ES2791248T3

ES2791248T3 - Receptor antigénico quimérico (CAR) anti-CD123 para su uso en el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2791248T3
Application number: ES15756525T
Authority: ES
Inventors: Saad Kenderian; Jennifer Brogdon; Saar Gill; David Glass; Andreas Loew; Joan Mannick; Michael Milone; Leon Murphy; David L Porter; Marco Ruella; Yongqiang Wang; Qilong Wu; Jiquan Zhang
Original assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: PL3183268T3; KR102616429B1; TW201617367A; AU2015305531A1; CA2958553A1; US11591404B2; IL280204A; WO2016028896A1; IL250362A0; MY189028A; PT3183268T; US9815901B2; JP7084138B2; RU2017108903A; JP2017530694A; SG11201700770PA; CN107108744B; BR112017003104A2; US20230220090A1; CN107108744A

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), donde el CAR comprende un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y donde dicho dominio de unión a CD123 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC), donde además dicho dominio de unión a CD123 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC), donde: (a) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 487, 492, 497, 502, 507 y 512, respectivamente; (b) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 517, 522, 527, 532, 537 y 542, respectivamente; o (c) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 335, 363, 391, 419, 447 y 475, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor antigénico quimérico (CAR) anti-CD123 para su uso en el tratamiento del cáncer

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reclama prioridad respecto a la Solicitud PCT N.° PCT/CN2014/084696, presentada el 19 de agosto de 2014, y la solicitud PCT N.° PCT/CN2014/090508, presentada el 6 de noviembre de 2014.

Lista de secuencias

La presente solicitud contiene una Lista de secuencias que se ha presentado por vía electrónica en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 18 de agosto de 2015, tiene como nombre N2067-7064WO5_SL.txt y un tamaño de 625588 bytes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general al uso de células inmunoefectoras (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) modificadas para expresar un Receptor de Antígeno Quimérico (CAR, por sus siglas en inglés) para tratar una enfermedad asociada con la expresión de la proteína de la Agrupación de Diferenciación 123 (CD123).

Antecedentes de la invención

La mayoría de los pacientes con leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés) no se pueden curar utilizando la terapia estándar (Mrozek et al., 2012, J Clin Oncol, 30:4515-23) y aquellos con AML recurrente o refractaria (RR-AML, por sus siglas en inglés) tienen un pronóstico especialmente malo (Kern et al., 2003, Blood 2003, 101:64-70; Wheatley et al., 1999, Br J Haematol, 107:69-79).

La modificación genética puede conferir a los linfocitos T especificidad respecto a una diana preferida. Los linfocitos T se pueden transducir con material genético que codifica un fragmento variable monocatenario (scFv) de un anticuerpo, junto con una molécula de señalización, y utilizar de esta manera la región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) para reconocer un antígeno de la superficie celular de una manera no restringida por MHC. Estas células se denominan linfocitos T con un receptor antigénico quimérico (CAR). Los esfuerzos preclínicos y clínicos por actuar sobre al menos 20 moléculas superficiales diferentes en diversas neoplasias malignas han logrado una cierta actividad, sin embargo a menudo se han visto limitados por una persistencia deficiente del producto de tipo linfocito T CAR infundido (Sadelain et al., 2009, Curr Opin Immunol 2009, 21:215-23). El reciente éxito con linfocitos T redirigidos anti-CD19 en pacientes con CLL y ALL avanzadas (Porter et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Transl Med, 3:95ra73; Grupp and Kalos, 2013, N Engl J Med, 368:1509-18) ha demostrado que estas células pueden erradicar una importante carga tumoral después de una única infusión con una remisión de hasta 3 años hasta la fecha, lo que subraya el importante potencial de la terapia con linfocitos T CAR. Ha habido unos pocos esfuerzos preclínicos para actuar sobre AML en modelos en animales (Marin et al., 2010, Haematologica, 95:2144-52; Tettamanti et al., 2013, Br J Haematol, 161:389-401) aunque un pequeño ensayo clínico publicado recientemente ha demostrado que es factible producir e infundir linfocitos T en pacientes con una neoplasia maligna agresiva (Ritchie et al., 2013, Mol Ther, 21:2122-9). Además de la capacidad del receptor antigénico quimérico de los linfocitos T modificados genéticamente de reconocer y destruir las células diana, una terapia con linfocitos T terapéuticos exitosa necesita tener la capacidad de proliferar y persistir a lo largo del tiempo, y de ser susceptible de control posteriormente para detectar recaídas. Los linfocitos T pueden tener una eficacia variable debido a anergia, supresión o agotamiento pero los técnicos expertos tienen un control limitado respecto a estas características en este momento. Para que sean efectivos, los linfocitos T de pacientes transformados con CAR necesitan persistir y mantener la capacidad de proliferar en respuesta al antígeno. Se ha mostrado que los linfocitos T de pacientes con ALL realizan pueden hacer esto con CART19 que comprende un scFv murino (remítase, por ejemplo, a Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013).

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la divulgación presenta una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), donde el CAR comprende un dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humano o humanizado), un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria). En un caso, el CAR comprende un dominio de unión a CD123 descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humano o humanizado descrito en la presente), un dominio transmembrana descrito en la presente, y un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria).

En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado (por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humano o humanizado) comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9). En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2, 6 o 9. En un caso, el dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 2, 6 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2, 6 o 9; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, 6 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2, 6 o 9.

En otros casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una CDR1 de HC, una CDR2 de HC, y una CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9. En algunos casos, el dominio de unión a CD33 comprende además una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, y una CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9.

En algunos casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una, dos o todas las CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2 o 9, y una, dos o todas las CDR1 de HC, CDR2 de HC, y CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9.

En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483 y 485. En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado (por ejemplo, un scFv) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de 157-160, 184-215, 478, 480, 483 y 485, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483 y 485.

En otro caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 216-219 o 243-274, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de las SEQ ID NO: 216-219 o 243-274 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a las SEQ ID NO: 216-219 o 243-274. En otro caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la región variable de la cadena pesada de las SEQ ID NO:478, 480, 483 o 485, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de la porción correspondiente de las SEQ ID NO: 478, 480, 483 o 485, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la porción correspondiente de las SEQ ID NO: 478, 480, 483 o 485.

En otro caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 275-278 o 302-333, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de las SEQ ID NO: 275-278 o 302-333 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a las SEQ ID NO: 275-278 o 302-333. En otro caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la región variable de la cadena ligera de las SEQ ID n O:478, 480, 483 o 485, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de la porción correspondiente de las SEQ ID NO: 478, 480, 483 o 485, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la porción correspondiente de las SEQ ID NO: 478, 480, 483 o 485.

En un caso, la molécula de ácido nucleico que codifica el scFv comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 479, 481,482, 484, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera, donde dicha secuencia de nucleótidos comprende una porción de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 479, 481, 482 y 484, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas, que corresponde a la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera. En un caso, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera, donde la secuencia de aminoácidos codificada se selecciona del grupo constituido por las SEQ ID NO: 157-160, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico codifica un scFv que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 184-215, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera, donde la secuencia de aminoácidos codificada se selecciona del grupo constituido por las SEQ ID NO: 184-215, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4 (SEQ ID NO:26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligeraconector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

En un caso, el CAR codificado incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína, por ejemplo, una proteína descrita en la presente, por ejemplo, seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, Cd45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 6. En un caso, el dominio transmembrana codificado comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita en la presente. En un caso, la región de bisagra codificada comprende la SEQ Id NO: 2 , o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica la región de bisagra comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio coestimulador. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización primaria. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primaria.

En un caso, el dominio coestimulador codificado es un dominio de señalización funcional de una proteína, por ejemplo, que se describe en la presente, por ejemplo, que se selecciona del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de la activación linfocitaria (proteínas SLAM, por sus siglas en inglés), receptores de linfocitos NK ^{activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40,}Cd2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), lTbR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.

En un caso, el dominio coestimulador codificado de 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En un caso, el dominio coestimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:7. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En otro caso, el dominio coestimulador codificado de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En un caso, el dominio coestimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:43. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de CD28 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 44 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En otro caso, el dominio coestimulador codificado de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En un caso, el dominio coestimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de CD27 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En otro caso, el dominio coestimulador codificado de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45. En un caso, el dominio coestimulador codificado de ICOS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:45. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de ICOS comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 46 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente.

En algunos casos, el dominio de señalización primaria codificado comprende un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En algunos casos, el dominio de señalización funcional de CD3 zeta comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 (CD3 zeta mutante) o la SEQ ID NO: 10 (CD3 zeta humano natural) o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de 4-1BB comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de CD27 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o la secuencia de aminoácidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de CD27 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de CD28 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o la secuencia de aminoácidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la sEq ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de CD28 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 44, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de ICOS y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y/o la secuencia de aminoácidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la sEq ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 45 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de ICOS comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 46, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta, y/o la secuencia de nucleótidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el constructo CAR que comprende una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita en la presente, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 que comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, una CDR3 de Lc, una cDr1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humano o humanizado descrito en la Tabla 2, 6 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con este; una región de bisagra descrita en la presente, por ejemplo, una región de bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; un dominio transmembrana descrito en la presente, por ejemplo, un dominio transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente (por ejemplo, un dominio coestimulador de 4-1BB que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o un dominio coestimulador de CD27 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8), y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización primaria descrito en la presente (por ejemplo, un dominio estimulador de CD3 zeta que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10). En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el constructo CAR incluye una secuencia líder codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 12, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (por ejemplo, está constituida por) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos CAR de la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID No: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156; o un aminoácido que tiene una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155,o SEQ ID NO: 156; o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155,o SEQ ID NO: 156.

En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (por ejemplo, está constituida por) una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, o SEQ ID NO:97 o una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% respecto a una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, o SEQ ID NO:97.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un dominio de unión a CD123, donde el dominio de unión a CD123 comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humano o humanizado que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC.

En otros casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una CDR1 de HC, una CDR2 de HC, y una CDR3 de HC de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada enumerada en la Tabla 2, 6 o 9. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 comprende además una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, y una CDR3 de LC de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumerada en la Tabla 2, 6 o 9.

En algunos casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una, dos o la totalidad de CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9, y una, dos o la totalidad de CDR1 de HC, CDR2 de HC, y CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9.

En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en la SEQ ID NO: 275-278 o 302-333) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en las SEQ ID NO:216-219 o 243-274). En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de en las SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483 o 485. En un caso, el dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en las SEQ ID NO: 275-278 o 302-333, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 275-278 o 302-333; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en las SEQ ID NO: 216-219 o 243-274, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos en las SEQ ID NO: 216-219 o 243-274.

En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:480, SEQ ID NO:483 y SEQ ID NO:485, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD123 codificado incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligeraconector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

Polipéptidos

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula polipeptídica aislada codificada por la molécula de ácido nucleico. En un caso, la molécula polipeptídica aislada comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, y SEQ ID NO: 156, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de un receptor antigénico quimérico (CAR) aislada (por ejemplo, polipéptido) que comprende un dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano o humanizado que se une específicamente a CD123), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria). En un caso, el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a CD123 descrito en la presente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano o humanizado que se une específicamente a CD123 tal como se describe en la presente), un dominio transmembrana descrito en la presente y un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria descrito en la presente).

En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9). En un caso, el dominio de unión a CD123 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 2, 6 o 9. En un caso, el dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 2, 6 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos proporcionada en la Tabla 2, 6 o 9; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, 6 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos proporcionada en la Tabla 2, 6 o 9.

En otros casos, el dominio de unión a CD123 comprende una CDR1 de HC, una CDR2 de HC, y una CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada proporcionadas en la Tabla 2, 6 o 9. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 comprende además una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, y una CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9.

En algunos casos, el dominio de unión a CD123 comprende una, dos o la totalidad de CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9, y una, dos o la totalidad de CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9.

En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:480, SEQ ID NO:483 y SEQ ID NO:485; o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente. En un caso, el dominio de unión a CD123 es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD123 incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

En un caso, la molécula de CAR aislada comprende un dominio transmembrana de una proteína, por ejemplo, una proteína descrita en la presente, por ejemplo, seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 6. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

En un caso, el dominio de unión a CD123 está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita en la presente. En un caso, la región de bisagra codificada comprende la SEQ ID NO: 2, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, la molécula CAR aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente.

En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de la molécula CAR aislada comprende un dominio coestimulador. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de la molécula CAR aislada comprende un dominio de señalización primaria. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular de la molécula c Ar aislada comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primaria.

En un caso, el dominio coestimulador comprende un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de la activación linfocitaria (proteínas SLAM), receptores de linfocitos NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, Cd 27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.

En un caso, el dominio coestimulador de 4-1BB comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En otro caso, el dominio coestimulador de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:43. En otro caso, el dominio coestimulador de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8. En otro caso, el dominio coestimulador de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:45.

En algunos casos, el dominio de señalización primaria comprende un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En algunos casos, el dominio de señalización funcional de CD3 zeta comprende la SEQ ID NO: 9 (CD3 zeta mutante) o la SEQ ID NO: 10 (CD3 zeta humano natural) o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SeQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD27 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD28 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o la secuencia de aminoácidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de ICOS y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y/o la secuencia de aminoácidos CD3 zeta de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381 y/o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En un caso, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 45 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

En un caso, la molécula de CAR aislada comprende además una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita en la presente. En un caso, la secuencia líder comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula CAR aislada que comprende una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita en la presente, por ejemplo, una secuencia líder de la SEQ ID NO: 1, o que tiene una identidad de un 95-99% con esta, un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 que comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, una CDR3 de LC, una CDR1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 descrito en la Tabla 2 o 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con este, una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita en la presente, por ejemplo, una región de bisagra de la SEQ ID NO: 2, o que tiene una identidad de un 95-99% con esta, un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana descrito en la presente, por ejemplo, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia que tiene una identidad de un 95-99% con esta, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria). En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente, por ejemplo, un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7, o que tiene una identidad de un 95-99% con esta, y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización primaria descrito en la presente, por ejemplo, un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o que tiene una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en la presente, por ejemplo, un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7, y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización primaria descrito en la presente, por ejemplo, un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

En un caso, la molécula CAR aislada comprende (por ejemplo, está constituida por) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, y SEQ ID NO: 156, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, 10, 15, 20 o 30 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 60, 50 o 40 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, y SEQ ID NO: 156, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, y SEQ ID NO: 156.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un dominio de unión a CD123 que comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC (por ejemplo, una, dos o tres CDR de HC de acuerdo con las Tablas 3, 7, 10 o 12; y/o una, dos o tres CDR de LC de acuerdo con las Tablas 4, 8, 11 o 13).

En otros casos, el dominio de unión a CD123 comprende una CDR1 de HC, una CDR2 de HC, y una CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 comprende además una CDR1 de LC, una CDR2 de LC y una CDR3 de LC. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 codificado comprende una CDR1 de LC, una CDR2 de LC, y una CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9.

En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende una región variable de la cadena ligera descrita en la presente (por ejemplo, en las SEQ ID NO:275-278 o 302-333) y/o una región variable de la cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, en las SEQ ID NO:216-219 o 243-274). En un caso, el dominio de unión a CD123 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:157-160, 184-215, 478, 480, 483 o 485. En un caso, el dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en las SEQ ID NO: 275-278 o 302-333, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos en las SEQ ID NO: 275-278 o 302-333; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en las SEQ ID NO: 216-219 o 243-274, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a una secuencia de aminoácidos en las SEQ ID NO: 216-219 o 243-274.

En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:480, SEQ ID NO:483, y SEQ ID NO:485, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD123 es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, 6 o 9, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD123 incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

Ácidos nucleicos, vectores y células

Las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente pueden ser una molécula de ADN, una molécula de ARN o una combinación de estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico es un ARNm que codifica un polipéptido CAR tal como se describe en la presente. En otros casos, la molécula de ácido nucleico es un vector que incluye cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En otro caso, el vector se selecciona del grupo constituido por una molécula de ADN o una molécula de ARN (por ejemplo, un plásmido, un vector lentivírico, un vector adenovírico o un vector retrovírico).

En un caso, el vector es un vector lentivírico. En un caso, el vector comprende además un promotor. En un caso, el promotor es un promotor EF-1. En un caso, el promotor EF-1 comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 11. En otro caso, el promotor es un promotor de PGK, por ejemplo, un promotor de PGK truncado tal como se describe en la presente.

En un caso, el vector es un vector transcrito in vitro, por ejemplo, un vector que transcribe ARN de una molécula de ácido nucleico descrita en la presente. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una cola de poli(A), por ejemplo, una cola de poli A descrita en la presente (por ejemplo, que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina (SEQ ID NO: 705)). En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una 3'UTR, por ejemplo, una 3 'UTR descrita en la presente, por ejemplo, que comprende al menos una repetición de una 3'UTR procedente de beta-globulina humana. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además un promotor, por ejemplo, un promotor de T2A.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una célula que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector, o que expresa un polipéptido CAR tal como se describe en la presente. En un caso, la célula es una célula descrita en la presente, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T o linfocito NK humanos, por ejemplo, un linfocito T o linfocito Nk humanos tal como se describen en la presente, o una población celular de estos). En un caso, el linfocito T humano es un linfocito T CD8+. En algunos casos, la célula expresa el ácido nucleico o polipéptido CAR, o en algún momento expresó el ácido nucleico o polipéptido CAR (por ejemplo, una molécula CAR expresada de manera transitoria).

En algunos casos, la célula (por ejemplo, la célula que expresa CAR) descrita en la presente puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agente puede ser una molécula quimérica que comprende una molécula inhibidora o un dominio de esta. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CeAc AM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR (por ejemplo, TGFRbeta), por ejemplo, tal como los descritos en la presente. En un caso, la molécula quimérica comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR (por ejemplo, TGFRbeta), o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de cualquiera de estos) y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como los descritos en la presente) y/o un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito en la presente). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta tal como se describe en la presente).

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para generar una célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria. El método incluye introducir en, por ejemplo, transducir, la célula efectora inmunitaria con una molécula de ácido nucleico descrita en la presente (por ejemplo, una molécula de ARN, por ejemplo, un ARNm), o un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente.

La presente divulgación también proporciona un método para generar una población de células (por ejemplo, células modificadas con ARN de manera transitoria que expresan un ARN exógeno). El método incluye la introducción en la célula de un ARN tal como se describe en la presente (por ejemplo, un ARN transcrito in vitro o ARN sintético; una secuencia de ARNm que codifica un polipéptido CAR tal como se describe en la presente). En algunos casos, el ARN expresa el polipéptido CAR de manera transitoria. En un caso, la célula es una célula tal como se describe en la presente, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK o una población celular).

Usos terapéuticos

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para proporcionar una inmunidad antitumoral a un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una célula que expresa una molécula CAR descrita en la presente. En un caso, la célula es una célula efectora inmunitaria autóloga, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. En un caso, la célula es una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. En un caso, el mamífero es un ser humano, por ejemplo, un paciente con un cáncer hematológico.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar a un mamífero que padece una enfermedad asociada con la expresión de CD123 (por ejemplo, una enfermedad proliferativa, una afección precancerosa o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD123). El método incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en la presente. En un caso, el mamífero es un ser humano, por ejemplo, un paciente con un cáncer hematológico.

En un caso, la enfermedad es una enfermedad descrita en la presente. En un caso, la enfermedad asociada con la expresión de CD123 se escoge entre: una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o una neoplasia maligna; una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD123. En un caso, la enfermedad es un cáncer hematológico.

En otros casos, la enfermedad se escoge entre una o más leucemias agudas, que incluyen, sin carácter limitante, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL, por sus siglas en inglés), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (leucemia linfoide aguda de linfocitos B, BALL, por sus siglas en inglés) y leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (leucemia linfoide aguda de linfocitos T (TALL, por sus siglas en inglés)); síndrome mielodisplásico; una neoplasia mieloproliferativa; un trastorno histiocítico (por ejemplo, un trastorno de mastocitos o una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas); un trastorno de los mastocitos, por ejemplo, mastocitosis sistémica o leucemia de mastocitos; una leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés); y una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas. En otros casos, la enfermedad asociada con la expresión de CD123 incluye, sin carácter limitante, cáncer atípico y/o no clásico, una neoplasia maligna, una afección precancerosa o una enfermedad proliferativa que expresa CD123; y una combinación de estos.

En un caso, la enfermedad se escoge entre uno o más de leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (leucemia linfoide aguda de linfocitos B, BALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (leucemia linfoide aguda de linfocitos T (TALL)), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés), tricoleucemia, linfoma de Hodgkin, un trastorno de mastocitos, un trastorno histiocítico, un síndrome mielodisplásico, una neoplasia mieloproliferativa, un mieloma de células plasmáticas, una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, o una combinación de estos. En un caso, la enfermedad es una leucemia, por ejemplo, ALL (por ejemplo, ALL recurrente y refractaria) o AML. En otros casos, la enfermedad es un cáncer negativo para CD19, por ejemplo, un cáncer recurrente negativo para CD19.

En algunos casos de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, comprende un vector, por ejemplo, un vector lentivírico, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR tal como se describe en la presente.

En otros casos de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, comprende un ARNm que codifica el polipéptido CAR tal como se describe en la presente. En un caso, la célula es una población de células modificadas con ARN que expresa CAR, por ejemplo, una población de células con expresión transitoria.

En algunos casos de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, el método incluye además administrar una o más dosis de una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria que contiene un ácido nucleico de CAR o polipéptido CAR tal como se describe en la presente) a un mamífero (por ejemplo, un mamífero que padece un cáncer, por ejemplo, un cáncer hematológico tal como se describe en la presente (por ejemplo, AML o ALL)). En algunos casos, la una o más dosis de células CAR (por ejemplo, células CAR CD123) comprende al menos aproximadamente 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, o 5 x 109 células.

En un caso, se administran hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 dosis de células. En otros casos, se administran una, dos, tres, cuatro, cinco o 6 dosis de las células al mamífero, por ejemplo, en un intervalo de tratamiento de una, dos, tres, cuatro o más semanas. En un caso, se administran hasta 6 dosis en dos semanas. Las dosis pueden ser idénticas o diferentes. En un caso, se administra inicialmente una dosis inferior seguida por una o más dosis superiores. En un caso a modo de ejemplo, la dosis inferior es de aproximadamente 1x 105 a 1x 109 células/kg, o de 1x 106 a 1x 108 células/kg; y la dosis superior es de aproximadamente 2x105 a 2x109 células/kg o de 2x106 a 2x108 células/kg, seguida por 3-6 dosis de aproximadamente 4x105 a 4x109 células/kg, o de 4x106 a 4x108 células/kg.

En un caso, la una o más dosis de las células se administran después de una o más terapias linforreductoras, por ejemplo, una quimioterapia linforreductora. En un caso, la terapia linforreductora incluye una quimioterapia (por ejemplo, ciclofosfamida).

En un caso, la una o más dosis están seguidas por un trasplante de células, por ejemplo, un trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas. Por ejemplo, el trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas ocurre entre aproximadamente 20 y aproximadamente 35 días, por ejemplo, entre aproximadamente 23 y 33 días.

En algunos casos, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con uno o más agentes o procedimientos terapéuticos tal como los descritos en la presente.

En un caso, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con un agente que incrementa la eficacia de una célula que expresa una molécula c A r , por ejemplo, un agente descrito en la presente.

En un caso, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con una dosis baja, de potenciación inmunitaria de un inhibidor de mTOR. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que el tratamiento con una dosis baja, de potenciación inmunitaria, (por ejemplo, una dosis que es insuficiente para suprimir por completo el sistema inmunitario pero suficiente para mejorar la función inmunitaria) está acompañado por un descenso en linfocitos T positivos para PD-1 o un incremento en linfocitos negativos para PD-1. Los linfocitos T positivos para PD-1, pero no los linfocitos T negativos para PD-1, se pueden agotar mediante unión con células que expresan un ligando de PD-1, por ejemplo, PD-L1 o PD-L2.

En este caso, se puede utilizar esta estrategia para optimizar el rendimiento de células CAR descritas en la presente en el sujeto. Aunque sin desear ceñirse a la teoría, se cree que, en un caso, se mejora el rendimiento de células efectoras inmunitarias no modificadas, endógenas, por ejemplo, linfocitos T. Aunque sin desear ceñirse a la teoría, se cree que, en un caso, se mejora el rendimiento de una célula que expresa CAR CD123. En otros casos, las células, por ejemplo, linfocitos T, que tienen, o se modificarán para expresar un CAR, se pueden tratar ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que incrementa el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD1 (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), o incrementa la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos Nk .

En un caso, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK. En un caso, las células CAR se administran después de un tiempo suficiente, o una dosificación suficiente, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, se haya incrementado, al menos de manera transitoria.

En un caso, la célula, por ejemplo, célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) que se va a modificar para expresar un CAR, se recolecta después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente con la dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos n K, en el sujeto o recolectadas del sujeto se haya incrementado, al menos de manera transitoria.

En un caso, la divulgación proporciona un inhibidor de mTOR para su uso en el tratamiento de un sujeto, donde dicho inhibidor de mTOR potencia una respuesta inmunitaria de dicho sujeto, y donde dicho sujeto ha recibido o está recibiendo 0 está a punto de recibir una célula efectora inmunitaria que expresa un CAR CD123 tal como se describe en la presente.

En otro caso, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, un agente descrito en la presente.

En un caso, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con un agente que trata la enfermedad asociada con CD123, por ejemplo, un agente descrito en la presente.

En un caso, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con un segundo agente o procedimiento terapéutico escogido entre uno o más de quimioterapia, una terapia anticancerosa dirigida, un fármaco oncolítico, un agente citotóxico, una citocina, procedimiento quirúrgico, un procedimiento con radiación, un agonista de una molécula coestimuladora, un inhibidor de una molécula que es un punto de control inmunitario, una vacuna o una segunda inmunoterapia basada en CAR.

En un caso, las células, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con un agonista de una molécula coestimuladora, por ejemplo, un agonista de una molécula coestimuladora escogida entre uno o más de una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de la activación linfocitaria (proteínas SLAM, por sus siglas en inglés), receptores de células NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), ^lT^bR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.

En otros casos, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente) se administra combinada con un inhibidor de una molécula que es un punto de control inmunitario escogida entre uno o más de PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina, TGFR (por ejemplo, TGFR beta), o una combinación de estos.

En un caso, el inhibidor de la molécula que es un punto de control inmunitario o el agonista de la molécula coestimuladora es una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo monoespecífico o una molécula de anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, se puede administrar combinada con un inhibidor de PD-1, un inhibidor de TIM-3, un inhibidor de CEACAM-1, o una combinación de estos. En un caso, el inhibidor de PD-1 y el inhibidor de TIM-3 se administran combinados. En otros casos, el inhibidor de TIM-3 y el inhibidor de CEACAM-1 se administran combinados.

En algunos casos, el inhibidor de la molécula que es un punto de control inmunitario se administra después de la administración de la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, aproximadamente 3 7 días después de la administración de la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias.

Tal como se describe en los Ejemplos en la presente, las células efectoras inmunitarias que expresan CAR 123 han mostrado ser un tratamiento eficaz para recaídas negativas para CD19 (por ejemplo, B-ALL negativo para CD19). Sin desear ceñirse a la teoría, se puede utilizar una estrategia combinatoria de inhibición de CD19 y CAR 123 (por ejemplo, células efectoras inmunitarias que expresan CAR19) para tratar enfermedades positivas para CD19 a la vez que se retrasan o previenen recaídas por pérdida de antígeno.

En consecuencia, en otros casos más de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, se administra combinada con un inhibidor de CD19, por ejemplo, un inhibidor de CD19 tal como se describe en la presente.

En algunos casos, el inhibidor de CD19 es una célula que expresa CAR CD19 o una molécula de anticuerpo anti-CD19. En un caso, la enfermedad es una leucemia, por ejemplo, ALL (por ejemplo, ALL recurrente y refractaria). En otros casos la enfermedad es AML. En otros casos, la enfermedad es un cáncer negativo para CD19, por ejemplo, un cáncer recurrente negativo para CD19.

Como alternativa o en combinación con cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, se proporciona un método para prevenir una recaída negativa para CD19 en un mamífero, por ejemplo, un ser humano. El método incluye administrar una cantidad eficaz de una célula, por ejemplo, una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células que expresan una molécula CAR descrita en la presente). En algunos casos, el método incluye además administrar un inhibidor de CD19, por ejemplo, una célula que expresa CAR CD19. En algunos casos, la enfermedad es una leucemia, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (por ejemplo, ALL recurrente y refractaria) o AML.

En algunos casos, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, se administra antes, de manera simultánea o a la vez, o después de la administración del inhibidor de CD19. En algunos casos, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, se administra después de la administración del inhibidor de CD19. En otros casos, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, se administra a la vez que el inhibidor de CD19.

En algunos casos, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, expresa un CAR CD129 y el CAR CD123 (por ejemplo, un CAR tal como se ha descrito en la presente).

Sin desear ceñirse la teoría, se ha observado que ciertas células leucémicas (por ejemplo, blastos B-ALL) coexpresan CD19 y CD123, mientras que las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) son normalmente positivas para CD123 (CD123+), pero negativas para CD19 (CD19-). Con el fin de tener como diana células leucémicas que coexpresan CD19 y CD123 (por ejemplo, blastos B-ALL) sin afectar a las HSC, se puede utilizar un CAR dividido donde los dominios intracelulares funcionales se separan entre CAR19 y CAR123. Tales moléculas CAR provocarían una activación total de la célula inmunitaria preferentemente cuando las células diana coexpresan CD19 y CD123 (por ejemplo, blastos B-ALL), a diferencia de una célula que expresa uno de CD19 o CD123 (por ejemplo, HSC).

En consecuencia, en algunos casos, el CAR CD19 o CAR CD123 comprende un dominio de señalización intracelular dividido de modo que la activación total de la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, ocurre cuando tanto CAR CD19 como CAR CD123 se unen a una célula diana, por ejemplo, una célula diana CD19+CD123+ (por ejemplo, un blasto B-ALL), en comparación con la activación cuando el CAR CD19 y CAR CD123 se unen a una célula diana que expresa solo uno de CD19 o CD123 (por ejemplo, una célula madre hematopoyéticas). En un caso, el CARCD123 comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio de señalización de 4-1BB, y el CAR CD19 comprende un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta. En algunos casos, el CARCD123 comprende un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta, y el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio de señalización de 4-1BB. El CARCD123 y el CAR CD19 pueden estar ligados opcionalmente, por ejemplo, a uno o más sitios de escisión peptídica tales como P2A.

En otros casos más, los métodos divulgados en la presente incluyen además administrar un agente de disminución de linfocitos T tras el tratamiento con la célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria tal como se describe en la presente), para reducir de esta manera (por ejemplo, disminuir) las células que expresan CAR (por ejemplo, las células que expresan CARCD123). Tales agentes de disminución de los linfocitos T se puede utilizar para disminuir de manera eficaz células que expresan CAR (por ejemplo, células que expresan CARCD123) para mitigar la toxicidad.

Por ejemplo, como alternativa o en combinación con los métodos divulgados en la presente, se divulga un método para reducir (por ejemplo, disminuir) una célula que expresa CAR después de una terapia con CAR (por ejemplo, una terapia con CAR123 divulgada en la presente). El método incluye administrar a un mamífero un agente de disminución de linfocitos T, en una cantidad que reduzca (por ejemplo, disminuya) las células que expresan CAR. En algunos casos, el agente de disminución de linfocitos T se administra después del tratamiento del mamífero con una célula, por ejemplo, una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, una población de células que expresan CAR), para de esta manera reducir (por ejemplo, disminuir) las células (por ejemplo, la célula que expresa CAR).

En algunos casos, el método incluye además trasplantar una célula, por ejemplo, una célula madre hematopoyética, o médula ósea, al mamífero.

En algunos casos, el mamífero padece una leucemia, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda.

En algunos casos, el agente de disminución de linfocitos T se administra una, dos, tres, cuatro o cinco semanas después de la administración de la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, descrita en la presente.

En un caso, el agente de disminución de linfocitos T es un agente que disminuye las células que expresan CAR, por ejemplo, induciendo citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o muerte celular inducida por el complemento. Por ejemplo, las células que expresan CAR descritas en la presente también pueden expresar un antígeno (por ejemplo, un antígeno diana) que es reconocido por moléculas capaces de inducir la muerte celular, por ejemplo, ADCC o muerte celular inducida por el complemento. Por ejemplo, las células que expresan CAR descritas en la presente también pueden expresar una proteína diana (por ejemplo, un receptor) capaz de ser la diana de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los ejemplos de tales proteínas diana incluyen, sin carácter limitante, EpCAM, VEGFR, integrinas (por ejemplo, integrinas avp3, a4, al%p3, a4p7, a5p1, avp3, av), miembros de la superfamilia de receptor de TNF (por ejemplo, TRAIL-R1, TRAIL-R2), receptor de PDGF, receptor de interferón, receptor de folato, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, receptor de IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11 , CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/receptor de IgE, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41 , CD44, CD51 , CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/basigina, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, y EGFR, y versiones truncadas de estos (por ejemplo, versiones que conservan uno o más epítopos extracelulares pero que carecen de una o más regiones dentro del dominio citoplasmático).

En algunos casos, la célula que expresa CAR coexpresa el CAR y la proteína diana, por ejemplo, expresa de manera natural la proteína diana o se modifica para que exprese la proteína diana. Por ejemplo, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, puede incluir un ácido nucleico (por ejemplo, vector) que comprende el ácido nucleico CAR (por ejemplo, un ácido nucleico CAR tal como se describe en la presente) y un ácido nucleico que codifica la proteína diana.

En un caso, el agente de disminución de linfocitos T es un inhibidor de CD52, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-CD52, por ejemplo, alemtuzumab.

En otros casos, la célula, por ejemplo, la población de células efectoras inmunitarias, expresa una molécula CAR tal como se describe en la presente (por ejemplo, CARCD123) y la proteína diana reconocida por el agente de disminución de linfocitos T. En un caso, la proteína diana es CD20. En algunos casos, cuando la proteína diana es CD20, el agente de disminución de linfocitos T es un anticuerpo anti-CD20, por ejemplo, rituximab.

En casos adicionales de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, los métodos incluyen además trasplantar una célula, por ejemplo, una célula madre hematopoyética, o médula ósea, al mamífero.

En otro aspecto, la presente divulgación presenta un método para acondicionar un mamífero antes del trasplante de células. El método incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula que comprende el ácido nucleico CAR tal como se describe en la presente, o el polipéptido tal como se describe en la presente. En algunos casos, el trasplante de células es un trasplante de células madre, por ejemplo, un trasplante de células madre hematopoyéticas, o un trasplante de médula ósea. En otros casos, acondicionar un sujeto antes del trasplante de células incluye reducir el número de células que expresan CD123 en un sujeto, por ejemplo, células normales que expresan CD123 o células cancerosas que expresan CD123.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un CAR de la divulgación, la molécula polipeptídica aislada de un CAR de la divulgación, el vector que comprende un CAR de la divulgación, y la célula que comprende un CAR de la divulgación para su uso como un medicamento, por ejemplo, tal como se describe en la presente (por ejemplo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de CD123).

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un CAR de la divulgación, la molécula polipeptídica aislada de un CAR de la divulgación, el vector que comprende un CAR de la divulgación, y la célula que comprende un CAR de la divulgación para su uso en el tratamiento de una enfermedad que expresa CD123, por ejemplo, una enfermedad que expresa CD123 como se describe en la presente. En ciertos casos, la enfermedad es un cáncer hematológico, por ejemplo, como se describe en la presente. En algunos casos, la enfermedad se escoge entre: una leucemia aguda, que incluye, sin carácter limitante, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL) leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (leucemia linfoide aguda de linfocitos B, BALL) y leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (leucemia linfoide aguda de linfocitos T (TALL)); síndrome mielodisplásico; una neoplasia mieloproliferativa; un trastorno histiocítico (por ejemplo, un trastorno de mastocitos o una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas); un trastorno de los mastocitos, por ejemplo, mastocitosis sistémica o leucemia de mastocitos; una leucemia mieloide crónica (CML); o una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas.

Las características y casos adicionales de las composiciones y métodos mencionados anteriormente incluyen uno o más de los siguientes:

En ciertos casos, la molécula CAR CD123 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD123 o un polipéptido CAR CD123 como se describe en la presente) o el dominio de unión a CD123 como se describe en la presente, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de HC y/o CDR3 de ^hC), que se proporcionan en la Tabla 3; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1 de LC, CDR2 de LC y/o CDR3 de LC) que se proporcionan en la Tabla 4 (por ejemplo, una, dos o tres CDR1 de HC, CDR2 de HC o CDR3 de HC, y/o una, dos o tres CDR1 de LC, CDR2 de LC o CDR3 de LC, de CAR123-1, CAR123-2, CAR123-3, CAR123-4, que se proporcionan en la Tabla 3 o 4); o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD123 o un polipéptido CAR CD123 como se describe en la presente) o el dominio de unión al antígeno anti-CD123 como se describe en la presente, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1 de HC, CDR2 de HC y/o CDR3 de HC), que se proporcionan en la Tabla 10; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera que se proporcionan en la Tabla 11 (por ejemplo, una, dos o tres CDR1 de HC, CDR2 de HC o CDR3 de HC, y/o una, dos o tres CDR1 de LC, CDR2 de LC o CDR3 de LC, de CAR123-1, CAR123-2, CAR123-3, CAR123-4, que se proporcionan en la Tabla 10 u 11); o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123 o el dominio de unión al antígeno anti-CD123, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1H, CDR2H y/o CDR3H), que se proporcionan en la Tabla 12; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera que se proporcionan en la Tabla 13 (por ejemplo, una, dos o tres CDR1 de HC, CDR2 de HC o CDR3 de HC, y/o una, dos o tres cDr1 de LC, CDR2 de LC o CdR3 de LC, de CAR123-1, CAR123-2, CAR123-3, CAR123-4, que se proporcionan en la Tabla 12 u 13); o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras)) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123, o el dominio de unión al antígeno anti-CD 123, incluye

(i) una CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena ligera enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9, o las CDR de LC en la Tabla 4, 8, 11 o 13; y/o

(ii) una CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC de cualesquiera secuencias de aminoácidos del dominio de unión a CD123 de la cadena pesada enumeradas en la Tabla 2, 6 o 9, o las CDR de HC en la Tabla 3, 7, 10 o 12.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123 (por ejemplo, un ácido nucleico CAR CD123 o un polipéptido CAR CD123 como se describe en la presente), o el dominio de unión al antígeno anti-CD123 como se describe en la presente, incluye: (1) una, dos o tres CDR de la cadena ligera (LC) escogidas entre una de las siguientes:

(1) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO:418, CDR2 de LC de la SEQ ID NO:446 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO:474 de CAR123-1;

(ii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO:419, CDR2 de LC de la SEQ ID NO:447 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO:475 de CAR123-2;

(iii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO:420, CDR2 de LC de la SEQ ID NO:448 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO:476 de CAR123-3;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO:421, CDR2 de LC de la SEQ ID NO:449 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO:477 de CAR123-4; y/o

(2) una, dos o tres CDR de la cadena pesada (HC) escogidas entre una de las siguientes:

(i) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO:334, CDR2 de HC de la SEQ ID NO:362 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 390 de CAR123-1;

(ii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 335, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 363 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 391 de CAR123-2;

(iii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 336, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 364 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 392 de CAR123-3;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 337, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 365 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 393 de CAR123-4.

(1) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO:501, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 506 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 511 de CAR123-1;

(ii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 502, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 507 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 512 de CAR123-2;

(iii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 503, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 508 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 513 de CAR123-3;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 504, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 509 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 514 de CAR123-4; y/o

(i) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO:486, CDR2 de HC de la SEQ ID NO:491 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 496 de CAR123-1;

(ii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 487, CDR2 de HC de la SEQ ID NO:492 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 497 de CAR123-2;

(iii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 488, CDR2 de HC de la SEQ ID NO:493 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 498 de CAR123-3;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 489, CDR2 de HC de la SEQ ID NO:494 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 499 de CAR123-4.

(1) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO:531, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 536 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 541 de CAR123-1;

(ii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 532, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 537 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 542 de CAR123-2;

(iii) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 533, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 538 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 543 de CAR123-3;

(iv) una CDR1 de LC de la SEQ ID NO: 534, CDR2 de LC de la SEQ ID NO: 539 y CDR3 de LC de la SEQ ID NO: 544 de CAR123-4; y/o

(i) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO:516, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 521 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 526 de CAR123-1;

(ii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 517, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 522 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 527 de CAR123-2;

(iii) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 518, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 523 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 528 de CAR123-3;

(iv) una CDR1 de HC de la SEQ ID NO: 519, CDR2 de HC de la SEQ ID NO: 524 y CDR3 de HC de la SEQ ID NO: 529 de CAR123-4.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado con el que los entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o evaluación de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Los encabezamientos, subencabezamientos o elementos con números o letras, por ejemplo, (a), (b), (i) etc, se presentan únicamente para facilitar la lectura. El uso de encabezamientos o elementos con números o letras en este documento no requiere que los pasos o elementos se realicen en orden alfabético ni que los pasos o elementos sean necesariamente discretos entre sí. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Ciertos casos de la presente divulgación proporcionan realizaciones de la presente invención. Más en particular, la presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La siguiente descripción detallada de los casos de la divulgación, incluidas las realizaciones preferidas de la invención, se entenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Con el objetivo de ilustrar la invención, se muestran en los dibujos las realizaciones que se prefieren en la presente. Se entenderá, sin embargo, que la invención no se limita a las disposiciones e instrumentalidades de las realizaciones que se muestran en los dibujos.

La Figura 1 muestra una representación gráfica de la expresión de CAR en células JNL transducidas con constructos CAR anti-CD123 según se evalúa por FACS y se presenta como el porcentaje de células que muestran señal por encima del nivel de la señal en células no traducidas (negativas para CAR) utilizando Proteína L como reactivo de detección.

La Figura 2, que comprende las Figuras 2A, 2B y 2C, muestra representaciones gráficas de actividad CAR CD123 en células JNL. Se evaluaron los constructos CAR anti-CD123 para determinar la actividad utilizando una línea de células Jurkat que contenía el indicador luciferasa impulsado por el promotor de NFAT (denominadas células JNL). La actividad CAR se mide como la activación de este indicador impulsado por NFAT.

La Figura 3 muestra una representación gráfica de la expresión de CAR CD123 en linfocitos T primarios. El porcentaje de células transducidas (que expresan el CAR anti-CD123 en la superficie celular) y su intensidad de fluorescencia relativa de expresión se determinaron mediante análisis por citometría de flujo en un BD LSRFortessa o BD-FACSCanto utilizando Proteína L como reactivo de detección. La selección de las gráficas de tipo histograma de intensidad de fluorescencia relativa del FACS para la señal por encima de la de las células no teñidas muestra el porcentaje de linfocitos T transducidos. La transducción dio como resultado un intervalo de células positivas para CAR de un 12-42%.

La Figura 4 muestra una representación gráfica de muerte celular mediada por CART-CD123. La muerte por linfocitos T se dirigió a células de leucemia mielógena aguda MOLM13 que expresaban CD123 que expresaban de manera estable la luciferasa. Los linfocitos T no transducidos se utilizaron para determinar los niveles de muerte no específica de fondo. Se midieron las actividades citolíticas de CART-CD123 en un intervalo de proporciones efector:célula diana de 4:1 y diluciones decrecientes con un factor de 2 de linfocitos T donde se definieron los efectores como linfocitos T que expresaban el receptor quimérico anti-CD123. Los ensayos se iniciaron mezclando un número apropiado de linfocitos T con un número constante de células diana. Se midió la señal de la luciferasa después de 20 horas utilizando el ensayo de luciferasa Bright-Glo™ en el instrumento EnVision.

Las Figuras 5A y 5B muestran la eficacia de transducción de linfocitos T con CAR-CD123. La Figura 5A muestra la eficacia de transducción de linfocitos T con 1172 y 1176. La Figura 5B muestra la eficacia de transducción de linfocitos T con los CAR CD1232-4.

La Figura 6 muestra la citometría de flujo de los CAR CD1232-4 y 1172 y 1176 para determinar la proporción CD4:CD8.

La Figura 7 (proporcionada en las Figuras 7-1,7-2 y 7-3) muestra la desgranulación de los CAR CD1232-4 y 1172 y 1176 tras la exposición a células tumorales CD123+.

La Figura 8 muestra una representación gráfica de un ensayo de luciferasa para evaluar la citotoxicidad de los linfocitos CART (clones NVS 2-4, 1172 y 1176) respecto a las células diana tumorales (MOLM14).

La Figura 9 muestra una comparación de la carga tumoral en ratones NSG inyectados con células MOLM14 que expresan luciferasa en D6 (antes de la inyección de CART) y en el día 13 (6 días después de la inyección con los clones nVs 2-4, 1172 o 1176) o en el día 20.

La Figura 10 muestra la expresión de CD30 y CD123 en la línea celular de linfoma de Hodgkin HDLM-2.

Las Figuras 11A y 11B muestran la expresión de CAR CD123 en linfocitos T transducidos con anti-CD123-41BB-CD3Z mediante la detección de dsRed, un marcador indirecto de CD123 mediante la coexpresión de T2A. Se detectó dsRed mediante citometría de flujo.

La Figura 12 muestra Q-PCR en la expresión de CD123 en 4 líneas celulares de linfoma de Hodgkin (HDLM2, KMH2, L428, SUPHD1), MOLM14 CD123+ (control positivo) y A375 (control negativo). Se utilizó GUSB como gen constitutivo. El umbral Ct fue 40.

La Figura 13 muestra el efecto de un anticuerpo para IL3 en un modelo in vivo del linfoma de Hodgkin. Se sometieron a un injerto ratones KO NOD-SCID-cadena-Y que sobreexpresan citocinas humanas que incluyen IL-3 (ratones NSG-S) con la línea celular HDLM-2 que expresaba luciferasa. Después de la inyección i.v., las células neoplásicas formaron de manera progresiva masas de tejido blando diseminadas. Las inyecciones en serie de un anticuerpo anti-IL3 neutralizante ralentizaron el crecimiento del tumor.

La Figura 14 muestra un ensayo de desgranulación con CD107a. Se incubaron linfocitos T no transducidos (UTD) o CART123 con HDLM-2 (línea celular CD123+ HL) durante 4 horas con una proporción de 5 células diana para 1 linfocito T en presencia de anticuerpos anti-CD28, anti-CD49d y monensina. Se utilizaron linfocitos T CAR anti-CD30 como controles adicionales. Con la detección por citometría de flujo se observó que CART123 pero no UTD mostraron una mayor desgranulación con CD107a.

La Figura 15 muestra una representación gráfica del ensayo de desgranulación que se muestra en la Figura 20.

La Figura 16 demuestra que los linfocitos T que expresan CAR CD123 muestran un incremento significativo en la producción de citocinas intracitoplasmáticas (IL-2, TNF).

La Figura 17 demuestra que CART123, pero no UTD, mostraron una muerte dependiente de la dosis tal como muestra el descenso de la emisión bioluminiscente en un ensayo de muerte de 24 h con luciferasa. Los linfocitos T se coincubaron con células HDML-2 luciferasa+ con diferentes proporciones (0,3:1 - 10:1).

La Figura 18 muestra que los linfocitos CART123 y CART30 pero no los UTD mostraron una proliferación enérgica cuando se cocultivan con líneas celulares de linfoma de Hodgkin en un ensayo de proliferación. Los linfocitos T se incubaron con líneas celulares HL (CD123+) o controles (Jurkat CD123- , MOLM-14 ^cD123+) o PMA/Ionomicina (control positivo) o medio celular (control negativo) en un ensayo de proliferación de linfocitos T de 5 días.

La Figura 19, que comprende las Figuras 19A, 19B, 19C y 19D muestra que CART123 induce la producción enérgica de IFNg (Fig. 19A), IL-2 (Fig. 19B), TNFa (Fig. 19C) y MIP1b (Fig. 19D), se muestran MFI de luminex.

La Figura 20 muestra una representación esquemática de un modelo in vivo del linfoma de Hodgkin. Se inyectaron i.v. 1 millón de células HDLM-2 luciferasa+ en el día 0. A continuación, se realizó una obtención de imágenes bioluminiscentes en serie (BLI, por sus siglas en inglés) demostrada para observar el nivel tumoral. Se observó un nivel bajo del tumor en el día 7, y después un incremento gradual en la carga tumoral a lo largo de aproximadamente 6 semanas, que reproduce la naturaleza indolente de la enfermedad humana. En el día 43 cuando la carga tumoral era 20 veces más elevada que al inicio, los ratones se trataron con 1,5 millones de linfocitos CART123 o linfocitos T de control.

La Figura 21 muestra BLI para detectar HDLM-2 días después de la inyección en ratones tratados con linfocitos CART123, linfocitos T de control, o no tratados, de acuerdo con la representación esquemática en la Figura 28.

La Figura 22 muestra la supervivencia de ratones tratados de acuerdo con la representación esquemática que se muestra en la Figura 28, CART123 indujo una erradicación completa y duradera del tumor diseminado en un periodo de 14 días como máximo, lo que conlleva a una supervivencia global de un 100% y una ausencia de recaídas de un 100% a los 6 meses.

La Figura 23 muestra una asociación entre la eliminación tumoral y expansión de linfocitos T CAR importante según se detectó por citometría de flujo en extracciones de sangre periférica en serie. Los linfocitos T expandidos fueron aproximadamente un 50% de células CD8 y un 50% de células CD4. El número de linfocitos T se redujo con el tiempo según disminuyó la carga tumoral.

La Figura 24, que comprende las Figuras 24A, 24B y 24C, está constituida por gráficas de barras que muestran la producción de citocinas a partir de linfocitos T que expresan constructos CAR123 (CD123-2, CD123-3 y CD123-4) cuando se cultivan con células diana MOLM13, PL21 y U87 con las proporciones indicadas. La Figura 24A muestra la producción de IL-2; la Figura 24B muestra la producción de IFN-gamma; y la Figura 24C muestra la producción de TNF-alfa.

La Figura 25 es un gráfico de barras que muestra la capacidad de proliferación de linfocitos T transducidos con lentivirus que expresan CAR123-2 (LV CAR123-2) o anti-GH de control cuando se cultivan en presencia de células diana MOLM13 (que expresa CD123), K562-CD123 humano (que expresa CD123 humano) o K562 (que no expresa CD123).

La Figura 26, que comprende las Figuras 26A, 26B y 26C, muestra la capacidad de linfocitos T tranducidos con lentivirus que expresan CAR123 CAR (LV CAR123-2) o control (Anti-GH), o células no transducidas (UTD) para matar células diana con diversas proporciones de célula diana:célula efectora, donde las células diana son MOLM13 que expresa CD123 (Fig. 26A) o células PL21 (Fig. 26B), o células U87 negativas para CD123 (Fig. 26C).

La Figura 27, que comprende las Figuras 27A y 27B, está constituida por gráficos que muestran la producción de citocinas a partir de linfocitos T transducidos con lentivirus que expresan CAR123 (LV CAR123-2) o control (Anti-GH) cuando se cultivan en presencia de células diana MOLM13 (que expresan CD123) y U87 (que no expresan CD123). La Figura 27A muestra la producción de citocinas en forma de IFNy y TNFa; la Figura 27B muestra la producción de citocinas en forma de IL-2.

La Figura 28 muestra la carga tumoral en un modelo en ratones in vivo de linfoma de Hodgkin, donde a los ratones que portaban tumores se administraron linfocitos T que expresaban diversos constructos CAR123: 1172, 1176, NVS2 (también denominado en la presente CAR123-2), NVS3 (también denominado en la presente CAR123-3) y NVS4 (también denominado en la presente CAR123-4). Se midió la carga tumoral en el día 6, día 14, día 20 y día 27 y se representó mediante obtención de imágenes bioluminiscentes (BLI).

La Figura 29 muestra la carga tumoral en un modelo en ratones in vivo, donde a los ratones que portaban tumores se administraron linfocitos T que expresaban CAR123-2 introducido a partir de un vector lentivírico (CART123 LV), CAR123-2 introducido como ARN (ARN de CART123 (NVS)), y un CAR123 herramienta, introducido como ARN (ARN de CART123 (Penn)). Se utilizaron linfocitos T no transducidos como control (UTD). Se representa la carga tumoral mediante unidades de obtención de imágenes bioluminiscentes (BLI).

La Figura 30, que comprende las Figuras 30A, 30B, 30C y 30D, muestra la obtención de imágenes bioluminiscentes de los tumores en un modelo en ratones in vivo. La Figura 30A muestra los ratones a los que se administraron células no transducidas; la Figura 30B muestra los ratones a los que se administraron los linfocitos T que expresan ARN de CAR123-2; la Figura 30C muestra los ratones a los que se administraron linfocitos T transducidos con lentivirus que expresan CAR123-2; la Figura 30D muestra los ratones a los que se administraron linfocitos T que expresan ARN de CAR123 herramienta.

La Figura 31, que comprende las Figuras 31A, 31B, 31C, 31D, 31E y 31F, muestra que CD123 presenta una expresión elevada en recaídas de leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B neg para CD19 después del tratamiento con CART19. La Figura 31A muestra la expresión de CD123 en comparación con CD19 en 42 muestras de ALL recurrente/refractaria. La Figura 31B muestra la coexpresión de CD123 y CD19 en blastos B-ALL. Selección de blastos (SSC bajo, singlete, vivo, CD45tenue). La Figura 31C muestra la estrategia de selección para las células madre de leucemia (LSC, por sus siglas en inglés). CD123 presenta una expresión elevada en este subconjunto. La Figura 32D muestra la coexpresión de CD123 y CD19 y los resultados del análisis FISH. Las Figuras 31E y 31F muestran la comparación de expresión de CD19 y CD123 en las condiciones iniciales o después de la recaída

La Figura 32, que comprende la Figuras 32A, 32B, 32C, 32D, 32E y 32F, muestra los resultados de diversos ensayos in vitro utilizando linfocitos T que expresan CAR CD19 (CAR19) o un CAR CD123 (CAR123). La Figura 32A muestra la expresión de CD19 y CD123; La Figura 32B muestra un ensayo de desgranulación con CD107a; la Figura 32C muestra la capacidad de muerte celular dirigida; la Figura 32D y E muestra la capacidad de proliferación; la Figura 32F muestra la producción de citocinas para las citocinas indicadas.

La Figura 33, que comprende las Figuras 33A, 33B y 33C, muestra que los linfocitos CART que expresan CAR CD19 (CAR19) o CAR CD123 (CAR123) tuvieron un efecto antitumoral en un modelo en ratones in vivo. La Figura 33A muestra la carga tumoral representada mediante obtención de imágenes bioluminiscentes; la Figura 33B muestra la curva de supervivencia global de ratones que reciben terapia con CART; y la Figura 33C muestra la expansión de linfocitos CART123 en la sangre periférica.

La Figura 34, que comprende las Figuras 34A, 34B, 34C, 34D, 34E y 34F, muestra que CART123 es activo en un modelo en ratones in vivo de recaída por pérdida de antígeno. La Figura 34A muestra el esquema experimental; la Figura 34B muestra la evolución de la enfermedad según se representa mediante obtención de imágenes bioluminiscentes en las condiciones iniciales y con recaída de la enfermedad con respecto a la expresión de CD19 (gráfico superior) y en respuesta al tratamiento con terapia con CART19 (gráfico inferior); la Figura 34C muestra imágenes bioluminiscentes de ratones a los que se les administraron linfocitos T no transducidos o linfocitos CART19; la Figura 34D muestra el esquema experimental para tratar con CART19 o CART123; la Figura 34E muestra la evolución de la enfermedad; y la Figura 34F muestra la supervivencia global de los ratones tratados.

La Figura 35, que comprende las Figuras 35A, 35B y 35C, muestra las interacciones ALL-CART en médula ósea del cráneo de ratones con xenoinjerto. La Figura 35A muestra el esquema experimental; la Figura 35B muestra imágenes en el plano XY multifotónicas representativas de linfocitos CART19 y linfocitos CART123 que interaccionan con el tumor ALL modificado para expresar CD19 y CD123 o CD123 solo (se indican las células como habilidad en los círculos discontinuos, se indican las células sin movilidad con las flechas); y la Figura 35C es una representación gráfica de las imágenes de microscopio.

La Figura 36, que comprende las Figuras 36A, 36B y 36C, muestra la prevención de recaídas neg para CD19 utilizando CART19 y CART123. La Figura 36A muestra el esquema experimental; la Figura 36B muestra la evolución de la enfermedad (carga tumoral según se representa mediante BLI) de ratones tratados con linfocitos T no transducidos (gráfico superior), CART19 (gráfico del medio), o la combinación de CART19 y CART123 (gráfico inferior); y la Figura 36C muestra la supervivencia global de este experimento.

La Figura 37, que comprende la Figuras 37A y 37B, muestran linfocitos T que expresan tanto CAR19 como CAR123 (Figura 37A) y los resultados de un ensayo de desgranulación (Figura 37B).

La Figura 38, que comprende las Figuras 38A y 38B, muestra la caracterización de los blastos ALL. La Figura 38A muestra la expresión de diversos marcadores CD19, CD123, CD10, CD34 y CD20; y la Figura 38B muestra la estrategia de selección para clasificar las células CD19-CD123+.

La Figura 39, que comprende las Figuras 39A, 39B, 39C y 39D, muestra la actividad antileucémica de CART123. La Figura 39A muestra la expresión de CD19 y CD123 en las células NALM6; la Figura 39B muestra la carga tumoral (según se representa mediante BLI) en respuesta a la terapia con CART19 o CART123; la Figura 39C muestra la supervivencia global de ratones a los que se les ha administrado CART19 o CART123; y la Figura 39D muestra la supervivencia global de ratones a los que se les han administrado dosis variables de CART123.

La Figura 40, que comprende las Figuras 40A y 40B, muestra la caracterización del modelo in vivo de la recaída por pérdida de antígeno. La Figura 40A muestra la expresión de CD123 en la enfermedad con recaídas negativa para CD19; y la figura 40B muestra el ensayo de desgranulación de linfocitos CART19 o CART123 cuando se cultivan con células en la situación inicial o de recaídas in vitro.

La Figura 41, que comprende las Figuras 41A, 41B y 41C, muestra la expresión de PD1 L1 o en células de AML primarias (Fig. 41A), y PD1 (Fig. 41B) y TIM3 (Fig. 41C) en linfocitos T.

La Figura 42, que comprende las Figuras 42A, 42B, 42C y 42D, muestra la expresión de los puntos de control inmunitarios PD1 (Fig. 42A), TIM3 (Fig. 42B), LAG3 (Fig. 42C) y CTLA4 (Fig. 42D) en linfocitos T CD8+.

La Figura 43 muestra el análisis por citometría de flujo de la expresión de TIM3 en muestras de AML iniciales (izquierda) y recurrente (derecha).

La Figura 44 muestra la carga tumoral (representada mediante obtención de imágenes bioluminiscentes, fotones/s) después del tratamiento con CART123 en comparación con el tratamiento con células no transducidas (UTD).

La Figura 45 muestra la expresión de TIM3 y PD1 en linfocitos T en xenoinjertos después del tratamiento con CD123 en remisión o después de una recaída.

La Figura 46, que comprende las Figuras 46A y 46B, muestra la caracterización de la médula ósea de ratones en recaída después del cocultivo con inhibidores de los puntos de control, por ejemplo, inhibidores de PD1, TIM3, una combinación de inhibidores de PD1 y TIM3, o una combinación de inhibidores de TIM3 y CEACAM-1. Se detectó el porcentaje de linfocitos T que expresan GMCSF, IFNg, Ki67 y MIP1b en ausencia (Fig. 46A) o en presencia de PMA/IONO (Fig. 46B).

La Figura 47 muestra el esquema experimental para tratar xenoinjertos de AML con células no transducidas e inhibidores de PD1 o inhibidores de T iM3.

La Figura 48 muestra la carga tumoral (representada mediante BLI, fotones/s) para el experimento representado en la Figura 47.

La Figura 49 muestra el esquema experimental para tratar xenoinjertos de AML con CART123 combinados con inhibidores de TIM y/o PD1.

La Figura 50, que comprende las Figuras 50A, 50B, 50C y 50D, muestra la carga tumoral (representada mediante BLI, fotones/s) para el experimento representado en la Figura 49. La Fig. 50A compara CART123 con la combinación de CART123 y el inhibidor de PD1; la Fig. 50B compara CART123 con la combinación de CART123 y el inhibidor de PD1 y el inhibidor de TIM3; la Fig. 50C compara CART123 con la combinación de CART123 y el inhibidor de TIM3, y la Fig. 50D muestra un gráfico representativo para los datos presentados en las Figs. 50A-C.

La Figura 51, que comprende las Figuras 51A, 51B, 51C, 51D y 51E, muestra las diversas configuraciones en un único vector, por ejemplo, donde el ARNhc regulado por U6 está en dirección 5' o en dirección 3' respecto a los elementos que codifican CAR regulados por EF1 alfa. En los constructos a modo de ejemplo representados en la Fig. 51A y 51B, la transcripción ocurre mediante los promotores U6 y EF1 alfa en la misma dirección. En los constructos a modo de ejemplo representados en la Fig. 51C y 51D, la transcripción ocurre mediante los promotores U6 y EF1 alfa en direcciones diferentes. En la Figura 51E, el ARNhc (y el correspondiente promotor U6) está en un primer vector y el CAR (y el correspondiente promotor EF1 alfa) está en un segundo promotor.

La Figura 52 representa las estructuras de dos configuraciones RCAR a modo de ejemplo. Los miembros de unión al antígeno comprenden un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de tipo interruptor. Los miembros de unión intracelulares comprenden un dominio de tipo interruptor, un dominio de señalización coestimulador y un dominio de señalización primaria. Las dos configuraciones demuestran que el primer y el segundo dominios de tipo interruptor descritos en la presente pueden estar en diferentes orientaciones con respecto al miembro de unión al antígeno y el miembro de unión intracelular. Se describen en más detalle en la presente otras configuraciones RCAR.

La Figura 53 muestra que la proliferación de linfocitos T transducidos que expresan CAR se ve fomentada por dosis bajas de RAD001 en un sistema de cultivo celular. Se cocultivaron CART con células Nalm-6 en presencia de diferentes concentraciones de RAD001. El número de linfocitos T positivos para CAR y positivos para c D3 (negro) y linfocitos T totales (gris) se evaluó después de 4 días de cocultivo.

La Figura 54 muestra medidas del crecimiento tumoral de células NALM6-luc con una dosificación diaria de 0,3, 1, 3 y 10 mg/kg (mpk) de RAD o dosificación con vehículo. Los círculos indican vehículo; los cuadrados indican la dosis de 10 mg/kg de RAD001; los triángulos indican la dosis de 3 mg/kg de RAD001, los triángulos invertidos indican la dosis de 1 mg/kg de RAD001; y los rombos indican la dosis de 0,3 mg/kg de RAD001.

La Figura 55, que comprende las Figuras 55A y 55B, muestra las curvas farmacocinéticas que muestran la cantidad de RAD001 en la sangre de ratones NSG con tumores NALM6. La FIG. 55A muestra la PK en el día 0 tras la primera dosis de RAD001. La FIG. 55B muestra la PK en el día 14 tras la dosis final de RAD001. Los rombos indican la dosis de 10 mg/kg de RAD001; los cuadrados indican la dosis de 1 mg/kg de RAD001, los triángulos indican la dosis de 3 mg/kg de RAD001; y las x indican la dosis de 10 mg/kg de RAD001.

La Figura 56, que comprende las Figuras 56A y 56B, muestra la proliferación in vivo de linfocitos CART CD19 humanizados con y sin dosificación de RAD001. Las dosis bajas diarias de RAD001 (0,003 mg/kg) conllevan un refuerzo de la proliferación de linfocitos T CAR, por encima de los niveles normales de proliferación de huCAR19. La FIG. 56A muestra linfocitos T CAR CD4+; la FIG. 56B muestra linfocitos T CAR CD8+. Los círculos indican PBS; los cuadrados indican huCTL019; los triángulos indican huCTL019 con 3 mg/kg de RAD001; los triángulos invertidos indican huCTL019 con 0,3 mg/kg de RAD001; los rombos indican huCTL019 con 0,03 mg/kg RAD001; y los círculos indican huCTL019 con 0,003 mg/kg RAD001.

La Figura 57 es un mapa vectorial de un vector lentivírico, para expresar un CAR123 y CD20 en una estrategia para cancelar la actividad CART123, donde la secuencia CAR123 y la secuencia CD20 están ligadas por una secuencia P2A. La Figura 58 muestra los resultados de un ensayo de desgranulación que compara linfocitos CART123 con CART123 P2A CD20.

La Figura 59, que comprende las Figuras 59A, 59B, 59C y 59D, muestra la producción de GMCSF (Fig. 59A), TNFalfa (Fig. 59B), IFNgamma (Fig. 59C) e IL-2 (Fig. 59D) por parte de linfocitos CART123 en comparación con linfocitos CART123 P2A CD20.

La Figura 60 muestra la capacidad citotóxica (según se representa mediante % de lisis específica) de linfocitos CART123 en comparación con linfocitos CART123 P2A CD20 cuando se incuban con las proporciones efector:célula diana indicadas. La Figura 61, que comprende las Figuras 61A y 61B, muestra la disminución de linfocitos T después del tratamiento con las dosis indicadas de rituximab en linfocitos cArT123 (Fig. 61A) y linfocitos CART123 P2A CD20 (Fig. 61B).

La Figura 62 muestra la disminución de linfocitos T después del tratamiento con las dosis indicadas de rituximab en linfocitos CART123 P2A CD20 en presencia de un 15% de complemento.

La Figura 63, que comprende las Figuras 63A y 63B, demuestra la estrategia de un linfocito CART dual que expresa tanto un CAR19 como un CAR123. La Figura 63A es un mapa vectorial que contiene un CAR19 y un CAR123, ligados mediante una secuencia P2A. La Figura 63 muestra el porcentaje de células que expresan CAR19, CAR123 (Q3), y tanto CAR19 (Q1) como CAR123 (Q2).

La Figura 64, que comprende las Figuras 64A y 64B, demuestra la estrategia de un linfocito CART dividido que expresa tanto un CAR19 como un CAR123. La Figura 64A es un mapa vectorial que contiene un CAR19 y un CAR123, ligados mediante una secuencia P2A. El CAR19 incluye un dominio CD3zeta mientras que CAR123 incluye un dominio 4-1BB. La Figura 64B muestra el porcentaje de células que expresan CAR19, CAR123 (Q3), y tanto CAR19 (Q1) como CAR123 (Q2).

La Figura 65 muestra la expresión de muestras de HSC, AML y BPDCN primarias.

La Figura 66, que comprende las Figuras 66A y 66B, muestra un ensayo de citotoxicidad para los clones de CAR123 32716 (Fig. 66A) y 26292 (Fig. 66A) cuando se incuban en presencia de células diana que expresan CD123 con las proporciones efector:célula diana indicadas.

La Figura 67 muestra un ensayo de desgranulación con CD107 para linfocitos CART123 cuando se incuban con HSC en comparación con BPDCN.

La Figura 68, que comprende las Figuras 68A y 68B, muestra la expresión de CD123 en células mononucleares de la sangre de un paciente con leucemia de mastocitos/mastocitosis sistémica según se detecta mediante tinción con anticuerpos del isotipo (Fig. 68A) como control o anticuerpo para CD123 (Fig. 68B).

La Figura 69, que comprende las Figuras 69A y 69B, muestra un ensayo de desgranulación con CD107 donde los linfocitos CART123 se cultivaron solos con PMA e ionomicina (Fig. 69A) o con células mononucleares procedentes de la sangre de un paciente con leucemia de mastocitos/mastocitosis sistémica (Fig. 69B).

La Figura 70 muestra el esquema experimental para la cohorte de sujetos 1 en un estudio clínico para administrar ARN CART123 en sujetos con aMl recurrente o refractaria.

La Figura 71 muestra el esquema experimental para la cohorte de sujetos 2 en un estudio clínico para administrar ARN CART123 en sujetos con AML recurrente o refractaria. Estos pacientes reciben dosis de quimioterapia linforreductora además de la terapia con CART.

La Figura 72, que comprende las Figuras 72A, 72B y 72C, muestra los resultados de la ablación de linfocitos T utilizando el anticuerpo anti-CD52 alemtuzumab después del tratamiento con linfocitos CART123 transducidos con lentivirus en un modelo de xenoinjerto MOLM14. Se administraron linfocitos CART123 o células no transducidas (UTD) a los ratones en la semana 1. Se administró alemtuzumab en la semana 2, semana 3 o semana 4 a ratones que recibieron linfocitos CART123, y se evaluó la carga tumoral durante 24 semanas. A las 12 semanas «MOLM14» experimentaron una reexposición. La Figura 72A muestra la carga tumoral tal como se detecta mediante obtención de imágenes bioluminiscentes (fotones/s); la Figura 72B muestra el porcentaje de linfocitos CART detectados en la sangre periférica; y la Figura 72C muestra la supervivencia global.

La Figura 73, que comprende las Figuras 73A y 73B, muestra los resultados de la ablación de linfocitos T utilizando alemtuzumab después del tratamiento con linfocitos CART123 transducidos con lentivirus en un modelo de xenoinjerto de AML pediátrica. Se administraron linfocitos CART123 o células no transducidas (UTD) a los ratones 6 semanas después del injerto de células de AML primarias (semana 0). Se administró alemtuzumab en la semana 4 a los ratones que recibieron tratamiento con CART123. La Figura 73A muestra la carga tumoral tal como se detecta mediante obtención de imágenes bioluminiscentes (fotones/s); la Figura 73B muestra el porcentaje de linfocitos CART detectados en la sangre periférica.

La Figura 74, que comprende las Figuras 74A y 74B, muestra el análisis de células de AML en el bazo (Fig. 74) y la médula ósea (Fig. 74B) después del tratamiento con CART123 y alemtuzumab, como se realizó en la Figura 73.

La Figura 75 muestra la comparación de tres estrategias de finalización: (1) ablación de linfocitos CART mediante tratamiento con alemtuzumab; (2) coexpresión de CAR/CD20 en linfocitos T y ablación mediante rituximab; y (3) linfocitos CART electroporados con ARN, en la carga tumoral (representada mediante obtención de imágenes bioluminiscentes; fotones/s) en el modelo de xenoinjerto de AML.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado con el que los entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

El término «un» y «uno/a» se refiere a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, «un elemento» significa un elemento o más de un elemento.

El término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ±20% o en algunos casos ±10%, o en algunos casos ±5%, o en algunos casos ± 1 %, o en algunos casos ±0,1% del valor especificado, ya que variaciones de este tipo son apropiadas para realizar los métodos divulgados.

La expresión «Receptor Antigénico Quimérico» o, como alternativa, un «CAR», se refiere a un constructo polipeptídico recombinante que comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmática (también denominado en la presente «un dominio de señalización intracelular») que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora tal como se define más adelante. En algunas realizaciones, los dominios en el constructo polipeptídico CAR están en la misma cadena polipeptídica, por ejemplo, comprenden una proteína de fusión quimérica. En algunas realizaciones, los dominios en el constructo polipeptídico CAR no son contiguos entre sí, por ejemplo, están en diferentes cadenas polipeptídica, por ejemplo, tal como se proporciona en un RCAR tal como se describe en la presente.

En un aspecto, la molécula estimuladora del CAR es la cadena zeta asociada con el complejo receptor de linfocitos T. En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización primaria de CD3-zeta). En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende además uno o más dominios de señalización funcionales procedentes de al menos una molécula coestimuladora tal como se define más adelante. En un aspecto, la molécula coestimuladora se elige entre 4-1BB (es decir, CD137), CD27, ICOS y/o CD28. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional procedente de una molécula estimuladora. En un aspecto, el c Ar comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional procedente de una molécula coestimuladora y un dominio de señalización funcional procedente de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende dos dominios de señalización funcionales procedentes de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional procedente de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende al menos dos dominios de señalización funcionales procedentes de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional procedente de una molécula estimulante. En un aspecto, el CAR comprende una secuencia líder opcional en el extremo amino (N-ter) de la proteína de fusión CAR. En un aspecto, el CAR comprende además una secuencia líder en el extremo N del dominio de reconocimiento del antígeno extracelular, donde la secuencia líder se escinde opcionalmente del dominio de reconocimiento del antígeno por ejemplo, un scFv) durante el procesamiento celular y la ubicación del CAR en la membrana celular.

