfomul malign, liposarcomul, fibrosarcomul şi carcinosarcomul; cancerul de colon; cancerul rectal; cancerul hepatic, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, carcinomul hepatocelular şi hepatoblastomul; cancerul de vezică biliară, cum ar fi adenocarcinomul; colagiocarcinoamul, cum ar fi, dar nefiind exhaustiv, papilar, nodular şi difuz; cancerele pulmonare, cum ar fi cancerul pulmonar cu celule necanceroase, carcinomul cu celule scuamoase (carcinomul epidermoid), adenocarcinomul, carcinomul cu celule mari şi cancerul pulmonar cu celule canceroase; cancerele testiculare, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, tumoarea germinală, seminomul anaplazic, clasic (tipic), spermatocitic, nonseminomul, carcinomul embrionar, carcinomul teratom, coriocarcinomul (tumoarea sacului vitelin), cancerele de prostată, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, neoplazia intraepitelială prostatică, adenocarcinomul, leiomiosarcomul şi rabdomiosarcomul; cancerele penale; cancerele orale, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, carcinomul cu celule scuamoase; cancerele bazale; cancerele glandelor salivare, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, adenocarcinomul, carcinomul mucoepidermoid şi carcinomul adenoid cistic; cancerele faringelui cum ar fi, dar nefiind exhaustive, cancerul cu celule scuamoase şi verucos; cancerele de piele, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, carcinomul bazocelular, carcinomul cu celule scuamoase şi melanomul, melanomul cu răspândire superficială, melanomul nodular, melanomul malign lentigo, melanomul lentiginos al extremităţilor; cancerele renale, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, carcinomul cu celule renale, adenocarcinomul, hipernefromul, fibrosarcomul, cancerul cu celule de tranziţie (ale pelvisului renal şi/sau uterului); tumoarea Wilms; cancerele vezicii urinare cum ar fi, dar nefiind exhaustive, carcinomul cu celule de tranziţie, cancerul cu celule scuamoase, adenocarcinomul, carcinosarcomul. Adiţional, cancerele includ mixosarcomul, sarcomul osteogenic, endoteliosarcomul, limfangioendoteliosarcomul, mezoteliomul, sinoviomul, hemangioblastomul, carcinomul epitelial, cistadenocarcinomul, carcinomul bronhogenic, carcinomul glandelor sudoripare, carcinomul glandei sebacee, carcinomul papilar şi adenocarcinoamele papilare (Fishman et al., Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1985; Murphy et al. Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America, 1997).

Într-o variantă de realizare NDV himerice, conform prezentei invenţii, sau compoziţii ale acestora, un vaccin oncolizat, un vaccin cu celule integre sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, sunt utile în tratamentul unei varietăţi de cancere şi boli proliferative anormale, inclusiv (dar nefiind exhaustive) următoarele: carcinomul, incluzând cel al vezicii urinare, mamar, de colon, renal, hepatic, pulmonar, ovarian, pancreatic, gastric, de col uterin, tiroidian şi de piele; incluzând carcinomul cu celule scuamoase; tumorile hematopoietice ale liniei limfoide, incluzând leucemia, leucemia limfocitară acută, leucemia limfoblastică acută, limfomul cu celule B, limfomul cu celule T, limfomul Burkitt; tumorile hematopoietice ale liniei mieloide, incluzând leucemiile mielocitare acute şi cronice şi leucemia promielocitară; tumorile de origine mezenchimală, incluzând fibrosarcomul şi rabdomiosarcomul; alte tumori, incluzând melanomul, seminomul, teratocarcinomul, neuroblastomul şi gliomul; tumorile sistemului nervos central şi periferic, incluzând astrocitomul, neuroblastomul, gliomul şi neurilemomul; tumorile de origine mezenchimală, incluzând fibrosarcomul, rabdomiosarcomul şi osteosarcomul; şi alte tumori, incluzând melanomul, xeroderma pigmentosum, keratoactantomul, seminomul, cancerul folicular tiroidian şi teratocarcinomul.

În unele variante cancerele asociate cu aberaţii în apoptoză sunt tratate în conformitate cu metodele prezentei invenţii. Astfel de cancere pot include, dar nefiind exhaustive, limfoamele foliculare, carcinoamele cu mutaţii p53, tumorile hormonodependente ale glandei mamare, prostatei şi ovarelor şi leziunile precanceroase, cum ar fi polipoza adenomatoasă familială şi sindroamele mielodisplazice. În realizările specifice modificările malignizante şi disproliferative (cum ar fi, metaplazia şi displazia) sau tulburările hiperproliferative ale pielii, plămânilor, ficatului, oaselor, creierului, stomacului, colonului, glandei mamare, prostatei, vezicii urinare, rinichilor, pancreasului, ovarelor şi/sau uterului sunt tratate în conformitate cu metodele prezentei invenţii. In alte realizări specifice un sarcom sau un melanom este tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţii.

Într-o variantă de realizare cancerul, tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţii, este leucemie, limfom sau mielom (de exemplu, mielom multiplu). Exemplele specifice de leucemii şi de alte tipuri de cancer transmisibile prin sânge, care pot fi tratate în conformitate cu metodele prezentei invenţii, includ, dar nefiind exhaustive, leucemia limfoblastică acută "LLA", leucemia acută limfoblastică cu celule B, leucemia acută limfoblastică cu celule T, leucemia acută mieloblastică "LAM", leucemia acuta promielocitara "LAP", leucemia monoblastică acută, leucemia eritroleucemică acută, leucemia megacarioblastică acută, leucemia mielomonocitară acută, leucemia nelimfocitară acută, leucemia nediferenţiată acută, leucemia mielocitară cronică "LMC", leucemia limfocitară cronica “LLC" şi leucemia cu celule păroase.

Exemplele specifice de limfoame, care pot fi tratate în conformitate cu metodele prezentei invenţii, includ, dar nefiind exhaustive, boala Hodgkin, limfomul non-Hodgkin, mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenstrom, boala lanţului greu şi policitemia vera.

Într-o altă realizare cancerul tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţii este o tumoare solidă. Exemplele de tumori solide, care pot fi tratate în conformitate cu metodele prezentei invenţii, includ, dar nefiind exhaustive, fibrosarcomul, mixosarcomul, liposarcomul, condrosarcomul, sarcomul osteogenic, cordomul, angiosarcomul, endoteliosarcomul, limfangiosarcomul, limfangioendoteliosarcomul, sinoviomul, mezoteliomul, tumoarea Ewing, leiomiosarcomul, rabdomiosarcomul, cancerul de colon, cancerul colorectal, cancerul de rinichi, cancerul pancreatic, cancerul osos, cancer mamar, cancerul ovarian, cancerul de prostată, cancerul esofagian, cancerul de stomac, cancerul oral, cancerul nazal, cancerul la gât, carcinomul cu celule scuamoase, carcinomul bazocelular, adenocarcinomul, carcinomul glandei sudoripare, carcinomul glandei sebacee, carcinomul papilar, adenocarcinoame papilare, cistadenocarcinomul, carcinomul medular, carcinomul bronhogenic, carcinomul cu celule renale, hepatomul, carcinomul de duct biliar, coriocarcinomul, seminomul, carcinomul embrionar, tumoarea Wilms, cancerul de col uterin, cancerul uterin, cancerul testicular, cancerul pulmonar cu celule canceroase, carcinomul de vezică urinară, cancerul pulmonar, carcinomul epitelial, gliomul, glioblastomul multiform, astrocitomul, meduloblastomul, craniofaringiomul, ependimomul, pinealomul, hemangioblastomul, neuromul acustic, oligodendrogliomul, meningiomul, cancerul de piele, melanomul, neuroblastomul şi retinoblastomul. Într-o altă formă de realizare cancerul tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţii este un cancer metastatic. Într-o altă formă de realizare cancerul, tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţii, este malign.

Într-o variantă de realizare cancerul tratat, în conformitate cu metodele prezentei invenţii, este un cancer care are un prognostic nefavorabil şi/sau are un răspuns ineficient la terapiile convenţionale, cum ar fi chimioterapie şi radiaţii. Într-o altă realizare specifică cancerul tratat, în conformitate cu metodele prezentei invenţii, este melanomul malign, gliomul malign, carcinomul cu celule renale, adenocarcinomul pancreatic, mezoteliom pleural malign, adenocarcinomul pulmonar, carcinomul pulmonar cu celule mici, carcinomul pulmonar cu celule scuamoase, cancerul tiroidian anaplazic şi carcinomul cu celule scuamoase al capului şi gâtului. Într-o altă realizare specifică cancerul, tratat în conformitate cu metodele prezentei invenţii, este un tip de cancer descris în continuare.

Terapii adiţionale

Terapiile adiţionale, care pot fi utilizate într-o combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, sau cu o compoziţie a acestuia, cu un vaccin oncolizat, sau cu un vaccin cu celule integre pentru tratamentul cancerului, includ, dar nefiind exhaustive, molecule mici, medicamente sintetice, peptide (inclusiv peptide ciclice), polipeptide, proteine, acizi nucleici (de exemplu, nucleotide ale ADN şi ARN incluzând, dar nefiind exhaustive, secvenţe de nucleotide antisens, helix triplu, ARNi şi secvenţe de nucleotide care codifică proteine, polipeptide sau peptide biologic active), anticorpi, molecule anorganice naturale sau sintetice, agenţi mimetici şi molecule organice naturale sau sintetice. Într-o variantă de realizare terapia adiţională reprezintă un agent chimioterapeutic.

În unele variante de realizare un NDV, conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre se utilizează în asociere cu radioterapia, care prevede utilizarea razelor roentgen, razelor gamma şi altor surse de radiaţii pentru a distruge celulele canceroase. În realizările specifice radioterapia se administrează ca radioterapie externă sau teleterapie, în care radiaţia este direcţionată spre o sursă îndepărtată. În alte realizări radioterapia se administrează ca tratament intern sau brahiterapie, în care o sursă radioactivă este plasată în interiorul corpului aproape de celule canceroase şi/sau de o masă tumorală.

În anumite realizări un NDV, conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule integre se utilizează în asociere cu terapia cu celule T adoptive. Într-o variantă de realizare celulele T, utilizate în terapia cu celule T adoptive, reprezintă limfocite care infiltrează tumoarea, izolate de la un subiect, şi celula T concretă sau clona au fost înmulţite pentru utilizare. În unele variante celulele T, utilizate în terapia cu celule T adoptive, reprezintă celulele T prelevate din sângele pacientului după administrarea unui vaccin împotriva cancerului şi înmulţite in vitro înainte de utilizare. Într-o altă realizare specifică celulele T, utilizate în terapia cu celule T adoptive, reprezintă celulele T care au fost influenţate să recunoască şi să atace puternic tumoarea. Într-o altă realizare specifică celulele T, utilizate în terapia cu celule T adoptive, au fost modificate genetic pentru a exprima receptorul celulelor T, specific pentru antigenul tumoral, sau un receptor de antigen himeric (CAR). Într-o variantă de realizare terapia cu celule T adoptive utilizate este similară celei descrise în continuare.

În anumite realizări un NDV, conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule canceroase integre sunt utilizate în combinaţie cu o citokină. Într-o variantă de realizare un NDV, conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, sau un vaccin cu celule canceroase integre se utilizează în asociere cu interferon (de exemplu, cu IFN-Γ).

Terapiile anticancer disponibile în prezent şi dozele acestora, căile de administrare şi de utilizare recomandate sunt cunoscute în domeniu şi sunt descrise în literatura de specialitate (Physician's Desk Reference, 67th ed., 2013).

Exemplele specifice de agenţi anticancer, care pot fi utilizaţi în combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, sau cu o compoziţie a acestuia includ: agenţi hormonali (de exemplu, un inhibitor de aromatază, un modulator selectiv al receptorului de estrogen (SERM) şi un antagonist al receptorului estrogenic), agenţi chimioterapeutici (de exemplu, un blocant de dezasamblare a microtubulilor, antimetabolit, inhibitor de topoizomerază şi agent de reticulare sau agent de deteriorare a ADN), agenţi antiangiogenici (de exemplu, antagonist VEGF, antagonist al receptorilor, antagonist al integrinei, agent de ţintire vasculară (VTA)/agent de perturbare vasculară (VDA)), terapia cu radiaţii (radioterapia) şi chirurgia obişnuită.

Exemplele nelimitative de agenţi hormonali, care pot fi utilizaţi în combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, sau cu o compoziţie a acestuia includ: inhibitori de aromatază, SERM şi antagonişti ai receptorilor de estrogen. Agenţii hormonali, care sunt inhibitori de aromatază, pot fi steroidieni sau nesteroidieni. Exemplele nelimitative de agenţi hormonali nesteroidieni includ: letrozol, anastrozol, aminoglutetimidă, fadrozol şi vorozol. Exemplele nelimitative de agenţi hormonali steroidieni includ: aromasină (exemestan), formestan şi testolactonă. Exemplele nelimitative de agenţi hormonali, care sunt SERM, includ tamoxifen (marcă/comercializat ca Nolvadex®), afimoxifen, arzoxifen, bazedoxifen, clomifen, femarel, lasofoxifen, ormeloxifen, raloxifen şi toremifen. Exemplele nelimitative de agenţi hormonali, care sunt antagonişti ai receptorilor de estrogen, includ: fulvestrant. Alţi agenţi hormonali includ, dar nefiind exhaustive, abirateron şi lonaprisan.

Exemplele nelimitative de agenţi chimioterapeutici, care pot fi utilizaţi în combinaţie cu un NDV, conform prezentei invenţii, sau cu o compoziţie a acestuia, cu un vaccin oncolizat sau cu un vaccin cu celule integre includ: blocant de dezasamblare a microtubulilor, antimetabolit, inhibitor de topoizomerază şi agent de reticulare sau agent de deteriorare a ADN. Agenţii chimioterapeutici, care sunt blocanţi de dezasamblare a microtubulilor includ, dar nefiind exhaustivi, taxene (de exemplu, paclitaxel (marcă/comercializat ca TAXOL®), docetaxel, abraxan, larotaxel, ortataxel şi tesetaxel); epotilone (de exemplu, ixabepilon) şi alcaloizi de vinca (de exemplu, vinorelbină, vinblastină, vindesină şi vincristină (marcă/comercializate ca ONCOVIN®)).

Agenţii chimioterapeutici, care sunt antimetaboliţi includ, dar nefiind exhaustivi, antimetaboliţi de folat (de exemplu, metotrexat, aminopterină, pemetrexed, raltitrexed); antimetaboliţi purinici (de exemplu, cladribină, clofarabină, fludarabină, mercaptopurină, pentostatin, tioguanină); antimetaboliţi pirimidinici (de exemplu, 5-fluorouracil, capecitabină, gemcitabină (GEMZAR ®), citarabină, decitabină, floxuridină, tegafur) şi antimetaboliţi dezoxiribonucleotidici (de exemplu, hidroxiuree).

