KR20070083899A

KR20070083899A - Ｃｄ30 양성 림프종의 치료 방법

Info

Publication number: KR20070083899A
Application number: KR1020077009968A
Authority: KR
Inventors: 티보르 켈러; 엘케 포게 본 스트란드만; 안드레아스 엔게르트; 피터 보르흐만; 보리스 뵈엘
Original assignee: 메다렉스, 인코포레이티드
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2007-08-24
Also published as: EP1802345A2; AU2005292227A1; IL182260A0; CA2582016A1; US20060177442A1; ZA200703154B; WO2006039644A2; JP2008514730A; WO2006039644A3; MX2007003533A; BRPI0516727A; CN101056655A; NO20071714L; US7790160B2

Abstract

CD30 발현을 특징으로하는 림프종을 항-CD30 항체 및 프로테아좀 억제제를 조합 사용하여 치료하는 방법이 제공된다.

항-CD30 항체, 프로테아좀 억제제

Description

ＣＤ30 양성 림프종의 치료 방법{METHODS OF TREATING CD30 POSITIVE LYMPHOMAS}

CD30 세포 표면 분자는 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R) 슈퍼패밀리의 일원이다. 이 과의 분자들은 구성원간에 가변적인 상동성을 가지며, 신경 성장 인자 수용체(NGFR), CD120(a), CD120(b), CD27, CD40, CD95, OX40, Fas, TNF-Rl 및 TNF-R2를 포함하고, 이들은 환경으로부터 세포 조절 면역 반응으로 신호를 전달하는 주요 조절 분자이다(1, 2). 이들 분자는 전형적으로 세포질외 영역에 다중 시스테인-풍부 반복부를 갖는 것을 특징으로 한다[참조: de Bruin, P. C, et al. Leukemia 9:1620-1627 (1995)]. 이 과의 구성원들은 림프구의 증식과 분화를 조절하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 여겨진다.

CD30는 중앙 힌지(hinge) 서열과 함께 6개(인간) 또는 3개(쥐 및 래트)의 시스테인-풍부 반복부를 갖는 타입 I 막횡단 당단백질이다. CD30는 90 kDa의 세포간 전구 단백질로부터 발달하는 120 kDa 막 분자로 존재한다. 이는 약 90 kDa의 가용성 단백질(sCD30)로 세포 표면으로부터 떨어져나온다. sCD30가 떨어져나오는 것은 생활성있는 CD30 세포의 활성 과정으로서, 단지 죽어가거나 죽은 세포로부터의 방출에 의해 일어나는 것이 아니다. CD30 단백질을 코딩하는 cDNA는 HLTV-1 인간 T-세포주 HUT-102의 발현 라이브러리로부터 모노클로날 항체 Ki-1 및 Ber-H2로 면역 스크리닝하여 클로닝되었다[참조: Schwab, U., et al., Nature 299:65 (1982)]. 마우스 및 래트 CD30 cDNA는 각각 498 및 493개의 아미노산을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 인간 CD30 cDNA는 시스테인 풍부 도메인의 하나로부터 부분적으로 중복되는, 추가로 90개의 아미노산을 코딩한다. CD30 유전자는 인간에서는 1p36에, 래트에서는 5q36.2에 지도화되었다.

CD30는 활성화된 림프양 세포에 의해 우선적으로 발현된다. 세포 표면 수용체는, 호지킨 병(Hodgkin's disease)의 호지킨(Hodgkin) 및 리드-스테른버그(Reed-Sternberg) 세포상에 발현되는 항원과 반응성인 모노클로날 항체 Ki-1에 의해 최초로 확인되었다[참조: Schwab et al., Nature 299:65 (1982)]. 따라서, CD30는 호지킨 림프종 및 관련된 혈액학적 악성 병증의 임상적 표지로서 널리 사용된다[참조: Froese et al., J. Immunol. 139:2081 (1987); Carde et al., Eur. J. Cancer 26:474 (1990)]. 림프양 세포에서 CD30를 자극하는 것이 세포 유형, 분화 단계 및 다른 자극의 존재 여부에 따라 증식, 활성화, 분화 및 세포 사멸을 포함하는 다상유전성 생물학적 효과를 유도한다는 것이 후에 알려졌다[참조: Gruss, H.J. et al., Blood 83:2045-2056 (1994)]. 악성 세포 상에서 CD30 수용체의 과다발현은 HD-유도 세포에서 NF-κB의 활성화에 기인하여 생존 및 아폽토시스 저항에 기여하는 것으로 믿어진다(3-5).

CD30는 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 퇴행성 대세포 림프종 (ALCL), 피부 T-세포 림프종, 소결절 소형 절단-세포 림프종, 림프구성 림프종, 말단 T-세포 림프종, 레너트 림프종(Lennert's lymphomas), 면역아세포성 림프종, T-세포 백혈 병/림프종(ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 및 중심아세포/중심세포(cb/cc) 포상 림프종을 포함하는 소분류의 비-호지킨 림프종(NHL) 상에 발현될 뿐만 아니라[참조: Stein et al., Blood 66:848 (1985); Miettinen, Arch. Pathol. Lab. Med. 116:1197 (1992); Piris et al., Histopathology 17:211 (1990); Burns et al., Am. J. Clin. Pathol. 93:327(1990); and Eckert et al., Am. J. Dermatopathol. 11:345 (1989)], 인간 T-세포 림프주향성 바이러스 I 또는 II 형질전환된 T-세포, 및 엡슈타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 형질전환된 B-세포와 같은 몇몇 바이러스 형질전환주 상에서도 발현되는 것으로 알려졌다[참조: Stein et al., Blood 66:848 (1985); Andreesen et al., Blood 63:1299 (1984)]. 또한, CD30 발현은 배아성 암, 비배아선 암, 악성 흑색종, 간엽조직 종양, 및 분화 후기의 골수 세포주 및 대식세포에서 일어나는 것으로 보고되었다[참조: Schwarting et al., Blood 74:1678 (1989); Pallesen et al., Am J. Pathol. 133:446 (1988); Mechtersheimer et al., Cancer 66:1732 (1990); Andreesen et al., Am. J. Pathol. 134:187 (1989)].

나이가 들었거나 HD 단계가 진전된 HD 환자의 약 20 내지 30%는 최초 치료 후에 재발할 것이다. 이들 환자 중, 자가 줄기 세포 이식과 병행되는 고용량의 약물 요법으로 구성되는 샐비지(salvage) 요법을 수행하면, 추가로 40 내지 60%가 치료될 수 있을 것이다. 여러 단일 약물 요법, 예를 들어, 경구용 에토포사이드(etoposide), 클로람부실(chlorambucil), 빈블라스틴(vinblastine), 젬시타바인(gemcitabine), 비노렐바인(vinorelbine)은 이식에 실패하거나 수 개월 또는 수 년 동안 이식에 부적합한 환자의 증상을 완화시킬 수 있을 것이다[참조: Devizzi et al., Annals of Oncology 5: 817-820, 1994]. 보다 최근에 개발된 샐비지 요법으로서, 예를 들어, 프로테아좀 억제제, 항-CD30 항체, 및 독실, 나벨바인, 젬시타바인 등의 병용 요법은 몇몇 예외적인 경우를 제외하고는 CD30 양성 림프종을 치료하는데 있어서 대부분 효과가 없다.

정상인 개인에 있어서는 CD30-양성 세포의 퍼센트가 아주 작기 때문에, 종양 세포에서 CD30의 발현은 CD30-양성 신생 세포에 대항하도록 치료제를 특이적으로 유도하는 항체 매개 치료법에 있어서 종양 세포가 중요한 표적이 되게 한다[참조: Chaiarle, R., et al., Clin. Immunol. 90(2):157-164 (1999)]. 그러나, 이제까지 얻어진 결과가 CD30를 면역치료법의 유용한 표적으로서 확실히 하고 있는 반면, 현재 이용하고 있는 쥐 및 키메라 항체가 이상적인 치료제가 되지 못한다는 것을 보여준다. 완전한 인간 항-CD30 모노클로날 항체 5F11은 ALCL 및 각종 HD-유도 세포주에 대하여 생체내 및 시험관내에서 유효한 것으로 나타났다(17). 완전한 인간 항체가 쥐 및 키메라 항-CD30 항체에 비하여 개선된 효능을 가짐에도 불구하고, CD30 양성 표적 세포의 5F11에 대한 감수성의 변화가 관찰되었다. CD30 양성 림프종의 원인이 되는 CD30-발현 세포를 사멸시키는 항체의 능력을 개선시키는 것이 바람직할 것이다.

따라서, CD30에 의해 매개되는 질병의 치료 및 예방에 효과적인, CD30에 대한 개선된 치료용 항체가 필요하다.

[발명의 요약]

본 발명에서, NF-kB 활성화에 대한 5F11의 효과는 아폽토시스 저항의 메카니 즘을 연구하기 위하여 각종 HD-유도 세포주에서 연구되었다. 본 발명은 시험관내 및 피하 인간 호지킨 종양 모델 모두에서, NF-κB 활성화를 억제하는 것으로 알려진 프로테아좀 억제제인 보르테조밉(bortezomib)과 병용시에 5F11의 개선된 효능을 증명한다.

따라서, 본 발명은 CD30 양성 림프종이 있는 환자에게 NF-kB 활성 억제제, 예를 들어, 프로테아좀 억제제와 병행하여 치료 유효량의 항-CD30 모노클로날 항체를 투여하여, 상기 CD30 양성 림프종 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

하나의 실시 태양에서, 항-CD30 항체와 동시에 또는 항-CD30 항체 투여 후 적어도 1일 이내에 프로테아좀 억제제를 투여하며, 이 때 항체 투여량은 1 mg/kg 내지 25 mg/kg으로, 프로테아좀 억제제 투여량은 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 한다.

또 다른 실시 태양에서, 항-CD30 항체를 프로테아좀 억제제를 투여하기 적어도 1일 전에 투여하며, 이때 항체 투여량은 1 mg/kg 내지 25 mg/kg으로, 프로테아좀 억제제 투여량은 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 한다.

또 다른 실시 태양에서, 항-CD30 항체를 프로테아좀 억제제를 투여하기 적어도 1 주일 전에 투여한다. 이러한 실시 태양의 또 다른 국면은, 항-CD30 항체를 프로테아좀 억제제를 투여하기 전에 매주 적어도 1회식 12주까지 투여하며, 이 때 항체 투여량은 1 mg/kg 내지 25 mg/kg으로, 프로테아좀 억제제 투여량은 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 하는 것이다.

또 다른 실시 태양에서, 항-CD30 항체를 1회의 대용량, 예를 들어, 10 내지 25 mg/kg으로 투여하며, 이어서 프로테아좀 억제제를 항체 투여 후 1주 까지 적어도 1회; 항체 투여 후 2주 까지 적어도 1회; 항체 투여 후 3주 까지 적어도 1회; 항체 투여 후 4주 까지 적어도 1회; 항체 투여 후 1월 까지 적어도 1회; 항체 투여 후 2월 까지 적어도 1회; 또는 항체 투여 후 3월 까지 적어도 1회 투여한다.

본 발명의 다른 특징과 장점은 하기 상세한 설명과 실시예에 의해 명확해질 것이며, 실시예가 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 출원의 내용은 언급됨으로써 본 명세서에 명백히 포함되는 것으로 간주되어야 한다.

도 1은 5F11 및 MGl32로 처리한 후 L540 세포에서 아폽토시스의 유도에 관한 그래프이다. L540 세포를 PBS(대조), 교차결합된 5F11, MGl32 또는 5F11과 MG132의 조합물과 함께 16시간 동안 배양하였다. 아폽토시스 세포를 어넥신V-FITC 염색으로 표지하고, 생활성 및 아폽토시스 세포의 백분율을 FACS 분석에서 평가된대로 제시하였다. 3회의 독립적인 실험의 결과를 나타냈다.

도 2는 교차결합된 5F11 및 MGl32가 CD30 발현 세포주의 생활성을 감소시킨다는 것을 보여준다. XTT-검정은 5F11의 존재(다이아몬드) 또는 부재(삼각형)하에 증가량의 보르테조밉에 노출된 후 호지킨 세포주 L540(A), L428(B), ALCL 세포주 카르파스(Karpas) 299(C) 및 CD30 음성 세포주 REH(E)의 생활성을 보여준다. 독성 농도 미만의 5F11 및 교차결합 GaH 항체를 증가하는 양의 보르테조밉과 병용하였다. 세포를 보르테조밉을 가하기 전에 항체들과 30분간 프리-인큐베이션하였다. 세포 생활성을 48시간 인큐베이션한 후에 평가하였다. CD30-발현 세포에 있어서, 보르테조밉의 IC₅₀은 5F11의 존재하에 감소하였다. 5F11을 가하기 전에 세포를 보르테조밉과 30분간 프리-인큐베이션한 경우에는 L428 세포(D)에 대한 보르테조밉의 세포독성을 증가시키지 않았다. 대조 실험(5F11 다이아몬드) 및 염소 -항-인간 항체(화살표) 및 5F11 + GaH (원)의 결과를 나타냈다. 수치는 3회의 독립된 실험의 결과이다.

도 3은 SCID 마우스에서 5Fll과 보르테조밉이 피하 L540Cy 호지킨 종양의 성장에 미치는 효과를 도시한 것이다. L540 유도 종양의 부피가 약 100 mm³이 되었을 때 마우스를 무작위로 네 개의 그룹으로 나누고, PBS, 5F11(100 μg), 보르테조밉(10 ng) 또는 5F11과 보르테조밉의 조합물을 투여하였다. 각 마우스의 종양 부피가 주어졌다. 화살표는 처리일을 나타낸다. 독립적인 실험에서, 이들 결과는 5F11 및 5F11+보르테조밉 그룹 각각 4 마리에 대해서 얻어진 것이다(데이타는 표시하지 않음).

도 4는 5F11 및 보르테조밉이 NF-κB의 세포내 분포 및 전사 활성에 미치는 영향을 도시한 것이다. L428 세포를 각각 리포터 구조물 pCMV-luc(형질도입 대조) 또는 pNF-κB-luc(막대 2 내지 4) 또는 pNF-κB-luc와 발현 벡터 IkB-M(막대 5 내지 7)로 형질도입하였다. 형질도입 효율은 약 10 %였으며, DNA 총량은 일정하게 유지되었다. 하룻 밤 지나 회수한 후에, 형질도입주를 PBS(기본값), 5F11 또는 보르테조밉으로 24 시간 동안 처리하였다. 세포의 루시퍼라제 활성(RLU)을 측정하였 으며, 이값은 NF-κB-의존적 프로모터 활성의 상대적 수준을 나타내는 것이다.

본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 우선 용어들을 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명을 통하여 설명될 것이다.

"CD30" 및 "CD30 항원"은 본 명세서에서 교환적으로 사용되며, 세포에 의해 천연적으로 발현되는 인간 CD30의 임의의 변형체, 이소형 및 종 동족체를 포함한다. 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 항체가 CD30-항원에 결합하는 것은 CD30 리간드가 CD30에 결합하는 것을 억제 또는 차단함으로써 CD30 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)의 성장을 억제한다. "CD30 리간드"란 CD30에 대한 모든(예를 들어, 생리학적) 리간드를 포함한다. 바람직한 실시 태양에서, CD30 리간드는 CD30L, CD153, TRAFl, TRAF2, TRAF3 또는 TRAF5이다. 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 항체가 CD30-항원에 결합하는 것은 이펙터 세포의 식작용 및/또는 CD30 발현 세포의 사멸을 매개한다. 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 항체가 CD30-항원에 결합하는 것은 CD30 발현 세포에 대한 이펙터 세포의 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 매개한다.

본 명세서에서, (예를 들어, 세포와 관련하여) "성장을 억제한다"라 함은 세포를 항-CD30 항체와 접촉시킬 때, 그 세포를 항-CD30 항체와 접촉시키지 않았을 때와 비교하여 세포의 성장에 있어서 측정가능한 정도의 감소를 나타내는 것을 포함하는 의미이며, 예를 들어, 세포 성장의 억제는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 이상, 또는 100%일 수 있다.

"면역 반응"이란, 예컨대, 침입하는 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역이나 병적 염증의 경우에는 정상 인간 세포 또는 조직에 선택적으로 손상을 가하거나, 그들을 파과하거나 인체 밖으로 제거해내는 결과를 가져오는, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 면역 관련 세포 또는 간에서 생산되는 가용성 거대 분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 이르는 것이다.

본 명세서에서 "단리된 항체"란 실질적으로 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 없는 항체를 이르는 것으로, 예를 들어, CD30에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 CD30가 아닌 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 포함되어 있지 않다. 그러나, CD30에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 종으로부터의 CD30 분자와 같은 다른 항원에 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.

본 명세서에서 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일한 분자 조성의 항체 분자의 제제를 말한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해서 단일한 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본 명세서에서 "인간 항체"란 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수도 있는데, 예를 들어, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 변이 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 변이를 도입시킬 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 생식세포 서열로부터 유래하는 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그래프트된 항체는 포함하지 않는다.

"인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일한 결합 특이성을 나타내는 항체를 이른다. 하나의 실시 태양에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스와 같은 비-인간 트랜스제닉 동물로부터 얻어진 B 세포가 불멸화 세포에 융합된 하이브리도마에 의해 생산된다.

본 명세서에서 "재조합 인간 항체"란 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함하는 것으로, 예를 들면, (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 유전자전환되거나 염색체전환된 동물(예, 마우스)로부터 또는 그로부터 제조된 하이브리도마(하기 상술함)로부터 단리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 복합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 다른 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 항체가 있다. 그러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 몇몇 실시 태양에서, 재조합 인간 항체는 시험관내 변이유발될 수 있으며(또는, 인간 Ig 서열에 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이), 따라서, 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 관련되어 있을지라도, 생체내 인간 항체 생식세포 유전자 서열 레퍼토어내에 자연적으로 존재하지 않는 서열일 수 있다.

본 명세서에서, "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgGl)를 이른다.

"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본 명세서에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 표현과 교환적으로 사용될 수 있다.

"인간 항체 유도체"는 인간 항체의 변형된 형태, 예컨대, 항체와 다른 물질 또는 항체와의 컨쥬게이트를 말한다. "인간화 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포 유전자 서열로부터 유래되는 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그래프트된 항체를 이르는 것으로 의도된다. 인간 프레임워크 서열 내에서 추가의 프레임워크 영역 변형이 이루어질 수 있다.

"키메라 항체"란 가변 영역 서열이 어느 하나의 종으로부터 유래되고, 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 것인 항체를 이르는 것이다.

본 명세서에서, "인간 CD30에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 CD30에 K_D 값 1 x 10^-7 M 이하로, 보다 바람직하게는 5 x 10^-8 M 이하로, 보다 바람직하게는 3 x 10^-8 M 이하로, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하로, 더 더욱 바람직하게는 1 x 10^-9 M 이하로 결합하는 항체를 이르는 것이다.

본 명세서에서, "K_assoc" 또는 "K_a"는 특정 항원-항체 상호 작용의 결합 속도를 의미하는 한편, "K_dis" 또는 "K_d"는 특정 항원-항체 상호 작용의 해리 속도를 나타낸다. 또한, "K_D"는 K_a에 대한 K_d의 비율(즉, K_d/K_a)로부터 얻어지며, 몰 농도(M)로 표시되는 해리 상수를 나타낸다. 항체에 대한 K_D 값은 당 분야에 잘 수립된 방법으로 결정할 수 있다. 항체의 K_D를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명, 바람직하게는 바이아코어(Biacore®) 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 이용하는 것이다.

본 명세서에서, IgG 항체에 대하여 "고(높은) 친화도"라 함은 항체의 표적 항원에 대한 K_D값이 10^-8M 이하, 바람직하게는 10^-9 M 이하, 보다 바람직하게는 10^-10 M 이하인 경우를 의미한다. 그러나, "고 친화도" 결합은 다른 항체 이소타입에 대해서는 변화될 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 "고 친화도" 결합은 항체의 K_D 값이 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-9 M 이하인 경우를 말한다.

본 명세서에서 "개체" 및 "환자"는 교환적으로 사용되며, 인간이나 인간이 아닌 동물을 이를 수 있다. "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등의 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시 태양에서, 환자는 인간이다.

본 명세서에서, "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 그의 단쇄를 포함하는 의미이다. "항체"는 디술파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 적어도 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(V_H로 약칭함)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(V_L로 약칭함)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 C_L로 이루어진다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 불리우는 보다 보존적인 영역 사이에 분산되어 있으며, 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리우는 초가변성의 영역으로 더욱 세분화될 수 있다. 각 V_H 및 V_L은 세 개의 CDR과 네 개의 FR 영역으로 이루어지며, 이들은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배치되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 이뮤노글로불린이 면역계의 각종 세포(예, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분(Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.