Un CAR que comprende un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, un scFv, un anticuerpo de un único dominio o TCR (por ejemplo, un dominio de unión de TCR alfa o dominio de unión de TCR beta)) que se une específicamente a un marcador tumoral X específico, donde X puede ser un marcador tumoral tal como se describe en la presente, también se denomina XCAR. Por ejemplo, un CAR que comprende un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a CD123 se denomina CAR CD123. El CAR se puede expresar en cualquier célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria tal como se describe en la presente (por ejemplo, un linfocito T o un linfocito NK).

La expresión «dominio de señalización» se refiere a la porción funcional de una proteína que actúa transmitiendo información dentro de la célula para regular la actividad celular a través de rutas de señalización definidas generando segundos mensajeros o funcionando como efectores que responden a dichos mensajeros.

Tal como se utilizan en la presente, las expresiones «subunidad alfa del receptor de IL-3», «IL3Ra», «CD123», «cadena de IL3Ra» y «subunidad de IL3Ra» se refieren indistintamente a un determinante antigénico del que se sabe que se puede detectar en las células precursoras de la leucemia. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos humanos y murinos se pueden encontrar en una base de datos pública, tal como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de IL3Ra humana se puede encontrar con el N.° de acceso NP 002174 y la secuencia de nucleótidos que codifica la IL3Ra se puede encontrar con el N.° de acceso NM 005191. En un aspecto, la porción de unión al antígeno del CAR reconoce y se une a un epítopo dentro del dominio extracelular de la proteína CD123. En un aspecto, la proteína CD123 se expresa en una célula cancerosa. Tal como se utiliza en la presente, «CD123» incluye proteínas que comprenden mutaciones, por ejemplo, mutaciones puntuales, fragmentos, inserciones, deleciones y variantes de corte y empalme de CD123 de tipo natural completo.

El término «anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína o secuencia polipeptídica procedente de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, de cadena múltiple o sencilla, o inmunoglobulinas intactas, y pueden proceder de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos pueden ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina.

La expresión «fragmento de anticuerpo» se refiere a al menos una porción de un anticuerpo intacto, o variantes recombinantes de este, y se refiere al dominio de unión al antígeno, por ejemplo, una región variable determinante antigénica de un anticuerpo intacto, que es suficiente para conferir reconocimiento y unión específica del fragmento de anticuerpo a una diana, tal como un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, sin carácter limitante, fragmentos Fab, Fab', F(ab')²y Fv, fragmentos de anticuerpo scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tales como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH camélidos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo tales como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra, y una CDR aislada u otros fragmentos de unión al epítopo de un anticuerpo. Un fragmento de unión al antígeno también se puede incorporar a anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (remítase, por ejemplo, a Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). También se pueden injertar fragmentos de unión al antígeno en esqueletos basados en polipéptidos tales como una fibronectina de tipo III (Fn3) (remítase a la Pat. de EE. UU. N.° 6 703 199, que describe minicuerpos del polipéptido fibronectina).

El término «scFv» se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, donde las regiones variable de la cadena ligera y pesada están ligadas de manera contigua a través de un conector polipeptídico flexible corto, y capaz de expresarse como una única cadena polipeptídica, y en donde el scFv mantiene la especificidad del anticuerpo intacto del cual procede. A menos que se especifique, tal como se utiliza en la presente, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-conector-VH o puede comprender VH-conector-VL.

La expresión «región determinante de la complementariedad» o «CDR», tal como se utiliza en la presente, se refiere a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo que confieren especificidad y afinidad de unión por el antígeno. Por ejemplo, en general, hay tres CDR en cada región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1H, CDR2H, CDR3H) y tres CDR en cada región variable de la cadena ligera (CDR1L, CDR2L, CDR3L). Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5.a Ed. Public Health Service, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD (esquema de numeración de «Kabat»), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeración de «Chotia») o una combinación de estos. Con el esquema de numeración de Kabat, en algunas realizaciones, los residuos aminoacídicos de CDR en el dominio variable de la cadena pesada (VH) tienen la numeración 31-35 (CDR1H), 50-65 (CDR2H) y 95-102 (CDR3H); y los residuos aminoacídicos de CDR en el dominio variable de la cadena ligera (VL) tienen la numeración 24-34 (CDR1L), 50-56 (CDR2L) y 89-97 (CDR3L). Con el esquema de numeración de Chotia, en algunas realizaciones, los aminoácidos de CDR en VH tienen la numeración 26-32 (CDR1H), 52-56 (CDR2H) y 95-102 (CDR3H); y los residuos aminoacídicos de CDR en VL tienen la numeración 26-32 (CDR1L), 50-52 (CDR2L) y 91-96 (CDR3L). En un esquema de numeración combinado de Kabat y Chothia, en algunas realizaciones, las CDR corresponden a los residuos aminoacídicos que son parte de una CDR Kabat, una CDR Chothia o ambas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las CDR corresponden a los residuos aminoacídicos 26-35 (CDR1H), 50-65 (CDR2H) y 95-102 (CDR3H) en un VH, por ejemplo, un VH de mamífero, por ejemplo, un VH humano; y los residuos aminoacídicos 24-34 (CDR1L), 50-56 (CDr2l) y 89-97 (CDR3L) en un VL, por ejemplo, un VL de mamífero, por ejemplo, un VL humano.

La porción de la composición de CAR de la invención que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de este puede existir en diversas formas en las que el dominio de unión al antígeno se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua que incluye, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo monocatenario (scFv) y un anticuerpo humano o humanizado (Harlow et al., 1999, En: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión al antígeno de una composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, el CAR comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión «dominio de unión» o «molécula de anticuerpo» (también denominada en la presente «dominio de unión anti-diana (por ejemplo, CD123») se refiere a una proteína, por ejemplo, una cadena de inmunoglobulina o fragmento de esta, que comprende al menos una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina. La expresión «dominio de unión» o «molécula de anticuerpo» abarca anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. En una realización, una molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, comprende una pluralidad de secuencias del dominio variable de inmunoglobulina, donde una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad por dos antígenos como máximo. Una molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo.

La expresión «cadena pesada de anticuerpo» se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en moléculas de anticuerpo en sus conformaciones de origen natural y que normalmente determina la clase a la que pertenece el anticuerpo.

La expresión «cadena ligera de anticuerpo» se refiere al menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en moléculas de anticuerpos en sus conformaciones de origen natural. Las cadenas ligeras kappa ( ^k ) y lambda (A) se refieren a los dos isotipos principales de la cadena ligera de anticuerpo.

La expresión «anticuerpo recombinante» se refiere a un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago o un sistema de expresión en levaduras. También se debe entender que la expresión se refiere a un anticuerpo que ha sido generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y donde la molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, donde la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido utilizando ADN recombinante o tecnología de secuencias de aminoácidos que está disponible y es muy conocida en la técnica.

El término «antígeno» o «Ag» se refiere a una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede conllevar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la técnica entenderá que cualquier macromolécula, incluidas virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede servir como un antígeno. Además, los antígenos pueden proceder de ADN recombinante o genómico. Un experto entenderá que cualquier ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial que codifica una proteína que provoca una respuesta inmunitaria, codifica, por lo tanto, un «antígeno» tal como se utiliza ese término en la presente. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos completa de un gen. Es muy obvio que la presente divulgación incluye, sin carácter limitante, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado por un "gen" en absoluto. Es muy obvio que un antígeno se puede generar sintetizado o proceder de una muestra biológica, o podría ser una macromolécula además de un polipéptido. Una muestra biológica de este tipo puede incluir, sin carácter limitante, una muestra de tejido, una muestra tumoral, una célula o un fluido con otros componentes biológicos.

La expresión «efecto antitumoral» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células tumorales, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de células tumorales, una disminución de la supervivencia de células tumorales o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un «efecto antitumoral» también se puede poner de manifiesto por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la divulgación en la prevención de la aparición del tumor en primer lugar.

La expresión «efecto anticanceroso» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células cancerosas, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de células cancerosas, una disminución de la supervivencia de células cancerosas o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un «efecto anticanceroso» también se puede poner de manifiesto por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos descritos para prevenir la aparición del cáncer en primer lugar.

La expresión «efecto antitumoral» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen del tumor, una disminución del número de células tumorales, una disminución de la proliferación de células tumorales o una disminución de la supervivencia de células tumorales.

El término «autólogo» se refiere a cualquier material procedente del mismo individuo que luego se reintroducirá en el individuo.

El término «alogénico» se refiere a cualquier material procedente de un animal diferente de la misma especie que el individuo en el que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de individuos de la misma especie puede ser lo suficientemente diferente desde un punto de vista genético para interactuar de manera antigénica.

El término «xenogénico» se refiere a un injerto procedente de un animal de una especie diferente.

El término «aféresis» tal como se utiliza en la presente se refiere al proceso extracorpóreo reconocido en la técnica mediante el cual la sangre de un donante o paciente se retira del donante o paciente y se pasa a través de un aparato que separa el(los) componente(s) particular(es) seleccionado(s) y devuelve el resto a la circulación del donante o paciente, por ejemplo, mediante retransfusión. Por lo tanto, en el contexto de «una muestra de aféresis» se refiere a una muestra obtenida utilizando aféresis.

El término «combinación» se refiere a una combinación fija en una forma farmacéutica unitaria o a una administración combinada donde un compuesto de la presente invención y un miembro de la combinación (por ejemplo, otro fármaco tal como se explica más adelante, también denominado «agente terapéutico» o «coagente») se puede administrar de manera independiente a la vez o por separado dentro de intervalos de tiempo, especialmente cuando esos intervalos permiten que los miembros de la combinación muestren un efecto cooperativo, por ejemplo, sinérgico. Los diferentes componentes se pueden empaquetar en un kit o por separado. Uno o los dos componentes (por ejemplo, polvos o líquidos) se pueden reconstituir o diluir hasta una dosis deseada antes de la administración. Los términos «coadministración» o «administración combinada» o similares, tal como se utilizan en la presente, se pretende que abarquen la administración del componente de la combinación seleccionado a un único sujeto que lo necesite (por ejemplo, un paciente), y se pretende que incluyan pautas de tratamiento en las que los agentes no se administran necesariamente por la misma vía de administración o a la vez. La expresión «combinación farmacéutica», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un producto que es el resultado de la mezcla o combinación de más de un principio activo e incluye combinaciones tanto fijas como no fijas de los principios activos. La expresión «combinación fija» significa que los principios activos, por ejemplo, un compuesto de la presente invención y un miembro de la combinación, se administran ambos a un paciente simultáneamente en forma de una sola entidad o dosificación. La expresión «combinación no fija» significa que los principios activos, por ejemplo, un compuesto de la presente invención y un miembro de la combinación, se administran ambos a un paciente como entidades separadas ya sea de manera simultánea, concurrente o secuencial sin límites de tiempo específicos, donde dicha administración proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente. Esto último también se aplica a la politerapia, por ejemplo, la administración de tres o más principios activos.

El término «cáncer» se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido y descontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas se pueden diseminar localmente o a otras partes del cuerpo a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático. En la presente se describen ejemplos de diversos cánceres e incluyen, sin carácter limitante, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares. Los términos «tumor» y «cáncer» se utilizan indistintamente en la presente, por ejemplo, ambos términos abarcan tumores sólidos y hemolinfáticos, por ejemplo, difusos o circulantes. Tal como se utiliza en la presente, el término «cáncer» o «tumor» incluye cánceres y tumores tanto premalignos como malignos.

La expresión «que procede de», tal como se utiliza en la presente, indica una relación entre una primera y una segunda molécula. Se refiere de manera general a la similitud estructural entre la primera molécula y una segunda molécula y no connota ni incluye una limitación de la fuente o proceso en una primera molécula que procede de una segunda molécula. Por ejemplo, en el caso de un dominio de señalización intracelular que procede de una molécula CD3zeta, el dominio de señalización intracelular mantiene suficiente estructura CD3zeta para que tenga la función requerida, en concreto, la capacidad para generar una señal en las condiciones apropiadas. No connota ni incluye una limitación en un proceso particular para producir el dominio de señalización intracelular, por ejemplo, no significa que, para proporcionar el dominio de señalización intracelular, se deba comenzar con una secuencia de CD3zeta y eliminar la secuencia no deseada, o imponer mutaciones, para conseguir el dominio de señalización intracelular.

La frase «enfermedad asociada con la expresión de CD123», tal como se utiliza en la presente, incluye, sin carácter limitante, una enfermedad asociada con la expresión de CD123 o una afección asociada con una célula que expresa CD123 (por ejemplo, CD123 de tipo natural o mutante) que incluye, por ejemplo, una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o neoplasia maligna; una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con una célula que expresa CD123 (por ejemplo, CD123 de tipo natural o mutante). En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD123 (por ejemplo, CD123 de tipo natural o mutante) es un cáncer hematológico. En un aspecto, la enfermedad incluye AML, ALL, tricoleucemia, leucemia prolinfocítica, leucemia mieloide crónica (CML), linfoma de Hodgkin, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, leucemia linfoblástica de linfocitos B (leucemia linfoide aguda de linfocitos B, BALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (leucemia linfoide aguda de linfocitos T (TALL)); síndrome mielodisplásico; una neoplasia mieloproliferativa; un trastorno histiocítico (por ejemplo, un trastorno de mastocitos o una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas); un trastorno de los mastocitos, por ejemplo, mastocitosis sistémica o leucemia de mastocitos; y similares. Más enfermedades asociadas con la expresión de expresión de CD123 incluyen, sin carácter limitante, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias malignas, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas asociadas con la expresión de CD123. También se pueden incluir las indicaciones no relacionadas con el cáncer asociadas con la expresión de CD123.

En algunos casos, la célula que expresa el antígeno tumoral (por ejemplo, CD123 o CD19) expresa, o expresó en algún momento, ARNm que codifica el antígeno tumoral. En una realización, la célula que expresa el antígeno tumoral (por ejemplo, CD123 o CD19) produce la proteína antigénica tumoral (por ejemplo, de tipo natural o mutante), y la proteína antigénica tumoral puede estar presente en niveles normales o niveles reducidos. En un caso, la célula que expresa el antígeno tumoral (por ejemplo, CD123 o CD19) produjo niveles detectables de una proteína antigénica tumoral en un momento determinado, y después no produjo sustancialmente proteína antigénica tumoral detectable.

La expresión «modificaciones de secuencia conservadoras» se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Las modificaciones conservadoras de este tipo incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras son unas en las que el residuo aminoacídico es reemplazado por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificaciones en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos aminoacídicos dentro de un CAR de la invención pueden ser reemplazados por otros residuos aminoacídicos de la misma familia de cadenas laterales y el CAR alterado se puede estudiar utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

El término «estimulación» se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando afín para mediar de esta manera en un evento de transducción de señales, tal como, sin carácter limitante transducción de señales a través del complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar en la expresión alterada de ciertas moléculas, tales como disminución regulada de TGF-p, y/o reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares.

La expresión «molécula estimuladora» se refiere a una molécula expresada por un linfocito T que proporciona la(s) secuencia(s) de señalización citoplasmática primaria que regula(n) la activación primaria del complejo TCR de manera estimuladora para al menos algún aspecto de la vía de señalización de linfocitos T. En un aspecto, la señal primaria se inicia, por ejemplo, mediante la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, y que da lugar a la mediación de una respuesta de linfocitos T, que incluye, sin carácter limitante, proliferación, activación, diferenciación y similares. Una secuencia de señalización citoplasmática primaria (también denominada "dominio de señalización primaria") que actúa de manera estimuladora puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de una secuencia de señalización citoplasmática primaria que contiene ITAM que es de uso particular en la invención incluyen, sin carácter limitante, aquellos procedentes de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, Cd 3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como «ICOS»), FceRI, CD66d, DAP10 y DAP12. En un CAR específico de la invención, el dominio de señalización intracelular en uno o más CARS de la invención comprende una secuencia de señalización intracelular, por ejemplo, una secuencia de señalización primaria de CD3-zeta. En un CAR específico de la invención, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 9 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares. En un CAR específico de la invención, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 10 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares.

La expresión «célula presentadora de antígeno» o «APC» (por sus siglas en inglés) se refiere a una célula del sistema inmunitario tal como una célula accesoria (por ejemplo, un linfocito B, una célula dendrítica y similares) que muestra un antígeno extraño complejado con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Los linfocitos T pueden reconocer estos complejos utilizando sus receptores de los linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés). Las APC procesan antígenos y los presentan a los linfocitos T.

Un «dominio de señalización intracelular», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a una porción intracelular de una molécula. El dominio de señalización intracelular puede generar una señal que fomenta una función efectora inmunitaria de la célula que contiene CAR, por ejemplo, un linfocito CART o linfocito n K que expresa CAR. Los ejemplos de la función efectora inmunitaria, por ejemplo, en un linfocito CART o linfocito NK que expresa CAR, incluyen actividad citolítica y actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas. En las realizaciones, el dominio de señalización intracelular transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para realizar una función especializada. Aunque se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar la cadena completa. En la medida en que se utilice una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada se puede utilizar en lugar de la cadena intacta, siempre que transduzca la señal de la función efectora. La expresión dominio de señalización intracelular pretende, por lo tanto, incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular primaria. Los dominios de señalización intracelular primaria a modo de ejemplo incluyen los procedentes de las moléculas responsables de la estimulación primaria, o simulación dependiente de antígeno. En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio intracelular coestimulador. Los dominios de señalización intracelular coestimuladores a modo de ejemplo incluyen los procedentes de las moléculas responsables de las señales coestimuladoras, o la simulación independiente de antígeno. Por ejemplo, en el caso de una célula efectora inmunitaria que expresa CAR, por ejemplo, linfocito CART o linfocito NK que expresa CAR, un dominio de señalización intracelular primaria puede comprender una secuencia citoplasmática de un receptor de los linfocitos T, y un dominio de señalización intracelular coestimulador puede comprender una secuencia citoplasmática de una molécula correceptora o coestimuladora.

Un dominio de señalización intracelular primaria puede comprender un motivo de señalización que se conoce como un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de secuencias de señalización citoplasmática primaria que contienen ITAM incluyen, sin carácter limitante, aquellas procedentes de CD3 zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 («ICOS»), FceRI, CD66d, DAP10 y DAP12.

El término «zeta» o, como alternativa, «cadena zeta», «CD3-zeta» o «TCR-zeta» se define como la proteína proporcionada como N.° Acc. GenBank BAG36664.1, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, y un «dominio estimulador zeta» o, como alternativa, un «dominio estimulador CD3-zeta» o un «dominio estimulador de TCR-zeta» se define como los residuos aminoacídicos del dominio citoplasmático de la cadena zeta que son suficientes para transmitir funcionalmente una señal inicial necesaria para la activación de los linfocitos T. En un aspecto, el dominio citoplasmático de zeta comprende los residuos 52 a 164 del N.° Acc. GenBank BAG36664.1 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, que son ortólogos funcionales de estos. En un aspecto, el «dominio estimulador zeta» o un «dominio estimulador CD3-zeta» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 9. En un aspecto, el «dominio estimulador zeta» o un «dominio estimulador CD3-zeta» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 10.

La expresión «molécula coestimuladora» se refiere a compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, y de esta manera media en una respuesta coestimuladora por parte del linfocito T, tal como, sin carácter limitante, proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores del antígeno o sus ligandos que se requieren para una respuesta inmunitaria eficaz. Las molécula coestimuladoras incluyen, sin carácter limitante, una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de la activación linfocitaria (proteínas SLAM), receptores de células NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.

Un dominio de señalización intracelular coestimulador se refiere a la porción intracelular de una molécula coestimuladora. El dominio de señalización intracelular puede comprender la porción intracelular completa, o el dominio de señalización intracelular nativo completo, de la molécula de la que procede, o un fragmento funcional de esta.

El término «4-1BB» se refiere al miembro de la superfamilia de TNFR con una secuencia de aminoácidos proporcionada como el N.° Acc. GenBank AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares; y un «dominio coestimulador de 4-1BB» se define como los residuos aminoacídicos 214 255 del N.° Acc. GenBank AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares. En un aspecto, el «dominio coestimulador de 4-1BB» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 7 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares.

La «célula efectora inmunitaria», según se utiliza el término en la presente, se refiere a una célula que participa en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la promoción de una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de células efectoras inmunitarias incluyen los linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T alfa/beta y linfocitos T gamma/delta, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), mastocitos y fagocitos de origen mieloico.

La «función efectora inmunitaria o respuesta efectora inmunitaria», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a una función o respuesta, por ejemplo, de una célula efectora inmunitaria, que fomenta o promueve un ataque inmunitario de una célula diana. Por ejemplo, una función o respuesta efectora inmunitaria se refiere a una propiedad de un linfocito T o NK que promueve la muerte o la inhibición del crecimiento o proliferación, de una célula diana. En el caso de un linfocito T, la estimulación primaria y coestimulación son ejemplos de función o respuesta efectora inmunitaria.

La expresión "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.

El término "codificante" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (por ejemplo, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de estos. Por lo tanto, un gen, ADNc o ARN, codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto a la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y generalmente se proporciona en listas de secuencias, como a la hebra no codificante, utilizada como el molde para la transcripción de un gen o ADNc, se les puede denominar codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

A menos que se especifique lo contrario, una «secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos» incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pueda contener, en alguna versión, un(os) intrón(intrones).

Las expresiones «cantidad eficaz» o «cantidad terapéuticamente eficaz» se utilizan indistintamente en la presente, y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, tal como se describen en la presente, eficaz para lograr un resultado biológico particular.

El término «endógeno» se refiere a cualquier material de un organismo, célula, tejido o sistema o producido dentro de estos.

El término «exógeno» se refiere a cualquier material introducido desde fuera de un organismo, célula, tejido o sistema o producido fuera de estos.

El término «expresión» se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por un promotor.

La expresión «vector de transferencia» se refiere a una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede utilizar para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica que incluyen, sin carácter limitante, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, la expresión «vector de transferencia» incluye un virus o un plásmido que se replica de forma autónoma. La expresión también debe interpretarse para incluir además compuestos no plasmídicos y no víricos que facilitan la transferencia de ácido nucleico al interior de las células, tales como, por ejemplo, un compuesto de polilisina, liposoma y similares. Ejemplos de vectores de transferencia víricos incluyen, sin carácter limitante, vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos y similares.

La expresión «vector de expresión» se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión ligadas operablemente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, incluidos los cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

El término «vector» tal como se utiliza en la presente se refiere a cualquier vehículo que se puede utilizar para suministrar y/o expresar una molécula de ácido nucleico. Puede ser un vector de transferencia o un vector de expresión tal como se describe en la presente.

El término «lentivirus» se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus ya que son capaces de infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética al ADN de la célula hospedadora, por lo que son uno de los métodos más eficaces de un vector de suministro de genes. El HIV, SIV y FIV son ejemplos de lentivirus.

La expresión «vector lentivírico» se refiere a un vector procedente de al menos una porción de un genoma de lentivirus, que incluye especialmente un vector lentivírico autoinactivante como se proporciona en Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Otros ejemplos de vectores de lentivirus que se pueden utilizar en la clínica incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, la tecnología de suministro de genes l En TIVECTOR® de Oxford BioMedica, el sistema vectorial LENTIMAX™ de Lentigen y similares. También se puede disponer de tipos no clínicos de vectores lentivíricos y estos son conocidos para el experto en la técnica.

El término «homólogo» o «identidad» se refiere a la identidad secuencial de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas o idénticas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 50%; si el 90% de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 90%.

Las formas «humanizadas» de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen una secuencia mínima procedente de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpos de estos son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo o fragmento de anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de armazón (FR, por sus siglas en inglés) Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, un anticuerpo/fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o de armazón importadas. Estas modificaciones pueden refinar y optimizar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo de este comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o una parte significativa de las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, remítase a Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

La expresión «completamente humano» se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en que la molécula completa es de origen humano o está constituida por una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo o inmunoglobulina.

El término «aislado» significa alterado o eliminado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está «aislado», pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o completamente de los materiales con los que coexiste en su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en una forma sustancialmente purificada, o puede existir en un entorno no nativo, tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que se producen de manera habitual. «A» se refiere a adenosina, «C» se refiere a citosina, «G» se refiere a guanosina, «T» se refiere a timidina y «U» se refiere a uridina.

La expresión «ligado operablemente» o «control transcripcional» se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heterólogo que da como resultado la expresión de este último. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está ligada operablemente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está ligado operablemente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de ADN ligadas operablemente pueden ser contiguas entre sí y, por ejemplo, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.

La expresión administración «parenteral» de una composición inmunógena incluye, por ejemplo, la inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, intratumoral o técnicas de infusión.

La expresión «ácido nucleico» o «polinucleótido» o «molécula de ácido nucleico» se refiere al ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), o una combinación de ADN y ARN de este, y polímeros de estos, ya sea en forma mono- o bicatenaria. La expresión «ácido nucleico» incluye un gen, ADNc o un ARNm. En una realización, la molécula de ácido nucleico es sintética (por ejemplo, de síntesis química) o recombinante. A menos que se limite de forma específica, la expresión engloba ácidos nucleicos que contienen análogos o derivados de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a la de los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también engloba de forma implícita variantes modificadas de forma conservadora de esta (por ejemplo, sustituciones del codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como también la secuencia indicada de forma explícita. Específicamente, se pueden conseguir sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o su totalidad) se sustituya con una base mixta y/o residuos de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos «péptido», «polipéptido» y «proteína» se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto que comprende residuos aminoacídicos unidos de forma covalente por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se limita el número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia proteica o peptídica. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en la presente, el término se refiere tanto a cadenas cortas, a las que también se alude comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, a las que generalmente se alude en la técnica como proteínas, de las cuales existen muchos tipos. Los «polipéptidos» incluyen, por ejemplo, fragmentos con actividad biológica, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Un polipéptido incluye un péptido natural, un péptido recombinante o una combinación de estos.

El término «promotor» se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.

La expresión «secuencia promotora/reguladora» se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico ligado operablemente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico de una manera específica para el tejido.

El término promotor «constitutivo» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o la totalidad de condiciones fisiológicas de la célula.

La expresión promotor «inducible» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo cuando está presente en la célula un inductor que corresponde al promotor.

La expresión promotor «específico para el tejido» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especificado por un gen, provoca que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

La expresión «antígeno asociado al cáncer» o «antígeno tumoral» se refiere indistintamente a una molécula (normalmente una proteína, carbohidrato o lípido) que se expresa en la superficie de una célula cancerosa, ya sea en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido) y que es útil para la actuación preferencial de un agente farmacológico sobre la célula cancerosa. En algunos casos, el antígeno tumoral es un marcador expresado tanto por células normales como por células cancerosas, por ejemplo, un marcador del linaje, por ejemplo, CD19 o CD123 en linfocitos B. En algunos casos, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que está sobreexpresada en una célula cancerosa en comparación con una célula normal, por ejemplo, una sobreexpresión con un factor de 1 , una sobreexpresión con un factor de 2, una sobreexpresión con un factor de 3 o más en comparación con una célula normal. En algunos casos, un antígeno tumoral es una molécula de superficie celular que se sintetiza de manera inapropiada en la célula cancerosa, por ejemplo, una molécula que contiene deleciones, adiciones o mutaciones en comparación con la molécula expresada en una célula normal. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral se expresará exclusivamente en la superficie celular de una célula cancerosa, en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido) y no se sintetiza o expresa en la superficie de una célula normal. En algunos casos, los CAR de la presente invención incluyen CAR que comprenden un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un péptido presentado en MHC. Normalmente, los péptidos procedentes de proteínas endógenas rellenan las cavidades de las moléculas de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y son reconocidos por los receptores de los linfocitos T (TCR) en linfocitos T CD8+. Los complejos de la clase I del MHC son expresados de manera constitutiva por todas las células nucleadas. En el cáncer, los complejos péptido/MHC específicos del virus y/o específicos del tumor representan una clase única de dianas de la superficie celular para la inmunoterapia. Se han descrito anticuerpos similares a TCR que tienen como diana péptidos procedentes de antígenos víricos o tumorales en el contexto del antígeno leucocitario humano (HLA)-A1 o HLA-A2 (remítase, por ejemplo, a Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21 ):1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 20135(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Por ejemplo, se puede identificar un anticuerpo similar a TCR cribando una colección, tal como una colección de presentación en fagos de scFv humano.

La expresión «conector polipeptídico flexible» o «conector», tal como se utiliza en el contexto de un scFv, se refiere a un conector peptídico constituido por aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina utilizados solos o combinados, para conectar regiones de la cadena pesada variables y de la cadena ligera variables. En una realización, el conector polipeptídico flexible es un conector Gly/Ser y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 38), donde n es un número entero positivo igual a o superior a 1. Por ejemplo, n=1, n=2, n=3. n=4, n=5 y n=6, n=7, n=8, n=9 y n=10. En una realización, los conectores polipeptídicos flexibles incluyen, sin carácter limitante, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO:27) o (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO:28). En otra realización, los conectores incluyen múltiples repeticiones de (Gly2Ser), (GlySer) o (Gly3Ser) (SEQ ID NO:29). También se incluyen dentro del alcance de la invención los conectores descritos en el documento w O2012/138475.

Tal como se utiliza en la presente, una caperuza 5' (también denominada una caperuza de ARN, una caperuza de ARN 7-metilguanosina o una caperuza de ARN m7G) es un nucleótido de guanina modificado que ha sido añadido al extremo "frontal" o 5' de un ARN mensajero eucariota poco después del inicio de la transcripción. La caperuza 5' está constituida por un grupo terminal que está ligado al primer nucleótido transcrito. Su presencia es crucial para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección contra las RNasas. La adición de la caperuza está acoplada a la transcripción, y se produce a la vez que la transcripción, de modo que cada una influye en la otra. Poco después del comienzo de la transcripción, el extremo 5' del ARNm que está siendo sintetizado se une a un complejo de síntesis de la caperuza asociado con la ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas que se requieren para la generación de la caperuza del ARNm. La síntesis prosigue como una reacción bioquímica de múltiples pasos. El resto de adición de la caperuza se puede modificar para modular la funcionalidad del ARNm tal como su estabilidad o eficacia de traducción.

Tal como se utiliza en la presente, «ARN transcrito in vitro» se refiere a ARN, preferentemente ARNm, que ha sido sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende un molde que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.

Tal como se utiliza en la presente, un «poli(A)» es una serie de adenosinas unidas por poliadenilación al ARNm. En la realización preferida de un constructo para la expresión transitoria, el poliA está entre 50 y 5000 (SEQ ID NO: 30), preferentemente más de 64, más preferentemente más de 100, de la manera más preferente más de 300 o 400. Las secuencias de poli(A) se pueden modificar por medios químicos o enzimáticos para modular la funcionalidad del ARNm, tal como la ubicación, estabilidad o eficacia de la traducción.

Tal como se utiliza en la presente, el término «poliadenilación» se refiere al enlace covalente de un resto poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En los organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola 3' poli(A) es una secuencia larga de nucleótidos de adenina (a menudo varios cientos) añadidos al pre-ARNm mediante la acción de una enzima, la poliadenilato polimerasa. En eucariotas superiores, la cola poli(A) se añade a transcritos que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola poli(A) y la proteína unida a ella ayudan a proteger el ARNm de la degradación por parte de exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm desde el núcleo y la traducción. La poliadenilación ocurre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción de ADN en ARN, pero además también puede ocurrir más tarde en el citoplasma. Después de finalizar la transcripción, la cadena de ARNm es escindida por la acción de un complejo de endonucleasa asociado con la ARN polimerasa. El sitio de escisión generalmente se caracteriza por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Después de que se haya escindido el ARNm, se añaden residuos adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.

Tal como se utiliza en la presente, «transitorio» se refiere a la expresión de un transgen no integrado durante un período de horas, días o semanas, donde el período de tiempo de expresión es menor que el período de tiempo para la expresión del gen si está integrado en el genoma o está contenido dentro de un replicón plasmídico estable en la célula hospedadora.

Tal como se utilizan en la presente, los términos «tratar», «tratamiento» y «que trata» se refieren a la reducción o mejora de la evolución, gravedad y/o duración de un trastorno proliferativo, o a la mejora de uno o más síntomas (preferentemente, uno o más síntomas discernibles) de un trastorno proliferativo que es el resultado de la administración de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos tales como un CAR de la invención). En realizaciones específicas, los términos «tratar», «tratamiento» y «que trata» se refieren a la mejora de al menos un parámetro físico medible de un trastorno proliferativo, tal como el crecimiento de un tumor, no necesariamente perceptible por el paciente. En otras realizaciones los términos «tratar», «tratamiento» o «que trata» se refieren a la inhibición de la evolución de un trastorno proliferativo, ya sea de manera física, por ejemplo, estabilización de un síntoma perceptible, fisiológica, por ejemplo, estabilización de un parámetro físico, o ambas. En otras realizaciones, los términos «tratar», «tratamiento» y «que trata» se refieren a la reducción o estabilización del tamaño tumoral o recuento de células cancerosas.

La expresión «ruta de transducción de señales» se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señales que desempeñan una función en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. La expresión «receptor de la superficie celular» incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana de una célula.

El término «sujeto» pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, un ser humano).

La expresión célula «sustancialmente purificada» se refiere a una célula que está esencialmente exenta de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos de células con las que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, esta expresión se refiere simplemente a la célula que ha sido separada de las células con las que está normalmente asociada en su estado natural. En algunos aspectos, las células se cultivan in vitro. En otros aspectos, las células no se cultivan in vitro.

El término «terapéutico», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un tratamiento. Se obtiene un efecto terapéutico por reducción, supresión, remisión o erradicación de un estado patológico.

El término «profilaxis», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la prevención o el tratamiento protector para una enfermedad o estado patológico.

En el contexto de la presente invención, «antígeno tumoral» o «antígeno de un trastorno hiperproliferativo» o «antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo» se refiere a antígenos que son comunes a trastornos hiperproliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos del trastorno hiperproliferativo de la presente divulgación proceden de cánceres que incluyen, sin carácter limitante, melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no hodgkiniano, leucemias, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, y similares.

El término «transfectado» o «transformado» o «transducido» se refiere a un proceso por el cual el ácido nucleico exógeno se transfiere o introduce en la célula hospedadora. Una célula «transfectada» o «transformada» o «transducida» es una que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto principal y su progenie.

La expresión «se une específicamente» se refiere a un anticuerpo, o un ligando, que reconoce una proteína que es un compañero de unión afín y se une a este (por ejemplo, una molécula estimuladora y/o coestimuladora presente en un linfocito T) presente en una muestra, pero donde el anticuerpo o ligando no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en la muestra.

La expresión «receptor antigénico quimérico regulable (RCAR, por sus siglas en inglés)», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un conjunto de polipéptidos, normalmente dos en las realizaciones más simples, que cuando están en una célula efectora inmunitaria, proporcionan a la célula especificidad por una célula diana, normalmente una célula cancerosa, y una generación de señales intracelulares regulable. En algunas realizaciones, un RCAR comprende al menos un dominio de unión al antígeno extracelular, uno transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático (también denominado en la presente «un dominio de señalización intracelular») que comprende un dominio de señalización funcional procedente de una molécula estimuladora y/o molécula coestimuladora tal como se define en la presente en el contexto de una molécula CAR. En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos en el RCAR no son contiguos entre sí, por ejemplo, están en diferentes cadenas polipeptídicas. En algunas realizaciones, el RCAR incluye un interruptor de dimerización que, cuando está presente una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión al antígeno con un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el RCAR se expresa en una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria) también descrita en la presente, por ejemplo, una célula que expresa un RCAR (también denominada en la presente «célula RCARX»). En una realización, la célula RCARX es un linfocito T y se denomina linfocito RCART. En una realización, la célula RCARX es un linfocito NK y se denomina célula RCARN. El RCAR puede proporcionar a la célula que expresa el RCAR especificidad por una célula diana, normalmente una célula cancerosa, y la proliferación o generación de señales intracelulares regulables, que puede optimizar una propiedad efectora inmunitaria de la célula que expresa el RCAR. En algunas realizaciones, una célula CAR depende, al menos en parte, de un dominio de unión al antígeno para proporcionar especificidad por la célula diana que comprende el antígeno al que se une el dominio de unión al antígeno.

El «anclaje a la membrana» o «dominio de fijación a la membrana», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a un polipéptido o resto, por ejemplo, un grupo miristoílo, suficiente para anclar un dominio extracelular o intracelular a la membrana plasmática.

El «dominio de tipo interruptor», tal como se utiliza la expresión en la presente, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiere a una entidad, normalmente una entidad de base polipeptídica, que, en presencia de una molécula de dimerización, se asocia con otro dominio de tipo interruptor. La asociación da como resultado un acoplamiento funcional de una primera entidad ligada a, por ejemplo, fusionada con, un primer dominio de tipo interruptor, y una segunda entidad ligada a, por ejemplo, fusionada con, un segundo dominio de tipo interruptor. Un primer y segundo dominios de tipo interruptor se denominan de manera global un interruptor de dimerización. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios de tipo interruptor son idénticos entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria y se denominan de manera global un interruptor de homodimerización. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios de tipo interruptor son diferentes entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos primarias y se denominan de manera global un interruptor de heterodimerización. En algunas realizaciones, el interruptor es intracelular. En algunas realizaciones, el interruptor es extracelular. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, basado en FRB o FKBP, y la molécula de dimerización es una molécula de bajo peso molecular, por ejemplo, un rapálogo. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, un scFv que se une al péptido myc, y la molécula de dimerización es un polipéptido, un fragmento de este, o un multímero de un polipéptido, por ejemplo, un ligando myc o multímeros de un ligando myc que se unen a uno o más scFv para myc. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, un receptor para myc, y la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmento de este, por ejemplo, un anticuerpo para myc.

La «molécula de dimerización», tal como se utiliza la expresión en la presente, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiera una molécula que promueve la asociación de un primer dominio de tipo interruptor con un segundo dominio de tipo interruptor. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización no se produce de manera natural en el sujeto, o no se producen concentraciones que darían como resultado una dimerización significativa. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula de bajo peso molecular, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001.

El término «bioequivalente» se refiere una cantidad de un agente que no es el compuesto de referencia (por ejemplo RAD001), necesaria para producir un efecto equivalente al efecto producido por la dosis de referencia o cantidad de referencia del compuesto de referencia (por ejemplo RAD001). En una realización, el efecto es el nivel de inhibición de mTOR, por ejemplo, tal como se mide en función de la inhibición de la cinasa P70 S6, por ejemplo, tal como se evalúa en un ensayo in vivo o in vitro, por ejemplo, tal como se mide con un ensayo descrito en la presente, por ejemplo el ensayo Boulay, o la medida de los niveles de S6 fosforilada por inmunoelectrotransferencia. En una realización, el efecto es la alteración de la proporción de células efectoras positivas para PD-1/negativas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, según se mide mediante clasificación celular. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que consigue el mismo nivel de inhibición de la cinasa P70 S6 que la dosis de referencia o cantidad de referencia de un compuesto de referencia. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que consigue el mismo nivel de alteración de la proporción de células efectoras inmunitarias positivas para PD-1/negativas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos n K que la dosis de referencia o cantidad de referencia de un compuesto de referencia.

La expresión «dosis baja, de potenciación inmunitaria» cuando se utiliza junto con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, o un inhibidor catalítico de mTOR, se refiere a una dosis de un inhibidor de mTOR que inhibe parcial, pero no totalmente, la actividad de mTOR, por ejemplo, según se mide mediante la inhibición de la actividad cinasa de P70 S6. En la presente se analizan métodos para evaluar la actividad de mTOR, por ejemplo, mediante la inhibición de la cinasa P70 S6. La dosis es insuficiente para dar como resultado una supresión inmunitaria completa pero es suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria. En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado un descenso del número de células efectoras inmunitarias positivas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, y/o un incremento en el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, o un incremento en la proporción de linfocitos T negativos para PD-1/células efectoras inmunitarias positivas para PD-1, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK.

En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado un incremento en el número de células efectoras inmunitarias vírgenes, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK. En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado uno o más de los siguientes:

un incremento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+ y BCL2, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria;

un descenso en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria; y

un incremento en el número de precursores de los linfocitos T de memoria, por ejemplo, células con cualquiera de las siguientes características o una combinación de estas: incremento de CD62Lelevado, incremento de CD127elevado, incremento de CD27+, disminución de KLRG1 e incremento de BCL2;

donde cualquiera de los cambios descritos anteriormente se produce, por ejemplo, al menos de manera transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.

El término «refractario» tal como se utiliza en la presente se refiere una enfermedad, por ejemplo, cáncer, que no responde a un tratamiento. En las realizaciones, un cáncer refractario puede ser resistente a un tratamiento antes o al comienzo del tratamiento. En otras realizaciones, el cáncer refractario se puede volver resistente durante un tratamiento. Un cáncer refractario también se denomina un cáncer resistente.

El término «recurrente» o «recaída» tal como se utiliza en la presente se refiere a la recurrencia o reaparición de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) o las señales y síntomas de una enfermedad tal como el cáncer después de un periodo de mejora o respuesta, por ejemplo, después del tratamiento anterior de una terapia, por ejemplo, terapia contra el cáncer. El periodo inicial de respuesta puede conllevar que el nivel de células cancerosas caiga por debajo de un cierto umbral, por ejemplo, por debajo de un 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, o un 1%. La reaparición puede conllevar que el nivel de células cancerosas se eleve por encima de un cierto umbral, por ejemplo, por encima de un 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, o un 1%. Por ejemplo, por ejemplo, en el contexto de B-ALL, la reaparición puede conllevar, por ejemplo, una reaparición de blastos en la sangre, médula ósea (> 5%), o cualquier sitio extramedular, después de una respuesta completa. Una respuesta completa, en este contexto, puede conllevar <5% de blastocitos BM. De manera más general, en una realización, una respuesta (por ejemplo, respuesta completa o respuesta parcial) puede conllevar la ausencia de MRD (siglas en inglés de enfermedad residual mínima) detectable. En una realización, el periodo inicial de respuesta dura al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días; al menos 1,2, 3 o 4 semanas; al menos 1,2, 3, 4, 6, 8, 10 o 12 meses; o al menos 1,2, 3, 4 o 5 años.

En algunas realizaciones, una terapia que incluye un inhibidor de CD19, por ejemplo, una terapia con CAR CD19, puede presentar recaídas o ser refractaria al tratamiento. La recaída o resistencia puede estar provocada por la pérdida de CD19 (por ejemplo, una mutación con pérdida del antígeno) u otra alteración de CD19 que reduzca el nivel de CD19 (por ejemplo, provocada por la selección clonal de clones negativos para CD19). Un cáncer que alberga tal pérdida o alteración de CD19 se denomina en la presente como un «cáncer negativo para CD19» o un «cáncer recurrente negativo para CD19»). Se entenderá que no es necesario que un cáncer negativo para CD19 tenga una pérdida de CD19 de un 100%, sino una reducción suficiente para reducir la eficacia de una terapia para CD19 de modo que el cáncer presente recaídas o se vuelva refractario. En algunas realizaciones, un cáncer negativo para CD19 es el resultado de una terapia con CAR CD19.

Intervalos: a lo largo de esta divulgación, se pueden presentar en un formato de intervalo diversos aspectos de la invención. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no se debe interpretar como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo divulga específicamente todos los posibles subintervalos, así como también los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 divulga específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como también números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Como otro ejemplo, un intervalo tal como una identidad de un 95-99%, incluye algo con una identidad de un 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, e incluye subintervalos tales como una identidad de un 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% y un 98-99%. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

En la presente se proporcionan composiciones de materia y métodos de uso para el tratamiento o prevención de una enfermedad tal como el cáncer utilizando receptores antigénicos quiméricos (CAR) CD123.

En un aspecto, la divulgación proporciona varios receptores antigénicos quiméricos (CAR) que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo modificado para unirse de manera específica a una proteína CD123 o fragmentos de esta. En un aspecto, la divulgación proporciona una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T o un linfocito NK) modificado para expresar un CAR, donde la célula que expresa un CAR (por ejemplo, linfocito NK que expresa un CAR o «CART») exhibe una propiedad antitumoral. En un aspecto, una célula se transforma con el CAR y al menos una parte del CAR se expresa en la superficie celular. En algunos casos, la célula (por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) se transduce con un vector vírico que codifica un CAR. En algunos casos, el vector vírico es un vector retrovírico. En algunos casos, el vector vírico es un vector lentivírico. En tales casos, la célula puede expresar de manera estable el CAR. En otro caso, la célula (por ejemplo, célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) se transfecta con un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADNc, ADN, que codifica un CAR. En algunos de tales casos, la célula puede expresar de manera transitoria el CAR.

En un aspecto, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, el dominio de unión a CD123 humano o humanizado, del CAR es un fragmento de anticuerpo scFv. En un aspecto, tales fragmentos de anticuerpo son funcionales en el sentido de que retienen la afinidad de unión equivalente, por ejemplo, se unen al mismo antígeno con una eficacia equiparable, a la del anticuerpo IgG que tiene las mismas regiones variables de la cadena pesada y ligera. En un aspecto, tales fragmentos de anticuerpo son funcionales en el sentido de que proporcionan una respuesta biológica que puede incluir, sin carácter limitante, activación de una respuesta inmunitaria, inhibición del origen de la transducción de señales de su antígeno diana, inhibición de la actividad cinasa y similares, como entenderá un experto.

En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación se incorporan a un receptor antigénico quimérico (CAR). En un aspecto, el CAR comprende la secuencia polipeptídica proporcionada en la presente como las SEQ ID NO: 98-101, y 125 156.

En un aspecto, la porción que es el dominio de unión a CD123, por ejemplo, dominio de unión a CD123 humanizado o humano, de un CAR de la invención está codificada por un transgen cuya secuencia ha experimentado optimización de codones para la expresión en una célula de mamífero. En un aspecto, todo el constructo CAR de la invención está codificado por un transgen cuya secuencia completa ha experimentado optimización de codones para la expresión en una célula de mamífero. La optimización de codones se refiere al descubrimiento de que la frecuencia de aparición de codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido) en el ADN codificante presenta un sesgo en diferentes especies. Una degeneración de codones de este tipo permite que un polipéptido idéntico esté codificado por diversas secuencias de nucleótidos. En la técnica se conocen diversos métodos de optimización de codones e incluyen, por ejemplo, los métodos divulgados en al menos las Patentes de EE. UU. N.os 5786464 y 6114148.

En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD123 humano. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD123 humanizado. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo para CD123 que comprende un scFv. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR es un scFv para CD123 humano. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo para CD123 humanizado que comprende un scFv. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR es un scFv para CD123 humanizado.

En un aspecto, el dominio de unión a CAR123 comprende la porción scFv proporcionada en las SEQ ID NO:157-160 y 184-215. En un aspecto, la porción scFv es humana. En un aspecto, el dominio de unión a CAR123 humano comprende la porción scFv proporcionada en las SEQ ID NO:157-160. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 157. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 158. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 159. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 160. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 478. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 480. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 483. En un aspecto el dominio de unión a CD123 humano comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO: 485.

En un aspecto, la porción scFv está humanizada. En un aspecto, el dominio de unión a CAR123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en las SEQ ID NO:184-215. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 184. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 185. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 186. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 187. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 188. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 189. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 190. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 191. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 192. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 193. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 194. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 195. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 196. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 197. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 198. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 199. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 200. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 201. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 202. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 203. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 204. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 205. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 206. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 207. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 208. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 209. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 210. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 211. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 212. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 213. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 214. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en la SEQ ID NO 215. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en las SEQ ID NOs: 556-587.

Además, la presente divulgación proporciona composiciones de CAR CD123 y su uso en medicamentos o métodos para tratar, entre otras enfermedades, cáncer o cualquier neoplasia maligna o enfermedades autoinmunitarias que implican células o tejidos que expresan CD123.

En un aspecto, el CAR de la invención se puede utilizar para erradicar células normales que expresan CD123, y de esta manera tiene aplicación en el uso como una terapia de acondicionamiento celular antes del trasplante de células. En un aspecto, la célula normal que expresa CD123 es una célula progenitora mieloide que expresa que expresa CD123 y el trasplante de células es un trasplante de células madre.

En un aspecto, la invención proporciona una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T o un linfocito NK) modificado para expresar un receptor antigénico quimérico (por ejemplo, célula efectora inmunitaria que expresa CAR, por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR o CART) de la presente invención, donde la célula (por ejemplo, «CART») exhibe una propiedad antitumoral. En consecuencia, la invención proporciona un CAR-CD123 que comprende un dominio de unión a CD123 que se introduce en una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T o un linfocito NK, y métodos de su uso para la terapia adoptiva.

En un aspecto, el CAR-CD123 comprende al menos un dominio intracelular, por ejemplo, descrito en la presente, por ejemplo, seleccionado del grupo de un dominio de señalización de CD137 (4-1BB), un dominio de señalización de CD28, dominio de señalización de CD3zeta y cualquier combinación de estos. En un aspecto, el CAR-CD123 comprende al menos un dominio de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras que no son un CD123 (4-1BB) o CD28.

Receptor Antigénico Quimérico (CAR)

La presente divulgación engloba un constructo de ADN recombinante que comprende secuencias que codifican un CAR, donde el CAR comprende un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo) que se une específicamente a CD123 o un fragmento de este, por ejemplo, CD123 humano, donde la secuencia del dominio de unión a CD123 (por ejemplo, anticuerpo o fragmento anticuerpo) es, por ejemplo, contiguo a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular y está en el mismo marco de lectura que esta. El dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización coestimulador y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, una cadena zeta. El dominio de señalización coestimulador se refiere a una porción del CAR que comprende al menos una porción del dominio intracelular de una molécula coestimuladora.

En aspectos específicos, un constructo CAR de la presente divulgación comprende un dominio scFv seleccionado del grupo constituido por las SEQ ID NOS:157-160,184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587, donde el scFv puede estar precedido por una secuencia líder opcional tal como se proporciona en la SEQ ID NO: 1 y seguido por una secuencia de

bisagra opcional tal como se proporciona en la SEQ ID No :2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o Se Q ID NO:5, una región transmembrana tal como se proporciona en la SEQ ID NO:6, un dominio de señalización intracelular que incluye la SEQ

ID NO:7 o la SEQ ID NO:8 y una secuencia CD3 zeta que incluye la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, por ejemplo, donde

los dominios son contiguos y están en el mismo marco de lectura para formar una única proteína de fusión. En algunos

casos, el dominio scFv es un dominio scFv humano seleccionado del grupo constituido por las SEQ ID NOS: 157-160,

478, 480, 483 y 485. En algunos casos, el dominio scFv es un dominio scFv humanizado seleccionado del grupo constituido por las SEQ ID NOS: 184-215 y 556-587. También se incluye en la presente divulgación una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cada uno de los fragmentos scFv seleccionados del grupo constituido por las

SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587. También se incluye en la presente divulgación una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cada uno de los fragmentos scFv seleccionados del grupo constituido por las SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587, y cada uno de los dominios de las s Eq

ID NOS: 1,2, y 6-9, más el CAR CD123 codificado de la invención.

En un aspecto, los constructos CARCD123 a modo de ejemplo comprenden una secuencia líder opcional, un dominio de

unión al antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio estimulador intracelular. En un aspecto, un constructo CARCD123 a modo de ejemplo comprende una secuencia líder opcional, un dominio de unión al antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular y un dominio estimulador intracelular.

En algunos casos, las secuencias CAR CD123 completas también se proporcionan en la presente como las SEQ ID NOS:

98-101 y 125-156, tal como se muestra en la Tabla 2 o 6.

Se proporciona una secuencia líder a modo de ejemplo como la SEQ ID NO: 1. Se proporciona una secuencia de bisagra/espaciadora a modo de ejemplo como la Se Q ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5. Se proporciona una secuencia del dominio transmembrana a modo de ejemplo como la SEQ ID NO:6. Se proporciona una secuencia a modo de ejemplo del dominio de señalización intracelular de la proteína 4-1BB como la SEQ Id NO: 7. Se proporciona una secuencia a modo de ejemplo del dominio de señalización intracelular de CD27 como la SEQ ID NO:8.

Se proporciona una secuencia del dominio CD3zeta a modo de ejemplo como la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Se proporciona una secuencia a modo de ejemplo del dominio de señalización intracelular de CD28 como la SEQ ID NO:43.

Se proporciona una secuencia a modo de ejemplo del dominio de señalización intracelular de ICOS como la SEQ ID NO:45.

En un aspecto, la presente divulgación engloba un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a CD123, por ejemplo, descrito en la presente, por ejemplo, que es contiguo a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular y está en el mismo marco de lectura

que esta. En un aspecto, un dominio de unión a CD123 se selecciona entre una o más de las SEQ ID NOS: 157-160, 184

215, 478, 480, 483, 485 y 556-587. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 es un dominio de unión a CD123 humano seleccionado del grupo constituido por las SEQ ID NOS: 157-160, 478, 480, 483 y 485. En algunos casos, el dominio de unión a CD123 es un dominio de unión a CD123 humanizado seleccionado del grupo constituido por las SEQ

ID NOS: 184-215 y 556-587. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 157. En un aspecto, el

ID No : 159.

to, el

ID No : 210.

En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 211. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 212. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 213. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 213. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 215. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID No : 478. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID No : 480. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 483. En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es la SEQ ID NO: 485.

En un aspecto, la presente divulgación engloba un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a CD123, por ejemplo, donde la secuencia es contigua a la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular y está en el mismo marco de lectura que esta. Un dominio de señalización intracelular a modo de ejemplo que se puede utilizar en el CAR incluye, sin carácter limitante, uno o más dominios de señalización intracelular de, por ejemplo, CD3-zeta, CD28, 4-1BB, ICOS y similares. En algunos casos, el CAR puede comprender cualquier combinación CD3-zeta, CD28, 4-1BB, ICOS y similares.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR de la divulgación se selecciona entre una o más de las SEQ ID NOS:39-42 y 66-97. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:39. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:40. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:41. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:42. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:66. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:67. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:68. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo ^cA^rcomprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:69. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:70. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:71. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:72. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:73. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:74. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:75. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:76. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo c Ar comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:77. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:78. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID n O:79. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:80. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:81. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:82. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:83. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:84. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo c Ar comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:85. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:86. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID n O:87. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:88. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:89. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:90. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:91. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:92. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo c Ar comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:93. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:94. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID n O:95. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:96. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR comprende (por ejemplo, está constituida por) la SEQ ID NO:97. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cribando colecciones de células que expresan el gen, obteniendo el gen de un vector que se sabe que los incluye, o aislándolo directamente de células y tejidos que lo contienen, utilizando técnicas estándar. Como alternativa, el ácido nucleico de interés se puede producir por vías sintéticas, en lugar de clonarse.

La presente invención incluye constructos vectoriales retrovíricos y lentivíricos que expresan un CAR que se puede utilizar para transducir directamente una célula.

La presente invención también incluye un constructo de ARN que se puede utilizar directamente para transfectar una célula. Un método para generar ARNm para su uso en la transfección conlleva la transcripción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés) de un molde con cebadores diseñados especialmente, seguido de la adición de poliA, para producir un constructo que contiene la secuencia no traducida 3' y 5' («UTR»), una caperuza 5' y/o un Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés), el ácido nucleico que se va a expresar y una cola de poliA, normalmente de una longitud de 50 a 2000 bases. El ARN producido de esta manera se puede utilizar para transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En una realización, el molde incluye secuencias para el CAR. En una realización, un vector de ARN de CAR se utiliza para transducir un linfocito T por electroporación.

Dominio de unión al antígeno

En un aspecto, el CAR de la presente divulgación comprende un elemento de unión específico para la diana al que se denomina de otra manera un dominio de unión al antígeno. La elección del resto depende del tipo y del número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno se puede elegir para reconocer un ligando que actúa como un marcador de la superficie celular en las células diana asociadas con un estado patológico particular.

En un aspecto, la respuesta de linfocitos T mediada por CAR se puede dirigir a un antígeno de interés modificando un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno deseado en el CAR.

En un aspecto, la porción del CAR que comprende el dominio de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que tiene como diana CDR123 o un fragmento de este. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno tiene como diana CD123 humano o un fragmento de este.

El dominio de unión al antígeno puede ser cualquier dominio que se une al antígeno incluidos, sin carácter limitante, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, y un fragmento funcional de estos, incluidos, sin carácter limitante, un anticuerpo de dominio único tal como un dominio variable de la cadena pesada (VH), un dominio variable de la cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de un nanocuerpo procedente de un camélido, y a un esqueleto alternativo del que se sabe en la técnica que funciona como un dominio de unión al antígeno, tal como un dominio de fibronectina recombinante, y similares. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno proceda de la misma especie en la que se utilizará finalmente el CAR. Por ejemplo, para uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno proceda de la misma especie en la que se utilizará finalmente el CAR. Por ejemplo, para uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por lo tanto, en un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo. En un caso, el dominio de unión a CD123 humano comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD123 humano descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 humano descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humano que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD123 humano comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de la HC) y la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 humano descrito en la presente, por ejemplo, el dominio de unión a CD123 humano tiene dos regiones variables de la cadena pesada, comprendiendo cada una una CDR1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC descritas en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD123 humano comprende una región variable de la cadena ligera humana descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 o 9) y/o una región variable de la cadena pesada humana descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 o 9). En un caso, el dominio de unión a CD123 humano comprende una región variable de la cadena pesada humana descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 o 9), por ejemplo, al menos dos regiones variables de la cadena pesada humana descritas en la presente (por ejemplo, en la Tabla 2 o 9). En un caso, el dominio de unión a CD123 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 o 9. En un caso, el dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 2 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2 o 9, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 o 9. En un caso, el dominio de unión a CD123 humano comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:157-160, 478, 480, 483 y 485, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD123 humano es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2 o 9, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 2, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD123 humano incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4 (SEQ ID NO:26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesadaconector-región variable de la cadena ligera.

En algunos aspectos, un anticuerpo no humano se humaniza, donde las secuencias o regiones específicas del anticuerpo se modifican para incrementar la similitud con un anticuerpo producido de forma natural en un ser humano o fragmento de este. Por lo tanto, en un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizados. En un caso, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión a CD123 humanizado descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 humanizado descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humanizado que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC y una o más, por ejemplo, las tres, CDR de HC. En un caso, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de la HC) y la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC) de un dominio de unión a CD123 humanizado descrito en la presente, por ejemplo, el dominio de unión a CD123 humanizado tiene dos regiones variables de la cadena pesada, comprendiendo cada una una CDR1 de HC, una CDR2 de HC y una CDR3 de HC descritas en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende una región variable de la cadena ligera humanizada descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 6) y/o una región variable de la cadena pesada humanizada descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 6). En un caso, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende una región variable de la cadena pesada humanizada descrita en la presente (por ejemplo, en la Tabla 6), por ejemplo, al menos dos regiones variables de la cadena pesada humanizada descritas en la presente (por ejemplo, en la Tabla 6). En un caso, el dominio de unión a CD123 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 6. En un caso, el dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 4, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 6; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 6. En un caso, el dominio de unión a CD123 humanizado comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:184-215 y 302-333, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD123 humanizado es un scFv, y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 6, está unida a una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 6, mediante un conector, por ejemplo, un conector descrito en la presente. En un caso, el dominio de unión a CD123 humanizado incluye un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4 (SEQ ID NO:26). La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-conector-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-conector-región variable de la cadena ligera.

Se puede producir un anticuerpo humanizado utilizando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, sin carácter limitante, injerto de CDR (remítase, por ejemplo, a la Patente Europea N.° EP 239400; Publicación Internacional N.° WO 91/09967; y las Pat. de EE. UU. N.os 5225539, 5530 101 y 5585089, rebarnizado o rechapado (remítase, por ejemplo, a las Patentes Europeas N.os EP 592 106 y EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, 91: 969-973, reordenamiento de cadenas (remítase, por ejemplo, a la Pat. de EE. UU. N.° 5565332, y técnicas divulgadas en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° US2005/0042664, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° US2005/0048617, la Pat. de EE. UU. N.° 6407213, la Pat. de EE.UU. N.° 5766886, Publicación Internacional N.° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng, 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Sup):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994) y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994). A menudo, los residuos de armazón en las regiones de armazón se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar la unión al antígeno. Estas sustituciones de armazón se identifican por métodos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de la CDR y los residuos de armazón para identificar residuos de armazón importantes para la unión al antígeno y la comparación secuencial para identificar residuos de armazón inusuales en posiciones particulares. (Remítase, por ejemplo, a Queen et al., Pat. de EE. UU. N.° 5 585089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323).

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos que permanecen en él de una fuente que no es humana. A estos residuos aminoacídicos no humanos se les denomina a menudo residuos «importados», que típicamente se toman de un dominio variable «importado». Tal como se proporciona en la presente, los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos humanizados comprenden una o más CDR de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones de armazón donde los residuos aminoacídicos que comprenden el armazón proceden completa o principalmente de la línea germinal humana. Múltiples técnicas para la humanización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son muy conocidas en la técnica y pueden realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), colocando CDR o secuencias de CDR de roedores en lugar de las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano, es decir, injerto de CDR (documento EP 239400; Publicación PCT N.° WO 91/09967; y Pat. de EE. UU. N.os 4816567; 6331 415; 5225539; 5530 101; 5585089; 6548640). En anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanizados de este tipo, sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. Los anticuerpos humanizados son a menudo anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de armazón (FR) son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos también se puede lograr mediante rebarnizado o rechapado (documentos EP 592 106; EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) o reordenamiento de cadenas (Pat. de EE. UU. N.° 5 565332).

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se pueden utilizar en la producción de los anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado método de «mejor ajuste», la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la colección de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como el armazón (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza un armazón particular procedente de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Se puede utilizar el mismo armazón para diferentes anticuerpos humanizados (remítase, por ejemplo, a Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Us a , 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). En algunas realizaciones, la región de armazón, por ejemplo, las cuatro regiones de armazón, de la región variable de la cadena pesada proceden de una secuencia de la línea germinal VH4_4-59. En una realización, la región de armazón puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente. En una realización, la región de armazón, por ejemplo, las cuatro regiones de armazón, de la región variable de la cadena ligera proceden de una secuencia de la línea germinal VK3_1.25. En una realización, la región de armazón puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente.

En algunos aspectos, la porción de una composición de CAR de la invención que comprende un fragmento de anticuerpo se humaniza con retención de alta afinidad por el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. De acuerdo con un aspecto de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Se puede disponer fácilmente de modelos tridimensionales de inmunoglobulina y los expertos en la técnica están familiarizados con ellos. Se puede disponer de programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidata seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, por ejemplo, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno diana. De esta forma, los residuos Fr se pueden seleccionar y combinar de secuencias del receptor y de importación de modo que se logre la característica deseada de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un incremento de la afinidad por el antígeno diana. En general, los residuos de CDR están directamente y muy sustancialmente implicados en influenciar la unión al antígeno.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado puede que retenga una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, por ejemplo, en la presente divulgación, la capacidad de unirse a CD123 o un fragmento de este. En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado puede que tenga una mejor afinidad y/o especificidad de unión a CD123 humano o un fragmento de este.

En un aspecto, la porción que es el dominio de unión al antígeno comprende una o más secuencias seleccionadas entre las SEQ Id NOS:157-160,184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587. En un aspecto, el CAR CD123 que incluye un dominio de unión a CD123 humano se selecciona entre una o más secuencias seleccionadas entre las SEQ ID NOS:157-160, 478, 480, 483 y 485. En un aspecto, el CAR CD123 que incluye un dominio de unión a CD123 humanizado se selecciona entre una o más secuencias seleccionadas entre las SEQ ID NOS:184-215 y 556-587.

En un aspecto, el dominio de unión a CD123 se caracteriza por características o propiedades funcionales particulares de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, en un aspecto, la porción de una composición CAR de la presente divulgación que comprende un dominio de unión al antígeno se une específicamente a CD123 humano o un fragmento de este. En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un dominio de unión al antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, donde el dominio de unión del anticuerpo se une específicamente a una proteína CD123 o fragmento de esta, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos de la SeQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de un scFv seleccionado entre las SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587. En ciertos aspectos, el scFv es contiguo a la secuencia líder y está en el mismo marco de lectura que esta. En un aspecto, la secuencia líder es la secuencia polipeptídica proporcionada como la SEQ ID NO:1.

En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es un fragmento, por ejemplo, un fragmento variable monocatenario (scFv). En un aspecto, el dominio de unión a CD123 es un Fv, un Fab o un (Fab')2, o un anticuerpo híbrido bifuncional (por ejemplo, biespecífico) (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de estos de la presente divulgación se unen a la proteína CD123 o un fragmento de esta con una afinidad de tipo natural o potenciada.

En algunos casos, un scFv humano también puede proceder de una colección de presentación. Una colección de presentación es una agrupación de entidades; cada entidad incluye un componente polipeptídico accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente polipeptídico. El componente polipeptídico se hace variar de manera que están representadas las diferentes secuencias aminoacídicas. El componente polipeptídico puede tener cualquier longitud, por ejemplo, de tres aminoácidos a más de 300 aminoácidos. Una colección de presentación puede incluir más de un componente polipeptídico, por ejemplo, las dos cadenas polipeptídicas de un Fab. En un caso a modo de ejemplo, una colección de presentación se puede utilizar para identificar un dominio de unión a CD123 humano. En una selección, el componente polipeptídico de cada miembro de la colección se explora con CD123 o un fragmento de este, y si el componente polipeptídico se une a CD123, el miembro de la colección de presentación se identifica, normalmente mediante retención en un soporte.

Los miembros de la colección de presentación retenidos se recuperan del soporte y se analizan. El análisis puede incluir la amplificación y una selección posterior en condiciones similares o diferentes. Por ejemplo, se pueden alternar selecciones positivas y negativas. El análisis también puede incluir determinar la secuencia de aminoácidos del componente polipeptídico, es decir, el dominio de unión anti-CD123, y la purificación del componente polipeptídico para una caracterización detallada.

Se puede utilizar una variedad de formatos para las colecciones de presentación. Los ejemplos incluyen la presentación en fagos. En la presentación en fagos, el componente proteico está normalmente ligado de manera covalente a una proteína del recubrimiento del bacteriófago. La unión es el resultado de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente proteico fusionado a la proteína del recubrimiento. La unión puede incluir un conector peptídico flexible, un sitio de proteasa o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de parada. La presentación en fago se describe, por ejemplo, en los documentos U.S. 5223409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8. Los bacteriófagos que presentan el componente proteico se pueden cultivar y recolectar utilizando métodos de preparación de fagos estándar, por ejemplo, precipitación con PEG del medio de cultivo. Después de la selección de fagos de presentación individuales, el ácido nucleico que codifica los componentes proteicos seleccionados se puede aislar a partir de células infectadas con los fagos seleccionados o a partir de los propios fagos, después de la amplificación. Se pueden recoger las colonias o placas individuales y se puede aislar y secuenciar el ácido nucleico.

Otros formatos de presentación incluyen la presentación en células (remítase, por ejemplo, al documento WO 03/029456), fusiones proteína/ácido nucleico (remítase, por ejemplo, al documento US 6207 446), presentación en ribosomas (remítase, por ejemplo, a Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol.

18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2): 119-35), y presentación periplásmica en E. coli (22 de noviembre de 2005;PMID: 16337958).

En algunos casos, los scFv se pueden preparar de acuerdo con un método conocido en la técnica (remítase, por ejemplo, a Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Las moléculas de ScFv se pueden producir ligando regiones VH y VL entre sí utilizando conectores polipeptídicos flexibles. Las moléculas de scFv comprenden un conector (por ejemplo, un conector de Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizadas. La longitud del conector puede afectar en gran medida la forma en que las regiones variables de un scFv se pliegan e interactúan. De hecho, si se emplea un conector polipeptídico corto (por ejemplo, entre 5-10 aminoácidos) se evita el plegamiento intracatenario. También se requiere plegamiento intercatenario para unir las dos regiones variables con el fin de formar un sitio de unión al epítopo funcional. Para consultar ejemplos de orientación del conector y tamaño, remítase, por ejemplo, a Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. N.os 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 y publicaciones PCT N.os WO2006/020258 y WO2007/024715.

Un scFv puede comprender un conector de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos aminoacídicos entre sus regiones Vl y VH. La secuencia de conector puede comprender cualquier aminoácido que se produce de forma natural. En algunas realizaciones, la secuencia conectora comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra realización, la secuencia conectora comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tales como (Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo igual o superior a 1 (SEQ ID NO:25). En una realización, el conector puede ser (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:27) o (Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28). La variación en la longitud del conector puede retener o potenciar la actividad, lo que da lugar a una eficacia superior en estudios de actividad.

Constructos CAR CD123 a modo de ejemplo y dominios de unión al antígeno

Los constructos CAR CD123 divulgados en la presente a modo de ejemplo comprenden un scFv (por ejemplo, un scFv humano tal como se divulga en las Tablas 2, 6 y 9 de la presente, precedido opcionalmente por una secuencia líder opcional (por ejemplo, la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:12 para las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos líder a modo de ejemplo, respectivamente). Las secuencias de los fragmentos scFv humanos (secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 157-160) se proporcionan en la presente en la Tabla 2. Las secuencias de fragmentos scFv humanos, sin la secuencia líder, se proporcionan en la presente en la Tabla 9 (SEQ ID NOs: 479, 481,482 y 484 para las secuencias de nucleótidos, y las Se Q iD NOs: 478, 480, 483 y 485 para las secuencias aminoacídicas). El constructo CAR CD123 puede incluir además un dominio bisagra opcional, por ejemplo, un dominio bisagra de CD8 (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o codificado por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13); un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana de CD8 (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17); un dominio intracelular, por ejemplo, un dominio intracelular de 4-1BB (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18); y un dominio de señalización funcional, por ejemplo, un dominio de CD3 zeta (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o 10, o codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 20 o 21). En ciertos casos, los dominios son contiguos y están en el mismo marco de lectura para formar una proteína de fusión única. En otros casos, los dominios están en polipéptidos separados, por ejemplo, como en una molécula RCAR tal como se describe en la presente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123 completa incluye la secuencia de aminoácidos de, o está codificada por la secuencia de nucleótidos de, CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, o hzCD123-32, que se proporciona en la Tabla 2, 6 o 9, o una secuencia sustancialmente (por ejemplo, 95-99%) idéntica a esta.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123, o el dominio de unión al antígeno de CD123, incluye la secuencia de aminoácidos de scFv de CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, o hzCD123-32, que se proporciona en la Tabla 2, 6 o 9; o incluye la secuencia de aminoácidos de scFv de, o está codificada por la secuencia de nucleótidos de, CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, o hzCD123-32, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o con hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123, o el dominio de unión al antígeno de CD123, incluye la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera de CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, o hzCD123-32, que se proporciona en la Tabla 2 o 6, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o con hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123, o el dominio de unión al antígeno de CD123, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1H, CDR2H y/o CDR3H) que se proporcionan en la Tabla 3 o 7; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1L, c Dr 2l y/o CDR3L) de CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, o hzCD123-32, que se proporcionan en la Tabla 4 o 8; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o con hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CAR CD123, o el dominio de unión al antígeno de CD123, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1H, CDR2H y/o CDR3H) que se proporcionan en la Tabla 10; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1L, CDR2L y/o CDR3L) de CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, o hzCD123-32, que se proporcionan en la Tabla 11; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o con hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En ciertos casos, la molécula CD123, o el dominio de unión al antígeno de CD123, incluye una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena pesada (por ejemplo, CDR1H, CDR2H y/o CDR3H) que se proporcionan en la Tabla 12; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de la cadena ligera (por ejemplo, CDR1L, CDR2L y/o CDR3L) de CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, o hzCD123-32, que se proporcionan en la Tabla 13; o una secuencia sustancialmente (por ejemplo, idéntica en un 95-99%, o con hasta 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos) respecto a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

Las secuencias de las secuencias CDR de los dominios scFv se muestran en las Tablas 3, 7, 10 y 12 para los dominios variables de la cadena pesada y en las Tablas 4, 8, 11 y 13 para los dominios variables de la cadena ligera. «ID» representa la SEQ ID NO respectiva para cada CDR.

