JP2005534281A - Ｃｄ３０に対するヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

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Abstract

CD30（例えばヒトCD30）に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体が開示される。本ヒト抗体は、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、複数のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体を産生できる、トランスジェニック・マウスなどの非ヒトトランスジェニック動物で産生させることができる。さらに、本ヒト抗体の誘導体（例えば二重特異的抗体及び免疫結合体）、本ヒト抗体を含む医薬組成物、本ヒト抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物及びハイブリドーマ、及び本ヒト抗体を用いるための治療法及び診断法も開示される。

Description

本出願は、その内容を引用をもってここに援用することとする２００２年１月９日提出の米国60/347649号、２００２年８月１９日提出の米国60/404427号、及び２００２年１２月６日提出の米国60/431684号に基づく優先権を主張するものとする。
発明の背景
CD30細胞表面分子は、腫瘍壊死因子受容体(TNF-R)スーパファミリのメンバである。このファミリの分子はそのメンバ間で可変の相同性を有し、その中には神経成長因子受容体 (NGFR)、CD120(a)、CD120(b)、CD27、CD40 及びCD95がある。これらの分子は典型的に、細胞質外領域に複数のシステイン−リッチな反復配列があることを特徴とする(de Bruin, P.C., et al. Leukemia 9:1620-1627 (1995))。 このファミリのメンバは、リンパ球の増殖及び分化を調節するために重要であると考えられている。
CD30は、中央にヒンジ配列を持つ６つ（ヒト）又は３つ（マウス及びラット）のシステイン−リッチな反復配列を持つタイプＩ膜貫通糖タンパク質である。CD30は、120kDa膜分子として存在し、90kDaの細胞間前駆タンパク質から発生する。それは細胞表面からほぼ90kDaの可溶性タンパク質（sCD30）として放出される。sCD30の放出は生存CD30細胞の活動プロセスとして起きるが、単に死につつある又は死んだ細胞からの遊離として起きるのではない。CD30タンパク質をコードするcDNAは、モノクローナル抗体Ki-1及びBer-H2による免疫スクリーニングにより、HLTV-1 ヒトT細胞株HUT-102 の発現ライブラリからクローンされている (Schwab, U., et al. Nature 299:65 (1982))。マウス及びラットCD30 cDNAが、それぞれ498及び493個のアミノ酸をコードしていることが判明している。ヒトCD30 cDNAは、システイン−リッチなドメインの１つから部分的に複製される更に90個のアミノ酸をコードしている。CD30遺伝子はヒトでは1p36に、そしてラットでは5q36.2にマップされている。
CD30は活性化リンパ球で優先的に発現する。具体的には、リンパ球のCD30が刺激されると、細胞種、分化段階及び他の刺激の存在に応じて、増殖、活性化、分化及び細胞死を含む多形質発現性生物効果を誘導することが示されている (Gruss, H.J. et al., Blood 83:2045-2056 (1994))。CD30は最初、ホジキン病のホジキン及びリード−シュテルンベルグ細胞上で発現する抗原に対して反応性であるモノクローナル抗体Ki-1により同定された(Schwab et al., Nature 299:65 (1982))。従って、CD30は、ホジキンリンパ腫及び関連造血系悪性腫瘍の臨床マーカとして広く用いられている(Froese et al., J. Immunol. 139:2081 (1987); Carde et al., Eur. J. Cancer 26:474 (1990))。
CD30は、次に、バーキットリンパ腫、未分化型大細胞リンパ腫(ALCL)、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小分割細胞リンパ腫、リンパ球性 リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病/リンパ腫 (ATLL)、成人Ｔ細胞白血病 (T-ALL)、及びエントロブラスティック（原語：entroblastic）／中心細胞 (cb/cc) 小胞性リンパ腫 を含む非ホジキン・リンパ腫（NHL）(Stein et al., Blood 66:848 (1985); Miettinen, Arch. Pathol. Lab. Med. 116:1197 (1992); Piris et al., Histopathology 17:211 (1990); Burns et al., Am. J. Clin. Pathol. 93:327(1990); and Eckert et al., Am. J. Dermatopathol. 11:345 (1989))の下位集団や、ヒトＴ細胞リンパ栄養性ウィルスＩ又はＩＩ形質転換Ｔ細胞及びエプスタイン−バーウィルス形質転換Ｂ細胞 などのいくつかのウィルス形質転換株(Stein et al., Blood 66:848 (1985); Andreesen et al., Blood 63:1299 (1984))上で発現することが示されている。加えて、CD30の発現は、胎児癌、非胎児癌、悪性黒色種、間葉性腫瘍、及び、分化後期にある骨髄細胞系及びマクロファージについて記載されている(Schwarting et al., Blood 74:1678 (1989); Pallesen et al., Am J. Pathol. 133:446 (1988); Mechtersheimer et al., Cancer 66:1732 (1990); Andreesen et al., Am. J. Pathol. 134:187 (1989))。
正常な個人におけるCD30陽性細胞のパーセンテージは大変小さいため、腫瘍細胞におけるCD30の発現は、CD30陽性新形成性細胞を治療剤の特異的標的とする抗体媒介治療法の重要なターゲットとなっている (Chaiarle, R., et al. Clin. Immunol. 90(2):157-164 (1999))。しかしながら、今日までに得られた結果は、CD30が免疫治療法にとって有用なターゲットであることを確立していながら、これらの結果は、現在利用できるマウス抗体は理想的な治療剤ではないことを示してもいる。
従って、CD30が媒介する疾患を治療及び／又は予防するために効果的な、CD30に対する優れた治療用抗体が必要とされている。
発明の概要
本発明は、ヒトCD30に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体や、誘導体（例えば免疫結合体及び二重特異的分子）、並びに、このような抗体を、単独又は別の治療剤と組み合わせて含有する多の治療用組成物、を提供するものである。さらに、本発明の抗体及び組成物を用いて多種のCD30媒介疾患を治療する方法も提供される。
本発明のヒト抗体はCD30に結合して、CD30機能(及びCD30媒介性効果) を阻害し、及び／又は、例えば腫瘍細胞及び免疫疾患に関与する細胞など、CD30発現細胞の成長を阻害（例えば致死を媒介）する 。このような細胞には、例えば、骨髄細胞、肝細胞、 リンパ節細胞、皮膚細胞、脾細胞、胸腺細胞、扁桃細胞、脱落膜細胞、子宮内膜細胞、ホジキン細胞、リード／シュテルンベルグ細胞、未分化型大細胞リンパ腫(ALCL)細胞、多形性及び免疫芽球性リンパ腫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び単球、がある。ある具体的な実施態様では、リンパ腫の治療でヒト抗体を用いて、 ホジキン細胞の成長を阻害／致死を媒介する。
本発明のある実施態様では、本ヒト抗体は、ヒトエフェクタ細胞（例えば単球又は単核細胞）の存在下で抗体依存的細胞傷害性（ADCC）を誘導することにより、腫瘍細胞の成長を阻害／致死を媒介する。別の実施態様では、本ヒト抗体はマクロファージの存在下でCD30を発現している腫瘍細胞の貪食を誘導する。従って、本発明の抗体は、CD30の固有の特異性（例えばエピトープ特異性、及び関連細胞表面抗原との交差反応性の欠如）、親和性、構造、機能的活性、及びこれらが完全ヒトであるという事実、に部分的に起因するCD3活性が媒介する異常を治療及び予防する優れた手段を提供するものであり、従ってヒト患者に投与した場合に、これまで作製された他のCD30抗体（例えばマウス及びヒト化抗体）に比べ、これらの免疫原性は有意に低く、そして治療上より効果的かつ有用なものとなっている。
本発明の単離されたヒト抗体には、多種の抗体アイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、及びIgE、が含まれる。典型的には、これらには、IgG1 (例えばIgG1k)、IgG3 及びIgM アイソタイプが含まれる。当該抗体は完全長（例えばIgG1 又はIgG3 抗体）でもよく、あるいは抗原結合部分 （例えばFab、F(ab')2 、Fv もしくは一本鎖Fvフラグメント)しか含んでいなくともよい。
本発明の具体的な治療用抗体は、（ａ）それぞれ配列番号1及び配列番号3に記載されたヌクレオチド配列並びにこれらの保存的配列改変をそれらの可変領域に含むヒト重鎖及びヒト軽鎖核酸にコードされた、又は（ｂ）それぞれ配列番号2及び配列番号4に示されたアミノ酸配列並びにこれらの保存的配列改変を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含有する、ヒトモノクローナル抗体(HuMab) 17G1及び機能的に均等な抗体を包含するものである。
本発明の別の具体的な治療用抗体は、（ａ）それぞれ配列番号5及び配列番号7に記載されたヌクレオチド配列並びにこれらの保存的配列改変をそれらの可変領域に含むヒト重鎖及びヒト軽鎖核酸にコードされた、又は（ｂ）それぞれ配列番号6及び配列番号8に示されたアミノ酸配列並びにこれらの保存的配列改変を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含有する、ヒトモノクローナル抗体2H9及び機能的に均等な抗体を包含するものである。
本発明のさらに別の具体的な治療用抗体は、（ａ）それぞれ配列番号9及び配列番号11に記載されたヌクレオチド配列並びにこれらの保存的配列改変をそれらの可変領域に含むヒト重鎖及びヒト軽鎖核酸にコードされた、又は（ｂ）それぞれ配列番号10及び配列番号12に示されたアミノ酸配列並びにこれらの保存的配列改変を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含有する、ヒトモノクローナル抗体5F11及び機能的に均等な抗体を包含するものである。
さらに本発明には、抗体17G1、2H9又は5F11により規定されるヒトCD30上のエピトープに結合する、及び／又は、CD30への結合をめぐって抗体17G1、2H9又は5F11と競合する、あるいは、抗体17G1、2H9又は5F11の示す他の機能的結合特性を有する、抗体も包含される。このような抗体には、ほぼ10-11 Mの解離平衡定数（Kd）で、及び／又は、少なくとも107 M-1の結合平衡定数（Ka）で、CD30に結合するものが含まれる。このような抗体には、関連細胞表面抗原と交差反応せず、従ってそれらの機能を阻害しないようなものも含まれる。
本発明のさらに他の具体的なヒト抗体には、ヒト重鎖及び軽鎖CDR1領域、ヒト重鎖及び軽鎖CDR2領域、及びヒト重鎖及び軽鎖CDR3領域を有するCDRドメインを含有するものが含まれ、但しこの場合、
（ａ）前記ヒト重鎖領域の前記CDR1、CDR2、及びCDR3が、図７（それぞれ配列番号16、17及び18）、図９(それぞれ配列番号28、29及び30）、及び図１１(それぞれ配列番号40、41及び42）に示されたCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列、並びにこれらの保存的配列改変、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして
（ｂ）前記ヒト軽鎖領域の前記CDR1、CDR2、及びCDR3が、図８（それぞれ配列番号22、23及び24）、図１０(それぞれ配列番号34、35及び36）、及び図１２(それぞれ配列番号46、47及び48）に示されたCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列、並びにこれらの保存的配列改変、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。代替的には、本発明の具体的なヒト抗体には、図７乃至１２に示されたCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列 (配列番号16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41、42、46、47及び48)に少なくとも80%相同、好ましくは85%相同、より好ましくは90%、95%、98%、及び99%相同なアミノ酸配列を含むヒト重鎖及び軽鎖CDR1領域、ヒト重鎖及び軽鎖CDR2領域、及びヒト重鎖及び軽鎖CDR3領域を有するCDRドメインを含むものが包含される。
別の実施態様では、本発明のヒト抗体はCD30に結合して、CD30リガンドのCD30に対する結合を部分的もしくは完全に遮断することにより、CD30機能（例えばCD30媒介性効果）を阻害する。CD30リガンドの例には、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3 及びTRAF5がある。
さらに別の実施態様では、本発明のヒト抗体を、以下の特性：
ａ）CD30に対する特異性；
ｂ）少なくとも約107 M-1、好ましくは約108 M-1、そしてより好ましくは約109 M-1乃至1010 M-1 又はそれ以上の親和定数による、CD30への結合親和性；
ｃ） 少なくとも約103、より好ましくは約104そして最も好ましくは約105 M-1S-1の、CD30との結合定数（Kassoc）；
ｄ）約10-3 s-1、好ましくは約10-4 s-1、より好ましくは10-5 s-1、そして最も好ましくは10-6 s-1の、CD30からの解離定数（Kdis）；
ｅ）CD30発現細胞のオプソニン化能；又は
ｆ）（例えばin vitroで）約10μg/ml以下の濃度での、ヒトエフェクタ細胞の存在下でのCD30発現細胞の成長の阻害能、及び／又は、貪食及び致死の媒介能、
のうちの１つ以上により、特徴付けることができる。
本発明のヒト抗CD30抗体を、ホスト細胞（例えばCHO細胞又はリンパ球性細胞）で組換えにより作製することも、あるいは、本抗体を発現するハイブリドーマ（即ち、本抗体をコードするヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物由来のＢ細胞を不死化細胞に融合させて含有するもの）から直接得ることもできる。ある具体的な実施態様では、本抗体は、ここで17G1 (配列番号1-4)、2H9 (配列番号5-8) 及び5F11 (配列番号 9-12)と言及されるハイブリドーマにより産生される。
さらに別の局面では、本発明は、CD30に結合するヒトモノクローナル抗体を発現する、トランスジェニックマウス（ここでは「HuMAbマウス」とも言及される）などの非ヒトトランスジェニック動物を提供するものである。ある具体的な実施態様では、本非ヒトトランスジェニック動物は、本発明の抗体の全部又は一部をコードするヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスである。該非ヒトトランスジェニック動物は、CD30抗原の精製もしくは濃縮製剤及び／又はCD30発現細胞で、免疫することができる。好ましくは、該非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスなど、が、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、複数のアイソタイプの抗CD30ヒトモノクローナル抗体 （例えばIgG、IgA 及び／又はIgM)を産生できるとよい。アイソタイプ・スイッチングは、例えば古典的又は非古典的アイソタイプ・スイッチングなど、で起きてよい。
従って、さらに別の局面では、本発明は、ヒト抗CD30抗体を発現する、トランスジェニックマウスなど、上述の非ヒトトランスジェニック動物を由来とする単離されたＢ細胞を提供するものである。こうしてこの単離されたＢ細胞を、不死化細胞への融合により不死化して、ヒト抗CD30抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供することができる。このようなハイブリドーマ（即ち、ヒト抗CD30抗体を産生するもの）も、本発明の範囲に包含される。
ここで例示するように、本発明のヒト抗体は、本抗体を発現するハイブリドーマから直接得ることも、又は、ホスト細胞(例えばCHO細胞又はリンパ球性細胞)でクローニングして、組換えにより発現させることもできる。従って、別の局面では、本発明は、ヒトCD30に結合するヒトモノクローナル抗体を作製する方法を提供するものである。ある実施態様では、本方法は、上述のトランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物（例えば抗CD30抗体の全部又は一部をコードするヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するなど）を、ヒトCD30抗原の精製もしくは濃縮製剤、及び／又は、ヒトCD30発現細胞で、免疫するステップを含む。次に、該動物のＢ細胞（例えば脾Ｂ細胞）を得、骨髄腫細胞に融合させて、CD30に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成する。
さらに別の局面では、本発明のヒト抗CD30抗体を、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばFab'フラグメント）などの別の機能分子で誘導体化する、前記機能分子に連結する、又は前記機能分子と同時発現させる。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分を、例えば別の抗体（例えば二重特異的又は多重特異的抗体を作製するため）、細胞毒、細胞リガンド又は抗原（イムノトキシンなどの免疫結合体を作製するため）など、一つ以上の他の分子に機能的に連結（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的結合又は他の方法などにより）することができる。従って、本発明は、いずれもCD30発現細胞に結合したり、他の分子を前記細胞にターゲティングするために使用できるような、多種の抗体結合体、二重及び多重特異的分子、及び融合タンパク質を包含する。
ある特定の実施態様では、本発明は、CD30に対する少なくとも一つの第一結合特異性部分（例えばヒト抗CD30抗体又はそのフラグメントもしくはミメティック）と、Fc受容体（例えばFcγRIなどのヒトFcγ受容体、又はヒトFcα受容体など）に対する結合特異性部分などの、ヒトエフェクタ細胞に対する第二結合特異性部分とを備える二重特異的又は多重特異的分子を提供するものである。典型的には、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、少なくとも一種の抗体又はそのフラグメント（例えばFab、Fab'、F(ab'）2、Fv、又は一本鎖Fv)、好ましくはヒト抗体又はその一部分、又は「キメラ」もしくは「ヒト化」抗体又はその一部分を含む（例えば非ヒト抗体（例えばマウス）由来の可変領域又は相補性決定領域（CDR）を有し、残りの部分はヒト由来であるなど）。
従って、本発明は、ヒトCD30と、例えばヒトIgG受容体、例えばFc-ガンマ受容体（FcγR）、例えばFcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、及びFcγRIII (CD16)など、のFc受容体との両方に結合する二重特異的及び多重特異的分子を包含する。ヒトIgA受容体（例えばFcαRI）などの他のFc受容体も標的とすることができる。当該のFc 受容体は好ましくは、例えば単球、マクロファージ又は活性化多核細胞など、エフェクタ細胞の表面上に位置するとよい。ある好適な実施態様では、本二重特異的及び多重特異的分子は、当該Fc受容体のうちで免疫グロブリンFc（例えばIgG又はIgA）結合部位とは異なる部位で、この受容体に結合する。従って、本二重特異的及び多重特異的分子の結合は、生理的レベルの免疫グロブリンでは遮断されない。
さらに別の局面では、本発明は、CD30発現細胞の成長が阻害されるように、該細胞を、有効量の本発明の抗体、抗体誘導体又は他の治療用組成物に接触させることにより、該細胞の成長を阻害する方法を提供する。ある実施態様では、本方法は、ADCCなどにより、エフェクタ細胞の存在下でCD30発現細胞を致死させるステップを含む。さらに別の実施態様では、本方法は、貪食によりCD30発現細胞を致死させるステップを含む。前記細胞の致死又は阻害は、CD30は発現はしていないが、例えば構造上関連する細胞表面抗原を発現していると思われる（即ち、関連する、しかし機能上は別個の細胞表面抗原に対する交差反応性のない）細胞を致死させる又はその活性を阻害することなく、行われるとよい。本発明のヒト抗体を用いて阻害又は致死の可能なCD30発現細胞には、例えば、腫瘍細胞、骨髄細胞、肝細胞、リンパ節細胞、皮膚細胞、脾細胞、胸腺細胞、扁桃細胞、脱落膜細胞、子宮内膜細胞、ホジキン細胞、リード／シュテルンベルグ細胞、未分化型大細胞リンパ腫(ALCL)細胞、多形性及び免疫芽球性リンパ腫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び単球、がある。
従って、本発明のヒト抗体を、本抗体を多種のCD30媒介疾患の患者に投与することにより、このような疾患を治療及び／又は予防するために用いることができる。治療（例えば改善）又は予防の可能な疾患の例には、限定はしないが、腫瘍形成性疾患及び自己免疫疾患がある。治療及び／又は予防の可能な腫瘍形成性疾患の例には、ホジキン病、未分化型大細胞リンパ腫 (ALCL)、成人Ｔ細胞 リンパ腫。(ATL)、血管免疫芽球性リンパ節症 (AILD)様Ｔ細胞リンパ腫、HIV随伴性の体腔を基にした HIVリンパ腫、胎児性癌、鼻咽頭の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍）、カストルマン病、カポジ肉腫及び他のＴ細胞もしくはＢ細胞リンパ腫、がある。治療及び／又は予防の可能な自己免疫疾患の例には、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメンズ（原語：Omen's）症候群、慢性腎不全、急性感染性単核細胞症、HIV及び疱疹ウィルス随伴疾患、がある。
本発明のある実施態様では、本抗体を投与しようとする対象を、化学療法薬、放射線、又は、Fcα受容体もしくはFcγ受容体などのFc受容体の発現又は活性を、高める又は阻害するなど修飾する薬剤、例えばサイトカインなど、で付加的に治療する。治療中の投与に向く典型的なサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、及び腫瘍壊死因子（TNF）、がある。典型的な治療剤には、とりわけ、抗新生物薬、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミドヒドロキシウレアなど、がある。
CD30を高率では発現しないような癌細胞に対して、本発明のヒト抗CD30抗体の治療効果を増すには、本抗体を、例えば腫瘍細胞上のCD30の発現を上方調節し、より均質にするリンホカイン製剤など、CD30の発現を上方調節又はもたらす薬剤と一緒に同時投与することができる。投与に適したリンホカイン製剤には、インターフェロン-ガンマ、腫瘍壊死因子、及びこれらの組合せ、がある。これらを静脈内投与することもできる。リンホカインの適した投薬量は、典型的には、10,000乃至1,000,000単位／患者の範囲である。
さらに別の局面では、本発明は、CD30関連疾患を診断するためなど、試料中のCD30の存在をin vitro又はin vivoで検出する方法を提供するものである。ある実施態様では、これは、テストしようとする試料を、選択に応じてコントロール試料も並行して、本発明のヒトモノクローナル抗体（又はその抗原結合部分）に、本抗体及びCD30間の複合体が形成可能な条件下で接触させることで達成される。次に複合体形成を（例えばELISAを用いて）検出する。テスト試料と並行してコントロール試料を用いる場合、両方の試料で複合体を検出し、これら試料間で複合体形成の統計上有意な違いがあれば、テスト試料中にCD30が存在することの指標となる。
さらに別の局面では、本発明は、ヒト抗CD30抗体及びその部分（例えばその可変領域）をコードする核酸分子や、本発明の該核酸を含有する組換え発現ベクタ、及び、このようなベクタをトランスフェクトしたホスト細胞、を提供するものである。これらのホスト細胞を培養することで、本抗体を作製する方法も、本発明に包含される。本発明により提供される具体的な核酸は、ヒト抗C30抗体(HuMab）17G1のそれぞれ重鎖及び軽鎖をコードする配列番号1及び配列番号3に示されたヌクレオチド配列、ヒト抗C30抗体(HuMab)2H9のそれぞれ重鎖及び軽鎖をコードする 配列番号5 及び配列番号7に示されたヌクレオチド配列、及び、ヒト抗C30抗体(HuMab)5F11のそれぞれ重鎖及び軽鎖をコードする配列番号9 及び配列番号11に示されたヌクレオチド配列、を包含する。
別の局面では、本発明は、１種以上の（即ち組合せの）ヒト抗CD30抗体を担体と一緒に含む治療用及び診断用組成物を提供するものである。ある具体的な実施態様では、さらに本組成物は、細胞傷害性もしくは放射毒性作用薬などや、あるいは、CD30の発現、又は、Fc受容体の発現を上方調節するGM-CSFなど、エフェクタ細胞上に発現する分子の発現、を上方調節する作用薬などといった、１種以上の他の治療剤も含む。
CD30媒介疾患のin vivo治療及び予防で使用する場合、本発明のヒト抗体は、例えば注射や、抗体ベースの臨床用製品について当業で公知の他の投与経路など、いずれかの適した投与経路を用いて、治療上有効量、患者（例えばヒトの対象）に投与される。
別の局面では、本発明は、本発明の完全ヒト抗CD30抗体を、例えば細胞毒、放射性毒、化学療法薬、免疫抑制剤、又は、ステロイド系もしくは非ステロイド系の抗炎症剤などの抗炎症剤など、治療剤に結合させて含有する、イムノトキシンなどの免疫結合体を提供するものである。
代替的には、本発明のヒト抗体を、このような治療剤及び細胞傷害性作用薬と同時に、しかしこれらに連結せずに、投与することができる。これらをこのような作用薬と同時に（例えば単一の組成物で、又は別々に）投与することも、あるいは、このような作用薬の投与前又は投与後に投与することもできる。上述したように、このような作用薬には、細胞傷害性作用薬、放射性毒、又は化学療法薬、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドヒドロキシウレア及びこれらの組合せなど、を含めることができる。
本発明の他の特徴及び長所は、以下の詳細な説明及び実施態様から明かとなるであろうが、以下の詳細な説明及び実施例を限定的なものと捉えられてはならない。本出願全般を通じて引用された全参考文献、特許及び公開済み特許出願の内容を、引用をもってここに援用することを明示しておく。
発明の詳細な説明
本発明は、CD30及び／又はCD30発現細胞により媒介される多種の異常（例えばCD30の増殖作用により引き起こされる異常）を治療及び診断するための優れた抗体ベースの治療法を提供するものである。本発明の治療法は、CD30又はCD30発現細胞に結合してこのような機能を、特にヒトの治療において阻害する、単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を利用する。
ある実施態様では、本ヒト抗体を、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、複数のアイソタイプの抗CD30ヒトモノクローナル抗体 （例えばIgG、IgA 及び／又はIgE)を産生できる、例えばトランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物で産生させる。従って、本発明の特定の局面には、抗体、抗体フラグメント、及びこれらの医薬組成物だけでなく、モノクローナル抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物、Ｂ細胞及びハイブリドーマも含まれる。本発明の抗体を用いて、CD30発現細胞を、in vitro又はin vivoで検出する方法も、本発明の包含するところである。本発明の抗体を用いて、CD30誘導性活性、例えば増殖活性など、を遮断又は阻害する方法も提供され、例えば腫瘍形成性疾患（例えばホジキン病）及び自己免疫疾患（例えばHIV）など、CD30の関連する異常の治療において有用である。
本発明がより容易に理解できるよう、いくつかの用語をまず定義する。更なる定義は、本詳細な説明欄全体に記載されている。
用語「CD30」、及び「CD30抗原」はここでは交換可能に用いられており、細胞により天然で発現される、ヒトCD30のバリアント、アイソフォーム及び種相同体を包含する。ある好適な実施態様では、本発明の抗体がCD30抗原に結合すると、CD30リガンドのCD30への結合が阻害又は遮断されることで、CD30発現細胞（例えば腫瘍細胞）の成長が阻害される。用語「CD30リガンド」は、CD30に対する全ての（例えば生理的な）リガンドを包含する。ある好適な実施態様では、CD30リガンドはCD30L、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3 又はTRAF5である。別の好適な実施態様では、本発明の抗体がCD30抗原に結合すると、エフェクタ細胞によるCD30発現細胞の貪食及び／又は致死が媒介される。さらに別の好適な実施態様では、本発明の抗体がCD30抗原に結合すると、CD30発現細胞のエフェクタ細胞ADCCが媒介される。
ここで用いる用語「成長を阻害する」（例えば細胞を言及する）とは、抗CD30抗体に接触した細胞の成長の、抗CD30抗体に接触していない同じ細胞の成長に比較したときのあらゆる測定可能な減少、例えば細胞成長の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、又は100%の阻害など、を包含することを意図している。
用語「抗体」には、ここで言及する場合、抗体全体や、そのあらゆる抗原結合フラグメント（即ち「抗原結合部分」）又は一本鎖が含まれる。「抗体」とは、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖をジスルフィド結合で相互に接続して含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分、を言う。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではVHと省略される）と重鎖定常領域とから成る。重鎖定常領域はCH1、CH2及びCH3という３つのドメインから成る。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではVLと省略される）及び軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は一つのドメインCLから成る。VH及びVL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域間に介在する相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域に小さく分割することができる。各VH及びVLは、以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端まで並んだ３つのCDR及び４つのFRから成る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多種の細胞（例えばエフェクタ細胞）を含めホスト組織又は因子や、古典的な補体系の第一コンポーネント（C1q）に対する免疫グロブリンの結合を媒介していると考えられる。