본 명세서에서, 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단하게 "항체 부분")은 항원(예를 들어, CD30)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, 즉, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 즉, 힌지 영역에서 디술파이드 결합에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) V_H 도메인으로 구성되는 dAb 단편(참조: Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 개의 도메인인 V_L 및 V_H는 분리되어 있는 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법, 예를 들어, V_L 및 V_H 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단쇄 Fv(scFv))로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다[참조: Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883)]. 그러한 단쇄 항체 또한 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 알려진 종래의 기술로 얻어지며, 단편은 온전한 항체와 같은 방식으로 이용성에 관해 스크리닝된다.

"에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정 부위이다. 에피토프는 일반적으로 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄 등으로 구성되며, 대개는 특이적 삼차원 구조적 특성 내지는 특이적 하전 특성을 갖는다. 구조적 및 비구조적 에피토프는 전자가 변성 용매 존재하에 결합능을 손실하는 반면 후자는 그러하지 않다는 점에서 구별된다.

본 명세서에서, "결합을 억제한다" 및 "결합을 차단한다"는 표현은, 예를 들어, CD30 리간드의 CD30에의 결합을 억제하고(하거나) 차단하는 경우 등에 사용된다. 억제 및(또는) 차단은 교환적으로 사용되며, 부분적 및 완전한 억제 및(또는) 차단을 포함하는 의미이다. CD30의 억제 및/또는 차단은 바람직하게는 CD30 결합이 억제 또는 차단없이 일어날 때, 예를 들어, CD30-유도되는 증식이 억제없이 일어나는 때의 활성의 정상적 수준 또는 유형을 감소 또는 변화시킨다. 억제 및 차단은 CD30가 항-CD30 항체와 접촉하지 않을 때와 비교하여 그와 접촉할 때 결합 친화도의 측정가능한 감소를 포함하는 것으로 의도되며, CD30의 그의 수용체에 대한 차단은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100%이다.

"이중특이적 분자"란 두 개의 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 물질, 예컨대, 단백질, 펩티드 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함한다. 분자는, 예를 들어, (a) 세포 표면 항원, 및 (b) 이펙터 세포 표면의 Fc 수용체와 결합하거나 상호작용할 수 있다. "다중특이적 분자" 또는 "헤테로특이적 분자"는 세 개 이상의 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 물질, 예컨대, 단백질, 펩티드 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하는 것으로 의도된다. 분자는, 예를 들어, (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면의 Fc 수용체, 및 (c) 적어도 하나의 다른 성분과 결합하거나 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD30과 같은 세포 표면 항원, 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 다른 표적에 관련되는 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

"이중특이적 항체"는 또한 다이아바디(diabody)를 포함한다. 다이아바디는, V_H 및 V_L 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 위에 발현되어 있기는 하나, 같은 쇄 상의 두 도메인 사이에서 페어링이 일어나기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인이 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝을 이루어 두 개의 항원 결합 부위를 형성하는, 2가의 이중특이적 항체이다[참조: Holliger, P., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al., (1994) Structure 2:1121-1123]. 본 명세서에서, "헤테로항체"란 두 개 이상의 항체, 항체 결합 단편(예, Fab), 그들의 유도체, 또는 함께 연결된 항원-결합 영역으로서, 그 중 적어도 둘 이상이 상이한 특이성을 갖는 항체를 말한다. 이들 상이한 특이성은 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성, 및 종양 세포와 같은 표적 세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 포함한다.

본 명세서에서, "이종성 항체"는 그러한 항체를 생산하는 비-인간 트랜스제닉 생물체와 관련하여 사용된다. 이 용어는 트랜스제닉 비-인간 동물을 구성하지 않는 생물체에서 발견되며 일반적으로 그 트랜스제닉 비-인간 동물이 아닌 다른 종으로부터 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 갖는 항체를 이른다.

본 명세서에서, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 생물 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 의미한다. 예를 들어, 인간 중쇄에 결합된 쥐 경쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다. 헤테로하이브이드 항체의 예에는 상기 논의된 키메라 및 인간화 항체가 있다.

본 명세서에서, "글리코실화 패턴"은 탄수화물 단위가 단백질, 보다 구체적으로는 이뮤노글로불린에 공유결합되는 패턴이다. 이종성 항체의 글리코실화 패턴은 비-인간 트랜스제닉 동물 종에 의해 생산되는 항체 상에 자연적으로 나타나는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있으며, 당업자는 이종성 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스유전자의 CH 유전자가 유래된 종 보다는 비-인간 트랜스제닉 동물 종에 의해 나타나는 글리코실화 패턴에 보다 유사하다는 것을 쉽게 인지할 수 있을 것이다.

본 명세서에서, "자연적으로 발생하는"이란 어떠한 물질이나 현상이 자연에서 발견된다는 사실을 이르는 것이다. 예를 들어, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 인간에 의해 실험실에서 의도적으로 변형되지 않은 어떤 생물체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로 발생하는 것이다.

"재배열된"이란 본질적으로 완전한 V_H 또는 V_L 도메인을 코딩하는 구조에 있어서, V 절편이 각각 D-J 또는 J 절편에 바로 인접하여 위치된 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 좌위의 배치를 이르는 것이다. 재배열된 이뮤노글로불린 유전자 좌위는 생식세포 DNA와 비교하여 찾아낼 수 있으며, 재배열된 좌위는 적어도 하나의 조합된 헵타머/노나머 상동 요소를 가질 것이다.

V 절편과 관련하여 사용되는 "재배열되지 않은" 또는 "생식세포 서열 배치"는 V 절편이 D 또는 J 절편에 바로 인접하지 않게 조합된 V 배치를 이르는 것이다.

항-CD30 항체

CD30에 대한 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 5F11, HeFi-1, ClO, M44, AClO, Ber-H2, HRS-1, HRS-3, HRS-4, Ki-1, Ki-2, Ki-3, Ki-4, Ki-5, Ki-6, Ki-7, IRac 및 M67이 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 바람직하게는 키메라, 인간화, 또는 인간 항체이다. 특정 실시 태양에서, 항체는 완전한 인간 항체이다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 항체는 항체의 특정 기능적 특징 또는 특성을 특징으로 한다. 예를 들어, 항체는 인간 CD30에 높은 친화도로 특이적으로 결합하며, 바람직하게는 하기 특징 중 한 가지 이상을 나타낸다:

a) CD30에 대한 결합 친화도는 친화도 상수가 약 10⁷ M^-1 이상, 바람직하게는 약 10⁸ M^-1 이상, 보다 바람직하게는 약 10⁹ M^-1 내지 10¹⁰ M^-1 또는 그 이상이다;

b) CD30와의 결합 상수(K_assoc)는 약 10³, 바람직하게는 약 10⁴, 보다 바람직하게는 약 10⁵ M^-1S^-1이상이다;

c) CD30로부터의 해리 상수(K_dis)는 약 10^-3 s^-l, 바람직하게는 약 10^-4 s^-l, 보다 바람직하게는 약 10^-5 s^-l, 가장 바람직하게는 약 10^-6 s^-l이다;

d) CD30 발현 세포에 대한 식작용 증진(opsonization) 능력이 있다;

e) 약 10 μg/ml 또는 그 이하의 농도(예, 시험관내)에서 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD30 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)의 성장을 억제 및/또는 그의 식작용 또는 사멸을 매개하는 능력을 갖는다;

f) CD30에 결합하여 CD30 리간드(CD30 리간드의 예는 CD153, TRAFl, TRAF2, TRAF3 및 TRAF5를 포함)가 CD30에 결합하는 것을 부분적으로 또는 완전히 차단하여 CD30 기능(예를 들어, CD30 매개 효과)을 억제한다.

바람직하게는, 항체는 인간 CD30에 K_D 값 5 x 10^-9 M 이하로, 보다 바람직하게는 4 x 10^-9 M 이하로, 보다 바람직하게는 3.5 x 10^-9 M 이하로, 더욱 바람직하게는 3 x 10^-9 M 이하로, 더 더욱 바람직하게는 2.8 x 10^-9 M 이하로 결합한다.

항체의 CD30에 대한 결합능을 평가하는 표준 검정법이 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 RIA등이 있다. 적절한 검정법은 하기 실시예에 상세히 기술한다. 항체의 결합 동력학(예를 들어, 결합 친화도)도 당업계에 알려진 표준 분석법으로 평가할 수 있으며, 바이아코어 분석 등이 그것이다.

모노클로날 항체 17Gl, 2H9 및 5F11

본 발명에 사용하기에 바람직하게는 항체는 인간 모노클로날 항체 17Gl, 2H9 및 5F11이며, 이들은 미합중국 출원 제2004/0006215호에 특성화 및 기술되어 있으며, 상기 출원의 내용 전체가 본 명세서에서 포함된다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_H 아미노산 서열은 각각 서열 번호 2, 6 및 10에 나타나있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_L 아미노산 서열은 각각 서열 번호 4, 8 및 12에 나타나있다.

이들 항체 각각이 CD30에 결합할 수 있으므로, V_H 및 V_L 서열을 "혼합하고 조화시켜" 본 발명에 사용하기 위한 다른 항-CD30 결합 분자를 생성할 수 있다. 그와 같이 "혼합하고 조화시킨" 항체의 CD30 결합은 상기 및 하기 실시예에 기술된 결합 분석(예, ELISA)을 사용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, V_H 및 V_L 쇄가 혼합 및 조화될 때, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터의 V_H 서열은 구조적으로 유사한 V_H 서열로 교체된다. 마찬가지로, 특정 V_H/V_L 쌍으로부터의 V_L 서열은 구조적으로 유사한 V_L 서열로 교체되는 것이 바람직하다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명의 방법은

(a) 서열 번호 2, 6 및 10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(b) 서열 번호 4, 8 및 12로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, CD30, 바람직하게는 인간 CD30에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 사용할 수 있다.

바람직한 중쇄 및 경쇄의 조합은

(a) 아미노산 서열 번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역과, (b) 아미노산 서열 번호 4를 포함하는 경쇄 가변 영역;

(b) 아미노산 서열 번호 6을 포함하는 중쇄 가변 영역과, (b) 아미노산 서열 번호 8을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(c) 아미노산 서열 번호 10을 포함하는 중쇄 가변 영역과, (b) 아미노산 서열 번호 12를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 국면에서, 17Gl, 2H9 및 5F11의 중쇄 및 경쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 또는 그의 조합을 포함하는 항체가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_H CDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 16, 28 및 40에 나타나있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_H CDR2의 아미노산 서열은 서열 번호 17, 29 및 41에 나타나있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_H CDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 18, 30 및 42에 나타나있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_K CDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 22, 34 및 46에 나타나있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_K CDR2의 아미노산 서열은 서열 번호 23, 35 및 47에 나타나있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_K CDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 24, 36 및 48에 나타나있다. CDR 영역은 카밧(Kabat) 시스템[Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]을 사용하여 밝혀냈다.

이들 각 항체가 CD30에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDRl, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공되는 만큼, V_H CDRl, CDR2 및 CDR3 서열 및 V_K CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 "혼합하고 조화시켜" (즉, 비록 각 항체가 V_H CDRl, CDR2 및 CDR3 및 V_K CDRl, CDR2 및 CDR3를 가져야하지만, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합되고 조화되어) 본 발명에 사용하기 위한 다른 항-CD30 결합 분자를 생성할 수 있다. 그와 같이 혼합하고 조화시킨 항체의 CD30 결합은 상기 및 하기 실시예에 기술된 결합 분석(예, ELISA, 마이아코어 분석)을 사용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, V_H CDR 서열이 혼합 및 조화될 때, 특정 V_H 서열로부터의 CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열로 교체된다. 마찬가지로, V_K CDR 서열이 혼합 및 조화될 때, 특정 V_K 서열로부터의 CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열로 교체되는 것이 바람직하다. 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L CDR 영역 서열을 본 명세서에서 모노클로날 항체 17Gl, 2H9 및 5F11에 대하여 개시한 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환하여 신규 V_H 및 V_L 서열을 생성할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 하기와 같은 영역을 포함하며, CD30, 바람직하게는 인간 CD30에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 사용할 수 있다:

(a) 서열 번호 16, 28 및 40으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDRl;

(b) 서열 번호 17, 29 및 41로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 18, 30 및 42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 22, 34 및 46으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDRl;

(e) 서열 번호 23, 35 및 47로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 24, 36 및 48로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.

바람직한 실시 태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDRl;

(b) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDRl;

(e) 서열 번호 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 24를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시 태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDRl;

(b) 서열 번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDRl;

(e) 서열 번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시 태양에서, 항체는

(a) 서열 번호 40을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDRl;

(b) 서열 번호 41을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) 서열 번호 42를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) 서열 번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDRl;

(e) 서열 번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및

(f) 서열 번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3를 포함한다.

특정 생식세포 유전자 서열을 갖는 항체의 사용

특정 실시 태양에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 특정 생식세포 이뮤노글로불린 중쇄 유전자 서열로부터의 중쇄 가변 영역, 및/또는 특정 생식세포 이뮤노글로불린 경쇄 유전자 서열로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

바람직한 실시 태양에서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 인간 V_H 4-34 유전자 또는 인간 V_H 3-11 유전자의 산물이거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하며, CD30에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 실시 태양에서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 V_K L15 유전자, 인간 V_KA27 유전자 또는 인간 V_K L6 유전자의 산물이거나 그로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하며, CD30에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 본 발명은

(a) 인간 V_H 4-34 또는 3-11 유전자(이들 유전자는 각각 서열 번호 49 및 51에 나타낸 아미노산 서열을 코딩함)의 산물이거나 그로부터 유도된 중쇄 가변 영역 을 포함하고;

(b) 인간 V_K Ll5 또는 V_K A27 또는 V_K L6 유전자(이들 유전자는 각각 서열 번호 50, 52 및 53에 나타낸 아미노산 서열을 코딩함)의 산물이거나 그로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하며;

(c) CD30, 바람직하게는 인간 CD30에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

각각 V_H 4-34 및 V_K L15의 V_H 및 V_K를 갖는 항체의 예는 5F11이다. V_H 3-11 및 V_K A27의 V_H 및 V_K를 갖는 항체의 예는 17Gl이다. 각각 V_H 4-34 및 V_K L6의 V_H 및 V_K를 갖는 항체의 예는 2H9이다.

본 발명에 따라서, 항체의 가변 영역이 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열을 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우, 인간 항체는 특정 생식세포 유전자 서열의 "산물" 또는 그로부터 "유도된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 수반하는 트랜스제닉 마우스를 관심있는 항원으로 면역화거나, 파아지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 그러한 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열의 "산물"이거나 그로부터 "유도된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열과 서열에 있어서 가장 근사한(즉, 가장 큰 일치율 %를 나타내는) 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열을 선택함으로써 찾아낼 수 있다. 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열의 "산물"이거나 그로부터 "유도된" 인간 항체는, 자연 발생 체세포 돌연변이나 의도적 부위-지정 돌연변이의 도입에 기인하여, 생식세포 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열 과 비교하여 전형적으로 90% 이상의 서열 일치도를 나타내며, 다른 종의 생식세포 이뮤노글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 쥐의 생식세포 아미노산 서열)과 비교할 때 인간의 것임을 확인시키는 아미노산 잔기를 함유한다. 어떤 경우에, 인간 항체는 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 95% 이상, 또는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 일치율을 보인다. 전형적으로, 특정 인간 생식세포 유전자 서열로부터 유도된 인간 항체는 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낸다. 어떤 경우에는, 인간 항체는 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 심지어 4, 3, 2 또는 1개 아미노산 차이를 나타낸다.

상동 항체

또 다른 실시 태양에서, 본 발명에 유용한 항체는 본 명세서에서 기재된 바람직한 항체의 아미노산 서열에 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항체는 바람직한 항-CD30 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.

본 발명의 방법에 유용한 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 하기와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:

(a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2, 6 및 10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다;

(b) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4, 8 및 12로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다;

(c) 항체는 인간 CD30에 K_D 값 1 x 10^-8 M 이하로 결합한다;

(d) 항체의 CD30와의 결합 상수(K_assoc)는 약 10³, 보다 바람직하게는 약 10⁴, 가장 바람직하게는 약 10⁵ M^-1S^-1 이상이다;

(e) 항체의 CD30로부터의 해리 상수(K_dis)는 약 10^-3 s^-l, 보다 바람직하게는 약 10^-4 s^-l, 보다 바람직하게는 10^-5 s^-l, 가장 바람직하게는 10^-6 s^-1이다;

(f) 항체는 CD30 발현 세포에 대한 식작용 증진 능력을 갖는다;

(g) 항체는 약 10 μg/ml 이하의 농도에서(예를 들어, 시험관내) 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD30 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)의 성장을 억제 및/또는 그의 식작용 및 사멸을 매개하는 능력을 갖는다; 또는

(h) 항체는 CD30에 결합하여 CD30 리간드(CD30 리간드의 예는 CD153, TRAFl, TRAF2, TRAF3 및 TRAF5를 포함함)의 CD30에의 결합을 부분적으로 또는 완전히 차단하여 CD30 기능(예를 들어, CD30 매개 효과)을 억제하는 능력을 갖는다.

여러 실시 태양에서, 항체는 예컨대, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.

다른 실시 태양에서, V_H 및/또는 V_L 아미노산 서열은 상술한 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 상술한 V_H 및 V_L 영역 서열에 대한 동일성이 높은(즉, 80% 이상) V_H 및 V_L 영역을 갖는 항체는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11을 코딩하는 핵산 분자를 변이 유발(예를 들어, 부위 지정 또는 PCR-매개 돌연변이)시키고, 본 명세서에서 기술된 방법으로 보유된 기능(즉, 상기 (c) 및 (d)에 설명됨)에 대하여 코딩되어 변형된 항체를 시험하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 그 두 서열 간의 퍼센트 일치율과 같다. 두 서열 간의 퍼센트 일치율은 두 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 수, 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100)이다. 두 서열 간의 서열 비교 및 퍼센트 일치율의 결정은 하기 비-제한적 실시예에 기재된 수학적 알고리듬에 의해 달성될 수 있다.

두 아미노산의 서열의 퍼센트 일치율은 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 도입된문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]에 기재된 알고리듬을 사용하여 얻을 수 있고, 이 때 PAM120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용한다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 일치율은 GCG 소프트웨어 팩키지(입수처 http://www.gcg.com) 중 GAP 프로그램에 도입된 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리듬을 사용하여 결정할 수 있으며, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용한다.

추가의 또는 대체 방법으로, 본 발명의 단백질 서열은, 예를 들어, 관련 서열을 찾아내기 위해 공중 테이터베이스 검색을 수행하기 위한 "퀘리(query) 서열" 로 사용될 수 있다. 그러한 검색은 XBLAST 프로그램(버젼 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다[참조: Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 항체 분자에 동일한 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3으로 수행할 수 있다. 비교의 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위하여, 갭드(Gapped) BLAST를 이용할 수 있다[참조: Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램의 디폴트 파라메터(예, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].

보존적 변형을 갖는 항체

특정 실시 태양에서, 본 발명의 항체는 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본 명세서에서 바람직한 것으로 기술된 항체(예를 들어, 17Gl, 2H9 또는 5F11)에 기초한 구체화된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형체를 포함하며, 본 발명의 항-CD30 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때

(a) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 아미노산 서열 번호 18, 30 및 42, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 아미노산 서열 번호 24, 36 및 48, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며;

(c) 항체는 인간 CD30에 K_D 값 1 x 10^-8 M 이하로 결합하고;

(d) 항체의 CD30와의 결합 상수(K_assoc)는 약 10³, 보다 바람직하게는 약 10⁴, 가장 바람직하게는 약 10⁵ M^-1S^-1 이상이며;

(e) 항체의 CD30로부터의 해리 상수(K_dis)는 약 10^-3 s^-l, 보다 바람직하게는 약 10^-4 s^-l, 보다 바람직하게는 10^-5 s^-l, 가장 바람직하게는 10^-6 s^-1이고;

(f) 항체는 CD30 발현 세포에 대한 식작용 증진 능력을 가지며;

(g) 항체는 약 10 μg/ml 이하의 농도에서(예를 들어, 시험관내) 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD30 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)의 성장을 억제하고(하거나) 그의 식작용 및 사멸을 매개하는 능력을 갖거나; 또는

(h) 항체는 CD30에 결합하여 CD30 리간드(CD30 리간드의 예는 CD153, TRAFl, TRAF2, TRAF3 및 TRAF5를 포함함)의 CD30에의 결합을 부분적으로 또는 완전히 차단하여 CD30 기능(예를 들어, CD30 매개 효과)을 억제하는 능력을 갖는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

바람직한 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 번호 17, 29 및 41의 아미노산 서열 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 번호 23, 35 및 47, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시 태양에서, 중쇄 가변 영역 CDRl 서열은 아미노산 서열 번호 16, 28 및 40, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDRl 서열은 아미노산 서열 번호 22, 34 및 46, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

여러 실시 태양에서, 항체는 예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.

