KR20090088891A - 비티엘에이에 대한 인간 단일클론 항체 및 이용 방법 - Google Patents

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켄트 비 쑤디움
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메다렉스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 고친화도로 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공한다. 또한 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 본 발명의 항체를 발현하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 항체를 포함하는, 면역접합체, 이중특이적 분자 및 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 항-BTLA 항체를 사용하여, 암 및 감염성 질환을 포함하는, 다양한 질환을 치료하는 방법뿐만 아니라 BTLA를 탐지하는 방법을 제공한다.
BTLA, 단일클론 항체, 항원 결합부, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역

Description

비티엘에이에 대한 인간 단일클론 항체 및 이용 방법{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO BTLA AND METHODS OF USE}
본 발명은 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA에 결합하고 수 많은 바람직한 성질들을 나타낸다. 이러한 성질들은, 예를 들어, 인간 BTLA에 대한 결합에 대하여 높은 친화성을 갖지만, 인간 CD28, CTLA-4, PD-1, 또는 ICOS와의 실질적인 교차-반응을 결여한다. 또한, 본 발명의 항체는 면역 반응을 조절하는 것으로 보여지고 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 항-BTLA 항체를 이용하여 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 T-세포 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항-BTLA 항체를 이용하여 생체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
양성 및 음성 공통자극 신호들은 B 및 T 세포 활성의 조절에 있어서 중요한 역할을 하며, 이러한 신호들을 전달하는 분자는 면역조절제의 유효한 타겟이라는 것이 증명되었다. 양성 공통자극은, T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 연동에 더하여, 천연 T 세포의 최적 활성화에 필요하며, 반면에 음성 공통자극은, 작동자 T 세포 기능의 종료는 물론, 자신에 대한 면역 내성(immunologic tolerance)의 획득에 필요하다. 항원-제시 세포(antigen-presenting cells, APC)의 표면에서 B7.1 또는 B7.2와 상호작용하면서, 원형(prototypic) T 세포 공통자극 분자인 CD28은 TCR 연동에 반응하여 T 세포 증식 및 분화를 촉진하는 신호를 발산하고, 반면에 CD28 상동 세포독 T 림프구 항원-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4)는 T 세포 증식 및 작동자 기능의 억제를 조절한다(Chambers 등, Ann. Rev. Immunol., 19:565-594, 2001; Egen 등, Nature Immunol., 3:611-618, 2002).
B7 종에 대해 상동성을 갖는 몇 개의 새로운 분자들이 발견되었으며(Abbas 등, Nat. Med., 5:1345-6,1999; Coyle 등, Nat. Immunol., 2: 203-9, 2001; Carreno 등, Annu. Rev. Immunol., 20: 29-53, 2002; Liang 등, Curr. Opin. Immunol., 14: 384-90, 2002), T 세포 활성화에서 그것들의 역할은 이제 밝혀지기 시작했다. 이러한 새로운 공통자극 리간드들은 B7h, PD-L1, PD-L2, 및 B7-H3을 포함한다.
또한 B7RP-1(Yoshinaga 등, Nature, 402: 827-32, 1999), GL50(Ling, 등, J. Immunol., 164:1653-7, 2000), B7H2 (Wang 등, Blood, 96: 2808-13, 2000), 및 LICOS (Brodie 등, Curr. Biol., 10: 333-6, 2000)로 알려진 B7h (Swallow 등, Immunity, 11: 423-32, 1999)는 활성화된 T 세포 상에서 유도성 공통자극제(inducible costimulator, ICOS)에 결합하고, T 세포 증식과 인터루킨4(interleukin4, IL-4) 및 IL-10과 같은 사이토카인의 생산을 공통자극한다.
B7-H1(Dong 등, Nat. Med., 5, 1365-9, 1999)로서도 알려진 PD-L1(Freeman 등, J. Exp. Med., 192: 1027-34, 2000), 및 B7-DC(Tseng 등, J. Exp. Med., 193, 839-46, 2001)로서도 알려진 PD-L2(Latchman 등, Nat. Immunol., 2:261-8, 2001)는 T 및 B 세포 상에서 프로그램된 사멸 1(programmed death 1, PD-1) 수용체에 결합한다.
마지막으로, B7-H3는 활성화된 T 세포 상에서 아직까지는 미지의 역-수용체에 결합하며, 그리고 CD4+ T 헬퍼(T helper, Th) 세포 및 CD8+ 세포독 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs 또는 Tcs)의 증식을 증진시키고 IFN-γ발현을 선택적으로 강화하는 것으로 보고 되고 있다(Chapoval 등, Nat. Immunol., 2, 269-74, 2001; Sun 등, J. Immunol., 168, 6294-7, 2002). 또한 B7-H3은 음성 조절제인 것으로 보고 되어 왔다(Suh 등, Nat. Immunol., 4, 899-906, 2003; Prasad 등, J.Immunol., 173, 2500-2506, 2004).
T 세포 공통자극 활성을 가지는 추가적인 분자의 동정(identification)은 그것들의 기본적인 생물학적 중요성 및 그것들의 활성에 영향을 줄 수 있는 제제의 치료 가능성으로 인하여 중요한 관심사가 된다. 공통자극 신호를 조절할 수 있으며, 그렇게 함으로써 CD8+ CTLs 및 CD4+ Th 세포의 활성화 및/또는 작동자 기능을 조절할 수 있는 제제는 면역 반응의 조절에서 용도를 발견하고, 그리고 매우 바람직하다.
특히, 많은 자가면역성 질환은 자가반응성 T 세포 및 자가항체를 포함하는 것으로 알려진다. 병원체에 대항하여 방어하는 면역 시스템의 능력을 손상시키지 않고서 자가반응성 림프구를 억제하거나 제거할 수 있는 제제는 매우 바람직하다.
반대로, 입양 면역치료와 같은, 많은 암 면역치료는 종양-특이성 T 세포 수를 증가시키고 그것들이 종양 세포를 공격하고 죽이도록 하게 한다(Dudley 등, Science 298:850-854, 2002; Pardoll, Nature Biotech., 20:1207-1208, 2002; Egen 등, Nature Immunol., 3:611-618, 2002). 종양 공격을 증대시킬 수 있는 제제는 매우 바람직하다.
덧붙여, 많은 상이한 항원(예, 미생물성 항원 또는 종양 항원)에 대한 면역 반응은, 탐지될 수 있지만, 그러한 항원을 발현하는 제제(예, 감염성 미생물 또는 종양 세포)에 의하여 조절되는 질병 과정에 대항하여 보호하기에는 빈번하게 불충분한 크기이다. 대상체 내에 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 보조제를, 항원과 함께, 대상체에 투여하는 것은 종종 바람직하다.
소정의 환경 하에서 항원에 대한 정상 면역 반응을 억제하는 것도 바람직하다. 예를 들어, 이식을 받은 환자 내에 정상 면역 반응을 억제하는 것은 바람직하고, 그러한 면역억제성 활성을 나타내는 제제는 매우 바람직하다.
공통자극 신호, 특히 양성 공통 자극 신호는, 또한 B 세포 활성을 조절하는 역할을 한다. 예를 들어, B 세포 활성화 및 배심(germinal center) B 세포의 생존은 항원에 의한 자극에 더하여 T 세포-유도 신호를 요구한다. 헬퍼 T 세포의 표면에 존재하는 CD40 리간드는 B 세포의 표면 상의 CD40과 상호작용하고, B 세포 내에서 T-세포 종속 효과(T-cell dependent effects)와 같은 많은 것을 조절한다.
단백질 BTLA(B and T lymphocyte attenuator)는 CD28, CTLA-4, ICOS 및 PD-1도 포함하는 수용체의 CD28 종의 멤버이다. 상기 종의 초기 멤버들인, CD28 및 ICOS은 단일클론 항체의 추가가 뒤따르는 T 세포 증식을 증대시키는 것에 대한 기능적 효과에 의해 발견되었다(Hutloff 등, (1999) Nature 397:263-266; Hansen 등, (1980) Immunogenics 10:247-260). BTLA는 TH1 세포 내에서 차분 발현(differential expression)을 위한 스크리닝을 통해 발견되었다. 덧붙여, BTLA는 CTLA-4에 유사한, 음성 자극 신호를 제공하는 것으로 설명되었다. 작용제 항-BTLA mAb의 존재하에, 항-CD3 및 항-CD28 활성화 T-세포는 감소된 IL-2 생산 및 증식을 보여준다(Kreig 등, J.Immunol., 175, 6420-6472, 2005). 무손상(intact)의 BTLA 유전자가 결여된 마우스는 DNP-KLH 후-면역에 대한 더 높은 역가 및 EAE에 대한 증가된 감도를 보여준다(Watanabe 등, Nat. Immunol., 4, 670-679, 2003). HVEM(herpes virus entry mediator)은 BTLA를 위한 리간드라 생각된다(Scully 등, (2005) Nat. Immunol. 6:90-98; Gonzalez 등, (2005) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 102: 1116-1121).
따라서, BTLA를 인식하는 제제, 및 그러한 제제를 이용하는 방법이 요망된다.
<발명의 개요>
본 발명은 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA에 결합하고 수 많은 바람직한 성질들을 나타낸다. 이러한 성질들은, 예를 들어, 인간 BTLA에 대한 결합에 대하여 높은 친화성을 갖지만, 인간 CD28, CTLA-4, PD-1, 또는 ICOS와의 실질적인 교차-반응을 결여한다. 또한, 본 발명의 항체는 면역 반응을 조절하는 것으로 보여지고 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 항-BTLA 항체를 이용하여 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 T-세포 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항-BTLA 항체를 이용하여 생체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
한 관점에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부에 관한 것으로, 상기 항체는 다음의 성질 중 적어도 하나를 나타낸다:
(a) 1 × 10-7 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합함;
(b) 인간 TrkB, CD28, CTLA-4, PD-1 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않음;
(c) BTLA에 대한 HVEM의 결합을 억제함.
어떤 구체예에서, 상기 항체는 나아가
(a) T-세포 반응을 자극하고;
(b) 항체 반응을 자극하며;
(c) 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제한다.
대안적 구체예에서 상기 항체가, 예컨대, 쥐 항체, 키메릭 항체 또는 인간화된 항체일 수 있지만, 바람직하게 상기 항체는 인간 항체이다.
더 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 5 × 10-8 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하거나, 1 × 10-8 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하거나, 5 × 10-9 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하거나, 1 × 10-8 M과 1 × 10-10 M 사이의 KD로 인간 BTLA에 결합한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA에 결합하는 것에 대하여 다음을 포함하는 참조 항체와 교차-경쟁한다:
(a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역.
다양한 구체예에서, 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 관점에서, 본 발명은 인간 VH 2-05 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부에 관한 것이며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VH 2-70 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VH 4-59 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VH 3-20 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VH 3-33 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VK A27 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VK L18 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VK L15 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 나아가 인간 VK 04 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 2-05 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK A27 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 2-70 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK A27 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 4-59 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK L18 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 4-59 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK A27 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 3-20 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK L15 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 3-33 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK 04 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 3-33 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK A27 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며:
(a) 인간 VH 2-05 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 인간 VK A27 유전자의 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
다른 관점에서, 본 발명은, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데,
(a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고:
(b) 상기 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며: 및
(c) 상기 항체는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다.
바람직하게, 상기 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또한 다른 관점에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데:
(a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74, 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 80%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며;
(b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 80%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 상기 항체는 인간 BTLA에 1 × 10-7 M 이하의 KD로 결합하며; 및
(d) 상기 항체는 인간 TrkB, PD-1, CD28, CTLA-4, 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않는다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체는 추가적으로 BTLA에 대한 하나 이상의 BTLA 리간드(예, HVEM)의 결합을 억제한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 상기 항체는 상기에 열거된 하나 이상의 다른 특징들을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하며:
(a) 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
(f) 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
여기에서 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 49를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 50을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 51을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 31을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 78을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 80을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 81을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 82를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 87을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 90을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 91을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 92를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 78을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 95를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 96을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 97을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
본 발명의 다른 바람직한 항체 또는 이의 항원 결합부는 다음을 포함하며:
(a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다.
바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 항체는, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4 이소타입의, 전장 항체일 수 있다. 대안적으로 상기 항체는 Fab 또는 Fab'2 분절과 같은 항체 분절, 또는 단일 사슬 항체일 수 있다.
또한 본 발명은 사이토톡신 또는 방사선 동위원소와 같은 치료학적 제제와 연관된, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 또한 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부와는 상이한 결합 특이성을 갖는 제2의 기능성 부분에 결합된, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 이중 특이적 분자를 제공한다.
또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부, 또는 면역접합체 또는 이중 특이적 분자, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부을 암호화하는 핵산 분자 또한 본 발명에 포함되며, 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 물론 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명은 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 트랜스유전자성 마우스를 제공하는데, 상기 마우스는 본 발명의 항체를 발현하며, 뿐만 아니라 본 발명은 그러한 마우스로부터 제조된 하이브리도마를 제공하는데, 상기 하이브리도마는 본 발명의 항체를 생산한다.
또한 다른 관점에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부를 대상체에 투여하여 상기 대상체 내에서 면역 반응을 조정하는 것을 포함하는, 대상체 내 면역 반응을 조정하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 상기 대상체 내에서 면역 반응을 증진시키거나, 자극하거나, 또는 증가시킨다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 상기 대상체 내에서 면역 반응을 저해하거나, 감소시키거나, 또는 억제한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-BTLA 항체 또는 이의 항원-결합부를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 다른 항-BTLA 항체가 대신하여(또는 본 발명의 항-BTLA 항체와 조합하여) 사용될 수 있어도, 본 발명의 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 키메릭, 인간화된 또는 완전 인간 항-BTLA 항체를 종양 성장을 억제하는 방법에 사용할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-BTLA 항체 또는 이의 항원-결합부를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 다른 항-BTLA 항체가 대신하여(또는 본 발명의 항-BTLA 항체와 조합하여) 사용될 수 있어도, 본 발명의 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 키메릭, 인간화된 또는 완전 인간 항-BTLA 항체를 감염성 질환을 치료하는 방법에 사용할 수 있다.
더 나아가서, 본 발명은 대상체에 (i) 항원; 및 (ii) 항-BTLA 항체, 또는 이의 항원-결합부를 투여하여 상기 대상체 내에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 것을 포함하는, 대상체 내 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 병원체로부터의 항원일 수 있다. 상기 방법에 다른 항-BTLA 항체가 대신하여(또는 본 발명의 항-BTLA 항체와 조합하여) 사용될 수 있어도, 본 발명의 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 키메릭, 인간화된 또는 완전 인간 항-BTLA 항체를 대상체 내에서 항원에 대한 면역 반응을 강화시키는 방법에 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 명세서에서 제공된 항-BTLA 항체의 서열에 기초하여 "2세대" 항-BTLA 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 다음을 포함하는 항-BTLA 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 및/또는 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 또는 (ii) 서열 번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 및/또는 서열 번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 것;
(b) 적어도 하나의 변형된 항체 서열을 생성시키기 위하여, 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및 상기 경쇄 가변 영역 항체 서열로부터 선택된, 적어도 하나의 가변 영역 항체 서열 내에 존재하는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형시키는 것; 및
(c) 상기 변형된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 제한적으로 해석되어서는 안 될 하기의 상세한 설명 및 실시예로부터 명확해질 것이다. 본 명세서 전체에 인용된 모든 참조 문헌, 진뱅크(Genbank) 등록 번호, 특허 및 공개 특허 출원서의 내용은 참조를 위하여 본 명세서에 명백히 포함된다
<상세한 설명>
한 관점에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 특히 BTLA에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체에 관한 것이다. 소정의 구체예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 바람직한 기능적 성질, 예를 들어 BTLA로의 높은 친화성 결합, 다른 CD28 종 멤버로의 교차-반응의 결여, T 및/또는 B 세포 증식을 자극하는 능력, BTLA로의 하나 이상의 BTLA 리간드(예, HVEM)의 결합을 억제하는 능력, 생체 내 종양 세포의 성장을 억제하는 능력, 항원-특이적 기억 반응을 자극하는 능력, 및/또는 항체 반응을 자극하는 능력을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 면역 반응을 억제한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 특정한 중쇄 및 경쇄 생식세포계열 서열로부터 유래되고 및/또는 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특징을 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 분리된 항체, 그러한 항체를 만드는 방법, 그러한 항체를 포함하는 면역접합체 및 이중 특이적 분자 그리고 및 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 항-BTLA 항체를 이용하여 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 항-BTLA 항체는 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제할 수 있다. 또한 본 발명은 암과 같은 질환 또는 감염성 질환을 치료하거나, 또는 방어성 자가면역 반응을 자극하거나 또는 항원-특이적 면역 반응을 자극(예, 관심의 항원과 함께 항-BTLA의 공동투여에 의하여)하기 위할 뿐만 아니라 면역 반응을 변경하기 위하여 항체를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 더욱 쉽게 이해시키기 위하여, 소정의 용어를 우선 정의한다. 추가적 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 기술된다.
용어 "B 및 T 림프구 어테뉴에이터"와 "BTLA" 유전자/단백질은 상호교환적으로 사용되는데, 변이체(variants), 이소형태(isoforms), 상동체(homologs), 오르토로그(orthologs) 및 파라로그(paralogs)를 포함한다. 예를 들어, 인간 BTLA에 특이적인 항체는, 소정의 구체예에서, 인간 이외의 종으로부터의 BTLA와 교차-반응할 수 있다. 다른 구체예에서 인간 BTLA에 특이적인 항체는 인간 BTLA에 완전히 특이적일 수 있고 종 또는 다른 유형의 교차 반응성을 보여주지 못한다. 용어 "인간 BTLA"는, 진뱅크(Genbank) 기탁 번호 NP_861445를 갖는 인간 BTLA의 완전한 아미노산 서열과 같은, 인간 서열 BTLA를 지칭한다. 인간 BTLA 서열은, 예컨대, 보존적 돌연변이 또는 비-보존 영역 내 돌연변이를 가짐으로써 서열번호 73의 인간 BTLA와는 다를 수 있고 BTLA는 서열번호 73과는 본질적으로 동일한 생물학적 기능을 가진다. 예를 들어, 인간 BTLA의 생물학적 기능은, T-세포 반응과 같은 면역 반응을 억제하는 것이다. 즉, BTLA는 음성 조절제라고 생각된다. 그것은 IL-2 생산 및 T 세포 증식을 줄이는데 관여되는 C-말단 억제제 모티프를 가진다(Watanabe 등, Nat. Immunol., 4, 670-679, 2003; Chemnitz 등, J. Immunol., 176, 6603-6614, 2006). 덧붙여, 인간 BTLA의 생물학적 기능은, 예컨대, 본 발명의 항체에 의하여 특이적으로 결합된 BTLA의 세포 밖 도메인 내의 에피토프(epitope)를 가질 수 있다.
특정한 BTLA 서열은 서열번호 73의 인간 BTLA와는 아미노산 서열에 있어서 일반적으로 적어도 90%가 동일할 것이고 다른 종(예, 쥐과 동물)의 BTLA 아미노산 서열과 비교할 때 인간이라는 것으로서의 아미노산 서열을 정의하는 아미노산 잔기들을 포함한다. 소정의 경우에서, 인간 BTLA는 서열번호 73의 인간 BTLA와는 적어도 95%, 또는 심지어는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일할 수 있다. 소정의 구체예에서, 인간 BTLA 서열은 서열번호 73의 BTLA와는 단지 10개의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 어떤 구체예에서, 인간 BTLA는 서열번호 73의 BTLA와는 단지 5개, 또는 심지어 단지 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 퍼센트 동일성은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 "면역 반응"은, 예를 들어, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포들 또는 간(항체, 사이토카인(cytokines) 및 보체를 포함)에 의하여 생산되는 가용성 거대분자의 거동을 말하는데, 이것은 침입 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역 또는 병리적 염증의 경우에서 있어서, 보통 인간 세포 또는 조직에 손상을 주거나 그것을 파괴하거나 또는 그것을 인간 신체로부터 제거하는 결과를 가져온다.
"신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 또 다른 부분으로의 신호 전달에 있어서 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 본원에서 사용되는 어구 "세포 표면 수용체"는, 예를 들어, 신호를 받고 그 신호를 세포의 원형질 막을 가로질러 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다. 본 발명의 "세포 표면 수용체"의 예는 BTLA 수용체이다.
본 명세서에서 지칭되는 용어 "항체"는, 온전한 항체 및 이의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합부") 또는 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두 개의 중쇄(H) 및 적어도 두개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약자화) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 이러한 중쇄 불변 영역은 세가지 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 이러한 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역들은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로 불리우는, 초가변 영역들로 더 나뉠 수 있는데, 이들은 골격 영역(framework region, FR)으로 불리우는 더 보존적인 영역과 섞여 있다. 각 VH 및 VL은 세 개 CDR과 네 개 FR로 구성되고, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단방향으로 하기 순서로 정렬되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 항체들의 불변 영역은, 면역계(예, 작동자(effector) 세포) 및 전통적인 보체계(classical complement system)의 제 1 요소(Clq)를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린을 결합시키는 것을 매개할 수 있다
용어 항체의 "항원-결합부" (간단히 "항원부")는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항원(예컨대, BTLA)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편들을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의하여 수행될 수 있음을 보여 주었다. 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함되는 결합 단편들의 예는, (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 힌지 영역에서 이황화 다리(disulfide bridge)에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VL과 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward 등, (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 개 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화 되어 있지만, 그것들은 재조합 방법들을 사용하여, 합성 링커에 의해 결합되어 단일 단백질 사슬로서 만들어 질 수 있고, 여기서 VL 및 VH 영역들은 짝을 이뤄 단일가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로서 공지됨; 예, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)를 형성하게 된다. 그러한 단일 사슬 항체들은 또한 항체의 "항원-결합부" 용어의 범위내에 내포되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편들은 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 기술을 사용하여 얻을 수 있고, 상기 단편들을 본래의 항체들과 동일한 방식으로 검출하여 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성들을 가지는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, BTLA와 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 BTLA 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체들이 실질적으로 없다). 그러나 BTLA에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터 유래한 BTLA 분자와 같은 다른 항원에 교차 반응성(cross-reactivity)을 가진다. 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은, 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.