抗体の「抗原結合部分」（又は簡単に「抗体部分」）という用語は、ここで用いる場合、抗原（例えばCD30）への結合能を維持した、抗体のうちの一つ以上のフラグメントを言う。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のうちの数フラグメントに行わせることができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメントであるFabフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab'）2フラグメント；（ｉｉｉ）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；（ｉｖ）抗体の一本の腕のVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；（ｖ）VHドメインから成るdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域(CDR)、がある。さらに、Fvフラグメントの２つのドメインVL及びVHは別々の遺伝子にコードされているが、これらは、VL及びVH領域が対を成して一価の分子を形成するような一個のタンパク質鎖に作製できるようにする合成リンカーにより、組換え法を用いて接合することができる（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えば Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものと、意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、それらのフラグメントを、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてスクリーニングされている。
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群から成り、通常は特異的な三次元構造上の特徴や、特異的な電荷上の特徴を有する。コンホメーション的及び非コンホメーション的エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないことで区別される。
ここで用いる用語「結合を阻害する」及び「結合を遮断する」は、CD30リガンドのCD30への結合の阻害／遮断を言う。）阻害／遮断は交換可能に用いられており、部分的及び完全な阻害／遮断の両方を包含する。好ましくはCD30の阻害／遮断により、CD30の結合が、CD30誘導性増殖の阻害など、阻害又は遮断なしで起きるような正常なレベル又は種類の活性が低下又は変化するとよい。さらに阻害及び遮断は、抗CD30抗体に接触していないCD30に比較した場合の、抗CD30抗体に接触したときのCD30の結合親和性のあらゆる測定可能な低下、例えば、CD30のその受容体に対する少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、又は100%の遮断など、を包含することも意図している。
用語「二重特異的分子」には、２つの異なる結合特異性部分を有する、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体など、あらゆる作用物質を包含されることが意図されている。例えば前記分子は、（ａ）細胞表面抗原及び（ｂ）エフェクタ細胞の表面上のFc受容体に結合又は相互作用してもよい。用語「多重特異的分子」又は「ヘテロ特異的分子」は、３つ以上の異なる結合特異性部分を有する、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体など、あらゆる作用物質を包含することを意図している。例えば前記分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクタ細胞の表面上のFc受容体、及び（ｃ）少なくとも一つの他の成分、に結合又は相互作用してもよい。従って本発明は、限定はしないが、CD30などの細胞表面抗原や、エフェクタ細胞上のFc受容体などの他の標的に向けられた二重特異的、三重特異的、四重特異的、及び他の多重特異的分子を包含する。
用語「二重特異抗体」はジアボディも含む。ジアボディはVH及びVLドメインが一個のポリペプチド鎖上に発現しているが、この同じ鎖上の２つのドメインの間で対を成させるには短すぎるリンカを用いることで、これらドメインを別の鎖の相補ドメインと対を成させて、２つの抗原結合部位を生じるようにした二価の二重特異的な抗体である (例えばHolliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123)。ここで用いる用語「ヘテロ抗体」とは、少なくともそのうちの２種以上が異なる特異性部分を有するような、相互に連結された２種以上の抗体、抗体結合フラグメント（例えばFab）、それらの誘導体、又は抗原結合領域を言う。これらの異なる特異性部分には、エフェクタ細胞上のFC受容体に対する結合特異性部分と、腫瘍細胞などの標的細胞上の抗原又はエピトープに対する結合特異性部分とが含まれる。
ここで用いる用語「ヒト抗体」には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれるものと、意図されている。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にはコードされていないアミノ酸残基（例えばin vitroでのランダムもしくは部位特異的変異誘発法や、又はin vivoでの体細胞変異などにより導入された変異など）が含まれていてもよい。しかしながら、ここで用いる用語「ヒト抗体」に、マウスなどの別のほ乳類種の生殖細胞系由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列内に移植された抗体が含まれるとは、意図していない。
ここで用いる用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成から成る抗体分子の製剤を言う。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性及び親和性を特定のエピトープに対して示す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、単一の結合特異性を示すと共に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変領域及定常領域を有するような抗体を言う。ある実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物から得たＢ細胞を、不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマにより産生される。
ここで用いる用語「組換えヒト抗体」には、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（さらに下のセクションＩで解説する）、（ｂ）ホスト細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクタを用いて発現させた抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングに関係する何らかの他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体、など、組換え手段により調製、発現、作製又は単離されたあらゆるヒト抗体が含まれると、意図されている。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変及び定常領域を有する。しかしながら、いくつかの実施態様では、このような組換えヒト抗体にin vitroで変異誘発を行う（又は、ヒトIg配列についてトランスジェニックな動物を用いる場合はin vivoで体細胞変異誘発を行う）ことができ、こうして当該の組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系VH及びVL配列を由来とし、そして関係しながらも、in vivoのヒト抗体生殖細胞系レパートリー中には天然で存在しないであろう配列となる。
ここで用いる場合「異種抗体」は、このような抗体を産生する非ヒトトランスジェニック生物との関係から定義される。この用語は、当該の非ヒトトランスジェニック動物を構成しない生物に見られるものに相当するアミノ酸配列又はコードする核酸配列を有し、一般的には当該の非ヒトトランスジェニック動物の種以外の種を由来とする抗体を言う。
ここで用いる「ヘテロハイブリッド抗体」とは、異なる生物由来の軽鎖及び重鎖を有する抗体を言う。例えば、ヒト重鎖をマウス軽鎖に結合させて有する抗体がヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、上に解説したキメラ抗体及びヒト化抗体がある。
ここで用いる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を言うものと、意図されている（例えばCD30に結合する単離された抗体は、CD30以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトCD30のエピトープ、アイソフォーム又はバリアントに結合する単離された抗体であれば、例えば他の種由来など（例えばCD30の種相同体）、他の関連する抗原に対して交差反応性を有していてもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないであろう。本発明のある実施態様では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組合せを、良く定義された組成で組み合わせる。
ここで用いる「特異的結合」とは、所定の抗原への抗体の結合を言う。典型的には、抗体は少なくとも約1×107M-1の親和性で結合し、所定の抗原に対しては、前記所定の抗原又は関係の近い抗原以外の非特異的な抗原（例えばBSA、カゼイン）に対するその結合親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で結合する。文言「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」はここでは用語「抗原に特異的に結合する抗体」と交換可能に用いられている。
ここで用いる用語、あるIgG抗体に対する「高親和性」とは、少なくとも約107M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、より好ましくは少なくとも約109M-1、1010M-1、1011M-1又はそれ以上、例えば最高で1013M-1又はそれより高いものなど、の結合親和性を言う。しかしながら、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプでは様々であろう。例えばIgMアイソタイプにとっての「高親和性」結合とは、少なくとも約1×107M-1の結合親和性を言う。
ここで用いる用語「Kassoc」又は「Ka」とは、特定の抗体−抗原相互作用の結合定数を言うものと、意図されている。
ここで用いる用語「Kdis」又は「Kd」とは、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を言うものと、意図されている。
ここで用いる「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子にコードされた抗体クラス（例えばIgM又はIgG1）を言う。
ここで用いる「アイソタイプ・スイッチング」とは、抗体のクラス、即ちアイソタイプ、が、あるIgクラスから他のIgクラスのうちの一つに変化する現象を言う。
ここで用いる「スイッチングのないアイソタイプ」とは、アイソタイプ・スイッチングが起きないときに産生される重鎖のアイソタイプ・クラスを言い、スイッチングのないアイソタイプをコードするCH遺伝子は、典型的には、機能上の再編成の起きるVDJ遺伝子のすぐ下流の一番目にあるCH遺伝子である。アイソタイプ・スイッチングは、古典的もしくは非古典的なアイソタイプ・スイッチングに分類されてきた。古典的なアイソタイプ・スイッチングは、導入遺伝子中の少なくとも一つのスイッチ配列領域が関与する組換え事象により起きるものである。非古典的アイソタイプ・スイッチングは、例えばヒトσμとヒトΣμとの間の相同組換え（δ関連欠失）などで起きることがある。その他の非古典的スイッチング機序、なかでも例えば導入遺伝子間及び／又は染色体間の組換えなどがあると、アイソタイプ・スイッチングが起きることがある。
ここで用いる用語「スイッチ配列」とは、スイッチ組換えを担うDNA配列を言う。「スイッチ・ドナー」配列は典型的にμスイッチ領域であり、スイッチ組換えの際に欠失するコンストラクト領域の5'側（即ち上流）にあるであろう。「スイッチ・アクセプタ」領域は、欠失するコンストラクト領域と、置換定常領域（例えばγ、ε、等）との間にあるであろう。組換えが必ず起きるという特定の部位はないため、最終的な遺伝子配列は、コンストラクトからは予測できないことが多いであろう。
ここで用いる「糖鎖付加パターン」は、タンパク質、より具体的には免疫グロブリンタンパク質、に共有結合する糖単位のパターンであると定義しておく。ある異種抗体の糖鎖付加パターンが、導入遺伝子のCH遺伝子の由来となった種よりも当該の非ヒトトランスジェニック動物の種の糖鎖付加パターンの方により似ていると当業者が認識するのであれば、この異種抗体の糖鎖付加パターンを、前記非ヒトトランスジェニック動物の種の産生する抗体に天然で起きる糖鎖付加パターンに実質的に似ていると特徴付けることができる。
ある物質に対してここで用いられる用語「天然で発生する」とは、物質が自然界に見られる事実を言う。例えば、（ウィルスを含む）生物中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列であって、天然にある源から単離でき、実験室で人間により意図的な改変を加えられていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然で発生したものである。
ここで用いる用語「再編成される」とは、Vセグメントが、D-J又はJセグメントのすぐ隣に位置して、それぞれ完全VH又はVLドメインを実質的にコードするコンホメーションとなった状態の重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を言う。再編成の起きた免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞DNAに比較することで特定でき、再編成の起きた遺伝子座は少なくとも一つの組換えられた７量体／９量体相同配列を有するであろう。
Vセグメントに関してここで用いる用語「再編成のない」又は「生殖細胞の立体配置」とは、Vセグメントが組換えられておらず、D又はJセグメントのすぐ隣にあるような立体配置を言う。
ここで用いる用語「核酸分子」には、DNA分子及びRNA分子が包含されるものと、意図されている。核酸分子は一本鎖でも、又は二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
CD30に結合する抗体又は抗体部分（例えばVH、VL、CDR3など）をコードする核酸に関してここで用いる用語「単離された核酸分子」とは、当該抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、CD30以外の抗原に結合する抗体又は抗体部分をコードする、天然ではヒトゲノムDNA中で当該核酸をフランクしているであろう他のヌクレオチド配列を含まないことを言うものと、意図されている。ある実施態様では、本ヒト抗CD30抗体、又はその部分は、17G1、2H9又は5F11のヌクレオチド又はアミノ酸配列や、それぞれ配列番号 1 及び 2、5及び6、並びに9 及び10に示された配列を有する重鎖（VH）可変領域、及び、それぞれ配列番号 3 及び 4、7及び8、並びに11 及び12に示された配列を有する軽鎖（VL）可変領域を含む。
ここに開示及び請求するように、配列番号 1-12に示す配列は、「保存的配列改変」、即ち、当該ヌクレオチド配列にコードされた、又は、当該アミノ酸配列を含有する、抗体の結合特性に有意に影響しない又は変化させないようなヌクレオチド及びアミノ酸配列改変を包含する。このような保存的配列改変には、ヌクレオチド及びアミノ酸の置換、追加及び欠失、がある。また、例えば部位指定変位誘発法及びPCR媒介変異誘発法など、当業で公知の標準的な技術によっても、配列番号1-12に改変を導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当業で定義されている。これらのファミリーには、塩基性の側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性の側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、がある。このように、ヒト抗CD30抗体の中で予測される重要でないアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基に置換することが好ましい。
あるいは、別の実施態様では、例えば飽和変異誘発法などにより、抗CD30抗体コーディング配列の全部又は一部にわたって変異を無作為に導入することができ、その結果改変された抗CD30抗体を結合活性についてスクリーニングすることができる。
従って、ここで開示する（重鎖及び軽鎖可変領域）ヌクレオチド配列にコードされた抗体、及び／又は、ここに開示する（即ち配列番号 1-12)（重鎖及び軽鎖可変領域）アミノ酸配列を含有する抗体には、類似の配列にコードされた又は類似の配列を含有する、保存的に改変された実質的に類似の抗体が含まれる。このような実質的に類似の抗体を、ここに配列番号1-12として開示された部分的（即ち重鎖及び軽鎖可変領域）配列に基づいてどのように作製できるかを、以下にさらに論じる。
核酸の場合、用語「実質的な相同性」は、最適にアライメントして比較した場合の２つの核酸又はそのうちの指示した配列が、適当なヌクレオチド挿入又は欠失がありながらも、ヌクレオチドの少なくとも約80%、通常はヌクレオチドの少なくとも約90%乃至95%、そしてより好ましくは少なくとも約98%乃至99.5%、同一であることを指すものである。代替的には、数セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で当該鎖の相補配列にハイブリダイズするときに、実質的な相同性が存在することとする。
二つの配列間のパーセント同一性は、これら二つの配列を最適にアライメントするのに導入せねばならないギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これら配列に共通の同一位置の数の関数である（即ち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×100）。二つの配列間の配列比較及びパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に解説するように、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
二つのヌクレオチド間のパーセント同一性は、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで入手できる）のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマトリックスを用いて、ギャップ・ウェイトを40、50、60、70、又は80 にし、そしてレングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして決定することができる。二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ALIGNプログラム（バージョン2.0)に組み込まれた E. マイヤース及びW. ミラーのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) を用い、PAM120 ウェイト残基表を用いて、ギャップ・レングス・ペナルティを12、そしてギャップ・ペナルティを4にして、決定することもできる。さらに、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで入手できる)のGAPプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを用い、Blossum 62 マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ・ウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4にし、レングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして、決定することができる。
さらに本発明の核酸及びタンパク質の配列を「クエリー配列」として利用して、公開データベースの検索を行って、例えば関連する配列を同定することなどができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST 及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）を利用すれば行える。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラムを用い、スコア= 100、ワード長= 12 にして行うと、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、 XBLASTプログラムを用い、スコア= 50、ワード長= 3にして行うと、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップのあるアライメントを行うには、Gapped BLAST をAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402が解説するとおりに利用できる。BLAST及びギャップドBLASTプログラムを利用する場合、各プログラムの（例えばXBLAST 及びNBLAST)のデフォルト・パラメータを利用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov. を参照されたい。
当該核酸は全細胞中にあっても、細胞ライセート中にあっても、又は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形で存在してもよい。核酸は、アルカリ／SDS処理、CsClバンディング、カラム・クロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動法、及び当業で公知の他の技術を含む標準的な技術により、例えば他の細胞内核酸又はタンパク質など、他の細胞成分又は他の混入物質を取り除いて精製されている場合に、「単離されている」又は「実質的に純粋である」ことになる。 F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。
cDNA、ゲノム又は混合物由来である本発明の核酸組成物は、しばしば天然配列（改変された制限部位等を除き）のままであり、遺伝子配列を提供する標準的技術に従って変異させてもよい。コーディング配列の場合、これらの変異は、必要に応じアミノ酸配列を左右するものでもよい。具体的には、ここで解説した天然V、D、J、定常、スイッチ及び他のこのような配列に実質的に相同又は由来とするDNA配列が考えられる（「由来する」が、ある配列が別の配列と同一か、もしくは別の配列から改変されていることを指す場合）。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作動的に連結された」ことになる。例えば、あるプロモータ又はエンハンサが、あるコーディング配列の転写を左右するのであれば、その配列に作動的に連結されていることになる。転写制御配列に関する場合、作動的に連結されたとは、連結しようとするDNA配列が連続していることを意味し、また２つのタンパク質コーディング領域を接合するために必要な場合には、連続し、かつ読み取り枠内にあることを意味する。スイッチ配列の場合には、作動的に連結された、とは、当該配列がスイッチ組換えを起こし得ることを指す。
ここで用いる用語「ベクタ」とは、連結された先の別の核酸を輸送できる核酸分子を言うものと、意図されている。ベクタの一種が、付加的なDNAセグメントを連結できる環状の二本鎖DNAループを言う「プラスミド」である。ベクタのもう一つの種類がウィルスベクタであり、この場合、付加的なDNAセグメントは、ウィルスゲノム内に連結させることができる。いくつかのベクタは導入された先のホスト細胞内で自律的複製が可能である（例えば細菌由来の複製開始点を有する細菌性ベクタや、エピソームほ乳類ベクタなど）。他のベクタ（例えば非エピソームほ乳類ベクタなど）は、ホスト細胞に導入されるや、ホスト細胞のゲノムに組み込まれるため、ホストゲノムと一緒に複製させることができる。さらに、いくつかのベクタは、作動的に連結された先の遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクタをここでは「組換え発現ベクタ」（又は単に「発現ベクタ」）と呼ぶ。一般的に、組換えDNA技術で実用性のある発現ベクタは、しばしばプラスミドの形である。本明細書では、プラスミドが最も普通に用いられている形のベクタであるため、「プラスミド」及び「ベクタ」を交換可能に用いている場合がある。しかしながら、本発明には、例えばウィルスベクタ（例えば複製欠陥レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルス）など、同等の機能を果たす他の形のこのような発現ベクタも包含されることが、意図されている。
ここで用いる用語「組換えホスト細胞（又は単に「ホスト細胞」）とは、組換え発現ベクタが導入された細胞を言うものと、意図されている。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も言うものと意図されていることは、理解されねばならない。突然変異又は環境による影響が原因で、特定の改変が継代に起きる場合があるため、このような後代は実際には親細胞と同一でないかも知れないが、それでも尚、ここで用いる用語「ホスト細胞」の範囲内に含まれる。組換えホスト細胞には、例えば、CHO細胞及びリンパ球性細胞がある。
ここで用いる用語「トランスフェクトーマ」は、CHO細胞又はNS/0細胞など、本抗体を発現する組換え真核ホスト細胞を包含する。
ここで用いる用語「対象」は、あらゆるヒト又は非ヒト動物を包含する。用語「非ヒト動物」は、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類等、ほ乳類及び非ほ乳類などのあらゆる脊椎動物を包含する。
用語「非ヒトトランスジェニック動物」とは、一つ以上のヒト重鎖及び／又は軽鎖導入遺伝子又はトランスクロモゾーム（当該動物の天然ゲノムDNAに組み込まれた、又は組み込まれていない）を含むゲノムを有し、完全ヒト抗体を発現できる非ヒト動物を言う。例えば、トランスジェニックマウスは、CD64抗原及び／又はCD64発現細胞で免疫されたときに、ヒト抗CD64抗体を産生するように、該マウスは、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子又はヒト重鎖トランスクロモゾームのいずれかとを有することができる。該ヒト重鎖導入遺伝子は、例えばHuMAbマウスなどのトランスジェニックの場合と同様に、マウスの染色体DNAに組み込ませることができ、あるいは該ヒト重鎖導入遺伝子を、WO 02/43478に解説されたトランスクロモゾマル（例えばKM）マウスの場合のように、染色体外に維持させることもできる。このようなトランスジェニック及びトランスクロモゾマル・マウスは、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、CD64に対して複数のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体（例えばIgG、IgA 及び／又は IgE)を産生することができる。
本発明の多様な局面を、以下の小項でさらに詳細に解説することとする。
Ｉ．CD30に対するヒト抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体（MAb）は、従来のモノクローナル抗体法、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術など、を含む多様な技術により作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション法が基本的には好適であるが、モノクローナル抗体を作製する他の技術、例えばＢリンパ球のウィルス又は腫瘍形成性形質転換など、も利用できる。
ハイブリドーマを調製するための好適な動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は大変よく確立された手法である。融合用の免疫化脾細胞の免疫プロトコル及び単離のための技術は当業で公知である。融合相手（例えばマウス骨髄腫細胞）及び融合法も公知である。
ある好適な実施態様では、CD30を狙ったヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を持つトランスジェニックマウスを用いて作製できる。これらのトランスジェニックマウスはここでは「HuMAb」マウスと呼ばれ、再編成していないヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子最小遺伝子座を、内因性のμ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的設定された変異と一緒に含有する(Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859)。従って、このマウスの示すマウスIgM又はκの発現は低く、免疫処置に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子がクラス・スイッチング及び体細胞変異を起こすことにより高親和ヒトIgGκモノクローナルが生じる (Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacologyで113:49-101レビューされた 上記のLonberg, N. et al. (1994) ; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, 及びHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546)。HuMAbマウスの作製は、下の項ＩＩ及びTaylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851に詳細に解説されており、これらすべての内容全体を引用をもってここに援用することとする。さらに、すべてLonberg 及びKay、並びにジェンファーム・インターナショナル社に付与された米国特許第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；及び第5,770,429号；Surani et al.のto 米国特許第5,545,807号；１９９８年６月１１日に公開された国際公報WO 98/24884；１９９４年１１月１０日に公開されたWO 94/25585；１９９３年６月２４日に公開された WO 93/1227；１９９２年１２月２３日に公開されたWO 92/22645；１９９２年３月１９日に公開されたWO 92/03918を参照されたく、これらのすべての開示全体を、引用をもってここに援用することとする。代替的には、実施例２で解説するHCO12トランスジェニックマウスを用いてヒト抗CD30抗体を作製することができる。
HuMAb免疫化
CD30に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するためには、HuMAbマウスをLonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 及び WO 98/24884に解説されたようにCD30抗原の精製もしくは濃縮製剤及び／又はCD30発現細胞で免疫することができる。好ましくは、当該マウスは１回目の輸注時に６乃至１６週齢であるとよい。例えば、CD30抗原（例えばCD30を発現するLNCaP細胞から精製されたもの）の精製もしくは濃縮製剤（5乃至20μg）を用いて、HuMAbマウスを腹腔内により免疫することができる。CD30抗原の精製もしくは濃縮製剤を用いた免疫処置でも抗体が生じない場合、腫瘍細胞株など、CD30発現細胞でマウスを免疫して、免疫応答を促進することもできる。
多様な抗原を用いて蓄積した経験では、HuMAbトランスジェニックマウスは、まず抗原を完全フロイント・アジュバントに入れて腹腔内（IP）免疫し、その後不完全フロイントアジュバントに抗原を入れて１週置きに（最高で合計６回）腹腔内免疫処置したときに最も良く応答することが示された。免疫応答は、眼窩後方の採血で得た血漿試料で、免疫プロトコルの経過にわたって観察することができる。血漿はELISA（以下に解説するように）でスクリーニングすることができ、充分な抗体価の抗CD30ヒト免疫グロブリンを持つマウスを融合に用いることができる。マウスは、と殺及び脾臓の摘出から３日前に抗原を静注して追加免疫することができる。各抗原について２乃至３回の融合を行う必要があるだろうと予測される。数匹のマウスを、各抗原について免役することになるであろう。例えばHC07及びHC012株の合計１２匹のHuMAbマウスを免疫することができる。
