CN113227147B - 全人源的抗cd30单链抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
特异性结合CD30的新型抗体和抗体片段，尤其是全人源的单链抗体scFv。编码这些抗体的核酸、载体和表达所述核酸的宿主细胞,包含所述抗体的组合物、及其在治疗和诊断中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及特异性结合CD30的新型抗体和抗体片段，尤其是单链抗体(如单链scFv)。本发明还涉及编码这些抗体和抗体片段的核酸、载体和表达所述核酸的宿主细胞。此外，本发明也涉及包含本发明抗体的组合物、及其在治疗和诊断中的用途。
背景技术
CD30，也称为Ki-1或TNFRSF8，是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。CD30作为105-120kD的I型跨膜糖蛋白受体，具有胞内域、跨膜域和胞外域，并在胞外域中存在多个富半胱氨酸的区域。该胞外域可以断裂以产生88kD的可溶性形式的CD30(sCD30)，该可溶性CD30可以释放至血清中，并且可以在自身免疫性疾病如类风湿关节炎、炎性状态和CD30阳性血液恶性肿瘤的患者中检测到增加的血清CD30。Pierce JM等，ExpertRev.Hematol.2017 Jan；10(1)：29-37.doi：10.1080/17474086.2017.1270202.Epub 2016Dec 21。
在健康个体中，CD30表达局限于一小部分的活化T和B淋巴细胞上。但CD30在经典霍奇金淋巴瘤(HL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)中广泛表达。CD30也不同程度地在一些其它的淋巴增生性病症中表达，包括例如，T细胞淋巴瘤，如非特指型外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)；各种B细胞非霍奇金淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，尤其是EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤；蕈样肉芽肿病。
CD30已经被提议用于诊断和预后，例如作为霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的诊断生物标志物。Froese et al.，J.Immunol.139：2081(1987)；Carde et al.，Eur.J.Cancer 26：474(1990)。Smith CA等，Cell 1993；73：1349-1360.
此外，CD30在一些淋巴瘤亚型和一些非淋巴样瘤性疾病中的过表达，也已经使得其成为一些疾病，如霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的理想治疗靶点。此类新型靶向治疗制剂的出现，将可能提高传统化疗和放疗的治愈率，并降低长期毒性。Wang等，Advances in CD30-and PD-1-targeted therapies for classical Hodgkin lymphoma，Journal of Hematology & Oncology，2018，11：57.已经提出多种CD30靶向治疗方式，包括例如抗体-药物偶联物(ADC)、双特异性抗体和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T细胞)。
在CD30抗体-药物偶联物(ADC)方面，已经报道了由嵌合CD30单克隆抗体经由蛋白酶可切割接头与微管破坏药物一甲基澳瑞他汀E(MMAE，monomethyl auristatin E)连接形成的偶联物brentuximab vedotin。该化合物在霍奇金淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和甚至表达CD30的B细胞淋巴瘤中的I和II期临床试验中，已经被证实具有良好耐受，并且更为重要的是，能够实现疾病控制，包括在多次复发或难治性疾病患者中控制疾病。CA van der Weyden等，Blood Cancer Journal(2017)7，e603；doi10.1038/bcj.2017.85.
在双特异性抗体方面，已经研发了靶向CD30和CD16的双特异性抗体和靶向CD30和CD64的双特异性抗体。最新研发的颇具前景的是靶向CD30和CD16A的双特异性抗体AFM13。这些免疫疗法使用双特异性抗体作为桥梁，将CD30阳性肿瘤细胞与免疫效应细胞(如NK细胞/巨噬细胞)联系起来。
在CAR-T细胞免疫治疗中方面，最近，Baylor研究者公布了7例HL和2例ALCL患者CD30CAR-T细胞的I期临床研究，结果显示在一些患者上获得了持久的完全缓解(CR，complete reaction)。
单链scFv抗体是一种小分子的基因工程抗体，它是在DNA水平上利用基因工程方法将天然抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接(通常通过一段人工合成的连接肽(或“接头”)连接)而成的小分子重组抗体。与完整抗体分子相比，scFv单链抗体具有以下优点：含有完整的抗体可变区，保留原抗体的抗原特异性和结合活性；不含有抗体分子的Fc区，因而免疫原性弱，用于人体不易产生免疫反应；分子量小，穿透性强、易于渗入组织，用于显像诊断或治疗时可以进入一般完整抗体不能达到的组织内部；不需要进行糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子，利于原核表达系统大量生产；易于操作，适用于作为基因工程构件，制备具有新性质的其它抗原特异性结合分子，例如全长抗体、scFv-Fc等。
鉴于CD30作为疾病诊断、预后和治疗靶点的价值，本领域仍然需要新的CD30特异性结合分子。本发明通过提供以高靶特异性和高亲合性结合CD30，尤其是与肿瘤细胞表面上表达的CD30结合，并具有低副作用的全人单链抗体，满足了这方面的需求。本发明的全人单链抗体不仅适于单独用于肿瘤和癌症的诊断或治疗中，而且，更有利地的是，适于作为基因工程构件制备具有高CD30靶向性的其它诊断和治疗分子，例如各种形式的抗体、scFv-Fc、以及基于抗体的融合物和缀合物等。
发明概述
本发明提供了全人源抗人CD30抗体及其编码基因与应用。通过利用转基因小鼠和噬菌体展示技术，本发明人筛选出抗人CD30的全人源抗体，并获得其可变区基因序列，在此基础上构建了全人单链scFv抗体和scFv-hFc抗体。本发明的重组单链抗体分子不仅以高亲和力与非膜结合型人CD30结合，也以高亲和力与细胞表面表达的CD30结合。
因此，本发明提供特异性结合CD30的抗体，尤其是单链抗体、及编码其的核酸分子、及它们在治疗和诊断中的用途。
在一个方面，本发明提供特异性地结合CD30(优选人CD30蛋白质)的抗体或其抗原结合片段。在一个优选实施方案中，本发明抗体是单链抗体。在一个优选实施方案中，本发明抗体是单链scFv抗体。在另一优选实施方案中，本发明抗体是scFv-Fc抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体以大约100nM至1nM的KD结合人CD30蛋白，其中KD值按照例如生物膜层光学干涉技术(例如Fortebio检测法)测量。在一些实施方案中，本发明的抗体以大约100nM至0.1nM的EC50结合细胞表面表达的人CD30蛋白，其中EC50值按照例如流式细胞术(例如FACS)测量。
在一些实施方案中，本发明抗体包含表A所示任一抗体的VH区序列或其变体。在另一些实施方案中，本发明抗体包含表A所示任一抗体的VL区序列或其变体。在另一些实施方案中，本发明抗体包含表A所示任一抗体的VH和VL序列对、或其变体。在一些实施方案中，本发明抗体包含表A所示任一抗体的6个CDR区序列、或其变体，其中所述变体在6个CDR区上共包含至少一个且不超过10，或不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，优选地重链CDR3保持不变。在一个实施方案中，抗体的CDR序列是表B所示的CDR序列。
在一些实施方案中，本发明抗体是单链scFv抗体。优选地，scFv抗体包含VH序列、VL序列和接头。优选地scFv抗体从N端到C端包含：VL结构域-接头-VH结构域，或VH结构域-接头-VL结构域。
在一些实施方案中，本发明还提供由本发明单链scFv抗体和野生型或改变的Fc区融合形成的scFv-Fc抗体。在一些实施方案中，本发明的scFv-Fc抗体的Fc区是低或无岩藻糖基化的。在一些实施方案中，scFv抗体通过铰链区与Fc区融合。
再一方面，本发明涉及基于本发明抗体，尤其是单链抗体构建的融合物和缀合物。
再一方面，本发明涉及治疗CD30相关病症的方法和组合物，其中向所述受试者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段、或本发明的融合物或缀合物。在一些实施方案中，CD30相关病症是由CD30和/或表达CD30的细胞介导或与其相关的病症，例如以表达CD30的瘤性细胞的生长为特征的疾病。在一些优选的实施方案中，CD30相关病症是CD30阳性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，优选地选自霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)，最优选间变性大细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，本发明抗体分子与其它治疗剂联用。在再一实施方案中，本发明抗体分子与治疗剂缀合，例如与细胞毒素或放射性同位素缀合。
再一方面，本发明涉及检测样品中CD30的方法和试剂盒，其中所述方法包括：(a)将所述样品与本发明抗体或其抗原结合片段、融合物或缀合物接触；和(b)检测所述抗体或其抗原结合片段或融合物或缀合物和CD30蛋白之间复合物的形成。检测可以是体外的或体内的。在一些实施方案中，样品是来自患者的组织活检物、血清、血浆、或全血。在一些实施方案中，样品来自淋巴瘤患者。
附图简述
图1示意性显示本发明的示例性scFv-hFc重组单链抗体的表达载体克隆策略。
图2A和2B显示，通过流式细胞术测定的，本发明示例性scFv-hFc重组单链抗体与Karpas299细胞的亲和力。
图3显示本发明的示例性CDR序列。
图4显示本发明示例性抗体的VH序列。
图5显示本发明示例性抗体的VL序列。
图6显示人CD30抗原全长蛋白及其胞外结构域(ECD)的示例性氨基酸序列。
图7显示用于构建本发明示例性scFv-Fc构建体的接头、铰链区和Fc区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图8显示阳性对照抗体V2AC10和XL的可变区氨基酸序列。
发明详述
除非明确指明相反，否则本发明的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。这些方法的描述可以参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，2008年7月更新)；ShortProtocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Glover，DNACloning：A Practical Approach，vol.I&II(IRL Press，Oxford，1985)；Anand，Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins，Eds.，1984)；Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane，Antibodies，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998)Current Protocols in ImmunologyQ.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober，eds.，1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊专著如Advances in Immunology。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项的任意两项或多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
在本文中，术语“抗原结合分子”是指包含能够与靶抗原结合的抗原结合区或抗原结合部分的分子，例如蛋白质或多肽。在本发明中，结合CD30的抗原结合分子也称作CD30结合分子。抗原结合分子包括例如抗体及其抗原结合片段、单链scFv抗体、基于scFv构建的各种融合物和缀合物，例如scFv-Fc抗体。如本领域技术人员明了的，抗体的抗原结合部分通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。在一些情况下，根据上下文，“CD30结合分子”与“本发明抗体”或“抗CD30抗体”可以互换使用。
在本文中，术语“抗体”是指至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，所述免疫球蛋白可变区特异性识别并结合抗原。该术语涵盖各种抗体结构，包括、但不限于单克隆抗体、单链抗体或多链抗体、单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全人源抗体或嵌合抗体或人源化抗体、全长抗体和抗体片段，只要它们呈现期望的抗原结合活性即可。
本领域技术人员明了，“全抗体”(在本文中可与“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”互换使用)包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。可变区是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原结合的结构域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。抗体的重链可以取决于其重链恒定区的氨基酸序列而划分为主要5种不同的类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。IgG的重链分子为γ链，IgM、IgA、IgE和IgD的重链分别为μ、α、ε和δ链。参见例如Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.编辑，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。
术语“抗体片段”是指并非完整抗体的分子，其包含完整抗体中用于结合该完整抗体所结合的抗原的部分。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、单链Fv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、微抗体(minibody)；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，例如，通过木瓜蛋白酶消化完全抗体能够获得Fab片段。可以借接头将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建成单一多肽链，即单链Fab(scFab)(参见例如US20070274985A1)。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体可以产生F(ab′)2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab′)2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，从F(ab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。另外，可以使用重组方法，将独立编码Fv片段的两个结构域VL和VH的基因，通过编码连接肽(接头)的核酸序列连接在一起，重组表达形成单链Fv，在该单条蛋白链中VH区和VL区配对提供抗原结合位点。双链抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一多肽链中包含通过短接头连接的VL和VH。在双链抗体中，由于接头过短，同一链上的VH和VL两个结构域之间无法配对，而被迫与另一链上的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双链抗体可以是二价的或双特异性的。双链抗体的更详细描述可以参见例如，EP 404，097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；以及Hollinger等人，PNAS USA 90：6444-6448(1993)。三链抗体和四链抗体和微抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)，和邵荣光等人(编辑)，抗体药物研究与应用，人民卫生出版社(2013)。关于抗体片段的更详细的描述，也可以参见：基础免疫学(FundamentalImmunology)，W.E.Paul编辑，Raven Press，N.Y.(1993)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”表示，得自基本上同质的抗体群体的抗体，即，除了通常以很少量存在的可能变体抗体(例如，含有天然突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生的变体抗体)以外，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位。单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法。
术语“人抗体”或“全人源抗体”在本文中可以互换使用，指包括其中构架区和CDR区二者均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。而且，如果抗体含有恒定区，恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸(例如，通过体外随机或点特异诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR——尤其在CDR3中。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意欲包括其中的CDR序列衍生自其他哺乳动物物种(如，小鼠)的种系而移植入人构架序列的抗体。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如，(a)自用人免疫球蛋白基因进行转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)自转化成表达人抗体的宿主细胞例如转染瘤分离的抗体，(c)自重组、组合人抗体文库例如噬菌体展示文库分离的抗体，和(d)通过包括剪接人免疫球蛋白基因至其他DNA序列的任意其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有构架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，可以对重组人抗体进行体外诱变(或使用人Ig序列转基因动物时为体内体细胞诱变)，由此得到的重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列，尽管源自人种系VH和VL序列并与之相关、但是并不天然存在于体内的人抗体种系库中。
