CN1638800B - 抗cd30的人类单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了分离的与CD30(如人类CD30)结合的人类单克隆抗体。人类抗体可在非人类的转基因动物如转基因小鼠中产生，该转基因动物能够通过V-D-J重组和同种型转换而产生多种人类单克隆抗体同种型。同样公开的是人类抗体的衍生物(如双特异性抗体和免疫偶联物)、包含人类抗体的药物组合物、产生人类抗体的非人类转基因动物和杂交瘤，以及应用人类抗体的治疗和诊断方法。

Description

抗CD30的人类单克隆抗体
相关申请 
本申请要求于2002年1月9日提交的美国序列号60/347649、于2002年8月19日提交的美国序列号60/404427和于2002年12月6日提交的美国序列号60/431684的优先权，在此处将其内容整体引入作为参考。 
发明背景 
CD30细胞表面分子是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族的一个成员。该分子家族在其成员中具有不定的同源性，且包括神经生长因子受体(NGFR)、CD120(a)、CD120(b)、CD27、CD40和CD95。这些分子一般特征在于在胞质外区域中存在多个富含半胱氨酸的重复(de Bruin，P.C.等人，Leukemia 9：1620-1627(1995))。据认为该家族中成员对于调节淋巴细胞的增殖和分化是至关紧要的。 
CD30是具有6个(人类)或3个(鼠和大鼠)富含半胱氨酸的重复的I型跨膜糖蛋白，且具有1个中央铰链序列。CD30以从90kDa的细胞间前体蛋白发展来的120kDa膜分子存在。它作为约90kDa的可溶性蛋白质(sCD30)从细胞表面释放。sCD30的释放作为有生活力的CD30细胞的活性过程发生，且不仅仅由从垂死或死亡细胞中的释放引起。已通过用单克隆抗体Ki-1和Ber-H2进行免疫筛选而从HLTV-1人类T-细胞系HUT-102的表达文库中克隆了编码CD30蛋白质的cDNA(Schwab，U.等人，Nature 299：65(1982))。已发现小鼠和大鼠CD30 cDNA分别编码498和193个氨基酸。人类CD30 cDNA编码额外的90个氨基酸，其中部分是一个富含半胱氨酸的结构域的重复。CD30基因已定位于人类中的1p36和大鼠中的5q36.2。 
CD30优选地由活化的淋巴样细胞表达。特定地，依赖于细胞类型、分化阶段和其他刺激的存在，淋巴样细胞中CD30的刺激已显示可诱导多效的生物学作用，包括增殖、活化、分化和细胞死亡(Gruss，H.J.等人，Blood 83：2045-2056(1994))。CD30最初通过单克隆抗体Ki-1进行鉴定，该单克隆抗体与表达于何杰金氏病的何杰金氏和 Reed-Sternberg细胞上的抗原反应(Schwab等人，Nature 299：65(1982))。因此，CD30广泛用作何杰金氏淋巴瘤和相关的血液恶性肿瘤的临床标记(Froese等人，J.Immunol.139：2081(1987)；Carde等人，Eur.J.Cancer 26：474(1990))。 
随后显示CD30表达于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的亚型上，包括伯基特淋巴瘤、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T-细胞淋巴瘤、结节性小切割的细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、Lennert氏淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-细胞淋巴瘤(T-ALL)和内分芽型/中央细胞(centrocytic)(cb/cc)滤泡淋巴瘤(Stein等人，Blood 66：848(1985)；Miettinen，Arch.Pathol.Lab.Med.116：1197(1992)；Piris等人，Histopathology 17：211(1990)；Burns等人，Am.J.Clin.Pathol.93：327(1990)和Eckert等人，Am.J.Dermatopathol.11：345(1989))，以及几种病毒转化的品系，如人类T-细胞嗜淋巴细胞病毒I或II(human T-Cell Lymphotrophic Virus I or II)转化的T-细胞和EB病毒(Epistein-Barr virus)转化的B-细胞(Stein等人，Blood 66：848(1985)；Andreesen等人，Blood 63：1299(1984))。此外，在分化晚期也在胚胎性瘤、非胚胎性瘤、恶性黑素瘤、间充质肿瘤和骨髓细胞系和巨噬细胞中记录到了CD30表达(Schwartting等人，Blood 74：1687(1989)；Pallesen等人，Am.J.Pathol.133：446(1988)；Mechtersheimer等人，Cancer 66：1732(1990)；Andreesen等人，Am.J.Pathol.134：187(1989))。 
由于正常个体中CD30-阳性细胞的百分比相当小，所以CD30在肿瘤细胞中的表达使其成为抗体介导的治疗的重要目标，以特异性地将治疗剂导向CD30-阳性的孳生性细胞(Chaiarle，R.等人，Clin.Immunol.90(2)：157-164(1999))。然而，尽管迄今获得的结果清楚地确定CD30是免疫治疗的有用目标，但该结果也显示目前可用的鼠抗体未构成理想的治疗剂。 
因此，存在对改进治疗性抗CD30抗体的需要，该抗体对于治疗和/或预防由CD30介导的疾病是有效的。 
发明概述 
本发明提供了单独的与人类CD30结合的分离的人类单克隆抗体，以及单独的衍生物(如免疫偶联物和双特异性分子)和其他含有该抗体的治疗组合物，或者与额外治疗剂的组合。同样提供的是应用本发明的抗体和组合物治疗多种CD30介导的疾病的方法。 
本发明的人类抗体与CD30结合，并抑制CD30的功能(和CD30介导的作用)和/或抑制表达CD30的细胞的生长(如介导杀伤)，该细胞如肿瘤细胞和免疫疾病中包括的细胞。这种细胞包括如骨髓细胞、肝细胞、淋巴结细胞、皮肤细胞、脾细胞、胸腺细胞、扁桃体细胞、蜕膜细胞、子宫内膜细胞、何杰金氏细胞、Reed-Sternberg细胞、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)细胞、多形的和免疫母细胞淋巴瘤细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。在一个特定的实施方案中，人类抗体用于在淋巴瘤的治疗中抑制何杰金氏细胞的生长/介导杀伤何杰金氏细胞。 
在本发明的一个实施方案中，人类抗体通过在人类效应细胞(如单核细胞或单核的细胞)存在时诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)而抑制肿瘤细胞生长/介导杀伤肿瘤细胞。在另一个实施方案中，人类抗体在巨噬细胞存在时诱导表达CD30的肿瘤细胞的吞噬作用。因此，本发明的抗体提供了治疗和预防由CD30活性介导的病症的改进方法，这部分归因于其独特的特异性(如表位特异性和缺乏与相关的细胞表面抗原的交叉反应性)、亲和力、结构、功能活性及它们完全是人类的事实，这使得它们当施用于人类患者时比以前生成的其他CD30抗体(如鼠和人源化的抗体)具有显著更低的免疫原性和更高的治疗效果和有用性。 
本发明分离的人类抗体包括多种抗体同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。一般地，它们包括IgG1(如IgG1k)、IgG3和IgM同种型。抗体可为全长的(如IgG1或IgG3抗体)，或者可仅包括抗原-结合部分(如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段)。 
本发明特定的治疗性抗体包括人类单克隆抗体(HuMab)17G1和功能等价的抗体，该抗体(a)由在其可变区包含分别在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中提出的核苷酸序列的人类重链和人类轻链核酸及其保守的序列修饰物编码，或(b)包括分别在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的重链和轻链可变区及其保守的序列修饰物。 
本发明另一种特定的治疗性抗体包括人类单克隆抗体2H9和功能等价的抗体，该抗体(a)由在其可变区包含分别在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7中提出的核苷酸序列的人类重链和人类轾链核酸及其保守的序列修饰物编码，或(b)包括分别在SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的重链和轻链可变区及其保守的序列修饰物。 
本发明另一种特定的治疗性抗体包括人类单克隆抗体5F11和功能等价的抗体，该抗体(a)由在其可变区包含分别在SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中提出的核苷酸序列的人类重链和人类轻链核酸及其保守的序列修饰物编码，或(b)包括分别在SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：12中所示的氨基酸序列的重链和轻链可变区及其保守的序列修饰物。 
同样包括于本发明中的是如下抗体，该抗体与由抗体17G1、2H9或5F11限定的人类CD30上的表位结合，和/或与抗体17G1、2H9或5F11竞争与CD30的结合，或具有由抗体17G1、2H9或5F11展示的其他功能性结合特征。这种抗体包括以约10-11M的解离平衡常数(Kd)和/或以至少约107M-1的结合平衡常数(Ka)与CD30结合的抗体。这种抗体也包括那些不与相关的细胞表面抗原交叉反应的抗体，因而不抑制其功能。 
本发明另一个特定的人类抗体包括那些包含如下CDR结构域的抗体，该CDR结构域具有人类重链和轻链的CDR1区域、人类重链和轻链的CDR2区域和人类重链和轻链的CDR3区域，其中 
(a)人类重链区域的CDR1、CDR2和CDR3包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列选自示于图7(分别为SEQ ID NO：14、16和18)、图9(分别为SEQ ID NO：26、28和30)和图11(分别为SEQ ID NO：38、40和42)中的CDR1、CDR2和CDR3区域氨基酸序列及其保守的序列修饰物，和 
(b)人类轻链区域的CDR1、CDR2和CDR3包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列选自示于图8(分别为SEQ ID NO：20、22和24)、图10(分别为SEQ ID NO：32、34和36)和图12(分别为SEQ ID NO：44、46和48)中的CDR1、CDR2和CDR3区域氨基酸序列及其保守的序 列修饰物。可选择地，本发明特定的人类抗体包括那些包含如下CDR结构域的抗体，该CDR结构域具有人类重链和轾链的CDR1区域、人类重链和轻链的CDR2区域和人类重链和轻链的CDR3区域，该结构域包含与图7-12中所示的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列(SEQ IDNO：14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48)至少为80％同源性的氨基酸序列，优选地为85％同源性，更优选地为90％、95％、98％和99％同源性。 
在另一个实施方案中，本发明的人类抗体与CD30结合并通过部分或完全阻断CD30配体与CD30的结合而抑制CD30功能(如CD30介导的作用)。CD30配体的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5。 
在另一个实施方案中，本发明的人类抗体特征在于一种或多种下述性质： 
a)对CD30的特异性； 
b)亲和常数至少为约107M-1的与CD30的结合亲和力，该亲和常数优选地为108M-1，且更优选地为约109M-1～1010M-1或更高； 
c)与CD30至少为约103M-1S-1的结合常数(Kasscc)，更优选地为约104M-1S-1，且最优选地为约105M-1S-1； 
d)从CD30至少为约10-3s-1的解离常数(Kdls)，优选地为约10-4s-1，更优选地为10-5s-1，且最优选地为10-6s-1； 
e)调理表达CD30的细胞的能力；或 
f)在浓度为约10μg/ml或更低的人类效应细胞存在时(如在体外)抑制表达CD30的细胞(如肿瘤细胞)生长和/或介导吞噬作用和杀伤的能力。 
本发明的人类抗-CD30抗体可在宿主细胞(如CHO细胞或淋巴细胞)中进行重组生产，或者可直接从表达抗体的杂交瘤(即该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从转基因的非人类动物如转基因小鼠中获得，该动物具有包含编码抗体的人类重链转基因和人类轻链转基因的基因组)中获得。在一个特定实施方案中，抗体是通过在此处称为17G1(SEQ ID NO：1-4)、2H9(SEQ ID NO：5-8)和SF1 1(SEQ ID NO：9-12)的杂交瘤生产的。 
在另一方面，本发明提供了转基因的非人类动物，如转基因小鼠(在此处也称为“HuMAb小鼠”)，该动物表达与CD30结合的人类单 克隆抗体。在一个特定的实施方案中，转基因的非人类动物是转基因小鼠，该转基因小鼠具有包含编码本发明所有或部分抗体的人类重链转基因和人类轻链转基因的基因组。转基因的非人类动物可用CD30抗原和/或表达CD30的细胞的纯化或浓缩制剂进行免疫接种。优选地，转基因的非人类动物如转基因小鼠能够通过V-D-J重组和同种型转换而产生多种抗CD30的人类单克隆抗体同种型(如IgG、IgA和/或IgM)。同种型转换可通过如经典的或非经典的同种型转换发生。 
因此，在另一方面，本发明提供了从如上所述的转基因非人类动物如转基因小鼠分离的B-细胞，该B-细胞表达人类抗-CD30抗体。然后可通过与无限增殖化细胞融合而使分离的B-细胞无限增殖化，以提供人类抗-CD30抗体的来源(如杂交瘤)。这种杂交瘤(即产生人类抗CD30抗体的)也包括于本发明范围内。 
如在此处所示例的，本发明的人类抗体可直接从表达该抗体的杂交瘤获得，或者可进行克隆并在宿主细胞(如CHO细胞或淋巴细胞)中进行重组表达。因此，在另一方面，本发明提供了生产与人类CD30结合的人类单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，该方法包括应用纯化或浓缩的人类CD30抗原和/或表达人类CD30的细胞对转基因非人类动物如转基因小鼠进行免疫接种，该转基因非人类动物如前文所述(如具有包含人类重链转基因和人类轻链转基因的基因组，该转基因编码所有或部分抗-CD30抗体)。然后获得动物的B细胞(如脾B细胞)，并与骨髓瘤细胞融合以形成无限增殖化杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞分泌抗CD30的人类单克隆抗体。 
在另一方面，本发明的人类抗-CD30抗体是衍生化的，与另一种功能分子如另一种肽或蛋白质(如Fab’片段)连接或共表达。例如，本发明的抗体或抗原结合部分可在功能上与一种或多种其他分子实体连接(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)，如另一种抗体(如以便产生双特异性或多特异性抗体)、细胞毒素、细胞配体或抗原(如以便产生免疫偶联物，如免疫毒素)。因此，本发明包含大量抗体偶联物、双特异性和多特异性分子和融合蛋白质，它们全部与表达CD30的细胞结合且可用于将其他分子导向于这些细胞。 
在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种双特异性或多特异性分子，该分子包含至少一种对CD30的第一结合特异性(如人类抗- CD30抗体或其片段或模拟物)，以及对人类效应细胞的第二结合特异性，如对Fc受体(如人类Fcγ受体(如FcγRI)或者人类Fcα受体)的结合特异性。一般地，本发明的双特异性和多特异性分子包含至少一种抗体或其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv)，优选地为人类抗体或其片段，或“嵌合的”或“人源化的”抗体或其部分(如具有源自非人类抗体(如鼠的)的可变区或互补性决定区(CDR)，而剩余部分的来源为人类)。 
因此，本发明包括与人类CD30和Fc受体两者结合的双特异性和多特异性分子，该Fc受体如人类IgG受体，如Fcγ-受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。也可导向于其他Fc受体，如人类IgA受体(如FcαRI)。Fc受体优选地定位于效应细胞的表面，如单核细胞、巨噬细胞或活化的单核的细胞。在一个优选实施方案中，双特异性和多特异性分子在与受体的免疫球蛋白Fc(如IgG或IgA)结合位点不同的位点与Fc受体结合。因此，双特异性和多特异性分子的结合不被免疫球蛋白的生理学水平阻断。 
在另一方面，本发明提供了通过与本发明具有有效量的抗体、抗体衍生物或其他治疗组合物的细胞接触而抑制表达CD30的细胞生长的方法，从而该细胞的生长受到了抑制。在一个实施方案中，该方法包括在存在效应细胞时杀死表达CD30的细胞，如通过ADCC。在另一个实施方案中，该方法包括通过吞噬作用杀死表达CD30的细胞。将细胞优选地杀死或抑制，而不杀死或抑制不表达CD30但可表达如结构相关的细胞表面抗原的细胞活性(即与相关的但功能不同的细胞表面抗原无交叉反应性)。可用本发明的人类抗体抑制或杀死的表达CD30的细胞包括如肿瘤细胞、骨髓细胞、肝细胞、淋巴结细胞、皮肤细胞、脾细胞、胸腺细胞、扁桃体细胞、蜕膜细胞、子宫内膜细胞、何杰金氏细胞、Reed-Sternberg细胞、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)细胞、多形的和免疫母细胞淋巴瘤细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞。 
因此，本发明的人类抗体可用于通过向患这种疾病的患者施用抗体而治疗和/或预防多种CD30介导的疾病。可进行治疗(如改善)或预防的示例性疾病包括，但不局限于致瘤性疾病和自身免疫病。可进行治疗和/或预防的致瘤性疾病的例子包括何杰金氏病、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞 淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T-细胞或B-细胞淋巴瘤。可进行治疗和/或预防的自身免疫病的例子包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、Omen氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒(herpesvirus)相关的疾病。 
在本发明一个特定实施方案中，将施用了抗体的被试者额外用化疗剂、放射或一种试剂如细胞因子进行治疗，该试剂调节如增强或抑制Fc受体如Fcα或Fcγ受体的表达或活性。在治疗过程中施用的一般细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。此外，一般的治疗剂包括抗癌剂如阿霉素(adriamycin)、顺式铂氨硫酸博来霉素、亚硝基脲氮芥、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲。 
为了增加本发明的人类抗-CD30抗体抗不高度表达CD30的癌细胞的治疗功效，抗体可以与上调或另外影响CD30的表达的试剂共同施用，该试剂如导致CD30在肿瘤细胞上上调的且更均一表达的淋巴因子制剂。适合于施用的淋巴因子制剂包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子及其组合。这些可在静脉内施用。适当的淋巴因子剂量一般为10,000～1,000,000单位/患者。 
在另一方面，本发明提供了在体外或在体内探测样品中CD30存在性的方法，如CD30-相关的疾病的诊断。在一个实施方案中，这是通过使要检验的样品任选地和对照样品一起与本发明的人类单克隆抗体(或其抗原结合部分)在如下条件下接触，该条件使得能够在抗体和CD30之间形成复合物。然后探测复合物的形成(如应用ELISA)。当应用对照样品连同检验样品时，在两种样品中均探测到复合物，且样品间复合物形成中的任何统计学显著的差异可指示检验样品中存在CD30。 
在另一方面，本发明提供了编码人类抗-CD30抗体及其部分(如其可变区)的核酸分子，以及包括本发明的核酸的重组表达载体和用该载体转染的宿主细胞。通过培养这些宿主细胞生产抗体的方法也包含于本发明中。由本发明提供的特定核酸包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO： 3中所示的核苷酸序列，分别编码人类抗-CD30抗体(HuMab)17G1的重链和轻链；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列，分别编码人类抗-CD30抗体(HuMab)2H9的重链和轻链；以及SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：11中所示的核苷酸序列，分别编码人类抗-CD30抗体(HuMab)5F11的重链和轻链。 
在另一方面，本发明提供了包含一种或多种(即其组合)人类抗-CD30抗体连同一种载体的治疗性和诊断性组合物。在一个特定实施方案中，该组合物进一步包括一种或多种其他治疗剂，如细胞毒性或放射毒性剂，或者包括上调CD30表达或在效应细胞表面表达的分子表达的试剂，如上调Fc受体表达的GM-CSF。 
对于在CD30介导的疾病的体内治疗和预防中的应用，本发明的人类抗体是通过任何适当的施用途径以治疗有效剂量施用于患者(如人类被试者)的，如注射和其他本领域公知的用于基于抗体的临床产品的施用途径。 
在另一方面，本发明提供了一种免疫偶联物，如免疫毒素，该免疫偶联物包括与治疗剂偶联的本发明的完整人类抗-CD30抗体，该治疗剂如细胞毒性剂，放射毒性剂，化疗药物，免疫抑制剂，或者抗炎试剂，如类固醇和非类固醇抗炎试剂。 
可选择地，本发明的人类抗体可与这种治疗性和细胞毒性剂共同施用，但不与其连接。它们可同时与这种试剂共同施用(即在单个组合物中或单独地)，或者可在这种试剂施用前或施用后施用。如上所述，这种试剂可包括细胞毒性剂、放射毒性剂或化疗剂，如阿霉素(adriamycin)、顺式铂氨硫酸博来霉素、亚硝基脲氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺羟基脲及其组合。 
本发明的其他特征和优点在下面的详述和实施例中是显而易见的，该详述和实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容均在此处清楚地引入作为参考。 
附图简述 
图1是比较抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同种型对照与重组CD30的剂量依赖性结合的图。 
图2是比较抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同种型对照与何杰金氏淋巴瘤细胞系L540的剂量依赖性结合的图。 
图3是比较抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同种型对照对L540何杰金氏肿瘤细胞的单核的细胞介导的抗体依赖性细胞毒性的图。 
图4是比较抗-CD30的HuMab 17G1、5F11、2H9和同种型对照对L540何杰金氏肿瘤细胞的单核细胞介导的抗体依赖性细胞毒性的图。 
图5A和B是显示用HuMab 5F11对细胞生长进行抑制的图。 
图6是显示应用异种移植的小鼠模型在体内用HuMab 5F11对表达CD30的肿瘤细胞进行生长抑制的图。 
图7显示来自HuMab 17G1的VH-区的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。显示了CDR区域。 
图8显示来自HuMab 17G1的VL-区的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。显示了CDR区域。 
图9显示来自HuMab 2H9的VH-区的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。显示了CDR区域。 
图10显示来自HuMab 2H9的VL-区的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。显示了CDR区域。 
图11显示来自HuMab 5F11的VH-区的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。显示了CDR区域。 
图12显示来自HuMab 5F11的VL-区的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。显示了CDR区域。 
图13分别显示种系序列VH4-34、L15、VH3-11、A27和L6的核苷酸序列(SEQ ID NO：49、50、51、52和53)。 
图14是显示抗A聚簇的抗体能够抑制FITC-标记的HuMab 5F11与L540细胞结合，而抗B或C聚簇的抗体不能进行抑制的图，从而显示5F11结合或靠近A聚簇表位。 
图15是显示在弥散性模型中HuMab 5F11的治疗对用人类HL细胞L540CY攻击的SCID小鼠的存活率的作用的图。 
发明详述 
本发明提供了用于治疗和诊断多种由CD30和/或表达CD30的细胞 介导的病症(如由CD30的增殖作用导致的病症)的改进的基于抗体的治疗。本发明的治疗应用分离的人类单克隆抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与CD30或表达CD30的细胞结合并抑制其功能，特别是在人类治疗中。 
在一个实施方案中，人类抗体在非人类的转基因动物如转基因小鼠中产生，该非人类的转基因动物能够通过V-D-J重组和同种型转换产生多种抗CD30的人类单克隆抗体同种型(如IgG、IgA和/或IgE)。因此，本发明的特定方面不仅包括抗体、抗体片段及其药物组合物，也包括产生单克隆抗体的非人类转基因动物、B-细胞和杂交瘤。应用本发明的抗体以在体外或在体内探测表达CD30的细胞的方法也包含于本发明中。也提供了应用本发明的抗体阻断或抑制CD30诱导的活性如增殖活性的方法，且该方法可用于治疗与CD30相关的病症，如致瘤性疾病(如何杰金氏病)和自身免疫病(如HIV)。 
为了使本发明更易于理解，首先定义了某些术语。额外的定义贯穿于详述中提出。 
术语“CD30”和“CD30抗原”在此处可互换应用，且包括由细胞天然表达的人类CD30的各种变体、同种型和种类同系物。在一个优选实施方案中，本发明的抗体与CD30-抗原的结合通过抑制或阻断CD30配体与CD30的结合抑制了表达CD30的细胞(如肿瘤细胞)的生长。术语“CD30配体”包含CD30的所有(如生理学)配体。在一个优选实施方案中，CD30配体是CD30L、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3或TRAF5。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体与CD30-抗原的结合介导表达CD30的细胞的效应细胞吞噬作用和/或杀伤。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体与CD30-抗原的结合介导表达CD30的细胞的效应细胞ADCC。 
如在此处所用的，术语“抑制生长”(如涉及细胞)意欲包括与不接触抗-CD30抗体的相同细胞的生长相比，当接触抗-CD30抗体时细胞生长中任何可测量的降低，如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的细胞生长抑制。 
此处涉及的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”指通过二硫键相互连接的至少2个重链(H)和2个轻链(L)，或其抗原结合部分。每一个重 链由重链可变区(此处缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域Ch1、CH2和CH3组成。每一个轻链由轻链可变区(此处缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区域可进一步再分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，散布于更加保守的称为构架区(FR)的区域中。VH和VL均由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端到羧基末端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和传统补体系统的第一成分(Clq)。 
