CN116836282B - 抗体、嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

抗体、嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种分离的靶向CD123的抗体，包含该抗体的重链可变区和轻链可变区的嵌合抗原受体，以及相应的核酸分子、载体、细胞、组合物、制备方法和用于制备治疗癌症等疾病的药物。

Description

抗体、嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本公开涉及免疫学和分子生物学领域，特别是嵌合抗原受体(Chimeric AntigenReceptor,CAR)修饰的免疫细胞及其用途。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是一种发病率不断上升的恶性肿瘤。尽管65-74岁的患者在过去连续三十年中，12个月生存率从20％提高到30％，但目前AML的治疗仍不令人满意，这些患者的5年生存率<5％(Thein MS,Ershler WB,Jemal A,Yates JW,Baer MR.Outcome ofolder patients with acute myeloid leukemia:an analysis of SEER data over3decades.Cancer 2013；119(15):2720–7)。对于较年轻的AML患者，主要的治疗方法是强化化疗，对于复发风险较高的患者(治愈率35-40％)，采用异基因造血细胞移植(AHCT)，而老年患者的预后仍然很差(Thein MS,Ershler WB,Jemal A,Yates JW,Baer MR.Outcome ofolder patients with acute myeloid leukemia:an analysis of SEER data over3decades.Cancer2013；119(15):2720–7)。复发的AML患者获得第二次缓解的几率小于50％，而在第二次抢救性化疗后，只有16％的患者能实现病情控制(Kantarjian HM,DiNardo CD,Nogueras-Gonzalez GM,Kadia TM,Jabbour E,Bueso-Ramos CE,etal.Results of second salvage therapy in 673adults with acute myelogenousleukemia treated at a single institution since2000.Cancer 2018；124(12):2534–40)。因此，需要新的治疗策略。
近年来，利用抗CD19和抗CD20嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗淋巴样恶性肿瘤(B细胞急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤)取得了良好的效果(Khalil DN,SmithEL,Brentjens RJ,Wolchok JD.The future of cancer treatment:immunomodulation,CARs and combination immunotherapy.Nat Rev Clin Oncol 2016；13(6):394)。目前，针对AML治疗的CAR-T靶点，有CD123、CD33、CLL1、FLT3等；其中，CD123CAR-T研究最多。
虽然，CAR-T细胞在肿瘤细胞治疗中已取得了较好效果，但是CAR-T的疗效和安全性依然存在较大问题，主要有脱靶效应、细胞因子风暴、神经毒性等(Gauthier J,TurtleCJ.Insights into cytokine release syndrome and neurotoxicity after CD19-specific CAR-T cell therapy.Curr Res Transl Med 2018；66(2):50–2)。因此提高CAR-T细胞的安全性和有效性亟需解决。
发明内容
一方面，本公开提供了一种分离的靶向CD123的抗体，其包括轻链可变区和重链可变区。其中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，靶向CD123的抗体包括轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，靶向CD123的抗体包括轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，靶向CD123的抗体包括轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，靶向CD123的抗体包括轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
在一个具体实施方案中，所述抗体为单链抗体。
在一个具体实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区可选择性地通过连接肽连接，形成单链抗体。所述连接肽包含如GSTSGSGKPGSGEGSTKG或(GGGGS)n所示的氨基酸序列，n为大于或等于1的整数，诸如1、2、3、4或5。优选地，所述连接肽包含如GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述单链抗体包含选自SEQ ID NOs:5、6、7或8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供了一种嵌合抗原受体，其含有如前所述的抗体。