术语“嵌合抗体”是指可变区序列源自一物种、恒定区序列源自另一物种的抗体。
术语“人源化抗体”是指将源自其他哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列接到人构架序列上的抗体。
“分离的”抗体是已经与它的天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
表位是抗体所结合的抗原区域。表位可以由连续的氨基酸形成或者通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。
术语“CD30”包括人CD30的变体、同种型、物种同源物、和与CD30(例如人CD30)具有至少一个相同表位的类似物。图6显示了一个示例性的人CD30序列(SEQ ID NO：162)。CD30蛋白也可包括CD30的片段，诸如胞外结构域以及胞外结构域的片段，例如保持与本发明任何抗体结合能力的片段。
术语“特异性结合”表示抗体选择性地或优先地结合抗原。如果在生物光干涉测量中，抗体以大约5x 10-7M或更低、大约1x 10-7M或更低、大约5x 10-8M或更低、大约1x 10-8M或更低、大约5x 10-9M或更低的KD，与人CD30结合，则该抗体是“与人CD30特异性结合”的抗体。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数(KD)代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。
与结合例如CD30的抗原的参考抗体“竞争结合的抗体”是指这样的抗体，该抗体在竞争检验中阻断参考抗体与抗原(例如CD30)的结合达到50％或更多，并且反过来，在竞争检验中参考抗体也阻断该抗体与抗原(例如CD30)的结合达50％或更多。示例性竞争检验描述于：“Antibodies”，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY)。竞争结合的抗体可以与参考抗体结合相同的表位区，例如相同表位、相邻表位或重叠表位。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分的恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区域。该术语包括天然序列Fc-区和变体Fc-区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc-区从重链的Cys226或从Pro230延伸至羧基端。然而，Fc-区的C-端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外指出，Fc-区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 91-3242中所述。
与抗体相关的术语“变体”在本文中指，包含已经通过至少1个，例如1-30，或1-20或1-10个，例如1或2或3或4或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的目标抗体区域(例如重链可变区或轻链可变区或重链CDR区或轻链CDR区)的抗体，其中变体基本上保持改变之前的抗体分子的生物学特性。在一方面，本发明涵盖在本文中所述及的任何抗体的变体。在一个实施方案中，抗体变体保持改变前抗体的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。在一些实施方案中，所述改变不导致抗体变体丧失对抗原的结合，但任选地可以赋予诸如提高的抗原亲和力和不同的效应子功能等性质。可以理解的，抗体的重链可变区或轻链可变区、或各CDR区可以单独改变或组合改变。在一些实施方案中，在一个或多个或全部三个重链CDR中的氨基酸改变不超过1个、2个、3个、4个、或5个。在一些实施方案中，在一个或多个或全部三个轻链CDR中的氨基酸改变不超过1个、2个、3个、4个、或5个。在一些实施方案中，在全部6个CDR中的氨基酸改变不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。优选地，所述氨基酸改变为氨基酸取代，优选保守取代。在一些实施方案中，抗体变体与亲本抗体在目标抗体序列区域上具有至少80％、85％、90％或95％或99％或更高的氨基酸同一性。例如，在一个实施方案中，本发明抗体，与表A所列任一抗体相比，在重链可变区上具有至少80％、85％、90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的序列同一性。在再一实施方案中，本发明抗体与表A所列任一抗体相比，在轻链可变区上具有至少80％、85％、90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的序列同一性。在再一实施方案中，本发明抗体与表A所列任一抗体相比，在重链可变区和轻链可变区上具有至少80％、85％、90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的序列同一性。
在本文中，“序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“序列同一性百分比”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。
在本发明中，就抗体序列而言，氨基酸序列同一性百分数通过将候选抗体序列与参考抗体序列最佳比对后，在一个优选方案中按照Kabat编号规则进行最佳比对后，予以确定。比对后，将目标抗体区域(例如，重链或轻链的整个可变区、或其部分例如一个或多个CDR区)与参考抗体的相同区域进行比较。目标抗体区域和参考抗体区域之间的序列同一性百分数为：在目标和参考抗体区域两者中被相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区域的比对位置总数(空位不计入)并乘以100得到的百分数。在本文中，在不指定目标抗体区域的情况下，将适用于在参考抗体序列的全长上进行比对。在一些实施方案中，就抗体而言，序列同一性可以分布在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或序列百分数同一性可以仅限定于构架区，而对应CDR区的序列保持100％相同。
A.本发明的CD30结合分子
I.本发明的抗CD30抗体
本发明一方面提供以高靶特异性和高亲合性结合CD30(尤其是膜结合性CD30)的抗体，尤其是单链抗体(例如单链scFv抗体)。
本发明的抗体具有以下一个或多个特性：
(i)以高亲和力，例如以小于100nM，例如小于50nM，例如1-30nM，优选小于10nM的KD值，与人CD30(如SEQ ID NO：162的多肽)结合；
(ii)以高亲和力，例如以小于100nM，例如小于70nM，例如0.1-30nM，优选小于20nM，更优选小于10或5nM，最优选小于1nM的EC50值，与细胞表面表达的人CD30(如SEQ IDNO：162的多肽)结合；
(iii)与人CD30(如SEQ ID NO：162的多肽)结合的解离速率常数(Kdis)小于100×10-4，优选地小于60×10-4，例如30-10×10-4s-1，优选地5-1×10-4s-1；
(iv)与CD30上，尤其是CD30的胞外域ECD上的表位特异性结合(例如，与表A所列任一抗体识别相同或相似的表位)；
(v)显示与表A所列任一抗体相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(vi)抑制(例如，竞争性抑制)本文所述的抗体分子，例如表A所示的任一抗体分子，与CD30的结合；
(vii)与表A所示的任一抗体结合相同或重叠的表位；
(viii)与表A所示的任一抗体竞争结合CD30和/或结合CD30上的相同表位；
(ix)具有本文所述的抗体分子，例如表A所列任一抗体分子的一个或多个生物学特性；
(x)具有本文所述的抗体分子，例如表A所示任一抗体的一种或多种药代动力学特性；
(xi)抑制表达CD30的肿瘤细胞的生长；
(xii)在效应细胞存在下诱导针对表达CD30的肿瘤细胞的杀伤作用(例如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。
在一些实施方案中，本发明抗CD30抗体分子以高亲和力，例如，以下述解离平衡常数(KD)与人CD30(例如SEQ ID NO：162的多肽)结合，所述KD小于约100nM，小于或等于大约80nM、70nM、60nM、或50nM，更优选地小于或等于大约40nM、30nM或20nM，更优选地小于或等于大约10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一个实施方案中，KD值通过使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量法)测定。
在一些实施方案中，本发明抗CD30抗体分子与人CD30(例如SEQ ID NO：162的多肽)结合的解离速率常数(Kdis)小于6×10-3s-1、例如4-1×10-3s-1、优选地小于8×10-4s-1，例如小于5×10-4或3×10-4s-1，例如约2×10-4s-1。在一些实施方案中，抗CD30抗体分子与人CD30(例如SEQ ID NO：162的多肽)结合的结合速率常数(Kon)大于1×104、5×104、1×105或2×105M-1s-1。
在一些实施方案中，本发明抗CD30抗体分子以高亲和力结合表达CD30的细胞，优选地在细胞表面表达人CD30的淋巴瘤细胞(例如Karpas299细胞)，优选地，以流式细胞术(例如FACS)测定，所述抗体与细胞结合的EC50值小于大约200nM、150nM或100nM，优选地，小于或等于大约80nM、70nM、60nM、或50nM，更优选地小于或等于大约40nM、30nM或20nM，更优选地小于或等于大约10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM，最优选小于1nM。
在一个实施方案中，抗体分子与包含氨基酸序列SEQ ID NO：162的人CD30结合。在一些实施方案中，抗体分子结合CD30上，优选CD30的胞外域上的表位。
在一些实施方案中，抗体分子是全长抗体。在另一些实施方案中，抗体分子是抗体片段。例如，本发明的抗体分子可以包含或可以是Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、单链scFv抗体、双链抗体(diabody)、三链抗体、四链抗体、微抗体。在一个优选的实施方案，本发明抗体分子是单链scFv抗体。在一个优选的实施方案，本发明抗体分子包含scFv及与其连接的Fc区。在一个优选的实施方案，本发明抗体分子是全人源的。
抗体可变区
“可变区”或“可变结构域”是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原的结合的结构域。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)可以进一步再划分为高变区(HVR，又称作互补决定区(CDR))，其间插有较保守的区域(即，构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。在一些情况下，单个VH或VL结构域足以赋予抗原-结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域文库而分离(参见，例如，Portolano，S.等，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等，Nature 352(1991)624-628)。在本文中，术语“VH”或“VH结构域”涵盖全长抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab、scFab或本文公开的其它抗体片段的重链可变区VH。在本文中，术语“VL”或“VL结构域”涵盖全长抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab、scFab或本文公开的其它抗体片段的轻链可变区VL。
在一个实施方案中，本发明抗CD30抗体分子包含：(i)与表A所列任一抗体的抗原结合区(例如，重链可变区和轻链可变区对)相同的抗原结合区；或(ii)与(i)的抗原结合区在氨基酸序列上具有例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的抗原结合区。
在再一个实施方案中，本发明抗CD30抗体分子包含：(i)与表A所列任一抗体的重链可变区相同的重链可变区；或(ii)与(i)的重链可变区在氨基酸序列上具有例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的重链可变区；或(iii)(i)的重链可变区的变体，其中所述变体包含至少一个且不超过30、20或10个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，且优选地所述变体在3个重链互补决定区(CDR)区中包含总共不超过10个、优选5-0个氨基酸改变(优选氨基酸取代)。
在再一个实施方案中，本发明抗CD30抗体分子包含：(i)与表A所列任一抗体的轻链可变区相同的轻链可变区；或(ii)与(i)的轻链可变区在氨基酸序列上具有例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的轻链可变区；或(iii)(i)的轻链可变区的变体，其中所述变体包含至少一个且不超过30、20或10个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，且优选地所述变体在3个轻链互补决定区(CDR)中包含总共不超过10个、优选5-0个氨基酸改变(优选氨基酸取代)。
在一些实施方案中，本发明提供包含表A所列任一抗体的重链可变区和轻链可变区对的氨基酸序列的抗CD30抗体、或其变体。在一个优选实施方案中，所述抗体包含选自以下的氨基酸序列对：SEQ ID NOs：4/9，14/19，24/29，34/39，44/49，54/59，64/69，74/79，84/89，94/99，104/109，和114/119。在一个优选实施方案中，所述变体在VH和/或VL氨基酸序列上具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性、或在VH和/或VL氨基酸序列上包含至少一个且不超过30、20或10个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含重链可变区VH和轻链可变区VL的抗CD30抗体，所述VH包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列。本发明也提供该抗体的变体，例如在VH和/或VL上具有至少95-99％同一性或包含不超过10个氨基酸改变的变体。
在上述任一实施方案中，优选地，相对于所述的参考重链可变区氨基酸序列，本发明抗体的重链可变区在全部3个CDR区域上包含不超过10个，优选不超过5个(例如，3、2、1或0个)氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在上述任一实施方案中，优选地，相对于所述的参考轻链可变区氨基酸序列，本发明抗体的轻链可变区VL在全部3个CDR区域上包含不超过10个，优选不超过5个(例如，3、2、1或0个)氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
抗体CDR区
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变区中主要负责与抗原表位结合的氨基酸区域。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案。例如，Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。而Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触性”(Contact)HVR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。根据不同的CDR确定方案，这些HVR中的每一个HVR/CDR的残基如下所述。
HVR也可以是根据Kabat编号系统位于如下Kabat残基位置的HVR序列：
VL中的位置24-36或24-34(LCDR1)，位置46-56或50-56(LCDR2)，和位置89-97或89-96位置(LCDR3)；和VH中的位置26-35或26-35B(HCDR1)，位置50-65或49-65(HCDR2)，和位置94-102或95-102(HCDR3)。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR是根据Kabat编号系统位于如下Kabat残基位置的HVR序列：
VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3)，以及VH中的位置26-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置95-102(HCDR3)。
HVR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”或“HVR”或“HVR序列”涵盖以上述任一种方式确定的HVR或CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))的编号位置。
在一个优选的实施方案中，本发明抗体的CDR为综合Kabat和chothia划分方法，取两者的并集确定的CDR序列。在另一优选的实施方案中，本发明CDR序列如表B中所示。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含与表A所列任一抗体的对应CDR相同的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，或其变体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含与表A所列任一抗体的对应重链CDR相同的至少一个、两个、或三个HCDR，或其变体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含与表A所列任一抗体的对应轻链CDR相同的至少一个、两个、或三个HCDR，或其变体。在本文中，CDR变体是已经通过至少一个，例如1或2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入而修饰的CDR，其中包含CDR变体的抗原结合分子基本上保持包含未修饰CDR的抗原结合分子的生物学特性，例如，保持至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。可以理解，各CDR可以单独修饰或组合修饰。优选地，氨基酸修饰为氨基酸取代，尤其是保守氨基酸取代，例如表X中列出的优选保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2、和HCDR3：
(i)与表A列出的任一抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2、和HCDR3分别相同；或
(ii)相对于(i)的HCDR1、HCDR2和HCDR3，共包含至少1个且不超过10，优选不超过5个(优选1、2或3个)氨基酸改变(优选取代、更优选保守取代)，且优选地在HCDR3区上的氨基酸改变不超过3个(例如，2、1或0个)。
在一些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3：
(i)与表A列出的任一抗体的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别相同；或