본 명세서에 사용되는, 용어 "인간 항체"는, 골격 영역 및 CDR 영역 양쪽 다 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열들로부터 유래한 가변 영역을 가지는 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 상기 항체가 불변 영역을 포함한다면, 그 불변 영역 또한 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래한다. 본 발명의 인간 항체들은 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열들에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기들(예, 시험관 내 랜덤 또는 자리-특이적(site-specific) 돌연변이생성(mutagenesis)에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이들)을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는, 용어 "인간 항체"는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열들이 인간 골격 서열들에 이식된 항체들을 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "인간 단일클론 항체"는, 골격 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열들로부터 유래된, 가변 영역을 가지는 단일 결합 특이성을 보이는 항체들을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 인간 단일클론 항체들은, 무한증식 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는, 트랜스유전자성 비인간 동물, 예를 들어, 트랜스유전자성 쥐로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "재조합 인간 항체"는, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 만들어지거나 또는 분리된 모든 인간 항체들, 예를 들어, (a) 인간 면역글로불린 유전자들에 대하여 트랜스유전자성(transgenic) 이거나 트랜스염색체성(transchromosomal)인 동물(예, 마우스)로부터 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(하기에 설명됨)로부터 분리된 항체들, (b) 형질전환되어 인간 항체를 발현하는 숙주세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체들, (c) 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열들을 다른 DNA 서열들로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 만들어지거나 또는 분리된 항체들을 포함한다. 그러한 재조합 인간 항체들은, 골격 영역 및 CDR 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열들로부터 유래되는, 가변 영역을 가진다. 그러나 어떤 구체예에서, 그러한 재조합 인간 항체들은 시험관 내 돌연변이생성(mutagenesis) (또는 인간 Ig 서열들에 대해 트랜스유전자성인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이생성)으로 처리될 수 있고, 따라서 재조합 항체들의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열들은, 인간 생식세포계열 VH 및 VL 서열들로부터 유래되고 이에 관련된 것인 반면에, 생체 내에서 인간 항체 생식세포계열 원천에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열들이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자들에 의해 암호화되는 항체 등급 (예, IgM 또는 IgGl)을 지칭한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 함께 상호교환적으로 이용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변이형태, 예를 들어, 항체 및 다른 제제나 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열들이 인간 골격 서열들에 접합된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가의 골격 영역 변형이 인간 골격 서열 내에서 이루어 질 수 있다.
용어 "키메릭 항체"는 가변 영역 서열들이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 다른 종으로부터 유래된 항체들, 예를 들어, 가변 영역 서열들이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는, "인간 BTLA에 특이적으로 결합하는" 항체는 1 × 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 5 × 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 1 × 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 5 × 10-9 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어"Kassoc"또는 "Ka"는, 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도(association rate)를 지칭하는 것이고, 반면에 본 명세서에서 사용되는, 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "KD"는, Kd 대 Ka 의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고, 몰 농도(M)로 표시되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체들에 대한 KD 값은 당해 분야에 설정된 방법들을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD 를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬(plasmon) 공명, 바람직하게, 바이어코어(Biacore)® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 IgG 항체에 대한 "고친화도"는 타겟 항원에 대하여 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 10-9 M 이하, 그리고 더욱 더 바람직하게는 10-10 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소타입(isotypes)에 대하여 다양해질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 "고친화도" 결합은 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 10-8 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-9 M 이하의 KD 를 가지는 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은, 포유 동물 및 비포유동물의 모든 척추동물을 포함한다.
본 발명의 다양한 관점들을 하기 소단락에서 더 상세하게 설명한다
항-BTLA 항체
본 발명의 항체는 항체의 특정한 기능적 특징 또는 성질을 특징으로 하고 있다. 예를 들어, 항체는 BTLA에 특이적으로 결합한다(예, 인간 BTLA에 결합하고 게잡이 원숭이와 같은, 다른 종으로부터의 BTLA와 교차-반응할 수 있음). 바람직하게, 본 발명의 항체는 고친화도, 예컨대 1 × 10-7 M 이하의 KD로 BTLA에 결합한다. 본 발명의 항- BTLA는 바람직하게는 다음의 특징 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 1 × 10-7 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합함;
(b) 인간 TrkB, CD28, CTLA-4, PD-1 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않음; 또는
(c) HVEM이 BTLA에 결합하는 것을 억제함.
추가 구체예에서, 본 발명의 항-BTLA 항체는 다음의 특징들을 나타낸다:
(a) 면역 반응을 자극함;
(b) 항체 반응을 자극함; 또는
(c) 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제함.
추가 구체예에서, 본 발명의 항- BTLA 항체는 면역 반응을 자극한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체는 길항제 항체이며 HVEM 매개 억제 신호를 막지만, 반면에 다른 구체예에서 본 발명의 항체는 BTLA를 활성화시키는 작용제 항체이며 BTLA를 발현하는 세포에 억제 신호를 제공한다.
바람직하게, 항체는 5 × 10-8 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하고, 1 × 10-8 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하며, 5 × 10-9 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하고, 또는 1 × 10-8 M과 1 × 10-10 M 의 사이 또는 그 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합한다.
본 발명의 항체는 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 상기-열거된 특징들과 같이, 상기-열거된 특징들의 임의의 조합을 나타낼 수 있다.
BTLA에 대한 항체들의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석법은, 예를 들어, ELISAs, 웨스턴 블랏(Western blots) 및 RIAs를 포함하는, 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학(예, 결합 친화도)은 또한 바이어코어(Biacore) 분석에 의한 것과 같은, 당해 기술 분야에 공지된 표준 분석법에 의해 평가될 수 있다. 임의의 상기-기술된 특징들을 평가하기 위한 적절한 분석법은 실시예에서 자세히 설명한다.
단일클론 항체 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9
본 발명의 바람직한 항체는 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 분리되고 구조적으로 특징된, 인간 단일클론 항체 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9 이다. 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9의 VH 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74, 및 85에 각각 보인다. 3C2a의 VH 아미노산 서열은 3C2의 것과 동일하다. 10H6a의 VH 아미노산 서열은 10H6의 것과 동일하다. 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9의 VL 아미노산 서열은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86에 각각 보인다.
이러한 항체 각각이 BTLA에 결합할 수 있다면, VH 및 VL 서열은 "혼합되고 짝지워져서" 본 발명의 다른 항-BTLA 결합 분자를 만들 수 있다. 그러한 "혼합되고 짝지워진" 항체의 BTLA 결합을 상기 및 실시예에서 기술된 결합 분석법(예, ELISAs)을 이용하여 검사할 수 있다. 바람직하게, VH 및VL 사슬이 혼합되고 짝지워질 때, 특정 VH/VL 접합으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하게 특정 VH/VL 접합으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 V L서열로 대체된다.
따라서, 일 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고:
(a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74, 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
여기에서 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다.
바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은 다음을 포함하다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a) 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a) 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(a) 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 관점에서, 본 발명은 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9의 중쇄 및 경쇄 CDR1들, CDR2들 및 CDR3들, 또는 이들의 조합물을 포함하는 항체를 제공한다. 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 및 4C9의 VH CDR1들의 아미노산 서열은 서열 번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87에 각각 보인다. 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 및 4C9의 VH CDR2들의 아미노산 서열은 서열 번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88에 각각 보인다. 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 및 4C9의 VH CDR3들의 아미노산 서열은 서열 번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89에 각각 보인다. 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9 의 Vk CDR1들의 아미노산 서열은 서열 번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95에 각각 보인다. 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9 의 Vk CDR2들의 아미노산 서열은 서열 번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96에 각각 보인다. 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9 의 Vk CDR3들의 아미노산 서열은 서열 번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97에 각각 보인다. CDR 영역은 카밧 시스템(Kabat system)을 이용하여 그 윤곽이 그려져 있다(Kabat, E. A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
이러한 항체 각각이 BTLA에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역에 의하여 일차적으로 제공된다면, VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 Vk CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 "혼합되고 짝지워져서" 즉, 비록 각 항체가 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 Vk CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하더라도 상이한 항체들의 CDR들이 혼합되고 짝지어질 수 있음), 본 발명의 다른 항-BTLA 결합 분자를 만들 수 있다. 그러한 "혼합되고 짝지워진" 항체의 BTLA 결합은 상기에서 및 실시예에서 기술된 결합 분석법(예컨대, ELISAs, 바이어코어(Biacore) 분석)을 이용하여 검사할 수 있다. 바람직하게, VH CDR 서열이 혼합되고 짝지어질 때, 특정 VH 서열의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 마찬가지로, Vk CDR 서열이 혼합되고 짝지어질 때, 특정 Vk 서열의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 바람직하게는 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 단일클론 항체 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a, 및 4C9의 본 명세서에 공지된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열을 만들 수 있다는 것은 통상적으로 숙련된 기술자에게는 확실히 명백하다.
따라서, 다른 관점에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공하고:
(a) 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77 및 87로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78 및 88로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79 및 89로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
여기에서 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 49를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 50을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 51을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 31을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 78을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 80을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 81을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 82를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 87을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 90을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 91을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 92를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 78을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 95를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 96을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 97을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
CDR3 도메인은, CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, 단독으로 동족체 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정지을 수 있다는 것과 공통의 CDR3 서열에 근거하여 동일한 결합 특이성을 가지는 다중 항체들이 발생될 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Klimka 등, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (쥐 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 영역 도메인 CDR3만을 사용한 인간화된 항-CD30 항체의 생산을 설명함); Beiboer 등, J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (부모 쥐 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 사용한 재조합 상피 당단백질-2 (EGP-2) 항체를 설명함); Rader 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (쥐 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중쇄 및 경쇄 가변 CDR3 도메인을 사용한 인간화된 항-인테그린 αvβ3 항체들의 패널을 설명하고 있고 여기서 각 항체 구성원은 CDR3 도메인 외부에 있고 부모 쥐 항체와 동일하거나 더 높은 친화도를 가지고 부모 쥐 항체와 동일한 에피토프를 결합할 수 있는 고유의 서열을 포함함); Barbas 등, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (CDR3 도메인은 항원 결합에 가장 중대한 공헌을 한다는 것을 설명함); Barbas 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (인간 태반 DNA에 대한 세 개 Fab (SI-1, SI-40, 및 SI-32)의 중쇄 CDR3 서열들을 항-파상풍 유독소(toxoid) Fab의 중쇄에 접합하고 이로써 기존의 중쇄 CDR3를 대체하는 것을 설명하고, CDR3 도메인 단독으로 결합 특이성을 부여한다는 것을 증명함); 및 Ditzel 등, J. Immunol. 157:739-749 (1996) (부모 다중특이성 Fab LNA3의 중쇄 CDR3 만을 단일특이적인 IgG 파상풍 유독소-결합 Fab p313 항체의 중쇄에 전달하는 것으로도 부모 Fab의 결합 특이성을 유지하는 데 충분하다는 결과를 나타낸 이식 연구를 설명함)을 참조. 이러한 참고 문헌 각각은 전체적으로 본 명세서 상에 참조로서 통합되어 있다.
따라서, 소정의 관점 내에서, 본 발명은 마우스 또는 쥐 항체와 같은, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 여기에서 단일클론 항체는 BTLA에 특이적으로 결합할 수 있다. 어떤 구체예 내에서, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 그러한 독창적인 항체는 (a) 결합을 위한 경쟁을 할 수 있고; (b) 기능적 특징을 보유하며; (c) 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 부모 비-인간 항체와 유사한 결합 친화도를 가진다.
다른 관점 내에서, 본 발명은, 예를 들어, 비-인간 동물로부터 얻은 인간 항체와 같은, 제 1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 상기 제 1 인간 항체는 BTLA에 특이적으로 결합할 수 있고 제 1 인간 항체로부터의 상기 CDR3 도메인은 BTLA에 대한 결합 특이성이 부족한 인간 항체에서 CDR3 도메인을 교환하여 BTLA에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 인간 항체를 생성한다. 어떤 구체예 내에서, 제 1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 그러한 독창적인 항체는 (a) 결합을 위한 경쟁을 할 수 있고; (b) 기능적 특징을 보유하며; (c) 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 부모 제 1 인간 항체와 동일한 결합 친화도를 가진다.
특정 생식세포계열 서열을 갖는 항체
소정 실시예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식세포계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식세포계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VH 2-05 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VH 2-70 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VH 4-59 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VH 3-20 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VH 3-33 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VK A27 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VK L18 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VK L15 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 인간 VK 04 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는 BTLA, 바람직하게는 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하는데, 상기 항체는:
(a) 인간 VH 2-05, 2-70, 4-59, 3-20, 또는 3-33(유전자가 서열번호 66, 67, 68, 69, 또는 99에서 기술된 아미노산 서열을 각각 암호화함)의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고;
(b) 인간 VK A27, L18, L15 또는 04 유전자(유전자가 서열번호 70, 71, 또는 72에서 기술된 아미노산 서열을 각각 암호화함)의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하며; 및
(c) BTLA에 특이적으로 결합한다.
VH 2-05 및 VK A27의 VH 및 VK를 가지는 항체들의 예들은, 각각, 1B4, 6A5, 및 E8D9이다. VH 2-70 및 VK A27의 VH 및 VK를 가지는 항체의 예는, 각각, E4H9이다. VH 4-59 및 VK L18의 VH 및 VK를 가지는 항체의 예는, 각각, 3C2이다. VH 4-59 및 VK A27의 VH 및 VK를 가지는 항체의 예는, 각각, 3C2a이다. VH 3-20 및 VK l15의 VH 및 VK를 가지는 항체의 예는 각각, 11E2이다. VH 3-33 및 VK 04의 VH 및 VK를 가지는 항체의 예는, 각각, 10H6이다. VH 3-33 및 VK A27의 VH 및 VK를 가지는 항체의 예는, 각각, 10H6a이다. VH 2-05 및 VK A27의 VH 및 VK를 가지는 항체의 예는, 각각, 4C9이다.
본 명세서에서 사용되는, 인간 항체는, 항체의 가변 영역들이 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어진다면, 특정 생식세포계열 서열 "의 생성물" 또는 특정 생식세포계열 서열 "로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 시스템들은 인간 면역글로불린 유전자를 가지는 트랜스유전자성 마우스를 관심의 항원으로 면역화하거나 또는 파지 상에 전시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심의 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식세포계열 면역글로불린 "의 생성물" 또는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열 "로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 면역글로불린의 아미노산 서열들과 비교하고 서열에 있어서 인간 항체의 서열과 가장 가까운(즉, 최대 % 상동성) 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 그러한 것으로 확인될 수 있다. 특정 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열 "의 생성물" 또는 특정 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열 "로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어, 자연발생적 체세포 변이 또는 자리-지정 돌연변이(site-directed mutation)의 인위적 도입으로 인해 생식세포계열 서열과 비교하여 상이한 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 일반적으로는 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열에 있어서 적어도 90% 동일하고 다른 종의 생식세포계열 면역글로불린 아미노산 서열들(예, 쥐의 생식세포계열 서열들)과 비교할 때, 인간 항체를 인간이라는 것으로 확인하는 아미노산 잔기들을 포함한다. 소정의 경우에, 인간 항체는, 아미노산 서열에 있어서, 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과, 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일반적으로, 특정 인간 생식세포계열 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 단지 10개의 아미노산 차이만을 보인다. 특정의 경우, 상기 인간 항체는 생식세포계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 단지 5 개, 또는 심지어 단지 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산 차이만을 보인다.
상동성 항체
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 본 명세서에서 설명된 바람직한 항체들의 아미노산 서열들에 상동성인 아미노산 서열들을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체들은 본 발명의 항-BTLA 항체들의 소망의 기능적 성질을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하며, 여기에서:
(a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74, 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며; 및
상기 항체는 다음의 성질 중 하나 이상을 나타낸다:
(i) 상기 항체는 1 × 10-7 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합한다;
(ii) 상기 항체는 인간 TrkB, CD28, CTLA-4, PD-1 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않는다;
(iii) 상기 항체는 BTLA로의 HVEM의 결합을 억제한다;
(iv) 상기 항체는 면역 반응을 자극한다;
(v) 상기 항체는 항체 반응을 자극한다;
(vi) 상기 항체는 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제한다.
다른 구체예에서 항체는 면역 반응을 억제하거나 억누른다.
다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열들은 상기 설명된 서열들에 대하여 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 설명된 서열들의 VH 및 VL 영역에 대하여 높은 (즉, 80% 이상) 상동성을 가지는 VH 및 VL 영역을 가지는 항체는 서열번호 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 및/또는 65를 암호화하는 핵산 분자의 돌연변이생성(예컨대, 자리-지정 또는 PCR-매개 돌연변이생성)에 의하여 얻은 후, 본 명세서에서 설명된 기능적 분석법을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기에서 (c) 부터 (g)에 설명된 기능)에 대하여 상기 암호화된 변형된 항체를 테스트할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 두 개의 아미노산 서열 간의 상동성 백분율은 두 서열 간의 동일성 백분율에 대응된다. 두 서열 간의 동일성 백분율은, 두 서열의 최적 정렬에 대하여 도입될 필요가 있는, 간격들의 수 및 각 간격의 길이를 고려하여, 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 × 100). 두 서열 간 서열의 비교 및 백분율 동일성의 결정은, 하기 비-제한적 실시예에서 설명된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 사용하여 이룰 수 있다.
두 개 아미노산 서열간의 동일성 백분율은 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 결정될 수 있고, 이 알고리즘은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있으며, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 간격 길이 페널티 및 4의 간격 페널티를 사용한다. 또한, 두 개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 이 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램에 통합되어 있으며, 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 간격 가중치와 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열들을 "조회(query) 서열"로 사용하여 공공 데이터베이스에 대하여 검색을 수행함으로써, 예를 들어, 연관 서열들을 확인할 수 있다. 그러한 검색은 Altschul, 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이= 3을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 항체 분자와 상동인 아미노산 서열들을 얻을 수 있다. 비교 목적상 이격된 정렬들을 얻기 위해, Gapped BLAST를 Altschul 등, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에서 설명된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 변수들이 사용될 수 있다(www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
보존적 변형체를 갖는 항체
소정의 구체예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는데, 이러한 CDR 서열들의 하나 이상은 본 명세서에서 설명된 바람직한 항체들(예컨대, 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, 및 E8D9) 또는 이의 보존적 변형체에 기초한 특정 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 상기 항체는 본 발명의 항-BTLA 항체들의 소망의 기능적 성질을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공하는데, 여기에서,
(a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 및
상기 항체는 다음의 성질 중 하나 이상을 나타낸다:
(i) 항체는 1 × 10-7 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합한다;
(ii) 항체는 인간 TrkB, PD-1, CD28, CTLA-4 또는 ICOS에 본질적으로 결합하지 않는다;
(iii) 항체는 BTLA로의 HVEM의 결합을 억제한다;
(iv) 항체는 면역 반응을 자극한다;
(v) 항체는 항체 반응을 자극한다;
(vi) 항체는 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제한다.
다른 구체예에서 항체는 면역 반응을 억제하거나 억누른다.
바람직한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 및 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "보존적 서열 변형물"은 그 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성을 유의하게 변화 또는 변경하지 않는 아미노산 변형체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러한 보존적 변형체는 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 자리-지정 돌연변이 생성법 및 PCR-매개 돌연변이 생성법과 같이, 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여, 본 발명의 항체에 변형을 유도할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 일 군은 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 군들은 염기성 측쇄(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파르트 산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가진 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역내에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 군으로부터 나온 다른 아미노산 잔기와 대체될 수 있고, 이러한 변형된 항체는 본 명세서에서 설명된 기능 분석 방법을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기에서 (c) 부터 (g)에서 설명된 기능들)에 대하여 테스트할 수 있다.
본 발명의 항-BTLA 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 BTLA 단일클론 항체(즉, BTLA에 결합하는 것에 대하여 본 발명의 임의의 단일클론 항체와 교차-경쟁하는 능력을 가진 항체)와 동일한 인간 BTLA 상의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 교차-경쟁 연구를 위한 참조 항체는 단일클론 항체 1B4(서열번호 1 및 7에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 E4H9(서열번호 2 및 8에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 3C2(서열번호 3 및 9에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 3C2a(서열번호 3 및 10에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 6A5(서열번호 4 및 11에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 11E2(서열번호 5및 12에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 E8D9(서열번호 6 및 13에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 10H6(서열번호 74 및 75에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 10H6a(서열번호 74 및 76에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 단일클론 항체 4C9(서열번호 85 및 86에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐)일 수 있다. 그러한 교차-경쟁하는 항체들은 표준 BTLA 결합 분석법에서 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 또는 4C9 와 교차-경쟁하는 그들의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 바이어코어(BIAcore) 분석법, ELISA 분석법 또는 유세포 분석법은 본 발명의 항체들과의 교차-경쟁을 증명하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간 BTLA에 대한 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 또는 4C9의 결합을 억제하는 테스트 항체의 능력은 테스트 항체가 인간 BTLA에 결합하는 데 있어서 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 또는 4C9와 경쟁할 수 있고 따라서 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 또는 4C9와 인간 BTLA 상의 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 증명한다. 바람직한 구체예에서, 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 또는 4C9와 인간 BTLA 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단일클론 항체이다. 그러한 인간 단일클론 항체들은 실시예에서 설명된 바와 같이 제조 및 분리될 수 있다.
조작되고 변형된 항체
본 발명의 항체는 본 명세서에서 공지된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열들을 가지는 항체를 출발 물질로 사용하여, 이러한 출발 항체로부터 변형된 특성을 가지는, 변형된 항체를 조작함으로써 제조될 수 있다. 하나 또는 양 쪽 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 골격 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 항체를 조작할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형함으로써, 항체를 조작하여, 예를 들어, 항체의 작동자(effector) 기능(들)을 바꿀 수 있다.