본 명세서에서, "보존적 서열 변형"이란 그 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 상당한 영향을 주거나 변화시키지 않는 아미노산 변화를 이른다. 그러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 추가 및 결실을 포함한다. 본 발명의 항체의 변형은 당업계에 알려진 표준 기술, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이 및 PCR-매개 변이 유발에 의해 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 교체되는 경우를 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 족은 당업계에 잘 정의되어 있다. 이들 족은 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기니, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산 족이다. 따라서, 본 발명 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 동일한 측쇄를 갖는 족으로부터의 아미노산 잔기로 교체될 수 있으며, 변화된 항체를 상기 기능 분석법을 이용하여 보유된 기능(즉, 상기 (c) 내지 (j)에 기재된 기능)에 대해 시험할 수 있다.

본 발명의 항-CD30 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체

본 명세서에서 기재된 항체에 추가하여, 본 발명의 방법은 기재된 CD30 모노클로날 항체와 동일한 인간 CD30 상의 클러스터(A, B 또는 C), 또는 보다 바람직하게는 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 다시 말해서, CD30에 결합하기 위해 상기 17Gl, 2H9 및 5F11 등의 모노클로날 항체 중 어느 하나와 교차-경쟁하는 능력을 갖는 항체를 사용할 수 있다. 그와 같은 교차-경쟁 항체는 표준 CD30 결합 분석에서 17Gl, 2H9 또는 5F11과 교차 경쟁하는 능력에 기초하여 찾아낼 수 있다. 예를 들어, 바이아코어(BIAcore) 분석, ELISA 분석 또는 유동 세포측정법을 사용하여 본 발명 항체와의 교차 경쟁을 입증할 수 있다. 시험 항체가 17Gl, 2H9 또는 5F11 등이 인간 CD30에 결합하는 것을 억제하는 것은, 시험 항체가 인간 CD30에의 결합에 대하여 그러한 항체와 경쟁한다는 것, 그러한 항체와 동일한 인간 CD30상 에피토프에 결합한다는 것을 증명하는 것이다. 바람직한 실시 태양에서, 17Gl, 2H9 또는 5F11과 동일한 인간 CD30상의 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이며, 이는 당업계에 공지된 방법으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조되어 단리될 수 있다.

엔지니어링 및 변형된 항체

본 발명에 사용되는 항체는 본 명세서에서 개시된 항체로부터의 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L 서열을 출발 물질로 사용하여 변형된 항체를 엔지니어링함으로써 제조될 수 있으며, 변형된 항체는 개시된 항체와는 다른 변화된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역, 즉 V_H 및/또는 V_L 내, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역, 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변화시킴으로써 엔지니어링할 수 있다. 추가적으로 또는 다른 방법으로, 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 변형, 예컨대, 항체의 이펙터 기능을 변화시키도록 항체를 엔지니어링할 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 엔지니어링의 한 형태는 CDR 그래프팅이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 개개 항체들 사이에서 CDR 밖의 아미노산 서열에 비해 보다 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용에 관여하기 때문에, 특정 천연 항체로부터의 CDR 서열이 다른 특성을 갖는 다른 항체의 프레임워크 서열 상에 그래프트된 발현 벡터를 제작함으로써 특정 천연 항체의 성질을 흉내내는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다[참조: Riechmann, L. et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al., (1986) Nature 32l.:522-525; Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 미합중국 특허 제5,225,539호(Winter), 및 미합중국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호(Queen et al.)]

따라서, 본 발명의 또 다른 실시 태양은 17Gl, 2H9 또는 5F11로부터의 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 서열에 변형이 있는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 그러한 항체는 모노클로날 항체 17Gl, 2H9 또는 5F11의 V_H 및 V_L CDR 서열을 함유하지만, 그러한 항체와는 다른 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.

그와 같은 프레임워크 서열은 생식세포 항체 유전자 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개 문헌을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포 DNA 유전자 서열은 "VBase" 인간 생식세포 유전자 서열 데이터베이스(입수처: www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase) 및 문헌[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., (1992) "The Repertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798: and Cox, J. P. L. et al., (1994) "A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있으며, 각 문헌의 내용이 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 항체에 사용하기에 바람직한 프레임워크 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어, 본 발명의 바람직한 모노클로날 항체에 의해 사용되는 V_H 4-34 프레임워크 서열(서열 번호: 49) 및/또는 V_H 3-11 프레임워크 서열(서열 번호: 51) 및/또는 V_K L15 프레임워크 서열(서열 번호: 50) 및/또는 V_K A27 프레임워크 서열(서열 번호: 52) 및/또는 V_K L6 프레임워크 서열(서열 번호: 53)과 구조적으로 유사한 것이다. V_H CDRl, CDR2 및 CDR3 서열, 및 V_K CDRl, CDR2 및 CDR3 서열은 그 프레임워크 서열이 유래하는 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 서열에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그래프트되거나, CDR 서열들은 생식세포 유전자 서열에 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하는 프레임워크 영역 상에 그래프트될 수 있다. 어떤 경우에는, 항체의 항원 결합능을 유지 또는 증진시키기 위해 프레임워크 영역 내에서 잔기를 변이시키는 것이 유리한 것으로 나타났다[참조: 미합중국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호(Queen et al.)].

가변 영역 변형의 또 다른 형태는 V_H 및/또는 V_K CDRl, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 변이시킴으로써 관심있는 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화도)을 변화시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이 또는 PCR-매개 돌연변이는 변이를 도입하기 위하여 수행되며, 항체 결합 또는 다른 기능적 특성에 대한 효과는 본 명세서에 기재되고 실시예에 제공된 시험관내 또는 생체내 분석법으로 수행할 수 있다. 보존적 변형(상기한 바와 같은)이 도입되는 것이 바람직하다. 변이는 아미노산 치환, 추가 또는 결실일 수 있으나, 치환인 것이 바람직하다. 또한, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변화된다.

따라서, 또 다른 실시 태양에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 (a) 서열 번호 16, 28 및 40으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 16, 28 및 40과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDRl 영역; (b) 서열 번호 17, 29 및 41로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 17, 29 및 41과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR2 영역; (c) 서열 번호 18, 30 및 42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 18, 30 및 42와 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR3 영역; (d) 서열 번호 22, 34 및 46으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 22, 34 및 46과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDRl 영역; (e) 서열 번호 23, 35 및 47로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 23, 35 및 47과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDR2 영역; 및 (f) 서열 번호 24, 36 및 48로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 24, 36 및 48과 비교할 때 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDR3 영역 CDRl 영역을 포함하는, 단리된 항-CD30 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

본 발명의 엔지니어링된 항체는 항체의 특성을 개선하도록 V_H 및/또는 V_K 영역 내의 프레임워크 잔기에 변형이 가해진 것을 포함한다. 전형적으로 그러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소하도록 만들어진다. 예를 들어, 하나의 알려진 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식세포 유전자 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 일으킨 항체는 그가 유래된 생식세포 유전자 서열과 다른 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 그러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 그가 유래된 생식세포 유전자 서열과 비교하여 찾아낼 수 있다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거하도록 프레임워크 영역 내, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역내의 하나 이상의 잔기를 변이시킴으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 "탈면역화"라고도 불리우며, 미합중국 특허 출원 제2003/0153043호(Carr et al.)에 상세히 기술되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에 도입된 변형에 더하여 또는 그를 대체하여, 본 발명에 사용되는 항체는 Fc 영역 내에 변형을 포함하여, 전형적으로는 하나 이상의 항체의 기능적 특성, 예를 들어, 혈청-반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변화시키도록 엔지니어링될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 하나 이상의 기능적 특성을 변화시키기 위하여, 화학적으로 변형(예를 들어, 항체에 하나 이상의 화학적 잔기를 부착)시키거나, 글리코실화를 변화시키도록 변형될 수 있다. 이들 각 실시 태양은 하기 상세히 설명되어 있다. Fc 영역 내 잔기의 번호매김은 카밧(Kabat)의 EU 인덱스의 것과 같다.

하나의 실시 태양에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변화, 예컨대, 증가 또는 감소하도록 변형된다. 이러한 접근법은 미합중국 특허 제 5,677,425호(Bodmer et al.)에 상세히 기술되어 있다. CH1 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예컨대, 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진하거나, 항체의 안전성을 증가 또는 감소시키도록 변화된다.

또 다른 실시 태양에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 변이시켜 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여 손상된 스타필로코커스 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 하나 이상의 변이를 도입한다. 이러한 접근법은 미합중국 특허 제6,165,745호(Ward et al.)에 상세히 기재되어 있다.

또 다른 실시 태양에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 각종 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하나 이상의 다음과 같은 변이를 도입시킬 수 있다: T252L, T254S, T256F[참조: 미합중국 특허 제6,277,375호(Ward)]. 다른 방법으로서, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개의 루프로 부터 취한 셀비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체를 CHl 또는 CL 영역 내에서 변화시킬 수 있다[참조: 미합중국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호(Presta et al.)].

또 다른 실시 태양에서, 항체의 이펙터 기능을 변화시키기 위해 Fc 영역을 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하여 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을, 항체가 이펙터 리간드에 대한 변화된 친화도를 갖는 반면 패런트 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록, 다른 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 그에 대한 친화도가 변화된 이펙터 리간드는, 예를 들어, 보체의 Fc 수용체 또는 Cl 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미합중국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호(양 특허 모두 Winter et al.)에 상세히 기재되어 있다.

또 다른 실시 태양에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산은 항체가 변화된 Clq 결합 및/또는 감소되거나 소실된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 가지도록 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 방법은 미합중국 특허 제6,194,551호(Idusogie et al.)에 상세히 기재되어 있다.

또 다른 실시 태양에서, 아미노산 위치 231 및 239내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화시켜 항체가 보체를 고정하는 능력을 변화시킨다. 이 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351(Bodmer et al.)에 상세히 기재되어 있다.

또 다른 실시예에서, Fc 영역은 항체가 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고, 그리고/또는 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 다음 위치 중 하나 이상의 아미노산을 변화시켜 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072(Presta)에 기재되어 있다. 더우기, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgGl상의 결합 부위는 지도화되어 있고, 개선된 결합능을 갖는 변이체가 개시되어 있다[참조: Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604)]. 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 나타났다. 추가로, 다음의 조합 돌연변이가 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.

또 다른 실시 태양에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화 항체를 제조할 수 있다(즉, 항체가 글리코실화를 결여한다). 글리코실화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변화될 수 있다. 그러한 탄수화물 변형은 항체 서열 내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변화시켜 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환을 수행함으로써 그 위치에서 글리코실화를 제거한다. 그러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 접근법은 미합중국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호(Co et al.)에 상세히 기재되어 있다.

추가로 또는 다른 방법으로서, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화 항체, 또는 증가된 이분 GlcNac 구조를 갖는 항체와 같은 변화된 글리코실화 유형을 갖는 항체를 제작할 수 있다. 그러한 변화된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 그러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체를 변화된 글리코실화 공장을 갖는 숙주 세포에서 발현시켜 수행할 수 있다. 변화된 글리코실화 공장을 갖는 세포는 당 기술 분야에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시키는 숙주 세포로 사용하여 글리코실화가 변화된 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195(Hanai et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴됨으로써, 그에 의해 발현되는 항체가 하이포푸코실화를 나타내는 세포주를 기재하고 있다. PCT 공개 WO 03/035835(Presta)는 푸코오스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되었으며, 그 숙주 세포에서 발현되는 항체가 하이포푸코실화되는 변이 CHO 세포주, Lec13 세포를 기재하고 있다[참조: Shields, R.L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740)]. PCT 공개 WO 99/54342(Umana et al.)는 글리코단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)를 발현하도록 엔지니어링되어 그 안에서 발현되는 항체가 증가된 ADCC 활성을 가져오는, 증가된 이분 GlcNac 구조를 나타내는 세포주를 기재하고 있다[참조: Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180)].

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 항체의 또 다른 변형은 페길레이션(pegylation)을 포함한다. 항체는 그의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길레이션될 수 있다. 항체를 페길레이션시키기 위해 항체 또는 그의 단편을 전형적으로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드와, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에 반응시킨다. 바람직하게는, 페길레이션은 반응성 PEG 분자(또는 유사 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통하여 수행된다. 본 명세서에서, "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도하는데 사용되어 온 임의의 형태의 PEG, 예를 들어, 모노(Cl-ClO) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함한다. 특정 실시 태양에서, 페길레이트될 항체는 아글리코실화 항체이다. 단백질을 페길레이트하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다[참조: EP 0 154 316(Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384(Ishikawa et al.)].

항체를 엔지니어링하는 방법

상기 논의한 바와 같이, 본 명세서에서 개시된 V_H 및 V_K 서열을 갖는 항-CD30 항체는 V_H 및/또는 V_K 서열 또는 그에 부착되 불변 영역을 변형시킴으로써 새로운 항-CD30 항체를 제조하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항-CD30 항체, 예를 들어, 17Gl, 2H9 또는 5F11의 구조적 특징은 본 발명 항체의 적어도 하나의 기능적 특성, 즉, 인간 CD30에의 결합을 보유하는 구조적으로 연관된 항-CD30 항체를 제작하는데 사용한다. 예를 들어, 17Gl, 2H9 또는 5F11의 하나 이상의 CDR 영역 또는 그의 변이를 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합하여 추가의, 재조합-엔지니어링된 본 발명의 항-CD30 항체를 상술한 바와 같이 제작한다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에서 기술한 것들을 포함한다. 엔지니어링 방법의 출발 물질은 본 발명에 제공된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 엔지니어링된 항체를 제작하기 위해, 본 발명에 제공된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할(즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 서열(들)에 함유된 정보는 원래 서열(들)로부터 유도된 "제2 세대" 서열(들)을 제작하는데 출발 물질로 사용되며, "제2 세대" 서열(들)을 제조하고 단백질로서 발현시킨다.

따라서, 또 다른 실시 태양에서, 본 발명은

(a) (i) 서열 번호 16, 28 및 40으로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열 번호 17, 29 및 41로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDR2 서열 및/또는 서열 번호 18, 30 및 42로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 번호 22, 34 및 46으로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDRl 서열, 23, 35 및 47로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDR2 서열, 및/또는 서열 번호 24, 36 및 48로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계;

(b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변화시켜 적어도 하나의 변화된 항체 서열을 제조하는 단계; 및

(c) 변화된 항체 서열을 단백질로 발현시키는 단계를 포함하는, 항-CD30 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

변화된 항체 서열을 제조하고 발현시키기 위해 표준 분자 생물학 기술을 사용할 수 있다.

바람직하게는, 변화된 항체 서열에 의해 코딩되는 항체는 본 명세서에서 기재된 항-CD30 항체의 하나, 몇몇 또는 모든 기능적 특성을 보유하는 것이며, 그러한 기능적 특성은

(a) 항체는 인간 CD30에 K_D 값 1 x IO^-8 M 이하로 결합한다;

(b) 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4, 8 및 12로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 80% 이상 동일하다;

(c) 항체는 인간 CD30에 K_D 값 I x IO^-8 M 이하로 결합한다;

(d) 항체의 CD30에의 결합 상수(K_assoc)는 약 10³, 보다 바람직하게는 약 10⁴, 가장 바람직하게는약 10⁵ M^-1S^-1 이상이다;

(e) 항체의 CD30로부터의 해리 상수(K_dis)는 약 10^-3 s^-l, 바람직하게는 약 10^-4 s^-l, 보다 바람직하게는 10^-5 s^-l, 가장 바람직하게는 10^-6 s^-l이다;

(f) 항체는 CD30 발현 세포에 대해 식작용 증진 능력을 갖는다;

(g) 항체는 약 10 μg/ml 이하의 농도에서 (예를 들어, 시험관내) 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD30 발현 세포의 성장을 억제 및/또는 그의 식작용 및 사멸을 매개하는 능력을 갖는다; 또는

(h) 항체는 CD30에 결합하여, CD30 리간드(CD30 리간드의 예는 CD153, TRAFl, TRAF2, TRAF3 및 TRAF5를 포함한다)가 CD30에 결합하는 것을 부분적으로 또는 완전히 차단함으로써 CD30 기능(예를 들어, CD30 매개 효과)을 억제하는 특성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

변화된 항체의 기능적 특성은 당업자에 알려지거나 본 명세서에서 기재된 표준 검정법, 예를 들어, 실시예에 설명된 방법(예, 유동 세포측정, 결합 검정)으로 평가할 수 있다.

본 발명의 항체를 엔지니어링하는 방법의 특정 실시 태양에서, 항-CD30 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부에 걸쳐 돌연변이를 무작위로 또는 선택적으로 도입할 수 있으며, 생성된 변형된 항-CD30 항체는 결합 활성 또는 기재된 다른 특성에 대하여 스크리닝할 수 있다. 변이 유발법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780(Short)는 포화 돌연변이 유발, 합성 리게이션 어셈블리, 또는 이를 조합하여 항체 돌연변이를 생성시키고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. 다른 방법으로, PCT 공개 WO 03/074679(Lazar et al.)는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위하여 컴퓨터 스크리닝의 사용법을 기재하고 있다.

본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자

본 발명의 유용한 항체를 코딩하는 핵산 분자는 본 명세서에서 기재되어 있다(서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9 및 11). 핵산은 전세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수"하게 되며, 이를 위한 표준 기술은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 공지된 방법을 포함한다[참조: F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]. 본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 핵산은 cDNA 분자이다.

본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 하기 기술하는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 유전자를 수반하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체에 있어서, 하이브리도마로 부터 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA를 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술로 얻을 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 (예를 들어, 파아지 디스플레이 기술로) 얻은 항체에 대하여, 항체를 코딩하는 핵산을 라이브러리로부터 회수할 수 있다.

본 발명의 바람직한 핵산 분자는 17Gl, 2H9 또는 5F11 모노클로날 항체의 V_H 및 V_L 서열을 코딩하는 것이다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_H 서열을 코딩하는 DNA 서열은 각각 서열 번호 1, 5 및 9에 나타나있다. 17Gl, 2H9 및 5F11의 V_L 서열을 코딩하는 DNA 서열은 각각 서열 번호 3, 7 및 11에 나타나있다.

일단 V_H 및 V_L 절편을 코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 이를 표준 재조합 DNA 기술로 더욱 조작하여, 예컨대, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이러한 조작에서 V_H 또는 V_L-코딩 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 플렉서블 링커와 같은 다른 단백질을 코딩하는 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된다"라 함은, 두 개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 프레임 내에 유지되도록 두 개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미한다.

V_H 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 중쇄 불변 영역(CHl, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결됨으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자는 당업계에 알려져 있으며[참조: Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)], 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나. 가장 바람직하게는 IgGl 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자를 위해서는 V_H-코딩 DNA가 중쇄 C_Hl 불변 영역만을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

V_L 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 이를 경쇄 불변 영역인 C_L을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시켜 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계 알려져 있으며[참조: Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)], 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 카파 불변 영역이다.

scFv 유전자를 생성하기 위해, V_H 및 V_L-코딩하는 DNA 단편을 V_H 및 V_L 영역이 플렉서블 링커에 의해 연결된 연속 단쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 플렉서블 링커, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly₄ -Ser)₃를 코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 연결 연결한다[참조: Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554)].

본 발명의 모노클로날 항체의 생산

본 발명에 유용한 모노클로날 항체(mAb)는 종래의 모노클로날 항체 방법을 포함하는 여러 가지 기술에 의해 생산될 수 있으며, 예를 들어, 표준 체세포 혼성화[Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495] 기술이 있다. 체세포 혼성화 기술이 원론적으로 바람직하지만, B 림프구의 바이러스 또는 암유전자 형질 전환과 같은 모노클로날 항체 생산 기술도 사용될 수 있다.

하이브리도마 제조에 바람직한 동물계는 쥐 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 잘 확립되어 있는 과정이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화된 비장 세포 단리 기술은 당업계에 알려져 있다. 융합 파트너(예를 들어, 쥐 골수 세포)와 융합 과정 또한 알려져 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기와 같이 제조된 쥐 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는DNA를 관심 있는 쥐 하이브리도마로부터 얻어서, 표준 분자 생물학 기술로 쥐가 아닌(예, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 포함하도록 엔지니어링할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 제조하기 위하여, 쥐 가변 영역을 당업계 공지된 기술로 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다[참조: 미합중국 특허 제4,816,567호, Cabilly et al)]. 인간화 항체를 제조하기 위하여, 쥐 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다[참조: 미합중국 특허 제5,225,539호(Winter), 및 미합중국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호, 모두 Queen et al.].

