TWI741460B - 全人源的抗cd30單鏈抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及特異性結合CD30的新型抗體和抗體片段,尤其是全人源的單鏈抗體scFv。本發明還涉及編碼這些抗體的核酸、載體和表達該核酸的宿主細胞。此外,本發明也涉及包含本發明抗體的組成物、及其在治療和診斷中的用途。
Description
本發明涉及特異性結合CD30的新型抗體和抗體片段,尤其是單鏈抗體(如單鏈scFv)。本發明還涉及編碼這些抗體和抗體片段的核酸、載體和表達該核酸的宿主細胞。此外,本發明也涉及包含本發明抗體的組成物、及其在治療和診斷中的用途。
CD30,也稱為Ki-1或TNFRSF8,是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員。CD30作為105-120kD的I型跨膜糖蛋白受體,具有胞內域、跨膜域和胞外域,並在胞外域中存在多個富半胱胺酸的區域。該胞外域可以斷裂以產生88kD的可溶性形式的CD30(sCD30),該可溶性CD30可以釋放至血清中,並且可以在自身免疫性疾病如類風濕關節炎、炎性狀態和CD30陽性血液惡性腫瘤的患者中檢測到增加的血清CD30。Pierce JM等,Expert Rev.Hematol.2017 Jan;10(1):29-37.doi:10.1080/17474086.2017.1270202.Epub 2016 Dec 21。
在健康個體中,CD30表達局限於一小部分的活化T和B淋巴細胞上。但CD30在經典霍奇金淋巴瘤(HL)和間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)中廣泛表達。CD30也不同程度地在一些其它的淋巴增生性病症中表達,包括例如,T細
胞淋巴瘤,如非特指型外周T細胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤(AITL)、結外NK/T細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL);各種B細胞非霍奇金淋巴瘤,包括彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL),尤其是EBV陽性彌漫性大B細胞淋巴瘤;蕈樣肉芽腫病。
CD30已經被提議用於診斷和預後,例如作為霍奇金淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤的診斷生物標誌物。Froese et al.,J.Immunol.139:2081(1987);Carde et al.,Eur.J.Cancer 26:474(1990)。Smith CA等,Cell 1993;73:1349-1360.
此外,CD30在一些淋巴瘤亞型和一些非淋巴樣瘤性疾病中的過表達,也已經使得其成為一些疾病,如霍奇金淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤的理想治療靶點。此類新型靶向治療製劑的出現,將可能提高傳統化療和放療的治癒率,並降低長期毒性。Wang等,Advances in CD30- and PD-1-targeted therapies for classical Hodgkin lymphoma,Journal of Hematology & Oncology,2018,11:57.已經提出多種CD30靶向治療方式,包括例如抗體-藥物偶聯物(ADC)、雙特異性抗體和嵌合抗原受體修飾T細胞(CAR-T細胞)。
在CD30抗體-藥物偶聯物(ADC)方面,已經報導了由嵌合CD30單株抗體經由蛋白酶可切割接頭與微管破壞藥物一甲基澳瑞他汀E(MMAE,monomethyl auristatin E)連接形成的偶聯物本妥昔單抗(brentuximab vedotin)。該化合物在霍奇金淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤和甚至表達CD30的B細胞淋巴瘤中的I和II期臨床試驗中,已經被證實具有良好耐受,並且更為重要的是,能夠實現疾病控制,包括在多次復發或難治性疾病患者中控制疾
病。CA van der Weyden等,Blood Cancer Journal(2017)7,e603;doi:10.1038/bcj.2017.85.
在雙特異性抗體方面,已經研發了靶向CD30和CD16的雙特異性抗體和靶向CD30和CD64的雙特異性抗體。最新研發的頗具前景的是靶向CD30和CD16A的雙特異性抗體AFM13。這些免疫療法使用雙特異性抗體作為橋樑,將CD30陽性腫瘤細胞與免疫效應細胞(如NK細胞/巨噬細胞)聯繫起來。
在CAR-T細胞免疫治療中方面,最近,Baylor研究者公佈了7例HL和2例ALCL患者CD30 CAR-T細胞的I期臨床研究,結果顯示在一些患者上獲得了持久的完全緩解(CR,complete reaction)。
單鏈scFv抗體是一種小分子的基因工程抗體,它是在DNA水平上利用基因工程方法將天然抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)連接(通常藉由一段人工合成的連接肽(或“接頭”)連接)而成的小分子重組抗體。與完整抗體分子相比,scFv單鏈抗體具有以下優點:含有完整的抗體可變區,保留原抗體的抗原特異性和結合活性;不含有抗體分子的Fc區,因而免疫原性弱,用於人體不易產生免疫反應;分子量小,穿透性強、易於滲入組織,用於顯像診斷或治療時可以進入一般完整抗體不能達到的組織內部;不需要進行糖基化修飾即可形成有功能的抗體分子,利於原核表達系統大量生產;易於操作,適用於作為基因工程構件,製備具有新性質的其它抗原特異性結合分子,例如全長抗體、scFv-Fc等。
鑒於CD30作為疾病診斷、預後和治療靶點的價值,本領域仍然需要新的CD30特異性結合分子。本發明藉由提供以高靶特異性和高親合性結合CD30,尤其是與腫瘤細胞表面上表達的CD30結合,並具有低副作用的全人單
鏈抗體,滿足了這方面的需求。本發明的全人單鏈抗體不僅適於單獨用於腫瘤和癌症的診斷或治療中,而且,更有利地的是,適於作為基因工程構件製備具有高CD30靶向性的其它診斷和治療分子,例如各種形式的抗體、scFv-Fc、以及基於抗體的融合物和綴合物等。
本發明提供了全人源抗人CD30抗體及其編碼基因與應用。藉由利用轉基因小鼠和噬菌體展示技術,本發明人篩選出抗人CD30的全人源抗體,並獲得其可變區基因序列,在此基礎上構建了全人單鏈scFv抗體和scFv-hFc抗體。本發明的重組單鏈抗體分子不僅以高親和力與非膜結合型人CD30結合,也以高親和力與細胞表面表達的CD30結合。
因此,本發明提供特異性結合CD30的抗體,尤其是單鏈抗體、及編碼其的核酸分子、及它們在治療和診斷中的用途。
在一個方面,本發明提供特異性地結合CD30(較佳人CD30蛋白質)的抗體或其抗原結合片段。在一個較佳實施方案中,本發明抗體是單鏈抗體。在一個較佳實施方案中,本發明抗體是單鏈scFv抗體。在另一較佳實施方案中,本發明抗體是scFv-Fc抗體。在一些實施方案中,本發明的抗體以大約100nM至1nM的KD結合人CD30蛋白,其中KD值按照例如生物膜層光學干涉技術(例如Fortebio檢測法)測量。在一些實施方案中,本發明的抗體以大約100nM至0.1nM的EC50結合細胞表面表達的人CD30蛋白,其中EC50值按照例如流式細胞術(例如FACS)測量。
在一些實施方案中,本發明抗體包含表A所示任一抗體的VH區序列或其變體。在另一些實施方案中,本發明抗體包含表A所示任一抗體的VL區序列或其變體。在另一些實施方案中,本發明抗體包含表A所示任一抗體的VH和VL序列對、或其變體。在一些實施方案中,本發明抗體包含表A所示任一抗體的6個CDR區序列、或其變體,其中所述變體在6個CDR區上共包含至少一個且不超過10,或不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代),較佳地重鏈CDR3保持不變。在一個實施方案中,抗體的CDR序列是表B所示的CDR序列。
在一些實施方案中,本發明抗體是單鏈scFv抗體。較佳地,scFv抗體包含VH序列、VL序列和接頭。較佳地scFv抗體從N端到C端包含:VL結構域-接頭-VH結構域,或VH結構域-接頭-VL結構域。
在一些實施方案中,本發明還提供由本發明單鏈scFv抗體和野生型或改變的Fc區融合形成的scFv-Fc抗體。在一些實施方案中,本發明的scFv-Fc抗體的Fc區是低或無岩藻糖基化的。在一些實施方案中,scFv抗體藉由鉸鏈區與Fc區融合。
再一方面,本發明涉及基於本發明抗體,尤其是單鏈抗體構建的融合物和綴合物。
再一方面,本發明涉及治療CD30相關病症的方法和組合物,其中向該受試者施用有效量的本發明抗體或其抗原結合片段、或本發明的融合物或綴合物。在一些實施方案中,CD30相關病症是由CD30和/或表達CD30的細胞介導或與其相關的病症,例如以表達CD30的瘤性細胞的生長為特徵的疾病。在一些較佳的實施方案中,CD30相關病症是CD30陽性腫瘤,包括霍奇金淋巴瘤
和非霍奇金淋巴瘤,較佳地選自霍奇金淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤(AITL),最佳間變性大細胞淋巴瘤和經典霍奇金淋巴瘤。在一些實施方案中,本發明抗體分子與其它治療劑聯用。在再一實施方案中,本發明抗體分子與治療劑綴合,例如與細胞毒素或放射性同位素綴合。
再一方面,本發明涉及檢測樣品中CD30的方法和試劑盒,其中該方法包括:(a)將該樣品與本發明抗體或其抗原結合片段、融合物或綴合物接觸;和(b)檢測該抗體或其抗原結合片段或融合物或綴合物和CD30蛋白之間複合物的形成。檢測可以是體外的或體內的。在一些實施方案中,樣品是來自患者的組織活檢物、血清、血漿、或全血。在一些實施方案中,樣品來自淋巴瘤患者。
第1圖示意性顯示本發明的示例性scFv-hFc重組單鏈抗體的表達載體選殖策略。
第2A圖和第2B圖顯示,藉由流式細胞術測定的,本發明示例性scFv-hFc重組單鏈抗體與Karpas299細胞的親和力。
第3圖顯示本發明的示例性CDR序列。
第4圖顯示本發明示例性抗體的VH序列。
第5圖顯示本發明示例性抗體的VL序列。
第6圖顯示人CD30抗原全長蛋白及其胞外結構域(ECD)的示例性氨基酸序列。
第7圖顯示用於構建本發明示例性scFv-Fc構建體的接頭、鉸鏈區和Fc區的胺基酸序列和核苷酸序列。
第8圖顯示陽性對照抗體V2AC10和XL的可變區胺基酸序列。
除非明確指明相反,否則本發明的實施將採用本領域技術內的常規化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學和細胞生物學的方法。這些方法的描述可以參見,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001);Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,2008年7月更新);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);Harlow和Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology
Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991);Annual Review of Immunology;以及期刊專著如Advances in Immunology。
除非另有定義,否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的,下文定義了以下術語。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時,應理解為意指可選項中的任一項或可選項的任意兩項或多項。
如本文中所用,術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟,但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中,當使用術語“包含”或“包括”時,除非另有指明,否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如,當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時,也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
在本文中,術語“抗原結合分子”是指包含能夠與靶抗原結合的抗原結合區或抗原結合部分的分子,例如蛋白質或多肽。在本發明中,結合CD30的抗原結合分子也稱作CD30結合分子。抗原結合分子包括例如抗體及其抗原結合片段、單鏈scFv抗體、基於scFv構建的各種融合物和綴合物,例如scFv-Fc抗體。如本領域技術人員明瞭的,抗體的抗原結合部分通常包含來自
“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基。在一些情況下,根據上下文,“CD30結合分子”與“本發明抗體”或“抗CD30抗體”可以互換使用。
在本文中,術語“抗體”是指至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區的多肽,該免疫球蛋白可變區特異性識別並結合抗原。該術語涵蓋各種抗體結構,包括、但不限於單株抗體、單鏈抗體或多鏈抗體、單特異性或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全人源抗體或嵌合抗體或人源化抗體、全長抗體和抗體片段,只要它們呈現期望的抗原結合活性即可。
本領域技術人員明瞭,“全抗體”(在本文中可與“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”互換使用)包含至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。可變區是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原結合的結構域。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合,但是顯示出多種效應子功能。抗體的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列歸入兩種類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。抗體的重鏈可以取決於其重鏈恆定區的胺基酸序列而劃分為主要5種不同的類型:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,並且這些類型中的幾種可以進一步劃分成亞類,如,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。IgG的重鏈分子為γ鏈,IgM、IgA、IgE和IgD的重鏈分別為μ、α、ε和δ鏈。參見例如Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.編輯,第二版,Raven Press,N.Y.(1989))(其為所有目的以其整體在此引作參考)。
術語“抗體片段”是指並非完整抗體的分子,其包含完整抗體中用於結合該完整抗體所結合的抗原的部分。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、單鏈Fv、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、微抗體(minibody);以及從抗體片段形成的多特異性抗體。Fab片段是一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段,例如,藉由木瓜蛋白酶消化完全抗體能夠獲得Fab片段。可以借接頭將Fab的輕鏈(L鏈)和重鏈(H鏈)融合構建成單一多肽鏈,即單鏈Fab(scFab)(參見例如US20070274985A1)。此外,藉由胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下面消化完全抗體可以產生F(ab')2,其為Fab’的二聚體,是二價的抗體片段。F(ab')2可以在中性條件下藉由破壞鉸鏈區中的二硫鍵而被還原,從F(ab')2二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區的Fab片段。Fv片段由抗體單臂的VL和VH結構域組成。另外,可以使用重組方法,將獨立編碼Fv片段的兩個結構域VL和VH的基因,藉由編碼連接肽(接頭)的核酸序列連接在一起,重組表達形成單鏈Fv,在該單條蛋白鏈中VH區和VL區配對提供抗原結合位點。雙鏈抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段,該片段在同一多肽鏈中包含藉由短接頭連接的VL和VH。在雙鏈抗體中,由於接頭過短,同一鏈上的VH和VL兩個結構域之間無法配對,而被迫與另一鏈上的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合位點。雙鏈抗體可以是二價的或雙特異性的。雙鏈抗體的更詳細描述可以參見例如,EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);以及Hollinger等人,PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三鏈抗體和四鏈抗體和微抗體也描述於Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003),和邵榮光等人(編輯),抗體藥物研究與
應用,人民衛生出版社(2013)。關於抗體片段的更詳細的描述,也可以參見:基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯,Raven Press,N.Y.(1993)。
本文中使用的術語“單株抗體”表示,得自基本上同質的抗體群體的抗體,即,除了通常以很少量存在的可能變體抗體(例如,含有天然突變或在單株抗體製品的生產過程中產生的變體抗體)以外,構成該群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位。單株抗體可以藉由多種技術來製備,所述技術包括、但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法,和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的轉基因動物的方法。
術語“人抗體”或“全人源抗體”在本文中可以互換使用,指包括其中構架區和CDR區二者均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。而且,如果抗體含有恆定區,恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸(例如,藉由體外隨機或點特異誘變或體內體細胞突變引入的突變),例如在CDR一一尤其在CDR3中。然而,如本文所使用的,術語“人抗體”不意欲包括其中的CDR序列衍生自其他哺乳動物物種(如,小鼠)的種系而移植入人構架序列的抗體。
如本文所用,術語“重組人抗體”包括所有藉由重組方式製備、表達、產生或分離的人抗體,例如,(a)自用人免疫球蛋白基因進行轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤分離的抗體,(b)自轉化成表達人抗體的宿主細胞例如轉染瘤分離的抗體,(c)自重組、組合人抗體文庫例如噬菌體展示文庫分離的抗體,和(d)藉由包括剪接人免疫球蛋白基因至其他DNA序列的任意其他方式製備、表達、產生或分離的抗體。這些重組人抗體具有構架區和CDR區源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。然而,在某些實施方案中,可
以對重組人抗體進行體外誘變(或使用人Ig序列轉基因動物時為體內體細胞誘變),由此得到的重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列,儘管源自人種系VH和VL序列並與之相關、但是並不天然存在於體內的人抗體種系庫中。
術語“嵌合抗體”是指可變區序列源自一物種、恆定區序列源自另一物種的抗體。
術語“人源化抗體”是指將源自其他哺乳動物物種例如小鼠種系的CDR序列接到人構架序列上的抗體。
“分離的”抗體是已經與它的天然環境中的組分分離的抗體。在一些實施方案中,將抗體純化至大於95%或99%純度,該純度藉由例如電泳(例如,SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例如,離子交換或反相HPLC)確定。關於評價抗體純度的方法的綜述,參見,例如,Flatman,S.等,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
表位是抗體所結合的抗原區域。表位可以由連續的胺基酸形成或者藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。
術語“CD30”包括人CD30的變體、同種型、物種同源物、和與CD30(例如人CD30)具有至少一個相同表位的類似物。第6圖顯示了一個示例性的人CD30序列(SEQ ID NO:162)。CD30蛋白也可包括CD30的片段,諸如胞外結構域以及胞外結構域的片段,例如保持與本發明任何抗體結合能力的片段。
