CN115073599B - 结合pd-l1的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与人PD‑L1特异结合的分离的单克隆抗体。还提供编码该抗体的核酸分子，以及用于表达该抗体的表达载体、宿主细胞和方法。本发明还提供包含该抗体的免疫交联物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本发明抗体的治疗方法。

Description

结合PD-L1的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种与人PD-L1特异结合的抗体、及其制备和用途，尤其是其在治疗与PD-L1相关疾病中的用途，例如癌症和感染性疾病。

背景技术

基于T细胞的免疫激活识别和清除体内异常细胞，包括病原体感染的细胞和肿瘤细胞，是机体自我保护的重要机制之一。然而，人体的T细胞活性受到众多的免疫共激活和共抑制信号的调控，这些分子统称为免疫检查点。这些免疫检查点是机体保护自身组织不受破坏和免疫耐受的重要调控机制。

在所有的免疫调控靶点中，PD1/PD-L1信号通路显示出巨大的临床治疗应用潜力。PD-1是下调免疫应答的I型跨膜蛋白，主要表达于外周组织的记忆T细胞，也少量表达于B细胞、活化的单核细胞、树突状细胞和自然杀伤(NK)细胞(Keir ME et al.，(2008)Annu RevImmunol.26：677-704；Ishida Y et al.，(1992)EMBOJ.11(11)：3887-3895)。PD-L1和PD-L2是PD-1的两个配体。PD-L1为I型跨膜蛋白，由2个胞外结构域(即，IgV-和IgC-样结构域)、跨膜结构域和胞内结构域构成，其中胞内结构域很短，作用未知。该蛋白组成性地表达于抗原提呈细胞、T细胞、B细胞、单核细胞和上皮细胞，且在促炎症细胞因子的存在下，很多细胞会上调PD-L1的表达(Keir ME et al.，(2008)同上；Chen J et al.，(2016)Ann Oncol.27(3)：409-416)。研究表明，PD-L1可以通过诱导IL-10而对T细胞产生抑制性作用(Dong H etal.，(1999)Nat Med.5(12)：1365-1369)。PD-L2的表达基本局限于抗原提呈细胞，且在树突状细胞和巨噬细胞等中可诱导表达。PD-1与其配体结合后，主要通过产生细胞因子如IFN-γ、TNF-α、和IL-2来抑制T细胞反应，以此保护正常组织不受免疫系统的攻击(Keir ME etal.，(2008)同上；Chen J et al.，(2016)同上)。同时，PD-1与其配体的结合也会抑制细胞存活因子的分泌以及抑制与效应细胞功能相关的转录因子的表达，影响T细胞的存活和分化，并抑制活化的B细胞和NK细胞的裂解活性(Terme M et al.，(2011)Cancer Res.71(16)：5393-5399；Fanoni D et al.，(2011)Immunol Lett.134(2)：157-160)。PD-1还高表达于调节性T细胞(Treg)，在与配体结合后促进Treg活化和增殖，进一步抑制免疫反应(Francisco LM et al.，(2009)JExp Med.206(13)：3015-3029)。

PD-1信号通路还被肿瘤细胞所利用，以帮助其逃避免疫系统的监视。具体而言，PD-1在大比例的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)表面高表达，而其配体，尤其是PD-L1，在多种肿瘤细胞上组成性地表达，包括黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肾癌等，或在炎性信号如IFN-γ下诱导表达(Dong H et al.，(2002)Nat Med.8(8)：793-800；Kim J et al.，(2005)Am JRespir Cell Mol Biol.33(3)：280-289；Lee SK et al.，(2005)J Dermatol Sci.40(2)：95-103)。此外，PD-L1也在肿瘤微环境中的髓细胞如巨噬细胞和树突状细胞上表达。研究表明，在肿瘤微环境中，PD-L1-PD-1的相互作用引起T细胞功能障碍和衰竭、以及IL-10的分泌，抑制CD8⁺ T细胞对肿瘤细胞的杀伤，促进肿瘤细胞的生长(Zou W，Chen L.(2008)NatRev Immunol.8(6)：467-477；Sun Z et al.，(2015)Cancer Res.75(8)：1635-1644)。肿瘤微环境中的Treg细胞也对效应免疫应答产生抑制效果(Francisco LM et al.，(2009)同上)。此外，研究还表明，PD-L1可以与CD80形成二聚体，削减CD80-CTLA相互作用，进一步抑制抗肿瘤免疫作用(Butte MJ et al.，(2007)Immunity.27(1)：111-122；Paterson AM etal.，(2011)J Immunol.187(3)：1097-1105)。