Las CDR proporcionadas en las Tablas 3, 4, 7 y 8 son según una combinación del esquema de numeración de Kabat y Chothia.

Tabla 3. CDR del dominio variable de la cadena pesada

Tabla 4. CDR del dominio variable de la cadena li era

Tabla 7. CDR del dominio variable de la cadena pesada

Tabla 8. CDR del dominio variable de la cadena li era

Tabla 10. CDR del dominio variable de la cadena pesada según el esquema de numeración de Kabat (Kabat e t a l. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5.a Ed. Servicio Nacional de Salud, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD

Tabla 11. CDR del dominio variable de la cadena ligera según el esquema de numeración de Kabat (Kabat e t a l. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5.a Ed. Servicio Nacional de Salud, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD

Tabla 12. CDR del dominio variable de la cadena pesada según el esquema de numeración de Chothia (Al-Lazikani e t a l., (1997 J M B 273,927-948

Tabla 13. CDR del dominio variable de la cadena ligera según el esquema de numeración de Chothia (Al-Lazikani e t a l., (1997 J M B 273,927-948

En algunos casos, los fragmentos variables monocatenarios de CD123 se generan y clonan en vectores de expresión CAR lentivíricos con el dominio intracelular CD3zeta y el dominio coestimulador intracelular de 4-1BB. Los nombres de los scFv CD123 totalmente humanos se muestran en la Tabla 1. Los nombres de los scFv CD123 humanizados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 1: Constructos CAR-CD123

Tabla 5: Constructos CAR-CD123

En algunos casos, se hace variar el orden en el que aparecen los dominios VL y VH en el scFv (es decir, orientación VL-VH o VH-VL) y donde tres o cuatro copias de la subunidad «G4S» (SEQ ID NO:25), en las que cada subunidad comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID NO:25) (por ejemplo, (G4S)3 (SEQ ID NO:28) o (G4S)4(SEQ ID NO:27)), conectan los dominios variables para crear la totalidad del dominio scFv, tal como se muestra en la Tabla 2, Tabla 6 y Tabla 9.

Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de los dominios scFv CD123 y moléculas CAR CD123 se proporcionan en la Tabla 2, Tabla 6 y Tabla 9. Las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada variable y la cadena ligera variable para cada scFv también se proporcionan en la Tabla 2 y Tabla 6. Cabe señalar que los fragmentos scFv (SEQ ID NOs: 157-160 y 184-215) con una secuencia líder (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12) y sin una secuencia líder (SEQ ID NOs: 478, 480, 483, 485 y 556-587) también están englobados por la presente divulgación.

Líder (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 1)

MALPVTALLLPLALLLHAARP

Líder (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 12)

A TG G CCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCC

GCTAGACCC

Bisagra de CD8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 2)

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

Bisagra de CD8 (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 13)

A C C A C G A C G C C A G CG CCG CG A C CA CCA A CA CCG G CG CCCA CCA TCG CG TCG CA GCCCCTGTCCCTG CG CCCA G A G G CG TG CC G GC CA G CG G CG G G G G G CG CA G TG C AC A CG A G G GGGCT GG ACTT CGCCTGTG AT

Transmembrana de CD8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 6) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

Transmembrana de CD8 (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 17) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTG GTTATCACCCTTTACTGC

Dominio intracelular de 4-1BB (secuencia de aminoácidos); (SEQ ID NO: 7) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

Dominio intracelular de 4-1BB (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 18) AAACGGGGCAGA A A G A A A CTCCTG TA TA TA TTCA A A CA A CCA TTTA TG A G A CC A G TAC AAACTA CTCA A G A G G A A G A T GGCT GT AG CTG CCG A TTT CC AGAAGAAG AAGAA G G A G G A TG T GAACTG

Dominio intracelular de CD28 (secuencia de aminoácidos); (SEQ ID NO: 43) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 43)

Dominio intracelular de CD28 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 44)

A G G A G TA A G A G G A G C A G G CTCCTG CA CA G TG A CTA CA TG A A CA TG A CTCCCCG C C G CCCCG G G CCCA C CCG CA A G CA TTA CCA G CCCTA TG CCCCA CCA CG CG A CTT CGCAG CCTA TCG CTCC (SEQ ID NO: 44)

Dominio intracelular de ICOS (secuencia de aminoácidos); (SEQ ID NO: 45)

T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L (SEQ ID NO: 45) Dominio intracelular de ICOS (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO: 46)

AC A A A A A A G AA G T A TT C A TC C A G T GT GC A CG ACC CT A A C G G T G AAT AC AT GTT C AT G AG AGC AGT GAACACAG CCAAAAAAT CCAG ACT CAC AG A T GT GACCCTA

(SEQ ID NO: 46)

Dominio de CD3 zeta (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 9)

R V K FSR SA D A PA Y K Q G Q N Q LY N ELN LG RREEY D V LD K RRG RD PEM G G K PR RK N P Q EG LY N ELQ K D K M A EA Y SEIG M K G ERRRG K G H D G LY Q G LSTA TK D TY D A LH M Q A LPPR

CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 20)

A G A G TG A A G TTCA G CA G G A G CG CA G A CG CCCCCG CG TA CA A G CA G G G CCA G A A CCA G CTCTA TA A CG A G CTCA A TCTA G G A CG A A G A G A G G A G TA CG A TG TTTTG GACA A G A G A CG TG G CCG G G A CCCTG A G A TG G G G G G A A A G CCG A G A A G G A A G A ACCCTCA G G A A G G CCTG TA CA A TG A A CTG CA G A A A G A TA A G A TG G CG G A G G CC TACAGTG A G A TTG G G A TG A A A G G CG A G CG CCG G A G G G G CA A G G G G CA CG A TG GCCTTTACCAGG G TCTCA G TA CA G CCA CCA A G G A CA CCTA CG A CG CCC TTC A CA T GCAGGCCCT GCCCCCT CGC

Dominio de CD3 zeta (secuencia de aminoácidos; Secuencia de referencia NCBI NM 000734.3) (SEQ ID NO: 10)

RVKFSRSADAPA Y Q Q G Q N Q LY N ELN LG RREEY D V LD K RRG RD PEM G G K PR RK N P QEG LY N ELQ K D K M A EA Y SEIG M K G ERRRG K G H D G LY Q G LSTA TK D TY D A LH M Q A LPPR CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico; Secuencia de referencia NCBI NM 000734.3); (SEQ ID NO:21)

AGAGTGAAGTTCA G CA G G A G CG CA G A CG CCCCCG CG TA CCA G CA G G G CCA G AACCA G CT CT AT AACG A G CT CA A T CTAGG A CG A A G A G A G G AGT A CG A T GTTT TGGACAAGAGACG TG G CCG G G A CCCTG A G A TG G G G G G A A A G CCG A G A A G G A AGAACCCTCA G G A A G G CCTG TA CA A TG A A CTG CA G A A A G A TA A G A TG G CG G AGGCCTACAGTG A G A TTG G G A TG A A A G G CG A G CG CCG G A G G G G CA A G G G G C ACGATGGCCTTTACCAG G G TCTCA G TA CA G CCA CCA A G G A CA CCTA CG A CG C CCTTCA CATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

Bisagra de IgG4 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:36)

ESK Y G PPCPPCPA PEFLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISR TPEV TC V W D V SQ ED PEV Q FN W YVDG VEV H N A K T K P R E E Q F N S T Y R W S VLT V LHQDW LN GKE Y K CK V SNKGLP S SIEK TISK A KGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQP

EN N Y K TTPPV LD SD G SFFLY SRLTV D K SR W Q EG N V FSCSV M H EA LH N H Y TQ K SLS LSLGKM

Bisagra de IgG4 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO:37)

G A G A G CA A G TA CG G CCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGC G G A CCCA G CG TG TTCCTG TTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGC CG G A CCCCCG A G G TG A CCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGA GGTCCA G TTCA A CTG G TA CG TG G A CG G CG TG G A G G TG CA CA A CG CCA A G A CCA AGCCCCG G G A G G A G CA G TTCA A TA G CA CCTA CCG G G TG G TG TCCG TG CTG A CC G TG CTG CA CCA G G A CTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAA CA A G G G CCTG CCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGC CTCG G G A G CCCCA G G TG TA CACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAG A A CCA G G TG TCCCTG A CCTG CCTG G TG A A G G G CTTCTA CCCCA G CG A CA TCG CC G TG G A G TG G G A G AGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCC T GT GCT GGAC A G CG ACGGC A G CTTCTT CCT GTAC AGCCGGCT GAC CGT GGAC AA G A G CCG G TG G CA G G AGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCC TG CA CA A CCA CTA CA CCCA GAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG

En algunos casos, estos clones en la Tabla 2 y 6 contenían todos ellos un cambio de residuo Q/K en el dominio de señal del dominio coestimulador procedente de la cadena CD3zeta.

Tabla 2. Secuencias CAR CD123 a modo de e emplo

Tabla 6: Secuencias CAR CD123 humanizadas

En algunos casos, una molécula CAR descrita en la presente comprende un scFv que se une específicamente a CD123 y no contiene una secuencia líder, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La siguiente Tabla 9 proporciona las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las secuencias scFv CD123 que no contienen una secuencia líder SEQ ID NO: 1.

Tabla 9. Secuencias scFv CAR CD123

En algunos casos, los fragmentos de scFv CAR se clonaron a continuación en vectores lentivíricos para crear un constructo CAR completo en un único marco de codificación, y utilizando el promotor EF1 alfa para la expresión (SEQ ID NO: 11).

Promotor EF1 alfa

CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTT CCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCA GAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAAT TACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCT TGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCT GGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGAC GCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCG GGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCG GACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGC GGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCA AAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAG CCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTAC GTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGG CCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTC AGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA

Gly/Ser (SEQ ID NO:25)

GGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:26): Esta secuencia puede englobar 1-6 unidades repetidas «Gly Gly Gly Gly Ser» GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:27)

GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:28)

GGGGSGGGGS GGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:29)

GGGS

PoliA: (A)5000 (SEQ ID NO:30)

Esta secuencia puede englobar 50-5000 adeninas.

PoliA: (T)100 (SEQ ID NO:31)

PoliA: (T)5000 (SEQ ID NO:32)

Esta secuencia puede englobar 50-5000 timinas.

PoliA: (A)5000 (SEQ ID NO:33)

Esta secuencia puede englobar 100-5000 adeninas.

PoliA:

Esta secuencia puede englobar 100-400 adeninas.

PoliA:

Esta secuencia puede englobar 50-2000 adeninas.

Gly/Ser (SEQ ID NO:709): Esta secuencia puede englobar 1-10 unidades repetidas «Gly Gly Gly Ser»

GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS

Los fragmentos de scFv CAR se pueden clonar en vectores lentivíricos para crear un constructo CAR completo en un único marco de codificación, y utilizando el promotor EF1 alfa para la expresión (SEQ ID NO: 11).

El constructo CAR puede incluir un conector de Gly/Ser que tiene una o más de las siguientes secuencias: GGGGS (SEQ ID NO:25); que engloba 1-6 unidades repetidas «Gly Gly Gly Gly Ser», por ejemplo, GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:27); GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO:28); GGGS (SEQ ID NO:29); o que engloba 1-10 unidades repetidas «Gly Gly Gly Ser», por ejemplo, GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (SEQ ID NO:709). En algunas realizaciones, el constructo CAR incluye una secuencia de poliA, por ejemplo, una secuencia que engloba 50-5000 o 100-5000 adeninas (por ejemplo, la SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 o SEQ ID NO:35), o una secuencia que engloba 50-5000 timinas (por ejemplo, la SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32). Como alternativa, el constructo CAR puede incluir, por ejemplo, un conector que incluye la secuencia GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 704).

C A R b ie s p e c íf ic o s

En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad por dos antígenos como máximo. Una molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, el primer y segundo epítopos están en el mismo antígeno, por ejemplo, la misma proteína (o subunidad de una proteína multimérica). En una realización, el primer y segundo epítopos se superponen. En una realización, el primer y segundo epítopos no se superponen. En una realización, el primer y segundo epítopos están en antígenos diferentes, por ejemplo, proteínas diferentes (o subunidades diferentes de una proteína multimérica). En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de la cadena ligera que tienen especificidad de unión por un primer epítopo y una secuencia del dominio variable de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de la cadena ligera que tienen especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende medio anticuerpo que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y medio anticuerpo que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende medio anticuerpo, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y medio anticuerpo, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende un scFv, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y un scFv, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo.

En ciertas realizaciones, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico o triespecífico). En la técnica existe constancia de protocolos para generar moléculas de anticuerpo biespecífico o heterodimérico; que incluyen, sin carácter limitante, la estrategia de «botón en ojal» descrita, por ejemplo, en el documento US 5731168; el apareamiento de Fc por orientación debida a interacción electrostática tal como se describe en, por ejemplo, los documentos WO 09/089004, WO 06/106905 y WO 2010/129304; formación de heterodímeros de Dominios Modificados por Intercambio de Hebras (SEED, por sus siglas en inglés) tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 07/110205; intercambio de la rama Fab tal como se describe en, por ejemplo, los documentos WO 08/119353, WO 2011/131746 y WO 2013/060867; conjugado de anticuerpo doble, por ejemplo, entrecruzando anticuerpos para generar una estructura biespecífica utilizando un reactivo heterobifuncional que tiene un grupo reactivo de tipo amina y un grupo reactivo de tipo sulfhidrilo tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 4433059; determinantes de anticuerpos biespecíficos generados recombinando la mitad de anticuerpos (pares de cadenas pesada-ligera o Fab) de diferentes anticuerpos mediante un ciclo de reducción y oxidación de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas, tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 4444878; anticuerpos trifuncionales, por ejemplo, tres fragmentos Fab' entrecruzados mediante grupos reactivos de tipo sulfhidrilo, tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5273743; proteínas de unión biosintéticas, por ejemplo, un par de scFv entrecruzados a través de las colas C-terminales preferentemente a través de entrecruzamiento químico con reactivos de tipo amina o disulfuro tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5534254; anticuerpos bifuncionales, por ejemplo, fragmentos Fab con diferentes especificidades de unión dimerizados a través de cremalleras de leucina (por ejemplo, c-fos y c-jun) que han reemplazado el dominio constante tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5582996; receptores mono- y oligovalentes biespecíficos y oligoespecíficos, por ejemplo, las regiones VH-CH1 de dos anticuerpos (dos fragmentos Fab) ligados a través de un espaciador polipeptídico entre la región CH1 de un anticuerpo y la región VH del otro anticuerpo normalmente con cadenas ligeras asociadas tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5591828; conjugados de ADN-anticuerpo biespecíficos, por ejemplo, entrecruzando anticuerpos o fragmentos Fab a través de un fragmento bicatenario de ADN tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5635602; proteínas de fusión biespecíficas, por ejemplo, un constructo de expresión que contiene dos scFv con un conector peptídico helicoidal hidrófilo entre ellos y una región constante completa tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5637481; proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas, por ejemplo, un dímero de polipéptidos que tiene un primer dominio con la región de unión de la región variable de la cadena pesada de Ig, y un segundo dominio con la región de unión de la región variable de la cadena ligera de Ig, denominados generalmente diacuerpos (también están englobadas estructuras de un orden superior para crear moléculas biespecíficas, triespecíficas o tetraespecíficas tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5837242; constructos de minicuerpos con cadenas VL y v H ligadas conectadas además con espaciadores peptídicos a una región de bisagra de un anticuerpo y una región CH3, que pueden dimerizar para formar moléculas biespecíficas/multivalentes tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5837821; dominios VH y VL ligados con un conector peptídico corto (por ejemplo, 5 o 10 aminoácidos) o sin conector en cualquier orientación, que pueden formar dímeros para formar diacuerpos biespecíficos; trímeros y tetrámeros tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5844094; una secuencia de dominios VH (o dominios VL en miembros de la familia) conectados por uniones peptídicas con grupos que se pueden entrecruzar en el extremo C asociados además con dominios VL para formar una serie de FV (o scFv), tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5864019; y los polipéptidos de unión monocatenarios con tanto un dominio VH como uno VL ligados a través de un conector peptídico se combinan para obtener estructuras multivalentes mediante entrecruzamiento no covalente o químico para formar, por ejemplo, estructuras homobivalentes, heterobivalentes, trivalentes y tetravalentes utilizando tanto un formato de tipo scFv como de diacuerpo tal como se describe, por ejemplo, en el documento US5869620. Se pueden consultar moléculas multiespecíficas y biespecíficas a modo de ejemplo adicionales y métodos para prepararlas, por ejemplo, en los documentos US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1.

Dentro de cada anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, scFv) de una molécula de anticuerpo biespecífico, el VH puede estar en dirección 5' o en dirección 3' de VL. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 5' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VH (VH1) en dirección 5' respecto a su VL (VL1) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 3' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VL (VL2) en dirección 5' respecto a su VH (VH2), de modo que la molécula de anticuerpo biespecífico global tiene la disposición VH1-VL1-VL2-VH2. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 5' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VL (VL1) en dirección 5' respecto a su VH (VH1) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en dirección 3' (por ejemplo, scFv) se dispone con su VH (VH2) en dirección 5' respecto a su VL (VL2), de modo que la molécula de anticuerpo biespecífico global tiene la disposición VL1-VH1-VH2-VL2. Opcionalmente, se dispone un conector entre dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, scFv), por ejemplo, entre VL1 y VL2 si el constructo se dispone como VH1-VL1-VL2-VH2, o entre VH1 y VH2 si el constructo se dispone como VL1-VH1-VH2-VL2. El conector puede ser un conector tal como se describe en la presente, por ejemplo, un conector (Gly4-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEQ ID NO: 64). En general, el conector entre los dos scFv debería ser lo suficientemente largo para evitar emparejamientos erróneos entre los dominios de los dos scFv. Opcionalmente, se dispone un conector entre el VL y VH del primer scFv. Opcionalmente, se dispone un conector entre el VL y VH del segundo scFv. En constructos que tienen múltiples conectores, dos o más cualesquiera de los conectores pueden ser idénticos o diferentes. En consecuencia, en algunas realizaciones, un CAR biespecífico comprende VL y VH y opcionalmente uno o más conectores en una disposición tal como se describe en la presente.

En un aspecto, la molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, un scFv, que tiene especificidad de unión por CD123, por ejemplo, que comprende un scFv tal como se describe en la presente, por ejemplo, tal como se describe en la Tabla 2, Tabla 6 o Tabla 9, o comprende CDR de la cadena ligera y/o CDR de la cadena pesada de un scFv CD123 descrito en la presente, y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo en un antígeno diferente. En algunos aspectos, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por un antígeno expresado en células de AML, por ejemplo, un antígeno que no es CD123. Por ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por CLL-1. Como otro ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por CD33. Como otro ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por CD34. Como otro ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por FLT3. Por ejemplo, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por el receptor de folato beta. En algunos aspectos, la segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión por un antígeno expresado en linfocitos B, por ejemplo, CD19, CD20, CD22 o ROR1.

T C R q u im é r ic o

En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo para CD123 de la presente divulgación (por ejemplo, los divulgados en las Tablas 2, 6 o 9) se pueden injertar en uno o más dominios constantes de una cadena de un receptor de linfocitos T («TCR»), por ejemplo, una cadena alfa de TCR o cadena beta de TCR, para crear un TCR quimérico que se une específicamente a CD123. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que los TCR quiméricos señalizarán a través del complejo TCR tras la unión del antígeno. Por ejemplo, un scFv CD123 tal como se divulga en la presente, se puede injertar en el dominio constante, por ejemplo, al menos una porción del dominio constante extracelular, el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático, de una cadena de TCR, por ejemplo, la cadena alfa de TCR y/o la cadena beta de TCR. Como otro ejemplo, un fragmento de anticuerpo para CD123, por ejemplo, un dominio VL tal como se describe en la presente, se puede injertar en el dominio constante de una cadena alfa de TCR, y un fragmento de anticuerpo para CD123, por ejemplo, un dominio VH tal como se describe en la presente, se puede injertar en el dominio constante de una cadena beta de TCR (o como alternativa, un dominio VL se puede injertar en el dominio constante de la cadena beta de TCR y un dominio VH se puede injertar en una cadena alfa de TCR). Como otro ejemplo, las CDR de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD123, por ejemplo, las CDR de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para CD123 tal como se describe en las Tablas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 o 13 se pueden injertar en una cadena alfa y/o beta de TCR para crear un TCR quimérico que se une específicamente a CD123. Por ejemplo, las CDRL divulgadas en la presente se pueden injertar en el dominio variable de una cadena alfa de TCR y las CDRH divulgadas en la presente se pueden injertar en el dominio variable de una cadena beta de TCR, o viceversa. Tales TCR quiméricos se pueden producir mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Willemsen RA et al., Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al., Cáncer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al., Gene Ther, abril de 2012;19(4):365-74).

E s ta b i l id a d y M u ta c io n e s

La estabilidad de un dominio de unión a CD123, por ejemplo, moléculas de scFv (por ejemplo, scFv soluble), se puede evaluar haciendo referencia a las propiedades biofísicas (por ejemplo, estabilidad térmica) de un anticuerpo completo o una molécula de scFv de control convencional. En una realización, el scFv humano tiene una estabilidad térmica que es superior a aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,25, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,75, aproximadamente 1, aproximadamente 1,25, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,75, aproximadamente 2 , aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10 grados, aproximadamente 11 grados, aproximadamente 12 grados, aproximadamente 13 grados, aproximadamente 14 grados o aproximadamente 15 grados Celsius a la de una molécula de unión de control (por ejemplo, una molécula de scFv convencional) en los ensayos descritos.

La estabilidad térmica mejorada del dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, se confiere posteriormente al constructo CART123 completo, lo que conlleva propiedades terapéuticas mejoradas del constructo CART123. La estabilidad térmica del dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, se puede mejorar en al menos aproximadamente 2 °C o 3 °C en comparación con un

anticuerpo convencional. En una realización, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, tiene una estabilidad térmica mejorada en 1 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra realización, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, tiene una estabilidad térmica mejorada en 2 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra realización, el scFv tiene una estabilidad térmica mejorada en 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 °C en comparación con un anticuerpo convencional. Se pueden realizar comparaciones, por ejemplo, entre las moléculas de scFv divulgadas en la presente y los anticuerpos completos. La estabilidad térmica se puede medir utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en un caso, se puede medir la Tf. Más adelante se describen en más detalle métodos para medir la Tm y otros métodos para determinar la estabilidad proteica.

Las mutaciones en scFv alteran la estabilidad del scFv y mejoran la estabilidad global del scFv y el constructo CART123. La estabilidad del scFv humanizado o humano se determina utilizando medidas tales como Tf, desnaturalización por temperatura y agregación por temperatura.

La capacidad de unión de los scFv mutantes se puede determinar utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos.

En una realización, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, comprende al menos una mutación tal que el scFv mutado confiere una mejora de la estabilidad al constructo CART123. En otra realización, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mutaciones que surgen del proceso de humanización tales que el scFv mutado confiere una mejora de la estabilidad al constructo CART123.

M é to d o s d e E v a lu a c ió n d e la E s ta b i l id a d d e la P r o te ín a

La estabilidad de un dominio de unión al antígeno se puede evaluar utilizando, por ejemplo, los métodos descritos más adelante. Tales métodos permiten la determinación de múltiples transiciones de desplegamiento térmico donde el dominio menos estable se despliega primero o limita el umbral de estabilidad global de una unidad multidominio que se despliega cooperativamente (por ejemplo, una proteína multidominio que exhibe una única transición de desplegamiento). El dominio menos estable se puede identificar de varias maneras adicionales. La mutagénesis se puede realizar para estudiar qué dominio limita la estabilidad global. Adicionalmente, la resistencia a la proteasa de una proteína multidominio se puede realizar en condiciones en las que se sabe que el dominio menos estable está intrínsecamente desplegado a través de DSC u otros métodos espectroscópicos (Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol.

393: 672-692). Una vez que se identifica el dominio menos estable, la secuencia que codifica este dominio (o una porción de esta) se puede emplear como una secuencia de prueba en los métodos.

a ) E s ta b i l id a d T é rm ic a

La estabilidad térmica de las composiciones se puede analizar utilizando varias técnicas biofísicas o bioquímicas no limitantes conocidas en la técnica. En ciertos casos, la estabilidad térmica se evalúa mediante espectroscopía analítica.

Un método de espectroscopía analítica a modo de ejemplo es la Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, por sus siglas en inglés). La DSC emplea un calorímetro que es sensible a las absorbancias de calor que acompañan el desplegamiento de la mayoría de las proteínas o dominios de proteínas (remítase, por ejemplo, a Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988). Para determinar la estabilidad térmica de una proteína, se inserta una muestra de la proteína en el calorímetro y se eleva la temperatura hasta que se despliega el Fab o scFv. La temperatura a la que se despliega la proteína es indicativa de la estabilidad global de la proteína.

Otro método de espectroscopía analítica a modo de ejemplo es la espectroscopía de Dicroísmo Circular (CD, por sus siglas en inglés). La espectrometría de CD mide la actividad óptica de una composición en función de una temperatura creciente. La espectroscopía de dicroísmo circular (CD) mide las diferencias en la absorción de la luz polarizada a la izquierda frente a la luz polarizada a la derecha que surgen debido a la asimetría estructural. Una estructura desordenada o desplegada da como resultado un espectro de CD muy diferente al de una estructura ordenada o plegada. El espectro de CD refleja la sensibilidad de las proteínas a los efectos desnaturalizantes de la temperatura creciente y, por lo tanto, es indicativo de la estabilidad térmica de una proteína (remítase a van Mierlo y Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000).

Otro método de espectroscopía analítica a modo de ejemplo para medir la estabilidad térmica es la Espectroscopía de Emisión de Fluorescencia (remítase a van Mierlo y Steemsma, mencionado anteriormente). Otro método más de espectroscopía analítica a modo de ejemplo para medir la estabilidad térmica es la espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (remítase, por ejemplo, a van Mierlo y Steemsma, mencionado anteriormente).

La estabilidad térmica de una composición se puede medir por medios bioquímicos. Un método bioquímico a modo de ejemplo para evaluar la estabilidad térmica es un ensayo de exposición térmica. En un «ensayo de exposición térmica», se somete una composición a un intervalo de temperaturas elevadas durante un período de tiempo establecido. Por ejemplo, en un caso, las moléculas scFv de prueba o las moléculas que comprenden moléculas de scFv se someten a un intervalo de temperaturas crecientes, por ejemplo, durante 1-1,5 horas. La actividad de la proteína se somete a ensayo a continuación con un ensayo bioquímico relevante. Por ejemplo, si la proteína es una proteína de unión (por ejemplo, un scFv o un polipéptido que contiene scFv), la actividad de unión de la proteína de unión se puede determinar mediante un ELISA funcional o cuantitativo.

Un ensayo de este tipo se puede realizar en un formato ultrarrápido y en los divulgados en los Ejemplos utilizando E. coli y cribado ultrarrápido. Se puede crear una colección de dominios de unión a CD123, por ejemplo, variantes de scFv, utilizando métodos conocidos en la técnica. Se puede inducir la expresión de dominios de unión a CD123, por ejemplo, scFv, y se pueden someter los dominios de unión a CD123, por ejemplo, scFv, a una exposición térmica. Las muestras de prueba expuestas se pueden analizar para determinar la unión y aquellos dominios de unión a CD123, por ejemplo, scFvs, que son estables, se pueden aumentar y caracterizar en mayor medida.

La estabilidad térmica se evalúa midiendo la temperatura de fusión (Tf) de una composición utilizando cualquiera de las técnicas anteriores (por ejemplo, técnicas de espectroscopía analítica). La temperatura de fusión es la temperatura en el punto medio de una curva de transición térmica en la que el 50% de las moléculas de una composición están en estado plegado (remítase, por ejemplo, a Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692). En una realización, los valores de Tf para un dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, son de aproximadamente 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. En una realización, los valores de Tf para una IgG son de aproximadamente 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. En una realización, los valores de Tf para un anticuerpo multivalente son de aproximadamente 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91°C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C.

La estabilidad térmica también se evalúa midiendo el calor específico o la capacidad calorífica (Cp) de una composición utilizando una técnica calorimétrica analítica (por ejemplo, DSC). El calor específico de una composición es la energía (por ejemplo, en kcal/mol) que se requiere para aumentar en 1 °C la temperatura de 1 mol de agua. Como Cp grande es un rasgo característico de una composición proteica desnaturalizada o inactiva. El cambio en la capacidad calorífica (ACp) de una composición se mide determinando el calor específico de una composición antes y después de su transición térmica. La estabilidad térmica también se puede evaluar midiendo o determinando otros parámetros de estabilidad termodinámica, incluida la energía libre de Gibbs de desplegamiento (AG), la entalpía de desplegamiento (AH) o la entropía de desplegamiento (AS). Uno o más de los ensayos bioquímicos anteriores (por ejemplo, un ensayo de exposición térmica) se utilizan para determinar la temperatura (es decir, el valor Tc) en el que el 50% de la composición mantiene su actividad (por ejemplo, actividad de unión).

Además, las mutaciones en el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, alteran la estabilidad térmica del dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, en comparación con el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, no mutado. Cuando el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, humanizado o humano se incorpora a un constructo CART123, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv humanizado o humano confiere estabilidad térmica al constructo global CART CD123. En una realización, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, comprende una única mutación que confiere estabilidad térmica al dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv. En otra realización, el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, comprende múltiples mutaciones que confieren estabilidad térmica al dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv. En una realización, las múltiples mutaciones en el dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, tienen un efecto aditivo sobre la estabilidad térmica del dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv.

b) % de Agregación

La estabilidad de una composición se puede determinar midiendo su propensión a agregarse. La agregación se puede medir mediante un número de técnicas bioquímicas o biofísicas no limitantes. Por ejemplo, la agregación de una composición se puede evaluar utilizando cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). La SEC separa moléculas en función del tamaño. Una columna se llena con perlas semisólidas de un gel polimérico que admitirá iones y moléculas pequeñas en su interior, pero no grandes. Cuando se aplica una composición proteica en la parte superior de la columna, las proteínas plegadas compactas (es decir, proteínas no agregadas) se distribuyen a través de un mayor volumen de disolvente que el que está disponible para los grandes agregados de proteínas. Por consiguiente, los agregados grandes se mueven con mayor rapidez a través de la columna, y de esta manera la mezcla se puede separar o fraccionar en sus componentes. Cada una de las fracciones se puede cuantificar por separado (por ejemplo, mediante dispersión de la luz) a medida que se eluye del gel. Por consiguiente, el % de agregación de una composición se puede determinar comparando la concentración de una fracción con la concentración total de proteína aplicada al gel. Las composiciones estables eluyen de la columna como esencialmente una fracción única y aparecen esencialmente como un pico único en el perfil de elución o cromatograma.

c) Afin idad de Unión

La estabilidad de una composición se puede evaluar determinando su afinidad de unión por la diana. En la técnica existe constancia de una amplia diversidad de métodos para determinar la afinidad de unión. Un método a modo de ejemplo para determinar la afinidad de unión emplea resonancia por plasmones superficiales. La resonancia por plasmones superficiales es un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo, utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones más detalladas, remítase, a Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol.Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión al antígeno descrita en la presente, y el dominio de unión al antígeno mantiene las propiedades funcionales deseadas de los fragmentos de anticuerpo para CD123 descritos en la presente. En un aspecto específico, la composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, ese fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

En diversos aspectos, el dominio de unión al antígeno del CAR se altera modificando uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (por ejemplo, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. En un aspecto específico, la composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, ese fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

Un experto ordinario en la técnica entenderá que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente divulgación se puede modificar adicionalmente de modo que varíe su secuencia de aminoácidos (por ejemplo, respecto al tipo natural), pero no la actividad deseada. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones adicionales de nucleótidos en la proteína que dan lugar a sustituciones de aminoácidos en residuos aminoacídicos «no esenciales». Por ejemplo, un residuo aminoacídico no esencial en una molécula puede ser reemplazado por otro residuo aminoacídico de la misma familia de la cadena lateral. En otro caso, una secuencia de aminoácidos puede ser reemplazada por una secuencia similar desde un punto de vista estructural que difiera en orden y/o composición de los miembros de la familia de la cadena lateral, por ejemplo, se puede realizar una sustitución conservadora, en la que un residuo aminoacídico es reemplazado por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar.

En la técnica se han definido las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen las cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

El porcentaje de identidad en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias que son iguales. Dos secuencias son «sustancialmente idénticas» si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacídicos o nucleotídicos que son iguales (por ejemplo, una identidad de un 60%, opcionalmente una identidad de un 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a lo largo de una región especificada o, cuando no se especifique, a lo largo de toda la secuencia), cuando se comparan y se alinean para conseguir una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o por alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe a lo largo de una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos), o más preferentemente a lo largo de una región que tiene una longitud de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos).

Para la comparación de secuencias, habitualmente una secuencia actúa como secuencia de referencia respecto a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de referencia y de prueba se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencias, cuando proceda, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por defecto o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula los porcentajes de identidades secuenciales para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa. Los métodos de alineamiento de secuencias para su comparación son muy conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Grupo computacional de genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (remítase, por ejemplo, a Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad secuencia y similitud secuencial son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res.

25:3389-3402; y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está a disposición del público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller 1988, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) que ha sido incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de peso de residuos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453) que ha sido incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

En un aspecto, la presente divulgación contempla modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento (por ejemplo, scFv) de partida que generan moléculas equivalentes desde un punto de vista funcional. Por ejemplo, el VH o VL de un dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, comprendido en el CAR se puede modificar para mantener una identidad de al menos aproximadamente un 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% respecto a la región de armazón de VH o VL del dominio de unión a CD123, por ejemplo, scFv, de partida. La presente invención contempla modificaciones de todo el constructo CAR, por ejemplo, modificaciones en una o más secuencias de aminoácidos de los diversos dominios del constructo CAR con el fin de generar moléculas equivalentes desde un punto de vista funcional. El constructo CAR se puede modificar para mantener una identidad de al menos aproximadamente un 70%, 71% 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% respecto al constructo CAR de partida.

Dominio transmembrana

Con respecto al dominio transmembrana, en diversas realizaciones, un CAR se puede diseñar para comprender un dominio transmembrana que esté unido al dominio extracelular del CAR. Un dominio transmembrana puede incluir uno o más aminoácidos adicionales adyacentes a la región de transmembrana, por ejemplo, uno o más aminoácidos asociados con la región extracelular de la proteína de la que procede el dominio transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región extracelular) y/o uno o más aminoácidos adicionales asociados con la región intracelular de la proteína de la cual procede la proteína transmembrana (por ejemplo, 1 , 2 , 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región intracelular). En un aspecto, el dominio transmembrana es uno que está asociado con uno de los otros dominios del CAR que se utiliza. En algunos casos, el dominio transmembrana se puede seleccionar o modificar por sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de la membrana superficial, por ejemplo, para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de homodimerizarse con otro CAR en la superficie celular de la célula que expresa CAR, por ejemplo, linfocito CART. En un aspecto diferente, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana se puede modificar o sustituir con el fin de minimizar las interacciones con los dominios de unión del compañero de unión nativo presente en la misma célula que expresa CAR, por ejemplo, linfocito CART.

El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o recombinante. Cuando la fuente es natural, el dominio puede proceder de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de señalizar al(a los) dominio(s) intracelular(es) cada vez que el CAR se ha unido a una diana. Un dominio transmembrana de uso particular en esta invención puede incluir al menos la(s) región(regiones) transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por ejemplo, CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede incluir al menos la(s) región(regiones) transmembrana de, por ejemplo, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C y CD19.

En algunos casos, el dominio transmembrana se puede unir a la región extracelular del CAR, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno del CAR, a través de una bisagra, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana. Por ejemplo, en una realización, la bisagra puede ser una bisagra de Ig (inmunoglobulina) humana, por ejemplo, una bisagra de IgG4 o una bisagra de CD8a. En una realización, la bisagra o el espaciador comprende (por ejemplo, está constituido por) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto, el dominio transmembrana comprende (por ejemplo, está constituido por) un dominio transmembrana de la SEQ ID NO: 6.

En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de IgG4. Por ejemplo, en una realización, el espaciador o la bisagra comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (SEQ ID NO:3). En algunas realizaciones, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra codificada por la secuencia de nucleótidos de GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGG

ACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGA CCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGG GAGGAGCAGTT CAAT AGC ACCTACCGGGT GGT GTCCGTGCTGACCGT GCT GCACC A GGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCC AGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGG TGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACG GCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAG CTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAAC GT CTTTAGCT GCT CCGT GAT GCACGAGGCCCT GCACAACC ACT ACACCCAGAAGAG CCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (SEQ ID NO: 14).

En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de IgD. Por ejemplo, en una realización, el espaciador o la bisagra comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERET KTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTG GVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQA PVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPG STTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH (SEQ ID NO:4). En algunas realizaciones, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra codificada por la secuencia de nucleótidos de

AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCA GGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACT GGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGA GAGGGAGACCAAGACCCCT GAAT GT CCAT CCCAT ACCC AGCCGCT GGGCGTCT ATC TCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGT TT CGT CGT GGGCT CT GACCTGAAGGAT GCCCATTTG ACTT GGGAGGTTGCCGGAAA GGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTT GCT GGAGCGCC ATTCCAAT GGCTCT CAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTC TGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAG AGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTG AT CCCCCAGAGGCCGCC AGCTGGCT CTTAT GCGAAGT GTCCGGCTTTAGCCCGCCC AAC AT CTTGCT C AT GT GGCT GG AGG ACC AGCG AG A AGT GAAC ACC AGCGGCTTCG CT CCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTT CT ACCAC ATT CT GGGCCT GGAGTGTC TTAAGGGT CCC AGCACCACCT AGCCCCC AGCCAGCCAC ATACACCT GT GTT GT GT C CCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACG T G ACT G ACC ATT (SEQ ID NO: 15).

En un aspecto, el dominio transmembrana puede ser recombinante, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrófobos, tales como leucina y valina. En un aspecto, se puede detectar un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada uno de los extremos de un dominio transmembrana recombinante.

Opcionalmente, un conector oligo- o polipéptido corto, por ejemplo, de una longitud de entre 2 y 10 aminoácidos, puede formar la unión entre el dominio transmembrana y la región citoplasmática del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector especialmente adecuado. Por ejemplo, en un aspecto, el conector comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:5). En algunas realizaciones, el conector está codificado por una secuencia de nucleótidos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO:16).

En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de KIR2DS2.

Dominio citoplasmático

El dominio o región citoplasmáticos del presente CAR incluye un dominio de señalización intracelular. Un dominio de señalización intracelular es capaz de activar al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha introducido el CAR.

Los ejemplos de dominios de señalización intracelulares para uso en el CAR de la invención incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de linfocitos T (TCR) y correceptores que actúan concertados para iniciar la transducción de señales después de la activación del receptor del antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia recombinante que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para una activación completa del linfocito T y que también se requiere una señal secundaria y/o coestimuladora. Por lo tanto, se puede decir que la activación de los linfocitos T está mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmáticas: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno a través del TCR (dominios de señalización intracelular primaria) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (dominio citoplasmático secundario, por ejemplo, un dominio coestimulador).

Un dominio de señalización primaria regula la activación primaria del complejo TCR, ya sea de manera estimuladora o inhibidora. Los dominios de señalización intracelular primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM.

Los ejemplos de dominios de señalización intracelular primaria que contienen ITAM que son de especial uso en la invención incluyen aquellos de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta , CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como «ICOS»), FceRI, DAP10, DAP12 y CD66d. En un caso, un CAR de la divulgación comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primaria de CD3-zeta.

En una realización, un dominio de señalización primaria comprende un dominio ITAM modificado, por ejemplo, un dominio ITAM mutado que tiene una actividad alterada (por ejemplo, incrementada o disminuida) en comparación con el dominio ITAM nativo. En una realización, un dominio de señalización primaria comprende un dominio de señalización intracelular primaria que contiene ITAM modificado, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria que contiene ITAM optimizado y/o truncado. En una realización, un dominio de señalización primaria comprende uno, dos, tres, cuatro o más motivos ITAM.

Ejemplos adicionales de moléculas que contienen un dominio de señalización primaria que son de especial uso en la invención incluyen aquellos de DAP10, DAP12 y CD32.

El dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización primaria, por ejemplo, dominio de señalizacion de CD3-zeta, por sí mismo o se puede combinar con cualquier(cualesquiera) otro(s) dominio(s) de señalización intracelular deseado(s) útil(es) en el contexto de un CAR de la invención. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender un dominio de señalización primaria, por ejemplo, una porción de la cadena CD3-zeta, y un dominio de señalización coestimulador. El dominio de señalización coestimulador se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de linfocitos frente a un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen una molécula de la clase I de MHC, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de la activación linfocitaria (proteínas SLAM), receptores de células NK activadores, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, lAt , GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83. Por ejemplo, se ha demostrado que la coestimulación de CD27 potencia la expansión, función efectora y supervivencia de linfocitos CART humanos in vitro y aumenta la persistencia de linfocitos T humanos y actividad antitumoral in vivo (Song et al. Blood.

2012; 119(3):696-706).

Las secuencias de señalización intracelular dentro de la porción citoplasmática de un CAR de la invención pueden unirse entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un conector oligo- o polipéptido corto, por ejemplo, de una longitud de entre 2 y 10 aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) puede formar la unión entre secuencia de señalización intracelular. En una realización, se puede utilizar un doblete de glicina-serina como un conector adecuado. En una realización, se puede utilizar un único aminoácido, por ejemplo., una alanina, una glicina, como un conector adecuado.

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más, dominios de señalización coestimuladores. En una realización, los dos o más, por ejemplo, 2 , 3, 4, 5 o más dominios de señalización coestimuladores, están separados por una molécula conectora, por ejemplo, una molécula conectora descrita en la presente. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladores. En algunas realizaciones, la molécula conectora es un residuo de glicina. En algunas realizaciones, el conector es un residuo de alanina.

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB es un dominio de señalización de la SEQ ID NO: 7. En un aspecto, el dominio de señalización de CD3-zeta es un dominio de señalización de la SEQ ID NO: 9 (CD3-zeta mutante) o la SEQ ID NO: 10 (CD3-zeta humano de tipo natural).

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD27. En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 comprende una secuencia de aminoácidos de QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO:8). En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCC GCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCA GCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 19).

En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 comprende una secuencia de aminoácidos de QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO:8).

En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCC GCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCA GCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 19).

En un aspecto, el intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 379. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 380.

En un aspecto, el intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de ICOS. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 381. En un aspecto, el dominio de señalización de ICOS está codificado por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 382.

En un aspecto, la célula que expresa CAR descrita en la presente puede comprender además un segundo CAR, por ejemplo, un segundo CAR que incluye un dominio de unión al antígeno diferente, por ejemplo, a la misma diana (CD123) o una diana diferente (por ejemplo, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3, o el receptor de folato beta). En un caso, el segundo CAR incluye un dominio de unión al antígeno para una diana expresada en las células de leucemia mieloide aguda tal como, por ejemplo, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta. En un caso, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR que tiene como diana un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimulador pero no un dominio de señalización primaria, y un segundo CAR que tiene como diana un segundo antígeno, diferente, e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primaria pero no un dominio de señalización coestimulador. Sin querer ceñirse a la teoría, la colocación de un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, de 4-1BB, CD28, CD27, ICOS o OX-40, en el primer CAR, y el dominio de señalización primaria, por ejemplo, de CD3 zeta, en el segundo CAR puede limitar la actividad CAR a las células en las que se expresan ambas dianas. En un caso, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR CD123 que incluye un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un segundo CAR que tiene como diana un antígeno que no es CD123 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria. En otro caso, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR CD123 que incluye un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria y un segundo CAR que tiene como diana un antígeno que no es CD123 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, c D19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, la célula que expresa CAR comprende un CAR CD123 descrito en la presente y un CAR inhibidor. En un caso, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno presente en células normales pero no en células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan CD123. En un caso, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR (por ejemplo, t Gf R beta).

En un caso, cuando la célula que expresa CAR comprende dos o más CAR diferentes, los dominios de unión al antígeno de los diferentes CAR pueden ser tales que los dominios de unión al antígeno no interaccionen entre sí. Por ejemplo, una célula que expresa un primer y un segundo CAR puede tener un dominio de unión al antígeno del primer CAR, por ejemplo, como un fragmento, por ejemplo, un scFv, que no forma una asociación con el dominio de unión al antígeno del segundo CAR, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno del segundo CAR es un VHH.

En algunos casos, el dominio de unión al antígeno comprende moléculas de unión al antígeno de dominio único (SDAB, por sus siglas en inglés) e incluye moléculas cuyas regiones determinantes de la complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos incluyen, sin carácter limitante, dominios variables de la cadena pesada, moléculas de unión desprovistas de manera natural de cadenas ligeras, dominios únicos procedentes de anticuerpos de cadena 4 convencionales, dominios modificados y esqueletos de dominio único diferentes de aquellos procedentes de anticuerpos. Las moléculas SDAB pueden ser cualesquiera de la técnica, o cualesquiera moléculas de dominio único futuras. Las moléculas SDAB pueden proceder de cualquier especie que incluye, sin carácter limitante, ratón, ser humano, camello, llama, lamprea, pez, tiburón, cabra, conejo y bóvidos. El término también incluye moléculas de tipo anticuerpo de dominio único de especies diferentes de los tiburones y Camelidae.

En un aspecto, una molécula SDAB se puede obtener de una región variable de la inmunoglobulina presente en peces, tal como, por ejemplo, la que se obtiene a partir del isotipo de inmunoglobulina conocido como receptor de antígeno novedoso (NAR, por sus siglas en inglés) presente en el suero del tiburón. Los métodos para producir moléculas de dominio único que se obtienen de una región variable de NAR («IgNAR») se describen en el documento WO 03/014161 y en Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.

De acuerdo con otro aspecto, una molécula SDAB es una molécula de unión al antígeno de dominio único de origen natural conocida como cadena pesada desprovista de cadenas ligeras. Tales moléculas de dominio único se divulgan en el documento WO 9404678 y en Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, por ejemplo. A efectos de claridad, este dominio variable que se obtiene de una molécula de cadena pesada desprovista de manera natural de la cadena ligera se conoce en la presente como un VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Una molécula VHH de este tipo se puede obtener de la especie Camelidae, por ejemplo, en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además de Camelidae pueden producir moléculas de cadena pesada desprovistas de manera natural de la cadena ligera; tales VHH están dentro del alcance de la divulgación.

Las moléculas SDAB pueden ser recombinantes, injertadas de CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas mediante presentación en fagos).

También se ha descubierto que en células que tienen una pluralidad de receptores integrados en la membrana quiméricos que comprenden un dominio de unión al antígeno las interacciones entre el dominio de unión al antígeno de los receptores pueden ser indeseables, por ejemplo, porque se inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión al antígeno para unirse a su antígeno afín. En consecuencia, en la presente se divulgan células que tienen un primer y un segundo receptor integrado en la membrana quimérico de origen no natural que comprenden dominios de unión al antígeno que minimizan tales interacciones. También se divulgan en la presente ácidos nucleicos que codifican un primer y un segundo receptor integrado en la membrana quimérico de origen no natural que comprenden dominios de unión al antígeno que minimizan tales interacciones, así como también métodos para preparar y utilizar tales células y ácidos nucleicos. En un caso, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor integrado en la membrana quimérico de origen no natural comprende un scFv y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único que se obtiene de una secuencia humana o de ratón.

En algunos casos, la presente divulgación comprende un primer y segundo CAR, donde el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo c Ar no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR es un scFv y el otro no es un scFv. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único que se obtiene de una secuencia humana o de ratón. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un dominio VHH de camélido.

En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único que se obtiene de una secuencia humana o de ratón. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR es un scFv y el otro comprende un nanocuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR comprende un scFv y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

En algunos casos, cuando está presente en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión al antígeno de dicho primer CAR a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo CAR. En algunos casos, la unión del dominio de unión al antígeno de dicho primer CAR a su antígeno afín en presencia de dicho segundo CAR es un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% de la unión del dominio de unión al antígeno de dicho primer CAR a su antígeno afín en ausencia de dicho segundo CAR.

En algunos casos, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión al antígeno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR se asocian entre sí en menor medida que si ambos fueran dominios de unión al antígeno scFv. En algunos casos, los dominios de unión al antígeno de dicho primer CAR y dicho segundo CAR se asocian entre sí un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% menos que si ambos fueran dominios de unión al antígeno scFv.

En otro caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, PD1, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, Pd -L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACa M (por ejemplo, CEACAM-1, CEACa M-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR (por ejemplo, TGFR beta). En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora, por ejemplo, es una molécula descrita en la presente, por ejemplo, un agente que comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR (por ejemplo, TGFR beta), o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de estos) y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como los descritos en la presente) y/o un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito en la presente). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta tal como se describe en la presente). En algunos casos, la célula que expresa CAR descrita en la presente comprende un receptor coestimulador de tipo interruptor, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 2013/019615. PD1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha mostrado que dos ligandos para PD1, PD-L1 y PD-L2 reducen de manera regulada la activación de linfocitos T tras unirse a PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD1 con PD-L1.

En un caso, el agente comprende el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) de una molécula inhibidora, por ejemplo, muerte programada 1 (PD1, por sus siglas en inglés) se puede fusionar a un dominio transmembrana y dominios de señalización intracelular tales como 41BB y CD3 zeta (también denominado en la presente CAR PD1). En un caso, el CAR PD1, cuando se utiliza en combinaciones con un c A r CD123 descrito en la presente, mejora la persistencia de la célula que expresa CAR, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. En un caso, el CAR es un CAR PD1 que comprende el dominio extracelular de p D1 indicado como la parte subrayada en la SEQ ID NO: 24. En un caso, el CAR PD1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24.

MalpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallwtegdnatftcsfsntsesfVlnwvrmspsnqtdklaaf pedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmswrarmdsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvttt paprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeed gcscrfpccccggcclrvkfsrsadapaykqgqnqlynclnlgrrccydvldkrrgrdpcmggkprrknpqcglynclqkdkmac ayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:24).

En un caso, el CAR PD1 comprende la secuencia de aminoácidos que se proporcionan a continuación (SEQ ID NO:22).

pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesMnwvrmspsnqtdklaafpedrsapgadcrfrvtalp ngrdfhmswrarmdsgtvlcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslr peacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrv kfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkgh dglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:22).

En un caso, el agente comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR PD1, por ejemplo, el CAR PD1 descrito en la presente. En un caso, la secuencia de ácido nucleico para el CAR PD1 se muestra a continuación con el ECD PD1 subrayado a continuación en la SEQ ID NO: 23.

atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctc cggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaac acctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgca accgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgact ccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagc gcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgcc gcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgt gcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcac cctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacg gttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataa gcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggac cccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggccta ctccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggac acatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (SEQ ID NO: 23).

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células que expresan CAR, por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR. En algunos casos, la población de células que expresan CAR comprende una mezcla de células que expresan diferentes CAR. Por ejemplo, en un caso, la población de células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan c A r ) puede incluir una primera célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, y una segunda célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a CD123 diferente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 descrito en la presente que difiere del dominio de unión a CD123 en el CAR expresado por la primera célula. Como otro ejemplo, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión a CD123, por ejemplo, tal como se describe en la presente, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión al antígeno que tiene una diana que no es CD123 (por ejemplo, CD33, CD34, CLL-1, FLT3 o receptor de folato beta). En un caso, la población de células que expresan CAR incluye, por ejemplo, una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización intracelular primaria, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización secundaria, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células donde al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio CD123 descrito en la presente, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACa M (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR (por ejemplo, TGFR beta). En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora, por ejemplo, es una molécula descrita en la presente, por ejemplo, un agente que comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, PD-L2 , CTLA4, TIM3, CEA^cA ^m(por ejemplo, C^eA^cA^m-1, CEAC^aM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR (por ejemplo, TGFR beta), o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de estos) y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como los descritos en la presente) y/o un dominio de señalización primaria (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito en la presente). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta tal como se describe en la presente).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden administrar una población de células que expresan CAR, por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR, por ejemplo, una mezcla de células que expresan diferentes CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de cinasa, tal como un inhibidor de cinasa descrito en la presente. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden administrar una población de células donde al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión al antígeno asociado anti-canceroso tal como se describe en la presente, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de cinasa, tal como un inhibidor de cinasa descrito en la presente.

CAR con receptor de linfocitos cito líticos naturales (NKR)

En un caso, la molécula CAR descrita en la presente comprende uno o más componentes de un receptor de linfocitos citolíticos naturales (NKR) y de esta manera forma un CAR-NKR. El componente NKR puede ser un dominio transmembrana, un dominio bisagra o un dominio citoplasmático de cualquiera de los siguientes receptores de linfocitos citolíticos naturales: receptor de tipo inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR, por sus siglas en inglés), por ejemplo, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, y KIR3DP1; receptor de citotoxicidad natural (NCR), por ejemplo, NKp30, NKp44, NKp46; familia de molécula de señalización de la activación linfocitaria (SLAM) de los receptores de células inmunitarias, por ejemplo, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, y CD2F-10; receptor de Fc (FcR), por ejemplo, CD16, y CD64; y receptores de Ly49, por ejemplo, LY49A, LY49C. Las moléculas CAR-NKR descritas en la presente pueden interaccionar con una molécula adaptadora o dominio de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. Las configuraciones y secuencias a modo de ejemplo de moléculas CAR que comprenden componentes de NKR se describen en la Publicación Internacional N.° WO2014/145252.

CAR divid ido

En algunas realizaciones, la célula que expresa CAR utiliza un CAR dividido. La estrategia de CAR dividido se describe más detalladamente en las publicaciones WO2014/055442 y WO2014/055657. Resumiendo, un sistema CAR dividido comprende una célula que expresa un primer CAR que tiene un primer dominio de unión al antígeno y un dominio coestimulador (por ejemplo, 41 BB) y la célula también expresa un segundo CAR que tiene un segundo dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, CD3 zeta). Cuando la célula encuentra el primer antígeno, se activa el dominio coestimulador y la célula prolifera. Cuando la célula encuentra el segundo antígeno, se activa el dominio de señalización intracelular y comienza la actividad citolítica. Por lo tanto, la célula que expresa CAR solo está totalmente activada en presencia de ambos antígenos. En algunos casos, el primer dominio de unión al antígeno reconoce CD123, por ejemplo, comprende un dominio de unión al antígeno descrito en la presente, y el segundo dominio de unión al antígeno reconoce un antígeno expresado en las células de leucemia mieloide aguda, por ejemplo, CLL-1, CD33, CD34, FLT3 o receptor de folato beta. En algunos casos, el primer dominio de unión al antígeno reconoce CD123, por ejemplo, comprende un dominio de unión al antígeno descrito en la presente, y el segundo dominio de unión al antígeno reconoce un antígeno expresado en linfocitos B, por ejemplo, CD19, CD20, CD22 o ROR1.

Estrategias para regular los receptores antigénicos quiméricos

Existen muchas maneras de regular las actividades de CAR. En algunas realizaciones, un CAR regulable (RCAR), en donde la actividad CAR se puede controlar es deseable para optimizar la seguridad y eficacia de una terapia con CAR. Por ejemplo, se puede utilizar la inducción de la apoptosis utilizando, por ejemplo, una caspasa fusionada a un dominio de dimerización (remítase, por ejemplo, a Di et al., N Engl. J. Med. 3 de noviembre de 2011; 365(18):1673-1683), como un interruptor de seguridad en la terapia con CAR de la presente invención. En otro ejemplo, las células que expresan CAR también pueden expresar una molécula Caspasa-9 inducible (iCaspasa-9) que, después de administrar un fármaco dimerizador (por ejemplo, rimiducid (también denominado AP1903 (Bellicum Pharmaceuticals) o AP20187 (Ariad)) da lugar a la activación de la Caspasa-9 y apoptosis de las células. La molécula iCaspasa-9 contiene un dominio de unión inductor químico de la dimerización (CID, por sus siglas en inglés) que hace de mediador de la dimerización en la presencia de un CID. Esto da como resultado una disminución inducible y selectiva de células que expresan CAR. En algunos casos, la molécula iCaspasa-9 está codificada por una molécula de ácido nucleico separada del(de los) vector(es) que codifica(n) el CAR. En algunos casos, la molécula iCaspasa-9 está codificada por la misma molécula de ácido nucleico que codifica el CAR. La iCaspasa-9 puede proporcionar un interruptor de seguridad para evitar cualquier toxicidad de células que expresan CAR. Remítase, por ejemplo, a Song et al. Cáncer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Id. de ensayo clínico N.° NCT02107963; y Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83.

Estrategias alternativas para regular la terapia con CAR de la presente invención incluyen utilizar moléculas de bajo peso molecular o anticuerpos que desactivan o deshabilitan la actividad CAR, por ejemplo, eliminando células que expresan CAR, por ejemplo, mediante citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos (ADCC). Por ejemplo, las células que expresan CAR descritas en la presente también pueden expresar un antígeno que es reconocido por moléculas capaces de inducir la muerte celular, por ejemplo, ADCC o muerte celular inducida por el complemento. Por ejemplo, las células que expresan CAR descritas en la presente también pueden expresar un receptor capaz de ser la diana de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Los ejemplos de tales receptores incluyen EpCAM, VEGFR, integrinas (por ejemplo, integrinas avp3, a4, aI%p3, a4p7, a5p1, avp3, av), miembros de la superfamilia de receptor de TNF (por ejemplo, TRAIL-R1, TRAIL-R2), receptor de PDGF, receptor de interferón, receptor de folato, GPNMB, lCAM-1, HLA-Dr , CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, receptor de IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/receptor de IgE, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41 , CD44, CD51 , CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/basigina, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, y EGFR, y versiones truncadas de estos (por ejemplo, versiones que conservan uno o más epítopos extracelulares pero que carecen de una o más regiones dentro del dominio citoplasmático).

Por ejemplo, una célula que expresa CAR descrita en la presente también puede expresar un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) truncado que carece de capacidad de señalización pero mantiene el epítopo que es reconocido por moléculas capaces de inducir ADCC, por ejemplo, cetuximab (ERBITUX®), de modo que la administración de cetuximab induce ADCC y la posterior disminución de células que expresan CAR (remítase, por ejemplo, al documento WO2011/056894, y a Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860). Otra estrategia incluye expresar un gen marcador/suicida sumamente compacto que combina epítopos diana de ambos antígenos CD32 y CD20 en las células que expresan CAR descritas en la presente, que se une a rituximab, y da como resultado la disminución selectiva de las células que expresan CAR, por ejemplo, por ADCC (remítase, por ejemplo, a Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287). Otros métodos para disminuir las células que expresan CAR descritas en la presente incluyen la administración de CAMPATH, un anticuerpo anti-CD52 monoclonal que, de manera selectiva, se une y tiene como diana linfocitos maduros, por ejemplo, células que expresan CAR, para la destrucción, por ejemplo, induciendo ADCC. En otras realizaciones, se puede actuar selectivamente sobre la célula que expresa CAR utilizando un ligando de CAR, por ejemplo, un anticuerpo antidiotípico. En algunas realizaciones, el anticuerpo antidiotípico puede provocar actividad de células efectoras, por ejemplo, actividad ADCC o ADC, y reducir de esta manera el número de células que expresan CAR. En otras realizaciones, el ligando de CAR, por ejemplo, el anticuerpo antidiotípico, se puede acoplar a un agente que induce la muerte celular, por ejemplo, un toxina, e inducir de esta manera el número de células que expresan c Ar . Como alternativa, las propias moléculas CAR se pueden configurar de manera que la actividad se pueda regular, por ejemplo, activar y desactivar, tal como se describe más adelante.

En otros casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente también puede expresar una proteína diana reconocida por un agente de disminución de linfocitos T. En un caso, la proteína diana es CD20 y el agente de disminución de linfocitos T es un anticuerpo anti-CD20, por ejemplo, rituximab. En tales casos, el agente de disminución de linfocitos T se administra una vez y es deseable para reducir o eliminar la célula que expresa CAR, por ejemplo, para mitigar la toxicidad inducida por CAR. En otros casos, el agente de disminución de linfocitos T es un anticuerpo anti-CD52, por ejemplo, alemtuzumab, tal como se describe en los Ejemplos de la presente.

En otros casos, un RCAR comprende un conjunto de polipéptidos, normalmente dos en los casos más simples, en el cual los componentes de un CAR estándar descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular, se reparten en polipéptidos o miembros separados. En algunos casos, el conjunto de polipéptidos incluye un interruptor de dimerización que, cuando está presente una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión al antígeno con un dominio de señalización intracelular. Se proporcionan una descripción y configuraciones a modo de ejemplo adicionales de tales CAR regulables en la presente y en la Publicación Internacional N.° WO 2015/090229.

En un aspecto, un RCAR comprende dos polipéptidos o miembros: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria descrito en la presente, y un primer dominio de tipo interruptor; 2 ) un miembro de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno, por ejemplo, que se une específicamente a un antígeno tumoral descrito en la presente, tal como se describe en la presente y un segundo dominio de tipo interruptor. Opcionalmente, el RCAR comprende un dominio transmembrana descrito en la presente. En un caso, se puede disponer un dominio transmembrana en el miembro de señalización intracelular, o el miembro de unión al antígeno, o en ambos. (A menos que se indique lo contrario, cuando se describen en la presente miembros o elementos de un RCAR, el orden puede ser según se proporciona, pero también se incluyen otros órdenes. Dicho de otra manera, en un caso el orden es tal como se expone en el texto, pero en otros casos el orden puede ser diferente. Por ejemplo, el orden de los elementos en un lado de la región transmembrana puede ser diferente del ejemplo, por ejemplo, la ubicación de un dominio de tipo interruptor respecto a un dominio de señalización intracelular puede ser diferente, por ejemplo, invertido).

En un caso, el primer y segundo dominios de tipo interruptor pueden formar un interruptor de dimerización intracelular o extracelular. En un caso, el interruptor de dimerización puede ser un interruptor de homodimerización, por ejemplo, donde el primer y segundo dominio de dimerización son idénticos, o un interruptor de heterodimerización, por ejemplo, donde el primer y segundo dominios de dimerización son diferentes entre sí.

En algunos casos, un RCAR puede comprender un «multiinterruptor». Un multiinterruptor puede comprender dominios de tipo interruptor de heterodimerización o dominios de tipo interruptor de homodimerización. Un multiinterruptor comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, dominios de tipo interruptor, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión al antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular. En un caso, el primer miembro puede comprender una pluralidad de primeros dominios de tipo interruptor, por ejemplo, dominios de tipo interruptor basados en FKBP, y un segundo miembro puede comprender una pluralidad de segundos dominios de tipo interruptor, por ejemplo, dominios de tipo interruptor basados en f Rb . En un caso, el primer miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, por ejemplo, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB, y el segundo miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, por ejemplo, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB.

En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria y uno o más dominios de señalización coestimuladores.

En un caso, el miembro de unión al antígeno puede comprender uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, uno o más dominios de señalización coestimuladores. En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladores descritos en la presente, por ejemplo, seleccionados entre 4-1BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y en casos, ningún dominio de señalización intracelular primaria. En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores, en dirección de extracelular a intracelular: 4-1BB-CD27; 4-1BB-CD27; CD27-4-1 BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1 BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB; o 4-1BB-CD28. En tales casos, el miembro de unión intracelular comprende un dominio CD3zeta. En un caso de este tipo, el RCAR comprende (1) un miembro de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y dos dominios coestimuladores y un primer dominio de tipo interruptor; y (2 ) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana y al menos un dominio de señalización intracelular primaria, y un segundo dominio de tipo interruptor.

Un caso proporciona RCAR donde el miembro de unión al antígeno no está fijado a la superficie de la célula CAR. Esto permite que una célula que tiene un miembro de señalización intracelular se empareje convenientemente con uno o más dominios de unión al antígeno, sin transformar la célula con una secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno. En tales casos, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: un primer dominio de tipo interruptor, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria, y un primer dominio de tipo interruptor; y 2 ) un miembro de unión al antígeno que comprende: un dominio de unión al antígeno, y un segundo dominio de tipo interruptor, donde el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el RCAR puede comprender además 3) un segundo miembro de unión al antígeno que comprende: un segundo dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un segundo dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno diferente del que se une al dominio de unión al antígeno; y un segundo dominio de tipo interruptor.

También se proporcionan en la presente RCAR donde el miembro de unión al antígeno comprende capacidad de activación y direccionamiento biespecíficas. En este caso, el miembro de unión al antígeno puede comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión al antígeno, por ejemplo, scFv, donde cada dominio de unión al antígeno se une a un antígeno diana, por ejemplo, antígenos diferentes o el mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En un caso, la pluralidad de dominios de unión al antígeno están en tándem, y opcionalmente, se dispone un conector o región de bisagra entre cada uno de los dominios de unión al antígeno. En la presente se describen conectores y región de bisagra adecuados.

Un caso proporciona RCAR que tienen una configuración que permite realizar un cambio de la proliferación. En este caso, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: opcionalmente, un dominio transmembrana o dominio de anclaje a la membrana; uno o más dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados entre 4-1BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y un dominio de tipo interruptor; y 2) un miembro de unión al antígeno que comprende: un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular primaria, por ejemplo, un dominio de CD3zeta, donde el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio de tipo interruptor, o no comprende un dominio de tipo interruptor que dimeriza con un dominio de tipo interruptor en el miembro de señalización intracelular. En un caso, el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio de señalización coestimulador. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de tipo interruptor de un interruptor de homodimerización. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un primer dominio de tipo interruptor de un interruptor de heterodimerización y el RCAR comprende un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de tipo interruptor del interruptor de heterodimerización. En tales casos, el segundo miembro de señalización intracelular comprende los mismos dominios de señalización intracelular que el miembro de señalización intracelular. En un caso, el interruptor de dimerización es intracelular. En un caso, el interruptor de dimerización es extracelular.

En cualquiera de las configuraciones RCAR descritas en la presente, el primer y segundo dominios de tipo interruptor comprenden un interruptor basado en FKBP-FRB tal como se describe en la presente.

También se proporcionan en la presente células que comprenden un RCAR descrito en la presente. Se puede utilizar cualquier célula que se modifica para expresar un RCAR como una célula RCARX. En un caso, la célula RCARX es un linfocito T y se denomina linfocito RCART. En un caso, la célula RCARX es un linfocito NK y se denomina célula RCARN.

También se proporcionan en la presente ácidos nucleicos y vectores que comprenden secuencias que codifican RCAR. Las secuencias que codifican diversos elementos de un RCAR se pueden disponer en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo plásmido o vector, por ejemplo, vector vírico, por ejemplo, vector lentivírico. En un caso, (i) una secuencia que codifica un miembro de unión al antígeno y (ii) una secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico, por ejemplo, vector. La producción de las correspondientes proteínas se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso de promotores separados, o mediante el uso de un producto de transcripción bicistrónico (que puede dar como resultado la producción de dos proteínas mediante la escisión de un único producto de traducción o mediante la traducción de dos productos proteicos separados). En un caso, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un péptido escindible, por ejemplo, secuencia p2a o F2A. En un caso, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un iRe S, por ejemplo, un EMCv o EV71 IRES. En estos casos, (i) y (ii) se transcriben como un ARN único. En un caso, un primer promotor está ligado operablemente a (i) y un segundo promotor está ligado operablemente a (ii), de modo que (i) y (ii) se transcriben como ARNm separados.

Como alternativa, la secuencia que codifica diversos elementos de un RCAR se puede disponer en las diferentes moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, diferentes plásmidos o vectores, por ejemplo, vector vírico, por ejemplo, vector lentivírico. Por ejemplo, la (i) secuencia que codifica un miembro de unión al antígeno puede estar presente en un primer ácido nucleico, por ejemplo, un primer vector, y la (ii) secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular puede estar presente en el segundo ácido nucleico, por ejemplo, el segundo vector.

In te r r u p to r e s d e d im e r iz a c ió n

Los interruptores de dimerización pueden ser no covalentes o covalentes. En un interruptor de dimerización no covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción no covalente entre los dominios de tipo interruptor. En un interruptor de dimerización covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción covalente entre los dominios de tipo interruptor.

En una realización, el RCAR comprende un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB o FKBP/FRAP. FKBP12 (FKBP o proteína de unión a FK506) es una proteína citoplasmática abundante que actúa como la diana intracelular inicial para el fármaco inmunosupresor de tipo producto natural rapamicina. La rapamicina se une a FKBP y al homólogo de PI3K grande FRAP (RAFT, mTOR). FRB es una porción de 93 aminoácidos de FRAP que es suficiente para unirse al complejo FKBP-rapamicina (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51).

En algunas realizaciones, un interruptor basado en FKBP/FRAP, por ejemplo, FKBP/FRB, puede usar una molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un análogo de rapamicina.

La secuencia de aminoácidos de FKBP es la siguiente:

D Y P D Y A S L G G P S S P K K K R K Y S R G Y Q Y E T I S P G D G R T F P K

R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G

W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D

V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 588)

En algunas realizaciones, un dominio de tipo interruptor FKBP puede comprender un fragmentos de FKBP que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, la porción subrayada de la SEQ ID NO: 588, que es:

V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R

D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A

Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO:589)

La secuencia de aminoácidos de FRB es la siguiente:

ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF

NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRRISK (SEQ ID NO:

590)

«Interruptor basado en FKBP/FRAP, por ejemplo, FKBP/FRB», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a un interruptor de dimerización que comprende: un primer dominio de tipo interruptor, que comprende un fragmentos de FKBP o un análogo de este que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001, y que tiene una identidad de al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 99% respecto a, o difiere en como máximo 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de, la secuencia FKBP de la SEQ ID NO: 54 o 55; y un segundo dominio de tipo interruptor, que comprende un fragmentos de FRB o un análogo de este que tiene la capacidad de unirse a FRB, o un fragmento o análogo de este, en presencia de rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, y que tiene una identidad de al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 99% respecto a, o difiere en como máximo 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de, la secuencia FRB de la s Eq ID NO: 56. En un caso, un RCAR descrito en la presente comprende un dominio de tipo interruptor comprende residuos aminoacídicos divulgados en la SEQ ID NO: 588 (o la SEQ ID NO: 589), y un dominio de tipo interruptor comprende residuos aminoacídicos divulgados en la SEQ ID NO: 590.

En algunas realizaciones, el interruptor de dimerización FKBP/FRB comprende un dominio de tipo interruptor FRB modificado que muestra una formación compleja alterada, por ejemplo, potenciada, entre un dominio de tipo interruptor basado en FRB, por ejemplo, el dominio de tipo interruptor FRB modificado, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP, y la molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001. En una realización, el dominio de tipo interruptor FRB modificado comprende una o más mutaciones, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, seleccionadas entre mutaciones en la(s) posición(posiciones) aminoacídica(s) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 y f2108, donde el aminoácido de tipo natural está mutado a otro aminoácido de origen natural. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032, donde E2032 se muta a fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), por ejemplo, la SEQ ID NO: 591, o leucina (E2032L), por ejemplo, SEQ ID NO: 592. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en T2098, donde T2098 se muta a fenilalanina (T2098F) o leucina (T2098L), por ejemplo, la SEQ ID NO: 593. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032 y en T2098, donde E2032 se muta a cualquier aminoácido, y donde T2098 se muta a cualquier aminoácido, por ejemplo, la SEQ ID NO: 594. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032I y una T2098L, por ejemplo, la SEQ ID NO: 595. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032L y una T2098L, por ejemplo, la SEQ ID NO: 596.

Tabla 14. FRB mutante a modo de eemplo que tiene una ma or afinidad por una molécula de dimerización.

Otros interruptores de dimerización adecuados incluyen el interruptor de dimerización basado en GyrB-GyrB, un interruptor de dimerización basado en Giberelina, un interruptor de dimerización etiqueta/aglutinante y un interruptor de dimerización etiqueta-Halo/etiqueta-SNAP. Siguiendo las directrices que se proporcionan en la presente, tales interruptores y moléculas de dimerización relevantes serán evidentes para un experto en la técnica.