術語“特異性結合”表示抗體選擇性地或優先地結合抗原。如果在生物光干涉測量中,抗體以大約5x 10-7M或更低、大約1x 10-7M或更低、大約5x 10-8M或更低、大約1x 10-8M或更低、大約5x 10-9M或更低的KD,與人CD30結合,則該抗體是“與人CD30特異性結合”的抗體。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由平衡解離常數(KD)代表,平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是kdis和kon)的比值。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
與結合例如CD30的抗原的參考抗體“競爭結合的抗體”是指這樣的抗體,該抗體在競爭檢驗中阻斷參考抗體與抗原(例如CD30)的結合達到50%或更多,並且反過來,在競爭檢驗中參考抗體也阻斷該抗體與抗原(例如CD30)的結合達50%或更多。示例性競爭檢驗描述於:“Antibodies”,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)。競爭結合的抗體可以與參考抗體結合相同的表位區,例如相同表位、相鄰表位或重疊表位。
本文中的術語“Fc區”用於定義含有至少一部分的恆定區的免疫球蛋白重鏈的C-末端區域。該術語包括天然序列Fc-區和變體Fc-區。在一個實施方案中,人IgG重鏈Fc-區從重鏈的Cys226或從Pro230延伸至羧基端。然而,Fc-區的C-端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外指出,Fc-區或恆定區中的胺基酸殘基的編號根據EU編號系統,也稱為EU索引,如Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述。
與抗體相關的術語“變體”在本文中指,包含已經藉由至少1個,例如1-30,或1-20或1-10個,例如1或2或3或4或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的目標抗體區域(例如重鏈可變區或輕鏈可變區或重鏈
CDR區或輕鏈CDR區)的抗體,其中變體基本上保持改變之前的抗體分子的生物學特性。在一方面,本發明涵蓋在本文中所述及的任何抗體的變體。在一個實施方案中,抗體變體保持改變前抗體的至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。在一些實施方案中,所述改變不導致抗體變體喪失對抗原的結合,但視需要地可以賦予諸如提高的抗原親和力和不同的效應子功能等性質。可以理解的,抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區、或各CDR區可以單獨改變或組合改變。在一些實施方案中,在一個或多個或全部三個重鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、或5個。在一些實施方案中,在一個或多個或全部三個輕鏈CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、或5個。在一些實施方案中,在全部6個CDR中的胺基酸改變不超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個。較佳地,該胺基酸改變為胺基酸取代,較佳保守取代。在一些實施方案中,抗體變體與親本抗體在目標抗體序列區域上具有至少80%、85%、90%或95%或99%或更高的胺基酸同一性。例如,在一個實施方案中,本發明抗體,與表A所列任一抗體相比,在重鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中,本發明抗體與表A所列任一抗體相比,在輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。在再一實施方案中,本發明抗體與表A所列任一抗體相比,在重鏈可變區和輕鏈可變區上具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的序列同一性。
在本文中,“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”:將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較,確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如,A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目,將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即,窗大小),並且將結果乘以100,以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對,可以按本領域已知的多種方式實現,例如,使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數,包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。
在本發明中,就抗體序列而言,胺基酸序列同一性百分數藉由將候選抗體序列與參考抗體序列最佳比對後,在一個較佳方案中按照Kabat編號規則進行最佳比對後,予以確定。比對後,將目標抗體區域(例如,重鏈或輕鏈的整個可變區、或其部分例如一個或多個CDR區)與參考抗體的相同區域進行比較。目標抗體區域和參考抗體區域之間的序列同一性百分數為:在目標和參考抗體區域兩者中被相同胺基酸佔據的位置的數目除以兩個區域的比對位置總數(空位不計入)並乘以100得到的百分數。在本文中,在不指定目標抗體區域的情況下,將適用於在參考抗體序列的全長上進行比對。在一些實施方案中,就抗體而言,序列同一性可以分佈在整個重鏈可變區和/或整個輕鏈可變區上,或序列百分數同一性可以僅限定於構架區,而對應CDR區的序列保持100%相同。
本發明一方面提供以高靶特異性和高親合性結合CD30(尤其是膜結合性CD30)的抗體,尤其是單鏈抗體(例如單鏈scFv抗體)。
本發明的抗體具有以下一個或多個特性:
(i)以高親和力,例如以小於100nM,例如小於50nM,例如1-30nM,較佳小於10nM的KD值,與人CD30(如SEQ ID NO:162的多肽)結合;
(ii)以高親和力,例如以小於100nM,例如小於70nM,例如0.1-30nM,較佳小於20nM,更佳小於10或5nM,最佳小於1nM的EC50值,與細胞表面表達的人CD30(如SEQ ID NO:162的多肽)結合;
(iii)與人CD30(如SEQ ID NO:162的多肽)結合的解離速率常數(Kdis)小於100×10-4,較佳地小於60×10-4,例如30-10×10-4s-1,較佳地5-1×10-4s-1;
(iv)與CD30上,尤其是CD30的胞外域ECD上的表位特異性結合(例如,與表A所列任一抗體識別相同或相似的表位);
(v)顯示與表A所列任一抗體相同或相似的結合親和力和/或特異性;
(vi)抑制(例如,競爭性抑制)本文所述的抗體分子,例如表A所示的任一抗體分子,與CD30的結合;
(vii)與表A所示的任一抗體結合相同或重疊的表位;
(viii)與表A所示的任一抗體競爭結合CD30和/或結合CD30上的相同表位;
(ix)具有本文所述的抗體分子,例如表A所列任一抗體分子的一個或多個生物學特性;
(x)具有本文所述的抗體分子,例如表A所示任一抗體的一種或多種藥物代謝動力學特性;
(xi)抑制表達CD30的腫瘤細胞的生長;
(xii)在效應細胞存在下誘導針對表達CD30的腫瘤細胞的殺傷作用(例如藉由抗體依賴性細胞毒性(ADCC))。
在一些實施方案中,本發明抗CD30抗體分子以高親和力,例如,以下述解離平衡常數(KD)與人CD30(例如SEQ ID NO:162的多肽)結合,所述KD小於約100nM,小於或等於大約80nM、70nM、60nM、或50nM,更佳地小於或等於大約40nM、30nM或20nM,更佳地小於或等於大約10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一個實施方案中,KD值藉由使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量法)測定。
在一些實施方案中,本發明抗CD30抗體分子與人CD30(例如SEQ ID NO:162的多肽)結合的解離速率常數(Kdis)小於6×10-3s-1、例如4-1×10-3s-1、較佳地小於8×10-4s-1,例如小於5×10-4或3×10-4s-1,例如約2×10-4s-1。在一些實施方案中,抗CD30抗體分子與人CD30(例如SEQ ID NO:162的多肽)結合的結合速率常數(Kon)大於1×104、5×104、1×105或2×105M-1s-1。
在一些實施方案中,本發明抗CD30抗體分子以高親和力結合表達CD30的細胞,較佳地在細胞表面表達人CD30的淋巴瘤細胞(例如Karpas299細胞),較佳地,以流式細胞術(例如FACS)測定,所述抗體與細胞結合的EC50值小於大約200nM、150nM或100nM,較佳地,小於或等於大約80nM、70nM、60nM、或50nM,更佳地小於或等於大約40nM、30nM或20nM,更佳地小於或等
於大約10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM,最佳小於1nM。
在一個實施方案中,抗體分子與包含胺基酸序列SEQ ID NO:162的人CD30結合。在一些實施方案中,抗體分子結合CD30上,較佳CD30的胞外域上的表位。
在一些實施方案中,抗體分子是全長抗體。在另一些實施方案中,抗體分子是抗體片段。例如,本發明的抗體分子可以包含或可以是Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、單鏈scFv抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體、四鏈抗體、微抗體。在一個較佳的實施方案,本發明抗體分子是單鏈scFv抗體。在一個較佳的實施方案,本發明抗體分子包含scFv及與其連接的Fc區。在一個較佳的實施方案,本發明抗體分子是全人源的。
“可變區”或“可變結構域”是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原的結合的結構域。重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)可以進一步再劃分為高變區(HVR,又稱作互補決定區(CDR)),其間插有較保守的區域(即,構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成,從胺基端到羧基端以如下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些情況下,單個VH或VL結構域足以賦予抗原-結合特異性。此外,結合特定抗原的抗體可以使用來自結合所述抗原的抗體的VH或VL結構域篩選互補VL或VH結構域文庫而分離(參見,例如,Portolano,S.等,J.Immunol.150(1993)880-887;Clackson,T.等,Nature 352(1991)624-628)。在本文中,術語“VH”或“VH
結構域”涵蓋全長抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab、scFab或本文公開的其它抗體片段的重鏈可變區VH。在本文中,術語“VL”或“VL結構域”涵蓋全長抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab、scFab或本文公開的其它抗體片段的輕鏈可變區VL。
在一個實施方案中,本發明抗CD30抗體分子包含:(i)與表A所列任一抗體的抗原結合區(例如,重鏈可變區和輕鏈可變區對)相同的抗原結合區;或(ii)與(i)的抗原結合區在胺基酸序列上具有例如,至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的抗原結合區。
在再一個實施方案中,本發明抗CD30抗體分子包含:(i)與表A所列任一抗體的重鏈可變區相同的重鏈可變區;或(ii)與(i)的重鏈可變區在胺基酸序列上具有例如,至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的重鏈可變區;或(iii)(i)的重鏈可變區的變體,其中所述變體包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代),且較佳地所述變體在3個重鏈互補決定區(CDR)區中包含總共不超過10個、較佳5-0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代)。
在再一個實施方案中,本發明抗CD30抗體分子包含:(i)與表A所列任一抗體的輕鏈可變區相同的輕鏈可變區;或(ii)與(i)的輕鏈可變區在胺基酸序列上具有例如,至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的輕鏈可變區;或(iii)(i)的輕鏈可變區的變體,其中所述變體包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代),且較佳地所述變體在3個輕鏈互補決定區(CDR)中包含總共不超過10個、較佳5-0個胺基酸改變(較佳胺基酸取代)。
在一些實施方案中,本發明提供包含表A所列任一抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區對的胺基酸序列的抗CD30抗體、或其變體。在一個較佳實施方案中,該抗體包含選自以下的胺基酸序列對:SEQ ID NOs:4/9、14/19、24/29、34/39、44/49、54/59、64/69、74/79、84/89、94/99、104/109、和114/119。在一個較佳實施方案中,該變體在VH和/或VL胺基酸序列上具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性、或在VH和/或VL胺基酸序列上包含至少一個且不超過30、20或10個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:19的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:24的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:29的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:34的胺基酸序列,且該VL包含SEQ
ID NO:39的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:44的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:49的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:54的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:59的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:64的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:74的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:79的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:84的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:89的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:94的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:99的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:104的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:109的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在一些實施方案中,本發明提供包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗CD30抗體,該VH包含SEQ ID NO:114的胺基酸序列,且該VL包含SEQ ID NO:119的胺基酸序列。本發明也提供該抗體的變體,例如在VH和/或VL上具有至少95-99%同一性或包含不超過10個胺基酸改變的變體。
在上述任一實施方案中,較佳地,相對於所述的參考重鏈可變區胺基酸序列,本發明抗體的重鏈可變區在全部3個CDR區域上包含不超過10個,較佳不超過5個(例如,3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在上述任一實施方案中,較佳地,相對於該參考輕鏈可變區胺基酸序列,本發明抗體的輕鏈可變區VL在全部3個CDR區域上包含不超過10個,較佳不超過5個(例如,3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用),是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸
區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3,從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如,Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的並且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中,並且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。根據不同的CDR確定方案,這些HVR中的每一個HVR/CDR的殘基如下所述。
HVR也可以是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列:
VL中的位置24-36或24-34(LCDR1),位置46-56或50-56(LCDR2),和位置89-97或89-96位置(LCDR3);和VH中的位置26-35或26-35B(HCDR1),位置50-65或49-65(HCDR2),和位置94-102或95-102(HCDR3)。
在一個實施方案中,本發明抗體的HVR是根據Kabat編號系統位於如下Kabat殘基位置的HVR序列:
VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3),以及VH中的位置26-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置95-102(HCDR3)。
HVR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明,否則在本發明中,術語“CDR”或“CDR序列”或“HVR”或“HVR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的HVR或CDR序列。
除非另有說明,否則在本發明中,當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時,是指根據Kabat編號系統(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。
在一個較佳的實施方案中,本發明抗體的CDR為綜合Kabat和chothia劃分方法,取兩者的並集確定的CDR序列。在另一較佳的實施方案中,本發明CDR序列如表B中所示。
具有不同特異性(即,針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而,儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的,但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少兩種,可以確定最小重疊區域,從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭,藉由抗體的結構和蛋白折疊,可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此,本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如,在一個CDR的變體中,最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變,而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
在一些實施方案中,本發明的抗體包含與表A所列任一抗體的對應CDR相同的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR,或其變體。在一些實施方案中,本發明的抗體包含與表A所列任一抗體的對應重鏈CDR相同的至少一個、兩個、或三個HCDR,或其變體。在一些實施方案中,本發明的抗體包含與表A所列任一抗體的對應輕鏈CDR相同的至少一個、兩個、或三個HCDR,或其變體。在本文中,CDR變體是已經藉由至少一個,例如1或2或3個胺基酸取代、缺失和/或插入而修飾的CDR,其中包含CDR變體的抗原結合分子基本上保持包含未修飾CDR的抗原結合分子的生物學特性,例如,保持至少60%、70%、80%、90%、或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。可以理解,各CDR可以單獨修飾或組合修飾。較佳地,胺基酸修飾為胺基酸取代,尤其是保守胺基酸取代,例如表X中列出的較佳保守胺基酸置換。