CD30に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
標準的なプロトコルに基づき、マウス脾細胞を単離し、PEGでマウス骨髄腫細胞株に融合させることができる。こうして出来たハイブリドーマを次に、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。例えば免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単個細胞懸濁液を、50%PEGで、P3X63-Ag8.653非分泌性マウス骨髄腫細胞 (ATCC, CRL 1580)の数の６分の１に融合させる。細胞を平底の微量定量プレートに約2×105になるようにプレートし、20%ウシクローン血清、18%「653」調整培地、5%オリゲン（IGEN社）、4 mM L-グルタミン、1 mM L~グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50 単位/ml ペニシリン、50 mg/ml ストレプトマイシン、50 mg/ml ゲンタマイシン及び1×HAT (シグマ社；HATは融合から２４時間後に加える）を含有する選択培地で２週間インキュベートする。２週間後、HATをHTに取り替えた培地で細胞を培養する。次に個々のウェルをELISAによりヒト抗CD30モノクローナルIgM及びIgG抗体についてスクリーニングする。広汎なハイブリドーマ成長が起きたら培地を通常１０乃至１４日後に観察する。抗体を分泌しているハイブリドーマを再度プレートし、再度スクリーニングし、ヒトIgG、抗CD30モノクローナル抗体についてまだ尚陽性であれば、限界希釈により少なくとも２回、サブクローニングすることができる。次に安定なサブクローンをin vitroで培養して、少量の抗体を組織培養培地中に生じさせ、特徴付けに向ける。
CD30に対するヒトモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明のヒト抗体は、当業で公知のように、組換えDNA技術及び遺伝子トランスフェクション法の組合せなどを用いて、ホスト細胞トランスフェクトーマで作製することもできる (Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
例えば、抗体又はその抗体フラグメントを発現させるためには、部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするDNAを、標準的な分子生物技術（例えばPCR増幅法、部位指定変異誘発法など）により得ることができ、当該遺伝子が転写及び翻訳制御配列に機能的に連結しているように、発現ベクタ内に挿入することができる。この関係から、用語「作動的に連結された」とは、ベクタ内の転写及び翻訳制御配列が、当該抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するというそれらに意図された機能を果たすように、ベクタに連結されていることを意味するものと、意図されている。発現ベクタ及び発現制御配列は、用いる発現ホスト細胞と適合性があるように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクタに挿入することもできるが、又はより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクタに挿入する。抗体遺伝子は発現ベクタ内に、標準的な方法（例えば抗体遺伝子断片とベクタの相補的な制限部位の連結、又は、制限部位がない場合には平滑末端の連結）により挿入される。VHセグメントがベクタ内のCHセグメントに作動的に連結するように、そしてVLセグメントがベクタ内のCLセグメントに作動的に連結するように、ここで解説する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクタ内に挿入することにより、いかなる抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子も、作製することができる。加えて、又は、代替的に、本組換え発現ベクタは、ホスト細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナル・ペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナル・ペプチドが当該抗体鎖遺伝子のアミノ末端にイン−フレームで連結されているように、ベクタ内にクローニングすることができる。シグナル・ペプチドは、免疫グロブリン・シグナル・ペプチドでも、又は異種シグナル・ペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナル・ペプチド）でもよい。
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクタは、ホスト細胞内での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を運ぶ。用語「調節配列」には、プロモータ、エンハンサ、及び、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御因子（例えばポリアデニレーション・シグナル）が含まれるものと、意図されている。このような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に解説されている。当業者であれば、調節配列の選択を含め、発現ベクタのデザインは、形質転換させようとするホスト細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等の因子に依存するであろうことは、理解されよう。哺乳動物ホスト細胞での発現に好適な調節配列には、例えばサイトメガロウィルス（CMV）、シミアン・ウィルス40（SV40）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス主要後期プロモータ（AdMLP））及びポリオーマを由来とするプロモータ及び／又はエンハンサなど、哺乳動物細胞でタンパク質の高レベルの発現を命令するウィルス配列がある。代替的には、例えばユビキチン・プロモータ又はb-グロビン・プロモータなど、非ウィルス調節配列を用いてもよい。
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加え、本発明の組換え発現ベクタには、ホスト細胞内でのベクタの複製を調節する配列（例えば複製開始点）や、選択マーカ遺伝子など、付加的な配列を持たせてもよい。選択マーカ遺伝子により、ベクタが導入されたホスト細胞の選抜が容易になる（例えばすべてAxel et al.の米国特許第4,399,216号、第4,634,665号及び第5,179,017号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択マーカ遺伝子は、ベクタが導入されたホスト細胞に、G418、ヒグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬物に対する耐性をもたらす。好適な選択マーカ遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ (DHFR) 遺伝子 (メトトレキセートの選択／増幅でdhfr-ホスト細胞で用いる）及びneo遺伝子（G418 選択用）、がある。
軽鎖及び重鎖の発現のためには、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクタを、標準的な技術によりホスト細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の多種の型は、外因性のDNAを原核性もしくは真核性ホスト細胞に導入するために通常用いられている幅広い技術、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、DEAEデキストラン・トランスフェクション等、を包含することを意図している。理論的には、本発明の抗体を、原核ホスト細胞又は真核ホスト細胞のいずれでも発現させることはできるが、真核細胞、そして最も好ましくは哺乳動物ホスト細胞で抗体を発現させることが最も好ましい。なぜなら、このような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、正しく折り畳まれ、かつ免疫的に活性な抗体を集合させて分泌する可能性が高いからである。抗体遺伝子の原核性発現は、活性な抗体を高収率で作製するためには効果的でないことが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
本発明の組換え抗体を発現させるのに好適な哺乳動物ホスト細胞には、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO細胞) (Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に解説され、DHFR選択マーカと一緒に、例えばR. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に解説されたように用いられるdhfr- CHO細胞)、NSO 骨髄腫細胞、COS細胞及びSP2細胞、がある。具体的には、NSO骨髄腫細胞で用いるには、別の好適な発現系は、WO 87/04462、WO 89/01036 及びEP 338,841に開示されたGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクタを哺乳動物ホスト細胞に導入する場合、抗体がホスト細胞で発現するのに、又はより好ましくは、ホスト細胞を成長させている培地へ抗体が分泌されるのに充分な時間、ホスト細胞を培養することにより、抗体を産生させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。
インタクト抗体を発現させるための部分的抗体配列の利用
抗体は、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（CDR）に位置するアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用する。そのため、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外にある配列よりも、個々の抗体間の違いが大きい。CDR配列は大半の抗体−抗原相互作用を担っているため、特定の天然発生型の抗体を由来とするCDR配列を、異なる性質を持つ異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した状態で含有するような発現ベクタを構築すると、特定の天然発生型抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えばRiechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; and Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033を参照されたい）。このようなフレームワーク配列は生殖細胞抗体遺伝子配列を含む公共DNAデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞配列は成熟型の抗体遺伝子配列とは異なるが、それはなぜなら、それらには、Ｂ細胞成熟の過程でV(D)J接合により形成される、完全に集合した可変遺伝子が含まれていないからである。生殖細胞遺伝子配列はまた、高親和二次レパートリー抗体の配列とも、可変領域全体にわたって個々のレベルで均一に異なる。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域のアミノ末端部分では比較的に頻度が低い。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域1のアミノ末端部分及びフレームワーク領域4のカルボキシ末端部分では比較的に頻度が低い。さらに、数多くの体細胞変異は、抗体の結合特性に大きく影響するものではない。そのために、もとの抗体のものと同様な結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直すために、特定の抗体のDNA配列全体を得る必要はない（あらゆる目的で、引用をもってここに援用することとする１９９９年３月１２日出願のPCT/US99/05535を参照されたい）。典型的には、CDR領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列があれば、この目的にとって充分である。この部分的配列を用いて、どの生殖細胞可変遺伝子及びジョイニング遺伝子セグメントが、組換え後の抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次にこの生殖細胞配列を用いて、可変領域の欠けている部分を充填する。重鎖及び軽鎖リーダ配列はタンパク質成熟の過程で切断され、最終的な抗体の特性には寄与しない。そのため、発現コンストラクトのためには対応する生殖細胞リーダ配列を用いる必要がある。欠けている配列を追加するためには、クローニングされたcDNA配列を、ライゲーション又はPCR増幅法により、合成オリゴヌクレオチドに組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合成し、PCR増幅法で組み合わせて、完全に人工的な可変領域クローンを作製することもできる。このプロセスは、特定の制限部位を削除又は含有させたり、あるいは特定のコドンを最適化するなどのいくつかの利点を有する。
ハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を用いて、重複組の合成オリゴヌクレオチドをデザインし、天然配列と同一のアミノ酸コーディング能を持つ合成V配列を作製する。この合成重鎖及びカッパ鎖配列は３つの方法で天然配列と異なってもよい：一続きの反復ヌクレオチド塩基に中断を加えてオリゴヌクレオチド合成及びPCR増幅がし易いようにする；最適な翻訳開始部位をコザックの規則に従い導入する(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870)；そしてHindIII部位をこの翻訳開始部位の上流に操作する。
重鎖及び軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコーディング鎖配列及び対応する非コーディング鎖配列を、この対応する非コーディングオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０乃至５０ヌクレオチドに分割する。従って各鎖毎に、オリゴヌクレオチドを、１５０乃至４００個のヌクレオチドのセグメントにわたる重複する二本鎖の組に組み立てることができる。次にこのプールをテンプレートとして用いて、１５０乃至４００個のヌクレオチドから成るPCR増幅産物を作製する。典型的には、一個の可変領域オリゴヌクレオチドの組を２つのプールに分割し、これらのプールを別々に増幅して２つの重複するPCV産物を作製することになるであろう。次にこれらの重複する産物をPCR増幅で組み合わせて完全な可変領域を形成する。また、重鎖又は軽鎖定常領域（カッパ軽鎖のBbsI部位、又はγ重鎖のAgeI部位を含む）の重複するフラグメントをPCR増幅で含めることが、発現ベクタコンストラクト内に容易にクローニングできるフラグメントを作製するには望ましいであろう。
次に、再構築された重鎖及び軽鎖可変領域を、クローニングされたプロモータ配列、翻訳開始配列、定常領域配列、3'側非翻訳配列、ポリアデニレーション配列、及び転写終了配列に組み合わせて、発現ベクタコンストラクトを形成する。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトを単一のベクタに組み合わせることも、同時トランスフェクトすることも、順にトランスフェクトすることも、あるいはホスト細胞内に別々にトランスフェクトしてからこのホスト細胞を融合して、両方の鎖を発現するホスト細胞を形成することもできる。
ヒトIgGκのための発現ベクタの構築に用いるプラスミドを以下に解説する。当該プラスミドは、PCR増幅後のV重鎖及びVカッパ軽鎖cDNA配列を用いると完全重鎖及び軽鎖最小遺伝子を再構築できるように構築された。これらのプラスミドは、完全にヒトの、もしくはキメラの、IgG1κ又はIgG4κ抗体を発現させるために用いることができる。同様なプラスミドは、他の重鎖アイソタイプを発現させたり、又は、ラムダ軽鎖を含む抗体を発現させるためにも、構築することができる。
このように、本発明の別の局面では、本発明のヒト抗CD30抗体、例えば17G1、2H9、又は5F11、の構造上の特徴を用いて、CD30に結合するなどの本発明の抗体の少なくとも一つの機能的特性を維持した、構造上関連するヒト抗CD30抗体を作製する。より具体的には、17G1、2H9、又は5F11の一つ以上のCDRを、既知のヒトフレームワーク領域及びCDRに組換えにより組み合わせることで、更なる、組換え操作された、本発明のヒト抗CD30抗体を作製することができる。
従って、別の実施態様では、本発明は：
（１）ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRであって、前記ヒト重鎖CDRのうちの少なくとも一つが、図７、９、又は１１（配列番号 16、17、18、28、29、30、40、41 及び42）に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRと；（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRであって、前記軽鎖CDRのうちの少なくとも一つが、図８、１０、又は１２ (配列番号 22、23、24、34、35、36、46、47 及び48)に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRとを含む抗体を調製するステップ
を含み、前記抗体がCD30への結合能を維持している、抗CD30抗体を調製する方法を提供するものである。
当該抗体のCD30への結合能は、実施例に記載したものなど、標準的な結合検定法（例えばELISA）を用いて判定することができる。
抗体の重鎖及び軽鎖CDR3ドメインは特に重要な役割を、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において果たすことが当業で公知であるため、上述のように調製された本発明の組換え抗体は、好ましくは、10F8の重鎖及び軽鎖CDR3を含むとよい。本抗体にさらに17G1、2H9、又は5F11のCDR2を含めることもできる。本抗体にはさらに17G1、2H9、又は5F11のCDR1を含めることもできる。さらに本抗体には、これらCDRのいずれかの組合せを含めることもできる。
従って、別の実施態様では、さらに本発明は、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖CDR1領域、ヒト重鎖CDR2領域、及びヒト重鎖CDR3領域であって、前記ヒト重鎖CDR3領域が図７、９、又は１１ (配列番号18、30、又は42)に示された17G1、2H9、又は5F11の重鎖CDR3である、ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖CDR1領域、ヒト重鎖CDR2領域、及びヒト重鎖CDR3領域と、（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖CDR1領域、ヒト軽鎖CDR2領域、及びヒト軽鎖CDR3領域であって、前記ヒト軽鎖CDR3領域が図８、１０、又は１２ (配列番号24、36、又は48)に示された17G1、2H9、又は5F11の軽鎖CDR3である、ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖CDR1領域、ヒト軽鎖CDR2領域、及びヒト軽鎖CDR3領域を含む抗CD30抗体であって、但し前記抗体はCD30に結合する、抗CD30抗体を提供するものである。さらに本抗体に、 17G1、2H9、又は5F11の重鎖CDR2及び／又は軽鎖CDR2を含めてもよい。さらに本抗体に、17G1、2H9、又は5F11の重鎖CDR1及び／又は軽鎖CDR1を含めてもよい。
上述の操作された抗体のCDR1、2、及び／又は3領域は、ここに開示した17G1、2H9、又は5F11のそれと全く同じアミノ酸配列を含むことができる。しかしながら、当業者であれば、抗体のCD30への結合能が事実上保持されれば、17G1、2H9、又は5F11通りのCDR配列から何らかの逸脱があってもよいことは理解されよう。従って、別の実施態様では、操作後の抗体は、17G1、2H9、又は5F11の一つ以上のCDRに対し、例えば95%、98% 又は99.5% 同一な、一つ以上のCDRから成ってもよい。
CD30へ単に結合することに加えて、又は代替的に、上述したものなどの操作された抗体を、本発明の抗体の他の機能上の特徴：例えば：
（１）ヒトCD30に結合して、CD30発現腫瘍細胞の成長を阻害する；
（２）CD30リガンドのヒトCD30への結合を阻害する；
（３）エフェクタ細胞の存在下で、CD30発現腫瘍細胞のADCCを誘導する；
（４）マクロファージの存在下で、CD30発現腫瘍細胞の貪食を誘導する；及び／又は
（５）少なくとも108 M-1の平衡定数（Ka）でヒトCD30に結合する、
の保持について選抜してもよい。
CD30へのヒトモノクローナル抗体の結合の特徴付け
本発明のヒトモノクローナルCD30抗体の結合を特徴付けるには、免疫したマウスの血清をELISAなどで検査することができる。典型的（しかし限定的ではない）ELISAプロトコルの例では、微量定量プレートを、PBSに入れた0.25μg/mlの精製CD30で被覆した後、5%ウシ血清アルブミンPBS溶液で遮断する。CD30免疫マウスから採った血漿の希釈液を各ウェルに加え、３７℃で１乃至２時間、インキュベートする。このプレートをPBS／Tweenで洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗ヒトIgG Fc特異ポリクローナル試薬と一緒に３７℃で１時間、インキュベートする。洗浄後、プレートをpNPP基質（1mg/ml）で展開させ、405乃至650のODで分析する。好ましくは、最も高い抗体価を生じるマウスを融合に用いるとよい。
上述のELISA検定は、CD30免疫原との陽性反応性を示すハイブリドーマを探すスクリーニングにも用いることができる。CD30に強力に結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴付けることとなる。親細胞の反応性を維持した（ELISAにより）各ハイブリドーマから採った一個のクローンを選択し、5乃至10バイアルの細胞バンクを作製して-140℃で保存し、抗体精製に向ける。
ヒト抗CD30抗体を精製するには、選抜されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製用の２リットル入りスピナー・フラスコで成長させることができる。上清を濾過し、濃縮してからプロテインＡ−セファロース（ニュージャージー州ピスカタウェイ、ファルマシア社）によるアフィニティ・クロマトグラフィにかけることができる。溶出したIgGをゲル電気泳動法及び高速液体クロマトグラフィでチェックして純度を確認することができる。緩衝液をPBSに交換し、1.43の吸光係数を用いたOD280により、濃度を判定できる。このモノクローナル抗体を分取し、-80℃で保存できる。
選抜されたヒト抗CD30モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかを調べるためには、各抗体を市販の試薬（イリノイ州ロックフォード、ピアース社）を用いてビオチン化することができる。未標識のモノクローナル抗体及びビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合実験は、CD30で被覆したELISAプレートを上述したように用いて行うことができる。ビオチン化MAbの結合は、ストレプアビジン−アルカリホスファターゼ・プローブで検出できる。
精製された抗体のアイソタイプを調べるには、アイソタイプELISAを行うことができる。微量定量プレートのウェルを10μg/ml の抗ヒトIg で一晩かけて４℃で被覆できる。5% BSAで遮断した後、プレートを10μg/mlのモノクローナル抗体又は精製済みのアイソタイプ・コントロールに、周囲温度で２時間、反応させる。次にこのウェルをヒトIgGl 又はヒトIgM-特異アルカリホスファターゼ−結合プローブに反応させることができる。プレートを展開させ、上述したように分析する。
CD30発現生存細胞へのモノクローナル抗体の結合を実証するためには、フローサイトメトリを利用できる。フローサイトメトリ・プロトコルの典型的（しかし限定的ではない）の一例では、CD30発現細胞株（標準的な成長条件下で成長させたもの）を、0.1% BSA及び20%マウス血清を含有する多様な濃度のモノクローナル抗体PBS溶液に混合し、３７℃で１時間、インキュベートする。洗浄後、細胞を、フルオレセインで標識された抗ヒトIgG抗体に、一次抗体染色と同じ条件下で反応させる。これら試料は、FACScan装置により、単個細胞に当たる光及び側光散乱特性を用いて分析することができる。蛍光顕微鏡法を用いた代替的な検定法を（フローサイトメトリ検定法に加えて又は代わりに）用いてもよい。細胞は上述した通りに染色し、蛍光顕微鏡法で調べることができる。この方法では、個々の細胞の観察が可能であるが、抗原の濃度によっては感受性が劣るかも知れない。
さらに抗CD30ヒトIgGは、CD30抗原との反応性についてウェスタン・ブロット法でもテストすることができる。例えば、CD30発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にかけることができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース・メンブレンに写し取り、20%マウス血清で遮断し、テスト対象のモノクローナル抗体でプローブする。ヒトIgGの結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBT基質錠剤で展開させることができる（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカルズ社）。
CD30に対するヒトモノクローナル抗体の貪食及び細胞致死活性
ヒトモノクローナル抗CD30抗体は、CD30への特異的結合に加え、CD30発現細胞の貪食及び致死を媒介する能力についても、テストすることができる。モノクローナル抗体活性のin vitroでの検査は、in vivoモデルでのテストの前の最初のスクリーニングとなるであろう。簡単に説明すると、健康なドナーからの多核白血球(PMN）又は他のエフェクタ細胞をフィッコール・ハイパック密度遠心分離法で精製した後、混入赤血球を溶解させることができる。洗浄したPMNを、10%熱不活化ウシ胎児血清を添加したRPMI中に懸濁させ、51Crで標識したCD30発現細胞と、様々なエフェクタ細胞対腫瘍細胞の比（−エフェクタ細胞：腫瘍細胞）で混合することができる。次に、精製済みのヒト抗CD30 IgGを様々な濃度で加えることができる。 無関係のヒトIgGを陰性コントロールとして用いることができる。検定は、３７℃で４乃至１８時間かけて行うことができる。51Crの培養上清への放出を測定することで、試料を細胞溶解について検定できる。さらに抗CD30モノクローナルを相互に組み合わせてテストして、複数のモノクローナル抗体で細胞溶解が高められるかを調べることもできる。
さらに、CD30に結合するヒトモノクローナル抗体をin vivoモデル（例えばマウス）でテストして、腫瘍細胞など、CD30発現細胞の貪食及び致死の媒介能を調べることができる。これらの抗体は、排他的であることを意図しない以下の基準などに基づいて選抜することができる：
１）CD30発現生存細胞への結合；
２）CD30への結合の高親和性；
３）CD30上の固有のエピトープへの結合（それにより、補完的な活性を持つモノクローナル抗体を組み合わせて用いた場合に、同じエピトープへの結合をめぐった競合が起きる可能性をなくす）；
（４）CD30発現細胞のオプソニン化；
（５）ヒトエフェクター細胞の存在下でのCD30発現細胞の成長阻害、貪食及び／又は致死の媒介。
本発明の好適なヒトモノクローナル抗体は、これらの基準の一つ以上、そして好ましくは全てを満たすものである。ある具体的な実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体を、２種以上の抗CD30モノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む医薬組成物などとして、組み合わせて用いる。例えば、所望の治療又は診断効果を上げるために、異なる、しかし補完的な活性を有するヒト抗CD30モノクローナル抗体を単一の治療法に組み合わせることができる。これの一例は、エフェクタ細胞の存在下での標的細胞の効果の高い致死を媒介する抗CD30ヒトモノクローナル抗体を、CD30発現細胞の成長を阻害する別のヒト抗CD30モノクローナル抗体と組み合わせて含有する組成物であろう。
ＩＩ． ヒトモノクローナル抗CD30抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物の作製
さらに別の局面では、本発明は、CD30に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現できるトランスジェニックもしくはトランスクロモゾマルマウスなどの非ヒトトランスジェニック及びトランスクロモゾマル動物を提供するものである。ある具体的な実施態様では、本発明は、当該マウスが、CD30抗原及び／又はCD30発現細胞で免疫されたときにヒト抗CD30抗体を産生するように、ヒト重鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックもしくはトランスクロモゾマル・マウスを提供する。該ヒト重鎖導入遺伝子は、ここで詳述し、また例示するように、HuMAbマウスなどのトランスジェニックの場合と同様に、当該マウスの染色体DNA中に組み込むことができる。代替的には、該ヒト重鎖導入遺伝子を、WO02/43478で解説された通りにトランスクロモゾマル（例えばKM）マウスの場合と同様に、染色体外に維持することができる。このようなトランスジェニック及びトランスクロモゾマル動物は、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、CD30に対して複数のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体(例えばIgG、IgA 及び／又は IgE)を産生できる。アイソタイプ・スイッチングは、例えば古典的又は非古典的なアイソタイプ・スイッチングなどで起きるものでもよい。
外来の抗原刺激に対して異種抗体レパートリーで応答する非ヒトトランスジェニック又はトランスクロモゾマル動物をデザインするには、トランスジェニック動物内に含まれた異種免疫グロブリン導入遺伝子がＢ細胞発生の経路全体にわたって正確に機能する必要がある。これには、例えば、異種重鎖導入遺伝子のアイソタイプ・スイッチングが含まれる。従って、導入遺伝子は、アイソタイプ・スイッチングと、以下：（１）高レベルかつ細胞種特異的な発現、（２）機能遺伝子の再編成、（３）アレル排除の活性化及びアレル排除への応答、（４）充分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞の超変異、及び（７）免疫応答注の導入遺伝子抗体遺伝子座の優性、のうちの一つ以上とが生じるように、構築される。
前述の基準の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を機能的に破壊した実施態様では、この導入遺伝子はアレル排除を活性化する必要はない。さらに、導入遺伝子が機能的に再編成された重鎖及び／又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む実施態様では、機能遺伝子の再編成という二番目の基準は、導入遺伝子が既に再編成されている限りにおいて、不要である。分子免疫学の背景については、Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.を参照されたい。