如在此处所用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单的“抗体部分”)指保持与抗原(如CD30)结合能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段履行。包含于术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含由二硫键在铰链区连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH 和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂上的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以应用重组方法通过合成的连接体进行连接，该连接体使得它们能够作为单个蛋白质链进行制备，其中VL和VH区域配对以形成单价分子(已知为单链Fv(ssFv)；参见如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也意欲包含于术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员公知的常规技术获得，且这些片段以与完整抗体相同的方式进行有用性的筛选。 
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由化学活性的分子表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的带电特征。构象和非构象的表位区别在于存在变性溶剂时与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。 
如在此处所用的，术语“抑制结合”和“阻断结合”指抑制/阻断CD30配体与CD30的结合。抑制/阻断可互换应用，且包含部分和完全 的抑制/阻断。CD30的抑制/阻断优选地降低或改变当不存在抑制或阻断时CD30结合发生的活性的正常水平或类型，如抑制CD30诱导的增殖。抑制和阻断也意欲包括与不接触抗-CD30抗体的CD30相比，当接触抗-CD30抗体时CD30的结合亲和力中任何可测量的降低，如对CD30与其受体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的阻断。 
术语“双特异性分子”意欲包括任何试剂，如蛋白质、肽或蛋白质或肽复合物，该试剂具有两种不同的结合特异性。例如，该分子可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体结合或相互作用。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”意欲包括任何试剂，如蛋白质、肽或蛋白质或肽复合物，该试剂具有超过两种不同的结合特异性。例如，该分子可以与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面的Fc受体和(c)至少一种其他成分结合或相互作用。因此，本发明包括，但不局限于双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子，该分子导向于细胞表面抗原如CD30，或导向于其他目标，如效应细胞上的Fc受体。 
术语“双特异性抗体”也包括二价双抗体(diabodies)。二价双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单个多肽链上，但应用的连接体太短以至于在相同的链上不能进行两个结构域之间的配对，从而使得结构域与另一个链的互补性结构域配对并生成2个抗原结合位点(参见如Holliger，P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。如在此处所用的，术语“异种抗体”指两种或多种抗体、抗体结合片段(如Fab)、其衍生物或连接在一起的抗原结合区，其至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上Fc受体的结合特异性和对目标细胞如肿瘤细胞上抗原或表位的结合特异性。 
如在此处所用的，术语“人类抗体”意欲包括具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如在此处所用的，术语“人类抗体”不意欲包括如下抗体，其中源自另一种哺 乳动物物种如小鼠种系的CDR序列已移植入到人类构架序列中。 
如在此处所用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单个分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物展示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人类单克隆抗体”指展示单一结合特异性的抗体，该抗体具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在一个实施方案中，人类单克隆抗体通过杂交瘤生产，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从转基因非人类动物如转基因小鼠中获得，具有包含人类重链转基因和轻链转基因。 
如在此处所用的，术语“重组人类抗体”意欲包括所有通过重组方法制备、表达、生成或分离的人类抗体，如(a)从人类免疫球蛋白基因的转基因动物(如小鼠)中分离的抗体(进一步描述于下文的I部分中)，(b)应用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，(c)从重组的组合人类抗体文库中分离的抗体，和(d)通过任何其他方法制备、表达、生成或分离的抗体，该方法包括人类免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。这种重组人类抗体具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这种重组人类抗体可进行体外诱变(或者，当应用人类Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因而重组抗体VH和VL区域的氨基酸序列尽管源自或与人类种系的VH和VL序列相关，但不是在体内人类抗体种系所有组成成分中天然存在的。 
如在此处所用的，“异源抗体”是相对于产生该抗体的转基因非人类生物进行定义的。该术语指具有如下氨基酸序列或编码性核酸序列的抗体，该氨基酸序列或编码性核酸序列相应于在不由转基因非人类动物组成的生物中发现的，且通常来自除转基因非人类动物之外的物种。 
如在此处所用的，“异源杂交抗体”指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠的轻链结合的人类重链的抗体是异源杂交抗体。异源杂交抗体的例子包括上述嵌合和人源化的抗体。 
如在此处所用的，“分离的抗体”指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(如分离的与CD30结合的抗体基本不含与除CD30之外的抗原结合的抗体)。然而，与人类CD30的表位、同种型或变体 结合的分离抗体与其他相关的抗原具有交叉作用性，该抗原如来自其他物种的(如CD30种类同系物)。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学制剂。在本发明的一个实施方案中，在充分限定的组合物中组合了具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体组合。 
如在此处所用的，“特异性结合”指抗体与预定抗原结合。一般地，抗体以至少约1×107M-1的亲和力进行结合，且以比与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)结合亲和力高至少2倍的亲和力与预定抗原结合。术语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在此处与术语“特异性地与抗原结合的抗体”互换应用。 
如在此处所用的，术语IgG抗体的“高亲和力”指至少约107M-1 的结合亲和力，优选为至少约108M-1，更优选为至少约109M-1、1010M-1、1011M-1或更高，如高达1013M-1或更高。然而，“高亲和力”结合对于其他的抗体同种型可有变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合指至少约1×107M-1的结合亲和力。 
如在此处所用的，术语“Kassoc”或“Ka”指特定抗体-抗原相互作用的结合常数。 
如在此处所用的，术语“Kdis”或“Kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。 
如在此处所用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(如IgM或IgG1)。 
如在此处所用的，“同种型转换”指抗体的种类或同种型从一种Ig种类改变为其他Ig种类之一的现象。 
如在此处所用的，“非转换的同种型”指当不发生同种型转换时产生的重链同种型类型；编码非转换的同种型的CH基因一般是紧在功能上重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换已分类为传统或非传统的同种型转换。传统的同种型转换通过在转基因中包含至少一个转换序列区域的重组事件发生。非传统的同种型转换可通过如在人类σμ和人类∑μ(δ-相关的缺失)之间的同源重组发生。此外，可选择的非传统的同种型转换如转基因间和/或染色体间重组可发生并实现同种型转换。 
如在此处所用的，术语“转换序列”指负责转换重组的DNA序列。 “转换供体”序列一般是μ转换区，将是在转换重组过程中缺失的构建体区域的5’(即上游)。“转换受体”区位于要缺失的构建体区域和替代恒定区(如γ、ε等)之间。由于没有始终发生重组的特异性位点，所以一般不能从构建体预测最终的基因序列。 
如在此处所用的，“糖基化模式”定义为共价附着于蛋白质上的糖单位，更具体地为免疫球蛋白。异源抗体的糖基化模式特征在于基本与由非人类转基因动物产生的抗体上天然存在的糖基化模式相似，此时，本领域技术人员将认识到异源抗体的糖基化模式比转基因的CH基因源自的物种更加与非人类转基因动物中的该糖基化模式相似。 
如在此处所用的，应用于一个主题的术语“天然存在的”指该主题可在自然中发现。例如，存在于生物(包括病毒)中的可从天然来源分离且未由人类在实验室中进行有目的的修饰的多肽或多核苷酸是天然存在的。 
如在此处所用的，术语“重排的”指一种重链和轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中在分别编码基本完整的VH和VL结构域的构象中，V段紧紧接近D-J或J段。重排的免疫球蛋白基因座可通过与种系DNA的比较进行鉴定；重排的基因座具有至少一个重组的七碱基序列/九碱基顺序同源性元件。 
如在此处所用的，关于V段的术语“未重排的”或“种系构型”指其中V段未进行重组从而紧紧接近D或J段的构型。 
如在此处所用的，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链或双链的，但优选为双链的DNA。 
如在此处所用的，关于编码与CD30结合的抗体或抗体部分(如VH、VL、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”指如下核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码与除CD30之外的抗原结合的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，该其他的序列可天然地位于人类基因组DNA中核酸序列的侧翼。在一个实施方案中，人类抗-CD30抗体或其部分包括17G1、2H9或5F11的核苷酸或氨基酸序列，和具有分别示于SEQ ID NO：1和2、5和6及9和10中的序列的重链(VH)可变区，以及具有分别示于SEQ ID NO：3和4、7和8及11和12中的序列的轻链(VL)可变区。 
如在此处公开和请求保护的，在SEQ ID NO：1-12中提出的序列包 括“保守的序列修饰”，即未显著影响或改变由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。这种保守的序列修饰包括核苷酸和氨基酸替代、添加和缺失。修饰可通过本领域中公知的标准技术引入到SEQ ID NO：1-12中，如定点诱变和PCR-介导的诱变。保守性氨基酸替代包括氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基的替代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，人类抗-CD30抗体中预测的非基本氨基酸残基优选地由来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代。 
可选择地，在另一个实施方案中，突变可沿着全部或部分抗-CD30抗体编码序列随机引入，如通过饱和诱变，且可对结果所得修饰的抗-CD30抗体进行结合活性的筛选。 
因此，由在此处公开的(重链和轻链可变区)核苷酸序列编码和/或含有在此处公开的(重链和轻链可变区)氨基酸序列(即SEQ IDNO：1-12)的抗体包括基本相似的抗体，该抗体由进行了保守修饰的相似序列编码或含有进行了保守修饰的相似序列。在下文中提供了关于如何基于在此处如SEQ ID NO：1-12中公开的部分(即重链和轻链可变区)序列生成这种基本相似的抗体的进一步讨论。 
对于核酸，术语“基本同源性”显示两种核酸或其指定的序列当最适地进行比对和比较时，在至少约80％的核苷酸中是相同的，通常为在至少约90％～95％，且更优选为在至少约98％～99.5％的核苷酸中，而具有适当的核苷酸插入或缺失。可选择地，当段在选择性杂交条件下与互补链杂交时，则存在基本同源性。 
考虑空位数目和每一个空位的长度后，该空位是实现两个序列之间的最适比对所需要引入的，两个序列之间的百分比相同性是由序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置#/总的位置 #×100)。序列比较和两个序列间百分比相同性的确定可应用数学算法实现，如在下文非限制性的例子中所述的。 
两个核苷酸序列之间的百分比相同性可应用GCG软件包中的GAP程序(可在http://www.gcg.com上获得)进行确定，其中应用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比相同性也可应用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法进行确定，该算法已整合入ALIGN程序(2.0版)中，其中应用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。此外，两个氨基酸序列之间的百分比相同性可应用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法进行确定，该算法已整合入GCG软件包中的GAP程序(可在http://www.gcg.com上获得)中，其中应用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。 
本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作如“询问序列”以对公共数据库进行搜索，以鉴定相关的序列。这种搜索可应用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸搜索可应用得分＝100、字长＝12的NBLAST程序进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可应用得分＝50、字长＝3的XBLAST程序进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述应用有空位的BLAST。当应用BLAST和有空位的BLAST程序时，可应用各自程序(即XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。 
核酸可存在于完整细胞中、细胞裂解物中，或者为部分纯化的或基本纯的形式。核酸当通过标准技术从其他细胞成分或其他污染物如其他细胞核酸或蛋白质纯化时，则是“分离的”或“基本纯的”，该技术包括碱/SDS处理、CsCl显带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域中众所周知的其他技术。参见如F.Ausubel等人，ed.CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York(1987)。 
本发明来自cDNA、基因组或其混合物的核酸组合物尽管常为天然的序列(除修饰的限制位点等之外)，但可根据标准技术进行突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可影响预期的氨基酸序列。具体而言，预期有基本与在此处描述的天然V、D、J、恒定区、转换和其他这种序列同源或源自这些序列的DNA序列(其中“源自”显示一个序列与另一个序列相同或从后者修饰得来)。 
当将核酸置于与另一个核酸序列功能相关的位置时，该核酸是“可操作连接的”。例如，启动子和增强子如果影响序列的转录，则为与编码序列可操作连接的。关于转录调节序列，可操作连接的指连接的DNA序列是连续的，且在需要连接两个蛋白质编码区时，是连续并符合读框的。对于转换序列，可操作连接的显示序列能够影响转换重组。 
如在此处所用的，术语“载体”指能够转运另一个与其连接的核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指在其中可连接额外的DNA段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中额外的DNA段可连接入病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(如非附加型哺乳动物载体)当引入到宿主细胞中时，可整合入宿主细胞的基因组中，因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此处将这种载体称为“重组表达载体”(或简单的“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术中的表达载体常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换应用，这是因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意欲包括发挥等价功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。 
如在此处所用的，术语“重组宿主细胞”(或简单的“宿主细胞”)指已引入了重组表达载体的细胞。应该理解的是，该术语不仅指特定的被试者细胞，而且指这种细胞的后代。因为在随后的世代中由于突变或环境影响可发生某些修饰，所以这种后代事实上可能与亲代细胞不同，但仍然包括在此处所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括如CHO细胞和淋巴细胞。 
如在此处所用的，术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，如CHO细胞或NS/0细胞。 
如在此处所用的，术语“被试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类的灵长类、绵羊、狗、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。 
术语“转基因的非人类动物”指具有包含一个或多个人类重链和/或轻链转基因或转染色体(transchromosomes)(整合或未整合入动物天然的基因组DNA中)的基因组的非人类动物，且该动物能够表达完整的人类抗体。例如，转基因小鼠可具有人类轻链转基因和人类重链转基因或人类重链转染色体，从而该小鼠当用CD64抗原和/或表达CD64的细胞免疫接种时，可产生人类抗-CD64抗体。人类重链转基因可整合入小鼠的染色体DNA中，如在转基因的小鼠如HuMAb小鼠的情形中，或者人类重链转基因可维持在染色体外，如在WO 02/43478中描述的转染色体(如KM)小鼠的情形中。这种转基因和转染色体小鼠能够通过V-D-J重组和同种型转换产生多种人类抗CD64的单克隆抗体同种型(如IgG、IgA和/或IgE)。 
本发明的各个发明进一步详细描述于下面的小节中。 
I.抗CD30的人类抗体的生产
本发明的单克隆抗体(MAb)可通过多种技术生产，包括常规的单克隆抗体方法学，如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法是优选的，但原则上，可以采用其他生产单克隆抗体的技术，如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。 
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统，小鼠中的杂交瘤生产是充分确立的方法。免疫接种规程和从融合中分离免疫接种的脾细胞的技术是本领域中公知的。融合配偶体(如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也已知。 
在一个优选实施方案中，抗CD30的人类单克隆抗体可应用带有部分人类免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠生成。这些转基因小鼠在此处称为“HuMAb”小鼠，含有编码未重排的人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及使内源μ和κ链基因座失活的导向的突变(Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展示降低的小鼠IgM 或κ的表达，且在对免疫接种的反应中，引入的人类重链和轻链转基因进行类别转换和体细胞突变以生成高亲和力的人类IgGκ单克隆(Lonberg，N.等人，(1994)，见上文；Lonberg，N.(1994)Handbookof Experimental Pharmacology 113：49-101中的综述；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷：65-93，及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠的制备详细描述于下文II节中，并描述于Taylor，L.等人，(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等人，(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等人，(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等人，(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Taylor，L.等人，(1994)International Immunology6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.等人，(1996)Nature Biotechnology14：845-851，其所有内容均在此处整体引入作为参考。进一步参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；均授予Lonberg和Kay及GenPharm International；授予Surani等人的美国专利号5,545,807；于1998年6月11日公布的国际申请号WO 98/24884；于1994年11月10日公布的WO 94/25585；于1993年6月24日公布的WO 93/1227；于1992年12月23日公布的WO 92/22645；于1992年3月19日公布的WO 92/03918，其所有公开内容均在此处整体引入作为参考。可选择地，描述于实施例2中的HCO12转基因小鼠可用于生成人类抗-CD30抗体。 
HuMAb免疫接种 
为了生成抗CD30的全长人类单克隆抗体，可用纯化或浓缩的CD30抗原和/或表达CD30的细胞制剂对HuMAb小鼠进行免疫接种，如由 Lonberg，N.等人，(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人，(1996)Nature Biotechnology 14：845-851和WO 98/24884所描述的。优选地，在第一次输注时小鼠为6-16周龄。例如，纯化或浓缩的CD30抗原制剂(5-20μg)(如从表达CD30的LNCaP细胞中纯化的)可用于对HuMAb小鼠进行腹膜内免疫接种。如果应用纯化或浓缩的CD30抗原制剂的免疫接种不产生抗体，那么可用表达CD30的细胞如肿瘤细胞系对小鼠进行免疫接种以促进免疫反应。 
各种抗原的累积经历已显示，当初始时用完全弗氏佐剂中的抗原进行腹膜内(IP)免疫接种，随后每两周用不完全弗氏佐剂中的抗原进行腹膜内(i.p.)免疫接种(总共达6次)时，HuMAb转基因小鼠的反应是最好的。免疫反应可在免疫接种规程的过程中以由眶后(retroorbital)放血获得的血浆样品进行监控。可用ELISA对血浆进行筛选(如下文所述)，且具有足够的抗-CD30人类免疫球蛋白效价的小鼠可用于进行融合。在处死和去除脾之前3日，可以用抗原在静脉内对小鼠进行强化。预期对于每一种抗原需要进行2-3次融合。可用每一种抗原对几个小鼠进行免疫接种。例如，可对总共12个HC07和HC012品系的HuMAb小鼠进行免疫接种。 
产生抗CD30的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成 
基于标准规程可分离小鼠脾细胞，并将其与PEG一起与小鼠骨髓瘤细胞系进行融合。然后对结果所得的杂交瘤进行筛选以生产抗原特异性抗体。例如，使来自免疫接种的小鼠的脾淋巴细胞单细胞悬浮液与具有50％PEG的1/6数目的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。将细胞以约2×105涂平板于平底的微量滴定板上，然后在选择性培养基上进行两周的温育，该培养基含有20％胎儿克隆血清(Clone Serum)、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml艮他霉素和1×HAT(Sigma；HAT在融合后24小时添加)。两周后，将细胞培养于培养基中，其中HAT由HT替代。然后通过ELISA对单个孔进行人类抗-CD30单克隆IgM和IgG抗体的筛选。一旦发生了大量杂交瘤生长，则通常在10-14日后观察培养基。将分泌抗体的 杂交瘤再次涂平板和筛选，且如果对于抗CD30的单克隆抗体人类IgG仍然是阳性的，则可通过限制性的稀释进行至少两次亚克隆。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成小量的抗体用于进行表征。 
产生抗CD30的人类单克隆抗体的转染瘤的生成 
本发明的人类抗体也可应用如本领域中众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中生产(如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。 
例如，为了表达抗体或其抗体片段，编码部分或全长轻链和重链的DNA可通过标准分子生物学技术(如PCR扩增、定点诱变)获得，且可插入到表达载体中，从而该基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在该情形中，术语“可操作连接的”指抗体基因连接入载体中，从而载体中的转录和翻译控制序列可发挥其预期功能，以调节抗体基因的转录和翻译。对表达载体和表达控制序列进行选择以与所用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入到单独的载体中，或者更一般地，两个基因插入到相同的表达载体中。抗体基因通过标准方法插入到表达载体中(如抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或者如果不存在限制位点时的平端连接)。此处描述的抗体轻链和重链可变区通过将其插入到表达载体中，而可用于生成任何抗体同种型的全长抗体基因，该表达载体编码预期同种型的重链恒定区和轻链恒定区，从而VH段与载体中的CH段可操作地连接，而VL段与载体中的CL段可操作地连接。此外或可选择地，重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。抗体链基因可克隆入载体中，从而信号肽符合读框地与抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。 
除抗体链基因之外，本发明的重组表达载体带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意欲包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录和翻译的其他表达控制元件(如多腺苷酸化信号)。这种调节序列描述于如Goeddel；Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中。本领域技术人员可以理解表达载体的设计，包 括调节序列的选择，依赖于如下因素，如要转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如源自巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(adenovirus)(如腺病毒的主要晚期启动子(AdMLP))和多形瘤的启动子和/或增强子。可选择地，可应用非病毒调节序列，如遍在蛋白质启动子和β-珠蛋白启动子。 
除抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可带有额外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于对已引入了载体的宿主细胞的选择(参见如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017，均为Axel等人的)。例如，选择性标记一般赋予已引入了载体的宿主细胞对药物的抗性，如G418、潮霉素或氨甲蝶呤。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于由氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。 
为了轻链和重链的表达，将编码重链和轻链的表达载体用标准技术转染入宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意欲包括多种通常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的技术，如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞及最优选的在哺乳动物宿主细胞中的抗体表达是最优选的，这是因为这种真核细胞，特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠且具有免疫学活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达对于产生高产量的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。 
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，与DHFR选择性标记一起应用，如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体而言，对于NSO骨髓瘤细胞的应用，另一个优选的表达系统是在WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系 统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够的时间以使抗体在宿主细胞中表达，或者更优选地，使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中以生产抗体。可应用标准的蛋白质纯化技术从培养基中回收抗体。 
应用部分抗体序列以表达完整的抗体 
抗体主要通过位于6个重链和轻链互补性决定区(CDR)中的氨基酸残基与目标抗原相互作用。为此，CDR中的氨基酸序列比CDR之外的序列在单独的抗体之间有更大的变化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体而表达模拟特定的天然存在的抗体性质的重组抗体，该表达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然存在的抗体的CDR序列(参见如Riechmann，L.等人，1998，Nature 332：323-327；Jones，P.等人，1986，Nature 321：522-525；和Queen，C.等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这种构架序列可从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库中获得。这些种系序列与成熟的抗体基因序列不同，这是因为它们不包括完全装配的V基因，该基因是在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接形式的。种系基因序列在单独均匀跨可变区中也不同于所有高亲和力次级组成成分抗体的序列。例如，体细胞突变相对很少发生于构架区的氨基末端部分。例如，体细胞突变相对很少发生于构架区1的氨基末端部分和构架区4的羧基末端部分。此外，许多体细胞突变不显著改变抗体的结合性质。因此，不必获得特定抗体的完整DNA序列以重构具有与初始抗体相似的结合性质的完整重组抗体(参见于1999年3月12日提交的PCT/US99/05535，此处为所有目的将其引入作为参考)。跨CDR区的部分重链和轻链序列对于该目的一般是足够的。该部分序列用于确定何种种系V和J基因段对重组的抗体V基因有贡献。然后将种系基因用于填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中切除，且不对最终抗体的性质有贡献。因此，对于表达构建体必须应用相应的种系前导序列。为了添加缺失的序列，可通过连接或PCR扩增使克隆的cDNA序列cab与合成的寡核苷酸组合。可选择地，完整的可变区可以合成为一套短的重叠寡核苷酸，并通过PCR扩增进行组 合以生成完整的合成可变区克隆。该方法具有某些优点，如消除了或不包括特定的限制位点，或使特定的密码子最适化。 
将来自杂交瘤的重链和轻链转录物用于设计重叠的合成寡核苷酸组，以生成具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。合成的重链和κ链序列与天然序列在3个方面不同：重复的核苷酸碱基链是间断的，以促进寡核苷酸合成和PCR扩增；最适的转录起始位点根据Kozak规则整合(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)；和HindIII位点加工为处于翻译起始位点的上游。 
对于重链和轻链可变区，最适的编码链序列和相应的非编码链序列大约在相应非编码寡核苷酸的中点断裂为30-50个核苷酸。因此，对于每一条链，寡核苷酸均可装配为跨150-400个核苷酸的段的重叠双链组。然后将该集合体用作模板以产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。一般地，可变区寡核苷酸组将断裂为2个可单独扩增以生成2种重叠PCV产物的集合体。然后这些重叠产物通过PCT扩增进行组合以形成完整的可变区。也预期在PCR扩增中包括重链和轻链恒定区的重叠片段(包括κ轻链的Bbs I位点或γ重链的Age I位点)，以生成易于克隆入表达载体构建体中的片段。 
然后重构的重链和轻链可变区与克隆的启动子、翻译起始、恒定区、3’非翻译的、多腺苷酸化和转录终止的序列组合，以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可组合入单个载体中，共转染、连续地转染或单独转染入宿主细胞中，然后将该宿主细胞融合以形成表达两种链的宿主细胞。 
用于构建人类IgGκ的表达载体的质粒描述如下。构建质粒，从而PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可用于重构完整的重链和轻链小基因。这些质粒可用于完整地表达人类或嵌合的IgG1κ或IgG4κ抗体。可构建类似的载体以表达其他重链同种型，或表达包含λ轻链的抗体。 
因而，在本发明的另一个方面中，将本发明人类抗-CD30抗体如17G1、2H9或5F11的结构特征用于生成结构上相关的人类抗-CD30抗体，该结构上相关的人类抗-CD30抗体保持了至少一种本发明抗体的功能性质，如与CD30的结合。更特定地，17G1、2H9或5F11的一种或多种CDR可与已知的人类构架区和CDR进行重组组合，以生成本发明 额外的、重组加工的人类抗-CD30抗体。 
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了制备抗-CD30抗体的方法，包含： 
制备如下抗体，该抗体包含(1)人类重链构架区和人类重链CDR，其中至少一种人类重链CDR包含选自示于图7、9或11中的氨基酸序列(SEQ ID NO：14、16、18、26、28、30、38、40和42)的氨基酸序列，和(2)人类轻链构架区和人类轻链CDR，其中至少一种人类轻链CDR包含选自示于图8、10或12中的氨基酸序列(SEQ ID NO：20、22、24、32、34、36、44、46和48)的氨基酸序列； 
其中抗体保持结合CD30的能力。 
抗体结合CD30的能力可应用标准的结合测定进行确定，如那些在实施例中提出的(如ELISA)。 
由于本领域中众所周知的是抗体的重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中起特别重要的作用，所以上文提出的本发明制备的重组抗体优选地包含10F8的重链和轻链CDR3。该抗体进一步包含17G1、2H9或5F11的CDR1。该抗体可进一步包含CDR的任何组合。 
因此，在另一个实施方案中，本发明进一步提供了抗-CD30抗体，包含(1)人类重链构架区、人类重链CDR1区、人类重链CDR2区和人类重链CDR3区，其中人类重链CDR3区是如图7、9或11所示的17G1、2H9或5F11的重链CDR3(SEQ ID NO：18、30或42)；和(2)人类轻链构架区、人类轻链CDR1区、人类轻链CDR2区和人类轻链CDR3区，其中人类轻链CDR3区是如图8、10或12所示的17G1、2H9或5F11的轻链CDR3(SEQ ID NO：24、36或48)，其中抗体结合CD30。该抗体可进一步包含17G1、2H9或5F11的重链CDR2和/或轻链CDR2。该抗体可进一步包含17G1、2H9或5F11的重链CDR1和/或轻链CDR1。 
上述加工的抗体的CDR1、2和/或3区域可包含此处公开的17G1、2H9或5F11的准确序列。然而，本领域技术人员可以理解从17G1、2H9或5F11的准确序列的一些偏离是可能的，而同时仍然保持抗体有效结合CD30的能力。因此，在另一个实施方案中，加工的抗体可由一种或多种CDR组成，该CDR与17G1、2H9或5F11的一种或多种CDR具有如95％、98％或99.5％的相同性。 
除仅仅结合CD30之外，或者作为替代，可对如上所述加工的抗体针对其保持本发明抗体的其他功能性质进行选择，如： 
(1)与人类CD30结合，并抑制表达CD30的肿瘤细胞的生长； 
(2)抑制CD30配体与人类CD30的结合； 
(3)在存在效应细胞时诱导表达CD30的细胞的ADCC； 
(4)在存在巨噬细胞时诱导表达CD30的细胞的吞噬作用；和/或 
(5)以至少108M-1的平衡常数(Ka)与人类CD30结合。 
人类单克隆抗体与CD30结合的表征 
为了表征本发明的人类单克隆CD30抗体的结合，可通过如ELISA对来自免疫接种的小鼠的血清进行检验。在ELISA规程的一个一般(但非限制性的)例子中，将微量滴定板用PBS中的0.25μg/ml纯化的CD30覆盖，然后用PBS中5％的牛血清清蛋白阻断。将来自CD30-免疫接种的小鼠血浆的稀释物加入到每一个孔中，并于37℃温育1-2小时。将平板用PBS/Tween洗涤，然后于37℃与偶联到碱性磷酸酶上的山羊抗人IgG Fc-特异性多克隆试剂温育1小时。洗涤后，将平板用pNPP底物(1mg/ml)显影，并在405-650的OD进行分析。优选地，将发展了最大效价的小鼠用于融合。 
如上所述的ELISA测定也可用于对显示与CD30免疫原正反应性的杂交瘤进行选择。对以高亲和力与CD30结合的杂交瘤进行亚克隆和进一步的表征。从每一个杂交瘤可选择一个保持了亲代细胞反应性(通过ELISA)的克隆，以制备贮存于-140℃的5-10小瓶细胞库，及进行抗体纯化。 
为了纯化人类抗CD30抗体，选择的杂交瘤可生长于2升旋转的瓶中以进行单克隆抗体纯化。在应用A蛋白-琼脂糖(Phannacia，Piscataway，NJ)的亲和层析之前可将上清液进行过滤和浓缩。洗脱的IgG可通过凝胶电泳和高效液相层析进行检查以确保纯度。可将缓冲溶液交换为PBS，且浓度可通过应用1.43消光系数的OD280进行确定。可将单克隆抗体等分试样并贮存于-80℃。 
为了确定选择的人类抗-CD30单克隆抗体是否与唯一的表位结合，可将每一种抗体用商业上可购得的试剂(Pierce，Rockford，IL)进行生物素化。可以应用如上所述的CD30覆盖的ELISA平板进行应用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。生物素化的 Mab结合可用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针进行探测。 
为了确定纯化的抗体的同种型，可进行同种型ELISA。例如，微量滴定板的孔可于4℃用10μg/ml抗人的Ig包被过夜。在用5％BSA阻断后，将平板于环境温度与10μg/ml单克隆抗体或纯化的同种型对照反应2小时。然后使孔与人类IgG1或人类IgM-特异性的碱性磷酸酶偶联的探针进行反应。使平板显影并如上所述进行分析。 
为了证明单克隆抗体与表达CD30的活细胞的结合，可应用流式细胞仪。在流式细胞仪规程的一般(但非限制性)例子中，使表达CD30的细胞系(在标准生长条件下生长)与含有0.1％BSA和20％小鼠血清的各种浓度的单克隆抗体混合，并于37℃温育1小时。洗涤后，使细胞在与一级抗体染色相同的条件下与荧光素标记的抗人类IgG的抗体反应。样品可通过FACScan设备进行分析，该设备应用光学和侧面散射的性质以形成单个细胞的通道。除流式细胞仪测定之外或代替该测定，可应用作为替代的应用荧光显微镜的测定。细胞可精确地如上所述进行染色，并由荧光显微镜进行检查。该方法使得能够观察到单个细胞，但依赖于抗原的密度可具有减少的灵敏性。 
抗-CD30的人类IgG可进一步通过蛋白质印迹检验与CD30抗原的反应性。例如，可以制备来自表达CD30的细胞的细胞提取物，并将其进行十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％的小鼠血清进行阻断，并用要检验的单克隆抗体进行探测。人类IgG结合可应用抗人类IgG的碱性磷酸酶进行探测，并用BCIP/NBT底物片剂进行显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。 
抗CD30的人类单克隆抗体的吞噬和细胞杀伤活性 
除与CD30的特异性结合之外，可对人类单克隆抗-CD30抗体介导表达CD30的细胞的吞噬作用和杀伤的能力进行检验。体外单克隆抗体活性的检验将在检验体内模型之前提供初始的选择。简言之，来自健康供体的多形核细胞(PMN)或其他效应细胞可通过Ficoll Hypaque密度离心及随后裂解污染的红细胞而进行纯化。洗涤的PMN可悬浮于补充了10％热灭活的胎牛血清的RPMI中，并以效应细胞对肿瘤细胞(-效应细胞：肿瘤细胞)的各种比例与51Cr标记的表达CD30的细胞混合。 然后可以添加各种浓度的纯化的人类抗-CD30 IgG。测定可于37℃进行4-18小时。可通过测量释放入培养物上清液中的51Cr以测定样品的细胞溶解。也可对抗-CD30单克隆抗体的相互组合进行检验，以确定多个单克隆抗体是否增强了细胞溶解。 
也可在体内模型(如小鼠)中检验与CD30结合的人类单克隆抗体，以确定它们在介导表达CD30的细胞如肿瘤细胞的吞噬作用和杀伤中的功效。例如，可基于如下标准选择这些抗体，该标准不是排他的： 
1.)与表达CD30的活细胞结合； 
2.)与CD30结合的高亲和力； 
3.)与CD30上独特的表位的结合(以消除当组合应用时具有互补活性的单克隆抗体将竞争结合相同表位的可能性)； 
4.)表达CD30的细胞的调理作用； 
5.)在存在人类效应细胞时介导表达CD30的细胞的生长抑制、吞噬作用和/或杀伤。 
本发明优选的人类单克隆抗体满足这些标准的一个或多个，且优选地满足全部标准。在一个特定实施方案中，人类单克隆抗体组合应用，如作为包含两种或多种抗-CD30单克隆抗体或其片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的人类抗-CD30单克隆抗体可在单个治疗中进行组合，以实现所需的治疗或诊断作用。其一个例子为一种组合物，该组合物含有在效应细胞存在时介导对目标细胞的高效杀伤的抗-CD30人类单克隆抗体与另一种抑制表达CD30的细胞生长的人类抗-CD30单克隆抗体。 
II.生成人类单克隆抗-CD30抗体的转基因非人类动物的生产
在另一方面，本发明提供了转基因和转染色体的非人类动物，如转基因或转染色体小鼠，该动物能够表达特异性结合CD30的人类单克隆抗体。在一个特定实施方案中，本发明提供了一种转基因或转染色体小鼠，该小鼠具有包含人类重链转基因的基因组，从而当用CD30抗原和/或表达CD30的细胞进行免疫接种时，该小鼠产生人类抗-CD30抗体。人类重链转基因可整合入小鼠的染色体DNA中，如同在如转基因HuMAb小鼠的情形中的，如在此处详细描述和示例的。可选择地，人类重链转基因可在染色体外维持，如同描述于WO 02/43478中的转 染色体(如KM)小鼠的情形中的。这种转基因和转染色体动物能够通过V-D-J重组和同种型转换产生抗CD30的人类单克隆抗体的多个同种型(如IgG、IgA和/或IgE)。同种型转换可通过传统或非传统的同种型转换发生。 
以所有异源抗体组成成分对外源抗原刺激进行反应的转基因或转染色体非人类动物的设计需要包含于转基因动物中的异源免疫球蛋白转基因在整个B-细胞发育途径过程中正确地发挥功能。这包括如异源重链转基因的同种型转换。因此，构建转基因以产生同种型转换和一种或多种下面的抗体：(1)高水平和细胞类型特异性的表达，(2)功能性基因重排，(3)等位基因排斥的活化和对其的反应，(4)足够的所有初级组成成分的表达，(5)信号转导，(6)体细胞高变和(7)免疫反应过程中转基因抗体基因座的显性化。 
不是所有前述标准均需满足。例如，在其中转基因动物的内源免疫球蛋白基因座功能破坏的那些实施方案中，转基因不需活化等位基因排斥。此外，在其中转基因包含功能上重排的重链和/或轻链免疫球蛋白基因的那些实施方案中，功能性基因重排的第二个标准是不需要的，至少对于已经重排的转基因是这样的。对于分子免疫学的背景，参见Fundamental Immunology，第二版(1989)，Paul William E.，ed.Raven Press，N.Y.。 
在某些实施方案中，用于生成本发明的人类单克隆抗体的转基因或转染色体非人类动物在转基因动物种系中含有重排的、未重排的或重排和未重排的异源免疫球蛋白重链和轻链转基因的组合。每一种重链转基因包含至少一种CH基因。此外，重链转基因可含有功能性同种型转换序列，该序列能够支持转基因动物B-细胞中编码多个CH基因的异源转基因的同种型转换。这种转换序列可为充当转基因CH基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座中天然存在的序列，或者这种转换序列可源自存在于接受转基因构建体的物种(转基因动物)的序列。例如，如果用于产生转基因小鼠的人类转基因构建体整合了与天然存在于小鼠重链基因座中的相似的转换序列，则可产生较高频率的同种型转换事件，这可能是因为小鼠转换序列与小鼠转换重组酶可发挥最优的功能，而人类转换序列不可以。转换序列可通过常规克隆方法进行分离和克隆，或者可从重叠的合成寡核苷酸从头合成，该寡核苷酸是 基于与免疫球蛋白转换区序列相关的公布序列信息设计的(Mills等人，Nucl.Acids Res.15：7305-7316(1991)；Sideras等人，Intl.Immunol.1：631-642(1989))。对于每一种前述转基因动物，功能性重排的异源重链和轻链免疫球蛋白转基因可见于转基因动物B-细胞的显著组分中(至少百分之十)。 
生成用于产生本发明的人类单克隆抗体的转基因非人类动物的转基因包括重链转基因，该重链转基因包含编码至少一个V基因段、一个D基因段、一个J基因段和至少一个恒定区基因段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因包含编码至少一个V基因段、一个J基因段和至少一个恒定区基因段的DNA。编码轻链和重链基因段的基因段与转基因动物是异源的，这表现为它们源自或相应于编码不由转基因非人类动物组成的物种的免疫球蛋白重链和轻链基因段的DNA。在本发明的一个方面，这样构建转基因，从而单个基因段未重排，即未进行重排以编码功能性免疫球蛋白轻链和重链。当接触CD30抗原时，在转基因动物中，这种未重排的转基因支持V、D和J基因段的重组(功能型重排)，且优选地支持所有或部分D区基因段整合入结果所得的重排免疫球蛋白重链中。 
在一可选择的实施方案中，转基因包含未重排的“小基因座”。这种转基因一般包含C、D和J段的基本部分和V基因段的亚群。在这种转基因构建体中，各种调节序列，如启动子、增强子、类别转换区、RNA加工的剪接供体和剪接受体序列、重组信号等包含源自异源DNA的相应序列。这种调节序列可整合入来自用于本发明中的非人类动物的相同或相关物种的转基因中。例如，人类免疫球蛋白基因段可以与鼠免疫球蛋白增强子序列在转基因中进行组合以用于转基因小鼠中。可选择地，合成的调节序列可整合入转基因中，其中这种合成的调节序列与已知天然存在于哺乳动物基因组中的功能性DNA序列不同源。合成的调节序列是根据一致原则进行设计的，如那些限定剪接受体位点或启动子/增强子基元的可允许的序列的。例如，小基因座包含基因组免疫球蛋白基因座的部分，该部分与天然存在的种系Ig基因座相比具有至少一个内部的(即不位于该部分的末端的)非基本DNA部分的缺失。 
在本发明一个优选实施方案中，用于生成人类抗CD30抗体的转基 因或转染色体动物含有至少一个，一般为2-10个，且有时为25-50或更多拷贝的描述于WO 98/24884的实施例12中的转基因(如pHC1或pHC2)，使该动物与含有单拷贝的描述于WO 98/24884的实施例5、6、8或14中的轻链转基因的动物进行交配，并使后代与描述于WO98/24884的实施例10中的JH缺失的动物进行交配。将动物交配至对这3个性状的每一个都为纯合性的。这种动物具有如下基因型：单拷贝的(每个单倍的染色体组)人类重链未重排的小基因座(描述于WO98/24884的实施例12中)、单拷贝的(每个单倍的染色体组)重排的人类K轻链构建体(描述于WO 98/24884的实施例14中)和去除所有功能性JH段的每一个内源小鼠重链基因组中的缺失(描述于WO98/24884的实施例10中)。使这种动物与对JH段缺失纯合的小鼠(WO98/24884的实施例10)进行交配，以生产对JH缺失纯合且对人类重链和轻链构建体半合的后代。将结果所得的动物用抗原进行注射，并用于生产抗这些抗原的人类单克隆抗体。 
从这种动物分离的B细胞对于人类重链和轻链是单特异性的，这是因为它们仅含有单拷贝的每种基因。此外，它们对于人类和小鼠重链将是单特异性的，这是因为两个内源小鼠重链基因拷贝均由于跨JH 区的缺失而是无功能的，该缺失如WO 98/24884的实施例9和12中所述引入。此外，B细胞的基本部分对于人类或小鼠轻链将是单特异性的，这是因为单拷贝重排的人类κ轻链基因的表达将等位性或同种型性地排除B-细胞极大部分中内源小鼠κ和λ链基因的重排。 
优选的转基因和转染色体非人类动物，如小鼠，将展示具有所有重要组成成分的免疫球蛋白生产，理想地为与天然小鼠的基本相似。因而，例如，在已使内源Ig基因失活的实施方案中，总的免疫球蛋白水平将为血清中约0.1～10mg/ml，优选为0.5～5mg/ml，理想地为至少约1.0mg/ml。当将能够影响从IgM向IgG转换的转基因引入到转基因小鼠中时，成人小鼠的血清IgG对IgM的比例优选为约10∶1。IgG对IgM的比例在未成熟的小鼠中将非常低。通常，大于约10％，优选为40～80％的脾和淋巴结B细胞专一地表达人类IgG蛋白质。 
所有组成成分理想地将接近示于天然小鼠中的，通常为至少高约10％，优选地为25～50％或更高。通常，主要依赖于引入到小鼠基因组中的不同V、J和D区的数目，将产生至少约一千种不同的免疫球蛋 白(理想地为IgG)，优选地为104～106或更多。这些免疫球蛋白一般将识别约一半或更多高度抗原性的蛋白质，如葡萄球菌A蛋白。免疫球蛋白对于预选的抗原一般将展示低于10-7M的亲和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低。在一些实施方案中，优选可生成具有预定的所有组成成分的非人类动物，以限制在抗体对预定的抗原类型反应中表现的V基因的选择。具有预定的所有组成成分的重链转基因包含如优选用于对人类中预定抗原类型的抗体反应中的人类VH基因。可选择地，由于各种原因(如具有低的编码预定抗原的高亲和力V区的可能性；具有低的进行体细胞突变和亲和力锐化(sharpening)倾向；或对于某些人是免疫原性的)，可从限定的所有组成成分中排除一些VH基因。因而，在含有各种重链或轻链基因段的转基因进行重排之前，这种基因段易于通过如杂交或DNA测序鉴定为来自除转基因动物之外的物种或生物。 
如上所述的转基因和转染色体非人类动物，如小鼠可用如CD30抗原和/或表达CD30的细胞的纯化或重组制剂进行免疫接种。可选择地，转基因动物可用编码人类CD30的DNA进行免疫接种。然后动物将产生B细胞，该B细胞通过转基因内转换重组(顺式转换(cis-switching))进行类别转换，并表达与CD30反应的免疫球蛋白。该免疫球蛋白可为人类抗体(也称为“人类序列抗体”)，其中重链和轻链多肽由人类转基因序列编码，该序列包括通过体细胞突变和V区重组连接衍生的序列以及种系编码的序列；这些人类抗体可称为基本与由人类VL或VH 基因段和人类JL或DH和JH段编码的多肽序列相同，即使作为体细胞突变和不同V-J和V-D-J重组连接的结果可存在其他非种系序列。每一种抗体链的可变区一般至少有80％由人类种系V、J和在重链的情形中的D基因段编码；常有至少85％的可变区由存在于转基因上的人类种系序列编码；且常有90％或95％或更多的可变区由存在于转基因上的人类种系序列编码。然而，由于非种系序列是通过体细胞突变和VJ和VDJ连接引入的，所以人类序列抗体常具有一些不是由小鼠种系中的人类转基因中可见的人类V、D或J基因段编码的可变区序列(及较不常见的恒定区序列)。一般地，这种非种系序列(或单独的核苷酸位置)将在CDR中或靠近CDR聚簇，或者在已知聚簇了体细胞突变的区域中聚簇。 
与预定的抗原结合的人类抗体可通过同种型转换产生，从而可产生包含人类序列γ链(如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人类序列轻链(如κ)的人类抗体。作为抗原对B细胞的亲和力成熟和选择的结果，特别是在二级(或随后的)抗原攻击之后，这种同种型转换的人类抗体一般在可变区且常在CDR的约10个残基中常含有一个或多个体细胞突变。3种高亲和力的人类抗体可具有低于10-7M的结合亲和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或更低。 
本发明的另一个方面包括源自此处所述的转基因或转染色体非人类动物的B细胞。B细胞可用于生成表达人类单克隆抗体的杂交瘤，该单克隆抗体以高亲和力(如低于10-7M)与人类CD30结合。因而，在另一个实施方案中，当应用重组人类CD30作为分析物并应用抗体作为结合人类CD30的配体通过BIACORE 3000设备中的表面胞质基因共振(SPR)技术进行确定时，本发明提供了产生人类抗体的杂交瘤，该人类抗体具有低于10-7M的亲和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10 M或更低，其中该抗体包含： 
由以下成分组成的人类序列轻链，即(1)具有基本与由人类VL 基因段和人类JL段编码的多肽序列相同的多肽序列的轻链可变区，和(2)具有基本与由人类CL基因段编码的多肽序列相同的多肽序列的轻链恒定区；和 
由以下成分组成的人类序列重链，即(1)具有基本与由人类VH 基因段、任选的D区和人类JH段编码的多肽序列相同的多肽序列的重链可变区，和(2)具有基本与由人类CH基因段编码的多肽序列相同的多肽序列的恒定区。 
高亲和力的抗CD30的人类单克隆抗体的开发可由在具有包含整合的人类免疫球蛋白转基因的基因组的转基因非人类动物中扩张人类可变区基因段的所有组成成分的方法促进，该方法包含向基因组中引入V基因的转基因，该转基因包含不存在于该整合的人类免疫球蛋白转基因中的V区基因段。V区转基因常是包含人类VH或VL(VK)基因段阵列的酵母人工染色体，如天然存在于人类基因组中的或可单独通过重组方法剪接在一起的，该酵母人工染色体可包括颠倒的或省略的V基因段。通常在YAC中含有至少5个或更多功能性V基因段。在该变体中，可能制备通过所有V组成成分扩张方法产生的转基因动物，其中该动 物表达免疫球蛋白链，该免疫球蛋白链包含由存在于V区转基因上的V区基因段编码的可变区序列和在人类Ig转基因上编码的C区。通过所有V组成成分扩张方法，可生成具有至少5个不同V基因的转基因动物；且可生成含有至少约24个V基因或更多的动物。一些V基因段是非功能性的(如假基因等)；如果需要，可通过技术人员可应用的重组方法保留这些段，或将其选择性地删除。 
一旦小鼠种系已进行加工以含有功能性YAC，该功能性YAC具有基本不存在于含有J和C基因段的人类Ig转基因中的扩张的V段所有组成成分，那么可使该性状增殖，并交配到其他遗传背景中，包括将具有扩张的V段所有组成成分的功能性YAC交配到具有不同人类Ig转基因的非人类动物种系中的背景。可将具有扩张的V段所有组成成分的多功能性YAC交配到种系中以对人类Ig转基因(或多个人类Ig转基因)起作用。尽管此处称为YAC转基因，但当整合入基因组中时，这种转基因基本缺失酵母序列，如酵母中自主复制所必需的序列；在酵母中复制不再是必需的之后(即在引入到小鼠ES细胞或小鼠原合子(prozygote)中之前)，可通过基因工程(如限制酶切消化和脉冲场凝胶电泳或其他适当的方法)任选地将这种序列去除。人类序列免疫球蛋白表达性状增殖的方法包括使转基因动物繁殖，该转基因动物具有人类Ig转基因，且任选地也具有功能性YAC，该功能性YAC具有扩张的V段所有组成成分。VH和VL基因段两者均存在于YAC上。可由实践者将转基因动物交配到任何需要的背景中，包括带有其他人类转基因的背景，该其他人类基因包括人类Ig转基因和/或编码其他人类淋巴细胞蛋白质的转基因。本发明也提供了由具有扩张的V区所有组成成分YAC转基因的转基因小鼠产生的高亲和力人类序列免疫球蛋白。尽管前文描述了用于产生本发明的人类单克隆抗体的转基因动物的优选实施方案，但可预期有其他实施方案，该实施方案分为4类： 