在一些實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區,該重鏈可變區的HCDR1、HCDR2、和HCDR3:
(i)與表A列出的任一抗體的重鏈可變區的HCDR1、HCDR2、和HCDR3分別相同;或
(ii)相對於(i)的HCDR1、HCDR2和HCDR3,共包含至少1個且不超過10,較佳不超過5個(較佳1、2或3個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代),且較佳地在HCDR3區上的胺基酸改變不超過3個(例如,2、1或0個)。
在一些實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3:
(i)與表A列出的任一抗體的輕鏈可變區的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別相同;或
(ii)相對於(i)的LCDR1、LCDR2和LCDR3,共包含至少1個且不超過10個(較佳1-5個,較佳1、2或3個)胺基酸改變(較佳取代、更佳保守取代)。
在一些實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3,且該輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中所述抗體:
(i)包含表A所列任一抗體的重鏈和輕鏈可變區的全部6個CDR區的序列;或
(ii)相對於表A所列任一抗體,在全部6個CDR區上包含不超過10個,較佳不超過5個(例如,3、2、1或0個)胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。
在一個較佳的實施方案中,本發明抗體或抗原結合片段包含選自以下的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的HCDR1、2和3序列和LCDR1、2和3序列:
(i)SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:9的VL;
(ii)SEQ ID NO:14的VH和SEQ ID NO:19的VL;
(iii)SEQ ID NO:24的VH和SEQ ID NO:29的VL;
(iv)SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:39的VL;
(v)SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:49的VL;
(vi)SEQ ID NO:54的VH和SEQ ID NO:59的VL;
(vii)SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:69的VL;
(viii)SEQ ID NO:74的VH和SEQ ID NO:79的VL;
(ix)SEQ ID NO:84的VH和SEQ ID NO:89的VL;
(x)SEQ ID NO:94的VH和SEQ ID NO:99的VL;
(xi)SEQ ID NO:104的VH和SEQ ID NO:109的VL;
(xii)SEQ ID NO:114的VH和SEQ ID NO:119的VL。
在一些實施方案中,本發明提供選自以下胺基酸序列組合的重鏈CDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3):SEQ ID NOs:1/2/3、11/12/13、21/22/23、3132/33、41/42/43、51/52/53、61/62/63、71/72/73、81/82/83、91/92/93、101/102/103、和111/112/113。本發明也提供所述重鏈CDR組合的變體,在一個較佳實施方案中,所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。本發明也提供包含該重鏈CDR組合或該變體的抗CD30抗體。
在一些實施方案中,本發明提供選自以下的CDR序列組合、以及包含該組合的抗體或抗原結合片段:
(i)包含SEQ ID NO:1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:3序列的HCDR3;
(ii)包含SEQ ID NO:11序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:12序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:13序列的HCDR3;
(iii)包含SEQ ID NO:21序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:22序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:23序列的HCDR3;
(iv)包含SEQ ID NO:31序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:32序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:33序列的HCDR3;
(v)包含SEQ ID NO:41序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:42序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:43序列的HCDR3;
(vi)包含SEQ ID NO:51序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:52序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:53序列的HCDR3;
(vii)包含SEQ ID NO:61序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:62序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:63序列的HCDR3;
(viii)包含SEQ ID NO:71序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:72序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:73序列的HCDR3;
(ix)包含SEQ ID NO:81序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:82序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:83序列的HCDR3;
(x)包含SEQ ID NO:91序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:92序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:93序列的HCDR3;
(xi)包含SEQ ID NO:101序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:102序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:103序列的HCDR3;
(xii)包含SEQ ID NO:111序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:112序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO:113序列的HCDR3。
在一些實施方案中,本發明提供具有選自以下胺基酸序列組合的輕鏈CDR組合(按順序分別為LCDR1、LCDR2和LCDR3):SEQ ID NOs:6/7/8、16/17/18、26/27/28、36/37/38、46/47/48、56/57/58、66/67/68、76/77/78、86/87/88、96/97/98、106/107/108、和116/117/118。本發明也提供該輕鏈CDR組合的變體,在一個較佳實施方案中,該變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過10或5個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。本發明也提供包含該輕鏈CDR組合或該變體的抗CD30抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中,本發明提供選自以下的CDR組合、以及包含該組合的抗體或抗原結合片段:
(i)包含SEQ ID NO:6序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:7序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:8序列的LCDR3;
(ii)包含SEQ ID NO:16序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:17序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:18序列的LCDR3;
(iii)包含SEQ ID NO:26序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:27序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:28序列的LCDR3;
(iv)包含SEQ ID NO:36序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:37序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:38序列的LCDR3;
(v)包含SEQ ID NO:46序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:47序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:48序列的LCDR3;
(vi)包含SEQ ID NO:56序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:57序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:58序列的LCDR3;
(vii)包含SEQ ID NO:66序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:67序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:68序列的LCDR3;
(viii)包含SEQ ID NO:76序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:77序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:78序列的LCDR3;
(ix)包含SEQ ID NO:86序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:87序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:88序列的LCDR3;
(x)包含SEQ ID NO:96序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:97序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:98序列的LCDR3;
(xi)包含SEQ ID NO:106序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:107序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:108序列的LCDR3;
(xii)包含SEQ ID NO:116序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:117序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO:118序列的LCDR3。
在再一些實施方案中,本發明提供選自以下胺基酸序列組合的重鏈和輕鏈CDR組合(按順序分別為HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3):SEQ ID NOs:1/2/3/6/7/8、11/12/13/16/17/18、21/22/23/26/27/28、31/32/33/36/37/38、41/42/43/46/47/48、51/52/53/56/57/58、61/62/63/66/67/68、71/72/73/76/77/78、81/82/83/86/87/88、91/92/93/96/97/98、101/102/103/106/107/108,和111/112/113/116/117/118。本發明也提供該CDR組合的變體,在一個較佳實施方案中,該變體在該六個CDR區上共包含至少一個且不超過20、10或5個胺基酸改變(較佳胺基酸取代,較佳保守取代)。本發明也提供包含該重鏈和輕鏈CDR組合或該變體的抗CD30抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中,本發明抗體或其抗原結合片段包含3個重鏈互補決定區HCDR以及3個輕鏈互補決定區LCDR,其中:
(a)HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列;或
(b)HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列;或
(c)HCDR1包含SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列;或
(d)HCDR1包含SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列;或
(e)HCDR1包含SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:42所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:43所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:46所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:47所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:48所示的胺基酸序列;或
(f)HCDR1包含SEQ ID NO:51所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:52所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:53所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:56所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:57所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:58所示的胺基酸序列;或
(g)HCDR1包含SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:62所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:63所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:66所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:67所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:68所示的胺基酸序列;或
(h)HCDR1包含SEQ ID NO:71所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:72所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:73所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:76所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:77所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:78所示的胺基酸序列;或
(i)HCDR1包含SEQ ID NO:81所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:82所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:83所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:86所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:87所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:88所示的胺基酸序列;或
(j)HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:92所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:93所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:96所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:97所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:98所示的胺基酸序列;或
(k)HCDR1包含SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:102所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:103所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:106所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:107所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:108所示的胺基酸序列;或
(l)HCDR1包含SEQ ID NO:111所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:112所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:113所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:116所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:117所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:118所示的胺基酸序列。
在本發明抗體的上述實施方案中,“保守性取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在本發明任一實施方案中,在一個較佳的方面,保守取代殘基來自以下的保守替代表X,較佳地為表X中所示較佳置換殘基。
本發明提供了如實施例中分離並表徵的特異性結合CD30(例如人CD30)的全人源抗體。下表A中列出了本發明這些示例性抗體的可變區序列(也見第4圖及第5圖)。下表B中給出這些抗體的示例性CDR序列(也見第3)。
表A.本發明示例性全人源抗體分子的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列和核苷酸序列。
本發明也提供上述抗體的變體。在一個實施方案中,抗體的胺基酸序列或編碼胺基酸序列的核酸已經被突變,但仍與表A中描述的序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高同一性。一些實施方案,抗體包括突變的可變區胺基酸序列,其中與表A所示的可變區序列相比時,可變區VH和/或VL中已突變了不多於1、2、3、4、5或10個胺基酸,但保留基本相同的抗原結合活性。
此外,由於上述抗體每一個都可以與CD30結合,故可以“混合並匹配”VH和VL(胺基酸序列和編碼該胺基酸序列的核苷酸序列)以產生結合