いくつかの実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を作製するために用いる非ヒトトランスジェニック又はトランスクロモゾマル動物は、再編成された、再編成のない、又は再編成された及び再編成のないものの組合せの異種免疫グロブリン重鎖及び軽鎖導入遺伝子を、このトランスジェニック動物の生殖細胞に含有する。重鎖導入遺伝子のそれぞれは少なくとも一つのCH遺伝子を含む。加えて、この重鎖導入遺伝子が、このトランスジェニック動物のＢ細胞中で、複数のCH遺伝子をコードする異種導入遺伝子のアイソタイプ・スイッチングを支援できる機能的アイソタイプ・スイッチ配列を含有していてもよい。このようなスイッチ配列は、導入遺伝子CH遺伝子の源として働く種由来の生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然で存在するものであってもよく、あるいはこのようなスイッチ配列は、導入遺伝子コンストラクトを受け取る側の種（トランスジェニック動物）にあるものを由来としてもよい。例えば、トランスジェニックマウスを作製するために用いるヒト導入遺伝子コンストラクトは、マウス重鎖遺伝子座に天然で存在するものと類似のスイッチ配列が導入されている場合には、より高頻度でアイソタイプ・スイッチング事象を起こすと思われる。これはおそらく、マウススイッチ・リコンビナーゼ酵素系で機能するには、このようなマウススイッチ配列は最適であるが、ヒトスイッチ配列はそうでないからであろう。スイッチ配列は従来のクローニング法で単離及びクローニングしてもよく、又は、免疫グロブリンスイッチ領域配列に関して公開された配列情報に基づいてデザインされた重複合成オリゴヌクレオチドからde novo合成してもよい (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989))。前述のトランスジェニック動物のそれぞれの場合、機能的に再編成された異種重鎖及び軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子が、このトランスジェニック動物のＢ細胞の大部分で見られる（少なくとも１０パーセント）。
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生させるために用いられる非ヒトトランスジェニック動物を作製するために用いる導入遺伝子は、少なくとも一つの可変遺伝子セグメント、一つの多様性遺伝子セグメント、一つのジョイニング遺伝子セグメント、及び少なくとも一つの定常領域遺伝子セグメント、をコードするDNAを含む重鎖導入遺伝子を含む。免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子は、少なくとも一つの可変遺伝子セグメント、一つのジョイニング遺伝子セグメント、及び少なくとも一つの定常領域遺伝子セグメント、をコードするDNAを含む。前記軽鎖及び重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、当該の非ヒトトランスジェニック動物を構成しない種を由来とする免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAを由来とするか、又は、このようなDNAに相当するという点で、このトランスジェニック動物にとって異種である。本発明の一局面では、これら個々の遺伝子セグメントが再編成されないように、即ち、機能的免疫グロブリン軽鎖又は重鎖をコードするよう、再編成されないように、導入遺伝子を構築する。このような再編成のない導入遺伝子は、V、D、及びJ遺伝子セグメントの組換え（機能的再編成）を支援し、好ましくは、CD30抗原に暴露したときに、当該トランスジェニック動物内でD領域遺伝子セグメントの全部又は一部が再編成後の免疫グロブリン重鎖へ取り込まれることを支援するとよい。
代替的な実施態様では、当該導入遺伝子は再編成のない「最小遺伝子座」を含むものである。このような導入遺伝子は典型的に、C、D、及びJセグメントの大部分や、V遺伝子セグメントのサブセットを含む。このような導入遺伝子コンストラクトにおいては、多様な調節配列、例えばプロモータ、エンハンサ、クラス・スイッチ領域、RNAプロセッシングの際のスプライス−ドナー及びスプライス−アクセプタ配列、組換えシグナル等、は、当該の異種DNA由来の対応する配列を含む。このような調節配列は、この導入遺伝子に、本発明で用いられる非ヒト動物と同じ種から、又は、関連する種から、導入してよい。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを導入遺伝子内でげっ歯類免疫グロブリンエンハンサ配列に組み合わせて、トランスジェニックマウスでの利用に向けてもよい。代替的には、哺乳動物のゲノムに天然で存在することが公知の機能的DNA配列にとって相同でないような合成調節配列を、導入遺伝子に組み込んでもよい。合成調節配列は、例えばスプライス−アクセプタ部位又はプロモータ／エンハンサ・モチーフの許容可能な配列を明示したものなど、コンセンサスの規則に従ってデザインされる。例えば、最小遺伝子座は、天然で発生する生殖細胞Ig遺伝子座に比較して、必須でないDNA部分（例えば介在配列；イントロン又はその一部分）に、少なくとも一つの中間（即ち当該部分の末端ではない）の欠失を有するゲノム免疫グロブリン遺伝子座部分を含む。
本発明のある好適な実施態様では、CD30に対するヒト抗体を作製するために用いるトランスジェニック又はトランスクロモゾマル動物は、WO98/24884の実施例5、6、8、又は14に解説された軽鎖導入遺伝子を１コピー含有する動物と、WO98/24884の実施例10で解説されたJHを欠失させた動物と交配したその仔で育種したWO98/24884の実施例１２で解説された導入遺伝子（例えばpHC1又はpHC2）のコピーを少なくとも１つ、典型的には２乃至１０、そして時には２５乃至５０又はそれ以上、含有する。動物は、これら３種の形質のそれぞれについてホモ接合型となるよう、交配する。このような動物は以下の遺伝子型：（WO98/24884の実施例１２に解説された）ヒト重鎖の再編成のない最小遺伝子座 の一個のコピー（染色体の１ハプロイド当たり）、（WO98/24884の実施例１４に解説された）再編成されたヒトK軽鎖コンストラクトの一個のコピー（染色体の１ハプロイド当たり）、及び（WO98/24884の実施例１０に解説された）機能的JHセグメントの全てを除去する各内因性マウス重鎖遺伝子座での欠失、を有する。このような動物を、JHセグメントの欠失についてホモ接合型になったマウス（WO98/24884の実施例１０）と交配して、JH欠失についてホモ接合型、そしてヒト重鎖及び軽鎖コンストラクトについてヘミ接合型となった仔を作る。その動物に抗原を注射して、これらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の作製に用いる。
このような動物から単離されたＢ細胞は、ヒト重鎖及び軽鎖について単一特異的であるが、それはこれらが各遺伝子のコピーを１つしか含有しないからである。さらに、これらはヒト又はマウス重鎖についても単一特異的となるであろうが、それは、内因性マウス重鎖遺伝子コピーの両方が、WO98/24884の実施例9及び12に解説するように導入されたJH領域全般の欠失のために、機能を失っているからである。さらに、Ｂ細胞の大部分が、ヒト又はマウス軽鎖について単一特異的となるであろうが、それは、再編成されたヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーが発現することで、Ｂ細胞の大部分において、内因性マウスκ及びラムダ鎖遺伝子の再編成がアレル及びアイソタイプの上で、排除されることになるからである。
好適な非ヒトトランスジェニック及びトランスクロモゾマル動物、例えばマウス、は、大きなレパートリー、理想的には天然マウスのそれと実質的に同様なレパートリーで、免疫グロブリン産生を示すであろう。このように、例えば内因性Ig遺伝子が不活化されている実施態様では、総免疫グロブリンレベルは、血清の約0.1 から10 mg/ml、好ましくは0.5 から5 mg/mlの範囲、理想的には少なくとも約1.0 mg/mlであろう。IgMからIgGへのスイッチを行うことのできる導入遺伝子がトランスジェニックマウスに導入されている場合、成体マウスの血清IgG対IgMの比は好ましくは約１０：１である。IgG対IgMのこの比は幼若マウスではずっと低くなるであろう。おおざっぱに言って、当該脾臓及びリンパ節Ｂ細胞の約10%を越えるもの、好ましくは40乃至80%が、ヒトIgGタンパク質のみを発現する。
前記レパートリーは、理想的には、天然マウスが示すものに、通常は少なくとも約10%、好ましくは25乃至50%又はそれ以上、近いとよいであろう。概して、少なくとも約１０００種の異なる免疫グロブリン（理想的にはIgG）、好ましくは104乃至106又はそれ以上の種類が、主にマウスゲノムに導入された様々なV、J及びD領域の数に応じて産生されるとよいであろう。これらの免疫グロブリンは、典型的には、例えばブドウ球菌プロテインＡなど、抗原性の高いタンパク質の約半分以上を認識するであろう。典型的には、これらの免疫グロブリンは、所定の抗原に対しては、10-7M未満、例えば10-8M、10-9M、又は10-10M未満あるいはそれ未満の親和性(KD）を示すであろう。いくつかの実施態様では、所定の抗原種に対する抗体応答で現れるV遺伝子の選択幅を制限するために、予め決められたレパートリーを持つ非ヒト動物を作製することが好ましいであろう。予め決められたレパートリーを有する重鎖導入遺伝子は、ヒトにおいて所定の抗原種に対する抗体応答で優先的に用いられるヒトVH遺伝子などを含んでもよい。代替的には、いくつかのVH遺伝子は、多様な理由（例えば所定の抗原に対して親和性の高いV領域をコードする可能性が低い；体細胞変異及び親和性尖鋭化を起こす傾向が小さい；又は、特定のヒトに対して免疫原性である、など）のために規定のレパートリーから除外してもよい。このように、多様な重鎖又は軽鎖遺伝子セグメントを含有する導入遺伝子が再編成される前に、このような遺伝子セグメントを、当該トランスジェニック動物以外の生物種由来であるとして、例えばハイブリダイゼーション又はDNA配列決定法などにより、容易に特定できよう。
非ヒトトランスジェニック及びトランスクロモゾマル動物、例えばマウス、は、前述したようにCD30抗原の精製もしくは組換え製剤、及び／又は、CD30発現細胞などで免疫することができる。代替的には当該トランスジェニック動物をヒトCD30をコードするDNAで免疫することができる。この動物が産生するＢ細胞は、導入遺伝子内スイッチ組換え（cisスイッチング）を通じてクラス・スイッチングを起こして、CD30と反応性の免疫グロブリンを発現するであろう。この免疫グロブリンはヒト抗体（ここでは「ヒト配列抗体」とも言及される）でもよく、その重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、ヒト導入遺伝子配列にコードされていてもよいが、前記ヒト導入遺伝子配列は、体細胞変異及びV領域組換えジョイント由来の配列や、生殖細胞にコードされた配列を含んでもよい。これらのヒト抗体は、たとえ他の非生殖細胞配列も、体細胞変異及び示差的なV-J 及びV-D-J組換えジョイントの結果存在していたとしても、ヒトVL又はVH遺伝子セグメント及びヒトJL又はDH及びJHセグメントにコードされたポリペプチド配列と実質的に同一であると言うことができる。各抗体鎖の可変領域は、典型的に、ヒト生殖細胞V、Jに、そして重鎖の場合D、遺伝子セグメントに、少なくとも８０パーセント、コードされている。しばしば可変領域の少なくとも８５パーセントが、導入遺伝子上に存在するヒト生殖細胞配列にコードされている。可変領域配列のうちのしばしば９０又は９５パーセント又はそれ以上が、導入遺伝子上に存在するヒト生殖細胞配列にコードされている。しかしながら、体細胞変異並びにVJ及びVDJジョイニングでは非生殖細胞配列が導入されるために、当該ヒト配列抗体はしばしば、ヒト導入遺伝子に見られるようなヒトV、D又はJ遺伝子セグメントにはコードされていない何らかの可変領域配列を（そして頻度は劣るが定常領域配列を）、このマウスの生殖細胞中に有するであろう。典型的には、このような非生殖細胞配列（又は個々のヌクレオチド位置）は、CDR中か、又はCDR近傍、あるいは体細胞変異が集中的に起きることが知られている領域に集まるであろう。
所定の抗原に結合するヒト抗体は、ヒト配列γ鎖（例えばγ1、γ2a、γ2B、又はγ3）及びヒト配列軽鎖（例えばカッパ）を含むヒト抗体が生じるようなアイソタイプ・スイッチングにより生じさせることができる。このようなアイソタイプ・スイッチングの起きたヒト抗体は、親和性成熟及び抗原によるＢ細胞の選択の結果として、特に二次（又は後続）抗原刺激の結果として、一箇所以上の体細胞変異を、典型的には可変領域、そしてしばしばCDRの内部か、又はCDRから約１０残基以内に、しばしば含有する。これらの高親和性ヒト抗体は、10-7M未満、例えば10-8M、10-9M又は10-10M未満又はさらに低い結合親和性（KD）を有するであろう。
本発明の別の局面は、ここで解説したトランスジェニック又はトランスクロモゾマル非ヒト動物由来のＢ細胞を包含する。該Ｂ細胞は、ヒトCD30に高親和（例えば10-7M未満）結合するヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを作製するために、用いることができる。このように、別の実施態様では、本発明は、組換えヒトCD30を分析物とし、本抗体をCD30への結合リガンドとして用いて、BIACORE 3000装置で表面プラスモン共鳴（SPR）技術で判定したときに、親和性（KD）が10-7 M未満、例えば10 -8 M未満、10-9 M未満、又は10-10 M未満又はさらにそれより低いようなヒト抗体を産生するハイブリドーマを提供するものであり、 但し当該抗体が：
（１）ヒトVL遺伝子セグメント及びヒトJLセグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、及び（２）ヒトCL遺伝子セグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する軽鎖定常領域、から成るヒト配列軽鎖と；
（１）ヒトVH遺伝子セグメント、選択的にD領域、及びヒトJHセグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び（２）ヒトCH遺伝子セグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する定常領域、から成るヒト配列重鎖と
を含む。
CD30に対する高親和ヒトモノクローナル抗体の開発は、組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子を含むゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物で、ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを拡大する方法により容易になるが、当該方法は、前記組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子には存在しないV領域遺伝子セグメントを含むV遺伝子導入遺伝子を前記ゲノムに導入するステップを含む。しばしば前記V領域導入遺伝子は、ヒトゲノムに天然で存在するような、又は、組換え法で一緒に別にスプライスされるような、ヒトVH又はVL（VK）遺伝子セグメント・アレイの一部分を含む酵母人工染色体であり、この酵母人工染色体の含有するV遺伝子セグメントは順序が狂っていても、又は省略されていてもよい。しばしば少なくとも５つ又はそれ以上の機能的V遺伝子セグメントがYAC上に含有されている。このバリエーションで、前記Vレパートリー拡大法で生じるトランスジェニック動物を作製することが可能であり、このとき当該動物は、V領域導入遺伝子上に存在するV領域遺伝子セグメントにコードされた可変領域配列と、ヒトIg導入遺伝子にコードされたC領域とを含む免疫グロブリン鎖を発現する。Vレパートリー拡大法により、少なくとも５個の異なるV遺伝子を有するトランスジェニック動物を作製でき、また少なくとも約２４個又はそれ以上のV遺伝子を含有する動物も作製できる。いくつかのV遺伝子セグメントは非機能的であってもよい（例えば偽遺伝子等）。これらのセグメントを維持してもよいが、あるいは、必要に応じて当業者に可能な組換え法により選択的に欠失させてもよい。
マウス生殖細胞を操作して、J及びC遺伝子セグメントを含有するヒトIg導入遺伝子には実質的に存在しない拡大されたVセグメント・レパートリーを有する機能的YACを含有させたら、拡大されたVセグメント・レパートリーを有する機能的YACを、異なるヒトIg導入遺伝子を有する非ヒト動物生殖細胞に交雑するバックグラウンドを含め、他の遺伝的バックグラウンドにこの形質を伝播及び交雑することができる。拡大されたVセグメント・レパートリーを有する複数の機能的YACを、１つのヒトIg導入遺伝子（又は複数のヒトIg導入遺伝子）と一緒に働かせるために生殖細胞に交雑してよい。ここではYAC導入遺伝子と言及するが、ゲノムに組み込んだときのこのような導入遺伝子は、酵母で自律的複製を行うのに必要な配列など、酵母配列を実質的に欠いていてもよい。このような配列は、選択的に、酵母での複製がもはや必要でなくなってから（即ちマウスES細胞又はマウス前接合子への導入前に）遺伝子操作（例えば制限消化及びパルス界ゲル電気泳動法又は他の適した方法など）により取り除いてもよい。ヒト配列免疫グロブリン発現の形質を伝播させる方法には、ヒトIg導入遺伝子を有し、そして選択的には、拡大されたVセグメント・レパートリーを有する機能的YACもさらに有するようなトランスジェニック動物を育種する方法がある。VH及びVL遺伝子セグメントの両方がYAC上に存在していてもよい。当該トランスジェニック動物は、ヒトIg導入遺伝子、及び／又は、他のヒトリンパ球たんぱくをコードする導入遺伝子を含め、他のヒト導入遺伝子を持つバックグラウンドを含む、開業医が希望するいかなるバックグラウンドに交雑してもよい。さらに本発明は、拡大されたV領域レパートリーYAC導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスが産生する高親和ヒト配列免疫グロブリンも提供する。前の記載では、本発明のヒトモノクローナル抗体を作製するのに用いるトランスジェニック動物の好適な実施態様を解説したが、以下、４つのカテゴリーに分類された他の実施態様も考察されている：
Ｉ．再編成のない重鎖及び再編成される軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物；
ＩＩ．再編成のない重鎖及び再編成される軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物；
ＩＩＩ．再編成される重鎖及び再編成のない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物；及び
ＩＶ．再編成される重鎖及び再編成される軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物。
これらのカテゴリーのトランスジェニック動物のうち、優先度の順序は以下、ＩＩ＞Ｉ＞ＩＩＩ＞ＩＶ（この場合の内因性の軽鎖遺伝子（又は少なくともK遺伝子）は、相同組換え（又は他の方法）によりノックアウトされている）、及びＩ＞ＩＩ＞ＩＩＩ＞ＩＶ （この場合の内因性軽鎖遺伝子はノックアウトされておらず、アレル排除により劣性とならなければならない）の通りである。
ＩＩＩ． CD30に結合する二重特異的／多重特異的分子
本発明のさらに別の実施態様では、CD30に対するヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を誘導体化するか、又は、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばFab'フラグメント）などの別の機能分子に連結して、複数の結合部位又は標的エピトープに結合する二重特異的又は多重特異的分子を作製することができる。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、例えば別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド又は結合ミメティックなど、１つ以上の他の結合分子に（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的結合又は他の方法により）機能的に連結することができる。
従って、本発明は、CD30に対する少なくとも１つの第一結合特異性部分と、第二標的エピトープに対する第二結合特異性部分とを含む二重特異的及び多重特異的分子を包含するものである。本発明のある具体的な実施態様では、前記第二標的エピトープは、例えばヒトFcγRI（CD64）又はヒトFcα受容体（CD89）などのFc受容体である。従って、本発明は、FcγR、FcαR又はFcεRを発現するエフェクタ細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球（PMN）など）と、CD30を発現する標的細胞の両方に結合できる二重特異的及び多重特異的分子を包含する。これらの二重特異的及び多重特異的分子はCD30発現細胞をエフェクタ細胞に狙わせて、本発明のヒトモノクローナル抗体と同様、Fc受容体が媒介するエフェクタ細胞の活性、例えばCD30発現細胞の貪食、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ADCC）、サイトカイン放出、又はスーパーオキシド・アニオンの産生など、を惹起する。
さらに本発明の二重特異的及び多重特異的分子には、抗Fc結合特異性部分及び抗CD30結合特異性部分に加え、第三結合特異性部分をさらに含めることができる。ある実施態様では、前記第三結合特異性部分は、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合して標的細胞への免疫応答を増す分子など、抗エンハンスメント因子（EF）部分である。前記の「抗エンハンスメント因子部分」は、抗原又は受容体などの特定の分子に結合して、Fc受容体又は標的細胞抗原の結合決定基の作用を高めるような抗体、機能的抗体フラグメント又はリガンドであってよい。前記「抗エンハンスメント因子部分」は、Fc受容体又は標的細胞抗原に結合することができる。代替的には、前記抗エンハンスメント因子部分は、第一及び第二結合特異性部分が結合する実体とは異なる実体に結合することができる。例えば、前記抗エンハンスメント因子部分は、細胞傷害性Ｔ細胞に（例えばCD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1を介して、又は、標的細胞への免疫応答が高まる結果となる他の免疫細胞を介して）結合することができる。
ある実施態様では、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、例えばFab、Fab'、F（ab')2、Fv、又は一本鎖Fvなどを含め、少なくとも一種の抗体又はその抗体フラグメントを結合特異性部分として含む。この抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体であっても、あるいは、その内容を引用をもって援用することと明示しておく１９９０年８月７日発行の Ladner et al. の米国特許第4,946,778号に解説されているようなFv又は一本鎖コンストラクトなど、その何らかの最小フラグメントであってもよい。
ある実施態様では、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、エフェクタ細胞の表面上に存在するFcγR又はFcαRに対する結合特異性部分と、CD30などの標的細胞抗原に対する第二結合特異性部分とを含む。
ある実施態様では、Fc受容体に対する結合特異性を、その結合がヒト免疫グロブリンG（IgG）の遮断を受けないヒトモノクローナル抗体によって提供する。ここで用いる用語「IgG受容体」とは、１番染色体上にある８つのγ鎖遺伝子のいずれをも言う。これらの遺伝子は 、３つのFcγ受容体クラス：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、及びFcγRIII（CD16）に分類される合計１２種の膜貫通又は可溶性の受容体アイソフォームをコードしている。ある好適な実施態様では、前記Fcγ受容体はヒト高親和FcγRIである。このヒトFcγRIは72kDaの分子であり、単量体IgGに対して高い親和性（108乃至109M-1）を示す。
これらの好適なモノクローナル抗体の作製及び特徴付けは、その教示全体を引用をもってここに援用することとするFanger et al. のPCT 出願WO 88/00052 及び米国特許第4,954,617号に解説されている。これらの抗体は FcγRI、FcγRII 又はFcγRIII のエピトープに、当該受容体のFcγ結合部位とは異なる部位で結合するため、これらの結合は、生理的レベルのIgGでは実質的に遮断を受けない。本発明で有用な特異的抗FcγRI 抗体はMAb 22、MAb 32、MAb 44、MAb 62 及びMAb 197である。MAb 32を産生するハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからATCC登録番号HB9469で入手できる。抗FcγRI MAb 22、MAb 22のF(ab'）2フラグメントは、メダレックス社（ニュージャージー州アナンデール）から入手できる。他の実施態様では、抗Fcγ受容体抗体は、ヒト化型のモノクローナル抗体22(H22)である。H22抗体の作製及び特徴付けはGraziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 及び PCT/US93/10384に解説されている。H22抗体産生細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９２年１１月４日に指定番号HA022CL1で寄託され、登録番号CRL 11177を受けている。
さらに別の好適な実施態様では、Fc受容体に対する結合特異性部分を、その結合が好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（IgA）の遮断を受けない、Fc-アルファ受容体（FcαRI（CD89））などのヒトIgA受容体に結合する抗体に提供させる。用語「IgA受容体」には、１９番染色体上にある一個のα遺伝子（FcαRI）の遺伝子産物が包含されるものと、意図されている。この遺伝子は、55乃至110kDaの選択的にスプライシングされる膜貫通型アイソフォームをいくつかコードしていることが知られている。FcαRI（CD89）は、単球／マクロファージ、好酸性及び好中性顆粒球上で構成的に発現するが、非エフェクタ細胞集団上では発現しない。FcαRIはIgA1及びIgA2の両方に対して中間の親和性（≫5×107M-1）を有するが、この親和性は、G-CSF 又はGM-CSFなどのサイトカインに暴露すると上昇する (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。FcαRIに、IgAリガンド結合ドメイン以外で結合する、A3、A59、A62及びA77と同定された４種類のFcαRI特異的モノクローナル抗体が解説されている。(Monteiro, R.C. et al., 1992, J. Immunol. 148:1764)。
FcαRI及びFcγRIは、（１）単球、PMN、マクロファージ及び樹状細胞などの免疫エフェクタ細胞上に主に発現する；（２）高レベル（例えば１個の細胞当たり5,000乃至100,000）で発現する；（３）細胞傷害活性（ADCC、貪食等）の媒介物質である；（４）自己抗原を含め、それらが狙う抗原の抗原提示促進を媒介する、点で、本発明での使用に好適なトリガー受容体である。
他の実施態様では、本発明の二重特異的及び多重特異的分子はさらに、CD30などの標的細胞抗原に、結合するなど認識する結合特異性部分を含む。ある好適な実施態様では、前記結合特異性部分を、本発明のヒトモノクローナル抗体に提供させる。
ここで用いる「エフェクタ細胞特異抗体」とは、エフェクタ細胞のFc受容体に結合する抗体又は機能的抗体フラグメントを言う。本発明で用いるのに好適な抗体は、エフェクタ細胞のFc受容体に、内因性免疫グロブリンが結合しない部位で結合するものである。
ここで用いる用語「エフェクタ細胞」とは、免疫応答の認識及び活性化段階でなく、免疫応答のエフェクタ段階に関与する免疫細胞を言う。免疫細胞の例には、骨髄又はリンパ系由来の細胞、例えばリンパ球（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（CTL）を含むＢ細胞及びＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多核白血球、顆粒球、マスト細胞、及び好塩基球、がある。いくつかのエフェクタ細胞は特異的Fc受容体を発現し、特異的免疫機能を果たす。好適な実施態様では、エフェクタ細胞は、ADCCを誘導できる好中球など、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ADCC）を誘導することができる。例えば、FcRを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的致死及び他の免疫系構成成分への抗原提示か、又は、抗原提示細胞への結合に関与している。他の実施態様では、エフェクタ細胞は、標的抗原、標的細胞、又は微生物を貪食することができる。エフェクタ細胞上の特定のFcRの発現は、サイトカインなどの体液性因子により調節することができる。例えば、FcγRIの発現がインターフェロンガンマ（IFN-γ）により上方調節されることが判明している。この発現亢進により、FcγRI担持細胞の標的に対する細胞傷害活性が増す。エフェクタ細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食又は溶解することができる。
「標的細胞」は、本発明の組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、二重特異的もしくは多重特異的分子）の標的とすることができる、対象（例えばヒト又は動物）内の何らかの望ましくない細胞を意味することとする。好適な実施態様では、本標的細胞は、CD30を発現又は過剰発現している細胞である。CD30を発現する細胞には、典型的に、腫瘍細胞、例えば膀胱、乳房、結腸、腎臓、卵巣、前立腺、腎細胞、扁平細胞、肺（非小細胞）、並びに頭部及び頸部の腫瘍細胞、がある。他の標的細胞には滑膜線維芽細胞がある。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異的もしくは多重特異的分子に利用できる他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。
キメラマウス−ヒトモノクローナル抗体（即ちキメラ抗体）は、当業で公知の組換えDNA技術により作製できる。例えば、マウス（又は他の種の）モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化して、このマウスFcをコードする領域を取り除き、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の同等の部分に置換する（Robinson et al., 国際特許公報 PCT/US86/02269; Akira, et al., ヨーロッパ特許出願 184,187; Taniguchi, M., ヨーロッパ特許出願 171,496; Morrison et al., ヨーロッパ特許出願 173,494; Neuberger et al., 国際出願 WO 86/01533; Cabilly et al. 米国特許第4,816,567号；Cabilly et al., ヨーロッパ特許出願125,023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; 及びShaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559を参照されたい）。
さらに本キメラ抗体は、抗原結合に直接は関与していないFv可変領域の配列を、ヒトFv可変領域由来の同等の配列に置換することによって、ヒト化することができる。ヒト化キメラ抗体の概略的レビューはMorrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207 及びOi et al., 1986, BioTechniques 4:214に提供されている。これらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも一方から、免疫グロブリンFv可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を単離、操作、及び発現させるステップを含む。このような核酸の源は当業者に公知であり、例えば、抗GPIIbIIIa抗体産生ハイブリドーマである7E3から得てもよい。こうして、キメラ抗体又はそのフラグメントをコードする組換えDNAを適した発現ベクタ内にクローニングすることができる。適したヒト化抗体は、代替的には、CDR置換法米国特許第5,225,539号；Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; 及びBeidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060によっても作製できる。
特定のヒト抗体のCDRの全部を、非ヒトCDRの少なくとも一部分に置換してもよいが、又は、CDRのうちのごく一部を、非ヒトCDRに置換してもよい。ヒト化抗体をFc受容体に結合させるのに必要な数のCDRを置換するだけでよい。
抗体は、ヒト抗体のCDRの少なくとも一部分を非ヒト抗体由来のCDRと置換できれば、いかなる方法によっても、ヒト化することができる。Winter氏は、本発明のヒト化抗体の調製に使用してもよい方法を解説している（その内容を引用をもってここに援用することを明示しておく、１９８７年３月２６日提出の英国特許出願GB 2188638A）。ヒトCDRは、国際出願WO 94/10332 の標題 Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytesに解説された通りにオリゴヌクレオチド部位指定変異誘発法を用いて非ヒトCDRに置換してもよい。