(ii)相对于(i)的LCDR1、LCDR2和LCDR3，共包含至少1个且不超过10个(优选1-5个，优选1、2或3个)氨基酸改变(优选取代、更优选保守取代)。
在一些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述抗体：
(i)包含表A所列任一抗体的重链和轻链可变区的全部6个CDR区的序列；或
(ii)相对于表A所列任一抗体，在全部6个CDR区上包含不超过10个，优选不超过5个(例如，3、2、1或0个)氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个优选的实施方案中，本发明抗体或抗原结合片段包含选自以下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的HCDR1、2和3序列和LCDR1、2和3序列：
(i)SEQ ID NO：4的VH和SEQ ID NO：9的VL；
(ii)SEQ ID NO：14的VH和SEQ ID NO：19的VL；
(iii)SEQ ID NO：24的VH和SEQ ID NO：29的VL；
(iv)SEQ ID NO：34的VH和SEQ ID NO：39的VL；
(v)SEQ ID NO：44的VH和SEQ ID NO：49的VL；
(vi)SEQ ID NO：54的VH和SEQ ID NO：59的VL；
(vii)SEQ ID NO：64的VH和SEQ ID NO：69的VL；
(viii)SEQ ID NO：74的VH和SEQ ID NO：79的VL；
(ix)SEQ ID NO：84的VH和SEQ ID NO：89的VL；
(x)SEQ ID NO：94的VH和SEQ ID NO：99的VL；
(xi)SEQ ID NO：104的VH和SEQ ID NO：109的VL；
(xii)SEQ ID NO：114的VH和SEQ ID NO：119的VL。
在一些实施方案中，本发明提供选自以下氨基酸序列组合的重链CDR组合(按顺序分别为HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NOs：1/2/3，11/12/13，21/22/23，3132/33，41/42/43，51/52/53，61/62/63，71/72/73，81/82/83，91/92/93，101/102/103，和111/112/113。本发明也提供所述重链CDR组合的变体，在一个优选实施方案中，所述变体在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过10或5个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。本发明也提供包含所述重链CDR组合或所述变体的抗CD30抗体。
在一些实施方案中，本发明提供选自以下的CDR序列组合、以及包含该组合的抗体或抗原结合片段：
(i)包含SEQ ID NO：1序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：2序列的HCDR2、和包含SEQ IDNO：3序列的HCDR3；
(ii)包含SEQ ID NO：11序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：12序列的HCDR2、和包含SEQID NO：13序列的HCDR3；
(iii)包含SEQ ID NO：21序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：22序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO：23序列的HCDR3；
(iv)包含SEQ ID NO：31序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：32序列的HCDR2、和包含SEQID NO：33序列的HCDR3；
(v)包含SEQ ID NO：41序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：42序列的HCDR2、和包含SEQID NO：43序列的HCDR3；
(vi)包含SEQ ID NO：51序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：52序列的HCDR2、和包含SEQID NO：53序列的HCDR3；
(vii)包含SEQ ID NO：61序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：62序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO：63序列的HCDR3；
(viii)包含SEQ ID NO：71序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：72序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO：73序列的HCDR3；
(ix)包含SEQ ID NO：81序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：82序列的HCDR2、和包含SEQID NO：83序列的HCDR3；
(x)包含SEQ ID NO：91序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：92序列的HCDR2、和包含SEQID NO：93序列的HCDR3；
(xi)包含SEQ ID NO：101序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：102序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO：103序列的HCDR3；
(xii)包含SEQ ID NO：111序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：112序列的HCDR2、和包含SEQ ID NO：113序列的HCDR3。
在一些实施方案中，本发明提供具有选自以下氨基酸序列组合的轻链CDR组合(按顺序分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ IID NOs：6/7/8，16/17/18，26/27/28，36/37/38，46/47/48，56/57/58，66/67/68，76/77/78，86/87/88，96/97/98，106/107/108，和116/117/118。本发明也提供所述轻链CDR组合的变体，在一个优选实施方案中，所述变体在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过10或5个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。本发明也提供包含所述轻链CDR组合或所述变体的抗CD30抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明提供选自以下的CDR组合、以及包含该组合的抗体或抗原结合片段：
(i)包含SEQ ID NO：6序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：7序列的LCDR2、和包含SEQ IDNO：8序列的LCDR3；
(ii)包含SEQ ID NO：16序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：17序列的LCDR2、和包含SEQID NO：18序列的LCDR3；
(iii)包含SEQ ID NO：26序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：27序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO：28序列的LCDR3；
(iv)包含SEQ ID NO：36序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：37序列的LCDR2、和包含SEQID NO：38序列的LCDR3；
(v)包含SEQ ID NO：46序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：47序列的LCDR2、和包含SEQID NO：48序列的LCDR3；
(vi)包含SEQ ID NO：56序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：57序列的LCDR2、和包含SEQID NO：58序列的LCDR3；
(vii)包含SEQ ID NO：66序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：67序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO：68序列的LCDR3；
(viii)包含SEQ ID NO：76序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：77序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO：78序列的LCDR3；
(ix)包含SEQ ID NO：86序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：87序列的LCDR2、和包含SEQID NO：88序列的LCDR3；
(x)包含SEQ ID NO：96序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：97序列的LCDR2、和包含SEQID NO：98序列的LCDR3；
(xi)包含SEQ ID NO：106序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：107序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO：108序列的LCDR3；
(xii)包含SEQ ID NO：116序列的LCDR1、包含SEQ ID NO：117序列的LCDR2、和包含SEQ ID NO：118序列的LCDR3。
在再一些实施方案中，本发明提供选自以下氨基酸序列组合的重链和轻链CDR组合(按顺序分别为HCDR1、HCDR2和HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NOs：1/2/3/6/7/8，11/12/13/16/17/18，21/22/23/26/27/28，31/32/33/36/37/38，41/42/43/46/47/48，51/52/53/56/57/58，61/62/63/66/67/68，71/72/73/76/77/78，81/82/83/86/87/88，91/92/93/96/97/98，101/102/103/106/107/108，和111/112/113/116/117/118。本发明也提供所述CDR组合的变体，在一个优选实施方案中，所述变体在所述六个CDR区上共包含至少一个且不超过20、10或5个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。本发明也提供包含所述重链和轻链CDR组合或所述变体的抗CD30抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段包含3个重链互补决定区HCDR以及3个轻链互补决定区LCDR，其中：
(a)HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或
(b)HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；或
(c)HCDR1包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；或
(d)HCDR1包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；或
(e)HCDR1包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列；或
(f)HCDR1包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列；或
(g)HCDR1包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列；或
(h)HCDR1包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列；或
(i)HCDR1包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列；或
(j)HCDR1包含SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列；或
(k)HCDR1包含SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：102所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列；或
(l)HCDR1包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列。
在本发明抗体的上述实施方案中，“保守性取代”是指导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸的氨基酸改变。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。在本发明任一实施方案中，在一个优选的方面，保守取代残基来自以下的保守替代表X，优选地为表X中所示优选置换残基。
表X
示例性抗体序列
本发明提供了如实施例中分离并表征的特异性结合CD30(例如人CD30)的全人源抗体。下表A中列出了本发明这些示例性抗体的可变区序列(也见图4-5)。下表B中给出这些抗体的示例性CDR序列(也见图3)。
表A.本发明示例性全人源抗体分子的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
| 抗体名称 | VH | VH DNA | VL | VL DNA |
| HB38E4 | SEQ ID NO：4 | SEQ ID NO：5 | SEQ ID NO：9 | SEQ ID NO：10 |
| HB10F1 | SEQ ID NO：14 | SEQ ID NO：15 | SEQ ID NO：19 | SEQ ID NO：20 |
| HB49G9 | SEQ ID NO：24 | SEQ ID NO：25 | SEQ ID NO：29 | SEQ ID NO：30 |
| HB36F7 | SEQ ID NO：34 | SEQ ID NO：35 | SEQ ID NO：39 | SEQ ID NO：40 |
| HB68H2 | SEQ ID NO：44 | SEQ ID NO：45 | SEQ ID NO：49 | SEQ ID NO：50 |
| HB69G7 | SEQ ID NO：54 | SEQ ID NO：55 | SEQ ID NO：59 | SEQ ID NO：60 |
| HB10B6 | SEQ ID NO：64 | SEQ ID NO：65 | SEQ ID NO：69 | SEQ ID NO：70 |
| HB16H7 | SEQ ID NO：74 | SEQ ID NO：75 | SEQ ID NO：79 | SEQ ID NO：80 |
| HB6A9 | SEQ ID NO：84 | SEQ ID NO：85 | SEQ ID NO：89 | SEQ ID NO：90 |
| HB16H8 | SEQ ID NO：94 | SEQ ID NO：95 | SEQ ID NO：99 | SEQ ID NO：100 |
| P5E10 | SEQ ID NO：104 | SEQ ID NO：105 | SEQ ID NO：109 | SEQ ID NO：110 |
| P27B3 | SEQ ID NO：114 | SEQ ID NO：115 | SEQ ID NO：119 | SEQ ID NO：120 |
表B.示例性重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列
本发明也提供上述抗体的变体。在一个实施方案中，抗体的氨基酸序列或编码氨基酸序列的核酸已经被突变，但仍与表A中描述的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高同一性。一些实施方案，抗体包括突变的可变区氨基酸序列，其中与表A所示的可变区序列相比时，可变区VH和/或VL中已突变了不多于1、2、3、4、5或10个氨基酸，但保留基本相同的抗原结合活性。
此外，由于上述抗体每一个都可以与CD30结合，故可以“混合并匹配”VH和VL(氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)以产生结合CD30的本发明其他抗体。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA，和实施例部分中描述的其他测定法)测试这类“混合和匹配的”抗体与CD30的结合。在混合和匹配这些链时，优选地，将来自具体VH/VL配对的VH序列替换为结构相似的VH序列。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列优选地替换为结构上相似的VL序列。
在另一方面，本发明也提供上述抗体的变体。在一个实施方案中，抗体在一个或多个或全部6个CDR区的氨基酸序列或编码该氨基酸序列的核酸上已经被突变。在一些实施方案中，突变的CDR区的氨基酸序列，与表A的对应CDR区相比时，已突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸，但保留基本相同的抗原结合活性。
此外，鉴于表A抗体的每一者均可以与CD30结合且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，故可以将VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列“混合并匹配”(即，可以混合并匹配来自不同抗体的CDR，不过每种抗体优选地含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3)，以产生结合CD30的本发明其他分子。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA、SET、Biacore)和实施例中描述的那些测定法，测试这类“混合和匹配的”抗体与CD30的结合。当混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地替换为结构上相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地替换为结构上相似的CDR序列。本领域技术人员明了，也可以通过将一个或多个VH和/或VL CDR区序列置换为来自本文中所示抗体的结构上相似的CDR序列，以产生本发明的其它抗体。
II.单链scFv抗体
在一个优选方面，本发明抗体是单链scFv抗体。
在本文中，“单链scFv抗体”或“scFv”或“单链scFv”是指，包含免疫球蛋白或抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的单个多肽链，在该单条蛋白链中VH区和VL区配对提供抗原结合位点。