Molécula de dimerización

La asociación entre los dominios de tipo interruptor está fomentada por la molécula de dimerización. En presencia de la molécula de dimerización la interacción o asociación entre dominios de tipo interruptor permite la transducción de señales entre un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado con, un primer dominio de tipo interruptor, y un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado con, un segundo dominio de tipo interruptor. En presencia de niveles no limitantes de la molécula de dimerización la transducción de señales aumenta en 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, por ejemplo, según se mide en un sistema descrito en la presente.

Se pueden utilizar rapamicina y análogos de rapamicina (denominados a veces rapálogos), por ejemplo, RAD001, como moléculas de dimerización en un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB descrito en la presente. En una realización, la molécula de dimerización se puede seleccionar entre rapamicina (sirolimus), RAD001 (everolimus), zotarolimus, temsirolimus, AP-23573 (ridaforolimus), biolimus y AP21967. En la sección titulada «Terapias Combinadas» o en la subsección titulada «Combinación con una dosis baja de un inhibidor de mTOR» se describen adicionalmente más análogos de rapamicina adecuados para su uso con interruptores de dimerización basados en FKBP/FRB.

Coexpresión de CAR con un receptor de quim iocinas

En algunos casos, la célula que expresa CAR descrita en la presente comprende además una molécula receptora de quimiocinas. La expresión transgénica de los receptores de quimiocinas CCR2b o CXCR2 en linfocitos T fomenta el tráfico a tumores sólidos que secretan CCL2 o CXCL1 incluidos el melanoma y neuroblastoma (Craddock et al., J Immunother. octubre de 2010; 33(8):780-8 y Kershaw et al.,Hum Gene Ther. 1 de noviembre de 2002; 13(16):1971-80). Por lo tanto, sin desear ceñirse a la teoría, se cree que los receptores de quimiocinas expresados en células que expresan CAR que reconocen quimiocinas secretadas por tumores, por ejemplo, tumores sólidos, pueden mejorar la migración dirigida de la célula que expresa CAR al tumor, facilitar la infiltración de la célula que expresa CAR en el tumor y potenciar la eficacia antitumoral de la célula que expresa CAR. La molécula receptora de quimiocinas puede comprender un receptor de quimiocinas de origen natural o recombinante o un fragmento de unión a quimiocinas de este. Una molécula receptora de quimiocinas adecuada para la expresión en una célula que expresa CAR descrita en la presente incluye un receptor de quimiocinas CXC (por ejemplo, ^cX^cR1 , CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 o CXCR7), un receptor de quimiocinas CC (por ejemplo, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 o CCR11), un receptor de quimiocinas CX3C (por ejemplo, CX3CR1), un receptor de quimiocinas XC (por ejemplo, XCR1), o un fragmento de unión a quimiocinas de estos. En un caso, la molécula receptora de quimiocinas que se va a expresar con un CAR descrito en la presente se selecciona en función de la(s) quimiocina(s) secretada(s) por el tumor. En un caso, la célula que expresa c A r descrita en la presente comprende además, por ejemplo, expresa, un receptor CCR2b o un receptor CXCR2. En un caso, el CAR descrito en la presente y la molécula receptora de quimiocinas están en el mismo vector o están en dos vectores diferentes. En algunos casos, cuando el CAR descrito en la presente y la molécula receptora de quimiocinas están en el mismo vector, el CAR y la molécula receptora de quimiocinas están, cada uno, controlados por dos promotores diferentes o están controlados por el mismo promotor.

Transfección con ARN

En la presente se divulgan métodos para producir un ARN de CAR transcrito in vitro. La presente invención también incluye un constructo de ARN que codifica un CAR que se puede utilizar directamente para transfectar una célula. Un método para generar ARNm para su uso en la transfección puede conllevar la transcripción in vitro (IVT) de un molde con cebadores diseñados especialmente, seguido de la adición de poliA, para producir un constructo que contiene la secuencia no traducida 3' y 5' («u Tr »), una caperuza 5' y/o un Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES), el ácido nucleico que se va a expresar y una cola de poliA, normalmente de una longitud de 50 a 2000 bases (SEQ ID NO: 35). Con el a Rn producido de esta manera se pueden transfectar eficientemente diferentes tipos de células. En un aspecto, el molde incluye secuencias para el CAR.

En un aspecto, el CAR CD123 está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica el CAR CD123 se introduce en un linfocito T para la producción de un linfocito CART.

En una realización, el ARN de CAR transcrito in vitro se puede introducir en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce por transcripción in vitro utilizando un molde generado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente puede convertirse directamente por PCR en un molde para la síntesis de ARNm in vitro utilizando cebadores apropiados y ARN polimerasa. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente apropiada de ADN. El molde deseado para la transcripción in vitro es un CAR de la presente invención. Por ejemplo, el molde para el ARN de CAR comprende una región extracelular que comprende un dominio variable monocatenario de un anticuerpo antitumoral; una región de bisagra, un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana de CD8a); y una región citoplasmática que incluye un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB.

En una realización, el ADN que se va a utilizar para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede ser de una secuencia de ADN de origen natural procedente del genoma de un organismo. En una realización, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones 5' y/o 3' no traducidas (UTR). El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En una realización, el ADN que se va a utilizar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano. En otra realización, el ADN que se va a utilizar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano que incluye las UTR 5' y 3'. Como alternativa, el ADN puede ser una secuencia de ADN artificial que normalmente no se expresa en un organismo de origen natural. Una secuencia de ADN artificial a modo de ejemplo es aquella que contiene porciones de genes que están ligadas para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que están ligadas entre sí pueden proceder de un solo organismo o de más de un organismo.

La PCR se utiliza para generar un molde para la transcripción in vitro de ARNm que se utiliza para la transfección. Métodos para realizar la PCR son muy conocidos en la técnica. Los cebadores para uso en la PCR están diseñados para tener regiones que son sustancialmente complementarias a las regiones del ADN que se van a utilizar como un molde para la PCR. La expresión «sustancialmente complementarias», tal como se utiliza en la presente, se refiere a secuencias de nucleótidos en las que una mayoría o todas las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias o están emparejadas de manera errónea. Las secuencias sustancialmente complementarias son capaces de asociarse o hibridarse con la diana de ADN objetivo en las condiciones de hibridación utilizadas para la PCR. Los cebadores se pueden diseñar para ser sustancialmente complementarios a cualquier porción del molde de ADN. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar para amplificar la porción de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluidas las u Tr 5' y 3'. Los cebadores también se pueden diseñar para amplificar una porción de un ácido nucleico que codifica un dominio particular de interés. En una realización, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, que incluye la totalidad o porciones de las UTR 5' y 3'. Se pueden generar cebadores útiles para la PCR mediante métodos sintéticos muy conocidos en la técnica. Los «cebadores directos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos en el molde de ADN que están en dirección 5' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar. «En dirección 5'» se utiliza en la presente para referirse a una ubicación 5' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación a la cadena codificante. Los «cebadores inversos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a un molde de ADN bicatenario que están en dirección 3' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar. «En dirección 3'» se utiliza en la presente para referirse a una ubicación 3' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación a la cadena codificante.

Se puede utilizar cualquier ADN polimerasa útil para la PCR en los métodos descritos en la presente. Los reactivos y la polimerasa son comercializados por varios proveedores.

También se pueden utilizar estructuras químicas con la capacidad de fomentar la estabilidad y/o la eficacia de la traducción. El ARN tiene preferentemente UTR 5' y 3'. En una realización, la UTR 5' tiene una longitud de entre uno y 3000 nucleótidos. La longitud de las secuencias UTR 5' y 3' que se van a añadir a la región codificante se puede alterar mediante diferentes métodos, que incluyen, sin carácter limitante, diseño de cebadores para PCR que se hibridan a diferentes regiones de las UTR. Utilizando este enfoque, un experto en la técnica puede modificar la longitud de las UTR 5 'y 3' requerida para lograr una eficiacia de traducción óptima después de la transfección con el ARN transcrito.

Las UTR 5' y 3' pueden ser las UTR 5' y 3' que se producen de forma natural, endógenas respecto al ácido nucleico de interés. Como alternativa, las secuencias u Tr que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés se pueden añadir incorporando las secuencias UTR en los cebadores directo e inverso o mediante cualesquiera otras modificaciones del molde. El uso de secuencias UTR que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficacia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que elementos ricos en AU en las secuencias UTR 3' pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, se pueden seleccionar o diseñar UTR 3' para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en las propiedades de UTR muy conocidas en la técnica.

En una realización, la UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del ácido nucleico endógeno. Como alternativa, cuando se añade una UTR 5' que no es endógena respecto al ácido nucleico de interés por PCR, tal como se ha descrito anteriormente, se puede rediseñar una secuencia Kozak consenso añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias Kozak pueden aumentar la eficacia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece que se necesiten en todos los ARN para posibilitar una traducción eficaz. Existe constancia del requisito de secuencias de Kozak para muchos ARNm. En otras realizaciones, la UTR 5' puede ser una UTR 5' de un virus de ARN, cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones, se pueden utilizar diversos análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.

Para permitir la síntesis de ARN a partir de un molde de ADN sin la necesidad de clonación génica, se debe unir un promotor de la transcripción al molde de ADN en dirección 5' respecto a la secuencia que se va a transcribir. Cuando una secuencia que funciona como un promotor para una ARN polimerasa se añade al extremo 5' del cebador directo, el promotor de ARN polimerasa se incorpora al producto de PCR en dirección 5' respecto al marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización preferida, el promotor es un promotor de la polimerasa T7, tal como se describe en otra parte de la presente. Otros promotores útiles incluyen, sin carácter limitante, promotores de la ARN-polimerasa T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la técnica.

En una realización preferida, el ARNm tiene tanto una caperuza en el extremo 5' como una cola poli(A) 3' que determina la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En un molde de ADN circular, por ejemplo, ADN plasmídico, la ARN polimerasa produce un producto concatamérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucariotas. La transcripción del ADN plasmídico linealizado en el extremo de la UTR 3' da como resultado un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariota, incluso si se poliadenila después de la transcripción.

En un molde de ADN lineal, la ARN-polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' del transcrito más allá de la última base del molde (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

El método convencional de integración de tramos de poliA/T en un molde de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia de poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede provocar inestabilidad plasmídica, que es por lo que los moldes de ADN plasmídico obtenidos de células bacterianas están a menudo muy contaminados con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no solo sean laboriosos y lentos, sino que a menudo no sean fiables. Es por eso que un método que permite la construcción de moldes de ADN con un tramo de poliA/T 3' sin clonación es sumamente deseable.

El segmento de poliA/T del molde de ADN transcripcional se puede producir durante la PCR utilizando un cebador inverso que contiene una cola poliT, tal como la cola 100T (SEQ ID NO: 31) (el tamaño puede ser 50-5000 T (SEQ ID NO: 32)), o después de la PCR por cualquier otro método, incluidos, pero sin carácter limitante, ligamiento de ADN o recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. Generalmente, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) está entre 100 y 5000 adenosinas (SEQ ID NO 33).

Las colas de poli(A) de los ARN se pueden extender aún más después de la transcripción in vitro con el uso de una poli(A) polimerasa, tal como la poliA-polimerasa de E. co li(E-PAP). En una realización, aumentar la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos (SEQ ID NO: 34) da como resultado un aumento de aproximadamente dos veces en la eficacia de traducción del ARN. Adicionalmente, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Una unión de este tipo puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos de ATP se pueden incorporar en la cola de poli(A) utilizando poli(A)-polimerasa. Los análogos de ATP pueden aumentar adicionalmente la estabilidad del ARN.

Las caperuzas 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los métodos descritos en la presente incluyen una caperuza 5'. La caperuza 5' se proporciona utilizando técnicas conocidas en la materia y descritas en la presente (Cougot et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

Los ARN producidos por los métodos divulgados en la presente también pueden contener una secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia vírica, cromosómica o diseñada por medios artificiales que inicie la unión del ribosoma independiente de la caperuza al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Se pueden incluir cualesquiera solutos adecuados para la electroporación celular, que puede contener factores que facilitan la permeabilidad y la viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y surfactantes.

El ARN se puede introducir en células diana utilizando cualquiera de varios métodos diferentes, por ejemplo, métodos comercializados que incluyen, sin carácter limitante, electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (bTx ) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo Alemania), la transfección mediada por liposomas catiónicos utilizando lipofección, encapsulación de polímeros, transfección mediada por péptidos o sistemas de suministro biolístico de partículas, tales como «cañones de genes» (remítase, por ejemplo, a Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12 (8): 861 -70 (2001).

Métodos de sum inistro no víricos

En algunos aspectos, se pueden utilizar métodos no víricos para suministrar un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente a una célula o tejido en un sujeto.

En algunos casos, el método no vírico incluye el uso de un transposón (también denominado elemento transposable). En algunos casos, un transposón es una pieza de ADN que se puede insertar en una ubicación en un genoma, por ejemplo, una pieza de ADN que es capaz de autorreplicarse e insertar su copia en un genoma, o una pieza de ADN que se puede escindir de un ácido nucleico más largo e insertarse en otro lugar en un genoma. Por ejemplo, un transposón comprende una secuencia de ADN compuesta de repeticiones invertidas que flanquean genes para la transposición.

Los métodos a modo de ejemplo de suministro de ácido nucleico utilizando un transposón incluyen el sistema transposón Bella Durmiente (SBTS, por sus siglas en inglés) y un sistema transposón piggyBac (PB). Remítase, por ejemplo, a Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; y Ding et al. Cell.

122.3(2005):473-83.

El SBTS incluye dos componentes: 1) un transposón que contiene un transgén y 2) una fuente de enzima transposasa. La transposasa puede transponer el transposón de un plásmido portador (u otro ADN donante) a un ADN diana, tal como un cromosoma/genoma de la célula hospedadora. Por ejemplo, la transposasa se une al ADN donante/plásmido portador, corta el transposón (incluido(s) el(los) transgen(es)) del plásmido, y lo inserta en el genoma de la célula hospedadora. Remítase, por ejemplo, a Aronovich et al., mencionado anteriormente.

Los tansposones a modo de ejemplo incluyen un transposón basado en pT2. Remítase, por ejemplo, a Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; y Singh et al. Cáncer Res. 68.8(2008): 2961-2971. Las transposasas a modo de ejemplo incluyen una transposasa de tipo Tc1/mariner, por ejemplo, la transposasa SB10 o la transposasa SB11 (una transposasa hiperactiva que se puede expresar, por ejemplo, a partir de un promotor de citomegalovirus). Remítase, por ejemplo, a Aronovich et al.; Kebriaei et al.; y Grabundzija et al.

El uso de SBTS permite la integración y expresión eficaces de un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En la presente se proporcionan métodos para generar una célula, por ejemplo, un linfocito T o linfocito NK, que expresa de manera estable un CAR descrito en la presente, por ejemplo, utilizando un sistema transposón tal como SBTS.

De acuerdo con los métodos descritos en la presente, en algunas realizaciones, se suministran a una célula (por ejemplo, linfocito T o NK) uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, plásmidos, que contienen los componentes SBTS. Por ejemplo, el(los) ácido(s) nucleico(s) se suministra(n) mediante métodos estándar de suministro de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN plasmídico), por ejemplo, métodos descritos en la presente, por ejemplo, electroporación, transfección o lipofección. En algunos casos, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En algunos casos, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente) así como también una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. En otros casos, se proporciona un sistema con dos ácidos nucleicos, por ejemplo, un sistema plasmídico dual, por ejemplo, donde un primer plásmido contiene un transposón que comprende un transgén, y un segundo plásmido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. Por ejemplo, el primer y el segundo ácidos nucleicos se suministran conjuntamente a la célula hospedadora.

En algunos casos, se generan células, por ejemplo, linfocitos T o NK, que expresan un CAR descrito en la presente utilizando una combinación de inserción génica utilizando SBTS y edición génica utilizando una nucleasa (por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc (ZFN, por sus siglas en inglés), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés), el sistema CRISPR/Cas o meganucleasas modificadas (endonucleasas de asentamiento rediseñadas).

En algunas realizaciones, el uso de un método no vírico de suministro permite la reprogramación de células, por ejemplo, linfocitos T o NK, e infusión directa de las células en el sujeto. Las ventajas de los vectores no víricos incluyen, sin carácter limitante, la facilidad y coste relativamente bajo de producción de cantidades suficientes para que una población de pacientes esté cubierta, la estabilidad durante el almacenamiento y la ausencia de inmunogenicidad.

Constructos de Ácido Nucleico que Codifican un CAR

La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más constructos CAR descritos en la presente. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como un transcrito de ARN mensajero. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como un constructo de ADN.

En consecuencia, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), donde el CAR comprende un dominio de unión a CD123 (por ejemplo, un dominio de unión a CD123 humano o humanizado), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, la cadena zeta. En un caso, el dominio de unión a CD123 es un dominio de unión a CD123 descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a CD123 que comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende un dominio de unión a CD123 humano que comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 157-160, 478, 480, 483 y 485. En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende un dominio de unión a CD123 humanizado que comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 184-215 y 556-587. En un caso, el dominio transmembrana es el dominio transmembrana de una proteína, por ejemplo, que se describe en la presente, por ejemplo, que se selecciona del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En un caso, el dominio de unión a CD123 está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, por ejemplo, una bisagra descrita en la presente. En un caso, la región de bisagra comprende las SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En un caso, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína, por ejemplo, que se describe en la presente, por ejemplo, que se selecciona del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, una proteína receptora de t Nf , una proteína similar a inmunoglobulinas, un receptor de citocinas, una integrina, una molécula de señalización de la activación linfocitaria (proteína SLAM), un receptor de activación de linfocitos NK, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, La T, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.

En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas, y la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia con una identidad de un 95-99% estas, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una cadena polipeptídica única.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un constructo CAR que comprende una secuencia líder de la SEQ ID NO: 1, un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NOS: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas), una región de bisagra de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas), un dominio transmembrana que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6 (o una secuencia con identidad de un 95-99% con esta), un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:7 o un dominio coestimulador de CD27 que tiene una secuencia de la SEQ ID n O:8 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta), o un dominio coestimulador de CD28 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:43 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta) o un dominio coestimulador de ICOS que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 45 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta), y un dominio estimulador CD3-zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:9 o la SEQ ID NO: 10 (o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas).

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula polipeptídica aislada codificada por la molécula de ácido nucleico. En un caso, la molécula polipeptídica aislada comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO:98-101 y 125-156, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de un receptor antigénico quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador, y donde dicho dominio de unión a CD123 comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485 y 556-587, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende un dominio de unión a CD123 humano que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las Se Q ID NO: 157-160, 478, 480, 483 y 485, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, el dominio de unión a CD123 comprende un dominio de unión a CD123 humanizado que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 184-215 y 556-587, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

En un caso, la molécula CAR codificada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En un caso, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína que se selecciona del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a inmunoglobulinas, un receptor de citocinas, una integrina, una molécula de señalización de la activación linfocitaria (proteína SLAM), un receptor de activación de linfocitos NK, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, Cd 27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO:7.

En un caso, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, una molécula de la clase I de MHC, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a inmunoglobulinas, un receptor de citocinas, una integrina, una molécula de señalización de la activación linfocitaria (proteína SLAM), un receptor de activación de linfocitos NK, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11 a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2,

SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 alfa, CD8 beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), ^lT^bR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un lingado que se une específicamente con CD83.

En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO:6. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1 BB y un dominio de señalización funcional de zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la SEQ ID NO: 9, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una cadena polipeptídica única. En un caso, el dominio de unión a CD123 está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra. En un caso, la región de bisagra comprende la SEQ ID NO:2. En un caso, la región de bisagra comprende la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula CAR codificada que comprende una secuencia líder de la SEQ ID NO: 1, un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 157-160,184-215, 478, 480, 483, 485, 556-587, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas, una región de bisagra de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6, un dominio coestimulador de 4-1BB que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:7 o un dominio coestimulador de CD27 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:8 o un dominio coestimulador de CD28 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:43 o un dominio coestimulador de ICOS que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 45 y un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10. En un caso, la molécula CAR codificada comprende una secuencia seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 98-101 y 125-156, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cribando colecciones de células que expresan el gen, obteniendo el gen de un vector que se sabe que los incluye, o aislándolo directamente de células y tejidos que lo contienen, utilizando técnicas estándar. Como alternativa, el gen de interés se puede producir por medios sintéticos, en lugar de clonarse.

La presente invención también proporciona vectores en los que se inserta un ADN de la presente invención. Los vectores obtenidos de retrovirus tales como el lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia génica a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja añadida frente a los vectores derivados de oncorretrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, tales como hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de una baja inmunogenicidad. Un vector retrovírico también puede ser, por ejemplo, un vector gammarretrovírico. Un vector gammarretrovírico puede incluir, por ejemplo, un promotor, una señal de empaquetamiento (y ), un sitio de unión al cebador (PBS, por sus siglas en inglés), uno o más (por ejemplo, dos) repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés), y un transgén de interés, por ejemplo, un gen que codifica un CAR. Un vector gammarretrovírico puede carecer de genes estructurales víricos tales como gag, pol y env. Los vectores gammarretrovíricos a modo de ejemplo incluyen el virus de la leucemia murina (MLV, por sus siglas en inglés), virus formador de focos en el bazo (SFFV, por sus siglas en inglés) y virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV, por sus siglas en inglés), y vectores derivados de estos. Otros vectores gammarretrovíricos se describen, por ejemplo, en Tobias Maetzig et al., «Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application» Viruses. junio de 2011; 3(6): 677-713.

En otra realización, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica el CAR deseado de la invención es un vector adenovírico (A5/35). En otra realización, la expresión de los ácidos nucleicos que codifican CAR se puede lograr utilizando transposones tales como el de la bella durmiente, crisper, CAS9 y nucleasas con dedos de zinc. Remítase a continuación a June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716.

En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican los CAR se logra normalmente ligando operablemente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones de este a un promotor, e incorporando el constructo en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación y la integración en eucariotas. Los vectores típicos de clonación contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia deseada de ácido nucleico.

Los constructos de expresión de la presente invención también se pueden utilizar para la inmunización con ácidos nucleicos y la terapia génica, utilizando protocolos de suministración de genes estándar. En la técnica existe constancia de métodos para el suministro de genes. Remítase, por ejemplo, a las Pat. de EE.UU. N.os 5399346, 5580859, 5 589466. En otra realización, la invención proporciona un vector de terapia génica.

El ácido nucleico se puede clonar en un cierto número de tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, sin carácter limitante, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

Además, el vector de expresión se puede proporcionar a una célula en forma de un vector vírico. La tecnología de vectores víricos es muy conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, sin carácter limitante, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios para endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, documentos WO 01/96584; WO 01/29058; y Pat de EE.UU. N° 6326 193).

Se ha desarrollado un cierto número de sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de suministro de genes. Un gen seleccionado se puede insertar en un vector y empaquetar en partículas retrovíricas utilizando técnicas conocidas en la técnica. El virus recombinante se puede aislar y suministrar a las células del sujeto ya sea in vivo o ex vivo. En la técnica existe constanica de cierto número de sistemas retrovíricos. En algunas realizaciones, se utilizan vectores adenovíricos. En la técnica existe constancia de un cierto número de vectores adenovíricos. En una realización, se utilizan vectores lentivíricos.

Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Típicamente, estos se ubican en la región de 30-110 pb en dirección 5' respecto al sitio de inicio, aunque se ha mostrado que un cierto número de promotores contienen también elementos funcionales en dirección 3' respecto al sitio de inicio. El espacio entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven uno con respecto al otro. En el promotor de timidina-cinasa (tk), el espacio entre los elementos promotores se puede aumentar a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece ser que los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción.

Un ejemplo de un promotor que es capaz de expresar un transgén CAR en un linfocito T de mamífero es el promotor EF1a. El promotor EF1a nativo impulsa la expresión de la subunidad alfa del complejo del factor de elongación 1, que es responsable del suministro enzimático de los aminoacil-ARNt al ribosoma. El promotor EF1a se ha utilizado exhaustivamente en los plásmidos de expresión de mamíferos y ha mostrado ser eficaz para impulsar la expresión de CAR a partir de los transgenes clonados en un vector lentivírico. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). En un aspecto, el promotor EF1a comprende la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO:11.

Otro ejemplo de un promotor es la secuencia promotora del citomegalovirus (CMV) inmediata temprana. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar niveles elevados de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica ligada operablemente a ella. Sin embargo, también se pueden utilizar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, sin carácter limitante, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40, por sus siglas en inglés), el virus del tumor mamario de ratones (MMTV, por sus siglas en inglés), el promotor de repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés) del virus de inmunodeficiencia humana (HIV, por sus siglas en inglés), el promotor de MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor inmediato temprano del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como también promotores de genes humanos, tales como, sin carácter limitante, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor del factor de elongación 1a, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina-cinasa. Además, la invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la invención. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica que está ligada operablemente cuando se desea tal expresión, o capaz de desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, sin carácter limitante, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclinas.

Otro ejemplo de un promotor es el promotor fosfoglicerato-cinasa (PGK, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, se puede desear un promotor PGK truncado (por ejemplo, un promotor PGK con una o más, por ejemplo, 1,2, 5, 10, 100, 200, 300 o 400, deleciones de nucleótidos cuando se compara con la secuencia del promotor PGK de tipo natural). A continuación se proporcionan las secuencias de nucleótidos de promotores PGK a modo de ejemplo.

Promotor PGK de tipo natural

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC

GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGC GCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCG CTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGC CTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGC ACCATAAGCT

(SEQ ID NO: 597)

Promotores PGK truncados a m odo de ejemplo:

PGK100:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG

(SEQ ID NO: 598)

PGK200:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CG

(SEQ ID NO: 599)

PGK300:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC

CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGC GCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG

(SEQ ID NO: 600)

PGK400:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTAC GCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGC CGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAA CGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGC GCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCG CTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG

(SEQ ID NO: 601)

Un vector también puede incluir, por ejemplo, una secuencia señal para facilitar la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de la transcripción (por ejemplo, gen de la Hormona de Crecimiento Bovina (BGH, por sus siglas en inglés)), un elemento que permite la replicación episómica y la replicación en procariotas (por ejemplo, origen SV40 y ColE1 u otros conocidos en la técnica) y/o elementos para permitir la selección (por ejemplo, gen de resistencia a la ampicilina y/o marcador de zeocina).

Con el fin de evaluar la expresión de un polipéptido CAR o porciones de este, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células que lo expresan a partir de la población de células que se desea transfectar o infectar mediante vectores víricos. En otros aspectos, el marcador seleccionable se puede transportar en una pieza de ADN separada y utilizar en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células hospedadora. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.

Los genes indicadores se utilizan para identificar células que pueden haber sido transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen indicador es un gen que no está presente ni se expresa en el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se pone de manifiesto por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen indicador se analiza en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol-acetiltransferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína fluorescente verde (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son muy conocidos y se pueden preparar utilizando técnicas conocidas u obtenerse de proveedores comerciales. En general, la construcción con la región flanqueante 5' mínima que muestra el nivel más alto de expresión del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden estar ligadas a un gen indicador y se pueden utilizar para evaluar a los agentes según la capacidad de modular la transcripción impulsada por el promotor.

En una realización, el vector puede comprender además un ácido nucleico que codifica un segundo CAR. En una realización, el segundo CAR incluye un dominio de unión al antígeno para una diana expresada en las células de leucemia mieloide aguda tal como, por ejemplo, CD33, CD34, CLL-1, FLT3 o el receptor de folato beta. En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer CAR que tiene como diana un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimulador pero no un dominio de señalización primaria, y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que tiene como diana un segundo antígeno, diferente, e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primaria pero no un dominio de señalización coestimulador. En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer CAR CD123 que incluye un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que tiene como diana un antígeno que no es CD123 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD33, CD34, CLL-1, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria. En otra realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer CAR CD123 que incluye un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que tiene como diana un antígeno que no es CD123 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CD33, CLL-1, CD34, FLT3 o el receptor de folato beta) e incluye un dominio de unión al antígeno para el antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador.

En un caso, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un CAR CD123 descrito en la presente y un ácido nucleico que codifica un CAR inhibidor. En un caso, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno presente en células normales pero no en células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan CD123. En un caso, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina y TGFR beta.

En algunos casos, el vector puede comprender dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR, por ejemplo, un CAR CD123 descrito en la presente y un segundo CAR, por ejemplo, un CAR inhibidor o un CAR que se une específicamente a un antígeno que no es CD123 (por ejemplo, un antígeno expresado en células AML, por ejemplo, CLL-1, CD33, CD34, FLT3 o receptor de folato beta). En tales casos, las dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican el CAR están codificadas por una única molécula de ácido nucleico en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En este aspecto, los dos o más CAR pueden, por ejemplo, estar separados por uno o más sitios de escisión peptídica (por ejemplo, un sitio de autoescisión o un sustrato para una proteasa intracelular). Los ejemplos de sitios de escisión peptídica inclu en los si uientes, donde los residuos GSG son opcionales:

En la técnica existe constancia de métodos para introducir y expresar genes en una célula. En el contexto de un vector de expresión, el vector se puede introducir fácilmente en una célula hospedadora, por ejemplo, células de mamífero, bacterianas, de levaduras o de insectos mediante cualquier método de la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son muy conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula hospedadora es la transfección con fosfato de calcio.

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos, se han convertido en el método más ampliamente utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, seres humanos. Se pueden obtener otros vectores víricos a partir de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simplex I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Remítase, por ejemplo, a las Pat. de EE.UU. N.os 5350674 y 5585362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal a modo de ejemplo para su uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). Se dispone de otros métodos de vanguardia de suministro dirigido de ácidos nucleicos tales como el suministro de polinucleótidos con nanopartículas dirigidas u otro sistema de suministro adecuado para tamaños submicrónicos.

En el caso en el que se utiliza un sistema de suministro no vírico, un vehículo de suministro a modo de ejemplo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otra manera con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura «colapsada». También pueden simplemente intercalarse en una solución, posiblemente formando agregados que no tienen un tamaño o forma uniformes. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las microgotas grasas que se producen de forma natural en el citoplasma, así como también la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Se pueden obtener lípidos adecuados para su uso de proveedores comerciales. Por ejemplo, se puede obtener dimiristilfosfatidilcolina («DMPC») de Sigma, St. Louis, MO; se puede obtener fosfato de dicetilo («DCP») de K & K Laboratories (Plainview, NY); se puede obtener colesterol («Choi») de Calbiochem-Behring; se puede obtener dimiristilfosfatidilglicerol («DMPG») y otros lípidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Las soluciones de partida de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20°C. El cloroformo se utiliza como el único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. «Liposoma» es un término genérico que abarca una diversidad de vehículos lipídicos simples y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos encerrados. Los liposomas pueden estar caracterizados por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos de Lipofectamine-ácido nucleico.

Independientemente del método utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula hospedadora o exponer de otra manera una célula al inhibidor de la presente divulgación, con el fin de confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula hospedadora, se pueden realizar varios ensayos. Los ensayos de este tipo incluyen, por ejemplo, ensayos «biológicos moleculares» muy conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos «bioquímicos», tales como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA e inmunoelectrotransferencia) o por ensayos descritos en la presente para identificar agentes comprendidos en el alcance de la divulgación.

La presente divulgación proporciona además un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR. En un aspecto, con un vector CAR se puede transducir directamente una célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T o linfocito NK. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o expresión, por ejemplo, un vector que incluye, sin carácter limitante, uno o más plásmidos (por ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas diminutos dobles), constructos vectoriales retrovíricos y lentivíricos. En un aspecto, el vector es capaz de expresar el constructo CAR en células efectoras inmunitarias de mamífero, por ejemplo, linfocitos T de mamífero o linfocitos NK de mamífero. En un aspecto, en linfocito T de mamífero es un linfocito T humano.

Fuentes de células

Antes de la expansión y modificación genética, se obtiene una fuente de células (por ejemplo, células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de un sujeto. El término «sujeto» pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de estos. Los linfocitos T se pueden obtener de un cierto número de fuentes, incluidas las células mononucleares de la sangre periférica, la médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores.

En ciertos aspectos de la presente invención, se puede utilizar cualquier número de líneas de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) disponibles en la técnica. En ciertos aspectos de la presente invención, los linfocitos T se pueden obtener de una unidad de sangre recogida de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto, tal como la separación con Ficoll™ . En un aspecto preferido, se obtienen células de la sangre circulante de un individuo por aféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluidos linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros globulos blancos nucleados, globulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. En un aspecto de la invención, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En un aspecto alternativo, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos cationes divalentes, si no todos. Las etapas de activación iniciales en ausencia de calcio pueden conducir a una activación magnificada. Como los expertos ordinarios en la técnica apreciarían fácilmente, una etapa de lavado se puede lograr mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como utilizando una centrífuga semiautomática de «flujo continuo» (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en diversos tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS exento de Ca, exento de Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Como alternativa, los componentes indeseables de la muestra de aféresis se pueden separar y las células resuspender directamente en medios de cultivo.

Se reconoce que los métodos de la solicitud pueden utilizar condiciones de medios de cultivo que comprenden un 5% o menos, por ejemplo, un 2%, de suero AB humano, y emplear composiciones y condiciones de medios de cultivo conocidas, por ejemplo, las descritas en Smith et al., «Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement» Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.

En un aspecto, los linfocitos T se aíslan de linfocitos de la sangre periférica lisando los glóbulos rojos y disminuyendo los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLLTM o por elutriación centrífuga de contraflujo. Una subpoblación específica de linfocitos T, tales como los linfocitos T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, se puede aislar adicionalmente mediante técnicas de selección positivas o negativas. Por ejemplo, en un aspecto, los linfocitos T se aíslan mediante incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, 3x28), tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para una selección positiva de los linfocitos T deseados. En un aspecto, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En un aspecto adicional, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto adicional, el período de tiempo es de al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otro aspecto preferido más, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En un aspecto, el período de tiempo de incubación es de 24 horas. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar linfocitos T en cualquier situación en la que haya pocos linfocitos T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL, por sus siglas en inglés) del tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más prolongados puede aumentar la eficacia de captura de linfocitos T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo en que se permite que los linfocitos T se unan a las perlas de CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la proporción de perlas respecto a linfocitos T (tal como se describe más adelante en la presente), se puede seleccionar preferentemente a favor o en contra de subpoblaciones de linfocitos T en el inicio del cultivo o en otros puntos temporales durante el proceso. Adicionalmente, al aumentar o disminuir la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se puede seleccionar preferentemente a favor o en contra de las subpoblaciones de linfocitos T en el inicio del cultivo o en otros puntos temporales deseados. El experto reconocería que también se pueden utilizar múltiples rondas de selección en el contexto de esta invención. En determinados aspectos, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y utilizar las células «no seleccionadas» en el proceso de activación y expansión. Las células «no seleccionadas» también se pueden someter a rondas adicionales de selección.

El enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores superficiales únicos para las células seleccionadas de manera negativa. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un combinado de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas de manera negativa. Por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un combinado de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11bb, CD16, HLA-DR y CD8. En determinados aspectos, puede ser deseable enriquecer o seleccionar de manera positiva en linfocitos T reguladores que expresan típicamente CD4+, CD25+, CD62Lelevado, GITR+ y FoxP3+. Como alternativa, en ciertos aspectos, los linfocitos T reguladores se hacen disminuir con perlas anti-C25 conjugadas u otros métodos de selección similares.

Los métodos descritos en la presente pueden incluir, por ejemplo, la selección de una subpoblación específica de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que son una población con disminución de linfocitos T reguladores, células con disminución de CD25+, utilizando, por ejemplo, una técnica de selección negativa, por ejemplo, descrita en la presente. Preferentemente, la población de células con linfocitos T reguladores disminuidos contiene menos de un 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% de células CD25+.

En una realización, los linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, se eliminan de la población utilizando un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento de este, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o un fragmento de este, o ligando de unión a CD25 se conjuga con un sustrato, por ejemplo, una perla, o de lo contrario se utiliza para recubrir un sustrato, por ejemplo, una perla. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, se conjuga con un sustrato tal como se describe en la presente.

En una realización, los linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, se eliminan de la población utilizando un reactivo para disminuir CD25 de Miltenyi™. En una realización, la proporción de células respecto al reactivo para disminuir CD25 es de 1e7 células respecto a 20 uL, o de 1e7 células respecto a 15 uL, o de 1e7 células respecto a 10 uL, o de 1e7 células respecto a 5 uL, o de 1e7 células respecto a 2,5 uL, o de 1e7 células respecto a 1,25 uL. En una realización, por ejemplo, para linfocitos T reguladores, por ejemplo, la disminución de CD25+, se utilizan más de 500 millones de células/mL. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 600, 700, 800 o 900 millones de células/mL.

En una realización, la población de células efectoras inmunitarias que se va a disminuir incluye aproximadamente 6 x 109 linfocitos T CD25+. En otros aspectos, la población de células efectoras inmunitarias que experimentará una disminución incluye de aproximadamente 1 x 109 a 1x 1010 linfocitos T CD25+, y cualquier valor entero entre ellos. En una realización, la población resultante de células con linfocitos T reguladores disminuidos tiene 2 x 109 linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, o menos (por ejemplo, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107, o menos células CD25+).

En una realización, los linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, se eliminan de la población utilizando el sistema CliniMAC con un conjunto de tubos de disminución tales como, por ejemplo, tubos 162-01. En una realización, el sistema CliniMAC se ejecuta en una configuración de eliminación tal como, por ejemplo, DEPLETION2.1.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, la reducción del nivel de reguladores negativos de las células inmunitarias (por ejemplo, disminución del número de células inmunitarias no deseadas, por ejemplo, linfocitos Treg), en un sujeto antes de la aféresis o durante la producción de un producto de tipo célula que expresa CAR puede reducir el riesgo de recaídas del sujeto. Por ejemplo, en la técnica existe constancia de métodos para disminuir los linfocitos Treg. Los métodos de reducción de linfocitos Treg incluyen, sin carácter limitante, ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR (un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente), disminución de CD25, y combinaciones de estos.

En algunas realizaciones, los métodos de producción comprenden reducir el número de (por ejemplo, disminuir) linfocitos Treg antes de la producción de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, los métodos de producción comprenden poner en contacto la muestra, por ejemplo, la muestra de aféresis, con un anticuerpo anti-GITR y/o un anticuerpo anti-CD25 (o un fragmento de este, o un ligando de unión a CD25), por ejemplo, para disminuir los linfocitos Treg antes de producir el producto de tipo célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T, linfocito NK).

En una realización, se pretrata un sujeto con una o más terapias que reducen los linfocitos Treg antes de la recogida de células para la producción del producto de tipo célula que expresa CAR, y de esta manera se reduce el riesgo de que el sujeto recaiga con el tratamiento con la célula que expresa CAR. En una realización, los métodos para reducir los linfocitos Treg incluyen, sin carácter limitante, la administración al sujeto de uno o más de: ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, disminución de CD25 o una combinación de estos. La administración de uno o más de: ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, disminución de CD25 o una combinación de estos puede ocurrir antes, durante o después de una infusión del producto de tipo célula que expresa CAR.

En una realización, se pretrata un sujeto con ciclofosfamida antes de la recogida de células para la producción del producto de tipo célula que expresa CAR, y de esta manera se reduce el riesgo de que el sujeto recaiga con el tratamiento con la célula que expresa CAR. En una realización, se pretrata un sujeto con un anticuerpo anti-GITR antes de la recogida de células para la producción del producto de tipo célula que expresa CAR, y de esta manera se reduce el riesgo de que el sujeto recaiga con el tratamiento con la célula que expresa CAR.

En una realización, la población de células que se van a eliminar no son linfocitos T reguladores ni células tumorales, sino células que afectan negativamente de otra manera la expansión y/o función de los linfocitos CART, por ejemplo, células que expresan CD14, CD11b, CD33, CD15 u otros marcadores expresados por células potencialmente inmunosupresoras. En una realización, se contempla que tales células se eliminen a la vez que los linfocitos T reguladores y/o células tumorales, o tras dicha disminución, o en otro orden.

Los métodos descritos en la presente pueden incluir más de un paso de selección, por ejemplo, más de un paso de disminución. El enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr, por ejemplo, con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores superficiales únicos para las células seleccionadas de manera negativa. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un combinado de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas de manera negativa. Por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un combinado de anticuerpos monoclonales puede incluir anticuerpos contra CD14, CD20, CD11bb, CD16, HLA-DR y CD8.

Los métodos descritos en la presente pueden incluir además la eliminación de células de la población que expresa un tumor antigénico, por ejemplo, un tumor antigénico que no comprende CD25, por ejemplo, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 o CD11b, para proporcionar de esta manera una población de células con linfocitos T reguladores disminuidos, por ejemplo, CD25+ disminuidos, y con células con antígenos tumorales disminuidas que son adecuadas para la expresión de un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente. En una realización, las células que expresan antígenos tumorales se eliminan simultáneamente con los linfocitos T reguladores, por ejemplo, CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y un anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento de este, se pueden unir al mismo sustrato, por ejemplo, perla, que se puede utilizar para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, o el anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento de este, se pueden unir a perlas separadas, y esta mezcla se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el antígeno tumoral es secuencial y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

También se proporcionan métodos que incluyen eliminar células de la población que expresan un inhibidor de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control descritos en la presente, por ejemplo, una o más células PD1+, células LAG3+, y células TIM3+, para proporcionar de esta manera una población de células con linfocitos T reguladores disminuidos, por ejemplo, células con Cd 25+ disminuidos, y células con inhibidores de puntos de control disminuidos, por ejemplo, células con PD1+, LAG3+ y/o TIM3+ disminuidos. Los inhibidores de puntos de control a modo de ejemplo incluyen B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA y LAIR1. En una realización, las células que expresan un inhibidor de puntos de control se eliminan simultáneamente con los linfocitos T reguladores, por ejemplo, CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y un anticuerpo anti-inhibidor de puntos de control, o fragmento de este, se pueden unir a la misma perla, que se puede utilizar para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y el anticuerpo anti inhibidor de puntos de control, o fragmento de este, se pueden unir a perlas separadas, y esta mezcla se puede utilizar para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de linfocitos T reguladores, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el inhibidor de puntos de control es secuencial y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

En una realización, se puede seleccionar una población de linfocitos T que expresa uno o más de: IFN-Y, TNFa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B y perforina, u otras moléculas apropiadas, por ejemplo, otras citoquinas. Se pueden determinar métodos para el cribado de la expresión celular, por ejemplo, según los métodos descritos en la Publicación PCT N.°: WO 2013/126712.

Para el aislamiento de una población de células deseada mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas). En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las perlas y las células (por ejemplo, aumento de la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de 2 billones de células/mL. En un aspecto, se utiliza una concentración de 1 billón de células/mL. En un aspecto adicional, se utilizan más de 100 millones de células/mL. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/mL. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/mL. En aspectos adicionales, se pueden utilizar concentraciones de 125 o 150 millones de células/mL. El uso de altas concentraciones puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficaz de las células que puedan expresar débilmente antígenos diana de interés, tales como linfocitos T negativos para CD28, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (por ejemplo, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y serían deseables de obtener. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En un aspecto relacionado, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de linfocitos T y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona las células que expresan cantidades elevadas de antígenos deseados para unirse a las partículas. Por ejemplo, los linfocitos T CD4+ expresan niveles más elevados de CD28 y se capturan de manera más eficaz que los linfocitos T CD8+ en concentraciones diluidas. En un aspecto, la concentración de células utilizada es 5 X 10e6/mL. En otros aspectos, la concentración utilizada puede ser de aproximadamente 1 X 105/mL a 1 X 106/mL, y cualquier valor entero entre ellos.

En otros aspectos, las células se pueden incubar en un dispositivo rotatorio durante períodos de tiempo variables a velocidades variables a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

Los linfocitos T para estimulación también se pueden congelar después de un paso de lavado. Sin desear ceñirse a la teoría, el paso de congelación y descongelación posterior proporciona un producto más uniforme al separar granulocitos y, en cierta medida, monocitos en la población celular. Después del paso de lavado que separa el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Si bien muchas soluciones y parámetros de congelación son conocidos en la técnica y serán útiles en este contexto, un método conlleva el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano, o medios de cultivo que contienen un 10% de Dextrano 40 y un 5% de Dextrosa, un 20% de Albúmina de Suero Humano y un 7,5% de DMSO, o un 31,25% de Plasmalyte-A, un 5% de Dextrosa, un 0,45% de NaCl, un 10% de Dextrano 40 y un 5% de Dextrosa, un 20% de Albúmina de Suero Humano y un 7,5% de DMSO u otros medios de congelación celular adecuados que contienen, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células se congelan después a -80°C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden utilizar otros métodos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

En ciertos aspectos, las células crioconservadas se descongelan y se lavan tal como se describe en la presente y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación utilizando los métodos de la presente invención.

También se contempla en el contexto de la invención la recogida de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior al momento en que se podrían necesitar las células expandidas tal como se describen en la presente. Como tal, la fuente de las células que se van a expandir se puede recoger en cualquier punto temporal necesario, y las células deseadas, tales como células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, aislar y congelar para su uso posterior en la terapia con linfocitos T para cualquier número de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con células, por ejemplo, terapia con linfocitos T, tales como las descritas en la presente. En un aspecto, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En ciertos aspectos, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y congelan para su uso posterior. En ciertos aspectos, las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, se pueden expandir, congelar y utilizar en un momento posterior. En ciertos aspectos, se recogen muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular tal como se describe en la presente, pero antes de cualesquiera tratamientos. En un aspecto adicional, las células se aíslan de una muestra de sangre o de una aféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, sin carácter limitante, tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivíricos, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos, tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación.

En un aspecto adicional de la presente invención, los linfocitos T se obtienen de un paciente directamente después del tratamiento que deja al sujeto con linfocitos T funcionales. A este respecto, se ha observado que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en particular los tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el período en que los pacientes normalmente se recuperarían del tratamiento, la calidad de los linfocitos T obtenidos puede ser óptima o mejorada en lo que respecta a su capacidad de expandirse ex vivo. Del mismo modo, después de la manipulación ex vivo utilizando los métodos descritos en la presente, estas células pueden estar en un estado preferido para un mejor injerto y expansión in vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la presente invención recoger células de la sangre, incluidos linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertos aspectos, los regímenes de movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y acondicionamiento pueden utilizarse para crear una condición en un sujeto en el que se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos de células particulares, especialmente durante un intervalo de tiempo definido después de la terapia. Los tipos ilustrativos de células incluyen linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

En un caso, las células efectoras inmunitarias que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en al presente, se obtienen de un sujeto que ha recibido una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR. En una realización, la población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que se va a modificar para expresar un CAR, se recolecta después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente con la dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, en el sujeto o recolectadas del sujeto se haya incrementado, al menos de manera transitoria.

En otras realizaciones, la población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que tienen, o se modificarán para expresar un CAR, se pueden tratar ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que incrementa el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, o incrementa la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T.

En una realización, una población de linfocitos T es deficiente en diaglicerol-cinasa (DGK, por sus siglas en inglés). Las células deficientes en d Gk incluyen células que no expresan RNA o proteína de DGK, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de DGK. Las células deficientes en DGK se pueden generar mediante estrategias genéticas, por ejemplo, administración de agentes de interferencia por ARN, por ejemplo, ARNip, ARNhc, ARNmi, para reducir o prevenir el expresión de DGK. Como alternativa, las células deficientes en DGK se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de DGK descritos en la presente.

En una realización, una población de linfocitos T es deficiente en Ikaros. Las células deficientes en Ikaros incluyen células que no expresan el ARN o la proteína de Ikaros, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de Ikaros, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante estrategias genéticas, por ejemplo, administrando agentes de interferencia por ARN, por ejemplo, ARNip, ARNhc, ARNmi, para reducir o evitar la expresión de Ikaros. Como alternativa, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de Ikaros, por ejemplo, lenalidomida.

En algunas realizaciones, una población de linfocitos T es deficiente en DGK y deficiente en Ikaros, por ejemplo, no expresa DGK ni Ikaros, o tiene una reducción o inhibición de la actividad de DGK e Ikaros. Tales células deficientes en DGK e Ikaros se pueden generar mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.

En una realización, los linfocitos NK se obtienen del sujeto. En otra realización, los linfocitos NK son una línea de linfocitos NK, por ejemplo, línea de linfocitos NK-92 (Conkewest).

Células efectoras inmunitarias CAR alogénicas

En las realizaciones descritas en la presente, la célula efectora inmunitaria puede ser una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. Por ejemplo, la célula puede ser un linfocito T alogénico, por ejemplo, un linfocito T alogénico que carece de la expresión de un receptor de linfocitos T (TCR) y/o antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, HLA de clase I y/o h La de clase II, funcionales.

Un linfocito T que carece de un TCR funcional se puede, por ejemplo, modificar de manera que no exprese ningún TCR funcional en su superficie, modificar de manera que no exprese una o más subunidades que comprenden un TCR funcional (por ejemplo, modificar de manera que no exprese (o muestre una expresión reducida) de TCR alfa, TCR beta, TCR gamma, TCR delta, TCR épsilon y/o TCR zeta) o modificar de manera que produzca muy poco TCR funcional en su superficie. Como alternativa, el linfocito T puede expresar un TCR sustancialmente alterado, por ejemplo, por expresión de formas mutadas o truncadas de una o más subunidades del TCR. La expresión «TCR sustancialmente alterado» significa que este TCR no suscita una reacción inmunitaria adversa en un hospedador.

Un linfocito T descrito en la presente se puede, por ejemplo, modificar de manera que no exprese un HLA funcional en su superficie. Por ejemplo, un linfocito T descrito en la presente, se puede modificar de modo que la expresión en la superficie celular de HLA, por ejemplo, HLA de clase 1 y/o HLA de clase II, experimente una disminución regulada. En algunos aspectos, se puede lograr una disminución regulada de HLA reduciendo o eliminando la expresión de la microglobulina beta-2 (B2M, por sus siglas en inglés).

En algunas realizaciones, el linfocito T puede carecer de un TCR funcional y un HLA funcional, por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II.

Los linfocitos T modificados que carecen de un TCR y/o HLA funcionales se pueden obtener mediante cualquier medio adecuado, incluida la supresión o disminución de una o más subunidades de t Cr o HLA. Por ejemplo, el linfocito T puede incluir una disminución de TCR y/o HLA utilizando ARNip, ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos reguladres (CRISPR), nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o endonucleasa con dedos de zinc (ZFN).

En algunas realizaciones, la célula alogénica puede ser una célula que no expresa o expresa en niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante cualquier método descrito en la presente. Por ejemplo, la célula puede ser una célula que no expresa o expresa con niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, que puede reducir la capacidad de una célula que expresa CAR para organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, por inhibición al nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el comportamiento de la célula que expresa CAR. En algunas realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNbc, por ejemplo, un ARNip o ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa con dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en la presente.

ARNip y ARNhc para inh ib ir TCR o HLA

En algunas realizaciones, se puede inhibir la expresión de TCR y/o la expresión de HLA utilizando ARNip o ARNhc que tiene como diana un ácido nucleico que codifica un TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina, y TGf R beta), en una célula.

La expresión de ARNip o ARNhc en linfocitos T se puede lograr utilizando cualquier sistema de expresión convencional, por ejemplo, tal como un sistema de expresión lentivírico.

Los ARNhc a modo de ejemplo que reducen de manera regulada la expresión de uno o más componentes del TCR se describen, por ejemplo, en la Publicación de EE. UU. N.°: 2012/0321667. Los ARNip y ARNhc a modo de ejemplo que reducen de manera regulada la expresión de los genes de HLA de clase I y/o HLA de clase II se describen, por ejemplo, en la publicación de EE. UU. N.°: US 2007/0036773.

CRISPR para inh ib ir TCR o HLA

El término «CRISPR» o «CRISPR contra TCR y/o HLA» o «CRISPR para inhibir TCR y/o HLA», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un conjunto de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares, o un sistema que comprende un conjunto de repeticiones de este tipo. El término «Cas», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína asociada a CRISPR. Un sistema «CRISPR/Cas» se refiere a un sistema que se obtiene a partir de CRISPR y Cas que se puede utilizar para silenciar o mutar un gen de TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina, y TGf R beta).

Se observan sistemas CRISPR/Cas de origen natural en aproximadamente un 40% de los genomas eubacterianos secuenciados y en un 90% de las arqueas secuenciadas. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema es un tipo de sistema inmunitario procariótico que confiere resistencia a elementos genéticos exógenos tales como plásmidos y fagos y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845.

El sistema CRISPR/Cas ha sido modificado para su uso en la edición génica (silenciar, potenciar o cambiar genes específicos) en eucariotas tales como ratones o primates. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Esto se logra introduciendo en la célula eucariota un plásmido que contiene un CRISPR diseñado específicamente y una o más Cas apropiadas.

La secuencia CRISPR, a veces denominada locus CRISPR, comprende repeticiones y espaciadores que se alternan. En un CRISPR de origen natural, los espaciadores comprenden normalmente secuencias exógenas respecto a la bacteria tal como una secuencia de fago o plásmido; en el sistema CRISPR/Cas TCR y/o HLA, los espaciadores se obtienen de la secuencia del gen TCR o HLA.

El ARN del locus CRISPR es expresado de manera constitutiva y procesado por proteínas Cas para obtener ARN pequeños. Estos comprenden un espaciador flanqueado por una secuencia repetida. Los ARN guian otras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos a nivel de ARN o ADN. Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7. Los espaciadores sirven de este modo como moldes para moléculas de ARN, de manera análoga a los ARNip. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.

Ya que estos ocurren de manera natural en muchos tipos diferentes de bacterias, las disposiciones exactas de los CRISPR y la estructura, función y número de genes Cas y su producto difieren un tanto de unas especies a otras. Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; y Stern et al. (2010) Trends. Genet.

28: 335-340. Por ejemplo, las proteínas Cse (subtipo Cas, E. coli) (por ejemplo, CasA) forman un complejo funcional, Cascade, que procesa los transcritos de ARN CRISPR para obtener unidades de espaciador-repetición que retiene Cascade. Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964. En otras procariotas, Cas6 procesa el transcrito CRISPR. La inactivación de fagos basada en CRISPR en E. coli requiere Cascade y Cas3, pero no Cas1 o Cas2. La proteína Cmr (módulo Cas RAMP) en Pyrococcus furiosus y otras procariotas forman un complejo funcional con ARN CRISPR pequeños que reconoce y escinde ARN diana complementarios. Un sistema CRISPR más simple depende de la proteína Cas9, que es una nucleasa con dos sitios de corte activos, uno para cada hebra de la doble hélice. La combinación de Cas9 y a Rn del locus CRISPR modificado se puede utilizar en un sistema para la edición génica. Pennisi (2013) Science 341: 833 836.

El sistema CRISPR/Cas se puede utilizar, por lo tanto, para editar un gen de TCR y/o HLA (añadiendo o eliminando un par de bases) o introducir una parada prematura que disminuya de esta manera la expresión de TCR y/o HLA. Como alternativa, el sistema CRISPR/Cas se puede utilizar como un ARN de interferencia, desactivando el gen de TCR y/o HLA de manera reversible. En una célula de mamífero, por ejemplo, el ARN puede guiar la proteína Cas a un promotor de TCR y/o HLA, y bloquear estéricamente las ARN polimerasas.

Se pueden generar sistemas CRISPR/Cas artificiales que inhiben TCR y/o HLA, utilizando tecnología conocida en la técnica, por ejemplo, la descrita en la Publicación de EE. UU. N.° 20140068797 y Cong (2013) Science 339: 819-823. También se pueden generar otros sistemas CRISPR/Cas que se conocen en la técnica que inhiben TCR y/o HLA, por ejemplo, el descrito en Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, Patente de EE. UU. N.°: 8871 445; 8865406; 8 795965; 8771 945; y 8697359.

TALEN para inh ib ir TCR o HLA

El término «TALEN» o «TALEN contra HLA y/o TCR» o «TALEN para inhibir HLA y/o TCR» se refiere a una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción, una nucleasa artificial que se puede utilizar para editar el gen de HLA y/o TCR, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina, y TGFR beta).

Las TALEN se producen de manera artificial fusionando un dominio de unión a ADN del efector TAL con un dominio de escisión de ADN. Los efectos de tipo activación de la transcripción (TALE) se pueden modificar para que se unan a cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una porción del gen de HLA o TCR. Al combinar un TALE modificado con un dominio de escisión de ADN, se puede producir una enzima de restricción que es específica para cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una secuencia HLA o TCR. Estas se pueden introducir posteriormente en una célula, donde se pueden utilizar para la edición genómica. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; y Boch et al. (2009) Science 326: 1509 12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.

Los TALE son proteínas secretadas por bacterias Xanthomonas. El dominio de unión a ADN contiene una secuencia repetida de 33-34 aminoácidos muy conservados con excepción de los aminoácidos 12.° y 13.°. Estas dos posiciones son muy variables y muestran una sólida correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos. Por lo tanto, se pueden modificar para unirse a una secuencia de ADN deseada.

Para producir una TALEN, se fusiona una proteína TALE a una nucleasa (N), que es una endonucleasa Fokl de tipo natural o mutada. Se han realizado varias mutaciones en Fokl para su uso en TALEN; estas, por ejemplo, mejoran la especificidad o actividad de escisión. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech.

29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.

El dominio Fokl funciona como un dímero, que requiere dos constructos con dominios de unión a ADN únicos para sitios en el genoma diana con una orientación y separación adecuadas. Tanto el número de residuos aminoacídicos entre el dominio de unión a ADN de TALE y el dominio de escisión Fokl como el número de bases entre dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para lograr niveles elevados de actividad. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.

Se puede utilizar una TALEN para HLA o TCR dentro de una célula para producir una rotura bicatenaria (DSB, por sus siglas en inglés). Se puede introducir una mutación en el sitio de rotura si los mecanismos de reparación reparan de manera incorrecta la ruta mediante unión de extremos no homólogos. Por ejemplo, la reparación incorrecta puede introducir una mutación del marco de lectura. Como alternativa, se puede introducir ADN exógeno en la célula junto con la TALEN; dependiendo de las secuencias del ADN exógeno y la secuencia cromosómica, este proceso se puede utilizar para corregir un defecto en el gen de HLA o TCR o introducir un defecto de este tipo en un gen de HLA o TCR de tipo natural, y reducir de este modo la expresión de HLA o TCR.

Se pueden construir TALEN específicas para secuencias en HLA o TCR utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluidos varios esquemas que utilizan componentes modulares. Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509.

Nucleasa con dedos de zinc para inh ib ir HLA y/o TCR

El término «ZFN» o «Nucleasa con dedos de zinc» o «ZFN contra HLA y/o TCR» o «ZFN para inhibir HLA y/o TCR» se refiere a una nucleasa con dedos de zinc, una nucleasa artificial que se puede utilizar para editar el gen de HLA y/o TCR, y/o una molécula inhibidora descrita en la presente (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina, y TGFR beta).

Como una TALEN, una ZFN comprende un dominio nucleasa Fokl (o derivado de este) fusinado con un dominio de unión a ADN. En el caso de una ZFN, el dominio de unión a ADN comprende uno o más dedos de zinc. Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; y Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.

Un dedo de zinc es un pequeño motivo estructural proteico estabilizado por uno o más iones de zinc. Un dedo de zinc puede comprender, por ejemplo, Cys2His2, y puede reconocer una secuencia de aproximadamente 3 pb. Se pueden combinar diversos dedos de zinc de especificidad conocida para producir polipéptidos con múltiples dedos que reconocen secuencias de aproximadamente 6, 9, 12, 15 o 18 pb. Se puede disponer de diversas técnicas de selección y ensamblaje modular para generar dedos de zinc (y combinaciones de estos) que reconocen secuencias específicas, incluidos la presentación en fagos, sistemas de único híbrido en levaduras, sistemas de único híbrido y de doble híbrido bacterianos, y células de mamífero.

Como una TALEN, una ZFN debe dimerizar para escindir ADN. Por lo tanto, se necesita un par de ZFN para tener como diana sitios de ADN no palindrómicos. Las dos ZFN individuales deben unirse a hebras opuestas del ADN con sus nucleasas debidamente separadas. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5.

También al igual que una TALEN, una ZFN puede crear una rotura bicatenaria en el ADN, que puede crear una mutación del marco de lectura si se repara de forma incorrecta, lo que conlleva un descenso en la expresión y cantidad de HLA y/o TCR en una célula. Las ZFN también se pueden utilizar con recombinación homóloga para mutar en el gen de HLA o TCR.

Se pueden construir ZFN específicas para secuencias en HLA y/o TCR utilizando cualquier método conocido en la técnica. Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96; Publicación de Patente de EE. UU.

2011/0158957; y Publicación de Patente de EE. UU. 2012/0060230.

Expresión de telomerasa

Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, en algunas realizaciones, un linfocito T terapéutico tiene una persistencia poco prolongada en un paciente, debido a telómeros acortados en el linfocito T; en consecuencia, la transfección con un gen de telomerasa puede alargar los telómeros del linfocito T y mejorar la persistencia del linfocito T en el paciente. Remítase a Carl June, «Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic», Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Por lo tanto, en una realización, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T, expresa de manera ectópica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. En algunos aspectos, esta divulgación proporciona un método para producir una célula que expresa CAR, que comprende poner en contacto una célula con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. La célula se puede poner en contacto con el ácido nucleico antes, a la vez o después de ponerse en contacto con un constructo que codifica un CAR.

En un aspecto, la divulgación presenta un método para generar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos Nk ). En un caso, el método comprende: proporcionar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica un CAR; y poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, hTERT, en condiciones que permiten la expresión de CAR y la telomerasa.

En un caso, el ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa es ADN. En un caso, el ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa comprende un promotor capaz de impulsar la expresión de la subunidad de telomerasa.

En un caso, hTERT tiene la siguiente secuencia de aminoácidos de la Proteína GenBank ID AAC51724.1 (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization» Cell volumen 90, número 4, 22 de agosto de 1997, páginas 785-795):

MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVC

VP WDARPPPAAPSFRQ V S CFKEFVARYFQRFCERGAKNVFAF GF AFFDGARGGPPE AF TT S YRS YFPNT YTD AFRG S G A W GFFFRRY GDD YE YHFFARC AFF YE YAP S CAY Q YCG PPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASR SLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCWSPARPAEEATSLEGAL SGTRHSHPSYGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSS LRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGV LLKTHCPLRAAYTPAAGVCAREKPQGSYAAPEEEDTDPRRLYQLLRQHSSPWQVYGF VRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLR RSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYWELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKS VWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDY WGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLR VRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAWQKAAHGH VRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFM CHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLL VTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCWNLRKTWNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFP WCGLLLDTRTLE V Q SD Y S S Y ART SIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLF G VLRLKCH SLFL DLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSI LKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQL SRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (SEQ ID NO: 606)

En un caso, la hTERT tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o un 99% a la secuencia de la SEQ ID NO: 606. En un caso, hTERT tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 606. En un caso, la hTERT comprende una deleción (por ejemplo, como máximo 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el extremo N, el extremo C o ambos. En un caso, la hTERT comprende una secuencia de aminoácidos transgénica (por ejemplo, de como máximo 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el extremo N, el extremo C o ambos.

En un caso, hTERT está codificada por la secuencia de ácido nucleico de GenBank con el N.° de Acceso AF018167 (Meyerson et al., «hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization» Cell volumen 90, número 4, 22 de agosto de 1997, páginas 785-795):

1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg

3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg

3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc

3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct

3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc

3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc

3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc

3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc

3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt

3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg

3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa

4021 aaaaaaa (SEQ ID NO: 607)

En un caso, la hTERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98% o un 99% a la secuencia de la SEQ ID NO: 607. En un caso, hTERT está codificada por un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 607.

Activación y Expansión de Células

Las células se pueden activar y expandir generalmente utilizando métodos tal como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU.6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7 172869; 7232 566; 7 175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 20060121005.

Por lo general, los linfocitos T de la invención se pueden expandir por contacto con una superficie que tiene unido a ella un agente que estimula una señal asociada con el complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T. En particular, las poblaciones de linfocitos T se pueden estimular tal como se describe en la presente, tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión al antígeno de este, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o por contacto con un activador de proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de linfocitos T se puede poner en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de los linfocitos T. Para estimular la proliferación de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+, se pueden utilizar un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 que se puede utilizar incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besanqon, Francia), al igual que otros métodos de uso común en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

En ciertos aspectos, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para el linfocito T se pueden proporcionar mediante diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada una de las señales pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando están acoplados a una superficie, los agentes se pueden acoplar a la misma superficie (es decir, en formación «cis») o a superficies separadas (es decir, en formación «trans»). Como alternativa, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En un aspecto, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En determinados aspectos, ambos agentes pueden estar en solución. En un aspecto, los agentes pueden estar en forma soluble y después entrecruzarse con una superficie, tal como una célula que expresa receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, remítase, por ejemplo, a las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. u U. N.os 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC, por sus siglas en inglés) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de linfocitos T en la presente invención.

En un aspecto, los dos agentes se inmovilizan sobre perlas, ya sea en la misma perla, es decir, «cis» o en perlas separadas, es decir, «trans». A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno de este y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno de este; y ambos agentes se coinmovilizan en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un aspecto, se utiliza una proporción 1:1 de cada uno de los anticuerpos unidos a las perlas para la expansión de linfocitos T CD4+ y el crecimiento de linfocitos T. En ciertos aspectos de la presente invención, se utiliza una proporción de anticuerpos anti-CD3:CD28 unidos a las perlas tal que se observa un aumento en la expansión de linfocitos T en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En un aspecto particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En un aspecto, la proporción de anticuerpo para CD3:CD28 unido a las perlas varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto de la presente invención, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la proporción de CD3:CD28 es inferior a uno. En ciertos aspectos de la invención, la proporción de anticuerpo anti-CD28 respecto a anticuerpo anti-CD3 unido a las perlas es superior a 2:1. En un aspecto particular, se utiliza una proporción CD3:CD28 de 1:100 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción CD3:CD28 de 1:75 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto adicional, se utiliza una proporción CD3:CD28 de 1:50 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción CD3:CD28 de 1:30 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto preferido, se utiliza una proporción CD3:CD28 de 1:10 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción CD3:CD28 de 1:3 del anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto más, se utiliza una proporción CD3:CD28 de 3:1 del anticuerpo unido a las perlas.

Se pueden utilizar proporciones de partículas respecto a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero entre ellos para estimular linfocitos T u otras células diana. Como los expertos ordinarios en la técnica apreciarán fácilmente, la proporción de partículas respecto a células puede depender del tamaño de partícula con relación a la célula diana. Por ejemplo, las perlas de pequeño tamaño solo se pueden unir a unas pocas células, mientras que las perlas más grandes se pueden a unir muchas. En ciertos aspectos, la proporción de células respecto a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero entre ellos, y en aspectos adicionales, la proporción comprende de 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero entre ellos, que también se pueden utilizar para estimular los linfocitos T. Las proporciones de partículas anti-CD3 y anti-CD28 acopladas respecto a los linfocitos T que da como resultado la estimulación de los linfocitos T puede variar tal como se ha señalado anteriormente, sin embargo ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, y 15:1 siendo una proporción preferida al menos 1:1 partículas por linfocito T. En un aspecto, se utiliza una proporción de partículas respecto a células de 1:1 o inferior. En un aspecto particular, una proporción de partículas:células preferida es 1:5. En aspectos adicionales, la proporción de partículas respecto a células puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en un aspecto, la proporción de partículas respecto a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células cada día o en días alternos a partir de entonces durante hasta 10 días, con proporciones finales de 1:1 a 1:10 (basadas en recuentos de células el día de la adición). En un aspecto particular, la proporción de partículas respecto a células es 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden a diario o en días alternos con una proporción final de 1:1 el primer día y de 1:5 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, la proporción de partículas respecto a células es 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden a diario o en días alternos con una proporción final de 1:1 el primer día y de 1:10 el tercer y quinto días de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que pueden ser adecuadas diversas proporciones diferentes para su uso en la presente invención. En particular, las proporciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y del tamaño y tipo de célula. En un aspecto, las proporciones más típicas para su uso están en las proximidades de 1:1, 2:1 y 3:1 el primer día.

En aspectos adicionales de la presente invención, las células, tales como los linfocitos T, se combinan con perlas recubiertas con agente, las perlas y las células se separan posteriormente, y entonces se cultivan las células. En un aspecto alternativo, antes del cultivo, las perlas recubiertas con agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En un aspecto adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, que da como resultado un incremento del ligamiento de los marcadores de la superficie celular, y con ello se induce la estimulación celular.

A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular se pueden ligar permitiendo que perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y anti-CD28 (perlas 3x28) entren en contacto con los linfocitos T. En un aspecto, las células (por ejemplo, de 104 a 109 linfocitos T) y perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T con una proporción 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo PBS (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). Nuevamente, los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede utilizar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy rara en la muestra y comprender solo un 0,01% de la muestra o toda la muestra (es decir, un 100%) puede comprender la célula diana de interés. En consecuencia, cualquier número de células está dentro del contexto de la presente invención. En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las partículas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de aproximadamente 10000 millones de células/mL, 9000 millones/mL, 8000 millones/mL, 7000 millones/mL, 6000 millones/mL, 5000 millones/mL o 2000 millones de células/mL. En un aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/mL. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/mL. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/mL. En aspectos adicionales, se pueden utilizar concentraciones de 125 o 150 millones de células/mL. El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de concentraciones celulares elevadas permite una captura más eficaz de las células que puedan expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como linfocitos T negativos para CD28. Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en ciertos aspectos. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

En un caso, las células transducidas con un ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente, se expanden, por ejemplo, mediante un método descrito en la presente. En un caso, las células se expanden en cultivo durante un periodo de varias horas (por ejemplo, de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) a aproximadamente 14 días (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días). En un caso, las células se expanden durante un periodo de 4 a 9 días. En un caso, las células se expanden durante un periodo de 8 días o menos, por ejemplo, 7, 6 o 5 días. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD123 descrita en la presente, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes son más potentes que las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. La potencia se puede definir, por ejemplo, mediante diversas funciones de los linfocitos T, por ejemplo, proliferación, muerte de células diana, producción de citocinas, activación, migración o combinaciones de estas. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD123 descrita en la presente, expandidas durante 5 días muestran un incremento de al menos una, dos, tres o cuatro veces en duplicaciones de células tras la estimulación del antígeno, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En un caso, las células, por ejemplo, las células que expresan un CAR CD123 descrito en la presente, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes muestran una producción de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-y y/o GM-CSF, superior en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD123 descrita en la presente, expandidas durante 5 días muestran un incremento de al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, diez veces o más en pg/mL de producción de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-y y/o GM-CSF, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo.

En un aspecto de la presente invención, la mezcla se puede cultivar durante de varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 días o cualquier valor entero por hora entre ellos. En un aspecto, la mezcla se puede cultivar durante 21 días. En un aspecto de la invención, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante aproximadamente ocho días. En un aspecto, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante 2-3 días. También pueden ser deseables varios ciclos de estimulación, de modo que el tiempo de cultivo de los linfocitos T pueda ser de 60 días o más. Las condiciones apropiadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medio Mínimo Esencial o Medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluido suero (por ejemplo, suero humano o bovino fetal), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualesquiera otros aditivos para el crecimiento de células conocidos por el experto. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, sin carácter limitante, un tensioactivo, Plasmanate y agentes reductores, tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, Dm Em , MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o con un suplemento de una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de linfocitos T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir a un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para propiciar el crecimiento, por ejemplo una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (por ejemplo, aire más un 5% de CO2) apropiadas.

En una realización, las células se expanden en un medio apropiado (por ejemplo, medio descrito en la presente) que incluye una o más interleucinas lo que da como resultado un incremento de al menos 200 veces (por ejemplo, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces) de células a lo largo de un periodo de expansión de 14 días, por ejemplo, según se mide mediante un método descrito en la presente tal como citometría de flujo. En una realización, las células se expanden en presencia de IL-15 y/o IL-7 (por ejemplo, IL-15 e IL-7).