I.含有未重排的重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因小鼠； 
II.含有未重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因小鼠； 
III.含有重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因小鼠； 
IV.含有重排的重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因小鼠； 
在这些转基因动物种类中，优选顺序如下：当内源轻链基因(或至少K基因)已通过同源重组被敲除时为II＞I＞III＞IV，而当内源轻链基因未被敲除且必须由等位基因排斥支配时为I＞II＞III＞IV。 
III.与CD30结合的双特异性/多特异性分子
在本发明另一个实施方案中，人类抗CD30的单克隆抗体或其抗原结合部分可进行衍生化或连接到其他功能性分子上，如另一种肽或蛋白质(如Fab’片段)上，以生成与多个结合位点或目标表位结合的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的抗体或抗原结合部分可与一种或多种其他结合分子功能性连接(如通过化学偶联、遗传融合、单价结合等)，如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物。 
因此，本发明包括双特异性和多特异性的分子，该分子包含至少一个对CD30的第一结合特异性和对第二种目标表位的第二结合特异性。在本发明一个特定实施方案中，第二种目标表位是Fc受体，如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括既能与表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))结合，又能与表达CD30的目标细胞结合的双特异性和多特异性分子。这些双特异性和多特异性的分子将表达CD30的细胞导向于效应细胞，且与本发明的人类单克隆抗体相同，可触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达CD30的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子的生成。 
除抗-Fc结合特异性和抗-CD30结合特异性之外，本发明的双特异性和多特异性分子可进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，如与参与细胞毒性活性的表面蛋白质结合并因而增加抗目标细胞的免疫反应的分子。“抗增强因子部分”可为与给定分子如抗原或受体结合，并因而导致结合决定簇对Fc受体或目标细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可结合Fc受体或目标细胞抗原。可选择地，抗增强因子部分可以结合与第一和第二结合特异性结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T-细胞(如通过导 致增强的抗目标细胞免疫反应的CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞)。 
在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。抗体也可为轻链或重链二聚体，或任何其模拟片段，如于1990年8月7日授予Ladner等人的美国专利号4,946,778中描述的Fv或单链构建体，将该专利的内容清楚地引入作为参考。 
在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含对存在于效应细胞表面的FcγR或FcαR的结合特异性，以及对目标细胞抗原如CD30的第二结合特异性。 
在一个实施方案中，对Fc受体的结合特异性由人类单克隆抗体提供，其结合不由人类免疫球蛋白G(IgG)阻断。如在此处所用的，术语“IgG受体”指位于染色体1上的8个γ-链基因的任何一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型分为3个Fcγ受体类型：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，Fcγ受体是人类高亲和力FcγRI。人类FcγRI是72kDa的分子，显示对单体IgG的高度亲和力(108-109M-1)。 
这些优选单克隆抗体的生产和表征由Fanger等人在PCT申请WO88/00052和在美国专利号4,954,617中描述，在此处将其教导整体引入作为参考。抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位结合，因而，其结合基本不由生理学水平的IgG阻断。用于本发明中的特定抗-FcγRI抗体为MAb 22、MAb 32、MAb 44、MAb 62和MAb 197。产生MAb 32的杂交瘤可购自美国典型培养物保藏中心，ATCC保藏号为HB9469。抗-FcγRI的MAb 22和MAb22的F(ab’)2片段可购自Medarex，Inc.(Annandale，N.J.)。在另一个实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的生产和表征描述于Graziano，R.F.等人(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和PCT/US93/10384中。产生H22抗体的细胞系于1992年11月4日以HA022CL1的名称保藏在美国典型培养物保藏中心，且具有保藏号CRL 11177。 
在另外一个优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由与人类IgA受体如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，其结合 优选地不由人类免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”意欲包括位于染色体19上的一个α-基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码7个55～110kDa的可变剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者均具有中等亲和力(≈5×107M-1)，在暴露于细胞因子如G-CSF或GM-CSF后该亲和力增加(Morton，H.C.等人(1996)Critical Reviews inImmunology 16：423-440)。已描述了4种鉴定为A3、A59、A62和A77的FcαRI-特异性单克隆抗体，该单克隆抗体在IgA配体结合结构域之外结合FcαRI(Monteiro，R.C.等人，1992，J.Immunol.148：1764)。 
FcαRI和FcγRI是用于本发明中的优选触发受体，这是因为它们(1)主要表达于免疫效应细胞上，如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞；(2)以高水平进行表达(如每细胞5,000-100,000)；(3)是细胞毒性活性(如ADCC、吞噬作用)的介质；(4)介导导向于它们的抗原(包括自身抗原)增强的抗原呈递。 
在其他实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子进一步包含识别如与目标细胞抗原如CD30结合的结合特异性。在一个优选实施方案中，结合特异性由本发明的人类单克隆抗体提供。 
如在此处所用的，“效应细胞特异性抗体”指结合效应细胞的Fc受体的抗体或功能性抗体片段。用于主题发明中的优选抗体在未由内源免疫球蛋白结合的位点结合效应细胞的Fc受体。 
如在此处所用的，术语“效应细胞”指与免疫反应的识别阶段和活化阶段相反，参与免疫反应的效应阶段的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括髓样或淋巴样来源的细胞，如淋巴细胞(如B细胞和T细胞，包括细胞毒性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体，并发挥特定的免疫功能。在优选实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，如嗜中性粒细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与目标细胞的特异性杀伤和将抗原呈递到免疫系统的其他成分或与呈递抗原的细胞结合。在其他实施方案中，效应 细胞可吞噬目标抗原、目标细胞或微生物。效应细胞上特定FcR的表达可由体液因子如细胞因子调节。例如，已发现FcγRI的表达可由干扰素γ(IFN-γ)上调。该增强的表达可增加带有FcγRI的细胞对目标的细胞毒性活性。效应细胞可吞噬或溶解目标抗原或目标细胞。 
“目标细胞”应指被试者(如人类或动物)中任何不需要的细胞，该细胞可由本发明的组合物(如人类单克隆抗体、双特异性或多特异性分子)导向。在优选实施方案中，目标细胞是表达或超量表达CD30的细胞。表达CD30的细胞一般包括肿瘤细胞，如膀胱、乳腺、结肠、肾、卵巢、前列腺、肾细胞、扁平细胞、肺(非小细胞)和头和颈肿瘤细胞。其他目标细胞包括滑膜成纤维细胞。 
尽管人类单克隆抗体是优选的，可用于本发明的双特异性或多特异性分子中的其他抗体为鼠的、嵌合的和人源化的单克隆抗体。 
嵌合的鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)可由本领域公知的重组DNA技术生产。例如，用限制酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，以去除编码鼠Fc的区域，并替代为编码人类Fc恒定区的基因的等价部分。(参见Robinson等人，国际专利申请PCT/US86/02269；Akira等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，国际申请WO 86/01533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567，Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better等人(1988Science 240：1041-1043)；Liu等人(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等人，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等人，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449和Shaw等人，1988，J.NatlCancer Inst.80：1553-1559)。 
嵌合的抗体可进一步通过用来自人类Fv可变区的等价序列替代不直接参与抗原结合的Fv可变区序列而进行人源化。人源化抗体的综述由Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207和由Oi等人，1986，BioTechniques 4：214提供。这些方法包括分离、处理和表达核酸序列，该核酸序列编码来自至少一个重链或轻链的全部或部分免疫球蛋白Fv可变区。这种核酸的来源是本领域技术人员众所周知的，且例如，可从7E3获得，即一种产生抗-GPIIbIIIa抗体的杂交瘤。然后， 可将编码嵌合抗体的重组DNA或其片段克隆入适当的表达载体中。适当的人源化抗体可选择地由CDR替代产生。美国专利号5,225,539；Jones等人，1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等人，1988Science 239：1534和Beidler等人，1988 J.Immunol.141：4053-4060。 
特定的人类抗体的所有CDR均可由至少一部分非人类的CDR替代，或者仅有一些CDR可由非人类的CDR替代。仅需要替代将人源化抗体结合到Fc受体上所必需的CDR的数目。 
抗体可通过任何方法进行人源化，该方法能够用源自非人类抗体的CDR替代至少一部分人类抗体的CDR。Winter描述了可用于制备本发明的人源化抗体的方法(于1989年3月26日提交的英国专利申请GB 2188638A)，将其内容清楚地引入作为参考。人类CDR可应用寡核苷酸定点诱变而由非人类的CDR替代，如描述于题为HumanizedAntibodies to Fc Receptorsfor Immunoglobulin G on HumanMononuclear Phagocytes的国际申请WO 94/10332中的。 
同样在本发明范围内的是嵌合的和人源化的抗体，其中特定的氨基酸已被替代、缺失或添加。具体而言，优选的人源化抗体在构架区中具有氨基酸替代，从而改进与抗原的结合。例如，在一种具有小鼠CDR的人源化抗体中，位于人类构架区中的氨基酸可由位于小鼠抗体中相应位置的氨基酸替代。已知这种替代在一些例子中可改进人源化抗体与抗原的结合。此处将氨基酸已进行添加、缺失或替代的抗体称为修饰的抗体或改变的抗体。 
术语修饰的抗体也意欲包括已通过如缺失、添加或替代部分抗体进行修饰的抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，抗体可通过缺失恒定区并由意欲增加抗体的半衰期如血清半衰期、稳定性或亲和力的恒定区替代而进行修饰。任何修饰均在本发明范围之内，只要双特异性和多特异性分子具有至少一个对FcγR特异性的抗原结合区，并触发至少一种效应功能。 
本发明的双特异性和多特异性分子可应用化学技术(参见如D.M.Kranz等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)、“polydoma”技术(参见授予Reading的美国专利号4,474,893)或重组DNA技术制备。 
具体而言，本发明的双特异性和多特异性分子可通过应用本领域中公知的和在此处提供的实施例中描述的方法偶联组分结合特异性制备，如抗-FcR和抗-CD30结合特异性。例如，双特异性和多特异性分子的每一种结合特异性可单独生成，然后相互偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联或交联剂可用于共价偶联。交联剂的例子包括A蛋白、碳二亚氨基、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己基-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)(参见如Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括那些由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等人(Science(1985)229：81-83和Glennie等人，(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所描述的。优选的偶联试剂为SATA和sulfo-SMCC，两者均可购自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。 
当结合特异性是抗体时(如两种人源化抗体)，它们可通过两个重链C-末端铰链区的巯基键偶联。在一个特别优选的实施方案中，对铰链区进行修饰以使其在偶联前含有奇数个巯基残基，优选为1个。 
可选择地，两种结合特异性可在相同的载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性和多特异性分子是MAb x MAb，MAb x Fab，Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白质时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性和多特异性分子，如双特异性分子可为单链分子，如单链双特异性抗体、包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链双特异性分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可为单链分子，或者可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性和多特异性分子的方法描述于如美国专利号5,260,203、美国专利号5,455,030、美国专利号4,881,175、美国专利号5,132,405、美国专利号5,091,513、美国专利号5,476,786、美国专利号5,013,653、美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858中。 
双特异性和多特异性分子与其特异性目标的结合可通过酶联免疫 吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或蛋白质印迹测定进行证实。这些测定的每一个通常通过应用对感兴趣的复合物特异性的标记试剂(如抗体)探测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，FcR-抗体复合物可应用如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段进行探测。可选择地，该复合物可应用多种其他免疫测定中的任何一种进行探测。例如，抗体可为放射性标记的并用于放射免疫测定(RIA)中(参见如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，1986年3月，在此处将其引入作为参考)。放射性同位素可通过以下方法探测，即γ计数器或闪烁计数器或放射自显影。 
IV.免疫偶联物
在另一方面，本发明的特征为与治疗部分如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射毒素偶联的人类抗-CD30单克隆抗体或其片段。此处将这种偶联物称为“免疫偶联物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫偶联物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害(如杀伤细胞)的试剂。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩葡糖苷、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红菌素、二羟炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。 
用于形成本发明的免疫偶联物的适当治疗剂包括，但不局限于抗代谢物(如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化剂(如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺式铂氨)、安慈那环素(如道诺红菌素(以前为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(如更生霉素(以前为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(如长春花新碱和长春花碱)。在一个优选实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或放射毒性剂。在另一 个实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。在另一个实施方案中，治疗剂是GM-CSF。在一个优选实施方案中，治疗剂是阿霉素(阿霉素(adriamycin))、顺式铂氨博来霉素硫酸盐(cisplatin bleomycinsulfate)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺羟脲或蓖麻毒蛋白A。 
本发明的抗体也可与放射毒素如放射性碘偶联，以生成用于治疗CD30-相关的病症如癌的细胞毒性防放射药物。本发明的抗体偶联物可用于修饰给定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可为具有需要的生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括如酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；一种蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者生物学反应调节物，如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。 
使这种治疗部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等人(eds.)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(eds.)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，第303-16页(AcademicPress 1985)和Thorpe等人，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。 
V.药物组合物
在另一方面，本发明提供了一种组合物，如药物组合物，该组合物含有与药物可接受的载体配制在一起的本发明的一种人类单克隆抗体或其抗原结合部分，或它们的组合。在一个优选实施方案中，组合物包括本发明多种(如两种或更多)分离的人类抗体或其抗原结合部分的组合。优选地，组合物的每一种抗体或其抗原结合部分与不同的预选CD30表位结合。 
本发明的药物组合物也可在组合治疗中施用，即与其他试剂组合。例如，组合治疗可包括具有至少一种抗炎剂或至少一种免疫抑制剂的本发明的组合物。此外，这种治疗剂包括甾族和非甾族的抗炎药物(NSAIDS)，如阿司匹林和其他水杨酸盐，如布洛芬(布洛芬(Motrin)，阿迪维尔片(Advil))、萘普生(萘普生(Naprosyn))、舒林酸(舒林酸(Clinoril))、扶他林(扶他林(Voltaren))、吡罗昔康(吡罗昔康(Feldene))、酮基布洛芬(酮基布洛芬(Orudis))、二氟尼柳(二氟尼柳(Dolobid))、萘丁美酮(萘丁美酮(Relafen))、依托度酸(依托度酸(Lodine))、噁丙嗪(噁丙嗪(Daypro))、吲哚美辛(吲哚美辛(Indocin))，且阿司匹林为高剂量。 
如在此处所用的，“药物可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。依赖于施用途径，可将活性化合物即双特异性和多特异性分子包被于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。 
“药物可接受的盐”指保持了亲代化合物的所需生物学活性且不引起任何不想要的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些源自非毒性无机酸的，如盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及源自非毒性有机酸的，如脂族单和二酸酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括那些源自碱土金属的，如钠、钾、镁、钙等，以及源自非毒性有机胺的，如N，N’-二苄基亚乙基二酰胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。 
本发明的组合物可通过本领域中公知的多种方法施用。如本领域 技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将依赖于需要的结果而变化。活性化合物可以与防止该化合物快速释放的载体一起制备，如有控制的释放制剂，包括植入物、经皮的药膏和微囊化的送递系统。可应用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法是获得专利的，且通常是本领域技术人员公知的。参见如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。 
为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，必须用防止其失活的材料包被化合物，或使该化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，化合物可在适当的载体中给被试者施用，例如脂质体或稀释剂。药物可接受的稀释剂包括盐水和含水的缓冲液。脂质体包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳剂以及常规的脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。 
药物可接受的载体包括用于临时制备无菌注射型溶液或分散体的无菌的含水溶液或分散体和无菌粉末。这种药物活性物质的介质和试剂的用途是本领域中公知的。除在任何常规介质或试剂与活性化合物相容的情况之外，可以预期其在本发明的药物组合物中的用途。也可将补加的活性化合物整合入组合物中。 
治疗组合物一般必须为无菌的，且在制造和贮藏条件下为稳定下。组合物可制备为溶液、微乳、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可为溶剂或分散介质，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适当的混合。适当的流动性的维持可通过如应用包被物如卵磷脂，通过在分散的情形中维持必需的颗粒大小及通过应用表面活性剂。在许多情形中，在组合物中优选地包括等渗剂，例如，糖；多元醇，如甘露醇、山梨糖醇；或氯化钠。注射型组合物延长的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来实现，如单硬脂酸盐和明胶。 
无菌的注射型溶液的制备包括将必需量的活性化合物与必需的一种上述列举的成分或成分的组合整合入适当的溶剂中，随后为灭菌的微量过滤。通常，分散体通过将活性化合物整合入无菌的载体中进行制备，该载体含有基本的分散介质和来自上述列举的其他必需成分。 在用于制备无菌注射型溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这可从其前述无菌过滤的溶液中得到活性成分加任何额外必需成分的粉末。 
对剂量方案进行调整以提供最适的所需反应(如治疗反应)。例如，可施用单个大丸剂，随时间可施用几个分开的剂量，或者可如治疗状况的紧急情况所示按比例降低或增加剂量。尤其有利的是为了便于施用和剂量的一致，以剂量单位形式制备肠胃外组合物。如在此处所用的剂量单位形式指适用做要治疗的被试者的单位剂量的物理上不连续的单位；每一个单位含有预定量的活性化合物，该活性化合物经计算可以与必需的药物载体结合产生所需的治疗作用。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和要达到的特殊治疗作用，和(b)本领域中化合这样的活性化合物以治疗个体中的敏感性中固有的限制。 
药物可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱盐酸(cysteine hydrochloride)、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁化羟基甲苯(DHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合物，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。 
对于治疗组合物，本发明的制剂包括那些适合于口服、经鼻的、局部的(包括经口的和舌下的)、直肠的、阴道的和/或肠胃外施用的。制剂可方便地以单位剂量形式存在，且可通过药剂学领域中公知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分的量将依赖于要治疗的被试者和特殊的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分的量通常为产生治疗作用的组合物的量。通常，在100％中，该量范围为约0.01％～约99％的活性成分，优选地为约0.1％～70％，最优选地为约1％～约30％。 
本发明适用于阴道施用的制剂也包括含有本领域中公知的适当载体的阴道栓、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。用于本发明组合物的局部或经皮施用的剂量形式包括粉末、喷雾、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与药物可接受的载体及与任何必需的防腐剂、缓冲液或推进剂进行 混合。 
如在此处所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”指不同于肠的和局部施用的施用模式，通常通过注射，且包括但不局限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、胸骨内注射和输注。 
可用于本发明的药物组合物中的适当的含水或不含水载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射型有机酯如油酸乙酯。适当的流动性可通过如应用包被材料如卵磷脂、在分散情形中维持必需的颗粒大小和应用表面活性剂而维持。 