CDR 접합은 항체의 가변 영역을 조작하는 데 실시될 수 있다. 항체들은 주로, 여섯 개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR들)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해서 타겟 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내에 있는 아미노산 서열들은 CDR바깥의 서열들보다 개별적 항체들 간에 있어서 더욱 다양하다. CDR 서열들이 대부분 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 가지는 상이한 항체로부터 유래된 골격 서열들에 접합된, 특이적 자연발생 항체들로부터 나온 CDR 서열들을 포함하는 발현 벡터들을 제작함으로써 특이적 자연 발생 항체들의 특성을 닮은 재조합 항체들을 발현하는 것이 가능하다 (예, Riechmann, L. 등 (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. 등 (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. 등 (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Winter의 미국 특허 제 5,225,539 호, 및 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
따라서, 본 발명의 다른 구체예는 각각 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87, 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88, 및 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96, 및 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체들은 단일클론 항체 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6A, 및 4C9의 VH 및 VL CDR 서열들을 포함하나, 이러한 항체들로부터의 상이한 골격 서열들을 포함할 수 있다.
그러한 골격 서열들은, 생식세포계열 항체 유전자 서열들을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포계열 DNA 서열들은 Kabat, E. A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., 등 (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of V-H Segments with Different Hypervariable Lopps" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. 등 (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836에서는 물론 "VBase" 인간 생식세포계열 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 인터넷 상으로 이용가능)에서 발견될 수 있고, 이들 각각의 내용은 참조문헌으로 본 명세서에 명백하게 병합된다.
항체 단백질 서열들은 축척된 단백질 서열 데이터베이스와 비교하는 데 있어서 당해 분야의 숙련자들에게는 잘 알려진, 서열 유사성 검색 방법들 중 하나인, Gapped BLAST으로 불리는 방법을 사용할 수 있다(Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402). BLAST는 발견적(heuristic) 알고리즘으로, 여기서 항체 서열 및 데이터베이스 서열 간의 통계적으로 유의한 정렬은 정렬된 단어들의 고-득점 분절 쌍(high-scoring segment pairs, HSP)을 포함할 수 있을 것이다. 연장 또는 가지치기(trimming)에 의해서 그 득점을 향상시키지 못하는 분절 쌍(segment pair)을 히트(hit)라고 칭한다. 간략하게, VBASE 유래의 뉴클레오티드 서열들(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)은 번역되어 있고, FR1 내지 FR3 골격 영역간 및 이를 포함하는 영역은 유지되어 있다. 상기 데이터베이스 서열들은 평균 98 잔기의 길이를 가진다. 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 정확히 들어맞는 이중 서열들은 제외된다. 저 복잡도 필터(complexity filter)를 정지시킨 것을 제외하고는 디폴트의(default), 표준 변수들을 가지고 blastp 프로그램 및 BLOSUM62의 치환 매트릭스를 사용하여 단백질들에 대하여 BLAST 검색을 실시하여 5 등까지의 히트를 걸러내어, 서열 짝(match)들을 생성하였다. 그 뉴클레오티드 서열들을 6 개 모든 프레임에서 번역하고 상기 데이터베이스 서열의 매칭 분절에서 정지 코돈이 없는 프레임이 잠재적인 히트로 고려된다. 이를, 다음, BLAST 프로그램 tblastx를 사용하여 확정한다. 이것은 상기 항체 서열을 6 개 모든 프레임에서 번역하며 이러한 번역물을 6 개 모든 프레임에서 동적으로 번역된 VBASE 뉴클레오티드 서열들과 비교한다.
동일한 것들은 서열의 전체 길이에 걸쳐서 항체 서열과 단백질 데이터베이스 간의 아미노산이 정확하게 들어맞는 것들이다. 양성적인 것들(동일한 것들+치환 짝)은 일치하지는 않으나 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 가이드되는 아미노산 치환물이다. 만약 항체 서열이 동일한 동일성을 가진 두 데이터베이스 서열과 매치된다면, 가장 양성적인 것들을 가지는 히트는 매칭 서열 히트(matching sequence hit)인 것으로 결정될 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기에 바람직한 골격 서열들은 본 발명의 선택된 항체들에 의해 사용된 골격 서열들과 구조적으로 유사한데, 예컨대, 본 발명의 바람직한 단일클론 항체들에 의해 사용되는 VH 2-05 골격 서열들(서열번호 66) 및/또는 VH 2-70 골격 서열들(서열번호 67) 및/또는 VH 4-59 골격 서열들(서열번호 68) 및/또는 VH 3-20 골격 서열들(서열번호 69) 및/또는 VH 3-33 골격 서열들(서열번호 99) 및/또는 VK A27 골격 서열들(서열번호 70) 및/또는 VK L18 골격 서열들(서열번호 71) 및/또는 VK L15 골격 서열들(서열번호 72) 및/또는 VK 04 골격 서열들(서열번호 100)에 유사하다. VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 VK CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은, 골격 서열이 유래하는 생식세포계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 가지는 골격 영역 상에 접합될 수 있거나, 또는 상기 CDR 서열들은 생식세포계열 서열들에 비하여 하나 이상의 변형을 포함하는 골격 영역 상에 접합될 수 있다. 예를 들어, 소정의 경우, 골격 영역 내의 잔기를 변형시켜 항체의 항원 결합능을 유지 또는 강화시키는 것이 유익한 것으로 알려져 있다(예, Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
다른 유형의 가변 영역 변이는 VH 및/또는 VK CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 변이시켜 관심의 항체의 하나 이상의 결합 성질(예, 친화도)을 향상시키는 것이다. 자리-지정 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성을 수행하여 변이(들)를 도입하고 항체 결합, 또는 다른 관심의 기능적 성질에 대한 효과는 명세서에서 설명되고 실시예에서 제공된 바와 같이, 시험관내 또는 생체내 분석법으로 평가할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변이(상기에서 기술된 바와 같은)가 도입된다. 이러한 변이는 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 더욱이, 일반적으로, 하나의 CDR 영역 내에서 단지 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 잔기만이 변형된다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항-BTLA 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부를 제공한다: (a) 서열번호14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열번호32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR1 영역; (e) 서열번호39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR2 영역; (f) 서열번호46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR3 영역.
본 발명의 조작된 항체들은, 예를 들어, 항체의 성질을 향상시키기 위하여, VH 및/또는 VK 내의 골격 잔기에 변이가 만들어진 것을 포함한다. 일반적으로 그러한 골격 변이들은 항체의 면역원성을 감소시키도록 만들어진다. 예를 들어, 하나의 접근 방법은 하나 이상의 골격 잔기를 상응하는 생식세포계열 서열로 "복귀돌연변이" 시키는 것이다. 더욱 상세하게는, 체세포 변이된 항체는 항체가 유래되는 생식세포계열 서열과는 상이한 골격 잔기를 포함할 수 있다. 그러한 잔기는 항체 골격 서열들을 항체가 유래되는 생식세포계열 서열들을 비교함으로써 확인할 수 있다.
예를 들어, 하기 표 1은 부모 생식세포계열 서열과는 다른 항-BTLA 항체 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 및 4C9의 골격 영역에서의 많은 수의 아미노산 변이를 보여준다. 골격 영역 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기들을 그들의 생식세포계열 배열로 복귀시키기 위하여, 예를 들어, 자리-지정 돌연변이생성(site-directed mutagenesis) 또는 PCR-매개 돌연변이생성에 의하여, 체세포 돌연변이를 생식세포계열로 "복귀돌연변이" 시킬 수 있다.
부모 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열에 대한 1B4의 VH 영역의 정렬은 도 7에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk A27 아미노산 서열에 대한 1B4의 Vk 영역의 정렬은 도 8에 보인다. 부모 생식세포계열 VH 2-70 아미노산 서열에 대한 E4H9의 VH 영역의 정렬은 도 9에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk A27 아미노산 서열에 대한 E4H9의 Vk 영역의 정렬은 도 10에 보인다. 부모 생식세포계열 VH 4-59 아미노산 서열에 대한 3C2의 VH 영역의 정렬은 도 11에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk L18 아미노산 서열에 대한 3C2의 Vk 영역의 정렬은 도 12에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk L15 아미노산 서열에 대한 3C2a의 Vk 영역의 정렬은 도 13에 보인다. 부모 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열에 대한 6A5의 VH 영역의 정렬은 도 14에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk A27 아미노산 서열에 대한 6A5의 Vk 영역의 정렬은 도 15에 보인다. 부모 생식세포계열 VH 3-20 아미노산 서열에 대한 11E2의 VH 영역의 정렬은 도 16에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk L15 아미노산 서열에 대한 11E2의 Vk 영역의 정렬은 도 17에 보인다. 부모 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열에 대한 E8D9의 VH 영역의 정렬은 도 18에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk A27 아미노산 서열에 대한 E8D9의 Vk 영역의 정렬은 도 19에 보인다. 부모 생식세포계열 VH 3-33 아미노산 서열에 대한 10H6의 VH 영역의 정렬은 도 22에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk 04 아미노산 서열에 대한 10H6의 Vk 영역의 정렬은 도 23에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk A27 아미노산 서열에 대한 10H6a의 Vk 영역의 정렬은 도 24에 보인다. 부모 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열에 대한 4C9의 VH 영역의 정렬은 도 26에 보인다. 부모 생식세포계열 Vk A27 아미노산 서열에 대한 4C9의 Vk 영역의 정렬은 도 27에 보인다.
<표 1> 생식세포계열 배열로부터의 항체 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2의 변이
항-BTLA Ab 아미노산 위치 항체의 아미노산 생식세포계열 배열의 원래 아미노산
1B4 VH 30 N S
72 S T
E4H9 VH 86 D N
3C2 VH 24 I V
69 M I
72 E D
6A5 VH 85 A T
11E2 VH 12 I V
91 S T
95 Y H
10H6 VH 33 D G
50 A V
53 N Y
10H6a Vk 32 I S
4C9 VH 37 A G
56 D N
85 S T
4C9 Vk 32 T S
35 V A
다른 유형의 골격 변이는 골격 영역내 또는 심지어는 하나 이상의 CDR 영역 내에 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거하고 그것에 의하여 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근방식은 또한 "탈면역화"로 칭하여지고 Carr 등의 미국 특허 공개 번호 제20030153043호에 보다 상세히 설명되어 있다.
골격 또는 CDR 영역 내에서 만들어진 변이에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체들을 조작하여 Fc 영역 내에서 변이를 만들어, 일반적으로 항체의 하나 이상의 기능적 성질, 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포 독성과 같은 기능적 성질을 변경할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체를 화학적으로 변이시키고(예, 하나 이상의 화학적 분체를 항체에 붙일수 있다) 또는 글리코실화를 변경하는 것으로 변이시켜 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 변경할 수 있다. 이러한 구체예들 각각이 하기에 더 상세히 설명되어 있다. Fc 영역에서의 잔기의 번호매김은 카밧의 EU 인덱스의 것과 같다.
하나의 구체예에서, CH1의 힌지 부분을 변이시켜 힌지 영역에서의 시스테인 잔기들의 수를 변경, 예를 들어 증가시키거나 감소시킨다. 이러한 접근 방법은 Bodmer 등의 미국 특허 제 5,677,425 호에 더 설명되어 있다. CH1의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수를 변경하여, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄들의 조합을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시킨다.
다른 구체예에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 변이시켜 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 더욱 상세하게는, 하나 이상의 아미노산 변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입하여 상기 항체가, 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여, 손상된 포도상구균 단백질 A (SpA) 결합을 가지게 된다. 이러한 접근은 Ward 등의 미국 특허 제 6,165,745 호에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 상기 항체를 변이시켜 생물학적 반감기를 증가시킨다. 다양한 접근 방식이 가능하다. 예를 들어, Ward의 미국 특허 제6,277,375호에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 하기 변이를 도입할 수 있다: T252L, T254S, 및 T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 연장시키기 위해, Presta 등의 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에서 설명된 바와 같이, 항체를 CH1 또는 CL 영역에서 변경시켜 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개 루프로부터 얻은 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 포함할 수 있다.
또한 다른 구체예에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 항체의 작동자(effector) 기능(들)을 변경하도록 Fc 영역을 변경할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산들을 상이한 아미노산 잔기로 치환하여 항체가 작동자(effector) 리간드에 대한 변경된 친화도를 가지지만, 부모 항체의 항원-결합 능력을 보유하게 한다. 친화도가 변경되는 상기 작동자 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근 방법은 Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더 상세히 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산들을 다른 아미노산 잔기로 치환하여 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 폐지된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 가지게 된다. 이러한 접근 방법은 Idusogie 등의 미국 특허 제6,194,551호에 더 상세히 설명되어 있다.
다른 구체예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경하여 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경한다. 이러한 접근 방법은 Bodmer 등의 PCT 공개 제WO 94/29351호에 더 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 다음의 위치에서 하나 이상의 아미노산들을 변이시킴으로써 Fc 영역을 변이시켜 항체 의존성 세포성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 조정하는 항체의 능력을 증가시키고 및/또는 Fcγ수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근 방법은 Presta의 PCT 공개 번호 제WO 00/42072호에 더 상세히 기술되어 있다. 더욱이, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 위치가 지도화되어 있고 향상된 결합을 가지는 변이체들이 기술되어 있다 (Shields, R.L. 등 (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 변이는 FcγRIII에 대한 결합을 향상시키는 것으로 나타났다. 추가로, 다음의 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 향상시키는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
또 다른 구체예에서, 항체의 글리코실화를 변이시킨다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체를 만들 수 있다(즉, 항체는 글리코실화를 결여한다). 글리코실화를 변경하여, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 탄수화물 변이는, 예를 들어, 항체 서열 내에서 하나 이상의 글리코실화 위치를 변경함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 위치를 제거하도록 야기하는 하나 이상의 아미노산 치환을 만들어서 그 위치에서 글리코실화를 없애버릴 수 있다. 그러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 접근 방법은 Co 등의 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 가지는 항체, 예를 들어, 감소된 양의 퓨코실 잔기를 가지는 저퓨코실화 항체, 또는 증가된 두갈래 GlcNac 구조를 가지는 항체를 만들 수 있다. 그러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체들의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러한 탄수화물 변이는, 예를 들어, 변경된 글리코실화 기제(machinery)를 가진 숙주 세포에서 상기 항체를 발현시킴으로써 이루어 질 수 있다. 변경된 글리코실화 기제를 가진 세포들은 당해 분야에 공지되어 있고 본 발명의 재조합 항체들을 발현하여 변경된 글리코실화를 가지는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8(알파 (1,6) 퓨코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어서, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체들은 그들 탄수화물 상에서 퓨코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주들은 두 개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자를 타겟 파괴함으로써 만들 수 있다(Yamane 등의 미국 특허 공개 제20040110704호 및 Yamane-Ohnuki 등 (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22 참조). 다른 예로서, Hanai 등의 유럽 특허 제1,176,195호에는 퓨코실 트랜스퍼라제를 암호화하고 있는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴되어 있는 세포주가 기술되어 있고, 그러한 세포주에서 발현되는 항체들은 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저퓨코실화를 나타내게 된다. Hanai 등은 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 퓨코스를 첨가하는데 낮은 효소 활성을 가지는 또는 그러한 효소 활성을 가지지 않는 세포주, 예를 들어, 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)를 기술하고 있다. Presta의 PCT 공개번호 제WO 03/035835호는 변형 CHO 세포주인 Lec13 세포에 대해서 기술하고 있는 데, 이 세포들은 Asn(297)-연결 탄수화물에 퓨코스를 첨부하는 능력이 감소되어 있어서, 그러한 숙주 세포에서 발현된 항체들에 저퓨코실화를 야기하게 된다(또한 Shields, R.L. 등 (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). Umana 등의 PCT 공개번호 제WO 99/54342호는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기술하고 있고, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체들은 증가된 양갈래 GlcNac 구조를 보이고, 결과적으로 상기 항체들의 증가된 ADCC 활성을 나타낸다 (Umana 등 (1999) Nat. Biotech. 17:176-180도 참조). 대안적으로, 퓨코시다제 효소를 사용하여 상기 항체의 퓨코스 잔기를 절단할 수 있다. 예를 들어, 퓨코시다제 알파-L-퓨코시다제는 항체들에서 퓨코실 잔기를 제거한다 (Tarentino, A.L. 등 (1975) Biochem. 14:5516-23).
본 발명에 의하여 고려될 수 있는 본 발명의 항체들의 다른 변이방법은 PEG화(pegylation)이다. 항체를 PEG화시켜, 예를 들어, 항체의 생물학적(예, 혈청) 반감기를 늘릴 수 있다. 항체를 PEG화 시키기 위해, 항체, 또는 이의 단편을, 하나 이상의 PEG 군이 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서, 예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응시킨다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질들, 예를 들어, 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도하는 데 사용된 PEG의 임의의 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 어떤 구체예에서, PEG화될 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 유럽 특허 제0 154 316호 및 Ishikawa 등의 유럽 특허 제0 401 384호 참조.
항체를 조작하는 방법
전술한 바와 같이, 본 명세서에서 공지된 VH 및 VK 서열들을 가지는 항-BTLA 항체를 사용하여 VH 및/또는 VK 서열들 또는 이에 부착된 불변 영역(들)을 변이시킴으로써 새로운 항-BTLA 항체를 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점에서, 본 발명의 항-BTLA 항체, 예컨대, 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, 또는 E8D9의 구조적 특징을 이용하여, 인간 BTLA에 결합하는 것과 같은, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 성질을 보유하는, 구조적으로 관련된 항-BTLA 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, 또는 E8D9, 또는 이의 돌연변이들의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 골격 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합하여, 상기에 검토한 바와 같이, 추가의 재조합적으로 조작된 본 발명의 항-BTLA항체를 만들 수 있다. 변이의 다른 유형은 앞 부분에서 설명되었던 것들을 포함한다. 이러한 조작 방법에 사용되는 개시 물질은 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VK 서열들 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 만들기 위해, 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VK 서열들 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역을 가지는 항체를 실제적으로 제조하는(즉, 단백질로서 발현시키는) 것은 필요치 않다. 그보다는, 그 서열(들)에 포함된 정보를 개시 물질로 사용하여 원래 서열(들)로부터 유래된 "2세대" 서열(들)을 생성한 후, 상기 "2세대" 서열(들)을 제조하고 단백질로서 발현시킨다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-BTLA 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96으로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하고;
(b) 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 상기 경쇄 가변 영역 항체 서열 내에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형하여 적어도 하나의 변형된 항체 서열을 생성하며; 및
(c) 상기 변형된 항체 서열을 단백질로서 발현하는 것.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 상기 변형된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
바람직하게, 변형된 항체 서열(들)에 의하여 암호화된 항체는 본 명세서에서 기술된 항-BTLA 항체의 기능적 성질들의 하나, 몇 개 또는 모두를 보유하는 항체이며, 상기 기능적 성질들은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:
(a) 항체는 1 × 10-7 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합한다;
(b) 항체는 인간 TrkB, PD-1, CD28, CTLA-4 또는 ICOS에 본질적으로 결합하지 않는다;
(c) 항체는 BTLA로의 HVEM의 결합을 억제한다;
(d) 항체는 면역 반응을 자극한다;
(e) 항체는 항체 반응을 자극한다;
(f) 항체는 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제한다.
다른 구체예에서, 항체는 면역 반응을 억제하거나 억누른다.
상기 변형된 항체들의 기능적 성질들은, 실시예에 설명된 바와 같이, 당해 분야에서 이용가능하고 및/또는 본 명세서에 기술된 표준 분석법(예컨대, 유세포 분석법, 결합 분석법)을 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체를 조작하는 방법에 관한 소정의 구체예에서, 항-BTLA 항체 암호화 서열의 전체 또는 일부를 따라서 돌연변이를 무작위적으로 또는 선택적으로 도입할 수 있고, 그 결과의 변형된 항-BTLA 항체들을 본 명세서에 설명된 바와 같이, 결합 활성에 대하여 및/또는 다른 기능적 성질들에 대하여 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, Short의 PCT 공개번호 제WO 02/092780호는 포화 돌연변이 생성법, 합성 결찰 조립법(synthetic ligation assembly) 또는 이의 조합 방법을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 검출하는 방법을 기술하고 있다. 대안적으로, Lazar 등의 PCT 공개번호 제WO 03/074679호는 컴퓨터화된 스크리닝 방법을 사용하여 항체들의 생리학적 성질을 최적화시키는 방법들을 기술하고 있다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산은 온전한 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태 내에 존재할 수 있다. 핵산은, 알카라인/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로즈 젤 전기영동 및 당해 업계에 공지된 다른 기술을 포함한 표준 기술을 사용하여, 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때, "분리"되거나 "실질적으로 순수하게 된" 것이다. F. Ausubel 등, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York 참조. 본 발명의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론성 서열들을 포함할 수도 안할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마(예, 후술하는 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 트랜스유전자성 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호하하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻어진(예, 파지 디스플레이 기술을 사용함) 항체의 경우, 그 항체를 암호화하는 핵산은 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자들은 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 또는 4C9 단일클론 항체들의 VH 및 VL 서열들을 암호화하는 것들이다. 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 및 4C9의 VH 서열들을 암호화하는 DNA 서열들은 각각 서열번호 53, 54, 55, 56, 56, 58, 83 및 93에 나타나 있다. 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6, 10H6a 또는 4C9 의 VL 서열들을 암호화하는 DNA 서열은 각각 서열번호 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 84, 98, 및 94에 나타나 있다.