CAR-T细胞的活化程度受CAR分子中单链抗体(single chain variablefragment,scFv)的亲和力、铰链区长度、胞内信号域、靶细胞表面抗原密度等多种因素影响。CAR-T细胞可能会在识别肿瘤细胞的同时也能够识别抗原密度相对较低的正常细胞，产生严重脱靶效应，且鼠源scFv在人体内会产生免疫原性，需要进行人源化改造。而获得人源化改造且可以有效活化细胞的嵌合抗原受体，并非易事。
本公开的scFv不仅为人源化改造的序列，同时兼具了亲和力以及CAR-T细胞杀伤效应，靶向CD123的效果更好。进一步，将CAR分子进行了胞内信号域序列的突变改造，以使得CAR-T细胞具有更好的效果。
在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号转导结构域中的一种或多种。优选地，包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号转导结构域。
在一个具体实施方案中，所述共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD-2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或其任意组合。
在一个具体实施方案中，所述共刺激结构域选自4-1BB或CD28。
在一个具体实施方案中，所述4-1BB包含如SEQ ID NO:19所述的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述CD28包含如SEQ ID NO:20所述的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述胞内信号转导结构域为CD3ζ胞内信号转导结构域。
在一个具体实施方案中，所述CD3ζ包含如SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列或其变体。
在一个具体实施方案中，所述CD3ζ变体相比SEQ ID NO:9包含以下突变位点：
1)Q14K；或
2)V2L、D9E、Q15K、Y90F；或
3)V2L、D9E、Q14K、Q15K、Y90F。
在一个具体实施方案中，所述CD3ζ变体包含如SEQ ID NO:10、11或12所述的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述铰链区或跨膜区选自IgG1、IgG4、CD8α、CD28、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、PD-1或CD34的铰链区或跨膜区。
在一个具体实施方案中，所述嵌合抗原受体包括依次连接的：
a)靶向CD123的抗体，其包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示的氨基酸序列；
b)铰链区和跨膜区；
c)4-1BB共刺激结构域，包含如SEQ ID NO:19所述的氨基酸序列；或者CD28共刺激结构域，包含如SEQ ID NO:20所述的氨基酸序列；和
d)CD3ζ胞内信号转导结构域，包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其变体，优选地，所述CD3ζ变体相比SEQ ID NO:9包含以下突变位点：1)Q14K；或2)V2L、D9E、Q15K、Y90F；或3)V2L、D9E、Q14K、Q15K、Y90F，优选地，所述CD3ζ变体包含如SEQ IDNO:10、11或12所述的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述嵌合抗原受体包括如SEQ ID NOs:21、22、23、24、25、26、27、28或29所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。
又一方面，本公开进一步提供了一种分离的核酸分子，其编码如前所述的抗原结合结构域或如前所述的嵌合抗原受体。
本公开提供了一种载体，其包含如前所述的分离的核酸分子；优选的，其中所述载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体中的一种或多种。
本公开提供了一种细胞，其包含如前所述的分离的核酸分子或载体。
在一个实施方案中，所述细胞为T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润T细胞或调节性T细胞。
本公开还提供了一种药物组合物或试剂盒，其包括选自下述的一项或多项：
i)如前所述的分离的抗原结合结构域；
ii)如前所述的分离的嵌合抗原受体；
iii)如前所述的分离的核酸分子；
iv)如前所述的载体；和
v)如前所述的细胞；
以及，药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开提供了用于制备如前所述的细胞的方法，其包括：
将编码如前所述的嵌合抗原受体的核酸引入所述细胞中。
再一方面，本公开还公开了如前所述的抗体、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病优选自表达CD123的肿瘤。
本公开提供了在患有疾病的受试者中进行细胞免疫治疗的方法，其包括向受试者施用如前所述的药物组合物或如前所述的细胞，所述疾病选自与CD123表达相关的疾病，优选为与CD123表达相关的肿瘤。
在一个实施方案中，所述的肿瘤是肿瘤特异性分子介导的实体瘤或血液学癌症，其中所述肿瘤优选自急性髓系白血病(AML)、原生质浆样树突状肿瘤(BPDCN)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)和霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。在一个具体实施方案中，所述的肿瘤是复发的或难治的肿瘤。
附图说明
参考下述附图，本发明可以被更充分地理解。
图1示出不同CD123 scFv-Fc融合蛋白的EC50检测结果。