바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. CD30에 대해 유도된 인간 모노클로날 항체는 마우스 계라기 보다는 인간 면역계의 일부를 수반하는 트랜스유전자 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 트랜스유전자 또는 트랜스염색체 마우스는 본 명세서에서 각각 HuMAb mouse® 또는 KM mouse®라 불리우는 마우스를 포함하며, 통칭하여 "인간 Ig 마우스"로 불리운다. 이들 마우스는 당업계에 공지되어 있다[참조: Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546)]. HuMab 마우스의 제조와 생산, 및 그런 마우스에 의해 행해지는 유전자 변형은 문헌[참조: Taylor, L. et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., (1994) International Immunology 6:579-591; and Fishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 상세히 기재되어 있으며, 이 문헌 내용 전체가 본 명세서에서 포함된다[참조: 미합중국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호; 모두 Lonberg 및 Kay에게 허여됨; 미합중국 특허 제5,545,807호(Surani et al.); PCT 공개 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962, 모두 Lonberg 및 Kay에게 허여됨; 및 PCT 공개 WO 01/14424 (Korman et al.)].

또 다른 실시 태양에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 항체 이뮤노글로불린 유전자 서열을 수반하는 마우스, 예를 들어, 인간 중쇄 가변 영역 트랜스유전자 및 인간 경쇄 가변 영역 트랜스염색체를 함유하는 마우스를 사용하여 유도할 수 있다. 본 명세서에서 "KM mouse®"라고도 불리우는 그와 같은 마우스는 PCT 공개 WO 02/43478(Ishida et al.)에 상세히 기재되어 있다.

이에 더하여, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 다른 트랜스제닉 동물계가 당업계에 이용되고 있으며, 본 발명의 항-CD30 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Abgenix, Inc.)라 불리우는 다른 트랜스제닉 계가 사용될 수 있으며, 그와 같은 마우스는, 예를 들어, 미합중국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호(Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.

또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 트랜스염색체 동물계가 당업계에 이용되고 있으며, 본 발명의 항-CD30 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 수반하는, "TC 마우스"라 불리우는 마우스를 사용할 수 있으며, 그와 같은 마우스는 문헌[Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 수반하는 소가 문헌(Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)에 기재되어 있으며, 본 발명의 항-CD30 항체를 유도하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스플레이법으로도 제조할 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 그와 같은 파아지 디스플레이법은 당업계에 확립되어 있다[참조: 미합중국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호(Ladner et al.); 미합중국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호(Dower et al.); 미합중국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호(McCafferty et al.); 및 미합중국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호(Griffiths et al.)].

본 발명에 사용되는 인간 모노클로날 항체는 면역화시에 인간 항체 반응이 일어나도록 인간 면역 세포가 재구성되어 있는 SCID 마우스를 사용하여서도 제조할수 있다. 그와 같은 마우스는, 예를 들어, 미합중국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호(Wilson et al.)에 기재되어 있다.

인간 Ig 마우스의 면역화

인간 항체를 유도하기 위한 인간 Ig 마우스의 면역화는 미합중국 출원 제2004/0006215호에 상세히 기재되어 있으며, 이 문헌의 내용이 본 명세서에서 포함된다. CD30에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 제조하는 상세한 과정 또한 기재되어 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생산

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제작하기 위하여, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포 및/또는 림프절 세포를 단리하여 마우스 골수 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원 특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝할 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, US 2004/0006125에 기재되어 있다.

본 발명의 모노클로날 항체를 생성하는 트랜스펙토마의 생성

본 발명에 사용되는 항체는, 예를 들어, 당업계에 잘 알려져 있고[참조: Morrison, S. (1985) Science 229:1202)] US 2004/0006125에 상세히 기재되어 있는, 재조합 DNA 기술과 유전자 형질도입법을 조합하여 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다.

인간 모노클로날 항체의 CD30에 대한 결합의 특성화

본 발명의 모노클로날 CD30 항체의 결합을 특성화하기 위하여, 면역화된 마우스로부터의 혈청을, 예를 들어, ELISA로 시험할 수 있다. ELISA 프로토콜의 전형적인(그러나, 비-제한적인) 예에서, 마이크로타이터 플레이트를 PBS중 0.25μg/ml 농도의 정제된 CD30로 코팅하고, PBS 중 5% 소 혈청 알부민으로 차단한다. CD30-면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액을 각 웰에 가하고, 37 ℃에서 1 내지 2 시간 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세척한 다음, 알칼라인 포스파타제에 컨쥬게이트된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 37 ℃에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후 플레이트를 pNPP 기질(1 mg/ml)로 전개시키고, 405 내지 650의 OD에서 분석한다. 바람직하게는, 최고의 타이터를 나타낸 마우스를 융합에 사용한다.

상기와 같은 ELISA 검정법은 CD30 면역원과 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. CD30에 고 친화도로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 더욱 특성화한다. 패런트 세포의 반응성을 보유하는, 각 하이브리도마로부터의 하나의 클론(ELISA에 의해)을 -140 ℃에서 저장되는 5 내지 10의 바이알 세포 뱅크를 만들고, 항체를 정제하기 위하여 선택할 수 있다.

인간 항-CD30 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제용 2 리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과하고 농축시켜 단백질 A-세파로스(Pharmacia, Piscataway, NJ)로 친화도 크로마토그래피할 수 있다. 용출된 IgG는 순도를 보장하기 위하여 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 검사한다. 완충 용액을 PBS 내로 교환하여 넣고, 1.43 여기 계수를 사용하여 OD280으로 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80 ℃에서 보관한다.

선택된 인간 항-CD30 모노클로날 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지 알아보기 위해, 시판되고 있는 시약(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체와 비오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁성 연구는 상술한 바와 같은 CD30 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼라인 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다.

정제된 항체의 이소타입을 알아보기 위하여, 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 10 μg/ml의 항-인간 Ig로 4 ℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 5% BSA로 차단한 후에, 플레이트를 10 μg/ml의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조와 주위 온도에서 두 시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgGl 또는 인간 IgM-특이적 알칼라인 포스파타제-컨쥬게이트된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전개하고, 상술한 바와 같이 분석한다.

모노클로날 항체가 CD30를 발현하는 살아 있는 세포에 결합하는 것을 입증하기 위하여, 유동 세포측정법을 사용할 수 있다. 유동 세포측정 프로토콜의 전형적인(그러나, 비-제한적인) 예에서, (표준 성장 조건하에 성장된) CD30 발현 세포주를 0.1% BSA 및 20% 마우스 혈청을 포함하는 PBS 중 여러 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 세포를 형광-표지된 항-인간 IgG 항체와 일차 항체 염색과 동일한 조건하에 반응시킨다. 시료를 단일 세포에 게이팅하는 광 및 측면 산란 특성을 이용한 FACScan 기기로 분석할 수 있다. 유동 세포측정에 더하여 또는 그를 대신하여, 형광 현미경을 사용하는 분석법을 수행할 수 있다. 세포를 상술한 바와 같이 염색하고, 형광 현미경으로 검사한다. 이 방법은 개개의 세포를 시각화할 수 있으나, 항원의 밀도에 따라 감도가 감소될 수 있다.

항-CD30 인간 IgG는 웨스턴 블롯팅에 의하여 CD30 항원과의 반응성에 대해 더욱 시험할 수 있다. 예를 들어, CD30 발현 세포의 세포 추출물을 준비하고, 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로오스 멤브레인 상으로 옮기고, 20% 마우스 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼라인 포스파타제를 사용하여 검출하고, BCIP/NBT 기질 태블릿(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)으로 전개할 수 있다.

CD30에 대한 인간 모노클로날 항체의 식작용 및 세포 사멸 활성

CD30에 특이적으로 결합하는 것 이외에, 인간 모노클로날 항-CD30 항체는 CD30 발현 세포의 식작용 및 세포 사멸을 매개하는 활성에 대해 시험할 수 있다. 시험관 내 모노클로날 항체 활성의 시험은 생체내 모델을 시험하기 전에 초기 스크리닝을 제공한다. 간략히 설명하면, 건강한 공여자로부터의 다형핵 세포(PMN), 또는 다른 이펙터 세포를 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리로 정제한 후, 오염 적혈구를 용해할 수 있다. 세척된 PMN을 10% 열-불활성화 태 송아지 혈청으로 보충된 RPMI에 현탁시키고, ⁵¹Cr 표지된 CD30 발현 세포와, 종양 세포에 대한 이펙터 세포의 비율(이펙터 세포:종양 세포)을 다양하게 하여 혼합시킬 수 있다. 이어서, 정제된 인간 항-CD30 IgGs를 다양한 농도로 가할 수 있다. 관련이 없는 인간 IgG를 음성 대조로 사용할 수 있다. 검정은 37 ℃에서 4 내지 18시간 동안 수행될 수 있다. 배양 상등액으로의 ⁵¹Cr 방출을 측정하여 시료를 세포용해에 대하여 검정한다. 항-CD30 모노클로날 항체를 서로 조합하여 시험함으로써 다중 모노클로날 항체에 있어서 세포용해가 증진되는지를 시험할 수 있다.

CD30에 결합하는 인간 모노클로날 항체는 또한 CD30 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)에 대한 식작용 및 사멸을 매개하는 효능을 측정하기 위하여 생체내(예를 들어, 마우스) 모델에서 시험할 수 있다. 이들 항체는 다음과 같은 기준에 따라 선택할 수 있는데, 이러한 기준이 절대적인 것은 아니다:

1) 살아 있는 CD30 발현 세포에의 결합;

2) CD30에의 높은 친화성 결합;

3) CD30 상의 독특한 에피토프에의 결합 (상보적 활성을 갖는 모노클로날 항체가 조합되어 사용될 때 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 가능성을 배제하기 위함);

4) CD30 발현 세포에 대한 식작용 증진(opsinization);

5) 인간 이펙터 세포의 존재하에 시험관내 CD30 발현 세포의 성장 억제, 식작용 및/또는 사멸을 매개.

본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 이들 기준의 하나 이상, 바람직하게는 모두를 충족시킨다. 특정 실시 태양에서, 인간 모노클로날 항체는 조합되어, 예를 들어, 2종 이상의 항-CD30 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물로서 사용된다. 예를 들어, 상이하지만 상보적 활성을 갖는 항-CD30 모노클로날 항체를 단일 요법에서 조합하여 사용하여 목적하는 치료 또는 진단 효과를 달성할 수 있다. 이러한 요법의 예는 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포를 아주 효과적으로 사멸하는 항-CD30 인간 모노클로날 항체가, CD30 발현 세포의 성장을 억제하는 다른 항-CD30 모노클로날 항체와 조합되어 함유된 조성물을 사용하는 것일 것이다.

CD30에 결합하는 이중특이적 및(또는) 다중특이적 분자

본 발명의 방법의 또 다른 실시 태양에서, CD30에 대한 인간 모노클로날 항체또는 그의 항원-결합 부분은 다른 기능적 분자, 예컨대, 다른 펩티드 또는 단백질(예, Fab' 단편)로 유도되거나 그에 결합되어 다중 결합 부위 또는 다중 표적 에피토프에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분은 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대, 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 미메틱(mimetic)에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합 또는 비공유적 결합 또는 다른 방식으로)될 수 있다. 본 발명에 유용한 이중특이적 분자는 US 2004/0006215에 기재된 것을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 이중특이적 항체는 H22xKi4이며, 이는 US 2004/0006215에 기재되어 있다.

본 명세서에서 "이펙터 세포 특이적 항체"란 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합하는 항체 또는 기능적 항체 단편을 말한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 항체는 내생 이뮤노글로불린에 의해 결합되어지지 않는 부위에서 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합한다.

본 명세서에서 "이펙터 세포"란 면역 반응의 인식 또는 활성화 상이 아닌, 이펙터 상에 관여하는 면역 세포를 이른다. 면역 세포의 예로는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어, 림프구(B 세포, 세포 용해 T 세포(CTL)를 포함하는 T 세포), 킬러 세포, 천연 킬러 세포, 대식 세포, 단핵구, 호산구, 중성구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포, 호염구 등이 있다. 일부 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하며, 특이적 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시 태양에서, 이펙터 세포는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있으며, 예를 들어, 중성구는 ADCC를 유도할 수 있다. FcR을 발현하는 단핵구, 대식 세포 등은 표적 세포를 특이적으로 사멸시키고, 면역계의 다른 성분에 항원을 제시하거나 항원을 제시한 세포에 결합하는데 관여한다. 다른 실시 태양에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 먹을 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인과 같은 체액성 인자에 의해 조정될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 감마(IFN-γ)에 의해 상향 조절되는 것으로 나타났다. 이와 같이 증진된 발현은 표적에 대한 FcγRI-수반 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 먹거나 용해시킬 수 있다.

"표적 세포"는 본 발명의 조성물(예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는, 개체(예를 들어, 인간 또는 동물)내의 바람직하지 않은 세포를 말한다. 바람직한 실시 태양에서, 표적 세포는 CD30 발현 또는 과다발현 세포, 예컨대 CD30 양성 림프종을 이른다. CD30 발현 세포는 전형적으로 방광, 유방, 직장, 신장, 난소, 전립선 종양 세포, 신장 세포, 인상 세포(squamous cell), 폐(비-소형 세포), 및 두부 및 경부 종양 세포를 포함한다. 다른 표적 세포는 활막아세포를 포함한다.

키메라 마우스-인간 모노클로날 항체(즉, 키메라 항체)는 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있다. 예를 들어, 쥐(또는 다른 종의) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자를 제한 효소로 소화하여 쥐 Fc를 코딩하는 영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 대등한 부분의 유전자로 치환한다[참조: Robinson et al, 국제 특허 출원 PCT/US86/02269; Akira, et al., 유럽 특허 출원 제184,187호; Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 제171,496호; Morrison et al., 유럽 특허 출원 제173,494호; Neuberger et al., 국제 출원 WO 86/01533; Cabilly et al., 미합중국 특허 제4,816,567호; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제125,023호; Better et al., (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al., (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cane. Res. 47:999-1005; Wood et al., (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559)].

키메라 항체는 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역으로부터의 대등한 서열로 치환하여 더욱 인간화시킬 수 있다. 인간화 키메라 항체에 관한 전반적인 사항은 문헌[Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207 and Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214]에 제공되어 있다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나로부터의 이뮤노글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작 및 발현시키는 것을 포함한다. 그러한 핵산의 공급원은 당업자에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항-GPIIbIIIa 항체 생산 하이브리도마인 7E3으로부터 얻을 수 있다. 키메라 항체를 코딩하는 재조합 DNA 또는 그의 단편을 적절한 발현 벡터내로 클로닝할 수 있다. 적절한 인간화 항체는 CDR 치환에 의해서도 생산될 수 있다[참조: 미합중국 특허 제5,225,539호; Jones et al., 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534; Beidler et al., 1988 J. Immunol. 141 :4053-4060].

특정 인간 항체의 모든 CDR을 비-인간 CDR의 적어도 일부로 교체할 수 있거나, CDR의 단지 일부를 비-인간 CDR로 교체할 수 있다. 인간화 항체를 Fc 수용체에 결합시키는데 필요한 수의 CDR을 교체시키는 것이 필요할 뿐이다.

항체는 인간 항체 CDR의 적어도 일부를 비-인간 항체로부터 유도한 CDR로 교체시킬 수 있는 어떠한 방법으로나 인간화할 수 있다. 윈터(Winter)는 본 발명의 인간화 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 방법을 기재하고 있는데[UK 특허 출원 GB 2188638 A, 1987년 3월 26일 출원], 특허 문헌의 내용이 본 명세서에 포함된다. 인간 CDR은 국제 공개 WO 94/10332["Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes]에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이를 이용하여 비-인간 CDR로 교체할 수 있다.

특정 아미노산이 치환, 결실 또는 추가된 키메라 및 인간화 항체가 본 발명의 범주에 든다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 항원에 대한 결합능을 개선시키도록 프레임워크 영역 내에 아미노산 치환이 있다. 예를 들어, 마우스 CDR을 갖는 인간화 항체에 있어서, 인간 프레임워크 영역에 위치하는 아미노산은 마우스 항체에서 상응하는 위치에 존재하는 아미노산으로 치환될 수 있다. 그러한 치환은 몇몇 경우에 인간화 항체가 항원에 결합하는 것을 개선시키는 것으로 알려졌다. 아미노산이 추가, 결실 또는 치환된 항체는 본 명세서에서 변형된 항체 또는 변화된 항체로 불리운다.

"변형된 항체"란 또한 항체의 일부가 결실, 추가 또는 치환에 의해 변형된 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 항체는 혈청 반감기와 같은 반감기, 안정성 및 친화도를 증가시키기 위해 불변 영역을 결실시키고 이를 다른 불변 영역으로 교체할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자가 FcγR 수용체에 대해 특이적인 적어도 하나의 항원 결합 영역을 가지며, 적어도 하나의 이펙터 기능을 개시시키는 한, 그러한 변형은 모두 본 발명의 범주 내에 든다.

본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학적 기술[D. M. Kranz et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807)], "폴리도마" 기술(미합중국 특허 제4,474,893호, Reading), 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되고 실시예에 기재된 방법에 따라서, 구성 결합 특이성 부분, 예를 들어, 항-FcR 및 항-CD30 결합 특이성 부분을 컨쥬게이트하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이성 부분을 개별적으로 생성시킨 다음, 서로 컨쥬게이트할 수 있다. 결합 특이성 부분이 단백질 또는 펩티드일 경우, 공유적 컨쥬게이션을 위해 여러 가지 커플링제 또는 가교결합제를 사용할 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙시닐-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 포함한다[Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)]. 다른 방법은 문헌[Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al., (Science (1985) 229:81-83); Glennie et al., (J. Immunol. (1987) 139:2367-2375)]에 기재된 것을 포함한다. 바람직한 컨쥬게이팅제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들은 둘다 제조원(Pierce Chemical Co., Rockford, IL 소재)으로부터 구입할 수 있다.

결합 특이성 부분이 항체(예를 들어, 두 개의 인간화 항체)일 경우, 이들은 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 컨쥬게이트될 수 있다. 특히 바람직한 실시 태양에서, 힌지 영역은 컨쥬게이션 전에 홀수, 바람직하게는 하나의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형될 수 있다.

다른 방법으로, 두 결합 특이성 부분을 동일한 벡터 내에 코딩시키고 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 통합시킬 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')₂ 또는 리간드 x Fab 융합 단백질일 때 특히 바람직하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어, 이중특이적 분자는 단쇄 이중특이적 항체, 하나의 단쇄 항체 및 결합 결정 부위를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자, 또는 두 개의 결합 결정 부위를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자와 같은 단쇄 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단쇄 분자이거나 적어도 두 개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 미합중국 특허 제5,260,203호; 미합중국 특허 제5,455,030호; 미합중국 특허 제4,881,175호; 미합중국 특허 제5,132,405호; 미합중국 특허 제5,091,513호; 미합중국 특허 제5,476,786호; 미합중국 특허 제5,013,653호; 미합중국 특허 제5,258,498호; 및 미합중국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.

이중특이적 및 다중특이적 분자가 그들의 특이 표적에 결합하는 것은 효소-결합 면역흡착 검정법(ELISA), 방사선면역검정법(RIA), FACS 분석, 생검정법(예, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정법에 의해서 확인될 수 있다. 이들 각 검정법은 관심 있는 단백질-항체 결합체에 특이적인 표지된 시약(예, 항체)를 사용함으로써 특정의 관심 있는 결합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 결합체는 항체-FcR 결합체를 인식하여 그에 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 다른 방법으로, 결합체는 각종 다른 면역검정법 중 어느 것을 사용하여서나 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사성 동위원소 표지되어 방사선면역검정법(RIA)에 사용될 수 있다[참조: Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, 이 문헌의 내용이 본 명세서에서 포함됨]. 방사성 동위원소는 γ 계수기 또는 신틸레이션 계수기를 사용하거나, 오토라디오그래피로 검출될 수 있다.

면역 컨쥬게이트

다른 측면에서, 본 발명에 사용되는 항체는 세포독소, 약물(예, 면역억제제) 또는 방사성 독소와 같은 치료제 잔기에 컨쥬게이트될 수 있다. 그와 같은 컨쥬게이트를 본 명세서에서 "면역컨쥬게이트"라 한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 치명적인(예컨대, 세포를 죽이는) 물질은 어느 것이나 포함한다. 이의 예는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메타인, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 그의 동족체 또는 유사체를 포함한다. 치료제는 또한, 예를 들어, 항대사제(예, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신으로 불림) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신으로 불림), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.

본 발명의 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 다른 바람직한 치료용 세포독소의 예는 두오카르마이신, 칼리키아미신, 마이탄신, 오리스타틴 및 그의 유도체를 포함한다. 칼리키아미신 항체 컨쥬게이트의 예는 시판되고 있다(Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).