Agenţii chimioterapeutici, care sunt inhibitori ai topoizomerazei includ, dar nefiind exhaustivi, inhibitori ai topoizomerazei din clasa I (camptoteca) (de exemplu, topotecan (marcă/comercializat ca HYCAMTIN®) irinotecan, rubitecan şi belotecan); inhibitori ai topoizomerazei din clasa II (podophyllum) (de exemplu, etoposid sau VP-16 şi tenipozid); antracicline (de exemplu, doxorubicină, epirubicină, Doxil, aclarubicină, amrubicină, daunorubicină, idarubicină, pirarubicină, valrubicină şi zorubicină) şi antracendione (de exemplu, mitoxantron şi pixantron).

Agenţii chimioterapeutici, care sunt agenţi de reticulare a ADN (sau agenţi de deteriorare a ADN) includ, dar nefiind exhaustivi, agenţi de alchilare (de exemplu, ciclofosfamidă, mecloretamină, ifosfamidă (marcă/comercializat ca IFEX®), trofosfamida, clorambucil, melfalan, prednimustin, bendamustin, uramustin, estramustin, carmustină (marcă/comercializat ca BiCNU®), lomustin, semustin, fotemustin, nimustin, ranimustin, streptozocin, busulfan, manosulfan, treosulfan, carbocuonă, N,N'-trietilentiofosforamidă, triazicuonă, trietilenmelamină); agenţi similari agenţilor de alchilare (de exemplu, carboplatină (marcă/comercializată ca PARAPLATIN®), cisplatină, oxaliplatină, nedaplatină, tetranitrat de triplatină, satraplatină, picoplatină); agenţi de reticulare a ADN neclasici (de exemplu, procarbazină, dacarbazină, temozolomidă (marca/comercializată ca TEMODAR®), altretamină, mitobronitol) şi agenţi de intercalare (de exemplu, actinomicină, bleomicina, mitomicină şi plicamicină).

Modulatori imuni

În realizările specifice un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre următorii imunomodulatori: orice agonist al unui semnal costimulator al unei celule imune (cum ar fi, de exemplu, limfocitele T, celulele NK sau o celulă prezentatoare de antigen (de exemplu, o celulă dendritică sau macrofage) şi/sau orice antagonist al unui semnal inhibitor al unei celule imune (cum ar fi, de exemplu, limfocitele T, celulele NK sau o celulă prezentatoare de antigen (de exemplu, o celulă dendritică sau macrofage), cunoscute specialiştilor în domeniu. În unele realizări particulare un NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre agoniştii unui semnal costimulator al unei celule imune, descrişi mai sus. În unele realizări un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre antagoniştii unui semnal inhibitor al unei celule imune, descrişi mai sus. În anumite realizări un NDV, conform prezentei invenţii, (de exemplu, un NDV himeric) sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat sau un vaccin cu celule integre se administrează la un subiect în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre agoniştii unui semnal costimulator al unei celule imune şi/sau cu unul sau mai mulţi dintre antagoniştii unui semnal inhibitor al unei celule imune, descrişi în continuare(de exemplu, un anticorp anti-CTLA-4, un anticorp ICOS-L, un anticorp anti PD-1 sau un anticorp anti-PD-L1).

Metode de analiză biologică

Analiza virusului in vitro

Analizele virusului includ acele, care măsoară replicarea virală alterată (cum este determinat, de exemplu, prin formarea plăcilor) sau producerea de proteine virale (cum este determinat, de exemplu, prin analiza Western blot) sau ARN virali (cum este determinat, de exemplu, prin RT-PCR sau analiza Northern Blot) în celulele de cultură in vitro, folosind metode bine cunoscute în domeniu.

Creşterea NDV, conform prezentei invenţii, poate fi evaluată prin orice metodă cunoscută în domeniu sau descrisă aici (de exemplu, în cultura celulară (de exemplu, culturile de celule renale embrionare de pui sau culturile de fibroblaste embrionare de pui (CEF)). Titrul viral poate fi determinat prin inocularea diluţiilor în serie de un NDV, conform prezentei invenţii, în culturi de celule (de exemplu, CEF, MDCK, celule EFK-2, celule Vero, celule endoteliale din vena ombilicală primară umană (HUVEC), linia de celule epiteliale umane H292 sau de celule HeLa), embrioni de pui sau animale vii (de exemplu, păsări). După incubarea virusului pentru un timp specificat, virusul este izolat, folosind metode standard. Cuantificarea fizică a titrului virusului poate fi realizată folosind PCR aplicată la supernatante virale (Quinn & Trevor, 1997; Morgan et al., 1990), teste de hemaglutinare, doze infecţioase de cultură tisulară (TCID50) sau doze infecţioase pentru embrionii de păsări (EID50). O metodă tipică de evaluare a titrului viral este descrisă în continuare.

Incorporarea secvenţelor nucleotidice, care codifică o peptidă sau proteină heteroloagă (de exemplu, o citokină, o proteină F mutantă, o proteină V mutantă sau locusul ţintă pentru miARN) în genomul unui NDV himeric, conform prezentei invenţii, poate fi evaluată prin orice metodă cunoscută în domeniu sau descrisă aici (de exemplu, în cultură celulară, pe un model animal sau în cultură virală în oua embrionate). De exemplu, particulele virale din culturile celulare de lichid alantoidian de ouă embrionate pot fi purificate prin centrifugare într-un gradient de zaharoză şi ulterior analizate pentru expresia proteinelor de fuziune prin metode de Western blot bine cunoscute în domeniu.

Abordările, bazate pe imunofluorescenţă pot fi, de asemenea, folosite pentru a detecta virusul şi a evalua creşterea virală. Astfel de abordări sunt bine cunoscute specialiştilor în domeniu, de exemplu, microscopia de fluorescenţă şi citometria în flux.

Analiza anticorpilor

Anticorpii, generaţi de NDV, conform prezentei invenţii, pot fi caracterizaţi printr-o varietate de moduri bine cunoscute de către specialiştii în domeniu (de exemplu, ELISA, metoda de rezonanţă a plasmonului de suprafaţă (BIAcore), Western blot, imunofluorescenţă, colorare cu utilizarea unui marker imun şi/sau teste de microneutralizare) . În special, anticorpii, generaţi de NDV himerice, conform prezentei invenţii, pot fi testaţi pentru abilitatea de a se lega specific la un antigen de virus sau la o peptidă sau proteină heteroloagă. Un astfel de test poate fi efectuat în soluţie (Houghten, Bio/Techniques, no 13, 1992, p. 412-421), pe granule (Lam. Nature, no 354, 1991, p. 82-84), pe cipuri (Fodor. Nature, no 364, 1993, p. 555-556), pe bacterii (US 5223409 A 1993.06.29), pe spori (US 5571698 A 1996.11.05; US 5403484 A 1995.04.04; US 5223409 A 1993.06.29), pe plasmide (Cull et al. Proc. Natl. Acad. Sci., no 89, USA, 1992, p. 1865-1869) sau pe fag (Scott and Smith. Science, no 249, 1990, p. 386-390; Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci., no 87, USA, 1990, p. 6378-6382; Felici. J. Mol. Biol., no 222, 1991, p. 301-310).

Anticorpii, generaţi de NDV himerice, conform prezentei invenţii, identificaţi pentru a se lega specific la un antigen de virus sau la o peptidă sau proteină heteroloagă, pot fi testaţi pentru specificitatea lor la respectivul antigen al virusului sau peptidă sau proteină heteroloagă. Anticorpii pot fi testaţi pentru legarea specifică la un antigen de virus sau la o peptidă sau proteină heteroloagă şi pentru reactivitatea lor încrucişată cu alte antigene prin orice metodă cunoscută în domeniu. Testele imunologice, care pot fi utilizate pentru a analiza reactivitatea lor încrucişată şi legarea specifică includ, dar nefiind exhaustive, sisteme de testare competitive şi necompetitive, utilizând metode, cum ar fi Western blot, analiza radioimună, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), imunotestele "sandwich", teste de imunoprecipitare, reacţii de precipitare, reacţiile de precipitare difuză în gel, analize de imunodifuzie, teste de aglutinare, reacţia de fixare a complementului, analize imunoradiometrice, imunoanaliza fluorescentă, imunoanaliza proteinei A (Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994).

Afinitatea de legare a unui anticorp la un antigen şi rata de disociere la interacţiunea anticorpului cu antigenul poate fi determinată prin analize de legare competitivă. Alternativ, o metodă de rezonanţă a plasmonului de suprafaţă (de exemplu, analiza cinetică BIAcore) sau testul KinExA (Blake, et al. Analytical Biochem., no. 272, 1999, p. 123-134) pot fi utilizate pentru a determina ratele de legare a anticorpilor şi de disociere a anticorpilor cu antigenele NDV himerice, conform prezentei invenţii.

Analiza IFN

Inducerea li eliberarea IFN ca răspuns la NDV, conform prezentei invenţii, pot fi determinate folosind metode cunoscute unui specialist în domeniu sau descrise aici. De exemplu, cantitatea de IFN, indusă în celulele după infecţia cu un NDV, conform prezentei invenţii, poate fi determinată utilizând un test imunologic (de exemplu, ELISA sau Western blot) pentru a măsura exprimarea IFN sau pentru a măsura expresia unei proteine, a cărei expresie este indusă prin IFN. Alternativ, cantitatea de IFN indusă poate fi măsurată la nivelul ARN prin aşa metode, cum ar fi Northern blot şi RT-PCR cantitativă, cunoscute specialiştilor în domeniu. În variantele concrete de realizare a prezentei invenţii cantitatea eliberată de IFN poate fi măsurată utilizând un test ELISPOT (de exemplu, metodele descrise în continuare). Mai mult decât atât, inducerea şi eliberarea de citokine poate fi determinată, de exemplu, printr-o analiză imunologică sau ELISPOT la nivel de proteine şi/sau RT-PCR cantitativă sau Northern blot la nivel de ARN. Descrierea analizei în scopul măsurării inducţiei şi eliberării citokinelor este prezentată în continuare.

Analiza markerilor de activare

Metodele de apreciere a nivelului de expresie al markerilor de activare, moleculei costimulatoare, ligandului sau moleculei inhibitoare de celulele imune sunt cunoscute specialiştilor în domeniu. De exemplu, expresia unei marker de activare, moleculei costimulatoare, ligandului sau moleculei inhibitoare de celulele imune (de exemplu, T limfocitele sau celulele NK) poate fi evaluată prin citometria în flux. Într-o variantă de realizare a prezentei invenţii metodele, descrise în continuare, sunt utilizate pentru a evalua exprimarea unui marker de activare, moleculei costimulatoare, ligandului sau moleculei inhibitoare de celulele imune.

Analiza infiltrării celulelor imune

Metodele de evaluare a infiltrării celulelor imune sunt cunoscute specialiştilor în domeniu. Într-o variantă de realizare a prezentei invenţii metodele, descrise în continuare, sunt utilizate pentru a evalua infiltrarea celulelor imune.

Studierea toxicităţii

În unele variante de realizare NDV, conform prezentei invenţii, sau compoziţiile acestora, vaccinurile oncolizate, vaccinuri cu celule integre sau terapiile combinate, conform prezentei invenţii sunt testate pentru citotoxicitate pe linii celulare de mamifere, de preferinţă umane (de exemplu, testul de citotoxicitate descris în continuare). În anumite realizări citotoxicitate este evaluată în una sau mai multe dintre următoarele exemple nelimitative de linii celulare: o linie celulară de monocite umane U937; celule primare mononucleare din sângele periferic (PBMC); o linie de celule de hepatoblastom uman Huh7; celule HL60, celule HT1080, celule HEK 293T şi 293H, MLPC, linii de celule de mezonefros uman; liniile de celule de melanom uman, cum ar fi SkMel2, SKMEL-119 şi SKMEL-197; monocite umane THP-1; linia de celule HeLa; linii de celule de neuroblastom, cum ar fi MC-IXC, SK-N-MC, SK-N-MC, SK-N-DZ, SH-SY5Y şi BE (2)-C. În anumite realizări ale invenţiei citotoxicitatea este evaluată în diferite celule canceroase. În unele variante de realizare pentru evaluarea toxicităţii se foloseşte analiza ToxLite.

Multe teste, cunoscute în domeniu, pot fi utilizate pentru a evalua viabilitatea celulelor sau liniilor celulare după infectarea cu un NDV, conform prezentei invenţii, sau cu o compoziţie a acestuia, sau după un tratament cu un vaccin oncolizat, conform prezentei invenţii, cu un vaccin cu celule integre, conform prezentei invenţii, , sau o terapie combinată, conform prezentei invenţii, şi, astfel, se determină citotoxicitatea NDV sau a compoziţiei acestuia, a vaccinului oncolizat, a vaccinului cu celule integre sau a terapiei combinate. De exemplu, proliferarea celulelor poate fi apreciată prin măsurarea încorporării bromdeoxiuridinei (BrdU), incorporării (3H) timidinei prin numărarea directă a celulelor sau prin detectarea schimbărilor in transcripţia, translaţia sau activitatea genelor cunoscute, cum ar fi proto-oncogenele (de exemplu, fos, myc) sau markerilor ciclului celular (Rb, Cdc2, ciclină A, D1, D2, D3, E, etc). Nivelurile de astfel de proteine şşi ARNm şi activitatea pot fi determinate prin orice metodă bine cunoscută în domeniu. De exemplu, proteina poate fi cuantificată prin metode cunoscute de imunodiagnostic, cum ar fi ELISA, Western blot sau imunoprecipitare, folosind anticorpi, inclusiv anticorpi comercial disponibili. ARNm poate fi determinat cantitativ utilizând metode bine cunoscute şi de rutină în domeniu, de exemplu, folosind Northern blot, protecţia de ARNză sau reacţia polimerazei în lanţ asociată cu transcripţie inversă. Viabilitatea celulelor poate fi evaluată prin colorare cu tripan albastru sau alţi marcheri de moarte celulară sau de viabilitate, cunoscuţi în domeniu. Într-o variantă de realizare pentru determinarea viabilităţii celulare este măsurat nivelul de ATP celular. În realizări preferate NDV, conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, un vaccin cu celulă integră sau o terapie combinată distruge celulele canceroase, dar nu ucide celulele sănătoase (adică, necanceroase). Într-o variantă de realizare NDV, conform prezentei invenţii, sau o compoziţie a acestuia, un vaccin oncolizat, un vaccin cu celulă integră sau o terapie combinată distruge preponderant celulele canceroase, dar nu ucide celulele sănătoase (adică, necanceroase).

În variantele concrete de realizare a prezentei invenţii viabilitatea celulară este măsurată în perioade de trei zile şi de şapte zile, folosind un test standard în domeniu, cum ar fi setul de reagenţi CelITiter-GIo (Promega), cu care se măsoară nivelurile de ATP intracelular. O reducere a ATP celular este un indicator al unui efect citotoxic. Într-o altă variantă de realizare viabilitatea celulară poate fi măsurată cu testul de absorbţie a roşului neutru. În alte exemple de realizare a invenţiei observarea vizuală a modificărilor morfologice poate include extinderea, granularea, celule cu margini neregulate, un aspect voalat, rotunjire, detaşare de la suprafaţa godeului sau alte modificări.