En algunos casos, los métodos descritos en la presente, por ejemplo, métodos de producción de células que expresan CAR, comprenden eliminar linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, de una población celular, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento de este, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En la presente se describen métodos para eliminar linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, de una población de células. En algunos casos, los métodos, por ejemplo, métodos de producción, comprenden además poner en contacto una población de células (por ejemplo, una población de células en las que se han disminuido los linfocitos T reguladores, tales como linfocitos T CD25+; o una población de células que se ha puesto en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, o ligando de unión a CD24) con IL-15 y/o IL-7. Por ejemplo, la población de células (por ejemplo, que se ha puesto en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, fragmento de este o ligando de unión a CD25) se expande en presencia de IL-15 y/o IL-7.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo interleucina-15 (IL-15), un polipéptido de tipo receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación de ambos, un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15, durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende una combinación de un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15 Ra durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo.

En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la expansión ex vivo. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 durante la expansión ex vivo. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo ⁱL-15Ra durante la expansión ex vivo. En un caso, la puesta en contacto da como resultado la supervivencia y proliferación de una subpoblación de linfocitos, por ejemplo, linfocitos T CD8+.

Los linfocitos T que han sido expuestos a tiempos de estimulación variados pueden exhibir características diferentes. Por ejemplo, productos de tipo células mononucleares de la sangre o de la sangre periférica sometida a aféresis típicos tienen una población de linfocitos T auxiliares (TH, CD4+) que es mayor que la población de linfocitos T citotóxicos o supresores (TC, CD8+). La expansión ex vivo de linfocitos T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de linfocitos T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en células TH, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de linfocitos T comprende una población cada vez mayor de linfocitos TC. Por consiguiente, dependiendo del propósito del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto una población de linfocitos T que comprende predominantemente linfocitos TH. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto de linfocitos TC específicos para el antígeno, puede ser beneficioso expandir este subconjunto hasta un grado mayor.

Además, aparte de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de forma reproducible durante el curso del proceso de expansión celular. Por lo tanto, dicha reproducibilidad permite la capacidad de adaptar un producto de tipo linfocitos T activados para fines específicos.

Una vez que se construye un CAR CD123, se pueden utilizar diversos ensayos para evaluar la actividad de la molécula, tales como, sin carácter limitante, la capacidad de expandir las células T después de la estimulación con antígeno, mantener la expansión de linfocitos T en ausencia de reestimulación y actividades anticancerosas en modelos in vitro y en animales apropiados. Los ensayos para evaluar los efectos de un CAR CD123 se describen con más detalle más adelante.

Se puede utilizar el análisis por inmunoelectrotransferencia de la expresión de CAR en linfocitos T primarios para detectar la presencia de monómeros y dímeros. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, los linfocitos T (mezcla 1:1 de linfocitos T CD4+ y CD8+) que expresan los CAR se expanden in vitro durante más de 10 días, seguido de lisis y SDS-PAGE en condiciones reductoras. Los CAR que contienen el dominio citoplasmático TCR-Z completo y la cadena TCR-Z endógena se detectan mediante inmunoelectrotransferencia utilizando un anticuerpo para la cadena TCR-Z. Los mismos subconjuntos de linfocitos T se utilizan para el análisis SDS-PAGE en condiciones no reductoras para permitir la evaluación de la formación de dímeros covalentes.

La expansión in vitro de linfocitos T CAR+ después de la estimulación con antígeno se puede medir mediante citometría de flujo. Por ejemplo, se estimula una mezcla de linfocitos T CD4+ y CD8+ con aAPC aCD3/aCD28, seguido de transducción con vectores lentivíricos que expresan GFP bajo el control de los promotores que se van a analizar. Los promotores a modo de ejemplo incluyen promotores del gen IE de CMV, EF-1a, ubiquitina C o de la fosfoglicerocinasa (PGK). La fluorescencia de GFP se evalúa el día 6 de cultivo en los subconjuntos de linfocitos T CD4+ y/o CD8+ mediante citometría de flujo. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Como alternativa, una mezcla de linfocitos T CD4+ y CD8+ se estimula con perlas magnéticas recubiertas con aCD3/aCD28 el día 0, y se transduce con CAR el día 1 utilizando un vector lentivírico bicistrónico que expresa CAR junto con eGFP utilizando una secuencia de omisión ribosómica 2A. Los cultivos se reestimulan con células K562 CD19+ (K562-CD19), células K562 de tipo natural (K562 de tipo natural) o células K562 que expresan hCD32 y 4-1BBL en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (K562-BBL-3/28) después del lavado. Se añaden 100 U/mL de IL-2 exógena a los cultivos en días alternos. Los linfocitos T GFP+ se enumeran por citometría de flujo utilizando un recuento basado en las perlas. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Se pueden realizar ensayos similares utilizando linfocitos T anti-CD123 (remítase, por ejemplo, a Gill et al. Blood 2014;123:2343) o con linfocitos T CAR anti-CD123.

También se puede medir la expansión sostenida de linfocitos T CAR+ en ausencia de reestimulación. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, el volumen medio de linfocitos T (fl) se mide el día 8 de cultivo utilizando un contador de partículas Multisizer III de Coulter, un Cellometer Vision de Nexcelom o Scepter de Millipore, después de la estimulación con perlas magnéticas recubiertas con aCD3/aCD28 el día 0, y la transducción con el CAR indicado el día 1.

También se pueden utilizar modelos en animales para medir la actividad de un CART. Por ejemplo, se puede utilizar un modelo de xenoinjerto utilizando linfocitos T CAR+ específicos para CD19 para tratar una pre-B ALL humana primaria en ratones inmunodeficientes. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, después del establecimiento de ALL, los ratones se distribuyen aleatoriamente en grupos de tratamiento. Se coinyectan diferentes números de linfocitos T modificados aCD19-Z y aCD19-BB-Z con una proporción 1:1 en ratones NOD-SCID-y-/" portadores de B-ALL. El número de copias del vector aCD19-Z y aCD19-BB-Z en a Dn del bazo de ratones se evalúa en diversos momentos tras la inyección con linfocitos T. Se evalúa la leucemia en los animales con intervalos semanales. Se miden los recuentos de blastos B-ALL CD19+ de la sangre periférica en ratones a los que se inyectan linfocitos T CAR+ aCD19-Z o linfocitos T con una transducción simulada. Las curvas de supervivencia de los grupos se comparan utilizando la prueba del orden logarítmico. Además, también se pueden analizar los recuentos de linfocitos T CD4+ y CD8+ de la sangre periférica 4 semanas después de la inyección de linfocitos T en ratones NOD-SCID-y-/'. Se inyectan a los ratones células leucémicas y 3 semanas más tarde se les inyectan linfocitos T modificados para expresar c A r mediante un vector lentivírico bicistrónico que codifica el CAR ligado a eGFP. Los linfocitos T se normalizan respecto a un 45-50% de linfocitos T GFP+ de entrada mezclando células que han experimentado una transducción simulada antes de la inyección, y se confirma mediante citometría de flujo. Se evalúa la leucemia en los animales con intervalos de 1 semana. Las curvas de supervivencia de los grupos de linfocitos T CAR+ se comparan utilizando la prueba del orden logarítmico. Se pueden realizar experimentos similares con CART CD123.

Se puede evaluar la respuesta al tratamiento con CAR dependiente de la dosis. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Por ejemplo, se obtiene sangre periférica 35-70 días después de establecer la leucemia en ratones inyectados el día 21 con linfocitos T CAR, un número equivalente de linfocitos T sometidos a una transducción simulada, o ausencia de linfocitos T. Se obtuvo sangre de manera aleatoria de ratones de cada grupo para determinar los recuentos de blastos ALL CD19+ en la sangre periférica y posteriormente se sacrificaron en los días 35 y 49. Los animales restantes se evaluaron en los días 57 y 70. Se pueden realizar experimentos similares con CART CD123.

La evaluación de la proliferación celular y la producción de citocinas se ha descrito previamente, por ejemplo, en Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, la evaluación de la proliferación mediada por CAR se realiza en placas de microtitulación mezclando linfocitos T lavados con células K562 que expresan CD19 (K19) o CD32 y CD137 (KT32-BBL) para obtener una proporción final de linfocito T:K562 de 2:1. Las células K562 se irradian con radiación gamma antes de su uso. Se añaden anticuerpos monoclonales anti-CD3 (clon OKT3) y anti-CD28 (clon 9.3) a cultivos con células KT32-BBL para actúen de control positivo para estimular la proliferación de linfocitos T, ya que estas señales propician la expansión a largo plazo de linfocitos T CD8+ ex vivo. Se enumeran los linfocitso T en cultivos utilizando perlas fluorescentes CountBright™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) y citometría de flujo como lo describe el fabricante. Los linfocitos T CAR+ se identifican mediante la expresión de GFP utilizando linfocitos T que han sido modificados con vectores lentivíricos que expresan CAR ligado a eGFP-2A. Para los linfocitos T CAR+ que no expresan GFP, los linfocitos T CAR+ se detectan con proteína CD123 recombinante biotinilada y un conjugado secundario de avidina-PE. La expresión de CD4+ y CD8+ en linfocitos T también se detecta simultáneamente con anticuerpos monoclonales específicos (BD Biosciences). Las medidas de citocinas se realizan en sobrenadantes recogidos 24 horas después de la reestimulación utilizando el kit de matriz de perlas citométrico para citocinas de TH1/TH2 humanas (BD Biosciences, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o utilizando un kit Luminex 30-plex (Invitrogen). La fluorescencia se evalúa utilizando un citómetro de flujo BD Fortessa, y los datos se analizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se pueden realizar experimentos similares con CART CD123.

La citotoxicidad se puede evaluar mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, las células diana (líneas K562 y células de pro-B-ALL primaria) se cargan con 51Cr (como NaCrO4, New England Nuclear, Boston, MA) a 37 °C durante 2 horas con agitación frecuente, se lavan dos veces en RPMI completo y se colocan en placas de microtitulación. Los linfocitos T efectores se mezclan con las células diana en los pocillos en RPMI completo con proporciones variables de célula efectora:célula diana (E:T). También se preparan pocillos adicionales que contienen solo medio (liberación espontánea, SR, por sus siglas en inglés) o una solución al 1% de detergente triton-X 100 (liberación total, TR, por sus siglas en inglés). Después de 4 horas de incubación a 37 °C, se recolecta el sobrenadante de cada uno de los pocillos. El 51Cr liberado se mide a continuación utilizando un contador de partículas gamma (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Cada condición se realiza al menos por triplicado, y el porcentaje de lisis se calcula utilizando la fórmula: % de lisis = (ER-SR) / (TR - SR), donde ER representa el 51 Cr medio liberado para cada condición experimental.

Se pueden utilizar tecnologías de obtención de imágenes para evaluar el tráfico y proliferación específicos de los CAR en modelos en animales portadores de tumores. Tales ensayos se han descrito, por ejemplo, en Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). Resumiendo, los ratones N^oD/SCID/^yc'^a(NSG) son inyectados IV con células Nalm-6 y 7 días después con linfocitos T 4 horas después de electroporación con los constructos CAR. Los linfocitos T están transfectados de manera estable con un constructo lentivírico para expresar luciferasa de luciérnaga, y se obtienen imágenes de los ratones por bioluminiscencia. Como alternativa, se pueden medir la eficacia terapéutica y especificidad de una única inyección de linfocitos T CAR+ en un modelo de xenoinjerto con Nalm-6 de la siguiente manera: Se inyectan ratones NSG con Nalm-6 transducidas para expresar de manera estable luciferasa de luciérnaga, seguido por una única inyección en la vena de la cola de linfocitos T electroporados con CAR CD1237 días más tarde. Se obtienen imágenes de los animales en diversos puntos temporales después de la inyección. Por ejemplo, se pueden generar mapas cromáticos de densidad fotónica de leucemia positiva para luciferasa de luciérnaga en ratones representativos el día 5 (2 días antes del tratamiento) y el día 8 (24 h después de PBL CAR+)

También se pueden utilizar otros ensayos, incluidos los descritos en la sección de Ejemplos de la presente, así como los que se conocen en la técnica, para evaluar los constructos CAR CD123 de la invención.

Como alternativa, o en combinación con los métodos divulgados en la presente, se divulgan métodos y composiciones para uno o más de: detección y/o cuantificación de células que expresan CAR (por ejemplo, in vitro o in vivo (por ejemplo, monitorización clínica)); expansión y/o activación de células inmunitarias; y/o selección específica de CAR que conlleva el uso de un ligando de CAR. En un caso a modo de ejemplo, el ligando de CAR es un anticuerpo que se une a la molécula CAR, por ejemplo, se une al dominio de unión al antígeno extracelular de CAR (por ejemplo, un anticuerpo que se une al dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un anticuerpo antidiotípico; o un anticuerpo que se une a una región constante del dominio de unión extracelular). En otros casos, el ligando de CAR es una molécula para el antígeno CAR (por ejemplo, una molécula para el antígeno CAR como se describe en la presente).

En un aspecto, se divulga un método para detectar y/o cuantificar células que expresan CAR. Por ejemplo, se puede utilizar el ligando CAR para detectar y/o cuantificar células que expresan CAR in vitro o in vivo (por ejemplo, monitorización clínica de células que expresan CAR en un paciente, o dosificación a un paciente). El método incluye:

proporcionar el ligando de CAR (opcionalmente, un ligando de CAR marcado, por ejemplo, un ligando de CAR que incluye una etiqueta, una perla, una marca radioactiva o fluorescente);

adquirir la célula que expresa CAR (por ejemplo, adquirir una muestra que contiene células que expresan CAR, tal como una muestra de producción o una muestra clínica);

poner en contacto la célula que expresa CAR con el ligando de CAR en condiciones donde tiene lugar la unión, y detectar de esta manera el nivel (por ejemplo, cantidad) de las células que expresan CAR presentes. La unión de la célula que expresa CAR con el ligando de CAR se puede detectar utilizando técnicas estándar tales como FACS, ELISA y similares.

En otro aspecto, se divulga un método para expandir y/o activar células (por ejemplo, células efectoras inmunitarias). El método incluye:

proporcionar una célula que expresa CAR (por ejemplo, una primera célula que expresa CAR o una célula que expresa CAR de manera transitoria);

poner en contacto dicha célula que expresa CAR con un ligando de CAR, por ejemplo, un ligando de CAR tal como se describe en la presente), en condiciones en las que tiene lugar la expansión y/o proliferación de células inmunitarias, y producir de esta manera la población de células activadas y/o expandidas.

En ciertos casos, el ligando de CAR está presente en (por ejemplo, está inmovilizado o unido a un sustrato, por ejemplo, un sustrato que no tiene origen natural). En algunos casos, el sustrato es un sustrato no celular. El sustrato no celular puede ser un soporte sólido elegido entre, por ejemplo, una placa (por ejemplo, una placa de microtitulación), una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa), una matriz, un chip o una perla. En algunos casos, el ligando de CAR está presente en el sustrato (por ejemplo, en la superficie del sustrato). El ligando de CAR se puede inmovilizar, unir o asociar covalente o no covalentemente (por ejemplo, entrecruzar) al sustrato. En un caso, el ligando de CAR se une (por ejemplo, se une covalentemente) a una perla. En los casos mencionados anteriormente, la población de células inmunitarias se puede expandir in vitro o ex vivo. El método puede incluir además cultivar la población de células inmunitarias en presencia del ligando de la molécula CAR, por ejemplo, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente.

En otros casos, el método para expandir y/o activar las células comprende además la adición de una segunda molécula estimuladora, por ejemplo, CD28. Por ejemplo, el ligando de CAR y la segunda molécula estimuladora se pueden inmovilizar en un sustrato, por ejemplo, una o más perlas, y proporcionar de esta manera un incremento de la expansión y/o activación celulares.

En otro aspecto más, se proporciona un método para seleccionar una célula que expresa CAR o para enriquecer en esta. El método incluye poner en contacto la célula que expresa CAR con un ligando de c Ar tal como se describe en la presente; y seleccionar la célula en función de la unión del ligando de CAR.

En otros aspectos más, se proporciona un método para disminuir, reducir y/o provocar la muerte de una célula que expresa CAR. El método incluye poner en contacto la célula que expresa CAR con un ligando de CAR tal como se describe en la presente; y actuar sobre la célula en función de la unión del ligando de CAR, y reducir de esta manera el número, y/o provocar la muerte, de la célula que expresa CAR. En un caso, el ligando de CAR se acopla a un agente tóxico (por ejemplo, una toxina o un fármaco citoablativo). En otro caso, el anticuerpo antidiotípico puede provocar la actividad de células efectoras, por ejemplo, actividad ADCC o ADC.

Los anticuerpos anti-CAR a modo de ejemplo que se pueden utilizar en los métodos divulgados en la presente se describen, por ejemplo, en el documento WO 2014/190273 y en Jena et al., «Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials», PLOS marzo de 2013 8:3 e57838. En una realización, la molécula de anticuerpo antidiotípico reconoce una molécula de anticuerpo anti-CD19, por ejemplo, un scFv anti-CD19. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo antidiotípico puede competir por la unión con el clon n.° 136.20.1 de mAB contra CAR específico para CD19 descrito en Jena et al., PLOS marzo 2013 8:3 e57838; puede tener las mismas CDR (por ejemplo, una o más de, por ejemplo, la totalidad de, CDR1 de VH, CDR2 de VH, Cd R3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de Vl y CDR3 de VL, utilizando la definición de Kabat, la definición de Chothia, o una combinación de las definiciones de Kabat y Chothia) que el clon n.° 136.20.1 del mAb contra CAR específico de CD19; puede tener una o más (por ejemplo, 2) regiones variables que el clon n.° 136.20.1 del mAb contra CAR específico para CD19, o puede comprender el clon n.° 136.20.1 del mAb contra CAR específico para CD19. En algunas realizaciones, se generó el anticuerpo antidiotípico de acuerdo con un método descrito en Jena et al. En otra realización, la molécula de anticuerpo antidiotípico es una molécula de anticuerpo antiditípico descrita en el documento WO 2014/190273. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo antidiotípico tiene las mismas CDR (por ejemplo, una o más, por ejemplo, la totalidad, de CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL) que una molécula de anticuerpo del documento WO 2014/190273 tal como 136.20.1; puede tener una o más (por ejemplo, 2) regiones variables de una molécula de anticuerpo del documento WO 2014/190273, o puede comprender una molécula de anticuerpo del documento WO 2014/190273 tal como 136.20.1. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CAR se une a una región constante del dominio de unión extracelular de la molécula CAR, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 2014/190273. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CAR se une a la región constante del dominio de unión extracelular de la molécula CAR, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, una región de bisagra CH2-CH3) o la región constante de la cadena ligera. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti CAR compite por la unión con el anticuerpo monoclonal 2D3 descrito en el documento WO 2014/190273, tiene las mismas CDR (por ejemplo, una o más, por ejemplo, la totalidad, de CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de CH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL) que 2D3, o tiene una o más (por ejemplo, 2) regiones variables de 2D3, o comprende 2D3 tal como se describe en el documento WO 2014/190273.

En algunos aspectos y realizaciones, las composiciones y métodos de la presente se optimizan para un subconjunto específico de linfocitos T, por ejemplo, tal como se describe en el documento de EE. UU. con N.° de serie 62/031 699, presentado el 31 de julio de 2014. En algunas realizaciones, los subconjuntos optimizados de linfocitos T muestran una persistencia mejorada en comparación con un linfocito T de control, por ejemplo, un linfocito T de un tipo diferente (por ejemplo, CD8+ o CD4+) que expresa el mismo constructo.

En algunos casos, un linfocito T CD4+ comprende un CAR descrito en la presente, donde el CAR comprende un dominio de señalización intracelular adecuado para (por ejemplo, optimizado para, por ejemplo, que da lugar a una persistencia mejorada en) un linfocito T CD4+, por ejemplo, un dominio de ICOS. En algunos casos, un linfocito T CD8+ comprende un CAR descrito en la presente, donde el CAR comprende un dominio de señalización intracelular adecuado para (por ejemplo, optimizado para, por ejemplo, que da lugar a una persistencia mejorada de) un linfocito T CD8+, por ejemplo, un dominio de 4-1BB, un dominio de CD28, u otro dominio coestimulador que no sea un dominio de ICOS. En algunos casos, el CAR descrito en la presente comprende un dominio de unión al antígeno descrito en la presente, por ejemplo, un CAR que comprende un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a CD123, por ejemplo, un CAR de la Tabla 2 o la Tabla 6.

En un aspecto, se describe en la presente un método para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que padece cáncer. El método incluye administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de:

1) un linfocito T CD4+ que comprende un CAR (el CARCD4+)

que comprende:

un dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a CD123, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno de la Tabla 2, Tabla 6 o Tabla 9;

un dominio transmembrana; y

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un primer dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio de ICOS; y

2) un linfocito T CD8+ que comprende un CAR (el CARCD8+) que comprende:

un dominio transmembrana; y

un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un segundo dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio de 4-1BB, un dominio de CD28, u otro dominio coestimulador que no es un dominio de ICOS;

donde el CARCD4+ y el CARCD8+ difieren el uno del otro.

Opcionalmente, el método incluye además administrar:

3) un segundo linfocito T CD8+ que comprende un CAR (el segundo CARCD8+) que comprende:

un dominio transmembrana; y

un dominio de señalización intracelular, donde el segundo CARCD8+ comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador, no presente en el CARCD8+ y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización de ICOS.

Aplicación terapéutica

Enfermedades y/o trastornos asociados con CD123

La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de CD123 o una afección asociada con células que expresan CD123 incluidos, por ejemplo, una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o neoplasia maligna o una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con células que expresan CD123. En un aspecto, el cáncer asociado con la expresión de CD123 es un cáncer hematológico. En un aspecto, un cáncer hematológico incluye, sin carácter limitante, AML, síndrome mielodisplásico, ALL, leucemia mieloide crónica, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, neoplasias mieloproliferativas, linfoma de Hodgkin y similares. Más enfermedades asociadas con la expresión de expresión de CD123 incluyen, sin carácter limitante, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias malignas, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas asociadas con la expresión de CD123. También se pueden incluir las indicaciones no relacionadas con el cáncer asociadas con la expresión de CD123.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de CD123. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad donde parte del tumor es negativo para CD123 y parte del tumor es positivo para CD123. Por ejemplo, el CAR de la invención es útil para tratar sujetos que han recibido tratamiento para una enfermedad asociada con la expresión elevada de CD123, donde el sujeto que ha recibido tratamiento para los niveles elevados de CD123 presenta una enfermedad asociada con niveles elevados de CD123. En algunos casos, el CAR de la invención es útil para tratar sujetos que han recibido tratamiento para una enfermedad asociada con la expresión de CD123, donde el sujeto que ha recibido tratamiento relacionado con la expresión de CD123 presenta una enfermedad asociada con la expresión de CD123.

En un aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende CAR CD123 ligado operablemente a un promotor para la expresión en células efectoras inmunitarias de mamífero, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK. En un aspecto, la invención proporciona un linfocito T recombinante que expresa el CAR CD123 para su uso en el tratamiento de tumores que expresan CD123, donde las células efectoras inmunitarias recombinantes, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que expresan el CAR CD123 se denominan célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD123 o CART CD123). En un aspecto, el CART CD123 de la invención es capaz de poner en contacto una célula tumoral con al menos un CAR CD123 de la invención expresado en su superficie de tal manera que la célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD123 o CART CD123) tiene como diana la célula tumoral y se inhibe el crecimiento del tumor.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para inhibir el crecimiento de una célula tumoral que expresa CD123, que comprende poner en contacto la célula tumoral con una célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR c D123 o CART CD123) de la presente invención de modo que la célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD123 o CART CD123) se activa en respuesta al antígeno y tiene como diana la célula cancerosa, donde se inhibe el crecimiento del tumor.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar cáncer en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto una célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD123 o CART CD123) de la presente invención de modo que se trata el cáncer en el sujeto. Un ejemplo de un cáncer que se puede tratar con la célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito NK que expresa Ca R CD123 o CART CD123) de la invención es un cáncer asociado con la expresión de CD123. Un ejemplo de un cáncer que se puede tratar mediante la célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito que expresa CAR CD123 o CART CD123) de la invención incluye, sin carácter limitante, AML, linfoma de Hodgkin, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide crónica y otras neoplasias mieloproliferativas, o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, y similares.

La invención incluye un tipo de terapia celular donde las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, están modificadas genéticamente para expresar un receptor antigénico quimérico (CAR) y la célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito NK que expresa CAR CD123 o CART CD123) se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de provocar la muerte de células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR, por ejemplo, los linfocitos T modificados con CAR o linfocitos NK modificados con CAR) son capaces de replicarse in vivo lo que da como resultado una persistencia a largo plazo que puede conllevar un control tumoral sostenido. En diversos aspectos, las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que se administran al paciente, o su progenie, persisten en el paciente durante al menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, trece meses, catorce meses, quince meses, dieciséis meses, diecisiete meses, dieciocho meses, diecinueve meses, veinte meses, veintiún meses, veintidós meses, veintitrés meses, dos años, tres años, cuatro años o cinco años después de la administración de la célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK, al paciente.

La invención también incluye un tipo de terapia celular donde las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, están modificadas, por ejemplo, mediante ARN transcrito in vitro, para expresar de manera transitoria un receptor antigénico quimérico (CAR) y la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART o linfocito NK CAR) se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de provocar la muerte de células tumorales en el receptor. Por lo tanto, en diversos aspectos, las células efectoras inmnunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, administradas al paciente, están presentes durante menos de un mes, por ejemplo, tres semanas, dos semanas, una semana, después de la administración de la célula efectora inmunitaria, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK, al paciente.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, la respuesta de inmunidad antitumoral provocada por las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva, o como alternativa puede ser debida a una respuesta inmunitaria directa vs indirecta. En un aspecto, las células efectoras inmunitarias transducidas con CAR, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, muestran una secreción de citocinas proinflamatorias específicas y una actividad citolítica potente en respuesta a células cancerosas humanas que expresan CD123, resisten la inhibición de CD123 soluble, median en la muerte de células cercanas (bystander killing) y median en la regresión de un tumor humano establecido. Por ejemplo, las células tumorales sin antígeno dentro de un campo heterogéneo de tumor que expresa CD123 pueden ser susceptibles de destrucción indirecta por parte de la célula efectora inmunitaria redirigida a CD123, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que ha reaccionado previamente contra células cancerosas positivas para el antígeno adyacentes.

En un aspecto, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR totalmente humanas (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la invención pueden ser un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un ser humano.

Con respecto a la inmunización ex vivo, al menos uno de lo siguiente ocurre in vitro antes de administrar la célula, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK, a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR en las células o iii) crioconservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son muy conocidos en la técnica y se analizan en más detalle más adelante. En síntesis, las células se aíslan de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) y se modifican genéticamente (por ejemplo, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR divulgado en la presente. La célula modificada con CAR se puede administrar a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un ser humano y la célula modificada con CAR puede ser autóloga con respecto al receptor. Como alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

El procedimiento para la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas y células progenitoras se describe en la Pat. de EE. UU. N.° 5199942, se puede aplicar a las células de la presente invención. En la técnica existe constancia de otros métodos adecuados, por lo tanto, la presente invención no se limita a ningún método particular de expansión ex vivo de las células. En síntesis, el cultivo y la expansión ex vivo de linfocitos T comprende: (1) recoger células progenitoras y células madre hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de la recolección de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir tales células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la Pat. de EE. UU. N.° 5199942, se pueden utilizar otros factores, tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y la expansión de las células.

Además de utilizar una vacuna basada en células en lo que se refiere a la inmunización ex vivo, la presente divulgación también proporciona composiciones y métodos para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.

Por lo general, las células activadas y expandidas tal como se describe en la presente se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la invención se utilizan en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD123. En ciertos aspectos, las células de la invención se utilizan en el tratamiento de pacientes en riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD123. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD123, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK) de la invención.

En un aspecto, las células que expresan CAR (linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de las invenciones se pueden utilizar para tratar una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o neoplasia maligna o es una afección precancerosa tal como mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD123 es una preleucemia cancerosa hematológica, un trastorno hiperproliferativo, una hiperplasia o una displasia, que se caracteriza por un crecimiento anómalo de las células.

En un aspecto, las células que expresan CAR (linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la invención se utilizan para tratar un cáncer, donde el cáncer es un cáncer hematológico. Las afecciones de tipo cáncer hematológico son los tipos de cáncer tales como leucemia y afecciones linfoproliferativas malignas que afectan a la sangre, médula ósea y el sistema linfático.

En un aspecto, las composiciones y células que expresan CAR (linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la presente invención son particularmente útiles para tratar leucemias mieloides, AML y sus subtipos, leucemia mieloide crónica (CML), síndrome mielodisplásico (MDS), neoplasias mieloproliferativas (MPN), trastornos histiocíticos y trastornos de mastocitos.

La leucemia se puede clasificar como leucemia aguda y leucemia crónica. La leucemia aguda se puede clasificar además como leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia linfoide aguda (ALL). La leucemia crónica incluye leucemia mielógena crónica (CML) y leucemia linfoide crónica (CLL). Otras afecciones relacionadas incluyen síndromes mielodisplásicos (MDS, conocidos previamente como «preleucemia») que son una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides y riesgo de transformación en AML.

El linfoma es un grupo de tumores de células de la sangre que se desarrollan a partir de linfocitos. Los linfomas a modo de ejemplo incluyen el linfoma no hodgkiniano y el linfoma de Hodgkin.

En AML, la transformación maligna y la proliferación descontrolada de una célula progenitora mieloide de larga vida, diferenciada de manera anómala da como resultado números circulantes elevados de formas sanguíneas inmaduras y el reemplazo de médula ósea normal por células malignas. Los síntomas incluyen fatiga, palidez, facilidad para que aprezcan hematomas y de sufrir hemorragias, fiebre e infección; los síntomas de inflitración leucémica están presentes en tan solo aproximadamente un 5% de los pacientes (a menudo como manifestaciones de la piel). El examen de un frotis de la sangre periférica y de la médula ósea es una prueba diagnóstica. El tratamiento existente incluye quimioterapia de inducción para lograr remisión y quimioterapia después de la remisión (con o sin trasplante de células madre) para evitar recaídas.

AML tiene varios subtipos que se distinguen entre sí por la morfología, inmunofenotipo y citoquímica. Se describen cinco clases, en función del tipo celular predominante, incluida la mieloide, mieloide-monocítca, monocítica, eritroide y megacariocítica.

Las tasas de inducción de la remisión varían entre un 50 y un 85%. La supervivencia sin enfermedad a largo plazo ocurre supuestamente entre un 20 y un 40% de lo pacientes y aumenta hasta entre un 40 y un 50% en los pacientes más jóvenes tratados con un trasplante de células madre.

Ciertos factores pronósticos ayudan a determinar la intensidad y protocolo del tratamiento; los pacientes con características diagnósticas muy negativas reciben normalmente las formas más intensas de terapia, debido a que se cree que los posibles beneficios justifican la mayor toxicidad del tratamiento. El factor pronóstico más importante es el cariotipo celular de la leucemia; los cariotipos favorables incluyen t(15;17), t(8;21), e inv16 (p13;q22). Los factores negativos incluyen el aumento de edad, una fase mielodisplásica precedente, leucemia secundaria, recuento de WBC elevado y ausencia de cuerpos de Auer.

La terapia inicial intenta inducir la remisión y difiere en mayor grado de la ALL en que la AML responde a menos fármacos. La pauta básica de inducción incluye citarabina mediante infusión IV continua o dosis elevadas durante de 5 a 7 días; se administra IV daunorubicina o iadurbicina durante 3 días durante este tiempo. Algunas pautas incluyen 6-tioguanina, etopósido, vincristina y prednisona, pero su contribución no está clara. El tratamiento normalmente da como resultado una mielosupresión significativa, con infección o hemorragia; hay una latencia significativa antes de la recuperación de la médula ósea. Durante este tiempo, es vital un cuidado preventivo y asistencial meticuloso.

La leucemia mielógena (o mieloide) crónica (CML) también se conoce como leucemia granulocítica crónica, y está caracterizada como un cáncer de los glóbulos blancos sanguíneos. Las pautas de tratamiento habituales para CML incluyen inhibidores de la tirosina-cinasa Bcr-Alb, imatinib (Gleevec®), dasatinib y nilotinib. Los inhibidores de la tirosinacinasa Bcr-Abl son específicamente útiles para pacientes de CML con la translocación del cromosoma de Filadelfia.

Los síndromes mielodisplásicos (MDS) son afecciones médicas hematológicas caracterizadas por una hematopoyesis, o producción de sangre, desordenada e ineficaz. Por lo tanto, el número y calidad de las células formadoras de sangre declinan de manera irreversible. Algunos pacientes con MDS pueden desarrollar anemia grave, mientras que otros están asintomáticos. En la ténica se conoce el esquema de clasificación para MDS, con criterios que designan la proporción o frecuencia de los tipos particulares de células sanguíneas, por ejemplo, mieloblastos, monocitos y precursores de globulos rojos. MDS incluye anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos anulares, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación, leucemia mielomonocítica crónica (CML).

Los tratamientos para los MDS varían según la gravedad de los síntomas. Las formas agresivas de tratamiento para los pacientes que experimentan síntomas graves incluyen trasplantes de médula ósea y cuidados asistenciales con ayuda en forma de productos sanguíneos (por ejemplo, transfusiones de sangre) y factores de crecimento hematopoyético (por ejemplo, eritropoyetina). Se utilizan otros agentes frecuentemente para tratar MDS: 5-azacitidina, decitabina y lenalidomida. En algunos casos también se pueden administrar los quelantes de hierro deferoxamina (Desferal®) y deferasirox (Exjade®).

En otra realización, las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la invención se utilizan para tratar un cánceres o leucemias con células madre leucémicas. Por ejemplo, las células madre leucémicas son células leucémicas CD34+/CD38-.

La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para tratar el cáncer. En un aspecto, el cáncer es un cáncer hematológico que incluye, sin cáracter limitante, leucemia (tal como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica y síndrome mielodisplásico) y afecciones linfoproliferativas malignas, que incluyen el linfoma (tal como mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt y linfoma folicular microcítico y macrocítico).

En un aspecto, las células que expresan CAR (por ejemplo, linfocitos CART o linfocitos NK que expresan CAR) de la invención se pueden utilizar para tratar otros cánceres y neoplasias malignas tales como, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemias agudas que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemia linfoide agua de linfocitos B («B-ALL»), leucemia linfoide aguda de linfocitos T («T-ALL»), leucemia linfoide aguda (ALL); una o más leucemias crónicas que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, tricoleucemia, linfoma folicular microcítico o macrocítico, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zonas marginales, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom y «preleucemia» que es una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por una producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides, y similares. Las células inmunitarias modificadas con CAR, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, de la presente invención se pueden administrar solas o como una composición farmacéutica comibnadas con diluyentes y/u otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares.

La presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir una población de células que expresan CD123, comprendiendo los métodos poner en contacto una población de células que comprenden una célula que expresa CD123 con una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito n K que expresa CAR CD123) de la invención que se une a la célula que expresa CD123. En un aspecto específico, la presente divulgación proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CD123, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CD123 con una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) de la invención que se une a la célula que expresa CD123. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CD123, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CD123 con una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) de la invención que se une a la célula que expresa CD123. En ciertos aspectos, la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) de la invención reduce la cifra, número, cantidad o porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 65%, al menos un 75%, al menos un 85%, al menos un 95% o al menos un 99% en un sujeto con o modelo en animales de leucemia mieloide u otro cáncer asociado con células que expresan CD123 respecto a un control negativo. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada con células que expresan CD123 (por ejemplo, un cáncer hematológico o cáncer atípico que expresa CD123), comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) de la invención que se une a la célula que expresa CD123. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de trastornos asociados con células que expresan CD123 incluyen trastornos autoinmunitarios (tales como lupus), trastornos inflamatorios (tales como alergias y asma) y cánceres (tales como cánceres hematológicos o cánceres atípicos que expresan CD123).

La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada con células que expresan CD123, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) de la invención que se une a la célula que expresa CD123. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

La presente divulgación proporciona métodos para prevenir la recaída de un cáncer asociado con células que expresan CD123, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) de la invención que se une a la célula que expresa CD123. En un aspecto, los métodos comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) descrito en la presente que se une a la célula que expresa CD123 combinada con una cantidad eficaz de otra terapia.

Ablación de médula ósea

En un aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones y métodos para la ablación de médula ósea. Por ejemplo, en un aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones y métodos para erradicar al menos una porción de la médula ósea existente en un sujeto. Se ha descrito en la presente que, en ciertos casos, los linfocitos CART123 que comprenden un CAR CD123 de la presente invención erradican células progenitoras mieloides de médula ósea positivas para CD123.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método de ablación de médula ósea que comprende administrar una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa c Ar CD123) de la invención a un sujeto que necesita ablación de médula ósea. Por ejemplo, el método de la presente se puede utilizar para erradicar parte o la totalidad de la médula ósea de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno en el que el trasplante de médula ósea o reacondicionamiento de médula ósea es una estrategia de tratamiento beneficiosa. En un aspecto, el método de ablación de la médula ósea de la divulgación, que comprende la administración de una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) descrito en otro punto de la presente, se realiza en un sujeto antes del trasplante de médula ósea. Por lo tanto, en un aspecto, el método de la divulgación proporciona una pauta de acondicionamiento celular antes del trasplante de médula ósea o de células madre. En un aspecto, el trasplante de médula ósea comprende el trasplante de una célula madre. El trasplante de médula ósea puede comprender trasplante de células autólogas o alogénicas.

La presente divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa c A r CD123) de la invención para erradicar al menos una porción de la médula ósea existente. El método se puede utilizar como al menos una porción de una pauta de tratamiento para tratar cualquier enfermedad o trastorno donde el trasplante de médula ósea es beneficioso. Es decir, el método de la presente se puede utilizar en cualquier sujeto que necesite un trasplante de médula ósea. En un aspecto, la ablación de médula ósea que comprende la administración de una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) es útil en el tratamiento de a Ml . En ciertos aspecto, la ablación de médula ósea según el método de la presente es útil para tratar un cáncer hematológico, un túmor sólido, una enfermedad hematológica, un trastorno metabólico, HIV, HTLV, un trastorno por almacenamiento lisosomal y una inmunodeficiencia.

Las composiciones y métodos divulgados en la presente se pueden utilizar para erradicar al menos una porción de la médula ósea existente para tratar cánceres hematológicos que incluyen, sin carácter limitante, leucemia, linfoma, mieloma, ALL, AML, CLL, CML, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano y mieloma múltiple.

Las composiciones y métodos divulgados en la presente se pueden utilizar para tratar enfermedades hematológicas que incluyen, sin carácter limitante, mielodisplasia, anemia, hemoglobinuria nocturna paroxística, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura adquirida, anemia de Diamon-Blackfan, anemia de Fanconi, citopenia, trombocitopenia amegacariocítica, trastornos mieloproliferativos, policitemia vera, trombocitosis esencial, mielofibrosis, hemoglobinopatías, anemia de células falciformes, talasemia p mayor, entre otros.

Las composiciones y métodos divulgados en la presente se pueden utilizar para tratar trastornos por almacenamiento lisosomal que incluyen, sin carácter limitante, lipidosis, esfingolipidosis, leucodistrofias, mucopolisacaridosis, glucoproteinosis, lipofuscinosis ceroide neuronal infantil, enfermedad de Jansky-Bielschowsky, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Gaucher, adrenoleucodistrofia, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Krabbe, síndrome de Hurler, síndrome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo, síndrome de Morquio, síndrome de Maroteaux-Lamy, síndrome de Sly, mucolipidosis, fucolipidosis, aspartilglucosaminuria, alfamanosidosis y enfermedad de Wolman.

Las composiciones y métodos divulgados en la presente se pueden utilizar para tratar inmunodeficiencias que incluyen, sin carácter limitante, deficiencias de linfocitos T, deficiencias combinadas de linfocitos T y linfocitos B, trastornos de los fagocitos, enfermedades por desregulación inmunitaria, deficiencias inmunitarias innatas, ataxia telangiectasia, síndrome de DiGeorge, inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés), síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de Kostmann, síndrome de Shwachman-Diamond, síndrome de Griscelli y deficiencia del modulador esencial de NF-Kappa-B (NEMO, por sus siglas en inglés).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar cáncer que comprende acondicionamiento de médula ósea, donde al menos una porción de la médula ósea del sujeto se erradica con la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) de la invención. Por ejemplo, en ciertos casos, la médula ósea del sujeto comprende una célula precursora maligna que se puede atacar y eliminar mediante la actividad de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123). En un aspecto, una terapia de acondicionamiento de la médula ósea comprende administrar un trasplante de médula ósea o células madre al sujeto tras la erradicación de la médula ósea nativa. En un aspecto, la terapia de reacondicionamiento de la médula ósea se combina con una o más de otras terapias contra el cáncer que incluyen, sin carácter limitante, terapias CAR antitumorales, quimioterapia, radiación y similares.

En un aspecto, se puede necesitar la erradicación de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito Nk que expresa CAR CD123) administrada antes de la infusión del trasplante de médula ósea o células madre. La erradicación de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito CART CD123 o linfocito NK que expresa CAR CD123) se puede lograr utilizando cualquier estrategia o tratamiento adecuados, incluidos, sin carácter limitante, el uso de un gen suicida, CAR codificados por ARN con una persistencia de CAR limitada, o modalidades anti-linfocitos T incluidos anticuerpos o quimioterapia.

Terapias combinadas

Se puede utilizar una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con otros agentes y terapias conocidos. La expresión administrado «en combinación», tal como se utiliza en la presente, significa que se suministran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto durante el curso de la aflicción del sujeto con el trastorno, por ejemplo, se suministran los dos o más tratamientos después de que el sujeto haya sido diagnosticado con el trastorno y antes de que el trastorno haya sido curado o eliminado o el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas realizaciones, el suministro de un tratamiento todavía está ocurriendo cuando comienza el suministro del segundo, de modo que hay una superposición en lo que se refiere a la administración. Esto a veces se denomina en la presente «suministro simultáneo» o «suministro concurrente». En otras realizaciones, el suministro de un tratamiento finaliza antes de que comience el suministro del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquier caso, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más efectivo, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida, de lo que se observaría si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o se observa una situación análoga con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, el suministro es tal que la reducción en un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor de lo que se observaría cuando se suministra un tratamiento en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o más que aditivo. El suministro puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado aún sea detectable cuando se suministra el segundo.

Una célula que expresa CAR descrita en la presente y el al menos un agente terapéutico adicional se pueden administrar simultáneamente, en las mismas composiciones o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial, la célula que expresa el CAR descrita en la presente se puede administrar primero, y el agente adicional puede administrarse en segundo lugar, o el orden de administración se puede invertir.

La terapia con CAR y/o otros agentes, procedimientos o modalidades terapéuticos se pueden administrar durante periodos en los que el trastorno está activo o durante un periodo de remisión o menor actividad de la enfermedad. La terapia con CAR se puede administrar antes del otro tratamiento, a la vez que el tratamiento, después del tratamiento o durante la remisión del trastorno.

Cuando se administran combinados, la terapia con CAR y el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, se pueden administrar en una cantidad o dosis que es superior, inferior o igual a la cantidad o dosificación de cada agente que se utiliza de manera individual, por ejemplo, como una monoterapia. En ciertas realizaciones, la cantidad o dosificación administrada de la terapia con CAR, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, es inferior (por ejemplo, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o al menos un 50%) a la cantidad o dosificación de cada agente utilizado de manera individual, por ejemplo, como una monoterapia. En otras realizaciones, la cantidad o dosificación de la terapia con CAR, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, que da como resultado un efecto deseado (por ejemplo, el tratamiento del cáncer) es inferior (por ejemplo, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o al menos un 50% inferior) a la cantidad o dosificación de cada agente utilizado de manera individual, por ejemplo, como una monoterapia requerida para lograr el mismo efecto terapéutico.

En aspectos adicionales, una célula que expresa CAR descrita en la presente se puede utilizar en una pauta de tratamiento combinada con cirugía, citocinas, radiación o quimioterapia tal como citoxano, fludarabina, inhibidores de la histonadesacetilasa, agentes desmetilantes o una vacuna peptídica, tal como la descrita en Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971.

En ciertos casos, los compuestos de la presente invención se combinan con otros agentes terapéuticos, tales como otros agentes anticancerosos, agentes antialérgicos, agentes contra las náuseas (o antieméticos), analgésicos, agentes citoprotectores y combinaciones de estos.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se puede utilizar combinada con un agente quimioterápico. Los agentes quimioterápicos a modo de ejemplo incluyen una antraciclina (por ejemplo, doxorubicina (por ejemplo, doxorubicina liposomal)), un alcaloide de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), un agente alquilante (por ejemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalán, ifosfamida, temozolomida), una célula inmunitaria de tipo anticuerpo (por ejemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab), un antimetabolito (incluidos, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina-desaminasa (por ejemplo, fludarabina)), un inhibidor de mTOR, un agonista de la proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR, por sus siglas en inglés) TNFR, un inhibidor de proteasoma (por ejemplo, aclacinomicina A, gliotoxina o bortezomib), un inmunomodulador tal como talidomida o un derivado de talidomida (por ejemplo, lenalidomida).

Los agentes quimioterápicos generales considerados para su uso en terapias combinadas incluyen anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfán (Myleran®), inyección de busulfán (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucilo (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabine, arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposomas de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), clorhidrato de daunorubicina (Cerubidine®), inyección de liposomas de citrato de daunorubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), clorhidrato de doxorubicina (Adriamycin®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea®), Idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecán (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), milotarg, paclitaxel (Taxol®), fénix (Itrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), tenipósido (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), clorhidrato de topotecán para inyección (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) y vinorelbina (Navelbine®).

Los agentes anticancerosos de interés particular para combinaciones con los compuestos de la presente invención incluyen: antraciclinas; agentes alquilantes; antimetabolitos; fármacos que inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina o la cinasa p70S6 FK506) o inhiben la cinasa p70S6; inhibidores de mTOR; inmunomoduladores; antraciclinas; alcaloides de la vinca; inhibidores del proteasoma; agonistas de GITR; inhibidores de la proteína-tirosinafosfatasa; un inhibidor de la cinasa CDK4; un inhibidor de BTK; un inhibidor de la cinasa MKN; un inhibidor de la cinasa DGK; o un virus oncolítico.

Los antimetabolitos a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, análogos de piridimina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina-desaminasa): metotrexato (Rheumatrex®, Trexall®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®, Fluoroplex®), floxuridina (FUDF®), citarabina (Cytosar-U®, Tarabina PFS), 6-mercaptopurina (Puri-Nethol®)), 6-tioguanina (Tioguanina Tabloid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), pentostatina (Nipent®), pemetrexed (Alimta®), raltitrexed (Tomudex®), cladribina (Leustatin®), clofarabina (Clofarex®, Clolar®), azacitidina (Vidaza®), decitabina y gemcitabina (Gemzar®). Los antimetabolitos preferidos incluyen citarabina, clofarabina y fludarabina.

Los agentes alquilantes a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), clormetina (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™) , ifosfamida (Mitoxana®), melfalán (Alkeran®), clorambucilo (Leukeran®), pipobromano (Amedel®, Vercyte®), trietilenomelamina (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), trietilentiofosforamina, Temozolomida (Temodar®), tiotepa (Thioplex®), busulfán (Busilvex®, Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®), estreptozocina (Zanosar®) y Dacarbazina (DTIC-Dome®). Los agentes alquilantes a modo de ejemplo adicionales incluyen, sin carácter limitante, Oxaliplatino (Eloxatin®); Temozolomida (Temodar® y Temodal®); Dactinomicina (también conocida como actinomicina-D, Cosmegen®); Melfalán (también conocido como L-PAM, L-sarcolisina y mostaza de fenilalanina, Alkeran®); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Carmustina (BiCNU®); Bendamustina (Treanda®); Busulfán (Busulfex® y Myleran®); Carboplatino (Paraplatin®); Lomustina (también conocida como CCNU, CeeNU®); Cisplatino (también conocido como CDDP, Platinol® y Platinol®-AQ); Clorambucilo (Leukeran®); Ciclofosfamida (Cytoxan® y Neosar®); Dacarbazina (también conocida como DTIC, DIC e imidazolcarboxamida, DTIC-Dome®); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Ifosfamida (Ifex®); Prednumustina; Procarbazina (Matulane®); Mecloretamina (también conocida como mostaza nitrogenada, muarin y clorhidrato de mecloroetamina, Mustargen®); Estreptozocina (Zanosar®); Tiotepa (también conocida como tiofosfoamida, TESPA y TSPA, Thioplex®); Ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); y bendamustina HCl (Treanda®).

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con fludarabina, ciclofosfamida y/o rituximab. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con fludarabina, ciclofosfamida y rituximab (FCR). En algunos casos, el sujeto padece CLL. Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En algunos casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En algunos casos, la fludarabina se administra con una dosificación de aproximadamente 10-50 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, o 45-50 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En algunos casos, la ciclofosfamida se administra con una dosificación de aproximadamente 200-300 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 200-225, 225-250, 250-275 o 275-300 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En algunos casos, el rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 400-600 mg/m2 (por ejemplo, de 400-450, 450-500, 500-550 o 550-600 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con bendamustina y rituximab. En algunos casos, el sujeto padece CLL. Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En algunos casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgV^H). En algunos casos, la bendamustina se administra con una dosificación de aproximadamente 70-110 mg/m2 (por ejemplo, de 70-80, 80-90, 90-100 o 100-110 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En algunos casos, el rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 400-600 mg/m2 (por ejemplo, de 400-450, 450-500, 500-550 o 550-600 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y/o un corticosteroide (por ejemplo, prednisona). En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y/o prednisona (R CHOP). En algunos casos, el sujeto padece un linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL, por sus siglas en inglés). En algunos casos, el sujeto padece DLBCL en estadio limitado no voluminoso (por ejemplo, comprende un tumor que tiene un tamaño/diámetro de menos de 7 cm). En algunos casos, el sujeto se trata con radiación combinada con R-CHOp . Por ejemplo, al sujeto se le administra R-CHOP (por ejemplo, 1-6 ciclos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 o 6 ciclos de R-CHOP), y después radiación. En algunos casos, al sujeto se le administra R-CHOP (por ejemplo, 1-6 ciclos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ciclos de R-CHOP) después de la radiación.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con etopósido, predinisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorubicina y/o rituximab. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con etopósido, predinisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorubicina y rituximab (EPOCH-R). En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con EPOCH-R de dosis ajustada (DA-EPOCH-R). En algunos casos, el sujeto padece un linfoma de linfocitos B, por ejemplo, un linfoma de linfocitos B agresivo con reordenación de Myc.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab y/o lenalidomida. Lenalidomida ((RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidino-2,6-diona) es un inmunomodulador. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab y lenalidomida. En algunos casos, el sujeto padece linfoma folicular (FL, por sus siglas en inglés) o linfoma de células del manto (MCL, por sus siglas en inglés). En algunos casos, el sujeto padece FL y no ha sido tratado previamente con una terapia contra el cáncer. En algunos casos, lenalidomida se administra con una dosificación de aproximadamente 10-20 mg (por ejemplo, de 10-15 o 15-20 mg), por ejemplo, a diario. En algunos casos, rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425 450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

Los inhibidores de mTOR a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, temsirolimus; ridaforolimus (conocido formamente como deferolimus, dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.049] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como AP23573 y MK8669, y descrito en la Publicación PCT N.° WO 03/064383); everolimus (Afinitor® o RAD001); rapamicina (AY22989, Sirolimus®); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimus, (5-{2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); y W2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartil-L-serina- (SEQ ID NO: 706), sal interna (SF1126, CAS 936487-67-1), y XL765.

Los inmunomoduladores a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, afutuzumab (se puede adquirir de Roche®); pegfilgrastim (Neulasta®); lenalidomida (^cC-5013, Revlimid®); talidomida (Thalomid®), actimid (CC4047); e IRX-2 (mezcla de citocinas humanas que incluyen interleucina 1, interleucina 2 e interferón y, CAS 951209-71-5, que se puede adquirir de IRX Therapeutics).

Las antraciclinas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, doxorubicina (Adriamycin® y Rubex®); bleomicina (lenoxane®); daunorubicina (clorhidrato de dauorubicina, daunomicina y clorhidrato de rubidomicina, Cerubidine®); daunorubicina liposomal (liposoma de citrato de daunorubicina, DaunoXome®); mitoxantrona (DHAD, Novantrone®); epirubicina (Ellence™); idarubicina (Idamycin®, Idamicina PFS®); mitomicina C (Mutamycin®); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; y desacetilravidomicina.

Los alcaloides de la vinca a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, tartrato de vinorelbina (Navelbine®), Vincristina (Oncovin®) y Vindesina (Eldisine®)); vinblastina (también conocida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina y VLB, Alkaban-AQ® y Velban®); y vinorelbina (Navelbine®).

Los inhibidores del proteasoma a modo de ejemplo incluyen bortezomib (Velcade®); carfilzomib (PX-171-007, (S)-4-metil-W-((S)-1-(((S)-4-metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); y 0-metil-N-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L-seril-0-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]-L-serinamida (ONX-0912).

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con brentuximab. Brentuximab es un conjugado anticuerpo-fármaco de un anticuerpo anti-CD30 y monometil-auristatina E. En algunos casos, el sujeto padece linfoma de Hodgkin (HL, por sus siglas en inglés), por ejemplo, HL recurrente o refractario. En algunos casos, el sujeto comprende HL CD30+. En algunos casos, el sujeto se ha sometido a un trasplante de células madre autólogo (ASCT, por sus siglas en inglés). En algunos casos, el sujeto no se ha sometido a un ASCT. En algunos casos, brentuximab se administra con una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con brentuximab y dacarbazina o combinada con brentuximab y bendamustina. Dacarbazina es un agenet alquilante con el nombre químico 5-(3,3-dimetil-1-triazenil)imidazol-4-carboxamida. Bendamustina es un agente alquilante con el nombre químico ácido 4-[5-[bis(2-cloroetil)amino]-1-metilbencimidazol-2-il]butanoico. En algunos casos, el sujeto padece linfoma de Hodgkin (HL). En algunos casos, el sujeto no ha sido tratado previamente con una terapia contra el cáncer. En algunos casos, el sujeto tiene una edad de al menos 60 años, por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o mayor. En algunos casos, dacarbazina se administra con una dosificación de aproximadamente 300-450 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, o 425-450 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En algunos casos, bendamustina se administra con una dosificación de aproximadamente 75-125 mg/m2 (por ejemplo, de 75-100 o 100-125 mg/m2, por ejemplo, de aproximadamente 90 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En algunos casos, brentuximab se administra con una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de CD20, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, un anticuerpo mono- o biespecífico anti-CD20) o un fragmento de este. Los anticuerpos anti-CD20 a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, veltuzumab, obinutuzumab, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), ocaratuzumab y Pro131921 (Genentech). Remítase, por ejemplo, a Lim et al. Haematologica. 95,1(2010):135-43.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende rituximab. Rituximab es un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa quimérico de ratón/humano que se une a CD20 y provoca la citólisis de una célula que expresa CD20, por ejemplo, tal como se describe en www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab. En algunos casos, el sujeto padece CLL o SLL.

En algunos casos, rituximab se administra por vía intravenosa, por ejemplo, como una infusión intravenosa. Por ejemplo, cada infusión proporciona aproximadamente 500-2000 mg (por ejemplo, aproximadamente 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400 1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, o 1900-2000 mg) de rituximab. En algunos casos, rituximab se administra en una dosis de 150 mg/m2 a 750 mg/m2, por ejemplo, de aproximadamente 150-175 mg/m2, 175-200 mg/m2, 200-225 mg/m2, 225-250 mg/m2, 250-300 mg/m2, 300-325 mg/m2, 325-350 mg/m2, 350-375 mg/m2, 375-400 mg/m2, 400 425 mg/m2, 425-450 mg/m2, 450-475 mg/m2, 475-500 mg/m2, 500-525 mg/m2, 525-550 mg/m2, 550-575 mg/m2, 575-600 mg/m2, 600-625 mg/m2, 625-650 mg/m2, 650-675 mg/m2, o 675-700 mg/m2, donde m2 indica el área de superficie corporal del sujeto. En algunos casos, rituximab se administra con un intervalo posológico de al menos 4 días, por ejemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 días o más. Por ejemplo, rituximab se administra con un intervalo posológico de al menos 0,5 semanas, por ejemplo, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas o más. En algunos casos, rituximab se administra con una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, de al menos 2 semanas, por ejemplo, de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 semanas, o más. Por ejemplo, rituximab se administra con una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un total de al menos 4 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o más dosis por ciclo de tratamiento).

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende ofatumumab. Ofatumumab es un anticuerpo monoclonal humano IgG1K anti-CD20 con un peso molecular de aproximadamente 149 kDa. Por ejemplo, ofatumumab se genera utilizando un ratón transgénico y tecnología de hibridoma y se expresa y purifica a partir de una línea celular murina (NS0). Remítase, por ejemplo, a www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/1253261 bl.pdf; y el Identificador de Ensayos Clínicos número NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352, y NCT01397591. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con ofatumumab. En algunos casos, el sujeto padece CLL o SLL.

En algunos casos, ofatumumab se administra como una infusión intravenosa. Por ejemplo, cada infusión proporciona aproximadamente 150-3000 mg (por ejemplo, aproximadamente 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, o 2800-3000 mg) de ofatumumab. En algunos casos, ofatumumab se administra con una dosificación inicial de aproximadamente 300 mg, seguida por 2000 mg, por ejemplo, durante aproximadamente 11 dosis, por ejemplo, 24 semanas. En algunos casos, ofatumumab se administra con un intervalo posológico de al menos 4 días, por ejemplo, de 4, 7, 14, 21,28, 35 días o más. Por ejemplo, ofatumumab se administra con un intervalo posológico de al menos 1 semana, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 semanas o más. En algunos casos, ofatumumab se administra con una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, de al menos 1 semana, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 semanas o más, o de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, o de 1, 2, 3, 4, 5 años o más. Por ejemplo, ofatumumab se administra con una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un total de al menos 2 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, o más dosis por ciclo de tratamiento).

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende ocrelizumab. Ocrelizumab es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado, por ejemplo, tal como se describe en los Identificadores de Ensayos Clínicos N.os NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, y Kappos et al. Lancet. 19.378(2011): 1779-87.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende veltuzumab. Veltuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra CD20. Remítase, por ejemplo, al identificador de Ensayos Clínicos N.° NCTO0547066, NCT00546793, NCT01101581, y Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende GA101. GA101 (también denominado obinutuzumab o RO5072759) es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado y glucomodificado. Remítase, por ejemplo, a Robak Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Identificadores de Ensayos Clínicos Números: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422, y NCT01414205; y www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende AME-133v. AME-133v (también denominado LY2469298 u ocaratuzumab) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado contra CD20 con un aumento de la afinidad por el receptor FcYRIIIa y una potenciación de la actividad de tipo citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) en comparación con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1 (2011):13-25; y Forero-Torres et al. Clin Cáncer Res. 18.5(2012):1395-403.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende PRO131921. PRO131921 es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado modificado para tener una mejor unión a FcYRIIIa y una potenciación de ADCC en comparación con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; y Casulo et al. Clin Immunol. 154.1 (2014):37-46; e Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT00452127.

En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende TRU-015. TRU-015 es una proteína de fusión anti-CD20 obtenida a partir de dominios de un anticuerpo contra CD20. TRU-015 es más pequeña que los anticuerpos monoclonales, pero mantiene las funciones efectoras mediadas por Fc. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25. TRU-015 contiene un fragmento variable monocatenario (scFv) anti-CD20 ligado a los dominios CH2, CH3 y bisagra de IgG1 humana pero que carece de los dominios CH1 y CL.

En algunos casos, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la presente se conjuga o une de otra manera al agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterápico (por ejemplo, citoxano, fludarabina, inhibidor de la histona-desacetilasa, agente desmetilante, vacuna peptídica, antibiótico antitumoral, inhibidor de la tirosina-cinasa, agente alquilante, agente antimitótico o antimicrotubular), agente antialérgico, agente contra las náuseas (o antiemético), analgésico o agente citoprotector descrito en la presente.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor del linfoma de linfocitos B 2 (BCL-2) (por ejemplo, venetoclax, también denominado A bT-199 o GDC-0199;) y/o rituximab. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con venetoclax y rituximab. Venetoclax es una molécula de bajo peso molecular que inhibe la proteína antiapoptótica BCL-2. La estructura de venetoclax (4-(4-{[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1 H-pirrolo[2,3-ó]piridin-5-iloxi)benzamida) se muestra a continuación.

En algunos casos, el sujeto padece CLL. En algunos casos, el sujeto padece CLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer. En algunos casos, venetoclax se administra con una dosificación de aproximadamente 15-600 mg (por ejemplo, de 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, o 500-600 mg), por ejemplo, a diario. En algunos casos, rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, mensualmente.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra combinada con un virus oncolítico. En algunos casos, los virus oncolíticos son capaces de replicarse de manera selectiva en una célula cancerosa y de desencadenar su muerte o de ralentizar su crecimiento. En algunos casos, los virus oncolíticos no tienen efecto, o un efecto mínimo, sobre las células no cancerosas. Un virus oncolítico incluye, sin carácter limitante, un adenovirus oncolítico, virus del herpes simple oncolíticos, retrovirus oncolítico, parvovirus oncolítico, virus de la variolovacuna oncolítico, virus Sinbis oncolítico, virus de la gripe oncolítico, o virus de ARN oncolítico (por ejemplo, reovirus oncolítico, virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en inglés), virus del sarampión oncolítico o virus de la estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés) oncolítico).

En algunos casos, el virus oncolítico es un virus, por ejemplo, virus oncolítico recombinante, descrito en el documento US2010/0178684 A1. En algunos casos, un virus oncolítico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico heterólogo) que codifica un inhibidor de una respuesta inmunitaria o inflamatoria, por ejemplo, como se describe en el documento US2010/0178684 A1. En algunos casos, el virus oncolítico recombinante, por ejemplo, NDV oncolítico, comprende una proteína proapoptótica (por ejemplo, apoptina), una citocina (por ejemplo, GM-CSF, interferón-gamma, interleucina-2 (IL-2), factor de necrosis tumoral alfa), una inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo contra ED-B de fibronectina), antígeno asociado a un tumor, una proteína adaptadora biespecífica (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo dirigido contra la proteína HN de NDV y un receptor coestimulador de linfocitos T, tal como CD2 o CD28; o una proteína de fusión entre IL-2 humana y un anticuerpo monocatenario dirigido contra la proteína HN de NDV). Remítase, por ejemplo, a Zamarin et al. Future Microbio!. 7.3(2012):347-67. En algunos casos, el virus oncolítico es un NDV oncolítico quimérico descrito en los documentos US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1, o US 2014/0271677 A1.

En algunos casos, el virus oncolítico comprende un adenovirus de replicación condicionada (CRAd) que está diseñado apra replicarse exclusivamente en células cancerosas. Remítase, por ejemplo, a Alemany et al. Nature Biotechnol.

18(2000):723-27. En algunos casos, un adenovirus oncolítico comrpende uno descrito en la Tabla 1 en la página 725 de Alemany et al.

Los virus oncolíticos a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, los siguientes:

Grupo B de adenovirus oncolíticos (ColoAd1) (PsiOxus Therapeutics Ltd.) (remítase al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT02053220);

ONCOS-102 (denominado previamente CGTG-102), que es un adenovirus que comprende el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés) (Oncos Therapeutics) (remítase, por ejemplo, al Identifiador de Ensayos Clínicos: NCT01598129);

VCN-01, que es un adenovirus humano oncolítico modificado genéticamente que codifica la hialuronidasa PH20 humana (VCN Biosciences, S.L.) (remítase, por ejemplo, a los Identificadores de Ensayos Clínicos: NCT02045602 y NCT02045589);

Adenovirus de replicación condicionada ICOVIR-5, que es un virus derivado del serotipo 5 del adenovirus humano de tipo natural (Had5) que se ha modificado para que se replique de manera selectiva en células cancerosas con una ruta de retinoblastoma/E2F desregulada (Instituto Catalán de Oncología) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01864759);

Celyvir, que comprende células madre mesenquimatosas (MSC, por sus siglas en inglés) autólogas derivadas de médula ósea infectadas con ICOVIR5, un adenovirus oncolítico (Hospital Infantil Universitario Niño Jesus, Madrid, España/Ramón Alemany) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01844661);

CG0070, que es un adenovirus con serotipo 5 (Ad5) oncolítico con replicación condicionada en el que el promotor E2F-1 humano impulsa la expresión de los genes víricos E1a esenciales, y se restringe de esta manera la replicación vírica y citoxicidad a las células tumorales defectuosas en la ruta Rb (Cold Genesys, Inc.) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT02143804); o

DXN-2401 (denominado anteriormente Delta-24-RGD), que es un adenovirus que se ha modificado para replicarse de manera selectiva en células deficientes en la ruta de retinoblastoma (Rb) y para infectar células que expresan ciertas integrinas de unión a RGD de manera más eficaz (Clínica de la Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/DNAtrix, Inc.) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01956734).

En algunos casos, un virus oncolítico descrito en la presente se administra por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intraarterial, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. En algunos casos, un virus oncolítico descrito en la presente se administra por vía intratumoral, transdérmica, transmucosa, oral, intranasa o mediante administración por vía pulmonar.

En un caso, las células que expresan un CAR descrito en la presente se administran a un sujeto combinadas con una molécula que reduce la población de linfocitos Treg. En la técnica existe constancia de métodos que reducen (por ejemplo, disminuyen) el número de linfocitos Treg y estos incluyen, por ejemplo, disminución de CD25, administración de ciclofosfamida, modulación de la función de GITR. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que la reducción del número de linfocitos Treg en un sujeto antes de la aféresis o antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente reduce el número de células inmunitarias no deseadas (por ejemplo, Treg) en el microentorno del tumor y reduce el riesgo de que el sujeto recaiga.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con una molécula que tiene como diana GITR y/o que modula las funciones de GITR, tal como un agonista de GITR y/o un anticuerpo para GITR que disminuye los linfocitos T reguladores (Treg). En algunos casos, las células que expresan un CAR descritas en la presente se administran a un sujeto combinadas con ciclofosfamida. En un caso, las moléculas de unión a GITR y/o moléculas que modulan las funciones de GITR (por ejemplo, agonista de GITR y/o anticuerpos GITR que disminuyen Treg) se administran antes de la administración de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agonistra de GITR se puede administrar antes de la aféresis de las células. En algunos casos, la ciclofosfamida se administra al sujeto antes de la administración (por ejemplo, infusión o reinfusión) de la célula que expresa CAR o antes de la aféresis de las células. En algunos casos, la ciclofosfamida y un anticuerpo anti-GITR se administran al sujeto antes de la administración (por ejemplo, infusión o reinfusión) de la célula que expresa CAR o antes de la aféresis de las células. En un caso, el sujeto padece cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido o un cáncer hematológico tal como ALL o CLL). En un caso, el sujeto padece CLL. En algunos casos, el sujeto padece ALL. En algunos casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer sólido descrito en la presente. Los agonistas de GITR a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión con GITR y anticuerpos anti-GITR (por ejemplo, anticuerpos anti-GITR bivalentes) tales como, por ejemplo, una proteína de fusión con GI^tR descrita en la Patente de EE. UU. N.°: 6111 090, Patente Europea N.°: 090505B1, Patente de EE. UU. N.°: 8586023, Publicación PCT N.os: WO 2010/003118 y 2011/090754, o un anticuerpo anti-GITR descrito, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.°: 7025962, Patente Europea N.°: 1947183B1, Patente de EE. UU. N.°: 7 812 135, Patente de EE. UU. N.°: 8388967, Patente de EE. UU. N.°: 8591 886, Patente Europea N.°: EP 1866339, Publicación PCT N.°: WO 2011/028683, Publicación PCT N.°: WO 2013/039954, Publicación N.°: W02005/007190, Publicación PCT N.°: WO 2007/133822, Publiación PCT N.°: W02005/055808, Publicación PCT N.°: WO 99/40196, Publiación PCT N.°: WO 2001/03720, Publiación PCT N.°: WO99/20758, Publicación PCT N.°: WO2006/083289, Publicación PCT N.°: WO 2005/115451, Patente de EE. UU. N.°: 7618632, y Publiación PCT N.°: WO 2011/051726.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un agonista de GITR, por ejemplo, un agonista de GITR descrito en la presente. En un caso, el agonista de GITR se administra antes que la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el agonistra de GITR se puede administrar antes de la aféresis de las células.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en la presente, por ejemplo, un rapálogo tal com oeverolimus. En un caso, el inhibidor de mTOR se administra antes que la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en un caso, el inhibidor de mTOR se puede administrar antes de la aféresis de las células.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de una proteína-tirosina-fosfatasa, por ejemplo, un inhibidor de una proteína-tirosina-fosfatasa descrito en la presente. En un caso, el inhibidor de la proteína-tirosina-fosfatasa es un inhibidor de SHP-1, por ejemplo, un inhibidor de SHP-1 descrito en la presente, tal como, por ejemplo, estibogluconato de sodio. En un caso, el inhibidor de la proteína-tirosina-fosfatasa es un inhibidor de SHP-2.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se puede utilizar combinada con un inhibidor de cinasa. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 descrito en la presente, por ejemplo, un inhibidor de CD4/6, tal como, por ejemplo, clorhidrato de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-ilpiridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (también denominado palbociclib o PD0332991). En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, un inhibidor de BTK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, ibrutinib. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en la presente, tal como, por ejemplo, rapamicina, un análogo de rapamicina, OSl-027. El inhibidor de mTOR puede ser, por ejemplo, un inhibidor de mTORC1 y/o un inhibidor de mTORC2, por ejemplo, un inhibidor de mTORC1 y/o inhibidor de mTORC2 descrito en la presente. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK, por ejemplo, un inhibidor de MNK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)pirazolo [3,4-d] pirimidina. El inhibidor de MNK puede ser, por ejemplo, un inhibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a y/o MNK2b. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de DGK, por ejemplo, un inhibidor de DGK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, DGKinh1 (D5919) o DGKinh2 (D5794). En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4 seleccionado entre aloisina A, flavopiridol o HMR-1275, 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(3S,4R)-3-hidroxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066; clorhidrato de 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]-4H-1-benzopiran-4-ona (P276-00); 1-metil-5-[[2-[5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]-4-piridinil]oxi]-N-[4-(trifluorometil)fenil]-1H-bencimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclib (PD0332991); dinaciclib (SCH727965); N-[5-[[(5-ferf-butiloxazol-2-il)metil]tio]tiazol-2-il]piperidino-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4-[[9-cloro-7-(2,6-difluorofenil)-5wpirimido[5,4-d][2]benzazepin-2-il]amino]benzoico (MLN8054); 5-[3-(4,6-difluoro-1H-bencimidazol-2-il)-1H-indazol-5-il]-N-etil-4-metil-3-piridinometanamina (AG-024322); N-(piperidin-4-il)amida del ácido 4-(2,6-diclorobenzoilamino)-1H-pirazol-3-carboxílico (AT7519); 4-[2-metil-1-(1-metiletil)-1H-imidazol-5-il]-N-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-pirimidinamina (AZD5438); y XL281 (BMS908662).

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, palbociclib (PD0332991), y el palbociclib se administra con una dosis de aproximadamente 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg o 125 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante 14-21 días de un ciclo de 28 días, o a diario durante 7-12 días de un ciclo de 21 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de palbociclib.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de la cinasa dependiente de ciclinas (CDK, por sus siglas en inglés) 4 o 6, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 o un inhibidor de CDK6 descrito en la presente. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de CDK4/6 (por ejemplo, un inhibidor que tiene como diana tanto CDK4 como CDK6), por ejemplo, un inhibidor de CDK4/6 descrito en la presente. En un caso, el sujeto padece MCL. MCL es un cáncer agresivo con una repuesta muy deficiente a las terapias de las que se dispone en la actualidad, es decir, esencialmente incurable. En muchos casos de MCL, la ciclina D1 (un regulador de CDK4/6) se expresa (por ejemplo, debido a la translocación cromosómica que implica los genes de la inmunoglobulina y ciclina D1) en células de MCL. Por lo tanto, sin desear ceñirse a la teoría, se cree que las células de MCL son sumamente sensibles a la inhibición de CDK4/6 con una especificidad elevada (es decir, efecto mínimo en células inmunitarias normales). Los inhibidores de CDK4/6 solos han tenido una cierta eficacia para tratar MCL, pero solo han logrado una remisión parcial con una tasa de recaídas elevada. Un inhibidor de CDK4/6 a modo de ejemplo es LEE011 (también denominado ribociclib), cuya estructura se muestra a continuación.

Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente con un inhibidor de CDK4/6 (por ejemplo, LEE011 u otro inhibidor de CDK4/6 descrito en la presente) puede logar una respuesta elevada, por ejemplo, con tasas de remisión más elevadas y/o tasas de recaídas menores, por ejemplo, en comparación con un inhibidor de CDK4/6 solo.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK seleccionado entre ibrutinib (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13. En un caso preferido, el inhibidor de BTK no reduce ni inhibe la actividad cinasa de la cinasa inducible por interleucina 2 (ITK) y se selecciona entre GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, ibrutinib (PCI-32765). En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib). En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con ibrutinib (también denominado PCI-32765). La estructura de ibrutinib (1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoxifenil)-1H-pirazolo[3,4-cf]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona) se muestra a continuación.

En algunos casos, el sujeto padece CLL, linfoma de las células del manto (MCL) o linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En algunos casos, el sujeto padece CLL o SLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer (por ejemplo, se le han administrado previamente una, dos, tres o cuatro terapias contra el cáncer anteriores). En algunos casos, el sujeto padece CLL o SLL refractaria. En otros casos, el sujeto padece linfoma folicular, por ejemplo, linfoma folicular refractario o recurrente. En algunos casos, se administra ibrutinib con una dosificación de aproximadamente 300 600 mg/día (por ejemplo, de aproximadamente 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, o 550-600 mg/día, por ejemplo, de aproximadamente 420 mg/día o de aproximadamente 560 mg/día), por ejemplo, a diario. En algunos casos, se administra el ibrutinib con una dosis de aproximadamente 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por ejemplo, 250 mg, 420 mg o 560 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo ciclo de 21 días o a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de ibrutinib.

En algunos casos, ibrutinib se administra combinado con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (¡R) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Resumen 675 presentado en el 55.a Reunión y Exposición Anual de a Sh , Nueva Orleans, LA 7-10 diciembre. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que la adición de ibrutinib potencia la respuesta proliferativa de linfocitos T y puede hacer que los linfocitos cambien de un fenotipo T-auxiliar-2 (Th2) a T-auxiliar-1 (Th1). Th1 y Th2 son fenotipos de los linfocitos T auxiliares, donde Th1 versus Th2 dirigen diferentes rutas de respuesta inmunitaria. Un fenotipo Th1 se asocia con respuestas proinflamatorias, por ejemplo, para provocar la muerte de células, tales como virus/patógenos intracelulares o células cancerosas, o en la perpetuación de respuestas autoinmunitarias. Un fenotipo Th2 se asocia con respuestas antiinflamatorias y de acumulación de eosinófilos.

En algunos casos de los métodos, usos y composiciones de la presente, el inhibidor de BTK es un inhibidor de BTK descrito en la Solitud Internacional WO/2015/079417. Por ejemplo, en algunos casos, el inhibidor de BTK es un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de este;

donde

R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con hidroxi;

R2 es hidrógeno o halógeno;

R3 es hidrógeno o halógeno;

R4 es hidrógeno;

R5 es hidrógeno o halógeno;

o R4 y R5 están unidos entre sí y representan un enlace, -CH2-, -CH2-CH2- , - CH=CH-, -CH=CH-CH2-; -CH2-CH=CH-; o -CH2-CH2-CH2-;

R6 y R7 representan independientemente el uno del otro H, alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con hidroxilo, cicloalquilo C3-C6 sustituido opcionalmente con halógeno o hidroxi, o halógeno;

R8, R9, R, R', R10 y R11 independientemente los unos de los otros representan H o alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con alcoxi C1-C6; o dos cualesquiera de R8, R9, R, R', R10 y R11 junto con el átomo de carbono al que se encuentran unidos pueden formar un anillo carbocíclico saturado de 3-6 miembros;

R12 es hidrógeno o alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con halógeno o alcoxi C1-C6;

o R12 y cualquiera de R8, R9, R, R', R10 o R11 junto con los átomos a los que se encuentran unidos pueden formar un anillo azacíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros, anillo que puede estar opcionalmente sustituido con halógeno, ciano, hidroxilo, alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6;

n es 0 o 1 ; y

R13 es alquenilo C2-C6 sustituido opcionalmente con alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6 o N,N-di-alquilamino C1-C6; alquinilo C2-C6 sustituido opcionamente con alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6; o alquenilóxido C2-C6 sustituido opcionalmente con alquilo C1-C6.

En algunos casos, el inhibidor de BTK de Fórmula I se escoge entre: N-(3-(5-((1-acriloilazetidin-3-il)oxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (£)-N-(3-(6-amino-5-((1-(but-2-enoil)azetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-((1-propioloilazetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-((1-(but-2-inoil)azetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-((1-acriloilpiperidin-4-il)oxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilacrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (£)-N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilbut-2-enamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilpropiolamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (£)-N-(3-(6-amino-5-(2-(4-metoxi-N-metilbut-2-enamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilbut-2-inamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(2-((4-amino-6-(3-(4-ciclopropil-2-fluorobenzamido)-5-fluoro-2-metilfenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metiloxirano-2-carboxamida; N-(2-((4-amino-6-(3-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(1H)-il)fenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metilacrilamida; N-(3-(5-(2-acrilamidoetoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-etilacrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-(2-fluoroetil)acrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-((1-acrilamidociclopropil)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-(2-acrilamidopropoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-(2-(but-2-inamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilacrilamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilbut-2-inamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(3-(N-metilacrilamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-((1-acriloilpirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-((1-(but-2-inoil)pirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-2-(3-(5-((1-acriloilpirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; N-(2-((4-amino-6-(3-(6-ciclopropil-1-oxo-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metilacrilamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(((2S,4R)-1-(but-2-inoil)-4-metoxi pirrolidin-2-il)metoxi)pi rimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; 2-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; N-(3-(5-(((2S,4S)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(((2S,4S)-1-(but-2-inoil)-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-fluoropirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(((2S,4R)-1-(but-2-inoil)-4-fluoropirrolidin-2-il)metoxi)pi rimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ci clopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-((1-acriloilazetidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-((1-propioloilazetidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-2-(3-(5-(( 1 -acriloilazetidin-2-il)metoxi)-6-aminopi rimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; (R)-N-(3-(5-((1-acriloilazetidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (R)-N-(3-(5-((1-acriloilpiperidin-3-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2R,3S)-1-acriloil-3-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-cianopirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; o N-(3-(5-(((2S,4S)-1-acriloil-4-cianopirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida.

A menos que se diga lo contrario, los términos químicos utilizados anteriormente para describir el inhibidor de BTK de Fórmula I se utilizan de acuerdo con su significado tal como se expone en la Solicitud Internacional WO/2015/079417.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR seleccionado entre temsirolimus; ridaforolimus dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.049]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como AP23573 y MK8669; everolimus (RAD001); rapamicina (AY22989); simapimod; (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-c(]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-mmino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502); y N2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-aaspartil-L-serina-(SEQ ID NO: 706), sal interna (SF1126); y XL765.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, y la rapamicina se administra con una dosis de aproximadamente 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por ejemplo, 6 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo ciclo de 21 días, o a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de rapamicina. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, everolimus y el everolimus se administra con una dosis de aproximadamente 2 mg, 2,5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por ejemplo, 10 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de everolimus.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK seleccionado entre CGP052088; 4-amino-3-(pfluorofenilamino)pirazolo [3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-1780445-2; y 4-amino-5-(4-fluoroanilino)pirazolo [3,4-d]pirimidina.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de fosfoinositido-3-cinasa (PI3K) (por ejemplo, un inhibidor de PI3K descrito en la presente, por ejemplo, idelalisib o duvelisib) y/o rituximab. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con idelalisib y rituximab. En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con duvelisib y rituximab. Idelalisib (también denominado GS-1101 o CAL-101; Gilead) es una molécula de bajo peso molecular que bloquea la isoforma delta de PI3K. La estructura de idelalisib (5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-quinazolinona) se muestra a continuación.

Duvelisib (también denominado IPI-145; Infinity Pharmaceuticals y Abbvie) es una molécula de bajo peso molecular que bloquea PI3K-5,y. La estructura de duvelisib (8-cloro-2-fenil-3-[(1s)-1-(9H-purin-6-ilamino)etil]-1(2H)-isoquinolinona) se muestra a continuación.

En algunos casos, el sujeto padece CLL. En algunos casos, el sujeto padece CLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer (por ejemplo, se le ha administrado previamente un anticuerpo anti-CD20 o se le ha administrado previamente ibrutinib). Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En algunos casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVn). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En algunos casos, el sujeto tiene una deleción en el brazo largo del cromosoma 11 (del(11q). En otros casos, el sujeto no tiene una del(11q). En algunos casos, idelalisb se administra con una dosificación de aproximadamente 100-400 mg (por ejemplo, de 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, o 375-400 mg), por ejemplo, dos veces al día. En algunos casos, duvelisib se administra con una dosificación de aproximadamente 15-100 mg (por ejemplo, de aproximadamente 15-25, 25-50, 50-75, o 75-100 mg), por ejemplo, dos veces al día. En algunos casos, rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375 400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.

En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor dual de fosfatidillinositol-3-cinasa (PI3K) y mTOR seleccionado entre 2-amino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-cf]pirimidin-7(8H)-ona (PF-04691502); N-[4-[[4-(dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-N'-[4-(4,6-di-4-morfolinil-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea (PF-05212384, PKI-587); 2-metil-2-{4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil}propanenitrilo (BEZ-235); apitolisib (GDC-0980, RG7422); 2,4-difluoro-N-{2-(metiloxi)-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenesulfonamida (GSK2126458); 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ona ácido maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-morfolinilpirido[3',2':4,5]furo[3,2-d]pirimidin-2-il]fenol (PI-103); 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (v S-5584, SB2343); y N-[2-[(3,5-dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4-[(4-metil-3-metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK). Las cinasas A l K a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, crizotinib (Pfizer), ceritinib (Novartis), alectinib (Chugai), brigatinib (también denominado AP26113; Ariad), entrectinib (Ignyta), P^f-06463922 (Pfizer), T^sR-011 (Tesaro) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT02048488), CEP-37440 (Teva) y X-396 (Xcovery). En algunos casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer sólido descrito en la presente, por ejemplo, cáncer de pulmón.

El nombre químico de crizotinib es 3-[(1R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi]-5-(1-piperidin-4-ilpirazol-4-il)piridin-2-amina. El nombre químico de ceritinib es 5-cloro-N2-[2-isopropoxi-5-metil-4-(4-piperidinil)fenil]-N4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-2,4-pirimidinodiamina. El nombre químico de alectinib es 9-etil-6,6-dimetil-8-(4-morfolinopiperidin-1-il)-11 -oxo-6,11 -dihidro-5Hbenzo[b]carbazol-3-carbonitrilo. El nombre químico de brigatinib es 5-cloro-N2-{4-[4-(dimetilamino)-1-piperidinil]-2-metoxifenil}-N4-[2-(dimetilfosforil)fenil]-2,4-pirimidinodiamina. El nombre químico de entrectinib es N-(5-(3,5-difluorobencil)-1 H-indazol-3-il)-4-(4-metilpiperazin-1 -il)-2-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzamida. El nombre químico de PF-06463922 es (10R)-7-amino-12-fluoro-2,10,16-trimetil-15-oxo-10,15,16,17-tetrahidro-2H-8,4-(meteno)pirazolo[4,3-h][2,5,11]-benzoxadiazaciclotetradecino-3-carbonitrilo. La estructura química de CEP-37440 es (S)-2-((5-cloro-2-((6-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)-1-metoxi-6,7,8,9-tetrahidro-5H-benzo[7]anulen-2-il)amino)pirimidin-4-il)amino)-N-metilbenzamida. El nombre químico de X-396 es (R)-6-amino-5-(1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi)-N-(4-(4-metilpiperazina-1-carbonil)fenil)piridazino-3-carboxamida.

También se pueden utilizar fármacos que inhiben ya sea la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En un aspecto adicional, las composiciones celulares de la presente invención se pueden administrar a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) el trasplante de médula ósea, terapia ablativa con linfocitos T utilizando agentes quimioterápicos tales como fludarabina, radioterapia externa (XRT), ciclofosfamida y/o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de linfocitos B tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxán. Por ejemplo, en una realización, los sujetos se pueden someter a un tratamiento estándar con una dosis elevada de quimioterapia, y después trasplante de células madre de la sangre periférica. En ciertas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO). IDO es una enzima que cataliza la degradación del aminoácido L-triptófano en kinurenina. Muchos cánceres expresan IDO, por ejemplo, cáncer prostático, colorrectal, pancreático, de cuello uterino, gástrico, de ovario, de cabeza y de pulmón. Las pDC, macrófagos y células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) pueden expresar IDO. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que un descenso en L-triptófano (por ejemplo, catalizado por IDO) da como resultado un medio inmunosupresor al inducir la anergia y apoptosis de linfocitos T. Por lo tanto, sin desear ceñirse a la teoría, se cree que un inhibidor de IDO puede potenciar la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente, por ejemplo, al reducir la supresión o muerte de una célula inmunitaria que expresa CAR. En algunos casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en la presente, por ejemplo, cáncer prostático, colorrectal, pancreático, de cuello uterino, gástrico, de ovario, de cabeza o de pulmón. Los inhibidores de IDO a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, 1 -metiltriptófano, indoximod (NewLink Genetics) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos N.os NCT01191216; NCT01792050) y iNc B024360 (Incyte Corp.) (remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos N.os NCT01604889; NCT01685255).

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un modulador de células supresoras de origen mieloide (MDSC, por sus siglas en inglés). Las MDSC se acumulan en la periferia y en el sitio tumoral de muchos tumores sólidos. Estas células suprimen las respuestas de linfocitos T, y de esta manera obstaculizan la eficacia de la terapia con células que expresan c A r . Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que la administración de un modulador de MdSc potencia la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente. En un caso, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en la presente, por ejemplo, glioblastoma. Los moduladores de MDSC a modo de ejemplo, incluyen, sin carácter limitante, MCS110 y BLZ945. MCS110 es un anticuerpo monoclonal (mAb) contra el factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF). Remítase, por ejemplo, al Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT00757757. BLZ945 es una molécula de bajo peso molecular inhibidora del receptor del factor 1 estimulador de colonias (CSF1R, por sus siglas ens inglés). Remítase, por ejemplo, a Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72. La estructura de BLZ945 se muestra a continuación.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un agente que inhibe o reduce la actividad de células plasmáticas inmunosupresoras. Se ha mostrado que las células plasmáticas inmunosupresoras impiden la terapia inmunógena dependiente de linfocitos T, tal como oxaliplatino (Shalapour et al., Nature 2015, 521:94- 101). En un caso, las células plasmáticas inmunosupresoras pueden expresar uno o más de: IgA, interleucina (IL)-10 y PD-L1. En un caso, el agente es una células que expresa CAR CD19 o una célula que expresa CAR BCMA.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un polipéptido de tipo interleucina-15 (IL)-15, polipéptido de tipo receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación de ambos, un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetIL-15 es un complejo no covalente heterodimérico de IL-15 e IL-15Ra. hetIL-15 se describe, por ejemplo, en los documentos U.S. 8124084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, y U.S. 2011/0081311. En algunos casos, het-IL-15 se administra por vía subcutánea. En algunos casos, el sujeto padece un cáncer, por ejemplo, un cáncer sólido, por ejemplo, melanoma o cáncer de colon. En algunos casos, el sujeto tiene un cáncer metastásico.

En algunos casos, al sujeto que padece una enfermedad descrita en la presente, por ejemplo, un trastorno hematológico, por ejemplo, AML o MSD, se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un agente, por ejemplo, un agente citotóxico o quimioterápico, una terapia biológica (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo monoclonal o terapia celular) o un inhibidor (por ejemplo, inhibidor de una cinasa). En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un agente citotóxico, por ejemplo, CPX-351 (Celator Pharmaceuticals), citarabina, daunorubicina, vosaroxin (Sunesis Pharmaceuticals), sapacitabina (Cyclacel Pharmaceuticals), idarubicina, o mitoxantrona. CPX-351 es una formulación liposomal que comprende citarabina y daunorubicina con una proporción molar de 5:1. En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un agente hipermetilante, por ejemplo, un inhibidor de la ADN-metiltransferasa, por ejemplo, azacitidina o decitabina. En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con una terapia biológica, por ejemplo, un anticuerpo o terapia celular, por ejemplo, 225Aclintuzumab (Actimab-A; Actinium Pharmaceuticals), Ip H2102 (Innate Pharma/Bristol Myers Squibb), SGN-CD33A (Seattle Genetics), o gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg; Pfizer). SGN-CD33A es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) que comprende un dímero de pirrolobenzodiazepina que se une a un anticuerpo anti-CD33. Actimab-A es un anticuerpo anti-CD33 (lintuzumab) marcado con actinio. IPH2102 es un anticuerpo monoclonal que tiene como diana receptores de tipo inmunoglobulina de linfocitos citolíticos naturales (KIR, por sus siglas en inglés). En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de FLT3, por ejemplo, sorafenib (Bayer), midostaurin (Novartis), quizartinib (Daiichi Sankyo), crenolanib (Arog Pharmaceuticals), PLX3397 (Daiichi Sankyo), AKN-028 (Akinion Pharmaceuticals), o ASP2215 (Astellas). En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de la isocitratodeshidrogenasa (IDH), por ejemplo, AG-221 (Celgene/Agios) or AG-120 (Agios/Celgene). En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un regulador del ciclo celular, por ejemplo, inhibidor de la cinasa tipo polo 1 (Plk1, por sus siglas en inglés), por ejemplo, volasertib (Boehringer Ingelheim); o un inhibidor de la cinasa 9 dependiente de ciclinas (Cdk9), por ejemplo, alvocidib (Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis). En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de la red de señalización del receptor de linfocitos B, por ejemplo, un inhibidor del linfoma de linfocitos B 2 (Bcl-2), por ejemplo, venetoclax (Abbvie/Roche); o un inhibidor de la tirosina-cinasa de Bruton (Btk, por sus siglas en inglés), por ejemplo, ibrutinib (Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical). En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con un inhibidor de la aminopeptidasa M1, por ejemplo, tosedostat (CTI BioPharma/Vernalis); un inhibidor de la histona-desacetilasa (HDAC, por sus siglas en inglés), por ejemplo, pracinostat (MEI Pharma); un inhibidor de múltiples cinasas, por ejemplo, rigosertib (Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio); o un agonista inverso de CXCR4 peptídico, por ejemplo, BL-8040 (BioLineRx). En algunos casos, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR que tiene como diana CD123 combinada con una célula que expresa CAR que tiene como diana un antígeno que no es CD123, por ejemplo, CLL-1, BCMA, CD33, CD19, FLT-3 o receptor de folato beta.

En otra realización, los sujetos reciben una infusión de las composiciones con células que expresan CAR CD123 de la presente invención antes del trasplante de células, por ejemplo, trasplante de células madre alogénicas. En una realización preferida, las células que expresan CAR-CD123 expresan de manera transitoria CAR CD123, por ejemplo, mediante electroporación con un ARNm de CAR CD123, conforme al cual la expresión del CD123 se hace terminar antes de la infusión de células madre del donante para evitar el fracaso del injerto.

Algunos pacientes pueden experimentar reacciones alérgicas a los compuestos de la presente invención y/o otro(s) agente(s) anticanceroso(s) durante o después de la administración; por lo tanto, a menudo se administran agentes antialérgicos para minimizar el riesgo de una reacción alérgica. Los agentes antialérgicos incluyen corticosteroides, tales como dexametasona (por ejemplo, Decadron®), beclometasona (por ejemplo, Beclovent®), hidrocortisona (también conocida como cortisona, succinado de hidrocortisona sódica, fosfato de hidrocortisona sódica, que se comercializa con los nombres comerciales Ala-Cort®, fosfato de hidrocortisona, Solu-Cortef®, Hydrocort Acetate® y Lanacort®), prednisolona (que se comercializa con los nombres comerciales Delta-Cortel®, Orapred®, Pediapred® y Prelone®), prednisona (que se comercializa con las denominaciones comerciales Deltasone®, Liquid Red®, Meticorten® y Orasone®), metilprednisolona (también conocida como 6-metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinado de metilprednisolona sódica, que se comercializa con las denominaciones comerciales Duralone®, Medralone®, Medrol®, M-Prednisol® y Solu-Medrol®); antihistamínicos, tales como difenhidramina (por ejemplo, Benadryl®), hidroxizina, y ciproheptadina; y broncodilatadores, tales como los agonistas del receptor beta-adrenérgico, albuterol (por ejemplo, Proventil®), y terbutalina (Brethine®).

Algunos pacientes pueden experimentar náuseas durante y después de la administración del compuesto de la presente invención y/u otro(s) agente(s) anticanceroso(s); por lo tanto, se utilizan antieméticos para prevenir las náuseas (estómago superior) y vómitos. Los antieméticos adecuados incluyen aprepitant (Emend®), ondansetrón (Zofran®), granisetrón HCl (Kytril®), lorazepam (Ativan®, dexametasona (Decadron®), proclorperazina (Compazine®), casopitant (Rezonic® y Zunrisa®), y combinaciones de estos.

A menudo se prescribe medicación para aliviar el dolor experimentado durante el periodo de tratamiento para hacer que el paciente esté más cómodo. A menudo se utilizan analgésicos sin receta médica tales como Tylenol®. Sin embargo, los analgésicos opioides tales como hidrocodona/paracetamol o hidrocodona/acetaminofeno (por ejemplo, Vicodin®), morfina (por ejemplo, Astramorph® o Avinza®), oxicodona (por ejemplo, OxyContin® o Percocet®), clorhidrato de oximorfona (Opana®), y fentanilo (por ejemplo, Duragesic®) también son útiles para el dolor moderado o grave.

En un intento de proteger las células normales de la toxicidad del tratamiento y de limitar la toxicidad a los órganos, se pueden utilizar como una terapia complementaria agentes citoprotectores (tales como neuroprotectores, antioxidantes, cardioprotectores, neutralizadores de la extravasación de antraciclina, nutrientes y similares). Los agentes citoprotectores adecuados incluyen amifostina (Ethyol®), glutamina, dimesna (Tavocept®), mesna (Mesnex®), dexrazoxano (Zinecard® o Totect®), xaliprodeno (Xaprila®), y leucovorina (tambien conocida como laucovorina cálcica, factor citrovorum y ácido folínico).

La estructura de los compuestos activos identificados con números de código, denominaciones comerciales o genéricas se puede consultar en la edición actual del compendio estándar «The Merck Index» o en bases de datos, por ejemplo, Patents International (por ejemplo, IMS World Publications).

Los compuestos mencionados anteriormente, que se pueden utilizar combinados con un compuesto de la presente invención, se pueden preparar y administrar tal como se describe en la técnica, tal como en los documentos citados anteriormente.

En un caso, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, un compuesto de la presente divulgación) o una sal farmacéuticamente aceptable de este junto con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración a un sujeto humano o animal, ya sea solo o junto con otros agentes anticancerosos.

En un caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a sujetos humanos y animales que padecen una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer. La presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto humano o animal que necesita un tratamiento de este tipo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, un compuesto de la presente divulgación) o un sal farmacéuticamente aceptable de este, ya sea solo o combinado con otros agentes anticancerosos.

En particular, las composiciones se formularán juntas como un agente terapéutico combinado o se administrarán por separado.

En la terapia combinada, el compuesto de la presente invención y otro(s) agente(s) anticanceroso(s) se pueden administrar de manera simultánea, a la vez o de manera secuencial sin límites de tiempo específicos, donde una administración de este tipo proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente.

En una realización preferida, el compuesto de la presente invención y el(los) otro(s) agente(s) anticanceroso(s) se administran generalmente de manera secuencial en cualquier orden por infusión o vía oral. La pauta posológica puede variar dependiendo del estadio de la enfermedad, forma física del paciente, perfiles de seguridad de los fármacos individuales y tolerancia de los fármacos individuales, así como también otros criterios muy conocidos por el médico especialista y médico(s) general(es) que administran la combinación. El compuesto de la presente invención y otro(s) agente(s) anticanceroso(s) se pueden administrar con una separación entre ellos de como máximo minutos, horas, días o incluso semanas dependiendo del ciclo particular que se está utilizando para el tratamiento. Además, el ciclo podría incluir la administración de un fármaco más a menudo que el otro durante el ciclo de tratamiento y con dosis diferentes por administración del fármaco.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan kits que incluyen uno o más compuestos de la presente divulgación y un miembro de la combinación tal como se divulgan en la presente. Los kits representativos incluyen (a) un compuesto de la presente divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable de este, (b) al menos un miembro de la combinación, por ejemplo, tal como se ha indicado anteriormente, conforme a lo cual un kit de este tipo puede comprender un prospecto u otra ficha técnica que incluye directrices para la administración.

Un compuesto de la presente invención también se puede utilizar para conseguir una mejora en combinación con procesos terapéuticos conocidos, por ejemplo, la administración de hormonas o radiación especialmente. Un compuesto de la presente invención se puede utilizar en particular como un radiosensibilizador, especialmente para el tratamiento de tumores que muestran poca sensibilidad a la radioterapia.

En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que reduce o mejora un efecto secundario asociado con la administración de una célula que expresa CAR. Los efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa CAR incluyen, sin carácter limitante, CRS y la linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH, por sus siglas en inglés), también denominada Síndrome de Activación de Macrófagos (MAS, por sus siglas en inglés). Los síntomas de CRS incluyen fiebre alta, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia y similares. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos inespecíficos tales como fiebre, fatiga, anorexia, mialgias, artralgias, náuseas, vómitos y cefaleas. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos cutáneos tales como sarpullido. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos gastrointestinales tales como náuseas, vómitos y diarrea. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos respiratorios tales como taquipnea e hipoxemia. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos cardiovasculares tales como taquicardia, presión arterial diferencial amplia, hipotensión, aumento del gasto cardiaco (temprano) y potencialmente disminución del gasto cardiaco (tardío). CRS puede incluir señales y síntomas clínicos de coagulación tales como d-dímero elevado, hiprofibrinogenemia con o sin hemorragia. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos renales tales como azotemia. CRS puede incluir señales y síntomas clínicos hepáticos tales como transaminitis e hiperbilirrubinemia. CRS puede incluir señales y síntomas neurológicos tales como cefaleas, cambios del estado mental, confusión, delirio, dificultad para encontrar palabras o afasia clara, halucinaciones, temblores, dismetría, marcha alterada y convulsiones.

En consecuencia, los métodos descritos en la presente pueden comprender administrar una célula que expresa CAR descrita en la presente a un sujeto y administrar adicionalmente uno o más agentes para gestionar niveles elevados de un factor soluble resultante del tratamiento con una célula que expresa CAR. En un caso, el factor soluble elevado en el sujeto es uno o más de IFN-^y, TNFa, IL-2 e IL-6. En un caso, el factor elevado en el sujeto es uno o más de IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 y fraktalkina. Por lo tanto, un agente administrado para tratar este efecto secundario puede ser un agente que neutralice uno o más de estos factores solubles. En un caso, el agente que neutraliza uno o más de estas formas solubles es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este. Los ejemplos de agentes de este tipo incluyen, sin carácter limitante, un esteroide (por ejemplo, corticosteroide), un inhibidor de TNFa y un inhibidor de IL-6. Un ejemplo de un inhibidor de TNFa es una molécula de anticuerpo anti-TNFa tal como infliximab, adalimumab, certolizumab pegol y golimumab. Otro ejemplo de un inhibidor de TNFa es una proteína de fusión tal como entanercept. La molécula de bajo peso molecular inhibidora de TNFa incluye, sin carácter limitante, derivados de xantina (por ejemplo, pentoxifilina) y bupropión. Un ejemplo de un inhibidor de ⁱL-6 es una molécula de anticuerpo anti-IL-6 tal como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, y FM101. En un caso, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra.

En algunas realizaciones, al sujeto se le administra un corticosteroide, tal como, por ejemplo, metilprednisolona, hidrocortisona, entre otros.

En algunas realizaciones, al sujeto se le administra un vasopresor, tal como, por ejemplo, norepinefrina, dopamina, fenilefrina, epinefrina, vasopresina o una combinación de estas.

En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente antipirético. En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente analgésico.

En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que potencie la actividad de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora, por ejemplo, el agente es un inhibidor de puntos de control. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, muerte programada 1 (PD1), pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, p D-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, por inhibición a nivel de ADN, ARN o proteínas, puede optimizar el comportamiento de una célula que expresa CAR. En algunas realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNbc, por ejemplo, un ARNip o ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa con dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en la presente para inhibir la expresión de una molécula inhibidora en la célula que expresa c A r . En una realización, el inhibidor es un ARNhc. En una realización, la molécula inhibidora es inhibida dentro de una célula que expresa CAR. En estas realizaciones, una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula inhibidora está enlazada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes del CAR.

En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está ligada operablemente a un promotor, por ejemplo, un promotor obtenido a partir de H1 o U6, de modo que la molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T se expresa, por ejemplo, se expresa dentro de una célula que expresa CAR. Remítase, por ejemplo, a Tiscornia G., «Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA», capítulo 3, en Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann y Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU., 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está presente en el mismo vector, por ejemplo, un vector lentivírico, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización de este tipo, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está ubicada en el vector, por ejemplo, el vector lentivírico, en 5' o 3' respecto al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. La molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T se puede transcribir en la misma dirección o en una dirección diferente al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes del CAR.

En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está presente en un vector diferente al vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T se expresa de manera transitoria dentro de una célula que expresa CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T está integrada de manera estable en el genoma de una célula que expresa c A r . Las Figuras 51A-51E muestran ejemplos de vectores para expresar un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR con una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe la función de los linfocitos T.

A continuación se proporcionan ejemplos de moléculas de ARNbc útiles para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T, donde la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de los linfocitos T es PD-1.

A continuación en la Tabla 16 se proporcionan los nombres de los agentes de ARNi para PDCD1 (PD1) (obtenidos de su posición en la secuencia génica de PDCD1 de ratón NM_008798.2), junto con las SEQ ID NOs: 216-263 que representan la secuencia de ADN. En esta tabla están presentes tanto las secuencias sentido (S) como antisentido (AS) como secuencias de 19-mer y 21-mer. También cabe señalar que la posición (PoS, por ejemplo, 176) se obtiene del número de la posición en la secuencia génica de PDCD1 de ratón NM_008798.2. Las SEQ ID Nos se indican en grupos de 12 que corresponden a las secuencias «sentido 19» SEQ ID NOs: 608-619; «sentido 21» SEQ ID NOs: 620-631; «antisentido 21» SEQ ID NOs: 632-643; «antisentido 19» SEQ ID NOs: 644-655.

Tabla 16. Secuencias de ARNhc ara PDCD1 PD1 de ratón

A continuación en la Tabla 17 se proporcionan los nombres de los agentes de ARNi para PDCD1 (PD1) (obtenidos de su posición en la secuencia génica de PDCD1 humana, junto con las SEQ ID NOs. 264-311 que representan la secuencia de ADN. Están presentes tanto las secuencias sentido (S) como antisentido (AS) como secuencias de 19-mer y 21-mer. Las SEQ ID Nos se indican en grupos de 12 que corresponden a las secuencias «sentido 19» SEQ ID NOs: 656-667; «sentido 21» SEQ ID NOs: 668-679; «antisentido 21» SEQ ID NOs: 680-691; «antisentido 19» SEQ ID NOs: 692-703.

Tabla 17. Secuencias de ARNhc ara PDCD1 PD1 humano

En una realización, el inhibidor de una señal inhibidora puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una molécula inhibidora. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a PD1, PD-L1, PD-L2 o CTLA4 (por ejemplo, ipilimumab (también denominado MDX-010 y MDX-101, y comercializado como Yervoy®; Bristol -Myers Squibb; Tremelimumab (anticuerpo monoclonal IgG2 disponible de Pfizer, conocido anteriormente como ticilimumab, c P-675,206). ). En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a TIM3. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a LAG3. En algunos casos, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR, por ejemplo, inhibidor de una molécula inhibidora, se administra combinado con un CAR alogénico, por ejemplo, un CAR alogénico descrito en la presente (por ejemplo, descrito en la sección de CAR alogénico de la presente).

PD-1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha mostrado que dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2 reducen de manera regulada la activación de linfocitos T tras unirse a PD-1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al.

2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1.

En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de PD-1, PD-L1 y PD-L2 y estos se pueden utilizar combinados con c Ar de la presente invención descritos en la presente. Por ejemplo, nivolumab (también denominado BMS-936558 o MDX1106; Bristol-Myers Squibb) es un anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humano que bloquea de manera específica PD-1. Nivolumab (clon 5C4) y otros anticuerpos monoclonales humanos que se unen de manera específica a PD-1 se divulgan en los documentos US 8008449 y WO2006/121168. Pidilizumab (C^t-011; Cure Tech) es un anticuerpo monoclonal IgG1k humanizado que se une a PD-1. Pidilizumab y otros anticuerpos monoclonales anti-PD-1 humanizados se divulgan en el documento WO2009/101611. Pembrolizumab (conocido anteriormente como lambrolizumab, y también denominado MK03475; Merck) es un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado que se une a PD-1. Pembrolizumab y otros anticuerpos anti-PD-1 humanizados se divulgan en los documentos US 8354509 y WO2009/114335. MEDI4736 (Medimmune) es un anticuerpo monoclonal humano que se une a PDL1 e inhibe la interacción del ligando con PD1. MDPL3280A (Genentech / Roche) es un anticuerpo monoclonal IgG1 optimizado para Fc humano que se une a PD-L1. MDPL3280A y otros anticuerpos monoclonales humanos contra PD-L1 se divulgan en la Patente de EE. UU. N.°: 7943743 y la Publicación de EE. UU. N.°: 20120039906. Otros agentes de unión anti-PD-L1 incluyen YW243.55.S70 (regiones variables de la cadena pesada y ligera se muestran en las SEQ ID NOs 20 y 21 en el documento WO2010/077634) y MDX-1 105 (también denominado BMS-936559, y, por ejemplo, agentes de unión anti-PD-L1 divulgados en el documento WO2007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; por ejemplo, divulgado en el documento WO2010/027827 y WO2011/066342), es un receptor soluble de fusión PD-L2 Fc que bloquea la interacción entre PD-1 y B7-H1. Otros anticuerpos anti-PD-1 incluyen AMP 514 (Amplimmune), entre otros, por ejemplo, anticuerpos anti-PD-1 divulgados en los documentos US 8609089, US 2010028330 y/o US 20120114649.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de este es una molécula de anticuerpo anti-PD-1 tal como se describe en el documento US2015/0210769, titulado «Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof». En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-1 incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR (o de manera global todas las CDR) de una región variable de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo elegido entre cualquiera de BAP049-hum01, BAP049-hum02, BAP049-hum03, BAP049-hum04, BAP049-hum05, BAP049-hum06, BAP049-hum07, BAP049-hum08, BAP049-hum09, BAP049-hum10, BAP049-hum11, BAP049-hum12, BAP049-hum13, BAP049-hum14, BAP049-hum15, BAP049-hum16, BAP049-Clon-A, BAP049-Clon-B, BAP049-Clon-C, BAP049-Clon-D o BAP049-Clon-E; o tal como se describe en la Tabla 1 del documento US 2015/0210769, o codificado por la secuencia de nucleótidos de la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente; o CDR estrechamente relacionadas, por ejemplo, CDR que son idénticas o que tienen al menos una alteración aminoacídica, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o inserciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).

En otra realización más, la molécula de anticuerpo anti-PD-1 comprende al menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo descrito en la presente, por ejemplo, un anticuerpo elegido entre cualquiera de BAP049-hum01, BAP049-hum02, BAP049-hum03, BAP049-hum04, BAP049-hum05, BAP049-hum06, BAP049-hum07, BAP049-hum08, BAP049-hum09, BAP049-hum10, BAP049-hum11, BAP049-hum12, BAP049-hum13, BAP049-hum14, BAP049-hum15, BAP049-hum16, BAP049-Clon-A, BAP049-Clon-B, BAP049-Clon-C, BAP049-Clon-D o BAP049-Clon-E; o tal como se describe en la Tabla 1 del documento US 2015/0210769, o codificado por la secuencia de nucleótidos de la Tabla 1; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

TIM3 (linfocito T inmunoglobulina-3) también regula de manera negativa la función de los linfocitos T, especialmente en linfocitos T1 citotóxicos CD8+ y linfocitos auxiliares T1 CD4+ que segregan IFN-g, y desempeña una función crucial en el agotamiento de los linfocitos T. La inhibición de la interacción entre TIM3 y sus ligandos, por ejemplo, galectina-9 (Gal9), fosfatidilserina (PS) y HMGB1, puede incrementar la respuesta inmunitaria. En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de TIM3 y sus ligandos y estos se pueden utilizar combinados con un CAR CD19 descrito en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, moléculas de bajo peso molecular o inhibidores peptídicos que tienen como diana TlM3 se unen al dominio IgV de TIM3 para inhibir la interacción con sus ligandos. En los documentos WO2013/006490 y US20100247521 se divulgan anticuerpos y péptidos que inhiben TIM3. Otros anticuerpos anti-TIM3 incluyen versiones humanizadas de RMT3-23 (divulgado en Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551), y el clon 8B.2C12 (divulgado en Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). En el documento US20130156774 se divulgan anticuerpos biespecíficos que inhiben TIM3 y PD-1.

En una realización, el anticuerpo anti-TIM3 o fragmento de este es una molécula de anticuerpo anti-TIM3 tal como se describe en el documento US2015/0218274, titulado «Antibody Molecules to TIM3 and Uses Thereof». En una realización, la molécula de anticuerpo anti-TIM3 incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR (o de manera global todas las CDR) de una región variable de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo elegido entre cualquiera de ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23; o tal como se describe en las Tablas 1-4 del documento US 2015/0218274; o codificado por la secuencia de nucleótidos de las Tablas 1-4; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, o CDR estrechamente relacionadas, por ejemplo, CDR que son idénticas o que tienen al menos una alteración aminoacídica, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o inserciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).

En otra realización más, la molécula de anticuerpo anti-TIM3 comprende al menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo descrito en la presente, por ejemplo, un anticuerpo elegido entre cualquiera de ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23; o tal como se describe en las Tablas 1-4 del documento US 2015/0218274; o codificado por la secuencia de nucleótidos de las Tablas 1-4; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más) a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En otras realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR es un inhibidor de CEACAM (por ejemplo, inhibidor de CEACa M-1, CEACAM-3, y/o CEACAM-5). En una realización, el inhibidor de CEACAM es una molécula de anticuerpo anti-CEACAM. Se describen anticuerpos anti-CEACAM-1 a modo de ejemplo en los documentos WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 y WO 2014/022332, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal 34B1, 26H7, y 5F4; o una forma recombinante de estos tal como se describe, por ejemplo, en los documentos US 2004/0047858, US 7132255 y WO 99/052552. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM se une a CEACAM-5 tal como se describe en, por ejemplo, Zheng et al. PLoS One. 2 de septiembre de 2010;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), o presenta reactividad cruzada con CEa Ca M-1 y CEACAM-5 tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2013/054331 y US 2014/0271618.

Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que las moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM), tales como CEACAM-1 y CEACAM-5, median, al menos en parte, en la inhibición de la respuesta inmunitaria antitumoral (remítase, por ejemplo, a Markel et al. J Immunol. 15 de marzo de 2002;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 1 de noviembre de 2006;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. febrero de 2009;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. febrero de 2010;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. junio de 2012;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 1 de junio de 2005;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2 de septiembre de 2010;5(9). pii: e12529). Por ejemplo, se ha descrito CEACAM-1 como un ligando heterófilo para TIM-3 y como una molécula que desempeña una función en la tolerancia de los linfocitos T y agotamiento de estos mediados por TIM-3 (remítase, por ejemplo, al documento WO 2014/022332; Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848). En algunas realizaciones, se ha mostrado que el bloqueo conjunto de CEACAM-1 y TIM-3 potencia una respuesta inmunitaria antitumoral en modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal (remítase, por ejemplo, al documento WO 2014/022332; Huang, et al. (2014), mencionado anteriormente). En otras realizaciones, el bloqueo conjunto de CEACAM-1 y PD-1 reduce la tolerancia de los linfocitos T tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2014/059251. Por lo tanto, se pueden utilizar inhibidores de CEACAM con los otros inmunomoduladores descritos en la presente (por ejemplo, inhibidores anti-PD-1 y/o anti-TIM-3) para potenciar la respuesta inmunitaria contra un cáncer, por ejemplo, melanoma, un cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC), un cáncer de vejiga, un cáncer de colon, un cáncer ovárico y otros cánceres tal como se describe en la presente.

LAG3 (gen-3 de activación de linfocitos o CD223) es una molécula de la superficie de las células expresada en linfocitos T y linfocitos B activados que ha mostrado que desempeña una función en el agotamiento de los linfocitos T CD8+. En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de LAG3 y sus ligandos y estos se pueden utilizar combinados con un CAR CD19 descrito en la presente. Por ejemplo, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) es un anticuerpo monoclonal que tiene como diana LAG3. IMP701 (Immutep) es un anticuerpo antagonista contra LAG3 e IMP731 (Immutep y GlaxoSmithKline) es un anticuerpo de disminución contra LAG3. Otros inhibidores de LAG3 incluyen IMP321 (Immutep), que es una proteína de fusión recombinante de una porción soluble de LAG3 e Ig que se une a moléculas MHC de clase II y activa las células presentadoras de antígeno (APC). Se divulgan otros anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO2010/019570.

En algunas realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR puede ser, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, donde el primer dominio es una molécula inhibidora, o fragmento de esta, y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de señalización intracelular como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el polipéptido que se asocia con una señal positiva puede incluir un dominio coestimulador de CD28, CD17, ICOS, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de CD28, CD27 y/o ICOS, y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, de CD3 zeta, por ejemplo, como se describe en la presente. En una realización, la proteína de fusión es expresada por la misma célula que expresó el CAR. En otra realización, la proteína de fusión es expresada por una célula, por ejemplo, un linfocito T que no expresa un CAR CD123.

En una realización, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR descrita en la presente es miR-17-92.

En un caso, el agente que potencia la actividad de un CAR descrito en la presente es una citocina. Las citocinas tienen importantes funciones relacionadas con la expansión, diferenciación, supervivencia y homeostasis de linfocitos T. Las citocinas que se pueden administrar al sujeto que recibe una célula que expresa CAR descrita en la presente incluyen: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18 e IL-21, o una combinación de estas. En casos preferidos, la citocina administrada es IL-7, IL-15 o IL-21, o una combinación de estas. La citocina se puede administrar una vez al día o más de una vez al día, por ejemplo, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. La citocina se puede administrar durante más de un día, por ejemplo, la citocina se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. Por ejemplo, la citocina se administra una vez al día durante 7 días.

En algunos casos, la citocina se adminstra combinada con linfocitos T que expresan CAR. La citocina se puede administrar de manera simultánea o a la vez que los linfocitos T que expresan c Ar , por ejemplo, administrarse en el mismo día. La citocina se puede preparar en la misma composición farmacéutica que los linfocitos T que expresan CAR, o se puede preparar en una composición farmacéutica separada. Como alternativa, la citocina se puede administrar poco después de la administracion de los linfocitos T que expresan CAR, por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de los linfocitos T que expresan c Ar . En los casos donde la citocina se administra en una pauta posológica que se produce a lo largo de más de un día, el primer día de la pauta posológica de la citocina puede ser el mismo día de la administración de los linfocitos T que expresan CAR, o el primer día de la pauta posológica de la citocina puede ser 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de los linfocitos T que expresan CAR. En un caso, en el primer día, los linfocitos T que expresan CAR se administran al sujeto, y en el segundo día, se administra una citocina una vez al día durante los siguientes 7 días. En un caso preferido, la citocina que se va a administrar combinada con linfocitos T que expresan CAR es IL-7, IL-15 o IL-21.

En otros casos, la citocina se administra un periodo de tiempo después de la administración de células que expresan CAR, por ejemplo, al menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 1 año o más después de la administración de las células que expresan CAR. En un caso, la citocina se administra después de evaluar la respuesta del sujeto a las células que expresan CAR. Por ejemplo, al sujeto se le administran células que expresan CAR de acuerdo con la dosificación y pautas descritas en la presente. La respuesta del sujeto a la terapia con células que expresan CAR se evalúa 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 1 año o más después de la administración de células que expresan CAR, utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente, incluidas la inhibición del crecimiento tumoral, reducción de las células tumorales circulantes o regresión tumoral. A los sujetos que no muestran una respuesta suficiente a la terapia con células que expresan CAR se les puede administrar una citocina. La administración de la citocina al sujeto que tiene una respuesta subóptima a la terapia con células que expresan CAR mejora la eficacia de las células que expresan CAR o la actividad anticancerosa. En un caso preferido, la citocina administrada después de la administración de las células que expresan CAR es IL-7.

Combinación con inhibidores de CD19

Los métodos y composiciones divulgados en la presente se pueden utilizar combinados con un inhibidor de CD19. En algunas realizaciones, las células que contienen CARCD123 y el inhibidor de CD19 (por ejemplo, una o más células que expresan una molécula CAR que se une a CD19, por ejemplo, una molécula CAR que se une a CD19 descrita en la presente) se administran de manera simultánea o a la vez o de manera secuencial.

En algunas realizacones, las células que contienen CARCD123 y el inhibdor de CD19 se infunden a un sujeto de manera simultánea o a la vez, por ejemplo, se mezclan en el mismo volumen de infusión. Por ejemplo, se mezclan una población de células que contienen CARCD123 y células que contienen CARCD19. Como alternativa, se administra una población de células que coexpresan un CARCD123 y un CARCD19. En otras realizaciones, la administración simultánea comprende la administración separada de las células que contienen CARCD123 y el inhibidor de CD19, por ejemplo, dentro de un intervalo de tiempo predeterminado (por ejemplo, con una separación entre ellos de como máximo 15, 30 o 45 minutos).

En algunas realizaciones, el comienzo de las células que contienen CARCD123 y el comienzo del inhibidor de CD19 tienen una separación entre ellos de como máximo 1, 2, 3, 4, 6, 12, 18 o 24 horas, o tienen una separación entre ellos de como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 60, 80 o 100 días. En algunas realizaciones, el final del suministro de las células que contienen CARCD123 y el final del suministro del inhibidor de CD19 tienen una separación entre ellos de como máximo 1,2, 3, 4, 6, 12, 18 o 24 horas, o tienen una separación entre ellos de como máximo 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 60, 80 o 100 días. En algunas realizaciones, la superposición en lo que se refiere a la administración entre el del suministro de las células que contienen CARCD123 (por ejemplo, infusión) y el final del suministro del inhibidor de CD19 (por ejemplo, infusión) es de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 minutos. En una realización, el inhibidor de CD19 se administra antes que las células que contienen CARCD123. En otras realizaciones, las células que contienen CARCD123 se administran antes que el inhibidor de CD19.

En algunas realizaciones, las células que contienen CARCD123 se administran mientras el inhibidor de CD19 (por ejemplo, una o más células que expresan una molécula de CARCD19) está presente (por ejemplo, células que se están expandiendo) en el sujeto. En otras realizaciones, el inhibidor de CD19 (por ejemplo, una o más células que expresan una molécula de CARCD19) se administran mientras que las células que contienen CARCD123 (por ejemplo, células que se están expandiendo) están presentes en el sujeto.

Un inhibidor de CD19 incluye, sin carácter limitante, una célula que expresa CAR CD19, por ejemplo, un linfocito CART CD19 o un anticuerpo anti-CD19 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD19 mono- o biespecífico) o un fragmento o conjugado de este.

En un caso, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con una célula CAR CD19 (por ejemplo, linfocito CART) (por ejemplo, CTL019, por ejemplo, como se describe en el documento WO2012/079000).

En otros casos, la célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con una célula CAR CD19 (por ejemplo, linfocito CART) que incluye un dominio de unión al antígeno humanizado como se describe en el documento WO2014/153270 (por ejemplo, Tabla 3 del documento WO2014/153270).

El inhibidor de CD19 (por ejemplo, una primera célula que expresa CAR CD19) y una segunda célula que expresa CAR CD123 pueden ser expresados por el mismo tipo o tipos diferentes de células. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula que expresa CAR CD19 es un linfocito T CD4+ y la célula que expresa un CAR CD123 es un linfocito T CD8+, o la célula que expresa un CAR CD19 es un linfocito T CD8+ y la célula que expresa CAR CD123 es un linfocito T CD4+. En otras realizaciones, la célula que expresa CAR CD19 es un linfocito T y la célula que expresa un CAR CD123 es un linfocito NK, o la célula que expresa un CAR CD19 es un linfocito NK y la célula que expresa CAR CD123 es un linfocito T. En otras realizaciones, la célula que expresa CAR CD19 y la célula que expresa un CAR CD123 son ambas linfocitos NK o son ambas linfocitos T, por ejemplo, son ambas linfocitos T CD4+ o son ambas linfocitos T CD8+. En otras realizaciones más, una única célula expresa el CAR CD19 y CAR CD123 y esta célula es, por ejemplo, un linfocito NK o un linfocito T tal como linfocito T CD4+ o linfocito T CD8+.

El primer CAR y el segundo CAR pueden comprender el mismo o diferentes dominios de señalización intracelulares. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el CAR CD19 comprende un dominio de señalización de CD3 zeta y el CAR CD123 comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador de 41BB, CD27 o CD28, mientas que en algunas realizaciones, el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador de 41BB, CD27 o CD28 y el CAR CD123 comprende un dominio de señalización de CD3 zeta. En otras realizaciones, cada uno de CAR CD19 y CAR CD123 comprende el mismo tipo de dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta, pero el CAR CD19 y el CAR CD123 comprenden dominios coestimuladores diferentes, por ejemplo, (1) el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador de 41BB y el CAR CD123 comprende un dominio coestimulador diferente, por ejemplo, un dominio coestimulador de CD27, (2) el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador de CD27 y el CAR CD123 comprende un dominio coestimulador diferente, por ejemplo, un dominio coestimulador de 41BB, (3) el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador de 41BB y el c Ar c D123 comprende un dominio coestimulador de CD28, (4) el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador de CD28 y el CAR CD123 comprende un dominio coestimulador diferente, por ejemplo, un dominio coestimulador de 41BB, (5) el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador de CD27 y el CAR CD123 comprende un dominio coestimulador de CD28, o (6) el CAR CD19 comprende un dominio coestimulador de CD28 y el CAR CD123 comprende un dominio coestimulador de CD27. En otra realización, una célula comprende un CAR que comprende tanto un dominio de unión al antígeno CD19 como un dominio de unión al antígeno CD123, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico.

En algunas realizaciones, el sujeto padece leucemia mieloide aguda (AML), por ejemplo, AML positiva para CD19 o AML negativa para CD19. En algunas realizaciones, el sujeto padece un linfoma CD19+, por ejemplo, un linfoma no hodgkiniano (NHL, por sus siglas en inglés) CD19+, un FL CD19+ o un DLBCL CD19+. En algunas realizaciones, el sujeto padece un linfoma CD19+ recurrente o refractario. En algunas realizaciones, se administra quimioterapia linforreductora al sujeto antes, a la vez, o después de la administración (por ejemplo, infusión) de linfocitos CART CD19. En un ejemplo, se administra quimioterapia linforreductora al sujeto antes de la administración de linfocitos CART CD19.

Por ejemplo, la quimioterapia linforreductora finaliza 1-4 días (por ejemplo, 1,2, 3 o 4 días) antes de la infusión de linfocitos CART c D19. En algunas realizaciones, se administran múltiples dosis de linfocitos CART CD19, por ejemplo, como se describe en la presente. Por ejemplo, una única dosis comprende aproximadamente 5 x 108 linfocitos CART CD19. En algunos casos, se administra quimioterapia linforreductora a un sujeto antes, a la vez, o después de la administración (por ejemplo, infusión) de una célula que expresa CAR descrita en la presente, por ejemplo, una célula que expresa CAR sin CD19. En algunos casos, se administra CART CD19 a un sujeto antes, a la vez, o después de la administración (por ejemplo, infusión) de una célula que expresa CAR sin CD19, por ejemplo, una célula que expresa CAR sin CD19 descrita en la presente.

En algunos casos, se administra a un sujeto una célula que expresa CAR descrita en la presente combinada con una célula que expresa CAR CD19, por ejemplo, CTL019, por ejemplo, como se describe en el documento WO2012/079000, para el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de CD123, por ejemplo, un cáncer descrito en la presente. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que la administración de una célula que expresa CAR CD19 combinada con una célula que expresa CAR mejora la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente al tener como diana células cancerosas de linaje temprano, por ejemplo, células madre cancerosas, modulando la respuesta inmunitaria, disminuyendo los linfocitos B reguladores y/o mejorando el microentorno del tumor. Por ejemplo, una célula que expresa CAR c D19 tiene como diana células cancerosas que expresan marcadores del linaje temprano, por ejemplo, células madre cancerosas y células que expresan CD19, mientras que la célula que expresa CAR descrita en la presente tiene como diana células que expresan marcadores del linaje tardío, por ejemplo, CD123. Esta estrategia de preacondicionamiento puede mejorar la eficacia de la célula que expresa CAR descrita en la presente. En tales casos, la célula que expresa CAR CD19 se administra antes, a la vez o después de la administración (por ejemplo, infusión) de una célula que expresa CAR descrita en la presente.

En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente también expresa un CAR que tiene como diana CD19, por ejemplo, un CAR c D19. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente y un CAR CD19 se administra a un sujeto para el tratamiento de un cáncer descrito en la presente, por ejemplo, AML. En un caso, las configuraciones de una o ambas moléculas CAR comprende un dominio de señalización intracelular primaria y un dominio de señalización coestimulador. En otro caso, las configuraciones de una o ambas moléculas CAR comprende un dominio de señalización intracelular primaria y dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 o más, dominios de señalización coestimuladores. En tales casos, la molécula CAR descrita en la presente y el CAR CD19 pueden tener un domino de señalización intracelular primaria idéntico o diferente, dominios de señalización coestimuladores idénticos o diferentes o el mismo número o un número diferente de dominios de señalización coestimuladores. Como alternativa, el CAR descrito en la presente y el CAR CD19 se configuran como un CAR dividido, en el que una de las moléculas CAR comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio coestimulador (por ejemplo, 4-1 b B), mientras que la otra molécula CAR comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular primaria (por ejemplo, CD3 zeta).

En un caso, el CAR descrito en la presente y el segundo CAR, por ejemplo, CAR CD19, están en el mismo vector o están en dos vectores diferentes. En algunos casos, cuando el CAR descrito en la presente y el segundo CAR, por ejemplo, CAR CD19, están en el mismo vector, las secuencias de ácido nucleico que codifican el CAR descrito en la presente y el segundo CAR, por ejemplo, CAR CD19, están en el mismo marco, y están separadas por uno o más sitios de escisión peptídica, por ejemplo, P2A.

En otros casos, la célula que expresa CAR divulgada en la presente se administra combinada con un anticuerpo inhibidor anti-CD19. En un caso, el anticuerpo anti-CD19 es un dominio de unión al antígeno humanizado tal como se describe en el documento WO2014/153270 (por ejemplo, Tabla 3 del documento WO2014/153270), o un conjugado de este. Otros anticuerpos anti-CD19 a modo de ejemplo o fragmentos o conjugados de estos incluyen, sin carácter limitante, blinatumomab, SAR3419 (Sanofi), m Ed I-551 (MedImmune LLC), Combotox, DT2219ARL (Masonic Cancer Center), MOR-208 (también denominado XmAb-5574; MorphoSys), XmAb-5871 (Xencor), MDX-1342 (Bristol-Myers Squibb), SGN-CD19A (Seattle Genetics), y AFM11 (Affimed Therapeutics). Remítase, por ejemplo, a Hammer. MAbs. 4.5(2012): 571-77. Blinatomomab es un anticuerpo biespecífico que comprende dos scFv, uno que se une a CD19 y uno que se une a CD3. Blinatomomab dirige a los linfocitos T para que ataquen a las células cancerosas. Remítase, por ejemplo, a Hammer et al.; Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT00274742 y NCT01209286. MEDI-551 es un anticuerpo anti-CD19 humanizado con un Fc modificado para tener una mejor citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos (ADCC). Remítase, por ejemplo, a Hammer et al.; e Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT01957579. Combotix es una mezcla de inmunotoxinas que se unen a CD19 y CD22. Las inmunotoxinas están compuestas por fragmentos de anticuerpo scFv fusionados con una cadena A de ricina desglucosilada. Remítase, por ejemplo, a Hammer et al.; y Herrera et al. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 31.12(2009):936-41; Schindler et al. Br. J. Haematol. 154.4(2011):471-6. DT2219ARL es una inmunotoxina biespecífica que tiene como diana CD19 y CD22, que comprende dos scFv y una toxina de la difteria truncada. Remítase, por ejemplo, a Hammer et al.; e Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT00889408. SGN-CD19A es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD19 ligado a un agente citotóxico sintético que provoca la muerte de las células, auristatina monometilo F (MMAF, por sus siglas en inglés). Remítase, por ejemplo, a Hammer et al.; e Identificador de Ensayos Clínicos N.os n Ct 01786096 y NCT01786135. SAR3419 es un conjugado anticuerpo anti-CD19-fármaco (ADC) que comprende un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD19 conjugado a un derivado de maitansina mediante un conector escindible.

Remítase, por ejemplo, a Younes et al. J. Clin. Oncol. 30.2(2012): 2776-82; Hammer et al.; Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT00549185; y Blanc et al. Clin Cáncer Res. 2011;17:6448-58. XmAb-5871 es un anticuerpo anti-üD19 humanizado con Fc modificado. Remítase, por ejemplo, a Hammer et al. MDX-1342 es un anticuerpo anti-CD19 con Fc modificado humano con una mejor ADCC. Remítase, por ejemplo, a Hammer et al. En algunos casos, la molécula de anticuerpo es una molécula biespecífica anti-CD19 y anti-CD3. Por ejemplo, AFM11 es un anticuerpo biespecífico que tiene como diana CD19 y CD3. Remítase, por ejemplo, a Hammer et al.; e Identificador de Ensayos Clínicos N.° NCT02106091. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD19 descrito en la presente se conjuga o une de otro modo a un agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterápico, vacuna peptídica (tal como la descrita en Izumoto et al.

2008 J Neurosurg 108:963-971), agente inmunosupresor o agente inmunoablativo, por ejemplo, ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, FK506, CAMPATH, anticuerpo anti-CD3, citoxina, fludarabina, rapamicina, ácido micofenólico, esteroide, FR901228 o citocina.

Combinación con una dosis baja de un inh ib idor de mTOR

Los métodos descritos en la presente utilizan dosis bajas, de potenciación inmunitaria, de inhibidores de mTOR, por ejemplo, inhibidores de mTOR alostéricos, incluidos rapálogos tales como RAD001. La administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR (por ejemplo, una dosis que es insuficiente para suprimir completamente el sistema inmunitario, pero suficiente para mejorar la función inmunitaria) puede optimizar el funcionamiento de las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o células que expresan CAR, en el sujeto. En la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2015/01240036 se describen métodos para medir la inhibición de mTOR, dosificaciones, pautas de tratamiento y composiciones farmacéuticas adecuadas.

En una realización, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR puede dar como resultado uno o más de los siguientes:

i) un descenso en el número de células efectoras inmunitarias positivas para PD-1;

ii) un incremento en el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD-1;

iii) un incremento en la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD-1/células efectoras inmunitarias posivitas para PD-1;

iv) un incremento en el número de linfocitos T vírgenes;

v) un incremento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+ y BCL2, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria;

vi) un descenso en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria; o

vii) un incremento en el número de precursores de los linfocitos T de memoria, por ejemplo, células con cualquiera de las siguientes características o una combinación de estas: incremento de CD62Lelevado, incremento de CD127elevado, incremento de CD27+, disminución de KLRG1 e incremento de BCL2;

y donde cualquiera de los anteriores, por ejemplo, i), ii), iii), iv), v), vi), o vii), ocurre, por ejemplo, al menos de manera transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.

En otra realización, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR da como resultado una proliferación prolongada o mayor de células que expresan CAR, por ejemplo, en cultivo o en un sujeto, por ejemplo, en comparación con células que expresan CAR no tratadas o un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, la proliferación incrementada se asocia con un incremento en el número de células que expresan CAR. Los métodos para medir la proliferación prolongada o mayor se describen en los Ejemplos 9 y 10. En otra realización, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR da como resultado una muerte mayor de células cancerosas por parte de células que expresan CAR, por ejemplo, en cultivo o en un sujeto, por ejemplo, en comparación con células que expresan CAR no tratadas o un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, una muerte de células cancerosas mayor se asocia con un descenso en el volumen tumoral. Los métodos para medir la muerte de células cancerosas mayor se describen en el Ejemplos 2.

En un caso, la célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en la presente, se administra combinada con una dosis baja, de potenciación inmunitaria de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor de mTOR catalítico. Por ejemplo, la administración de la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR se puede iniciar antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; completar antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; iniciar a la vez que la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; superponer con la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente; o continuar después de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente.

Como alternativa, o además, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR puede optimizar las células efectoras inmunitarias que se van a modificar para que expresen una molécula CAR descrita en la presente. En tales casos, la administración de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia o completa antes de la recolección de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que se van a modificar para que expresen una molécula CAR descrita en la presente, de un sujeto.

En otro caso, las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, que se van a modificar para que expresen una molécula CAR descrita en la presente, por ejemplo, después de la recolección de un sujeto, o células efectoras inmunitarias que expresan CAR, por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK, por ejemplo, antes de la administración a un sujeto, se pueden cultivar en presencia de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR.

En una realización, la administración al sujeto de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR comprende administrar, por ejemplo, una vez a la semana, por ejemplo, en una forma farmacéutica de liberación inmediata, de 0,1 a 20, de 0,5 a 10, de 2,5 a 7,5, de 3 a 6 o aproximadamente 5 mg de RAD001, o una dosis bioequivalente de este. En una realización, la administración al sujeto de una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR comprende administrar, por ejemplo, una vez a la semana, por ejemplo, en una forma farmacéutica de liberación sostenida, de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18 o aproximadamente 15 mg de RAD001, o una dosis bioequivalente de este.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos un 5 pero no más de un 90%, al menos un 10 pero no más de un 90%, al menos un 15, pero no más de un 90%, al menos un 20 pero no más de un 90%, al menos un 30 pero no más de un 90%, al menos un 40 pero no más de un 90%, al menos un 50 pero no más de un 90%, al menos un 60 pero no más de un 90%, al menos un 70 pero no más de un 90%, al menos un 5 pero no más de un 80%, al menos un 10 pero no más de un 80%, al menos un 15, pero no más de un 80%, al menos un 20 pero no más de un 80%, al menos un 30 pero no más de un 80%, al menos un 40 pero no más de un 80%, al menos un 50 pero no más de un 80%, al menos un 60 pero no más de un 80%, al menos un 5 pero no más de un 70%, al menos un 10 pero no más de un 70%, al menos un 15, pero no más de un 70%, al menos un 20 pero no más de un 70%, al menos un 30 pero no más de un 70%, al menos un 40 pero no más de un 70%, al menos un 50 pero no más de un 70%, al menos un 5 pero no más de un 60%, al menos un 10 pero no más de un 60%, al menos un 15, pero no más de un 60%, al menos un 20 pero no más de un 60%, al menos un 30 pero no más de un 60%, al menos un 40 pero no más de un 60%, al menos un 5 pero no más de un 50%, al menos un 10 pero no más de un 50%, al menos un 15, pero no más de un 50%, al menos un 20 pero no más de un 50%, al menos un 30 pero no más de un 50%, al menos un 40 pero no más de un 50%, al menos un 5 pero no más de un 40%, al menos un 10 pero no más de un 40%, al menos un 15, pero no más de un 40%, al menos un 20 pero no más de un 40%, al menos un 30 pero no más de un 40%, al menos un 35 pero no más de un 40%, al menos un 5 pero no más de un 30%, al menos un 10 pero no más de un 30%, al menos un 15, pero no más de un 30%, al menos un 20 pero no más de un 30%, o al menos un 25 pero no más de un 30%.

El grado de inhibición de mTOR se puede expresar como, o corresponde al, grado de inhibición de la cinasa P70 S6, por ejemplo, el grado de inhibición de mTOR se puede determinar mediante el nivel de descenso en la actividad de activida cinasa P70 S6, por ejemplo, mediante el descenso en la fosforilación de un sustrato de la cinasa P70 S6. El nivel de inhibición de mTOR se puede evaluar mediante varios métodos, tales como medir la actividad de la cinasa P70 S6 mediante el ensayo Boulay, como se describe en la Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2015/01240036, o como se describe en la Patente de E^e. UU. N.° 7727950; medir el nivel de S6 fosforilado mediante inmunoelectrotransferencia; o evaluar un cambio en la proporción de células efectoras inmuntiarias negativas para PD1 resepcto a células efectoras inmunitarias positivas para PD1.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión «inhibidor de mTOR» se refiere a un compuesto o ligando, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, que inhibe la cinasa mTOR en una célula. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor alostérico. Los inhibidores de mTOR alostéricos incluyen el compuesto tricíclico neutro rapamicina (sirolimus), compuestos relacionados con rapamicina, es decir, compuestos que tienen una similitud funcional y estructural con rapamicina que incluyen, por ejemplo, derivados de rapamicina, análogos de rapamicina (también denominados rapálogos) y otros compuestos macrólidos que inhiben la actividad de mTOR. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor catalítico.

La rapamicina es un antibiótico macrólido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus que tiene la estructura que se muestra en la Fórmula A.

Remítase, por ejemplo, a McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; Patente de EE. UU. N.° 3929992. Existen varios esquemas de numeración propuestos para rapamicina. Para evitar confusión, cuando se nombran análogos de rapamicina específicos en la presente, los nombres se proporcionan haciendo referencia a rapamicina utilizando el esquema de numeración de la fórmula A.

Los análogos de rapamicina útiles en la invención son, por ejemplo, análogos O-sutituidos en los que el grupo hidroxilo del anillo de ciclohexilo de rapamicina es reemplazado por OR1 en el cual R1 es hidroxialquilo, hidroxialcoxialquilo, acilaminoalquilo o aminoalquilo; por ejemplo, RAD001, también conocido como everolimus como se describe en los documentos US 5665772 y WO94/09010. Otros análogos de rapamicina adecuados incluyen los sutituidos en la posición 26 o 28. El análogo de rapamicina puede ser un epímero de un análogo mencionado anteriormente, particularmente un epímero de un análogo sustituido en la posición 40, 28 o 26, y opcionalmente se puede hidrogenar adicionalmente, por ejemplo, como se describe en los documentos US 6015815, WO95/14023 y WO99/15530, por ejemplo, ABT578 también conocido como zotarolimus o un análogo de rapamicina descrito en los documentos US 7091 213, WO98/02441 y WO01/14387, por ejemplo, AP23573 también conocido como ridaforolimus.

Los ejemplos de análogos de rapamicina adecuados para su uso en la presente invención del documento US 5665772 incluyen, sin carácter limitante, 40-O-bencilrapamicina, 40-O-(4'-hidroximetil)bencilrapamicina, 40-O-[4'-(1,2-dihidorxietil)]bencilrapamicina, 40-O-alilrapamicina, 40-O-[3'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)il)prop-2'-en-1'-il]rapamicina, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihidroxipent-2'-en-1'-il)rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetilrapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etilrapamicina, 40-O-(3-hidroxi)propilrapamicina, 40-O-(6-hidroxi)hexilrapamicina, 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etilrapamicina, 40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metilrapamicina, 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]rapamicina, 40-O-(2-acetoxi)etilrapamicina, 40-O-(2-nicotinoiloxi)etilrapamicina, 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etilrapamicina, 40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etilrapamicina, 40-O-[2-(N-metil-N'-piperazinil)acetoxi]etilrapamicina, 39-O-desmetil-39,40-O,O-etilenerapamicina, (26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etilrapamicina, 40-O-(2-aminoetil)rapamicina, 40-O-(2-acetaminoetil)rapamicina, 40-O-(2-nicotinamidoetil)rapamicina, 40-O-(2-(N-metilimidazo-2'-ilcarbetoxamido)etil)rapamicina, 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)rapamicina y 40-O-[2-(4',5'-dicarboetoxi-1,2',3'-triazol-1-il)etil]rapamicina.

Otros análogos de rapamicina útiles en la presente invención son análogos donde el grupo hidroxilo del anillo ciclohexilo de rapamicina y/o el grupo hidroxi en la posición 28 es reemplazado por un grupo hidroxiéster se describen, por ejemplo, análogos de rapamicina en el documento US RE44768, por ejemplo, temsirolimus.

Otros análogos de rapamicina útiles en la presente invención incluyen aquellos donde el grupo metoxi en la posición 16 es reemplazado por otro sustituyente, preferentemente alquiniloxi, bencilo, ortometoxibencilo o clorobencilo (opcionalmente hidroxi-sustituido) y/o donde el grupo mextoxi en la posición 39 se elimina junto con el carbono 39 de manera que el anillo ciclohexilo de la rapamicina se convierte en un anillo ciclopentilo que carece del grupo metioxi de la posición 39; por ejemplo, como se describe en los documentos WO95/16691 y WO96/41807. Los análogos se pueden modificar adicionalmente de modo que el hidroxi en la posición 40 de rapamicina esté alquilado y/o el carbonilo-32 esté reducido.

Los análogos de rapamicina del documento WO95/16691 incluyen, sin carácter limitante, 16-desmetoxi-16-(pent-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-(but-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmtoxi-16-(propargil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi 16-(4-hidroxibut-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-benciloxi-40-0(2-hidroxietil)rapamicina, 16-desmetoxi-16-benciloxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-orto-metoxibencilrapamicina, 16-desmetoxi-40-0-(2-metoxietil)-16-pent-2-inil)oxirrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-formil-42-nor-rapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-hidroximetil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-carboxi-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(4-metilpiperazin-1-il)carbonil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(morfolin-4-il)carbonil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-[N-metil, N-(2-piridin-2-iletil)]carbamoil-42-norrapamicina y 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(ptoluenesulfonilhidrazonometil)-42-norrapamicina.

Los análogos de rapamicina del documento WO96/41807 incluyen, sin carácter limitante, 32-desoxorrapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-desoxorrapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-desoxo-40-0-(2-hidroxietil)rapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-(S)-dihidro-40-0-(2-hidroxietil)rapamicina, 32(S)-dihidro-40-0-(2-metoxi)etilrapamicina y 32(S)-dihidro-40-0-(2-hidroxietil)rapamicina.

Otro análogo de rapamicina adecuado es umirolimus como se describe en el documento US2005/0101624.

RAD001, conocido de otra forma como everolimus (Afinitor®), tiene el nombre químico (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietoxi)-3-metoxiciclohexil]-1-metiletil}-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1,04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentaona.

Ejemplos adicionales de inhibidores de mTOR alostéricos incluyen sirolimus (rapamicina, AY-22989), 40-[3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]rapamicina (también denominado temsirolimus o CCI-779) y ridaforolimus (AP-23573/MK-8669). Otros ejemplos de inhibidores de mTOR alostéricos incluyen zotarolimus (ABT578) y umirolimus.

Como alternativa o de manera adicional, se ha observado que los inhibidores de mTOR competitivos con ATP, catalíticos tienen como diana directamente el dominio cinasa de mTOR y tienen como diana tanto mTORC1 como mTORC2. Existen inhibidores de mTORC1 más eficaces que estos inhibidores de mTOR alostéricos como rapamicina, debido a que modulan respuestas de mTORC1 resistentes a rapamicina tales como la fosforilación de 4EBP1-T37/46 y traducción dependiente de la caperuza.

