DE19543039C1 - Rekombinante Liganden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige rekombinante DNA- Moleküle, welche für variable Immunglobulinketten oder Fragmente derselben kodieren, die Spezifität für das menschliche Zellmem­ bran-Antigen CD30 aufweisen. Die Erfindung betrifft ferner Ex­ pressionsvektoren, die diese DNA-Moleküle enthalten, sowie damit transformierte Wirtszellen, die in der Lage sind, die neuartigen Liganden zu produzieren. Darüber hinaus werden ein Verfahren zur Herstellung von Liganden der bezeichneten Spezifität unter Ver­ wendung der transformierten Wirtszellen, die daraus resultieren­ den Liganden sowie diese enthaltende diagnostische und phamazeu­ tische Präparate bereitgestellt.

Das CD30-Antigen ist ein Glykoprotein mit einer Molekülmasse von 120 kD, wenn diese durch eine SDS-Elektrophorese bestimmt wird. Das besondere an dem CD30-Antigen ist, daß es normalerweise im Organismus nur auf sehr wenigen aktivierten T-Zell- und B-Zell- Blasten und an diesen auch nur in geringer Dichte vorhanden ist (Stein et al., "Identification of Hodgkin and Sternberg-Reed cells as a unique cell type derived from a newly detected small cell population", Int. J. Cancer, 30, S. 445-459, 1982; Stein et al.,"The expression of the Hodgkin′s disease associated antigen Ki-1 in reactive and neoplastic lymphoid tissue: evidence that Reed-Sternberg and histiocytic malignancies are derived from activated lymphoid cells", Blood, 66, S. 848-858, 1985; Schwar­ ting et al., "Ber-H2: a new monoclonal antibody of the Ki-1 family for the detection of Hodgkin′s disease in formaldehyde­ fixed tissue sections (A2.13)", in: Leucocyte Typing III, White Cell Differentiation Antigens, A.J. McMichael, Hrsg., Oxford University Press, Oxford - New York - Tokyo, S. 574-575, 1987), während es aber bei einer Reihe von lymphoproliferativen Prozes­ sen und bei embryonalen Karzinomen in sehr viel höherer Konzen­ tration exprimiert wird. Zu den stark CD30-positiven malignen Lymphomen gehören in erster Linie die Hodgkin-Lymphome, das anaplastische großzellige Lymphom wie auch die akute Form der adulten T-Zell-Leukämie.

Kürzlich konnte gezeigt werden, daß das CD30-Molekül selektiv von aktivierten T_H2-Blasten (S. Romagnani, "Induction of T_H1 and T_H2 responses: a key role for the ′natural′ immune response?", Immunol. Today, 13, S. 379-381, 1992) in vitro und in vivo ex­ primiert wird (Del Prete et al., "CD30, Th2 cytokines and HIV infection: a complex and fascinating link", Immunol. To­ day,16(2): 76-80, 1995). Bei Patienten mit allergischen Erkran­ kungen war die Zahl der CD30⁺ T_H2-Blasten im Vergleich zu Normal­ personen um ein Vielfaches erhöht. Es ist daher denkbar, daß die Mehrzahl der Autoaggressionserkrankungen auf eine Fehlsteuerung der T_H-Antwort mit Vermehrung von T_H2-Zellen zurückzuführen ist.

Wegen des äußerst seltenen Vorkommens des CD30-Moleküls im nor­ malen Organismus und der hohen Expression dieses Moleküls auf den Tumorzellen der oben genannten Lymphome und des embryonalen Karzinoms sowie auf aktivierten T_H2-Blasten sind eine auf die Ex­ pression des CD30-Moleküls aufbauende Diagnostik und Therapie eine wichtige Strategie zur Erkennung und Behandlung der genann­ ten Erkrankungen.

Es sind bereits Immunotoxine versuchsweise in vivo beim Menschen angewendet worden, mit denen Hodgkin-Lymphomzellen erkannt bzw. eliminiert werden können (B. Falini et al., "Response of refrac­ tory Hodgkin′s disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin", Lancet, 339, S. 1195-1196, 1992; Falini et al., "In vivo targe­ ting of Hodgkin and Reed-Sternberg cells of Hodgkin′s disease with monoclonal antibody Ber-H2 (CD30): Immunohistological evi­ dence", Brit. J. Haematol., 82, S. 38-45, 1992).