NDV, conform prezentei invenţii, sau compoziţiile acestora, vaccinurile oncolizate, vaccinurile cu celule întregi sau terapiile combinate pot fi testate pentru toxicitate in vivo pe modele de animale (de exemplu, modelele de animale descrise în continuare). De exemplu, modelele de animale, descrise aici şi/sau alte modele de animale cunoscute în domeniu, utilizate pentru a testa efectele compuşilor chimici asupra cancerului, de asemenea, pot fi utilizate pentru a determina toxicitatea in vivo a NDV, conform prezentei invenţii, sau a compoziţiilor acestora, a vaccinurilor oncolizate, a vaccinurilor cu celule integre sau a terapiilor combinate. De exemplu, la animale se administrează cantităţi diferite de pfu de NDV, conform prezentei invenţii (de exemplu, un NDV himeric descris în continuare). Ulterior animalele sunt monitorizate in timp pentru evidenţierea unor aşa indicatori, cum este moartea, pierderea în greutate sau incapacitatea de a creşte în greutate şi/sau se măsoară în serul sangvin nivelul de marker, care pot indica leziunea ţesuturilor (de exemplu, nivelul creatinfosfokinază ca un indicator de leziuni tisulare generale, nivelul de transaminaze ale acidului glutamic-oxalic sau de transaminază a acidului piruvic, ca indicatori ai deteriorării posibile a ficatului). Adiţional la evaluarea toxicităţii diferitor doze, aceste analize in vivo pot fi, de asemenea, adaptate pentru a testa toxicitatea diferitor metode şi/sau scheme de administrare.

Toxicitatea şi/sau eficienţa unui NDV, conform prezentei invenţii, sau a compoziţiei acestuia, unui vaccin oncolizat, conform prezentei invenţii, unui vaccin cu celule integre, conform prezentei invenţii, sau unei terapii combinate, conform prezentei invenţii, poate fi determinată prin proceduri farmaceutice standard în culturi celulare sau pe animale experimentale, de exemplu, prin determinarea LD50 (doza letală pentru 50% din populaţie) şi ED50 (doza terapeutic eficientă pentru 50% din populaţie). Raportul dozelor în efectele toxice şi terapeutice reprezintă un indice terapeutic şi acesta poate fi exprimat ca raportul LD50/ED50. Terapiile, care prezintă indici terapeutici mari, sunt preferate. Totodată, terapiile care prezintă efecte secundare toxice pot fi utilizate, dar trebuie respectate toate măsurile de precauţie, care constau în elaborarea unor aşa sisteme de livrare, care direcţionează astfel de terapii nemijlocit la ţesutul afectat, în scopul de a reduce la minimum potenţialul de deteriorare a celulelor necanceroase şi, prin urmare, de a reduce efectele secundare.

Datele, obţinute din analiza culturi celulare şi cercetările pe animale, pot fi utilizate în identificarea unui interval de dozare la administrarea terapiilor la subiecţi. Dozele de astfel de agenţi se află, de preferinţă, într-un interval de concentraţii circulante, care includ ED50 cu toxicitate redusă sau absentă. Doza poate varia în acest interval în funcţie de forma de dozare utilizată şi calea de administrare utilizată. Pentru orice terapie, conform prezentei invenţii, doza terapeutic eficientă poate fi estimată iniţial în baza analizei culturii celulare. O doză poate fi determinată pe modele de animale pentru a obţine un interval de concentraţii plasmatice, circulante în plasma sangvină, care include IC50 (adică, concentraţia de NDV himeric care realizează o jumătate din inhibarea maximă a simptomelor), determinată în cultura celulară. Astfel de informaţii pot fi utilizate pentru a determina mai precis dozele utile pentru administrare la subiecţi. Nivelurile de concentraţii din plasmă pot fi măsurate, de exemplu, prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă.

Cercetările anticancer

În unele realizări NDV, conform prezentei invenţii, sau compoziţiile acestora, vaccinurile oncolizate, conform prezentei invenţii, vaccinurile cu celule integre, conform prezentei invenţii, sau terapiile combinate, conform prezentei invenţii, sunt testate pentru prezenţa la ele a activităţii biologice, folosind modele de cancer la animale. Asemenea sisteme de modele de animale includ, nefiind exhaustive, şobolani, şoareci, păsări, vaci, maimuţe, porci, câini, iepuri, etc. Într-o variantă concretă de realizare a prezentei invenţii NDV sau terapia combinată se apreciază pe modele murine. Asemenea sisteme de modele se utilizează pe larg şi sunt bine cunoscute specialiştilor în domeniu, de exemplu, sistemul murin SCID sau şoareci transgenici.

Activitatea anti-cancer a NDV, conform prezentei invenţii, sau a unei compoziţii a acestuia, a vaccinului oncolizat, conform prezentei invenţii, a vaccinului cu celule integre, conform prezentei invenţii, sau a terapiilor combinate, conform prezentei invenţii, poate fi determinată prin administrarea a NDV, conform prezentei invenţii, sau a unei compoziţii a acestuia, a vaccinului oncolizat, conform prezentei invenţii, a vaccinului cu celule integre, conform prezentei invenţii, sau a terapiilor combinate, conform prezentei invenţii, pe un model de animal şi verificarea faptului, că NDV sau compoziţia acestuia, vaccinul oncolizat, vaccinul cu celule integre sau terapia combinată este eficientă în reducerea severităţii cancerului, reducerea simptomelor cancerului, reducerea metastazelor cancerului şi/sau reducerea dimensiunii unei tumori la modelul de animal menţionat (de exemplu, descrierea în continuare). Exemplele de modele animale pentru cancer includ în general, dar nefiind exhaustive, tumorile care apar spontan la animalele de companie (Vail & MacEwen. Cancer Invest, no 18 (8), 2000, p. 781-792). Exemplele de modele animale pentru cancerul pulmonar includ, dar nefiind exhaustive, modele de animale cu cancer pulmonar (Zhang & Roth. In-vivo, no 8(5), 1994, p. 755-769) şi modele de şoarece transgenic cu alterarea funcţiei genei p53 (Morris et al. J. La State Med Soc., no 150(4), 1998, p. 179-185). Un exemplu de model animal pentru cancerul mamar includ, dar nefiind exhaustiv, şoarecele transgenic cu supraexpresia ciclinei D1 (Hosokawa et al. Transgenic Res., no 10(5), 2001, p. 471-478). Un exemplu de model animal pentru cancerul de colon include, dar nefiind exhaustiv, un şoarece knock-out dublu al genei TCR b şi p53 (Kado et al. Cancer Res., no 61 (6), 2001, p. 2395-2398). Exemplele de modele animale pentru cancer pancreatic includ, dar nefiind exhaustive, un model metastatic de adenocarcinom pancreatic murin PancO2 (Wang et al. Int J. Pancreatol, no 29 (1), 2001, p. 37-46) şi soarecii-nuzi cu tumori pancreatice subcutanate (Ghaneh et al. Gene Ther., no 8 (3), 2001, p. 199-208). Exemplele de modele animale pentru limfom non-Hodgkin includ, dar nefiind exhaustive, şoarecii cu o imunodeficienţă combinată severă ("SCID") (Bryant et al. Lab. Invest., no 80 (4), 2000, p. 553-573) şi şoarecii transgenici IgHmu-HOX11 (Hough et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, no 95 (23), 1998, 13853-13858). Un exemplu de model animal pentru cancer esofagian include, dar nefiind exhaustiv, un şoarece transgenic pentru oncogena E7 a virusului papilomei umane de tip 16 (Herber et al. J. Virol., no 70 (3), 1996, p. 1873-1881). Exemplele de modele animale pentru carcinoamele colorectale includ, dar nefiind exhaustive, modele murine Apc (Fodde & Smits. Trends. Mol. Med., no 7 (8), 2001, p. 369-373). În variante concrete de realizare a prezentei invenţii modelele de animale pentru cancer descrise în continuare, sunt utilizate pentru a evalua eficacitatea unui NDV sau a compoziţiei acestuia, a unui vaccine oncolizat, a unui vaccin cu celule integre sau a unei terapii combinate.

Exemplul 1

Acest exemplu demonstrează eficacitatea terapeutică a terapiei cu NDV în combinaţie cu modulatori ai imunităţii punctelor de control, care sunt imunostimulatori în tratamentul cancerului.

Materiale şi metode

Şoareci

Şoarecii din linia BALB/c (în vârstă de 6…8 săptămâni) şi şoarecii din linia WT C57BL/6 au fost achiziţionaţi de la Jackson Laboratory. Toţi şoarecii au fost menţinuţi în cuşti Micro-Isolator® şi trataţi în conformitate cu cerinţele normative ale Institutului Naţional de Ocrotire a Sănătăţii al SUA şi Asociaţiei Americane de îngrijire a animalelor de laborator. Toate procedurile şi experimentele cu şoareci, realizate în acest studiu, au fost aprobate de către Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care şi Use Committee.

Liniile celulare

Liniile celulare murine de melanom (B16-F10) şi carcinom de colon (CT26 şi MC38) au fost menţinute în mediu RPMI suplimentat cu 10% ser fetal de viţel şi penicilină cu streptomicină. Linia celulară murine de cancer de prostată TRAMP-C2 a fost menţinută în mediu DMEM suplimentat cu 5% ser fetal de viţel (FCS; Mediatech, Inc.), 5% Nu Serum IV (BD Biosciences) HEPES, 2-ME, penicilină/streptomicină, L-glutamină, 5 µg/ml insulină (Sigma) şi 10 mmol/l DHT (Sigma).

Anticorpi

Anticorpii monoclonali terapeutici anti-CTLA-4 (clona 9H10), anti-PD-1 (clona RMP1-14) şi anti-PD-L1 au fost produşi de BioXcell. Anticorpii, utilizaţi pentru citometrie în flux, au fost achiziţionaţi de la eBioscience, Biolegend, Invitrogen şi BD Pharmingen.

Virusurile şi clonarea

Tulpina lentogenică recombinantă NDV LaSota a fost utilizată în toate experimentele. Pentru a genera virusul NDV, care exprimă ICOSL murin, un fragment de AND, care codifică ICOSL murin, flancat cu semnalele transcripţionale NDV-specifice ale ARN, a fost inserat în locusul de recunoaştere a restrictazei SacII, creat între genele P şi M ale constructului pT7NDV/LS. Virusurile erau salvate din ADNc, folosind metodele descrise anterior şi ordonate cu PCR cu transcripţie inversă pentru identificarea corectitudinii inserţiei. Titrurile de virus au fost determinate prin diluţii în serie şi imunofluorescenţă în celulele Vero. Constructul de fuziune recombinant ICOSL-F a fost generat prin amplificare PCR a ADN ICOSL, care codifică domeniul extracelular (aminoacizii 1-277) cu locii de flancare a restricţiei EcoRI şi Mlul, şi ADN F NDV, care codifică domeniile transmembranar şi intracelular ale proteinei F (aminoacizii 501 -554) cu loci de restricţie care flanchează Mlul şi Xhol. Fragmentele de ADN rezultate au fost inserate împreună în vectorul pCAGGS utilizând ligarea a trei părţi.

Experimente de infectare in vitro

Pentru evaluarea activării expresiei MHC-I, MHC-II şi ICAM-1 pe suprafaţa celulelor NDV, cât şi pentru evaluarea expresiei de suprafaţă a transgenei ICOSL din virusul NDV-ICOSL, celulele B16-F10 au fost infectate în trei repetări pe plăci cu 6 godeuri la MOI egal cu 2. Peste douăzeci şi patru de ore, celulele au fost recoltate prin răzuire mecanică şi prelucrate pentru marcarea suprafeţei şi cuantificarea prin citometrie în flux. Pentru experimentele cu determinarea curbei de dezvoltare a virusului, celulele B16-F10 au fost incubate la temperatura camerei cu virusul pe plăci de cultură cu 6 godeuri la MOI indicat într-un volum total de 100 µl. Peste o oră după incubare mediul de infectare a fost aspirat şi celulele au fost incubate la 37°C în 1 ml de mediu DMEM cu 10% lichid alantoidian aviar. După 24, 48 şi 72 de ore supernatantele au fost colectate şi titrurile de virus au fost determinate, cum este descris mai sus. Pentru experimentele de citotoxicitate in vitro, infectarea s-a efectuat într-o manieră similară. Peste 24, 48, 72 şi 96 de ore după infectare celulele au fost spălate şi incubate cu 1% Triton X-100 la 37°C pentru 30 de min. Activitatea LDH în lizate s-a determinat folosind setul de reagenţi CytoTox 96 (Promega), în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

Experimentele de supravieţuire la infectarea cu tumoare

Modelele cu tumori bilaterale pe flancuri au fost obţinute pentru a monitoriza eficacitatea terapeutică în ambele tumori, atât cea injectată, cât şi sistemică. Au fost stabilite scheme de tratament şi dozele de celule pentru fiecare model de tumoare astfel, pentru a atinge 10…20% de curăţare a tumorii prin NDV sau anticorpul anti-CTLA-4/anti-PD-1 în calitate de agenţi solitari. Pentru experimentele de evaluare a eficienţei terapiei combinate NDV de tip sălbatic (NDV-WT) cu blocatori ai punctelor de control imune, tumorile B16F10s-au implantat prin injectarea a 2x105 celule B16F10 în flancul drept în ziua 0 şi 5x104 celule în flancul stâng în ziua a 4. În zilele a 7, 10, 13 şi a 16 şoarecilor se administrau 4 injecţii intratumorale cu 2 x 107 pfu de NDV în PBS într-un volum total de 100 µl. Totodată, în zilele a 7, 10, 13 şi a 16 şoarecilor li s-au efectuat 4 injecţii intraperitoneale de anticorpi anti-CTLA-4 (100 µg) sau de anticorpi anti-PD-1 (250 µg). Grupurile de control au primit o doză corespunzătoare de anticorp izotip şi o injecţie intratumorală de PBS. Mărimea tumorii şi răspândirea ei au fost monitorizate prin măsurare cu un şubler.

Pentru modelul TRAMP-C2, 5x 05 de celule au fost implantate în flancul drept în ziua 0 şi 5x105 celule au fost implantate în flancul stâng în ziua a 8. Tratamentul cu injecţii a fost efectuat în zilele a 11, 14, 17 şi a 20 analogic metodei descrise mai sus.

Pentru experimentele de evaluare a eficienţei NDV recombinant, care exprimă ICOSL (NDV-ICOSL), tumorile B16F10 s-au implantat prin injectarea 2x105 celule B16F10 în flancul drept intracutanat în ziua 0 şi 1x105 celule în flancul stâng în ziua a 4. Tratamentul a fost efectuat cum este descris mai sus.