さらに、特定のアミノ酸を置換、欠失又は追加してあるキメラ抗体及びヒト化抗体も、本発明の範囲内にある。特に、好適なヒト化抗体は、例えば抗原への結合を向上させるためなど、フレームワーク領域にアミノ酸置換を有するものである。例えばマウスCDRを有するヒト化抗体においては、ヒトフレームワーク領域に位置するアミノ酸を、マウス抗体の相当する位置にあるアミノ酸と置換することができる。このような置換は、場合によっては抗原に対するヒト化抗体の結合を高めることが知られている。アミノ酸を追加、欠失、又は置換してある抗体をここでは改変された抗体又は変更された抗体と呼ぶ。
改変された抗体という用語には、さらに、抗体の数部分を欠失、追加、又は置換するなどにより改変されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体などの抗体が包含されるものと、意図されている。例えば抗体は、定常領域を欠失させ、それを抗体の血清半減期などの半減期、安定性又は親和性を増すはずの定常領域に置換することにより、改変することができる。いかなる改変も、当該の二重特異的及び多重特異的分子が、FcγRに対して特異的な抗原結合領域を少なくとも１つ有し、少なくとも１つのエフェクタ機能を惹起するのであれば、本発明の範囲内にある。
本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、化学的技術、（例えばD. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807)、「ポリオーマ」技術（Readingの米国特許第4,474,893号を参照されたい）、又は組換えDNA技術を用いて作製できる。
具体的には、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、当業で公知の、ここに紹介された実施例で解説する方法を用いて、例えば抗FcR及び抗CD30結合特異性部分など、構成部分の結合特異性部分を結合させることにより、調製することができる。例えば本二重特異的及び多重特異的分子の各結合特異性部分を別々に作製しておき、後で相互に結合することができる。これら結合特異性部分がタンパク質又はペプチドである場合、多種の結合又は架橋剤を共有結合に用いることができる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、及びスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-1-カルボキシレート (スルホ-SMCC) (例えばKarpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい)がある。他の方法にはPaulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83)、及びGlennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)が解説したものがある。好適な結合剤は 両者ともピアース・ケミカル社（イリノイ州ロックフォード）から入手できるSATA 及びスルホ-SMCCである。
結合特異性部分が抗体（例えば二種のヒト化抗体）である場合、これらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合させることができる。ある特に好適な実施態様では、前記ヒンジ領域を修飾して、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１つ、を結合前に含有させる。
代替的には、両方の結合特異性部分を同じベクタにコードさせ、同じホスト細胞内で発現及び集合させることができる。この方法は、当該二重特異的及び多重特異的分子がMAb×MAb、MAb×Fab、Fab×F(ab')2又はリガンド×Fab融合タンパク質である場合に特に有用である。例えば二重特異的分子など、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、例えば一本鎖二重特異抗体、１つの一本鎖抗体及び結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子、又は２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子など、一本鎖分子であってもよい。さらに二重特異的及び多重特異的分子は一本鎖分子であってもよく、あるいは少なくとも２つの一本鎖分子を含んで成るものでもよい。二重及び多重特異的分子を調製する方法は、例えば米国特許第5,260,203号；米国特許第5,455,030号；米国特許第4,881,175号；米国特許第5,132,405号；米国特許第5,091,513号；米国特許第5,476,786号；米国特許第5,013,653号；米国特許第5,258,498号；及び米国特許第5,482,858号に解説されている。
二重特異的及び多重特異的分子の、それらの特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ (RIA)、FACS分析、バイオアッセイ（例えば成長阻害）、又はウェスタン・ブロット検定法などにより、確認することができる。これらの検定法はそれぞれ、大まかに言って、目的のタンパク質−抗体複合体の存在を、この複合体に特異的な標識済みの試薬（例えば抗体）を利用して検出するものである。例えばFcR-抗体複合体は、この抗体-FcR複合体を認識して特異的に結合する、例えば酵素に結合させた抗体又は抗体フラグメントなどを用いて、検出することができる。代替的には、当該の複合体を、多種の他の免疫検定法のいずれかを用いて検出することもできる。例えば抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ (RIA)で用いることができる (例えば引用をもってここに援用するWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい）。放射性同位元素は、γカウンター又はシンチレーション」・カウンター、あるいはオートラジオグラフィの使用などの手段により、検出できる。
ＩＶ． 免疫結合体
別の局面では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）又は放射性同位元素などの治療部分に結合させたヒト抗CD30モノクローナル抗体又はそのフラグメントを特徴とする。このような結合体はここでは「免疫結合体」と呼ばれる。１種以上の細胞毒を含有する免疫結合体は「イムノトキシン」と呼ばれる。細胞毒又は細胞傷害性薬剤には、細胞にとって有害な（例えば致死させる）あらゆる物質が含まれる。例にはタキソール、シトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン並びにこれらの類似体又は同族体、がある。
本発明の免疫結合体を形成するために適した治療的薬剤には、限定はしないが、抗代謝産物（例えばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU) 及びロムスチン (CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、及びcis-ジクロロジアミンプラチナム(II) (DDP) シスプラチン)、アントラサイクリン (例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（AMC))、並びに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）、がある。ある好適な実施態様では、当該治療的薬剤は細胞傷害性薬剤又は放射性毒性の薬剤である。別の実施態様では、当該治療的薬剤は免疫抑制剤である。さらに別の実施態様では、当該治療的薬剤はGM-CSFである。ある好適な実施態様では、当該治療的薬剤はドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドヒドロキシウレア又はリシンＡである。
本発明の抗体を、放射性ヨウ素などの放射性毒素に結合させて、癌などのCD30関連疾患を治療するための細胞傷害性放射性医薬品を作製することもできる。本発明の抗体結合体を用いて所定の生物学的応答を修飾することができるが、当該の薬物成分を、古典的な化学療法薬に限定されるものと、捉えられてはならない。例えば当該の薬物成分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス・エキソトキシン、又はジフテリア毒素などの酵素活性のある毒素又はその活性フラグメント；腫瘍壊死因子又はインターフェロン-γなどのタンパク質；又は、例えばリンホカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、又は他の成長因子などの生物学的応答修飾物質、が含まれよう。
このような治療的部分を抗体に結合させる技術は公知であり、例えばMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)のArnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"； Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)のHellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery"；Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985) のThorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review"；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、の"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"及びThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照されたい。
Ｖ． 医薬組成物
別の局面では、本発明は、薬学的に許容可能な担体と一緒に調合された、本発明のヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を１つ又は組み合わせで含有する、医薬組成物などの組成物を提供するものである。ある好適な実施態様では、本組成物は、複数（例えば二種以上）の単離された本発明のヒト抗体又はその抗原結合部分の組合せを含有する。好ましくは、本組成物の抗体又はその抗原結合部分の各々が、CD30の別個の、予め選択されたエピトープに結合するとよい。
さらに本発明の医薬組成物を併用療法で投与することもでき、即ち他の薬剤と組み合わせることができる。例えば、当該の併用療法に、少なくとも１つの抗炎症剤又は少なくとも１つの免疫抑制剤と一緒に、本発明の組成物を含めることができる。このような治療的薬剤には、とりわけ、ステロイド系及び非ステロイド系の抗炎症剤（NSAIDS)、例えばアスピリン及び他のサリチル酸塩、例えばイブプロフェン(モトリン、アドビル）、ナプロキセン（ナプロシン）、スリンダック（クリノリル）、ジクロフェナック（ヴォルタレン）、ピロキシカム（フェルデン）、ケトプロフェン（オルディス）、ジフルニサル（ドロビド）、ナブメトン（レラフェン）、エトドラック（ロジン）、オキサプロジン（デイプロ）、インドメタシン（インドシン）、及び高用量のアスピリン、がある。
ここで用いる「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性あるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、当該の担体が静脈内、筋肉内、皮下、腸管外、脊髄もしくは表皮投与（例えば注射又は輸注により）に適しているとよい。投与経路によっては、活性化合物、即ち抗体、二重特異的及び多重特異的分子を、当該化合物を不活化しかねない酸及び他の天然条件の作用から当該化合物を保護する物質で被覆してもよい。
「薬学的に許容可能な塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持しつつも、望ましくない毒性作用を与えないような塩を言う（例えばBerge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照されたい）。このような塩の例には、酸添加塩及び塩基添加塩がある。酸添加塩には、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン等から誘導されたものや、非毒性の有機酸、例えば脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族の酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸等から誘導されたものがある。塩基添加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属から誘導されたものや、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の非毒性の有機アミンから誘導されたものがある。
本発明の組成物は、当業で公知の多種の方法で投与することができる。当業者であれば理解されるように、投与の経路及び／又は形態は、所望の結果に応じて様々であろう。当該活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロ封入送達系を含む制御放出製剤など、急速な放出から当該化合物を保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生分解性で生体適合性あるポリマを用いることができる。このような製剤の調製法が数多く、特許付与されており、当業者に広く公知である。 例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
特定の投与経路で本発明の化合物を投与するには、当該化合物の失活を防ぐ物質でそれを被覆するか、又は当該化合物と同時投与することが必要な場合がある。例えば本化合物を、適したリポソームなどの担体又は希釈剤に入れて対象に投与してもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には生理食塩水及び水性の緩衝液がある。リポソームには水中油中水CGFエマルジョンや、従来のリポソームがある(Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27)。
薬学的に許容可能な担体には無菌の水溶液又は分散液並びに、無菌の注射液又は分散液の即時調製用の無菌粉末がある。このような媒質及び薬剤の、薬学的に活性な物質のための使用は当業で公知である。従来の媒質又は薬剤が当該活性化合物にとって不適合でない限り、本発明の医薬組成物中へのその使用は考察されたところである。補助的な活性化合物も、本組成物中に組み込むことができる。
治療用の組成物は典型的に無菌でなければならず、また製造及び保管条件下で安定でなければならない。本組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、マイクロ乳液、リポソーム、又は他の秩序ある構造として調合することができる。当該の担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物などを含有する溶媒又は分散媒であってよい。適した流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持できる。多くの場合、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸塩及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることにより、可能である。
無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を適した溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１つ又は組み合わせと一緒に 加えた後、滅菌マイクロ濾過を行うことにより、調製できる。分散液は一般的には、塩基性の分散媒と、上に列挙したものの中で必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に当該活性化合物を加えることで、調製されている。無菌の注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）であり、その結果、活性成分及び付加的な所望の成分の粉末が、予め殺菌濾過されたその溶液から生じる。
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療的応答）が得られるように調節される。例えば単一の巨丸剤を投与してもよく、複数に分割された用量を一定期間にわたって投与しても、又は、治療状況の緊急度を指標として用量を比率的に増減させてもよい。投与の容易さ及び投薬量の均一性のためには、非経口用組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療しようとする対象にとって単位型の投薬量として調整された物理的に別個の単位を言う。各単位は、必要な薬品用担体との関連から所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の詳細は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、及び、達成しようとする特定の治療効果、及び（ｂ）このような活性化合物を、個体の感受性の治療に向けて配合する技術に内在する限界、によって決定され、またこれらに直接依存する。
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には：（１）水溶性の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロール、等；及び（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等がある。
治療用組成物の場合、本発明の調合物には、経口、鼻孔、局所（口腔内及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口投与に適したものが含まれる。当該調合物を適宜、単位剤形で提供してもよく、製薬業で公知の何らかの方法で調製してもよい。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療しようとする対象、及び特定の投与形態に応じて様々であろう。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物量となるであろう。概して、100パーセントのうちで、この量は約0.01パーセント乃至約99パーセントの活性成分、好ましくは約0.1パーセント乃至約70パーセント、最も好ましくは約1パーセント乃至約30パーセントの範囲であろう。
経膣投与に適した本発明の調合物には、さらに、当業で適していることが公知の担体を含有するペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー調合物がある。本発明の組成物の局所もしくは経皮投与用の剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤、がある。当該の活性化合物は、薬学的に許容可能な担体や、必要に応じて何らかの保存剤、緩衝剤、又は推進剤と無菌条件下で混合してよい。
ここで用いる文言「非経口投与」及び「非経口的に投与する」とは、通常は注射による、腸管内及び局所投与以外の投与形態を意味し、その中には、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び輸注、がある。
本発明の医薬組成物中に用いてもよい適した水性及び非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、がある。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料を用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持できる。
これらの組成物には、保存剤、湿潤剤、乳濁剤及び分散剤などのアジュバントを含有させてもよい。微生物の存在を防ぐには、上述の滅菌法と、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の多種の抗菌剤及び抗カビ剤の含有の両方を行うと、確実になるであろう。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることも好ましい場合がある。加えて、注射用の薬形の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を含めることにより、可能であろう。
本発明の化合物を製薬としてヒト及び動物に投与する場合、これらを単独で与えることもできるが、又は、例えば0.01%乃至99.5%（より好ましくは0.1%乃至90%）の活性成分を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する医薬組成物としても、与えることができる。
選択した投与経路に関係なく、適した水和型で用いてもよい本発明の化合物、及び／又は、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の常法により、薬学的に許容可能な剤形に調合される。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与形態にとって、患者に毒性となることなく所望の治療応答を得るために有効量の活性成分が得られるよう、変更してもよい。選択される投薬量レベルは、用いる本発明の特定の組成物又は、そのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与期間、用いる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いる特定の組成物と併用する他の薬物、化合物及び／又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の医療歴等、医業で公知の因子を含め、多種の薬物動態学的因子に依拠することとなろう。
当業において通常の技術を有する医師又は獣医であれば、本医薬組成物の必要な有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、この医師又は獣医は、当該医薬組成物中に用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るのに必要なそれより少ないレベルで開始し、この投薬量を所望の効果が得られるまで次第に増加させていってもよい。一般的には、本発明の組成物の適した一日当たりの用量は、治療効果を生むために有効な最も少ない用量である化合物量であろう。このような有効量は一般に、上で解説した因子に依拠するであろう。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下によることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与するとよい。必要に応じ、治療用組成物の有効な一日分の用量を、２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上の小分けした用量に分けて別々に、全日にわたって適当な間隔を置きながら、選択的には単位剤形で投与してもよい。本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、本化合物を医薬調合物（組成物）として投与することが好ましい。
治療用組成物は当業で公知の医療器具を用いて投与できる。例えばある好適な実施態様では、本発明の治療用組成物を、例えば米国特許第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号；又は第4,596,556号に開示された器具などの無針皮下注射器具で投与することができる。本発明で有用な公知のインプラント及びモジュールの例には、制御された速度で薬品を分配するインプラント可能なマイクロ輸注ポンプを開示する米国特許第4,487,603号；薬品を皮膚を透過させて投与する治療器具を開示する米国特許第4,486,194号；精確な輸注速度で医薬を送達する医療用輸注ポンプを開示する米国特許第4,447,233号；継続的な薬物送達のための可変流量式のインプラント可能な輸注装置を開示する米国特許第4,447,224号；多チャンバ・コンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,439,196号；及び浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,475,196号、がある。これらの特許を引用をもってここに援用することとする。数多くの他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールが当業者に公知である。
いくつかの実施態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を、in vivoで確実に適正に分布するように調合することができる。例えば血液脳関門（ＢＢＢ）は数多くの親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを確実に透過するようにする（望ましい場合）には、これらを例えばリポソーム中に調合することができる。リポソームの製造方法については、例えば米国特許第4,522,811号; 第5,374,548号；及び第5,399,331号を参照されたい。前記リポソームは、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送されて目的の薬物送達を高めるような１つ以上の成分を含んでいてもよい (例えばV.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685)。標的決定成分の例には、葉酸又はビオチン（例えばLow et al.の米国特許第5,416,016号を参照されたい)；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；その様々な種が本発明の調合物や、本発明の分子の構成成分を成していてもよいサーファクタントプロテインＡ受容体 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090);があり、さらにK. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273を参照されたい。本発明の一実施態様では、本発明の治療用化合物をリポソーム中に調合する。より好適な実施態様では、当該リポソームが標的決定成分を含む。最も好適な実施態様では、当該リポソーム中の治療用化合物を、炎症又は感染部位など、あるいは腫瘍部位など、所望の区域に近位の部位への大量注射により送達する。当該組成物は、注射筒での注入が容易な程度に流動性でなくてはならない。それは、製造及び保管条件下で安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から守られていなくてはならない。
「治療上有効量」とは、好ましくは、細胞成長又は腫瘍成長を、未処置の対象に比較して少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、そしてさらにより好ましくは少なくとも約80%、阻害するものである。化合物の癌阻害能は、ヒト腫瘍での効験を予測する動物モデル系で評価できる。代替的には、ある組成物のこのような性質は、当該化合物の阻害能を調べることで評価でき、このようなin vitroでの阻害を、当業者に公知の検定法で評価できる。治療上有効量の治療用化合物であれば、対象において腫瘍の大きさを減じたり、又は症状を軽減することができる。当業者であれば、このような量を、対象の体格、対象の症状の重篤度、及び選択された特定の組成物又は投与経路などの因子に基づいて決定できよう。
本組成物は、無菌、かつ、本組成物を注射筒で送達可能な程度に流動性でなくてはならない。当該の担体は、水に加え、等張の緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物であってよい。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を利用するなどにより、維持できる。多くの場合、糖類、マンニトール又はソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンなど、吸収を遅らせる物質を組成物中に含めると、可能である。
活性化合物を上述のように適切に保護すれば、当該化合物を、例えば不活性の希釈剤又は同化可能な食用担体と一緒に経口投与してもよい。
ＶＩ．発明の用途及び方法
本発明のヒト抗体、抗体組成物及び方法は、CD30媒介性異常の診断及び治療に関係するin vitro 及びin vivo で診断上及び治療上の実用性を多数、有する。例えばこれらの分子を、多種の異常を治療、予防又は診断するために、in vitro 又はex vivoなどの培養中の細胞や、又は、in vivoなどでヒト対象中に投与することができる。ここで用いる用語「対象」には、ヒト及び非ヒト動物が包含されるものと、意図されている。好適な対象には、CD30の活性が媒介する異常を有するヒトの患者が含まれる。
例えば、本発明のヒト抗体、抗体組成物及び方法を用いて、例えばホジキン病、未分化型大細胞リンパ腫 (ALCL)、成人Ｔ細胞 リンパ腫。(ATL)、血管免疫芽球性リンパ節症 (AILD)様Ｔ細胞リンパ腫、HIV随伴性の体腔を基にしたリンパ腫、胎児性癌、鼻咽頭の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍)、カストルマン病、カポジ肉腫及び他のＴ細胞もしくはＢ細胞リンパ腫、を含め、CD30発現腫瘍細胞の存在を特徴とする異常など、腫瘍形成性異常のある対象を治療することができる。本発明のヒト抗体、抗体組成物及び方法は、さらに、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメンズ（原語：Omen's）症候群、慢性腎不全、急性感染性単核細胞症、HIV及び疱疹ウィルス随伴疾患などを含む、自己免疫疾患などの他の異常のある対象を治療するためにも用いることができる。
ある実施態様では、本発明の抗体（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに組成物）を用いて、CD30のレベル、又は、膜表面上にCD30を含有する細胞のレベルを検出することができ、その後このレベルを特定の疾患症状に結び付けることができる。代替的には、本抗体を用いて、CD30機能を阻害又は遮断することができ、ひいてはこの機能を特定の疾患の症状の防止又は改善に結び付けて、CD30を当該疾患の媒介物質として関連づけることができる。これは、抗体とCD30との間の複合体形成が可能な条件下で、試料及びコントロール試料を、抗CD30抗体に接触させることにより、行うことができる。試料及びコントロール試料中で抗体及びCD30間で形成された複合体を検出し、比較する。
別の実施態様では、本発明の抗体（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに組成物）は、まず、治療又は診断上の用途に関連する結合活性について、in vitroでテストすることができる。例えば本発明の組成物を、以下の実施例で解説するELISA及びフロー・サイトメトリ検定法を用いてテストできる。さらに、CD30発現細胞の成長阻害及び／又は致死を含め、少なくとも一種のエフェクタ媒介性エフェクタ細胞活性を惹起する上でのこれらの分子の活性を検定することもできる。エフェクタ細胞媒介性のADCC又は貪食を検定するためのプロトコルを、以下の実施例で解説する。
本発明の抗体（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに組成物）は、CD30関連疾患の治療及び診断において更なる実用性を有する。例えば本ヒトモノクローナル抗体、多重特異的もしくは二重特異的分子及び免疫結合体を用いて、以下の生物学的活性：CD30発現細胞の成長を阻害、及び／又は、致死させる；ヒトエフェクタ細胞の存在下でCD30発現細胞の貪食又はADCCを媒介する；可溶性CD30の放出を阻害する、CD30リガンドのCD30への結合を遮断する、IL-4の発現を阻害する又はTh2表現型の発現を、低用量などで、媒介する、のうちの１つ以上をin vivo又はin vitroで惹起することができる。