Die primäre Diagnostik der CD30-positiven Krebsformen wird gegenwärtig immunhistologisch durchgeführt, wobei als Antikörper z.Z. ausschließlich Reagenzien der Maus wie z. B. Ber-H2 einge­ setzt werden. Bei diesem Reagenz handelt es sich um einen gegen das CD30-Molekül gerichteten monoklonalen Antikörper, der 1987 in einem Kurzbeitrag und 1989 in ausführlicher Weise von der Arbeitsgruppe der Erfinder beschrieben wurde (Schwarting et al.,"Ber-H2: a new anti-Ki-1 (CD30) monoclonal antibody directed at a formol-resistent epitope", Blood, 74, S. 1678-1689, 1989). Dieser Antikörper wird von der gleichnamigen Maus-Myelom-Hybrid­ zellinie sezerniert, die am 28.01.1992 bei der European Collec­ tion of Animal Cell Cultures (ECACC), Public Health Laboratories Service Board, 61 Collindale Avenue, London, NW9 5DF, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages unter der Hinterlegungs­ nummer Ber-H2 92012823 hinterlegt worden ist. Allerdings ist es bei der Massenproduktion dieses Antikörpers in Langzeitkultur (etwa in Fermentern) von erheblichem Nachteil, daß die Antikör­ per-produzierenden Zellen bereits nach einigen Generationen von solchen Zellen überwachsen werden, die die Fähigkeit zur Anti­ körperproduktion verloren haben, offenbar weil letztere nicht mehr in der Lage sind, schwere Immunglobulinketten oder auch schwere und leichte Immunglobulinketten zu synthetisieren.

Die Ausbreitungsdiagnostik der genannten Tumorerkrankungen er­ folgt in der Regel durch Computertomographie, Sonographie und/ oder Lymphographie. Die genannte nicht-invasive Ausbreitungs­ diagnostik ist jedoch mit dem Nachteil verbunden, daß lediglich relativ große Tumormassen identifiziert werden können, kleinere Tumore oder Metastasen jedoch nicht nachweisbar sind. Die des­ halb oft zusätzlich angewendete chirurgische Ausbreitungsdiagno­ stik ist für den Patienten sehr belastend und auf bestimmte Körperhöhlen (z. B. Bauchhöhle) beschränkt. Die gegenwärtigmedi­ zinisch ausschließlich akzeptierte und deswegen angewendete Standardtherapie der CD30-positiven Tumore erfolgt mit einer unspezifischen Radio- und/oder Chemotherapie. Obgleich die Er­ folgsrate ca. 60-70% beträgt, gibt es für die Therapieversager bisher kein kuratives Konzept.

Deshalb wurde der monoklonale Antikörper Ber-H2 mit pflanzlichen Giften konjugiert und versuchsweise zur Therapie von Patienten mit Morbus Hodgkins in terminaler Krankheitsphase eingesetzt (Falini et al., "Response of refractory Hodgkin′s disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin", Lancet, 339, S. 1195-1196, 1992). Dabei zeigten die vier behandelten Patienten innerhalb von 10 Tagen eine Tumormassenreduktion um 50% bis nahezu 100%. Allerdings kam es in allen Fällen nach unterschiedlicher Zeit zum Neuauftreten von Tumormassen an den alten und/oder neuen Lokalisationen. Eine Wiederholung der Immunotoxinapplikation war nicht möglich, weil die so behandelten Patienten ausnahmslos Antikörper gegen den Maus-Antikörper Ber-H2 gebildet hatten.

Die immunologisch begründete Problematik der in-vivo-Applikation von Maus-Antikörpern gegen das CD30-Molekül für diagnostische und therapeutische Zwecke läßt sich drastisch reduzieren, wenn anstelle des Maus-Antikörpers ein nicht oder nur geringfügig immunogenes Protein mit Spezifität für das CD30-Antigen einge­ setzt wird.

Es besteht heute die Möglichkeit, die variablen Regionen von schwerer (V_H) und leichter (V_L) Kette eines Maus-Antikörpers an die entsprechenden konstanten Regionen C_H und C_L eines mensch­ lichen Antikörpermoleküls anzufügen. Durch diese Manipulation werden die für den Menschen immunogenen Bereiche des Antikörper- Moleküls weitgehend beseitigt, während die Spezifität des ur­ spünglichen Maus-Antikörpers in dem chimären Molekül zumeist erhalten bleibt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher in der Be­ reitstellung von neuen CD30-spezifischen Substanzen mit vermin­ derter Immunogenität. Ferner soll die Instabilität der Zellinie Ber-H2 in Bezug auf die Produktion des monoklonalen Antikörpers verbessert werden.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe werden erfindungsgemäß die Gegenstände der Ansprüche 1, 6, 9, 13, 15, 25 und 26 vorgeschla­ gen, wobei bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfin­ dung in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben sind.

Erfindungsgemäß werden somit rekombinante DNA-Moleküle bereitge­ stellt, welche für variable Immunglobulinketten oder Fragmente derselben kodieren, die Spezifität für das menschliche Zellmem­ bran-Antigen CD30 aufweisen, wobei die rekombinanten DNA-Molekü­ le Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Va­ rianten derselben umfassen, die vorzugsweise vollständig oder teilweise operativ miteinander verknüpft sind. Ferner ist es bevorzugt, daß diese Sequenzen oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben operativ mit DNA-Sequenzen verknüpft sind, die für konstante Teile eines humanen oder tie­ rischen Immunglobulinmoleküls kodieren.

Nach einer weiteren Ausführungsform umfassen die rekombinanten DNA-Moleküle jeweils einen oder mehrere der hypervariablen Be­ reiche (die auch als CDR für "complementarity determining resi­ dues" bezeichnet werden) der in den SEQ ID NOS: 1 oder 3 bzw. in den SEQ ID NOS: 4 oder 6 angegebenen Sequenzen oder syngene oder allelische Varianten derselben.