Pentru modelul CT26, tumorile s-au implantat prin injectarea 1x106 celule CT26 în flancul drept intracutanat în ziua 0 şi 1x106 celulele în flancul stâng în ziua a 2. Tratamentul a fost efectuat cum este descris mai sus în zilele a 6, 9 şi a 12.

Izolarea limfocitelor care infiltrează tumoarea

Tumorile B16F10 au fost implantate prin injectare intracutanat a 2x105 celule B16F10 în flancul drept în ziua 0 şi 2x105 celule în flancul stâng în ziua a 4. În zilele a 7, 10 şi a 13 şoarecilor s-au introdus cu 3 injecţii intratumorale 2x107 pfu de NDV şi intraperitoneal 100 µg de anticorpi anti-CTLA-4 sau 250 µg de anticorpi anti-PD-1, în cazul în care se specifică. În ziua a 15 şoarecii au fost sacrificaţi prin inhalare de CO2. Tumorile şi tumorile de drenare ale ganglionilor limfatici au fost îndepărtate cu ajutorul forcepsului şi foarfecelor chirurgicale şi cântărite. Tumorile din fiecare grup au fost mărunţite cu foarfeca înainte de incubare cu 1,67 unităţi de Wünsch/ml de Liberase şi 0,2 mg/ml de ADNază timp de 30 min la 37°C Tumorile au fost omogenizate prin pipetare repetată şi filtrate printr-un filtru de nailon cu dimensiunea porilor de 70 µm. Suspensiile de celule au fost spălate o dată cu mediu RPMI complet şi purificate într-un gradient Ficoll pentru a elimina celulele moarte. Celulele din ganglionii limfatici de drenaj ai tumorii au fost izolate prin măcinarea ganglionii limfatici printr-un filtru de nailon cu dimensiunea porilor de 70 µm.

Citometria în flux

Celulele, izolate din tumori sau din ganglionii limfatici care drenează tumorile, au fost prelucrate pentru marcarea suprafeţei cu mai multe seturi pentru colorare din câţiva anticorpi pentru CD45, CD3, CD4, CD8, CD44, PD-1, ICOS, CD11c, CD19, NK1.1, CD11b, F4/80, Ly6C şi Ly6G. Colorantul de fixare pentru celulele viabile eFluor780 (eBioscience) a fost folosit pentru a distinge celulele vii. Apoi celulele au fost permeabilizate folosind FoxP3 de fixare şi kitul de permeabilizare (eBioscience) şi colorate pentru detectarea Ki-67, FoxP3, Granzimei B, CTLA-4 şi IFN gamma. Datele au fost obţinute folosind citometrul de flux LSRII (BD Biosciences) şi analizate cu software Flow Jo (Treestar).

Purificarea şi încărcarea DC

Splinele de la şoareci netrataţi anterior au fost izolate şi tratate cu 1,67 unităţi Wünsch/ml de liberază şi 0,2 mg/ml de ADNază timp de 30 min la 37°C. Suspensiile de celule rezultate au fost filtrate printr-un filtru de nailon cu dimensiunea porilor de 70 µm şi spălate o dată cu mediu RPMI complet. Celulele dendritice CD11c+ au fost purificate prin selecţie pozitivă utilizând particule magnetice Miltenyi. Celulele dendritice izolate au fost cultivate peste noapte cu GM-CSF recombinant şi lizate tumorale B16-F10 şi au fost purificate în gradient de ficol.

Analiza sintezei citokinelor

Suspensiile de celule din tumori şi din ganglionii limfatici, care drenează tumorile, au fost comasate şi îmbogăţite pentru creşterea conţinutului de celulele T, utilizând un kit de purificare a celulelor T Miltenyi. Celulele T izolate au fost numărate şi cocultivate timp de 8 ore cu celule dendritice, încărcate cu lizate celulare tumorale B16-F10 în prezenţa a 20 U/ml de IL-2 (R&D), plus Brefeldin A (BD Bioscience). După restimulare, limfocitele au fost prelucrate pentru citometrie în flux, cum s-a descris mai sus.

Statistică

Datele au fost analizate prin criteriul bilateral Student şi P<0,05 a fost considerat a fi statistic semnificativ.

Rezultate

Pentru a caracteriza răspunsul imun anti-tumoral, indus de virusul bolii de Newcastle (NDV), s-a evaluat expresia moleculelor MHC I şi MHC II, precum şi ICAM-1 pe suprafaţa celulelor infectate in vitro. Aşa cum se arată în fig. 1, infecţia cu NDV a celulelor de melanom B16 activează expresia moleculelor MHC de clasa I şi moleculelor MHC de clasa II, precum şi a moleculelor de adeziune ICAM-1, acestea fiind considerate a fi importante pentru recrutarea limfocitelor specifice tumorii şi activarea răspunsului imun antitumoral. Apoi răspunsul imun antitumoral, indus de infecţia cu NDV in vivo, a fost evaluat într-un model murin de melanom şi crearea un model bilateral de flanc, care a permis monitorizarea răspunsurilor atât în tumorile injectate cu virus, cât şi în tumorile la distanţă, în care nu s-a injectat virusul. Aşa cum se arată în fig. 2, în tumorile infectate cu virus se constată o infiltrare semnificativă cu celule imune, cum ar fi celulele NK, macrofage şi celule CD8 şi CD4, dar nu cu celulele T reglatoare. Deoarece o parte a acestui răspuns imun poate fi un răspuns la virus, decât la tumoare, s-a evaluat răspunsul imun în raport cu tumoarea colaterală (fig. 3). Urmează de remarcat, că aceste tumori au demonstrat un grad similar de creştere a infiltraţiei cu celule CD8 şi CD4 efectoare, dar nu cu celule T reglatoare. Analiza acestor celule a arătat, că ele stimulează activarea, proliferarea şi expresia markerilor de liză (fig. 4). Monoterapia cu NDV a fost eficace în controlul tumorile tratate (fig. 5A), dar numai nesemnificativ încetinea creşterea tumorilor contralaterale (fig. 5B). Şoarecii, care s-au vindecat de tumori, însă, au demonstrat un anumit grad de protecţie împotriva altei provocări cu tumoare (fig. 5D), ceea ce atestă că terapia cu NDV poate induce o imunitate de lungă durată.

În continuare a fost evaluată posibilitatea direcţionării mecanismelor suplimentare pentru a amplifica efectul antitumoral, generat de NDV. Caracterizarea limfocitelor, care infiltrează tumoarea, atât din cele injectate cu NDV, cât şi din tumorile neinjectate, a relevant activarea receptorului inhibitor CTLA-4 asupra limfocitelor (fig. 6). Apoi s-a evaluat dacă inhibarea receptorului CTLA-4 poate avea ca rezultat o eficacitate terapeutică mai bună a NDV. În mod surprinzător, terapia combinată a condus la respingerea tumorilor bilaterale la majoritatea animalelor, un efect care nu a fost observat la administrarea fiecărui dintre aceste tratamente în monoterapie (fig. 7). Acest efect a fost prezent chiar şi atunci când a fost utilizat modelul de adenocarcinom de prostată TRAMP, care nu este susceptibilă la infecţia virală (fig. 8). Aceste rezultate atestă, că replicarea virală minimă şi răspunsul inflamator rezultat s-au dovedit a fi suficiente pentru generarea unei imunităţi antitumorale de protecţie.

Pentru a determina dacă acţiunea asupra alte puncte de control imune în asociere cu terapia cu NDV ar putea fi benefică, a fost evaluat efectul asupra căii PD-1 - PD-L1, după infecţia cu NDV. Aşa cum este prezentat în fig. 9, celulele tumorale infectate cu NDV, atât in vitro, cât şi in vivo, au avut activarea expresia ligandului inhibitor PD-L1 la suprafaţa celulelor. Acest efect nu a fost doar un rezultat al unei injecţii directe de virus, deoarece a fost observat, de asemenea, când celulele neinfectate au fost tratate cu supernatante inactivare cu UV din celulele infectate cu virus (fig. 9b), precum şi tumorile contralaterale neinfectate (fig. 9c). Aceasta a determinat realizarea unui studiu al terapiei combinate cu ndv şi anticorpi anti-PD-1. Similar cu blocatorul CTLA-4, terapia cu NDV în combinaţie cu anticorpi anti-PD-1 într-un model de melanom B16 agresiv a condus la vindecarea majorităţii animalelor, un efect care a fost asociat cu creşterea infiltraţiei tumorii cu limfocite efectoare activate (fig. 10).

De-a lungul studiilor efectuate, eficacitatea terapeutică a unei terapii combinate se reducea atunci, când provocarea cu tumori se făcea într-un număr mai mare. Apoi s-a realizat evaluarea markerilor de activare, care ar putea asigura un răspuns mai bun şi ar putea fi deveni o ţintă pentru îmbunătăţirea în continuare a eficacităţii terapeutice. Analiza limfocitelor, izolate din tumori şi din ganglionii limfatici care drenează tumorile, a identificat expresia moleculei costimulatoare ICOS, ca unul dintre marcherii de activare la animalele tratate (fig. 11). Anterior s-a arătat, că activarea expresiei ICOS se asociază cu răspunsuri terapeutice mai îndelungate şi creşterea supravieţuirii la pacienţii trataţi cu terapie cu anticorpi anti-CTLA-4 pentru melanom malign. S-a evaluat dacă expresia intratumorală a ligandului ICOS (ICOSL) ar putea amplifica suplimentar răspunsul terapeutic într-o terapie combinată. Utilizarea abordării “geneticii inverse” pentru NDV, au fost generate NDV care exprimă ICOSL murin (NDV-ICOSL). Caracterizarea in vitro a acestui virus a arătat, că acesta posedă proprietăţi replicative şi litice similare cu proprietăţile tulpinii parentale NDV (fig. 12). La testarea in vivo, însă, cu o provocare cu tumoarea B16 într-un număr mai mare, NDV-ICOSL demonstrat un avantaj semnificativ faţă de virusul parental NDV atunci, când este utilizat în asociere cu blocatorul CTLA-4, cu supravieţuirea pe termen lung la majoritatea animalelor tratate (fig. 13). Acest efect nu s-a limitat la melanomului B16 şi a fost demonstrat pentru carcinomul de colon CT26 la şoarecii din linia Balb/C, sugerând că această strategie terapeutică ar putea fi traductibilă la diferite tipuri de tumori (fig. 14). Analiza tumorilor B16 de la animalele tratate a demonstrat infiltrarea lor semnificativă cu diferite subtipuri de celule imune, care exprimă marcherii de activare (fig. 15 şi 16). Aceste limfocite au fost specifice tumorale şi a demonstrat secreţia IFN gamma ca răspuns la stimularea cu celule dendritice, încărcate cu lizate tumorale (fig. 17). În cele din urmă, animalele care au fost vindecate de tumorile lor B16 sau CT26 au fost reprovocate cu celule tumorale şi a fost demonstrată protecţia completă împotriva reprovocării tumorii (fig. 18).

Pentru ameliorarea ulterioară a expresiei ICOSL în tumoare şi incorporarea ligandului în virion, a fost proiectată o proteină himerică care constă din domeniul extracelular al ICOSL (aminoacizii 1…277) şi domeniile transmembranare şi intracelulare ale proteinei F a NDV (aminoacizii 501…554) (fig. 19A). Transfecţia constructului rezultat în celulele B16-F10 a condus la exprimare crescută a ligandului himeric ICOSL-F pe suprafaţa celulelor transfectate, în comparaţie cu celulele transfectate cu ICOSL nativ, sugerând că mecanismele de reglementare, care administrează transportul de proteină F a NDV pe suprafaţă, pot fi utilizate pentru a creşte expresia de suprafaţă a liganzilor imunostimulatori (fig. 19B).

În general, aceste studii demonstrează, că 1) combinaţia NDV cu anticorpi, care reglează cu punctele de control imune, poate fi folosită ca o strategie pentru a evita limitările atât ale terapiei cu virusul oncolitic, cât şi terapiei cu anticorpi şi 2) expresia liganzilor imunostimulatori ai NDV poate îmbunătăţi suplimentar eficacitatea terapeutică a acestui virus, în special la utilizare în combinaţie cu anticorpi imunoregulatori. Aceste concluzii au aplicare clinică.

Exemplul 2

Acest exemplu demonstrează răspunsurile imune antitumorale, induse de NDV oncolitic, şi răspunsurile imune antitumorale, induse de NDV în combinaţie cu blocatori ai CTLA-4.

Materiale şi metode

Şoareci

Şoarecii din linia Balb/C şi şoarecii din linia C57BL/6J au fost achiziţionaţi de la Jackson Laboratory. Şoarecii IFNAR-/- în baza liniei C57BL/6J au fost oferiţi de Dr. Eric Pamer. Şoarecii transgenici Pmel-1 şi Trp-1 TCR au fost descrişi (Overwijk et al. J. Exp. Med., no 198, 2003, p. 568; Muransky et al. Blood, no 112, 2008, p. 362) şi au fost furnizaţi de N. Restifo (National Cancer Institute, Bethesda, MD). Şoarecii TRP1 au fost încrucişaţi cu şoarecii CD2:luciferază, oferiţi de Patrick Hwu de la MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) pentru a obţine şoareci TRP1 Luciferasa+ (TRP1-Fluc). Toţi şoarecii au fost menţinuţi în cuşti Micro-Isolator® şi trataţi în conformitate cu cerinţele normative ale Institutului Naţional de Ocrotire a Sănătăţii al SUA şi Asociaţiei Americane de îngrijire a animalelor de laborator. Toate procedurile şi experimentele cu şoareci, realizate în acest studiu, au fost aprobate de către Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care şi Use Committee.

Liniile celulare

Liniile celulare murine de melanom (B16-F10) şi carcinom de colon (CT26 şi MC38) au fost menţinute în mediu RPMI suplimentat cu 10% ser fetal de viţel şi penicilină cu streptomicină. Linia celulară murină de cancer de prostată TRAMP-C2 a fost menţinută în mediu DMEM suplimentat cu 5% ser fetal de viţel (FCS; Mediatech, Inc.), 5% Nu Serum IV (BD Biosciences) HEPES, 2-ME, penicilină/streptomicină, L-glutamină, 5 µg/ml insulină (Sigma) şi 10 mmol/l DHT (Sigma).

Anticorpi

Anticorpii monoclonali terapeutici anti-CTLA-4 (clona 9H10), anti-PD-1 (clona RMP1-14) şi anti-PD-L1 (clona 9G2), anti-CD8 (clona 2,43), anti-CD4 (clona GK1.5), anti-IFN-gamma (clona XMG1.2) şi anti-NK1.1 (clona PK136) au fost produşi de BioXcell. Anticorpii, utilizaţi pentru citometrie în flux, au fost achiziţionaţi de la eBioscience, Biolegend, Invitrogen şi BD Pharmingen.