세포독소는 본 발명에 사용되는 항체에 당업계에 이용되고 있는 링커 기술에 의해 컨쥬게이트될 수 있다. 세포독소를 항체에 컨쥬게이트하는데 사용되어 온 링커 유형의 예는, 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술파이드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 리소조옴 구역 내 낮은 pH에서 절단될 수 있는 링커, 또는 카텝신(예를 들어, 카텝신 B, C, D)과 같이 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제 등의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 링커를 선택할 수 있다.

세포독소, 링커 및 치료제를 항체에 컨쥬게이트시키는 방법에 대한 더욱 상세한 논의를 위해서 다음 문헌을 참조할 수 있다[참조: Saito, G. et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089- 1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264].

본 발명에 사용되는 항체는 방사성 면역컨쥬게이트라고도 불리우는, 세포독성 방사성약제를 제조하기 위해, 방사성 동위원소에 컨쥬게이트될 수 있다. 진단 또는 치료 목적으로 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 방사성 동위원소는 요오드¹³¹, 인듐¹¹¹, 이트륨⁹⁰ 및 루테늄¹⁷⁷을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 방사성 면역컨쥬게이트를 제조하는 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다. 방사성 면역컨쥬게이트는 제발린(Zevalin)™ (IDEC Pharmaceuticals) 및 벡사르(Bexxar)™ (Corixa Pharmaceuticals)를 포함하여 시판되고 있으며, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성 면역컨쥬게이트를 제조하기 위해 유사한 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 항체 컨쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 개질시킬 수 있으며, 약물 잔기는 고전적인 화학치료제로 한정되는 것은 아니다. 약물 잔기는, 예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질은, 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소와 같은 효소적 활성 독소 또는 그의 독성 단편; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF")와 같은 생물학적 반응 개질제, 또는 기타 성장 억제제를 포함한다.

그러한 치료제 잔기를 항체에 커플링시키는 기술은 공지되어 있다[참조: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)].

프로테아좀 억제제

본 발명에서 CD30 양성 림프종을 치료하기 위하여 항-CD30 항체와 조합하여 직접 또는 간접 억제를 통한 NF-κB의 억제제를 투여할 필요가 있다. 프로테아좀 억제제는 본 발명의 방법에 유용하다. 특정 실시 태양에서, 프로테아좀 억제제는 포유 동물 세포에서 발견되는 26S 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성을 감소 또는 차단한다. 26S 프로테아좀은 도처에 산재되어 있는 단백질을 분해하고 NF-κB 경로를 간접적으로 활성화시키는 큰 단백질 복합체이다. 프로테아좀 활성을 선택적으로 억제하는 것은, 세포 염증 반응을 조절하는 전사 인자인 NF-κB의 활성을 감쇠시키고, 세포 생존에 관련한 유전자인 bcl-2의 활성을 억제하는 등, 암 치료에 관련될 수 있는 다양한 효과를 갖는다. 상승된 NF-κB 및 bcl-2 활성은 암세포 자체가 표준 화학치료제에 의한 치료에 대항하는 것을 돕는다. NF-κB 및 bcl-2의 그와 같은 정상적인 기능을 차단함으로써, 프로테아좀 억제제는 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 26S 프로테아좀의 활성을 억제하는 등의 방식으로 NF-κB의 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시키는 화합물을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

프로테아좀 활성의 억제제 및 그의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 보론산 및 에스테르 화합물은 미합중국 특허 제5,780,454호, 제6,066,730호, 제6,083,903호, 제6,297,217호, 제6,465,433호, 제6,548,668호, 제6,617,317호, 및 제6,747,150호에 기재되어 있다. 다른 프로테아좀 억제제 화합물은 펩티드 알데히드, 예를 들어, ALLnL(N-아세틸-류신일(leucinyl)-류시닐(leucynil)-노르류시날, MGlOl), LLM(N-아세틸-류신일-류시닐-메티오날), Z-LLnV(카르보벤족실-류신일-류시닐-노르발리날, MGl15), Z-LLL(카르보벤족실-류신일-류시닐-류시날, MGl32), 락타시스틴, b-락톤, 보론산 펩티드, 유비퀴틴 리가제 억제제, 시클로스포린 A, FK506(타크로리무스) 및 데옥시스페르구알린을 포함한다.

또한, 화합물들은 DNA 결합 검정(Palombella, et al., Cell 78.773 (1994))을 통하여 NF-κB 활성화를 억제하는 능력에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 전세포 추출물을 시험 화합물과 1 시간 동안 예비처리되었으며 비처리되거나 TNF-α 처리된 세포로부터 제조할 수 있다. NF-κB의 DNA 결합 활성은 인간 IFN-β 유전자 프로모터로부터 PRDII 프로브를 사용하여 전기영동 이동성 쉬프트 검정법으로 측정할 수 있다. NF-κB 활성화의 간접적인 측정으로서, 일차적 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 상의 E-셀렉틴, I-CAM-1 및 V-CAM-I의 세포 표면 발현을 세포 표면 형광 면역-결합 검정으로 측정할 수 있다. E-셀렉틴, I-CAM-1 및 V-CAM-1은 NF-κB의 조절 하에 있기 때문에, NF-κB 활성화를 억제하면 세포 표면 상의 이들 접착 분자의 수준이 감소된다.

본 발명의 특정 실시 태양에서, 프로테아좀 억제제는 보르테조밉( Bortezomib; Millenium Pharmaceuticals; Cambridge, MA)이며, 이는 26S 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성의 가역적 억제제이고, 미합중국 특허 제5,780,454호에 기재되어 있다. 또 다른 실시 태양에서, 프로테아좀 억제제는 MG-132 (Calbiochem, CA)이다.

본 명세서에서, "NF-κB를 억제하는 화합물"은 직접적으로나 간접적으로 NF-κB의 활성에 영향을 주어, 아폽토시스를 허용하도록 할 수 있도록 NF-κB의 활성을 감소시키거나 차단하는 임의의 화합물 말한다. 상기한 프로테아좀 억제제는 NF-κB의 활성에 간접적으로 영향을 주는 화합물의 예이다.

약제학적 조성물

본 발명의 방법은 (i) 본 발명의 항-CD30 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분 1종 또는 그의 조합을 약제학적으로 허용가능한 담체와 제제화된 상태로 함유하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물, 및 (ii) 프로테아좀 억제제를 약제학적으로 허용가능한 담체와 제제화된 상태로 함유하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 사용한다. 항체 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체, 면역컨쥬게이트 또는 이중특이적 분자 1종 또는 조합(예를 들어, 2종 이상의 상이한 종류)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 약제학적 조성물은 CD30 상의 다른 에피토프에 결합하거나 상보적 활성을 갖는 항체(또는 면역컨쥬게이트 또는 이중특이적 분자)의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명에 사용되는 약제학적 조성물은 또한 추가의 치료제와 병용될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 경우, 본 발명의 병용 치료제, 즉, 항체와 프로테아좀 억제제는 적어도 하나의 항종양제, 세포 성장 정지제, 또는 세포 독성제를 포함할 수 있다. 본 발명의 병용 요법에 사용될 수 있는 추가의 치료제의 예는 하기 본 발명 항체의 용도에 관한 기재 부분에 더욱 상세히 기재되어 있다.

본 명세서에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 생리적으로 상용되는 모든 또는 임의의 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수내 또는 상피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입하여)에 적절하다. 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 항체, 면역컨쥬게이트 또는 이중특이적 분자는 산, 또는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 기타 자연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.

본 발명의 약제학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 염"이란 패런트 화합물의 목적하는 활성을 유지하며, 바람직하지 않은 독성 효과를 나타내지 않는 염이다[참조: Berge, S.M., et al., (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19)]. 그와 같은 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 비독성 무기산 뿐만 아니라, 지방족 모노 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다. 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리 토금속 뿐만 아니라 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민으로부터 유도된 것을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 항산화제의 예는 (1) 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 나트륨 비술페이트, 나트륨 메타비술파이트, 나트륨 술파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 오일 가용성 항산화제; 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그들의 적절한 혼합물, 올리브 유와 같은 식물성 오일, 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하거나 또는 계면활성제를 사용하여 적절한 유동도를 유지할 수 있다.

이들 조성물은 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산화제와 같은 보조제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 멸균 처리를 하거나, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 각종 항균 및 항진균제를 첨가함으로써 보장될 수 있다. 조성물에 설탕, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약제 형태의 장기간 흡수를 위하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킬 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위해 멸균 분말을 포함할 수 있다. 약제학적으로 활성인 물질에 사용하기 위한 그와 같은 매질 또는 물질은 당업계에 알려져 있다. 종래의 매질 또는 물질이 활성 화합물과 비상용적이지 않는 한, 그와 같은 매질 또는 물질을 본 발명의 약제학적 조성물에 사용할 수 있다. 보충적 활성 화합물을 또한 조성물 내에 혼입시킬 수 있다.

치료제 조성물은 전형적으로 멸균 상태이어야 하며, 제조 및 저장 조건 하에 안정하여야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 고농도 약물에 적절한 기타 조정된 구조일 수 있다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하거나 또는 계면활성제를 사용하여 적절한 유동도를 유지할 수 있다. 많은 경우에 있어서, 조성물에 설탕, 만니톨, 솔비톨과 같은 폴리알콜, 또는 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약제 형태의 장기간 흡수를 위하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킬 수 있다.

멸균 주사 용액은 적절한 용매에, 필요에 따라, 상기 열거한 성분 중의 하나 또는 조합과 함께 필요량의 활성 화합물을 혼입시키고, 멸균 마이크로필터링하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적 분산매와 상기 열거한 것 중의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 제조에 있어서는, 활성 성분과 기타 추가의 바람직한 성분을 함유하는 미리 멸균 여과된 용액으로부터 진공 건조 및 동결 건조(라이오필라이제이션)하여 얻는 것이 바람직하다.

단일 투여형을 생산하기 위하여 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상 및 투여 경로에 따라서 달라질 것이다. 단일 투여형을 생산하기 위하여 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 조성물 100 퍼센트 중 약 0.01 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1 내지 30 퍼센트의 활성 성분이 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 존재한다.

투여량 계획은 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예컨대, 투여량을 볼러스(bolus)로 일회 투여하거나, 얼마 간의 시간에 걸쳐 수 회 분할 투여하거나, 치료 상황에 나타나는 바에 따라 비례적으로 감소 또는 증가할 수 있다. 투여의 편의성 및 투여량 균일성을 고려하여 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 매우 바람직하다. 본 명세서에서, 투여량 단위 형태란 치료될 대상을 위한 단위 용량으로서 적합하게 만든 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 목적하는 치료 효과를 내도록 계산된 소정량의 활성 화합물과 필요한 약제학적 담체를 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태의 구체적인 양은 (a) 활성 화합물의 특유한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 개인에 따른 감도의 치료를 하기 위해 활성 화합물을 혼화하는데 있어서 당 분야 고유의 한계에 의해 지시되고 직접적으로 좌우된다. 항체의 투여를 위하여, 투여량은 숙주 체중을 기준으로 하여 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 전형적으로는 0.01 내지 25 mg/kg이다. 예를 들어, 투여량은 체중을 기준으로 하여 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg, 12.5 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 20 mg/kg, 또는 25 mg/kg 또는 1 내지 25 mg/kg 범위 내이다. 예시적인 치료 계획은 항체와 프로테아좀 억제제 조성물을 1주에 1회, 격주로 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 1월에 1회, 3월에 1회, 6월에 1회 동시에 투여하는 것이다. 본 발명의 항-CD30 항체의 바람직한 투여 계획은 정맥내 경로로 체중을 기준으로 1 mg/kg 또는 3 mg/kg 투여하는 것을 포함하며, 이때 항체는 (i) 매 4주마다 총 6회를 투여한 후, 매 3개월 마다 투여; (ii) 매 3주마다 투여; (iii) 3 mg/kg로 한번 투여 후 매 3주 마다 1 mg/kg씩 투여하는 방법으로 투여된다.

프로테아좀 억제제의 투여를 위하여, 투여량은 숙주 체중을 기준으로 하여 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 전형적으로는 0.01 내지 25 mg/kg이다. 예를 들어, 투여량은 체중을 기준으로 하여 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg, 12.5 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 20 mg/kg, 또는 1 내지 20 mg/kg 범위 내이다. 예시적인 치료 계획은 1주에 1회, 격주로 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 1월에 1회, 3월에 1회, 6월에 1회 투여하는 것이다. 본 발명의 항-CD30 프로테아좀 억제제의 바람직한 투여 계획은 정맥내 경로로 체중을 기준으로 1 mg/kg 또는 3 mg/kg 투여하는 것을 포함하며, 이 때 프로테아좀 억제제는 (i) 매 4주마다 총 6회를 투여한 후, 매 3개월 마다 투여; (ii) 매 3주마다 투여; (iii) 3 mg/kg로 한번 투여 후 매 3주 마다 1 mg/kg씩 투여하는 방법으로 투여된다.

몇몇 경우에, 상이한 특이성을 갖는 2종 이상의 모노클로날 항체를 동시에 투여할 수 있으며, 이 때 각 항체의 투여량은 상술한 범위 내에 들 것이다. 항체는 대개 여러 번 투여된다. 개별 투여시 마다의 간격은, 예를 들어, 1주, 1월, 3월 또는 1년이 될 수 있다. 간격은 또한 환자의 표적 항원에 대한 항체의 혈중 농도 측정에 의해 나타난 바에 따라 불규칙적일 수도 있다. 몇몇 방법에서는, 혈장 항체 농도가 약 1 내지 1000 μg/ml, 다른 몇몇 방법에서는 약 25 내지 300 μg/ml이 되도록 투여량이 조정된다.

다른 방법으로서, 항체 및 프로테아좀 억제제는 보다 덜 빈번하게 투여할 수 있는 서방성 제형으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자 내 항체의 반감기에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 가지며, 그 다음이 인간화 항체, 키메라 항체, 비인간 항체의 순이다. 투여량 및 빈도는 예방 목적인가 또는 치료 목적인가에 따라 달라질 것이다. 예방을 목적으로 하는 경우, 상대적으로 낮은 용량을 장기간에 걸쳐 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 투여한다. 일부 환자는 평생 치료를 계속하여야 한다. 치료를 목적으로 하는 경우, 질병의 진전이 감소 또는 종결될 때 까지, 바람직하게는 환자 증상의 부분적 또는 완전한 완화가 나타날 때 까지, 상대적으로 높은 용량을 상대적으로 짧은 간격으로 투여하는 경우가 있다. 이후에 환자는 예방적 투여 단계로 들어간다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 화합물의 실제 용량은 환자에 독성을 나타내지 않으면서, 환자, 조성물 및 투여 경로에 따라서 목적하는 치료 반응을 유효하게 달성하는 양의 활성 성분이 되도록 변화시킬 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용된 본 발명의 조성물, 그의 에스테르, 염 또는 아민의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 방출 속도, 치료 계속 기간, 사용된 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 일반적인 건강 상태 및 병력, 기타 의학 분야에 알려진 다른 인자 등을 포함하는 각종 약물동력학적 요인에 따라 달라질 것이다.

본 발명에 사용되는 항-CD30 항체 및 프로테아좀 억제제의 "치료 유효량"은 바람직하게는 질병 증상의 정도를 감소시키고, 질병 증상이 나타나지 않는 기간의 빈도 및 지속 시간을 증가시키거나, 질병의 침투에 기인한 손상 또는 장애를 방지한다. 예를 들어, CD30 양성 림프종의 치료에 있어서, "치료 유효량"은 치료되지 않은 환자에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 가량 세포 성장 또는 종양 성장을 억제한다. 화합물의 종양 성장 억제 능력은 실시예에 기재된 바와 같이, 인간 종양에서의 효능을 예견하는 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또 다른 방법으로는, 당업자에 공지된 검정법으로 화합물의 시험관내 억제와 같은 억제 능력을 검사하여 평가할 수 있다. 그러한 검정법은 실시예에, XTT-검정, 리포터 유전자 검정, TUNEL 검정, 어넥신 등이 기재되어 있다. 치료 화합물 치료 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 다른 식으로 환자의 증상을 완화시킬 수 있다. 당업자는 환자의 크기, 증상의 심각도, 선택된 조성물 및 투여 경로와 같은 요소를 고려하여 치료 유효량을 결정할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 각종 방법 중 하나 이상의 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로로 투여될 수 있다. 당업자에 자명한 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방법은 목적하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 항체를 위한 바람직한 투여 경로는 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수내 투여, 또는 기타 비경구 투여를 포함한다. 본 명세서에서 "비경구 투여"란 장내 및 국소 투여를 제외하고, 대개는 주사에 의한 투여 방법을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 기관내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관관통, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지망막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

다른 방식으로, 본 발명의 항체는 경구 경로, 예를 들어, 국소, 상피 또는 점막 투여 경로로, 비내, 구강내, 질내, 직장내, 설하 또는 국소적으로 투여될 수 있다.

활성 화합물은 그것이 급속히 방출되는 것을 막는 담체와 함께, 임플란트, 경피용 패취, 마이크로캡슐화 전달계를 포함하는 서방성 제형으로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생친화성 중합체를 사용할 수 있다. 그와 같은 제형을 제조하는 많은 방법이 특허되거나 당업자에 일반적으로 알려져 있다[참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].

치료제 조성물은 당업계에 공지된 의료용 디바이스로 투여될 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 치료제 조성물은 바늘이 없는 피하 주사용 디바이스로 투여될 수 있으며, 그러한 디바이스는 미합중국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 개시되어 있다. 본 발명에 유용한 공지된 임플란트 및 모듈의 예로서, 미합중국 특허 제4,487,603호는 조절된 속도로 약물을 방출하기 위한 이식 가능한 마이크로-주입 펌프를 개시하고 있고; 미합중국 특허 제4,486,194호는 피부를 통해 약제를 투여하는 치료용 디바이스를 개시하고 있으며; 미합중국 특허 제4,447,233호는 정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시하고 있고, 미합중국 특허 제4,447,224호는 지속적 약물 전달을 위한 가변 유동 이식용 주입 장치를 개시하고 있고; 미합중국 특허 제4,439,196호는 멀티 챔버 구획을 갖는 삼투압 약물 전달계를 개시하고 있으며; 미합중국 특허 제4,475,196호는 삼투압 약물 전달계를 개시하고 있다. 이들 특허의 내용이 본 명세서에서 포함된다. 다른 많은 임플란트, 전달계 및 모듈이 당업계에 공지되어 있다.

특정 실시 태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내에서 적절히 분포되도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈관-뇌 장벽(BBB)은 많은 고 친수성 화합물의 사용에 장애가 된다. 본 발명의 치료용 화합물이 (원하는 바에 따라) BBB를 통과하기 위해서는, 예를 들어, 리포조옴 내에 제형화될 수 있다. 리포조옴을 생산하는 방법은, 예를 들어, 미합중국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호에 기재되어 있다. 리포조옴은 특이적 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 잔기를 가짐으로써 표적화 약물 전달을 증진시킨다[참조: V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685)]. 표적화 잔기의 예는 폴레이트 또는 비오틴(미합중국 특허 제5,416,016호, Low et al.); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134): pl20 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)를 포함하며, 또한 문헌[K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 각종 방법으로 투여될 수 있다. 당업자에 자명한 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방법은 목적하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 활성 화합물은 그것이 급속히 방출되는 것을 막는 담체와 함께, 임플란트, 경피용 패취, 마이크로캡슐화 전달계를 포함하는 서방성 제형으로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생친화성 중합체를 사용할 수 있다. 그와 같은 제형을 제조하는 많은 방법이 특허되거나 당업자에 일반적으로 알려져 있다[참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].

본 발명의 화합물을 특정의 경로로 투여하기 위해, 화합물을 그의 불활성화를 막는 물질로 코팅하거나 그와 동시에 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 리포조옴 또는 희석제와 같은 적절한 담체 중에서 개체에 투여한다. 약제학적으로 허용가능한 희석제는 생리식염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 리포조옴은 종래의 리포조옴 뿐만 아니라 수중유중수 CGF 에멀젼을 포함한다[참조: Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27)].

약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 약제학적으로 활성인 물질에 사용하기 위한 그와 같은 매질 또는 물질은 당업계에 알려져 있다. 종래의 매질 또는 물질이 활성 화합물과 비상용적이지 않는 한, 그와 같은 매질 또는 물질을 본 발명의 약제학적 조성물에 사용할 수 있다. 보충적 활성 화합물을 또한 조성물 내에 혼입시킬 수 있다.