別の実施態様では、本発明の抗体（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに組成物）は、細胞の補体媒介性溶解を誘導することができないため、座瘡など、補体活性化性の炎症を惹起する副作用が少ない。座瘡の主な原因は皮脂を生ずる濾胞内の角質化パターンの変化である。ケラチノサイトはCD30を発現するため、皮膚内でのCD30シグナル伝達プロセスに干渉すると、濾胞内でケラチノサイトの成長及び分化が変化して、座瘡が形成されることがある。直接的な免疫蛍光実験で、初期の非炎症性及び炎症性座瘡病変では、古典的及び代替的な補体経路の活性化が起きていることが示されている。
ある具体的な実施態様では、本抗体（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに組成物）をin vivoで用いて、多種のCD30関連疾患を治療、予防又は診断する。CD30関連疾患の例には、とりわけ、癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、未分化型大細胞リンパ腫 (ALCL)、成人Ｔ細胞 リンパ腫。(ATL)、血管免疫芽球性リンパ節症 (AILD)様Ｔ細胞リンパ腫、HIV随伴性の体腔を基にした リンパ腫、胎児性癌、鼻咽頭の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍)、カストルマン病、カポジ肉腫及び他のＴ細胞もしくはＢ細胞リンパ腫、がある。他のCD30媒介疾患には、とりわけ、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメンズ（原語：Omen's）症候群、慢性腎不全、急性感染性単核細胞症、HIV及び疱疹ウィルス随伴疾患、がある。
ある具体的な実施態様では、本発明の抗体（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに組成物）は、ホジキン病及び他の腫瘍形成性疾患の進行においてCD30が果たす役割を制限するため、本抗体を用いてHDを治療又は予防する。ホジキン病はリンパ腫の１種である。リンパ腫は、身体の免疫系の一部であるリンパ系で発生する癌である。リンパ組織は身体の多くの部分に存在するため、HDは身体のほとんどすべての部分で発症し得る。この癌は、肝臓、骨髄（血球を作る身体の大きな骨内部の海綿組織）、及び脾臓を含め、身体のほとんどすべての器官又は組織に広がり得る。ホジキン及びリード−シュテルンベルグ細胞でのCD30の発現上昇が、HDの診断の違いと相関することが報告されている。従って、 本発明のCD30阻害性抗体は、HDに結び付くようなCD30の作用を防止又は遮断するために用いることができ、従って、この疾患を予防又は治療するために用いることができる。
本発明のヒト抗体（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異的及び二重特異的分子）は、さらに、CD30の他の作用を遮断又は阻害するためにも使用できる。例えば、CD30は、多種の非ホジキンリンパ腫サブタイプでも規則的に発現していることが知られている。従って、本発明の抗体のさらに別の用途には、非ホジキンリンパ腫を含む疾患の予防又は治療が含まれる。これらの疾患には、バーキットリンパ腫, 未分化型大細胞リンパ腫 (ALCL)、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小分割細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病/リンパ腫 (ATLL)、成人Ｔ細胞白血病 (T-ALL)、及びエントロブラスティック（原語：entroblastic）／中心細胞 (cb/cc) 小胞性リンパ腫癌 が含まれる。
別の具体的な実施態様では、本発明のヒト抗体 (例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに組成物）を用いて、CD30のさらに他の作用を遮断又は阻害することができる。例えば、CD30発現細胞の表面から可溶型CD30が規則的に放出されていることも公知である。sCD30レベルが上昇していることが、多種の腫瘍形成性及び自己免疫異常の患者の血清中で報告されている。従って、本発明の抗体のさらに別の用途には、sCD30の放出の遮断又は阻害に関係する疾患の予防又は治療がある。このような疾患には、限定はしないが、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、及びオーメンズ（原語：Omen's）症候群、がある。
本発明の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに免疫結合体）をin vivo又はin vitroで投与する適した経路は、当業で公知であり、当業者であれば選択することができる。例えば、本抗体組成物を注射（静脈内又は皮下など）により投与することができる。用いる分子の適した投薬量は、対象の年齢及び体重や、本抗体組成物の濃度及び／又は処方に応じて様々であろう。
前述したように、本発明のヒト抗CD30抗体を、例えば細胞傷害性薬剤、放射毒性薬剤又は免疫抑制剤など、１種以上の他の治療剤と同時投与することができる。本抗体を前記薬剤と連結させる（免疫複合体として）ことも、又は、前記薬剤とは別に投与することもできる。後者の（別の投与）場合、本抗体を、前記作用薬の前、後又は同時に投与することも、あるいは、例えば放射線など、抗癌治療などの他の公知の治療法と同時投与することもできる。このような治療剤には、とりわけ、例えば患者にとってそれら自体は、毒性又は亜毒性であるようなレベルのときにのみ効果的なドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミドヒドロキシウレアなどの抗新生物薬、がある。シスプラチンは４週毎に１回、100mg/m2の用量を静脈内投与し、アドリアマイシンは２１日毎に１回、60-75mg/m2の用量を静脈内投与する。本発明のヒト抗CD30抗体又はその抗原結合フラグメントの化学療法薬との同時投与により、ヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害性作用を生じる異なる機序で働く２つの抗癌剤が提供される。このような同時投与により、薬物耐性の発生という問題や、腫瘍細胞の抗原性に変化が生じて当該抗体に非反応性になることを原因とした問題を解決することができる。
例えば本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子）に連結させたエフェクタ細胞など、標的特異的エフェクタ細胞も、治療剤として用いることができる。標的を設定するエフェクタ細胞はヒト白血球、例えばマクロファージ、好中球又は単球であってよい。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞及び他のIgG-もしくはIgA受容体担持細胞、がある。必要に応じ、エフェクタ細胞を、治療しようとする対象から得ることができる。標的特異的エフェクタ細胞は、生理学的に許容可能な溶液に溶かした細胞懸濁液として、投与することができる。投与する細胞数は、108乃至109の程度でよいが、治療の目的に応じて様々であろう。一般的には、前記の量は、CD30を発現する腫瘍細胞などの標的細胞に局在させたり、そして貪食などの細胞致死を引き起こすのに充分なものであろう。投与経路も様々でよい。
標的特異的エフェクタ細胞を用いた治療は、標的細胞の除去のための他の技術と連携して行うことができる。例えば、本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子）、及び／又は、これらの組成物を結合させたエフェクタ細胞を用いた抗腫瘍療法を、化学療法と連携して用いることができる。さらに、併用免疫療法を用いて、２つの異なる細胞傷害性エフェクタ集団を腫瘍細胞拒絶に方向付けてもよい。例えば抗Fc-ガンマRI又は抗CD3に連結させた抗CD30抗体を、IgG-もしくはIgA-受容体特異的結合剤と連携して用いてもよい。
本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、例えば細胞表面上の受容体にキャップをして消去するなどにより、エフェクタ細胞上のFcγR又はFcαRレベルを修飾するためにも用いることができる。さらに抗Fc受容体の混合物をこの目的に使用することもできる。
例えばIgG1、-2、又は-3もしくはIgM由来の部分など、補体に結合する補体結合部位を有する本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに免疫結合体）は、補体の存在下でも用いることができる。ある実施態様では、標的細胞を含む細胞集団をex vivoで本発明の結合剤及び適したエフェクタ細胞で処理した後に、補体又は補体を含有する血清を添加することで補うことができる。本発明の結合剤で被覆してある標的細胞の貪食は、補体たんぱくの結合により亢進できる。別の実施態様では、本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子）で被覆した標的細胞を、補体により溶解させることもできる。さらに別の実施態様では、本発明の組成物は補体を活性化しない。
本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子並びに免疫結合体）を補体と一緒に投与することもできる。従って、ヒト抗体、多重特異的もしくは二重特異的分子及び血清又は補体を含む組成物が、本発明の範囲内にある。これらの組成物は、補体が当該ヒト抗体、多重特異的もしくは二重特異的分子の近くに位置するという点で有利である。代替的には、本発明のヒト抗体、多重特異的もしくは二重特異的分子と、補体又は血清とを、別々に投与することもできる。
さらに、本発明の抗体組成物（例えばヒト抗体及び免疫結合体）及び使用上の指示を含むキットも、本発明の範囲内にある。前記キットには、さらに、１種以上の更なる試薬、例えば免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤又は放射性毒素か、又は、１種以上の更なる本発明のヒト抗体（例えば第一ヒト抗体とは異なる、CD30抗原のエピトープに結合する補完的活性を有するヒト抗体など）を含めることができる。
従って、本発明の抗体組成物で治療した患者に、本ヒト抗体の治療効果を高める又は増強するような、細胞傷害性又は放射毒性薬剤などの別の治療剤を、付加的に投与（本発明のヒト抗体の投与前、投与と同時、又は投与後に）することができる。
他の実施態様では、例えば対象をサイトカインで処理するなどにより、Fcγ又はFcα受容体の発現又は活性を、高める又は阻害するなど修飾する薬剤で、対象を付加的に処理することができる。当該の多重特異的分子による処理中に投与するのに好適なサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、及び腫瘍壊死因子（TNF）、がある。
別の実施態様では、対象をリンホカイン製剤で付加的に処理することができる。リンホカイン製剤を用いると、CD30を高度には発現しない癌細胞にそうするよう、誘導することができる。リンホカイン製剤は、腫瘍細胞間でのCD30の発現をより均一にすることができるため、治療をより効果的にすることができる。投与に適したリンホカイン製剤には、インターフェロン-ガンマ、腫瘍壊死因子、及びこれらの組み合わせ、がある。これらを静脈内投与することができる。リンホカインの適した投薬量は10,000乃至1,000,000単位／患者である。
本発明の組成物（例えばヒト抗体、多重特異的及び二重特異的分子）は、FcγR又はCD30を発現する細胞を、このような細胞を標識するためなど、標的に設定するために用いることができる。このような使用の場合、結合剤を、検出の可能な分子に連結することができる。従って、本発明は、FcγR又はCD30など、Fc受容体を発現する細胞をex vivo又はin vitroで位置確認するための方法を提供する。この検出可能な標識は、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクターなどであってよい。
ある具体的な実施態様では、本発明は、試料中でCD30抗原の存在を検出する、又は、CD30抗原の量を測定する、方法を提供するものである。本方法は、前記試料及びコントロール試料を、CD30に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に、前記抗体又はその一部分とCD30との間の複合体形成が可能な条件下で接触させるステップを含む。その後複合体の形成を検出するが、このとき当該試料をコントロール試料に比較したときに複合体形成に違いがあれば、当該試料中のCD30抗原の存在の指標となる。
他の実施態様では、本発明は、例えばホジキン病、成人Ｔ細胞リンパ腫、感染性単核細胞症、及び全身性エリテマトーデスなど、対象におけるCD30媒介性異常を、上述のヒト抗体を対象に投与することにより治療する方法を提供するものである。このような抗体及びその誘導体は、増殖及び分化などの特定の異常に関連する、CD30により誘導される活性を阻害するために用いられる。本発明の抗体で阻害できる他のCD30により誘導される活性には、分泌型CD30の産生増加、IL-4の発現増加、及びTh2表現型の産生増加、がある。本抗体をCD30に接触させることにより（例えば本抗体を対象に投与することにより）、CD30のこのような活性の誘導能が阻害され、従って関連する異常が治療される。好適な抗体は、CD30に特異的なエピトープに結合し、従ってCD30により誘導される活性は有利に阻害するが、NGFR、CD27 及びCD40などの構造上関連する表面抗原の活性には干渉しないようなものである。
従って、別の実施態様では、本発明は、例えばホジキン病、非ホジキン・リンパ腫、未分化型大細胞リンパ腫 (ALCL)、成人Ｔ細胞リンパ腫、（ATL）、血管免疫芽細胞性リンパ節症（AILD）様Ｔ細胞リンパ腫、HIV関連体腔ベースのリンパ腫、胎児性癌、鼻咽頭の未分化癌 (例えばシュミンケ腫瘍)、カストルマン病, カポジ肉腫及び他のＴ細胞もしくはＢ細胞リンパ腫等、ヒトCD30が媒介する腫瘍形成性異常を治療又は予防する方法を提供するものである。本方法は、該異常を治療又は予防するのに有効量の、本発明の抗体組成物を、対象に投与するステップを含む。本抗体組成物を単独で投与することも、又は、CD30媒介疾患を治療又は予防するために本抗体組成物と協働又は相乗的に作用する細胞傷害性もしくは放射毒性作用薬などの別の治療剤と一緒に投与することもできる。ある特に好適な実施態様では、本発明は、ホジキン病を治療する方法を提供するものである。さらに別の特に好適な実施態様では、本発明は、ALCLを治療する方法を提供するものである。
別の実施態様では、本発明は、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメンズ（原語：Omen's）症候群、慢性腎不全、急性感染性単核細胞症、HIV及び疱疹ウィルス随伴疾患など、ヒトCD30が媒介する自己免疫異常を治療又は予防する方法を提供する。本方法は、本発明の抗体組成物を、該異常を治療又は予防するのに有効量、対象に投与するステップを含む。本抗体組成物を、単独で投与することも、又は、CD30媒介疾患を治療又は予防するために本抗体組成物と協働又は相乗的に作用する免疫抑制剤などの別の治療剤と一緒に投与することもできる。
さらに別の実施態様では、本発明は、in vivo又はin vitroでFc発現細胞の存在を検出又は量を定量する方法を提供する。本方法は、（ｉ）本発明の組成物（例えば多重もしくは二重特異的分子）又はその一フラグメントを、検出可能なマーカに結合させて、対象に投与するステップと；（ｉｉ）前記検出可能なマーカを検出する手段に対象を暴露して、Fc発現細胞を含有する区域を特定するステップとを含む。
さらに別の実施態様では、本発明の免疫結合体を用い、化合物（例えば治療剤）、標識、細胞毒、放射性毒素、免疫抑制剤等)を本抗体に連結することにより、CD30を表面に結合させて（例えば膜に結合させて、又は、CD30受容体に結合させて）有する細胞に、このような化合物を標的設定することができる。このように、本発明は、例えばホジキン細胞又はリード−シュテルンベルグ細胞などのCD30及びCD30受容体発現細胞を（例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクタなどの検出可能な標識で）ex vivo又はin vitroで位置確認する方法も提供する。代替的には、本免疫結合体を用い、細胞毒又は放射性毒素をCD30に標的設定することにより、表面にCD30を結合させて（例えば膜に結合させて、又は、CD30受容体に結合させて）有する細胞を致死させることができる。
さらに本発明を、以下の実施例により描出するが、以下の実施例をさらに限定的なものと捉えてはならない。
実施例１ CD30特異的ヒトモノクローナル抗体（HuMab）の作製
Ｉ．CD30に対する完全ヒトモノクローナル抗体産生用のトランスジェニック（Cmu標的化）マウスの作製
CMDターゲティング・ベクタの構築
プラスミドpICEmuは、mu遺伝子に延びる、Balb/Cゲノム・ラムダ・ファージディスプレイから得られたマウスIg重鎖遺伝子座のEcoRI/XhoI断片を含有する(Marcu et al. Cell 22: 187, 1980)。このゲノム断片をプラスミドpICEMI9HのXhoI/EcoRI部位にサブクローニングした (Marsh et al; Gene 32, 481-485, 1984)。pICEmuに含まれたこれら重鎖配列は、muイントロン・エンハンサのちょうど3'側に位置するEcoRI部位の下流から、mu遺伝子の最後の膜貫通エキソンのほぼ1kb下流に位置するXhoI部位まで延びる。しかし、このmuスイッチ反復領域の大半は、E. coliを継代させて欠失させてある。
ターゲティング・ベクタは以下の通りに構築された。1.3 kbのHindIII/SmaI 断片をpICEmuから切り出し、HindIII/SmaIで消化したpBluescript（カリフォルニア州ラホーヤ、ストラタジーン社）内にサブクローニングした。このpICEmu断片は、Cmu1のほぼ1 kb 5'側に位置するHindIII部位からCmu1内にあるSmaI部位まで延びる。その結果得られたプラスミドをSmaI/SpeIで消化し、pICEmu由来の、Cmu1の3'側のSmaI部位から最後のCmuエキソンのちょうど下流に位置するXbaI部位まで延びる約4 kb のSmaI/XbaI 断片を挿入した。その結果得られたプラスミドpTAR1をSmaI部位で直線化し、neo発現カセットを挿入した。このカセットは、マウスホスホグリセレートキナーゼ（pgk）プロモータ（XbaI/TaqI断片Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74）の転写制御下にあると共に、pgkポリアデニレーション部位(PvuII/HindIII 断片；Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308) を含有するneo遺伝子から成る。このカセットは、プラスミドpKJ1 (Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163に解説がある)から得たが、このプラスミドから前記neoカセットをEcoRI/HindIII断片として切り出し、EcoRI/HindIIIで消化したpGEM-7Zf（＋）内にサブクローンして、pGEM-7 (KJ1)を作製した。このneoカセットを、pGEM-7 (KJ1)からEcoRI/SalI消化により切り出し、平滑末端にしてから、プラスミドpTAR1のSmaI部位にゲノムCmu配列とは反対の方向でサブクローニングした。その結果得られたプラスミドをNot Iで直線化し、単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ(tk)カセットを挿入して、Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352が解説した通りに、相同組換え体を持つESクローンを濃縮できるようにした。このカセットは、Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163が解説したように、マウスpgkプロモータ及びポリアデニレーション部位を両端に持つtk遺伝子のコーディング配列から成る。その結果得られたCMDターゲティング・ベクタは、前記重鎖遺伝子座に合計でほぼ5.3 kb の相同性を含有し、neo発現カセットが一番目のCmuエキソンの非反復SmaI部位に挿入された変異mu遺伝子を生ずるよう、デザインされている。このターゲティング・ベクタを、ES細胞内に電気穿孔注入する前に、プラスミド配列内で切断するPvuIで直線化した。
標的化ES細胞の作製及び分析
AB-1 ES 細胞 (McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085) を有糸分裂不活性期のSNL76/7 細胞支持細胞層（同書）上で、基本的には解説 (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112のRobertson, E. J. (1987))された通りに成長させた。直線化させたCMDターゲティング・ベクタを、電気穿孔法でAB-1細胞に、Hasty et al. (Hasty, P. R. et al. (1991) Nature 350: 243-246)で解説された方法により注入した。注入後の細胞を100 mm 皿に、1-2×106細胞／皿の密度になるようにプレートした。２４時間後、G418 (200マイクログラム／mlの活性成分）及び FIAU (5×10-7M）を培地に加え、薬物耐性クローンを８乃至９日間、展開させた。クローンを摘みだし、トリプシン処理し、２つの部分に分割し、さらに展開させた。その後各クローン由来の細胞の半分を凍結させ、残りの半分を、ベクタと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
DNA解析をサザン・ブロット・ハイブリダイゼーションで行った。DNAはLaird et al. (Laird, P. W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19 : 4293)が解説した通りに前記クローンから単離された。単離されたゲノムDNAをSpeIで消化し、muイントロン・エンハンサとmuスイッチ領域との間の配列にハイブリダイズするプローブA（図１を参照されたい）である915 bp のSacI 断片でプローブした。プローブＡは、野生型遺伝子座の9.9 kbのSpeI断片と、CMDターゲティング・ベクタと相同組換えを起こしたmu遺伝子座の判断材料となる7.6kbのバンドとを検出する（neo発現カセットはSpeI部位を含有する)。サザン・ブロット解析でスクリーニングした1132 個のG418及びFIAU 耐性クローンのうち、3個が、mu遺伝子座での相同組換えを示す7.6 kb のSpeI バンドを示した。これら3個のクローンを酵素BglI、BstXI、及びEcoRI でさらに消化して、当該ベクタがmu遺伝子に相同的に組み込まれたことを確認した。プローブＡとハイブリダイズした場合、BglI、BstXI、又はEcoRI で消化した野生型DNAのサザン・ブロットでは、それぞれ15.7、7.3、及び12.5 kbの断片が生ずるが、標的化したmuアレルの存在は、それぞれ7.7、6.6、及び14.3 kbの断片で示される。SpeI消化により検出された３個の陽性クローンはすべて、neoカセットがCmu1エキソンへ挿入されたことの判断材料となる、予想通りのBglI、BstXI、及びEcoRI制限断片を示した。
変異mu遺伝子を持つマウスの作製
264番、272番及び408番と指定した３つの標的設定されたESクローンを解凍し、C57BL/6J胚盤胞にBradley (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151のBradley, A. (1987) )の解説通りに注入した。注入された胚盤胞を偽妊娠メスの子宮に移して、注入されたES細胞及びホストの胚盤胞を由来とする細胞の混合物であるキメラマウスを作製した。このキメラへのES細胞の寄与度は、黒色のC57BL/6Jバックグラウンド上に見える、ES細胞系由来の野鼠色の皮の量により視覚的に推定できる。クローン272及び408では、ごく低いパーセンテージでキメラが生じた（即ち、野鼠色の着色率が低い）が、クローン264では、高率でオスのキメラが生じた。これらのキメラをC57BL/6Jメスと交配し、ES細胞ゲノムの生殖細胞伝播を示す野鼠色の仔を作った。尾の生検で得たDNAをBgII消化し、サザン・ブロット分析して、標的設定されたmu遺伝子のスクリーニングを行った（ES細胞DNAの分析について上述した通り）。野鼠色の仔のほぼ５０％が、野生型のバンド15.7kbに加え、ハイブリダイズした7.7kbのBgIIバンドを示し、標的設定されたmu遺伝子の生殖細胞伝播が実証された。
mu遺伝子の機能不活性化に関するトランスジェニックマウスの分析
neoカセットをCmu1に挿入したことでIg重鎖遺伝子が不活性化したかどうかを調べるために、クローン264キメラを、JH遺伝子セグメントを欠失させて重鎖発現を不活性化させるJHD変異がホモ接合型となったマウスと交配した(Chen et al, (1993) Immunol. 5: 647-656)。４匹の野鼠色の仔を得た。血清を１月齢のこれら動物から得、ELISAで検定してマウスIgMの存在を調べた。４匹の仔のうち２匹がIgMを完全に欠いていた（表１を参照されたい）。４匹の動物を、尾の生検で得たDNAをBgII消化し、プローブＡ（図１を参照されたい）にハイブリダイズさせ、さらにStuI消化し、475bpのEcoRI/StuI断片（同書）にハイブリダイズさせる、といったサザン・ブロット分析で遺伝子型決定したところ、血清IgMを発現できない当該動物は、重鎖遺伝子座の一方のアレルがJHD変異を持ち、他方のアレルがCmu1変異を持つものであることが実証された。JHD変異がヘテロ接合型となったマウスは野生型のレベルの血清Igを示す。これらのデータは、Cmu1変異はmu遺伝子の発現を不活性化することを実証するものである。
Figure 2005534281
表１は、CMD及びJHD 変異の両方を持つマウス (CMD/JHD)、JHD変異についてヘテロ接合型のマウス (+/JHD)、野生型 (129Sv ×C57BL/6J)F1 マウス(+/+)、及び、JHD変異がホモ接合型のB細胞欠損マウス(JHD/JHD)について、ELISAで検出された血清IgMレベルを示す。
ＩＩ．HCO12トランスジェニックマウスの作製
80 kb のpHC2 のインサート(Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591)及び25 kbのpVx6のインサートを同時注入することで、HCO12重鎖導入遺伝子を作製した。プラスミドpVx6 を以下に解説するように構築した。
生殖細胞ヒトVH1-18 (DP-14)遺伝子を、ほぼ2.5 kb の5' 側フランキング及び5 kb の3'側フランキングゲノム配列と一緒に含む、8.5 kb のHindIII/SalI DNA 断片をプラスミド・ベクタpSP72 (ウィスコンシン州マジソン、プロメガ社）内にサブクローニングして、プラスミドp343.7.16を作製した。生殖細胞ヒトVH5-51 (DP-73)遺伝子を、ほぼ5 kbの5' 側フランキング及び1 kb の3' 側フランキングゲノム配列と一緒に含む、7 kbのBamHI/HindIII DNA断片を、pBR322ベースのプラスミド・クローニング・ベクタpGP1f (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295)内にクローニングして、プラスミドp251fを作製した。pGP1f、pGP1kを由来とする新しいクローニング・ベクタを、EcoRV/BamHIで消化し、生殖細胞ヒトVH3-23 (DP47)遺伝子をほぼ4 kbの5' 側フランキング及び5 kb の3' 側フランキングゲノム配列と一緒に含む、10 kbのEcoRV/BamHI DNA 断片に連結した。その結果得られたプラスミドp112.2RR.7をBamHI/SalI で消化し、p251fの7 kbの精製済みBamHI/SalI インサートに連結した。その結果得られたプラスミドpVx4をXhoIで消化し、p343.7.16の8.5 kbの XhoI/SalI インサートに連結した。
VH1-18遺伝子を他の２つのV遺伝子と同じ方向で持つクローンを得た。このクローンをpVx6と命名した後、NotIで消化し、精製されたその26 kbのインサートを、pHC2の精製済み80kbのNotIインサートと一緒に、1:1のモル比で、Hogan et al. (B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY)が解説したように半日齢(C57BL/6J x DBA/2J)F2 胚の前核に同時注入した。これらの注入を受けた胚から発生したマウスから、V×6及びHC2の両方を由来とする配列を含むトランスジェニックマウスの３つの個別の株を確立した。これらの株を(HCO12)14881、(HCO12)15083、及び(HCO12)15087と指定する。次にこれらの３つの株のそれぞれを、実施例１で解説したCMD変異、JKD 変異 (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820)、及び(KCo5)9272 導入遺伝子(Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851)を含むマウスに交配した。その結果得られるマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖導入遺伝子を、内因性マウス重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座の破壊についてホモ接合型であることをバックグラウンドとして発現する。
ＩＩＩ． CD30に対するHuMabの作製
ヒトCD30に対するヒトモノクローナル抗体を、上に解説したように作製したトランスジェニックマウスで以下の通りに作製した。
抗原： 可溶性CD30を初回の免疫用に完全フロイント（シグマ社F5881）アジュバントと混合した。その後、この抗原を不完全フロイント（シグマ社F5506）と混合した。25マイクログラムのCD30の100μL PBS溶液をこのアジュバントに乳化針を用いて1:1になるように混合した。マウスに0.2ccの作製された抗原を腹腔内注射した。
トランスジェニック・マウス：マウスを濾過器ケージ内に入れ、免疫日、採血日、及び融合日に、良好な健康状態であることを評価した。
免疫法： マウスに、完全フロイント・アジュバントに入れたL540細胞の一回のIP注射と、続いて不完全フロイント・アジュバントに入れた可溶性組換えCD30のIP注射の組合せを１４日毎に行うことにより、免疫した。CD30発現細胞株であるL540に対して抗CD30抗体価を生じた動物に、可溶性組換えCD30を静脈注射してから７２時間後に融合を行った。マウス脾細胞を回収し、精製し、融合させた。ハイブリドーマの作製： P3 X63 ag8.653 マウス骨髄腫細胞株 (ATCC CRL 1580、ロット F-15183)を融合に用いた。最初のATCC バイアルを解凍し、培養で展開させた。凍結したバイアルのシード保存液をこの展開液から調製した。細胞を３乃至６ヶ月間培養に維持し、１週間に２回、継代させた。 P388D1 (ATCC TIB-63 FL)を 200 mLになるまで展開させ、枯渇させた。上清を遠心分離し、濾過して、調整培地として知られる培地添加液として用いた。この細胞株を３乃至６ヶ月間継代させた後、新しいバイアルを解凍した。
5% FBS、及びペニシリン−ストレパティエントマイシン（Cellgro #30004030)を含有する高グルコース DMEM (メディアテック社、Cellgro # 10013245)を用いて、該骨髄腫及びP388D1細胞を培養した。5% FBS、及びペニシリン− ストレパティエントマイシン(Cellgro # 30004030) を含有する高グルコース DMEM (メディアテック社、Cellgro # 10013245)を用いて、該骨髄腫及びP388D1 細胞を培養した。更なる培地添加剤を、 3% オリゲン−ハイブリドーマ・・クローニング・ファクター (アイジェン社、36335)、10% P388D1 調整培地 (8/10/99 DH)、10% FBS (ハイクローン社、SH30071 ロット#AGH6843)、L-グルタミン(ギブコ社 # 1016483) 0.1% ゲンタマイシン（ギブコ社 # 1020070)、2-メルカパチエンタノール（ギブコ社 # 1019091) HAT (シグマ社、H0262) 1.0 x104 M ヒポキサンチン、4.0 x10-7 M アミノパティエンテリン、1.6 x10-5 M チミジン)、又はHT ((シグマ社、H0137) 1.0 x10-4 M ヒポキサンチン、1.6 x10-5 M チミジン)を含むこのハイブリドーマ成長培地に加えた。
可視のコロニが樹立するまで、ハイブリドーマを１週間、成長させた。上清を採集し、ヒトカッパ鎖特異的捕捉法及びヒトFc特異的検出法を用いて、ELISAによるヒトIgGの初回スクリーニングに用いた。次に、IgG陽性の上清をCD30特異性について、L540細胞及びCD30 ELISAを用いてフローサイトメトリで検定した。