图2示出含有不同scFv序列的CD123 CAR分子在T细胞中的转导效率。
图3示出含有不同scFv序列的CD123 CAR-T的总细胞增殖情况。
图4示出含有不同scFv序列的CD123 CAR-T的CAR-T细胞增殖情况。
图5示出含有不同scFv序列的CD123 CAR-T细胞分化情况。
图6示出含有不同scFv序列的CD123 CAR-T对CD123阳性肿瘤细胞的杀伤效率。
图7示出含有不同scFv序列的CD123 CAR-T对AML原代细胞的杀伤效率。
图8示出含有不同scFv序列的CD123 CAR-T对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效果。
图9示出含有不同信号域的CD123 CAR-T的CAR分子转导效率。
图10示出在静息状态下，含有不同信号域的CD123 CAR-T的总细胞增殖情况。
图11示出在CD123阳性肿瘤细胞刺激状态下，含有不同信号域的CD123 CAR-T的总细胞增殖情况。
图12示出在CD123阳性肿瘤细胞刺激状态下，含有不同信号域的CD123 CAR-T细胞的分化情况。
图13示出在CD123阳性肿瘤细胞刺激状态下，含有不同信号域的CD123 CAR-T细胞的耗竭分子表达情况。
图14示出含有不同信号域的CD123 CAR-T细胞对CD123阳性肿瘤细胞的杀伤效率。
图15示出在CD123阳性肿瘤细胞刺激状态下，含有不同信号域的CD123 CAR-T细胞的细胞因子释放情况。
图16示出含有不同信号域的CD123 CAR-T细胞对负荷CD123阳性肿瘤的小鼠的肿瘤抑制效果。
下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。
除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
本发明中，抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体可只结合抗原的一部分，抗原分子中负责与抗体特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗体通常包括重链和轻链，轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区，可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的可变区包括轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。VH和VL区可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，与更保守的称为骨架区(FR)的区域散布。重链中的CDR缩写为VH-CDR，例如VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，轻链中的CDR缩写为VL-CDR，例如VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3。抗体可为完整的免疫球蛋白形式，也可为仅包含重链可变区和轻链可变区的单链抗体(单链可变区片段或scFv)形式。单链抗体是指通过重组DNA技术形成的抗体，由抗体的重链可变区和轻链可变区通过氨基酸肽段(连接肽)连接而成。生成单链抗体的多种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；Bird(1988)Science242:423-442；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward等(1989)Nature 334:54454；Skerra等(1988)Science 242:1038-1041中描述的方法。本发明公开的抗体的CDR由Kabat编号所定义或识别。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。将参照下述非限制性实验实施例进一步理解本发明。
实施例1：特异性结合CD123的抗原结合结构域
本实施例公开的重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL是经过骨架区的人源化改造后获得。具体的VH和VL如表1和表2所示。
表1.VH和VL的氨基酸序列
表2.scFv序列
如表1所示，VH1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)是在鼠源scFv的VH氨基酸序列(SEQ IDNO:39)中进行了以下的替换：K5V、P9A、L11V、V12K、M20V、K38R、K40A、F48M、L70M、S72R、K74T、S76T、T87R、S91T、S119L。VH2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)是在鼠源scFv的VH氨基酸序列(SEQ ID NO:39)中进行了以下的替换：K5V、P9A、L11V、V12K、A16S、M20V、K38R、K40A、F48M、L70I、S72A、S76T、V79A、T87R、S91T、S119L。
VL1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)是在鼠源scFv的VL氨基酸序列(SEQ ID NO:40)中进行了以下的替换：L4M、A9S、A12S、V13A、L15V、Q17D、A19V、S22T、K24R、Q46K、P47A、V50L、I62V、A64S、N78T、H80S、P81S、V82L、E83Q、E84P、A87F、L108V和D109E。VL2氨基酸序列(SEQID NO:40)是在鼠源scFv的VL氨基酸序列中进行了以下的替换：D1E、Q3V、L4M、S10T、A12S、L15P、Q17E、I21L、K24R、P47A、K49R、V50L、A54G、D74E、N78T、H80S、P81S、V82L、E83Q、E84S、A87F、T89V、L108V和D109E。