투여량 계획은 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예컨대, 투여량을 볼러스로 일회 투여하거나, 얼마 간의 시간에 걸쳐 수 회 분할 투여하거나, 치료 상황에 나타나는 바에 따라 비례적으로 감소 또는 증가할 수 있다. 투여의 편의성 및 투여량의 균일성을 고려하여 비경구 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 매우 바람직하다. 본 명세서에서, 투여량 단위 형태란 치료될 대상을 위한 단위 용량으로서 적합하게 만든 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 목적하는 치료 효과를 내도록 계산된 소정량의 활성 화합물과 필요한 약제학적 담체를 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태의 구체적인 양은 (a) 활성 화합물의 특유한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 개인에 따른 감도의 치료를 하기 위해 활성 화합물을 혼화하는데 있어서 당 분야 고유의 한계에 의해 지시되고 직접적으로 좌우된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 항산화제의 예는 (1) 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 나트륨 비술페이트, 나트륨 메타비술파이트, 나트륨 술파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 오일 가용성 항산화제; 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다.

치료용 조성물에 있어서, 본 발명의 제제는 경구, 비내, 국소(볼 안쪽 및 설하 투여 포함), 직장내, 질내 및/또는 비경구 투여 제제를 포함한다. 제제는 단위 투여형으로 편리하게 제조될 수 있으며, 당 분야에 알려진 어느 방법으로나 제조할 수 있다. 단일 투여형을 생산하기 위하여 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상 및 투여 경로에 따라서 달라질 것이다. 단일 투여형을 생산하기 위하여 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 조성물 100 퍼센트 중 약 0.01 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 70 %, 가장 바람직하게는 약 1 내지 30 퍼센트의 활성 성분이 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 존재한다.

본 명세서에서 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된다"라는 것은 장내 및 국소 투여를 제외한 투여, 일반적으로 주사에 의한 것을 의미하며, 이러한 투여의 예로서 정맥내, 근육내, 동맥내, 기관내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관관통, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지망막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

항체 및 프로테아좀 억제제 조성물은 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산화제와 같은 보조제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 멸균 처리를 하거나, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 각종 항균 및 항진균제를 첨가함으로써 보장될 수 있다. 조성물에 설탕, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약제 형태의 장기간 흡수를 위하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킬 수 있다.

본 발명의 화합물이 약제로서 인간 및 동물에 투여될 때, 단독으로 투여되거나 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 0.01 내지 99.5%(보다 바람직하게는 0.1 내지 90%)의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다.

투여 경로와 무관하게, 본 발명의 화합물은 적절한 수화물 형태로 사용될 수 있고, 그리고/또는 본 발명의 약제학적 조성물은 당업자에게 알려진 종래의 방법으로 약제학적으로 허용가능한 투여형으로 제형화될 수 있다.

당 분야의 통상의 기술을 가진 의사나 수의사는 약제학적 조성물의 필요 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있을 것이다. 예를 들어, 의사나 수의사는 약제학적 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 양을 목적하는 치료 효과를 달성하는 양 보다 적은 양 부터 시작하여, 목적하는 효과를 얻을 때 까지 점차적으로 투여량을 늘려나갈 것이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적절한 1일 투여량은 치료 효과를 나타내는 최소량일 수 있다. 그와 같은 유효량은 일반적으로는 상기한 인자에 따라 달라진다. 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하에, 바람직하게는 표적 위치에 근접하게 투여하는 것이 바람직하다. 필요에 따라서는, 치료제 조성물의 1일용량을 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 소단위로 나누어, 임의로는 단위 용량 형태로, 하루에 적절한 간격을 두고 분리하여 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 약제학적 제제(조성물)의 형태로 투여할 수 있다.

특정 실시 태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내에서 적절히 분포되도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈관-뇌 장벽(BBB)은 많은 고 친수성 화합물의 사용에 장애가 된다. 본 발명의 치료용 화합물이 (원하는 바에 따라) BBB를 통과하기 위해서는, 예를 들어, 리포조옴 내에 제형화될 수 있다. 리포조옴을 생산하는 방법은, 예를 들어, 미합중국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호에 기재되어 있다. 리포조옴은 특이적 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 잔기를 가짐으로써 표적화 약물 전달을 증진시킨다[참조: V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685)]. 표적화 잔기의 예는 폴레이트 또는 비오틴(미합중국 특허 제5,416,016호, Low et al.); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 본 발명의 분자뿐 아니라, 본 발명의 제제를 포함할 수 있는 다른 종인 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134): pl20 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)를 포함하며, 또한 문헌[K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시 태양에서, 본 발명의 치료제 화합물은 리포조옴으로 제제화되며, 보다 바람직한 실시 태양에서, 리포조옴은 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시 태양에서, 리포조옴 중의 치료제 화합물은 볼러스 주사에 의해 목적하는 부분에 근접한 위치, 예컨대, 염증 또는 감염 부위 또는 종양 부위로 전달된다. 조성물은 시린지로 쉽게 투여할 수 있을 정도로 유동성을 가져야 한다. 또한, 생산 및 저장 조건하에 안정하여야 하며, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해서 보존될 수 있어야 한다.

"치료 유효량"은 치료되지 않은 환자에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 가량 세포 성장 또는 종양 성장을 억제한다. 화합물의 종양 성장 억제 능력은 실시예에 기재된 바와 같이, 인간 종양에서의 효능을 예견하는 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또 다른 방법으로는, 당업자에 공지된 검정법으로 화합물의 시험관내 억제와 같은 억제 능력을 검사하여 평가할 수 있다. 치료 화합물 치료 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 다른 식으로 환자의 증상을 완화시킬 수 있다. 당업자는 환자의 크기, 증상의 심각도, 선택된 조성물 및 투여 경로와 같은 요소를 고려하여 치료 유효량을 결정할 수 있다.

조성물은 멸균되어야 하며, 시린지로 전달할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 물에 더하여, 담체는 등장성 완충 생리식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 프로필렌 글리콜 등), 및 그들의 적절한 혼합물일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하거나 또는 계면활성제를 사용하여 적절한 유동도를 유지할 수 있다. 조성물에 설탕, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약제 형태의 장기간 흡수를 위하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킬 수 있다.

활성 화합물이 상술한 바와 같이 적절히 보호될 때, 불활성 희석제 또는 상용성 식용 담체화 함께 경구 투여될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 종양 생성 질병, 예를 들어, 호지킨 병(Hodgkin's disease), 퇴행성 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종(ATL), 혈관면역아세포 림프선증(AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강성 림프종, 배아종성 암, 비인두의 미분화 암(예를 들어, 슈밍크 종양(Schmincke's tumor)), 캐슬먼 병(Castleman's disease), 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma) 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종을 포함하는, CD30 발현 종양 세포를 특징으로하는 질병이 있는 대상에 사용할 수 있다. 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 다른 질병, 예를 들어, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, 전신 경화증, 아토피성 피부염, 그레이브즈 병(Graves' disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 베그너 육아종증(Wegner's granulomatosis), 오멘 증후군(Omen's syndrome), 만성 신부전, 급성 감염성 단핵증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질병을 포함하는 자가면역 질병이 있는 개체를 치료하는데 사용할 수 있다.

특정 실시 태양에서, 본 발명의 방법은 각종 CD30 관련 질병을 치료, 예방 또는 진단하기 위해 생체내 사용된다. CD30 관련 질병의 예는, 대표적으로, 호지킨 병, 퇴행성 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종(ATL), 혈관면역아세포 림프선증(AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강성 림프종, 배아종성 암, 비인두의 미분화 암(예를 들어, 슈밍크 종양), 캐슬먼 병, 카포시 육종 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종을 포함한다. 다른 CD30 관련 질병은 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, 전신 경화증, 아토피성 피부염, 그레이브즈 병, 하시모토 갑상선염, 베그너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질병을 포함한다.

특정 실시 태양에서, 본 발명의 방법은 호지킨 병(HD)을 치료 또는 예방하는데 사용되는데, 이 때 항체는 호지킨 병 및 기타 종양생성 질병의 진전에서 CD30의 역할을 제한한다. 호지킨 병은 일종의 림프종이다. 림프종은 인체 면역계의 일부인 림프계에서 발달하는 암이다. 인체의 많은 부분에 림프 조직이 있기 때문에, HD는 인체의 거의 모든 부분에서 시작할 수 있다. 암은 간, 골수(인체의 큰 뼈 안쪽의, 혈액 세포를 만드는 스폰지 조직) 및 지라를 포함하여, 인체의 거의 모든 기관이나 조직으로 퍼질 수 있다. 호지킨 및 리드-스테른베르크(Reed-Sternberg) 세포에서 CD30 발현의 증가는 HD의 분화 진단과 관련이 있는 것으로 보고되었다. CD30 억제 항체와 프로테아좀 억제제의 조합은 HD에 이르는 CD30의 효과를 방지 또는 차단하는데 사용될 수 있으며, 따라서 그와 같은 질병을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다.

인간 항체(예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 항체)와 프로테아좀 억제제의 조합은 CD30의 다른 효과를 차단 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 예컨대, CD30는 각종 비-호지킨 림프종 아형에서 조절되어 발현된다는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 다른 용도는 비-호지킨 림프종과 관련된 질병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 그와 같은 질병은 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 퇴행성 대세포 림프종(ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소형 절단-세포 림프종, 림프구성 림프종, 말단 T-세포 림프종, 레너트 림프종(Lennert's lymphomas), 면역아세포 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병(T-ALL), 및 중심아세포/중심세포(cb/cc) 소포성 림프종을 포함한다.

또 다른 실시 태양에서, 본 발명의 방법은 CD30의 다른 효과를 차단 또는 억제하기 위하여 사용할 수 있다. 예를 들어, CD30 발현 세포의 표면으로부터 가용성 CD30가 조절되어 떨어져 나온다는 것이 알려져 있다. 각종 종양 생성 및 자가면역 질병에서 환자의 혈청 내 sCD30 농도가 증가되는 것으로 보고되었다. 따라서, 항-CD30 항체와 프로테아좀 억제제의 조합은 sCD30가 떨어져 나오는 것을 차단 또는 억제하는 것과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 그와 같은 질병은 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, 전신 경화증, 아토피성 피부염, 그레이브즈 병, 하시모토 갑상선염, 베그너 육아종증 및 오멘 증후군을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 있어서, 항체 및 프로테아좀 억제제의 약제학적 조성물의 생체내 및 시험관내 투여 경로는 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예컨대, 항체 조성물은 주사(예를 들어, 정맥내 또는 피하)로 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적절한 투여량은 환자의 연령 및 체중, 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라 달라질 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 인간 항-CD30 항체와 프로테아좀 억제제는 하나 이상의 다른 치료제, 예컨대, 세포독성제, 방사성 독성제 또는 면역억제제와 함께 투여될 수 있다. 항체는 그와 같은 물질에 결합되거나(면역결합체) 그와 별개로 분리되어 투여될 수 있다. 후자와 같은 경우(분리 투여의 경우), 항체는 그와 같은 물질의 투여 전, 후 또는 그와 동시에 투여되거나, 다른 공지의 요법, 예를 들어, 방사선 항암 요법과 함께 투여될 수 있다. 그와 같은 치료제는, 대표적으로, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴, 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 및 시클로포스파미드 히드록시우레아 등과 같은 항신생물제를 포함하는데, 이들은 단독으로 사용할 때 환자에 대해서 독성이거나 아독성인 경우에만 효과를 낸다. 시스플라틴은 매 4주 마다 1회, 100 mg/m² 용량으로 정맥내 투여되고, 아드리아마이신은 매 21일 마다 1회, 60 내지 75 mg/m² 용량으로 정맥내 투여된다. 다른 화학치료제와의 병용 투여는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 두 가지 항암제를 사용하여 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 나타낸다. 그러한 병용 투여는 약물 내성 발달, 종양 세포를 항체와 비반응성이게 만드는 항원성의 변화 등에 기인한 문제점들을 해결할 수 있다.

본 발명의 표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어, 조성물(예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 결합된 이펙터 세포가 또한 치료제로 사용될 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 대식세포, 중성구 또는 단핵구와 같은 인간 백혈구일 수 있다. 다른 세포는 호산구, 천연 킬러 세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체 수반 세포를 포함한다. 필요에 따라, 이펙터 세포는 치료할 개체로부터 얻을 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액 중 세포 현탁액의 형태로 투여될 수 있다. 투여 세포의 수는 10⁸ 내지 1O⁹일 수 있으나, 치료 목적에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로는, 그와 같은 양은 CD30 발현 종양 세포와 같은 표적 세포에 배치되어, 예를 들어, 식작용과 같은 세포 사멸을 일으키는데 충분한 양일 것이다. 투여 경로 또한 다양할 수 있다.

표적-특이적 이펙터 세포를 사용하는 치료법은 표적 세포를 제거하는 다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물(예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및/또는 그와 같은 조성물이 수반된 이펙터 세포를 사용하는 종양 치료 요법은 화학요법과 함께 수행될 수 있다. 또한, 병용 면역요법을 사용하여 두 가지 상이한 세포독성 이펙터 세포 집단을 종양 세포 거부에 대하여 유도할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 결합된 항-CD30 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 이펙터 세포 상의 FcγR 또는 FcαR 수준을 세포 표면상의 수용체를 캡핑하여 제거하는 방식으로 조절하는데 사용할 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물을 또한 이와 같은 목적에 사용할 수 있다.

보체에 결합하는 IgGl, -2 또는 -3 또는 IgM의 부분으로부터의 보체 결합 부위를 갖는, 본 발명에 사용되는 항체 및 프로테아좀 억제제 조성물은 또한 보체의 존재하에 사용될 수 있다. 하나의 실시 태양에서, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터 세포로 생체외 처리하는 것은 보체 또는 보체 함유 혈청을 가하여 보충될 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식작용은 보체 단백질의 결합에 의해 개선될 수 있다. 또 다른 실시 태양에서, 본 발명의 조성물(예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는 보체에 의해 용해될 수 있다. 또 다른 실시 태양에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.

본 발명의 조성물(예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역컨쥬게이트)은 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범주에는 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물이 포함된다. 이와 같은 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 근접하여 위치한다는 장점이 있다. 다른 방식으로는, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 혈청 또는 보체가 분리하여 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 항체 및 프로테아좀 억제제로 치료되는 환자는 본 발명의 인간 항체를 투여하기 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 세포독성제 또는 방사선 독성제와 같은 다른 치료제를 추가로 투여받을 수 있는데, 이는 인간 항체의 치료 효과를 증진 내지는 확장할 것이다.

다른 실시 태양에서, 개체는 예컨대 사이토카인으로 처리를 받는 것과 같이, Fcγ 또는 Fcα 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 즉 증진 또는 억제하는 제제로 추가로 처리될 수 있다. 다중특이적 분자로 치료하는 과정에 투여하기에 바람직한 사이토카인은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ), 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다.

또 다른 실시 태양에서, 개체는 림포카인 제제로 추가로 처리될 수 있다. CD30를 고도로 발현하지 않는 암 세포는 림포카인 제제를 사용하여 그렇게 되도록 유도될 수 있다. 림포카인 제제는 종양의 세포 중에서 CD30를 보다 균질하게 발현시키도록 하므로, 보다 효과적인 치료법이 될 수 있다. 투여에 적절한 림포카인 제제는 인터페론-감마, 종양 괴사 인자 및 그들의 조합물이다. 이들은 정맥내 투여될 수 있다. 적절한 림포카인 투여량은 환자 당 10,000 내지 1,000,000 단위이다.

본 발명에 사용되는 항체 및 프로테아좀 억제제는 FcγR 또는 CD30를 발현하는 세포를 표적화하기 위하여, 예를 들어, 그와 같은 세포를 표지화하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같이 사용할 때, 결합제를 검출될 수 있는 분자에 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 FcγR와 같은 Fc 수용체 또는 CD30를 발현하는 세포를 생체외 또는 시험관내에서 찾아내는 방법을 제공한다. 검출될 수 있는 표지는, 예를 들어, 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소-조인자일 수 있다.

또 다른 실시 태양에서, 본 발명은 환자에게 상기한 인간 항체를 투여하여, CD30 매개 질환, 예를 들어, 호지킨 병, 성인 T-세포 림프종, 감염성 단핵증, 및 전신성 홍반성 낭창을 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 항체 및 그의 유도체는 특정 질환과 관련이 있는 CD30 유도된 활성, 예컨대, 증식 및 분화를 억제하는데 사용된다. 본 발명의 항체에 의해 억제될 수 있는 다른 CD30 유도된 활성은 가용성 sCD30의 생산 증가, IL-4의 발현 증가, Th2 표현형의 생산 증가를 포함한다. 항체를 CD30와 접촉시킴으로써(예를 들어, 항체를 개체에 투여하여), CD30가 그러한 활성을 유도하는 능력이 억제되고, 따라서 관련된 질환이 치료되는 것이다. 바람직한 항체는 CD30에 특이적인 에피토프에 결합하며, 따라서 CD30 유도 활성은 효과적으로 억제하나, NGFR, CD27 및 CD40과 같이 구조적으로 관련된 표면 항원의 활성에는 간섭하지 않는다.

따라서, 또 다른 실시 태양에서, 본 발명은 인간 CD30에 의해 매개되는 종양 생성 질환, 예를 들어, 호지킨 병, 비-호지킨 림프종, 퇴행성 대세포 림프종(ALCL), 성인 T-세포 림프종(ATL), 혈관면역아세포 림프선증(AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강성 림프종, 배아종성 암, 비인두의 미분화 암(예를 들어, 슈밍크 종양), 캐슬먼 병, 카포시 육종 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법은 개체에 본 발명의 항체 조성물을 질병을 치료하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 항체 조성물은 단독으로 투여되거나, CD30 매개 질환을 치료함에 있어서 본 발명의 조성물과 함께 또는 상승적으로 작용하는 세포독성제 또는 방사성독성제와 같은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 특정의 바람직한 실시 태양에서, 본 발명은 호지킨 병을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 특히 바람직한 실시 태양에 있어서, 본 발명은 ALCL의 치료 방법을 제공한다.

또 다른 실시 태양에서, 본 발명은, 예를 들어, 류머티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, 전신 경화증, 아토피성 피부염, 그레이브즈 병, 하시모토 갑상선염, 베그너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질환과 같은, 인간 CD30에 의해 매개되는 자가 면역 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 이 방법은 개체에 본 발명의 항체 및 프로테아좀 억제제 조성물을 질병을 치료 또는 예방하는데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 항체 조성물은 단독으로 투여되거나, CD30 매개 질환을 치료함에 있어서 본 발명의 조성물과 함께 또는 상승적으로 작용하는 면역억제제와 같은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.

또 다른 실시 태양에서, 본 발명의 면역컨쥬게이트는 화합물을 항체에 결합시킴으로써 그러한 화합물(예를 들어, 치료제, 표지, 세포 독소, 방사성 독소, 면역 억제제 등)을 표면에 CD30가 결합되어 있는(예를 들어, 막 결합 또는 CD30 수용체에 결합되어 있는) 세포로 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 생체외 또는 시험관 내에서 CD30 및 CD30 수용체를 발현하는 세포, 예를 들어, 호지킨 세포 또는 리드-스테른베르크 세포를 (예를 들어, 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 조인자와 같은 검출가능한 표지를 사용하여) 찾아내는 방법을 제공한다. 다른 방식으로는, 면역컨쥬게이트는 세포독소 또는 방사성독소를 CD30 표적으로 유도함으로써 CD30가 표면에 결합되어 있는 (예를 들어, 막 결합 또는 CD30 수용체에 결합되어 있는) 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예로 더욱 상세히 설명될 것이나, 본 발명이 그에 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다.

인간 항-CD30 항체에 의한 NF-κB의 활성화, 및 프로테아좀 억제제-유도된 아폽토 시스에 대한 림프종 세포의 감작

5F11은 시험관내 및 생체내에서 CD30-발현 림프종 세포주의 성장 정지 또는 사멸을 유도하는데 효과적인 것으로 나타난, CD30에 대하여 유도된 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 그러나, 일부 세포주는 5F11-유도된 아폽토시스에 부분적으로 또는 완전히 저항성이 있는 것으로 나타났다. 본 실시예에서는, 5F11과, 항종양 활성을 갖는 프로테아좀 억제제인 보르테조밉과의 조합물의 효능을 시험하였다. XTT 생활성 시험, TUNEL 검정법 및 FACS 분석에 의해서, 5F11과 보르테조밉의 상승적 세포 독성 효과가 호지킨 세포주(L540, L428) 및 CD30 발현 ALCL 카르파스(Karpas) 299에 의해 나타났다. 또한, SCID 마우스에서 피하 L540 유도된 인간 호지킨 종양의 성장은 보르테조밉과 조합된 5F11에 의해 억제된 반면, 각각 단독으로 사용한 경우의 효과의 합은 덜 효율적인 것으로 나타났다. 시험관 내에서 5F11과 보르테조밉의 상승 효과는 사용된 스케쥴에 따라 변화하며, 두 가지를 동시에 가하거나 세포를 우선 5F11과 먼저 프리-인큐베이션시킨 후에만 나타났다.