这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包括各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等而确保防止存在微生物。也预期在组合物中包括等渗剂如糖类、氯化钠等。此外，可通过包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶而实现注射型药物形式的延长的吸收。 
当本发明的化合物作为药物施用于人和动物时，它们可单独施用，或者作为药物组合物施用，该药物组合物含有如与药物可接受的载体组合的0.01～99.5％(更优选地为0.1～90％)的活性成分。 
不管所选择的施用途径，将本发明可以以适当的水合形式施用的化合物和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员公知的常规方法制备为药物可接受的剂量形式。 
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可进行改变，以获得可对特定患者、组合物和施用方式有效实现所需治疗反应，而不对患者有毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将依赖于多种药物代谢动力学因素，包括本发明应用的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用方式，施用时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物组合应用的其他药物、化合物和/或材料，治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和以前病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。 
本领域普通的医生或兽医易于确定并开出有效量的所需药物组合物的药方。例如，医生或兽医可以由低于为实现所需的治疗作用所必 需的剂量开始应用药物组合物中应用的本发明化合物，并逐渐增加剂量，直到实现了所需的作用。通常，本发明组合物适当的日用剂量为可有效产生治疗作用的最小剂量。这种有效剂量通常依赖于上述因素。优选的是通过静脉内、肌内、腹膜内或皮下进行施用，且优选的是施用于目标位点近处。如果需要，治疗组合物的有效日用剂量可在一日中以适当间隔单独施用的2次、3次、4次、5次、6次或更多次副剂量进行施用，任选地以单位剂量的形式。尽管可能单独施用本发明的化合物，但优选的是作为药物制剂(组合物)施用。 
治疗组合物可应用本领域公知的医疗设备施用。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针的皮下注射设备施用，如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的设备。用于本发明的众所周知的植入物和组件的例子包括：美国专利号4,487,603，该专利公开了用于以有控制的速率分散药物的植入型微量输注泵；美国专利号4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤施用药物(medicant)的治疗设备；美国专利号4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率送递药物的医学输注泵；美国专利号4,447,224，该专利公开了用于连续的药物送递的变流植入型输注设备；美国专利号4,439,196，该专利公开了具有多个室的区室的渗透药物送递系统；和美国专利号4,475,196，该专利公开了一种渗透药物送递系统。在此处将这些专利引入作为参考。许多其他这种植入物、送递系统和组件是本领域技术人员公知的。 
在某些实施方案中，可对本发明的人类单克隆抗体进行配制以确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)排除了任何高亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗组合物跨BBB(如果需要)，可将它们配制在如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一种或多种选择性地转运入特定细胞或器官中的部分，从而增强导向的药物送递(参见如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的导向性部分包括叶酸或生物素(参见如授予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂A蛋白受体(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同种类可包含本发明的制剂以及发明的分子的成分；p120(Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一个实施方案中，将本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选实施方案中，脂质体包括导向性部分。在一个最优选实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过快速灌注送递到靠近所需区域的位点，如炎症或感染位点，或者送递到肿瘤位点。组合物必须具有易于注射的流动程度。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的，且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。 
相对于未治疗的被试者而言，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长的至少约20％，更优选地为至少约40％，更优选地为至少约60％，更优选地为至少约80％。组合物抑制肿瘤的能力可在预示在人类肿瘤中的功效的动物模型中进行估计。可选择地，组合物的该性质可通过用技术人员公知的测定检查组合物进行抑制如体外抑制的能力而进行估计。治疗有效量的治疗化合物可减小肿瘤大小，或者改善患者中的症状。本领域技术人员能够基于如下因素确定这种量，该因素如被试者大小、被试者症状的严重性和选择的特定组合物或施用途径。 
组合物必须是无菌的，且流动性达到该组合物可通过注射器送递的程度。除水之外，载体可为等渗缓冲的盐溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其适当的混合物。适当的流动性的维持可通过如应用包被物如卵磷脂，通过在分散的情形中维持必需的颗粒大小及通过应用表面活性剂。在许多情形中，在组合物中优选地包括等渗剂，例如，糖；多元醇(polyalcohol)，如甘露醇、山梨糖醇；和氯化钠。注射型组合物长期的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来实现，如单硬脂酸盐或明胶。 
如上所述，当活性化合物得到适当保护时，该化合物可应用如惰性稀释剂或可同化的可食用载体进行口服。 
VI.本发明的用途和方法
本发明的人类抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内诊断和治疗效用，包括CD30介导的病症的诊断和治疗。例如，可将这些分子如在体外或来自体内施用于培养物中的细胞，或者如在体内施用于人类被试者，以治疗、预防和诊断多种病症。如在此处所用的，术语“被试者”意欲包括人类和非人类动物。优选的被试者包括患有CD30活性介导的病症的患者。 
例如，本发明的人类抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患有致瘤性病症的被试者，如特征在于存在表达CD30的肿瘤细胞的病症，包括如何杰金氏病、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T-细胞或B-细胞淋巴瘤。本发明的人类抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患有其他病症的患者，如自身免疫病，包括如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、Omen氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关的疾病。 
在一个实施方案中，本发明的抗体(如人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可用于探测CD30的水平，或用于探测其膜表面含有CD30的细胞的水平，然后该水平与某些疾病症状关联。可选择地，抗体可用于抑制或阻断CD30的功能，这反过来可与某些疾病症状的预防或改善关联，从而提示CD30是疾病的介质。这可通过使样品和对照样品与抗-CD30在使得抗体和CD30之间能够形成复合物的条件下接触而实现。在样品和对照中可探测并比较抗体和CD30之间形成的任何复合物。 
在另一个实施方案中，最初可检验本发明的抗体(如人类抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)与在体外的治疗或诊断用途相关的结合活性。例如，可应用在下文实施例中描述的ELISA和流式细胞仪测定检验本发明的组合物。此外，可以测定这些分子在触发至少一种效应物介导的效应细胞活性中的活性，包括抑制表达CD30的细胞的生长和/或杀死该细胞。用于测定效应细胞介导的ADCC或吞噬作用的 规程描述于下文实施例中。 
本发明的抗体(如人类抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在CD30-相关的疾病的治疗和诊断中具有额外的效用。例如，人类单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物可用于在体内或在体外引起一种或多种下述生物学活性：抑制表达CD30的细胞的生长和/或杀死该细胞；在人类效应细胞存在时介导表达CD30的细胞的吞噬作用或ADCC；抑制可溶性CD30的释放、阻断与CD30结合的CD30配体、抑制IL-4表达或介导Th2表型的表达，如在低剂量时。 
在另一个实施方案中，本发明的抗体(如人类抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)不能诱导补体介导的细胞裂解，因此，在触发补体活化的痛苦如痤疮中具有较少的副作用。痤疮的主要起因是产皮脂的滤泡中角化模式中的改变。由于角质细胞表达CD30，所以对皮肤中CD30信号转导过程的干扰可改变滤泡中角质细胞的生长和分化，这导致痤疮的形成。直接的免疫荧光研究已显示在早期非发炎的和发炎的痤疮损害中，存在补体经典途径和补体旁路途径的活化。 
在一个特定实施方案中，本发明的抗体(如人类抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可在体内用于治疗、预防或诊断多种CD30-相关的疾病。其中，CD30-相关的疾病的例子包括癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T-细胞或B-细胞淋巴瘤。此外，其他CD30介导的疾病包括自身免疫病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、Omen氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关的疾病。 
在一个特定实施方案中，本发明的抗体(如人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可用于治疗或预防何杰金氏病(HD)，这是因为抗体可限制CD30在HD和其他致瘤性疾病中所起的作用。何杰金氏病是一类淋巴瘤。淋巴瘤是在淋巴系统中发展的癌，该淋巴系统是身体免疫系统的一部分。因为在身体的许多部分存在淋巴组织，所以HD几乎可在身体的任何部分开始。癌可扩散到身体中的几 乎任何器官或组织，包括肝、骨髓(身体大骨骼中产生血细胞的海绵组织)和脾。已报道何杰金氏和Reed-Sternberg细胞中CD30升高的表达与HD的区分性诊断相关。因此，本发明的CD30抑制性抗体可用于预防或阻断导致HD的CD30的作用，因而，可用于预防或治疗该疾病。 
本发明的人类抗体(如人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)也可用于阻断或抑制CD30的其他作用。例如，已知CD30也由多种非何杰金氏淋巴瘤亚型进行有规律的表达。因此，本发明抗体的另一个用途包括预防和治疗包括非何杰金氏淋巴瘤的疾病。这些疾病包括伯基特淋巴瘤、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T-细胞淋巴瘤、结节性小切割的细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、Lennert氏淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-细胞淋巴瘤(T-ALL)和内分芽型/中央细胞(centrocytic)(cb/cc)滤泡淋巴瘤。 
在另一个特定实施方案中，本发明的人类抗体(如人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可用于阻断或抑制CD30的其他作用。例如，已知可溶性CD30有规律地从表达CD30的细胞表面释放。在患有多种致瘤性和自身免疫病症的患者血清中已报道有升高的sCD30水平。因此，本发明抗体的另一个用途包括预防或治疗疾病，包括阻断或抑制sCD30的释放。这种疾病包括，但不局限于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病和Omen氏综合征。 
在体内和在体外施用本发明的抗体组合物(如人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)的适当途径是本领域中众所周知的，且可由技术人员进行选择。例如，抗体组合物可通过注射(如静脉内或皮下)施用。所用的分子的适当剂量将依赖于被试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或配方。 
如上所述，本发明的人类抗-CD30抗体可以与一种或其他多种治疗剂一起施用，如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂。抗体可以与试剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与试剂单独施用。在后一种情形(单独施用)中，抗体可在试剂之前、之后或与其同时施用，或者与其他已知的治疗如抗癌治疗如放射共同施用。其中，这种治疗剂 包括抗癌剂如阿霉素(adriamycin)、顺式铂氨硫酸博来霉素、亚硝基脲氮芥、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲，这些治疗剂自身仅在对患者有毒性或亚毒性的水平上有效。顺式铂氨每隔4日1次以100mg/m2 的剂量经静脉内施用，而阿霉素每隔21日1次以60-75mg/m2的剂量经静脉内施用。本发明的人类抗-CD30抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共同施用提供了两种通过不同机制起作用的抗癌剂，该抗癌剂可对人类肿瘤细胞产生细胞毒性作用。这种共同施用可解决归因于肿瘤细胞对药物发展抗性和抗原性变化而使其与抗体无反应性的问题。 
目标特异性效应细胞也可用作治疗剂，如与本发明的组合物(如人类抗体、多特异性和双特异性分子)连接的效应细胞。导向性效应细胞可为人类白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞和其他带有IgG-或IgA-受体的细胞。如果需要，效应细胞也可从要治疗的被试者中获得。目标特异性效应细胞可作为生理学可接受的溶液中的细胞悬浮液施用。施用的细胞数目可在108-109的量级，但将依赖于治疗目的而变化。通常，该量将足以获得在目标细胞如表达CD30的肿瘤细胞的定位，并足以通过如吞噬作用影响细胞杀伤。施用途径也有变化。 
应用目标特异性效应细胞的治疗可以与用于去除导向的细胞的其他技术联合进行。例如，应用本发明的组合物(如人类抗体、多特异性和双特异性分子)和/或用这些组合物武装的效应细胞的抗癌治疗可以与化学疗法联合应用。此外，组合免疫疗法可用于将两种不同的细胞毒性效应物群体导向于肿瘤细胞排斥。例如，与抗-Fc-γRI或抗-CD3连接的抗-CD30抗体可用于与IgG-或IgA-受体特异性结合剂的联合。 
本发明的双特异性和多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcγR或FcαR水平，如通过覆盖或消除细胞表面上的受体。抗-Fc受体的混合物也可用于该目的。 
在补体存在时也可应用本发明的组合物(如人类抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)，该组合物具有补体结合位点，如来自结合补体的IgG1、-2或-3或IgM的部分。在一个实施方案中，可以通过添加该补体或含有该补体的血清来补充来自体内的细胞群体治疗，该细胞群体包含具有本发明结合剂的目标细胞和适当的效应细 胞。用本发明的结合剂包被的目标细胞的吞噬作用可通过结合补体蛋白质而改进。在另一个实施方案中，本发明的组合物(如人类抗体、多特异性和双特异性分子)包被的目标细胞也可通过补体裂解。在另一个实施方案中，本发明的组合物不活化补体。 
本发明的组合物(如人类抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)也可与补体一起施用。因此，在本发明范围内的有包含人类抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物和血清或补体的组合物。这些组合物优点在于补体位于人类抗体、多特异性或双特异性分子的最近处。可选择地，本发明的人类抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清可单独施用。 
同样在本发明范围内的是包含本发明的抗体组合物(如人类抗体和免疫偶联物)及其使用说明的试剂盒。该试剂盒可进一步含有一种或多种额外试剂，如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射毒性剂，或一种或多种本发明额外的人类抗体(如具有补体活性的人类抗体，该抗体与不同于第一人类抗体的CD30抗原中的表位结合)。 
因此，用本发明的抗体组合物治疗的患者可额外施用(在本发明的人类抗体施用之前、同时或之后)另一种治疗剂，如细胞毒性剂或放射毒性剂，该治疗剂可增强或增加人类抗体的治疗作用。 
在另一个实施方案中，被试者可额外用如下试剂进行治疗，该试剂通过如用细胞因子治疗被试者而调节如增强或抑制Fcγ或Fcα受体的表达或活性。用于在多特异性分子的治疗中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。 
在另一个实施方案中，被试者可额外用淋巴因子制剂进行治疗。应用淋巴因子制剂可诱导不高度表达CD30的癌细胞表达CD30。淋巴因子制剂可导致肿瘤细胞中更均一的CD30表达，这可导致更有效的治疗。适合于施用的淋巴因子制剂包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子及其组合。这些制剂可在静脉内施用。适当的淋巴因子剂量为10,000～1,000,000单位/患者。 
本发明的组合物(如人类抗体、多特异性和双特异性分子)也可用于导向于表达FcγR或CD30的细胞，例如标记这些细胞。对于这种用途，结合剂可以与可探测的分子连接。因而，本发明提供了来自体 内或在体外定位表达Fc受体如FcγR或CD30的细胞的方法。可探测的标记可为如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。 
在一个特定实施方案中，本发明提供了探测样品中存在CD30抗原或测量CD30抗原的量的方法，包含在使得在抗体或其部分和CD30之间能够形成复合物的条件下，使样品和对照样品与特异性结合CD30的人类单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后探测形成的复合物，其中与对照样品相比在样品间形成的不同复合物是样品中存在CD30抗原的指示。 
在另一个实施方案中，本发明提供了通过给被试者施用上述人类抗体而治疗被试者中CD30介导的病症的方法，如何杰金氏病、成人T-细胞淋巴瘤、传染性单核细胞增多症和系统性红斑狼疮。将这种抗体及其衍生物用于抑制与某些病症相关的CD30诱导的活性，如增殖和分化。可由本发明的抗体抑制的其他CD30诱导的活性包括增加的sCD30生产、增加的IL-4表达和增加的Th2表型的生产。通过使抗体与CD30接触(如通过给被试者施用抗体)，CD30诱导这种活性的能力受到抑制，因而相关的病症得到治疗。优选地，抗体与对CD30特异性的表位结合，因而，有利地抑制CD30诱导的活性，但不干扰结构相关的表面抗原如NGFR、CD27和CD40的活性。 
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防由人类CD30介导的致瘤性病症的方法，如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T-细胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌(如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T-细胞或B-细胞淋巴瘤。该方法包括以治疗和预防病症的有效量给被试者施用本发明的抗体组合物。抗体组合物可单独施用，或者与另一种治疗剂一起施用，如与抗体组合物联合或协同作用以治疗或预防CD30介导的疾病的细胞毒性剂或放射毒性剂。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种治疗何杰金氏病的方法。在另一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种治疗ALCL的方法。 
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防由人类CD30介导的自身免疫病的方法，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化、特应性皮炎、突眼性甲状腺肿、桥本甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、 Omen氏综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、HIV和疱疹病毒相关的疾病。该方法包括以治疗和预防病症的有效量给被试者施用本发明的抗体组合物。抗体组合物可单独施用，或者与另一种治疗剂一起施用，如与抗体组合物联合或协同作用以治疗或预防CD30介导的疾病的免疫抑制剂。 
在另一个实施方案中，本发明提供了在体内或在体外探测表达Fc的细胞的存在或对其量进行定量的方法。该方法包含(i)给被试者施用与可探测的标记偶联的本发明的组合物(如多特异性或双特异性分子)或其片段；(ii)对被试者应用探测该可探测的标记的方法以鉴定含有表达Fc的细胞的区域。 
在另一个实施方案中，本发明的免疫偶联物可用于通过使这种化合物与抗体连接而将化合物(如治疗剂、标记、细胞毒素、放射毒素、免疫抑制剂等)导向于在其表面上(如膜结合的或与CD30受体结合的)结合有CD30的细胞。因而，本发明也提供了来自体内或在体外定位表达CD30和CD30受体的细胞的方法，该细胞如何杰金氏和Reed-Sternberg细胞(如具有可探测的标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。可选择地，免疫偶联物可用于通过将细胞毒素或放射毒素导向于CD30而杀伤在其表面上(如膜结合的或与CD30受体结合的)结合有CD30的细胞。 
本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将该实施例理解为进一步的限制。 
实施例 
实施例1  CD30-特异性人类单克隆抗体(HuMab)的生成 
I.用于生产完整的人类抗CD30单克隆抗体的转基因(Cmu导向的)小鼠的生成
CMD导向性载体的构建 
质粒pICEmu含有跨mu基因的鼠Ig重链基因座的EcoRI/XhoI片段，该质粒购自Balb/C基因组λ噬菌体文库(Marcu等人，Cell 22：187，1980)。将该基因组片段亚克隆入质粒pICEMI9H的XhoI/EcoRI位点(Marsh等人，Gene 32，481-485，1984)。在pICEmu中包括的重链序列从紧靠在mu内含子增强子3’的EcoR I位点下游延伸到位于mu基因最后一个跨膜外显子下游约1kb的XhoI位点；然而，mu转换重复区的大部分均已通过在大肠杆菌(E.coli)中的传代而删除。 
导向性载体构建如下。从pICEmu中切下1.3kb的Hind III/SmaI片段，并亚克隆入Hind III/Sma I消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)中。该pICEmu片段从位于Cmu1的5’约1kb的Hind III位点延伸到位于Cmu1中的Sma I位点。将结果所得的质粒用Sma I/Spe I进行消化，并插入来自pICEmu的约4kb的SmaI/Xba I片段，该片段从Cmu1的3’中的Sma I位点延伸到紧靠在Cmu外显子上游的Xba I位点。将结果所得的质粒pTAR1在Sma I位点线性化，并插入neo表达盒。该盒由在小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子控制下转录(Xba I/Taq I片段；Adra等人，(1987)Gene 60：65-74)和含有pgk多腺苷酸化位点(Pvu II/Hind III片段；Boer等人，(1990)Biochemical Genetics 28：299-308)的neo基因组成。该盒从质粒pKJ1(由Tybulewicz等人，(1991)Cell 65：1153-1163描述)获得，其中neo盒作为EcoR I/Hind III片段从该质粒中切下并亚克隆入EcoR I/Hind III消化的pGEM-7Zf(+)中以生成pGEM-7(KJ1)。通过EcoR I/Sal I消化将neo盒从pGEM-7(KJ1)中切下，平端化，并在基因组Cmu序列的相反方向亚克隆入质粒pTAR1的Sma I位点。用Not I使结果所得的质粒线性化，并插入单纯疱疹病毒(herpessimplex virus)胸苷激酶(tk)盒，以使得带有同源重组的ES克隆能够富集，如Mansour等人，(1988)Nature 336：348-352所述。该盒由小鼠pgk启动子和多腺苷酸化位点所夹的tk基因组成，如Tybulewicz等人，(1991)Cell 65：1153-1163所述。结果所得的CMD导向性载体含有总共约5.3kb的重链基因座同源物，并设计为能够生成突变的mu基因，在该基因中已在第一个Cmu外显子的Sma I位点插入了一个neo表达盒。在电穿孔进入ES细胞中之前，将该导向性载体用Pvu I进行线性化，该Pvu I在质粒序列中进行切割。 
导向的ES细胞的生成和分析 
AB-1 ES细胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.，(1990)Cell62：1073-1085)在基本如所述的无有丝分裂活性的SNL76/7细胞饲养层(如上)上生长(Robertson，E.J.(1987)Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells：a Practical Approach.(E.J.Robertson，ed.)Oxford：IRL Press，第71-112页)。将线性化的CMD导向性载体通过Hasty等人描述的方法电穿孔入AB-1细胞中(Hasty，P.R.等人(1991)Nature 350：243-246)。将电穿孔的细胞以1-2×106细胞/皿的密度涂平板于100mm的皿中。24小时后，将G418(200微克/毫升活性成分)和FIAU(5×10-7M)加入到培养基中，并使药物抗性克隆能够发育8-9日。挑取克隆，用胰蛋白酶消化，将其分为两部分，并进一步扩张。然后将源自每一个克隆的一半细胞冷冻，而用另一半分析载体和目标序列之间的同源重组。 
通过Southern印迹杂交进行DNA分析。如Laird等人所述，从克隆中分离DNA(Laird，P.W.等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：4293)。用Spe I消化分离的基因组DNA，并用915bp的Sac I片段探针A(见图1)进行探测，该探针A与mu内含子增强子和mu交换区之间的序列杂交。探针A在野生型基因座中探测到9.9kb的Spe I片段，而在与CMD导向性载体(neo表达盒含有Spe I位点)同源重组的mu基因座中探测到诊断性的7.6kb条带。在通过Southern印迹分析筛选的1132个G418和FIAU抗性克隆中，3个显示了指示在mu基因座进行了同源重组的7.6kb Spe I片段。进一步用酶Bgl I、BstX I和EcoR I消化这3个克隆，以证实载体同源整合入mu基因中。当与探针A杂交时，用Bgl I、BstX I和EcoR I消化的野生型DNA的Southern印迹分别产生15.7、7.3和12.5kb的片段，而mu等位基因的存在分别通过7.7、6.6和14.3kb的片段显示。通过Spe I消化探测的所有3个阳性克隆均显示预期的Bgl I、BstX I和EcoR I限制片段，该片段是neo盒插入到Cmu1外显子中的诊断性片段。 