CD30的本發明其他抗體。可以使用本領域已知的結合測定法(例如,ELISA,和實施例部分中描述的其他測定法)測試這類“混合和匹配的”抗體與CD30的結合。在混合和匹配這些鏈時,較佳地,將來自具體VH/VL配對的VH序列替換為結構相似的VH序列。同樣,來自特定VH/VL配對的VL序列較佳地替換為結構上相似的VL序列。
在另一方面,本發明也提供上述抗體的變體。在一個實施方案中,抗體在一個或多個或全部6個CDR區的胺基酸序列或編碼該胺基酸序列的核酸上已經被突變。在一些實施方案中,突變的CDR區的胺基酸序列,與表A的對應CDR區相比時,已突變了不多於1、2、3、4或5個胺基酸,但保留基本相同的抗原結合活性。
此外,鑒於表A抗體的每一者均可以與CD30結合且抗原結合特異性主要由CDR1、2和3區提供,故可以將VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列“混合並匹配”(即,可以混合並匹配來自不同抗體的CDR,不過每種抗體較佳地含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3),以產生結合CD30的本發明其他分子。可以使用本領域已知的結合測定法(例如,ELISA、SET、Biacore)和實施例中描述的那些測定法,測試這類“混合和匹配的”抗體與CD30的結合。當混合並匹配VH CDR序列時,來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。同樣,當混合並匹配VL CDR序列時,來自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列較佳地替換為結構上相似的CDR序列。本領域技術人員明瞭,也可以藉由將一個或多個VH和/或VL CDR區序列置換為來自本文中所示抗體的結構上相似的CDR序列,以產生本發明的其它抗體。
在一個較佳方面,本發明抗體是單鏈scFv抗體。
在本文中,“單鏈scFv抗體”或“scFv”或“單鏈scFv”是指,包含免疫球蛋白或抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的單個多肽鏈,在該單條蛋白鏈中VH區和VL區配對提供抗原結合位點。
在較佳的實施方案中,本發明單鏈scFv抗體的VH區和VL區藉由連接肽例如柔性連接肽共價連接在一起。術語“柔性連接肽”是由胺基酸組成的肽接頭。藉由這樣的肽接頭可以連接抗體中的各個可變結構域,例如VH和VL區。肽接頭通常富含表現柔性的甘胺酸以及表現溶解性的絲胺酸或蘇胺酸。例如可以單獨或組合使用甘胺酸和/或絲胺酸殘基。柔性連接肽或肽接頭的非限定性例子公開於Shen等人,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)、WO2012/138475和WO2014/087010,將其內容全文併入作為參考。如本領域已知的,在scFv的構建中,較佳,接頭將利於促使VH和VL配對,且不干擾VH和VL對形成功能有效的抗原結合位點。
在一些實施方案中,本發明scFv單鏈抗體包含由肽鍵連接的胺基酸殘基組成的柔性連接肽或肽接頭。在某些實施方案中,該胺基酸選自二十種天然胺基酸。在某些其他實施方案中,一個或多個胺基酸選自甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺和賴胺酸。在一個較佳實施方案中,一個或多個胺基酸選自Gly、Ser、Thr、Lys、Pro、和Glu。
在一些實施方案中,接頭的長度是約1-30個胺基酸、或約10個至約25個胺基酸、約15個至約20個胺基酸或約10個至約20個胺基酸或者任意介於
中間的胺基酸長度。在較佳實施方案中,接頭具有15-25個胺基酸殘基長度,在更佳實施方案中,具有15-18個胺基酸殘基的長度。在一些實施方案中,接頭的長度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或者更多個胺基酸。
可以用於本發明的肽接頭的實例包括:甘胺酸聚合物(G)n;甘胺酸-絲胺酸聚合物(G1-5S1-5)n,其中n是至少1、2、3、4或5的整數;甘胺酸-丙胺酸聚合物;丙胺酸-絲胺酸聚合物;以及本領域已知的其它柔性接頭。本領域技術人員可以理解,在一些實施方案中,VH和VL之間的接頭可以完全由柔性連接肽組成,或者接頭可以由柔性連接肽部分以及賦予較小柔性結構的一個或多個部分組成。
在一個較佳實施方案中,肽接頭是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:157)。在一個實施方案中,編碼胺基酸序列SEQ ID NO:157的核苷酸序列在SEQ ID NO:158中給出。
在一個實施方案中,肽接頭是Gly/Ser連接肽。在一個實施方案中,肽接頭是(GxS)n接頭,其中G=甘胺酸、S=絲胺酸,(x=3,n=8、9或10)或(x=4和n=6、7或8),在一個實施方案中,x=4,n=6或7。在一些實施方案中,接頭可以包括胺基酸序列(G4S)n,其中n是等於或大於1的整數,例如,n是1-7的整數。在一個較佳實施方案中,x=4,n=7。在一個實施方案中,接頭是(G4S)3。在一個實施方案中,接頭是(G4S)4。在一個實施方案中,接頭是(G4S)6G2。
其它示例性接頭包括但不限於下述胺基酸序列:GGG;DGGGS;TGEKP(參見,例如,Liu等人,PNAS5525-5530(1997));GGRR
(Pomerantz等人.1995,同上);(GGGGS)n,其中n=1、2、3、4或5(Kim等人,PNAS 93,1156-1160(1996);EGKSSGSGSESKVD(Chaudhary等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070);KESGSVSSEQLAQFRSLD(Bird等人,1988,Science242:423-426),GGRRGGGS;LRQRDGERP;LRQKDGGGSERP;LRQKD(GGGS)2ERP。可選地,可以使用能夠模建DNA-結合位點和肽自身的計算機程序(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS91:11099-11103(1994)),或者藉由噬菌體或酵母展示方法,合理地設計柔性接頭。
本發明單鏈scFv抗體中VH和VL可以取任一方向。在一些實施方案中,scFv從N端到C端包含:VH-接頭-VL;或VL-接頭-VH。在一個較佳實施方案中,本發明單鏈scFv抗體從N端到C端包含:VH-接頭-VL。在一個較佳實施方案中,VH以其C末端經由接頭共價連接VL的N末端。
在一些實施方案中,除了接頭,VL和VH結構域之間也可以插入具有特定功能的其它多肽片段,例如具有調節免疫反應功能的多肽片段、或具有引起細胞溶劑或細胞殺傷的多肽片段。
在一些實施方案中,可以藉由在scFv中引入二硫鍵以穩定單鏈抗體。例如,可以藉由引入鏈內或鏈間二硫鍵而連接scFv的VH和VL的構架區。在一個實施方案中,可以藉由將抗體VH和VL的各1個胺基酸殘基突變為半胱胺酸,例如根據Kabat編號系統,VH的44位和VL的100位,或者VH的105位和VL的43位。
本發明的單鏈scFv多肽抗體可以由包括VH-和VL-編碼序列的核酸表達,如Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879~5883,1988)。還可參見美國專利號5,091,513、5,132,405和4,956,778;以及美國專利公開號
20050196754和20050196754。在一些實施方案中,本發明的單鏈scFv抗體在真核細胞中表達,例如酵母細胞、哺乳動物細胞如HEK293細胞或CHO細胞。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:121的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:121具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:122的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:4的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:4的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:9的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:4所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:9所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:4所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:9所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:3的HCDR3和SEQ ID NO:8的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:1的VH CDR1、SEQ ID NO:2的VH CDR2、和SEQ ID NO:3的VH CDR3。在某些實施
方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:6的VL CDR1、SEQ ID NO:7的VL CDR2、和SEQ ID NO:8的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:1的VH CDR1、SEQ ID NO:2的VH CDR2、和SEQ ID NO:3的VH CDR3,以及SEQ ID NO:6的VL CDR1、SEQ ID NO:7的VL CDR2、和SEQ ID NO:8的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:124的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:124具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:125的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:19的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:14的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:19的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:14所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:19所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:14所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:19所示序列的
VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:13的HCDR3和SEQ ID NO:18的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:11的VH CDR1、SEQ ID NO:12的VH CDR2、和SEQ ID NO:13的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:16的VL CDR1、SEQ ID NO:17的VL CDR2、和SEQ ID NO:18的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:11的VH CDR1、SEQ ID NO:12的VH CDR2、和SEQ ID NO:13的VH CDR3,以及SEQ ID NO:16的VL CDR1、SEQ ID NO:17的VL CDR2、和SEQ ID NO:18的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:127的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:127具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:128的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:24的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:29的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:24的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:29的胺基
酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:24所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:29所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:24所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:29所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:23的HCDR3和SEQ ID NO:28的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:21的VH CDR1、SEQ ID NO:22的VH CDR2、和SEQ ID NO:23的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:26的VL CDR1、SEQ ID NO:27的VL CDR2、和SEQ ID NO:28的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:21的VH CDR1、SEQ ID NO:22的VH CDR2、和SEQ ID NO:23的VH CDR3,以及SEQ ID NO:26的VL CDR1、SEQ ID NO:27的VL CDR2、和SEQ ID NO:28的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:130的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:130具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:131的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:34的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:39的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需
要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:34的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:39的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:34所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:39所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:34所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:39所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:33的HCDR3和SEQ ID NO:38的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:31的VH CDR1、SEQ ID NO:32的VH CDR2、和SEQ ID NO:33的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:36的VL CDR1、SEQ ID NO:37的VL CDR2、和SEQ ID NO:38的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:31的VH CDR1、SEQ ID NO:32的VH CDR2、和SEQ ID NO:33的VH CDR3,以及SEQ ID NO:36的VL CDR1、SEQ ID NO:37的VL CDR2、和SEQ ID NO:38的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:133的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:133具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:134的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:44的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:49的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:44的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:49的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:44所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:49所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:44所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:49所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:43的HCDR3和SEQ ID NO:48的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:41的VH CDR1、SEQ ID NO:42的VH CDR2、和SEQ ID NO:43的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:46的VL CDR1、SEQ ID NO:47的VL CDR2、和SEQ ID NO:48的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:41的VH CDR1、SEQ ID NO:42的VH CDR2、和SEQ ID NO:43的VH CDR3,以及SEQ ID NO:46的VL CDR1、SEQ ID NO:47的VL CDR2、和SEQ ID NO:48的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:136的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一