Schließlich können die in den SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 angegebenen Sequenzen oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben operativ mit DNA-Sequenzen ver­ knüpft sein, die für toxische Proteine oder Enzyme kodieren.

Ferner werden erfindungsgemäß Expressionsvektoren bereitge­ stellt, die ein oder mehrere der genannten rekombinanten DNA- Moleküle in operativer Verknüpfung mit Expressionskontroll-Se­ quenzen enthalten und vorzugsweise für die Expression in Proka­ ryonten- und/oder Eukaryonten-Wirtszellen geeignet sind.

Weiterhin stellt die Erfindung Wirtszellen zur Verfügung, die mit den genannten Expressionsvektoren transfiziert sind, wobei Prokaryonten- oder Eukaryonten-Zellen in Betracht kommen, wobei die bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell­ kulturen GmbH) am 8. August 1995 unter der Zugriffsnummer DSM ACC2224 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinter­ legte Eukaryonten-Zelle CH-BerH2 bevorzugt ist.

Im übrigen wird ein Verfahren zur Herstellung von Liganden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 bereitgestellt, bei dem man eine der genannten Wirtszellen in einem geeigneten Nährmedi­ um kultiviert, anschließend die Zellen von dem Medium abtrennt und die Liganden als Expressionsprodukte aus dem Medium oder aus dem Cytoplasma der Wirtszellen isoliert. Vorzugsweise werden die Liganden anschließend gereinigt und mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen zu pharmazeutischen oder diagnostischen Präparaten formuliert.

Ferner werden rekombinante Liganden für das menschliche Zellmem­ bran-Antigen CD30 bereitgestellt, die mindestens die in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebenen Aminosäuresequenzen oder Fragmente oder allelische Varianten derselben umfassen. Vorzugs­ weise umfassen diese Liganden jeweils einen oder mehrere der hypervariablen CDR-Bereiche der in den SEQ ID NOS: 2 und/ oder 5 angegebenen Aminosäuresequenzen oder syngene oder alle­ lische Varianten derselben. Nach einer besonderen Ausführungs­ form sind in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebene Ami­ nosäuresequenzen oder Fragmente oder allelische Varianten der­ selben untereinander verknüpft. Ferner können diese Sequenzen oder Fragmente oder allelische Varianten derselben vorzugsweise mit konstanten Teilen eines humanen oder tierischen Immunglo­ bulinmoleküls verknüpft sein. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die vorstehend genannten rekombinanten Liganden peptidisch oder über Linker-Moleküle mit toxischen Proteinen oder mit Enzymen bzw. Proenzymen verknüpft, wobei die Toxine vorzugsweise in Form von Ribosomen-inaktivierenden Pro­ teinen vorliegen und die Enzyme vorzugsweise aus der Gruppe der Phosphodiesterasen ausgewählt sind. Nach einer alternativen Ausführungsform sind die vorstehend genannten rekombinanten Liganden direkt oder über Linker-Moleküle kovalent oder konju­ giert mit photoaktivierbaren Verbindungen oder mit radioaktiven Isotopen verknüpft, wobei letztere vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Indium, Jod, Yttrium, Technetium, Rhenium, Kupfer und Lutetium ausgewählt sind. Die Verknüpfung kann beispiels­ weise unter Verwendung von Chelatbildnern oder über photochemi­ sche Aktivierungsprozesse erfolgen (vgl. WO 94/04189).

Schließlich werden diagnostische oder pharmazeutische Präparate bereitgestellt, die vorzugsweise einen oder mehrere der vorste­ hend genannten oder durch das erfindungsgemäße Verfahren herge­ stellte Liganden allein oder in Kombination mit üblichen Träger­ stoffen und Verdünnungsmitteln enthalten. Diese Präparate dienen vorzugsweise der Diagnostik und/oder Behandlung von Krebs formen wie insbesondere der Hodgkinschen Erkrankung, bei denen das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 auf Zellen exprimiert wird, die für die Erkrankung von Bedeutung sind.

Zur Lösung des der Erfindung zugrunde liegenden Problems wurden ausgehend von dem Maus-Antikörper Ber-H2 die Sequenzen der va­ riablen Region der leichten (V_LJ) und schweren Ketten (V_HDJ) dieses CD30-reaktiven monoklonalen Antikörpers bestimmt. Die zugehörigen genomischen Sequenzen wurden dann mit den Sequenzen für die konstanten Regionen eines menschlichen Immunglobulinmo­ leküls verbunden. Das resultierende Konstrukt wurde in einer ge­ eigneten Zelle, vorzugsweise einer keine eigenen Immunglobulin­ ketten produzierenden Myelomzellinie, zur Expression gebracht.