재료 및 방법

세포주

호지킨-유도 세포주(L540 및 L428), 퇴행성 대세포 림프종 유도 카르파스 299 및 CD30-음성 급성 림프성 백혈병-유도 세포주 REH를 제조원(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DMSZ))으로부터 얻었으며, 이들의 특성은 상술한 바와 같다. 모든 세포를 10% (v/v) 열-불활성화 송아지 태아 혈청(FCS), 50μg/ml 스트렙토마이신, 50μg/ml 페니실린 및 2mM L-글루타민으로 보 충된 RPMI-1640 배지 중, 37 ℃, 5% CO₂ 대기하에 배양하였다. 배지를 1주에 2회 및 검정을 수행하기 24시간 전에 교체하였다. 검정을 FCS 및 항생물질이 없는 배지(플레인 배지)에서 수행하였다.

항체, 시약 및 플라스미드

항-CD30 항체 5F11을 제조원(Medarex Inc., Bloomsbury, NJ)으로부터 공급받았다. 염소 항-인간 Fc 항체(GaH)를 제조원(Dianova/Jackson, USA)으로부터 구입하였다. 프로테아좀 억제제 MG-132를 제조원(Calbiochem, CA) 으로부터, 보르테조밉(Velcade)을 제조원(Millennium, MA)으로부터 구입하였다.

토끼 항-p65-IgG 및 FITC-표지 마우스-항-토끼-IgG를 제조원(Santa Cruz, USA)으로부터 수득하였다. 발현 벡터 및 NF-κB 활성화의 측정을 위한 리포터 구조물(NF-kB-luc, IkBaM)을 제조원(Clontech, BD Biosciences, CA (Mercury Vector Set))으로부터 입수하였다.

XTT-검정법

2 x 10⁴ 개의 세포를 96-웰-마이크로타이터 플레이트(조직 배양 등급의 편평한 바닥)의 각 웰에서 인큐베이션하였다. 세포를 37 ℃에서 5μg/ml 항-CD30-항체5F11 및 25μg/ml 가교 결합 항체 염소-항-인간(GaH)과 함께 프리인큐베이션하였다. 30분간 인큐베이션한 후, 보르테조밉을 웰당 총 부피 200μl 까지의 지시된 농도로 가하고, 세포를 37 ℃에서 48시간 인큐베이션하였다. 각 측정은 3회 수행되었다. 대조 웰(각 항체를 단독으로, 조합하여, 5F11의 부재하의 보르테조밉)의 인큐베이션 시간 및 농도는 상기한 바와 같다.

세포의 생활성을 측정하기 위하여, 세포를 1.49 mM XTT 및 0.025 mM 페나진-에토술페이트를 함유하는 신선한 플레인 배지로 4시간 동안 펄싱하고, 450 nm 대 650 nm에서 ELISA 판독기(Bio-Tek, Winooski, Vermont, USA)로 흡광도를 측정하였다. 테트라졸륨 카르복스아닐리드 턴오버의 50% 감소를 얻는데 필요한 농도(IC₅₀)를 미처리된 대조 배양물과 비교하여 계산하였다.

일시적 형질도입 및 루시퍼라제 리포터 유전자 검정

1 ml 배지 중의 5 x 10⁶ L428 세포를 10 μg NF-κB-luc, IkBaM 및 CMV-GFP로 전기천공하여 일시적으로 형질도입하였다. 세포를 추가의 2ml의 플레인 배지와 함께 6-웰 플레이트에 씨딩하였다. 37 ℃에서 24 시간 인큐베이션한 후에, GFP 형질도입된 세포를 형질도입 효능의 지표로서 녹색 형광에 대해 검사하였으며, 이는 5%에서 10%로 다양하였다. 세포를 20 μg/ml 5F11 + lOOμg/ml GaH와 함께 2 시간, 또는 10 ng/ml 보르테조밉 또는 둘을 조합하여, 또는 플레인 배지와 함께 12 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 수확 후에 PBS(인산염 완충 생리식염수)중에서 2회 세척하였다.

1 ml 빙냉 리포터 용해 완충액(Promega)을 사용하여 용해를 수행하고, 용해물을 -70 ℃에서 1 시간 동안 동결시켰다. 루시퍼라제 활성을 30 μl 용해물을 사용하여 96-웰 발광측정 플레이트에서 측정하고, 발광측정기로 분석하였다. 비처리되고, 리포터-유전자 형질도입된 세포를 사용하여 NF-κB 활성 기저값을 얻었다. 모든 검정법을 3회 중복 수행하여 중간값과 표준 편차를 얻었다.

TUNEL 검정 및 간접 면역형광법에 의한 NF-κB의 검출

단세포 수준에서 L428 및 L540 세포 중 5F11 및/또는 보르테조밉이 아폽토시스 및 NFκB-활성화에 미치는 효과를 측정하기 위해 사이토스핀(lOOOU/분에서 1분간)을 제공하였다. 2 x 10⁵ 세포를 6-웰 마이크로타이터 플레이트 중 3ml의 플레인 배지(대조) 또는 5F11 + GaH ( ml 당 5μg/25μg) 또는 보르테조밉(1OnM) 또는 이들 둘 다를 첨가한 배지에 씨딩하였다. 5F11에 대해서는 30분, 가교 결합 GaH에 대해서는 1 시간, 보르테조밉에 대해서는 적어도 6시간 동안, 모두 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시키고, 빙냉 아세톤을 사용하여 고정하였다(30초 인큐베이션). 조직내 세포 사멸 검출 키트, TMR 레드(In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red(Roche))를 사용하여 제조자의 지시에 따라 TUNEL 검정을 수행하였다. 최종적으로, 세포를 DAPI를 함유하는 벡타쉴드 (VECTASHIELD) 마운팅 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 마운팅하거나 토끼-항-p65 항체(Santa Cruz, 1OnM) 및 제2의 FITC-표지 마우스-항-토끼 항체(10 nM)로 염색하였다. 사이토스핀 분석물을 형광현미경으로 분석하였다.

비특이적 항체 결합을 배제하기 위하여, 비처리된 세포의 슬라이드를 토끼-항-p65-IgG, 또는 FITC-결합 마우스-항-토끼-IgG, 또는 DAPI로 염색하였다.

어넥신 V 결합 검정

2 x 10⁵ L540 세포를 5F11/GaH, 보르테조밉, 또는 둘 다 또는 상기한 바와 같은 플레인 배지와 함께 37 ℃에서 12 시간 동안 인큐베이션하였다(3중 시험). 아폽토시스 세포를 검출하기 위해, 포스파디딜세린의 원형질막 외부 소엽 부분으로의 위치 변경을, 권장되는 바에 따라 형광체에 결합된 어넥신 V (어넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트 I, BD Bioscience, USA)로 염색한 후에 유동 세포측정법(FACS calibur Bengton & Dickinson Flow Cytometer)으로 측정하였다. 3중으로 중복 측정하여 중간값 및 표준 편차를 계산하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅

전세포 단백질 추출물을 1 x 램리(Laemmli) 용액(10 μg)에 준비하고, 4-15% 겔을 사용한 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond-C, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Freiburg, Germany)으로 옮기고, 로티-블록(Roti-Block; Roth, Karlsruhe, Germany)으로 실온에서 1 시간 동안 차단하였다. 이뮤노블롯을 권장되는 바에 따라 아폽토시스 샘플러 키트 I 및 II (BD Bioscience, CA)로부터 수득된 1차 항체와 10 % 송아지 태 혈청으로 보충된 PBS 중에서 인큐베이션하였다. c-플립 특이적 항체는 제조원(Sigma; F-6550)으로부터 구입하였다. 결합된 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 2차 당나귀-항-마우스 또는 토끼-IgG mAb (Dianova, Hamburg, Germany) 또는 양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 염소-항-마우스 IgG (Dianova)로 1/10000 희석률로 검출하였다. 단백질은 제조자의 지시에 따라 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Amersham Pharmacia)으로 시각화하였다.

전기영동 이동성 쉬프트 검정

NF-κB가 DNA에 결합하는 것을 시각화하기 위해 전기영동 이동성 쉬프트 검정(EMSA)을 수행하였다. 상이한 항체로 처리한 세포로부터의 핵 단백질 추출물(5 μg; 20 mM HEPES, pH 7.9, 400 mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA)을 NF-κB 결합 서열이 있는 ³²P-표지 올리고뉴클레오티드(Santa Cruz)와 실온에서 30 분간 인큐베이션하였다. DNA/단백질 결합체를 6% 천연 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 분리하였다.

인간 HD의 이종이식 모델

인간 HD의 이종이식 모델은 전술한 바와 같다(17). 200 μL PBS에 재현탁된 L540Cy 세포(1 x 10⁷) 를 무균 면역결핍(SCID) 마우스(FOX CHASE SCID; Taconic M&B A/S, Ry, Denmark)의 오른쪽 옆구리에 주사하여 피하 고형 L540Cy 종양을 수립하였다. 매 3일 마다 종양 발달을 측정하고, 종양 부피를 식(길이 x 폭 x 높이/2)에 따라 계산하였다. 약 100mm³의 종양이 수립된 마우스를 무작위로 네 개의 그룹으로 나누고, 100 μg 5F11 (200 μL PBS 중에서 복강 내) 및 6 시간 후에 10 ng 보르테조밉을 꼬리 정맥 내로, 또는 각 시약을 단독으로 총 4회 주사하였다. 대조 마우스에는 PBS 만을 주었다. 대조 그룹의 중간 종양 직경이 2500 mm³을 초과할 때(제50일), 실험을 중단하고 마우스를 죽였다. 처리 및 대조 그룹은 각각 4 마리로 구성되었으며, 실험을 반복하여 결과를 확인하였다.

결과

5Fll 항체와 보르테조밉의 조합의 HD- 및 ALCL-유도 세포주에 대한 세포독성 증가

부분적 아폽토시스-저항성 HD-유도 세포주 L540에 있어서 단세포 수준에서의 5F11에 대한 세포 반응을 분석하였다. 5F11에의 결합 및 아폽토시스를 동시에 시각화하기 위하여, L540 세포를 TUNEL 검정을 수행하기 전에 5F11 및 FITC 표지된 가교결합 염소-항-인간 항체와 인큐베이션하였다. 모든 L540 세포가 5F11과 GaH-FITC과의 인큐베이션 후에 염색되었으며, 이는 모든 집단이 CD30에 대해 양성이라는 것을 나타낸다. 이들 세포의 TUNEL 검정은 모든 세포가 5F11에 상당한 정도로 결합하며, 단지 소집단의 세포만이 아폽토시스를 나타낸다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 5F11을 통한 CD30 자극에 대한 L540 세포의 분화 반응은 단세포 유형에서 조차도 하류 신호 분자의 이질 발현에 기인할 수 있다는 것을 암시한다. 호지킨 세포에서 발현되는 것으로 알려진 그와 같은 후보 물질 중 하나는 전사 인자 NF-κB이며, 이는 종양 세포를 아폽토시스로부터 보호한다.

5F11이 L540 세포에서 NF-κB 활성화를 유도하여 세포가 아폽토시스에 대해 저항성을 가지도록 한다면, NF-κB를 억제할 때 아폽토시스는 증진되어야 할 것이다. 따라서, 세포를 NF-κB 리프레서 IkB의 분해를 억제하는 것으로 알려진 프로테아좀 억제제인 MGl32 및 5F11/GaH에 노출시켰다. 5F11 및 MGl32의 조합은 각 물질을 독성 농도 미만으로 사용한 경우에도 대부분의 세포에서 아폽토시스를 유도하였다. 아폽토시스 속도를 어넥신-V 염색과 FACS 분석으로 정량화하였다. 항체 또는 MG132 단독으로는 대조군과 비교할 때 아폽토시스를 증진시키지 않았지만, 조합 물의 아폽토시스 속도는 대략 60% 였다. 모두를 고려할 때, 상기 데이터는 5Fll-매개-CD30 교차결합 및 보르테조밉이 아폽토시스 유도에 상승적 효과를 가져온다는 것을 나타낸다(도 M-1G 참조).

5F11 및 프로테아좀 억제의 세포독성 능력을 상이한 세포주에 대해 XTT 생활성 검정을 수행함으로써 측정하였다. 프로테아좀 억제제로서 보르테조밉을 사용한 실험을 제시하고 있지만, MG132를 사용하였을 때도 유사한 결과가 얻어졌다(데이터는 제시되지 않음). 시험된 각 세포주에서, 보르테조밉과 5F11의 조합은 세포의 생활성을 확실히 감소시켰다. 생활성의 최소 감소를 나타내는 보르테조밉 농도(25 ng/ml)에서, 독성 농도 미만의 5F11로 예비처리하였을 때 L540 세포는 완전히 죽었다. 훨씬 높은 농도의 5F11에 대해서 저항성을 보이는 카르파스 299 세포 및 L428 세포에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다(17). 상승 효과를 위해 5F11 프리-인큐베이션이 필요한지를 분석하기 위해, 순서를 바꾸어 먼저 L428를 보르테조밉과 함께 30분간 인큐베이션한 다음, 항체와 인큐베이션하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 이와 같은 순서는 보르테조밉의 세포독성 활성을 증진시키지 않았다. 따라서, 5F11 결합에 의해 유도되는 CD30 신호는 HD-유도 세포주에 대한 보르테조밉의 세포독성의 현저한 증가를 위하여 중요할 수 있다.

세포독성 상승 효과가 CD30에 대하여 특이적인 것인지를 증명하기 위하여, CD30를 발현하지 않는 급성 림프구성 백혈병 세포주 REH로 XTT 검정을 수행하였다. REH 세포는 용량-의존적 방식으로 보르테조밉에 의해 사멸된 반면, 5F11과의 프리-인큐베이션은 그의 세포독성 효과에 영향을 미치니 않았다(도 2E).

인간 호지킨 모델에 있어서 5F11과 보르테조밉 조합의 생체내 활성

보르테조밉과 5F11 조합의 활성을 고형 피하 L540Cy 호지킨 종양 모델에서 분석하였다. 종양이 있는 마우스에 5F11, 보르테조밉, 5F11과 보르테조밉의 조합 또는 PBS를 투여하였다. 동물들에 5F11을 주사한 다음, 보르테조밉을 6 시간 후에 주사하였다. 처리를 4일 마다 한 번씩 반복하였다(q x 일수 x 4). 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 5F11과 보르테조밉 양자는 PBS를 투여받은 대조군에 비해 상당히 지연된 종양 성장을 유도하였다. 5F11과 보르테조밉을 조합하여 투여 처리된 동물들에 있어서는 종양 성장이 거의 완전히 억제되는 훨씬 기대되는 효과가 나타났다. 가장 중요한 점은, 성장 억제가 처리 후 수 주간에 걸쳐 유지된 반면(화살표로 표시), 5F11 또는 보르테조밉을 단독으로 투여받은 동물에서는 종양 성장이 진행되었다는 것이다. 지시된 바와 같이 처리된 L540 종양 수반 마우스로부터 유도된 종양 부분을 헤마토자일린으로 염색하였다. 조직 내 종양 세포의 밀도는 5F11과 보르테조밉으로 조합하여 처리한 후 현저하게 감소하였다. 처리 6주 후에 L540 종양을 조직학적 검사한 결과, 5F11과 보르테조밉의 조합으로 처리한 마우스로부터 유도된 종양 조직 내에 종양이 없는 부분이 나타났다.

5F11 의존적 CD30 신호는 NF-κB를 활성화함

NF-κB 소단위 p65를 메탄올 고정된 미처리 L540 세포 상에서 항-p65 mab 및 2차 FITC-표지된 항체를 사용하여 검출하였다. 교차 결합된 5F11로 자극된 후 NF-κB의 발현 수준 및 핵내 분포는 증가된 반면, 보르테조밉에 노출되면 NF-κB가 세포 핵으로부터 방출되었다(세포 핵은 DAPI로 염색되었다).

이 데이터는 5F11는 단독으로는 모든 호지킨 세포에서 아폽토시스를 유도하는데 충분하지 않지만, 저항성 집단이 보르테조밉에 대해서 증가된 감도를 나타내는 것을 보여준다. 그와 같은 효과는 HD에서 아폽토시스 저항성의 주요 인자인 NF-κB 생존 인자의 활성화에 기인하는 것으로 보여진다. 또한, NF-κB는 보르테조밉에 대한 가장 잘 특성화된 표적 중의 하나이다. 호지킨 세포주 L540 및 L428를 교차결합된 5F11 및/또는 보르테조밉과 인큐베이션시킨 후에 NF-κB의 세포내 분포를 분석하였다. 미처리된 L540 세포에서 NF-κB 소단위 p65가 낮은 수준으로 발현되는 것이 검출되었다. 단백질은 주로 세포질 및 부분적으로는 핵에 편재되어 있었는데, 호지킨 세포에서 NF-κB가 구성적으로 발현되는 것을 의미한다(4). 5F11/GaH과 인큐베이션하면 NF-κB 의존성 항체 염색의 증가와 핵내의 축적이 유도되었는데, 이는 CD30 신호에 반응하는 NF-κB의 활성화를 나타내는 것이다. 이러한 효과는 5F11로 자극한지 30분 후에 보르테조밉을 투여하였을 때 억제되었으며, 6 내지 8 시간 후에는 NF-κB를 핵으로부터 배출시키는 것이 관찰되었다. 미처리된 세포의 NF-κB 염색과 비교할 때, 구성적으로 발현되는 NF-κB 조차도 세포질에서 제거된다는 것을 나타낸다. L428 세포를 5F11 +/- 보르테조밉으로 처리한 후 NF-κB 분포 분석에서도 유사한 효과가 나타났다.

NF-κB-반응성 루시퍼라제 리포터 유전자로 형질도입된 L428 세포를 사용하여 NF-κB 전사 활성의 활성화를 측정하였다(도 4 참조). 5F11로의 자극은 리포터 유전자를 약 2배 정도 활성화시키는 것으로 나타났다. 이와 같은 활성화는 보르테조밉의 존재하에서는 억제되어, NF-κB 리포터의 기본 활성도 감소시켰다. NF-κB 억제제인 IkB의 구성적 활성 돌연변이인 IkBaM을 코딩하는 발현 벡터로 동시 형질도입하였을 때는 루시퍼라제 유전자의 활성화가 나타나지 않았는데, 이는 측정된 효과가 NF-κB 특이적이라는 것을 나타내는 것이다. 5F11에 노출시킨 후 세포내 NF-κB의 DNA-결합 활성을 전기영동 이동성 쉬프트 검정(EMSA)으로 측정하였다. NF-κB DNA 결합은 미처리된 L540 뿐만 아니라 L428 세포에서도 검출되었으며, 교차결합된 5F11에 대한 노출은 두 세포주에서 DNA 결합을 증가시켰다. 이 셋팅에서 대조로서 사용된 항-CD30 항체 Ber-H2는 NF-κB를 활성화시키지 못하였으며(레인 3 및 6), HD-유도 세포주의 보르테조밉에 대한 감수성 증가를 유도하지 못하였다(XTT 검정에서). 이를 지지하는 것으로, 5F11-처리된 L540 세포의 활력있는 세포는 아폽토시스 세포에서는 볼 수 없는 강한 NF-κB 염색을 나타냈다.

5F11 및 보르테조밉에 의해 조절되는 항-아폽토시스 단백질 c-플립의 발현 수준

아폽토시스 연쇄 반응을 차단하는 몇몇 인자가 알려져 있으며, 따라서 전구-생존 유전자의 NF-κB 활성화에 관련된 후보 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다. 흥미롭게도, 가장 극적인 변화는 카스파제 억제제 c-플립의 발현에서 나타났다. c-플립은 5F11로 CD30를 자극한 후에 L540 및 L428 세포에서 강하게 유도된다. 대조적으로, 세포를 보르테조밉과 6, 8 및 16 시간 동안 동시 인큐베이션했을 때는 c-플립의 하향조절이 나타났다. bcl-2 및 bax 발현에는 단지 미소한 변화만 관찰되었으며, TRADD 및 FADD의 발현 수준은 5F11 교차결합 또는 보르테조밉 처리 후에도 변하지 않고 남아있었다.