在优选的实施方案中，本发明单链scFv抗体的VH区和VL区通过连接肽例如柔性连接肽共价连接在一起。术语“柔性连接肽”是由氨基酸组成的肽接头。通过这样的肽接头可以连接抗体中的各个可变结构域，例如VH和VL区。肽接头通常富含表现柔性的甘氨酸以及表现溶解性的丝氨酸或苏氨酸。例如可以单独或组合使用甘氨酸和/或丝氨酸残基。柔性连接肽或肽接头的非限定性例子公开于Shen等人，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)、WO2012/138475和WO2014/087010，将其内容全文并入作为参考。如本领域已知的，在scFv的构建中，优选，接头将利于促使VH和VL配对，且不干扰VH和VL对形成功能有效的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本发明scFv单链抗体包含由肽键连接的氨基酸残基组成的柔性连接肽或肽接头。在某些实施方案中，所述氨基酸选自二十种天然氨基酸。在某些其他实施方案中，一个或多个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一个优选实施方案中，一个或多个氨基酸选自Gly，Ser，Thr，Lys，Pro，和Glu。
在一些实施方案中，接头的长度是约1-30个氨基酸、或约10个至约25个氨基酸、约15个至约20个氨基酸或约10个至约20个氨基酸或者任意介于中间的氨基酸长度。在优选实施方案中，接头具有15-25个氨基酸残基长度，在更优选实施方案中，具有15-18个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，接头的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个氨基酸。
可以用于本发明的肽接头的实例包括：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是至少1、2、3、4或5的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其它柔性接头。本领域技术人员可以理解，在一些实施方案中，VH和VL之间的接头可以完全由柔性连接肽组成，或者接头可以由柔性连接肽部分以及赋予较小柔性结构的一个或多个部分组成。
在一个优选实施方案中，肽接头是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：157)。在一个实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：157的核苷酸序列在SEQ ID NO：158中给出。
在一个实施方案中，肽接头是Gly/Ser连接肽。在一个实施方案中，肽接头是(GxS)n接头，其中G＝甘氨酸、S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10)或(x＝4和n＝6、7或8)，在一个实施方案中，x＝4，n＝6或7。在一些实施方案中，接头可以包括氨基酸序列(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是1-7的整数。在一个优选实施方案中，x＝4，n＝7。在一个实施方案中，接头是(G4S)3。在一个实施方案中，接头是(G4S)4。在一个实施方案中，接头是(G4S)6G2。
其它示例性接头包括但不限于下述氨基酸序列：GGG；DGGGS；TGEKP(参见，例如，Liu等人，PNAS5525-5530(1997))；GGRR(Pomerantz等人.1995，同上)；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(Kim等人，PNAS 93，1156-1160(1996)；EGKSSGSGSESKVD(Chaudhary等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(Bird等人，1988，Science242：423-426)，GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；LRQKD(GGGS)2ERP。可选地，可以使用能够模建DNA-结合位点和肽自身的计算机程序(Desjarlais&Berg，PNAS90：2256-2260(1993)，PNAS91：11099-11103(1994))，或者通过噬菌体或酵母展示方法，合理地设计柔性接头。
本发明单链scFv抗体中VH和VL可以取任一方向。在一些实施方案中，scFv从N端到C端包含：VH-接头-VL；或VL-接头-VH。在一个优选实施方案中，本发明单链scFv抗体从N端到C端包含：VH-接头-VL。在一个优选实施方案中，VH以其C末端经由接头共价连接VL的N末端。
在一些实施方案中，除了接头，VL和VH结构域之间也可以插入具有特定功能的其它多肽片段，例如具有调节免疫反应功能的多肽片段、或具有引起细胞溶剂或细胞杀伤的多肽片段。
在一些实施方案中，可以通过在scFv中引入二硫键以稳定单链抗体。例如，可以通过引入链内或链间二硫键而连接scFv的VH和VL的构架区。在一个实施方案中，可以通过将抗体VH和VL的各1个氨基酸残基突变为半胱氨酸，例如根据Kabat编号系统，VH的44位和VL的100位，或者VH的105位和VL的43位。
本发明的单链scFv多肽抗体可以由包括VH-和VL-编码序列的核酸表达，如Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879～5883，1988)。还可参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754。在一些实施方案中，本发明的单链scFv抗体在真核细胞中表达，例如酵母细胞、哺乳动物细胞如HEK293细胞或CHO细胞。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：121的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：121具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：122的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：4所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：9所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：4所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQID NO：9所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQ ID NO：3的HCDR3和SEQ ID NO：8的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：1的VHCDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ ID NO：3的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：6的VL CDR1、SEQ ID NO：7的VL CDR2、和SEQ ID NO：8的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：1的VH CDR1、SEQ ID NO：2的VH CDR2、和SEQ IDNO：3的VH CDR3，以及SEQ ID NO：6的VL CDR1、SEQ ID NO：7的VL CDR2、和SEQ ID NO：8的VLCDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：124的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：124具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：125的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：14所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：19所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：14所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：19所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：13的HCDR3和SEQ ID NO：18的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：11的VH CDR1、SEQ ID NO：12的VH CDR2、和SEQ ID NO：13的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：16的VL CDR1、SEQ ID NO：17的VL CDR2、和SEQ ID NO：18的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：11的VH CDR1、SEQ ID NO：12的VH CDR2、和SEQ ID NO：13的VH CDR3，以及SEQ ID NO：16的VL CDR1、SEQ ID NO：17的VLCDR2、和SEQ ID NO：18的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：127的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：127具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：128的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：24所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：29所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：24所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：29所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：23的HCDR3和SEQ ID NO：28的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：21的VH CDR1、SEQ ID NO：22的VH CDR2、和SEQ ID NO：23的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：26的VL CDR1、SEQ ID NO：27的VL CDR2、和SEQ ID NO：28的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：21的VH CDR1、SEQ ID NO：22的VH CDR2、和SEQ ID NO：23的VH CDR3，以及SEQ ID NO：26的VL CDR1、SEQ ID NO：27的VLCDR2、和SEQ ID NO：28的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：130的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：130具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：131的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：34所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：39所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：34所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：39所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：33的HCDR3和SEQ ID NO：38的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：31的VH CDR1、SEQ ID NO：32的VH CDR2、和SEQ ID NO：33的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：36的VL CDR1、SEQ ID NO：37的VL CDR2、和SEQ ID NO：38的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：31的VH CDR1、SEQ ID NO：32的VH CDR2、和SEQ ID NO：33的VH CDR3，以及SEQ ID NO：36的VL CDR1、SEQ ID NO：37的VLCDR2、和SEQ ID NO：38的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：133的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：133具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：134的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：44所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：49所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：44所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：49所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：43的HCDR3和SEQ ID NO：48的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：41的VH CDR1、SEQ ID NO：42的VH CDR2、和SEQ ID NO：43的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：46的VL CDR1、SEQ ID NO：47的VL CDR2、和SEQ ID NO：48的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：41的VH CDR1、SEQ ID NO：42的VH CDR2、和SEQ ID NO：43的VH CDR3，以及SEQ ID NO：46的VL CDR1、SEQ ID NO：47的VLCDR2、和SEQ ID NO：48的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：136的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：136具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：137的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：59的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：54所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：59所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：54所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：59所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：53的HCDR3和SEQ ID NO：58的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：51的VH CDR1、SEQ ID NO：52的VH CDR2、和SEQ ID NO：53的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：56的VL CDR1、SEQ ID NO：57的VL CDR2、和SEQ ID NO：58的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：51的VH CDR1、SEQ ID NO：52的VH CDR2、和SEQ ID NO：53的VH CDR3，以及SEQ ID NO：56的VL CDR1、SEQ ID NO：57的VLCDR2、和SEQ ID NO：58的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：139的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：139具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：140的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：64的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：64所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：69所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：64所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：69所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：63的HCDR3和SEQ ID NO：68的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：61的VH CDR1、SEQ ID NO：62的VH CDR2、和SEQ ID NO：63的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：66的VL CDR1、SEQ ID NO：67的VL CDR2、和SEQ ID NO：68的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：61的VH CDR1、SEQ ID NO：62的VH CDR2、和SEQ ID NO：63的VH CDR3，以及SEQ ID NO：66的VL CDR1、SEQ ID NO：67的VLCDR2、和SEQ ID NO：68的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：142的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：142具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：143的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：74所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：79所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：74所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：79所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：73的HCDR3和SEQ ID NO：78的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：71的VH CDR1、SEQ ID NO：72的VH CDR2、和SEQ ID NO：73的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：76的VL CDR1、SEQ ID NO：77的VL CDR2、和SEQ ID NO：78的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：71的VH CDR1、SEQ ID NO：72的VH CDR2、和SEQ ID NO：73的VH CDR3，以及SEQ ID NO：76的VL CDR1、SEQ ID NO：77的VLCDR2、和SEID NO：78的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：145的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：145具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：146的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：8157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：84所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：89所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：84所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：89所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：83的HCDR3和SEQ ID NO：88的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：81的VH CDR1、SEQ ID NO：82的VH CDR2、和SEQ ID NO：83的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：86的VL CDR1、SEQ ID NO：87的VL CDR2、和SEQ ID NO：88的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：81的VH CDR1、SEQ ID NO：82的VH CDR2、和SEQ ID NO：83的VH CDR3，以及SEQ ID NO：86的VL CDR1、SEQ ID NO：87的VLCDR2、和SEQ ID NO：88的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：148的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：148具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：149的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：94所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：99所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：94所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：99所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQID NO：93的HCDR3和SEQ ID NO：98的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ IDNO：91的VH CDR1、SEQ ID NO：92的VH CDR2、和SEQ ID NO：93的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：96的VL CDR1、SEQ ID NO：97的VL CDR2、和SEQ ID NO：98的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：91的VH CDR1、SEQ ID NO：92的VH CDR2、和SEQ ID NO：93的VH CDR3，以及SEQ ID NO：96的VL CDR1、SEQ ID NO：97的VLCDR2、和SEQ ID NO：98的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：151的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：151具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：152的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：104的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：109的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：104所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：109所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：104所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：109所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQ ID NO：103的HCDR3和SEQ ID NO：108的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：101的VHCDR1、SEQ ID NO：102的VHCDR2、和SEQ ID NO：103的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：106的VL CDR1、SEQ ID NO：107的VL CDR2、和SEQ ID NO：108的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：101的VHCDR1、SEQ ID NO：102的VH CDR2、和SEQ ID NO：103的VH CDR3，以及SEQ ID NO：106的VLCDR1、SEQ ID NO：107的VL CDR2、和SEQ ID NO：108的VL CDR3。
在某些实施方式中，本发明的抗体是抗CD30 scFv或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：154的抗原结合区或其变体，并特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO：154具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性。在一个实施方案中，抗CD30 scFv由SEQ ID NO：155的核苷酸编码。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv抗体包括：包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的的轻链可变区，以及任选地在重链可变区和轻链可变区之间的接头，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列的VH。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：119的氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括具有SEQ ID NO：114所示序列的VH和包括具有SEQ ID NO：119所示序列的VL。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括SEQ ID NO：114所示序列的VH的3个HCDR序列和/或SEQ ID NO：119所示序列的VL的3个LCDR序列。在一些实施方案中，抗CD30 scFv包含SEQ ID NO：113的HCDR3和SEQ ID NO：118的LCDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：111的VHCDR1、SEQ ID NO：112的VHCDR2、和SEQ ID NO：113的VH CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包括：SEQ ID NO：116的VL CDR1、SEQ ID NO：117的VL CDR2、和SEQ ID NO：118的VL CDR3。在某些实施方式中，抗CD30 scFv包含：SEQ ID NO：111的VHCDR1、SEQ ID NO：112的VH CDR2、和SEQ ID NO：113的VH CDR3，以及SEQ ID NO：116的VLCDR1、SEQ ID NO：117的VL CDR2、和SEQ ID NO：118的VL CDR3。
III.scFv-Fc抗体
具有Fc区的抗体具有若干优势，包括，但不限于：可以通过Fc区介导效应子功能，例如CDC和ADCC免疫学活性；通过Fc区的二聚化功能形成二价抗体，可以提供强的抗原结合亲和力，和/或改变血浆半衰期和肾脏清除率；二价抗体可以以不同于单价Fab或scFv抗体的速率内化，改变免疫功能或载体功能。例如，α发射体不需要内化来杀伤靶细胞，但许多药物和毒素将受益于免疫复合物的内化。
因此，在一个优选的实施方案中，提供本发明单链scFv抗体与抗体Fc区融合形成的scFv-Fc抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含本发明的单链scFv抗体和野生型或改变的Fc区。在一个优选实施方案中，所述抗体从N端到C端包含：Fc-VH-接头-VL或Fc-VL-接头-VH；或优选地VH-接头-VL-Fc或VL-接头-VH-Fc。在一个优选实施方案中，Fc通过铰链区连接到可变区(VH或VL)上。在一些实施方案中，Fc为来自人免疫球蛋白的Fc区，优选人IgG1或IgG4Fc区。在一个优选实施方案中，Fc区具有SEQ ID NO：161所示的氨基酸序列、或相对于SEQ ID NO：161的氨基酸序列包含至少一个，两个或三个，但不超过20个，10个或5个氨基酸改变的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：161的氨基酸序列具有至少95-99％同一性的序列。在一些实施方案中，本发明的单链scFv抗体通过铰链区连接到Fc区上。在一个实施方案中，铰链区为C8铰链区，例如包含SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列、或相对于SEQ ID NO：159的氨基酸序列包含至少一个，两个或三个，但不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明提供这样的抗体，其特异性结合CD30多肽(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：162的CD30多肽或其片段)，并且包含选自SEQ ID NO：123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、和156的氨基酸序列、或相对于其包含至少一个，两个或三个，但不超过20个，10个或5个氨基酸改变的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
下表C中列出了本发明一些示例性ScFv-Fc抗体的氨基酸序列及用于构建其的单链scFv的氨基酸序列和核苷酸序列。这些scFv-Fc抗体中所用的接头和铰链的氨基酸序列和核苷酸序列示于图7中。
表C：
| 抗体名称 | scFv氨基酸序列 | scFv DNA序列 | scFv-hFc氨基酸序列 |
| HB38E4 scFv-Fc | SEQ ID NO：121 | SEQ ID NO：122 | SEQ ID NO：123 |
| HB10F1 scFv-Fc | SEQ ID NO：124 | SEQ ID NO：125 | SEQ ID NO：126 |
| HB49G9 scFv-Fc | SEQ ID NO：127 | SEQ ID NO：128 | SEQ ID NO：129 |
| HB36F7 scFv-Fc | SEQ ID NO：130 | SEQ ID NO：131 | SEQ ID NO：132 |
| HB68H2 scFv-Fc | SEQ ID NO：133 | SEQ ID NO：134 | SEQ ID NO：135 |
| HB69G7 scFv-Fc | SEQ ID NO：136 | SEQ ID NO：137 | SEQ ID NO：138 |
| HB10B6 scFv-Fc | SEQ ID NO：139 | SEQ ID NO：140 | SEQ ID NO：141 |
| HB16H7 scFv-Fc | SEQ ID NO：142 | SEQ ID NO：143 | SEQ ID NO：144 |
| HB6A9 scFv-Fc | SEQ ID NO：145 | SEQ ID NO：146 | SEQ ID NO：147 |
| HB16H8 scFv-Fc | SEQ ID NO：148 | SEQ ID NO：149 | SEQ ID NO：150 |
| P5E10 scFv-Fc | SEQ ID NO：151 | SEQ ID NO：152 | SEQ ID NO：153 |
| P27B3 scFv-Fc | SEQ ID NO：154 | SEQ ID NO：155 | SEQ ID NO：156 |
在一些实施方案中，本发明的scFv-Fc抗体具有效应子功能。术语“效应子功能”是指，可归因于抗体的Fc-区的那些生物活性，其随抗体类别而改变。存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的效应子功能包括例如但不限于：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B-细胞激活。US20120014943A1报道，在Fc区中包含选自239D和332E的至少一个氨基酸取代可以导致抗体具有增强的FcγRIIIa亲和力，从而引起增强的效应子功能。在一些实施方案中，本发明的scFv-Fc抗体通过效应细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性而阻断、抑制表达CD30的细胞(尤其是肿瘤细胞，如淋巴瘤细胞)的生长、和/或杀死所述细胞。
在某些实施方案中，Fc区可以包含具有一个或多个提高ADCC活性的氨基酸置换的Fc-区，例如，Fc-区的位置298、333和/或334的置换(残基的EU编号)。在一些实施方案中，也可以对Fc-区进行改变，以导致改变的(即，提高的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)(参见，例如，US6,194,551、WO99/51642和Idusogie，E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184)。
在另一些实施方案中，可以对Fc进行改变以增加或降低其糖基化程度和/或改变其糖基化模式。对Fc的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。举例而言，可实施一或多种氨基酸取代以消除一或多个糖基化位点，由此消除该位点处的糖基化。可制备具有改变类型的糖基化的抗体，例如具有减小量的岩藻糖基残基的低或无岩藻糖化抗体或具有增加的等分GlcNac结构的抗体。这类改变的糖基化模式已显示可增加抗体的ADCC能力。
因此，在一些优选实施方案中，本发明提供这样的抗体，其Fc区是低或无岩藻糖基化的，从而可以显著地增加抗体Fc结构域与效应细胞上表达的Fcγ受体(如FcγRIIIa)的结合亲和力，由此导致抗体具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。例如，抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。可以通过MALDI-TOF质谱法测量，相对于与Asn 297连接的所有糖结构(例如复合型、杂合型及高甘露糖型结构)的总和，计算在Asn297处糖链内的岩藻糖的平均量，由此确定岩藻糖的量，例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中大约位置297处(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中微小的序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸位置，即位置294与300之间。参见例如US2003/0157108；US2004/0093621。与“去岩藻糖基化”或“低岩藻糖基化”抗体变体有关的公布实例还包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki，A.等，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)614-622。可以在能够产生去岩藻糖基化或低岩藻糖基化抗体的细胞系中产生此类抗体变体。此类细胞的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka，J.等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)：533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)614-622；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO2003/085107)。再例如，细胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而可以在Ms704、Ms705及Ms709细胞系中表达缺乏岩藻糖的抗体。此外，EP 1,176,195也描述了具有功能受破坏的FUT8基因的细胞系，在这类细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖化。备选地，还可使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基；举例而言，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗体去除岩藻糖基残基(Tarentino等人(1975)Biochem.14：5516-23)。