SEQ ID NO:39(CN112646033B中的scFv-03的VH，SEQ ID NO:45序列)：
QVQLKQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFMTYVIHWVKQKPGQGLEWFGYCNPYNDGINYNEKFKGKATLTSDKSSSTVYMELSSLTSEDSAVYYCARSPSYYGRSYYYGMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:40(CN112646033B中的scFv-03的VL，SEQ ID NO:51序列)：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLDIK
实施例2：特异性结合CD123的scFv-Fc融合蛋白制备及其EC50检测
通过第三方公司(北京赛赋欣生生物科技有限公司)合成CD123scFv-Fc的融合蛋白。此融合蛋白的合成，首先采用基因合成方法得到scFv序列，将scFv序列与Fc序列构建至合适的表达载体骨架中，然后用此载体感染大肠杆菌，使用大肠杆菌表达系统表达出目的蛋白，最后收集含有目的蛋白的上清液，进行纯化浓缩得到CD123 scFv-Fc的融合蛋白。将表达CD123的肿瘤细胞系MOLM-13(Cat#CBP60678,南京科佰生物科技有限公司)，使用含有10％血清(Cat#10099-141C,Gibco)的1640培养基(Cat#30-2001,ATCC)进行培养至足够数量。将MOLM-13细胞以每组5.0×105的细胞数量进行分组，每组加入一定体积的CD123scFv-Fc的融合蛋白进行标记。每一份CD123 scFv-Fc的融合蛋白设置不同的浓度梯度，分别为：81μg/mL、27μg/mL、9μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL、0.003μg/mL、0.001μg/mL。然后在CD123 scFv-Fc融合蛋白标记结束后，加入二抗PEanti-human IgG Fc Antibody(Cat#410708,BioLegend)进行荧光标记，使用流式细胞仪(NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA)检测各组的CD123表达水平。其中scFv-01为对照组，序列来源于宾夕法尼亚大学报道(Cummins K,Frey N,Nelson A,Schmidt A,Luger S,Hexner E,et al.Treating Relapsed/Refractory.(RR)AML WithBiodegradable Anti-CD123 CAR Modified T Cells(2017)Atlanta,GA:Blood ASH.)，本发明中进行人源化改造的鼠源scFv，是基于此实验中对照组scFv-01(SEQ ID NO:41)改造所得，scFv-01序列公开于专利CN112646033B中。
SEQ ID NO:41(CN112646033B中的scFv-01，SEQ ID NO:55序列)：
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGNWDDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKDLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNKYPYTFGGGTKLEIK
如图1结果显示，与对照组scFv-01相比，scFv-02的EC50值与其相近，scFv-04和scFv-05的EC50值明显高于对照组，其中scFv-04的EC50值最高。此结果说明，本发明中改造后的人源化scFv的亲和力优于鼠源scFv。
实施例3：含有人源化CD123 scFv的CAR分子的制备
通过基因合成的方法合成表2中的scFv序列，使用基因克隆方法得到scFv序列片段，然后再使用基因克隆方法从CD19 CAR分子质粒中将含有CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ胞内区(序列来源于专利CN105177031B，CD8α铰链区和跨膜区序列为SEQ IDNO:17；4-1BB序列为SEQ ID NO:19；CD3ζ胞内区序列为SEQ IDNO:10)的序列片段扩增出来，最后采用同源重组方法将此两个序列片段构建到CAR分子载体中形成完整的CD123 CAR分子。将此CAR分子酶切连接到慢病毒载体pLenti6.3/V5(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)中。CAR-T-2中scFv如SEQ ID NO:5所示，CAR-T-3中scFv如SEQ ID NO:6所示，CAR-T-4中scFv如SEQ ID NO:7所示，CAR-T-5中scFv如SEQ ID NO:8所示。对照组CAR-T-1中的scFv序列为鼠源scFv，具体序列如SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:40的VL所示，scFv序列如SEQ ID NO:42所示。
SEQ ID NO:42(CN112646033B中的scFv-03，SEQ ID NO:57序列)：
QVQLKQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFMTYVIHWVKQKPGQGLEWFGYCNPYNDGINYNEKFKGKATLTSDKSSSTVYMELSSLTSEDSAVYYCARSPSYYGRSYYYGMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLDIK
从健康志愿者的外周血单个核细胞中，使用CD3/CD28 beads(Thermo Fisher，Cat#40203D)，分离出T细胞。将分离纯化后的T细胞以1.0×106个细胞/mL，接入含有500IU/mL IL-2(山东金泰生物工程有限公司，中国)的X-VIVO 15培养基(Lonza，Switzerland)中培养。在培养48小时后，将带有CD123 CAR分子序列的慢病毒载体以MOI＝0.5转染至T细胞中。慢病毒感染24小时后，进行细胞换液，并接入含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养基的新鲜培养体系中继续培养。在慢病毒感染5天后，使用移液枪反复吹打培养体系中的细胞并收集至离心管，置于磁力架上去除CD3/CD28 beads。T细胞离心并计数，取部分细胞使用流式细胞仪(NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA)检测各组细胞的CAR分子转导效率。
图2示出T细胞感染慢病毒5天、7天、9天、11天后，各组细胞的CAR分子转导效率。与对照组CAR-T-1相比，CAR-T-3、CAR-T-5组的CAR分子转导效率与其接近，CAR-T-2、CAR-T-4组明显高于对照组，说明各组CAR-T细胞的CAR分子表达情况均较好。
实施例4：含有人源化CD123 scFv的CAR-T的体外增殖能力
在CD123 CAR-T细胞培养过程中，以慢病毒感染T细胞为培养第二天，之后每隔2至3天，收集CAR-T细胞并离心，加1-2毫升的培养体系重悬，取10微升的细胞稀释一定倍数后，用台盼蓝(Solarbio，Cat#C0040)进行染色，在倒置显微镜(Ts2-FL，Nikon，日本)下分别计出活细胞总数与死细胞总数，然后计算得到各组细胞的增殖情况。
图3显示，与对照组CAR-T-1相比，CAR-T-5总细胞增殖略高，CAR-T-2、CAR-T-3、CAR-T-4的总细胞增殖与其相近。图4显示，相较于对照组CAR-T-1，CAR-T-2、CAR-T-4和CAR-T-5的CAR-T细胞增殖速率明显提高。说明人源化改造的CAR-T-2、CAR-T-4和CAR-T-5的scFv设计能够改善CD123 CAR-T细胞增殖能力，而CAR-T-3的scFv设计对CD123 CAR-T细胞增殖影响较小。
实施例5：含有人源化CD123的scFv CAR-T的细胞分化
CAR-T细胞培养至第11天时，各组分别取1×106个细胞并离心，弃上清加100微升DPBS(HyClone，CAT#SH30028.02)重悬；然后每组CAR-T细胞中分别加入T细胞分化相关荧光抗体进行标记，使用全光谱流式细胞仪(N7-00008-0A，Cytek Biosciences，Inc.Fremont)进行检测。
图5的结果中，CD45RA+CD62L+细胞群表示初始T细胞和干性记忆T细胞的组合，CD45RA+CD62L-细胞群为效应T细胞群。具有人源化改造scFv的CAR-T细胞的CD45RA+CD62L+细胞群占比高于对照组CAR-T-1，且CD45RA+CD62L-细胞群占比低于对照组CAR-T-1。说明人源化改造后的CAR-T具有更多的初始T细胞和干性记忆T细胞群，相较于对照组CAR-T-1，CAR-T-4最高、CAR-T-5和CAR-T-2次之、然后是CAR-T-3组。而初始T细胞和干性记忆T细胞属于具有分化增殖潜力的细胞群，所以这两群细胞占比高，表明此CAR-T细胞能够继续分化增殖，即持久性较好。
实施例6：含有人源化CD123 scFv的CAR-T在体外对CD123阳性肿瘤细胞的杀伤效率
表达CD123的肿瘤细胞系THP-1(Cat#TIB-202,ATCC)，每2天传代一次，使用含有10％血清(Cat#10099-141C,Gibco)的1640培养基(Cat#30-2001,ATCC)进行培养。在THP-1细胞培养至足够数量时，收集至离心管中并离心，用1毫升生理盐水(河北天成药业有限公司，中国)重悬，加5微升Calcein-AM(浓度1μg/μL，Cat#C3100MP，ThermoFisher,USA)，轻轻混匀，置于37℃培养箱中孵育30分钟，以标记靶细胞。孵育结束后，使用生理盐水清洗2次，加X-VIVO 15培养基重悬并计数。向48孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)中，每孔加入1×105个上述标记的靶细胞，并以E:T＝5:1的比例加入各组CAR-T细胞，置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育5小时。孵育完成后，加2％浓度的Triton-X-100(Cat#T8787-100ML，Sigma，Germany)裂解阳性对照组靶细胞；每孔分别取100微升杀伤体系上清于酶标板中，使用多功能酶标仪(Varioscan Lux,ThermoFisher)检测荧光值(激发波长：495nm，发射波长：515nm)。
图6显示较对照组CAR-T-1，具有不同抗原结合结构域的CD123CAR-T中CAR-T-5的杀伤效率升高。细胞系杀伤结果说明各组CD123CAR-T细胞对靶细胞均有一定杀伤效应，且CAR-T-5的scFv可以更好地使CAR-T杀伤肿瘤细胞系。
实施例7：含有人源化CD123 scFv的CAR-T在体外对AML原代细胞的杀伤效率
取2个CD123阳性AML骨髓血样，分离单个核细胞，并使用CD34MicroBeads(Cat#130-100-453，美天旎，德国)分选出CD34阳性AML原代细胞，用1毫升生理盐水重悬，加10微升Calcein-AM(浓度1μg/μL，ThermoFisher,USA)，轻轻混匀，置于37℃培养箱中孵育30分钟，以标记AML原代细胞。孵育结束后，使用生理盐水清洗2次，加X-VIVO 15重悬并计数。向48孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)中，每孔加入1×105个上述标记的AML原代细胞，并以E:T＝5:1的比例，分别加入CD123 CAR-T细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育5小时。孵育完成后，加2％浓度的Triton-X-100裂解阳性对照组AML原代细胞；每孔分别取100微升杀伤体系上清于酶标板中，使用多功能酶标仪(Varioscan Lux,ThermoFisher)检测荧光值(激发波长:495nm，发射波长:515nm)。