些實施方案中,變體與SEQ ID NO:136具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:137的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:54的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:59的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:54的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:59的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:54所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:59所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:54所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:59所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:53的HCDR3和SEQ ID NO:58的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:51的VH CDR1、SEQ ID NO:52的VH CDR2、和SEQ ID NO:53的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:56的VL CDR1、SEQ ID NO:57的VL CDR2、和SEQ ID NO:58的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:51的VH CDR1、SEQ ID NO:52的VH CDR2、和SEQ ID NO:53的VH CDR3,以及SEQ ID NO:56的VL CDR1、SEQ ID NO:57的VL CDR2、和SEQ ID NO:58的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:139的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:139具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:140的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:64的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:64的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:69的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:64所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:69所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:64所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:69所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:63的HCDR3和SEQ ID NO:68的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:61的VH CDR1、SEQ ID NO:62的VH CDR2、和SEQ ID NO:63的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:66的VL CDR1、SEQ ID NO:67的VL CDR2、和SEQ ID NO:68的VL CDR3。在某些實施方式中,抗
CD30 scFv包含:SEQ ID NO:61的VH CDR1、SEQ ID NO:62的VH CDR2、和SEQ ID NO:63的VH CDR3,以及SEQ ID NO:66的VL CDR1、SEQ ID NO:67的VL CDR2、和SEQ ID NO:68的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:142的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:142具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:143的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:74的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:79的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:74的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:79的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:74所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:79所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:74所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:79所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:73的HCDR3和SEQ ID NO:78的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ
ID NO:71的VH CDR1、SEQ ID NO:72的VH CDR2、和SEQ ID NO:73的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:76的VL CDR1、SEQ ID NO:77的VL CDR2、和SEQ ID NO:78的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:71的VH CDR1、SEQ ID NO:72的VH CDR2、和SEQ ID NO:73的VH CDR3,以及SEQ ID NO:76的VL CDR1、SEQ ID NO:77的VL CDR2、和SEQ ID NO:78的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:145的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:145具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:146的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:84的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:89的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:8157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:84的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:89的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:84所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:89所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30
scFv包括SEQ ID NO:84所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:89所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:83的HCDR3和SEQ ID NO:88的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:81的VH CDR1、SEQ ID NO:82的VH CDR2、和SEQ ID NO:83的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:86的VL CDR1、SEQ ID NO:87的VL CDR2、和SEQ ID NO:88的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:81的VH CDR1、SEQ ID NO:82的VH CDR2、和SEQ ID NO:83的VH CDR3,以及SEQ ID NO:86的VL CDR1、SEQ ID NO:87的VL CDR2、和SEQ ID NO:88的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:148的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:148具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:149的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:94的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:99的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:94的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:99的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:94所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:99所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:94所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:99所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:93的HCDR3和SEQ ID NO:98的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:91的VH CDR1、SEQ ID NO:92的VH CDR2、和SEQ ID NO:93的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:96的VL CDR1、SEQ ID NO:97的VL CDR2、和SEQ ID NO:98的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:91的VH CDR1、SEQ ID NO:92的VH CDR2、和SEQ ID NO:93的VH CDR3,以及SEQ ID NO:96的VL CDR1、SEQ ID NO:97的VL CDR2、和SEQ ID NO:98的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:151的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:151具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:152的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:104的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:109的胺基酸序列或與其具有至
少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:104的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:109的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:104所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:109所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:104所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:109所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:103的HCDR3和SEQ ID NO:108的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:101的VH CDR1、SEQ ID NO:102的VH CDR2、和SEQ ID NO:103的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:106的VL CDR1、SEQ ID NO:107的VL CDR2、和SEQ ID NO:108的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:101的VH CDR1、SEQ ID NO:102的VH CDR2、和SEQ ID NO:103的VH CDR3,以及SEQ ID NO:106的VL CDR1、SEQ ID NO:107的VL CDR2、和SEQ ID NO:108的VL CDR3。
在某些實施方式中,本發明的抗體是抗CD30 scFv或其抗原結合片段,其包含胺基酸序列SEQ ID NO:154的抗原結合區或其變體,並特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段)。在一些實施方案中,變體與SEQ ID NO:154具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性。在一個實施方案中,抗CD30 scFv由SEQ ID NO:155的核苷酸編碼。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv抗體包括:包含SEQ ID NO:114的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列的重鏈可變區,和包含SEQ ID NO:119的胺基酸序列或與其具有至少90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的的輕鏈可變區,以及視需要地在重鏈可變區和輕鏈可變區之間的接頭,例如接頭肽。在某些實施方式中,接頭包含SEQ ID NO:157的胺基酸序列。
在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:114的胺基酸序列的VH。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:119的胺基酸序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO:114所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO:119所示序列的VL。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括SEQ ID NO:114所示序列的VH的3個HCDR序列和/或SEQ ID NO:119所示序列的VL的3個LCDR序列。在一些實施方案中,抗CD30 scFv包含SEQ ID NO:113的HCDR3和SEQ ID NO:118的LCDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:111的VH CDR1、SEQ ID NO:112的VH CDR2、和SEQ ID NO:113的VH CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包括:SEQ ID NO:116的VL CDR1、SEQ ID NO:117的VL CDR2、和SEQ ID NO:118的VL CDR3。在某些實施方式中,抗CD30 scFv包含:SEQ ID NO:111的VH CDR1、SEQ ID NO:112的VH CDR2、和SEQ ID NO:113的VH CDR3,以及SEQ ID NO:116的VL CDR1、SEQ ID NO:117的VL CDR2、和SEQ ID NO:118的VL CDR3。
具有Fc區的抗體具有若干優勢,包括,但不限於:可以藉由Fc區介導效應子功能,例如CDC和ADCC免疫學活性;藉由Fc區的二聚化功能形成二價抗體,可以提供強的抗原結合親和力,和/或改變血漿半衰期和腎臟清除率;二價抗體可以以不同於單價Fab或scFv抗體的速率內化,改變免疫功能或載體功能。例如,α發射體不需要內化來殺傷靶細胞,但許多藥物和毒素將受益於免疫複合物的內化。
因此,在一個較佳的實施方案中,提供本發明單鏈scFv抗體與抗體Fc區融合形成的scFv-Fc抗體。在一些實施方案中,所述抗體包含本發明的單鏈scFv抗體和野生型或改變的Fc區。在一個較佳實施方案中,所述抗體從N端到C端包含:Fc-VH-接頭-VL或Fc-VL-接頭-VH;或較佳地VH-接頭-VL-Fc或VL-接頭-VH-Fc。在一個較佳實施方案中,Fc藉由鉸鏈區連接到可變區(VH或VL)上。在一些實施方案中,Fc為來自人免疫球蛋白的Fc區,較佳人IgG1或IgG4 Fc區。在一個較佳實施方案中,Fc區具有SEQ ID NO:161所示的胺基酸序列、或相對於SEQ ID NO:161的胺基酸序列包含至少一個,兩個或三個,但不超過20個,10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列,或與SEQ ID NO:161的胺基酸序列具有至少95-99%同一性的序列。在一些實施方案中,本發明的單鏈scFv抗體藉由鉸鏈區連接到Fc區上。在一個實施方案中,鉸鏈區為C8鉸鏈區,例如包含SEQ ID NO:159所示的胺基酸序列、或相對於SEQ ID NO:159的胺基酸序列包含至少一個,兩個或三個,但不超過5個胺基酸改變的胺基酸序列。
在一些較佳的實施方案中,本發明提供這樣的抗體,其特異性結合CD30多肽(例如,具有胺基酸序列SEQ ID NO:162的CD30多肽或其片段),並且包含選自SEQ ID NO:123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、
153、和156的胺基酸序列、或相對於其包含至少一個,兩個或三個,但不超過20個,10個或5個胺基酸改變的胺基酸序列,或與其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的胺基酸序列。
下表C中列出了本發明一些示例性ScFv-Fc抗體的胺基酸序列及用於構建其的單鏈scFv的胺基酸序列和核苷酸序列。這些scFv-Fc抗體中所用的接頭和鉸鏈的胺基酸序列和核苷酸序列示於第7圖中。
在一些實施方案中,本發明的scFv-Fc抗體具有效應子功能。術語“效應子功能”是指,可歸因於抗體的Fc-區的那些生物活性,其隨抗體類別而改變。存在五種主要的抗體類別:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,並且這些中的一些可以進一步分為亞類(同種型),例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。抗體的效應子功能包括例如但不限於:C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調;和B-細胞激活。US20120014943A1報道,在Fc區中包含選自239D和332E的至少一個胺基酸取代可以導致抗體具有增強的Fc γ RIIIa親和力,從而引起增強的效應子功能。在一些實施方案中,本發明的scFv-Fc抗體藉由效應細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性而阻斷、抑制表達CD30的細胞(尤其是腫瘤細胞,如淋巴瘤細胞)的生長、和/或殺死所述細胞。
在某些實施方案中,Fc區可以包含具有一個或多個提高ADCC活性的胺基酸置換的Fc-區,例如,Fc-區的位置298、333和/或334的置換(殘基的EU編號)。在一些實施方案中,也可以對Fc-區進行改變,以導致改變的(即,提高的或降低的)C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見,例如,US6,194,551、WO99/51642和Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184)。
在另一些實施方案中,可以對Fc進行改變以增加或降低其糖基化程度和/或改變其糖基化模式。對Fc的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。舉例而言,可實施
一或多種胺基酸取代以消除一或多個糖基化位點,由此消除該位點處的糖基化。可製備具有改變類型的糖基化的抗體,例如具有減小量的岩藻糖基殘基的低或無岩藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。這類改變的糖基化模式已顯示可增加抗體的ADCC能力。
因此,在一些較佳實施方案中,本發明提供這樣的抗體,其Fc區是低或無岩藻糖基化的,從而可以顯著地增加抗體Fc結構域與效應細胞上表達的Fc γ受體(如Fc γ RIIIa)的結合親和力,由此導致抗體具有增強的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性。例如,抗體中岩藻糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。可以藉由MALDI-TOF質譜法測量,相對於與Asn 297連接的所有糖結構(例如複合型、雜合型及高甘露糖型結構)的總和,計算在Asn297處糖鏈內的岩藻糖的平均量,由此確定岩藻糖的量,例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區中大約位置297處(Fc區殘基的EU編號)的天冬醯胺殘基;然而,由於抗體中微小的序列變化,Asn297也可能位於位置297上游或下游約±3個胺基酸位置,即位置294與300之間。參見例如US2003/0157108;US2004/0093621。與“去岩藻糖基化”或“低岩藻糖基化”抗體變體有關的公佈實例還包括:US2003/0157108;WO 2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US 2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282:US2004/0109865;WO2003/085119:WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki,A.等,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249;Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)614-622。可以在能夠產生去岩藻糖基化或低岩藻糖基化抗體的細胞系中產生此類抗體變體。此