带有突变的mu基因的小鼠的生成 
如Bradley所述，将称为264、272和408号的3个导向的ES克隆解冻并注射入C57BL/6J胚泡中(Bradley，A.(1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：a PracticalApproach.(E.J.Robertson，ed.)Oxford：IRL Press，第113-151页)。将注射的胚泡转移到假孕雌性的子宫中，以生成表现为源自输入的ES细胞和宿主胚泡的混合物的嵌合小鼠。ES细胞对嵌合体的贡献程度可通过黑色C57BL/6J背景上源自ES细胞系的野灰色皮毛颜色而进行可视的估计。克隆272和408仅产生低百分比的嵌合体(即，低百分比的野灰色色素)，但克隆264产生高百分比的雄性嵌合体。使这些嵌合体与C57BL/6J雌性交配，生成了野灰色的子代，显示ES细胞基因组的种系传播。通过来自尾巴活体解剖Bgl I消化的DNA的Southern印迹分析进行对导向的mu基因的筛选(如上文对ES细胞DNA的分析所述)。约50％的野灰色子代显示除15.7kb野生型条带之外的7.7kb杂交性Bgl I条带，从而证明导向的mu基因的种系传播。 
对转基因小鼠mu基因功能失活的分析 
为了确定neo盒插入到Cmu1中是否使Ig重链基因失活，使克隆264嵌合体与对JHD突变纯合的小鼠交配，该突变使由于JH基因段的缺失而使重链表达失活(Chen等人，(1993)Immunol.5：647-656)。生成了4个野灰色子代。从1月龄的这些动物获得血清，并通过ELISA测定鼠IgM的存在。4个子代中的2个完全缺乏IgM(参见表1)。通过Bgl I消化并与探针A杂交(参见图1)及通过Stu I消化并与475bp的EcoR I/Stu I片段杂交(如上)的来自尾巴活体解剖的Southern印迹分析对4个动物的基因分型证明不能表达血清IgM的动物是如下动物，其中重链基因座的一个等位基因带有JHD突变，另一个等位基因带有Cmu1突变。对JHD突变杂合的小鼠显示野生型水平的血清Ig。这些数据证明Cmu1突变使mu基因的表达失活。 
表1 
  小鼠   血清IgM  (微克/毫升) Ig H链基因型
  42   ＜0.002 CMD/JHD
  43   196 +/JHD
  44   ＜0.002 CMD/JHD
  45   174 +/JHD
  129 x BL6 F1   153 +/+
  JHD   ＜0.002 JHD/JHD
表1显示如下小鼠的通过ELISA探测的血清IgM水平，即带有CMD和JHD突变两者的小鼠(CMD/JHD)，对于JHD突变杂合的小鼠(+/JHD)，野生型(129Sv×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)和对于JHD突变纯合的B细胞缺陷型小鼠(JHD/JHD)。 
II.HCO12转基因小鼠的生成
HCO12人类重链转基因通过共同注射80kb的pHC2插入片段(Taylor等人，1994，Int.Immunol.，6：579-591)和25kb的pVx6插入片段生成。质粒pVx6如下所述进行构建。 
将8.5kb的Hind III/Sal I DNA片段亚克隆入质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)中以生成质粒p343.7.16，该DNA片段包含人类种系VH1-18(DP-14)基因及约2.5kb的5’侧翼的和5kb的3’侧翼的基因组序列。将7kb的BamH I/Hind III DNA片段克隆入基于pBR 322的质粒克隆载体pGPlf(Taylor等人，1992，Nucleic AcidsRes.20：6287-6295)中以生成质粒p251f，该DNA片段包含人类种系VH5-51(DP-73)基因及约5kb的5’侧翼的和1kb的3’侧翼的基因组序列。将源自pGPlf的新克隆载体pGPlk用EcoR I/BamH I消化，并与10kb的EcoR V/BamH I DNA片段连接，该DNA片段包含人类种系VH3-23(DP47)基因及约4kb的5’侧翼的和5kb的3’侧翼的基因组序列。将结果所得的质粒p112.2RR.7用BamH I/Sal I消化，并与7kb纯化的BamH I/Sal I p251f插入片段连接。将结果所得的质粒pVx4用Xho I消化，并与8.5kb的Xho I/Sal I p 343.7.16插入片段连接。 
获得了具有与其他2个V基因方向相同的VH1-18基因的克隆。然后用Not I消化称为pVx6的该克隆，并如Hogan等人所述，将纯化的26kb插入片段和纯化的80kb pHC2的Not I插入片段以1∶1的摩尔比共注射入半日的(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎原核中(B.Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，第2版，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，PlainviewNY)。从来自注射的胚胎发育的小鼠中确立了包含来自Vx6和HC2的序列的3个转基因小鼠独立品系。将这些品系称为(HCO12)14881、(HCO12)15083和(HCO12)15087。然后使这3个品系与包含描述于实施例1中的CMD突变、JKD突变(Chen等人，1993，EMBO J.12：811-820)和(KCo5)9272转基因(Fishwild等人，1996，NatureBiotechnology 14：845-851)的小鼠交配。结果所得的小鼠在对于内源小鼠重链和κ轻链基因座的破坏纯合的背景上，表达人类免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。 
III.抗CD30的HuMab的生产
抗人类CD30的人类单克隆抗体在如上所述生成的转基因小鼠中生产如下。 
抗原：将可溶性CD30与完全弗氏(Sigma F5881)佐剂混合以进行第一次免疫接种。然后，将抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma F5506)混合。应用乳化针将100μL PBS中的25微克CD30与佐剂进行1∶1的混合。将0.2毫升(cc)制备的抗原注射入小鼠腹膜内腔中。 
转基因小鼠：将小鼠置于过滤筐中，并进行估计以使其在免疫接种、出血日期和融合日处于良好的生理状况。 
免疫接种程序：将小鼠用如下组合进行免疫接种，即一次腹膜内注射完全弗氏佐剂中的L540细胞，和随后每隔14日腹膜内注射不完全弗氏佐剂中的可溶性重组CD30。将发展了抗表达CD30的细胞系L540的抗-CD30效价的动物在融合前72小时静脉内注射可溶性重组CD30。收获、纯化并融合小鼠脾细胞。杂交瘤制备：将P3 X63 ag8.653鼠骨髓瘤细胞系(ATCC CRL 1580，lot F-15183)用于融合。将最初的ATCC小瓶解冻，并在培养基中扩张。从该扩张中制备冷冻小瓶的原种。将细胞在培养基中维持3-6月，每周传代2次。将P388D1(ATCC TIB- 63FL)扩张为200mL并使其衰竭。将上清液沉淀且过滤，并用作称为条件培养基的培养基添加物。将该细胞系传代3-6个月，然后解冻一个新瓶。 
将含有5％FBS和青霉素-Strepatientomycin(Cellgro#30004030)的高葡萄糖DMEM(Mediatech，Cellgro#10013245)用于培养骨髓瘤和P388D1细胞。将含有5％FBS和青霉素-Strepatientomycin(Cellgro#30004030)的高葡萄糖DMEM(Mediatech，Cellgro#10013245)用于培养骨髓瘤和P388D1细胞。向杂交瘤生长培养基中添加额外的培养基补加物，包括3％Origen-杂交瘤克隆因子(Igen，36335)、10％P388D1条件培养基(8/10/99DH)、10％FBS(Hyclone，SH30071 lot#AGH6843)、L-谷氨酰胺(Gibco#1016483)、0.1％艮他霉素(Gibco#1020070)、2-巯基乙醇(Gibco#1019091)、HAT(Sigma，H0262)、1.0×104M次黄嘌呤、4.0×10-7 M Aminopatienterin、1.6×10-5M胸腺嘧啶核苷或HT((Sigma，H0137)、1.0×10-4M次黄嘌呤、1.6×10-5M胸腺嘧啶核苷)。 
使杂交瘤能够生长超过1周，直到确立了可见的群体。收获上清液，并将其用于通过ELISA应用人类κ链特异性捕获和人类Fc特异性探测对人类IgG进行初始筛选。然后通过流式细胞仪应用L540细胞和CD30 ELISA测定IgG阳性上清液。 
将产生特异性HuMab IgG的杂交瘤亚克隆并扩张。然后应用如下程序通过A蛋白柱层析纯化HuMab：(1)加载条件：将上清液加载在5ml用磷酸缓冲盐水(PBS)平衡的A蛋白柱上；(2)洗涤：PBS缓冲液；(3)洗脱：pH2.9的具有150mM NaCl的0.1M甘氨酸。将洗脱液用1M Tris缓冲液进行中和(每2ml组分用30μl)。在集合之前将每一种洗脱的组分进行凝胶电泳。一旦通过考马斯染色证实了纯度，则将组分集合，并用150mM pH7.2的NaCl对10mM磷酸钠缓冲液进行透析。该规程导致3种目标抗体的分离：17G1-1、5F11和2H9。 
从来自杂交瘤的RNA分离HuMab 17G1-1、5F11和2H9的VH和VL 区，逆转录为cDNA，并将V区用PCR进行扩增，且对PCR产物进行测序。 
实施例2  结合研究 
I.HuMab 5F11的亲和力和速度常数的确定
材料 
(1)2个克隆HuMab 5F11的IgG形式样品(Medarex，Inc.，Annandale，N.J.)。 
(2)人类CD30抗原(Medarex，Inc.，Annandale，N.J.)。 
(3)抗人类CD30/TNFRSF8多克隆抗体(R&D Systems；catalogno.AF229)。 
(4)CM5芯片、偶联缓冲液：10mM乙酸盐缓冲液，pH 6.0(CD 30偶联)和pH 3.5(A蛋白偶联)，再生缓冲液：10mM HCL。 
(5)Biacore 3000，BiaEval软件3.0.1版。 
A蛋白偶联 
应用氨基偶联化学将A蛋白(Fc2，2367Rus，注射时间10分钟，流速：5μl/分钟，pH 3.5)偶联在CH5芯片上。 
结合研究 
将HuMab 5F11(1μL/mL)在A蛋白表面捕获2.5分钟。(在独立的实验中，在G蛋白芯片上未捕获显著量的抗体)。在两个实验进行中，使不同浓度范围的CD30经过捕获的抗体。实验1的浓度范围包括：10、6.67、3.33和1.67μL/mL；实验2包括：5、4、2、1和0.5μL/mL。结合阶段持续10分钟，随后为10分钟的解离阶段。使数据符合朗缪尔结合模型，以确定各种参数，如下表所示。 
表2 
 实验#   抗体样品   Kon(x104 1/Ms)   Koff(x10-5 1/s)  KD(x10-9M)   Chi2
 1   5F11   6.09   7.47  1.23   2.83
 1   5F11   5.16   7.03  1.36   10.6
 2   5F11   6.13   6.86  1.12   7.92
 2   5F11   5.77   6.58  1.14   13.6
捕获的抗体表面的稳定性 
将HuMab 5F11(1μL/mL)在A蛋白表面捕获2.5分钟。使缓冲液流动1.5小时以模拟CD30抗原的结合和解离阶段，以检查捕获的抗体表面是否稳定。对于5F11，在整个实验期间显示了表面水平未改变(＜0.1％)的稳定表面。因此，5F11样品显示对CD30抗原相似的亲和常数，且捕获的抗体表面是稳定的，可进行进一步的结合研究。 
II.HuMab与重组CD 30的剂量依赖性结合
如下所述，通过捕获ELISA应用商业上可购得的鼠抗-CD30抗体BER-H2(DAKO Corp.，Carpenteria，CA)研究选择的HuMab与重组CD30结合的能力。 
将微量滴定板的孔用BerH2包被。在用5％BSA溶液阻断孔后，使得来自转染的表达重组CD30细胞的上清液与BER-H2包被的孔进行反应。去除上清液，并使不同浓度的A蛋白纯化的HuMab 5F11、2H9、17G1和同种型对照与CD30-结合的孔在37℃进行温育。1小时后，用PBS-tween洗涤孔，并通过使细胞与碱性磷酸酶标记的山羊抗人类IgGFc-特异性探针在37℃进行温育而探测结合的抗体。从孔中将过量的探针洗涤除去，并用pNPP显影液使平板显影。应用微量滴定板读数器确定405nm的光密度。 
如图1所示，抗-CD30 HuMab而不是同种型对照显示剂量依赖性结合。这显示抗-CD30HuMab特异性地识别重组CD30。抗-CD30HuMab与CD30结合中量的差异显示5F11、2H9和17G1是独特的抗体，这是因为结合中量的差异可能是由于亲和力差异和在重组形式CD30的识别中的差异。 
III.HuMab与L540的剂量依赖性结合
如下所述，通过流式细胞仪研究抗-CD30 HuMab与何杰金氏肿瘤细胞上的CD30结合的能力。 
对抗体与L540的结合进行检验，该L540是一种表达高水平CD30的何杰金氏淋巴瘤细胞系。使A蛋白纯化的HuMab 5F11、2H9、17G1和同种型对照以不同浓度与L540细胞系在4℃进行温育。1小时后，用PBS洗涤细胞，并通过使细胞与FITC标记的山羊抗人类IgG Fc-特 异性探针在4℃进行温育而探测结合的抗体。从细胞中用PBS将过量的探针洗涤除去，并通过应用FACScalibur设备的分析确定细胞结合的荧光。 
如图2所示，HuMab 5F11、2H9和17G1显示与L540细胞高水平的结合，且在低于1μg/ml的浓度达到饱和。这些数据证明这些抗体有效且特异性地与活肿瘤细胞上表达的天然CD30结合。 
IV.表位作图
已显示CD30含有至少3个命名为A、B和C的血清学限定的聚簇。为了确定HuMab 5F11结合哪个聚簇，研究了对聚簇A(Ki 4和BerH2)、聚簇B(Ki-1)或聚簇C(AC10)特异性的鼠抗体抑制FITC-标记的5F11与L540细胞结合的能力。简言之，使L540细胞同时与FITC-5F11连同10-20倍的未标记的抗体在冰上温育60分钟。洗涤细胞并通过FACS进行分析。所有阻断性抗体均为鼠来源的，且在其饱和浓度的10-倍过量水平应用。5F11 HuMab(1μg/ml)是异硫氰酸荧光素(FITC)标记的，且与CD30的结合通过荧光激活细胞分选仪(FACS)流式细胞计(FACScan，Becton Dickinson，Heidelberg，德国)确定。将一级抗体在冰冷的含有0.2％牛血清清蛋白和0.02％叠氮化钠(染色缓冲液)的磷酸缓冲盐水(PBS)中稀释，与1×105的L540细胞和5F11-FITC mAb在冰上温育60分钟。 
如图14所示，与聚簇A结合的抗体能够抑制FITC-5F11与L540细胞的结合，而与聚簇B或C结合的抗体不能，从而显示5F11与聚簇A表位结合或靠近聚簇A表位结合。 
实施例3  抗体依赖性细胞毒性(ADCC)研究 
I.HuMab对L540何杰金氏肿瘤细胞的单核细胞介导的抗体依赖性细胞毒性
应用健康人类单核细胞的51Cr-释放测定对抗-CD30 HuMab介导表达CD30的细胞裂解的能力进行了研究。在培养物中用IFN-γ活化健康人类单核细胞，以增量调节Fc受体和细胞溶解活性。将L540细胞用作由IFN-γ-活化的单核细胞进行裂解的目标。将从正常成人来源的 leukopacs纯化的单核细胞(Biological Specialty Corp.，PA)在巨噬细胞无血清培养基(M-SFM，Gibco，Grand Island，NY)上培养2日，该培养基补充了10％FBS和IFN-γ(1000u/ml，R&DSystems，Minneapolis，MN)。在U-底的微量滴定板上与效应细胞(E∶T＝50∶1)和HuMab组合之前，将目标细胞用100μCi的51Cr标记1-2小时。于37℃温育16小时后，收集上清液，并分析放射性。细胞毒性通过如下公式计算：％裂解＝(实验的CPM-目标泄露(target leak)CPM)/(去污剂裂解CPM-目标泄露CPM)×100％。特异性裂解＝具有HuMab的裂解％-不具有HuMab的裂解％。将测定进行3次。 
如图3所示，与同种型对照相比，HuMab 5F11、2H9和17G1介导何杰金氏肿瘤来源的L540细胞的特异性裂解。结果证明这些HuMab能够将表达CD30的肿瘤细胞导向于效应细胞，以进行Fc受体介导的裂解。 
II.HuMab对L540何杰金氏肿瘤细胞的单核的细胞介导的抗体依赖性细胞毒性
应用新鲜人类单核的细胞的51Cr-释放测定对抗-CD30 HuMab介导表达CD30的细胞裂解的能力进行了研究。 
将L540细胞用作由新鲜人类单核的细胞进行裂解的目标。单核的细胞通过ficoll hypaque密度离心从肝素化的全血中纯化。在U-底的微量滴定板上与效应细胞以各种效应细胞：目标细胞比例和与HuMab(5μg/ml)组合之前，将目标细胞用100μCi的51Cr标记1-2小时。于37℃温育4小时后，收集上清液，并分析放射性。细胞毒性通过如下公式计算：％裂解＝(实验的CPM-目标泄露CPM)/(去污剂裂解CPM-目标泄露CPM)×100％。特异性裂解＝具有HuMab的裂解％-不具有HuMab的裂解％。将测定进行3次。 
如图4所示，与同种型对照相比，HuMab 5F11和17G1介导何杰金氏肿瘤来源的L540细胞的特异性裂解。结果证明这些HuMab能够将表达CD30的肿瘤细胞导向于未活化的效应细胞，最可能导向于天然杀伤细胞(NK)，以进行Fc受体介导的裂解。 
实施例4  HuMab 5F11的生长抑制 
在96孔平板上由山羊抗人类IgG(GAH-IgG)抗体(10倍过量)使可溶性HuMab 5F11抗体(0.1、1和10μg/ml)与2×104细胞/孔(L540、L1236、Karpas 299、L428、BL38)交联。在37℃和5％CO2 中温育96小时后，应用XTT测定确定生长抑制，其中XTT即产色的四氮唑盐(钠3’-[1-[(苯基氨基)-羰基]-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯-磺酸水合物)。简言之，将具有或不具有10-倍过量的GAH-IgG的各种HuMab 5F11稀释物分配在96-孔平板的100μl等分试样中。添加100μl完全培养基等分试样中2-4×104的目标细胞(L540、L1236、Karpas 299)，并在37℃和5％CO2空气中温育48小时。然后用100μl新鲜培养基对细胞培养物脉冲4小时，该新鲜培养基补充了XTT和N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐(终浓度分别为1.49mM和0.025mM)。应用ELISA读数器(MWG Biotech，Ebersberg，德国)测量样品在450nm和650nm(参考波长)的分光光度吸收值。阴性对照的测量仅应用GAH-IgG和上述目标细胞，且应用HuMab 5F11和CD30阴性细胞系(BL38)上的交联抗体GAH-IgH。相对于未处理的对照培养物的细胞生存力用公式检验值/未处理的*100计算。所有测量均进行3次，并重复2次。具体而言，应用下面的对照：(1)无二级交联抗体；(2)仅有二级交联抗体；(3)无抗体的细胞；和(4)仅有XTT。 
T-细胞如HD细胞L540和Karpas 299细胞显示对细胞代谢的清楚的剂量依赖作用，而B-细胞如HD细胞L428和L1236不显示该作用。在10μg/ml的最高浓度达到了IC50，提示细胞毒性作用是中等的(参见图5)。这并不是一种假象，因为单独的GAH-IgG和5F11均不显示任何作用，且活性限制于L540和Karpas 299细胞。 
实施例5  HuMab 5F11的体内活性 
局部性肿瘤模型
在体内应用异种移植的小鼠模型对HuMab 5F11抑制表达CD30的肿瘤细胞生长的能力进行检查。通过将重悬于200μL PBS中的L540CY细胞(1×107)注射入SCID小鼠的右协腹中而确立皮下实体L540CY 肿瘤。每隔3日对肿瘤发展进行测量，且肿瘤体积用公式(长*宽*高)/2确定。具有确立的最大直径为4～6mm的肿瘤的动物随机分为不同的组，并每隔4日接受100μg 5F11(在200μL PBS中，腹膜内)，总共为4次注射。对照小鼠仅接受PBS。当对照组中的肿瘤直径中值超过20mm(第107日)时，停止实验并处死小鼠。治疗和各自由5个动物组成的对照组和结果由第二组实验证实。 
每隔4日在腹膜内4次施用HuMab 5F11。在治疗第1日静脉内施用1次外周血淋巴细胞(PBL)。结果表示为肿瘤体积对以日表示的时间的图(图6)。单独施用的PBL对肿瘤生长具有影响，但添加抗体可增强该作用。抗体单独显示相当的抗肿瘤活性(图6)。这些结果证明单独施用或与人类PBL组合施用的HuMab 5F11能够抑制动物模型中表达CD30的肿瘤细胞的生长。 
弥散性肿瘤模型
在无病原体的条件下维持无病原体的雌性C.B-17/Icr SCID小鼠(FOX CHASE M&B A/S，Ry，丹麦)，并饲喂高压灭菌的标准食物和水。将弥散性模型用于估计HuMab 5F11治疗对用人类HL细胞L540CY攻击的SCID小鼠存活力的作用。对于弥散性模型，将1×107指数生长的L540CY细胞通过尾部静脉(静脉内)注射入3-4周龄的SCID小鼠中。注射L540CY细胞后1日，使小鼠每隔4日在腹膜内(ip)接受在200μl PBS中稀释的100μg 5F11，总共为4次注射。对照组包括仅仅PBS、5F11+10倍过量的GAH-IgG mAb和应用相同治疗方案的单独GAH-IgG mAb。将具有渐进性疾病病征(波缘的皮毛、失活、头骨畸形)的小鼠处死。总体检查后，将肉眼可见的L540CY细胞浸润的器官用福尔马林固定。将存活到200日的动物杀死，并用福尔马林固定主要器官以进行进一步的检查。 
如由Kaplan-Meier分析所记录的(图15)，PBS治疗的对照组的平均存活时间为43日(范围为40-46日)，而GAH-IgG治疗的组为39日(范围为15-51日)。在5F11治疗组中，3/5小鼠是长期存活的(139日)，且在尸体解剖中未显示疾病病征。一个动物在第17日死亡，而未发展任何肉眼可见的疾病病征，提示死亡的原因与肿瘤无关。第二只小鼠在第57日死于渐进性疾病。在与GAH-IgG mAb交联后，4/4 小鼠未发展任何肿瘤病征，并于第200日处死。因而，在该HL异种移植模型中，用HuMab 5F11的治疗对于高百分比的动物是有疗效的(对于5F11+GAH-IgG和5F11治疗组分别为p＝0.01和p＝0.046)。 
实施例6  荧光素化的HuMab 5F11与正常人类组织的交叉反应性 
为了估计HuMab 5F11的荧光素化形式与正常人类组织冷冻切片的交叉反应性，应用了间接的免疫过氧化物酶方法。未观察到出乎意料的交叉反应性。 
该研究根据食品和药物管理实验室实践(GLP)规定(Food and DrugAdministration’s Laboratory Practice(GLP)Regulations)(21CFR Part 58)进行。人类组织实验组包括EC CPMP Guideline III/5271/94附件II中“建议用于交叉反应性免疫组织化学研究的人类组织列表(suggested list of human tissues to be used forimmunohistochemical investigations of cross reactivity)”上的组织和在1997 US FDA/CBER“在制造和检验用于人类的单克隆抗体中考虑的要点(Points to Consider in the Manufacture andTesting of Monoclonal Antibody Products for Human Use)”中建议的组织。 
将以前通过尸体解剖或外科活体解剖获得的组织在Tissue- 
Figure S03805221019960327D000701
O.C.T.基质中包埋，并在干冰上冷冻。将组织以约5μm进行切片，并于室温在丙酮中固定10分钟。将检验项目以两种浓度(2和10μg/mL)应用于载玻片，并将间接的免疫过氧化物酶方法(DakoEnVision Kit)用于探测结合。 
结果显示检验项目HuMab 5F11-FITC特异性地对阳性对照表达CD30的L540细胞的膜、何杰金氏病衍生的细胞系以及人类扁桃体中阳性对照表达CD30的淋巴细胞的膜进行染色。与阳性对照冷冻切片的反应性在两种检查的浓度(10μg/mL和2μg/mL)均是非常强的。在人类扁桃体中，CD30-阳性细胞位于滤泡外周以及滤泡间区域附近，并代表了低于1-2％的扁桃体细胞。 
对人类实验组织组的检查显示在除人类扁桃体之外的任何组织中未观察到交叉反应性。在所有3个检查的供体中，在位于滤泡外周以及滤泡间区域附近的淋巴细胞/单核的细胞中观察到了反应性。少于1 ％的扁桃体细胞被染色。该反应性是基于以前对CD30的扁桃体表达的报道预测的(Hecht等人，1985)。 
实施例7  抗体测序 
如上文实施例1所述，通过A蛋白柱层析纯化了来自产生特异性HuMab IgG的杂交瘤的HuMab，这导致了3种目标抗体的分离：17G1-1、5F11和2H9。随后从质粒RNA中分离了HuMab 17G1-1、5F11和2H9的VH和VL区，逆转录为cDNA，将V区通过PCR进行扩增，并将PCR产物测序。下面是HuMab的VH和VL区的核酸和氨基酸序列。 
17G1 VH核酸序列： 
GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTG 
GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTT 
AGTAACTCTTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAG 
GGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACGAAGATGGAAGTGAGA 
AATTCTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAG 
AGACAACGCCGAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCT 
GAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGTTCAT 
TGGTACTTCCATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTC 
CTCA(SEQ ID NO：1) 
17G1 VH氨基酸序列： 
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSNSWMSWVRQAPGKG 
LEWVANINEDGSEKFYVDSVKGRFTFSRDNAENSLYLQMNSLRA 
EDTAVYYCARVHWYFHLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：2) 
17G1 VL核酸序列： 
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCC 
AGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGT 
TAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAG 
GCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTG 
GCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTT 
CACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTG 
TATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTGGACGTTCGGCC 
AAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：3) 
17G1 VL氨基酸序列： 
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPR 
LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYG 
SSPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：4) 
2H9 VH核酸序列： 
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTT 
CGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTC 
AGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAG 
GGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACC 
AAGTACACCCCGTCCCTCAAGAGCCGAGTCACCATATCAGTAG 
ACACGTCCAAGCACCAATTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGAC 
CGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGACTGTC 
TACTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTC 