图7显示，与对照组CAR-T-1相比，具有人源化改造scFv的CAR-T-3对CD123阳性AML原代细胞的杀伤效率增强。而且其他人源化改造scFv的CAR-T对CD123阳性AML原代细胞的杀伤效率，与对照组CAR-T-1相近。说明具有人源化改造scFv的CD123 CAR-T细胞，能够有效杀伤CD123阳性AML原代细胞，且杀伤效率高于或相近于鼠源scFv的CAR-T-1组。
实施例8：含有人源化CD123 scFv的CAR-T在荷瘤小鼠中的抑瘤能力
从健康志愿者的外周血单个核细胞中，使用CD3/CD28 beads，分离出T细胞。将分离纯化后的T细胞以5×106个细胞/mL，接入含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中。在培养48小时后，将带有CD123 CAR分子序列的慢病毒载体以MOI＝1转染至T细胞中(同时培养不感染慢病毒的T细胞以供对照实验使用)。慢病毒感染24小时后，进行细胞换液，并接入新鲜含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中继续培养。在慢病毒感染5天时，使用移液枪反复吹打培养体系中的细胞并收集至离心管，置于磁力架上去除CD3/CD28 beads。之后每48小时离心换液，以0.5×106个细胞/mL接入新鲜含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中继续培养。培养至第9天，收获细胞并计数，同时取部分细胞使用流式细胞仪检测各组细胞的CAR表达率，CAR-T细胞以相应的CAR阳性细胞浓度重悬待用。5-6周龄NCG小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司，中国)共15只，分为5只/组，共3组。每只小鼠从尾静脉注射1.0×106个MV-4-11-LAE细胞(以MV-4-11细胞(ATCC，USA)为基础，过表达luciferase和EGFP荧光标签)，10天后，对小鼠进行荧光素酶活体成像(Lumina II小动物活体成像系统，PerkinElmer，USA)分析，以验证小鼠白血病模型是否成功。小鼠白血病模型制作成功后，每组小鼠分别从尾静脉注射CD123 CAR-T细胞(5×106个细胞/只)，同时在另外一组小鼠注射相应细胞数的T细胞作为对照。小鼠于CAR-T细胞注射后，前两周每周两次，之后每周一次的频率进行小鼠外周血CAR-T检测，于采血前一天或后一天进行小鼠活体成像分析。
图8显示，相较于对照组T细胞，CAR-T-4和CAR-T-5组具有显著的抑制肿瘤生长的能力，且截至第97天，CAR-T组小鼠依然全部处于存活状态。说明具有人源化改造scFv的CD123 CAR-T细胞，在小鼠体内能够有效抑制AML肿瘤细胞的生长。
实施例9：信号域改造的CD123 CAR分子及其制备
信号域改造：以CAR-T-5为基础，1、将CD3ζ胞内信号域进行突变改造(表3和表4)；2、将4-1BB共刺激信号域替换成CD28共刺激信号域。同时设置CAR-T-0作为对照组，CAR-T-0来源于专利IL241668A中的26292CAR。
表3.CD3ζ胞内信号转导结构域氨基酸序列
表4.CD3ζ胞内信号转导结构域核苷酸序列
表5.嵌合抗原受体氨基酸序列
表6.嵌合抗原受体的核苷酸序列
表7.嵌合抗原受体中各部分的信息
从健康志愿者的外周血单个核细胞中，使用CD3/CD28 beads，分离出T细胞。将分离纯化后的T细胞以1.5×106个细胞/mL，接入含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中。在培养24小时后，将带有CD123 CAR分子序列的慢病毒载体以MOI＝1转染至T细胞中。慢病毒感染24小时后，进行细胞换液，并接入新鲜含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中继续培养。在慢病毒感染4天时以及之后每2天，取部分细胞使用流式细胞仪检测各组细胞的CAR分子转导效率。
图9所示为T细胞感染慢病毒6天、8天、10天、12天后，各组细胞的CAR分子转导效率。与对照组CAR-T-0相比，实验组各组CAR-T的CAR分子转导效率均高于对照组，说明各组CAR-T细胞的CAR分子表达情况均较好。
实施例10：信号域改造的CD123 CAR-T的体外增殖能力
以T细胞分选为细胞培养的第0天，在CD123 CAR-T细胞培养至第6天时，使用移液枪反复吹打培养体系中的细胞并收集至离心管，置于磁力架上去除CD3/CD28 beads。将去除CD3/CD28 beads的T细胞进行离心并计数，每组CAR-T细胞平均分成两份。一份CD123CAR-T细胞正常培养，另一份CD123 CAR-T细胞以ET比为5:1(CAR-T细胞：AML肿瘤细胞系)，与AML肿瘤细胞系MOLM-13(Cat#CBP60678,南京科佰生物科技有限公司)进行共培养，每2天进行一次CAR-T细胞换液和计数，观察各组细胞的增殖情况。
图10显示，CAR-T细胞在静息状态下，与对照组CAR-T-0相比，CAR-T-5B、CAR-T-5P、CAR-T-5Pk的总细胞增殖明显增高，CAR-T-5C、CAR-T-5Ck、CAR-T-5S的总细胞增殖与之接近。
图11显示，当CD123 CAR-T细胞与其靶细胞共培养时，与对照组CAR-T-0相比，CAR-T-5B、CAR-T-5P、CAR-T-5Pk和CAR-T-5S的总细胞增殖明显提高。说明信号域改造后的CAR分子能够改善CD123CAR-T细胞的增殖能力。