類細胞的實例包括蛋白質岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO細胞(Ripka,J.等,Arch.Biochem.Biophys.249(1986):533-545;US 2003/0157108;和WO 2004/056312,尤其是實施例11);及基因敲除細胞系,例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8敲除的CHO細胞(參見,例如Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)614-622;Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688;和WO 2003/085107)。再例如,細胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基轉移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基轉移酶),從而可以在Ms704、Ms705及Ms709細胞系中表達缺乏岩藻糖的抗體。此外,EP 1,176,195也描述了具有功能受破壞的FUT8基因的細胞系,在這類細胞系中表達的抗體展現低岩藻糖化。備選地,還可使用岩藻糖苷酶切除抗體的岩藻糖殘基;舉例而言,岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體去除岩藻糖基殘基(Tarentino等人(1975)Biochem.14:5516-23)。
此外,本發明也考慮具有平分型(bisected)寡糖的抗體變體,例如,其中與Fc區連接的雙觸角寡糖被GlcNAc平分的抗體。這些抗體變體可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。這些抗體變體的實例描述於例如WO 2003/011878;US6,602,684;和US 2005/0123546。本發明也考慮在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。這些抗體變體可具有提高的CDC功能。這些抗體變體描述於例如WO 1997/30087;WO 1998/58964;和WO 1999/22764。
評價目標分子的ADCC活性的體外測定試驗的非限制性實例描述於US5,500,362(參見,例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83(1986)7059-7063;和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82(1985)
1499-1502);US 5,821,337(參見Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者,可採用非放射性測定方法(參見例如用於流式細胞術的ACTITM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)和CytoTox96®非放射性細胞毒性測定(Promega,Madison,WI))。適用於這些測定的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。備選地或另外地,可以在體內評價目標分子的ADCC活性,例如,在如Clynes,R.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95(1998)652-656中公開的動物模型中評價。為評價補體活化,可進行CDC測定(參見,例如Gazzano-Santoro,H.等,J.Immunol.Methods202(1996)163-171;Cragg,M.S.等,Blood101(2003)1045-1052;和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103(2004)2738-2743)。也可進行C1q結合測定,以確定抗體的C1q結合和CDC活性。參見例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。
在某些實施方案中,本發明也考慮具有一些但非所有效應子功能的抗體變體,這使其成為某些應用的理想候選物,在該應用中抗體的體內半衰期是重要的,但某些效應子功能(如補體和ADCC)是不必要或有害的。可進行如上所述的體外和/或體內測定試驗,以確認CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如,可進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體缺乏Fe γ R結合(因此很可能缺乏ADCC活性),但保持FcRn結合能力。例如,Fc區可以包含消除或減弱效應子功能的突變,例如具有突變P329G和/或L234A和L235A的人IgG1 Fc區,或具有突變P329G和/或S228P和L235E的人IgG4 Fc區。
在一些實施方案中,本發明的scFv-Fc區抗體可以藉由Fc區的二聚化作用而形成二價抗體,從而可以進一步具有增加的抗體總親和力和穩定性、
或形成多特異性如雙特異性。例如Fc區可以包含i)人IgG1亞類的同二聚Fc-區,或ii)人IgG4亞類的同二聚Fc-區,或iii)異二聚Fc-區,其中a)一個Fc-區多肽包含突變T366W,而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A和Y407V,或b)一個Fc-區多肽包含突變T366W和Y349C,而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和S354C,或c)一個Fc-區多肽包含突變T366W和S354C,而另一個Fc-區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一些實施方案中,本發明scFv-Fc重組抗體可以借組於Fc區部分而直接融合或綴合其它分子,包括但不限於,螢光染料、細胞毒素、放射性同位素等,例如,用於抗原定量研究、將抗體固定化用於親和力測量、用於治療劑的靶向輸送、使用免疫效應細胞的Fc-介導的細胞毒性測試以及許多其他用途。
在一個方面,本發明提供基本上純化的核酸分子,所述核酸分子編碼包含上述結合CD30的抗體鏈的區段或結構域的多肽。在一些實施方案中,本發明核酸分子編碼結合CD30的抗體鏈(例如本發明的任何抗體,包括單鏈scFv抗體和scFv-Fc抗體,及其片段)。
本發明的一些核酸包含編碼表A所示任一抗體的重鏈可變區或其變體的核苷酸序列,和/或表A所示相應抗體的輕鏈可變區或其變體的核苷酸序列。在一個具體實施方案中,核酸分子是表A中列出的DNA VH序列和/或DNAVL序列。本發明的一些其他核酸分子包含與表A中所示的核酸分子的核苷酸序列基本上相同(例如,至少65%、80%、95%、或99%同一性)的核苷酸序列。從
適宜的表達載體表達時,由這些多核苷酸編碼的多肽能夠顯示CD30抗原結合能力。
本發明中還提供多核苷酸,所述多核苷酸編碼來自上文所述的結合CD30的抗體的重鏈VH或輕鏈VL序列的至少一個CDR區和通常全部三個CDR區。一些進一步的實施方案中,多核苷酸編碼上文所述的結合CD30的抗體的重鏈和/或輕鏈的完整或基本上完整可變區序列。
如本領域技術人員明瞭的,因為密碼子簡並性,每一個抗體或多肽胺基酸序列可以由多種核酸序列編碼。
本發明的一些核酸序列包含編碼重鏈VH的核苷酸序列,其包含:(i)選自SEQ ID NOs:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、和115的核苷酸序列或與其具有例如,至少80%、90%或99%同一性的核苷酸序列。一些其他核酸序列包含編碼輕鏈VL的核苷酸序列,其包含SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、和120的核苷酸序列或與其具有例如,至少80%、90%或99%同一性的核苷酸序列。
在一些實施方案中,本發明的核酸序列編碼本發明的上述任何單鏈scFv抗體。在一些實施方案中,編碼scFv抗體的本發明核酸序列包含選自以下的編碼重鏈VH序列的核苷酸序列和編碼輕鏈VL序列的核苷酸序列:
(i)SEQ ID NO:5的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:10的序列或與其基本相同的序列,
(ii)SEQ ID NO:15的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:20的序列或或與其基本相同的序列,
(iii)SEQ ID NO:25的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:30的序列或或與其基本相同的序列,
(iv)SEQ ID NO:35的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:40的序列或或與其基本相同的序列,
(v)SEQ ID NO:45的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:50的序列或或與其基本相同的序列,
(vi)SEQ ID NO:55的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:60的序列或或與其基本相同的序列,
(vii)SEQ ID NO:65的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:70的序列或或與其基本相同的序列,
(viii)SEQ ID NO:75的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:70的序列或或與其基本相同的序列,
(ix)SEQ ID NO:85的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:90的序列或或與其基本相同的序列,
(x)SEQ ID NO:95的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:100的序列或或與其基本相同的序列,
(xi)SEQ ID NO:105的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:110的序列或或與其基本相同的序列,
(xii)SEQ ID NO:115的序列或與其基本相同的序列,以及SEQ ID NO:120的序列或或與其基本相同的序列。
在一個較佳實施方案中,編碼scFv抗體的本發明核酸還包含編碼接頭的核苷酸序列,例如SEQ ID NO:158中所示的序列或與其基本相同的序列。
在一個更較佳的實施方案中,編碼scFv抗體的本發明核酸包含選自SEQ ID NO:122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、和155的序列,或與其基本相同的序列。
在上述任一實施方案中,在一個較佳方面,“基本相同”的核苷酸序列是指與參考核苷酸序列在序列上具有至少80%、85%、90%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高同一性的序列。核苷酸序列的同一性可以使用本領域公知的各種序列比對方法確定。例如可以從NCBI(National Center for Biotechnology Information,Bethesda,MD)的網站上獲得BLAST序列比對檢索工具。典型地,百分比同一性採用NCBI Blast的默認參數進行。
可以藉由從頭固相DNA合成、或藉由PCR誘變編碼結合CD30的抗體或其結合片段的現有序列(例如,表A-C中所示的序列),產生這些多核苷酸序列。核酸的直接化學合成可以藉由本領域已知的方法完成,如Narang等人,1979,Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法;Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法;Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基磷醯亞胺法;和美國專利號4,458,066的固相支持法。藉由PCR向多核苷酸序列引入突變可以如同例如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編著),Freeman Press,NY,NY,1992;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編著),Academic Press,San Diego,CA,1990;Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991;and Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991中所述那樣進行。
抗體可以使用重組方法和組合物進行生產,例如US4,816,567中所述。
在一個實施方案中,提供了包含編碼本文所述結合CD30的抗體的分離核酸的載體。此核酸可以編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和/或包含抗體的VH的胺基酸序列。在進一步的實施方案中,載體為表達載體。在進一步的實施方案中,本發明提供包含此核酸的宿主細胞。在一個實施方案中,宿主細胞包含(例如已經用以下載體轉化):(1)包含編碼含有抗體VL的胺基酸序列和含有抗體VH的胺基酸序列的核酸的載體,或(2)包含編碼含有抗體VL的胺基酸序列的核酸的第一載體和包含編碼含有抗體VH的胺基酸序列的核酸的第二載體。在一個實施方案中,宿主細胞是真核的,例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HEK293細胞、或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施方案中,提供製備抗CD30抗體的方法,其中所述方法包括在適於抗體表達的條件下培養如上文提供的包含編碼抗體的核酸的宿主細胞,且視需要從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。
對於抗CD30抗體的重組生產,可以分離編碼抗體的核酸,例如如上所述的核酸,並且插入一個或多個載體內用於進一步選殖和/或在宿主細胞中表達。此核酸可以使用常規程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重和輕鏈可變區的基因特異性結合的寡核苷酸探針)容易地分離和測序。
多種表達載體可以用來表達編碼結合CD30的抗體鏈(例如本發明的任何抗體,包括scFv抗體和scFv-Fc抗體)的多核苷酸。基於病毒的表達載體和非病毒表達載體都可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體和系統
包含質粒、游離型載體和人工染色體,一般含有用於表達蛋白質或RNA的表達盒(參見,例如,Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。有用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒的載體,基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒載體和Semliki Forest病毒(SFV)的載體。參見,Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995;和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表達載體的選擇依賴於待在其中表達該載體的預期宿主細胞。一般,表達載體含有與編碼結合CD30的抗體鏈或多肽的多核苷酸有效連接的啟動子。除啟動子之外,也可能要求或需要其他調節元件用於高效表達結合CD30的抗體鏈或片段。這些元件通常包括ATG起始密碼子和鄰近核糖體結合位點或其他序列。此外,可以藉由納入適用於所用細胞系統的增強子增強表達的效率(參見,例如,Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994;和Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如,SV40增強子或CMV增強子可用於提高哺乳動物宿主細胞中的表達。
表達載體還可以提供分泌信號序列以形成含有CD30結合多肽的融合蛋白。或者,也可以將CD30結合抗體/多肽序列在插入載體之前與信號序列連接。在一個較佳實施方案中,信號肽包含如SEQ ID NO:164所示的胺基酸序列。用於接受編碼結合CD30的抗體輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的序列的載體有時還可以編碼恆定區或其部分。此類載體允許將可變區表達為與恆定區的融合蛋白,由此導致完整抗體或其片段的產生。通常,此類恆定區是人的恆定區例如人IgG1 Fc區。在一個較佳實施方案中,與可變區融合的Fc區包含如SEQ ID NO:161所示的胺基酸序列。
用於載體的選殖或表達的合適宿主細胞包括原核或真核細胞。例如,特別是當不需要糖基化和Fc效應子功能時,抗體可以在細菌中生產。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達,參見例如US5,648,237、US5,789,199和US5,840,523。(還參見Charlton,K.A.,見:MethodsinMolecularBiology,第248卷,Lo,B.K.C.(編輯),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254,其中描述了抗體片段在大腸桿菌中的表達)。在表達後,抗體可以在可溶級分中與細菌細胞糊分離且可以進一步純化。除了原核生物外,真核微生物例如絲狀真菌或酵母是用於抗體編碼載體的合適選殖或表達宿主,包括糖基化途徑已被“人源化”的真菌和酵母菌株,這導致具有部分或完全人糖基化模式的抗體的生產。參見Gerngross,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414;和Li,H.等,Nat.Biotech(2006)24:210-215。用於糖基化抗體表達的合適宿主細胞也可以源自多細胞生物(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了眾多桿狀病毒株,其可以與昆蟲細胞結合使用,特別用於草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞的轉染。植物細胞培養物也可以用作宿主。參見,例如,US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978和US6,417,429(描述用於在轉基因植物中生產抗體的PLANTIBODIESTM技術)。可以用作宿主的脊椎動物細胞包括,例如,懸浮生長適應化的哺乳動物細胞系可以是有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系的其他實例是SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7);人胚腎系(293或例如Graham,F.L.等,J.GenVirol.36(1997)59中描述的293細胞);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠塞爾托利細胞(例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-251中描述的TM4細胞);猴腎細胞(CV1);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人宮頸癌細胞(HELA);犬腎細胞
(MDCK);Buffalo大鼠肝細胞(BRL3A);人肺細胞(W138);人肝細胞(HepG2);小鼠乳房腫瘤(MMT 060562);TRI細胞,例如Mather,J.P.等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的;MRC5細胞;和FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR.CHO細胞(Urlaub,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220);和骨髓瘤細胞系,如Y0、NS0和Sp2/0。對於適合於抗體生產的一些哺乳動物宿主細胞系的綜述,參見,例如,Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methodsin MolecularBiology,Vol.248,Lo.B.K.C.(編輯),HumanaPress,Totowa,NJ(2004)pp.255-268。在一些較佳的實施方案中,哺乳動物宿主細胞用來表達並產生結合CD30的本發明抗體多肽。
可以藉由本領域已知的各種試驗,針對其物理/化學特性和/或生物活性,篩選、鑒定、或表徵本文中提供的抗CD30抗體。