일단 VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편들을 얻는다면, 이러한 DNA 단편들은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 더 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환시킬 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변 영역이나 유연한 링커와 같은, 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편과 작동적으로 연결되어 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "작동적으로 연결된"은, 두 개 DNA 단편들이 연결되어서 그 두 개 DNA 단편들에 의해 암호화된 아미노산 서열들이 프레임 내에 남아있는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역들(CH1, CH2, 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자들의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고(예를 들어, Kabat, E. A. 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편들은 표준 PCR 증폭으로 얻을 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA를 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결할 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴으로써, 전장 경쇄 유전자(Fab 경쇄 유전자는 물론)로 변환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열들은 당해 분야에 공지되어 있고(예를 들어, Kabat, E. A. 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편들은 표준 PCR 증폭으로 얻을 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직한 것은 카파 불변 영역이다.
scFv 유전자를 만들기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편들을 유연한 링커를 암호화하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3을 암호화하는 다른 단편과 작동적으로 연결시켜서, VH 및 VL 서열들을 상기 유연한 링커로 연결된 VL 및 VH 영역을 가지는 연속적인 단일 사슬 단백질로서 발현하게 할 수 있다(예를 들어, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty 등 (1990) Nature 348:552-554 참조).
본 발명의 단일클론 항체의 생산
본 발명의 단일클론 항체(mAbs)를 통상적인 단일클론 항체 방법, 예를 들어, Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495 의 표준 체세포 하이브리드화 기술을 포함하는 다양한 기술로 생산할 수 있다. 비록 체세포 하이브리드화 과정이 바람직하다 하더라도, 원칙적으로, 단일클론 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성적 형질전환을 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 방법이다. 면역화 프로토콜 및 융합용 면역화된 비장세포의 분리 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너들 (예를 들어, 쥐의 골수종 세포) 및 융합 방법이 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체들은 전술한 대로 제조된 쥐 단일클론 항체의 서열에 근거하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린들을 암호화하는 DNA는 관심의 쥐 하이브리도마로부터 얻을 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-쥐(예, 인간) 면역글로불린 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메릭 항체를 생성하기 위해, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 쥐의 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다(예, Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호 참조). 인간화된 항체를 만들기 위해, 업계에 공지된 방법을 사용하여 쥐의 CDR 영역들을 인간 골격으로 삽입할 수 있다(예, Winter의 미국 특허 제5,225,539호 및 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체들은 인간 단일클론 항체들이다. BTLA에 대하여 지정된 그러한 인간 단일클론 항체들은 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 부분을 지닌 트랜스유전자성(transgenic) 또는 트랜스염색체성(transchromosomic) 마우스를 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 트랜스유전자성 및 트랜스염색체성 마우스는 각각 본 명세서에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스™로 지칭되는 마우스를 포함하고, 총칭하여 본원에서 "인간 Ig 마우스"라고 한다.
HuMAb 마우스®(Medarex 사)는 정렬되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열들을, 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 불활성화시키는 타겟된 돌연변이와 함께 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 미소좌위(miniloci)를 포함한다(예, Lonberg, 등 (1994) Nature 368(6474):856-859 참조). 따라서, 그 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자들은 유형 전환(switching)과 체세포 돌연변이를 겪게되어 고 친화도 인간 IgG 단일클론을 생성한다(Lonberg, N. 등, (1994) 위 문헌; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. 및 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. 및 Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546에서 검토됨). HuMab 마우스의 제조와 사용, 및 이러한 마우스에 의한 게놈 변형은 Taylor, L. 등 (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. 등 (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi 등 (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. 등 (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon 등 (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. 등 (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 더 설명되어 있고, 이 모든 내용은 전체적으로 참조 문헌으로서 본 명세서에 특별히 병합된다. Lonberg 및 Kay의 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호; Surani 등의 미국 특허 제5,545,807호; Lonberg 및 Kay의 PCT 공개번호 제WO 92/03918호, 제WO 93/12227호, 제WO 94/25585호, 제WO 97/13852호, 제WO 98/24884호 및 제WO 99/45962호; 및 Korman 등의 PCT 공개번호 제WO 01/14424호를 더 참조.
다른 구체예에서, 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 지닌 마우스와 같은, 트랜스유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 지닌 마우스를 사용하여 본 발명의 인간 항체들을 만들 수 있다. 이러한 마우스는 본 명세서에서 "KM 마우스™"으로 지칭되며, Ishida 등의 PCT 공개번호 제WO 02/43478 호에 더 상세하게 설명되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스유전자성 동물 시스템이 당해 분야에서 이용가능하고 본 발명의 항-BTLA 항체를 키우는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse, Abgenix 사)로 지칭되는 대안적 트랜스유전자성 시스템을 사용할 수 있는데; 그러한 마우스는, 예를 들어, Kucherlapati 등의 미국 특허 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6, 150,584호 및 제6,162,963호에 설명되어 있다.
더구나, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스염색체성 동물 시스템은 당해 분야에서 이용가능하고 본 발명의 항-BTLA 항체를 키우는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 다를 지닌 마우스를 사용할 수 있는데; 그러한 마우스는 Tomizuka 등 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727에 설명되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 지닌 소는 당해 분야에서 설명되어 있고(Kuroiwa 등 (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) 본 발명의 항-BTLA 항체를 키우는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 단일클론 항체들은 또한 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체들을 분리하는 이러한 파지 디스플레이 방법들은 당해 분야에 확립되어 있다. 예를 들어: Ladner 등의 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호; Dower 등의 미국 특허 제5,427,908호 및 제5,580,717호; McCafferty 등의 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 및 Griffiths 등의 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호 참조.
본 발명의 인간 단일클론 항체들은 또한 인간 면역 세포가 재구성되어 인간 항체 반응이 면역화시 발생될 수 있는 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 그러한 마우스는, 예를 들어, Wilson 등의 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호에 설명되어 있다.
인간 Ig 마우스의 면역화
인간 Ig 마우스를 사용하여 본 발명의 인간 항체를 키울 때, Lonberg, N. 등 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 및 PCT 공개 번호 제WO 98/24884호 및 제WO 01/14424호에 의하여 설명된 바와 같이, 그러한 마우스를 BTLA 항원 및/또는 재조합 BTLA의 정제되거나 농축된 제조물, 또는 BTLA 융합 단백질로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 마우스는 첫 주입시가 6-16 주령일 것이다, 예를 들어, BTLA 항원의 정제되거나 재조합 제조물 (5-50 ㎍)은 복강내로 인간 Ig 마우스를 면역화시키는데 사용될 수 있다.
BTLA에 대한 인간 단일클론 항체를 충분히 생성하는 상세 과정이 하기 실시예 1에 기술되어 있다. 다양한 항원들과의 축적된 실험에 따르면, 트랜스유전자 마우스는, 리비(Ribi, Sigma M 6536 : MPL + TDM) 내의 항원으로 복강내 (IP)로 처음 면역화시킨 후, 보조제 내의 항원으로 2 주마다 (총 6 번까지) IP 면역화시키면, 반응하는 것으로 나타났다. 그러나, 리비(프로인트의 완전한 및 프로인트의 불완전한 보조제) 이외의 다른 항원 보조제도 효과적이라는 것이 발견되었다. 또한, 보강제 부재시 온전 세포가 높은 면역성이라는 것도 발견되었다. 안화후방 혈액(retroorbital bleed)에 의하여 얻은 혈장 샘플을 이용한 면역화 프로토콜의 과정에 걸쳐서 면역반응을 모니터할 수 있다. 혈장을 ELISA(하기에서 기술되는 바와 같은)로 스크린할 수 있고, 항-BTLA 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 가진 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 비장을 희생 및 제거하기 3일 전에 마우스를 항원으로 정맥내 증폭시킨다. 각 면역화에 대하여 2-3 개 융합이 수행되는 것이 필요한 것으로 예상된다. 일반적으로, 각 항원에 대하여 6 내지 24 마리 마우스를 면역화시킨다. 통상, HCo7 및 HCo12 세포주 둘 다가 사용된다. 또한, HCo7 및 HCo12 트랜스유전자 둘 다를 두 개의 상이한 인간 중쇄 트랜스유전자 (HCo7/HCo12)를 가진 단일 마우스내로 함께 배양할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 실시예 1에 보인 바와 같이, KM 마우스™ 종을 사용할 수 있다.
인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포 및/또는 림프절 세포를 분리하고 적절한 무한증식 세포주, 예를 들어, 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 결과로 생성된 하이브리도마를 항원-특이성 항체들의 생성을 위하여 스크린할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구들의 단일 세포 현탁액을 50% PEG를 사용하여, P3X63-Ag8.653을 분비하지 않는 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)에 융합시킬 수 있다. 세포를 평평한 바닥 마이크로타이터 플레이트에 약 2 x 105으로 도말한 후, 10%의 FBS, 3-5%의 오리겐(Origin, IGEN), OPI 보충제 (Sigma O 5003: 1.1 × 10-3 M의 옥살로 아세트산, 4.5 × 10-4 M의 피루브산나트륨, 및 24 international units/L의 소 인슐린), 4 mM L-글루타민, 0.055 mM의 2-메르캅토에탄올, 50 units/ml의 페니실린, 50 mg/ml의 스트렙토마이신, 및 1X HAT(Sigma H 0262)를 함유하는 선택 배지에 2주일 배양한다. 약 2 주일 후에는, 세포를 HAT가 HT(Sigma H 0137) 로 치환된 배지에서 배양할 수 있다. 그 다음, 개별 웰을 인간 단일클론 IgG 항체들에 대하여 ELISA에 의하여 스크린할 수 있다. 하이브리도마를 분비하는 항체를 재도말하고, 다시 스크린하고 나서, 인간 IgG에 대하여 여전히 양성이면, 하이브리도마를 제한 희석법으로 적어도 두 번 서브클론화할 수 있다. 그 다음 안정된 서브클론들을 시험관 내에서 배양하여 특성화용 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생성할 수 있다.
인간 단일클론 항체들을 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 단일클론 항체 정제용 2 리터 스피너-플라스크에서 키울 수 있다. 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 사용한 친화 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 젤 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피로 점검하여 순도를 확실하게 할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환할 수 있고, 농도를 1.43 흡광계수를 사용하는 OD280으로 결정할 수 있다. 상기 단일클론 항체들을 분주하고 -80℃에 보관할 수 있다.
단일클론 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체들은 또한, 예를 들어, 당해 분야에 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술의 조합과 유전자 형질감염 방법을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다(예, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
예를 들어, 상기 항체 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위해, 일부 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술(예, PCR 증폭 또는 관심의 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝)로써 수득할 수 있고 이러한 DNA들을 발현 벡터들에 삽입하여 그 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결되게 할 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 항체 유전자가 벡터로 결찰되어 벡터내의 전사 및 번역 조절 서열들이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 행하도록 하는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열들은 사용되는 발현 숙주 세포에 사용할 수 있도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터로 삽입될 수 있거나, 더욱 일반적으로는 양쪽 유전자들이 동일한 발현 벡터로 삽입된다. 상기 항체 유전자는 표준 방법으로써 (예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보 제한 위치의 결찰, 또는 제한 위치가 없는 경우 블런트 말단 결찰) 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 항체들의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들은, 이들을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하고 있는 발현 벡터 내로 삽입하여, 상기 벡터 내에서 VH 분절이 CH 분절(들)과 작동적으로 연결되고 벡터내에서 VK 분절이 CL 분절과 작동적으로 연결되게 하여, 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 생성하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포로부터 상기 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 상기 항체 사슬 유전자를 벡터로 클론화하여 신호 펩티드가 인-프레임으로 항체 사슬 유전자의 아미노산 말단에 연결되게 할 수 있다. 상기 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터 유래된 신호 펩티드)일 수 있다.
상기 항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열들을 지닌다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 조절 서열들은, 예를 들어, Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에 설명되어 있다. 조절 서열들의 선택을 포함하는, 발현 벡터의 구성은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요소에 달려있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 이해될 것이다. 포유 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 계도하는 바이러스성 요소, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미언 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스 및 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(major late promoter (AdMLP))를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스성 조절 서열들, 예를 들어, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 조절 요소들은, SV40초기 프로모터로부터 유래된 서열들 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복체를 포함하는 SRα 프로모터 시스템과 같이, 상이한 소스로부터 얻어진 서열들로 구성될 수 있다(Takebe, Y. 등, (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열들에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예, 복제 개시점) 및 선택 마커 유전자와 같은 서열들을 지닐 수 있다. 상기 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, Axel 등의 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 일반적으로, 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용) 및 네오(neo) 유전자(G418 선택용으로)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄를 발현하기 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술로써 숙주 세포로 형질감염시킨다. 용어 "형질감염"의 다양한 유형은 외부 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하는 데 공통적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 내포하는 것으로 의도된다. 비록 본 발명의 항체들을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현하는 것이 이론적으로 가능하다고 할지라도, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유 동물 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 그러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다, 적절히 폴드되고 면역적으로 활성인 항체를 더 잘 모으고 분비할 것 같기 때문이다. 항체 유전자의 원핵성 발현은 활성 항체를 높은 효율로 생산하는 것에 비효율적이라는 것이 보고되었다(Boss, M. A. 및 Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본 발명의 재조합 항체들을 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니스 햄스터 난소(CHO 세포) (Urlaub 및 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 에서 설명된 dhfr- CHO 세포를 포함, R. J. Kaufman 및 P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 에서 설명된 바와 같이, DHFR 선택 마커와 같이 사용), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 같이 사용하기 위해, 다른 바람직한 발현 시스템은 제WO 87/04462호, 제WO 89/01036호 및 유럽 특허 제338,841호에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포로 도입될 때, 숙주 세포에서 항체가 발현하기에, 더 바람직하게는 항체가 숙주세포가 성장되는 배양 배지로 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써, 상기 항체를 생산할 수 있다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다.
항원에 결합하는 항체의 특징 규명
BTLA에 결합하는 것에 대하여 본 발명의 항체들을, 예를 들어, 표준 ELISA에 의하여 테스트할 수 있다. 간단히 말하면, 미세 역가 플레이트(microtiter plates)를 PBS 내 1 ㎍/ml의 정제된 BTLA로 도말하고 나서, PBS/tween 내의 1% 소 혈청 알부민으로 블로킹시킨다. 항체의 희석(예, BTLA-면역 마우스로부터의 혈장 희석액)을 각각의 웰에 첨가하고 주위 온도에서 1-2 시간 동안 배양한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척하고 알칼리성 포스파타아제에 접합된 2차 시약(예, 인간 항체에서, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 다중클론 시약)으로 37℃에서 1 시간동안 배양한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질(1 mg/ml)로 전개시킨 다음, 405-650의 OD로 분석한다. 바람직하게, 최고의 역가를 전개한 마우스가 융합에 사용될 것이다.
상술한 바와 같은 ELISA 분석법을 또한 사용하여 BTLA 면역원과의 양성 반응성을 보여주는 하이브리도마를 스크린할 수 있다. 높은 결합력으로 BTLA에 결합하는 하이브리도마를 서브클론화하고 나아가 특정화한다. 부모 세포의 반응성을 보유하는(ELISA 분석법에 의함), 각 하이브리도마로부터의 하나의 클론을 선택하여 -140℃에서 저장된 5-10 바이얼 세포 은행(vial cell bank)을 만들고, 항체를 정제할 수 있다.
항-BTLA 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 단일클론 항체 정제용 조직 배양 플라스크 또는 스피너-플라스크에서 1-2 L의 부피로 키울수 있다. 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용한 친화 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 젤 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피로 점검하여 순도를 확실하게 할 수 있다. 완충액을 PBS로 치환할 수 있고, 농도를 1.43 흡광계수를 사용하는 OD280으로 결정할 수 있다. 상기 단일클론 항체들을 분주하고 -80℃에 보관할 수 있다.
선택된 항-BTLA 단일클론 항체가 특이한 에피토프에 결합하고 있는지를 판단하기 위하여, 각 항체를 시판되는 시약(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 비오티닐화할 수 있다. 비표지된 단일클론 항체와 비오티닐화된 단일클론 항체를 이용한 경쟁 연구를 전술된 BTLA 코팅-ELISA 플레이트를 이용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화된 mAb 결합을 스트렙-아비딘-알카라인 포스파타제 탐침자(strep-avidin-alkaline phosphatase probe)로 검출할 수 있다. 추가적으로, 유사한 경쟁 연구를 BTLA-CHO 세포 상에서 FACS로 수행할 수 있다. 세포에 대한 비오틴 표지 BTLA 항체의 결합은 스트렙타비딘-피코에리트린 탐침자로 검출할 수 있다.
정제된 항체들의 이소타입을 결정하기 위해, 특정 이소타입의 항체들에 특이적인 시약을 사용하여 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 단일클론 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 1 ㎍/ml의 항-인간 면역글로불린으로 밤새 4℃에서 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 플레이트를 1 ㎍/ml 이하의 테스트 단일클론 항체들 또는 정제된 이소타입 대조군과 주변 온도에서 1 내지 2 시간 반응시킨다. 다음, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이성 알카라인 포스파타제-접합 탐침자와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전개시키고 전술한 바와 같이 분석한다.
FACS 분석법을 사용하여 본 발명의 항체가 세포 상에 발현되는 천연 BTLA에 결합하고 있다는 것을 입증한다. 간단히 말하면, PBS 중 1% BSA에 0.5 % 소듐 아자이드를 더한 것(FACS 버퍼)에서의 항체 희석액을 BTLA를 발현하는 감염된 CHO 세포(105 세포)로 4℃에서 30분동안 배양한다. 세포를 원심분리, 상청액의 흡인, 및 신선한 FACS 버퍼의 첨가에 의하여 두번 세척한다. PE 표지된 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적) 항체에서 4℃에서 30분 동안 세포를 배양하고, 상기와 같이 그 세포를 2번 세척하고, FACS로 분석함으로써, 세포 상에서 BTLA에 대한 항체의 결합을 검출한다.
웨스턴 블랏팅(Western blotting)에 의하여, BTLA 항원과의 반응성에 대하여 항-BTLA 인간 IgG를 더 테스트할 수 있다. 간단히 말하면, BTLA를 준비하고, 여기에 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동을 실시한다. 전기영동 후, 분리된 항원들을 니트로셀룰로오스 막에 옮기고, 10% 태아 소혈청으로 차단하고, 테스트될 단일클론 항체들로 탐침한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알카라인 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 타블렛으로 전개시킬 수 있다(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
항체의 물리적 성질
본 발명의 항체들을 항-BTLA 항체의 다양한 물리적 성질에 의해 더 특징지어질 수 있다. 다양한 분석 방법들을 사용하여 이러한 물리적 성질에 근거하여 항체들의 상이한 부류를 검출 및/또는 구별지을 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체들은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 중 하나에서 하나 이상의 글리코실화 자리를 포함할 수 있다. 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 자리가 존재하는 것은 변경된 항원 결합으로 인하여 항체의 면역원성을 높이거나 항체의 pK를 변경하는 결과를 가져올 수 있다(Marshall 등 (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA 와 Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick 등 (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh 등 (1985) Nature 316:452-7; Mimura 등 (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 포함하는 모티프에서 일어난다고 알려져 있다. 가변 영역 글리코실화는 글로코블랏(Glycoblot) 분석법을 사용하여 테스트할 수 있는 데, 이것은 항체를 절단하여 Fab를 생산한 후, 과요오드산 산화 및 쉬프(Schiff) 염기 형성을 측정하는 분석법을 사용하여 글리코실화를 테스트하는 것이다. 대안적으로, 가변 영역 글리코실화는 다이오넥스 광 크로마토그래피(Dionex-LC)를 사용하여 테스트할 수 있는데, 이것은 Fab으로부터 당류를 단당류로 절단하고 개별적인 당 함유량을 분석하는 것이다. 어떤 경우엔, 가변 영역 글리코실화를 포함하지 않는 항-BTLA 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이것은 당해 분야에 잘 공지된 표준 기술을 사용하여, 가변 영역에서 글리코실화 모티프를 포함하지 않는 항체들을 선택함으로써 또는 글리코실화 모티프 내에 잔기를 돌연변이화함으로써 성취될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체들은 아스파라긴 이성화 자리를 포함하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트 산 효과는 각각 N-G 또는 D-G 서열들에서 일어날 수 있다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트 산 효과는, 주 사슬보다는 측쇄 카르복시 말단의 얽힘 구조(kinked structure)를 생성함으로써 항체의 안정성을 저하시키는, 이소아스파르트 산의 생성을 야기한다. 이소아스파르트 산의 생성을 등량분석법(iso-quant assay)을 사용하여 측정할 수 있는데, 이것은 역상 HPLC를 사용하여 이소아스파르트 산에 대한 테스트를 진행한다.
각 항체는 고유의 등전위점(pI)을 가질 것이나, 일반적으로 항체들은 6과 9.5 사이의 pH 범위안에 거할 것이다. IgG1 항체에 대한 pI는 일반적으로 7-9.5의 pH 범위에 있고, IgG4 항체에 대한 pI는 일반적으로 6-8의 pH 범위에 거한다. 항체들은 이러한 범위 밖에 있는 pI를 가질 수 있다. 비록 상기 효과들이 일반적으로 알려지지 않더라도, 정상적인 범위 밖의 pI를 가진 항체들이 생체 내 조건 하에서 풀림(unfolding) 및 불안정성을 가질 수 있다고 추측된다. 등전위점은 모세관 등전위 초점 분석법(capillary isoelectric focusing assay)을 사용하여 테스트할 수 있는데, 이것은 pH 구배를 만들고 정확성을 높이기 위하여 레이저 포커싱을 사용할 수 있다(Janini 등 (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma 등 (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt 등 (1998) J Chromatogr A 800:355-67). 어떤 경우엔, 정상 범위에 들어가는 pI 값을 포함하는 항-BTLA 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위 내의 pI를 가지는 항체를 선택함으로써, 또는 해당 분야에서 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 하전된 표면 잔기를 변이시킴으로써 성취할 수 있다.