实施例11：信号域改造的CD123 CAR-T的细胞分化和耗竭分子表达
CAR-T细胞培养至第12天时，各组分别取1×106个细胞并离心，100微升DPBS重悬；然后每组CAR-T细胞分别加T细胞分化和耗竭相关荧光抗体进行标记，使用全光谱流式细胞仪进行检测。
图12的结果中，CD45RA+CD62L+细胞群表示初始T细胞和干性记忆T细胞的组合，CD45RA-CD62L+细胞群表示中央记忆T细胞群，CD45RA-CD62L-细胞群表示效应记忆T细胞群，CD45RA+CD62L-细胞群为效应T细胞群。具有信号域改造的CAR-T细胞，其记忆T细胞群占比高于对照组CAR-T-0，且效应T细胞群占比低于对照组CAR-T-0。说明信号域改造后的CD123CAR-T细胞分化更趋向于记忆T细胞群占比多，其中以CAR-T-5P和CAR-T-5Pk最多，CAR-T-5B、CAR-T-5C、CAR-T-5Ck和CAR-T-5S次之。而记忆性T细胞群占比高，则细胞具有更好的增殖潜力，即具有更好的持久性。
图13结果显示，在信号域改造后的CAR-T细胞中，耗竭分子PD-1和LAG-3的总体表达水平，均低于对照组CAR-T-0。其中CAR-T-5B、CAR-T-5P和CAR-T-5Pk的耗竭分子表达最低，CAR-T-5C、CAR-T-5Ck和CAR-T-5S次之。说明信号域改造后的CAR-T细胞的耗竭水平，相对略低。
实施例12：信号域改造的CD123 CAR-T在体外对靶细胞系的杀伤效率
培养表达CD123的肿瘤细胞系MOLM-13(高抗原密度)、THP-1(中抗原密度)、HL-60(低抗原密度)(Cat#CCL-240,ATCC)，每2天传代一次，使用含有10％血清的1640培养基进行培养。当此3种肿瘤细胞系培养至足够数量时，收集细胞至离心管中，并离心，然后用1毫升生理盐水重悬，加5微升Calcein-AM，轻轻混匀，置于37℃培养箱中孵育30分钟，以标记靶细胞系。孵育结束后，使用生理盐水清洗2次，加X-VIVO 15重悬并计数。向48孔细胞培养板中，每孔加入1×105个上述标记的靶细胞，并以E:T＝10:1的比例加入各组CAR-T细胞，置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育5小时。孵育完成后，加2％浓度的Triton-X-100裂解阳性对照组靶细胞；每孔分别取100微升杀伤体系上清于酶标板中，使用多功能酶标仪检测荧光值(激发波长：495nm，发射波长：515nm)。
图14显示，对于靶细胞MOLM-13和HL-60，CAR-T-5C、CAR-T-5Ck、CAR-T-5S的杀伤效率高于对照组CAR-T-0。说明信号域改造在一定程度上可以提高CD123 CAR-T的细胞杀伤功能。
实施例13：信号域改造的CD123 CAR-T在靶细胞刺激下的细胞因子表达水平
向48孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)中，每孔加入1×105个靶细胞系，并以E:T＝10:1的比例加入各组CAR-T细胞，置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育5小时。将细胞上清用CBA试剂盒(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)处理，用流式细胞仪(NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA)检测各种细胞因子的表达水平。
图15显示，与对照组CAR-T-0相比，具有不同信号域的各组CAR-T，在靶细胞刺激下，TNF、IFN-γ的表达水平明显提高。说明信号域改造有利于CD123 CAR-T细胞因子的表达。
实施例14：含有信号域改造的CD123 CAR-T在荷瘤小鼠中的抑瘤能力
从健康志愿者的外周血单个核细胞中，使用CD3/CD28 beads，分离出T细胞。将分离纯化后的T细胞以1.5×106个细胞/mL，接入含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中。在培养48小时后，将带有CD123 CAR分子序列的慢病毒载体以MOI＝1转染至T细胞中(同时培养不感染慢病毒的T细胞以供对照实验使用)。慢病毒感染24小时后，进行细胞换液，并接入新鲜含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中继续培养。在慢病毒感染5天时，使用移液枪反复吹打培养体系中的细胞并收集至离心管，置于磁力架上去除CD3/CD28 beads。之后每48小时离心换液，以0.5×106个细胞/mL接入新鲜含有500IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养体系中继续培养。培养至第9天，收获细胞并计数，同时取部分细胞使用流式细胞仪检测各组细胞的CAR表达率，CAR-T细胞以相应的CAR阳性细胞浓度重悬待用。5-6周龄NCG小鼠共36只，分为6只/组，共6组。每只小鼠从尾静脉注射1.0×105个MOLM-13-LAE细胞(以MOLM-13细胞为基础，过表达luciferase和EGFP荧光标签)，6天后，对小鼠进行荧光素酶活体成像分析，以验证小鼠白血病模型是否成功。小鼠白血病模型制作成功后，每组小鼠分别从尾静脉注射CD123 CAR-T细胞(2×106个细胞/只)，同时在另外一组小鼠注射相应细胞数的T细胞作为对照。小鼠于CAR-T细胞注射后，前两周每周两次，之后每周一次的频率进行小鼠外周血CAR-T检测，于采血前一天或后一天进行小鼠活体成像分析。
图16显示，相较于对照组CAR-T-0，CAR-T-5Pk和CAR-T-5S组明显提高抑制肿瘤生长效果，且明显提高小鼠体内的CAR-T细胞增殖数量。同时，与对照组CAR-T-0组比，CAR-T-5B、CAR-T-5Pk、CAR-T-5C和CAR-T-5S，均明显增加了荷瘤小鼠生存期。说明具有信号域改造的CD123 CAR-T细胞，在小鼠体内能够有效抑制AML肿瘤细胞的生长。