此外，本发明也考虑具有平分型(bisected)寡糖的抗体变体，例如，其中与Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc平分的抗体。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。这些抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；US6,602,684；和US 2005/0123546。本发明也考虑在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有提高的CDC功能。这些抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
评价目标分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性实例描述于US5,500,362(参见，例如Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)和
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如，在如Clynes，R.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中评价。为评价补体活化，可进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro，H.等，J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg，M.S.等，Blood101(2003)1045-1052；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。也可进行C1q结合测定，以确定抗体的C1q结合和CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。
在某些实施方案中，本发明也考虑具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为某些应用的理想候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可进行如上所述的体外和/或体内测定试验，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此很可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。例如，Fc区可以包含消除或减弱效应子功能的突变，例如具有突变P329G和/或L234A和L235A的人IgG1 Fc区，或具有突变P329G和/或S228P和L235E的人IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，本发明的scFv-Fc区抗体可以通过Fc区的二聚化作用而形成二价抗体，从而可以进一步具有增加的抗体总亲和力和稳定性、或形成多特异性如双特异性。例如Fc区可以包含i)人IgG1亚类的同二聚Fc-区，或ii)人IgG4亚类的同二聚Fc-区，或iii)异二聚Fc-区，其中a)一个Fc-区多肽包含突变T366W，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或b)一个Fc-区多肽包含突变T366W和Y349C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或c)一个Fc-区多肽包含突变T366W和S354C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一些实施方案中，本发明scFv-Fc重组抗体可以借组于Fc区部分而直接融合或缀合其它分子，包括但不限于，荧光染料、细胞毒素、放射性同位素等，例如，用于抗原定量研究、将抗体固定化用于亲和力测量、用于治疗剂的靶向输送、使用免疫效应细胞的Fc-介导的细胞毒性测试以及许多其他用途。
B.多核苷酸和宿主
在一个方面，本发明提供基本上纯化的核酸分子，所述核酸分子编码包含上述结合CD30的抗体链的区段或结构域的多肽。在一些实施方案中，本发明核酸分子编码结合CD30的抗体链(例如本发明的任何抗体，包括单链scFv抗体和scFv-Fc抗体，及其片段)。
本发明的一些核酸包含编码表A所示任一抗体的重链可变区或其变体的核苷酸序列，和/或表A所示相应抗体的轻链可变区或其变体的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，核酸分子是表A中列出的DNA VH序列和/或DNA VL序列。本发明的一些其他核酸分子包含与表A中所示的核酸分子的核苷酸序列基本上相同(例如，至少65％、80％、95％、或99％同一性)的核苷酸序列。从适宜的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示CD30抗原结合能力。
本发明中还提供多核苷酸，所述多核苷酸编码来自上文所述的结合CD30的抗体的重链VH或轻链VL序列的至少一个CDR区和通常全部三个CDR区。一些进一步的实施方案中，多核苷酸编码上文所述的结合CD30的抗体的重链和/或轻链的完整或基本上完整可变区序列。
如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。
本发明的一些核酸序列包含编码重链VH的核苷酸序列，其包含：(i)选自SEQ IDNOs：5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、和115的核苷酸序列或与其具有例如，至少80％、90％或99％同一性的核苷酸序列。一些其他核酸序列包含编码轻链VL的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、和120的核苷酸序列或与其具有例如，至少80％、90％或99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的核酸序列编码本发明的上述任何单链scFv抗体。在一些实施方案中，编码scFv抗体的本发明核酸序列包含选自以下的编码重链VH序列的核苷酸序列和编码轻链VL序列的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：5的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：10的序列或与其基本相同的序列，
(ii)SEQ ID NO：15的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：20的序列或或与其基本相同的序列，
(iii)SEQ ID NO：25的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：30的序列或或与其基本相同的序列，
(iv)SEQ ID NO：35的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：40的序列或或与其基本相同的序列，
(v)SEQ ID NO：45的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：50的序列或或与其基本相同的序列，
(vi)SEQ ID NO：55的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：60的序列或或与其基本相同的序列，
(vii)SEQ ID NO：65的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：70的序列或或与其基本相同的序列，
(viii)SEQ ID NO：75的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：70的序列或或与其基本相同的序列，
(ix)SEQ ID NO：85的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：90的序列或或与其基本相同的序列，
(x)SEQ ID NO：95的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：100的序列或或与其基本相同的序列，
(xi)SEQ ID NO：105的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：110的序列或或与其基本相同的序列，
(xii)SEQ ID NO：115的序列或与其基本相同的序列，以及SEQ ID NO：120的序列或或与其基本相同的序列。
在一个优选实施方案中，编码scFv抗体的本发明核酸还包含编码接头的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：158中所示的序列或与其基本相同的序列。
在一个更优选的实施方案中，编码scFv抗体的本发明核酸包含选自SEQ ID NO：122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、和155的序列，或与其基本相同的序列。
在上述任一实施方案中，在一个优选方面，“基本相同”的核苷酸序列是指与参考核苷酸序列在序列上具有至少80％，85％，90％，90％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，or 99％或更高同一性的序列。核苷酸序列的同一性可以使用本领域公知的各种序列比对方法确定。例如可以从NCBI(National Center for Biotechnology Information，Bethesda，MD)的网站上获得BLAST序列比对检索工具。典型地，百分比同一性采用NCBIBlast的默认参数进行。
可以通过从头固相DNA合成、或通过PCR诱变编码结合CD30的抗体或其结合片段的现有序列(例如，表A-C中所示的序列)，产生这些多核苷酸序列。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，如Narang等人，1979，Meth.Enzymol.68：90的磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109，1979的磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.，22：1859，1981的二乙基磷酰亚胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可以如同例如PCR Technology：Principles and Applications for DNAAmplification，H.A.Erlich(编著)，Freeman Press，NY，NY，1992；PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications，Innis等人(编著)，Academic Press，San Diego，CA，1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967，1991；and Eckert等人，PCR Methods andApplications 1：17，1991中所述那样进行。
C.抗体的制备
抗体可以使用重组方法和组合物进行生产，例如US 4,816,567中所述。
在一个实施方案中，提供了包含编码本文所述结合CD30的抗体的分离核酸的载体。此核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，载体为表达载体。在进一步的实施方案中，本发明提供包含此核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用以下载体转化)：(1)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗CD30抗体的方法，其中所述方法包括在适于抗体表达的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
对于抗CD30抗体的重组生产，可以分离编码抗体的核酸，例如如上所述的核酸，并且插入一个或多个载体内用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此核酸可以使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体重和轻链可变区的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
多种表达载体可以用来表达编码结合CD30的抗体链(例如本发明的任何抗体，包括scFv抗体和scFv-Fc抗体)的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包含质粒、游离型载体和人工染色体，一般含有用于表达蛋白质或RNA的表达盒(参见，例如，Harrington等人，Nat Genet 15：345，1997)。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)的载体。参见，Smith，Annu.Rev.Microbiol.49：807，1995；和Rosenfeld等人，Cell 68：143，1992。
表达载体的选择依赖于待在其中表达该载体的预期宿主细胞。一般，表达载体含有与编码结合CD30的抗体链或多肽的多核苷酸有效连接的启动子。除启动子之外，也可能要求或需要其他调节元件用于高效表达结合CD30的抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其他序列。此外，可以通过纳入适用于所用细胞系统的增强子增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125，1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.，153：516，1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列以形成含有CD30结合多肽的融合蛋白。或者，也可以将CD30结合抗体/多肽序列在插入载体之前与信号序列连接。在一个优选实施方案中，信号肽包含如SEQ ID NO：164所示的氨基酸序列。用于接受编码结合CD30的抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的序列的载体有时还可以编码恒定区或其部分。此类载体允许将可变区表达为与恒定区的融合蛋白，由此导致完整抗体或其片段的产生。通常，此类恒定区是人的恒定区例如人IgG1 Fc区。在一个优选实施方案中，与可变区融合的Fc区包含如SEQ ID NO：161所示的氨基酸序列。
用于载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，抗体可以在细菌中生产。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton，K.A.，见：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254，其中描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以在可溶级分中与细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，这导致具有部分或完全人糖基化模式的抗体的生产。参见Gerngross，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等，Nat.Biotech(2006)24：210-215。用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了众多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。可以用作宿主的脊椎动物细胞包括，例如，悬浮生长适应化的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或例如Graham，F.L.等，J.Gen Virol.36(1997)59中描述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(例如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-251中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如Mather，J.P.等，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合于抗体生产的一些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo.B.K.C.(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2004)pp.255-268。在一些优选的实施方案中，哺乳动物宿主细胞用来表达并产生结合CD30的本发明抗体多肽。
D.抗体的筛选、鉴定和表征
可以通过本领域已知的各种试验，针对其物理/化学特性和/或生物活性，筛选、鉴定、或表征本文中提供的抗CD30抗体。
可以从表达人抗体的噬菌体展示文库中选择与所关注的目标抗原以高亲和力结合的噬菌体。已有多种在噬菌体表面展示抗体或抗体片段以及筛选文库的方法，参见例如邵荣光等人(编辑)，抗体药物研究与应用，人民卫生出版社(2013)。例如，可以通过磁珠分选(MACS)方法进行噬菌体展示文库筛选。例如可以将呈递完整抗体或抗体片段的噬菌体群，接触生物素化的靶抗原和链霉亲和素磁珠在液相中孵育一段时间、之后洗涤、借组磁场作用富集与靶抗原结合的噬菌体，之后洗脱噬菌体并进行扩增。经过数次“吸附-洗脱-扩增”后，对获得的特异性结合抗原的噬菌体进行克隆并测序。
也可以利用表达人免疫球蛋白库的转基因动物，如转基因小鼠来筛选与目标抗原以高亲和力结合的全人源抗体。例如，可以用目标抗原免疫免疫所述转基因小鼠，之后获取小鼠的脾脏并与骨髓瘤细胞融合，筛选产生所需抗体的杂交瘤并进行测序。
对于抗体的鉴定，可以就其抗原结合活性，例如通过已知方法，如ELISA、αLISA、蛋白质印迹、抗体或反相阵列等、以及实施例中所述的方法，鉴定或表征本发明的抗体。
例如，可以将抗体点在玻璃或硝基纤维素芯片上。用含有CD30的溶液阻断并孵育载玻片，洗涤以除去未结合的抗体，并用荧光标记的相应二抗检测结合的抗体。通过荧光载玻片扫描仪测量荧光信号。相似地，对于反相阵列，将重组CD30、细胞上清液、细胞或组织裂解液、体液等，点在玻璃或硝基纤维素芯片上。封闭载玻片并用针对CD30上特定表位的抗体孵育阵列。洗掉未结合的抗体，并用荧光标记的相应二抗检测结合的抗体。荧光信号通过荧光载玻片扫描仪来测量(Dernick，G.等，J.Lipid Res.，52(2011)2323-2331)。
也可以采用ForteBio测定法，检测抗体。ForteBio亲和力测定可以按照现有的方法(Estep，P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigenaffinity and epitope binning.MAbs，2013.5(2)：p.270-8)进行。例如，可以利用AHC(抗hIgG-Fc捕获表面)传感器，进行scFv-hFc抗体和抗原分子相互作用的动力学分析。
也可以通过流式细胞术检测抗体与表面表达CD30的细胞的结合。例如，可以将表达CD30的Karpas299细胞与系列稀释的抗体孵育一段时间(例如4℃，30分钟)。之后与二抗(例如藻胆色素标记的二抗)孵育一段时间(例如4℃，30分钟)。洗涤细胞后通过流式细胞术分析细胞。流式细胞术可以在Accuri C6系统(BD Biosciences)上进行，并利用Graphpad软件计算EC50值。