Virusurile şi clonarea

Tulpina lentogenică recombinantă NDV LaSota a fost utilizată în toate experimentele. Pentru a genera virusul NDV, care exprimă ICOSL murin, un fragment de AND, care codifică ICOSL murin, flancat cu semnalele transcripţionale NDV-specifice ale ARN, a fost inserat în locusul de recunoaştere a restrictazei SacII, creat între genele P şi M ale constructului pT7NDV/LS. Virusurile erau salvate din ADNc, folosind metodele descrise anterior şi ordonate cu PCR cu transcripţie inversă pentru identificarea corectitudinii inserţiei. Titrurile de virus au fost determinate prin diluţii în serie şi imunofluorescenţă în celulele Vero. Constructul de fuziune recombinant ICOSL-F a fost generat prin amplificare PCR a ADN ICOSL, care codifică domeniul extracelular (aminoacizii 1…277) cu locii de flancare a restricţiei EcoRI şi Mlul, şi ADN F NDV, care codifică domeniile transmembranar şi intracelular ale proteinei F (aminoacizii 501…554) cu loci de restricţie care flanchează Mlul şi Xhol. Fragmentele de ADN rezultate au fost inserate împreună în vectorul pCAGGS utilizând ligaturarea a trei părţi. Constructul fuzionat recombinant CD28scfv-F antimurin a fost generat prin amplificare PCR a cADN, care codifică anti-CD28scfv de hamster cu locii de flancare de restricţie EcoRI şi Mlul, şi ADN F NDV, care codifică domeniile transmembranare şi intracelulare ale proteinei F (aminoacizii 501…554) cu locii de restricţie de flancare Mlul şi Xhol. Fragmentele de ADN rezultate au fost inserate în vectorul pCAGGS utilizând ligaturarea a 3 părţi şi apoi subclonarea în vectorul pNDV între genele P şi M. Pentru a genera virusuri recombinante, care exprimă alte proteine himerice (HN-GITRL, HN-4-1BBL, HN-CD40L, HN-OX40L), ADNc, care codifică domeniul extracelular al fiecărei gene (fig. 44), a fost amplificat cu primeri specifici de genă cu loci de restricţie de flancare EcoRI şi Mlul, şi domeniul transmembranar şi intracelular al proteinei HN a fost amplificat cu primeri specifici cu loci de restricţie de flancare Mlul şi Xhol. Genele himerice complete împreună au fost inserate în vectorul pCAGGS utilizând ligaturarea a 3 părţi şi apoi subclonarte în vectorul pNDV între genele P şi M. Informaţia detaliată despre fiecare construct himeric este prezentată în fig. 44. Pentru a genera un NDV recombinant, care codifică IL-2, IL-15 şi IL-21, ADNc pentru fiecare genă a fost amplificat cu primeri specifici de genă cu loci de restricţie de flancare Sacii şi apoi clonat în vectorul pNDV între genele P şi M. Viruşii au fost salvaţi din ADNc, folosind metodele descrise anterior, şi ordonate cu PCR de transcripţie inversă pentru determinarea corectitudinii inserţiei. Titrurile de virusuri au fost determinate prin diluţie în serie şi imunofluorescenţă în celule Vero.

Experimentele cu infectare in vitro

Pentru marcarea suprafeţei celulele au fost infectate în trei repetări pe plăci cu 6 godeuri la MOI egal cu 2 (B16-F10) sau MOI egal cu 5 (TRAMP C2). Peste douăzeci şi patru de ore celulele au fost colectate prin răzuire mecanică şi prelucrate pentru marcarea suprafeţei şi cuantificarea prin citometrie în flux. Pentru experimentele de citotoxicitate in vitro celulele au fost infectate la MOI indicat şi incubate la 37°C într-un mediu fără ser în prezenţa a 250 ng/ml de TPCK tripsină. Peste 24, 48, 72 şi 96 de ore după infectare celulele au fost spălate şi incubate cu 1% Triton X-100 la 37°C pentru 30 de min. Activitatea LDH în lizate s-a determinat folosind kitul de analiză Cytotox 96 (Promega), în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

Experimentele de supravieţuire la infectarea cu tumoare

Modelele cu tumori bilaterale pe flancuri au fost obţinute pentru a monitoriza eficacitatea terapeutică în ambele tumori, atât cea injectată, cât şi sistemică. Au fost stabilite scheme de tratament şi dozele de celule pentru fiecare model de tumoare astfel, pentru a atinge 10-20% de curăţare a tumorii prin NDV sau anticorpul anti-CTLA-4/anti-PD-1 în calitate de agenţi solitari. Pentru experimentele de evaluare a eficienţei terapiei combinate NDV anticorp anti-CTLA-4, tumorile B16F10 s-au implantat prin injectarea intracutanată a 2x105 celule B16F10 în flancul drept în ziua 0 şi 5x104 celule în flancul stâng în ziua a 4. În zilele a 7, 9, 11 şi a 13 şoarecilor se administrau injecţii intratumorale cu 2x107 pfu de NDV în PBS într-un volum total de 100 µl. Totodată, în zilele a 7, 9, 11 şi a 13 şoarecilor s-au efectuat 4 injecţii intraperitoneale de anticorpi anti-CTLA-4 (100 µg), de anticorpi anti-PD-1 (250 µg) sau de anticorp anti-PD-L1 (250 µg). Grupurile de control au primit intraperitoneal o doză corespunzătoare de anticorp izotip şi o injecţie intratumorală de PBS. Animalele erau sacrificate după semnele de inaniţie sau când mărimea tumorii atingea 1000 mm3. Pentru eliminarea celulelor imune şoarecilor li s-a administrat intraperitoneal 500 µg de anticorpi monoclonali anti-CD8+, CD4+, NK.1.1 sau IFNΓ cu o zi până la şi peste două zile după provocare cu tumoare cu injectarea ulterioară a 250 µg la fiecare 5 zile pe parcursul experimentului.

Pentru modelul TRAMP-C2, 1x106 de celule au fost implantate în flancul drept în ziua 0 şi 5x105 celule au fost implantate în flancul stâng în ziua a 4. Tratamentul cu injecţii a fost efectuat în zilele a 7, 10, 13 şi a 16 analogic metodei descrise mai sus.

Pentru modelul CT26, tumorile s-au implantat prin injectarea 1x106 celule CT26 în flancul drept intracutanat în ziua 0 şi 1x106 celulele în flancul stâng în ziua a 2. Tratamentul a fost efectuat cum este descris mai sus în zilele a 6, 9 şi a 12.

Pentru experimentele de evaluare a eficienţei NDV recombinant, care exprimă ICOSL, 4-1BBL, OX40L, CD40L, GITRL, anti-CD28scfv, IL-2, IL-15 и IL-21 (NDV-trangenic), tumorile B16F10 s-au implantat prin injectarea 2x 05 celule B16F10 în flancul drept intracutanat în ziua 0 şi 1x105 celule în flancul stâng în ziua a 4. Concomitent, în zilele a 7, 9, 11 şi a 13 şoarecilor li s-a administrat intraperitoneal anticorpi anti-CTLA-4 (100 µg), anticorpi anti-PD-1 (250 µg) sau anticorpi anti-PD-L1 (250 µg).

Izolarea limfocitelor Trp1 şi Pmel şi transferul adoptiv

Splinele şi ganglioni limfatici de la şoarecii transgenici au fost izolate şi fărâmiţate prin filtre de nailon cu dimensiunea porilor de 70 µm. Celulele CD4+ şi CD8+ au fost purificate prin selecţie pozitivă utilizând particule magnetice Miltenyi.

Celulele Trp1 sau Pmel izolate au fost injectate la animale recipient prin vena caudal, conform schemei menţionate în cantitate de 2,5x104 celule per şoarece şi 1x106 celule per şoarece, respectiv.

Experimente cu transfer de ser

Grupurile de şoareci purtători de tumori au fost tratate intratumoral cu o injecţie unică de NDV în PBS. În ziua a patra sângele a fost colectat prin sângerare terminală şi serul a fost izolat prin centrifugare. Serurile au fost colectate de la fiecare grup şi tratate cu UV în dispozitivul Stratalinker 1800 cu şase impulsuri de raze UV cu o energie de 300 mJ/cm2 pentru a inactiva orice virus, care ar putea fi prezent. 100 µl de ser nediluat a fost injectat intratumoral şoarecilor purtători de tumori B16-F10, anterior netrataţi, un total de 3 injecţii odată la două zile. Tumorile au fost îndepărtate peste 3 zile după ultima injecţie şi prelucrate pentru izolarea limfocitelor, care infiltrează tumoarea, cum este descris în continuare.

Vizualizarea bioluminescentă

Vizualizarea şoarecilor s-a efectuat la fiecare 2…3 zile începând cu ziua 6. Şoarecilor s-a injectat retroorbital 50 µl de soluţie de D-luciferină (Caliper Life Sciences) în PBS cu concentraţie de 40 mg/ml şi imediat se realiza vizualizarea cu sistemul de vizualizare IVIS (Caliper Life Sciences). Imaginile fotografice alb-negre şi imaginile color bioluminescente au fost suprapuse, folosind programul de suprapunere The Living Image, versiunea 4.0 (Caliper Life Sciences). Regiune de interes (ROI) a fost selectată manual deasupra tumorii, menţinând zona ROI constantă.

Izolarea limfocitelor, care infiltrează tumorile

Tumorile B16-F10 au fost implantate prin injectarea intracutanat a 2x105 celule B16-F10 în flancul drept în ziua 0 şi 2x105 celule în flancul stâng în ziua 4. În zilele a 7, 9 şi a 11 şoarecii au fost trataţi cu injecţii intratumorale de 2x107 pfu de NDV şi intraperitoneal anticorpi anti-CTLA-4 sau anti-PD-1, unde se specifică. Un număr mic de animale, care au murit din cauza încărcăturii tumorale (întotdeauna grupurile martor netratate) sau de animale care complet s-au vindecat de tumori (întotdeauna în grupurile de tratament) nu a fost utilizat pentru analiză. În ziua a 15 şoarecii au fost sacrificaţi şi tumorile şi ganglionii limfatici care drenează tumorile au fost îndepărtaţi utilizând un forceps şi foarfece chirurgicale şi apoi cântărite. Tumorile din fiecare grupă au fost mărunţite cu foarfeca înaintea incubării cu 1,67 U Wünsch/ml Liberază şi 0,2 mg/ml ADNază pentru 30 de min la 37°C. Tumorile s-au omogenizat prin pipetare repetată şi s-au filtrat printr-un filtru de nailon cu dimensiunea porilor de 70 µm. Suspensiile de celule au fost spălate o dată cu mediu RPMI complet şi purificate cu un gradient Ficoll pentru eliminarea celulelor moarte. Celulele din ganglionii limfatici de drenaj ai tumorii au fost izolate prin mărunţirea ganglionii limfatici printr-un filtru de nailon cu dimensiunea porilor de 70 µm.

Citometria în flux

Celulele, izolate din tumori sau din ganglionii limfatici care drenează tumorile, au fost prelucrate pentru marcarea suprafeţei cu mai multe seturi pentru colorare din câţiva anticorpi pentru CD45, CD3, CD4, CD8, CD44, PD-1, ICOS, CD11C, CD19, NK1.1, CD11B, F4/80, Ly6C şi Ly6G. Colorantul de fixare pentru celulele viabile eFluor780 (eBioscience) a fost folosit pentru a distinge celulele vii. Apoi celulele au fost permeabilizate folosind Foxp3 de fixare şi kitul de permeabilizare (eBioscience) şi colorate pentru detectarea Ki-67, Foxp3, Granzimei b, CTLA-4 şi IFN gamma. Datele au fost obţinute folosind citometrul de flux LSRII (BD Biosciences) şi analizate cu software Flow Jo (Treestar).

Purificarea şi încărcarea DC

Splinele de la şoareci netrataţi anterior au fost izolate şi tratate cu 1,67 unităţi Wünsch/ml de liberază şi 0,2 mg/ml de ADNază timp de 30 min la 37°C. Suspensiile de celule rezultate au fost filtrate printr-un filtru de nailon cu dimensiunea porilor de 70 µm şi spălate o dată cu mediu RPMI complet. Celulele dendritice CD11c+ au fost purificate prin selecţie pozitivă utilizând particule magnetice Miltenyi. Celulele dendritice izolate au fost cultivate peste noapte cu GM-CSF recombinant şi lizate tumorale B16-F10 şi au fost purificate în gradient de ficol.

Analiza sintezei citokinelor

Suspensiile de celule din tumori şi din ganglionii limfatici, care drenează tumorile, au fost comasate şi îmbogăţite pentru creşterea conţinutului de celulele T, utilizând un kit de purificare a celulelor T Miltenyi. Celulele T izolate au fost numărate şi cocultivate timp de 8 ore cu celule dendritice, încărcate cu lizate celulare tumorale B16-F10 în prezenţa a 20 u/ml de IL-2 (R&D), plus brefeldin A (BD Bioscience). După restimulare, limfocitele au fost prelucrate pentru citometrie în flux, cum s-a descris mai sus.

Imunofluorescenţa şi microscopia

Tumorile au fost disecate de la şoareci, spălate cu PBS, fixate în 4% paraformaldehidă şi tratate pentru parafinare, în conformitate cu protocoalele descrise anterior. Secţiunile au fost tăiate utilizând un microtom, aranjat pe plăcuţe, şi prelucrate pentru colorare cu hematoxilină şi eozină (H & E) sau cu anticorpi anti-CD3 şi anti-FoxP3. Secţiunile au fost analizate cu microscop pe Zeiss Axio 2 cu câmp larg, folosind obiective 10x şi 20x.

Statistică

Datele au fost analizate prin criteriul bilateral Student (pentru compararea a 2 grupuri) şi ANOVA, după caz. Datele pentru supravieţuire au fost analizate prin criteriul de rang logaritmic (Mantel-Cox). P faţă-verso <0,05 a fost considerat statistic semnificativ (P ≤ 0,05 (*), P ≤ 0,01 (**), P ≤ 0,001 (***), P ≤ 0,0001 (****)).

Rezultate

Replicarea NDV limitată de tumoarea injectată

A fost caracterizată cinetica de distribuţie virală la administrarea intratumorală şi sistemică a NDV. Injecţie intratumorală de NDV recombinant, care exprimă construcţia reporter cu luciferază (NDV-Fluc), a condus la un semnal mai stabil de luciferază în tumoarea de flanc injectată, în timp ce administrarea sistemică a virusului nu a condus la nici un semnal de luciferază detectabil în tumoare (fig. 20A). Deoarece sistemul limitat de livrare sistemică de virus a fost puţin probabil abil să inducă o liză tumorală şi un răspuns imun suficient, injecţia intratumorală de NDV a fost studiată ca un mijloc de a declanşa un răspuns imun anti-tumoral, care ar putea depăşi limitările potenţialului terapiei sistemice intravenoase. Astfel, pentru continuarea studiilor modelul cu boală metastatică a fost modelat cu utilizarea modelului de tumoare bilaterală pe flanc B16-F10. (fig. 22A). Administrarea NDV-Fluc in tumoarea laterală dreaptă conducea la replicarea virusului în limitele tumorii injectate cu semnalul luciferazei, detectabil timp de până la 96 de ore (fig. 20B-D). Nici un virus nu a fost detectat în tumoarea contralaterală (laterală stângă) la analiza cu vizualizare luminiscentă (fig. 20B-D), prin trecere în ouă embrionate sau prin RT-PCR. Astfel, acest sistem a permis de a caracteriza răspunsurile imune atât în tumoarea injectată cu virus, cât în tumorile la distanţă, care nu au fost direct afectate de acţiunea NDV.