각 항체는 열 안정성을 나타내는 용융점을 가질 수 있다(Krishnamurthy R와 Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 더 높은 열적 안정성은 생체 내에서 더 큰 전체적인 항체 안정성을 나타낸다. 차등 스캐닝 열량계와 같은 기술을 사용하여 항체의 용융점을 측정할 수 있다(Chen 등 (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando 등 (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1은 항체의 초기 풀림의 온도를 나타낸다. TM2는 항체의 완전한 풀림의 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 TM1은 60℃ 이상, 바람직하게는 65℃ 이상, 더욱 바람직하게는 70℃ 이상이다. 대안적으로, 원편광 이색성 분석(circular dichroism)을 사용하여 항체의 열적 안정성을 측정할 수 있다(Murray 등 (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
바람직한 구체예에서, 빠르게 분해되지 않는 항체들을 선택한다. 항-BTLA 항체의 단편화는 당해 분야에 잘 알려진 바와 같은, 모세관 전기영동(CE) 및 MALDI-MS를 이용하여 측정할 수 있다(Alexander AJ 및 Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
다른 바람직한 구체예에서, 최소 결집 효과를 가지는 항체들을 선택한다. 결집은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 바람직하지 않은 약물동력학 성질을 일으킬 수 있다. 일반적으로, 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 15% 이하, 더 더욱 바람직하게는 10% 이하, 및 더욱 더 바람직하게는 5% 이하로 결집하는 항체가 허용된다. 크기-배제 컬럼(SEC) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 및 광 분산을 포함한, 당해 분야에 잘 알려진 몇가지 기술에 의하여 결집을 측정하여 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 확인할 수 있다.
면역접합체
다른 관점에서, 본 발명은 세포독소, 약물 (예, 면역억제제) 또는 방사능독소와 같은 치료적 분체에 접합된, 항-BTLA 항체, 또는 이의 단편을 특징으로 한다. 그러한 접합체를 본 명세서에서 "면역접합제"로 지칭한다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭한다. 세포독소 또는 세포독성 제제는 세포에 해로운(예, 죽임) 임의의 제제를 포함한다. 그 예는 택솔, 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에머틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체나 동족체를 포함한다. 치료제는 또한, 예를 들어, 항대사체(예, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루로우라실 데카르바진), 알킬화제(예, 메크로레타민, 티오테파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티넘 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예, 다우노루비신(이전 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예, 닥티노마이신 (이전 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열 제제(예, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료적 세포독소의 다른 바람직한 예는 듀오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 오리스타틴 및 이의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수할 수 있다(Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
당해 분야에 이용가능한 링커 기술을 사용하여 세포독소를 본 발명의 항체에 접합할 수 있다. 항체에 세포독소를 접합하는데 사용된 링커 유형의 예는, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 이황화물 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 리소좀 구획 내에서 저 pH에 의해 절단되거나, 카텝신(예, 카텝신 B, C, D)과 같이 종양 조직에서 선호적으로 발현되는 프로테아제와 같은 프로테아제에 절단되기 쉬운 링커를 선택할 수 있다.
치료제를 항체에 접합시키는 세포 독소, 링커 및 방법들에 대한 더 상세한 논의를 위하여, Saito, G. 등 (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. 등 (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. 및 Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. 및 Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264를 참조.
본 발명의 항체를 또한 방사능 동소체에 접합시켜 세포독성 방사능약물을 생성할 수 있고, 또한 이를 방사능 면역접합체로 지칭한다. 진단적으로 또는 치료적으로 사용하기 위한 항체들에 접합될 수 있는 방사능 동소체의 예는, 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 류테튬177을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 방사능 면역접합체를 제조하는 방법은 당해 분야에 확립되어 있다. 방사능 면역접합체의 예는 상업적으로 입수할 수 있는, Zevalin™(IDEC Pharmaceuticals) 및 Bexxar™(Corixa Pharmaceuticals)을 포함하며, 유사 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 이용하는 방사능 면역접합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변경할 수 있고, 약물 분체는 전통적인 화학 요법 제제에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 상기 약물 분체는 원하는 생물학적 활성을 지닌 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 단백질들은, 예를 들어, 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 활성 단편, 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어, 종양괴사인자 또는 인터페론-γ; 또는, 생물학적 반응 전환제, 예를 들어, 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
그러한 치료적 분체를 항체들에 접합하는 기술은 알려져 있는데, 예를 들어, Arnon 등, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy" Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 등 (eds.), pp. 243-56, (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 등, "Antibodies For Drug Delivery" Controlled Drug Delivery (제2판), Robinson 등 (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera 등 (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy" Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 등 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe 등, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)을 참조.
이중특이적 분자
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 항-BTLA 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 이중 특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부는, 다른 기능성 분자, 예컨대, 다른 펩티드 또는 단백질(예, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도되거나 연결되어 적어도 두 개 상이한 결합 위치 또는 타겟 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 사실상 하나 이상의 다른 기능성 분자에 유도되거나 연결되어 두 개 이상의 상이한 결합 위치 및/또는 타겟 분자들에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하는데; 그러한 다중특이적 분자들은 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "이중특이적 분자"에 내포되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 만들기 위해, 본 발명의 항체를, 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 의태체와 같은, 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결시키는데(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 연합 또는 기타 등등), 그렇게 하여 이중특이적 분자를 만들어낸다.
따라서, 본 발명은 BTLA에 대한 적어도 하나의 제 1 결합 특이체 및 제 2 타겟 에피토프에 대한 제 2 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제 2 타겟 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 작동자 세포(예, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포(polymorphonuclear cells, PMN)), 및 BTLA를 발현하는 타겟 세포 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자들은 BTLA 발현 세포를 작동자 세포에 타겟시키고 Fc 수용체-매개 작동자 세포 활성, 예를 들어, BTLA 발현 세포의 대식작용, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 사이토카인 분비, 또는 슈퍼옥사이드 음이온의 발생을 개시한다.
이중특이적 분자가 다중특이성인 본 발명의 일 구체예에서, 상기 분자는 항-Fc 결합 특이체 및 항-BTLA 결합 특이체에 더하여 제 3 결합 특이체를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제 3 결합 특이체는 항-증진 인자 (EF) 부분, 예를 들어, 세포독성 활성에 수반된 표면 단백질에 결합하여 타겟 세포에 대하여 면역 반응을 증가시키는 분자이다. 상기 "항-증진 인자 부분"은 주어진 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체에 결합하는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있고, 따라서 Fc 수용체 또는 타겟 세포 항원에 대한 결합 결정자의 작용을 향상시키는 결과를 낳는다. 상기 "항-증진 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 타겟 세포 항원과 결합할 수 있다. 대안적으로, 상기 항-증진 인자 부분은 제 1 및 제 2 결합 특이체들이 결합하는 독립체와는 다른 독립체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포와 결합할 수 있다 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는, 타겟 세포에 대하여 면역 반응을 증진시키는 결과를 가져오는 다른 면역 세포를 통해서).
한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서, 적어도 하나의 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함하고, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv를 포함한다. 상기 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편일 수 있는데, 예를 들어 Fv 또는 단일 사슬 작제물일 수 있고, 이는 Ladner 등의 미국 특허 제 4,946,778 호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 참조문헌으로서 명백히 본 명세서에 병합된다.
한 구체예에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이체가 단일클론 항체에 의해 제공되며, 이의 결합은 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "IgG 수용체"는 염색체 1 상에 위치한 8 개 γ-사슬 유전자들 중의 임의의 것을 지칭한다. 이러한 유전자들은 총 12 개의 트랜스멤브레인 또는 용해성 수용체 이소유형을 암호화하고 있고 이들은 세 가지 Fcγ수용체 군으로 나뉜다: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), 및 FcγRIII(CD16). 바람직한 일 구체예에서, Fcγ수용체는 인간 고친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 72 kDa 분자이고, 단량체성 IgG에 대하여 높은 친화도를 나타낸다(108 - 109 M-1).
소정의 바람직한 항-Fcγ단일클론 항체들의 생산 및 특성화는 Fanger 등의 PCT 공개번호 제WO 88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기술되어 있고, 이의 교시는 본 명세서에 참조문헌으로서 완전히 병합된다. 이러한 항체들은 수용체의 Fcγ의 결합 위치와 구별되는 위치에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하고, 따라서, 그 결합은 IgG의 생리학적 수준에 의해서 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이성 항-FcγRI 항체들은 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32 를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), ATCC 기탁번호 HB9469로부터 입수가능하다. 다른 구체예에서, 상기 항-Fcγ수용체 항체는 단일클론 항체 22의 인간화 형태이다 (H22). H22 항체의 생산과 특성화는 Graziano, R. F. 등 (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002 및 PCT 공개번호 제WO 94/10332호에 기술되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 HA022CL1의 지정하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었고 기탁번호 CRL 11177을 가진다.
또한 다른 바람직한 구체예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성이 인간 IgA 수용체, 예를 들어, Fc-알파 수용체(FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되며, 이의 결합은 바람직하게는 인간 면역글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 "IgA 수용체"는 염색체 19 상에 위치한 하나의 α-유전자(FcαRI)의 유전자 산물을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 유전자는 55 내지 110 kDa의 수 개의 교호적으로 스플라이스된 트랜스멤브레인 이소형태를 암호화하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립세포 상에 구조적으로 발현되나, 비작동자(non-effector) 세포군 상에서는 아니다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2둘 다에 대하여 중간정도의 친화도(
Figure 112009032869663-PCT00001
5 × 107 M-1)를 가지며, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인류에 노출시 증가된다(Morton, H. C. 등 (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). A3, A59, A62 및 A77로서 동정된, IgA 리간드 결합 도메인 외부의 FcαRI과 결합하는, 4 개 FcαRI-특이성 단일클론 항체가 설명된다(Monteiro, R. C. 등 (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcαRI 및 FcγRI는 본 발명의 이중특이적 분자에 사용하기에 바람직한 개시 수용체인데, 이는 이들이 (1) 면역 작동자 세포, 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포 상에서 일차적으로 발현되고; (2) 높은 수준(예, 세포당 5,000-100,000)으로 발현되며; (3) 세포독성 활성의 매개자이고(예, ADCC, 대식작용); (4) 이들에 타겟된, 자체-항원을 포함한, 항원의 향상된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
인간 단일클론 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 쥐, 키메릭 및 인간화 단일클론 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 구성적 결합 특이체, 예를 들어, 항-FcR 및 항-BTLA 결합 특이체들을 접합함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체는 분리적으로 생성되고 이후에 서로 접합될 수 있다. 상기 결합 특이체들이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 교차결합 제제가 공유결합성 접합에 사용될 수 있다. 교차결합 제제의 예는 단백질 A, 카보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-SMCC)를 포함한다(예, Karpovsky 등 (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 참조). 다른 방법들은 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan 등 (1985) Science 229:81-83), 및 Glennie 등 (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375에 기재된 것들을 포함한다). 바람직한 접합 제제는 SATA 및 sulfo-SMCC이고, 둘 다 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)에서 입수할 수 있다.
결합 특이체들이 항체인 경우, 이들은 두 개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설피드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 접합 전에, 힌지 영역은 변형되어 홀수의 설피드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 포함한다.
대안적으로, 양 쪽 결합 특이체들이 동일 벡터에서 암호화되어 있고, 동일한 숙주 세포에서 발현되고 회합될 수 있다. 이러한 방법은 상기 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 사슬 항체와 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 두 개 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 두 개 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,260,203호; 미국 특허 번호 제5,455,030호; 미국 특허 번호 제4,881,175호; 미국 특허 번호 제5,132,405호; 미국 특허 번호 제5,091,513호; 미국 특허 번호 제5,476,786호; 미국 특허 번호 제5,013,653호; 미국 특허 번호 제5,258,498호; 및 미국 특허 번호 제5,482,858호에 설명되어 있다.
이중특이적 분자가 그의 특이적 타겟에 결합하는 것은, 예를 들어, 효소연관 면역흡착법(ELISA), 방사능면역분석(RIA), FACS 분석, 생체분석(예, 성장 억제), 또는 웨스턴 블랏 분석법으로 확인될 수 있다. 이러한 분석법의 각각은 일반적으로, 관심의 복합체에 특이성인 표지된 시약(예, 항체)을 사용함으로써, 특정 관심의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 항체-FcR 복합체를 인식하고 특이적으로 결합하는, 예컨대 효소-연계 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 대안으로, 상기 복합체는 다양한 다른 면역분석법 중 임의의 것을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 방사능으로 표지되고 방사능면역분석 (RIA)에서 사용될 수 있다(예를 들어, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조, 이는 본 명세서에 참조문헌으로 병합됨). 방사능 동위원소는 γ계수기 또는 신틸레이션 카운터와 같은 수단을 사용하여 또는 자가방사기록법(autoradiography)으로 검출될 수 있다.
약제학적 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어, 본 발명의 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부(들) 중 하나 또는 조합물을 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 배합된 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물들은 본 발명의 (예를 들어, 두 개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이성 분자의 하나 또는 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 타겟 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 또는 상보적 활성을 가지는 항체(또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 조합 요법, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 다른 항-염증성 또는 면역억제제와 조합된 본 발명의 항-BTLA 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예들은 본 발명의 항체의 용도에 대한 부분에서 더 자세히 후술한다.
본 명세서에서 사용되는, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 양립할 수 있는, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항박테리아성 및 항균성 제제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구적, 척추 또는 표피 투여(예, 주사 또는 주입으로)에 적합하다. 투여 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉, 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시키는 다른 자연적 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
본 발명의 약제학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 염"은 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 임의의 바람직하지 않은 독소학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예, Berge, S. M. 등 (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조). 그러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 비독성 무기산으로부터 유도된 것은 물론, 지방족 모노- 및 디카르복실 산, 페닐-치환된 알카노 산, 하이드록시 알카노 산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰 산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다. 염기 부가 염은, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알카리 토금속으로부터 유도된 것은 물론 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민류로부터 유도된 것을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 항산화제의 예는: (1) 아스코르브 산, 시스테인 염산염, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트, 소듐 설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코빌 팔미테이트, 부틸레이티드 하이드록시아니솔(BHA), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; 및 (3) 시트르 산, 에틸렌디아민 테트라아세트 산(EDTA), 소르비톨, 타르타르 산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트화제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올류(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은) 및 이의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르류를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 전술한 살균 공정 및, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브 산 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균성 제제 주입으로 확립할 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제제를 조성물에 포함하는 것이 또한 바람직하다. 이에 더하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함하여 주사 약제학제형의 흡수를 연장할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용액이나 분산액의 임시 제조물용 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질용으로 그러한 매체 및 제제를 사용하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매체 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 본 발명의 약제학적 조성물에 이를 사용하는 것이 포함된다. 보조적인 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료적 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 환경하에서 반드시 멸균적이고 안정적이어야 한다. 상기 조성물을 용액, 미소유화액, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 규칙적인 구조로서 배합할 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 포함하는 용매나 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장제제, 예를 들어, 당, 폴리알코올류, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어 모노스테아레이트염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 포함시킴으로써 주사 약학제형의 흡수를 연장할 수 있다.
멸균된 주사가능한 용액은, 활성 화합물을 적절한 용매에 요구되는 양으로, 필요한 경우, 상기 설명된 성분 중 하나 또는 조합물과 같이 배합하고, 멸균 마이크로정제하여 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은 상기 활성 화합물을, 염기성 분산매 및 상기 설명된 것의 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 용액(vehicle)에 배합하여 제조된다. 멸균된 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조(lyophilization)이고 이는 활성 성분에 더하여 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 산출한다.
담체 물질과 조합하여 단일 투약 형태를 생성하는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 투여의 특정 방식에 따라 변할 것이다. 단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중에, 이러한 양은 활성 성분의 약 0.01 % 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 더 바람직하게는 활성 성분의 약 1% 내지 약 30%가 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되어 있다.
투약 섭생은 최적의 원하는 반응(예, 치료 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있고, 수 개 분리된 투약물이 여러 번 투여될 수 있고 또는 투여량은 치료 상태의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이, 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 투여의 일관성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 배합하는 것이 특히 유리하다. 투약 단위 형태는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 치료될 대상체에 단일성 투약물로서 적절한 물리적으로 분리된 단위체를 지칭하고, 각 단위체는 요구되는 약제학적 담체와 연합하여 바람직한 치료 효과를 생성하는 데 계산된 활성 화합물의 소정의 양을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 고유의 특성 및 이루어지는 특정 치료효과, 및 (b) 개인에게서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 조제하는 당해 분야에 고유한 제한에 의해 지시되고 및 직접적으로 의존한다.
항체의 투여의 경우, 투여량은 숙주 체중 kg 당 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중이거나 1-10 mg/kg의 범위에 있다. 예증적인 치료 섭생은 일 주에 한번, 이 주에 한번, 삼 주에 한번, 사 주에 한번, 한 달에 한 번, 세 달에 한번, 또는 삼 내지 육 개월에 한 번 투여일 수 있다. 본 발명의 항-BTLA 항체에 대한 바람직한 투여 섭생은 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중 정맥 내 투여를 포함하고, 상기 항체는 하기 투여 스케줄 중 하나를 이용한다: (i) 4 주마다 6 번 투여 후, 3 달 마다 투여; (ii) 3 주 마다; (iii) 3 mg/kg 체중 한 번 투여 후, 매 3 주 마다 1 mg/kg 체중 투여.
어떤 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가지는 두 개 이상의 단일클론 항체를 동시에 투여하며, 이 경우, 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위에 속한다. 항체는 통상적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여 간의 간격은, 예를 들어, 주간, 월간, 삼개월 또는 연간일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 타겟 항원에 대한 항체의 혈중 농도를 측정하여 지시되는 바에 따라, 불규칙할 수 있다. 어떤 방법에서, 투여량은 약 1-1000 ㎍/ml의 혈장 항체 농도, 및 특정의 방법에서는 약 25-300 ㎍ /ml의 농도를 얻도록 조절한다.
대안적으로, 항체는 지속 방출(sustained release) 배합물로서 투여될 수 있고, 이 경우, 투여 횟수가 줄어든다. 투여량 및 횟수는 환자에서 항체의 반감기에 의존하여 변한다. 일반적으로, 인간 항체들은 가장 긴 반감기를 보이며, 인간화된 항체들, 키메릭 항체들, 및 비인간 항체들이 그 뒤를 따른다. 투여량 및 투여 횟수는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 변할 수 있다. 예방적 적용에서는, 상대적으로 적은 투여량이 긴 시간에 걸쳐서 상대적으로 적은 횟수로 투여된다. 특정 환자는 그들 수명의 남은 기간 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 및 바람직하게, 환자가 질병의 증상의 부분적으로 또는 완전한 개선을 보일 때까지 상대적으로 잦은 횟수로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방적 섭생 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은, 특정 환자에 대하여, 환자에게 독성이 없이, 바람직한 치료 반응을 얻는 데 효과적인 활성성분의 양, 조성, 및 투여 방식을 얻도록, 변화시킬 수 있다. 선택된 투약 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염이나 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강과 이전 의료 기록, 및 의료 분야에 공지된 다른 요인들을 포함하는 다양한 약물동력학 요인들에 의존할 것이다.
본 발명의 항-BTLA 항체의 "치료적으로 유효한 투여량"은 바람직하게는 질병 증상의 중증도를 감소시키고, 무증상질병 기간의 빈도 및 기간을 증가시키고, 또는 질병 고통으로 인한 장애나 불능을 방지하는 결과를 가져온다. 예를 들어, 종양의 치료의 경우, "치료적으로 유효한 투여량"은 미치료 대상체에 비하여, 세포 성장 또는 종양 성장을 바람직하게는 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 더더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 만큼 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예시하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 이러한 조성물의 성질은 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있고, 그러한 억제는, 숙련된 실험자에 공지된 분석 방법으로 시험관 내에서 측정될 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 다르게는 증상을 개선시킨다. 당해 분야의 통상적인 숙련자는 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도, 및 선택된 투여의 특정 조성물이나 경로와 같은 요인에 근거하여 그러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여할 수 있다. 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 의존하여 변할 것이다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로는, 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 어구 "비경구 투여"는 장 및 국소 투여외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피부내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내, 경막외(epidural) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 국소, 표피 또는 점막 투여경로와 같은, 비경구가 아닌 경로, 예를 들어, 비강내, 경구적으로, 질내로, 직장내로, 설하내로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 조절된 분비 배합물과 같이, 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 빠른 분비에 대하여 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드류, 폴리글리콜 산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르류, 및 폴리락트 산과 같은, 생체분해성, 생체양립성 중합체를 사용할 수 있다. 그러한 배합물을 제조하기 위한 많은 방법은 특허되어 있거나 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참조.
치료 조성물은 당해 분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 미국 특허 번호 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 공지된 장치와 같이, 바늘없는 피하 주사 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유효한 공지된 이식물 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 미국 특허 번호 제4,487,603호, 조절된 속도로 약물을 분배하는, 이식될 수 있는 마이크로-주입 펌프를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,486,194호, 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 장치를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,447,233호, 정밀한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,447,224호, 연속적인 약물 전달용, 가변성 흐름 이식성 주입 장치를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,439,196호, 다중-챔버 구획을 가지는 삼투압성 약물 전달 시스템을 보여줌; 및 미국 특허 번호 제4,475,196호, 삼투압성 약물 전달 시스템을 보여줌. 이러한 특허들은 본 명세서에서 참조문헌으로 기입된다. 많은 다른 그러한 이식물, 전달 시스템, 및 모듈은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
소정 구체예에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체들을 배합하여 생체 내에서 적절히 분포하게 할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)은 많은 고도의 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 가로지르는 것을 확실하게 하기 위해(필요시), 상기 화합물은, 예를 들어, 리포좀 내에 배합될 수 있다. 리포좀 제조 방법에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조. 리포좀들은 선택적으로 특정 세포 또는 기관으로 운반되는 하나 이상의 분체를 포함하며, 따라서 타겟된 약물 전달을 향상시킬 수 있다(예컨대, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685 참조). 타겟 분체들의 예는 폴레이트 또는 비오틴(예컨대, Low 등의 미국 특허 번호 제 5,416,016호 참조); 만노시드(Umezawa 등, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman 등 (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais 등 (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe 등 (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273 참조)을 포함한다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 수 많은 시험관내 및 생체내 유용성을 가지는데, 예를 들어, BTLA의 검출 또는 BTLA의 차단에 의한 면역 반응의 증강을 포함한다. 어떤 구체예에서, 항체는 BTLA에 결합함으로써 면역 반응을 억제한다. 이 구체예에서 항체는 작용제로서 기능한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, 이러한 분자들을, 시험관내에서 또는 생체외에서, 배양중인 세포에, 또는 예컨대, 생체내에서, 인간 대상체에 투여하여 다양한 상황에서 면역성을 증강시킬 수 있다. 따라서, 일 관점에서, 본 발명은 대상체에 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 투여하는 것을 포함하여 대상체 내에서의 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하여 대상체 내에서의 면역 반응을 조절한다. 바람직하게, 반응을 증강시키거나, 자극하거나, 상-조정시킨다(up-regulated).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 비-인간 동물은 모든 척추동물들, 예를 들어, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류와 같은 포유 동물 및 비-포유동물을 포함하지만, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유 동물이 바람직하다. 바람직한 대상체는 면역 반응을 증진시킬 필요가 있는 인간 환자를 포함한다. 상기 방법은 T-세포 매개 면역 반응을 증대시킴으로써 치료될 수 있는 질환을 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적절하다. 특정한 구체예에서, 본 방법은 생체내에서 암 세포의 치료에 특히 적절하다. 면역의 항원-특이적 증강을 성취하기 위하여, 항-BTLA 항체를 관심의 항원과 함께 투여할 수 있다. BTLA에 대한 항체를 다른 제제와 함께 투여할 때, 이 둘을 순서대로 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 발명은 시료 내에서의 인간 BTLA 항원의 존재를 검출하거나, 인간 BTLA 항원의 양을 측정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 항체 또는 이의 항원 결합부 및 인간 BTLA와의 사이에서 복합체의 형성이 가능한 조건 하에서, 상기 시료 및 대조군 시료를 인간 BTLA에 특이적으로 결합하는, 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부에 접촉시키는 것을 포함한다. 그 다음, 복합체의 형성을 검출하는데, 여기서, 시료와 비교되는 대조군 시료 사이의 복합체 형성 차이는 시료내에서 인간 BTLA 항원의 존재를 나타낸다.