CTCA(SEQ ID NO：5) 
2H9 VH氨基酸序列： 
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKG 
LEWIGEINHSGSTKYTPSLKSRVTISVDTSKHQFSLKLSSVTAADT 
AVYYCARETVYYFDLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：6) 
2H9 VL核酸序列： 
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC 
AGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGT 
AAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGC 
TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGC 
ATCCCAGCCAGGCTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCA 
CTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTA 
TTACTGTCAACAGCGTAGCAACTGGCCGTGGACGTTCGGCCAA 
GGGACCAAGGTGGAAATCAAA(SEQ ID NO：7) 
2H9 VL氨基酸序列： 
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRL 
LIYDASNRATGIPARLSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN 
WPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：8) 
5F11 VH核酸序列： 
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTT 
CGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTC 
AGTGCTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGG 
GGCTGGAGTGGATTGGGGACATCAATCATGGTGGAGGCACCA 
ACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGA 
CACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTAACC 
GCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGCCTAACTGCCT 
ACTGGGGCCAGGGAAGCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO：9) 
5F11 VH氨基酸序列： 
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSAYYWSWIRQPPGKG 
LEWIGDINHGGGTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAAD 
TAVYYCASLTAYWGQGSLVTVSS(SEQ ID NO：10) 
5F11  VL核酸序列： 
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAACCTCACTGTCTGCATCTG 
TAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTAT 
TAGCAGCTGGTTAACCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGC 
CCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGG 
GTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA 
CTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTA 
TTACTGCCAACAGTATGATAGTTACCCTATCACCTTCGGCCAA 
GGGACACGACTGGAGATTAAA(SEQ ID NO：11) 
5F11  VL氨基酸序列： 
DIQMTQSPTSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLTWYQQKPEKAPK 
SLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYD 
SYPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO：12) 
实施例8对人类何杰金氏病(HD)的CD30介导的治疗 
由于引入多化学疗法方案如MOPP或ABVD及改进的放射技术(Devita VT，Jr.等人，Ann Intern Med 73：881(1970)；BonadonnaG等人，Cancer Treat Rep 66：881(1982)；Kaplan H.S.Cancer45：2439(1980))，何杰金氏病(HD)已成为可以治愈的疾病。最近，应用由German Hodgkin’s Lymphom Study Group(Diehl V等人，J Clin Oncol 16：3810(1998))确立的BEACOPP-方案后，晚期疾病患者显示改善的反应和存活率。然而，尽管大多数患者可通过标准方法治愈，但那些复发患者中低于30％的在第二线治疗后可达到持久无疾病的减轻(Carella A.M.等人，Leuk Lymphoma 7增刊：21(1992))。对于那些患有原发性难治疾病的患者结果更差(Linch D.C.等人，Lancet 341：1051(1993))。 
来自何杰金氏病以及其他恶性疾病的数据提示在第一线治疗后剩余的少数残留的肿瘤细胞可引起晚期的复发，该恶性疾病包括结肠直肠癌、骨髓白血病或非何杰金氏淋巴瘤(NHL)(Kanzler H等人，Blood87：3429(1996)；Wolf J等人，Blood 87：3418(1996)；RiethmullerG等人，Lancet 343：1177(1994)；Roy D.C.Blood 77：2404(1991)；Gribben J.G.等人，N Engl J Med 325：1525(1991))。因而，在第一线治疗后消除残留的何杰金氏-Reed/Sternberg(H-RS)细胞可进一步改善HD中的结果。已对用于治疗HD患者的许多不同单克隆进行了估计，包括抗体-毒素构建体(免疫毒素)、放射免疫偶联 物和未修饰的单克隆抗体。(Herpst J.M.等人，J Clin Oncol 13：2394(1995)；Schnell R.等人，Leuk Lymphoma 30：525(1998)；Engert A.等人，Blood 89：403(1997)；Schnell R.等人，已提交，(2001))。作为可能的替代物，双特异性抗体令人注意地可用作HD中的免疫试剂。通常，双特异性抗体已显示是良好耐受的。然而，这些构建体的副作用和细胞毒性潜力主要依赖于导向的效应细胞。 
迄今为止，大多数双特异性抗体包括淋巴细胞或NK细胞的不同亚群，它们在恶性疾病且特别是HD患者中是低效的(Hartmann F.等人，Blood 89：2042(1997))。因而，构建了一种新的基于高亲和力FcγRI受体(CD64)的双特异性分子(双特异性分子)，该受体在活化的嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达(Ravetch J.V.等人，Annu Rev Immunol 9：457(1991))。CD64充当对表达FcγRI的细胞毒性效应细胞的触发分子。单体IgG和IgG-抗原复合物均与FcγRI结合。仅有IgG-抗原复合物与FcγRI的结合导致增加的细胞毒性活性，包括细胞溶解、呼吸爆发和氧化性酶的产生(Fanger M.W.等人，Immunol Today 10：92(1989)；van de Winkel J.G.等人，J Leukoc Biol 49：511(1991))。 
鼠单克隆抗体M22在正常Fc结合结构域外部的表位结合FcγRI，从而避免与血清IgG的竞争(Guyre P.M.等人，J Immunol 143：1650(1989))。用于构建本发明报道的新双特异性分子的结合单位基于称为H22的抗-CD64单克隆抗体M22的人源化形式(Graziano R.F.等人，J Immunol 155：4996(1995))。H22 F(ab’)片段与源自抗CD30单克隆抗体Ki-4的F(ab’)片段化学连接。结果所得的双特异性分子H22xKi-4具有104kDa的分子量，因而使得与完整抗体相比具有更好的肿瘤穿透力。此外，该类构建体不活化补体或与表达Fc-受体的非细胞毒性细胞结合，从而导致最小的副作用(Fanger M.W.等人，Crit Rev Immunol 12：101(1992))。 
H22xKi-4的临床前体外检验证明该双特异性分子介导与单核细胞结合的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及与源自单核细胞的巨噬细胞结合的吞噬作用(MDM)(Sundarapandiyan K.等人，J Immunol Methods248：113(2001))。因而，CD64是用于在HD中募集免疫活性效应细胞的有希望的目标。进行了下面的I期临床研究，以证明该新治疗 性双特异性分子在HD患者中的功效。 
I.患者和方法
患者 
符合条件的患者具有可测量的和活性的晚期难治的HD，该HD不能由常规化学疗法改善。在≥30％从肿瘤活体解剖获得的H-RS细胞中通过与抗-CD30的反应性记录了CD30抗原的存在，该活体解剖在用H22xKi-4治疗前1年中进行。以前的化学疗法或放射疗法必须在研究药物施用前4周完成。此外，必须满足如下条件：存在可客观测量的疾病位点、2或更低的世界卫生组织(World Health Organization)(WHO)表现状态、18～70岁的年龄、至少3个月的生命期望、低于2mg/100ml的血清-肌酸酐、超过低限的75％的血清清蛋白、通过超声波心动描记法测量的基线左心室射血分数(LVEF)大于35％的心脏功能，和没有其他主要的医学问题。伴随的皮质类固醇治疗不是被排除的准则，因为渐进性HD患者常需要皮质类固醇治疗。该规程由制度上的道德委员会批准，且患者必须签署对治疗研究特性的书面同意书。 
研究设计
该临床实验是开放标记的(open-label)非随机I期剂量增加性研究。主要目的是确定当通过静脉内输注施用时，人类中H22xKi-4的最大耐受剂量(MTD)。第二个目的包括药物代谢动力学、剂量限制性毒性(DLT)、生物学最适剂量和任何抗肿瘤活性。患者接受至少两个各自由4次输注组成的疗程。H22xKi-4分别在第1、3、5和7日施用。根据单个研究者对患者反应的判断添加额外的疗程。 
剂量增加和主要毒性规则
最大耐受剂量(MTD)定义为紧在由毒性限制的剂量下的最高剂量水平。该剂量通过在3个或6个患者的至少2个中DLT的出现进行限定。6个患者均必须在MTD进行治疗。MTD应用如下加速的滴定设计进行估计：双步骤(100％)的剂量增加，其中每个同龄组中一个患者处于加速阶段，直到观察到任何疗程中的第一个DLT例子，或者观察到 任何疗程II级毒性的第二个例子为止(Simon R.等人，J Natl CancerInst 89：1138(1997))。然后，必须将目前剂量水平的同龄组扩展到至少3个患者，并将标准修饰的费氏(Fibonacci)剂量增加方案(具有50％的剂量增加)用于所有随后的剂量水平。未断定与研究药物相关的不利事件根据这些剂量增加规则和确定MTD的规则不认为是毒性。剂量组如下：1.0mg/m2/d、2.5mg/m2/d、5mg/m2/d、10mg/m2/d和20mg/m2/d。不管毒性的缺乏，在20mg/m2/d的剂量水平上总共登记了6个患者。DLT定义为任何III或IV级非血液学毒性(根据NCI准则)或IV级血液学毒性，不包括淋巴细胞减少、单核细胞减少或嗜中性粒细胞减少。如果已完成了以前剂量水平的H22xKi-4第三次施用而无DLT，那么患者可开始下一个剂量水平。在输注中的每一个小时和其后6小时中控制至关重要的病征。每周对患者进行监控，包括根据WHO准则的全血细胞计数、生物化学、尿状况、表现状况和毒性估计。在每一个疗程的第28日，重复基线估计，包括心电描记术、胸部x-射线、超声波心动描记法、肺功能检验、血清肌酸酐和肿瘤反应估计。 
药物配制和施用
H22xKi-4应用Glennie如前文所述的方法生产(Glennie M.J.等人，J Immunol 139：2367(1987))。药物在含有1mg/ml H22xKi-4的10ml无菌小瓶中提供，并必须贮存于4℃。在每次输注前，使患者接受总剂量10％或0.2mg(两者取较小的)H22xKi-4的初始检验剂量，该H22xKi-4溶于50ml生理盐水中并在10分钟内于静脉内施用。然后，在接受最终剂量的H22xKi-4之前30分钟，用口服1000mg对乙酰氨基酚和口服1mg氯马斯汀对患者进行前驱用药。如果在30分钟后，该检验剂量被耐受，而无任何显著毒性，则将H22xKi-4在500ml生理盐水中稀释，并开始以3mg/小时进行静脉内施用。如果在60分钟后未注意到不利反应，则将输注速率分别增加到6mg/小时和9mg/小时。 
药物代谢动力学 
在H22xKi-4施用的第1日，在下述时间点抽取血液到肝素化的试管中：输注前，紧在输注后，每一次输注后第2、4、8、12、24和48 小时。通过1,200g旋转10分钟从血液细胞分离血浆，随后贮存于-20℃中，直到进行药物代谢动力学的分析。H22xKi-4测定的探测限制对于前3个患者为0.125μg/ml，而对于所有随后的患者为0.04μg/ml。随时间过去的血浆H22xKi-4浓度数据在每一个被试者中H22xKi-4浓度对时间的半对数图上进行检查。Cmax和Tmax值是从原始药物代谢动力学数据中观察到的值。其他标准的药物代谢动力学参数应用WinNonlin Pro药物代谢动力学程序(Pharsight Corporation，Mountain View，CA.)进行估计。浓度-时间数据应用开放的非分区方法(open non-compartmental method)(WinNonlin model 202)进行分析。末期消除速率常数(ke)通过非分区分析确定，该分析应用末期3-6个点的血浆H22xKi-4浓度对数对时间作图的线性回归，应用非加权的范例。末期消除半衰期(T1/2)从0.693/ke估计。到最后一个数据点的AUC应用线性梯形法则(linear-trapezoidal rule)进行估计，并通过添加Wagner-Nelson校正(Clast/ke)外推到无穷大。总身体的清除(CL)通过用AUC(0-无穷大)除剂量来计算。表观分配体积(Vdz)从CL/ke估计。平均滞留期(MRT)从AUMC/AUC估计。稳定状态的表观分配体积(Vdss)从方程式Vdss＝CL×MRT估计。累积因子-R从方程式Treat X AUC(0-τ)/Treat 1 AUC(0-∞)估计。其中Treat X AUC(0-τ)是从0到任何治疗时给药间隔的AUC，而AUC(0-∞)是在第1日从0-无穷大的AUC。 
生物学活性的估计
由于本发明双特异性分子的DLT不大可能发生，所以研究了生物学活性的替代参数。紧在H22xKi-4输注前后和输注后第2、4、8和24小时测量了外周血中的单核细胞计数。CD64-表达通过应用适当抗体(FACS-Calibur，Becton-Dickinson)的FACS-分析确定，且与同种型对照相关。在相同的时间点，应用商业上可购得的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒确定了I1-6、I1-15、G-CSF和TNFα的血清水平。然后使治疗前的细胞因子水平与用双特异性分子治疗后的那些细胞因子相关，并应用Wilcoxcon-检验对显著性进行检验。与双特异性分子水平的相关应用Pearson系数进行检验。 
关于肿瘤，在每次施用双特异性分子日期的前后均通过ELISA (DAKO)测量sCD30水平。2个患者同意对最后输注H22xKi-4后24小时增大的外周淋巴结进行诊断性活体解剖。将该材料分为两部分，一部分立即进行新鲜的冷冻并贮存于-80℃，而另一部分包埋在石蜡中。对于免疫组织化学研究，将组织脱石蜡，切为5μm的切片，并用猪血清阻断10分钟，以减少非特异性染色。然后应用在PBS中1∶50稀释的一级单克隆抗体、多克隆兔抗小鼠Ab(DAKO)，并于4℃温育过夜，随后为生物素化的猪抗兔抗体(1∶200，于室温进行45分钟，E431 DAKO)和标准的生物素-链霉抗生物素蛋白试剂盒(DAKO)。最后，用固红(DAKO)对载玻片进行染色。作为第一个阴性对照(无双特异性分子)，在相同的程序中对来自未在本研究中进行处理的患者的HD标本进行染色。第二个阴性对照(以从其他用于染色程序的抗体中排除非特异性交叉反应性)是在该实验中获得的且未用一级抗体染色的材料。 
HABA/HAMA-反应
人类抗双特异性分子反应应用如前文所述的方法确定(PullarkatV.等人，Cancer Immunol Immunother 48：9(1999))。简言之，用双特异性分子包被的微量滴定板与血浆样品稀释物温育，且抗双特异性分子抗体应用碱性磷酸酶偶联的山羊抗(人类IgG)Fc-特异性探针进行探测。HABA-水平表示为在基线输注前值上x-倍的增加。 
反应的估计
根据Ann-Arbor分类系统进行阶段划分。完全的减轻(CR)定义为在至少4周的期间内不存在活性疾病的任何临床或放射性证据。部分的减轻(PR)定义为所有可测量的损害的两个最大垂直直径乘积中50％或更多的降低，如由不小于4周间隔的两次连续观察确定的。再次持续至少4周的小于25％的降低或总肿瘤体积的增加定义为无变化(NC)。渐进性疾病定义为出现任何新的损害，或肿瘤大小中大于25％的增加。 
II.结果
患者特征
总共包括了10个可以估计的在5个不同剂量水平治疗的多次预治疗复发的HD患者，其中2个是女性。年龄中值为34.6岁，范围为21～53岁。组织学包括3个具有何杰金氏病的混合细胞性的患者和7个具有结节性硬化亚型的患者。复发数目中值为3(范围为1～7)。已施用了中值为4的在前化学疗法(范围为2～6)，包括在9/10患者中具有自身干细胞支持的高剂量化学疗法。此外，所有患者已用放射疗法进行预治疗。在患者组中，分别为7个患者具有IV期疾病，3个患者具有III期疾病，5个患者具有研究登记(study entry)的B-症状，而8个患者用2个H22xKi-4疗程进行治疗，一个患者接受3个而一个患者接受4个治疗疗程(每个疗程均由4次输注组成)。 
毒性
在输注过程中和输注结束后6小时中，所有副作用均是瞬时发生的(参见表2)。在所有10个患者中，均观察到轻微的疲劳。其他毒性包括轻微低血压(4个，I级)、心动过速(6个，I级)、发烧(2个，I级；3个，II级)、寒冷(4个，I级)和肌痛(3个，I级)。所有这些副作用均在24小时中解决。未观察到血液学或器官毒性。 
药物代谢动力学
双特异性分子水平均在那些接受超过5mg/m2/d的患者中可探测。在所有被试者的所有治疗日中，Tmax发生在输注结束时或其后。血浆浓度随时间的衰减对于所有患者均为单指数的。在Cmax和AUC中存在随时间增加的趋势。因此，在一周的时间上对Cmax、T1/2z、AUC、Cl和Vdz进行了单变量、单因子重复的变异测量分析。该分析揭示了对Cmax (F＝5.885；p＝0.006)和AUC(F＝5.976；p＝0.005)的显著时间作用。这提示H22xKi-4随重复的给药而累积(参见图1和2)。对于所有研究的患者，通过第4次给药的累积因子R中值是1.36(范围为0.98-3.90)。H22xKi-4末期半衰期在10mg/m2/d的剂量为7.9小时(n＝1)，而在20mg/m2/d的剂量水平具有11.1小时的值(平均)(中值11.1小时；范围为5.3-18.2小时)(参见表3)。分配体积范围为20.26～183.20L/m2。20mg/m2组的分配体积(Vdz)平均值 为53.17L/m2。在第1日的总身体的H22xKi-4清除范围为1.02～14.06L/m2，其中接受了20mg/m2的患者组的平均值为3.91L/h/m2 (SD 5.04L/h/m2)。在所有具有可测量的双特异性分子水平的患者中可在第二个疗程结束后探测到低水平的HABA，这既不导致双特异性分子降低的血清水平，也不导致变态反应(参见表2)。用4个双特异性分子循环治疗的患者发展了高了HABA水平。 
生物学活性
存在I1-6、IL-15、TNFα和G-CSF的释放，其最大值在H22xKi-4输注结束后2～4小时。细胞因子释放是不显著的，可能是由于可估计的患者的有限数目(n＝6)和细胞因子水平的高患者间变异性。然而，存在如图3和4所示的细胞因子释放的清楚趋势。细胞因子释放看来随重复施用双特异性分子而改善，且对于G-CSF、TNFα和IL-6比IL-15是更显著的。一致地，外周血单核细胞上的CD64表达存在显著的降低(p＝0.018)，且其血量也下降(参见图5)。血清sCD30-水平在具有高肿瘤负担的患者中显著升高，但在第一次输注双特异性分子后不再可以探测，且维持非常低的水平，直到在所有患者中的治疗结束(未显示数据)。 
免疫组织化学
鼠的双特异性分子片段可应用上述方法在两个患者的淋巴结标本中进行探测(参见图6)。存在清楚的HRS-细胞染色，该染色定位于整个胞质中。此外，该组织中的巨噬细胞显示相同的染色模式。因而，存在双特异性分子穿入恶性淋巴结中的清楚证据。 
肿瘤反应
总的说来，有4个患者具有对H22xKi-4双特异性分子的客观反应。在弥散性肺小结最大为10mm的一个患者中观察到了CR。该反应持续3个月，然后肺小结变为再次可由CT-扫描测量的，并且起始了援救性的化学疗法。在3个患者中记录了持续4周～5个月的PR。一个患者(No 4)在4周后进行了额外的化学疗法。在该患者中，唯一的疾病位点是胸椎浸润。用双特异性分子的治疗导致神经学缺陷的完全 解决和可测量的部分反应。由于在另外2个H22xKi-4循环后不存在额外改善的反应，所以进行化学疗法以使疾病进展和可能的脊柱致命性骨折的危险最小化。 
在2个最低剂量水平治疗的2个患者具有渐进性的疾病，而4个患者显示稳定的疾病。在这些中，一个具有大块肿瘤(具有胸膜和胸壁浸润的右肺上部浸润)负担的患者(No 6)实现了该症状(咳嗽、盗汗)的显著改善，该患者在以前的化学疗法后经历了威胁生命的毒性(2个月的脓毒、急性肾衰竭、机械通气)。疾病稳定化和其一般状况的正常化持续12个月。 
III.结论
上述研究证明了以下内容：1)H22xKi-4在剂量达80mg/m2(在第1、3、5和7日给予)时是良好耐受的，仅具有轻微到中等的和瞬时的副作用。不存在剂量限制性毒性，且未达到该构建体的最大耐受剂量；2)在给予的最大剂量时H22xKi-4的半衰期是11.1小时，导致治疗期间由Cmax和AUC确定的药物的显著累积；3)存在IL-6、IL-15、TNFα和G-CSF的释放，以及单核细胞和CD64-表达的降低，提示了生物学活性剂量和方案；4)H22xKi-4诱导患有预治疗的晚期和难治的HD的患者中的肿瘤反应。H22xKi-4是一种新的双特异性分子，由源自鼠抗-CD30单克隆抗体Ki-4和人源化抗-CD64单克隆抗体H22的2个化学连接的F(ab’)片段组成。该构建体已显示在体外抗H-RS细胞系的活性(Sundarapandiyan K.等人，J Immunol Methods 248：113(2001))。 
在现有的和第一个H22xKi-4临床实验中，最常见的副作用是在所有治疗的10个患者中的疲劳。其他副作用包括心动过速、低血压、寒冷、发烧和肌痛。H22xKi-4的毒性特征类似如对几个抗淋巴瘤细胞的单克隆抗体描述的“细胞因子释放综合征”，该单克隆抗体包括Rituximab、Campath-1H或OKT3(Winkler U.等人，Blood 94：2217(1999)；Wing M.G.等人，J Clin Invest 98：2819(1996)；Norman D.J.等人，Transplant Proc 25：89(1993))。这些症状在所有剂量水平发作，提示即使在较低水平也有生物学活性。仅有II级发烧和轻微的肌痛局限于最高的剂量水平。症状的发作是多样 的，但在输注结束后持续不超过6小时。未观察到副作用和本研究中确定的H22xKi-4或细胞因子血清水平之间的直接相关。 
尽管有应用类似的高剂量的双特异性分子的事实，但不可确定H22xKi-4的MTD。6个患者用每个循环80mg/m2进行治疗，且给予一个患者的双特异性分子的最高总量为740mg。由于在该剂量水平不存在主要的副作用，所以在1、3、5和7日给予每个循环80mg/m2是安全的剂量。已知在其他特异性的单克隆抗体如rituximab中有非常相似的发现(Maloney D.G.等人，J Clin Oncol 15：3266(1997))。因而，每个循环80mg/m2是生物学活性剂量，特别是由于已经观察到与应用类似抗-CD64双特异性分子的在前研究相似的外周血单核细胞饱和(Pullarkat V.等人，Cancer Immunol Immunother 48：9(1999))。 
计算得出的11.1小时的半衰期也在对其他基于抗-CD64的双特异性分子报道的范围内(Curnow R.T.，Cancer I mmunol Immunother 45：210(1997))。该半衰期与基于人源化IgG的抗体如rituximab相比较短，在人源化IgG的抗体中已描述了超过400小时的半衰期。然而，H22xKi-4较短的半衰期并不令人惊讶，这是因为该新的分子与完整的基于IgG的抗体相比较小(104kDa对180kDa)，且缺乏Fc-部分(Tobinai K.等人，Ann Oncol 9：527(1998))。此外，与完整抗体相比，H22xKi-4的分子大小更易于使其穿入恶性淋巴结中(Jain R.K.，Cancer Res.50(增刊)：814s(1990))。 
用于本研究中的方案设计为用双特异性分子饱和所有外周血单核细胞和sCD30，从而导致可穿入组织中以结合HRS-细胞的过量的未结合的双特异性分子。与sCD30的结合可对H22xKi-4的分布产生重要的影响。观察到了以峰水平和AUC测量的H22xKi-4显著累积，从而提示该区室的饱和。此外，在整个治疗期间，sCD30在第一次H22xKi-4输注后仍然保持非常低的水平，这部分可能是由于由Ki-4抗体对CD30释放的阻断(Horn-Lohrens O.等人，Int J Cancer 60：539(1995))。此外，观察到了H22xKi-4与HRS-细胞的免疫组织化学结合。最后，观察到单核细胞来源的细胞因子即G-CSF、IL-6、IL-15和TNFα的释放与双特异性分子与效应细胞上的CD64显著结合的组合。 
对H22xKi-4的有希望的反应确证了应用抗-FcγRI单克隆抗体 H22的实体瘤报道的数据。在晚期乳腺癌患者中证明了通过与CD64结合对ADCC的诱导(van Ojik H.H.等人，Cancer Immunol Immunother45：207(1997))。在激素难治的前列腺癌中，抗-CD64×抗-HER2双特异性分子即使在比本实验中所应用的低的剂量也显示活性(JamesN.D.等人，Br J Cancer 85：152(2001))。 
总的说来，前述研究证明本发明的双特异性分子如H22xKi-4显示极好的毒性特征，以及在预治疗的晚期或难治的HD患者中有前途的功效。 
等同方案 
仅仅应用常规实验，本领域技术人员就将认识到或者能够确定，在此处描述的本发明特定实施方案的许多等同方案。这种等同方案意欲包含在下面的权利要求中。 
作为参考引入 
在此将所有此处引用的专利、未决的专利申请和其他出版物均整体引入作为参考。 
序列表
<110>Medarex，Inc.et al.
<120>抗cD30的人类单克隆抗体
<130>MXI-180PC
<150>US 60／347649
<151>2002-01-09
<150>US 60／404427
<151>2002-08-19
<150>US 60／431684
<151>2002-12-06
<160>53
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>348
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1              5                   10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tct    96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
             20                   25                   30
tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg    144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
gcc aac ata aac gaa gat gga agt gag aaa ttc tat gtg gae tct gtg    192
Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
     50                   55                  60
aag ggc cga ttc acc ttc tcc aga gac aac gcc gag aac tca ctg tat    240