Los inhibidores catalíticos incluyen: BEZ235 o 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)fenil]propionitrilo, o la forma salina de monotosilato. La síntesis de BEZ235 se describe en el documento WO2006/122806; c Cg 168 (conocido de otro modo como AZD-8055, Chresta, C.M., et al., Cáncer Res, 2010, 70(1), 288 298) que tiene el nombre químico {5-[2,4-bis-((S)-3-metilmorfolin-4-il)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-2-metoxifenil}metanol; 3-[2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N-metilbenzamida (WO09104019); 3-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (WO10051043 y WO2013023184); una N-(3-(N-(3-((3,5-dimetoxifenil)amino)quinoxalino-2-il)sulfamoil)fenil)-3-metoxi-4-metilbenzamida (WO07044729 y WO12006552); PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645) que tiene el nombre químico 1-[4-[4-(dimetilamino)piperidino-1-carbonil]fenil]-3-[4-(4,6-dimorfolino-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea; GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43) que tiene el nombre químico 2,4-difluoro-N-{2-metoxi-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenesulfonamida; ; 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (WO10114484); (E)-N-(8-(6-amino-5-(trifluorometil)piridin-3-il)-1-(6-(2-cianopropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)ilideno)cianamida (WO 12007926).

Ejemplos adicionales de inhibidores de mTOR catalíticos incluyen 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometilfenil)-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (WO2006/122806) y Ku-0063794 (Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42.. Ku-0063794 es un inhibidor específico de la diana en mamíferos de rapamicina (mTOR). WYE-354 es otro ejemplo de un inhibidor de mTOR catalítico (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res.

69(15): 6232-6240).

Los inhibidores de mTOR útiles de acuerdo con la presente invención también incluyen profármacos, derivados, sales farmacéuticamente aceptables o análogos de estos de cualquiera de los anteriores.

Los inhibidores de mTOR, tales como RAD001, se pueden formular para el suministro basándose en métodos muy consolidados en la técnica en función de las dosificaciones particulares descritas en la presente. En paticular, la Patente de EE. UU. 6004973 proporciona ejemplos de formulaciones que se pueden utilizar con los inhibidores de mTOR descritos en la presente.

Métodos y biomarcadores para evaluar la eficacia de CAR o la idoneidad de la muestra

En otro aspecto, la presente divulgación presenta un método para evaluar o monitorizar la eficacia de una terapia con células que expresan CAR (por ejemplo, una terapia con CAR CD123), en un sujeto (por ejemplo, un sujeto que padece cáncer, por ejemplo, un cáncer hematológico), o la idoneidad de una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis) para una terapia con CAR (por ejemplo, una terapia con CAR CD123). El método incluye adquirir un valor de eficacia para la terapia CAR, o idoneidad de la muestra, donde dicho valor es indicativo de la eficacia o idoneidad de la terapia con células que expresan CAR.

En algunos casos, el valor de la eficacia de la terapia con CAR, o idoneidad de la muestra, comprende una medida de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más (la totalidad) de los siguientes:

(i) el nivel o actividad de uno, dos, tres o más (por ejemplo, la totalidad) de los linfocitos Teff en reposo, linfocitos Treg en reposo, linfocitos T más jóvenes (por ejemplo, células CD4 o CD8, o linfocitos T gamma/delta más jóvenes), o linfocitos T de memoria tempranos, o una combinación de estos, en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado);

(ii) el nivel o actividad de uno, dos, tres o más (por ejemplo, la totalidad) de los linfocitos Teff activados, linfocitos Treg activados, linfocitos T más viejos (por ejemplo, células ^cD4 o CD8 más viejas), o linfocitos T de memoria tardíos, o una combinación de estos, en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado);

(iii) el nivel o actividad de un marcador del agotamiento de células inmunitarias, por ejemplo, uno, dos o más inhibidores de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, PD-1, PD-L1, TIM-3 y/o LAG-3) en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado); En un caso, una célula inmunitaria tiene un fenotipo agotado, por ejemplo, coexpresa al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresa PD-1 y TIM-3. En otros casos, una célula inmunitaria tiene un fenotipo agotado, por ejemplo, coexpresa al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresa PD-1 y LAG-3.

(iv) el nivel de actividad de las células efectoras inmunitarias CD27 y/o CD45RO- (por ejemplo, CD27+ CD45RO-), por ejemplo, en una población de linfocitos T CD4+ o CD8+, en una muestra (por ejemplo, una muestra de aféresis o una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado);

(v) el nivel o actividad de uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte o más de los biomarcadores elegidos entre CCL20, IL-17a y/o IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1;

(vi) un nivel o acitividad de citocinas (por ejemplo, calidad del conjunto de citocinas) en una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR, por ejemplo, muestra de producto de tipo célula que expresa CD123; o

(vii) una eficacia de transducción de una célula que expresa CAR en un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la terapia con células que expresan CAR comprende una pluralidad (por ejemplo, una población) de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, por ejemplo, una pluralidad (por ejemplo, una población) de linfocitos T o linfocitos NK, o una combinación de estos. En un caso, la terapia con células que expresan CAR es una terapia con CAR CD123.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la medida de uno o más de (i)-(vii) se obtiene de una muestra de aféresis adquirida del sujeto. La muestra de aféresis se puede evaluar antes de la infusión o reinfusión. En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la medida de de uno o más de (i)-(vii) se obtiene de una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR elaborado, por ejemplo, una muestra de un producto de tipo célula que expresa CAR CD123. El producto de tipo célula que expresa CAR elaborado se puede evaluar antes de la infusión o reinfusión.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, se evalúa el sujeto antes de recibir, durante, o después de recibir la terapia con células que expresan CAR.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la medida de uno o más de (i)-(vii) evalúa el perfil de uno o más de expresión génica, citometría de flujo o expresión de proteínas.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, el método comprende además identificar el sujeto como uno que responde al tratamiento, uno que no responde al tratamiento, uno con recaídas o uno sin recaídas, en función de la medida de uno o más de (i)-(vii).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento) tiene, o se ha identificado que tiene, un nivel o actividad más elevados de uno, dos o más (la totalidad) de GZMK, PPF1BP2 o linfocitos T vírgenes en comparación con un sujeto que no responde al tratamiento.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un nivel o actividad más elevados de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más (por ejemplo, la totalidad) de IL22, IL-2RA, IL-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, linfocitos T efectores o linfocitos T reguladores, en comparación con un sujeto que responde al tratamiento.

En un caso, un sujeto con recaídas es un paciente que tiene, o que se ha identificado que tiene, un nivel mayor de expresión de uno o más de (por ejemplo, 2 , 3, 4 o todos) los siguientes genes, en comparación con sujetos sin recaídas: MIR199A1, MIR1203, uc021ovp, ITm2c , y HLA-DQB1 y/o niveles reducidos de expresión de uno o más de (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o todos) los siguientes genes, en comparación con los sujetos sin recaídas: PPIAL4D, TTTY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNA00185, SULT1E1 y EIF1AY.

En algunos casos de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcenaje más elevado, por ejemplo, más elevado estadísticamente significativo, de linfocitos T CD8+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un porcentaje de linfocitos T CD8+ de un sujeto que no responde al tratamiento.

En algunos casos de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcenaje más elevado de células efectoras inmunitarias CD27+ CD45RO-, por ejemplo, en la población CD8+, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de células efectoras inmunitarias CD27+ CD45RO-.

En algunos casos de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcenaje más elevado, por ejemplo, más elevado estadísticamente significativo, de linfocitos T CD4+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un porcentaje de linfocitos T CD4+ de un sujeto que no responde al tratamiento.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de uno, dos, tres o más de (por ejemplo, todos) linfocitos T^effen reposo, linfocitos T^regen reposo, linfocitos T más jóvenes (por ejemplo, células CD4 o CD8, o linfocitos T gamma/delta más jóvenes), o linfocitos T de memoria tempranos, o una combinación de estos, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de linfocitos Teff en reposo, linfocitos T^regen reposo, linfocitos T más jóvenes (por ejemplo, células CD4 o CD8 más jóvenes) o linfocitos T de memoria tempranos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de uno, dos, tres o más de (por ejemplo, todos) linfocitos Teff activados, linfocitos T^regactivados, linfocitos T más viejos (por ejemplo, células CD4 o CD8 más viejas), o linfocitos T de memoria tardíos, o una combinación de estos, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que responde al tratamiento de linfocitos Teff activados, linfocitos Treg activados, linfocitos T más viejos (por ejemplo, células CD4 o CD8 más viejas) o linfocitos T de memoria tardíos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado del marcador de agotamiento de células inmunitarias, por ejemplo, uno, dos o más inhibidores de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, PD-1, PD-L1, TIM-3 y/o LAG-3). En un caso, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células efectoras inmunitarias que expresan PD-1, PD-L1 o LAG-3 (por ejemplo, linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+) (por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o células CD4+ que expresan CAR) en comparación con el porcentaje de células efectoras inmunitarias que expresan PD-1 o LAG-3 de un sujeto que responde al tratamiento.

En un caso, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células inmunitarias que tienen un fenotipo agotado, por ejemplo, células inmunitarias que coexpresan al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresan PD-1, PD-L1 y/o TIM-3. En otros casos, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células inmunitarias que tienen un fenotipo agotado, por ejemplo, células inmunitarias que coexpresan al menos dos marcadores de agotamiento, por ejemplo, coexpresan PD-1 y LAG-3.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, una población de células CAR CD123+) en comparación con un sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento) en forma de terapia con células que expresan CAR.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ que un sujeto que responde al tratamiento, en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, población de células CAR CD123+).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un fenotipo agotado de PD1/PD-L1+ CAR+ y coexpresión de LAG3 en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, una población de células CAR CD123+).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto que no responde al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, una población de células CAR CD123+) en comparación con el sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se ha identificado que tiene, un porcentaje más elevado de células PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ que los sujetos que responden al tratamiento, en la población de células que expresan CAR (por ejemplo, población de células CAR CD123+).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, la presencia de linfocitos T CD8+ CD27+ CD45RO- en la muestra de aféresis es un factor pronóstico positivo de la respuesta del sujeto a una terapia con células que expresan CAR (por ejemplo, una terapia con CAR CD123).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, un porcentaje elevado de linfocitos T PD1 CAR+ y LAG3+ o TIM3- en una muestra de aféresis es un factor pronóstico deficiente de la respuesta del sujeto a una terapia con células que expresan CAR (por ejemplo, una terapia con CAR CD123).

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, el sujeto que responde al tratamiento (por ejemplo, el sujeto con una repuesta completa o parcial al tratamiento) tiene uno, dos, tres o más (o la totalidad) del siguiente perfil:

(i) tiene un número mayor de células efectoras inmunitarias CD27+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de células efectoras inmunitarias CD27+;

(ii) tiene un número mayor de linfocitos T CD8+ en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de linfocitos T CD8+;

(iii) tiene un número menor de células inmunitarias que expresan uno o más inhibidores de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control escogidos entre PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 o KLRG-1, o una combinación, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de células que expresan uno o más inhibidores de puntos de control; o

(iv) tiene un número mayor de uno, dos, tres, cuatro o más (la totalidad) de linfocitos Teff en reposo, linfocitos Treg en reposo, células CD4 vírgenes, linfocitos de memoria no estimulados o linfocitos T de memoria tempranos, o una combinación de estos, en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un número de un sujeto que no responde al tratamiento de linfocitos Teff en resposo, linfocitos Treg en reposo, células CD4 vírgenes, linfocitos de memoria no estimulados o linfocitos T de memoria tempranos.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, el nivel o actividad de citocinas de (vi) se escoge entre una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (o la totalidad) de la citocina CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSF, IFNy, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 o TNFa, o una combinación de estas. La citocina se puede escoger entre una, dos, tres, cuatro o más (la totalidad) de IL-17a, CCL20, IL2, IL6, o TNFa. En un caso, un mayor nivel o actividad de una citocina se escoge entre una o más de IL-17a y CCL20, es indicativo de una mayor respuesta o menos recaídas.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, una eficacia de transducción de un 15% o superior en (vii) es indicativa de una mayor respuesta o menos recaídas.

En algunos casos de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, una eficacia de transducción inferior a un 15% en (vii) es indicativa de una menor respuesta o más recaídas.

En algunos casos, el sujeto que responde al tratamiento, un sujeto que no responde al tratamiento, un sujeto con recaídas o un sujeto sin recaídas identificado mediante los métodos de la presente se puede evaluar adicionalmente de acuerdo con criterios clínicos. Por ejemplo, un sujeto con una respuesta completa al tratamiento tiene, o se identificado como, un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer que muestra una respuesta completa, por ejemplo, una remisión completa, al tratamiento. Se puede identificar una respuesta completa, por ejemplo, utilizando NCCN Guidelines®, o Cheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999) y Cheson et al., «Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma», J Clin Oncol 25:579-586 (2007), como se describe en la presente. Un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento tiene, o se identificado como, un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer que muestra una respuesta parcial, por ejemplo, una remisión parcial, al tratamiento. Se puede identificar una respuesta parcial, por ejemplo, utilizando NCCN Guidelines®, o los criterios Cheson como se describe en la presente. Un sujeto que no responde al tratamiento tien, o se ha identificado como, un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer, que no muestra una respuesta a un tratamiento, por ejemplo, el paciente padece una enfermedad estable o enfermedad progresiva. Se puede identificar un sujeto que no responde al tratamiento, por ejemplo, utilizando NCCN Guidelines®, o los criterios Cheson como se describe en la presente.

Como alternativa, o en combinación con los métodos divulgados en la presente, responsivo a dicho valor, realizando uno, dos, tres, cuatro o más de:

administrar, por ejemplo, a un sujeto que responde al tratamiento o un sujeto sin recaídas, una terapia con células que expresan CAR;

administrar una dosificación alterada de una terapia con células que expresan CAR;

alterar la programación o evolución temporal de una terapia con células que expresan CAR;

administrar, por ejemplo, a un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento, un agente adicional combinado con una terapia con células que expresan CAR, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control descrito en la presente;

administrar a un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento una terapia que aumenta el número de linfocitos T más jóvenes en el sujeto antes del tratamiento con una terapia con células que expresan CAR;

modificar el proceso de elaboración de una terapia con células que expresan CAR, por ejemplo, enriqueciendo en linfocitos T más jóvenes antes de introducir un ácido nucleico que codifica un CAR, o aumentar la eficacia de transducción, por ejemplo, para un sujeto identificado como un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento;

administrar una terapia alternativa, por ejemplo, para un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con una respuesta parcial al tratamiento o un sujeto con recaídas; o

si el sujeto es, o se ha identificado como, un sujeto que no responde al tratamiento o un sujeto con recaídas, reducir la población de linfocitos Treg y/o característica génica de Treg, por ejemplo, mediante uno o más de disminución de CD25, administración de ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR o una combinación de estos.

En ciertos casos, el sujeto se trata previamente con un anticuerpo anti-GITR. En un cierto caso, el sujeto se trata con un anticuerpo anti-GITR antes de la infusión o reinfusión.

Métodos de sum inistro de biopolímeros

En algunos casos, una o más células que expresan CAR como se divulgan en la presente se pueden administrar o suministrar al sujeto mediante un esqueleto biopolimérico, por ejemplo, un implante biopolimérico. Los esqueletos biopoliméricos pueden reforzar o potenciar el suministro, expansión y/o dispersión de las células que expresan CAR descritas en la presente. Un esqueleto biopolimérico comprende un polímero biocompatible (por ejemplo, no induce sustancialmente una respuesta inflamatoria o inmunitaria) y/o biodegradable que puede ser de origen natural o sintético.

Los ejemplos de biopolímeros adecuados incluyen, sin carácter limtitante, agar, agarosa, alginato, alginato/cemento de fosfato de calcio (CPC, por sus siglas en inglés), beta-galactosidasa (p-GAL), (1,2,3,4,6-pentaacetil-a-D-galactosa), celulosa, quitina, quitosano, colágeno, elastina, gelatina, ácido hialurónico y colágeno, hidroxiapatita, poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (PHBHHx), poli(lactida), poli(caprolactona) (PCL), poli(lactida-co-glicólido) (PLG), óxido de polietileno (PEO), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), óxido de polipropileno (PPO), alcohol polivinílico (PVA), seda, proteína de soja, y aislado de proteína de soja, solo o combinado con cualquier otra composición polimérica, en cualquier concentración y en cualquier proporción. El biopolímero se puede aumentar o modificar con moléculas que fomentan la adhesión o migración, por ejemplo, péptidos que mimetizan colágeno que se unen al receptor de colágeno de los linfocitos, y/o moléculas estimuladoras para potenciar el suministro, expansión o función, por ejemplo, actividad anticancerosa, de las células que se van a suministrar. El esqueleto biopolimérico puede ser inyectable, por ejemplo, una composición en gel, o semisólida o sólida.

En algunos casos, las células que expresan CAR descritas en la presente se siembran en el esqueleto biopolimérico antes del suministro al sujeto. En algunos casos, el esqueleto biopolimérico comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales descritos en la presente (por ejemplo, otra célula que expresa CAR, un anticuerpo o una molécula de bajo peso molecular) o agentes que potencian la actividad de una célula que expresa CAR, por ejemplo, incoporada a los biopolímeros del esqueleto o conjugada con estos. En algunos casos, el esqueleto biopolimérico se inyecta, por ejemplo, por vía intratumoral, o se implanta quirúrgicamente en el tumor o en una distancia del tumor lo suficientemente próxima para mediar en un efecto antitumoral. Se describen ejemplos adicionales de composiciones bipoliméricas y métodos para su suministro en Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101; y el documento WO2014/110591.

Composiciones farmacéuticas y tratamientos

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender una célula que expresa CAR, por ejemplo, una pluralidad de células que expresan CAR, tal como se describe en la presente, combinada con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones, tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención están formuladas en un aspecto para la administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de la administración estarán determinadas por factores tales como el estado del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque se pueden determinar las dosificaciones apropiadas mediante ensayos clínicos.

En una realización, la composición farmacéutica está sustancialmente exenta de, por ejemplo, no hay niveles detectables de un contaminante, por ejemplo, seleccionado del grupo constituido por endotoxina, micoplasma, lentivirus competente para la replicación (RCL), p24, ácido nucleico de VSV-G, gag de HIV, perlas residuales recubiertas anti-CD3/anti-CD28, anticuerpos de ratón, suero humano combinado, albúmina de suero bovino, suero bovino, componentes de medios de cultivo, componentes de plásmidos o células de empaquetamiento de vectores, una bacteria y un hongo. En una realización, la bacteria es al menos una seleccionada del grupo que consiste en Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, y grupo A de Streptococcus pyogenes.

Cuando se indica «una cantidad inmunológicamente eficaz», «una cantidad antitumoral eficaz», «una cantidad inhibidora de tumores eficaz» o «cantidad terapéutica», la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se va a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y el estado del paciente (sujeto). Generalmente se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en la presente se puede administrar con una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, en algunos casos de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos T también se pueden administrar múltiples veces con estas dosificaciones.

En algunos casos, una dosis de células CAR (por ejemplo, células CAR CD123) comprende aproximadamente 1 x 106,

1,1 x 106, 2x106, 3,6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 o 5 x 108 células/kg. En algunos casos, una dosis de células CAR (por ejemplo, células CAR CD123) comprende al menos aproximadamente 1 x 106, 1,1 x 106, 2 x 106, 3,6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1,8 x 107, 2x 1075 x 107, 1 x 108, 2 x 108 o 5 x 108 células/kg. En algunos casos, una dosis de células CAR (por ejemplo, células CAR CD123) comprende hasta aproximadamente 1 x 106, 1,1 x 106, 2 x

106, 3,6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 1075 x 107, 1 x 108, 2 x 108 o 5 x 108 células/kg. En al de células CAR (por ejemplo, células CAR CD123) comprende aproximadamente 1,1 x 106 - 1,8 x 107 células/kg. En algunos casos, una dosis de células CAR (por ejemplo, células c Ar CD123) comprende aproximadamente 1 x 107, 2 x

107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 o 5 x 109 células. En algunos casos, una dosis de células CAR (por ejemplo, células CAR CD123) comprende al menos aproximadamente 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108,

1 x 109, 2 x 109 o 5 x 109 células. En algunos casos, una dosis de células CAR (por ejemplo, células CAR CD123) comprende hasta aproximadamente 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, o 5 x 109 células.

Las células se pueden administrar utilizando técnicas de infusión de uso común en inmunoterapia (remítase, por ejemplo, a Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

En ciertos aspectos, puede resultar deseable administrar linfocitos T activados a un sujeto y posteriormente volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar linfocitos T de esta de acuerdo con la presente invención, y reinfundir al paciente estos linfocitos T activados y expandidos. Este proceso se puede llevar a cabo varias veces cada pocas semanas.

En ciertos aspectos, los linfocitos T se pueden activar a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados aspectos, los linfocitos T se activan a partir de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc,

70cc, 80cc, 90cc o 100cc.

La administración de las composiciones objeto se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, que incluye la inhalación por aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranasal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o por vía intraperitoneal. En un aspecto, la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) de la presente invención se administra a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En un aspecto, la la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T o linfocito n K) de la presente invención se administra mediante inyección i.v. Las composiciones de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) se puede inyectar directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

En un aspecto a modo de ejemplo particular, los sujetos se pueden someter a leucoféresis, donde los leucocitos se recolectan, enriquecen o disminuyen ex vivo para seleccionar y/o aislar las células de interés, por ejemplo, células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK). Estos aislados de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) se pueden expandir mediante métodos conocidos en la técnica y tratar de tal manera que se puedan introducir uno o más constructos CAR de la invención para crear así una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la invención. Los sujetos que lo necesiten se pueden someter posteriormente a un tratamiento estándar con una dosis elevada de quimioterapia, seguida de trasplante de células madre de la sangre periférica. En ciertos aspectos, después o a la vez del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células que expresan CAR expandidas (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la presente invención. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos anteriores que se va a administrar a un paciente variará según la naturaleza precisa de la afección que se esté tratando y el receptor del tratamiento. El escalado de las dosificaciones para la administración a seres humanos se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis de CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, normalmente administrada a diario durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día aunque en algunos casos se pueden utilizar dosis mayores de hasta 40 mg al día (descritas en la Patente de EE. UU. N.° 6120766).

En una realización, el CAR se introduce en células efectoras inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos NK), por ejemplo, utilizando transcripción in vitro y el sujeto (por ejemplo, ser humano) recibe una administración incial de una célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la invención, y una o más administraciones posteriores de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la invención, donde la una o más administraciones posteriores se administran menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después de la administración previa. En una realización, se administra más de una administración de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la invención al sujeto (por ejemplo, ser humano) a la semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la invención a la semana. En una realización, el sujeto (por ejemplo, sujeto humano) recibe más de una administración de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) a la semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones a la semana) (también denominadas en la presente un ciclo), seguidas por una semana sin administraciones de célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) y después se administran al sujeto una o más administraciones adicionales de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) (por ejemplo, más de una administración de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) a la semana). En otra realización, el sujeto (por ejemplo, sujeto humano) recibe más de un ciclo de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expersa CAR) y el tiempo entre cada ciclo es inferior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, o 3 días. En una realización, la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) se administra en días alternos para tener 3 administraciones a la semana. En una realización, la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) de la invención se administra duante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.

En un aspecto, la célula que expresa CAR CD123 (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) se genera utilizando vectores víricos lentivíricos, tales como lentivirus. La célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) generada de esta manera tendrá una expresión estable de CAR.

En un aspecto, las células que expresan CAR, por ejemplo, linfocitos NK que expresan CAR o CART, se generan utilizando un vector vírico tal como un vector gammarretrovírico, por ejemplo, un vector gammarretrovírico descrito en la presente. Las células que expresan CAR, por ejemplo, linfocitos NK que expresan CAR o CART, generadas de esta manera tendrán una expresión estable de CAR.

En un aspecto, la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) expresa de manera transitoria vectores CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12 , 13, 14, 15 días después de la transducción. La expresión transitoria de CAR se puede efectuar mediante suministro del vector ARN de CAR. En un aspecto, el ARN de c A r se utiliza para transducir la célula (por ejemplo, linfocito T o linfocito NK) mediante electroporación.

Un posible problema que puede surgir en pacientes que están siendo tratados utilizando la célula CAR con expresión transitoria (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) es la anafilaxis después de múltiples tratamientos. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que una respuesta anafiláctica de este tipo puede estar causada porque el paciente desarrolla una respuesta anti-CAR humoral, es decir, anticuerpos anti-CAR que tienen un isotipo anti-IgE. Se cree que las células productoras de anticuerpos del paciente experimentan un cambio de clase desde un isotipo IgG (que no provoca anafilaxis) a un isotiopo IgE cuando hay un descanso en la exposición al antígeno de diez a catorce días. Si un paciente está en riesgo de generar una respuesta de anticuerpos anti-CAR durante el curso de la terapia con CAR transitoria (tal como las generadas por las transducciones con ARN), los descansos de infusión de la célula que expresa CAR (por ejemplo, linfocito T CAR o linfocito NK que expresa CAR) no deberían durar más de diez a catorce días. EJEMPLOS

La invención se describe adicionalmente en más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Sin una descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la memoria descriptiva anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, generar y utilizar los compuestos de la presente invención y llevar a la práctica los métodos reivindicados.

Ejemplo 1: Constructos de CAR humanos

Se aislaron fragmentos variables monocatenarios anti-CD123 totalmente humanos. Los scFv anti-CD123 se clonaron en vectores de expresión CAR lentivíricos con la cadena CD3zeta y la molécula coestimuladora 4-1BB. Los plásmidos que contienen CAR (Tabla 1 proporcionada en la Descripción Detallada) se amplificaron mediante transformación bacteriana en células STBL2, seguida por Maxiprepr utilizando el kit Plasmid Maki de Qiagen. Se produjo sobrenadante lentivírico en células 293T utilizando técnicas estándar.

El orden en el que aparecen los dominios VL y VH en el scFv (es decir, orientación VL-VH o VH-VL) se hizo variar y donde tres o cuatro copias de la subunidad «G4S» (SEQ ID NO:25), en las que cada subunidad comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID NO:25) (por ejemplo, (G4S)3 (SEQ ID NO:28) o (G4S)4(SEQ ID NO:27)), conectan los dominios variables para crear la totalidad del dominio scFv, tal como se muestra en la Tabla 2 (que se proporciona en la Descripción Detallada). Las secuencias de los constructos CAR y sus secuencias del dominio se enumeran en la Descripción Detallada. El análisis de los constructos CAR humanos se llevó a cabo como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 2, 3 y 6.

Ejemplo 2: Análisis y actividad in vitro de CART que portan scFv humanos

Se evaluaron constructos CAR anti-CD123 humanos para determinar la actividad utilizando una línea de células Jurkat que contenía el indicador luciferasa impulsado por el promotor de NFAT (denominadas células JNL). Se midió la actividad CAR CD123 para cuatro constructos CAR humanos descritos en la presente (CAR CD123 1-4) y los constructos CAR CD123 murinos 1172 y 1176. A continuación se proporciona la secuencia de aminoácidos para los constructos 1172 y 1176, y se describen y caracterizan adicionalmente en el documento PCT/US2014/017328.

Constructo 1172: CAR-4-lBBCD3z CD123 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 707) MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGNTF MHWY QQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYY CQQS NEDPPTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSSGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYI FTNYGMNWVKQAPGKSFKWMGWINTYTGESTYSADFKGRFAFSLETSASTAYLHIND LKNEDTATYFCARSGGYDPMDYWGQGTSVTVSSASSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGT CGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHD GLY QGLST ATKDT YD ALFIMQALPPR

Constructo 1176: CAR-4-lBBCD3z CD123 (26292) (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID

NO:708)

MALPVTALLLPLALLLHAARPGSDVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKDLAWYQ EKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNKYPYT FGGGTKLEIKGGGGSGGGGSSGGGSQVQLQQPGAELYRPGASVKLSCKASGYTFTSY WMNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSE D S A YYY C ARGN WDD Y WGQ GTTLT Y S S AS S GTTTP APRPPTP APTI AS QPL SLRPE ACRP AAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRP VQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYD VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAE AY SEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

La actividad CAR se midió como la activación de este indicador impulsado por NFAT. Los sobrenadantes lentivíricos que contenían los constructos CART se añadieron a las células JNL para la transducción. 4-6 días después de la transducción, las células JNL se evaluaron para detectar la expresión CAR por FACS como se describe más adelante o se mezclaron un líneas celulares positivas para la diana (células MOLM3, K562 modificadas para expresar CD123 (CD123-K562)) o negativas para la diana (K562) con una proporción de línea celular efectora (JNL) respecto a diana (E:T) de 3:1 para iniciar la activación Figura 1. Después de 20 horas de coincubación, se midió la señal de la luciferasa utilizando el Ensayo de Luciferasa Bright-Glo™ en el instrumento EnVision tal como se muestra en la Figura 2.

Los constructos CAR anti-CD123 óptimos se seleccionaron en función de la cantidad y calidad de las respuestas de linfocitos T efectores de los linfocitos T transducidos con CAR CD123 («CART-CD123» o «linfocitos T CART-CD123») en respuesta a las dianas que expresan CD123 («CD123+»). Las respuestas de linfocitos T efectores incluyen, sin carácter limitante, expansión celular, proliferación, duplicación, producción de citocinas y destrucción de células diana o actividad citolítica (desgranulación).

Generación de CART-CD123

Se utilizaron vectores de transferencia lentivíricos que codifican scFv humano para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivíricas pseudotipadas VSVg. El ADN del vector de transferencia lentivírico se mezcló con los tres componentes de empaquetamiento de VSVg, gag/pol y rev en combinación con el reactivo Lipofectamine para transfectarlos juntos en células Lenti-X 293T (Clontech).

Después de 30 h, el medio se recogió, se filtró y se almacenó a -80 °C. Los CART-CD123 terapéuticos se generaron a partir de sangre de un donante sometido a aféresis normal cuyos linfocitos T vírgenes se obtuvieron mediante selección negativa para linfocitos T, linfocitos CD4+ y CD8+. Estas células se activaron mediante perlas CD3x28 (Expansor-T Humano CD3/CD28 Dynabeads®, Invitrogen) con una proporción de 1:3 en RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino (FCS, por sus siglas en inglés) inactivado térmicamente, L-glutamina 2 mM, 1x Penicilina/Estreptomicina, aminoácidos no esenciales 100 pM, NaPiruvato 1 mM, Hepes 10 mM y 2-mercaptoetanol 55 pM a 37 °C, 5% de CO2. Los linfocitos T se cultivaron a 1x106 linfocitos T en 0,5 mL de medio por pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de 24 horas, los linfocitos T experimentaron activación (blasting) y se añadieron 0,5 mL de sobrenadante vírico. Los linfocitos T comenzaron entonces a dividirse con un patrón de crecimiento logarítmico, que se monitorizó midiendo los recuentos de células por mL, y los linfocitos T se diluyeron en medio fresco cada dos días. Como los linfocitos T comienzan a relajarse después de aproximadamente 10 días, el crecimiento logarítmico disminuye. La combinación de ralentización de la tasa de crecimiento y tamaño de linfocitos T que se acerca a D300 fl determinó el estado para que los linfocitos T se crioconservaran para un análisis posterior.

Antes de la crioconservación, el porcentaje de células transducidas (que expresan el CAR anti-CD123 en la superficie celular) y su intensidad de fluorescencia relativa de expresión se determinaron mediante análisis por citometría de flujo en un BD LSRFortessa o BD-FACSCanto utilizando Proteína L como reactivo de detección. La selección de las gráficas de tipo histograma de intensidad de fluorescencia relativa del FACS para la señal por encima de la de las células no teñidas demostró el porcentaje de linfocitos T transducidos. La transducción dio como resultado un intervalo de células positivas para CART de un 12-42%, tal como se muestra en la Figura 2.

Evaluación de la actividad cito lítica de lin focitos T redirig idos CART-CD123.

Para evaluar la capacidad funcional de los linfocitos T CART-CD123 para provocar la muerte de células que expresan la diana, las células se descongelaron y se permitió que se recuperaran durante toda la noche.

La muerte por linfocitos T se dirigió a líneas celulares de leucemia mielógena aguda MOLM13 que expresaban CD123 que expresaban de manera estable la luciferasa. Los linfocitos T no transducidos se utilizaron para determinar los niveles de muerte no específica de fondo. Se midieron las actividades citolíticas de CART-CD123 como una titulación de proporciones efector:célula diana de 4:1 y diluciones decrecientes con un factor de 2 de linfocitos T donde se definieron los efectores como linfocitos T que expresaban el receptor quimérico anti-CD123. Los ensayos se iniciaron mezclando un número apropiado de linfocitos T con un número constante de células diana. Se midió la señal de la luciferasa después de 20 horas utilizando el ensayo de luciferasa Bright-Glo™ en el instrumento EnVision. Según aumentó la proporción de células que expresaban CART-CD123 respecto a los linfocitos T no transducidos, la muerte de las células CD123 aumentó de manera similar. Los datos presentados en la presente sugieren que esas células que expresan CD123 son destruidas únicamente por células que expresan CART-CD123 y no por linfocitos T no transducidos. Figura 3.

Producción de citocinas

Para medir la producción de citocinas de los linfocitos CART CD123, se descongelaron células que expresaban CD123-2, CD123-3 o CD123-4 y se permitió que se recuperaran durante una noche. Se utilizaron linfocitos T que expresan un control isotípico (denominado «isotipo») como un control no específico para los efectos de fondo de linfocitos T. Los linfocitos T fueron dirigidos a células MOLM13, PL21 o U87 (denominadas células diana). El ensayo estudió una proporción de efector:diana de 1,25:1 o 20:1, como se señaló cuando los efectores se definieron como linfocitos T que expresan el CAR CD123. El ensayo se ejecutó 24 horas después de mezclar las células, cuando se retiró el medio para el análisis de citocinas IL-2 (Fig. 24A), IFN-gamma (Fig. 24B), y TNF-alfa (Fig. 24C) utilizando el kit CBA-Flex para la detección de citocinas humanas. Cuando los linfocitos T que expresan CAR CD123 se cultivaron con células cancerosas que expresaban CD123, todos los CART-CD123 produjeron citocinas en respuesta a las células que expresaban una diana.

Ejemplo 3: CART123 en AML

Transducción de lin focitos T

Se seleccionaron los clones humanos anti-CD123 humano NVS 2 (que expresa CAR123-2), NVS3 (que expresa CAR123-3), NVS4 (que expresa CAR123-4) para un estudio adicional. Todos estos clones presentaron una reactividad cruzada contra CD123 de cinomolgo. Su actividad se comparó contra los clones de ratón 1172 y 1176, que comprenden los dominios VH y VL en una orientación ligero-a-pesado con un dominio bisagra de CD8, un dominio transmembrana de CD8 y un dominio coestimulador de 41-BB. 1176 también presenta reactividad cruzada con CD123 de cinomolgo. 1172 no.

Se utilizaron plásmidos para transformar células competentes, se cultivaron en 500 cc de caldo, se aislaron mediante maxiprep y se utilizaron para transducir células 293T mediante métodos estándar. Se recogió el sobrenadante lentivírico a 24 y 48 horas, se concentró utilizando ultracentrifugación y se congeló.

Los lentivirus se valoraron en células SupT1 y se determinó la cantidad apropiada de virus para una transducción de linfocitos T primarios con un MOI de 3. Se estimularon células CD4+CD8 de donante normal primarias utilizando perlas anti-CD3/CD28 (Dynal, Invitrogen) y 100 U/mL de interleucina-2 durante 6 días, después se eliminaron las perlas y se congelaron una vez. El volumen celular de linfocitos T descendió hasta <300 fL (después de aprox. 10-12 días).

La eficacia de la transducción de linfocitos T fue de virtualmente un 100% para todos los clones (Fig. 5A y 5B). Las proporciones CD4:CD8 fueron de aproximadamente 1:1 en los clones NVS, y 3:2 en los clones 1172 y 1176 (Fig. 6).

Desgranulación

Para evaluar la desgranulación, se descongelaron linfocitos CART (clones NVS 2-4, 1172 y 1176), se dejaron reposar durante una noche con una concentración de 2e6 células/mL en medio para linfocitos T. A continuación, se contaron las células y se resuspendieron con una concentración de 1e6 células/mL el día siguiente. Se resuspendieron las células diana tumorales (TCM, PMA/iono, MOLM14 o JURKAT) con una concentración de 5e6 células/mL. Las células se sembraron en placas con una proporción de 1e6 linfocitos T: 5e6 células tumorales en placas de 48 pocillos y se incubaron durante 2 horas en presencia de anticuerpos anti-CD107a PECy7, anti-CD49d purificado y anti-CD28 purificado. Las células se recolectaron a continuación, se tiñeron con APC anti-CD3 y se realizó una adquisición utilizando BD LSR Fortessa (Fig. 7).

La desgranulación de linfocitos T se indica en el cuadrante superior derecho de cada gráfico de la Figura 7. Los resultados presentados en la presente demostraron un reconocimiento similar de los linfocitos T por las dianas CD123+, manifestado por una desgranulación similar utilizando un ensayo in vitro de 2 h. C1176 tuvo una granulación inferior de un 65% en comparación con aproximadamente un 80% en los otros clones.

Citotoxicidad

Para evaluar la citotoxicidad, se descongelaron linfocitos CART (clones NVS 2-4, 1172 y 1176) y se dejaron reposar durante una noche con una concentración de 2e6 células/mL en medio para linfocitos T. Se contaron las células y se resuspendieron con una concentración de 1e6 células/mL el día siguiente. Se resuspendieron las células diana tumorales (MOLM14) con una concentración de 1e6 células/mL. Las células se colocaron en una placa de 96 pocillos de fondo plano, negra con proporciones E:T decrecientes como se indica (Fig. 8), por duplicado. Después de 20 horas de incubación, se añadió luciferina y se obtuvieron imágenes de la placa para determinar el flujo de fotones como una medida de las células vivas residuales. La muerte de células MOLM14 fue equivalente entre todos los clones para la mayoría de proporciones efector:diana a las 20 horas.

Modelo in vivo en ratones

Se inyectaron i.v. 1e6 células MOLM14 que expresaban luciferasa a ratones NSG en D0. En D6 se obtuvieron imágenes de los ratones (Espectro IVIS) para determinar la carga tumoral y se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento. Los ratones con la carga tumoral más baja se asignaron al grupo de control (linfocitos T no transducidos, UTD). Los linfocitos CART (clones NVS 2-4, 1172 y 1176) o linfocitos T de control (1e6) se inyectaron i.v. en D7. Los datos de la obtención de imágenes realizada en D13 se muestran en la Figura 9. Seis días después de la inyección, todos los constructos anti-CD123 proporcionaron un efecto antitumoral igual, coherente con los datos in vitro.

Ejemplo 4: Constructos CAR humanizados

Se generaron fragmentos variables monocatenarios (scFv) anti-CD123 humanizados basado en 1176 murino que presenta reactividad cruzada contra CD123 de cinomolgo y se clonaron en un vector de expresión lentivírico con la cadena CD3zeta intracelular y el dominio coestimulador intracelular de 4-1BB y recibieron los nombres expuestos en la Tabla 5 (proporcionada en la Descripción Detallada).

El orden en el que aparecen los dominios VL y VH en el scFv (es decir, orientación VL-VH o VH-VL) se hizo variar y donde tres o cuatro copias de la subunidad «G4S» (SEQ ID NO:25), en las que cada subunidad comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID NO:25) (por ejemplo, (G4S)3 (SEQ ID NO:28) o (G4S)4(SEQ ID NO:27)), conectan los dominios variables para crear la totalidad del dominio scFv, tal como se muestra en la Tabla 6 (que se proporciona en la Descripción Detallada).

Las secuencias de los fragmentos scFv humanizados (SEQ ID NOs: 184-215) CARS se proporcionan en la presente en la Tabla 6. Todos estos clones contenían un cambio de residuo Q/K en el dominio señal del dominio coestimulador derivado de la cadena CD3zeta. Los fragmentos de scFv CAR se clonaron a continuación en vectores lentivíricos para crear un constructo CAR completo en un único marco de codificación, y se utilizó el promotor EF1 alfa para la expresión (SEQ ID NO: 11).

Ejemplo 5: CART123 en el linfoma de Hodgkin

Se sabe que CD123 se expresa en aproximadamente un 50% de los linfomas de Hodgkin (HL) clásicos mediante citometría de flujo. Se sabe que la administración exógena de IL3 a cultivos de líneas celulares de linfoma de Hodgkin estimula el crecimiento y es capaz de rescatar parcialmente las células de la apoptosis mediante privación de suero. Se sabe que la inhibición de CD123 (IL-3Ra) por parte de SL-401 reduce la viabilidad de las líneas celulares de HL CD123++ ( HDLM-2, L428).

Se analizaron 8 pacientes con HL para detectar la expresión de CD123 mediante inmunohistoquímica. Tal como se muestra en la Tabla 15, 4/8 de las muestras fueron positivas en células Reed-Sternberg y/o en células inmunitarias del microentorno.

Tabla 15: Expresión diana por IHC en 8 muestras de HL

La citometría de flujo mostró expresión de CD30 y CD123 en una línea celular de linfoma de Hodgkin muy conocida HDLM-2 (Fig. 10). Los marcadores CD19 y CD20 de linfocitos B estuvieron ausentes.

Los siguientes experimentos utilizan un ADN plasmídico pELNS anti-CD123-41BB-CD3Z (CAR123) con orientaciones de la cadena ligera-a-pesada o pesada-a-ligera del scFv anti-CD123 humano de ratón. Se obtuvieron linfocitos T de un donante normal (ND052, Centro de Inmunología Humana (Human Immunology Core)), se expandieron utilizando perlas magnéticas CD3/CD28 (Invitrogen) y se transdujeron en el día 2 con lentivirus CAR123. En el día 6 se detectó CD123 detectando sdRed, marcador indirecto de CD123 mediante la coexpresión de T2A. Se detectó dsRed mediante citometría de flujo (Fig. 11A-B).

A continuación, se realizó Q-PCR en la expresión de CD123 en 4 líneas celulares de linfoma de Hodgkin (HDLM2, KMH2, L428, SUPHD1), MOLM14 CD123+ (control positivo) y A375 (control negativo). Se expresó CD123 en todas las líneas celulares de linfoma de Hodgkin (Fig. 12). Se utilizó GUSB como gen constitutivo. El umbral Ct fue 40.

Función de IL-3 en la estimulación del crecim iento de células HL

Ya que CD123 es la cadena a del receptor de IL3 e IL-3 tiene importantes funciones en el crecimiento y diferenciación hematopoyéticos, se investigó si la señalización de IL3 es importante en el crecimiento de líneas celulares de linfoma de Hodgkin. Se sometieron a un injerto ratones KO NOD-SCID-cadena-Y que sobreexpresan citocinas humanas que incluyen IL-3 (ratones NSG-S) con la línea celular HDLM-2 que expresaba luciferasa. Después de la inyección i.v., las células neoplásicas formaron de manera progresiva masas de tejido blando diseminadas. Las inyecciones en serie de un anticuerpo anti-IL3 neutralizante ralentizaron el crecimiento del tumor. Los resultados presentados en la presente sugieren que CD123 puede ser una diana especialmente relevante en el linfoma de Hodgkin. La carga tumoral se muestra por BLI (Fig. 13).

Ensayo de desgranulación con CD107a

Se incubaron linfocitos T no transducidos (UTD) o CART123 con HDLM-2 (línea celular CD123+ HL) durante 4 horas con una proporción de 5 células diana para 1 linfocito T en presencia de anticuerpos anti-CD28, anti-CD49d y monensina. Se utilizaron linfocitos T CAR anti-CD30 como controles adicionales.

Con la detección por citometría de flujo se observó que CART123 pero no UTD mostró una mayor desgranulación con CD107a (Fig. 14 y 15). Además, CART123 mostró un incremento significativo en la producción de citocinas intracitoplasmáticas (IL-2, TNF) (Fig. 16).

CART provoca la muerte de células HDLM-2

Se realizó un ensayo de muerte de 24 h con luciferasa. Los linfocitos T se coincubaron con células HDML-2 luciferasa+ con diferentes proporciones (0,3:1 - 10:1). CART123, pero no UTD, mostró una muerte dependiente de la dosis tal como muestra el descenso de la emisión bioluminiscente. Resulta interesante que los linfocitos T CAR específicos para CD30 mostraron una actividad mínima (Fig. 17).

CART prolifera en presencia de líneas celulares de HL

Los linfocitos T se incubaron con líneas celulares HL (CD123+) o controles (Jurkat CD123- , MOLM-14 CD123+) o PMA/Ionomicina (control positivo) o medio celular (control negativo) en un ensayo de proliferación de linfocitos T de 5 días. Los linfocitos CART123 y CART30 pero no UTD muestran una proliferación enérgica cuando se cocultivan con líneas celulares de HL (Fig. 18).

Se recogió el sobrenandante del ensayo de proliferación después de 72 h y se analizó la presencia de 30 citocinas mediante un ensayo Luminex. CART123 mostró una producción enérgica de múltiples citocinas (IFNg, IL-2, TNFa y MIP1b luminex MFI se muestran en las Figuras 19A-19D, respectivamente).

Eficacia in vivo de CART123 contra una línea celular de linfoma de Hodgkin (HDLM-2)

Para confirmar los datos in vitro mostrados en la presente, se desarrolló un modelo in vivo. Se inyectaron i.v. 1 millón de células HDLM-2 luciferasa+ en el día 0. La obtención de imágenes bioluminiscentes (BLI, por sus siglas en inglés) en serie demostrada se realizó a continuación para observar el nivel tumoral (Fig. 20). Se observó un nivel bajo del tumor en el día 7, y después un incremento gradual en la carga tumoral a lo largo de aproximadamente 6 semanas, que reproduce la naturaleza indolente de la enfermedad humana. En el día 43 cuando la carga tumoral era 20 veces más elevada que al inicio, los ratones se trataron con 1,5 millones de linfocitos CART123 o linfocitos T de control.

CART123 indujo una erradicación completa y duradera del tumor diseminado en 14 días o menos, lo que dio lugar a una supervivencia global de un 100% y ausencia de recaídas de un 100% a los 6 meses (Figs. 21 y 22).

La eliminación del tumor se asoció con una expansión de linfocitos T CAR importante según se detectó por citometría de flujo en extracciones de sangre periférica en serie (Fig. 23). Los linfocitos T expandidos fueron aproximadamente un 50% de células CD8 y un 50% de células CD4. El número de linfocitos T se redujo con el tiempo según disminuyó la carga tumoral.

Ejemplo 6: Caracterización adicional de CAR CD123-2

Se realizaron ensayos in vitro adicionales para evaluar los linfocitos T primarios que se transdujeron con lentivirus para expresar el constructo CAR123-2 (también denominado en la presente LV CAR123-2). Los linfocitos T que expresan CAR (LV CAR123-2) se compararon con linfocitos T que expresan un scFv contra la glucoproteína H (gH) de citomegalovirus (hCMV) (denominado en la presente anti-GH), que actuó como un control negativo. Los ensayos in vitro cruciales incluyeron ensayos de producción de citocinas, proliferación y muerte celular. Los ensayos de proliferación se realizaron incubando linfocitos T (LV CAR123-2 o anti-GH) con líneas celulares que expresan CD123 (antígeno ), por ejemplo, MOLM13 o K562 que expresan CD123 humano, o líneas celulares de control negativas para CD123 (antígeno -), por ejemplo, K562. Los linfocitos T se cultivaron durante 4 días. Tal como se muestra en la Figura 25, las células que expresan CAR mostraron una proliferación enérgica en comparación con el control negativo cuando se cultivaron en presencia de células que expresan CD123.

La capacidad de los linfocitos T que expresan CAR123-2 para provocar la muerte de células diana se midió como una valoración de las proporciones célula diana:efectora comprendidas entre 1:20 y diluciones con un factor de 2 hasta 1:0,3125. Las células diana que se estudiaron fueron líneas celulares MOLM13 que expresan CD123 que expresan de manera estable luciferasa, células PL21 que expresan de manera estable luciferasa, y células U87 que expresan de manera estable luciferasa. Tal como se muestra en las Figuras 26A y 26B, las células que expresan CAR-CD123 demuestran una muerte dirigida de células cancerosas que expresan CD123 (MOLM13 y PL21), mientras que el control negativo (células que expresan anti-GH) y células no transducidas (UTD) no demostraron muerte dirigida. En la Figura 26C, UTD, control negativo (anti-GH) y las células que expresan CAR CD123 no demostraron muerte específica de células U87 (que no expresan CD123).

Se realizó un ensayo de producción de citocinas analizando el sobrenadante de cocultivos que comprenden linfocitos T (que expresan CAR123-2 o anti-GH) con células positivas para el antígeno (MOLM13) o negativas para el antígeno (U87). Los linfocitos T CAR-CD123 mostraron una producción de citocinas enérgica de IFN-gamma (Fig. 27A) e IL-2 (Fig. 27B).

Ejemplo 7: Combinación de linfocitos T CAR anti-CD19 y anti-CD23 para el tratamiento y la prevención de recaída por pérdida del antígeno

La leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (B-ALL) recurrente o refractaria (r/r) a la quimioterapia se asocia con un mal pronóstico pero, como se ha demostrado recientemente, sigue siendo sumamente sensible al sistema inmunitario. En particular, los linfocitos T con receptor antigénico quimérico anti-CD19 (CART 19, CTL019) y anticuerpos biespecíficos anti-CD19/CD3 (blinatumomab) generan unas tasas de respuesta completa sin precedentes en un 45-90% de esta población de pacientes. Ambas estrategias redirigen linfocitos T autólogos para que reconozcan células que expresan CD19. Blinatumomab utiliza una infusión a largo plazo continua de un constructo biespecífico que combina un fragmento variable monocatenario (scFv) anti-CD19 con un scFv anti-CD3; en el caso de linfocitos T CART19 se modifican genéticamente para expresar un scFv anti-CD19 que se combina con la señalización por el receptor de linfocitos T con dominios coestimuladores integrados. Un estudio reciente mostró que un 90% de los pacientes con r/r B-ALL tratados con CTL019 consiguió una remisión completa (CR, por sus siglas en inglés) con una supervivencia global (OS, por sus siglas en inglés) de un 78% a los 6 meses. También se obtuvieron resultados alentadores con CART19 en pacientes con otras neoplasias de linfocitos B tales como la leucemia linfocítica crónica y linfoma no hodgkiniano.

Sin embargo, un subconjunto de pacientes tratados con CART19 o blinatumomab tiene recaídas y una porción significativas de estas recaídas están caracterizadas por la pérdida de CD19. En B-ALL, se ha informado de recaídas negativas para CD19 en un 10-20% de los pacientes que seguían terapias con CART19 o blinatumomab y esto no se ha descrito en las configuraciones de otros tratamientos; en global aproximadamente un 30% de las recaídas después de blinatumomab y hasta un 50% después de CART19 son negativas para CD19. CD19 es un marcador de linfocitos B prototípico que se expresa desde etapas muy tempranas del desarrollo de linfocitos B hasta el linfocito B maduro. CD19 desempeña una importante función en la biología de linfocitos B ya que las células deficientes en CD19 muestran una desventaja de crecimiento selectiva. Por lo tanto, la ausencia de CD19 es un hallazgo muy inusual en B-ALL y se ha informado de este solo en escasos pacientes antes de la era de inmunoterapias potentes dirigidas contra CD19. El posible mecanismo de pérdida del antígeno se está investigando en la actualidad y lo más probable es que esté provocado por la presión selectiva en los subclones de leucemia ejercida por estos potentes agentes anti-CD19. Debido a la reciente aprobación por la FDA de blinatumomab y el estado revolucionario (breakthrough status) otorgado a CTL019, es probable que un número creciente de pacientes con r/r B-ALL serán tratados con estos agentes. Por tanto, se necesitan estrategias eficaces novedosas con el fin de ser capaces de tratar aquellos pacientes que tendrán recaídas con blastos negativos para CD19 después de CART19 o blinatumomab. Idealmente, una nueva estrategia trataría no solo a los pacientes con una recaída activa por pérdida de antígeno sino que si se empleara desde el principio podría potencialmente prevenir su aparición.

El receptor alfa de interleucina-3 (o CD123) está implicado en la hematopoyesis y se ha mostrado que está expresado en varias neoplasias hematológicas, que incluyen la leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, tricoleucemia y linfoma de Hodgkin. A diferencia de los antígenos superficiales asociados al linaje tales como CD33 (mieloide) o CD19 (linfoide B), CD123 se expresa de manera jerárquica en las células progenitoras hematopoyéticas y en AML CD123 se expresa en células madre leucémicas que están implicadas en la resistencia a la quimioterapia y la recaída después del tratamiento inicial. Debido a estas características, CD123 ha generado un gran interés para la terapia dirigida, y se están desarrollando múltiples agentes tales como la proteína de fusión IL3-toxina diftérica (SL-401, DT388IL3), anticuerpos monoclonales anti-CD123 desnudos (CSL-360, CSL-362), conjugados anticuerpo-fármaco, anticuerpos biespecíficos o constructos de fusión CD3Fc-IL3 y, más recientemente, linfocitos T con receptor antigénico quimérico anti-CD123. Algunas de estas estrategias se están validando en la actualidad en ensayos clínicos y muchas más serán estudiadas en entornos clínicos en los próximos años. Actuar sobre CD123 con linfocitos T con receptor antigénico quimérico (CART 123) puede conllevar respuestas profundas y a largo plazo en xenoinjertos de AML primaria humana y puede establecer una memoria de linfocitos T antileucémica. Aquí, CD123 se expresa en las recaídas de B-ALL negativas para CD19 que se producen después de terapias dirigidas a CD19 y esos linfocitos T CAR-123 combinados con CAR19 (CTL019) constituyen una terapia eficaz para el tratamiento y para la prevención de recaídas por pérdida de antígeno en xenoinjertos de B-ALL.

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas celulares y muestras primarias. Las líneas celulares se obtuvieron originalmente de ATCC (Manassas, VA) (K-562) o DSMZ (Braunschweig, Alemania) (MOLM-14 y NALM-6). Todas las líneas celulares se estudiaron para detectar la presencia de contaminación por micoplasma (kit de detección de micoplasma MycoAlert™, Lonza, Basilea, Suiza). Para algunos experimentos, las líneas celulares se transdujeron con luciferasa de luciérnaga/eGFP y a continuación se clasificaron para obtener un población positiva >99%. La línea celular K-562 positiva para luciferasa también se transdujo con CD19 truncado o CD123 truncado para obtener líneas celulares que expresaban solamente CD123, solamente CD19 o ninguno de ellos. MOLM-14 y K562 se utilizaron como controles como se indica en las figuras relevantes. Las líneas celulares se mantuvieron en cultivo con medio RPMI 1640 Gibco, 11875-085, LifeTechnologies, Grand Island, NY) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gemini, 100-106, West Sacramento, CA), y 50 UI/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco, LifeTechnologies,15070-063). Se obtuvieron muestras no identificadas de sangre periférica (PB, por sus siglas en inglés) y médula ósea (BM, por sus siglas en inglés) de ALL humana primaria de las consultas clínicas de la Universidad de Pensilvania/Hospital Infantil de Filadelfia conforme al protocolo del Comité de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés), adquirido del Centro de Células Madre y Xenoinjertos (Stem Cells andXenograft Core) de la Universidad de Pensilvania o de muestras de investigación de los ensayos clínicos con CTL019 actuales (Laboratorio de Traslación y Estudios Correlativos (Translation and Correlative Study Laboratory), en la Universidad de Pensilvania). Para todos los estudios funcionales, las células primarias se descongelaron al menos 12 horas antes del experimento y se dejaron reposar a 37 °C.

Expansión in vivo de blastos de B-ALL primaria. Métodos divulgados en D. M. Barrett, A. E. Seif, C. Carpenito, D. T. Teachey, J. D. Fish, C. H. June, S. A. Grupp, G. S. Reid, Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood 118, e112-117 (2011).

Hibridación in s itu con fluorescencia (FISH, por sus siglas en inglés) e inmunohistoquímica. El análisis FISH y la inmunohistoquímica se realizaron de acuerdo con el método estándar y tal como se describe. (M. A. Belaud-Rotureau, M. Parrens, P. Dubus, J. C. Garroste, A. de Mascarel, J. P. Merlio, A comparative analysis of FISH, RT-PCR, PCR, and immunohistochemistry for the diagnosis of mantle cell lymphomas. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 15, 517-525 (2002)). El análisis FISH se realizó de acuerdo con el método estándar. Resumiendo, las células ALL recolectadas se suspendieron en fijador (ácido acético y metanol), se depositaron en portaobjetos y se permitió que se secaran. Se aplicó la sonda de color dual para fusión génica BCR/ABL (Abbott Molecular) en la solución de tampón de hibridación. Los portaobjetos se cubrieron, se sellaron y se dejaron dentro de una cámara HYBrite a 37 °C durante 6 h. Después de retirar el sellante y el cubreobjetos, los portaobjetos se lavaron dos veces, se secaron con una sustancia absorbente, se secaron y se contratiñeron con DAPI. Los portaobjetos se examinaron en un microscopio fluorescente, y se evaluaron como mínimo 200 núcleos en cada muestra.

Generación de constructos CAR y linfocitos T CAR. Se generó el receptor antigénico quimérico anti-CD19 murino (bisagra de CD8, dominio coestimulador de 4-1BB y dominio de señalización de CD3) tal como se ha descrito previamente. (Milone, et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17, 1453-1464 (2009) e Imai et al., Leukemia 18, 676-684 (2004)). Este es el mismo constructo utilizado en la actualidad en los ensayos clínicos con CTL019 en la Universidad de Pensilvania. Para CAR123 scFv anti-CD123 (constructo 1172 (SEQ ID NO: 707, y como se describe en el documento PCT/US2014/017328) se utilizó y el mismo constructo de esqueleto de CAR19. La producción de linfocitos T que expresan CAR se realizó tal como se ha descrito previamente. (Gill et al., Blood 123, 2343-2354 (2014)). Se obtuvieron células mononucleares de PB (PBMC, por sus siglas en inglés) o linfocitos T CD4 y CD8 de un donante normal del Centro de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania. Los linfocitos T se colocaron en placas con una concentración de 1x106/mL con una proporción CD4:CD8 de 1:1 y se expandieron en medio X-vivo 15 (Lonza, 04-418Q), complementado con un 5% de suero AB humano (Gemini, 100-512), penicilina/estreptomicina (Gibco, 15070063) y Glutamax (Gibco, 35050061) utilizando Dynabeads anti-CD3/CD28 (Life Technologies, 11161D) añadidas en el día 1 del cultivo y separadas en el día 6. Los linfocitos T se transdujeron con lentivirus en el día 2. Los linfocitos T se expandieron en cultivo durante 8-15 días y se recolectaron cuando el volumen celular mediano fue inferior a 300 fl. A continuación se crioconservaron los linfocitos T en FBS con un 10% de DMSO para experimentos futuros. Antes de todos los experimentos, los linfocitos T se descongelaron y se dejaron reposar durante una noche a 37 °C.

Citometría de flu jo multiparamétrica Se realizó citometría de flujo tal como se ha descrito previamente (Kenderian, et al., Leukemia, (2015)). Se compraron anticuerpos anti-humano de Biolegend, eBioscience, o Becton Dickinson. Las células se aislaron a partir de un cultivo in vitro o a partir de animales, se lavaron una vez con PBS complementado con un 2% de suero bovino fetal, y se tiñeron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para la cuantificación del número de células, se utilizaron perlas Countbright (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En todos los análisis, la población de interés se seleccionó en función de las características de dispersión frontal vs. lateral y después se realizó una selección de singletes, y las células vivas se seleccionaron utilizando Live Dead Fixable Aqua (Invitrogen). Se incluyó selección temporal para el control de calidad. La expresión superficial de CAR19 se detectó como se ha descrito previamente, utilizando un anticuerpo anti-idiotípico. La detección de CAR123 se realizó utilizando anticuerpo de cabra anti-ratón (Jackson Laboratories) o CD123-Fc/His (Sino Biologicals) y anti-His-APC (R&D) o PE (AbCam). La citometría de flujo se realizó en un citómetro de cuatro láseres Frotessa-LSR II (Becton-Dickinson) y se analizó con FlowJo X 10.0.7r2 (Tree Star).

Ensayos de la función efectora de linfocitos T in vitro. Los ensayos de desgranulación, proliferación con CFSE y citotoxicidad se realizaron como se ha descrito previamente. (Gill et al., Blood 123, 2343-2354 (2014) y Kalos et al., Science translational medicine 3, 95ra73 (2011)).

Ensayo de desgranulación. Resumiendo, los linfocitos T se incubaron con células diana con una proporción 1:5 en medio para linfocitos T. Se añadieron al cocultivo anticuerpos anti-CD 107a-PECY7 (Biolegend), anti-CD28 (BD Biosciences), anti-CD49d (BD Biosciences) y monensina (BD Biosciences). Después de 4 horas, las células se recolectaron y se tiñeron para determinar la expresión de CAR, CD3, CD8 y tinción con Live Dead aqua (Invitrogen). Las células se fijaron y permeabilizaron (tampones Invitrogen Fix/Perm) y a continuación se realizó una tinción intracelular para detectar múltiples citocinas (IFN, TNFa, IL-2, GM-CSF, MIP1p).

Ensayo de proliferación. Los linfocitos T se lavaron y resuspendieron con una concentración de 1x107/mL en 100 uL de PBS y se tiñeron con 100 uL de CFSE 2,5 uM (Invitrogen) durante 5 minutos a 37 °C. La reacción se desactivó a continuación con medio frío y las células se lavaron tres veces. Las dianas se irradiaron con una dosis de 100 Gy. Los linfocitos T se incubaron con una proporción 1:1 con células diana irradiadas durante 120 horas, y se añadió medio a las 24 horas. A continuación, las células se recolectaron, se tiñeron para detectar CD3, CAR y Live Dead aqua (Invitrogen), y se añadieron perlas Countbright (Invitrogen) antes del análisis por citometría de flujo para una cuantificación absoluta.

Ensayos de citotoxicidad. Se utilizaron líneas celulares de luciferasa/eGFP+ para el ensayo de citotoxicidad como se ha descrito previamente. Resumiendo, las dianas se incubaron con las proporciones indicadas con linfocitos T efectores durante 24 horas. La muerte se calculó mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia en una cámara IVIS-200 Spectrum de Xenogen.

Medidas de citocinas. Las células efectoras y diana se coincubaron con una proporción de 1:1 en medio para linfocitos T durante 24. El sobrenadante se recolectó y se analizó mediante una matriz 30-plex Luminex (Luminex Corp, FLEXMAP 3D) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen).

Experimentos en animales. Los experimentos in vivo se realizaron tal como se ha descrito previamente. (Kenderian, et al., Leukemia, (2015)). Los esquemas de los modelos de xenoinjerto utilizados se analizan en detalle en las figuras relevante, resultado. Se compraron NOD-SCID-cadena y -/-(NSG) obtenidos originalmente de Jackson Laboratories del Centro de Células Madre y Xenoinjertos de la Universidad de Pensilvania. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con un protocolo (n.° 803230) aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) que se adhiere a la guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las células (líneas celulares de leucemia o linfocitos T) se inyectaron en 200 uL de PBS con la concentración indicada en la vena de la cola de ratones. La obtención de imágenes bioluminiscentes se realizó utilizando una cámara IVIS-200 Spectrum de Xenogen y se analizaron con software LivingImage v. 4.3.1 (Caliper LifeSciencies). Los animales se sacrificaron al final del experimento o cuando alcanzaron los criterios de valoración preespecificados de acuerdo con los protocolos IACUC.

Microscopía multifotónica. Los ratones se anestesiaron y se mantuvieron a una temperatura central de 37 °C. Se obtuvieron imágenes de la médula ósea después de retirar el cuero cabelludo e inmovilizar el cráneo. La obtención de imágenes se realizó utilizando un sistema de microscopio 2-fotónico Leica SP5 (Leica Microsystems) equipado con un láser de picosegundos (Coherent). Cada adquisición de imágenes duró 20 minutos seguida por una evaluación de la sedación del ratón. Se excitaron Violeta CellTrace, GFP, y Naranja CellTrace (o TRITC) utilizando luz láser de 850 nm. Las imágenes se obtuvieron utilizando una lente de inmersión en agua 20x. Las imágenes resultantes se analizaron con software Volocity (PerkinElmer).

Análisis estadístico. Todos los estudios estadísticos se realizaron como se indica utilizando GraphPad Prism 6 para Windows, versión 6.04 (La Jolla, CA). Se utilizó la prueba de la t de Student para comparar dos grupos; en el análisis en el que se compararon múltiples grupos, se realizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con corrección de Holm-Sida para comparaciones múltiples. Cuando se compararon múltiples grupos en múltiples puntos temporales/proporciones, se utilizó la prueba de la t de Student o ANOVA para cada punto temporal/proporción. Las curvas de supervivencia se compararon utilizando la prueba del orden logarítmico. En las figuras, los asteriscos se utilizan para representar los valores de p (*=<0,05, **=<0,01, ***=<0,001, ****=<0,0001) y «ns» significa «no significativo» (p>0,05). Se enumeran detalles adicionales de los estudios estadísticos para cada experimento en las leyendas de las figuras.

RESULTADOS

CD123 se expresa en B-ALL, en las células madre de leucemia y en las recaídas negativas para CD19

Con el fin de evaluar la expresión de CD123 en la leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B, se analizaron 42 muestras de pacientes con ALL adultos y pediátricos, incluidos 14 sujetos participantes en los presentes ensayos clínicos con CTL019 de los autores. Como se muestra en la Figura 31A, 31B y 38A, CD123 está expresado de manera elevada y homogénea en la superficie de la mayoría de blastos de ALL, y representa un candidato ideal para la terapia dirigida. Además, también se ha observado que CD123 se expresa en las células madre de leucemia (LSC) putativas, identificadas como CD34+ CD38- (Figura 31C). Se pueden identificar pequeños subconjuntos de blastos negativos para CD19 en algunos pacientes con ALL y estas células podrían contribuir a las recaídas por pérdida de antígeno, si contienen células con un fenotipo maligno. Con el fin de evaluar la presencia de enfermedad en subconjuntos negativos para CD19, se clasificaron células CD19- CD123+ de una población global con B-ALL positiva para el cromosoma de Filadelfia (CD45tenue, la estrategia de selección se muestra en la Figura 38B). Se observó que estas células fueron clonales para la translocación BCR-ABL, aunque con una frecuencia menor que los blastos CD19+ (Figura 31D). Este hallazgo indica que tener como diana CD19 solo podría, en algunos casos, conllevar una recaída subclonal derivada de células CD19-CD123+. Además, este hallazgo sugiere que tener como diana CD123 podría conllevar respuestas más profundas mediante la eliminación de LSC y posiblemente clones de leucemia negativos para CD19.

Finalmente, la expresión de CD123 también se evaluó en las muestras de pacientes B-ALL con recaídas después de CTL019 con pérdida de CD19. De manera importante, en contraste con la pérdida completa de CD19, la mayoría de los pacientes mantuvieron la expresión de CD123 en la recaída (Figuras 31E, 31f y 38C). Estos hallazgos indican que CD123 representa un marcador ideal cuando se tienen como diana blastos ALL negativos para CD19 que se producen después de CART19 o blinatumomab.

Los lin focitos T con receptor antigénico quimérico anti-CD123 son activos contra B-ALL humano in v itro e in vivo

Se generaron (37) linfocitos T con receptor antigénico quimérico anti-CD123 (CART123) que se transdujeron con lentivirus y se expandieron con perlas magnéticas anti-CD3/CD28. Se evaluaron la actividad in vitro e in vivo de CART contra leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B como se describe en la presente.

Se utilizaron la línea celular B-ALL NALM-6 que es CD19++ y CD123+ (Figuras 32A y 39A) y muestras de B-ALL primaria. Una comparación in vitro cabeza-con-cabeza entre CART123 y CART19 reveló tasas similares de desgranulación con CD107a cuando los linfocitos T se cocultivaron con NALM-6 o ALL primaria (Figura 32B). Los CART123 también fueron capaces de provocar la muerte de células NALM-6 con una eficacia similar a CART19 en una manera dependiente de la dosis (Figura 32C). En experimentos a mayor plazo, CART123 proliferó (Figuras 32D y 32E) y produjo múltiples citocinas (Figura 32F) cuando se cocultivó con NALM-6 o ALL primaria durante 3-5 días. Estos resultados indican que CART123 muestra una potencia equivalente a CART19 contra múltiples dianas de B-ALL.

Con el fin de confirmar estos datos en un modelo in vivo, se utilizó un modelo de ALL primaria. En este modelo, se realizó un pase de blastos primarios obtenidos de pacientes con B-ALL a ratones NOD-SCID-supresión de la cadena y (NSG) y se transdujeron con un constructo indicador que contenía eGFP y luciferasa de elatéridos (GFP/Luc). A todos los ratones se les inyectó GFP/blastos de ALL primaria Luc+ i.v. (JH331, CD19+, CD123+, añadir fenotipo) y después del injerto, los ratones se distribuyeron aleatoriamente para recibir CART19, CART123 o linfocitos T no transducidos (UTD) de control. Los ratones tratados con linfocitos T de control sucumbieron rápidamente a la enfermedad, mientras que los ratones tratados con CART19 o CART123 mostraron erradicación del tumor y supervivencia a largo plazo (Figuras 33A y 33B). Los linfocitos T CAR123 se expandieron significativamente en la sangre periférica (PB) de los ratones en comparación con los linfocitos T de control y expresaron niveles elevados de CAR123 (Figura 33C). La actividad antileucémica de CART123 fue específica y basada en el reconocimiento de CD123 en la superficie de los blastos ya que cuando los autores injertaron en ratones una leucemia CD123- CD19+ (AV576), solo CART19 mostró actividad antileucémica, mientras que CART123 no tuvo efecto en comparación con los controles UTD (Figuras 39B y 39C).

Con el fin de detectar una posible correlación de la dosis de CART y la actividad antitumoral, se desarrolló un modelo in vivo de ratones que portaban una carga elevada de leucemia (utilizando la línea celular NALM-6). En este modelo, las dosis estándar de CART123 (2 millones de células CAR+) no son capaces de eliminar el tumor. A estos ratones se les inyectaron diferentes dosis de CART123 (1,25, 2 y 5 millones de células CAR+) y se observó una actividad antileucémica relacionada con la dosis (Figura 39D).

CART123 pero no CART19 son sumamente activos en un modelo preclínico novedoso de recaída p o r pérdida de antígeno

Con el fin de estudiar nuevas estrategias para tener como diana recaídas negativas para CD19, se desarrolló un modelo in vivo novedoso de recaída por pérdida de antígeno. Se recogieron blastos de linfocitos B de un paciente (CHP101) participante en uno de los ensayos clínicos con CTL019 de los autores en la situación inicial (antes de la terapia con CTL019), cuando la enfermedad era CD19++ y CD123+, y con recaída después de CTL019 cuando el paciente desarrolló una enfermedad negativa para CTL019 (CD123 aún se expresaba, Figura 40A). A continuación, se expandieron los blastos en ratones NSG y se transdujeron con luciferasa verde de elatéridos (CBG, por sus siglas en inglés) para la enfermedad inicial (CD19+) o luciferasa roja de elatéridos (CBR, por sus siglas en inglés) para recaídas (CD19-) (remítase a la sección de Métodos). De manera importante, durante la expansión in vivo, los blastos mantuvieron la identidad de linfocitos B excepto para CD19 (datos que no se muestran). En un primer experimento, se injertó en ratones NSG la enfermedad inicial CD19+ (CBG, verde) o la leucemia negativa para CD19 (CBR, roja). Ambos grupos se distribuyeron de manera aleatoria para recibir CART19 o linfocitos T de control (UTD) (Figura 34A). Tal como se muestra en la Figura 34B, en ambos grupos los ratones tratados con UTD mostraron una evolución rápida tanto de la enfermedad inicial como con recaída, independientemente de la expresión de CD19. En cambio, en el grupo de ratones tratados con CART19, solo los ratones con injerto de la enfermedad inicial (positivos para CD19) respondieron al tratamiento con CART19 mientras que los ratones con injerto de la enfermedad con recaída (negativa para CD19) mostraron resistencia tal como se esperaba. Esto también se reprodujo in vitro en un ensayo de desgranulación con CD107a (Figura 40B). Con el fin de simular in vivo la presencia de diferentes clones que expresan CD19 o carecen de él, se injertó en ratones NSG una mezcla 1:1 de enfermedad inicial y con recaída; en el día 8 los ratones se distribuyeron aleatoriamente para recibir CART19 o linfocitos T de control. Se monitorizó la carga tumoral con obtención de imágenes de bioluminiscencia que podían discriminar entre el crecimiento relativo de leucemia CD19+ (CBG, verde)/CD19- (CBR, rojo) in vivo. Como se muestra en la Figura 43C, en los ratones que recibieron UTD tanto la leucemia CD19+ (verde) como la CD19- (roja) presentes en el día 6 aumentaron de manera similar en el día 11, mientras que en los ratones tratados con CART19 la enfermedad inicial (verde) se eliminó completamente mientras que la enfermedad con recaída (roja) mostró progresión.