通过引用并入
本文中提到的每个专利和科学文献的全部内容为所有目的通过引用并入本文。
等同性
本发明可以以其他特定方式体现，而不背离其精神或本质特征。因此，上述实施方式在所有情况下应该被当作是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是由上述描述指明，并打算将在权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims (21)

1.一种分离的抗体，其包括轻链可变区和重链可变区，其中，
所述重链可变区为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述重链可变区为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
其中，所述抗体靶向CD123。
2.如权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为单链抗体。
3.如权利要求2所述的抗体，其中，所述单链抗体选自SEQ ID NOs:6、7或8所示的氨基酸序列。
4.一种嵌合抗原受体，其含有如权利要求1至3任一项所述的抗体。
5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体，其包括铰链区、跨膜区、共刺激结构域和胞内信号转导结构域。
6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，所述共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或其任意组合。
7.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，所述共刺激结构域选自4-1BB或CD28。
8.如权利要求7所述的嵌合抗原受体，所述4-1BB为SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
9.如权利要求7所述的嵌合抗原受体，所述CD28为SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
10.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中，所述胞内信号转导结构域为CD3ζ胞内信号转导结构域；其中所述CD3ζ为SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其变体；其中所述CD3ζ变体相比SEQ ID NO:9包含以下突变位点：
1)Q14K；或
2)V2L、D9E、Q15K、Y90F；或
3)V2L、D9E、Q14K、Q15K、Y90F。
11.如权利要求10所述的嵌合抗原受体，所述CD3ζ变体为SEQ ID NO:10、11或12所述的氨基酸序列。
12.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，所述铰链区或跨膜区选自IgG1、IgG4、CD8α、CD28、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、PD-1或CD34的铰链区或跨膜区。
13.如权利要求4至12任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包括如SEQID NOs:22、23、24、25、26、27、28或29所示的氨基酸序列。
14.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至3中任一项所述的抗体或如权利要求4至13中任一项所述的嵌合抗原受体。
15.一种载体，其包含权利要求14所述的分离的核酸分子。
16.如权利要求15所述的载体，其选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体中的一种或多种。
17.一种细胞，其包含如权利要求14所述的分离的核酸分子或权利要求15或16所述的载体。
18.如权利要求17所述的细胞，其中所述细胞为T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞。
19.如权利要求17所述的细胞，其中所述细胞为细胞毒性T细胞、肿瘤浸润T细胞或调节性T细胞。
20.一种药物组合物或试剂盒，其包括选自下述的一项或多项：
i)如权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体；
ii)如权利要求4至13中任一项所述的嵌合抗原受体；
iii)如权利要求14所述的分离的核酸分子；
iv)如权利要求15或16所述的载体；和
v)如权利要求17至19所述的细胞；
以及，药学上可接受的稀释剂或赋形剂。
21.如权利要求1至3任一项所述的抗体、如权利要求4至13中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求14所述的核酸分子、如权利要求15或16所述的载体、如权利要求17至19任一项所述的细胞或如权利要求20所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自急性髓系白血病(AML)、原生质浆样树突状肿瘤(BPDCN)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)和霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
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