可以從表達人抗體的噬菌體展示文庫中選擇與所關注的目標抗原以高親和力結合的噬菌體。已有多種在噬菌體表面展示抗體或抗體片段以及篩選文庫的方法,參見例如邵榮光等人(編輯),抗體藥物研究與應用,人民衛生出版社(2013)。例如,可以藉由磁珠分選(MACS)方法進行噬菌體展示文庫篩選。例如可以將呈遞完整抗體或抗體片段的噬菌體群,接觸生物素化的靶抗原和鏈黴親和素磁珠在液相中孵育一段時間、之後洗滌、借組磁場作用富集與靶抗原結合的噬菌體,之後洗脫噬菌體並進行擴增。經過數次“吸附-洗脫-擴增”後,對獲得的特異性結合抗原的噬菌體進行選殖並測序。
也可以利用表達人免疫球蛋白庫的轉基因動物,如轉基因小鼠來篩選與目標抗原以高親和力結合的全人源抗體。例如,可以用目標抗原免疫免疫所述轉基因小鼠,之後獲取小鼠的脾臟並與骨髓瘤細胞融合,篩選產生所需抗體的融合瘤並進行測序。
對於抗體的鑒定,可以就其抗原結合活性,例如藉由已知方法,如ELISA、α LISA、蛋白質印跡、抗體或反相陣列等、以及實施例中所述的方法,鑒定或表徵本發明的抗體。
例如,可以將抗體點在玻璃或硝基纖維素芯片上。用含有CD30的溶液阻斷並孵育載玻片,洗滌以除去未結合的抗體,並用螢光標記的相應二抗檢測結合的抗體。藉由螢光載玻片掃描儀測量螢光信號。相似地,對於反相陣列,將重組CD30、細胞上清液、細胞或組織裂解液、體液等,點在玻璃或硝基纖維素芯片上。封閉載玻片並用針對CD30上特定表位的抗體孵育陣列。洗掉未結合的抗體,並用螢光標記的相應二抗檢測結合的抗體。螢光信號藉由螢光載玻片掃描儀來測量(Dernick,G.等,J.LipidRes.,52(2011)2323-2331)。
也可以採用ForteBio測定法,檢測抗體。ForteBio親和力測定可以按照現有的方法(Estep,P等人,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)進行。例如,可以利用AHC(抗hIgG-Fc捕獲表面)傳感器,進行scFv-hFc抗體和抗原分子相互作用的動力學分析。
也可以藉由流式細胞術檢測抗體與表面表達CD30的細胞的結合。例如,可以將表達CD30的Karpas299細胞與系列稀釋的抗體孵育一段時間(例如4℃,30分鐘)。之後與二抗(例如藻膽色素標記的二抗)孵育一段時間(例如4
℃,30分鐘)。洗滌細胞後藉由流式細胞術分析細胞。流式細胞術可以在Accuri C6系統(BD Biosciences)上進行,並利用Graphpad軟體計算EC50值。
再一方面,本發明提供包含本發明抗體的融合物或綴合物。可以藉由將本發明抗體融合或綴合於異源分子而產生融合物或綴合物。在一些實施方案中,本發明抗體多肽可以與一個或多個異源分子融合或綴合,其中該異源分子包括但不限於蛋白/多肽/肽、標記物、藥物、和細胞毒性劑。蛋白質、多肽或肽或化學分子與抗體融合或綴合的方法是本領域已知的。參見,例如,美國專利號5,336,603、5,622,929和EP 367,166。
在一個實施方案中,本發明抗體與異源蛋白或多肽或肽重組融合而形成融合蛋白。在再一實施方案中,本發明抗體與蛋白分子或非蛋白分子綴合而產生綴合物。
在一些實施方案中,本發明抗體可以以全長抗體或抗體片段的形式與異源分子融合或綴合。在一個較佳的實施方案中,本發明單鏈scFv抗體用於融合或綴合。在進一步較佳的實施方案中,提供包含本發明單鏈scFv的融合蛋白。這樣的融合蛋白可以容易地藉由本領域已知的重組方法進行製備。在再一較佳的實施方案中,提供包含本發明單鏈scFv的綴合物,例如,包含本發明的scFv與非蛋白藥物分子的綴合物。
接頭可以用於共價連接本發明融合物和/或綴合物中的不同實體。接頭包括化學接頭或單鏈肽接頭。在一些實施方案中,本發明單鏈抗體,例如scFv抗體,藉由肽接頭融合到其它肽段或蛋白質上。在一些實施方案中,
本發明單鏈抗體,例如scFv抗體,藉由化學接頭綴合到其它分子例如標記物或藥物分子上。
可以用於形成本發明的肽接頭包括由胺基酸殘基組成的肽。這樣的接頭肽通常是柔性的,允許與之連接的抗原結合部分如scFv獨立地移動。接頭肽的長度可以是由本領域技術人員根據實際情況而容易地確定,例如長至少4-15個胺基酸,或者更長,例如大約20-25個胺基酸。
可以用於形成本發明的化學接頭,包括,例如,各種偶聯劑。偶聯劑的實例有N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺酸酯的雙官能衍生物(如己二亞胺酸二甲基酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(如戊二醛)、二疊氮化合物(如二(對疊氮基苯甲醯)己二胺)、雙-重氮衍生物(如雙-(對二重氮苯甲醯)-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(如,1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。此外,接頭可以是利於多肽在遞送至靶位點後釋放的“可裂解接頭”。例如,可以使用酸不穩定性接頭、肽酶敏感性接頭、光不穩定性接頭、二甲基接頭或含二硫化物的接頭(Chari等,Cancer Research 52(1992)127-131;US 5,208,020)。
在一方面,本發明提供本發明抗CD30抗體、融合物或綴合物在診斷和檢測中的用途。本文中提供的任何抗CD30抗體、融合物或綴合物均可以用於檢測生物樣品中人CD30的存在。本文中使用的術語“檢測”包括定量或定
性檢測。示例性的檢測方法包括但不限於,免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如,FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如,RT-PCR)。在一些實施方案中,生物樣品包括體液、細胞或組織。在某些實施方案中,生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。
在一個實施方案中,提供了抗CD30抗體、融合物或綴合物用於診斷、預後或檢測方法。在進一步的方面中,提供了檢測生物樣品中CD30存在的方法。在一些實施方案中,該方法包括將生物樣品在允許抗CD30抗體、融合物或綴合物與CD30結合的條件下接觸本文中所述的抗CD30抗體、融合物或綴合物,並且檢測抗CD30抗體、融合物或綴合物和CD30之間是否形成了複合物。這樣的方法可以是體外或體內方法。
在一些實施方案中,可以使用本發明的抗體診斷或預後CD30相關病症,其中示例性病症包括例如經典霍奇金淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤等。經典霍奇金淋巴瘤的裡斯氏細胞(Reed-Sternberg)細胞表達CD30和CD15。缺乏CD30和CD15表達可以將結節性淋巴細胞優勢型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)與經典霍奇金淋巴瘤分開。CD30表達也是ALCL的必要特徵,包括ALK陽性和ALK-陰性ALCL。此外,淋巴瘤樣丘疹病(LymphomatoidPapulosis,LyP)也具有CD30的特徵性表達。已經報道,在來自間變性大細胞淋巴瘤和霍奇金病患者的血清中,增加的可溶性CD30水平與不良的預後相關(Younes & Kadin,2003,Journal of Clinical Oncology,21(18):3526-3534;Al-Shamkhani,2004,Current Opinion in Pharmacology,4:355-359)。
在一些實施方案中,抗CD30抗體、融合物或綴合物可以用於選擇適宜使用抗CD30抗體治療的受試者。在一些實施方案中,提供了用本發明的
抗體、融合物或綴合物對患者進行分層的方法,所述方法包括確定所述患者的細胞、例如腫瘤細胞是否在所述細胞的表面上表達CD30蛋白,其中所述細胞在其表面上表達CD30蛋白,則所述患者將可能響應並使用以CD30為靶點的治療劑(例如抗-CD30抗體)進行治療。
在一些實施方案中,抗CD30抗體可以與診斷劑或可檢測劑綴合。在一些實施方案中,本發明提供用於診斷或檢測的試劑盒,其包含本發明的任何抗CD30抗體、融合物或綴合物。
再一方面,本發明涉及治療CD30相關病症的方法,包括向所述受試者施用有效量的本發明抗體或其抗原結合片段、或本發明的綴合物或融合物。
術語“個體”或“受試者”可互換地使用,是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如,奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如,人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如,小鼠和大鼠)。特別地,受試者是人。
術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態,以及緩解或改善預後。
CD30相關病症是與CD30或表達CD30的細胞(尤其是瘤性細胞)介導或相關的病症,包括,但不限於,CD30陽性腫瘤、自身免疫疾病。可以使
用CD30抗體治療的示例性病症包括例如,霍奇金病、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)、結外NK/T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、血清免疫母細胞性淋巴結病樣T細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、蕈樣肉芽腫病(MF)、淋巴瘤樣丘疹病(LyP)、免疫母細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤。
如實施例中所示,本發明人基於篩選自人抗體庫的抗體序列而構建本發明的抗體。因此,有利地,在一些實施方案中,本發明抗體是包含全人源的VH區和全人源的VL區胺基酸序列的全人抗體,例如表A中所示的抗體、以及表C所示的單鏈scFv及由其構建的包含人hFc片段的scFv-Fc抗體。在一些實施方案中,本發明綴合物和融合物是包含全人抗體,例如全人單鏈scFv的綴合物和融合物。因此,在一個較佳的方面,本發明的抗體、融合物和綴合物尤其適用於人的治療應用。在一些較佳的實施方案中,本發明抗體、綴合物和融合物用於治療人的CD30相關病症,如CD30陽性腫瘤或涉及表達CD30的免疫細胞的自身免疫疾病,較佳地,霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
在一些實施方案中,本發明抗CD30抗體、綴合物或融合物的施用在體內導致對表達CD30的腫瘤細胞的生長抑制作用或殺傷作用。這樣的腫瘤細胞包括,例如,霍奇金細胞、裡-斯氏細胞(Reed-Sternberg cells)、HRS細胞、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞、皮膚T細胞淋巴瘤細胞、多形性和免疫母細胞性淋巴瘤細胞。在一個特定的實施方案中,本發明人抗體或包含其的綴合物或融合物用於霍奇金淋巴瘤(尤其是經典霍奇金淋巴瘤)治療中抑制/介導殺傷霍奇金細胞和裡斯氏細胞。在另一特定實施方案中,本發明人抗體或包含其的綴合物或融合物用於ALCL治療中抑制/介導殺傷CD30陽性ALCL腫瘤細胞。
可以理解,可將本發明的CD30抗體、或本發明的綴合物或融合物與其它治療形式組合施用,用於上述疾病例如腫瘤的治療。該其它治療形式包括治療劑、放療、化療、移植、免疫療法等。在一些實施方案中,本發明抗體分子、或本發明的綴合物或融合物與其它治療劑聯合使用。示例性的治療劑包括細胞毒性劑、放射性毒素、免疫抑制劑、細胞因子、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗炎劑、化療劑、放療劑、治療性抗體或者其它活性劑和輔助劑,例如抗腫瘤藥物。在一些實施方案中,本發明抗體分子與治療劑綴合,例如與細胞毒素或放射性同位素綴合。
本發明還考慮包含本文任一種或多種CD30結合抗體分子、融合物、綴合物、多核苷酸、載體、或宿主細胞的組成物。組成物包括但不限於醫藥組成物。醫藥組成物可以用於向細胞或動物單獨施用或者與一種或多種其它治療形式組合施用。
可以製備本發明抗體或融合物或綴合物的藥物製劑,例如藉由使具有所需純度的抗體、融合物或綴合物,與一種或多種視需要的藥學可接受的載體(Renmington’s PharmaceuticalScience,第16版,Osol,A.(編輯)(1980))混合,以凍幹製劑或水溶液的形式製備。藥學可接受的載體在採用的劑量和濃度下對接受者一般是無毒的,並且包括但不限於:緩衝劑,如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸和甲硫胺酸;防腐劑(如十八基二甲基苄基氯化銨;氯己雙銨;苯紮氯銨;苄索氯銨;苯酚、丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烷基酯例如對羥基苯甲酸甲或丙酯;兒茶酚;間苯二
酚;環己醇;3-戊醇;和間甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水聚合物,如聚(乙烯吡咯烷酮);胺基酸,如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸;單糖、二糖及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,如EDTA;糖,如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽抗衡離子,如鈉;金屬絡合物(例如Zn-蛋白質絡合物);和/或非離子型表面活性劑,如聚乙二醇(PEG)。
示例性凍幹抗體製劑描述於US6,267,958。水性抗體製劑包括US6,171,586和WO2006/044908中所述的那些,後面的製劑包括組胺酸-醋酸鹽緩衝液。
本文中的製劑還可以針對所治療的特定適應症按照需要含有一種以上的活性成分,較佳具有互補活性且不會不利地彼此影響的那些。此類活性成分適於以對於預期目的有效的量組合存在。
描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。
採用融合瘤技術,用重組人的CD30蛋白(Acro,貨號:CD0-H5229)免疫Harbour H2L2轉基因小鼠(廠家:北京維通利華實驗動物技術有限公司;許可證號:SCXK(京)2016-0006),然後獲取小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合,獲得能夠表達CD30抗體的融合瘤細胞。具體過程如下。
免疫轉基因小鼠:佐劑Ribi(廠家:Sigma;貨號:S6322;批號:077M4061V),與huCD30蛋白等體積混合,按每隻小鼠(共5知)50μg/200μl進行免疫,其中100μl皮下兩點注射,100μl腹腔注射。每兩週免疫一次,一共免疫5次。在融合前3天,按每隻小鼠50μg/300μl huCD30蛋白的劑量,腹腔注射,用於後續融合實驗。
電融合皿準備:用70%乙醇徹底浸泡電融合皿,並於超淨台中吹乾備用。
分離脾細胞:頸脫位將小鼠處死,用75%酒精消毒體表5min,隨即放入超淨台內小鼠解剖板上,左側臥位,用7號針頭固定四肢。無菌打開腹腔取出脾臟,用基礎培養基(配製方法如下表1)洗滌,並仔細去掉周圍附著的結締組織。隨後將脾臟轉移到另一個盛有基礎培養基的平皿中。以彎頭針頭壓住脾臟,用小針頭在脾臟上插孔,並用鑷子擠壓,使脾細胞充分釋放,製成脾細胞懸液。細胞懸液經70μM細胞篩網過濾後用30ml基礎培養基洗一遍,1200rpm離心6min。
裂解紅細胞:去除離心脾細胞懸液後的上清,用10ml RBC裂解緩衝液(GIBCO)重懸細胞。然後再加入20ml RBC裂解緩衝液。懸液靜置5min後1100rpm離心6min。去上清後用10ml基礎培養基重懸細胞,然後再加入30ml基礎培養基,1100rpm離心6min。去除上清後,細胞重懸於20ml基礎培養基中並計數。
電融合:用20ml基礎培養基重懸小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞(ATCC)並計數。將SP2/0和裂解紅細胞後的脾細胞以1:2~1:1的比例混合,1000rpm離心6min。去除上清後將混合的細胞重懸於10ml融合緩衝液(BTXpress)中。再加入15ml融合緩衝液,1000rpm離心5min,去除上清。重複上述步驟一遍後,加入適量體積的融合緩衝液重懸細胞,調整混合細胞密度至1×107個細胞/ml。電融合儀的參數設置如下表6。每個電融合皿中加入2ml上述細胞懸液進行電融。
電融合儀參數設置
電融合後鋪板:細胞於電融合皿中室溫靜置5min。將細胞轉移入離心管中,用篩選培養基(配製方法如下表2)稀釋細胞至1~2×104個細胞/ml。96孔板中每孔加入100μl細胞懸液。融合後第7天更換篩選培養基。培養第
10天(或更久,根據細胞生長狀態)後以細胞流式檢測法(FACS)篩選出表達特異性抗CD 30抗體的融合瘤細胞。
陽性融合瘤細胞亞選殖:
亞選殖步驟:準備一塊96孔板,第2至第8排每孔加入200μl如上所述的基礎培養基。將上述融合篩選出的陽性孔的細胞,按約1×105個/ml的密度,分別取300ul加入到第一排的每個孔中。用排搶,將第1排細胞懸液取100μl加入第2排,充分混勻後取100μl加入下一排。重複上述步驟,直至最後一列體積變為300μl;靜置96孔板15min,顯微鏡下觀察計數。取100個細胞對應的體積加入20ml如上所述的基礎培養基中,並混勻鋪板,每孔200μl。一周後顯微鏡下觀察,判斷並標記出單純株孔,待測挑出陽性孔。
細胞凍存:觀察細胞狀態,等細胞生長良好,活力>90%時,1000rpm離心5min,去除上清。用凍存液(45.5%FBS(Hyclone),44.5%RPMI-
1640(Hyclone),10%DMSO)重懸細胞至1×107個細胞/ml,分裝至凍存管,放入程序降溫盒中,-80℃凍存。
融合瘤測序:
利用NucleoSpin RNA Plus(Macherey-Nagel,貨號740984.250)試劑盒進行RNA抽提:取新鮮細胞1000rpm離心5min,去除上清,沉澱中加入350μl細胞裂解緩衝液LBP,混勻至澄清。加入到DNA去除管中,11000rpm離心30s,收集流穿液。向流穿液中加入100μl結合液BS,混勻至澄清。將澄清的溶液加入到RNA收集管中,11000rpm離心1min,去除液體,加入200μl洗滌液WB1,11,000rpm離心15s,棄去液體;將RNA柱打開蓋子並移至新的收集管中,加入600μl洗滌液WB2,11,000rpm離心15s,棄去液體;加入250μl洗滌液WB2,11,000rpm離心2min,棄去液體;離心徹底揮發去除乙醇後,向收集柱中加入30μl DEPC水,12000g離心2min,收集洗脫液。測定RNA濃度。
利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉錄獲得cDNA,步驟如下(所提及試劑均來自該試劑盒):
配製反應體系I如下表3
65℃溫育5min後,迅速置冰上冷卻。將反應體系I加入到下列反轉錄體系(表4),總量為20μl:
緩慢混勻後按下列條件進行反轉錄翻譯:42℃ 60min→95℃ 5min,然後放冰上冷卻,獲得cDNA。
採用Mighty TA-cloning Kit試劑盒(Takara),將cDNA連接T載體,步驟如下:
PCR分別擴增重鏈和輕鏈可變區。PCR反應體系如下表5所示。
PCR反應條件如下表6所示。
PCR反應所用引子如下表7和8所示。
上述引子按等比例混合後,獲得Primer Mix1用於VH的PCR擴增。
上述引子按等比例混合後,獲得Primer Mix 2用於VL的PCR擴增。
取4.5μl上述PCR反應獲得的PCR產物,加入0.5μl pMD20-T載體(Takara),5μl Ligation Mighty Mix(Takara),輕輕混勻,於37℃反應2h,獲得連接產物。
轉化細胞:
-80℃取出TOP10感受態(天根生化科技(北京)有限公司),冰上融化,取上述獲得的連接產物5μl加入到融化的TOP10感受態中,混勻後冰上孵育30min。42℃熱激90s後迅速冰上冷卻2min,向EP管中補加900μl LB培養基(生工生物工程(上海)股份有限公司),37℃,220rpm搖床培養1h。3000g離心2min,吸除800μl上清,用剩餘的培養基將菌體重懸並塗布在胺苄青黴素抗性的平板上。於37℃培養過夜,挑純株測序,分析後獲取融合瘤中VH和VL的序列。最終獲得10個抗體,HB38E4、HB10F1、HB49G9、HB36F7、HB68H2、HB69G7、HB10B6、HB16H7、HB6A9、HB16H8,其序列見表A。
利用轉基因小鼠產生抗CD30的全人源抗體外,還同時利用噬菌體展示技術製備抗體。從總的多樣性大於1×1010的6個合成抗體庫IBSal中篩選特異性結合CD30的全人源抗體(庫的設計和構建可以參見Raffi Tonikian et al.Nature Protocols,2007和Thomas A.Kunkel.Current Protocols in Molecular Biology,1987)。
篩選藉由磁珠分選方法(MACS)並利用生物素標記的、與Fc融合的重組人CD30篩選6個不同的合成抗體庫來完成。具體流程如下:
1.篩選用Input Phage(投入噬菌體)的製備
投入50-100倍庫容的凍存菌,接菌時使OD值至0.05,37℃ 200rpm培養至OD值達到0.5時,加入5×109cfu/ml的helper phage(輔助噬菌體)M13K07,搖勻,先37°靜置20-30min,再37°、200rpm培養30min,最後30℃培養20h。收集噬菌體,作為第一輪的input phage。
2.Panning(淘選)
取50ul磁珠(Thermo,貨號815-968-0747),用PBS洗4遍;用含3% BSA的PBS室溫轉動封閉2h。將磁珠與生物素標記的CD30/Avitag蛋白(Acro,貨號CD0-H82E6)結合,室溫,旋轉,溫育1小時。