CD28, ICOS 및 CTLA-4에 비해, BTLA에 대한 본 발명의 항체의 특이적 결합이 주어진다면, 본 발명의 항체를 사용하여 세포의 표면 상에서 BTLA 발현을 특이적으로 검출할 수 있고, 또한 면역친화 정제를 통하여 BTLA를 정제할 수 있다.
암
항체에 의한 BTLA의 차단은 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다. BTLA의 리간드인, HVEM은 TNFR 종 멤버이고 T, B, NK, 수지상 및 골수성 세포를 포함하는 림프구성 세포에서 체세포 조직을 유도할 수 있다(Murphy 등, Nat. Reviews Immunology, 6, 671-681, 2006). HVEM/BTLA 상호작용에 의해 유도된 면역 억제는 BTLA의 국부적 상호작용을 저해함으로써 HVEM으로 전환될 수 있다 (Watanabe 등, Nat. Immunol., 4, 670-679, 2003; Otsuki 등, BBRC 344, 1121-1127, 2006). 일 관점에서, 본 발명은 항-BTLA 항체를 이용하여 생체 내에서 대상체를 치료하여 암성 종양의 성장을 저해하는 것에 관한 것이다. 항-BTLA 항체를 단독으로 사용하여 암성 종양의 성장을 저해할 수 있다. 대안적으로, 항-BTLA 항체를, 하기에 기술된 바와 같이, 다른 면역성 제제, 표준 암 치료체, 또는 다른 항체와 결합하여 사용할 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 대상체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는데, 이것은 대상체에 치료상 유효한 양의 항-BTLA 항체 또는 이의 항원 결합부를 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게 항체는 인간 항-BTLA 항체(예를 들어 본 명세서에서 기술되는 임의의 인간 항-인간 BTLA 항체와 같은)이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메릭 또는 인간화 항-BTLA 항체이다.
본 발명의 항체의 사용에 의하여 성장이 억제될 수 있는 바람직한 암들은 면역치료에 전형적으로 반응하는 암들을 포함한다. 치료를 위한 바람직한 암의 비-제한적 예들은 흑색종(예, 전이성 악성 흑색종), 신장암, 전립선암, 유방암, 결장암 및 폐암을 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예들은 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구 내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 여성 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아의 고형암, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관의 암, 신우의 암종, 중추신경계(CNS)의 신생물 형성증, 1차 중추신경계 림프종, 종양 혈관신생, 척수 축 종양, 뇌간교세포종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피암, 편평상피세포암, T-세포 림프종, 석면에 의하여 유발된 것을 포함하여 환경적으로 유발된 암, 및 상기 암들의 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 전이성 암의 치료에 유용하다.
선택적으로, BTLA에 대한 항체를 암성 세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자를 포함), 세포, 및 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자로 감염된 세포(He 등 (2004) J. Immunol. 173:4919-28)와 같은, 면역성 제제와 조합할 수 있다. 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적 예들은 gp100의 펩티드, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제, 또는 감염되어 사이토카인 GM-CSF를 발현하는 종양 세포와 같은, 흑색종 항원의 펩티드를 포함한다(하기에 기술됨).
인간에 있어서, 어떤 종양은 흑색종과 같이 면역성을 가지는 것으로 보여진다. BTLA 차단에 의한 T 세포 활성의 역(threshold)을 높임으로써, 숙주에서 종양 반응을 활성화시킬 것으로 기대할 수 있다.
BTLA 차단은 백신 프로토콜과 조합할 때 가장 효과적일 수 있다. 종양에 대항하는 백신에 대한 많은 실험 전략이 고안되어 왔다(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738 참조; 또한 Restifo, N. 및 Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita, V. 등 (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. 제5판을 참조). 이러한 전략들 중 하나에서, 자가성 또는 알러지성 종양 세포를 이용하여 백신을 제조한다. 이러한 세포 백신은 종양 세포가 감염되어 GM-CSF를 발현할 때 가장 효과적이라고 보여지고 있다. GM-CSF는 종양 백신을 위한 항원 제시의 강력한 활성제라고 보여진다(Dranoff 등 (1993) Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A. 90: 3539-43).
다양한 종양에서 유전자 발현 및 대규모 유전자 발현 패턴의 연구는 소위 종양 특이적 항원을 정의하게 되었다(Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7). 많은 경우에, 이러한 종양 특이적 항원은, 종양에서 및 종양이 발생하는 세포에서 발현되는 분화 항원(differentiation antigens), 예를 들어, 멜라닌세포 항원 gp100, MAGE 항원, 및 Trp-2이다, 더 중요하게, 많은 이러한 항원은 숙주에서 발견되는 종양 특이적 T 세포의 타겟이 될 수 있다고 보여진다. BTLA 차단은 이러한 단백질에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여 종양에서 발현되는 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 집합과 결합하여 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 보통 자가 항원으로서 면역계에 의하여 정상적으로 보여지고 따라서 그것들에 대하여 내성을 가진다. 종양 항원은 또한 단백질 텔로머라제를 포함하는데, 이것은 염색체의 텔로머라제의 합성에 필요하고 85% 이상의 인간 암 및 제한된 수의 체세포 조직에서 발현된다(Kim, N 등 (1994) Science 266: 2011-2013). (이러한 체세포 조직은 다양한 수단에 의하여 면역 공격으로부터 보호될 수 있음). 종양 항원은, 또한, 관련없는 서열 사이에서 단백질 서열을 변경하거나 융합 단백질을 만들어내는 체세포 돌연변이(즉, 필라델피아 염색체 내의 bcr-abl), 또는 B 세포 종양으로부터의 유전자형 때문에, 암 세포내에서 발현되는 "네오-항원"일 수 있다.
다른 종양 백신은 인유두종 바이러스(Human Papilloma Virus, HPV), 간염 바이러스(Hepatitis Virus, HBV 및 HCV) 및 카포시 헤르페스 육종 바이러스(Kaposi's Herpes Sarcoma Virus, KHSV)와 같은 인간 암과 관련된 바이러스로부터의 단백질을 포함할 수 있다. BTLA 차단과 결합하여 사용될 수 있는 종양 특이적 항원의 또 다른 형태는 종양 조직 자체에서 분리된 정제된 열 충격 단백질(heat shock protein, HSP)이다. 이러한 열 충격 단백질은 종양 세포로부터의 단백질 단편을 포함하며 이러한 HSP들은 종양 면역을 이끌어 내는데 있어서 항원 제시 세포로의 전달에 매우 효율적이다(Suot, R 및 Srivastava, P (1995) Science 269:1585-1588; Tamura, Y. 등 (1997) Science 278:117-120).
수지상 세포(DC)는 1차 항원-특이적 반응에 유용할 수 있는 강력한 항원 제시 세포이다. DC는 생체 외에서 생산되고 종양 세포 추출물뿐만 아니라 다양한 단백질 및 펩티드 항원과 함께 적재될 수 있다(Nestle, F. 등 (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC는 또한 마찬가지로 유전자 수단에 의해 도입되어 이러한 종양 항원들을 발현시킨다. 또한 DC는 면역의 목적을 위하여 종양 세포에 직접 융합될 수 있다(Kugler, A. 등 (2000) Nature Medicine 6:332-336). 백신 접종의 방법으로서, DC 면역은 효과적으로 BTLA 차단과 조합하여 더 강력한 항-종양 반응을 활성화시킬 수 있다.
또한 BTLA 차단은 표준 암 치료와 조합할 수 있다. BTLA 차단은 화학요법과 효과적으로 조합할 수 있다. 이러한 경우에, 투여되는 화학요법적 시약의 양을 줄이는 것이 가능할 것이다(Mokyr, M. 등 (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 그러한 조합의 예는 흑색종의 치료를 위하여 데카르바진(decarbazine)과 조합한 항-BTLA 항체이다. 그러한 조합의 다른 예는 흑색종의 치료를 위하여 인터루킨-2(IL-2)와 조합한 항-BTLA 항체이다. BTLA 차단 및 화학요법의 조합된 사용의 이면에 대한 과학적 근거는, 대부분의 화학요법 화합물의 세포독성 작용의 결과인, 세포 사멸이 항원 제시 경로에서 종양 항원의 레벨을 증가시킨다는 것이다. 세포 사멸을 통하여 BTLA 차단과 상승작용을 일으킬 수 있는 다른 조합적 요법은 방사선, 수술, 및 호르몬 차단이다. 이러한 프로토콜 각각은 숙주에서 종양 항원의 소스를 생성한다. 혈관신생 저해제는 또한 BTLA 차단과 조합할 수 있다. 혈관신생(angiogenesis)의 억제는 종양 항원을 숙주 항원 제시 경로로 투입할 수 있어서 종양 세포 사멸을 이끈다.
또한, BTLA 차단 항체는, Fc알파 또는 Fc 감마 수용체-발현 작동자 세포를 종양 세포로 타겟하는 이중특이적 항체와 조합하여, 사용될 수 있다(예, 미국 특허 번호 제5,922,845호 및 제5,837,243호 참조). 이중특이적 항체는 별도의 두 항원을 타겟하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc 수용체/항 종양 항원(예, Her-2/neu) 이중특이적 항체는 대식세포를 종양의 자리로 타겟하는데 사용되고 있다. 이러한 타겟팅은 종양 특이적 반응을 더 효과적으로 활성화시킬 수 있다. 이러한 반응들의 T 세포 암(arm)은 BTLA 차단의 사용에 의하여 증진될 수 있다. 대안적으로, 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 이중특이적 항체를 사용함으로써, 항원을 DC에 직접적으로 전달할 수 있다.
종양은 매우 다양한 메커니즘에 의하여 숙주 면역 감시를 피한다. 이러한 메커니즘의 많은 것들은 종양에 의하여 발현되고 면역억제성이 있는 단백질을 불활성화시킴으로써 극복될 수 있다. 이러한 것들은 특히 TGF-베타(Kehrl, J. 등 (1986) J. Exp . Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. 및 O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드(Hahne, M. 등 (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 이러한 물질들 각각에 대한 항체를 항-BTLA와 조합하여 사용하여 면역억제제의 효과를 중화시킬 수 있고 숙주에 의한 종양 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화하는데 사용될 수 있는 다른 항체는 항-BTLA와 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 것은 DC 기능 및 항원 제시를 활성화하는 수지상 세포의 표면 상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성을 효과적으로 대신할 수 있고(Ridge, J. 등 (1998) Nature 393: 474-478), BTLA 항체와 접합하여 사용될 수 있다(Ito, N. 등 (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). CTLA-4 (예, 미국 특허 번호 제5,811,097호), OX-40 (Weinberg, A. 등 (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I. 등 (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), 및 ICOS (Hutloff, A. 등 (1999) Nature 397: 262-266)와 같은 T 세포 공통자극 분자들에 대한 항체를 활성화시켜 T 세포 활성화의 레벨을 증가시킬 수 있다.
골수 이식은 다양한 조혈 기원의 종양을 치료하는데 현재 이용되고 있다. 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease)이 이 치료의 결과인 반면에, 치료 이익은 이식편 대 종양 반응에서 얻을 수 있다. BTLA 차단을 이용하여 도너 이식 종양 특이적 T 세포의 효용성을 증가시킬 수 있다.
또한 종양에 대항하는 항원-특이적 T 세포를 활성화시키기 위하여 항원 특이적 T 세포의 생체 외 활성화 및 팽창과, 이러한 세포의 수용자에게로의 입양 전달을 포함하는 몇가지 실험적 치료 프로토콜이 있다(Greenberg, R. 및 Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51). 또한 이러한 방법들을 사용하여 CMV와 같은 감염성 제제에 대한 T 세포 반응을 활성화시킬 수 있다. 항-BTLA 항체의 존재하에 생체 외 활성화는 입양적으로 전달된 T 세포의 빈도수와 활성을 증가시킬 것으로 기대할 수 있다.
감염성 질환
본 발명의 또 다른 방법은 특정 독소 또는 병원체에 노출되어 왔던 환자를 치료하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 대상체에 항-BTLA 항체 또는 이의 항원 결합부를 투여하여 감염성 질환에 대하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는 대상체 내의 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 항체는 인간 항-인간 BTLA 항체(본 명세서에 기술된 임의의 인간 항-BTLA 항체와 같은)이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메릭 또는 인간화 항체일 수 있다.
상술한 바와 같은 종양에의 적용에 유사하게, 항체 매개 BTLA 차단은, 단독으로, 또는 보조제로서, 백신과 조합하여 사용하여, 병원체, 독소, 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 이러한 치료 접근이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예들은 일반적으로 효과적인 백신이 없는 병원체, 또는 전통적인 백신이 완전하게 효과적이지 않는 병원체를 포함한다. 이러한 것들은 HIV, 간염(B형 및 C형), 인플루엔자, 헤르페스, 지아르디아, 말라리아, 리슈마니아, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 아에루기노사를 포함하나 이에 제한되지 않는다. BTLA 차단은 감염의 과정 동안에 변경된 항원이 존재하는 HIV와 같은 제제에 의하여 만성화된 감염에 대하여 특히 유용하다. 이러한 신규한 에피토프는 항-인간 BTLA 투여시 이물질로서 인식되어 BTLA를 통하여 음성 신호에 의하여 약해지지 않는 강력한 T 세포 반응을 야기한다.
본 발명의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원체 바이러스의 몇가지 예들은 HIV, 간염(B형 또는 C형), 헤르페스 바이러스(예, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스테인바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스(flaviviruses), 에코바이러스(echovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 콕사키 바이러스(coxsackie virus), 코르노바이러스(cornovirus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 로타바이러스(rotavirus), 홍역 바이러스, 풍진 바이러스(rubella virus), 파보 바이러스(parvovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스(dengue virus), 유두종 바이러스(papillomavirus), 연속종 바이러스(molluscum virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 광견병 바이러스(rabies virus), JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus)를 포함한다.
본 발명의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원체 박테리아의 몇가지 예들은 클라미디아(Chlamydia), 리케챠 박테리아(rickettsial bacteria), 마이코박테리아(mycobacteria), 포도상구균(staphylococci), 연쇄상구균(streptococci), 뉴모노코커스(pneumonococci), 수막염균(meningococci) 및 코노코커스(conococci), 클렙시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(legionella), 디프테리아(diphtheria), 살모넬라(salmonella), 간균(bacilli), 콜레라(cholera), 티타누스(tetanus), 보툴리누스 중독(botulism), 탄저(anthrax), 페스트(plague), 렙토스피라병(leptospirosis), 및 라임병 박테리아(Lymes disease bacteria)를 포함한다.
본 발명의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원체 균류의 몇가지 예들은 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis), 등등), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼질러스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 나이저(niger), 등등), 무코랄레스 속(Mucorales)(무코(mucor), 앱시디아(absidia), 리조퍼스(rhizophus)), 스포로트릭스 센키(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코사이디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코사이디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본 발명의 방법에 의하여 치료될 수 있는 감염을 일으키는 병원체 기생체의 몇가지 예들은 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 밸런티디움 콜라이(Balantidium coli), 나에글레리아파울러리(Naegleriafowleri), 아칸트아메바 종(Acanthamoeba sp.), 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리듐 종(Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라스모듐 비백스(Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi), 및 니포스트롱길러스 브라시리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
상기 방법들 모두에서, BTLA 차단은 사이토카인 치료(예, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2), 또는 종양 항원의 강화된 제시를 제공하는 이중특이적 항체 치료와 같은 다른 형태의 면역 치료와 조합될 수 있다(예컨대, Holliger (1993) Proc . Natl. Acad . Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123 참조).
자가면역 반응
항-BTLA 항체는 자가면역 반응을 일으키거나 증폭시킬 수 있다. 실제로, 종양 세포 및 펩티드 백신을 이용한 항-종양 반응의 유도는 많은 항-종양 반응이 항-자기 반응성을 포함한다는 것을 나타낸다(위의 van Elsas 등의 항-CTLA-4 + GM-CSF-변이 B16 흑색종에서 관찰되는 탈색소; Trp-2 백신화 마우스에서의 탈색소(Overwijk, W. 등 (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 96: 2982-2987); TRAMP 종양 세포 백신에 의하여 일어난 자가면역 전립선염(위의 Hurwitz, A. (2000)), 인간 임상 치료에서 관찰되는 흑색종 펩티드 항원 백신접종 및 백반(Rosenberg, SA와 White, DE (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4).
따라서, 백신접종 프로토콜을 고안하여 질병 치료를 위한 이러한 자기 단백질에 대항하는 면역 반응을 효율적으로 발생시키기 위하여 다양한 자기 단백질과 조합하여 항-BTLA 차단을 이용하는 것을 고려할 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머 질환은 뇌에서의 아밀로이드 침적물 내의 Aβ 펩티드의 비적절한 축적을 포함하는데; 아밀로이드에 대항하는 항체 반응이 이러한 아밀로이드 침적물을 제거할 수 있다(Schenk 등, (1999) Nature 400: 173-177).
또한 기타 자기 단백질을 알러지와 천식의 치료를 위한 IgE, 및 류마티스 관절염을 위한 TNFα와 같은 타겟으로서 사용할 수 있다. 마지막으로, 항-BTLA 항체의 사용에 의하여 다양한 호르몬에 대한 항체 반응을 유도할 수 있다. 생식 호르몬에 대한 항체 반응을 중화시키는 것이 피임을 위하여 이용될 수 있다. 특정한 종양의 성장에 필요한 호르몬 및 다른 용해성 인자에 대한 항체 반응을 중화시키는 것을 가능한 백신접종 타겟으로서 고려할 수 있다.
항-BTLA 항체의 사용에 관한 상술된 방법과 유사한 방법을 치료적 자가면역 반응의 유도에 사용하여 알츠하이머 질환에서 Aβ, TNFα와 같은 사이토카인, 및 IgE를 포함하여, 아밀로이드 침적물와 같은, 기타 자기-항원의 비적절한 축적을 가지는 환자를 치료할 수 있다.
또한, 어떤 구체예에서, 상승작용(agonism) 역시 자가면역 반응을 감소시키는데 이용될 수 있다. 항 BTLA 항체는 작용제로서 유용하고, 그것에 의하여 면역 반응을 억제하지만 BTLA를 발현하는 면역 세포에 의하여 매개된다. 그러한 작용제 항체와 같은 것을 사용하여 치료될 수 있는 질환의 몇가지 예들은 자가면역 질환, 이식 거부, 및 염증을 포함한다.
백신
항-BTLA 항체를 관심의 항원(예, 백신)과 함께 공동투여함으로써 항원-특이적 면역 반응을 자극하는데 항-BTLA 항체를 이용할 수 있다. 따라서, 다른 관점에서, 본 발명은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 대상체에 (i) 항원; (ii) 항-BTLA 항체, 또는 이의 항원-결합부를 투여하는 것을 포함하며, 그렇게 함으로써 대상체 내에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시킨다. 바람직하게, 항체는 인간 항-인간 BTLA 항체(본 명세서에서 기술된 임의의 인간 항-BTLA 항체와 같은)이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메릭 또는 인간화된 항체일 수 있다. 항원은, 예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체로부터의 항원일 수 있다. 그러한 항원의 비-제한적 예들은 상기에서 검토된 종양 항원(또는 종양 백신), 또는 상기에서 검토된 바이러스, 박테리아 또는 기타 병원체로부터의 항원과 같은, 상기 구분에서 검토된 것들을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물(예, 인간 단일클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)의 적절한 생체 내 및 시험관 내 투여 경로는 당해 분야에 공지되어 있고, 통상의 기술을 가진 자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 조성물을 주사로 투여할 수 있다(예, 정맥내 또는 피하내). 상기 사용되는 분자의 적절한 투여량은 대상체의 나이와 체중, 및 항체 조성물의 농도 및/또는 배합에 의존할 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-BTLA 항체는 하나 이상의 다른 치료제제, 예를 들어, 세포독성 제제, 방사성독성 제제 또는 면역억제제와 공동 투여될 수 있다. 상기 항체는 상기 제제에 연결될 수 있거나(면역복합체로서) 또는 상기 제제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(별도 투여), 상기 항체는 상기 제제 투여 전, 후 또는 동시에 투여할 수 있거나, 다른 공지된 요법, 예를 들어, 항암 요법, 예를 들어 방사선 요법과 공동투여될 수 있다. 그러한 치료제들은, 특히, 항-종양 제제, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴, 블레오마이신 설페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 데카르바진 및 시클로포스파미드 하이드록시우레아를 포함하며, 이들은 그 자체로, 환자에 독성이거나 약독성(subtoxic)인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 4주에 한번씩 100 mg/dose 투여량으로 정맥내 투여되며 아드리아마이신은 21일 마다 한번씩 60-75 mg/ml 투여량으로 정맥내 투여된다. 본 발명의 인간 항-BTLA 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 화학요법제를 공동 투여하면, 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 나타내는 상이한 가작을 통해 작동하는 두 개의 항암제를 제공하게 된다. 그러한 공동 투여는, 약물에 대한 저항성의 발달로 인한 문제점 또는 종양세포가 상기 항체에 비반응적이 되도록 하는, 종양 세포의 항원성에서의 변화로 인한 문제점을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 조성물(예, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체)을 포함하는 키트들(kits) 및 사용을 위한 설명이 본 발명의 범위 내에 속한다. 키트는 본 발명의 적어도 하나의 추가 시약 또는 하나 이상의 추가 인간 항체(예, 제1 인간 항체와는 다른 BTLA 항원 내의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 가지는 인간 항체)를 더 포함할 수 있다. 키트들은 전형적으로 키트의 내용물의 의도된 사용을 설명하는 라벨을 포함한다. 라벨이라는 용어는 키트 상에 또는 함께 제공되거나 그렇지 않다면 키트를 수반하는 문서 또는 기록된 재질을 포함한다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 자세히 설명될 것이고, 이는 본 발명을 더 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에서 인용된 모든 도면 및 모든 참조물, 특허, 그리고 및 공개된 특허 출원서는 참조문헌으로 본 명세서에 명백히 병합된다.