Terapia cu NDV creşte infiltrarea locală şi la distanţă a tumorilor cu limfocite şi reţine creşterea tumorii

Analiza tumorile injectate cu virus a relevat un răspuns inflamator, fapt confirmat prin infiltrarea crescută cu celule, care exprimă antigen comun leucocitar CD45 (fig. 21A-B). Infiltratele imune au fost caracterizate printr-un conţinut sporit de celule din compartimentul imune înnăscute, inclusiv celulele mieloide, celule NK şi celule NKT (fig. 21c) şi de celule imune adaptive, inclusiv CD8+ şi celule convenţionale CD4+FoxP3- T celule (Tconv), ceea ce conducea la o creştere semnificativă a raporturilor între CD8 şi Tconv, pe de o parte, şi celulele T reglatorii (Treg), pe de altă parte(p = 0,0131 şi p = 0,0006, respectiv) (fig. 21D-21f). Remarcabil, că analiza tumorilor contralaterale a relevat o creştere similară în infiltratele inflamatorii (fig. 22B, C), caracterizate printr-o creştere a numărului de celule atât imune înnăscute (fig. 22D), cât şi de celule T efectoare (fig. 22E, G). Este necesar de menţionat, că în pofida faptului, că nu au existat schimbări majore ale numărului absolut de Treg (fig. 22G), a existat o reducere substanţială conţinutului lor procentual relativ (fig. 22 E, F, H), cu o creştere marcantă a raporturilor între CD8 şi Tconv, pe de o parte, şi Treg, pe de altă parte (p = 0,002 şi p = 0,0021, respectiv) (fig. 22I). Celulele T efectoare, izolate din tumorile la distanţă, aveau o expresie sporită a markerilor de activare, proliferare şi liză ICOS, Ki-67 şi Granzima B, respectiv (figura 22J, K). Ca şi anterior, virus sau ARN viral a putut fi izolat din tumorile la distanţă, sugerând faptul că modificările observate în micromediul tumorii la distanţă nu s-au datorat nemijlocit infecţiei virale. În scopul de a exclude în continuare posibilitatea de propagarea virală locală nedetectabilă, tumorile au fost implantate în alte locuri îndepărtate, cum ar fi tumorile bilaterale pe lăbuţele posterioare, obţinând, însă, rezultate similare (fig. 23).

În concordanţă cu efectul inflamator observat, administrarea intratumorală a NDV a condus la reţinerea creşterii nu numai a tumorilor injectate, dar şi a tumorilor contralaterale, rezultând cu supravieţuire mai îndelungată a animalelor (fig. 22L, M). Pentru a determina dacă acest efect nu a fost trecător şi dacă este posibilă o protecţie antitumorală de lungă durată, şoarecilor cu o singură tumoare de flanc unilaterală B16-F10 s-a administrat intratumoral NDV şi la supravieţuitorii pe termen lung au fost injectate celule B16-F10 pe flancul opus. Majoritatea animalelor au demonstrat întârzierea creşterii tumorii, iar 30% dintre animale au respins complet celulele administrate, sugerând că terapia intratumorală cu NDV poate induce într-adevăr un răspuns anamnestc antitumoral de protecţie (fig. 25).

NDV induce infiltraţia şi înmulţirea limfocitelor specifice tumorii

Pentru a determina dacă răspunsul imun antitumoral a fost dependent de tipul de tumoare injectată cu NDV sau este un rezultat al inflamaţiei nespecifice, generate de infecţia cu NDV, experimentul a fost efectuat cu tumori heterologe (carcinom de colon MC38 şi melanom B16-F10) implantate în flancuri opuse (fig. 24A). Pentru a urmări limfocitele tumorale specifice, celulele transgenice CD8+, care exprimă în calitate de marcaj receptorul celular T congen (Pmel) sau celulele CD4+ marcate cu luciferază (Trp1), care recunosc antigenele de diferenţiere a melanomului gp100 (Pmel) şi Trp1 (Trp1) au fost transferate adoptiv (Muransky et al. Blood, no 112, 2008, p. 362; Overwijk et al. J Exp Med, no 198, 2003, p. 569). Pentru a măsura cinetica distribuirii şi extinderii celulelor Trp1 adoptiv transferate s-a utilizat vizualizarea bioluminiscentă. Transferul de celule Trp1 la animale purtătoare de tumori tratate cu PBS nu a produs acumularea de Trp1 în tumori, evidenţiind natura foarte imunosupresoare a micromediului tumorii in acest model (fig. 24B-D). Injecţie de NDV în tumorile B16-F10 a condus la o creştere semnificativă a semnalului luciferazei în tumorile injectate (fig. 24B-D), indicând expansiunea celulelor T Trp1 (aria de sub curbă (AUC) p = 0,0084). Remarcabil, că o expansiune similară a fost observată în tumoarea contralaterală, deşi cu întârziere (p = 0,0009) (fig. 24B-D). Spre deosebire de aceasta, injectarea NDV în tumorile MC38 nu a reuşit să inducă o infiltrare substanţială Trp1 în tumorile MC38 injectate sau în tumorile B16-F10 la distanţă (fig. 24B-D), sugerând că infiltrarea limfocitelor specific tumorilor a tumorilor la distanţă este, probabil, dependentă de identitatea antigenică a tumorii injectate. În mod similar, injecţia intratumorală de NDV a condus la o infiltrare sporită de celule Pmel în tumorile la distanţă, care a fost mai pronunţată la injectare în cazul tumorii B16-F10, decât la injectare în cazul tumorii MC38 (fig. 24E).

Este necesar de menţionat, că deşi infiltrarea tumori B16-F10 la distanţă cu limfocite adoptive transferate a fost dependentă de identitatea tumorii injectate, tumorile la distanţă a demonstrat o infiltraţie imună sporită chiar şi atunci când tumoarea primar injectată era MC38 (fig. 24F), sugerând că o componentă a răspunsului inflamator nespecific poate, de asemenea, juca rolul său. În plus, serul de la animalele tratate cu NDV, prelucrat cu iradiere UV pentru a inactiva orice virus potenţial, induce infiltrarea tumorii cu leucocite atunci când era injectat intratumoral la şoarecii netrataţi purtători de tumori B16-F10 (fig. 24G, H), totodată, creşterea de bază s-a remarcat pentru celulele NK şi CD8 + (p = 0,0089 şi p = 0,0443, respectiv) (fig. 24I).

NDV şi blocatorii CTLA-4 exercită acţiune sinergică pentru a respinge tumorile locale şi la distanţă

În pofida unui răspuns inflamator marcant şi reţinerea creşterii în tumorile la distanţă, respingere completă a tumorilor contralaterale, legată cu o supravieţuire îndelungată, a fost observată doar la aproximativ 10% din animale (fig. 22M), ceea ce sugerează existenţa unor mecanisme imunosupresoare active în micromediul tumorii. Studierea tumori injectate cu NDV şi tumorilor la distanţă a relevat activarea CTLA-4 pe celulele T care infiltrează tumoarea (fig. 26), ceea ce atestă, că inflamaţia indusă de NDV în tumoare poate face tumoarea sensibilă la terapia sistemică cu blocatori CTLA-4. Remarcabil, că terapia combinată NDV cu anticorpi anti-CTLA-4 (fig. 27A) a condus la respingerea tumorilor bilaterale şi supravieţuirea pe termen lung la majoritatea animalelor - efect care nu a fost observat la utilizarea fiecărei din aceste terapii pentru tratament în monoterapie (fig. 27B-D). Pentru a determina durata protecţiei observate, animalele care au supravieţuit au fost injectate în flancul drept în ziua a 90 cu celule B16-F10 fără vreo terapie suplimentară. Animalele, tratate cu terapie combinată cu NDV şi anticorpi anti-CTLA-4 au demonstrat o protecţie de 80% de tumorile reprovocate, comparativ cu protecţia de 40% la animalele tratate doar cu anticorpi anti-CTLA-4 (fig. 27E).

Terapia combinată NDV şi blocatori CTLA-4 este eficientă împotriva tumorilor nepermisive pentru virus

Pentru a determina dacă această strategie de tratament ar putea fi extinsă la alte tipuri de tumori, strategia a fost evaluată pe un model adenocarcinom de prostată cu imunogenitate redusă TRAMP C2. Similar cu modelul B16-F10, terapia combinată a provocat regresia tumorilor injectate (fig. 27F) şi fie reţinea extinderea tumorilor la distanţă, sau conducea la regresia completă a tumorilor la distanţă cu prelungirea supravieţuirii pe termen lung (fig. 27F, G). Este necesar de menţionat, că în timp ce celulele B16-F10 au fost sensibile la liza NDV mediată in vitro, celulele TRAMP C2 au manifestat un grad înalt de rezistenţă cu o citotoxicitate redusă, observată la o multiplicare a infecţiei (MOI) de până la 10 (fig. 27H). În ambele linii celulare, infecţia cu NDV in vitro conducea la activarea de suprafaţă a MHC şi moleculelor costimulatoare (fig. 27I-K). Moleculele de MHC de clasa I în mod egal erau activate în toate celulele, chiar dacă nu toate celulele se infectează cu NDV la MAI egal cu 1. Cercetările anterioare au demonstrate, că NDV induce expresia IFN de tip 1 în celulele B16-F10 (Zamarin et al. Mol. Ther., no 17, 2009, p. 697). Se ştie, că ambele tipuri de IFN (Dezfouli et al. Immunol. Cell. Biol., no 81, 2003, p. 459; Seliger et al. Cancer Res., no 61, 2001, p. 1095) activează expresia moleculelor MHC de clasa I pe suprafaţa celulelor B16-F10, sugerând că în cazul tumorilor infectate aceste mecanisme pot juca un rol suplimentar în intensificarea imunogenicităţii tumorii. Astfel, aceste rezultate atestă, că sensibilitatea in vitro a lizei mediate de virus nu este necesară pentru sensibilitatea la terapia cu NDV in vivo şi suplimentar indică asupra importanţei preponderente a răspunsului inflamator generat de virus, comparativ cu oncoliza directă în eficacitatea antitumorală observată.

Efectul antitumoral sistemic este antigen-limitat de tipul de tumoare injectată

Pentru a determina dacă efectul antitumoral, observat în tumoarea la distanţă, a fost specific în raport cu tipul de tumoare injectat, s-a evaluat terapia combinată la animalele cu tumori B16-F10 la distanţă bilaterale şi la animalele cu tipuri de tumori heterologe (carcinom de colon MC38 şi melanom B16-F10) implantate pe flancuri opuse (fig. 28A). Deşi administrarea intracutanată a virusului în flancul drept fără tumori rezulta cu reţinerea creşterii tumorii din flancul stâng, dar asigura o protecţie de lungă durată şi respingerea tumorii, observate la animalele care poartă tumori bilaterale B16-F10 (fig. 28B, C). În mod similar, injectarea NDV în tumorile MC38 din flancul drept la animalele cu tumori B16-F10 în flancul stâng, s-a dovedit a fi incapabilă de respingerea tumorii B16-F10 (fig. 28D, E), ceea ce atestă, că răspunsul imun antitumoral indus cu NDV este probabil, antigen-limitat de tumoarea injectată.

Terapia combinată NDV şi anticorpi anti-CTLA-4 induce infiltraţie tumorii cu limfocite activate

Pentru a studia micromediul tumorii B16-F10 la animalele tratate, tumorile bilaterale au fost colectate şi prelucrate pentru analiza celulelor infiltrate. Analiza tumorile injectate şi tumorilor la distanţă de la animalele tratate a relevat infiltrate inflamatorii proeminente şi zone mari de necroză tumorală la animalele tratate cu terapie combinată (fig. 30A, fig. 29). Aceasta corelează cu creşterea numărului de celule CD45 + şi de celule T în grupul care a administrat tratament combinat (fig. 29A-C, fig. 30A-C). Ca şi anterior, creşterea observată a cantităţii de TĪL s-a datorat, în primul rând, infiltraţiei CD8+ şi Tconv, dar nu Treg, ceea ce conducea la creşterea raporturilor între celulele efectoare şi Treg (fig. 30D-F, fig. 29C-F). Caracteristica fenotipică a CD4+ şi CD8+ TIL de la animalele care au primit tratament combinat, a demonstrat activarea ICOS, Granzimei B şi Ki-67, comparativ cu animalele netratate şi tratate cu anticorpi anti-CTLA-4 (fig. 30G-I), şi un procent mai mare de celule CD8+, care exprimă IFN-gamma drept răspuns la restimularea cu celule dendritice (DC), activate cu lizate tumorale B16-F10 (fig. 30J).

Activitatea antitumorală a terapiei combinate NDV depinde de celulele CD8+, celulele NK şi de interferonii de tip I şi II

Pentru a determina care componente ale imunităţii celulare au fost responsabile pentru efectul terapeutic observat, tratamentul a fost repetat în prezenţa anticorpilor care epuizează pentru celulele CD4+, CD8+ sau NK. Depleţia celulelor necesară fiecărei subset de celule a fost confirmată prin citometrie în flux a sângelui periferic (fig. 31). Eliminarea sau epuizarea celulelor CD8+ sau NK a condus la dispariţia efectului terapeutic atât în tumori cu virus injectat, cât şi în tumorile la distanţă (fig. 32A, B) cu reducerea semnificativă a supravieţuirii pe termen lung (p <0,0001 pentru CD8 şi p < 0,0011 pentru epuizarea NK) (fig. 32C). În concordanţă cu aceste constatări, tratamentul animalelor cu un anticorp de neutralizare anti-IFNΓ, de asemenea, a redus eficacitatea terapeutică. În schimb, epuizarea celulelor CD4+ nu a exercitat vre-o schimbare semnificativă a efectului antitumoral, deşi aceste rezultate trebuie interpretate cu precauţie, deoarece epuizarea anti-CD4+, de asemenea, conduce la epuizarea concomitentă a Treg.

Anterior a fost demonstrat, că IFN de tipul I are un rol important în amorsarea celulelor CD8+ pentru răspunsul imun antitumoral (Fuertes et al. J. Exp. Med., no 208, 2011, p. 2005; Diamond et al. J. Exp. Med., no 208, 2011, p. 1989). Pentru a investiga rolul IFN de tip I în respingerea tumorii cu participarea NDV, experimentele au fost repetate cu şoarecii cu knockout al receptorului IFN de tip I (IFNAR-/-). Şoareci IFNAR-/- au demonstrat o evoluţie rapidă a tumorilor injectate, cât şi a celor contralaterale, şi o rezistenţă completă la terapia combinată (fig. 32D-F). În general, aceste constatări subliniază rolul important al ambelor răspunsuri imune, atât a celui înnăscut, cât şi adaptive, pentru eficacitatea terapeutică sistemică a virusului, observată în acest studiu.