將上面處理好的磁珠與步驟1的input phage結合,室溫旋轉,溫育1.5-2小時。然後用0.05%PBST洗8-10次,最後用0.5ml 0.1M鹽酸-甘胺酸洗脫液洗脫,再用2M Tris中和。
3.Phage侵染
取一半體積的phage洗脫液侵染對數生長期的大腸桿菌XL1-Blue菌液,37℃,200rpm培養20min,然後塗瓊脂平板。第二天刮板,3000rpm、5min離心,然後20%甘油-2×YT培養基重懸,測OD值。
2×YT培養基配(1L)製見表9。
然後過夜產生噬菌體,方法同上面的步驟1。步驟1-3如此循環四輪。
完成上述4輪panning(淘選)後,藉由Elisa檢測發現第四輪後有陽性信號明顯富集,將富集的含有特異抗體序列的噬菌體群體塗在瓊脂平板上,能夠得到包含特定抗體基因的噬菌體克純株菌落。挑取單純株,進行單個噬菌體純株的Elisa檢測。將Elisa陽性的純株進行測序,大約有37個序列不同的抗體。
後續將這37個抗體進行scFv-hIgG抗體形式的構建(方法同實施例3),所得質粒瞬時轉染6孔板,5天后取表達上清進行Elisa驗證。Elisa陽性的純株,再進行Fortebio檢測(方法同實施例5)。選取2個親和力較好的純株P5E10和P27B3,同實施例1中利用轉基因小鼠藉由融合瘤產生的10個候選純株一起大量表達純化。
此2株抗體分子P5E10和P27B3的胺基酸序列以及對應的核苷酸序列在上表A中給出。
為驗證scFv形式候選抗體與靶抗原CD30的親和力,分別構建了上述實例1和實例2中獲取的抗體的單鏈抗體可變區(scFv)與人Fc片段的重組蛋白表達載體。同時,也構建了相同形式的兩個陽性對照抗體V2AC10和XL。表C給出了構建的scFv-Fc重組蛋白的胺基酸序列及其對應的編碼核苷酸序列。兩個陽性對照抗體可變區胺基酸序列見第8圖。
第1圖中顯示了載體構建的示意圖。具體構建過程以其中一個抗體(HB69G7)序列舉例說明如下:
使用表10所示上下游引子序列和表11所示PCR反應體系,PCR擴增VH及VL區。
PCR擴增產物進行核酸電泳,收穫目的條帶,使用表12所示的反應體系進行overlap PCR。
PCR擴增產物進行核酸電泳,目的條帶進行回收,用於後續同源重組。
使用表13所示同源重組體系,實施同源重組反應。
37℃反應30min,獲得重組產物。重組產物轉化TOP10感受態,並挑取單純株測序,選擇包含插入方向正確的質粒的純株作為陽性純株,甘油管保存陽性純株。
1.根據所需轉染體積傳代HEK293細胞,轉染前一天將細胞密度調整至1.2×106/ml。
2.取3mL OptiMEM培養基(Gibco,31985-070)作為轉染緩衝液,分別上述相應攜帶scFv-hFc重組單鏈抗體編碼基因的質粒30μg,混勻後過濾靜置5min。
3.加90μL的1mg/rnL聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences,23966)到質粒-Opti MEM混合液中,混勻後室溫孵育15min。將混合物輕柔倒入細胞,36.5℃,8% CO2培養。
4.20h後補加0.6mL的200g/L的FEED(大豆蛋白腖Phytone Peptone(BD,211906)與植物蛋白腖Phytone(BD,210931)等比例),0.3mL的200g/L的葡萄
糖母溶液,30μL的2.2M丙戊酸鈉鹽(VPA)(Sigma,P4543)。
5.繼續培養至活力低於60%,收集上清,過濾後作親和層析純化。
1.用超純水沖洗填料及重力柱,去除填料保護液。
2.用0.1M NaOH將填料浸泡2h,每根重力柱添加浸泡後的300μL蛋白A親和層析介質(Mabselect sure)(GE Healthcare,17-5438-03)填料。
3.細胞料液以8000r/min離心40min,再使用0.45μm濾器過濾,4℃保存備用。
4.用大量超純水沖洗重力柱和填料,去除鹼液。
5.純化前用10ml結合/清洗緩衝液(20mM Tris+150mM NaCl(pH 7.2))平衡填料。
6.上樣,將需要純化的上清藉由管柱。
7.沖洗,用5~10ml結合/清洗緩衝液(20mM Tris+150mM NaCl(pH 7.2))沖洗填料,去除非特異性結合蛋白。
8.洗脫,用1mL的洗脫緩衝液(100mM檸檬酸鈉/檸檬酸緩衝液,pH 3.5)沖洗填料,收集特異性結合蛋白。
9.在收集液中按85μl/ml的比例加入中和緩衝液(2M Tris),調節pH至6~7。
基於光纖生物傳感器的生物膜層光學干涉技術(BLI),測定抗體分子的動力學常數。
BLI的基本原理是:當生物分子結合到傳感器表面就形成了一層生物膜,生物膜對透過傳感器的光的波形造成干涉現象,干涉現象以相位移動的方式被檢測,從而可以檢測結合到傳感器分子數量的變化;根據實時響應值的變化擬合出動力學曲線,並計算出結合常數(Kon)、解離常數(Kdis)、親和力(KD)。
我們所選用的Fortebio設備型號為Octet Red96,ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)進行。具體流程為:
1.實驗開始前半個小時,根據樣品數量,取合適數量的AHC Sensor浸泡於SD buffer(50ml PBS+0.1% BSA+0.05% Tween-20)中。
2.取100μl的SD buffer、scFv-hFc抗體、人CD30-His抗原(ACRO BIOSYSTEMS,BCA-H522Y),分別加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板中。
3.根據樣品位置布板,選擇sensors位置,設置運行步驟及時間:Baseline、Loading~1nm、Baseline、Association和Dissociation時間取決於樣品結合、解離速度;轉速為1000rpm,溫度為30℃。
4.12個scFv-hFc重組單鏈抗體與人CD30-His親和力檢測結果詳見表14。
此外,利用ForteBio進行表位測定。首先將生物素化的CD30固定在SA傳感器的表面,然後用高濃度(300-500nM)對照抗體結合CD30至飽和,最後用100nM其他競爭抗體結合CD30。若競爭抗體有結合信號,說明競爭抗體和對照抗體與CD30結合表位不同,若競爭抗體無結合信號,說明競爭抗體和對照抗體與CD30結合表位相同。
先將兩個對照抗體XL和V2AC10進行競爭性結合,結果顯示它們不是同一個表位(Bin)。將對照抗體XL與抗原的結合表位定義為Bin1,對照抗體V2AC10與抗原結合的表位定義為Bin2,結果如表14所示。P5E10和P27B3抗體與對照抗體XL同為Bin1;HB38E4、HB10F1和HB49G9抗體與對照抗體-V2AC10同為Bin2;HB36F7、HB68H2、HB69G7、HB10B6、HB16H7和HB6A9抗體與兩個對照抗體都不屬於同一個抗原結合表位,定義為Bin3。其中HB16H8抗體和兩個對照抗體的結合表位都有一定的重疊,定義為1/2Bin。表位檢測結果詳見表14。
由上表數據可見,12株單鏈抗體與單價人源CD30(CD30-His)的親和力(KD值)範圍在30nM到1nM之間。其中,HB49G9和P5E10兩株單鏈抗體與CD30-His的親和力比兩個陽性對照抗體都強。表位競爭性結合實驗數據表明,我們篩選得到的抗體既涵蓋對照抗體的結合表位,也涵蓋其他表位,說明篩選得到的抗體多樣性高。
scFv-hFc融合抗體製備完成後,使用CD30+人間變性大細胞淋巴瘤細胞Karpas299,進一步對單鏈抗體的細胞結合作了驗證。具體方法如下:
1.取人Karpas299(生物風biofeng.com,Cat#3135)細胞,調整細胞密度為2×106/ml,在96孔微孔板中每孔100μl,400G離心5min,去上清。
2.將scFv-hFc抗體從400nM濃度起始,在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中以3倍梯度連續稀釋共12個點,每孔加入100μl稀釋的抗體,4℃孵育30min;
3.400G離心5min,加入PBS洗兩次,每孔加入100μl稀釋在PBS(1% BSA)中的二抗((藻膽色素蛋白(Phycoerythrin,PE)標記的羊抗人IgG抗體,SoutherBiotech,終濃度5μg/ml),4℃孵育30min(避光);
4.400G離心5min,加入PBS洗兩次,每孔100μl PBS重懸細胞。在Accuri
C6系統(BD Bioscience)上進行流式細胞術,檢測PE陽性信號,並基於C6軟體計算MFI。用GraphPad軟件計算EC50值。
檢測結果如第2圖和下表15所示。由圖中結果可見,除陰性對照IgG4抗體外,12株單鏈抗體都表現出與Karpas299細胞結合,親和力EC50值範圍在70nM至0.4nM之間。
序列表描述
<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)
<120> 全人源的抗CD30單鏈抗體及其應用
<130> PF190633PCT
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<223> 抗體序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 抗體序列
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<212> PRT
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<212> DNA
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 抗體序列
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<212> DNA
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<223> 抗體序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 抗體序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 抗體序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 抗體序列
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<212> PRT
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<223> 抗體序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 抗體序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
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<210> 142
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 142
<210> 143
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
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<212> DNA
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<220>
<223> 抗體序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 147
<210> 148
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 148
<210> 149
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 149
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<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 150
<210> 151
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 151
<210> 152
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 152
<210> 153
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 153
<210> 154
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 154
<210> 155
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 155
<210> 156
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 156
<210> 157
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭
<400> 157
<210> 158
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭DNA
<400> 158
<210> 159
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 159
<210> 160
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈DNA
<400> 160
<210> 161
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 Fc
<400> 161
<210> 162
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD30全長序列
<400> 162
<210> 163
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD30 ECD
<400> 163
<210> 164
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源IgGκ信號肽
<400> 164
<210> 165
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源IgGκ信號肽DNA
<400> 165
<210> 166
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 166
<210> 167
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 167
<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 168
<210> 169
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體序列
<400> 169
Claims (27)
- 一種分離的特異性結合CD30的抗體或其抗原結合片段,該抗體包含3個重鏈互補決定區HCDR以及3個輕鏈互補決定區LCDR,其中:(a)HCDR1包含SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列;或(b)HCDR1包含SEQ ID NO:71所示的胺基酸序列,HCDR2包含SEQ ID NO:72所示的胺基酸序列,HCDR3包含SEQ ID NO:73所示的胺基酸序列,LCDR1包含SEQ ID NO:76所示的胺基酸序列,LCDR2包含SEQ ID NO:77所示的胺基酸序列,且LCDR3包含SEQ ID NO:78所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含重鏈可變區VH,該VH選自:(a)包含SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列的VH;或(b)包含SEQ ID NO:74所示的胺基酸序列的VH。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,該抗體包含輕鏈可變區VL,該VL選自:(a)包含SEQ ID NO:29所示的胺基酸序列的VL;或(b)包含SEQ ID NO:79所示的胺基酸序列的VL。
- 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段,該抗體包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,該VH和VL選自:(a)包含SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:29所示的胺基酸序列的VL;或 (b)包含SEQ ID NO:74所示的胺基酸序列的VH,和包含SEQ ID NO:79所示的胺基酸序列的VL。
- 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體具有以下一個或多個特性:(i)以小於50nM的KD值的高親和力,與人CD30結合;(ii)以小於70nM的EC50值,與細胞表面表達的人CD30結合;(iii)與人CD30結合的解離速率常數(Kdis)小於60×10-4s-1;(iv)與人CD30的胞外域ECD上的表位特異性結合。
- 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體是全人源抗體。
- 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體是單鏈抗體。
- 如申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體是單鏈scFv抗體,其中該單鏈scFv包含:從N端到C端,VL結構域-接頭-VH結構域,或VH結構域-接頭-VL結構域。
- 如申請專利範圍第8項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該接頭包含10個至20個胺基酸。
- 如申請專利範圍第9項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該接頭包含SEQ ID NO:157所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第8項的抗體或其抗原結合片段,其中該單鏈scFv抗體包含選自SEQ ID NO:127和142的胺基酸序列。
- 一種分離的特異性結合CD30的抗體,其中該抗體包含如申請專利範圍第8至11項中任一項的單鏈scFv抗體和Fc區。
- 如申請專利範圍第12項所述的抗體,其中該單鏈scFv藉由鉸鏈區與Fc區連接。
- 如申請專利範圍第13項所述的抗體,其中該鉸鏈區為CD8鉸鏈區,或其中該鉸鏈區包含SEQ ID NO:159所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第12至14項中任一項所述的抗體,其中該Fc區是人IgG1或IgG4 Fc區。
- 如申請專利範圍第15項所述的抗體,其中該Fc區是低或無岩藻糖基化的。
- 如申請專利範圍第12項的抗體,其中該抗體包含選自SEQ ID NO:129和144的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸,其編碼如申請專利範圍第1至17項中任一項的分離的抗體或其抗原結合片段。
- 一種包含如申請專利範圍第18項所述的核酸的載體。
- 一種包含如申請專利範圍第19項所述的載體的宿主細胞。
- 一種製備如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合片段的方法,包括:在適於表達所述抗體或其抗原結合片段的條件下,培養如申請專利範圍第20項所述的宿主細胞。
- 一種包含如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗體的綴合物或融合物。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合片段,或如申請專利範圍第22項所述的綴合物或融合物,以及藥用載體。
- 一種檢測樣品中CD30的方法,包括: (a)將所述樣品與如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第22項所述的綴合物或融合物接觸;和(b)檢測所述抗體或其抗原結合片段或綴合物或融合物和CD30蛋白之間複合物的形成。
- 一種如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的分離的抗體或其抗原結合片段、如申請專利範圍第22項所述的綴合物或融合物、或如申請專利範圍第23項所述醫藥的組成物用於製備治療CD30相關病症的藥物的用途。
- 如申請專利範圍第25項所述的用途,其中該CD30相關病症為表達CD30的腫瘤。
- 如申請專利範圍第26項所述的用途,其中該CD30相關病症選自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤(ATL)、和血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤(AITL)。
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