도 1A는 1B4 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 53) 및 아미노산 서열(서열번호 1)을 보여준다. CDR1(서열번호 14), CDR2(서열번호 20) 및 CDR3(서열번호 26) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V, D 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 1B는 1B4 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 59) 및 아미노산 서열(서열번호 7)을 보여준다. CDR1(서열번호 32), CDR2(서열번호 39) 및 CDR3(서열번호 46) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생 식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 2A는 E4H9 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 54) 및 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다. CDR1(서열번호 15), CDR2(서열번호 21) 및 CDR3(서열번호 27) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 2B는 E4H9 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 60) 및 아미노산 서열(서열번호 8)을 보여준다. CDR1(서열번호 33), CDR2(서열번호 40) 및 CDR3(서열번호 46) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 3A는 3C2 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 55) 및 아미노산 서열(서열번호 3)을 보여준다. CDR1(서열번호 16), CDR2(서열번호 22) 및 CDR3(서열번호 28) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 3B는 3C2 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 61) 및 아미노산 서열(서열번호 9)을 보여준다. CDR1(서열번호 34), CDR2(서열번호 41) 및 CDR3(서열번호 48) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 3C는 3C2 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 62) 및 아미노산 서열(서열번호 19)을 보여준다. CDR1(서열번호 35), CDR2(서열번호 42) 및 CDR3(서열번호 49) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생 식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 4A는 6A5 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56) 및 아미노산 서열(서열번호 4)을 보여준다. CDR1(서열번호 17), CDR2(서열번호 23) 및 CDR3(서열번호 29) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 4B는 6A5 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 63) 및 아미노산 서열(서열번호 11)을 보여준다. CDR1(서열번호 36), CDR2(서열번호 43) 및 CDR3(서열번호 50) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 5A는 11E2 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 57) 및 아미노산 서열(서열번호 5)을 보여준다. CDR1(서열번호 18), CDR2(서열번호 24) 및 CDR3(서열번호 30) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 5B는 11E2 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 64) 및 아미노산 서열(서열번호 12)을 보여준다. CDR1(서열번호 37), CDR2(서열번호 44) 및 CDR3(서열번호 51) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 6A는 E8D9 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 58) 및 아미노산 서열(서열번호 6)을 보여준다. CDR1(서열번호 19), CDR2(서열번호 25) 및 CDR3(서열번호 31) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생 식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 6B는 E8D9 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 65) 및 아미노산 서열(서열번호 13)을 보여준다. CDR1(서열번호 38), CDR2(서열번호 45) 및 CDR3(서열번호 52) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 7은 1B4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열(서열번호 66)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 8은 1B4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK A27 아미노산 서열(서열번호 70)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 9는 E4H9의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 2-70 아미노산 서열(서열번호 67)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 10은 E4H9의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK A27아미노산 서열(서열번호 70)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 11은 3C2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 4-59 아미노산 서열(서열번호 68)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 12는 3C2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK L18 아미노산 서열(서열번호 71)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 13은 3C2a의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK L15 아미노산 서열(서열번호 72)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 14는 6A5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열(서열번호 66)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 15는 6A5의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK A27 아미노산 서열(서열번호 70)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 16은 11E2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 3-20 아미노산 서열(서열번호 69)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 17은 11E2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK L15 아미노산 서열(서열번호 72)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 18은 E8D9의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열(서열번호 66)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 19는 E8D9의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK A27 아미노산 서열(서열번호 70)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 20은 인간 BTLA의 서열(서열번호 73)을 보여준다.
도 21A는 10H6 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 83) 및 아미노산 서열(서열번호 74)을 보여준다. CDR1(서열번호 77), CDR2(서열번호 78) 및 CDR3(서열번호 79) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V, D 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 21B는 10H6 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 84) 및 아미노산 서열(서열번호 75)을 보여준다. CDR1(서열번호 80), CDR2(서열번호 81) 및 CDR3(서열번호 82) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 21C는 10H6a 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 98) 및 아미노산 서열(서열번호 76)을 보여준다. CDR1(서열번호 95), CDR2(서열번호 96) 및 CDR3(서열번호 97) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 22는 10H6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 3-33 아미노산 서열(서열번호 99)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 23은 10H6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK 04 아미노산 서열(서열번호 100)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 24는 10H6a의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VK A27 아미노산 서열(서열번호 70)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 25A는 4C9 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 93) 및 아미노산 서열(서열번호 85)을 보여준다. CDR1(서열번호 87), CDR2(서열번호 88) 및 CDR3(서열번호 89) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V, D 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 25B는 4C9 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서 열번호 94) 및 아미노산 서열(서열번호 86)을 보여준다. CDR1(서열번호 90), CDR2(서열번호 91) 및 CDR3(서열번호 92) 영역들은 윤곽으로 그려져있고 V 및 J 생식세포계열 유도체들이 표시되어 있다.
도 26은 4C9의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 VH 2-05 아미노산 서열(서열번호 66)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 27은 4C9의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 Vk A27 아미노산 서열(서열번호 70)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 28A는 BTLA-CHO 세포로의 항-BTLA 항체의 농도 의존성 결합을 증명한다. 도 28B 및 도 28C는 항-BTLA 항체가 농도 의존성 방식으로 BTLA-CHO 세포로의 HVEM 결합을 방해하는 것을 증명한다.
도 29는 항-BTLA 항체의 항원 특이성을 증명한다. 도 29A는 다른 CD28 분자에 대한 결합과 비교하여 다양한 항-BTLA 항체의 결합 특이성을 나타낸 것이다. 도 29B는 항원 특이적 대조군을 나타낸 것이다.
실시예 1 : BTLA 에 대항하는 인간 단일클론 항체의 생성
항원
면역화 프로토콜은 (i) BTLA의 세포 외 부분을 포함하는 재조합 융합 단백질 및 (ii) 막 결합 전장 BTLA 둘 다를 항원으로서 이용하였다. 두 항원을 CHO 세포주 내 에서 재조합 형질감염 방법에 의하여 생성하였다.
트랜스유전자성 HuMab 및 KM 마우스™
HuMab 트랜스유전자성 마우스의 HCo 7 주와 트랜스유전자성 트랜스염색체 마우스의 KM 주를 사용하여, BTLA에 대한 완전 인간 단일클론 항체를 제조하였는데, 상기 각각은 인간 항체 유전자를 발현한다. 이러한 마우스 주의 각각에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 Chen 등 (1993) EMBO J. 12:811-820에 서술된 바와 같이 동형접합적으로 파괴되었으며 내인성 마우스 중쇄 유전자는 PCT 공개 제WO 01/09187호의 실시예 1에 서술된 바와 같이 동형접합적으로 파괴되었다. 이들 마우스주의 각각은, Fishwild 등 (1996) Nature Biotechnology 14:845-851에 기술된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스유전자인 KCo5를 보유한다. 미국 특허 번호 제 5,545,806호; 제5,625,825호; 및 제5,545,807호에 기술된 바와 같이 HCo7 주는 HCo7 인간 중쇄 트랜스유전자를 보유한다. PCT 공개 제WO 02/43478호에 기술된 바와 같이 KM 주는 SC20 트랜스염색체를 보유한다.
HuMab 및 KM 면역화:
BTLA에 대한 완전 인간 단일클론 항체를 생성하기 위해, HuMab 마우스 및 KM 마우스™를 정제된 재조합 BTLA 융합 단백질 및 BTLA-형질감염된 CHO 세포를 항원으로 사용하여 면역화시켰다. HuMab 마우스를 위한 일반적인 면역화 계획은 Lonberg, N. 등 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 PCT 공개 제WO 98/24884호에 기술되어 있다. BTLA 융합 단백질 항원의 정제된 재조합 제제(5-50 ㎍) 및 5 - 10 × 106 세포를 이용하여 HuMab 마우스 및 KM 마우스™를 복강내 주사(Ip), 또는 피하 주사(Sc)로 면역화시켰다.
<표 2> BTLA KM 마우스™ 에서 면역화 스케쥴
Figure 112009032869663-PCT00002
트랜스유전자성 KM 마우스™ 를 표 2에 약술한 바와 같이BTLA Ig 항원 및 CHO 세포 상에 발현되는 BTLA의 조합으로 90일의 기간 동안 면역화시켰다. BTLA-Ig를 융합 전에 Sc + Ip 면역법으로서 리비(Ribi) 보조제에 또는 PBS에 넣어 정맥 주사법으로서 투여하였다. 세포를 PBS에 넣어 복강 내로 투여하였다. 면역 계획을 표 2에 나타내었다. 안와후(방) 출혈에 의하여 면역 반응을 모니터하였다. 혈장을 ELISA에 의하여 스크린하였으며(하기에 기술됨), 항-BTLA 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 가진 마우스를 융합용으로 사용하였다. 마우스에 항원을 정맥 내 주사하고 3일 후에 안락사시키고 비장을 제거하였다. 10 HuMab와 10 KM 마우스™를 면역화시켰다.
항- BTLA 항체를 생산하는 HuMab 또는 KM 마우스™ 의 선택:
BTLA에 결합하는 항체를 생산하는 HuMab 또는 KM 마우스™를 선택하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 혈액을 Fishwild, D. 등 (1996)에 의하여 기술된 바와 같이 ELISA로 테스트하였다. 요약하면, 미세역가 평판을 PBS에 1㎍/ml로 형질 전환된 CHO 세포로부터 정제된 재조합 BTLA 융합 단백질을 넣어 도말하였고, 100㎕/wells을 4℃에서 밤새도록 배양한 다음, PBS/Tween(0.05%) 중 1%의 BSA의 200㎕/well로 블로킹하였다. BTLA-면역화 마우스로부터 얻은 혈청 희석액을 각각의 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 1∼2 시간 동안 배양하였다. 이 평판을 PBS/Tween으로 세척한 다음, 알칼라인 포스파타제와 접합된 염소-항-인간 IgG 폴리클론 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 세척한 다음, 이 평판을 pNPP 기질(Sigma, N 2770)로 전개시키고, OD 405에서 분광 측정계로 분석하였다. 항-BTLA 항체의 최고 역가를 전개시켰던 마우스를 융합용으로 사용하였다. 하기에 기술된 바와 같이 융합을 수행하였으며, 하이브리도마 상청액을 ELISA 및 FACS에 의하여 항-BTLA 활성에 대해 테스트하였다.
BTLA 에 대한 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성:
표준적인 프로토콜을 바탕으로 KM 마우스™로부터 분리한 마우스 비장 세포 를 PEG와 함께 마우스 골수종 세포주에 융합시켰다. 그리고나서, 결과의 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산을 위하여 스크리닝하였다. 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 동일한 수의 P3X63-Ag8.653 비-분비형 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)에 50% PEG(Sigma)와 함께 또는 전기융합(E-fusion, Cyto Pulse™ technology)에 의하여 융합하였다. 세포를 약 2 × 105의 밀도로 편평 바닥 미세 역가 평판에 도말한 다음, 10% FBS, 3-5% 오리겐(IGEN), OPI 보충체(Sigma O 5003: 1.1 × 10-3 M 옥살로 아세트산, 4.5 ×10-4 M 피루브산나트륨, 및 24 international units/L 소 인슐린), 4 mM L-글루타민, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 및 1X HAT를 함유하는 선택 배지에 2주 배양하였다. 약 2주 후, 세포를, HAT를 HT로 바꾼 배지 중에서 배양할 수 있다. 그리고 나서 개개의 웰을 ELISA 및 FACS(상기함)에 의하여 인간 항-BTLA 단일클론 IgG 항체에 대하여 스크린하였다. 항체-분비 하이브리도마를 재도말하고, 다시 스크린하였으며, 만일 여전히 인간 IgG에 대해 양성이라면, 희석을 제한함으로써 항-BTLA 단일클론 항체를 적어도 2회 서브클로닝하였다. 그리고나서 추가 특성규명을 위하여 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에서 소량의 항체를 생성시켰다.
하이브리도마 클론 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6 및 4C9를 추가 분석을 위해 선택하였다.
실시예 2 : 인간 단일클론 항체 1B4, E4H9 , 3 C2 , 3 C2a , 6A5, 11 E2 , E8D9 , 10 H6 및 4C9의 구조적 특징
1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6 및 4C9 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 cDNA 서열을, 표준 PCR 기술을 사용하여, 1B4, E4H9, 3C2, 3C2a, 6A5, 11E2, E8D9, 10H6 및 4C9 하이브리도마로부터 각각 얻은 후, 표준 DNA 서열 결정 기술을 이용하여 서열화하였다.
1B4의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 1A 및 서열번호 53 및 1에 각각 보인다.
1B4의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 1B 및 서열번호 59 및 7에 각각 보인다.
1B4 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 1B4 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 2-05로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 3-10로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 6b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 1B4 VH 서열을 생식세포계열 VH 2-05 서열에 대해 정렬한 것이 도 7에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 1B4 VH 서열의 추가 분석은 도 1A 및 도 7과 서열번호 14, 20 및 26에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
1B4 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 1B4 경쇄는 인간 생식세포계열 VK A27로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 5로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 1B4 VL 서열을 생식세포계열 VK A27 서열에 대해 정렬한 것이 도 8에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 1B4 VL 서열의 추가 분석은 도 1B 및 도 8과 서열번호 32, 39 및 46에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
E4H9의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 2A 및 서열번호 54 및 2에 각각 보인다.
E4H9의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 2B 및 서열번호 60 및 8에 각각 보인다.
E4H9 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, E4H9 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 2-70로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 3-10로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 6b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. E4H9 VH 서열을 생식세포계열 VH 2-70 서열에 대해 정렬한 것이 도 9에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 E4H9 VH 서열의 추가 분석은 도 2A 및 도 9와 서열번호 15, 21 및 27에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
E4H9 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, E4H9 경쇄는 인간 생식세포계열 VK A27로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 3으로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. E4H9 VL 서열을 생식세포계열 VK A27 서열에 대해 정렬한 것이 도 10에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 E4H9 VL 서열의 추가 분석은 도 2B 및 도 33과 서열번호 40 및 47에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
3C2의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 3A 및 서열번호 55 및 3에 각각 보인다.
3C2의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 3B 및 서열번호 61 및 9에 각각 보인다.
3C2 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 3C2 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 4-59로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 6-19로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 4b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 3C2 VH 서열을 생식세포계열 VH 4-59 서열에 대해 정렬한 것이 도 11에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 3C2 VH 서열의 추가 분석은 도 3A 및 도 11과 서열번호 16, 22 및 28에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
3C2 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 3C2 경쇄는 인간 생식세포계열 VK L18로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 3C2 VL 서열을 생식세포계열 VK L18 서열에 대해 정렬한 것이 도 12에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 3C2 VL 서열의 추가 분석은 도 3B 및 도 11과 서열번호 34, 41 및 48에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
3C2a의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 3C 및 서열번호 62 및 10에 각각 보인다.
3C2a 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 3C2a 경쇄는 인간 생식세포계열 VK A27로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 2로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 3C2a VL 서열을 생식세포계열 VK A27 서열에 대해 정렬한 것이 도 13에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 3C2a VL 서열의 추가 분석은 도 3C 및 도 12와 서열번호 35, 42 및 49에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
6A5의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 4A 및 서열번호 56 및 4에 각각 보인다.
6A5의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 4B 및 서열번호 63 및 11에 각각 보인다.
6A5 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 6A5 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 2-05로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 3-10로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 6b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 6A5 VH 서열을 생식세포계열 VH 2-05 서열에 대해 정렬한 것이 도 14에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 6A5 VH 서열의 추가 분석은 도 4A 및 도 14와 서열번호 17, 23 및 29에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
6A5 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 6A5 경쇄는 인간 생식세포계열 VK A27로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 5로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 6A5 VL 서열을 생식세포계열 VK A27 서열에 대해 정렬한 것이 도 15에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 6A5 VL 서열의 추가 분석은 도 4B 및 도 36과 서열번호 43 및 50에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
11E2의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 5A 및 서열번호 57 및 5에 각각 보인다.
11E2의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 5B 및 서열번호 64 및 12에 각각 보인다.
11E2 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 11E2 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 3-20로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 3-10로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 6b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 11E2 VH 서열을 생식세포계열 VH 3-20 서열에 대해 정렬한 것이 도 16에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 11E2 VH 서열의 추가 분석은 도 5A 및 도 16과 서열번호 18, 24 및 30에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
11E2 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 11E2 경쇄는 인간 생식세포계열 VK L15로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 1로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 11E2 VL 서열을 생식세포계열 VK L15 서열에 대해 정렬한 것이 도 17에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 11E2 VL 서열의 추가 분석은 도 5B 및 도 17과 서열번호 37, 44 및 51에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
E8D9의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 6A 및 서열번호 57 및 5에 각각 보인다.
E8D9의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 6B 및 서열번호 65 및 13에 각각 보인다.
E8D9 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, E8D9 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 2-05로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 3-10로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 6b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. E8D9 VH 서열을 생식세포계열 VH 2-05 서열에 대해 정렬한 것이 도 18에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 E8D9 VH 서열의 추가 분석은 도 6A 및 도 18과 서열번호 19, 25 및 31에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
E8D9 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, E8D9 경쇄는 인간 생식세포계열 VK A27로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. E8D9 VL 서열을 생식세포계열 VK A27 서열에 대해 정렬한 것이 도 19에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 E8D9 VL 서열의 추가 분석은 도 6B 및 도 19와, 서열번호 38, 45 및 52에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
10H6의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 21A 및 서열번호 83 및 74에 각각 보인다.
10H6의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 21B 및 서열번호 84 및 75에 각각 보인다.
10H6 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 10H6 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 3-33로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 3-10로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 6b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 10H6 VH 서열을 생식세포계열 VH 4-59 서열에 대해 정렬한 것이 도 22에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 10H6 VH 서열의 추가 분석은 도 21A 및 도 22와, 서열번호 77, 78 및 79에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
10H6 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 10H6 경쇄는, 위유전자(pseudogene)으로서 분류되는, 인간 생식세포계열 VK 04로부터의 VL 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 그러나, 이 경우에, 그것은 실제로 발현되고 있다. 10H6 경쇄는 또한 인간 생식세포계열 JK 2로부터의 JK 분절을 이용한다. 10H6 VL 서열을 생식세포계열 VK 04 서열에 대해 정렬한 것이 도 23에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 10H6 VL 서열의 추가 분석은 도 21B 및 도 23과, 서열번호 80, 81 및 82에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
10H6a의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 21C 및 서열번호 98 및 76에 각각 보인다.
10H6a 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 10H6a 경쇄는 인간 생식세포계열 VK A27로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 5로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 10H6a VL 서열을 생식세포계열 VK A27 서열에 대해 정렬한 것이 도 24에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 10H6a VL 서열의 추가 분석은 도 21C 및 도 24와, 서열번호 95, 96 및 97에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
4C9의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 25A 및 서열번호 93 및 85에 각각 보인다.
4C9의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 25B 및 서열번호 94 및 86에 각각 보인다.
4C9 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교한 결과, 4C9 중쇄는 인간 생식세포계열 VH 2-05로부터의 VH 분절, 인간 생식세포계열 3-10으로부터의 D 분절, 및 인간 생식세포계열 JH 6b로부터의 JH 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 4C9 VH 서열을 생식세포계열 VH 2-05 서열에 대해 정렬한 것이 도 26에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 4C9 VH 서열의 추가 분석은 도 25A 및 도 26과, 서열번호 87, 88 및 89에 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
4C9 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식세포계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교한 결과, 4C9 경쇄는 인간 생식세포계열 VK A27으로부터의 VL 분절 및 인간 생식세포계열 JK 1로부터의 JK 분절을 이용한다는 사실이 입증되었다. 4C9 VL 서열을 생식세포계열 VK A27 서열에 대해 정렬한 것이 도 27에 보인다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용한 4C9 VL 서열의 추가 분석은 도 25B 및 도 27과, 서열번호 90, 91 및 92에 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역을 윤곽지었다.
실시예 3 : 항- BTLA 인간 단일클론 항체의 결합의 특징화
본 실시예에서, 항-BTLA 항체의 결합 친화성과 결합 역학을 바이어코어 분석법에 의해 조사하였다. 결합 역학 및 억제를 유세포분석법에 의해 조사하였다.