Este modelo de xenoinjerto único de B-ALL negativa para CD19 primaria y fallo de CART19 se utilizó para evaluar la función de CART123 en el tratamiento de las recaídas por pérdida de antígeno. Se injertaron blastos negativos para CD19 primarios (CBR positivo) en ratones NSG (Figura 34D) y los ratones se distribuyeron aleatoriamente para recibir CART19, CART123 o linfocitos T de control. CART19 y los linfocitos T de control mostraron una ausencia total de actividad antitumoral, mientras que CART123 dio lugar a una erradicación completa de la enfermedad y supervivencia a largo plazo en estos ratones (Figuras 34E y 34F). Ciertamente, en un modelo preclínico de B-ALL primaria refractaria a CART19, el CART123 novedoso fue capaz de erradicar la enfermedad y conferir supervivencia a largo plazo.

Con el fin de entender el comportamiento diferencial de CART19 y CART123 en este modelo in vivo a un nivel unicelular, se realizaron una serie de experimentos inyectando una mezcla de CART19 (Violeta CellTrace, azul) y CART123(Naranja CellTracker o TRITC, rojo) marcados de manera diferencial en ratones que portaban blastos primarios positivos para CD19 (GFP) o blastos de recaída negativa para CD19 (GFP) y se controló su comportamiento utilizando microscopia 2-fotónica intravital de la médula de la bóveda craneal aproximadamente 24 horas después de la inyección (esquema experimental, Figura 35A). Estos estudios mostraron que CART19 y CART123 se desplazaron a espacios con médula ósea que contenían leucemia y que el reconocimiento de los linfocitos CART del antígeno afín se correlaciona con la parada de la movilidad. Específicamente, en ratones con injerto de leucemia CD19+CD123+ inicial, se observó que un 62,5% /- 3,8 de CART19 y un 81,1% /- 1,2 de CART123 se habían detenido con una morfología redondeada al lado de los blastos, mientras que en ratones con injerto de leucemia CD19-CD123+ con recaída, únicamente los linfocitos CART123 se detuvieron al lado de las células tumorales (80,9% /- 5,1 de CART123 vs 12,4% /- 2,2 de CART19) (Figuras 35B y 35C). Estos hallazgos indican que en ALL con recaída negativa para CD19 únicamente los CART123 fueron capaces de establecer sinapsis productivas con las células de leucemia (GFP) y, por lo tanto, redujeron su movilidad, mientras que los linfocitos CART19 continuaron rastreando y moviéndose en el entorno sin reconocer a los blastos leucémicos.

La combinación de CART123 y CART19 es capaz de prevenir las recaídas negativas para CD19

CART123 demostró ser eficaz en el tratamiento de recaídas negativas para CD19 producidas después de terapias dirigidas a CD19 en un modelo preclínico de resistencia a CART19. Sin embargo, una estrategia combinatoria podría tratar la enfermedad positiva para CD19 activa a la vez que se previenen las recaídas por pérdida de antígeno. Con el fin de probar esta hipótesis, se generó un modelo del problema cínico emergente de B-ALL con posibilidad de escape por negatividad de CD19 inyectando juntas la enfermedad primaria CD19- y CD19+ en ratones NSG. A continuación, los ratones se distribuyeron aleatoriamente para recibir linfocitos T de control (UTD), CART19 o la combinación de CART19 y CART123, con la misma dosis total de linfocitos T (Figura 36A). Como se muestra en la Figura 36B, los ratones tratados con linfocitos T de control presentaron progresión de ambos clones de leucemia y CART19 mostró una progresión rápida principalmente de la enfermedad negativa para CD19 (roja). Por el contrario, los ratones tratados con la combinación de CART123 y CART19 mostraron eliminación de la enfermedad y mejora de la supervivencia global, como se muestra en la Figura 36C. El análisis de los ratones sacrificados al final del experimento no mostró evidencia de leucemia residual en el grupo de linfocitos T CAR combinados. Por el contrario, los ratones con enfermedad progresiva después de la monoterapia con CART19 mantuvieron el fenotipo negativo para CD19 esperado (Figura 36D).

Por último, los linfocitos T fueron transducidos con 2 lentivirus, uno que portaba CAR19 y el otro CAR123 con el fin de desarrollar un CART capaz de ser activado por CD19 y/o CD123. Como se muestra en la Figura 37A, se detectaron cuatro subconjuntos de linfocitos T transducidos de manera diferente: linfocitos T doblemente negativos para CAR19 y CAR123, monopositivos para CAR19, monopositivos para CAR123 y doblemente positivos para CAR19/CAR123. Se clasificaron estos cuatro subconjuntos y se estudió su funcionalidad y especificidad contra K562-WT, K562 CD19+ o K562 CD123+. La Figura 37B muestra los resultados de un ensayo de desgranulación con CD107a donde los subconjuntos monopositivos responden a su diana específica mientras que la población doblemente positiva es capaz de desgranulación en presencia de K562 que expresa tanto CD19 como CD123. Además, los linfocitos CART estimulados dualmente mostraron una citotoxicidad más potente contra una diana doblemente positiva en comparación con un número equivalente de linfocitos CART estimulados singularmente, lo que sugiere un posible incremento de la eficacia utilizando un CAR que es activado por dos antígenos diferentes. (Figura 37C)

DISCUSIÓN

Las inmunoterapias dirigidas a CD19 están cambiando el paradigma de tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda recurrente y refractaria. Los pacientes con un desenlace que previamente era sombrío ahora disponen de una posibilidad realista de conseguir una respuesta completa y una remisión de la enfermedad a largo plazo. Sin embargo, como se muestra en algunas circunstancias para leucemia tratada con otras formas de potente terapia dirigida, las células de leucemia son capaces de desarrollar mutaciones con pérdida de antígeno que conllevan resistencia y recaídas. En el caso de CART19, se han observado dos patrones de recaídas principales. Los pacientes con una pérdida temprana de CART19 debido a un fracaso de la persistencia están en riesgo de recaídas del clon original; ciertamente, los análisis de la enfermedad residual mínima indican que puede que se necesiten entre 1-6 meses de actividad CART sostenida para erradicar completamente la neoplasia maligna. Por el contrario, aproximadamente un 50% de las recaídas se producen a pesar de la persistencia de CART19 y están caracterizadas por la aparición de una leucemia negativa para CD19. La última observación implica una presión selectiva potente por parte de CART19. Notablemente, también se ha producido recaídas negativas para CD19 después de la terapia con blinatumomab aunque estas representan la minoría de apariciones de recaídas después de esta terapia presumiblemente menos potente. (5) Existen múltiples posibles mecanismos para el desarrollo de enfermedad negativa para CD19. Uno de estos es la selección y ventaja de supervivencia relativa de los clones negativos para CD19 que estuvieran presentes en la situación inicial con una frecuencia muy baja, y esto se consideró inicialmente el factor más probable que conllevaba recaídas negativas para CD19. Más recientemente también se han considerado importantes otros mecanismos tales como la desregulación del corte y empalme de CD19. Aquí se muestra por primera vez que blastos CD19-ve raros en B-ALL pueden contener anomalías citogenéticas características observadas en los blastos de leucemia positivos para CD19 más comunes, lo que confirma esto como un posible mecanismo de recaída negativa para CD19. Los autores han confirmado estos hallazgos al demostrar que los blastos CD123+CD19-ve se pueden injertar en ratones inmunodeficientes, lo que indica que CD123 puede ser un marcador de células madre leucémicas en B-ALL tal como es en AML.

El objetivo de este estudio fue definir estrategias novedosas para tratar pacientes con recaídas por pérdida de antígeno después de terapias dirigidas a CD19. CD123 estuvo muy expresado en la mayoría de B-ALL, y en particular CD123 continuó expresado en aquellos con recaídas con una enfermedad negativa para CD19. Se demostró que la presencia de células leucémicas clonales en la población CD19-CD123+ indica que tener como diana CD123 en combinación con CART19 puede incrementar la probabilidad de erradicar subclones que podrían proliferar debido a la ventaja selectiva debida a la presión con CART19. CD123 ha sido validado previamente como un marcador de la célula madre leucémica en AML. Aquí se mostró que CD123 se va a expresar en la célula madre leucémica (LSC) definida inmunofenotípicamente en ALL, lo que plantea la posibilidad de que tener como diana CD123 en LSC podría promover la erradicación de ALL.

Para estudiar la función de CART123 en recaídas por pérdida de antígeno se desarrolló un modelo de xenoinjerto novedoso de recaídas negativas para CD19 a partir de blastos primarios derivados de un paciente con B-ALL (CHP1010) participante en uno de los ensayos con CTL019 de la Universidad de Pensilvania/Hospital Infantil de Filadelfia. Este paciente, en la situación inicial tuvo un fenotipo CD19+CD123+ clásico pero posteriormente tuvo una recaída con una enfermedad CD19-CD123+ después de tratamiento con CART19. Utilizando este modelo, se demostró que CART123 podría erradicar la enfermedad recurrente y combinado con CART19 podría prevenir la recaída por pérdida de antígeno. Esta es la primera demostración de una combinación de CART dual en un modelo derivado de un paciente con relevancia clínica. Además, mediante el uso de obtención de imágenes intravitales, se mostró que los linfocitos CART entran en la médula ósea en menos de 24 horas después de la inyección intravenosa, buscan sus dianas, y se ralentizan con el fin de interaccionar con las células que portan el antígeno afín. Además, se mostró que una señalización dual CART123/19 fue más eficaz que cualquier CARt solo o una combinación de ambos CAR, lo que es coherente con resultados publicados previamente.

Previamente, se mostró la eficacia preclínica del receptor antigénico quimérico anti-CD123 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda. CART123 provoca toxicidad hematopoyética debido al reconocimiento de CD123 en las células progenitoras y madre hematopoyéticas, un obstáculo potencialmente importante para la traslación clínica ya que una toxicidad profunda en las células madre podría conllevar una mieloablación permanente. Se ha hipotetizado que para minimizar la toxicidad hematopoyética, un constructo novedoso que activara linfocitos T solo tras la activación debida a CD19 o CD123 simultáneamente podría obviar esta toxicidad hematopoyética. Aquí se ha observado que los linfocitos CART que reciben una señal de activación del reconocimiento de CD19 y una señal estimuladora del reconocimiento de CD123 podrían provocar la muerte de células B-ALL así como también evitar la profunda toxicidad hematopoyética que han descrito previamente los autores. Aunque este concepto se ha publicado previamente utilizando un sistema artificial de reconocimiento de CD19/PSMA, este constructo con relevancia clínica representa un avance importante en el campo con una ruta relativamente libre de obstáculos para la traslación clínica. Notablemente, aunque un diseño CAR dual de este tipo estará asociado probablemente con una toxidciad reducida, puede dejar sin abordar el problema de la recaída por pérdida de antígeno al hacer el reconocimiento de CAR más, en lugar de menos, restrictivo. Sin embargo, si tener como diana CD123 erradica con éxito las células madre de ALL, esta estrategia podría ser tanto segura como eficaz.

Resumiendo, en la presente se demuestra una estrategia novedosa y eficaz para el tratamiento de B-ALL teniendo como diana CD123. Esta estrategia es especialmente atractiva debido a que CD123 se expresa en las raras células malignas negativas para CD19 en algunos pacientes con B-ALL y se conserva en las recaídas por pérdida de antígeno que ocurren después de las inmunoterapias dirigidas a CD19. Además la combinación de CART19 con CART123 puede prevenir la aparición de recaídas negativas para CD19.

Ejemplo 8: Potenciación de la función CART e índice terapéutico en combinación con inhibidores de puntos de control

A lo largo de los últimos años, la terapia con linfocitos T con receptor antigénico quimérico (CART) ha evolucionado para convertirse en una terapia poderosa y potencialmente curativa en las neoplasias malignas hematológicas. Los linfocitos CART dirigidos a CD19 han dado como resultado unas tasas de respuesta completa impresionantes de D90% en leucemia linfoblástica aguda que son duraderos para la mayoría de los pacientes. Sin embargo, las tasas de respuesta global en otras neoplasias malignas tales como la leucemia linfocítica crónica son de aproximadamente un 50%. Esto podría estar relacionado en parte con el agotamiento y disfunción de CART inducidos por las células leucémicas. En este ejemplo, se evaluó la función de los receptores/rutas inhibidores para inducir la disfunción y agotamiento de los linfocitos CART en las neoplasias malignas hematológicas.

Como un modelo tumoral, la línea celular de leucemia mieloide aguda (AML) (MOLM14) y muestras de AML primaria se trataron con linfocitos CART dirigidos a CD33 o CD123 (que comprenden dominios estimuladores 41BB y CD3z y un vector lentivírico, constructo 1172 (SEQ ID NO: 707)).

La incubación de muestras de AML primaria o línea celular MOLM14 con CART dirigidos a CD33 o CD123 dio como resultado un aumento regulado significativo de PDL1 en células tumorales después de 24 horas de incubación (0% en el día 0 vs 80% en el día 1, P <0,001), y aumento regulado de PD1 y TIM3 en linfocitos T 3-7 días después del cocultivo (8% de linfocitos T expresaron PD1 en el día 0 vs 43% en el día 3, P=0,03 y 13% de los linfocitos T expresaron TIM3 en el día 0 vs 71% en el día 3, p=0,001, Figuras 41A, 41B y 41C). Un análisis por citometría de flujo adicional demostró el aumento regulado de inhibidores de puntos de control PD1, TIM3 e inhibidores de puntos de control adicionales LAG y CTLA4, en linfocitos T CD8+ (Figuras 42A, 42B, 42C y 42D) y en linfocitos T CD4+. De manera importante, se observó una expresión máxima entre 3-7 días después de la exposición a las células diana (células MOLM14 o de AML primaria).

Para los experimentos in vivo, se injertó en ratones NSG (NOD-SCID-g-'-) una línea celular MOLM14. El tratamiento de estos xenoinjertos de AML con dosis subóptimas de CART CD33 o CD123 dio como resultado respuestas antitumorales iniciales y después recaídas de la enfermedad en un 40-60% de los ratones (Figura 44).

Se aislaron linfocitos T de la médula ósea de estos ratones y se analizaron para determinar la expresión diferencial de los receptores inhibidores. Hubo un incremento significativo del aumento regulado de los receptores PD1 y TIM-3 en los linfocitos T aislados de ratones con enfermedad recurrente en comparación con los linfocitos T aislados de ratones en remisión después de la terapia con linfocitos CART (Figuras 43 y 45).

A continuación, se investigó la función de la adición de inhibidores de los puntos de control para mejorar las funciones de linfocitos T ex vivo después de la terapia con linfocitos CART. Los linfocitos T aislados de médula ósea de ratones que sufrieron recaídas después de la terapia con linfocitos CART se cocultivaron, en presencia de tumor, con un inhibidor de PD-1 (BioXcell, el n.° de catálogo es BE0193 y el n.° del clon es J110), un inhibidor de TIM3 (Biolegend, clon F38-2E2, n.° de catálogo 345010), un inhibidor de CEAc Am (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo SAB1403604-100UG), o la combinación de inhibidores de PD1 y TIM3, o la combinación de inhibidores de PD1 y CEACAM1. Los inhibidores de puntos de control se administraron con una concentración de 1o ug/mL. Hubo una mejora de las funciones efectoras de linfocitos CART medidas en función de la producción de citocinas (por ejemplo, iFN-gamma) y marcador de proliferación Ki-67 en presencia de los inhibidores de puntos de control. La mejora de la función efectora de linfocitos CART fue más pronunciada cuando se combinaron tanto inhibidores de PD1 como de TIM3 (Figura 46A y 46B).

Finalmente, se estudió si combinando inhibidores de puntos de control con CART se mejoraría la actividad antitumoral, por ejemplo, aumento del índice terapéutico y prevención de recaídas en xenoinjertos de AML. En esta estrategia, los xenoinjertos de MOLM14 se trataron con dosis subóptimas de CART dirigidos a CD33 o CD123 o con linfocitos T no transducidos (UTD) de control, con o sin diferentes combinaciones de inhibidores de puntos de control. Se injertó en ratones NSG la línea celular de AML MOLM14. Se confirmó el injerto mediante obtención de imágenes bioluminiscentes. A continuación, se trataron los xenoinjertos de AML con dosis subóptimas (0,25-0,5 x106 de linfocitos T totales i.v.) de CART dirigidos a CD33 o CD123 o con linfocitos T no transducidos (UTD) de control. Los ratones también recibieron bloqueo de PD-1, bloqueo de TIM3 o la combinación de ambos en los días 3, 6, 9 y 12 después de los linfocitos T. Los ratones se controlaron con obtención de imágenes en serie para evaluar la carga de la enfermedad. El esquema experimental se resume en las Figuras 47 y 49.

La adición de inhibidores de puntos de control a los linfocitos T no transducidos no conllevó un efecto antileucémico (Figura 48). Sin embargo, la adición de bloqueo de PD1 o TIM3 dio como resultado una actividad antitumoral sinérgica tal como se muestra en las Figuras 50A, 50B, 50C y 50D. La tasa de respuesta completa duradera fue de: un 45% para el tratamiento con CART123 solo (Figuras 50A, 50B y 50C), un 80% para el tratamiento con CART123 inhibición de PD1 (Figura 50A), un 100% para el tratamiento con CART123 inhibición de TIM3 (Figura 50B), y un 80% para el tratamiento CART123 inhibición tanto de PD1 como de TIM3 (Figura 50C).

Por lo tanto, el tratamiento con CART123 en combinación con inhibidores de puntos de control dio como resultado una actividad antitumoral mayor que el efecto antitumoral observado cuando se administró CART123 combinado con el efecto antitumoral observado cuando se administró cualquiera de los inhibidores de puntos de control solos. Estos resultados indican que las rutas de PD1 y TIM3 están implicadas en el agotamiento y disfunción de CART en AML. La combinación de inhibidores de puntos de control con linfocitos CART puede conllevar funciones mejoradas en AML y otras neoplasias malignas hematológicas.

Ejemplo 9: Una dosis baja de RAD001 estimula la proliferación de CART en un modelo de cultivo celular

Se evaluó el efecto de dosis bajas de RAD001 en la proliferación de linfocitos T CAR in vitro cocultivando células que expresan CART con células diana en presencia de diferentes concentraciones de RAD001.

Materiales y métodos

Generación de lin foc itos T transducidos con CAR

Se utilizó un vector de transferencia lentivírico CAR anti-CD19 humano (huCART19) humanizado para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivíricas pseudotipadas VSVg. La secuencia de aminoácidos y nucleótidos del CAR anti-CD19 humano (huCART19) humanizado es CAR 1, ID 104875 que se describe en la publicación PCT, WO2014/153270, presentada el 15 de marzo de 2014, y se designa SEQ ID NOs. 85 y 31 allí.

El ADN del vector de transferencia lentivírico se mezcla con los tres componentes de empaquetamiento de VSVg env, gag/pol y rev en combinación con el reactivo de Lipofectamine para transfectar células Lenti-X 293T. El medio se cambia tras 24 h y 30 h después, el medio que contiene virus se recoge, se filtra y se almacena a -80 °C. Los CART se generan mediante transducción de linfocitos T vírgenes frescos o congelados obtenidos mediante selección magnética negativa de sangre de donantes sanos o leukopak. Los linfocitos T se activan por incubación con perlas anti-CD3/anti-CD28 durante 24 h, tras lo cual se añade sobrenadante vírico o virus concentrado (MOI = 2 o 10, respectivamente) a los cultivos. Se permite que los linfocitos T modificados se expandan durante aproximadamente 10 días. El porcentaje de células transducidas (que expresan CAR en la superficie celular) y el nivel de expresión de CAR (intensidad de fluorescencia relativa, Geo Mean) se determinan mediante análisis por citometría de flujo entre los días 7 y 9. La combinación de ralentización de la tasa de crecimiento y tamaño de linfocitos T que se acerca a D350 fL determina el estado para que los linfocitos T se crioconserven para un análisis posterior.

Evaluación de la proliferación de CART

Para evaluar la funcionalidad de los CART, los linfocitos T se descongelan y se cuentan y la viabilidad se evalúa mediante Cellometer. El número de células positivas para CAR en cada cultivo se normaliza utilizando linfocitos T no transducidos (UTD). Se estudió el impacto de RAD001 en CART en valoraciones con RAD001, comenzando con 50 nM. La línea celular diana utilizada en todos los experimentos de cocultivo es Nalm-6, una línea celular de leucemia linfoblástica aguda (ALL) de linfocitos pre-B humana que expresa CD19 y transducida para expresar luciferasa.

Para medir la proliferación de CART, los linfocitos T se cultivan con células diana en una proporción de 1:1. El ensayo se lleva a cabo durante 4 días, cuando las células se tiñen para determinar la expresión de ^cD3, CD4, CD8 y CAR. Se evalúa el número de linfocitos T mediante citometría de flujo contando las perlas como referencia.

Resultados

Se estudió la capacidad proliferativa de linfocitos CART en un ensayo de cocultivo de 4 días. Se evaluó el número de linfocitos T positivos para CAR y positivos para CD3 (barras oscuras) y linfocitos T positivos para CD3 totales (barras claras) después de cultivar los linfocitos T transducidos con CAR y no transducidos con Nalm-6 (Fig. 53). Los linfocitos huCART19 se expandieron cuando se cultivaron en presencia de menos de 0,016 nM de RAD001, y en menor grado a concentraciones más elevadas del compuesto. De manera importante, tanto a 0,0032 como 0,016 nM de RAD001 la proliferación fue mayor que la observada sin la adición de RAD001. Los linfocitos T no transducidos (UTD) no mostraron una expansión detectable.

Ejemplo 10: Una dosis baja de RAD estimula la expansión de CART in vivo

Este ejemplo evalúa la capacidad de los linfocitos huCAR19 para proliferar in vivo con diferentes concentraciones de RAD001.

Materiales y métodos:

Células NALM6-luc: Se desarrolló la línea celular de leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana NALM6 a partir de sangre periférica de un paciente con ALL recurrente. Las células se etiquetaron a continuación con luciferasa de luciérnaga. Estas células en suspensión se cultivaron en RPMI complementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente.

Ratones: Se recibieron ratones NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) de 6 semanas de edad de Jackson Laboratory (número de lote 005557).

Implante del tumor: Las células NALM6-luc se cultivaron y expandieron in vitro en RPMI complementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado. Las células se transfirieron a continuación a un tubo cónico de 15 mL y se lavaron dos veces con PBS estéril frío. A continuación, se contaron las células NALM6-luc y se resuspendieron con una concentración de 10x106 células por mililitro de PBS. Las células se colocaron en hielo y se implantaron inmediatamente (en una hora o menos) en los ratones. Las células NALM6-luc se inyectaron por vía intravenosa mediante la vena de la cola en un volumen de 100 pL, para conseguir un total de 1x106 células por ratón.

Dosificación de linfocitos T CAR: Se administraron a los ratones 5x106 linfocitos T CAR 7 días después de implantar el tumor. Las células se descongelaron parcialmente en un baño de agua a 37 grados Celsius y a continuación se descongelaron completamente añadiendo 1 mL de PBS estéril frío al tubo que contenía las células. Las células descongeladas se transfirieron a un tubo Falcon de 15 mL y el volumen final se ajustó a 10 mL con PBS. Las células se lavaron dos veces a 1000 rpm durante 10 minutos cada vez y a continuación, se contaron en un hemocitómetro. Los linfocitos T se resuspendieron a continuación con una concentración de 50x106 linfocitos T CAR por mL de PBS frío y se mantuvieron en hielo hasta que se administraron las dosis a los ratones. A cada ratón se le inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola 100 pL de los linfocitos T CAR para conseguir una dosis de 5x106 linfocitos T CAR por ratón. Se trataron ocho ratones por grupo con 100 pL de PBS solo (PBS) o linfocitos T CAR CD19 humanizados.

Dosificación de RAD001: Se formuló una microemulsión concentrada de 50 mg equivalente a 1 mg de RAD001 y a continuación se resuspendió en D5W (dextrosa al 5% en agua) en el momento de la dosificación. A los ratones se les administraron las dosis por vía oral a diario (vía oral forzada) con 200 pL de las dosis deseadas de RAD001.

Análisis PK: A los ratones se les administraron las dosis de RAD001 a diario comenzando 7 días después del implante del tumor. Los grupos de dosificación fueron de la siguiente manera: 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg. Se extrajo sangre de los ratones en los días 0 y 14 tras la primera y última dosis de RAD001, en los siguientes puntos temporales para el análisis PK: 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas.

Resultados:

Se estudió la expansión y farmacocinética de RAD001 en ratones NSG con tumores NALM6-luc. La dosificación oral diaria de RAD001 solo no tuvo un impacto en el crecimiento de los tumores NALM6-luc (Figura 54). El análisis farmacocinético de RAD001 mostró que es bastante estable en la sangre de los ratones que portan el tumor (Figura 55A y 55B). Tanto el día 0 como el día 14 los análisis PK muestran que las concentraciones de RAD001 en la muestra son superiores a 10 nM incluso 24 horas después de la dosificación con la dosis más baja estudiada (0,3 mg/kg).

Basándose en estas dosis, se administraron dosis de los linfocitos T CAR huCAR19 con y sin RAD001 para determinar la capacidad proliferativa de estas células. La dosis más elevada utilizada fue de 3 mg/kg basada en los niveles de RAD001 en la sangre 24 horas después de la dosificación. Como la concentración de RAD001 fue superior a 10 nM 24 horas después de la dosis final de RAD001, se utilizaron varias dosis más bajas de RAD001 en el estudio in vivo con los linfocitos T CAR. Se administraron dosis de los linfocitos T CAR IV un día antes de comenzar la dosificación oral diaria de RAD001. Se monitorizaron los ratones mediante FACS para determinar la expansión de linfocitos T.

Las dosis más bajas de RAD001 muestran una proliferación potenciada de los linfocitos T CAR (Figura 56). Esta proliferación potenciada es más evidente y prolongada con linfocitos T CAR CD4+ que con los linfocitos T CAR CD8+. Sin embargo, con los linfocitos T CAR CD8+, la proliferación potenciada se puede observar en puntos temporales tempranos tras la dosis con linfocitos T CAR. En algunas realizaciones, también se puede utilizar un linfocito con ARN de CART combinado con inhibidores de puntos de control.

Ejemplo 11: Caracterización in v itro de la estrategia de terminación de CART123

Las estrategias de terminación tienen un interés particular para minimizar la toxicidad de la terapia con CART123. Una estrategia para reducir la actividad de CART123 conlleva la ablación de linfocitos T que expresan CAR CD123 mediante la coexpresión de CAR123 con CD20, y la utilización del anticuerpo anti-CD20 rituximab que tiene como diana los linfocitos CART123 y provoca su destrucción. En este ejemplo, se genera un linfocito CART123 que coexpresa CD20 y se caracteriza mediante varios ensayos in vitro, tal como desgranulación y capacidad de producción de citocinas.

Se construyó un vector de expresión para expresar un CAR CD123 y CD20. El mapa del vector se muestra en la Figura 57. NVS2 CAR123 (también denominado en la presente CAR123-2) está compuesto por un fragmento variable monocatenario humanizado dirigido contra CD123, bisagra de CD8, dominio transmembrana de CD8 y dominios coestimuladores de 41BB y CD3. NVS2 CAR123 está bajo el promotor EF1 alfa y está ligado operablemente a la molécula de CD20 completa con una proteína P2A. Las células que expresan solo CAR123 se denominan en la presente linfocitos CART123, y las células que coexpresan CAR123 y CD20 se denominan en la presente linfocitos CART123P2ACD20.

Para el ensayo de desgranulación con CD107, se cultivaron linfocitos CART123 y CART123P2A CD20 solos, con la línea celular positiva para CD123 MOLM14, la línea celular de control negativo de CD123 Jurkat y con PMA/lonomicina como un control positivo, en presencia de moléculas coestimuladoras CD49d, CD28 y monensina. Se midió CD107a mediante citometría de flujo después de 4 horas de incubación. Los linfocitos CART123 P2A CD20 experimentan una desgranulación con CD107a específica sólida en respuesta a la diana positiva para CD123, similar a los linfocitos CART123 (Figura 58), y de esta manera se demuestra que la introducción de la molécula CD20 no tiene un impacto adverso en la desgranulación de los linfocitos CART123.

También se evaluó la producción de citocinas de los linfocitos CART123P2A CD20. Se cultivaron linfocitos CART123 y CART123P2A CD20 solos, con la línea celular positiva para CD123 MOLM14, la línea celular de control negativa para CD123 Jurkat y con PMA/lonomicina como un control positivo, en presencia de moléculas coestimuladoras CD49d, CD28 y monensina. Las células se recolectaron después de cuatro horas, se fijaron y permeabilizaron, se tiñeron para detectar las citocinas GM-CSP, TNFa, IFNy, o IL-2, y se realizaron análisis por citometría de flujo. Los resultados de estos ensayos demostraron que la mayoría de linfocitos CART123 P2A CD20 producen GM-CSF (Figura 59A), TNFa (Figura 59B), IFNy (Figura 59C) e IL-2 (Figura 59D) en respuesta a la diana positiva para CD123, similar a los linfocitos CART123.

En un ensayo de citotoxicidad, se incubaron linfocitos CART123 y CART123P2A CD20 con MOLM14-luc durante 24 h con diferentes proporciones E:T como se indica, y a continuación se realizó obtención de imágenes bioluminiscentes como una medida de las células vivas residuales. Los resultados mostraron que los linfocitos CART123 P2A CD20 daban como resultado la muerte específica de MOLM14 con la diana positiva para CD123, que es comparable a los linfocitos CART123 (Figura 60).

A continuación se evaluó la citotoxicidad mediada por rituximab para los linfocitos CART123 P2A CD20. Se incubaron CART123 y CART123 P2A CD20 con diferentes concentraciones de rituximab, 0 pg/mL, 1 pg/mL, 10 pg/mL y 100 pg/mL. Las células se recolectaron a las 0, 4, 12 y 48 horas y se tiñeron para detectar CD3. Se calculó el porcentaje de disminución de linfocitos T. Rituximab dio lugar a una toxicidad directa, con la concentración de 100 ug/mL y después de 48 horas de incubación en linfocitos CART123P2A CD20 (Figura 61B) pero no en los linfocitos CART123 (Figura 61A).

Se investigó el mecanismo por el cual está mediada la disminución de los linfocitos CART123P2ACD20. Los linfocitos CART123 P2A CD20 se incubaron con diferentes concentraciones de rituximab de 0 pg/mL, 1 pg/mL, 10 pg/mL y 100 pg/mL, en presencia de un 15% de complemento de conejo. Tal como se muestra en la Figura 62, 1 ug/mL o 10 ug/mL de rituximab dieron como resultado una disminución de la mayoría de linfocitos CART123 P2A CD20 después de 12 horas de incubación. 100 ug/mL de rituximab dieron como resultado una disminución de la mayoría de linfocitos CART123 P2A CD20 después de 4 horas de incubación. La disminución de linfocitos CART123 P2A CD20 está mediada por la citotoxicidad dependiente del complemento.

Ejemplo 12: Estrategias de terminación eficaz de CART CD123

Muchos niños y adultos con leucemia mieloide aguda (AML) recaen o son incurables con las modalidades de tratamiento actuales, lo que resalta la necesidad de terapias alternativas. Los linfocitos T con receptor antigénico quimérico que tienen como diana CD123 (CART 123) han demostrado una potente actividad antileucémica en modelos murinos de xenoinjerto de AML humana. Sin embargo, el tratamiento con CART123 de ratones con injerto de células hematopoyéticas humanas normales dio como resultado una profunda mieloablación, lo que suscita preocupación sobre una toxicidad hematológica grave en pacientes con AML que se puedan tratar con terapias de este tipo. Aquí, se evaluó si la disminución de linfocitos T después de la erradicación inducida por CART123 de AML podría minimizar esta toxicidad en células cercanas sin afectar al control de la leucemia, e incrementar de esta manera el margen terapéutico de la inmunoterapia con linfocitos CART anti-AML.

Métodos

Se examinaron tres estrategias de terminación en modelos de xenoinjerto de AML humana: (1) ablación de linfocitos T con el anticuerpo anti-CD52 alemtuzumab después del tratamiento con 1x105-1x106 linfocitos T transducidos con lentivirus con CART123 anti-CD 123-41BB-CD3zeta, (2) ablación de linfocitos T con el anticuerpo anti-CD20 rituximab después del tratamiento con 1x105-1x106 CART123 modificados para coexpresar CD20 (CART123/CD20), y (3) tratamiento con linfocitos T CAR electroporados con ARNm anti-CD123 (ARN-CART123) «biodegradables». Se trataron ratones con injerto de líneas celulares AML humana que expresaban luciferasa (MOLM14, MOLM13, U937) o muestras de AML primaria (n = 3) con los linfocitos T CAR redirigidos a CD123 como anteriormente. El constructo CAR CD123 utilizado para este experimento es el constructo 1172 (SEQ ID NO: 707) y se administró a los ratones en la semana 1. Para los estudios de disminución de linfocitos T, se inyectaron por vía intraperitoneal (IP) 1 o 5 mg/kg de alemtuzumab en la semana 2, semana 3 o semana 4 (por ejemplo, 1, 2 o 3 semanas después de CART123) para determinar la dosificación óptima y momento de la ablación de linfocitos T. En estudios posteriores, se inyectaron IP 10 mg/kg de rituximab 4 semanas después de CART123/CD20 o se inyectaron por vía intravenosa 1x107 ARN-CART123 en los días 5, 9 y 16 después del injerto de AML. Los ratones se controlaron semanalmente mediante obtención de imágenes bioluminiscentes y/o análisis por citometría de flujo cuantitativos de sangre, bazo y/o médula ósea.

Resultados

El tratamiento con CART123 de xenoinjertos de AML CD123+ indujo la expansión de linfocitos T marcados y erradicación de la leucemia in vivo, lo que dio como resultado una supervivencia del animal a largo plazo (p<0,0001 vs controles tratados con linfocitos T no transducidos). Se observaron mínimos efectos xenogénicos de injerto frente al hospedador.

Los resultados de la ablación en serie de CART123 en el modelo de xenoinjerto por administración de alemtuzumab se muestran en la Figura 72A. La cuantificación de los linfocitos CART123 también se realizó en los puntos temporales correspondientes (Fig. 72B) y muestran que las dosis únicas de alemtuzumab eliminaron rápidamente los linfocitos CART123. Una dosis de alemtuzumab eliminó rápidamente los linfocitos T en todos los modelos estudiados con la mejor eficacia con una dosificación de 5 mg/kg en la semana 4 (por ejemplo, 3 semanas después de CART123). El análisis de la supervivencia global se muestra en la Figura 72C, que demuestra que los ratones que recibieron alemtuzumab en la semana 3 o semana 4 mostraron una mejor supervivencia en comparación con los ratones que recibieron alemtuzumab en la semana 2.

CART123/CD20 erradicó AML con una cinética similar a la de CART123, y 1 dosis de rituximab 4 semanas después de la infusión con CART123/CD20 eliminó rápidamente los linfocitos T a la vez que conservó la remisión de la leucemia. Los ratones con remisión de AML inducida por CART123 o CART123/CD20 en el momento de la administración de alemtuzumab o rituximab siguieron estando libres de leucemia durante > 12 semanas (Fig. 72A), y la supervivencia de los animales no difirió de la de ratones tratados con linfocitos T CAR redirigidos a CD123 que no habían experimentado disminución de linfocitos T (p = 1,00). En cambio, los ratones tratados con CART123 con una AML residual en el momento de la administración anterior con alemtuzumab experimentaron una progresión de AML rápida, coherente con una eliminación de linfocitos T anterior eficaz (Figura 72A).

Además, la reexposición («recaída») a AML de los animales con ablación anterior de linfocitos T debida a alemtuzumab o rituximab dio como resultado una proliferación rápida de AML sin reemergencia de linfocitos T, lo que confirma que la disminución de linfocitos T había sido completa. Los ratones no sometidos a ablación demostraron una reexpansión de linfocitos T CAR con rechazo de la reexposición CD123+ (p<0,0001) (Fig. 72A).

También se examinó el tratamiento con alemtuzumab en un segundo modelo in vivo, un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes pediátricos. En este modelo, se inyectaron a los ratones células AML290. Seis semanas después del injerto de AML, se administró a los ratones solución salina, linfocitos T no transducidos o linfocitos CART123 (se representa en la semana 0). Se administraron 5 mg/kg de alemtuzumab a un subconjunto de los ratones que recibieron linfocitos CART123 en la semana 4. Se mostró que el tratamiento con alemtuzumab eliminó completamente los linfocitos T CART123 en la sangre periférica (Fig. 73B). El análisis de la progresión tumoral mostró que los ratones que recibieron CART123 demostraron remisión hasta 8 semanas después del tratamiento con CART123. Los ratones que recibieron tratamiento de alemtuzumab y ablación de linfocitos CART123 en la semana 4 permanecieron en remisión (Fig. 73A). El análisis de AML presente en diferentes órganos de los xenoinjertos después de la dosificación de CART123 se determinó mediante citometría de flujo. El tratamiento con linfocitos CART123 dio como resultado la ablación de las células AML tanto en el bazo (Fig. 74A) como en la médula ósea (Fig. 74B). El tratamiento con alemtuzumab 4 semanas después de la dosificación de CART123 mantuvo la remisión, como demuestra la ablación sostenida de células AML en el bazo (Fig. 74A) y médula ósea (Fig. 74B).

ARN-CART123 eliminó de la manera más rápida AML y facilitó la supervivencia de los animales a largo plazo, aunque ARN-CART123 tiene una persistencia in vivo previsiblemente más corta que la que tienen CART123 o CART123/CD20. Alemtuzumab o rituximab solos no inhibieron la proliferación de AML en modelos de xenoinjerto no tratados con CART123 vs controles de solo AML (p = 1,00).

La comparación de las tres estrategias de terminación descritas en este ejemplo se muestra en la Figura 75.

Conclusiones:

Alemtuzumab y rituximab eliminaron completamente los linfocitos T CAR redirigidos a CD123 en modelos de xenoinjerto de AML humana. La remisión de la leucemia sostenida requirió persistencia de CART123 o CART123/CD20 durante 4 semanas antes de la terminación de linfocitos T mediante 5 mg/kg de alemtuzumab o 10 mg/kg de rituximab después de CART123 o después de CART123/CD20, respectivamente. Estudios en curso están investigando la eficacia de la eliminación de linfocitos T en modelos adicionales de xenoinjerto de AML primaria y respecto a otras inmunoterapias con linfocitos T CAR anti-AML. Estas estrategias de terminación de linfocitos T pueden aumentar la eficacia de la terapia con linfocitos T CAR en pacientes con AML, particularmente antes de un posible trasplante de células madre hematopoyéticas.

Ejemplo 13: Combinaciones de CAR19 y CAR123

La mayoría de los blastos de leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (B-ALL) coexpresan CD19 y CD123. Tener como diana ambos antígenos a la vez puede conllevar una mayor actividad antitumoral y reducir la tasa de recaídas. Como se describe en el Ejemplo 8, la combinación de CAR19 y CAR123 posee una mayor eficacia terapéutica. En este ejemplo, se investigan diferentes constructos para administrar la combinación de CAR19 y CAR123.

Una estrategia para administrar la combinación de CAR19 y CAR123 es mediante un CART dual, donde un linfocito T expresa constructos tanto de CAR19 como CAR123. Se construyó un único vector lentivírico que porta las secuencias tanto de CAR19 como CAR123 (en lugar de 2 vectores separados) para facilitar la producción de CART dual para uso clínico (Figura 63A). El constructo lentivírico incluye tanto CAR19 como CAR123 ligados mediante un dominio P2A bajo el promotor EF1. Los linfocitos T se transdujeron con el constructo lentivírico, se cultivaron durante 6 días y a continuación se tiñeron con un anticuerpo específico para scFv CD19 y el péptido CD123-His y anticuerpo anti-His-PE, para el análisis por citometría de flujo. Los resultados muestran que se detectaron linfocitos T que expresan tanto CAR19 como CAR123 (Figura 63B).

En otra estrategia, se utilizó una estrategia de CAR dividido para expresar CAR19 y CAR123. En esta estrategia, se construyó un vector donde un CAR123 que comprende el dominio coestimulador de 4-1BB se ligó a través de un domino P2A a un CAR19 que comprende el dominio de señalización primaria de CD3zeta (Figura 64A). Específicamente, el CAR123 comprendió un scFv CD123, bisagra de CD8 y dominio transmembrana de CD8 y el dominio 4-1BB. El CAR19 comprendió un scFv CD19, bisagra de CD8 y dominio transmembrana de CD8 y el dominio CD3 zeta. En esta estrategia, únicamente el reconocimiento tanto de CD19 como CD123 por parte de las respectivas porciones de scFv del CAR dará como resultado la activación del linfocito CART dividido. Los linfocitos T se transdujeron con el constructo lentivírico, se cultivaron durante 6 días y a continuación se tiñeron con un anticuerpo específico para scFv CD19 y el péptido CD123-His y anticuerpo anti-His-PE, para el análisis por citometría de flujo. Los resultados muestran que se detectaron linfocitos T que expresan tanto CAR19 como CAR123 (Figura 64B).

Ejemplo 14: Terapia con CART CD123 en trastornos histiocíticos

La terapia con CART CD123 puede ser útil en los trastornos histiocíticos, tales como BPDCN o trastornos de mastocitos. En este ejemplo, se realizaron experimentos para evaluar la función de CART123 en el contexto de una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN, por sus siglas en inglés) y trastornos de mastocitos (tales como la mastocitosis sistémica y leucemia de mastocitos).

BPDCN es una neoplasia hematológica agresiva y rara que surge de los precursores de pDC, clasificada como una neoplasia de células dendríticas/histiocitos. Todas las BPDCN expresan CD123. CD123 parece ser crucial para la supervivencia de BPDCN ya que los blastos de BPDCN requieren iL-3 para una propagación ex vivo con éxito. A pesar de las tasas de respuesta elevadas iniciales a la quimioterapia, la supervivencia a largo plazo es normalmente muy desalentadora, y la supervivencia mediana es de 9-13 meses indistintamente de la presentación inicial.

Se determinó la expresión de CD123 mediante citometría de flujo en células madre hematopoyéticas (HSC), línea celular de leucemia mieloide aguda (AML) o dos BPDCN diferentes. Se indica la intensidad de la fluorescencia mediana. En la Figura 65 se muestra la expresión de CD123 en AML, células CD34+ de médula ósea normales y dos casos de BPDCN. Estos datos indican que CD123 se expresa con niveles 10-20 veces más elevados en BPDCN en comparación con médula ósea normal.

Se generaron constructos CART123 adicionales utilizando clones anti-CD123 alternativos (32716 (también denominado en la presente el constructo 1172) y 26292 (también denominado en la presente el constructo 1176), ambos constructos se describen y caracterizan en el documento PCT/US2014/017328. Se realizaron ensayos de muerte celular de manera similar a los descritos en el Ejemplo 2 o 3. El clon 26292 dio lugar a una muerte reducida de células CD34 normales en comparación con BPDCN o AML de control positivo, lo que indica que es factible producir CART-123 con una actividad atenuada que podría generar un margen terapéutico aumentado (Figura 66B). Por el contrario, el clon 32716 mostró una muerte de células CD34 y BPDCN similar (Figura 66A).

Se realizaron análisis sensibles de la función de linfocitos T tal como desgranulación y producción de citocinas de manera similar a los descritos en el Ejemplo 2 o 3. El clon 26292 CART123 se incubó con HSC CD34+ (Figura 67, fila superior) o BPDCN (Figura 67, fila inferior) durante cuatro horas. Se evaluó la desgranulación de CD107. Los resultados del ensayo de desgranulación mostraron que las funciones efectoras del clon 26292 todavía pueden ser activadas por HSC CD34+ (Figura 67, fila superior).

Los trastornos de mastocitos, incluidas la mastocitosis sistémica y leucemia de mastocitos, son neoplasias malignas histiocíticas raras que están asociadas con un mal pronóstico. Los mastocitos expresan niveles elevados de CD123 y, por lo tanto, los trastornos de mastocitos se podrían tratar con CART123.

Se realizó el análisis de la expresión de CD123 en trastornos de mastocitos. Las células mononucleares de la sangre de un paciente con leucemia de mastocitos/mastocitosis sistémica se tiñeron con live/dead aqua (LDAQ, eje x en la Figura 68A y 68B) e isotipo (Figura 68A) o CD123 PE (Figura 68B). La mayoría de las células SM expresan CD123.

Se realizó un ensayo de desgranulación con CD107 para evaluar la actividad de CART123 en presencia de células de leucemia de mastocitos. Las células CART123 se cultivaron solas, con PMA e ionomicina (Figura 69A) o con células mononucleares de la sangre de un paciente con leucemia de mastocitos/mastocitosis sistémica (Figura 69B) durante dos horas, en presencia de un anticuerpo anti-CD107a. Se seleccionaron los linfocitos T utilizando anti-CD3. Se seleccionó la positividad para CD107a utilizando el tubo de CART123 solo. La respuesta de CART123 a células SM es equivalente a la generada con el control positivo PMA ionomicina.

Ejemplo 15: Efecto de CART123 en el m icroentorno tumoral

En este ejemplo, los ensayos se realizan para estudiar el efecto de las células que expresan CAR CD123 en el microentorno tumoral. Estos ensayos se pueden utilizar para evaluar el efecto de CART123 en el microentorno tumoral en el linfoma de Hodgkin.

Se realiza un primer ensayo para determinar si las células malignas, por ejemplo, células de linfoma de Hodgkin (células HL), conllevan un fenotipo inmunosupresor en las células en el microentorno tumoral, por ejemplo, monocitos. Las células monocíticas y células Hl se cultivan en una placa Transwell que comprende una cámara superior y una inferior. Las células monocíticas y malignas se cultivan en las siguientes configuraciones: (1 ) la célula monocítica se cultiva en una cámara, por ejemplo, la cámara inferior, y la célula de HL se cultiva en la otra cámara, por ejemplo, la cámara superior, (2) la célula monocítica y la célula HL se cultivan juntas en el mismo lado de una placa Transwell, o (3) la célula monocítica se cultiva sola (control). Las células se cultivan durante un periodo de tiempo deseado, y a continuación las células se recolectan para el análisis por citometría de flujo o PCR cuantitativa en tiempo real para detectar el fenotipo monocítico, por ejemplo, fenotipo inmunosupresor, evaluando los niveles de marcadores tales como CD14 y HLADR.

Se realiza un segundo ensayo para determinar si las células inmunosupresoras del microentorno tumoral, por ejemplo, monocitos, pueden inhibir la inmunidad antitumoral por linfocitos T mediada por linfocitos CART. Este ensayo se puede realizar de dos maneras diferentes, utilizando una placa Transwell si se sospecha que la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T ocurre mediante un factor soluble, o utilizando recipientes para células estándar si se sospecha que la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T está mediada por el contacto. Para un ensayo donde la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T pueda producirse mediante un factor soluble, las células se cultivan en una placa Transwell que comprende una cámara superior y una inferior. Las células se cultivan en las siguientes configuraciones: (1) una células Hl en una cámara, por ejemplo, cámara superior, y un linfocito CART19 y una célula tumoral que expresa CD19, por ejemplo, un linfocito B tumoral, en la otra cámara, por ejemplo, cámara inferior; (2) un monocito en una cámara, por ejemplo, cámara superior, y un linfocito CART19 y una célula tumoral que expresa CD19, por ejemplo, un linfocito B tumoral, en la otra cámara; y (3) una célula HL y un monocito en una cámara, por ejemplo, cámara superior, y un linfocito CART19 y una célula tumoral que expresa CD19, por ejemplo, un linfocito B tumoral, en la otra cámara. Para un ensayo donde la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T pueda estar mediada por el contacto, las células se cultivan en las siguientes configuraciones: (1) una célula HL, un linfocito CART19 y una célula tumoral que expresa CD19; (2) un monocito, un linfocito CART19 y una célula tumoral que expresa CD19; y (3) una célula HL, un monocito, un linfocito CART19 y una célula tumoral que expresa CD19. Las células se cultivan durante un periodo de tiempo deseado, y a continuación se evalúa la función CART19. Los ensayos para evaluar la función CART19 incluyen ensayos de proliferación y muerte, por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos 2 y 3.

Se realiza un tercer ensayo para determinar que CART123 tenga como diana las células inmunosupresoras en el microentorno tumoral. Este ensayo se puede realizar de dos maneras diferentes, utilizando una placa Transwell si se sospecha que la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T ocurre mediante un factor soluble, o utilizando recipientes para células estándar si se sospecha que la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T está mediada por el contacto. Para un ensayo donde la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T pueda producirse mediante un factor soluble, las células se cultivan en una placa Transwell que comprende una cámara superior y una inferior. Las células se cultivan en las tres configuraciones de la placa Transwell para el segundo ensayo descritas anteriormente y, además, se cultivan en las siguientes configuraciones que incluyen el linfocito CART123: (4) una célula HL y un linfocito CART123 en una cámara, por ejemplo, cámara superior, y un linfocito CART19 y una célula tumoral CD19+CD123-, por ejemplo, un linfocito B tumoral, en la otra cámara, por ejemplo, cámara inferior; (5) un monocito y un linfocito CART123 en una cámara, por ejemplo, cámara superior, y un linfocito CART19 y una célula tumoral CD19+CD123-, por ejemplo, un linfocito B tumoral, en la otra cámara; y (6) una célula HL, un monocito y un linfocito CART123 en una cámara, por ejemplo, cámara superior, y un linfocito CART19 y una célula tumoral CD19+CD123-, por ejemplo, un linfocito B tumoral, en la otra cámara. Para un ensayo donde la inhibición de la inmunidad antitumoral por linfocitos T pueda estar mediada por contacto, las células se cultivan en los tres recipientes de cultivo celular estándar para el segundo ensayo descritos anteriormente y, además, se cultivan en las siguientes configuraciones que incluyen el linfocito CART123: (4) una célula HL, un linfocito CART19, un linfocito CART123 y una célula tumoral CD19+CD123-; (5) un monocito, un linfocito CART19, un linfocito CART123 y una célula tumoral CD19+CD123-; y (6) una célula HL, un monocito, un linfocito CART19, un linfocito CART123 y una célula tumoral CD19+CD123-. Las células se cultivan durante un periodo de tiempo deseado, y a continuación se evalúa la función CART19. Los ensayos para evaluar la función CART19 incluyen ensayos de proliferación y muerte, por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos 2 y 3.

Ejemplo 16: Estudio clín ico de ARN CART123 en AML refractaria o recurrente

Este estudio analiza la viabilidad, seguridad y eficacia de la administración intravenosa de linfocitos T autólogos electroporados con ARN que expresan receptores antigénicos quiméricos anti-CD123 que expresan en tándem los dominios coestimuladores de TCRz y 4-1BB (TCRZ /4-1BB) (denominados «ARN CART123») en sujetos con leucemia mieloide aguda (AML). Este estudio evalúa 15 sujetos. Los sujetos evaluables son aquellos que reciben al menos una dosis de linfocitos ARN CART123. La duración de la intervención de protocolo activo es de aproximadamente 2 meses desde la visita de cribado. Los sujetos se controlan durante 6 meses después de su primera infusión.

Los objetivos primarios de este estudio son evaluar la seguridad de ARN CART123 en sujetos con AML registrando la frecuencia y gravedad de eventos adversos, que incluyen, sin carácter limitante, la estimación de la frecuencia de CRS (síndrome de liberación de citocinas) y MAS (síndrome de activación de macrófagos). Los objetivos secundarios de este estudio incluyen: (1) determinar la persistencia y tráfico de linfocitos con ARN de CART123; (2) estimar la eficacia de al menos 1 dosis de linfocitos con ARN de CART123 en sujetos con AML midiendo la reducción del recuento de blastos en la sangre periférica y médula ósea; (3) estimar la eficacia de al menos 1 dosis de linfocitos con ARN de CART123 en sujetos con AML midiendo la tasa de respuesta global (ORR, por sus siglas en inglés) a los 28 /- 5 días, utilizando (i) un criterio de respuesta completa morfológico estándar (blastos malignos <5% con recuperación del recuento), (ii) blastos malignos <5% sin recuperación del recuento, y (iii) evaluación de la enfermedad residual mínima; (4) determinar la supervivencia global (OS) y supervivencia sin progresión (PFS, por sus siglas en inglés) y causa(s) de muerte para todos los sujetos hasta 6 meses después de la infusión de linfocitos con ARN de CART123; (5) determinar la duración de la respuesta (DOR, por sus siglas en inglés) para los sujetos que responden al tratamiento hasta 6 meses después de la infusión de linfocitos con ARN de CART123; y (6) determinar el porcentaje de sujetos que pasan a HCT alogénico (o HCT alogénico secundario).

Los sujetos aptos son hombres o mujeres de más de 18 años de edad con AML o síndrome mielodisplásico sin opciones de tratamiento curativo disponible utilizando las terapias disponibles en la actualidad. Sujetos con una segunda o posterior recaída, cualquier recaída refractaria al tratamiento de último recurso, o con una enfermedad persistente después de al menos dos líneas de terapia. Los sujetos deben tener una enfermedad evaluable >5% de blastos en el aspirado de médula ósea o biopsia, o enfermedad extramedular (la afectación del SNC está prohibida) en las 2 semanas anteriores al cribado.

Los sujetos se tratan con administración IV de linfocitos T con ARN de CAR anti-CD123 durante hasta seis dosis en total a lo largo de 2 semanas. La dosificación depende del peso del sujeto con una modificación escalada de la dosis en el sujeto. Los sujetos se dividen en dos cohortes. La cohorte 1 incluye los primeros 3 sujetos en recibir linfocitos con ARN de CART123 y recibe 3 modificaciones escaladas de la dosis de linfocitos con ARN de CART123, sin quimioterapia linforreductora antes de la infusión (Figura 70). La cohorte 2 incluye los 12 sujetos restantes del estudio, y recibe hasta seis dosis IV de linfocitos con ARN de CART123 con una modificación escalada de la dosis (Figura 71). La cohorte 2 puede recibir quimioterapia linforreductora 4 días (+/- 1 día) antes de la primera infusión de linfocitos CART123 (si ALC>500/uL). La quimioterapia linforreductora se puede repetir antes de la cuarta dosis de linfocitos con ARN de CART123 (si ALC>500/uL). La quimioterapia linforreductora incluye una dosis única de ciclofosfamida (1mg/m2). La dosis de quimioterapia linforreductora dentro de la pauta de tratamiento con ARN de CART123 se diseña para potenciar el injerto de las dosis posteriores de linfocitos T al aumentar el espacio homeostático.

En la siguien l r r i n n l i linf i ART n f n i n l :

El peso utilizado para la dosificación puede ser el peso obtenido antes del procedimiento de aféresis. Los números de células se basan en células CAR+ con expresión de CAR determinada por citometría de flujo. La dosificación no cambiará por cambios en el peso del sujeto. Las dosis indicadas con /-20% para tener en cuenta la variabilidad de la producción.

A continuaci n r r i n n r r m i n l i m r ARN ART12 :

Las evaluaciones tumorales iniciales y posteriores se realizarán de acuerdo con la práctica clínica del tratamiento habitual para AML. La evaluación de la médula ósea de AML inicial se puede realizar si la última de médula ósea del sujeto se realizó más de 2 semanas antes de la primera dosis de ciclofosfamida. Los sujetos tendrán una evaluación de la médula para determinar la respuesta de la leucemia en el Día 16 /- 2 (o en un plazo de como máximo 7 días de la última infusión de ARN CART123 recibida), Día 28 /- 5, y tanto a los 3 como 6 meses (para sujetos que no pasaron a un HCTalo). Los niveles de linfocitos CART y citocinas se determinarán mediante la prueba apropiada en el laboratorio de investigación de TCSL. Las definiciones de respuesta a la enfermedad pueden ser las estándar para AML.

Todos los sujetos con aplasia de médula ósea en D28 /- 5 (o 14 días después de la última infusión de linfocitos T, lo que ocurra antes) se someterán a un trasplante de células hematopoyéticas alogénico (HCTalo) como estrategia de rescate. Por lo tanto, todos los sujetos deberían tener identificado previamente un donante de células madre. La aplasia de médula ósea se define como una reducción >75% en la celularidad respecto a la normal para su edad, junto con ANC < 0,5 k/uL o plaquetas <50 k/uL.

Se define la toxicidad limitante del tratamiento (TLT, por sus siglas en inglés) como cualquier evento inesperado que posible, probable o definitivamente está relacionado con la infusión de linfocitos T, que incluye un evento adverso no hematológico de grado 3 o superior y cualquier reacción de hipersensibilidad y reacción autoimunitaria de grado 3 o superior tal como se define en la Sección 5.5. Los siguientes eventos no comprenden TLT: fiebre e infección, citopenias de cualquier grado, síndrome de lisis tumoral, síndrome de liberación de citocinas o cualesquiera anomalías metabólicas o de laboratorio que se resuelven en un Grado 2 o inferior en el plazo de siete días.

La notificación de eventos adversos comienza al inicio de la primera dosis de linfocitos con ARN de CART123 y continuará hasta el mes 4 o hasta el acondicionamiento para HCT o el inicio de otra terapia alternativa, lo que ocurra antes. Los sujetos se pueden reevaluar de manera continua para detectar evidencia de toxicidad aguda o acumulativa.

EQUIVALENTES

Aunque esta invención se ha divulgado haciendo referencia a aspectos específicos, es evidente que los expertos en la técnica pueden diseñar otros aspectos y variaciones de esta invención sin alejarse del alcance de la invención tal como la definen las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), donde el CAR comprende un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y donde dicho dominio de unión a CD123 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC), donde además dicho dominio de unión a CD123 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC), donde:

(a) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 487, 492, 497, 502, 507 y 512, respectivamente;

(b) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 517, 522, 527, 532, 537 y 542, respectivamente; o

(c) dichas secuencias de CDR1 de HC, CDR2 de HC, CDR3 de HC, CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 335, 363, 391, 419, 447 y 475, respectivamente.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, donde:

(a) dicha molécula de ácido nucleico codifica un CAR que comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 276;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 276; o (iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 276;

(b) dicha molécula de ácido nucleico codifica un CAR que comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 217;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 217; o (iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 217;

(c) el dominio de unión a CD123 codificado comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 480;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones respecto a la SEQ ID NO: 480; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la SEQ ID NO: 480;

(d) el dominio de unión a CD123 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo constituido por las SEQ ID NO: 479 y 481, o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a estas;

(e) el CAR codificado incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

(f) dicha molécula de ácido nucleico:

(i) codifica un dominio transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; o

(ii) comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a esta;

(g) el dominio de unión a CD123 codificado está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, opcionalmente donde o bien:

(i) la región de bisagra codificada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones respecto a esta, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la SEQ ID NO: 2; o bien

(ii) la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región de bisagra comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13, o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a esta;

(h) el CAR codificado comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones respecto a la SEQ ID NO: 99; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la SEQ ID NO: 99, y/o

(i) dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 40, o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a la SEQ ID NO: 40.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:

(a) el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio coestimulador que es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína que se selecciona del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a inmunoglobulinas, un receptor de citocinas, una integrina, una molécula de señalización de la activación linfocitaria (proteína SLAM), un receptor de activación de linfocitos NK, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CDIIb, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83, opcionalmente donde o bien:

(i) el dominio coestimulador codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; o bien

(ii) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a esta;

(b) el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta;

(c) el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

(d) el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

(e) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18, o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a esta, y/o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 21, o una secuencia de nucleótidos con una identidad de un 95-99% respecto a esta; y/o

(f) el ácido nucleico comprende además una secuencia líder que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

4. Una molécula polipeptídica aislada codificada por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un polipéptido de receptor antigénico quimérico (CAR) aislado, donde el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a CD123, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primaria, y donde dicho dominio de unión a CD123 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (CDR1 de HC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (CDR2 de HC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (CDR3 de HC), donde además dicho dominio de unión a CD123 comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (CDR1 de LC), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (CDR2 de LC) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (CDR3 de LC), donde:

6. El polipétido CAR aislado de la reivindicación 5, donde:

(a) dicho polipéptido CAR comprende:

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 276; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 276;

(b) dicho polipéptido CAR comprende:

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 217; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 217;

(c) dicho polipéptido CAR comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 480;

(d) el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de una proteína que se selecciona del grupo constituido por la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, C^d45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

(e) el dominio transmembrana comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6,

(ii) una secuencia de aminoácidos comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; o

(iii) una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6;

(f) el dominio de unión a CD123 está conectado al domino transmembrana por una región de bisagra, opcionalmente donde la región de bisagra comprende la SEQ ID NO: 2, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a esta; y/o

(g) el polipéptido CAR comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99;

(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la SEQ ID NO: 99.

7. El polipétido CAR aislado de la reivindicación 5 o 6, donde:

(a) el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína que se selecciona del grupo constituido por una molécula de la clase I de MHC, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a inmunoglobulinas, un receptor de citocinas, una integrina, una molécula de señalización de la activación linfocitaria (proteína SLAM), un receptor de activación de linfocitos NK, BTLA, un receptor de un ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CDIIa/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83;

(b) el dominio coestimulador comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7;

(c) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta;

(d) el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10; o una secuencia de aminoácidos con una identidad de un 95-99% respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10;

(e) el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, donde las secuencias de aminoácidos que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica; y/o

(f) el polipéptido CAR comprende además una secuencia líder que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

8. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, la cual es una molécula de ADN, una molécula de ARN o una combinación de estas, opcionalmente donde la molécula de ácido nucleico es un ARNm que codifica el polipéptido CAR de las reivindicaciones 4-7.

9. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde el vector es un vector de ADN o un vector de ARN, opcionalmente donde:

(a) el vector se selecciona del grupo que constituido por un plásmido, un vector de lentivirus, vector adenovírico y un vector de retrovirus; y/o

(b) el vector comprende además un promotor EF-1 que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 11.

10. Una célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, el polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones 4-7 o el vector de la reivindicación 9.

11. La célula de la reivindicación 10, donde la célula expresa además una molécula quimérica que comprende un primer polipéptido que comprende al menos una porción de una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que comprende una señal positiva de un dominio de señalización intracelular, opcionalmente donde la molécula quimérica comprende un primer polipéptido que comprende al menos una porción del dominio extracelular de PD1 y un segundo polipéptido que comprende un domino coestimulador y un dominio de señalización primaria.

12. Un método para producir una célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, o para generar una población de células, donde dicho método de producir una célula comprende introducir en, por ejemplo, transducir, una célula efectora inmunitaria con la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 1-3 u 8, o el vector de la reivindicación 9, y donde dicho método para generar una población de células comprende introducir ARN en una célula, donde el ARN comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, o un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde dicho método no es un método de tratamiento para el cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

13. Una célula o población de células, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria o población de células efectoras inmunitarias, que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, para su uso en:

(A) un método para proporcionar inmunidad antitumoral en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula o población de células, opcionalmente donde la célula es un linfocito T autólogo o un linfocito T alogénico; o

(B) un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad asociada con la expresión de CD123, comprendiendo dicho método administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula o población de células, opcionalmente donde (a) la enfermedad asociada con la expresión de CD123 es:

(i) un cáncer o neoplasia maligna,

(ii) una afección precancerosa, o

(iii) una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CD123;

(b) la enfermedad es un cáncer hematológico o una preleucemia;

(c) la enfermedad se escoge entre uno o más de leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (leucemia linfoide aguda de linfocitos B, BALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (leucemia linfoide aguda de linfocitos T (TALL)), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica (CML, por sus siglas en inglés), tricoleucemia, linfoma de Hodgkin, un trastorno histiocítico, un trastorno de mastocitos, una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico, una neoplasia mieloproliferativa, un mieloma de células plasmáticas, una neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, o cualquier combinación de estos;

y/o

(d) la enfermedad es un cáncer negativo para CD19, por ejemplo, un cáncer recurrente negativo para CD19.

14. La célula o población de células para su uso de la reivindicación 13, donde

(a) la célula o población de células se administra combinada con una o más de:

(i) un agente que incrementa la eficacia de la célula que comprende el ácido nucleico CAR o polipéptido CAR;

(ii) un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de la célula que comprende el ácido nucleico CAR o polipéptido CAR; o

(iii) un agente que trata la enfermedad asociada con la expresión de CD123;

y/o

(b) la célula o población de células comprende

(i) un ARNm que codifica el polipéptido CAR de las reivindicaciones 4-7; o

(ii) un vector lentivírico que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o que codifica el polipéptido CAR de las reivindicaciones 4-7;

opcionalmente donde dicho agente es un inhibidor de mTOR y al sujeto se le administra una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, donde opcionalmente además dicho inhibidor de mTOR se administra durante una cantidad de tiempo suficiente para reducir la proporción de linfocitos T positivos para PC-1, incrementar la proporción de linfocitos T negativos para PD-1, o incrementar la proporción de linfocitos T negativos para PD-1/linfocitos T positivos para PD-1, en la sangre periférica del sujeto, o en un preparado de linfocitos T aislados del sujeto.

15. La célula o población de células para su uso de la reivindicación 13, donde la célula o población de células se administra combinada con un segundo agente o procedimiento terapéutico escogido entre uno o más de quimioterapia, una terapia anticancerosa dirigida, un fármaco oncolítico, un agente citotóxico, una citocina, procedimiento quirúrgico, un procedimiento con radiación, un agonista de una molécula coestimuladora, un inhibidor de una molécula que es un punto de control inmunitario, una vacuna o una segunda inmunoterapia basada en CAR.

16. La célula o población de células para su uso de las reivindicaciones 13-15, donde la célula o población de células se administra combinada con o bien

(i) un agonista de una molécula coestimuladora escogida entre una o más de OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 o un ligando de CD83; o bien

(ii) un inhibidor de una molécula que es un punto de control inmunitario que se escoge entre uno o más de PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, clase I de MHC, clase II de MHC, GAL9, adenosina o TGFR, por ejemplo, TGFR beta.

17. La célula o población de células para su uso de la reivindicación 15, donde:

(a) la célula o población de células se administra combinada con un inhibidor de PD-1, un inhibidor de TIM-3, un inhibidor de CEACAM-1, o cualquier combinación de estos, opcionalmente donde el inhibidor de PD-1 y el inhibidor de TIM-3, o el inhibidor de TIM-3 y el inhibidor de CEACAM-1, se administran combinados;

(b) el agonista o el inhibidor es una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo monoespecífico o una molécula de anticuerpo biespecífico; y/o

(c) el inhibidor se administra después de la administración de la célula o población de células, opcionalmente donde el inhibidor se administra aproximadamente 3-7 días después de la administración de la célula o población de células.

18. La célula o población de células para su uso de la reivindicación 13, donde la célula o población de células se administra combinada con un inhibidor de CD19, opcionalmente donde el inhibidor de CD19 es una célula que expresa CAR CD19 o una molécula de anticuerpo anti-CD19.

19. Una célula o población de células, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria o población de células efectoras inmunitarias, que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, o el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, para su uso en un método para prevenir una recaída negativa para CD19 en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula o población de células, donde opcionalmente el método comprende además administrar un inhibidor de CD19, por ejemplo, una célula que expresa CAR CD19.

20. La célula o población de células para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 13-19, donde:

(i) la enfermedad es una leucemia, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (por ejemplo, ALL recurrente y refractaria) o AML; y/o

(ii) la célula o población de células expresa un CAR CD19 y el CAR CD123, opcionalmente donde el CAR CD19 o CAR CD123 comprende un dominio de señalización intracelular dividido de modo que la activación total de la célula o población de células ocurre cuando tanto el CAR CD19 como CAR CD123 se unen a una célula diana, por ejemplo, una célula diana CD19+CD123+ (por ejemplo, una célula de tipo blasto B-ALL), en comparación con la activación donde el CAR CD19 y el CAR CD123 se unen a una célula diana que expresa uno de CD19 o CD123 (por ejemplo, una célula madre hematopoyética), opcionalmente además donde el CARCD123 comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio de señalización de 4-1BB, y el CAR CD19 comprende un dominio de señalización primaria, por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta.

21. La célula o población de células para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 18-20, donde la célula o población de células se administra después, o la vez, de la administración del inhibidor de CD19.

22. La célula o población de células para su uso de la reivindicación 13 o 14, donde el método comprende además administrar un agente de disminución de linfocitos T después del tratamiento con la célula o población de células, para reducir de esta manera (por ejemplo, disminuir) la célula (por ejemplo, una célula que expresa CARCD123).

23. Un agente de disminución de linfocitos T para su uso en un método para reducir (por ejemplo, disminuir) las células que expresan CARCD123 después de una terapia con CAR, comprendiendo dicho método administrar a un mamífero dicho agente de disminución de linfocitos T después del tratamiento del mamífero con una célula o población de células, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria o población de células efectoras inmunitarias, que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, o el polipéptido CAR de cualquiera de las reivindicaciones 4 7, para reducir de esta manera (por ejemplo, disminuir) las células que expresan CARCD123.

24. La célula o población de células para su uso de la reivindicación 22, o el agente de disminución de linfocitos T para su uso de la reivindicación 23, donde

(a) el agente de disminución de linfocitos T se administra una, dos, tres, cuatro o cinco semanas después de la administración de la célula o población de células;

(b) al mamífero padece una leucemia, por ejemplo, ALL o AML;

(c) el agente de disminución de linfocitos T es un inhibidor de CD52, donde el inhibidor de CD52 es una molécula de anticuerpo anti-CD52, por ejemplo, alemtuzumab; y/o

(d) la célula o población de células expresa un polipéptido de CARCD123 y una proteína diana reconocida por el agente que disminuye linfocitos T, opcionalmente donde:

(i) la proteína diana es CD20 y el agente de disminución de linfocitos T es opcionalmente un anticuerpo anti-CD20, por ejemplo, rituximab; y/o

(ii) la célula, o población de células, comprende un ácido nucleico (por ejemplo, un vector) que comprende el ácido nucleico CARCD123 y un ácido nucleico que codifica la proteína diana.

25. La célula o población de células para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 13-22 y 24, o el agente de disminución de linfocitos T para su uso de la reivindicación 23 o 24, donde el método comprende además el trasplante de una célula, por ejemplo, una célula madre hematopoyética, o una médula ósea, en el mamífero.

26. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, el vector de la reivindicación 9 o la célula de la reivindicación 10, para su uso como un medicamento.

27. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, el vector de la reivindicación 9 o la célula de la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de CD123, opcionalmente donde la enfermedad se escoge entre cáncer, AML, ALL, B-ALL, T-ALL, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica, CML, tricoleucemia, linfoma de Hodgkin, trastorno de mastocitos, síndrome mielodisplásico, neoplasia mieloproliferativa, mieloma de células plasmáticas, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides o cualquier combinación de estos.

28. Una célula que comprende la molécula de ácido nucleico CAR de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8, o el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, para su uso en un método de acondicionamiento de un sujeto antes del trasplante de células, donde dicho acondicionamiento comprende reducir el número de células que expresan CD123 en un sujeto, por ejemplo, células normales que expresan CD123 o células cancerosas que expresan CD123, y donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la célula, opcionalmente donde el trasplante de células es un trasplante de células madre, por ejemplo, trasplante de células madre hematopoyéticas, o un trasplante de médula ósea.