特異的HuMab IgGを産生しているハイブリドーマをサブクローニングし、展開させた。次にHuMabをプロテインＡカラム・クロマトグラフィにより、以下の手法を用いて精製した：（１）充填条件：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で平衡させた5mlのプロテインＡカラムに上清を充填した；（２）洗浄：PBS緩衝液；（３）溶出：150 mM NaC1, pH 2.9を加えた0.1 M グリシン。溶出液を1M Tris 緩衝液 (2 ml 画分毎に30μl)で中和させた。溶出した各画分をゲルで泳動させてからプールした。クーマシー・染色で純度を確認してから、画分をプールし、150mM NaC12、 pH 7.2、を加えた10mMのリン酸ナトリウム緩衝液 で透析した。このプロトコルの結果、目的の三種類の抗体17G1-1、5F11 及び2H9が単離された。
HuMab 17G1-1、5F11及び2H9のVH 及び VL 領域を、ハイブリドーマのRNAから単離し、cDNAに逆転写させ、これらV 領域をPCRで増幅し、そのPCR産物を配列決定した。
実施例２ 結合研究
Ｉ． HuMab 5F11の親和定数及び速度定数の判定
材料
（１）IgG型のクローンHuMab 5F11の２つの試料（ニュージャージー州アナンデール、メダレックス社）。
（２）ヒトCD30 抗原 (ニュージャージー州アナンデール、メダレックス社)。
（３）抗ヒトCD30/TNFRSF8 ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号AF229)。
（４） CM5 チップ、結合緩衝液：10mM 酢酸緩衝液、pH 6.0 (CD30結合) 及びpH 3.5 (プロテインＡ結合)、再生緩衝液：10mM HCL。
（５） Biacore 3000、BiaEval ソフトウェア v.3.0.1。
プロテインＡカップリング
プロテインＡ（Fc2、2367 Rus、注射時間１０分間、流速：5μL/分、pH 3.5) をCH5チップに、アミノ結合化学法を用いて結合させた。
結合研究
HuMab 5F11 (1μL/mL) をプロテインＡ表面上で２．５分間、捕捉した。(別の実験で、プロテインＧチップ上には有意な量の抗体は捕捉されなかった）。２つの実験は、様々な濃度範囲のCD30を、捕捉された抗体上に通過させて行われた。実験１の濃度範囲には、：10、6.67、5、3.33、及び1.67μL/mLが含まれた；実験２には：5、4、2、1、及び0.5μL/mLが含まれた。結合相が１０分間続き、その後１０分間の解離相があった。データを1:1のラングミュアの解離モデルに合わせて、以下の表に示すように多種のパラメータを判定した。
Figure 2005534281
捕捉された抗体表面の安定性
HuMab 5F11 (1μL/mL) をプロテインＡ表面上で2.5分間、捕捉した。緩衝液を１．５時間流して、CD30抗原の結合相及び解離相を模倣して、捕捉された抗体表面が安定であるかをチェックした。この実験では、全実験時間にわたって、5F11に対する表面レベルは変わらず（0.1%未満）、安定な表面が示された。従って、5F11試料では、CD30抗原に対する同様な親和定数が示され、捕捉された抗体表面は、更なる結合研究を行うためにも安定だった。
ＩＩ． 組換えCD30に対するHuMabの用量依存的結合
選択されたHuMabの、組換えCD30への結合能を、捕捉ELISAにより、市販のマウス抗CD30抗体BER-H2 (カリフォルニア州カーペンテリア、DAKO社)を用いて以下の通りに調べた。
マイクロタイタ・ウェルをBerH2で被膜した。このウェルを5% BSA 溶液で遮断した後、組換えCD30を発現しているトランスフェクト細胞からの上清を、BER-H2で被膜されたウェルと反応させた。上清を取り除き、プロテインＡで精製されたHuMab 5F11、2H9、17G1、及びアイソタイプ・コントロールを、様々な濃度で、CD30の結合したウェルと一緒に３７℃でインキュベートした。１時間後、ウェルをPBS-Tweenで洗浄し、結合した抗体を、細胞をアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的プローブと一緒に３７℃でインキュベートすることにより、検出した。過剰なプローブをウェルから洗い落とし、プレートをpNPP展開剤で展開させた。405nmでの光学密度を微量定量プレート読み取り機を用いて判定した。
図１に示すように、抗CD30 HuMabは用量依存的結合を示したが、アイソタイプ・コントロールは示さなかった。このことは、抗CD30 HuMabが組換えCD30を特異的に認識したことを示している。抗CD30 HuMab間のCD30への結合の量的差は、5F11、2H9、及び17G1は独特の抗体であることを示している。なぜなら、この結合の量的差はおそらくは、組換え型のCD30の親和性の違い又は認識の違いが原因と考えられるからである。
ＩＩＩ． L540に対するHuMabの用量依存的結合
ホジキン腫瘍細胞上のCD30に対する抗CD30 HuMabの結合能を以下の通りにフローサイトメトリで調べた。
高レベルのCD30を発現するホジキンリンパ腫細胞株であるL540への結合について抗体を調べた。プロテインＡで精製したHuMab 5F11、2H9、17G1、及びアイソタイプ・コントロールを、様々な濃度でL540細胞株と一緒に４℃でインキュベートした。１時間後、これらの細胞をPBSで洗浄し、細胞をFITC標識ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的プローブと一緒に４℃でインキュベートすることで、結合した抗体を検出した。過剰なプローブを細胞からPBSで洗い落とし、細胞関連蛍光度をFACScalibur 装置を用いた分析で判定した。
図２で示すように、HuMab 5F11、2H9、及び17G1は、L540細胞に対し高レベルの結合を示し、1μg/ml未満の濃度で飽和した。これらのデータは、これらの抗体が、生存腫瘍細胞上に発現した天然CD30に効率的及び特異的に結合することを実証している。
ＩＶ． エピトープ・マッピング
CD30はA、B、及びCと指定される少なくとも三種類の血清学的に規定されるクラスタを含有することが示されている。どのクラスタHuMab 5F11が結合するかを判定するために、クラスタ A (Ki 4及びBerH2)、クラスタ B (Ki-1)、又はクラスタC(AC10) のいずれかに特異的なマウス抗体が、FITC標識5F11のL540細胞に対する結合を阻害するその阻害能を調べた。簡単に説明すると、L540細胞を、FITC-5F11と10乃至20倍過剰の未標識抗体とを一緒にして60分間、氷上で同時にインキュベートした。これらの細胞を洗浄し、FACSで分析した。遮断抗体はすべてマウス由来であり、それらの飽和濃度の10倍過剰にして用いられた。5F11 HuMab (1μg/ml)をフルオレセイン−イソチオシアネート(FITC)標識し、CD30への結合を、蛍光発色セルソータ (FACS)フローサイトメータ (ドイツ、ハイデルベルグ、ベクトン・ディッキンソン社、FACScan、)を用いて判定した。0.2% ウシ血清アルブミン及び 0.02% アジ化ナトリウム（染色緩衝剤）を含有する氷温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で一次抗体を希釈し、1x105 個のL540 細胞及び5F11-FITC mAbと一緒に６０分間、氷上でインキュベートした。
図１４に示すように、クラスタＡに結合する抗体は、FITC-5F11のL540 細胞への結合を阻害できたが、他方、クラスタＢ又はＣに結合する抗体はできなかったことから、5F11はクラスタＡエピトープに、又は、クラスタＡエピトープ近傍に結合することが示された。
実施例３ 抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）研究
Ｉ． HuMabによるL540ホジキン腫瘍細胞の単球媒介型抗体依存的細胞傷害性
抗CD30 HuMabsがCD30発現腫瘍細胞の溶解を媒介するその媒介能を、健康なヒトの単球を用いた 51Cr-放出検定を用いて調べた。健康なヒトの単球を、IFN-γとの培養で活性化させて、Fc受容体及び細胞溶解性を上方調節した。L540細胞を、IFN-ガンマ活性化単球による溶解の標的として用いた。正常な成人源ロイコパック（ペンシルバニア州、バイオロジカル・スペシャルティ社）から精製された単球を、10% FBS 及びIFN-γ （1000μ/ml、ミネソタ州ミネアポリス、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を加えたマクロファージ無血清培地（ニューヨーク州グランド・アイランド、ギブコ社、M-SFM）中で２日間、培養した。標的細胞に100μCiの51Crで１−２時間かけて標識してから、エフェクタ細胞（E:T=50:1）及びHuMabにＵ底微量定量プレートで配合した。１６時間、３７℃でインキュベートした後、上清を採集し、放射活性について分析した。細胞傷害性を式：% 溶解＝（実験上の CPM −標的リーク CPM)／（界面活性剤溶解CPM −標的リーク CPM) ×100%で計算した。特異的溶解＝％HuMab有りの溶解−％HuMab無しの溶解。検定は三重にして行われた。
図３に示すように、HuMab 5F11、2H9、及び17G1は、アイソタイプ・コントロールに比較して、ホジキン腫瘍由来L540細胞の特異的溶解を媒介した。この結果は、これらのHuMabが、CD30発現腫瘍細胞を、エフェクタ細胞によるFc受容体媒介性溶解の標的に設定することができることを示している。
ＩＩ． HuMabによるL540ホジキン腫瘍細胞の単核細胞媒介性抗体依存的細胞傷害性
抗CD30 HuMabがCD30発現腫瘍細胞の溶解を媒介するその媒介能を、新鮮なヒト単核細胞の51Cr放出検定を用いて調べた。
L540細胞を、新鮮なヒト単核細胞による溶解の標的として用いた。ヘパリン処理した全血からフィッコール・ハイパック密度遠心分離法により、単核細胞を精製した。標的細胞に100μCiの51Crで１−２時間かけて標識してから、エフェクタ細胞に、様々なエフェクタ：標的比で及びHuMab（5μg/ml）にＵ底微量定量プレートで配合した。３７℃で４時間、インキュベートした後、上清を採集し、放射活性について分析した。細胞傷害性を式：% 溶解＝（実験上の CPM −標的リーク CPM)／（界面活性剤溶解CPM −標的リーク CPM) ×100%で計算した。特異的溶解＝％HuMab有りの溶解−％HuMab無しの溶解。検定は三重にして行われた。
図４に示すように、HuMab 5F11、及び17G1は、アイソタイプ・コントロールに比較して、ホジキン腫瘍由来L540細胞の特異的溶解を媒介した。この結果は、これらのHuMabが、CD30発現腫瘍細胞を、不活性化エフェクタ細胞、おそらくはナチュラル・キラー細胞のFc受容体媒介性溶解の標的に設定することができることを示している。
実施例４ HuMab 5F11の成長阻害
可溶性HuMab 5F11 抗体 (0.1、1、及び10μg/ml) を、ヤギ抗ヒトIgG (GAH-IgG) 抗体(10 倍過剰)で、９６ウェル・プレート内で、１ウェル当たり2×104 個の細胞にして架橋した(L540、L1236、Karpas 299、L428、BL38)。３７℃及び5% CO2 で９６時間インキュベートした後、成長阻害を、XTTという、色素産生性テトラゾリウム塩 (ナトリウム3 -[1-[(フェニルアミノ)-カルボニル]-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼン-スルホン酸水和物) 検定を用いて判定した。簡単に説明すると、HuMab 5F11に10倍過剰量のGAH-IgGを加えた、又は加えない多種の希釈液を、 96ウェル・プレート内の100μlアリクォートに分配した。100μlのアリクォートの完全培地に入れた2-4×104 個(L540、L1236、Karpas 299)の標的細胞を加え、プレートを３７℃で5%のCO2 雰囲気中で４８時間、インキュベートした。次に細胞培養物に、XTT 及びN-メチルジベンゾピラジンメチルスルフェート（最終濃度はそれぞれ1.49mM 及び0.025mM）を加えた100μlの新鮮な培地で４時間、刺激した。この試料の分光測定による吸光度を、ELISA読み取り機（ドイツ、エベルスベルグ、MWGバイオテック社）で450 nm 及び650 nm （基準波長）で測定した。陰性コントロールをGAH-IgG mAbのみを上述の標的細胞と一緒に用い、そしてHuMab 5F11 及び架橋抗体であるGAH-IgGの組合せをCD30陰性細胞株 (BL38)に用いて測定した。未処理のコントロール培養株に比較した細胞生存率を式検査−値／未処理＊100を用いて計算した。測定はすべて、三重にして行われ、２回繰り返された。具体的には、以下のコントロールを用いた：（１）二次架橋抗体なし；（２）二次架橋抗体のみ；（３）抗体のない細胞；及び（４）XTTのみ。
細胞代謝に対する明確な用量依存的効果が、Ｔ細胞様HD細胞L540及びKarpas 299細胞では見られるが、Ｂ細胞様HD 細胞、L428 及びL1236では見られない。IC50には最高の濃度10μg/mlで達したことから、細胞傷害性が中程度であることが分かる（図５を参照されたい）。GAH-IgG又は5F11抗体のいずれも単独では何ら効果を見せず、活性はL540及びKarpas 299細胞に限定されていたため、これは人為的な産物ではない。
実施例５ HuMab 5F11 のin vivo活性
位置特定された腫瘍モデル
HuMab 5F11のCD30発現腫瘍細胞成長阻害能を、異種移植を受けたマウスモデルを用いてin vivoで調べた。SCIDマウスの右脇腹に、200μlのPBSに再懸濁させたL540CY細胞（1×107）を注射することで、皮下充実L540CY 腫瘍を樹立した。腫瘍の発達を三日毎に測定し、腫瘍体積を式（長さ＊幅＊高さ）/2を用いて決定した。最大直径が4乃至6mmの樹立腫瘍を持つ動物を無作為に様々な群に分け、４日毎に100μgの5F11（200μlのPBSに入れて、腹腔内）を合計４回の注射、投与した。コントロール・マウスにはPBSのみを与えた。実験を停止し、コントロール群の中間腫瘍直径が20mmを越えたときにマウスをと殺した。（１０７日目）。処理群及びコントロール群はそれぞれ５匹の動物から成り、結果を第二組目の実験で裏付けした。
HuMab 5F11を４日ごとに４回、腹腔内投与した。末梢血リンパ球(PBL) を処理日１日目に１回、静脈内投与した。その結果を、腫瘍体積を日数に対して表にして表した（図６）。PBLを単独で投与しても、腫瘍の成長には影響があったが、本抗体を加えると、この効果が高まる。抗体単独では相当な抗腫瘍活性が示された（図６）。これらの結果は、HuMab 5F11が、単独で投与された場合でも、又はヒトPBLと組み合わせて投与された場合でも、動物モデルのCD30発現腫瘍細胞の成長を阻害できることを実証している。
播種腫瘍モデル
無病原体メスC.B-17/Icr SCID マウス(デンマーク、ラーイ、M&B A/S社、FOX CHASE SCID(R))を無病原体条件下に維持し、加圧滅菌済みの標準的固形飼料及び水を与えた。播種モデルを用いて、HuMab 5F11処理が、ヒトHL 細胞 L540CYの抗原刺激を受けたSCIDマウスの生存率に及ぼす影響を評価した。この播種モデルのために、1x107 個の指数関数的に成長中のL540CY細胞を、尾の静脈（iv）を通じて３乃至４週齢のSCIDマウスに注射した。L540CY 細胞の注射から１日後に、マウスに100μgの5F11を200μlのPBSに希釈して４日毎に合計４回の注射、腹腔内（ip）注射した。 コントロール群には、同じ処理スケジュールを用いた、PBS のみ、5F11＋10倍過剰のGAH-IgG mAb、及びGAH-IgG mAb 単独が含まれた。進行性疾患（毛皮の波立ち、不活動性、頭蓋骨の変形）の兆候のあるマウスをと殺した。肉眼検査後に、L540CY細胞の肉眼的浸潤がある器官をホルマリン固定した。最長200日まで生存した動物はその時点でと殺され、主な器官を更なる検査のためにホルマリン固定した。
キャプラン−マイヤー分析（図１５）に記載されたように、PBS処理されたコントロール群の平均生存時間は４３日間（範囲４０乃至４６日間）であり、GAH-IgG 処理群では３９日間(範囲１５乃至５１日間）だった。5F11処理群では、3/5 のマウスの生存期間が長く（139日間）、剖検しても何ら疾患の兆候が見られなかった。１匹の動物が１７日目に死亡したが、疾患の肉眼的兆候が顕れないままだったことから、その死因は腫瘍に無関係であることが示された。２匹目のマウスは５７日目に進行性疾患が原因で死亡した。GAH-IgG mAbと架橋すると、4/4 のマウスで腫瘍の兆候が何ら発症せず、200日目にと殺された。このように、HuMab 5F11 での処理が、HLの異種移植モデルで、動物のうち高い比率で治癒的だった (5F11 + GAH-IgG 及び5F11 処理群のそれぞれについてp = 0,01 及びp = 0,046 )。
実施例６ フルオレセイン化HuMab 5F11の正常ヒト組織との交差反応性
フルオレセイン化型のHuMab 5F11の正常ヒト組織凍結切片との潜在的交差反応性を評価するために、間接的免疫ペルオキシダーゼ法を用いた。期待された交差反応性は観察されなかった。
本実験は食品医薬品庁の実験慣例規則（GLP）規則（21 CFR 第58部）に従って行われた。当該ヒト組織群には、EC CPMP 指針 III/5271/94の付属書類ＩＩの「交差反応性の免疫組織化学的調査に用いるためのヒト組織の提案表」『モノクローナル抗体の作製及び品質管理』 にある組織や、1997 US FDA/CBER 『ヒトでの使用に向けたモノクローナル抗体製品の製造及び検査で考慮すべき点』で推奨された組織、が含まれた。
部検又は外科的生検で予め得られた組織をティシュー・テックO.C.T. 培地に包埋し、ドライアイス上に置いて凍結させた。組織をほぼ5μmの切片にし、１０分間、室温のアセトン中で固定した。検査物を二種類の濃度（2及び10μg/ml）でスライドに載せ、間接的免疫ペルオキシダーゼ法（ダコ社エンビジョン・キット）を用いて結合を検出した。
その結果は、検査物HuMab 5F11-FITCは、ホジキン病由来細胞株である陽性コントロールCD30発現L540細胞の細胞膜や、ヒト扁桃の陽性コントロールCD30発現リンパ球の細胞膜を特異的に染色したことを示した。陽性コントロール凍結切片との反応性は、調べた両方の濃度（10μg/mL及び2μg/mL）で強い乃至大変強い、だった。ヒト扁桃においては、CD30陽性細胞は濾胞の周辺や、隣接する小胞内領域に局在しており、扁桃細胞の1-2% 未満を占めていた。
ヒト検査組織群の検査では、ヒト扁桃以外の組織では交差反応性は観察されなかったことが示された。検査を受けた三者のドナーのすべてで、濾胞の周辺や、隣接する小胞内領域に局在するリンパ球／単核細胞との反応性が観察された。扁桃細胞で染色されたのは1%未満だった。この反応性は、CD30の扁桃発現に関するそれまでの報告に基づいて予測されたものだった (Hecht et al., 1985)。
実施例７ 抗体の配列決定
実施例１で上述したように、特異的HuMab IgGを産生するハイブリドーマから得られたHuMabをプロテインＡカラム・クロマトグラフィで精製したところ、目的の三種類の抗体：17G1-1、5F11 及び 2H9が単離された。次にHuMab 17G1-1、5F11 及び2H9 の VH 及び VL 領域をハイブリドーマRNAから単離し、cDNAに逆転写させ、それらV領域をPCRで増幅し、そのPCR産物を配列決定した。以下は、HuMabのVH 及びVL 領域の核酸及びアミノ酸配列である。
17G1 VH 核酸配列：
GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTCTTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACGAAGATGGAAGTGAGAAATTCTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCCGAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGTTCATTGGTACTTCCATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA (配列番号1)
17G1 VH アミノ酸配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSNSWMSWVRQAPGKGLEWVANINEDGSEKFYVDSVKGRFTFSRDNAENSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVHWYFHLWGRGTLVTVSS (配列番号2)
17G1 VL 核酸配列
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (配列番号3)
17G1 VL アミノ酸配列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (配列番号4)
2H9 VH 核酸配列
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAAGTACACCCCGTCCCTCAAGAGCCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGCACCAATTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGACTGTCTACTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA (配列番号5)
2H9 VH アミノ酸配列
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTKYTPSLKSRVTISVDTSKHQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETVYYFDLWGRGTLVTVSS (配列番号6)
2H9 VL 核酸配列
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTAAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGCTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGCGTAGCAACTGGCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (配列番号7)
2H9 VL アミノ酸配列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARLSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPWTFGQGTKVEIK (配列番号8)
5F11 VH 核酸配列
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGCTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGACATCAATCATGGTGGAGGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTAACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGCCTAACTGCCTACTGGGGCCAGGGAAGCCTGGTCACCGTCTCCTCA (配列番号9)
5F11 VH アミノ酸配列
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSAYYWSWIRQPPGKGLEWIGDINHGGGTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCASLTAYWGQGSLVTVSS (配列番号10)
5F11 VL 核酸配列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAACCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAACCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATAGTTACCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (配列番号11)
5F11 VL アミノ酸配列
DIQMTQSPATIENTSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLTWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDSYPITFGQGTRLEIK (配列番号12)
実施例８ ヒトにおけるホジキン病（HD）のCD30媒介治療
ホジキン病（HD）は、MOPP 又はABVD 及び放射線技術の向上のような多重化学療法計画の導入により、治癒可能な疾患となった (Devita VT, Jr. et al. Ann Intern Med 73:881 (1970); Bonadonna G et al. Cancer Treat Rep 66:881 (1982); Kaplan H.S. Cancer 45:2439 (1980))。より最近では、疾患段階の進行した患者でも、ドイツのホジキンリンパ腫研究グループが確立した BEACOPP計画を用いて、優れた応答及び生存率が示されている (Diehl V et al. J Clin Oncol 16:3810 (1998))。しかしながら、大半の患者は標準的なアプローチで治癒可能であるが、再発患者のうちで第二選択肢の治療後に、永続性のある無疾患の寛解期が得られるのは30%未満である (Carella A.M. et al. Leuk Lymphoma 7 Suppl:21 (1992))。原発性難治性疾患患者のこの結果はさらに悪い(Linch D.C., et al. Lancet 341:1051 (1993))。
ホジキン病や、結腸直腸癌、骨髄性白血病、又は非ホジキンリンパ腫（NHL）を含む多の悪性疾患のデータでは、第一選択肢の治療法後に残った腫瘍細胞の少数が、晩期再発を生ずることがあることが示されている (Kanzler H et al. Blood 87:3429 (1996); Wolf J et al. Blood 87:3418 (1996); Riethmuller G et al. Lancet 343:1177 (1994); Roy D.C. Blood 77:2404 (1991); Gribben J.G. et al. N Engl J Med 325:1525 (1991)。このように、第一選択肢の治療法後に残るホジキン−リード／シュテルンベルグ（H-RS）細胞を消滅させると、HDでの結果がさらに向上するかも知れない。数多くの様々なモノクローナル抗体がHD患者の治療について評価されてきており、その中には抗体−毒素コンストラクト（イムノトキシン）、放射性免疫結合体、及び非修飾モノクローナル抗体がある。 (Herpst J.M. et al., J Clin Oncol 13:2394 (1995); Schnell R., et al., Leuk Lymphoma 30:525 (1998); Engert A., et al., Blood 89:403 (1997); Schnell R., et al., submitted, (2001))。可能な代替法として、二重特異抗体が、HDにおいて免疫試薬として関心を引いてきた。一般的には、二重特異抗体はよく寛容されることが示されている。しかしながら、これらのコンストラクトの副作用及び細胞傷害性の可能性は、重要なことに、標的決定しようとするエフェクタ細胞に左右される。
これまでのところ、大半の二重特異抗体は、悪性疾患患者、特にHD患者では効果の低い、リンパ球又はNK細胞のうちの異なる下位集団に関係していた(Hartmann F., et al., Blood 89:2042 (1997))。このように、活性化好中球、単球、及びマクロファージ上で発現する高親和FcγRI受容体（CD64）に基づく新規な二重特異的分子（二重特異的分子） (Ravetch J.V. et al., Annu Rev Immunol 9:457 (1991))が構築された。CD64は、FcγRIを発現する細胞傷害性エフェクタ細胞上のトリガ分子として働く。単量体IgG や、IgG-抗原複合体の両者ともFcγRIに結合する。IgG-抗原複合体のFcγRIへの結合のみが、細胞溶解、レスピラトリーバースト、及び酸化酵素の産生を含め、細胞傷害活性を増す (Fanger M.W. et al., Immunol Today 10:92 (1989); van de Winkel J.G. et al. J Leukoc Biol 49:511 (1991))。
マウスモノクローナル抗体M22は、FcγRIに、通常のFc結合ドメイン以外のエピトープで結合するため、血清IgGとの競合が回避される(Guyre P.M. et al., J Immunol 143:1650 (1989))。本発明で報告された新規な二重特異的分子の構築のために用いられる結合ユニットは、H22と呼ばれる、ヒト化型の抗CD64モノクローナル抗体M22に基づく (Graziano R.F. et al., J Immunol 155:4996 (1995))。H22 F(ab'）フラグメントを、抗CD30モノクローナル抗体Ki-4を由来とするF(ab')フラグメントに化学的に連結した。その結果得られた二重特異的分子H22xKi-4 は104 kDa の分子量を有するため、完全抗体に比較して、より優れた腫瘍貫通作用が可能である。加えて、この種類のコンストラクトは補体を活性化せず、またFc受容体を発現する非細胞傷害性細胞に結合することもないため、副作用も小さい(Fanger M.W. et al., Crit Rev Immunol 12:101 (1992))。H22×Ki-4 を予備臨床in vitro検査したところ、この二重特異的分子は、単球と相まって抗体依存的細胞傷害性（ADCC）を媒介したり、単球由来マクロファージ（MDM）と相まって貪食を媒介することが実証された(Sundarapandiyan K. et al., J Immunol Methods 248:113 (2001))。このように、CD64 は、HDにおいて免疫コンピテントエフェクタ細胞を召集するための将来性あるターゲットである。以下の臨床第１相研究は、HD患者における新規な治療的二重特異的分子の効果を実証するために行われた。
Ｉ． 患者及び方法
患者
適格患者は従来の化学療法に反応しない測定可能かつ進行性の不応性HDを有していた。H22×Ki-4での処理前１年以内に行われた腫瘍生検で得られたH-RS細胞の30%以上で抗CD30抗体との反応性があることで、CD30抗原の存在を記載しなければならなかった。研究薬物投与から４週間前に、事前化学療法又は放射線療法を完了しておかなければならなかった。加えて、以下の条件を満たさねばならなかった：他覚的に測定可能な疾患部位の存在、世界保健機構(WHO) による作業状況２以下、年齢１８歳以上７０歳以下、少なくとも３ヶ月の期待寿命、2mg/100ml未満の血清クレアチニン値、下限の75%を越える血清アルブミン値、心エコー検査で測定した心機能の基線左心室駆出率（LVEF） が35%を越え、他に主要な医学的問題がないこと、である。進行性HD患者には、しばしばコルチコステロイド治療が必要であるため、同時のコルチコステロイド治療は除外基準ではなかった。このプロトコルには倫理委員会団体の承認を受け治療の調査的性質について、患者からの書面によるインフォームド・コンセントを受けるものとした。
研究デザイン
この臨床治験はオープン・ラベルであり、非無作為化第１相用量漸増研究だった。主な目的は、静脈輸中で投与した場合のヒトにおけるH22×Ki-4の最大耐用量（MTD）を決定することだった。二番目の目的には、薬学的動態、用量制限毒性（DLT）、生物学的至適用量、及び何らかの抗腫瘍活性が含まれた。それぞれ４回の輸注から成る少なくとも２コースの治療を患者に行った。H22×Ki-4 をそれぞれ１日目、３日目、５日目及び７日目に投与した。応答のある患者で個々の調査者の判断に従って、付加的なコースを加えた。
用量の漸増及び主要毒性規則
最大耐用量（MTD）は毒性による制限を受ける用量直前の最も高い用量レベルとして定義されている。この用量は、３人又は６人の患者のうちの少なくとも２人でDLTが発生することで定義された。６人の患者が、MTDで治療を受けなければならなかった。このMTDを以下の通りの促進滴定デザインを用いて評価した：いずれかのコースで初回のDLTが観察されるまでに、又は、いずれかのコースで等級ＩＩの毒性の二回目発生が観察されるまでに、当該促進段階にある一コホート中の１人の患者で、二段階（100%）の用量漸増 (Simon R. et al., J Natl Cancer Inst 89:1138 (1997))。こうして、最新の用量レベルのコホートを少なくとも３人の患者に拡張しなければならず、標準的な改良フィボナッチ用量漸増スキーム（50%の用量増分で）を、その後の用量レベル全てに用いた。本研究薬物に関係があると判断されなかった有害反応を、これらの用量漸増規則や、MTD決定のための規則の点で、毒性とみなさなかった。用量群は以下の通りである：1.0 mg/m2/d、2.5 mg/m2, 5 mg/m2/d, 10 mg/m2/d, 及び20 mg/m2/d。合計６人の患者を毒性なしに関係なく、20 mg/m2/d 用量レベルに参加登録させた。DLTは、（NCI 基準に基づき）いずれかの等級ＩＩＩもしくはＩＶの非血液学的毒性か、又は、リンパ球減少症、単球減少症又は好中球減少症を除く等級ＩＶの血液学的毒性と定義された。前の用量レベルでのH22×Ki-4の３回目の投与がDLTなしで終了した場合に、患者は次の用量レベルを開始できた。輸注の間、そしてその後最長６時間、毎時間、バイタル・サインをコントロールした。WHO基準に基づく完全血球数、生化学的性質、尿の状態、動作特性及び毒性評価を含め、患者を毎週、観察した。 各コースの２８日目に、心電図、胸部Ｘ線、心エコー検査、肺機能検査、血清クレアチニン、及び腫瘍応答の評価を含め、基線評価を繰り返した。