Erfindungsgemäß wurde zunächst die zytoplasmatische RNA aus kultivierten, den Antikörper Ber-H2 produzierenden Zellen der Mausmyelomhybridlinie isoliert. Anschließend wurde mit Hilfe der reversen Transkriptase eine cDNA-Synthese von V_LJ und V_HDJ durch­ geführt, wobei die verwendeten, nachfolgend angegebenen Oligonu­ kleotide dem 5′-Ende der konstanten Regionen der L- bzw. H-Kette komplementär waren:

Um die cDNAs durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizieren zu können, wurden sie mit Guanosin-Trinukleotiden so verlängert, daß ein Poly-C-Anker-oligo mit der nachfolgend angegebenen Se­ quenz als 5′-Primer dienen konnte:

5′ GCGCGGCCGCGGAGGCCCCCCCCCCCCCC 3′ (AN-Poly-C).

Als 3′-Primer wurden die bereits zur cDNA-Synthese verwendeten Oligonukleotide konL1 bzw. konH1 eingesetzt. In weiteren PCR- Reaktionen wurden die cDNAs mit den nachfolgend angegebenen 3′- Oligonukleotiden konL2 bzw. konH2 sowie mit dem angegebenen Ankerprimer am 5′-Ende, die jeweils überhängende Re­ striktionsschnittstellen trugen, amplifiziert:

Zur Bestimmung der cDNA-Sequenzen wurden die erhaltenen Fragmen­ te in handelsübliche Sequenzierungsvektoren kloniert (z. B. unter Verwendung des Vektors pGEM®-11Zf(+) von Promega, Heidelberg).

Die Sequenzanalysen ergaben, daß das V-Gensegment der leichten Kette des mAk Ber-H2 mit dem J₂-Gensegement, das der schweren Kette mit dem J₃-Gensegment rekombiniert war.

Mit Hilfe dieser cDNA-Sequenzen konnten in einem weiteren Schr­ itt 5′-Primersequenzen festgelegt und synthetisiert werden, die im untranslatierten Bereich des jeweiligen Gens liegen. Da die Intronsequenzen sämtlicher J-Minigene bekannt und über Genbanken zugänglich sind, konnten hieraus ferner 3′-Primersequenzen abge­ leitet werden, die im nicht-kodierenden Bereich der DNA der Mausmyelomhybridlinie liegen. Auf diese Weise war es möglich, diese genomische DNA nach PCR-Amplifikation gerichtet zu klonie­ ren, ohne die originale Genstruktur (5′-UTR - Exon 1 - Intron - Exon 2 - J-Intron) zu verändern.

Um vollständige Sequenzen zu erhalten, wurden die V_LJ- bzw. V_HDJ- PCR-Produkte dann zunächst in geeignete Sequenzierungsvektoren kloniert und die "Insert"-Bereiche von jeweils drei Klonen voll­ ständig sequenziert. Parallel hierzu wurden die PCR-Produkte als Referenz direkt sequenziert. Nach Überprüfung des korrekten Leserahmens und des Nichtvorhandenseins von Stop-Codons inner­ halb der klonierten DNA wurde jeweils ein zu den PCR-Produkten sequenzhomologer Klon in die entsprechenden Expressionsvektoren (pUHW_q₁ bzw. pUHW_κ umkloniert. Diese Vektoren enthielten die für die konstanten Teile eines humanen Antikörpers kodierenden Se­ quenzen, ein murin/humanes Intronhybrid, einen Selektionsmarker, sowie die zur effizienten Expression notwendigen Maus-Promotor- und Enhancerelemente.

Nach Linearisierung der Plasmide wurde eine Kotransfektion bei­ der Konstrukte in Sp2/0-Ag14-Zellen (M. Shulman et al., Nature, 276, S. 269-270, 1978) durchgeführt. Diese Zellen haben die Fähigkeit verloren, eigene Immunglobulinketten zu synthetisie­ ren. Stabile Transfektanten wurden darauf durch Geneticin-Selek­ tion isoliert. Die Austestung der Kulturüberstände erfolgte mit der Immunfluoreszenztechnik auf L428KS-Zellen, einer Hodgkin­ lymphomlinie (V. Diehl et al., "Characteristics of Hodgkin′s disease-derived cell lines", Cancer Treatment Reports, 66, S. 615-632, 1982). Mehrere positive Primärkulturen wurden gefunden und jeweils kloniert und rekloniert. Zur Spezifitätsabklärung des sezernierten Antikörpers wurde untersucht, ob das Reaktions­ spektrum des chimären Proteins dem des murinen mAk Ber-H2 ent­ sprach. Sowohl ein Panel von CD30⁺- bzw. CD30⁻-Zellinien in der Immunfluoreszenz als auch die immunhistologische Austestung an humanem Morbus Hodgkin-Gewebe ergaben, daß das chimärisierte Reagenz eine mit dem ursprünglichen Maus-Antikörper Ber-H2 ver­ gleichbare Spezifität aufweist.