E.融合物和缀合物
再一方面，本发明提供包含本发明抗体的融合物或缀合物。可以通过将本发明抗体融合或缀合于异源分子而产生融合物或缀合物。在一些实施方案中，本发明抗体多肽可以与一个或多个异源分子融合或缀合，其中所述异源分子包括但不限于蛋白/多肽/肽、标记物、药物、和细胞毒性剂。蛋白质、多肽或肽或化学分子与抗体融合或缀合的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,336,603、5,622,929和EP 367，166。
在一个实施方案中，本发明抗体与异源蛋白或多肽或肽重组融合而形成融合蛋白。在再一实施方案中，本发明抗体与蛋白分子或非蛋白分子缀合而产生缀合物。
在一些实施方案中，本发明抗体可以以全长抗体或抗体片段的形式与异源分子融合或缀合。在一个优选的实施方案中，本发明单链scFv抗体用于融合或缀合。在进一步优选的实施方案中，提供包含本发明单链scFv的融合蛋白。这样的融合蛋白可以容易地通过本领域已知的重组方法进行制备。在再一优选的实施方案中，提供包含本发明单链scFv的缀合物，例如，包含本发明的scFv与非蛋白药物分子的缀合物。
接头可以用于共价连接本发明融合物和/或缀合物中的不同实体。接头包括化学接头或单链肽接头。在一些实施方案中，本发明单链抗体，例如scFv抗体，通过肽接头融合到其它肽段或蛋白质上。在一些实施方案中，本发明单链抗体，例如scFv抗体，通过化学接头缀合到其它分子例如标记物或药物分子上。
可以用于形成本发明的肽接头包括由氨基酸残基组成的肽。这样的接头肽通常是柔性的，允许与之连接的抗原结合部分如scFv独立地移动。接头肽的长度可以是由本领域技术人员根据实际情况而容易地确定，例如长至少4-15个氨基酸，或者更长，例如大约20-25个氨基酸。
可以用于形成本发明的化学接头，包括，例如，各种偶联剂。偶联剂的实例有N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(如己二亚胺酸二甲基酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二叠氮化合物(如二(对叠氮基苯甲酰)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对二重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(如，1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。此外，接头可以是利于多肽在递送至靶位点后释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等，Cancer Research 52(1992)127-131；US 5,208,020)。
F.用于诊断和检测的方法和组合物
在一方面，本发明提供本发明抗CD30抗体、融合物或缀合物在诊断和检测中的用途。本文中提供的任何抗CD30抗体、融合物或缀合物均可以用于检测生物样品中人CD30的存在。本文中使用的术语“检测”包括定量或定性检测。示例性的检测方法包括但不限于，免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在一些实施方案中，生物样品包括体液、细胞或组织。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。
在一个实施方案中，提供了抗CD30抗体、融合物或缀合物用于诊断、预后或检测方法。在进一步的方面中，提供了检测生物样品中CD30存在的方法。在一些实施方案中，该方法包括将生物样品在允许抗CD30抗体、融合物或缀合物与CD30结合的条件下接触本文中所述的抗CD30抗体、融合物或缀合物，并且检测抗CD30抗体、融合物或缀合物和CD30之间是否形成了复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。
在一些实施方案中，可以使用本发明的抗体诊断或预后CD30相关病症，其中示例性病症包括例如经典霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤等。经典霍奇金淋巴瘤的里斯氏细胞(Reed-Sternberg)细胞表达CD30和CD15。缺乏CD30和CD15表达可以将结节性淋巴细胞优势型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)与经典霍奇金淋巴瘤分开。CD30表达也是ALCL的必要特征，包括ALK阳性和ALK-阴性ALCL。此外，淋巴瘤样丘疹病(LymphomatoidPapulosis，LyP)也具有CD30的特征性表达。已经报道，在来自间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金病患者的血清中，增加的可溶性CD30水平与不良的预后相关(Younes & Kadin，2003，Journal of ClinicalOncology，21(18)：3526-3534；Al-Shamkhani，2004，Current Opinion in Pharmacology，4：355-359)。
在一些实施方案中，抗CD30抗体、融合物或缀合物可以用于选择适宜使用抗CD30抗体治疗的受试者。在一些实施方案中，提供了用本发明的抗体、融合物或缀合物对患者进行分层的方法，所述方法包括确定所述患者的细胞、例如肿瘤细胞是否在所述细胞的表面上表达CD30蛋白，其中所述细胞在其表面上表达CD30蛋白，则所述患者将可能响应并使用以CD30为靶点的治疗剂(例如抗-CD30抗体)进行治疗。
在一些实施方案中，抗CD30抗体可以与诊断剂或可检测剂缀合。在一些实施方案中，本发明提供用于诊断或检测的试剂盒，其包含本发明的任何抗CD30抗体、融合物或缀合物。
G.用于治疗的方法和组合物
再一方面，本发明涉及治疗CD30相关病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段、或本发明的缀合物或融合物。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，受试者是人。
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。
CD30相关病症是与CD30或表达CD30的细胞(尤其是瘤性细胞)介导或相关的病症，包括，但不限于，CD30阳性肿瘤、自身免疫疾病。可以使用CD30抗体治疗的示例性病症包括例如，霍奇金病、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、血清免疫母细胞性淋巴结病样T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、蕈样肉芽肿病(MF)、淋巴瘤样丘疹病(LyP)、免疫母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
如实施例中所示，本发明人基于筛选自人抗体库的抗体序列而构建本发明的抗体。因此，有利地，在一些实施方案中，本发明抗体是包含全人源的VH区和全人源的VL区氨基酸序列的全人抗体，例如表A中所示的抗体、以及表C所示的单链scFv及由其构建的包含人hFc片段的scFv-Fc抗体。在一些实施方案中，本发明缀合物和融合物是包含全人抗体，例如全人单链scFv的缀合物和融合物。因此，在一个优选的方面，本发明的抗体、融合物和缀合物尤其适用于人的治疗应用。在一些优选的实施方案中，本发明抗体、缀合物和融合物用于治疗人的CD30相关病症，如CD30阳性肿瘤或涉及表达CD30的免疫细胞的自身免疫疾病，优选地，霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
在一些实施方案中，本发明抗CD30抗体、缀合物或融合物的施用在体内导致对表达CD30的肿瘤细胞的生长抑制作用或杀伤作用。这样的肿瘤细胞包括，例如，霍奇金细胞、里-斯氏细胞(Reed-Sternberg cells)、HRS细胞、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)细胞、皮肤T细胞淋巴瘤细胞、多形性和免疫母细胞性淋巴瘤细胞。在一个特定的实施方案中，本发明人抗体或包含其的缀合物或融合物用于霍奇金淋巴瘤(尤其是经典霍奇金淋巴瘤)治疗中抑制/介导杀伤霍奇金细胞和里斯氏细胞。在另一特定实施方案中，本发明人抗体或包含其的缀合物或融合物用于ALCL治疗中抑制/介导杀伤CD30阳性ALCL肿瘤细胞。
可以理解，可将本发明的CD30抗体、或本发明的缀合物或融合物与其它治疗形式组合施用，用于上述疾病例如肿瘤的治疗。所述其它治疗形式包括治疗剂、放疗、化疗、移植、免疫疗法等。在一些实施方案中，本发明抗体分子、或本发明的缀合物或融合物与其它治疗剂联合使用。示例性的治疗剂包括细胞毒性剂、放射性毒素、免疫抑制剂、细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化疗剂、放疗剂、治疗性抗体或者其它活性剂和辅助剂，例如抗肿瘤药物。在一些实施方案中，本发明抗体分子与治疗剂缀合，例如与细胞毒素或放射性同位素缀合。
H.组合物和制剂
本发明还考虑包含本文任一种或多种CD30结合抗体分子、融合物、缀合物、多核苷酸、载体、或宿主细胞的组合物。组合物包括但不限于药物组合物。药物组合物可以用于向细胞或动物单独施用或者与一种或多种其它治疗形式组合施用。
可以制备本发明抗体或融合物或缀合物的药物制剂，例如通过使具有所需纯度的抗体、融合物或缀合物，与一种或多种任选的药学可接受的载体(Remington’sPharmaceutical Science，第16版，Osol，A.(编辑)(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学可接受的载体在采用的剂量和浓度下对接受者一般是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
示例性冻干抗体制剂描述于US 6,267,958。水性抗体制剂包括US 6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后面的制剂包括组氨酸-醋酸盐缓冲液。
本文中的制剂还可以针对所治疗的特定适应症按照需要含有一种以上的活性成分，优选具有互补活性且不会不利地彼此影响的那些。此类活性成分适于以对于预期目的有效的量组合存在。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1.利用转基因小鼠筛选抗CD30全人源抗体
采用杂交瘤技术，用重组人的CD30蛋白(Acro，货号：CD0-H5229)免疫HarbourH2L2转基因小鼠(厂家：北京维通利华实验动物技术有限公司；许可证号：SCXK(京)2016-0006)，然后获取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，获得能够表达CD30抗体的杂交瘤细胞。具体过程如下。
免疫转基因小鼠：佐剂Ribi(厂家：Sigma；货号：S6322；批号：077M4061V)，与huCD30蛋白等体积混合，按每只小鼠(共5只)50μg/200μl进行免疫，其中100μl皮下两点注射，100μl腹腔注射。每两周免疫一次，一共免疫5次。在融合前3天，按每只小鼠50μg/300μlhuCD30蛋白的剂量，腹腔注射，用于后续融合实验。
电融合皿准备：用70％乙醇彻底浸泡电融合皿，并于超净台中吹干备用。
分离脾细胞：颈脱位将小鼠处死，用75％酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基(配制方法如下表1)洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。随后将脾脏转移到另一个盛有基础培养基的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。细胞悬液经70μM细胞筛网过滤后用30ml基础培养基洗一遍，1200rpm离心6min。
表1：基础培养基
裂解红细胞：去除离心脾细胞悬液后的上清，用10mlRBC裂解缓冲液(GIBCO)重悬细胞。然后再加入20ml RBC裂解缓冲液。悬液静置5min后1100rpm离心6min。去上清后用10ml基础培养基重悬细胞，然后再加入30ml基础培养基，1100rpm离心6min。去除上清后，细胞重悬于20ml基础培养基中并计数。
电融合：用20ml基础培养基重悬小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC)并计数。将SP2/0和裂解红细胞后的脾细胞以1∶2～1∶1的比例混合，1000rpm离心6min。去除上清后将混合的细胞重悬于10ml融合缓冲液(BTXpress)中。再加入15ml融合缓冲液，1000rpm离心5min，去除上清。重复上述步骤一遍后，加入适量体积的融合缓冲液重悬细胞，调整混合细胞密度至1×107个细胞/ml。电融合仪的参数设置如下表6。每个电融合皿中加入2ml上述细胞悬液进行电融。
电融合仪参数设置
| 条件： | 小鼠(SP2/0-ECF-F) |
| Alignment： | 60v，30sec |
| Membrane breaking： | 1500V，30μs，3X |
| Post-fusion pulse： | 60V，3sec |
电融合后铺板：细胞于电融合皿中室温静置5min。将细胞转移入离心管中，用筛选培养基(配制方法如下表2)稀释细胞至1～2×104个细胞/ml。96孔板中每孔加入100μl细胞悬液。融合后第7天更换筛选培养基。培养第10天(或更久，根据细胞生长状态)后以细胞流式检测法(FACS)筛选出表达特异性抗CD 30抗体的杂交瘤细胞。
表2 筛选培养基
阳性杂交瘤细胞亚克隆：
亚克隆步骤：准备一块96孔板，第2至第8排每孔加入200μl如上所述的基础培养基。将上述融合筛选出的阳性孔的细胞，按约1×105个/ml的密度，分别取300ul加入到第一排的每个孔中。用排抢，将第1排细胞悬液取100μl加入第2排，充分混匀后取100μl加入下一排。重复上述步骤，直至最后一列体积变为300μl；静置96孔板15min，显微镜下观察计数。取100个细胞对应的体积加入20ml如上所述的基础培养基中，并混匀铺板，每孔200μl。一周后显微镜下观察，判断并标记出单克隆孔，待测挑出阳性孔。
细胞冻存：观察细胞状态，等细胞生长良好，活力＞90％时，1000rpm离心5min，去除上清。用冻存液(45.5％FBS(Hyclone)，44.5％RPMI-1640(Hyclone)，10％DMSO)重悬细胞至1×107个细胞/ml，分装至冻存管，放入程序降温盒中，-80℃冻存。
杂交瘤测序：
利用NucleoSpin RNA Plus(Macherey-Nagel，货号740984.250)试剂盒进行RNA抽提：取新鲜细胞1000rpm离心5min，去除上清，沉淀中加入350μl细胞裂解缓冲液LBP，混匀至澄清。加入到DNA去除管中，11000rpm离心30s，收集流穿液。向流穿液中加入100μl结合液BS，混匀至澄清。将澄清的溶液加入到RNA收集管中，11000rpm离心1min，去除液体，加入200μl洗涤液WB1，11,000rpm离心15s，弃去液体；将RNA柱打开盖子并移至新的收集管中，加入600μl洗涤液WB2，11,000rpm离心15s，弃去液体；加入250μl洗涤液WB2，11,000rpm离心2min，弃去液体；离心彻底挥发去除乙醇后，向收集柱中加入30μl DEPC水，12000g离心2min，收集洗脱液。测定RNA浓度。
利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录获得cDNA，步骤如下(所提及试剂均来自该试剂盒)：
配制反应体系I如下表3
表3：反应体系I
65℃温育5min后，迅速置冰上冷却。将反应体系I加入到下列反转录体系(表4)，总量为20μl：
表4：反转录体系
缓慢混匀后按下列条件进行反转录翻译：42℃ 60min→95℃ 5min，然后放冰上冷却，获得cDNA。
采用Mighty TA-cloning Kit试剂盒(Takara)，将cDNA连接T载体，步骤如下：
PCR分别扩增重链和轻链可变区。PCR反应体系如下表5所示。
表5：PCR反应体系
PCR反应条件如下表6所示。
表6：PCR反应条件
PCR反应所用引物如下表7和8所示。
表7.CD30抗体的重链可变区(VH)引物(Primer Mix 1)
上述引物按等比例混合后，获得Primer Mix1用于VH的PCR扩增。
表8.CD30抗体的轻链可变区(VL)引物(Primer Mix 2)：
上述引物按等比例混合后，获得Primer Mix 2用于VL的PCR扩增。
取4.5μl上述PCR反应获得的PCR产物，加入0.5μl pMD20-T载体(Takara)，5μlLigation Mighty Mix(Takara)，轻轻混匀，于37℃反应2h，获得连接产物。
转化细胞：
-80℃取出TOP10感受态(天根生化科技(北京)有限公司)，冰上融化，取上述获得的连接产物5μl加入到融化的TOP10感受态中，混匀后冰上孵育30min。42℃热激90s后迅速冰上冷却2min，向EP管中补加900μl LB培养基(生工生物工程(上海)股份有限公司)，37℃，220rpm摇床培养1h。3000g离心2min，吸除800μl上清，用剩余的培养基将菌体重悬并涂布在氨苄青霉素抗性的平板上。于37℃培养过夜，挑克隆测序，分析后获取杂交瘤中VH和VL的序列。最终获得10个抗体，HB38E4、HB10F1、HB49G9、HB36F7、HB68H2、HB69G7、HB10B6、HB16H7、HB6A9、HB16H8，其序列见表A。
实施例2.噬菌体(phage)展示技术筛选抗CD30的全人源抗体
利用转基因小鼠产生抗CD30的全人源抗体外，还同时利用噬菌体展示技术制备抗体。从总的多样性大于1×1010的6个合成抗体库IBSal中筛选特异性结合CD30的全人源抗体(库的设计和构建可以参见Raffi Tonikian et al.Nature Protocols，2007和ThomasA.Kunkel.Current Protocols in Molecular Biology，1987)。
筛选通过磁珠分选方法(MACS)并利用生物素标记的、与Fc融合的重组人CD30筛选6个不同的合成抗体库来完成。具体流程如下：
1.筛选用Input Phage(投入噬菌体)的制备
投入50-100倍库容的冻存菌，接菌时使OD值至0.05，37℃ 200rpm培养至OD值达到0.5时，加入5×109cfu/ml的helper phage(辅助噬菌体)M13K07，摇匀，先37°静置20-30min，再37°、200rpm培养30min，最后30℃培养20h。收集噬菌体，作为第一轮的inputphage。
2.Panning(淘选)
取50ul磁珠(Thermo，货号815-968-0747)，用PBS洗4遍；用含3％BSA的PBS室温转动封闭2h。将磁珠与生物素标记的CD30/Avitag蛋白(Acro，货号CD0-H82E6)结合，室温，旋转，温育1小时。
将上面处理好的磁珠与步骤1的input phage结合，室温旋转，温育1.5-2小时。然后用0.05％PBST洗8-10次，最后用0.5ml 0.1M盐酸-甘氨酸洗脱液洗脱，再用2M Tris中和。
3.Phage侵染
取一半体积的phage洗脱液侵染对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue菌液，37℃，200rpm培养20min，然后涂琼脂平板。第二天刮板，3000rpm、5min离心，然后20％甘油-2×YT培养基重悬，测OD值。
2×YT培养基配(1L)制见表9。
表9：2×YT培养基
然后过夜产生噬菌体，方法同上面的步骤1。步骤1-3如此循环四轮。