薬物の調合及び投与
H22×Ki-4を、以前に解説されたグレニー法を用いて作製した (Glennie M.J. et al., J Immunol 139:2367 (1987))。1mg/ml のH22×Ki-4 を含有する無菌の10ml入りバイアルで薬物を提供し、４℃で保管しなければならなかった。各輸注前に、総用量の10% 又は0.2 mgのいずれか少ない方のH22×Ki-4を50mlの通常の生理食塩水に溶解させた初回検査用量を、患者に１０分間かけて静脈内投与した。次に患者に1000 mg のアセトアミノフェンを経口的に予備投与し、1 mg のクレマスチンを３０分間かけて経口投与してから、最終用量のH22×Ki-4を投与した。この検査用量が３０分後に何ら有意な毒性無く寛容された場合、H22×Ki-4 を500 mlの通常の生理食塩水に希釈し、3 mg/hから初めて静脈内投与した。６０分後に何の有害反応も認められない場合、輸注速度をそれぞれ6 mg/hそしてその後9 mg/h に上げた。
薬物動態
H22×Ki-4投与の初日に、血液試料を、ヘパリン添加した試験管に以下の時点で採取した：輸注前、輸注直後、各輸注から2、4、8、12、24、及び48時間後。1,200gで１０分間遠心分離して血漿を血球から分離した後、薬物動態の分析まで-20℃で保存した。H22×Ki-4検定の検出限界は最初の３人の患者については0.125μg/ml であり、そしてそれ以降の患者全員については0.04μg/mlだった。血漿中H22×Ki-4濃度の経時データを各対象毎にH22×Ki-4濃度対時間の準対数表で検査した。Cmax及びTmax値は、なまの薬物動態データから得られた数値だった。他の標準的な薬物動態パラメータは、WinNonlin Pro薬物動態プログラム（カリフォルニア州マウンテン・ビュー、ファーサイト・コーポレーション社）を用いて推定された。濃度−時間データは、オープン・非コンパートメンタル法(WinNonlin モデル 202)を用いて分析された。終端消滅速度定数（ke）は、非コンパートメンタル分析法により、対数H22×Ki-4濃度対時間の表の終点3乃至6ポイントの線形回帰を用い、重みのないパラダイムを用いて決定された。終端消滅半減期（T1/2）は、0.693/keから推定された。AUCから最終データ点までを線形−台形規則を用いて推定し、Wagner-Nelson 補正（Clast/ ke)を加えることで無限大まで外挿した。総全身クリアランス(CL)はDose/AUCを除算することで計算された(0-無限大)。分散のみかけの体積 (Vdz) はCL/ keから推定された。平均残留時間（MRT）はAUMC/AUCから推定された。定常状態での分散のみかけの体積 (Vdss)は等式Vdss = CL×MRTから推定された。蓄積係数-Rは等式Treat X AUC(0-)/Treat 1 AUC(0-)から推定された。このTreat X AUC(0-) には、いずれかの治療の場合のゼロから投薬間隔までが含まれており、AUC(0-) は１日目のゼロ−無限大からのAUCだった。
生物活性の評価
本発明の二重特異的分子でのDLTはあり得そうになかったため、当該生物活性のためのサロゲート・パラメータを調べた。末梢血中の単球数をH22×Ki-4の輸注の直前及び後と、輸注から2、4、8及び24時間後に測定した。CD64発現をFACS分析で判定し、アイソタイプ・コントロールに、適した抗体を用いて相関付けた(FACS-Calibur、ベクトン−ディッキンソン社)。同じ時点でIl-6、Il-15、G-CSF、及びTNFαの血清中レベルを、市販の酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）キットを用いて判定した。次に、治療前のサイトカイン・レベルを、本二重特異的分子で処理した後のものに関係付け、ウィルコクスコン検定を用いて有意差を検定した。二重特異的分子レベルとの相関を、ピアソンの係数を用いて検定した。
腫瘍に関しては、sCD30レベルをELISA (DAKO社)により、二重特異的分子投与のそれぞれの日の前後に測定した。２人の患者から、H22×Ki-4の最後の輸注から２４時間後に肥大末梢リンパ節の診断生検についてインフォームド・コンセントを得た。 この材料を２つの部分に分割し、その一方をすぐに凍結させて−８０℃で保存し、他方をパラフィン包埋した。免疫組織化学検査のために、組織を脱パラフィンし、5μmの切片に切断し、ブタ血清で１０分間、遮断して、非特異的染色を減らした。次に、一次モノクローナル抗体、ポリクローナルウサギ抗マウスAb (DAKO社)をPBSに1:50に希釈したものを塗り、４℃で一晩インキュベートした後、ビオチン化ブタ抗ウサギ抗体 (1:200 を４５分間、室温で。E 431 DAKO) 及び標準的なビオチン−ストレパティエンタビジン・キット(DAKO)で繰り返した。最後にこのスライドをファスト・レッド（DAKO社）で染色した。一番目の陰性コントロール（二重特異的分子なし）として、本研究で処理を受けていない患者由来のHDの標本を同じ手法で染色した。二番目の陰性コントロール（染色手法に用いられた他の抗体からの非特異的交差反応性を除くため）はこの治験で得られた物質であり、一次抗体なしで染色した。
HABA/HAMA-応答
ヒト抗二重特異抗体応答を以前に解説された方法を用いて判定した(Pullarkat V., et al., Cancer Immunol Immunother 48:9 (1999))。簡単に説明すると、本二重特異的分子で被膜した微量定量プレートを血漿試料の希釈液と一緒にインキュベートし、抗二重特異的分子抗体を、アルカリ−ホスファターゼ結合ヤギ抗（ヒトIgG）Fc特異的プローブで検出した。HABAレベルを、基線の輸注前値のＸ倍の増加として表した。
応答の評価
アン−アーバーの分類システムに従って病期決定を行った。完全寛解（CR）を、少なくとも４週間の期間にわたる進行性疾患の何らかの臨床上又は放射線学上の証拠がないこととして定義した。部分的寛解 (PR) を、４週間未満の期間をあけた二回の連続的観察で判定したときに、測定可能な全ての病変の２つの最大垂直直径の積で50%以上の減少があったことと定義した。やはり少なくとも４週間続く、総腫瘍質量の25%未満の減少又は増加は、変化なし（NC）と定義した。進行性の疾患は、何らかの新たな病変の出現、又は、腫瘍の大きさの25%を越える増加と定義した。
ＩＩ． 結果
患者の特徴
５種類の異なる用量レベルで処理を受けた合計１０人の多重予備処理再発HD患者が含まれ、評価可能であったが、そのうち２人は女性だった。中央年齢は２１歳から５３歳までの範囲のうちの３４．６歳だった。組織検査には、細胞充実度が混合したホジキン病患者３人と、結節硬化型サブタイプの患者７人が含まれた。再発の中間数は3 (範囲は1乃至7）だった。１０人中９人の患者での自己由来幹細胞支援のある高用量化学療法を含め、中間回数4回（範囲は2乃至6回）の事前化学療法を与えた。加えて、患者のすべては放射線療法で予備処理されていた。 患者群のうちで、７人の患者が病期IVの疾患を有し、３人の患者が病期IIIの疾患を有し、５人の患者が研究登録日にＢ症状を有し、そして８人の患者が、それぞれ一方の患者が３つの処理コースと、一方の患者が４つの処理コースを受けるという（それぞれのコースが４回の輸注から成る）、２種類のコースのH22×Ki-4で処理された。
毒性
副作用はすべて、輸注の間、そして輸注終了から最長６時間起きる一過性のものだった（表２を参照されたい）。１０人の患者すべてで軽度の疲労が観察された。他の毒性には、軽度の低血圧（４級Ｉ）、頻脈（６級Ｉ）、発熱（２級Ｉ、３級ＩＩ）、寒気（４級Ｉ）、及び筋肉痛（３級Ｉ）が含まれた。これらの副作用のすべてが２４時間以内に消滅した。血液学的毒性も、臓器毒性も観察されなかった。
薬物動態
二重特異的分子レベルは、5mg/m2/dを越える量を投与された患者でのみ、検出可能だった。Tmax は、全ての対象で、全ての処理日に、輸注時又は輸注終了後に起きた。経時的な血漿濃度減少は、すべての患者で単一指数関数的だった。Cmax 及びAUC が時間とともに増す傾向があった。従って、１週間の処理期間にわたるCmax、T1/2z、AUC、Cl 及びVdz の分散の一変量、単一因数、反復測定解析を行った。この解析では、Cmax (F= 5.885; p=0.006)及びAUC(F= 5.976; p=0.005)に対する有意な時間効果が明らかになった。このことは、反復的な投薬によるH22×Ki-4 の蓄積を示唆するものである（図１及び２を参照されたい）。研究されたすべての患者について、蓄積因数Rの中間値は４回目の用量で1.36 (範囲0.98-3.90)である。H22×Ki-4 の終端半減期は 10 mg/m2/d 用量 (n=1) で７．９時間であり、そして20 mg/m2/d 用量レベル（中間値 11.1 h; 5.3- 18.2 時間の範囲)で１１．１時間（平均）の数値を有していた（表３を参照されたい）。分布体積は20.26 乃至183.20 L/m2の範囲だった。 20 mg/m2群の体積分布 (Vdz) の平均値は53.17 L/m2 だった。1日目のH22×Ki-4の全身クリアランスは1.02 乃至14.06 L/m2と幅があり、20 mg/m2 を受けた患者群の平均値は3.91 L/h/m2 (SD 5.04 L/h/m2)だった。低レベルのHABAが、二番目のコースの終了後にすべての患者で検出可能であり、二重特異的分子レベルが測定可能であり、二重特異的分子の血清中レベルの減少も、又はアレルギー反応も起きなかった（表２を参照されたい）。４回のサイクルの本二重特異的分子で処理された患者が高いHABAレベルを生じた。
生物活性
Il-6、IL-15、TNFα及びG-CSF の放出があり、H22×Ki-4輸注終了時から２乃至４時間に最高に達した。このサイトカイン放出は有意ではなく、おそらくは限られた数の評価可能な患者数（n=6）と、サイトカインレベルの患者間のばらつきが大きいことが原因である。しかしながら、図３及び４に示すようなサイトカイン放出の明確な傾向があった。このサイトカイン放出は、本二重特異的分子の反復投与で軽減するように思われ、IL-15よりも、G-CSF、TNF-α、及びIL-6 の方がより顕著だった。と同時に、末梢血単球上のCD64発現の有意な減少（p=0.018）や、それらの血球数の減少があった（図５を参照されたい）。血清中sCD30レベルは、腫瘍負荷の高い患者では著しく上昇していたが、本二重特異的分子の初回輸注後にはそれ以上検出可能でなくなり、すべての患者において処理終了まで大変低いレベルに留まった（データは図示せず）。
免疫組織化学
本二重特異的分子のマウス・フラグメントが、上述の方法を用いて、両方の患者のリンパ節標本中に検出できた（図６を参照されたい）。HRS細胞の明確な染色があり、細胞質全体に渡っていた。加えて、この組織中のマクロファージは同一の染色パターンを示した。このように、悪性リンパ節への本二重特異的分子の浸潤の明確な証拠があった。
腫瘍の応答
全体的には、H22×Ki-4二重特異的分子に対して他覚的応答のあった患者が４人いた。CRが一件、最大10mmのびまん性肺結節のあった患者で見られた。この応答は３ヶ月間続いた後、肺結節はやはりCTスキャンで測定可能になり、救護的化学療法を開始した。４週間乃至５ヶ月間続くPRを３人の患者で記載した。１人の患者（No 4）では、４週間後に更なる化学療法を行った。この患者では、疾患部位のみが、胸椎浸潤だった。本二重特異的分子で処理すると、神経学的異常が完全に解決し、測定可能な部分的応答が起きた。さらに２サイクルのH22×Ki-4後にはそれ以上の応答の向上がなかったため、疾患進行のリスクや脊椎の致命的損傷の可能性を減らすために、化学療法を行った。
最も低い二種類の用量レベルで処理した２人の患者に進行性の疾患があり、四人の患者が安定な疾患を示した。これらのうちで、前述の化学療法で生命に危険性のある毒性（敗血症、急性腎不全、二ヶ月間の機械的換気）を経験した、腫瘍負荷の大きい（右側上部肺に胸膜及び胸郭壁の浸潤がある）１人の患者（No 6）が、彼の症状（咳、夜間の発汗）で著しい向上を達成した。疾患の安定化及び彼の全体的状態の正常化は１２ヶ月間続いた。
ＩＩＩ． 結論
上述の研究では以下の事項が実証された：１）H22×Ki-4は最高80 mg/m2（１日目、３日目、５日目及び７日目に投与）の用量でよく寛容され、軽度から中度で一過性の副作用があるのみである。用量制限毒性もなく、このコンストラクトの最大寛容用量には達しなかった；２）投与された最大容量でのH22×Ki-4の半減期は１１．１時間であり、治療期間にわたってCmax及びAUCで判定したときに薬物の有意な蓄積があった；３）IL-6、IL-15、TNFα及びG-CSFのサイトカイン放出や、単球及びCD64発現の減少があり、生物学的効果的用量及びスケジュールの示唆となった；４）H22×Ki-4は予備処理された進行性かつ不応性のHD患者で腫瘍応答を誘導する。H22×Ki-4は、マウス抗CD30モノクローナル抗体Ki-4及びヒト化抗CD64モノクローナル抗体H22を由来とする２つのF（ab'）フラグメントを化学的に連結して成る新規な二重特異的分子である。このコンストラクトは、in vitroのH-RS細胞株に対して活性を示した (Sundarapandiyan K. et al., J Immunol Methods 248:113 (2001))。
H22×Ki-4の初めての臨床治験である本治験では、処理された１０人の患者すべてで起きた最も共通の副作用は疲労であった。他の副作用には、頻脈、低血圧、寒気、発熱、及び筋肉痛があった。H22×Ki-4の毒性プロファイルは、リツキシマブ、カンパス-1H、又はOKT3を含め、リンパ腫細胞に対するいくつかのモノクローナル抗体について解説された「サイトカイン−放出症候群」に似ている (Winkler U., et al., Blood 94:2217 (1999); Wing M.G. et al., J Clin Invest 98:2819 (1996); Norman D.J. et al., Transplant Proc 25:89 (1993))。これらの症状は、すべての用量レベルで起き、さらに低い用量でも生物活性を示す。等級IIの発熱及び軽度の筋肉痛のみが、最高の用量レベルに限られていた。症状の発症は様々であったが、輸注終了から６時間以内は続いた。副作用と、H22×Ki-4又はこの研究で判定されたサイトカインの血清中レベルとの間の直接的な相関関係は観察されなかった。
相当に高い用量の本二重特異的分子が用いられたという事実にもかかわらず、H22×Ki-4のMTDは確認できなかった。６人の患者を１回のサイクル当たり80 mg/m2で処理し、１人の患者に投与された二重特異的分子の最高総量は740 mgだった。この用量レベルでは大きな副作用はなかったため、 1日目、3日目、5日目、及び7日目で１サイクル当たり80 mg/m2の投与が、安全な用量である。大変類似した知見が、例えば リツキシマブなどの他の特異的モノクローナル抗体から公知である (Maloney D.G. et al., J Clin Oncol 15:3266 (1997))。このように、１サイクル当たり80 mg/m2が、特に匹敵する抗CD64二重特異的分子を用いた以前の研究と同様な末梢血単球の飽和が観察されている (Pullarkat V., et al., Cancer Immunol Immunother 48:9 (1999))ために、生物学的に有効な用量である。
１１．１時間という計算上の半減期は、他の抗CD64ベースの二重特異的分子について報告された範囲内でもある (Curnow R.T., Cancer Immunol Immunother 45:210 (1997))。この半減期は、400時間を超える半減期が記述されているリツキシマブなどのヒト化IgGベースの抗体と比較して短い。しかしながら、H22×Ki-4のこのような短い半減期は驚くことではない。なぜならこの新規な分子は、インタクトIgGベースの抗体に比較して小さく（104 kDa 対 180 kDa) 、Fc部分を欠くからである (Tobinai K. et al., Ann Oncol 9:527 (1998))。さらに、インタクト抗体と比較して、H22×Ki-4の分子サイズは、悪性のリンパ節へのその透過をより容易にすると思われる (Jain R.K., Cancer Res. 50 (Suppl).:814s (1990))。
本研究で用いられたこのスケジュールは、すべての末梢血単球及びsCD30を本二重特異的分子で飽和させて、過剰量の未結合の二重特異的分子が、その後に組織に透過してHRS細胞に結合できるように、デザインされた。sCD30への結合は、H22×Ki-4の分布に大きな影響を有していたかも知れない。ピーク・レベル及びAUCとして測定されたH22×Ki-4の著しい蓄積が観察されたことから、この区画の飽和が示唆された。さらに、最初のH22×Ki-4輸注後、全処理期間中、sCD30は大変低いレベルに留まったが、これはおそらく、部分的には、Ki-4抗体によるCD30遊離の遮断があったためであろう (Horn-Lohrens O., et al., Int J Cancer 60:539 (1995))。加えて、H22×Ki-4 のHRS細胞への結合が免疫組織化学検査で観察された。最後に、単球由来サイトカイン、即ちG-CSF、IL-6、IL-15、及びTNFαの放出が、エフェクタ細胞上のCD64に対する本二重特異的分子の充分な結合との組合せで、観察された。
H22×Ki-4に対する将来性ある応答は、抗FcγRIモノクローナル抗体H22を用いた充実腫瘍で報告されたデータを確証する。CD64への結合を介したADCCの誘導を、進行性乳癌患者で実証した (van Ojik H.H. et al, Cancer Immunol Immunother 45:207 (1997))。ホルモン不応性前立腺癌では、抗CD64×抗HER2 二重特異的分子が、本治験で用いられたよりも低い用量でも活性を示した (James N.D. et al., Br J Cancer 85:152 (2001))。
全体的には、前述の研究は、本発明の二重特異的分子、例えばH22×Ki-4、が予備処理された進行性又は不応性のHD患者において優れた毒性プロファイル及び将来性ある効験を示すことを実証するものである。
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説した本発明の具体的な実施例の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は、以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
引用による援用
ここで引用された全ての特許、係属中特許出願及び他の公開文献の全文を、引用をもってここに援用することとする。
図１は、抗CD30 HuMab、17G1、5F11、2H9 及びアイソタイプ・コントロールの組換えCD30との用量依存的結合を比較したグラフである。 図２は、抗CD30 HuMab、17G1、5F11、2H9 及びアイソタイプ・コントロールのホジキン・リンパ腫細胞株L540との用量依存的結合を比較したグラフである。 図３は、抗CD30 HuMab、17G1、5F11、2H9 及びアイソタイプ・コントロールによるL540ホジキン腫瘍細胞の単核細胞媒介性抗体依存的細胞傷害性を比較したグラフである。 図４は、抗CD30 HuMab、17G1、5F11、2H9 及びアイソタイプ・コントロールによるL540ホジキン腫瘍細胞の単球媒介性抗体依存的細胞傷害性を比較したグラフである。 図５Ａ及びＢは、HuMab 5F11を用いた細胞成長の阻害を示すグラフである。 図６は、異種移植を受けたマウスモデルを用いたin vivoのHuMab 5F11によるCD30発現腫瘍細胞の成長阻害を示すグラフである。 図７は、HuMab 17G1の VH-領域のヌクレオチド配列(配列番号1) 及び対応するアミノ酸配列 (配列番号2)を示す。CDR領域が示されている。 図８は、HuMab 17G1の VL-領域のヌクレオチド配列(配列番号3) 及び対応するアミノ酸配列 (配列番号4)を示す。CDR領域が示されている。 図９は、HuMab 2H9の VH-領域のヌクレオチド配列(配列番号5) 及び対応するアミノ酸配列 (配列番号6)を示す。CDR領域が示されている。 図１０は、HuMab 2H9の VL-領域のヌクレオチド配列(配列番号7) 及び対応するアミノ酸配列 (配列番号8)を示す。CDR領域が示されている。 図１１は、HuMab 5F11の VH-領域のヌクレオチド配列(配列番号9) 及び対応するアミノ酸配列 (配列番号10)を示す。CDR領域が示されている。 図１２は、HuMab 5F11の VL-領域のヌクレオチド配列(配列番号: 11) 及び対応するアミノ酸配列 (配列番号12)を示す。CDR領域が示されている。 図１３は、それぞれ生殖細胞配列 VH4-34、L15、VH3-11、A27、及びL6のヌクレオチド配列(配列番号49、50、51、52、及び53)を示す。 図１４は、クラスタAに対する抗体が、L540細胞へのFITC標識HuMab 5F11の結合を阻害できたが、クラスタB又はCに対する抗体はできなかったことを示したグラフであり、5F11がクラスタAエピトープに、又は、クラスタAエピトープ近傍に結合することを示す。 図１５は、播種モデルで、HuMab 5F11処理がヒトHL細胞L540CYで抗原刺激したSCIDマウスの生存率に及ぼす影響を示すグラフである。
【配列表】
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Claims (48)

  1. ヒトCD30に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
  2. 前記抗体が、CD30発現腫瘍細胞の成長を阻害する、請求項１に記載のヒト抗体。
  3. 前記抗体が、エフェクタ細胞の存在下で、CD30発現腫瘍細胞の抗体依存的細胞傷害性（ADCC）を誘導する、請求項１に記載のヒト抗体。
  4. ADCCが単球により媒介される、請求項３に記載のヒト抗体。
  5. ADCCが単核細胞により媒介される、請求項３に記載のヒト抗体。
  6. 前記腫瘍細胞が、骨髄細胞、肝細胞、リンパ節細胞、皮膚細胞、脾細胞、胸腺細胞、扁桃細胞、脱落膜細胞、子宮内膜細胞、ホジキン細胞、リード／シュテルンベルグ細胞、未分化型大細胞リンパ腫(ALCL)細胞、多形性及び免疫芽球性リンパ腫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞又は単球から成る群より選択される、請求項２に記載のヒト抗体。
  7. 前記腫瘍細胞がホジキン細胞又はリード−シュテルンベルグ細胞である、請求項２に記載のヒト抗体。
  8. 前記抗体が、少なくとも107 M-1の親和定数でヒトCD30に結合する、請求項１に記載のヒト抗体。
  9. ヒトIgG重鎖及びヒトカッパ軽鎖を含む、上記請求項のいずれかに記載のヒト抗体。
  10. IgG1又はIgG3重鎖を含む、上記請求項のいずれかに記載のヒト抗体。
  11. FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4 配列を含むヒト重鎖可変領域と、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及び FR4 配列を含むヒト軽鎖可変領域とを含む単離されたヒトモノクローナル抗体であって：
    （ａ）前記ヒト重鎖可変領域CDR3配列が、配列番号18、30 及び42、並びにこれらの保存的改変から成る群より選択され；
    （ｂ）前記ヒト軽鎖可変領域 CDR3 配列が、配列番号24、36 及び48、並びにこれらの保存的改変から成る群より選択され；
    前記ヒト抗体がヒトCD30に、少なくとも107 M-1の親和定数で結合し；
    前記ヒト抗体が抗体依存的細胞傷害性（ADCC）検定でCD30+ 腫瘍細胞の溶解を媒介し；そして
    （ｃ）前記ヒト抗体が、CD30+ 腫瘍細胞の成長をin vivoで阻害する、
    単離されたヒトモノクローナル抗体。
  12. 前記ヒト重鎖可変領域CDR2配列が、配列番号17、29 及び41、並びにこれらの保存的改変から成る群より選択され、そして前記ヒト軽鎖可変領域CDR2配列が 配列番号23、35 及び47並びにこれらの保存的改変から成る群より選択される、請求項１１に記載の単離されたヒト抗体。
  13. 前記ヒト重鎖可変領域CDR1配列が、配列番号16、28及び40、並びにこれらの保存的改変から成る群より選択され；そして前記ヒト軽鎖可変領域CDR1配列が配列番号22、34 及び 46並びにこれらの保存的改変から成る群より選択される、請求項１２に記載の単離されたヒト抗体。
  14. 少なくとも108 M-1の親和定数でヒトCD30に結合する、請求項１１に記載の単離されたヒト抗体。
  15. 少なくとも109 M-1の親和定数でヒトCD30に結合する、請求項１１に記載の単離されたヒト抗体。
  16. 前記ヒト重鎖可変領域FR1、FR2、FR3 及び FR4配列が、ヒト重鎖VH4-34 又はVH3-11 生殖細胞配列を由来とする、請求項１１に記載の単離されたヒト抗体。
  17. 前記ヒト軽鎖可変領域FR1、FR2、FR3 及び FR4配列が、ヒト軽鎖L15、A27 又はL6生殖細胞配列を由来とする、請求項１１に記載の単離されたヒト抗体。
  18. ヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を含む、単離されたヒトモノクローナル抗体であって：
    （ａ）前記ヒト重鎖可変領域が、配列番号2、6、10、並びに、配列番号2、6、及び10に少なくとも80%相同な配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み；
    （ｂ）前記ヒト軽鎖可変領域が、配列番号4、8、12、並びに、配列番号4、8、及び12に少なくとも80%相同な配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み；
    （ｃ）前記ヒト抗体が、少なくとも107 M-1 の親和定数でヒトCD30に結合し；
    （ｄ）前記ヒト抗体が抗体依存的細胞傷害性（ADCC）検定でCD30+ 腫瘍細胞の溶解を媒介し；そして
    （ｅ）前記ヒト抗体がCD30+ 腫瘍細胞の成長をin vivoで阻害する、
    単離されたヒトモノクローナル抗体。
  19. 前記抗体が少なくとも108 M-1の親和定数でヒトCD30に結合する、請求項１８に記載の単離されたヒト抗体。
  20. 前記抗体が少なくとも109 M-1の親和定数でヒトCD30に結合する、請求項１８に記載の単離されたヒト抗体。
  21. ヒト重鎖VH4-34 生殖細胞配列を由来とするヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖L15生殖細胞配列を由来とするヒト軽鎖可変領域とを含む単離されたヒトモノクローナル抗体であって、
    （ａ）前記ヒト重鎖可変領域が、配列番号10のアミノ酸配列、又は、配列番号10に少なくとも80%相同な配列、を含み；
    （ｂ）前記ヒト軽鎖可変領域が、配列番号12のアミノ酸配列、又は、配列番号12に少なくとも80%相同な配列、を含み；
    （ｃ）前記ヒト抗体が、少なくとも107 M-1の親和定数でヒトCD30に結合し；
    （ｄ）前記ヒト抗体が、抗体依存的細胞傷害性（ADCC）検定でCD30+ 腫瘍細胞の溶解を媒介し；そして
    （ｅ）前記ヒト抗体がCD30+ 腫瘍細胞の成長をin vivoで阻害する、
    単離されたヒトモノクローナル抗体。
  22. それぞれ配列番号2及び配列番号4に示されたアミノ酸配列を含むヒト重鎖及びヒト軽鎖可変領域を含む、単離されたヒトモノクローナル抗体。
  23. CD30との結合をめぐって、請求項２２に記載のヒトモノクローナル抗体と競合する、単離されたヒトモノクローナル抗体。
  24. それぞれ配列番号6及び配列番号8に示されたアミノ酸配列を含むヒト重鎖及びヒト軽鎖可変領域を含む、単離されたヒトモノクローナル抗体。
  25. CD30との結合をめぐって、請求項２４に記載のヒトモノクローナル抗体と競合する、単離されたヒトモノクローナル抗体。
  26. それぞれ配列番号10及び配列番号12に示されたアミノ酸配列を含むヒト重鎖及びヒト軽鎖可変領域を含む、単離されたヒトモノクローナル抗体。
  27. CD30との結合をめぐって、請求項２６に記載のヒトモノクローナル抗体と競合する、単離されたヒトモノクローナル抗体。
  28. ヒト重鎖導入遺伝子又はトランスクロモゾーム及びヒト軽鎖導入遺伝子又はトランスクロモゾームを含むゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物から得られたＢ細胞を、不死化細胞に融合させて調製されたハイブリドーマにより産生される、請求項１乃至２７のいずれかに記載の単離されたヒト抗体。
  29. 請求項１乃至２７のいずれかに記載のヒト抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  30. 請求項１乃至２７のいずれかに記載のヒト抗体を治療剤に連結させて含む免疫結合体。
  31. 前記治療剤が細胞毒である、請求項３０に記載の免疫結合体。
  32. 前記治療剤が放射性同位体である、請求項３０に記載の免疫結合体。
  33. 請求項３０乃至３２のいずれかに記載の免疫結合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  34. 請求項１乃至２７のいずれかに記載のヒト抗体をコードする単離された核酸分子。
  35. 前記核酸分子が、発現ベクタ内に導入されている、請求項３４に記載の単離された核酸分子。
  36. 請求項３５に記載の発現ベクタを含むトランスフェクトーマ。
  37. 前記非ヒトトランスジェニック動物が、ヒト重鎖導入遺伝子又はトランスクロモゾーム及びヒト軽鎖導入遺伝子又はトランスクロモゾームを含むゲノムを有する、請求項１乃至２７のいずれかに記載のヒト抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物。
  38. CD30発現細胞の成長が阻害されるように、有効量の請求項１乃至２７のいずれかに記載の抗体に、前記細胞を接触させるステップを含む、CD30発現細胞の成長を阻害する方法。
  39. CD30発現腫瘍細胞の成長を特徴とする疾患を治療又は予防する方法であって、請求項１乃至２７のいずれかに記載のヒト抗体を、前記疾患を治療又は予防するのに有効量、対象に投与するステップを含む、方法。
  40. 前記疾患が、ホジキン病、未分化型大細胞リンパ腫(ALCL)、成人Ｔ細胞リンパ腫 (ATL)、血管免疫芽球性リンパ節症 (AILD)様Ｔ細胞リンパ腫、HIV随伴体腔ベースのリンパ腫、胎児性癌、鼻咽頭の未分化癌 (例えばシュミンケ腫瘍)、カストルマン病、カポジ肉腫 及び他のＴ細胞又はＢ細胞リンパ腫から成る群より選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記疾患がホジキン病である、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記疾患が非ホジキン・リンパ腫である、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記非ホジキン・リンパ腫が未分化型大細胞リンパ腫 (ALCL)である、請求項３９に記載の方法。
  44. CD30発現免疫細胞が関与する自己免疫疾患を治療又は予防する方法であって、請求項１乃至２７のいずれかに記載のヒト抗体を、前記自己免疫疾患を治療又は予防するのに有効量、対象に投与するステップを含む、方法。
  45. 前記自己免疫疾患が、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、アトピー性皮膚炎、グレーブズ病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメンズ（原語：Omen's）症候群、慢性腎不全、急性感染性単核細胞症、HIV及び疱疹ウィルス随伴疾患、から成る群より選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ヒト抗体が治療剤に結合されている、請求項３８乃至４５のいずれかに記載の方法。
  47. 前記治療剤が細胞毒である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記治療剤が放射性同位体である、請求項４６に記載の方法。
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