Terapia cu NDV conduce la activarea PD-L1 pe celulele tumorale şi pe leucocitele, care infiltrează tumoarea

Pentru a determina dacă influenţa asupra altor puncte de control imun in asociere cu terapia cu NDV ar putea fi benefică, a fost apreciat efectul exercitat asupra căii PD-1 - PD-L1 după infecţia cu NDV. Aşa cum se arată în fig. 33, celulele tumorale infectate cu NDV, atât in vitro, cât şi in vivo, aveau activarea expresiei ligandului inhibitor PD-L1 pe suprafaţa celulelor (fig. 33A), care a fost, de asemenea, observată în tumorile la distanţă neinfectate. Activarea PD-L1 nu a fost doar limitată la celulele tumorale, dar a fost, de asemenea, observată în leucocitele, care infiltrează tumoarea atât de origine înnăscută, cât şi adoptivă (fig. 33B).

Terapia combinată NDV cu anticorpi care blochează PD-1 şi PD-L1 conduce la îmbunătăţirea imunităţii antitumorale şi supravieţuiri pe termen lung a animalelor

Combinaţia de NDV cu anticorpi, care blochează PD-1 şi combinaţia de NDV cu anticorpi, care blochează PD-L1 au fost evaluate în modelul de melanom bilateral de flanc, descris mai sus. Remarcabil, că, în mod similar cu blocatorii CTLA-4, terapia NDV în combinaţie fie cu anticorpi anti-PD-1 sau cu anticorpi anti-PD-L1 a condus la creşterea supravieţuirii animalelor (fig. 34 şi 35). Au fost caracterizate tumorile la distanţă de la animalele tratate cu combinaţie de NDV şi anticorpi anti-PD-1. După cum se poate observa din fig. 36, combinaţia de NDV intratumoral cu administrarea sistemică a blocatorului PD-1 a condus la o infiltrare semnificativă cu celule imune a tumorii la distanţă, totodată, cel mai important rezultat s-a dovedit a fi creşterea cantităţii de celule CD8, care infiltrează tumoarea. Celulele care infiltrează exprimau marker de proliferare şi liză Ki67 şi Granzimă B, respectiv (fig. 37).

NDV induce activarea expresiei ICOS asupra celulelor imune CD4 şi CD8, care infiltrează tumoarea în tumorale injectate cu virus şi în tumorile la distanţă şi în ganglionii limfatici care drenează tumoarea (TDLN)

Rezultatele anterioare atestă, că combinaţia de NDV introdus intratumoral şi administrarea sistemică a blocatorului punctelor de control imune conduce la un efect sinergic puternic al acestor două abordări terapeutice. În baza acestor rezultate, s-a studiat în continuare dacă consolidarea funcţiei efectoare a celulelor T în micromediul umorii printr-o cale costimulatoare relevantă poate conduce la amplificarea răspunsului imun antitumoral. Investigaţiile anterioare au relevant, că activarea stabilă a expresiei costimulatorului inductibil ICOS pe suprafaţa celulelor T este un indicator distinct al răspunsului la blocatorul CTLA-4 la pacienţi (Carthon et al. Clin. Cane. Res., no 16, 2010, p. 2861). ICOS este un omolog al CD28, exprimat pe suprafaţa celulelor T activate, care s-a dovedit a fi critic pentru formarea răspunsului B limfocitar, mediat de celulele T şi dezvoltarea subpopulaţiei de T helper (Simpson et al. Curr. Opin. Immunol., no 22, 2010, p. 326). Rolul ICOS în eficienţa antitumorală a blocatorilor CTLA-4 a fost confirmat recent în studii pe şoareci, în care şoarecii cu deficit de ICOS au fost grav compromişi în dezvoltarea unui răspuns antitumoral la utilizarea blocatorilor CTLA-4 (Fu et al. Cancer Res., no 71, 2011, p. 5445).

Expresia ICOS în modele de tumori bilaterale de flanc, tratate cu NDV, a fost caracterizată pentru a determina dacă receptorul ar putea servi ca o ţintă în aceasta abordare terapeutica. Pentru a caracteriza efectele locale şi abscopale ale terapiei intratumorale cu NDV, s-a utilizat modelul de melanom B16-F10 bilateral de flanc cu administrarea virusului într-o tumoare unilateral (fig. 38A). S-a evaluat activarea markerilor, care ar putea prognoza un răspuns mai bun şi ar putea fi ţinte pentru îmbunătăţirea ulterioară a eficacităţii terapeutice. Cu titlul de exemplu a fost selectat ICOS, deoarece anterior s-a demonstrat, că activarea ICOS este asociată cu răspunsuri terapeutice mai marcante şi o creştere a supravieţuirii la pacienţii melanom malign, trataţi cu anticorpi anti-CTLA-4. Analiza limfocitelor, izolate din tumori şi din ganglionii limfatici care drenează tumoarea, a relevat activarea molecule co-stimulatoare ICOS în calitate de unul dintre marcherii de activare la animalele tratate (fig. 38B, C).

Generarea şi evaluarea in vitro a virusului NDV-ICOSL

Utilizând abordările sistemului de “genetică inversă” pentru NDV, s-au obţinut NDV care exprimă ICOSL murin (NDV-ICOSL) (fig. 39a). Expresia ICOSL pe suprafaţa celulelor infectate B16-F10 a fost confirmată prin citometrie în flux după 24 de ore după infectare (fig. 39B). In vitro caracteristica acestui virus a arătat, că posedă proprietăţi replicative (fig. 39D) şi litice (fig. 39C), similare proprietăţilor tulpinii parentale de NDV.

NDV-ICOSL reţine creşterea tumorilor la distanţă şi induce intensificarea infiltrării tumorii cu limfocite

Pentru a evalua eficacitatea terapeutică a NDV-ICOSL în tumorile injectate cu virus şi în tumorile la distanţă, animalele cu tumori bilaterale B16-F10 au fost tratate cu 4 injecţii intratumorale de acest virus în tumorile de flanc unilaterale. Atât NDV-ICOSL, cât şi NDV de tip sălbatic au fost comparabile în capacitatea lor de a provoca regresii ale tumorilor la injectarea directă a acestui virus în tumoare (fig. 40A). Cu toate acestea, în comparaţie cu NDV de tip sălbatic, NDV-ICOSL conduce la o întârziere mai semnificativă a creşterii tumorii în tumorile la distanţă, totodată la câteva animale tumorile au lipsit un timp îndelungat (fig. 40B-C). Analiza tumorilor infectate cu virus a evidenţiat creşterea infiltraţiei tumorale cu celule efectoare CD4 şi CD8 la animalele tratate cu NDV de tip sălbatic şi NDV-ICOSL, deşi diferenţele dintre cele două virusuri nu au fost statistic semnificative, reflectând activitatea similară a celor două virusuri împotriva tumorilor din flancul drept (fig. 40A şi 40D). În contrast, analiza tumorilor de flanc stâng a relevat o creştere mai proeminentă a cantităţii de celule CD8 şi Tconv care infiltrează tumoarea în grupul tratat cu NDV-ICOSL (fig. 40E). Este remarcabil, că exista, de asemenea, o creştere a numărului absolut de celule T reglatoare, cu cea mai mare creştere observată în grupul tratat cu NDV-ICOSL (fig. 40E), deşi procentul relativ de celule T reglatoare a fost semnificativ mai redus la animalele tratate cu NDV (fig. 40F).

Terapia combinată NDV-ICOSL şi blocatori ai CTLA-4 conduce la respingerea tumorilor injectate şi tumorilor la distanţă

În general, rezultatele prezentate mai sus au demonstrate, că, în pofida unei reacţii inflamatorii semnificative, observată în tumorile la distanţă la administrarea intratumorală a NDV-ICOSL, majoritatea animalelor, însă, murit de la tumori, sugerând că mecanismele de inhibare active din micromediul tumorii previn respingerea tumorii prin infiltrarea celule imune. De aceea, s-a evaluat eficacitatea terapiei combinate administrate local cu NDV-ICOSL şi blocator sistemic al CTLA-4. Pentru aceste experimente dozele provocare tumorale au fost majorate până la nivelurile la care nu a fost observată nici o eficienţă terapeutică semnificativă cu NDV sau anticorpi anti-CTLA-4 la administrarea lor solitară. Ca şi anterior, animalele au fost tratate cu 4 doze de NDV administrate în tumoare pe un flanc unilateral, concomitent cu administrarea sistemică a anticorpilor anti-CTLA-4 (fig. 41A). În modelul B16-F10 terapia combinată cu NDV-ICOSL şi anticorpi anti-CTLA-4 a condus la regresia majorităţii tumorilor injectate şi tumorilor la distanţă cu supravieţuirea animalelor pe termen lung, care a fost semnificativ superioară cu indicatorii în combinaţia NDV-WT şi anticorpi anti-CTLA-4 (fig. 41B-D). Pentru a determina dacă aceste rezultate ar putea fi extinse şi la alte modele de tumori, acelaşi experiment a fost efectuat pe modelul bilateral carcinom de colon CT26 în flanc. În pofida sensibilităţii reduse a celulelor CT26 la liza mediată de NDV in vitro, s-a observat o eficacitate terapeutică semnificativă a terapiei combinate cu NDV şi anticorpi anti-CTLA-4 atât în tumorile injectate cu virus, cât şi în tumorile la distanţă, şi iarăşi cu o eficacitate mai înaltă în grupul, în care s-a administrat combinaţie de NDV-ICOSL cu anticorpi anti-CTLA-4 (fig. 42A-D). În ambele modele de tumori animalele, care complet s-au vindecat de tumori, au fost reprovocate cu o doză letală de celule tumorale în ziua a 90 fără o terapie ulterioară şi majoritatea animalelor au demonstrat protecţie împotriva reprovocării (fig. 41E şi 42E). Este de remarcat, că în timp ce în modelul CT26 toate animalele vindecate s-au dovedit a fi protejate de reprovocare, în modelul B16-F10 animalele tratate cu terapie combinată au demonstrat o protecţie net superioară, comparativ cu animalele care au fost tratate doar cu anticorpi anti-CTLA-4 (fig. 41E), ceea ce atestă, că abordarea combinată conduce la un răspuns anamnestic de protecţie mai eficient.

Terapia combinată conduce la o infiltrare semnificativă a tumorii cu celule imune înnăscute şi adaptive

Analiza tumorilor B16 la distanţă la animalele tratate cu combinaţie de NDV şi anticorpi anti-CTLA-4 a demonstrat o infiltrare tumorală semnificativă cu diferite subtipuri de celule imune (fig. 43A, B). O infiltrarea sporită a fost evidentă atât pentru celulele imune înnăscute (fig. 43B, D), cât şi pentru cele adaptive (fig. 43E), cu cea mai mare creştere vizibilă în grupul tratat cu combinaţia de NDV-ICOSL şi anticorpi anti-CTLA-4. Remarcabil este, că în timp ce acest grup a demonstrat cel mai mare număr de limfocite CD8+ de infiltrare, în acest grup, de asemenea, s-a relevant o creştere statistic semnificativă de celulele T reglatoare (fig. 43E), deşi procentul total de Treg a fost semnificativ mai redus, comparativ cu animalele netratate sau cu animalele tratate doar cu anticorpi anti-CTLA-4 (fig. 43F), cu creşterea rezultată a raportului dintre celulele efectoare şi Treg (fig. 43g). O analiză detaliată TIL a demonstrat, că TIL izolat de la animalele tratate cu combinaţie de NDV-ICOSL şi anticorpi anti-CTLA-4 au exprimat cele mai cantităţi de marker de activare, liză şi de proliferare ICOS, granzimă B şi Ki67 respectiv (fig. 43H-J).

Generarea NDV recombinant, care exprimă alte molecule costimulatoare

Acest exemplu demonstrează, că exprimarea unui ligand costimulator de NDV poate conduce la activarea unui răspuns imun mai puternic, care poate crea o imunitate anti-tumorală mai eficientă, în special în condiţiile unei terapii combinate cu blocatorul punctelor de control imune. Pentru a evalua molecule suplimentare costimulatoare, au fost studiaţi liganzii, ţinta cărora este superfamilia receptorilor de imunoglobuline de (ICOS şi CD28) şi superfamilia receptorilor TNF (GITR, 4-1BB, OX40 şi CD40). Pentru legarea cu CD28 a fost proiectat un ligand artificial, constând dintr-o proteină himerică cu domeniile citoplasmatice şi transmembranare ale glicoproteinei F de NDV şi domeniul extracelular, constând dintr-un anticorp cu un singur lanţ împotriva CD28 (aCD28-scFv) (fig. 44A, B). Pentru liganzii, specifici pentru superfamilia de receptori TNF, domeniul extracelular al fiecărui ligand a fost fuzionat cu domeniile transmembranar şi intracelular ale glicoproteinei HN NDV, în scopul de a asigura exprimarea crescută a liganzilor pe suprafaţa celulelor infectate (fig. 44a, B ). În plus, erau generate virusuri recombinante care exprimă citokine din familia receptorilor cu lanţ comun gamma (IL-2, IL-15 şi IL-21). Constructele rezultate sunt ilustrate în diagrama din fig. 44c. Virusurile recombinante au fost generate prin metode de “genetică inversă” şi prezenţa virusurilor a fost confirmată prin analize de hemaglutinare (fig. 45A). Pentru a confirma corectitudinea inserţiei genelor, din fiecare virus a fost izolat ARN şi RT-PCR a fost efectuată cu primeri de recoacere în afara regiunii genei clonate (fig. 45B, C). Secvenţă de fiecare genă a fost confirmată ulterior prin secvenţierea Sanger. Pentru a confirma exprimarea liganzilor costimulatori pe suprafaţa celulelor infectate, celule cultivate B16-F10 au fost infectate la MOI, egală cu 2, şi, peste 24 ore, analizate prin citometrie în flux cu anticorpi specifici pentru fiecare genă (fig. 46).

NDV-4-1BBL induce infiltrarea tumorii cu limfocite în tumorile la distanţă

Abilitatea virusurilor proiectate pentru a manifesta orice semne ale unui răspuns imun sporit a fost evaluată, folosind în calitate de exemplu NDV-4-1BBL. Şoarecii cu melanoame B16-F10 bilaterale de flancuri au fost trataţi în tumoarea dreaptă cu injecţie intratumorală de NDV de control sau NDV-4-1BBL, aşa cum a fost descris anterior, şi tumorile la distanţă au fost prelevate în ziua a 15. După cum se poate observa din fig. 47, terapia cu NDV-4-1BBL cauza infiltrarea sporită atât cu celule imune înnăscute, cât şi cu cele adaptive în tumorile contralaterale, ceea ce este în concordanţă cu concluziile anterioare, care demonstrează rezultate similare cu NDV, care exprimă ICOSL (fig. 40). În general, aceste rezultate atestă, ca expresia moleculelor imunostimulatoare de NDV în contextul micromediul tumorii poate conduce la creşterea imunităţii antitumorale.