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt    288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg agg gtt cat tgg tac ttc cat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc    336
Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
act gtc tcc tca                                                    348
Thr Val Ser Spr
        115
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<212>PRT
<213>人
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 l               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser
        115
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gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg    48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                   10                  15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc    96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc    144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt    192
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
     50                  55                  60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg gag    240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
 65                  70                  75                  80
cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt agc tca ccg    288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa    324
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>4
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<212>PRT
<213>人
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212>DNA
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<220>
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<400>5
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
 1               5                   10                  15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac    96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att    144
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pr0 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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ggg gaa atc aat cat agt gga agc acc aag tac acc ccg tcc ctc aag    192
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
     50                  55                  60
agc cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag cac caa ttc tcc ctg    240
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu
 65                  70                  75                  80
aag ctg agc tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg    288
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                 85                  90                  95
aga gag act gtc tac tac tte gat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc    336
Arg Glu Thr Val Tyr Tyr phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
act gtc tcc tca                                                    348
Thr Val Ser Ser
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<213>人
<400>6
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Glv
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gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gta agc agc aac    96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
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tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc    144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ctc agt ggc    192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly
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agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt caa cag cgt agc aac tgg ccg tgg    288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp
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<210>8
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<212>PRT
<213>人
<400>8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Glv
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<213>人
<220>
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<222>(1)...(336)
<400>9
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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aag ctg aac tct gta acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg    288
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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<213>人
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<400>11
gac atc cag atg acc cag tct cca acc tca ctg tct gca tct gta gga    48
Asp 11e Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                   15
gac aga gtc acc atc acttgt  cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                   25                  30
tta acc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc    144
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
         35                  40                  45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc    192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat gat agt tac cct atc    288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile
                 85                  90                  95
acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa                        321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>12
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 11e Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>13
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>13
aactcttgga  tgagc                                                 15
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>14
Asn Ser TrD Met Ser
 1               5
<210>15
<211>51
<212>DNA
<213>人
<400>15
aacataaacg aagatggaag tgagaaattc tatgtggact  ctgtgaaggg c         51
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>16
Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys
 1               5                  10                  15
Glv
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>17
gttcattggt  acttccatct c                                             21
<210>18
<211>5
<212>DNA
<213>人
<400>18
Val His Trp Tyr Phe His Leu
1                5
<210>19
<211>36
<212>DNA
<213>人
<400>19
agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc                               36
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>20
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
 1               5                  10
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>21
ggtgcatcca gcagggccac t                                                21
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>22
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
 1               5
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>23
cagcagtatggtagctcacc gtggacg                                   27
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>24
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
 1               5
<210>25
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>25
ggttactact ggagc                                               15
<210>26
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>26
Gly Tyr Tyr Trp Ser
 1               5
<210>27
<211>48
<212>DNA
<213>人
<400>27
gaaatcaatc atagtggaag caccaagtac accccgtccc tcaagagc            48
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>28
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser
 1               5                  10                  15
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人
<400>29
gagactgtct actacttcga tctc                                       24
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>30
Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu
 1               5
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人
<400>31
agggccagtc agagtgtaag cagcaactta  gcc                                33
<210>32
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>32
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
 1               5                  10
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>33
gatgcatcca acagggccac t                                               21
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>34
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
 1               5
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>35
caacagcgta gcaactggcc gtggacg                                           27
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>36
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr
 1               5
<210>37
<211>15
<212>DNA
<213>人
<400>37
gcttactact ggagc                                                15
<210>38
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>38
Ala Tyr Tyr Trp Ser
 1               5
<210> 39
<211> 48
<212>DNA
<213>人
<400>39
gacatcaatc atggtggagg caccaactac aacccgtccc tcaagagt            48
<210>40
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>40
Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
  1                  5              10                  15
<210>41
<211>12
<212>DNA
<213>人
<400>41
ctaactgcct ac                                                    12
<210>42
<211>4
<212>PRT
<213>人
<400>42
Leu Thr Ala Tyr
 1
<210>43
<211>33
<212>DNA
<213>人
<400>43
cgggcgagtc agggtattag cagctggtta acc                               33
<210>44
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>44
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Thr
 1               5                  10
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>45
gctgcatcca gtttgcaaag t                                            21
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>46
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
 l               5
<210>47
<2ll>27
<212>DNA
<213>人
<400>47
caacagtatg atagtt accc tatcacc                                     27
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>48
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile Thr
 l               5
<210>49
<211>291
<212>DNA
<213>人
<400>49
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc  60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc  120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac  180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg  240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag a           291
<210>50
<211>285
<212>DNA
<213>人
<400>50
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc   60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca  120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca  180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct  240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accct                  285
<210>51
<211>294
<212>DNA
<213>人
<400>51
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc   60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct  120
ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat  180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat  240
ctgeaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaga        294
<210>52
<211>288
<212>DNA
<213>人
<400>52
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc   60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa  120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca  180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag  240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacct               288
<210>53
<21l>285
<212>DNA
<213>人
<400>53
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc   60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct  120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc  180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct  240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcct                  285

Claims (23)

1.一种分离的人类单克隆抗体，包含人类重链可变区和人类轻链可变区，其中：
(a)人类重链和轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2和4中；
(b)人类重链和轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：6和8中；或
(c)人类重链和轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：10和12中。
2.权利要求1的分离的人类单克隆抗体，包含人类IgG重链和人类κ轻链。
3.权利要求1的分离的人类单克隆抗体，包含IgG1或IgG3重链。
4.权利要求1的分离的人类单克隆抗体，其中所述人类重链和人类轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2和SEQ ID N0：4中。
5.权利要求1的分离的人类单克隆抗体，其中所述人类重链和人类轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：6和SEQ ID N0：8中。
6.权利要求1的分离的人类单克隆抗体，其中所述人类重链和人类轻链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12中。
7.一种药物组合物，包含权利要求1-6中任一项的分离的人类单克隆抗体和药物可接受的载体。
8.一种免疫偶联物，包含与治疗剂连接的权利要求1-6中任一项的分离的人类单克隆抗体。
9.权利要求8的免疫偶联物，其中治疗剂是细胞毒素。
10.权利要求8的免疫偶联物，其中治疗剂是放射性同位素。
11.一种药物组合物，包含权利要求8-10中任一项的免疫偶联物和药物可接受的载体。
12.一种编码权利要求1-6中任一项的分离的人类单克隆抗体的分离的核酸分子。
13.权利要求12的分离的核酸分子，其中核酸分子整合入表达载体中。
14.一种转染瘤，其包含整合有权利要求12的分离的核酸分子的表达载体。
15.权利要求1-6中任一项的分离的人类单克隆抗体在制备抑制表达CD30的细胞生长的药物中的用途。
16.权利要求1-6中任一项的分离的人类单克隆抗体在制备治疗或预防以表达CD30的肿瘤细胞生长为特征的疾病的药物中的用途。
17.权利要求16的用途，其中所述疾病选自何杰金氏病、退行发育的大细胞淋巴瘤、成人T-细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎癌、鼻咽未分化的癌、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他T-细胞或B-细胞淋巴瘤。
18.权利要求16的用途，其中所述疾病是何杰金氏病。
19.权利要求16的用途，其中所述疾病是非何杰金氏淋巴瘤。
20.权利要求19的用途，其中非何杰金氏淋巴瘤是退行发育的大细胞淋巴瘤。
21.权利要求15-20中任一项的用途，其中分离的人类单克隆抗体与一种治疗剂偶联。
22.权利要求21的用途，其中治疗剂是细胞毒素。
23.权利要求21的用途，其中治疗剂是放射性同位素。
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