Der Vorteil der hier dargelegten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. ihrer Produkte gegenüber dem Stand der Technik besteht zum einen in der weit geringeren Immunogenität im menschlichen Kör­ per und zum anderen in deren vielfältigen Manipulationsmöglich­ keiten, die sich aufgrund der Kenntnis der DNA-Sequenzen erge­ ben. So ist es z. B. möglich, ein Protein mit CD30-Spezifität in Bakterien oder Insektenzellen mit viel niedrigeren Kosten herzu­ stellen, als in der konventionellen Zellkultur. Die Kenntnis der Sequenzen ermöglicht auch die Kopplung mit anderen DNA-Sequen­ zen, die für aktivierende oder toxische Proteine, Enzyme oder Liganden von Abwehrzellen kodieren. Ferner können Fragmente der Gesamtsequenzen wie z. B. isolierte hypervariable Regionen für die Synthese entsprechender Proteinfragmente eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen veranschaulicht.

Beispiel 1 Isolierung von Nukleinsäuren aus Myelomhybridzellen

Etwa 2 × 10⁸ Zellen der Mausmyelomhybridlinie Ber-H2 wurden mittels Zentrifugation pelletiert, in 100 µl PBS resuspendiert und in 4 ml GT-Puffer (enthaltend 4 M Guanidiniumisothiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, 0,5% Natriumlaurylsarcosin, 100 mM β-Mer­ captoethanol, pH-Wert 7,0) lysiert. Die erhaltene Suspension wurde auf einen Cäsiumchlorid-Gradienten geladen, welcher 2 ml 5,7 M Cäsiumchlorid, 1,5 ml 40% (Gew./Vol.) CsCl, 1,5 ml 30% (Gew./Vol.) CsCl und 1 ml 20% (Gew./Vol.) CsCl enthielt. Nach einer 20 Stunden langen Zentrifugation mit 35 000 UpM bei 15°C wurde die pelletierte cytoplasmatische RNA gewonnen, in destil­ liertem Wasser gelöst, durch PIC-Extraktion (50 Vol.-% Phenol, 48 Vol.-% CHCl₃, 2 Vol.-% Isoamylalkohol) aufgereinigt und mit Ethanol gefällt. Die Präzipitate wurden bis zur weiteren Ver­ arbeitung bei -80°C aufbewahrt.

Beispiel 2 cDNA-Synthese

Ein etwa 100 µg RNA entsprechendes Volumen des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Präzipitats wurde zur cDNA-Synthese eingesetzt. Das Präzipitat wurde 15 Minuten lang bei 4°C mit 14 000 UpM zentri­ fugiert, mit 300 µl 70%-igem Ethanol gewaschen, und die RNA wurde in 15 µl H₂O gelöst. Nachfolgend wurde der Ansatz 20 Minu­ ten lang bei 45°C mit 375 µl DMSO denaturiert, mit Ethanol ge­ fällt und nach 15 Minuten langer Zentrifugation bei 4°C und 14 000 UpM und nach Waschung mit 70% Ethanol in 5× RT-Puffer gelöst.

Der Reaktionsansatz für die Reverse Transkriptase enthielt je 1 mM der vier dNTP′s, 1 µg c_κ- bzw. c_γ-Primer, 1000 Einheiten MMLV-Reverse Transkriptase (BRL), 20 µCi [³²P]dCTP, 2 Einheiten RNAse Block 2 (Stratagene) und H₂O bis zu einem Endvolumen von 100 µl. Der Ansatz wurde 90 Minuten lang bei 37°C inkubiert und anschließend wurde die RNA 30 Minuten lang bei 42°C mit 50 µg RNAse behandelt. Nach PIC-Extraktion, Fällung, Zentrifugation und Waschen der cDNA gemäß Beispiel 1 wurde der Niederschlag in 8 µl H₂O gelöst, mit 8 µl denaturierendem Laufpuffer vermischt und auf ein Polyacrylamid-Harnstoff-Gel aufgetragen und 2 Stun­ den lang bei 54°C und 2500 V aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel 12 Stunden lang bei -80°C auf einem Röntgenfilm exponiert. Die im Autoradiogramm den V_LJ- bzw. V_HDJ-Fragmenten entsprechen­ den Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit 500 ml NH₄OAc bei 37°C eluiert. Die Eluate wurden anschließend mit Ethanol gefällt und nach Zentrifugation und Waschen der DNA gemäß Beispiel 1 in 10 µl H₂O gelöst.

Der Ansatz für die anschließende "Tailing"-Reaktion der cDNA enthielt 1 mM dGTP, 100 mM Na-Cacodylat, 1 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM CoCl₂, 2 µg BSA, 33 Einheiten terminale Desoxynukleotidyl­ transferase (BRL), 5 µl cDNA und Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 µl. Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37°C durch­ geführt. Nach PIC-Extraktion, Ethanolfällung und Waschen der Nukleinsäure gemäß Beispiel 1 wurde die erhaltene DNA nach Lösen in 20 µl Wasser und Herstellung einer Verdünnungsreihe dem an­ schließenden PCR-Verfahren zugeführt.