完成上述4轮panning(淘选)后，通过Elisa检测发现第四轮后有阳性信号明显富集，将富集的含有特异抗体序列的噬菌体群体涂在琼脂平板上，能够得到包含特定抗体基因的噬菌体克隆菌落。挑取单克隆，进行单个噬菌体克隆的Elisa检测。将Elisa阳性的克隆进行测序，大约有37个序列不同的抗体。
后续将这37个抗体进行scFv-hIgG抗体形式的构建(方法同实施例3)，所得质粒瞬时转染6孔板，5天后取表达上清进行Elisa验证。Elisa阳性的克隆，再进行Fortebio检测(方法同实施例5)。选取2个亲和力较好的克隆P5E10和P27B3，同实施例1中利用转基因小鼠通过杂交瘤产生的10个候选克隆一起大量表达纯化。
此2株抗体分子P5E10和P27B3的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列在上表A中给出。
实施例3.scFv-hFc重组单链抗体表达载体的构建
为验证scFv形式候选抗体与靶抗原CD30的亲和力，分别构建了上述实例1和实例2中获取的抗体的单链抗体可变区(scFv)与人Fc片段的重组蛋白表达载体。同时，也构建了相同形式的两个阳性对照抗体V2AC10和XL。表C给出了构建的scFv-Fc重组蛋白的氨基酸序列及其对应的编码核苷酸序列。两个阳性对照抗体可变区氨基酸序列见图8。
图1中显示了载体构建的示意图。具体构建过程以其中一个抗体(HB69G7)序列举例说明如下：
使用表10所示上下游引物序列和表11所示PCR反应体系，PCR扩增VH及VL区。
表10.PCR扩增所用引物：
表11.PCR体系
*对于VH链扩增，应用Primer F1，Primer R1；对于VL链扩增，应用Primer F2，Primer R2。
PCR扩增产物进行核酸电泳，收获目的条带，使用表12所示的反应体系进行overlap PCR。
表12.Overlap PCR体系：
PCR扩增产物进行核酸电泳，目的条带进行回收，用于后续同源重组。
使用表13所示同源重组体系，实施同源重组反应。
表13.同源重组体系
*：基于pTT5载体构建，插入了hFc编码序列。
37℃反应30min，获得重组产物。重组产物转化TOP10感受态，并挑取单克隆测序，选择包含插入方向正确的质粒的克隆作为阳性克隆，甘油管保存阳性克隆。
实施例4.scFv-hFc重组单链抗体的表达
1.根据所需转染体积传代HEK293细胞，转染前一天将细胞密度调整至1.2×106/ml。
2.取3mL Opti MEM培养基(Gibco，31985-070)作为转染缓冲液，分别上述相应携带scFv-hFc重组单链抗体编码基因的质粒30μg，混匀后过滤静置5min。
3.加90μL的1mg/mL聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，23966)到质粒-Opti MEM混合液中，混匀后室温孵育15min。将混合物轻柔倒入细胞，36.5℃，8％CO2培养。
4. 20h后补加0.6mL的200g/L的FEED(大豆蛋白胨Phytone Peptone(BD，211906)与植物蛋白胨Phytone(BD，210931)等比例)，0.3mL的200g/L的葡萄糖母溶液，30μL的2.2M丙戊酸钠盐(VPA)(Sigma，P4543)。
5.继续培养至活力低于60％，收集上清，过滤后作亲和层析纯化。
实施例5.蛋白A法纯化scFv-hFc重组单链抗体
1.用超纯水冲洗填料及重力柱，去除填料保护液。
2.用0.1M NaOH将填料浸泡2h，每根重力柱添加浸泡后的300μL蛋白A亲和层析介质(Mabselect sure)(GE Healthcare，17-5438-03)填料。
3.细胞料液以8000r/min离心40min，再使用0.45μm滤器过滤，4℃保存备用。
4.用大量超纯水冲洗重力柱和填料，去除碱液。
5.纯化前用10ml结合/清洗缓冲液(20mM Tris+150mM NaCl(pH7.2))平衡填料。
6.上样，将需要纯化的上清通过柱子。
7.冲洗，用5～10ml结合/清洗缓冲液(20mM Tris+150mM NaCl(pH 7.2))冲洗填料，去除非特异性结合蛋白。
8.洗脱，用1mL的洗脱缓冲液(100mM柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液，pH3.5)冲洗填料，收集特异性结合蛋白。
9.在收集液中按85μl/ml的比例加入中和缓冲液(2M Tris)，调节pH至6～7。
实施例6.scFv-hFc重组单链抗体的Fortebio检测
基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉技术(BLI)，测定抗体分子的动力学常数。
BLI的基本原理是：当生物分子结合到传感器表面就形成了一层生物膜，生物膜对透过传感器的光的波形造成干涉现象，干涉现象以相位移动的方式被检测，从而可以检测结合到传感器分子数量的变化；根据实时响应值的变化拟合出动力学曲线，并计算出结合常数(Kon)、解离常数(Kdis)、亲和力(KD)。
我们所选用的Fortebio设备型号为Octet Red96，ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep，P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs，2013.5(2)：p.270-8)进行。具体流程为：
1.实验开始前半个小时，根据样品数量，取合适数量的AHC Sensor浸泡于SDbuffer(50ml PBS+0.1％BSA+0.05％Tween-20)中。
2.取100μl的SD buffer、scFv-hFc抗体、人CD30-His抗原(ACRO BIOSYSTEMS，BCA-H522Y)，分别加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板中。
3.根据样品位置布板，选择sensors位置，设置运行步骤及时间：Baseline、Loading～1nm、Baseline、Association和Dissociation时间取决于样品结合、解离速度；转速为1000rpm，温度为30℃。
4. 12个scFv-hFc重组单链抗体与人CD30-His亲和力检测结果详见表14。
此外，利用ForteBio进行表位测定。首先将生物素化的CD30固定在SA传感器的表面，然后用高浓度(300-500nM)对照抗体结合CD30至饱和，最后用100nM其他竞争抗体结合CD30。若竞争抗体有结合信号，说明竞争抗体和对照抗体与CD30结合表位不同，若竞争抗体无结合信号，说明竞争抗体和对照抗体与CD30结合表位相同。
先将两个对照抗体XL和V2AC10进行竞争性结合，结果显示它们不是同一个表位(Bin)。将对照抗体XL与抗原的结合表位定义为Bin1，对照抗体V2AC10与抗原结合的表位定义为Bin2，结果如表14所示。P5E10和P27B3抗体与对照抗体XL同为Bin1；HB38E4、HB10F1和HB49G9抗体与对照抗体-V2AC10同为Bin2；HB36F7、HB68H2、HB69G7、HB10B6、HB16H7和HB6A9抗体与两个对照抗体都不属于同一个抗原结合表位，定义为Bin3。其中HB16H8抗体和两个对照抗体的结合表位都有一定的重叠，定义为1/2Bin。表位检测结果详见表14。
表14.scFv-hFc与人CD30-His亲和力和Bin的Fortebio检测结果
由上表数据可见，12株单链抗体与单价人源CD30(CD30-His)的亲和力(KD值)范围在30nM到1nM之间。其中，HB49G9和P5E10两株单链抗体与CD30-His的亲和力比两个阳性对照抗体都强。表位竞争性结合实验数据表明，我们筛选得到的抗体既涵盖对照抗体的结合表位，也涵盖其他表位，说明筛选得到的抗体多样性高。
实施例7.scFv-hFc重组单链抗体与Karpas299亲和力的检测
scFv-hFc融合抗体制备完成后，使用CD30+人间变性大细胞淋巴瘤细胞Karpas299，进一步对单链抗体的细胞结合作了验证。具体方法如下：
1.取人Karpas299(生物风biofeng.com，Cat#3135)细胞，调整细胞密度为2×106/ml，在96孔微孔板中每孔100μl，400G离心5min，去上清。
2.将scFv-hFc抗体从400nM浓度起始，在含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中以3倍梯度连续稀释共12个点，每孔加入100μl稀释的抗体，4℃孵育30min；
3. 400G离心5min，加入PBS洗两次，每孔加入100μl稀释在PBS(1％BSA)中的二抗((藻胆色素蛋白(Phycoerythrin，PE)标记的羊抗人IgG抗体，SoutherBiotech，终浓度5μg/ml)，4℃孵育30min(避光)；
4. 400G离心5min，加入PBS洗两次，每孔100μl PBS重悬细胞。在Accuri C6系统(BD Bioscience)上进行流式细胞术，检测PE阳性信号，并基于C6软件计算MFI。用GraphPad软件计算EC50值。
检测结果如图2和下表15所示。由图中结果可见，除阴性对照IgG4抗体外，12株单链抗体都表现出与Karpas299细胞结合，亲和力EC50值范围在70nM至0.4nM之间。
表15：单链抗体与Karpas299细胞的亲和力(EC50值)
| 抗体名称 | EC50(nM) |
| HB38E4 | 17.64 |
| HB10F1 | 2.891 |
| HB49G9 | 4.22 |
| HB36F7 | 13.12 |
| HB68H2 | 7.316 |
| HB69G7 | 28.88 |
| HB10B6 | 0.4311 |
| HB16H7 | 7.497 |
| HB6A9 | 13.8 |
| HB16H8 | 9.789 |
| P5E10 | 7.06 |
| P27B3 | 63.23 |
| 对照抗体-V2AC10 | 7.687 |
| 对照抗体-XL | 1.105 |
序列表描述
Claims (37)
1.一种分离的特异性结合CD30的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含3个重链互补决定区HCDR以及3个轻链互补决定区LCDR，其中：
（a）HCDR1为SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，HCDR2为SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，HCDR3为SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，LCDR1为SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，LCDR2为SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且LCDR3为SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；或
（b）HCDR1为SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，HCDR2为SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列，HCDR3为SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列，LCDR1为SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列，LCDR2为SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，且LCDR3为SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH，所述VH选自：
(a)包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列、或相对于其包含不超过10个或不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列的VH；或
(b)包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列、或相对于其包含不超过10个或不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列的VH。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区VL，所述VL选自：
(a)包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列、或相对于其包含不超过10个或不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列、或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列、或相对于其包含不超过10个或不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列的VL。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH和VL选自：
(a)包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列的VL。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列的重链可变区VH和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链可变区VL。
6.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:74所示的氨基酸序列的重链可变区VH和SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的轻链可变区VL。
7.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：
(i) 以高亲和力与人CD30结合，其中KD值为小于10nM；
(ii) 以高亲和力与细胞表面表达的人CD30结合，其中EC50值为小于10nM；
(iii) 与人CD30结合的解离速率常数(Kdis)为 5x10-4s-1至1x10-4s-1；
(iv) 与人CD30的胞外域ECD上的表位特异性结合。
8.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是全人源抗体。
9.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单链抗体。
10.权利要求9的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单链scFv抗体，其中所述单链scFv包含：从N端到C端，VL结构域-接头-VH结构域，或VH结构域-接头-VL结构域。
11.权利要求10的抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含1个至25个氨基酸长、或5个至20个氨基酸长、或10个至20个氨基酸长。
12.权利要求11的抗体或其抗原结合片段，其中所述接头为15-20个氨基酸长。
13.权利要求11的抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含SEQ ID NO: 157所示的氨基酸序列。
14.权利要求10-13任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述单链scFv抗体包含SEQID NO: 127或142的氨基酸序列、或与其具有至少85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列、或相对于其包含至少一个但不超过30、20或10个氨基酸改变的氨基酸序列。
15.一种分离的特异性结合CD30的抗体， 其中所述抗体包含权利要求10-14任一项的单链scFv抗体和Fc区。
16.权利要求15的抗体，其中所述单链scFv通过铰链区与Fc区连接。
17.权利要求16的抗体，其中铰链区为CD8铰链区。
18.权利要求16的抗体，其中铰链区包含SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:159的氨基酸序列包含至少一个，两个或三个，但不超过5个氨基酸改变的氨基酸序列。
19.权利要求15的抗体，其中所述Fc区是人IgG1 或IgG4 Fc区。
20.权利要求19的抗体，其中所述Fc区是低或无岩藻糖基化的。
21.权利要求15-20任一项的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 129或144的氨基酸序列、或相对于其包含至少一个但不超过30个、20个或10个氨基酸改变的氨基酸序列，或与其具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列。
22.分离的核酸，其编码权利要求1至21中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段。
23.包含权利要求22的核酸的载体。
24.权利要求23的载体，其中所述载体是表达载体。
25.包含权利要求23或24的载体的宿主细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母细胞或哺乳动物细胞。
27.制备权利要求1至21中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适于表达所述抗体或其抗原结合片段的条件下，培养权利要求25或26的宿主细胞。
28.包含权利要求1-21之任一项的抗体的缀合物或融合物。
29.药物组合物，其包含权利要求1至21中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，或权利要求28的缀合物或融合物，以及任选地药用载体。
30.权利要求29的药物组合物，其还包含一种或多种其它治疗剂。
31.一种检测样品中CD30的用于非诊断目的的体外方法，包括：
(a)将所述样品与权利要求1至21中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段、或权利要求28的缀合物或融合物接触；和
(b)检测所述抗体或其抗原结合片段或缀合物或融合物和CD30蛋白之间复合物的形成。
32.权利要求1至21中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段、或权利要求28的缀合物或融合物在制备用于检测样品中CD30的试剂盒中的用途。
33.权利要求1-21中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段、权利要求28的缀合物或融合物、或权利要求29或30的药物组合物在制备用于治疗CD30相关病症的药物中的用途。
34.权利要求33的用途，其中所述CD30相关病症为表达CD30的肿瘤。
35.权利要求34的用途，其中所述肿瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
36.权利要求34的用途，其中所述CD30相关病症选自霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)。
37.权利要求34的用途，其中，所述CD30相关病症选自间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、和皮肤T细胞淋巴瘤。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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