결합 친화도 및 반응 속도
항-BTLA 항체를 바이어코어 분석법(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 의하여 친화성 및 결합 역학에 대해 특성 규명하였다. 표준 아민 커플링 화학 작용 및 바이어코어에 의해 제공되는 키트를 이용하여, 정제된 재조합 인간 BTLA 융합 단백질을 1차 아민을 통해 CM5 칩(카르복시 메틸 덱스트란 코팅 칩)에 공유 결합시켰다. HBS EP완충액(바이어코어 AB에 의해 제공됨) 중 항체를 267nM의 농도 및 50㎕ul/min의 유속으로 흐르게 함으로써, 결합능을 측정하였다. 항원-항체 결합 역학은 3분 동안, 그리고 해리 역학은 7분 동안 관찰하였다. 결합 및 해리 곡선을 BIA평가 소프트웨어(바이어코어(Biacore) AB)를 이용하는 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 맞추었다. 결합 상수를 측정함에 있어서의 결합성의 효과를 최소화하기 위해, 결합 및 해리 단계에 상응하는 데이터의 처음 구간을 보정시 활용하였다. 결정된 KD 값들이 표 3에 보인다.
<표 3> KD, H 및 L 사슬의 질량
바이어코어( BiaCore )
클론 이소타입 K D ,×10 -9 M 중쇄 질량(D) 경쇄 질량(D)
6A5 IgG4 23793.4 50541.3
E4H9 IgG4 0.13 23692.3 50916.9
E8D9 IgG4 23525.0
1B4 IgG1 2.88 23585.0
3C2 IgG1 0.88
11E2 IgG1 0.61 23697.0 50405.6
유세포 측정법에 의한 결합 특이성
세포 표면에서 재조합 인간 BTLA를 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 전개시켰고, 이를 유세포 측정법에 의하여 BTLA 인간 단일클론 항체의 특이성을 결정하는데 사용하였다. CHO 세포를, BTLA의 트랜스멤브래인 형을 암호화하는 전장 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드로 형질 감염시켰다. 항-BTLA 인간 단일클론 항체로 형질감염된 세포를 0.01 nM 내지 66 nM의 농도에서 배양함으로써 항-BTLA 인간 단일클론 항체의 결합능을 평가하였다. 항체를 PBS 1% BSA에서 4℃에서 60분동안 105 BTLA CHO 세포로 배양하였다. 세포를 PBS-1% BSA에서 2번 세척하고 PE 표지된 항-인간 IgG로 염색하였다(Jackson InmmuoResearch 109-115-098). 프리즘 그래핑 소프트웨어(GraphPad software)를 사용하여 평균 형광 강도(MFI) 대 항체 농도의 로그를 플로팅(plotting)함으로써 EC50을 그래프식으로 결정하였다. FACS 어레이 유세포 분석법(Becton Dickinson, San Jose, CA)을 이용하여 유세포 분석법에 의한 분석을 실시하였다. 그 결과는 도 28A에 기술되어 있다.
실시예 4: BTLA 를 발현하는 세포에 대한 HVEM 리간드의 결합을 억제하는
항- BTLA 항체
또한, HVEM에 대한 BTLA의 결합을 막는 BTLA Mab의 능력을 FACS에 의하여 결정하였고, 105 BTLA CHO 세포에 대한 HVEM의 최대 결합능의 반(IC50)을 방해하기 항-BTLA IgG의 농도로서 표현한다. 다양한 농도에서의 BTLA CHO 세포 및 항체를 4℃에서 30분동안 선배양하고나서, 0.5 ug/ml 비오틴이 표지된 HVEM Ig(R & D Systems BAF 356)을 BTLA CHO-IgG 혼합물에 첨가하였고 다시 30분동안 배양하였다. 세포를 PBS-1% BSA에서 2번 세척하였고, 상기 세포를 스트렙타비딘-PE(BD Parmingen 3554061)로 염색한 후에 비오틴 HVEM Ig의 결합능을 FACS에 의하여 탐지하였다. 프리즘 소프트웨어(GraphPad Software)를 이용하여 IC50 값을 그래픽식으로 결정하였 다. 결과가 도 28B 및 도 28C에 기술되어 있다.
실시예 5: 항- BTLA 항체 특이성의 결정
ELISA 분석법을 전개하여 BTLA 수용체에서의 항-BTLA 항체의 판넬의 특이성을 검증하였고 수용체의 CD28종의 다른 멤버와 실질적인 교차-반응이 없다는 것을 보여주었다.
ELISA 플레이트를 인간 IgG의 Fc 부분에 융합되는 CD28 수용체 종 분자의 판넬의 세포외 도메인으로 구성되는 융합 단백질로 밤새 도말하였다(표 4). 상기 플레이트를 세척하고 차단시켜 비-특이적 결합을 최소화하였다. 모두 1 ug/mL로 희석된, 항-BTLA 항체 및 이소타입 대조군 항체의 판넬(표 5)과, 양성 대조군 탐지 항체(표 3)를 합하여 두 플레이트로 만들어 1 시간 동안 이 플레이트들을 분석하였다. 광범위한 세척 후, 적절한 HRP-접합 탐지 항체를 1 시간동안 상기 플레이트들에 첨가한 후, 세척 및 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 기질로 이용한 전개를 실시하였다. 650 nm 에서의 광학 밀도 측정을 기록하였다.
<표 4>
<표 5>
관찰된 BTLA-특이적 반응(도 29A 및 도 29B)와 비교해 볼 때, 테스트된 임의 의 다른 CD28 종 멤버 수용체와는 실질적인 교차-반응이 없었다. 이러한 결과는 여기에서 테스트된 항-BTLA 항체의 판넬이 인간 BTLA에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 항- BTLA 항체를 사용한 생체 내 종양 모델의 치료
암성 종양이 이식된 마우스를 생체내에서 항-BTLA 항체로 처리하고 종양 성장에 대한 항체의 생체내 효과를 검사하였다. 양성형 대조군으로서, 항-CTLA-4 항체를 사용하는데, 이는 그러한 항체가 생체내에서 종양 성장을 억제하는 것으로 보여왔기 때문이다.
종양 연구를 위하여, 6-8 주령의 암컷 AJ 마우스(Harlan Laboratories)를 무작위로 선택하여 체중에 따라 6개의 그룹으로 나누었다. 제0일에, 마우스의 오른쪽 옆구리에 200 ㎕의 DMEM 배지에 용해된 2 × 106 개의 SA1/N 섬유 육종 세포를 피하 이식하였다. 마우스를 PBS 비이클(vehicle) 또는 10 mg/kg 의 항체로 처리하였다. 제1, 제 4, 제 8, 및 제 11일에, 동물에 항체 또는 비이클을 포함하는 약 200 ㎕의 PBS를 복강 내 주사로 투여하였다. 각 그룹은 10마리의 동물을 포함하는데, 상기 그룹은 다음과 같이 구성된다: (i) 비이클 그룹, (ii) 대조군 마우스 IgG, (iii) 대조군 햄스터 IgG, (iv) 햄스터 항-마우스 BTLA-4 항체, 및 (v) 완전 인간 항-BTLA. 상기 마우스를 약 6주에 걸쳐 종양 성장에 대하여 매주 2회씩 관찰하였다. 전자 구경 측정계를 사용하여, 종양을 3차원적(높이×폭×길이)으로 측정하고 종양 의 부피를 계산한다. 종양이 종양 종점(1500 mm3)에 이를때 또는 15% 이상의 체중 손실을 보일 때 마우스를 안락사시킨다.
실시예 7 : 항체의 추가적 결합 특징
재조합 BTLA 단백질에 대한 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2 및 10H6 항체의 결합능을 항체 포획 방법을 이용하여 바이어코어(BIAcore)™에 의하여 검사하였다. 인간 항체의 중쇄 불변 영역 1에 대하여 특이적인 시약 항체(Zymed, Clone HP6045, Stock conc. 1.0 mg/mL)인, 항-CH1을 이용하여 각각의 여섯개의 항-BTLA 단일클론 항체를 포획하였다. 항-CH1을 CM5 칩(BR-1000-14, Research Grade) 상에 높은 밀도(6200-7960 RUs)로 코팅하였다. 제조자에 의하여 추천된 표준 고정화 과정에 기초하여 상기 코팅을 실시하였다. 그리고 나서 1-10 mg/mL 범위의 농도를 가지는, 1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2 및 10H6 정제 항체를, 항-CH1이 코팅된 칩 표면 상에서 0.5-1분 동안 10 ㎕/min의 유량으로 각각 포획하였다. 단일 농도의 재조합 인간 BTLA 융합 단백질(200 nM)을 30㎕/min의 유량으로 4분동안 포획된 항체에 주입하였다. 항원을 10분동안 해리하게 하였다. 각 주기 후에 10 ㎕의 30 mM NaOH로 칩 표면을 재생하였고 이어서 30 ㎕의 HBS EP로 세척하였다. 이소타입 대조군을 칩 상에서 전개시켰으며, 데이터를 이용하여 비-특이적 결합을을 뺐다. 모든 실험을 바이어코어 컨트롤 소프트웨어(BIAcore Control software) v 3.2를 이용하여, 바이어코어(Biacore) 3000 표면 플라즈몬 공명 기구 상에서 실시하였다. 바이어이밸류에이 션 v3.2 소프트웨어(BiaEvaluation v3.2 software)를 이용하여 데이터 분석을 실시하였다. 그 결과가 하기 표 6에 보인다.
<표 6> 인간 BTLA에 대한 항-BTLA 항체의 결합 친화도 및 반응 속도
항체 KD × 10-9 (M) kon × 104 (1/Ms) koff × 10-4 (1/s)
1B4 5.74 4.94 2.84
E4H9 0.006 4.57 0.003
3C2 6.65 4.52 3.01
6A5 0.09 3.89 0.04
11E2 8.54 2.8 9.84
10H6 3.82 4.0 1.53
1B4, E4H9, 3C2, 6A5, 11E2 및 10H6의 바이어코어(BIAcore) 결과는, 항체가 인간 BTLA에 높은 친화도로 결합할 수 있다는, 유세포 분석법 및 초기 바이어코어(BIAcore) 결과(상기, 실시예 3에서 기술됨)를 확인해준다. 이 실시예에서 기술된 항체 포획 방법을 이용하여 얻어진 KD 값은, 항원 포획 방법이 이용되었던, 실시예 3에서 기술된 KD 값과 다소 다르다. 이것은 이 실시예에서 이용된 항체 포획 방법이 항체 결합 성분을 가지지 않는다는 사실에 기인할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 두 방법 사이의 친화도의 차이는 칩의 표면 상에 포획된 항원 대 용액 중의 항원에서 mAbs에 의한 분자 인식 과정에서의 차이를 나타낼 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Korman, A. <120> Human Monoclonal Antibodies to BTLA and Methods of Use <130> 000000 <140> WO PCT/US00/00000 <141> 2007-11-05 <150> US 60/866,058 <151> 2006-11-15 <160> 100 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ile 20 25 30 Gly Val Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Arg Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Ser Gly Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile His Tyr 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 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Cys Ala 85 90 95 Arg Val Lys Val Tyr Ser Thr Gly Trp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Ile Arg Ile Thr Glu Val Arg Gly Val Ile Ile Ser Tyr 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ile Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp 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tgcacggata 300 cggtttacta tgtttcgggg agtctactac tattactacg gtttggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 55 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcacta tctctggtgg ctccatcagt aattactact ggaactggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtacgagcac caagtacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagagacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agtgaaagtg 300 tatagcactg gctggttctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 56 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tttctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt 120 cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc 180 tacagtccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tggccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacatc 300 cgtattactg aggttcgggg agttattatc tcctactacg gtatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 57 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggt gtgatacggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacaggttat 180 gcagcctctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctacaaatga acagtctgag agccgaggac tcggccttgt attactgtgc gagagattat 300 tactatggtc cggggagtcc taactacttc tactacgcta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc a 381 <210> 58 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt 120 cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc 180 tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacacc 300 agtattactg aggttcgggg agctattatc tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 59 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 60 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gatcactttc 300 ggccctggga ccaaagtgga tatcaaa 327 <210> 61 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gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gatcaccttc 300 ggccaaggga cacgactgga gattaaa 327 <210> 64 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 65 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggtc actcgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 66 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg 100 <210> 67 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile 100 <210> 68 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg <210> 69 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 70 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser 85 90 95 <210> 71 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 72 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 73 <211> 289 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val 1 5 10 15 Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu 20 25 30 Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile 35 40 45 Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala 50 55 60 Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser 85 90 95 Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser 100 105 110 Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser 115 120 125 Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser 130 135 140 Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro 145 150 155 160 Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys 165 170 175 Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala 180 185 190 Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr 195 200 205 Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly 210 215 220 Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser 225 230 235 240 Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val 245 250 255 Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala 260 265 270 Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg 275 280 285 Ser <210> 74 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Thr Gln Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 75 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 76 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ser Tyr Asp Met His 1 5 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ala Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Asp Arg Ile Thr Met Val Arg Gly Val Ile Thr Gln Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 83 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggaatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaccgt 300 attactatgg ttcggggagt tattacccaa tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc a 381 <210> 84 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggtgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca 120 gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg ccccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 85 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Ser Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Thr Arg Ile Ala Glu Val Arg Gly Val Ile Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 86 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Thr Ser Gly Val Gly Val Ala 1 5 <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 89 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Thr Arg Ile Ala Glu Val Arg Gly Val Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Asp Val <210> 90 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Val 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Trp Thr 1 5 <210> 93 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 cagatcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaagc ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggc ctggatccgt 120 cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc 180 tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgagcaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcgcacacc 300 cgcattgctg aggttcgggg agttatatac tactactacg gtatagacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 94 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagtctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ile Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 98 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcatctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gatcaccttc 300 ggccaaggga cacgactgga gattaaa 327 <210> 99 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 100 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro 85 90 95

Claims (87)

  1. 항체는 BTLA에 결합하며, 상기 항체는 다음의 성질 중 하나 이상을 나타내는 분리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부:
    (a) 1 × 10-7 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합함;
    (b) BTLA에 대한 HVEM의 결합을 억제함; 또는
    (c) 인간 TrkB, CD28, CTLA-4, PD-1 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않음.
  2. 청구항 1에 있어서,
    IgG1 또는 IgG4 이소타입(isotype)의 전장 항체인 항체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    항체 분절 또는 단일 사슬 항체인 항체.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체는 5 × 10-8 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하는 항체.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체는 1 × 10-8 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하는 항체.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체는 5 × 10-9 M 이하의 KD로 인간 BTLA에 결합하는 항체.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체는 1 × 10-8 M과 1 × 10-10 M 사이의 KD로 인간 BTLA에 결합하는 항체.
  8. 항체는 BTLA에 결합하는 것에 대하여 참조 항체와 교차-경쟁하며,
    상기 참조 항체는;
    (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74, 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는, 분리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  12. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  13. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  14. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  15. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  16. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  17. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  18. 청구항 8에 있어서,
    상기 인간 중쇄 가변 영역은 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간 경쇄 가변 영역은 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  19. 인간 VH 2-05 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  20. 인간 VH 2-70 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  21. 인간 VH 4-59 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  22. 인간 VH 3-20 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  23. 인간 VH 3-33 유전자의 생산물인 중쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  24. 인간 VK A27 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  25. 인간 VK L18 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  26. 인간 VK L15 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  27. 인간 VK 04 유전자의 생산물인 경쇄 가변 영역 또는 상기 유전자로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부.
  28. (a) 인간 VH 2-05 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vk A27 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  29. (a) 인간 VH 2-70 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vk A27 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  30. (a) 인간 VH 4-59 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vk L18 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  31. (a) 인간 VH 4-59 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vk A27 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  32. (a) 인간 VH 3-20 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vk L15 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  33. (a) 인간 VH 3-33 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vk 04 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  34. (a) 인간 VH 3-33 유전자의 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 인간 Vk A27 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  35. CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    (a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며:
    (b) 상기 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며: 및
    (c) 상기 항체는 BTLA에 특이적으로 결합하는,
    분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95의 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형체로 구성되 는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  38. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    (a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74, 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며;
    (c) 항체는 인간 BTLA에 1 × 10-7 M 이하의 KD로 결합하고; 및
    (d) 항체는 인간 Trkb, CD28, CTLA-4, PD-1 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않는,
    분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 항체는 BTLA에 대한 HVEM의 결합을 방해하는 항체.
  40. (a) 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부.
  41. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  42. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  43. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  44. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 50을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  45. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 51을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  46. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 31을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 52를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  47. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 78을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 80을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 81을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 82를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  48. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 78을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 95를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 96을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 97을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  49. 청구항 40에 있어서,
    (a) 서열번호 87을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 88을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 90을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 91을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 92를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체.
  50. (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 74 및 85로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 75, 76, 및 86으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하며, 항체가 BTLA에 특이적으로 결합하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부.
  51. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  52. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  53. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  54. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  55. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  56. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  57. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  58. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  59. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  60. 청구항 50에 있어서,
    (a) 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체.
  61. 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체, 또는 이의 항원 결합부, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  62. 치료적 제제와 관련된, 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체, 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 면역접합체.
  63. 청구항 62의 면역접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  64. 청구항 62에 있어서,
    상기 치료적 제제는 사이토톡신(cytotoxin)인 면역접합체.
  65. 청구항 64의 면역접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  66. 청구항 62에 있어서,
    상기 치료적 제제는 방사선 동위원소인 면역접합체.
  67. 청구항 64의 면역접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  68. 항체 또는 이의 항원-결합부와는 상이한 결합 특이성을 갖는 제2의 기능성 부분에 결합된, 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른, 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 이중특이적 분자.
  69. 청구항 68의 이중특이적 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  70. 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결 합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  71. 청구항 70의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  72. 청구항 71의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  73. 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하며, 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체를 발현하는 트랜스유전자성 마우스.
  74. 청구항 73의 마우스로부터 제조되고 상기 항체를 생산하는 하이브리도마.
  75. 대상체에 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부를 투여하여, 상기 대상체 내 면역 반응을 조정하는 것을 포함하는, 대상체 내 면역 반응을 조정하는 방법.
  76. 치료학적 유효량의 항-BTLA 항체 또는 이의 항원-결합부를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  77. 청구항 76에 있어서,
    상기 항체가 키메릭 항체인 방법.
  78. 청구항 76에 있어서,
    상기 항체가 인간화 항체인 방법.
  79. 청구항 76에 있어서,
    상기 항체가 완전 인간의 항체인 방법.
  80. 청구항 76에 있어서,
    상기 종양 세포는 흑색종, 신장암, 전립선암, 유방암, 결장암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 세포인 방법.
  81. 청구항 76에 있어서,
    상기 종양 세포는 골암, 췌장암, 피부암, 머리 또는 목의 암, 피부 또는 안구 내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 여성 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아의 고형암, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 수뇨관암, 신우 암종, 중추신경계(CNS)의 신생물 형성증, 1차 중추신경계 림프종, 종양 혈관신생, 척수 축 종양, 뇌간교세포종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피암, 편평상피세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발되는 암을 포함하는 환경적으로 유발되는 암, 및 상기 암들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 세포인 방법.
  82. 대상체에 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부를 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  83. 감염성 질환에 대하여 대상체를 치료하도록 상기 대상체에 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부를 투여하는 것을 포함하는 대상체 내 감염성 질활을 치료하는 방법.
  84. 청구항 83에 있어서,
    상기 감염성 질환은 다음으로 구성되는 리스트에서 선택된 방법: HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 지아르디아(Giardia), 말라리아, 리슈마니아(Leishmania), 간염 바이러스(A, B 또는 및 C형), 헤르페스(Herpes) 바이러스(예, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스타인바(Epstein Barr) 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스(coxsackie virus), 코르노바이러스(cornovirus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스(rubella virus), 파보바이러스(parvovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스(dengue virus), 유두종마바이러스(papillomavirus), 연속종 바이러스(molluscum virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus)에 의한 병원성 감염, 클라미디아, 리케챠 박테리아, 마이코박테리아, 포도상구균, 연쇄상구균, 뉴모노코커스, 수막염균(meningococci) 및 코노코커스(conococci), 클렙시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(legionella), 디프테리아(diphtheria), 살모넬라(salmonella), 간균(bacilli), 콜레라(cholera), 티타누스(tetanus), 보툴리누스 중독(botulism), 탄저(anthrax), 페스트(plague), 렙토스피라병(leptospirosis) 및 라임병(Lymes disease) 박테리아의 박테리아에 의한 병원성 감염, 칸디다(Candida)(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼질러스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 나이저(niger) 등), 무코랄레스 속(무코(mucor), 앱시디아(absidia), 리조퍼스(rhizophus)), 스포로트릭스 센키(Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라코사이디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코사이디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum) 진균에 의한 병원성 감염, 및 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 밸런티디움 콜라이(Balantidium coli), 나에글레리아파울러리(Naegleriafowleri), 아칸트아메바 종(Acanthamoeba sp.), 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리듐 종(Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 플라스모듐 비백스(Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi) 및 니포스트롱길러스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis) 기생체에 의한 병원성 감염.
  85. 대상체에 (i) 항원; 및 (ii) 청구항 1 내지 청구항 60의 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부를 투여하여 상기 대상체 내에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 것을 포함하는, 개체 내 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 방법.
  86. 청구항 85에 있어서,
    상기 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체로부터 유래하는 항원인 방법.
  87. (i) 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 77, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 78, 및 88로 이루어진 군으로 부터 선택된 CDR2 서열, 및 서열번호 26, 27, 28, 29, 30, 31, 79, 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 또는 (ii) 서열 번호 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 80, 90, 및 95로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 81, 91, 및 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및 서열 번호 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 82, 92, 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 것;
    하나 이상의 가변 영역 항체 서열 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 하나 이상의 변형된 항체 서열을 생성시키는 것으로, 상기 서열은 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및 상기 경쇄 가변 영역 항체 서열을 포함하며; 및
    상기 변형된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 것;
    을 포함하는 항-BTLA 항체를 제조하는 방법.
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