Beispiel 3 PCR-Verfahren

Die DNA aus Beispiel 2 wurde mit Hilfe eines Poly-C-Anker-Pri­ mers (AN-Poly-C) sowie des entsprechenden 3′c-Primers (konL1 bzw. konH1) in einer ersten PCR-Reaktion amplifiziert, wobei sich der Buchstabe c auf den konstanten Bereich bezieht. Der Reaktionsansatz enthielt 10 ng des Primers AN-Poly-C-Oligo, 100 ng Ankerprimer, 100 ng konL1- bzw. konH1-Oligo, 2 µl 10× PCR-Puffer (2 mM dNTP′s, 10 mM MgCl₂, 100mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH-Wert 8,4), 2 Einheiten Taq-Polymerase, 5 µl cDNA und Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 µl. Die Reaktion erfolgte nach dem folgenden PCR-Programm: 5 Minuten 94°C, 5 Zyklen von jeweils 1 Minute 94°C, 2 Minuten 42°C, 1 Minute 72°C, 30 Zyklen von jeweils 1 Minute 94°C, 1 Minute 42°C, 1 Minute 72°C und 10 Minuten 72°C.

Die auf diese Weise erhaltenen DNA-Moleküle wurden auf ein Aga­ rosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die mit V_k bzw. V_γ korrespondierenden Banden wurden ausgeschnitten und in 100 µl H₂O 12 Stunden lang bei 4°C eluiert. Anschließend erfolgte eine zweite PCR-Reaktion mit einer Verdünnungsreihe der aus dem Gel eluierten DNA wie oben beschrieben, jedoch mit der Abwei­ chung, daß 3′c-Primer (konL2 bzw. konH2) eingesetzt wurden, die Restriktionsschnittstellen-Überhänge an den 5′-Enden aufwiesen.

Beispiel 4 Klonierung der cDNA

Zunächst wurde sowohl der Vektor pGEM®-11Zf(+) (Promega, Heidel­ berg) als auch die erhaltene cDNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach Dephospho­ rylierung des Plasmids mit 2 × 4 Einheiten Kälberdarm-Phosphata­ se (20 Minuten 37°C, 10 Minuten 70°C) wurden Vektor und cDNA auf einem Agarose- bzw. Polyacrylamidgel aufgetrennt, anschließend auf eine NA-45-Membran (Schleicher & Schüll, Dassel) transfe­ riert und 30 Minuten lang bei 65°C mit 1M NaCl in 1× TE eluiert. Die Eluate wurden gemäß Beispiel 1 mit Ethanol gefällt, zentri­ fugiert, gewaschen und in H₂O gelöst. Die anschließende Liga­ tionsreaktion erfolgte 12 Stunden lang bei 16°C, wobei der An­ satz 2 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Boston, USA), 1 mM ATP und 5× Ligasepuffer enthielt und das molare Ver­ hältnis von Plasmid zu cDNA 1 : 2 betrug. Der Ligationsansatz wurde anschließend zur Transformation kompetenter E. coli-Bakte­ rien (XL 1 blue) mit 200 µl Bakteriensuspension vermischt und zunächst 30 Minuten lang bei 0°C, dann 2 Minuten lang bei 42°C, dann 5 Minuten lang bei 0°C und schließlich nach Zugabe von 1 ml LB-Medium 1 Stunde lang bei 37°C im Schüttler inkubiert. Jeweils 200 µl des Ansatzes wurden auf antibiotikahaltige Agarplatten ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die entstandenen Einzelkolonien wurden nun in LB-Ampicillin-Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C im Schüttler inkubiert.

Mit der auf diese Weise erhaltenen Bakterienkultur wurde sodann eine Plasmidpräparation durchgeführt und der Klonierungserfolg wurde nach Restriktionsverdau und anschließendem Auftragen des Ansatzes auf ein Agarosegel überprüft. Die positiven Klone wur­ den anschließend zur Sequenzierung 30 Minuten lang bei 37°C mit 0,2N NaOH alkalisch denaturiert. Nach Ethanolfällung, Zentrifu­ gation und Waschen des Niederschlags gemäß Beispiel 1 wurde die DNA gelöst und ein Aliquot zur Mengenabschätzung auf ein Aga­ rosegel geladen.

Beispiel 5 Sequenzierung der DNA-Fragmente

Die Sequenzierung der klonierten cDNA sowie der genomischen DNA erfolgte nach der Methode von Sanger (F. Sanger, S. Nicklen und A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74 : 546 (1977)) mit dem Sequenase-Kit-Version 2.0 (United States Biochemical, USA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Gelelektropho­ resen erfolgten bei 54°C und einer Spannung von 1500 V.

Mit Hilfe der cDNA-Sequenzen wurden in einem zweiten Schritt Primersequenzen festgelegt und synthetisiert, um die genomische DNA zu amplifizieren. Hierbei wurden die nachfolgend angegebenen 5′-Oligonukleotide

so gewählt, daß sie im Bereich der 5′-untranslatierten Regionen binden. Die 3′-Primer

wurden anhand der Information über das jeweils rekombinierte J- Minigen im entsprechend zugehörigen invarianten J-Intron ausge­ wählt. Die Primer enthielten außerdem die zur Klonierung in Ex­ pressionsvektoren notwendigen Restriktionsschnittstellen. Die genomische DNA wurde mit Hilfe dieser Primer amplifiziert. Die PCR-Reakton (5 µl 10× PCR-Puffer (1,5 mM MgCl₂, 200 mM dNTP′s, 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3), 2,5 Einheiten Taq- Polymerase (Perkin Elmer, Überlingen), je 5 µM Primer, 5 µl genomische DNA einer Verdünnungsreihe, ad 50 µl H₂O) wurde mit folgendem Programm durchgeführt: 5 Minuten 95°C, 26 Zyklen von jeweils 1 Minute 94°C, 2 Minuten 55°C, 2 Minuten 72°C, 7 Minuten 72°C.