결론

본 발명의 실시예는 HD 세포에서 CD30 매개된 세포 사멸에 대한 저항성은 NF-κB의 활성화에 기인하며, 이는 프로테아좀 억제제인 보르테조밉으로 처리하여 극복될 수 있다는 증거를 제공한다. 이러한 결론은, (1) 인간 항체 5F11를 통한 CD30 자극이 단세포 수준에서 NF-κB 발현에 미치는 영향을 분석한 결과, 저항성 세포의 아폽토시스에 있어서 발현 증가가 관찰되었으며, 이러한 현상은 또한 5F11-매개 세포 사멸에 불감성인 L428 세포주에서 또한 부분적으로 감수성인 세포주 L540의 저항성 집단에서도 나타났다는 점; 및 (2) 5F11의 존재하에 세포독성 농도 미만의 보르테조밉을 사용하여 NF-κB를 억제한 결과 아폽토시스에서 현저한 증가가 일어났으며, 이는 시험관내 및 피하 HD 종양 모델에서 일어났는데, 5F11과 보르테조밉의 조합은 단독으로보다는 더 효율적으로 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다는 점에 기초한 것이다. 5F11 단독 처리시 보다 조합 처리시의 잇점은 2 내지 3 주후에 가장 현저한데, 이는 5F11-매개된 신호화의 동력학을 잘 반영하고 있다. 5F11로의 초기 자극은 일부 세포에서 아폽토시스를 유도하는 반면, 저항성 세포는 미처리된 대조 세포에서 예상되었던 것과 대등하거나 심지어는 보다 높은 증식속도를 나타내었다. 비록 CD30 수용체를 여러 연구에서 표적화 면역요법에 사용하여 왔지만, 많은 모노클로날 항체 및 항체-독소 컨쥬게이트에 대한 임상적 평가는 실망스러운 것이었다(18-21). 하나의 예는 컨쥬게이트되지 않은 mAb Ber-H2인데, 이는 시험관내에서는 악성 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있지만, 임상상의 치료 잇점은 없는 것으로 나타났다(20). 매우 유사하게, 사포린 독소에 컨쥬게이트된 Ber-H2 면역독소는 HD 환자에서 단지 일시적인 반응만을 보였다(21). 본 명세서에 제시된 데이터는 CD30 관련된 면역 요법과 보르테조밉을 조합하는 것이 임상 결과의 개선을 가져올 것이라는 것을 시사한다.

TNF-R1은 어댑터 단백질을 충원함으로써 아폽토시스를 개시할 수 있으나 NF-κB 및 항-아폽토시스 표적 유전자를 활성화시켜 세포를 사멸로부터 보호할 수도 있는 TNF 과의 수용체이다(최근 문헌(22)). 형질도입된 HeLa 세포에서, TNF-RI-유도된 세포 사멸은 TNF-R2, CD40 또는 CD30로 동시자극하여 증진시킬 수 있다. 이는 NF-κB 활성화에 중요한 TNF-R 결합 인자 중의 하나인 TRAF2의 고갈에 의존하는 것으로 보인다(23). 동시-형질도입된 TRAF-2의 CD30 매개된 고갈, NF-κB 불활성화 및 증진된 아폽토시스는 또한 형질도입된 배아성 신종양 세포주(24, 25) 및 ALCL 세포주 카르파스 299(15)에서도 나타났다. 그러나, 이러한 메카니즘은 HD-유도된 세포에서는 아직까지 밝혀지지 않았으며, 최근에 TRAFl에 대하여 HD 림프종 및 ALCL 유도 세포에서 분화 기능이 보고되었다(26). 대조적으로, 본 발명의 실시예는, 보르테조밉을 사용하여 NF-κB 경로를 직접 억제하는 것이 HD- 및 ALCL-유도 세포주에서 CD30 매개 아폽토시스 속도를 현저하게 증진시킨다는 것을 입증하였다.

TRAIL 매개 아폽토시스에 대하여 초기에 저항성인 종양 세포를 보르테조밉으로 감작시키는 것은 주로 NF-κB 억제에 의존하지는 않는데, 카스파제 8의 절단 증가(27) 및 항-아폽토시스 단백질 c-플립의 감소(28)가 각각 저항성을 극복하는 것으로 보이기 때문이다. 본 발명자들은 NF-κB에 의해 상향조절되고 또한 산재화 및 프로테아좀 분해되는 c-플립의 발현(29, 30)이 CD30 자극 후에 활성화되나 보르 테조밉이 가해졌을 때 감소하는 것을 관찰하였다. 흥미롭게도, c-플립은 H-RS 세포에서 사멸 수용체 저항성의 주요 조절자인 것으로 최근에 알려졌다(31-33). HD 세포에서 c-플립의 발현은 또한 CD30, CD40 및 RANK 신호에 의해 조절되는 비정상적으로 활성인 MEK/ERK 경로에 의존한다(34).

NF-κB 리포터 유전자 검정, 면역형광 분석 및 웨스턴 블롯팅은 5F11 자극이 NF-κB 및 하류 항-아폽토시스 단백질 c-플립의 초기 활성화를 유도한다는 것을 밝혀내었으며, 이는 5F11을 통한 CD30 신호가 종양 세포의 보르테조밉에 대한 감작을 유도한다는 것을 나타낸다. 결론적으로, CD30 신호에 반응하는 아폽토시스 유도와 성장 자극의 균형은 CD30 자극이 프로테아좀 억제와 병행될 때 아폽토시스 쪽으로 이동한다. 본 발명의 실시예에 나타낸 5F11과 보르테조밉 조합의 시험관내 및 생체내 활성은 HD 환자의 치료에 있어서 치료적 가치가 있음을 보여준다.

추가의 참고 문헌

1. Croft, M. Costimulation of T cells by OX40, 4-1BB, and CD27. Cytokine Growth Factor Rev, 14: 265-273, 2003.

2. Cheng, X., Kinosaki, M., Murali, R., and Greene, M. I. The TNF receptor superfamily: role in immune inflammation and bone formation. Immunol Res, 27: 287-294, 2003.

3. Izban, K. F., Ergin, M., Huang, Q., Qin, J. Z., Martinez, R. L., Schnitzer, B., Ni, H., Nickoloff, B. J., and Alkan, S. Characterization of NF-kappaB expression in Hodgkin's disease: inhibition of constitutively expressed NF-kappaB results in spontaneous caspase-independent apoptosis in Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Mod Pathol, 14: 297-310, 2001.

4. Horie, R., Higashihara, M., and Watanabe, T. Hodgkin's lymphoma and CD30 signal transduction. Int J Hematol, 77: 37-47, 2003.

5. Horie, R., Watanabe, T., Morishita, Y., Ito, K., Ishida, T., Kanegae, Y., Saito, I., Higashihara, M., Mori, S., and Kadin, M. E. Ligand-independent signaling by overexpressed CD30 drives NF-kappaB activation in Hodgkin-Reed-Sternberg cells. Oncogene, 21: 2493-2503, 2002.

6. Schneider, C. and Hubinger, G. Pleiotropic signal transduction mediated by human CD30: a member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) family. Leuk Lymphoma, 43: 1355-1366, 2002.

7. Smith, C. A., Farrah, T., and Goodwin, R. G. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell, 76: 959962, 1994.

8. Arch, R. H., Gedrich, R. W., and Thompson, C. B. Tumor necrosis factor receptor-associated factors (TRAFs)--a family of adapter proteins that regulates life and death. Genes Dev, 12: 2821-2830, 1998.

9. Baker, S. J. and Reddy, E. P. Modulation of life and death by the TNF receptor superfamily. Oncogene, 17: 3261-3270, 1998.

10. Chiarle, R., Podda, A., Prolla, G., Podack, E. R., Thorbecke, G. J., and Inghirami, G. CD30 overexpression enhances negative selection in the thymus and mediates programmed cell death via a Bcl-2-sensitive pathway. J Immunol, 163: 194-205, 1999.

11. Su, C. C., Chiu, H. H., Chang, C. C., Chen, J. C., and Hsu, S. M. CD30 is involved in inhibition of T-cell proliferation by Hodgkin's Reed-Sternberg cells. Cancer Res, 64: 2148-2152, 2004.

12. Tarkowski, M. Expression and a role of CD30 in regulation of T-cell activity. Curr Opin Hematol, 10: 267-271, 2003.

13. Chakrabarty, S., Nagata, M., Yasuda, H., Wen, L., Nakayama, M., Chowdhury, S. A., Yamada, K., Jin, Z., Kotani, R., Moriyama, H., Shimozato, O., Yagita, H., and Yokono, K. Critical roles of CD30/CD30L interactions in murine autoimmune diabetes. Clin Exp Immunol, 133: 318-325, 2003.

14. Gruss, H. J., Boiani, N., Williams, D. E., Armitage, R. J., Smith, C. A., and Goodwin, R. G. Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma cell lines. Blood, 83: 2045-2056, 1994.

15. Mir, S. S., Richter, B. W., and Duckett, C. S. Differential effects of CD30 activation in anaplastic large cell lymphoma and Hodgkin disease cells. Blood, 96: 4307-4312, 2000.

16. Levi, E., Pfeifer, W. M., and Kadin, M. E. CD30-activation-mediated growth inhibition of anaplastic large-cell lymphoma cell lines: apoptosis or cell-cycle arrest? Blood, 98: 1630-1632, 2001.

17. Borchmann, P., Treml, J. F., Hansen, H., Gottstein, C., Schnell, R., Staak, O., Zhang, H. F., Davis, T., Keler, T., Diehl, V., Graziano, R. F., and Engert, A. The human anti-CD30 antibody 511 shows in vitro and in vivo activity against malignant lymphoma. Blood, 102: 3737-3742, 2003.

18. Horie, R. and Watanabe, T. The biological basis of Hodgkin's lymphoma. Drug News Perspect, 16: 649-656, 2003.

19. Barth, S., Huhn, M., Matthey, B., Tawadros, S., Schnell, R., Schinkothe, T., Diehl, V., and Engert, A. Ki-4(scFv)-ETA', a new recombinant anti-CD30 immunotoxin with highly specific cytotoxic activity against disseminated Hodgkin tumors in SCID mice. Blood, 95: 3909-3914, 2000.

20. Falini, B., Flenghi, L., Fedeli, L., Broe, M. K., Bonino, C., Stein, H., Durkop, H., Bigerna, B., Barbabietola, G., Venturi, S., and et al. In vivo targeting of Hodgkin and Reed- Sternberg cells of Hodgkin's disease with monoclonal antibody Ber-H2 (CD30): immunohistological evidence. Br J Haematol, 82: 3845, 1992.

21. Falini, B., Bolognesi, A., Flenghi, L., Tazzari, P. L., Broe, M. K., Stein, H., Durkop, H., Aversa, F., Corneli, P., Pizzolo, G., and et al. Response of refractory Hodgkin's disease to monoclonal anti-CD30 immunotoxin. Lancet, 339: 1195-1196, 1992.

22. Wajant, H., Henkler, F., and Scheurich, P. The TNF-receptor-associated factor family: scaffold molecules for cytokine receptors, kinases and their regulators. Cell Signal, 13: 389-400, 2001.

23. Fotin-Mleczek, M., Henkler, F., Samel, D., Reichwein, M., Hausser, A., Parmryd, I., Scheurich, P., Schmid, J. A., and Wajant, H. Apoptotic crosstalk of TNF receptors: TNF-R2-induces depletion of TRAF2 and IAP proteins and accelerates TNF-Rl-dependent activation of caspase-8. J Cell Sci, 115: 27572770, 2002.

24. Duckett, C. S., Gedrich, R. W., Gilfillan, M. C., and Thompson, C. B. Induction of nuclear factor kappaB by the CD30 receptor is mediated by TRAFl and TRAF2. Mol Cell Biol, 17: 1535-1542, 1997.

25. Duckett, C. S. and Thompson, C. B. CD30-dependent degradation of TRAF2: implications for negative regulation of TRAF signaling and the control of cell survival. Genes Dev, 11: 2810-2821, 1997.

26. Durkop, H., Hirsch, B., Hahn, C., Foss, H. D., and Stein, H. Differential expression and function of A20 and TRAFl in Hodgkin lymphoma and anaplastic large cell lymphoma and their induction by CD30 stimulation. J Pathol, 200: 229-239, 2003.

27. Johnson, T. R., Stone, K., Nikrad, M., Yeh, T., Zong, W. X., Thompson, C. B., Nesterov, A., and Kraft, A. S. The proteasome inhibitor PS- 341 overcomes TRAIL resistance in Bax and caspase 9-negative or Bcl-xL overexpressing cells. Oncogene, 22: 4953-4963, 2003.

28. Sayers, T. J., Brooks, A. D., Koh, C. Y., Ma, W., Seki, N., Raziuddin, A., Blazar, B. R., Zhang, X., Elliott, P. J., and Murphy, W. J. The proteasome inhibitor PS-341 sensitizes neoplastic cells to TRAIL-mediated apoptosis by reducing levels of c-FLIP. Blood, 102: 303-310, 2003.

29. Kreuz, S., Siegmund, D., Scheurich, P., and Wajant, H. NF-kappaB inducers upregulate cFLIP, a cycloheximide-sensitive inhibitor of death receptor signaling. Mol Cell Biol, 21: 3964-3973, 2001.

30. Kim, K. W., Kim, B. J., Chung, C. W., Jo, D. G., Kim, I. K., Song, Y. H., Kwon, Y. K., Woo, H. N., and Jung, Y. K. Caspase cleavage product lacking aminoterminus of IkappaBalpha sensitizes resistant cells to TNF-alpha and TRAILinduced apoptosis. J Cell Biochem, 85: 334-345, 2002.

31. Mathas, S., Lietz, A., Anagnostopoulos, I., Hummel, F., Wiesner, B., Janz, M., Jundt, F., Hirsch, B., Johrens-Leder, K., Vornlocher, H. P., Bommert, K., Stein, H., and Dorken, B. c-FLIP Mediates Resistance of Hodgkin/Reed-Sternberg Cells to Death Receptor-induced Apoptosis. J Exp Med, 199: 1041-1052, 2004.

32. Thomas, R. K., Kallenborn, A., Wickenhauser, C., Schultze, J. L., Draube, A., Vockerodt, M., Re, D., Diehl, V., and Wolf, J. Constitutive expression of c-FLIP in Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Am J Pathol, 160: 1521-1528, 2002.

33. Dutton, A., O'Neil, J. D., Milner, A. E., Reynolds, G. M., Starczynski, J., Crocker, J., Young, L. S., and Murray, P. G. Expression of the cellular FLICEinhibitory protein (c-FLIP) protects Hodgkin's lymphoma cells from autonomous Fas-mediated death. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 6611-6616, 2004.

34. Zheng, B., Fiumara, P., Li, Y. V., Georgakis, G., Snell, V., Younes, M., Vauthey, J. N., Carbone, A., and Younes, A. MEK/ERK pathway is aberrantly active in Hodgkin disease: a signaling pathway shared by CD30, CD40, and RANK that regulates cell proliferation and survival. Blood, 102: 1019-1027, 2003.

균등한 발명

당업자는 단지 통상적인 실험을 통하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체적 실시 태양과 균등한 많은 발명을 인식하거나 확신할 수 있을 것이다. 그와 같이 균등한 발명 또한 하기 특허 청구 범위에 포함되는 것이다.

참고 문헌 내용의 포함

본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 기타 간행물의 내용 전체가 본 명세서에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> MEDAREX, INC. et al. <120> METHOD OF TREATING CD30 POSITIVE LYMPHOMAS <130> MXI-327PC <150> 60/615284 <151> 2004-10-01 <160> 53 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(348) <400> 1 gag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tct 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg 144 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc aac ata aac gaa gat gga agt gag aaa ttc tat gtg gac tct gtg 192 Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc ttc tcc aga gac aac gcc gag aac tca ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac 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Asp Thr Ser Lys His Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Thr Val Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(321) <400> 7 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gta agc agc aac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ctc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Leu Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 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Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(321) <400> 11 gac atc cag atg acc cag tct cca acc tca ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 tta acc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc 144 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg 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MXI-327PC - 1 -

Claims

CD30 양성 림프종의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 (i) CD30에 결합하는 모노클로날 항체, 및 (ii) NF-κB 활성을 억제하는 화합물을 투여하는 것을 특징으로 하는, CD30 양성 림프종의 치료 방법.
제1항에 있어서, NF-κB 활성을 억제하는 화합물이 프로테아좀 억제제인 방법.
제2항에 있어서, 프로테아좀 억제제가 26S 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성을 억제하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 프로테아좀 억제제가 보르테조밉(bortezomib), ALLnL(N-아세틸-류신일(leucinyl)-류시닐(leucynil)-노르류시날, MGlOl), LLM(N-아세틸-류신일-류시닐-메티오날), Z-LLnV(카르보벤족실-류신일-류시닐-노르발리날, MG115), Z-LLL(카르보벤족실-류신일-류시닐-류시날, MG132), 락타시스틴, b-락톤, 보론산 펩티드, 유비퀴틴 리가제 억제제, 시클로스포린 A, FK506(타크롤리무스) 및 데옥시스페르구알린으로 부터 선택되는 것인 방법.
CD30 양성 림프종의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 인간 모노 클로날 항체 5F11 및 보르테조밉을 투여하는 것을 특징으로 하는, CD30 양성 림프종의 치료 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 프로테아좀 억제제를 투여받기 전에 항체를 투여받는 것인 방법.
CD30 양성 림프종의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 NF-κB 억제 화합물을 투여하며, 이 때 환자는 사전에 치료 유효량의 항-CD30 항체의 투여를 포함하는 요법을 받은 것을 특징으로 하는, CD30 양성 림프종의 치료 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgGl 또는 IgG3 중쇄를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역, 및 FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때

(a) 인간 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 번호 18, 30 및 42, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되고;

(b) 인간 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 번호 24, 36 및 48, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되며;

(c) 항체는 인간 CD30에 10⁷ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하고;

(d) 인간 항체는 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC) 분석에서 CD30⁺ 종양 세포의 용해를 매개하며;

(e) 인간 항체는 생체내 CD30⁺ 종양 세포의 성장을 억제하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 번호 17, 29 및 41, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되고; 인간 경쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 번호 23, 35 및 47, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 CDRl 서열이 서열 번호 16, 28 및 40, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되고; 인간 경쇄 가변 영역 CDRl 서열이 서열 번호 22, 34 및 46, 및 그들의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 CD30에 10⁸ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 CD30에 10⁹ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 FRl, FR2, FR3 및 FR4 서열이 인간 중쇄 VH_4-34 또는 VH_3-11 생식세포 서열로부터 유도되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 인간 경쇄 가변 영역 FRl, FR2, FR3 및 FR4 서열이 인간 경쇄 L15, A27 또는 L6 생식세포 서열로부터 유도되는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 중쇄 가변 영역 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이 때

(a) 인간 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2, 6, 10, 및 그들과 80% 이상 동일한 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 인간 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4, 8, 12, 및 그들과 80% 이상 동일한 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며;

(c) 인간 항체는 인간 CD30에 10⁷ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하고;

(d) 인간 항체는 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC) 분석에서 CD30⁺ 종양 세포의 용해를 매개하며;

(e) 인간 항체는 생체내 CD30⁺ 종양 세포의 성장을 억제하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 항체가 인간 CD30에 10⁸ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 항체가 인간 CD30에 10⁹ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 중쇄 VH_4-34 생식세포 서열로부터 유도되는 인간 중쇄 가변 영역, 및 인간 경쇄 L15 생식세포 서열로부터 유도되는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때

(a) 인간 중쇄 가변 영역은 서열 번호 10 또는 그와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 인간 경쇄 가변 영역은 서열 번호 12 또는 그와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며;

(c) 인간 항체는 인간 CD30에 10⁷ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하고;

(d) 인간 항체는 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC) 분석에서 CD30⁺ 종양 세포의 용해를 매개하며;

(e) 인간 항체는 생체내 CD30⁺ 종양 세포의 성장을 억제하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 중쇄 트랜스유전자 또는 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스유전자 또는 트랜스염색체를 포함하는 게놈 을 갖는 비-인간 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 B 세포가 불멸화 세포에 융합되어 제조된 하이브리도마에 의해 생산되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 5F11, AC-10, HeFi-1, 또는 CD-30에 결합하기 위해 5F11, AC-10, HeFi-1과 경쟁하는 항체로부터 선택되는 것인 방법.
CD30을 발현하는 세포를 그의 성장이 억제되도록 세포 성장 억제 유효량의 항체 및 프로테아좀 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, CD30 발현 세포의 성장 억제 방법.
CD30을 발현하는 종양 세포의 성장을 특징으로 하는 질병의 환자에게 CD30에 결합하는 모노클로날 항체 및 프로테아좀 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병의 치료 또는 예방 방법.
제27항에 있어서, 질병이 호지킨 병(Hodgkin's disease), 퇴행성 대세포 림프종(ALCL), 성인 T-세포 림프종(ATL), 혈관면역아세포 림프선증(AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강성 림프종, 배아종성 암, 비인두의 미분화 암(예를 들어, 슈밍크 종양(Schmincke's tumor)), 캐슬먼 병(Castleman's disease), 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma) 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종으로 구성되는 군으로부 터 선택되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 질병이 호지킨 병인 방법.
제27항에 있어서, 질병이 비-호지킨 림프종인 방법.
제30항에 있어서, 비-호지킨 림프종이 퇴행성 대세포 림프종(ALCL)인 방법.