Virusurile generate NDV-4-1BBL, NDV-GITRL, NDV-OX40L, NDV-CD40L, NDV-IL-2, IL-NDV-15, NDV-IL-21 au fost evaluate după abilitatea lor de a induce infiltrarea tumorii cu celule imune, folosind pentru aceasta metodele similare de analiză descrise aici. În plus, evaluarea terapeutică fiecărui dintre virusuri s-a realizat pe modelele de tumori bilaterale de flancuri, virusul fiind administrat în tumoare într-un singur flanc, în combinaţie cu administrarea sistemică a anticorpilor, care reglează punctele de control imune PD-1, PD-L1 şi/sau CTLA-4.

Concluzie

Pentru a declanşa moartea imunogenă a celulelor tumorale şi un răspuns inflamator, s-a folosind NDV nepatogene, care, în pofida activităţii sale litice relativ reduse, s-a dovedit a fi un inductor puternic al IFN de tip 1 şi de maturare a DC(Wilden et al. Int. J. Oncol., no 34, 2009, p. 971; Kato et al. Immunity, no 23, 2005, p. 19). A fost utilizat un model de melanom bilateral de flanc cu implantarea eşalonată a tumorilor conform unei scheme, pentru care a fost demonstrat anterior, că ea nu acordă rezistenţă la o infectare repetată (Turk et al., J. Exp. Med., no 200, 2004, p. 771). Acest exemplu demonstrează, că injectarea intratumorală a NDV conduce la infiltrarea tumorii la distanţă cu celule imune în lipsa răspândirii virusului la distanţă. Este necesar de menţionat, că acest efect a fost asociat cu reducerea relativă a numărului de Treg şi o creştere marcată a raportului dintre celulele efectoare CD4 şi CD8 şi celulele Treg, şi s-a demonstrată anterior, că acesta este un marker al unui răspuns imunologic favorabil la imunoterapie (Quezada et al. J. Clin. Invest. no 116, 1, 2006, p. 935; Curran et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, no 107, 2010, p. 4275).

Datele din acest exemplu demonstrează, că NDV amplifică infiltrarea tumorală cu limfocite cu specificitate tumorală, şi acest efect a fost dependent de identitatea tumorii injectate cu virus. Infiltrarea sporită a tumorii şi extinderea limfocitelor adoptive transferate atestă suplimentar despre interacţiunea reciproc amplificată dintre terapia cu virus oncolitic şi abordările terapeutice, care utilizează transferul de celule T adoptive. Este absolute posibil, că limfocitele cu specificitate tumorală sunt supuse activării şi expansiunii în locul infecţiei virale iniţiale, urmate de migrarea lor spre alte locusuri cu tumori, ceea ce, probabil, depinde de receptorii pentru chemokine şi receptorii homingului limfocitelor (Franciszkiewicz et al. Cancer Res., no 72, 2012, p. 6325). Datele din acest exemplu demonstrează, de asemenea, că infiltrarea cu celule imune a tumorii la distanţă parţial era nespecifică şi poate era indusă de infecţia cu NDV a tumorii heteroloage sau de transferul de ser de la animalele tratate la şoarecii cu tumori, care nu erau trataţi. Permeabilitatea vasculară crescută, indusă de citokinele inflamatorii, cum ar fi IL-6, poate contribui semnificativ în activarea vascularizării tumorii şi recrutarea limfocitelor în tumori (Fisher et al. Journal of Clinical Investigation, no 121, 2011, p. 3846).

În pofida creşterii semnificative a numărului de TIL, efectul terapeutic în tumorile la distanţă în monoterapie cu NDV a fost destul de modest, subliniind natura imunosupresivă a micromediului acestor tumori (Spranger et al. Sci. Transl. Med., no 5, 2013). Remarcabil este că combinaţia administrării sistemice a anticorpilor anti-CTLA-4 cu administrarea intratumorală a NDV a condus la respingerea tumorilor B16-F10 la distanţă cu supravieţuirea animalelor pe termen lung. Animalele au fost, de asemenea, protejate împotriva reinfectării cu tumoare, ceea ce atestă despre formarea memoriei imunologice pe termen lung. Remarcabil este, că eficacitatea terapeutică a fost, de asemenea, constatată în cazul modelelor de tumori TRAMP C2 şi CT26, care prezintă o sensibilitate redusă la liza celulară mediată de NDV in vitro. Aceste rezultate atestă importanţa răspunsului antitumoral imun/inflamator, indus de NDV, dar nu de liza directă, în calitate de mecanism primar, care determină eficacitatea antitumorală în acest model. În plus, analiza tumorilor injectate cu NDV şi tumorilor la distanţă după terapia combinată a relevat o infiltrare semnificativă cu celule imune înnăscute şi celule efectoare activate CD8+ şi CD4+, în timp ce epuizarea celulelor CD8+ şi celulelor NK conducea la dispariţia completă a eficacităţii terapeutice. Mai mult decât atât, strategia de combinaţie s-a dovedit a fi complet ineficientă la şoarecii IFNAR-/-, ceea ce susţine rolul căii cu implicarea IFN de tip 1 în inducerea imunităţii antitumorale în acest sistem (Fuertes et al. J. Exp. Med., no 208, 2011, p. 2005; Diamond et al. J. Exp. Med., no 208, 2011, p. 1989; Spranger et al. Sci. Transl. Med., no 5, 2013; Swann et al. J. Immunol., no 178, 2007, p. 7540).

Astfel, acest exemplu demonstrează, că terapie locală intratumorală a melanomului B16 cu NDV induce o reacţie inflamatoare, care conduce la infiltrate limfocitară şi la efect antitumoral în tumorile la distanţă (care nu au fost injectate cu virus) fără răspândirea virusului la distanţă. Acest efect inflamator coincide cu infiltraţia tumorilor la distanţă cu celule CD4+ şi CD8+ cu specificitate tumorală, care era dependentă de identitatea tumorii injectate cu virus. Terapia combinată cu NDV local şi administrarea sistemică a blocatorului CTLA-4 conducea la respingerea tumorilor la distanţă prestabilite şi instalarea protecţiei împotriva reprovocării cu tumoare în modele de tumori slab imunogenice, indiferent de sensibilitatea liniei de celule tumorale la liza mediată de NDV. Efectul terapeutic a fost asociat cu infiltrarea semnificativă a tumorilor la distanţă cu celule efectoare CD8+ şi CD4+ activate, dar nu cu celule T reglatoare, şi el era dependent de celulele CD8+, celulele NK de interferon de tip 1. Acest exemplu atestă, că terapia locală cu NDV oncolitic induce infiltrarea inflamatoare a tumorilor la distanţă cu celule imune, ceea ce le face susceptibile la terapia sistemică cu anticorpi imunomodulatori.

Volumul prezentei invenţii nu se limitează la realizările concrete descrise aici. În plus, diferite modificări ale prezentei invenţii, adiţional la cele descrise, vor deveni evidente specialiştilor în domeniu din descriere şi figurile anexate. Se consideră, că astfel de modificări se include în volumul revendicărilor anexate.

Toate documentele, menţionate în prezenta invenţie, sunt incluse în descriere prin referinţă integral şi pentru toate scopurile în aceeaşi măsură, în care fiecare publicaţie individuală sau cerere de brevet sau brevet au fost indicate în mod specific şi individual ca fiind incorporate prin referinţă integral pentru toate scopurile.

1. Sinkovics J.G., Horvath J.C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. J.Clin. Virol., no 16, 2000, p. 1-15

2. Lorence et al. Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus. Curr. Cancer Drug targets, no 7, 2007, p. 157-167

3. Hotte et al. An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701. Clin. Cancer Res., no 13, 2007, p. 977-985

Claims (42)

1. Metodă de tratament al cancerului, care prevede administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unei compoziţii care conţine virusul bolii Newcastle (NDV) şi a unei compoziţii ce conţine un antagonist al proteinei morţii celulare programate 1 (PD1), în care antagonistul PD1 reprezintă un anticorp, care se leagă specific la PD1 şi blochează legarea cu liganzii săi nativi.

2. Metodă de tratament al cancerului, care prevede administrarea la un subiect, care are nevoie de aceasta, a unei compoziţii care conţine un NDV hibrid şi un antagonist conţinând antagonistul PD1, în care NDV hibrid conţine un genom ambalat cu conţinut de o secvenţă de nucleotide, care codifică o citokină, în care această citokină este exprimată de virus, şi în care antagonistul PD1 reprezintă un anticorp care se leagă specific la PD1 şi blochează legarea cu liganzii săi nativi.

3. Metodă, conform revendicării 2, în care citokina reprezintă interieukina-2 (IL-2).

4. Metodă, conform revendicării 2, în care citokina reprezintă un factor granulocitar-macrofagal stimulator de colonii (GM-CSF).

5. Metodă, conform revendicării 2, în care citokina reprezintă interleukina-21 (IL-21).

6. Metodă, conform revendicării 2, în care citokina reprezintă interleukina-15 (IL-15).

7. Metodă, conform revendicării 2, în care citokina reprezintă interleukina - 7 (IL-7), interleukina - 9 (IL-9), interleukina - 17 (IL-17), interleukina - 22 (IL-22), gama-interferon (IFN) sau factorul de necroză tumoral (TNF)-alfa.

8. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 2-7, în care NDV reprezintă o tulpină LaSota şi genomul ambalat conţine o secvenţă de nucleotide, care codifică proteina mutantă F cu mutaţia aminoacidă L289A, în care proteina mutantă este exprimată de NDV.

9. Metodă, conform revendicării 1, în care NDV reprezintă o tulpină LaSota şi conţine genomul ambalat cu conţinut de o secvenţă de nucleotide, care codifică proteina mutantă F cu mutaţia aminoacidă L289A, în care proteina mutantă este exprimată de NDV.

10. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-7, în care NDV reprezintă o tulpină LaSota.

11. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-10, în care anticorpul reprezintă un anticorp monoclonal.

12. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-11, în care anticorpul reprezintă MK3475.

13. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-12, în care cancerul reprezintă melanom, cancer de colon, cancer mamar, carcinom cu celule scuamoase al capului şi gâtului, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer hepatic sau cancer cu celule renale.

14. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-12, în care cancerul reprezintă melanom, cancer de creier, cancer de vezică urinară, cancer mamar, cancer de col uterin, limfom Hodgkin, cancer colorectal, carcinom endometrial, cancer esofagian, glioblastom multiform, carcinom hepatocelular, cancer de rinichi, cancer hepatic, carcinom cu celule renale, adenocarcinom pancreatic, mezoteliom, cancer pulmonar, limfom non-Hodgkin, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer de prostată, cancer al glandelor salivare, sarcom, cancer tiroidian sau cancer uterin.

15. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-14, în care cancerul este metastatic.

16. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-15, în care cancerul este refractar sau recurent.

17. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-16, în care compoziţia cu conţinut de NDV se administrează intratumoral.

18. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-17, în care compoziţia cu conţinut de antagonist se administrează intravenos.

19. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-17, în care compoziţia cu conţinut de antagonist se administrează subcutanat.

20. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-17, în care compoziţia cu conţinut de antagonist se administrează sistemic.

21. Metodă, conform oricăreia dintre revendicările 1-20, în care subiectul este un om.

22. Compoziţie cu conţinut de virus al bolii Newcastle (NDV) în combinaţie cu antagonistul proteinei 1 a morţii celulare (PD1) pentru utilizare în tratamentul cancerului la un subiect care are nevoie de aceasta, în care antagonistul PD1 reprezintă un anticorp, care se leagă specific cu PD1 şi blochează legarea cu liganzii săi nativi.

23. Compoziţie cu conţinut de NDV hibrid în combinaţie cu antagonistul proteinei 1 a morţii celulare (PD1) pentru utilizare în tratamentul cancerului la un subiect care are nevoie de aceasta, în care NDV hibrid conţine un genom ambalat cu conţinut de o secvenţă de nucleotidă, care codifică o citokină, în care această citokină este exprimată de virus, şi în care antagonistul PD1 reprezintă un anticorp care se leagă specific cu PD1 şi blochează legarea cu liganzii săi nativi.

24. Compoziţie, conform revendicării 23, în care citokina reprezintă interleucina -2 (IL-2).

25. Compoziţie, conform revendicării 23, în care citokina reprezintă un factor granulocitar-macrofagal stimulator de colonii (GM-CSF)

26. Compoziţie, conform revendicării 23, în care citokina reprezintă interleukina - 21 (IL-21).

27. Compoziţie, conform revendicării 23, în care citokina reprezintă interleukina - 15 (IL-15).

28. Compoziţie, conform revendicării 23, în care citokina reprezintă interleukina - 7 (IL-7), interlekina - 9 (IL-9), interleukina - 17 (IL-17), interleukina - 22 (IL-22), gama-interferon (IFN) şi factorul de necroză tumoral (TNF)-alfa.

29. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 23-28, în care NDV reprezintă o tulpină LaSota şi genomul ambalat conţine o secvenţă de nucleotidă, care codifică proteina mutantă F cu mutaţia aminoacidă L289A, în care proteina mutantă este exprimată de NDV.

30. Compoziţie, conform revendicării 22, în care NDV reprezintă o tulpină LaSota şi conţine genomul ambalat cu conţinut de o secvenţă de nucleotidă, care codifică proteina mutantă F cu mutaţia aminoacidă L289A, în care proteina mutantă este exprimată de NDV.

31. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-28, în care NDV reprezintă o tulpină LaSota.

32. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-31, în care anticorpul reprezintă un anticorp monoclonal.

33. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-32, în care, în care anticorpul reprezintă MK3475.

34. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-33, în care cancerul reprezintă melanom, cancer de colon, cancer mamar, carcinom cu celule scuamoase al capului şi gâtului, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer hepatic sau cancer cu celule renale.

35. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-33, în care cancerul reprezintă melanom, cancer de creier, cancer de vezică urinară, cancer mamar, cancer de col uterin, limfom Hodgkin, cancer colorectal, carcinom endometrial, cancer esofagian, glioblastom multiform, carcinom hepatocelular, cancer de rinichi, cancer hepatic, carcinom cu celule renale, adenocarcinom pancreatic, mezoteliom, cancer pulmonar, limfom non-Hodgkin, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer de prostată, cancer al glandelor salivare, sarcom, cancer tiroidian sau cancer uterin.

36. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-35, în care cancerul este metastatic.

37. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-36, în care cancerul este refractar sau recurent.

38. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-37, în care NDV este prevăzut pentru administrare intratumorală.

39. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-38, în care antagonistul este prevăzut pentru administrare intravenoasă.

40. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-38, în care antagonistul este prevăzut pentru administrare subcutanată.

41. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-38, în care antagonistul este prevăzut pentru administrare sistemică.

42. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 22-41, în care subiectul este un om.