Um vollständige Sequenzen zu erhalten, wurden die VJ- bzw. VDJ- PCR-Produkte zunächst in Sequenzierungsvektoren klo­ niert (pGEM®-5Zf(+), Promega, Heidelberg) und jeweils 3 Klone vollständig (nach Beispiel 5) sequenziert. Parallel hierzu wurde das PCR-Produkt als Referenz direkt sequenziert (Cycle-Sequen­ cing-Kit, Perkin Elmer, Überlingen). Nach Überprüfung des kor­ rekten Leserahmens und des Nichtvorhandenseins von Stop-Codons innerhalb der klonierten DNA wurde jeweils ein zum PCR-Produkt sequenzhomologer Klon in den entsprechenden Expressionsvektor umkloniert. Diese Vektoren enthielten die für die konstanten Teile eines humanen Antikörpers kodierenden Sequenzen, ein mu­ rin-humanes Intronhybrid, einen Selektionsmarker sowie die zur Expression notwendigen Maus-Promotor- und Enhancerelemente.

Beispiel 6 Umklonierung in Expressionsvektor und Expression des chimären Proteins

Zur Umklonierung wurden sowohl von den pGEM®-5-Konstrukten gemäß Beispiel 5 als auch von den Expressionsvektoren pUHW_κ bzw. pUHW_q₁ (W. Weissenhorn et al., Gene, 106, S. 273-277, 1991) je ca. 1 µg DNA mit den Restriktionsenzymen SalI und NotI geschnitten. Nach der Restriktion wurde der Ansatz auf ein Polyacrylamidgel ge­ laden und elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden, die dem VJ- bzw. VDJ-Gen entsprachen, wurden gemäß Beispiel 4 aus dem Gel isoliert. Der Restriktionsverdau, die Aufreinigung und De­ phosphorylierung der Vektoren, die Ligation und Transformation sowie die Anzucht der Bakterienkultur erfolgte ebenfalls gemäß Beispiel 4. Nach Plasmidaufarbeitung und Restriktionsverdau wurde von je einem positiven Klon eine 100 ml umfassende Bakte­ rienkultur bei 37°C angezogen. Die zur Transfektion benötigte Plasmid-DNA wurde mit dem Quiagen-Plasmid-Midi-Kit (Quiagen GmbH, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers aus den Bakterien isoliert und aufgereinigt.

Die vorbereiteten Plasmide für leichte und schwere Ketten wurden zur stabilen Transfektion mit den Restriktionsenzymen EcoRI bzw. PvuI linearisiert, gereinigt, und zur Mengenabschätzung wurde ein Aliquot auf ein Agarosegel aufgetragen. Die Transfektion erfolgte unter Anwendung des Gene-Pulser-Geräts (Biorad, Mün­ chen): jeweils ca. 4 µg Plasmid und 1× 10⁶ Sp2/0-Maus-Myelomhy­ brid-Zellen wurden in 1× HeBs (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5mM KCl, 700 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,5) mit 940 µF und 270 V. gepulst, bevor die Zellen in einer Dichte von 1× 10⁵ Zellen/ml in Dulbec­ co′s Modified Eagle′s Medium unter Zusatz von 10% foetalem Kälberserum ausgesät wurden. Für die Selektion positiver Klone wurde dem Medium 48 Stunden nach der Aussaat das Antibiotikum G418 in einer Konzentration von zunächst 800 µg/ml zugegeben, wobei die Konzentration allerdings nach 12 Tagen auf 1200 µg/ml erhöht wurde. Nach 15 Tagen konnten Primärkulturen, deren Kul­ turüberstände mit L428KS-Zellen in der indirekten Immunfluores­ zenz reagierten, identifiziert werden. Diese Transfektanten wurden kloniert, rekloniert und Überstände mit Hilfe eines Durchflußcytometers wiederum auf L428KS-Zellen analysiert. Ein­ zelne Überstände wurden auch gegenüber CD30-negativen Zellen, z. B. der Zellinie KG-1, untersucht, eine Reaktion konnte erwar­ tungsgemäß nicht nachgewiesen werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (28)

1. Rekombinante DNA-Moleküle, welche für variable Immunglobu­ linketten oder Fragmente derselben kodieren, die Spezifität für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 aufweisen, wobei die rekombinanten DNA-Moleküle Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben umfassen, und wobei die SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und 6 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Rekombinante DNA-Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie jeweils einen oder mehrere der hypervaria­ blen Bereiche der in den SEQ ID NOS: 1 oder 3 bzw. in den SEQ ID NOS: 4 oder 6 angegebenen Sequenzen oder syngene oder allelische Varianten derselben umfassen, wobei die SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und 6 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

3. Rekombinante DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dies Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Frag­ mente oder syngene oder allelische Varianten derselben ope­ rativ miteinander verknüpft sind, wobei die SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und 6 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

4. Rekombinante DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 bis 3, da­ durch gekennzeichnet, daß die Sequenzen gemäß einer oder mehrerer der SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 oder deren Frag­ mente oder syngene oder allelische Varianten derselben ope­ rativ mit DNA-Sequenzen verknüpft sind, die für konstante Teile eines humanen oder tierischen Immunglobulinmoleküls kodieren, wobei die SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und 6 Bestand­ teil dieses Anspruchs sind.

5. Rekombinante DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 bis 4, da­ durch gekennzeichnet, daß die in den SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und/oder 6 angegebenen Sequenzen oder deren Fragmente oder syngene oder allelische Varianten derselben operativ mit DNA-Sequenzen verknüpft sind, die für toxische Proteine oder Enzyme kodieren, wobei die SEQ ID NOS: 1, 3, 4 und 6 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

6. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein oder mehrere der rekombinanten DNA-Moleküle nach den Ansprüchen 1 bis 5, operativ verknüpft mit Expressionskontroll-Sequenzen, enthält.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er für die Expression in einer Prokaryonten-Wirtszelle geeignet ist.

8. Expressionsvektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er für die Expression in einer Eukaryonten-Wirtszelle geeignet ist.

9. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem der Vektoren nach den Ansprüchen 6 bis 8 transformiert ist.

10. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Prokaryonten-Zelle ist.

11. Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Eukaryonten-Zelle ist.

12. Wirtszelle nach Anspruch 11 mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2224.

13. Verfahren zur Herstellung von Liganden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der Wirtszellen nach den Ansprüchen 9 bis 12 in einem geeigneten Nährmedium kultiviert, anschließend die Zellen von dem Medium abtrennt und die Liganden als Expressions­ produkte aus dem Medium oder aus dem Cytoplasma der Wirts­ zellen isoliert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Liganden anschließend reinigt und mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen zu pharmazeutischen oder diagnostischen Präpraten formuliert.

15. Rekombinante Liganden für das menschliche Zellmembran-Anti­ gen CD30, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 angegebenen Aminosäurese­ quenzen oder Fragmente oder allelische Varianten derselben umfassen, wobei die SEQ ID NOS: 2 und 5 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

16. Rekombinante Liganden nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich­ net, daß sie jeweils einen oder mehrere der hypervariablen CDR-Bereiche der in den SEQ ID NOS: 2 und/oder 5 ange­ gebenen Aminosäuresequenzen oder syngene oder allelische Varianten derselben umfassen, wobei die SEQ ID NOS: 2 und 5 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

17. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 oder 16, da­ durch gekennzeichnet, daß in den SEQ ID NOS: 2 und/ oder 5 angegebene Aminosäuresequenzen oder Fragmente oder allelische Varianten derselben untereinander verknüpft sind, wobei die SEQ ID NOS: 2 und 5 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

18. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 oder 16, da­ durch gekennzeichnet, daß in den SEQ ID NOS: 2 und/ oder 5 angegebene Aminosäuresequenzen oder Fragmente oder allelische Varianten derselben mit konstanten Teilen eines humanen oder tierischen Immunglobulinmoleküls verknüpft sind, wobei die SEQ ID NOS: 2 und 5 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

19. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie peptidisch oder über Linker-Moleküle mit toxischen Proteinen oder mit Enzymen bzw. Proenzymen verknüpft sind.

20. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Toxinen in Form von Ribosomen­ inaktivierenden Proteinen verknüpft sind.

21. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Enzymen aus der Gruppe der Phos­ phodiesterasen verknüpft sind.

22. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie direkt oder über Linker-Moleküle kovalent oder konjugiert mit radioaktiven Isotopen verknüpft sind.

23. Rekombinante Liganden nach Anspruch 22, dadurch gekennzeich­ net, daß die radioaktiven Isotope aus der Gruppe bestehend aus Indium, Jod, Yttrium, Technetium, Rhenium, Kupfer und Lutetium ausgewählt sind.

24. Rekombinante Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie direkt oder über Linker-Moleküle kovalent oder konjugiert mit photoaktivierbaren Verbindungen verknüpft sind.

25. Diagnostische oder pharmazeutische Präparate, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie einen oder mehrere der Liganden nach den Ansprüchen 15 bis 24 allein oder in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und Verdünnungsmitteln enthalten.

26. Diagnostische oder pharmazeutische Präparate, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie einen oder mehrere Liganden herge­ stellt nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 13 oder 14 allein oder in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und Verdünnungsmitteln enthalten.

27. Verwendung der Präparate nach den An­ sprüchen 25 oder 26 zur Diagnostik und/oder Behandlung von Krebsformen, bei denen das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 gebildet wird.

28. Verwendung der Präparate nach Anspruch 27 zur Diagnose und/oder Behandlung der Hodgkinschen Erkran­ kung.