通过抗体阻断PD-1-PD-L1之间的相互作用，能够在多种类型的肿瘤中持续性诱导肿瘤消退，包括实体瘤和血液瘤。目前，有超过1000多个不同的靶向PD-1/PD-L1的临床实验在进行中，适应症包含黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、神经内分泌癌以及微卫星高度不稳定和错配修复缺陷的实体瘤等，以及套细胞淋巴瘤、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、和滤泡型淋巴瘤等(Akinleye A，Rasool Z.(2019)J HematolOncol.12(1)：92；Chong Sun et.al.(2018)Immunity20；48(3)：434-452)。美国FDA已批准用于癌症治疗的PD-L1抗体有三种，即Atezolizumab、Durvalumab、和Avelumab。其中，Atezolizumab是一种全人源化IgG1抗体，可阻断PD-L1与PD-1以及CD80的结合，且Fc区设计成不引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，以防止对PD-L1⁺ T细胞的影响。临床数据表明Atezolizumab对多种实体瘤和血液瘤有效力，包括非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、胃癌、头颈鳞状细胞癌、和泌尿道上皮细胞癌。类似地，全人源抗体Durvalumab也可阻断PD-L1与PD-1以及CD80的结合，且设计成防止对PD-L1⁺ T细胞的ADCC，且在临床上显示出对于泌尿上皮癌、非小细胞肺癌等的效力。Avelumab为全人源IgG1抗体，可阻断PD-L1与PD-1以及CD80的相互作用，其Fc区未做改造，可诱导对肿瘤的ADCC，且显示出对于Merkel细胞癌、泌尿上皮癌、三阴乳癌等的较好的临床效果。其他的处于临床试验中的PD-L1抗体包括Envafolimab、BMS-936559等。PD-L1抗体还与其他抗体、靶向药物、或化疗药物联用，来更好地抑制肿瘤生长。

然而，尽管PD-1/PD-L1的靶向治疗具有广谱的肿瘤抑制效果，临床上只对少部分人显示出效果。而且，更加需要注意的是，部分人在开始的时候有非常不错的治疗效果，但是一段时间后会产生耐药效应。找到部分反应和产生耐药的原因，然后发展新的治疗方式和治疗手段，对癌症治疗来说至关重要。对于更多具有不同特性和药效特点的PD-L1抗体，例如，具备不同亲和力、阻断活性、甚至不同结合表位的PD-L1抗体，在癌症治疗领域仍存在巨大的需求。

此外，在病毒、细菌和寄生虫的急性或慢性感染方面，PD-1/PD-L1阻断也在临床和临床前研究中表现出良好的效果(Jubel JM et al.，(2020)Front Immunol.11：487)。例如，在乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)的慢性感染后，PD-L1抗体处理增加IFN-γ、IL-2和TNFα的分泌，T细胞耗竭情况得到缓解，病毒血症得到控制。在感染性疾病的治疗方面，也需要更多的PD-L1抗体。

发明内容

本申请提供一种分离的单克隆抗体，例如，与PD-L1(例如，人PD-L1和猴PD-L1)结合的鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体，其与现有技术抗体例如Atezolizumab相比，具有相当或更佳的人/猴PD-L1结合活性、相当的PD-L1-PD-1阻断活性、相当或更强的T细胞激活能力、以及相当或更好的体内抗肿瘤活性。

本申请的抗体可以用于多种应用，包括检测PD-L1蛋白、PD-L1相关疾病的治疗等。

因此，在一个方面，本申请涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与PD-L1结合，可以含有i)重链可变区，该重链可变区含有VH CDR1区、VHCDR2区和VH CDR3区，其中，VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区可以分别包含如(1)SEQ IDNOs：1、2和3；或(2)SEQ ID NOs：7、8和9所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区含有VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中，VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含如(1)SEQ ID NOs：4、5和6；或(2)SEQ ID NOs：10、11和12所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1区、VH CDR2区、VH CDR3区、VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含如(1)SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、和6；或(2)SEQ ID NOs：7、8、9、10、11和12所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与SEQ IDNOs：13-23中任一具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与SEQ IDNOs：24-32中任一具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区可以分别包含如(1)SEQ ID NOs：13和24；(2)SEQ ID NOs：14和25；(3)SEQ ID NOs：14和26；(4)SEQ ID NOs：14和27；(5)SEQ ID NOs：15和25；(6)SEQ ID NOs：15和26；(7)SEQ ID NOs：15和27；(8)SEQ ID NOs：16和25；(9)SEQ ID NOs：16和26；(10)SEQ ID NOs：16和27；(11)SEQID NOs：17和25；(12)SEQ ID NOs：17和26；(13)SEQ ID NOs：17和27；(14)SEQ ID NOs：18和28；(15)SEQ ID NOs：19和29所示的氨基酸序列；(16)SEQ ID NOs：20和30；(17)SEQ IDNOs：20和31；(18)SEQ ID NOs：20和32；(19)SEQ ID NOs：21和30；(20)SEQ ID NOs：21和31；(21)SEQ ID NOs：21和32；(22)SEQ ID NOs∶22和30；(23)SEQ ID NOs：22和31；(24)SEQ IDNOs：22和32；(25)SEQ ID NOs：23和30；(26)SEQ ID NOs：23和31；或(27)SEQ ID NOs：23和32所示的氨基酸序列；或与上述具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。其中，重链恒定区可以为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。进一步地，可以对重链恒定区进行工程化改造，可选地，例如减弱或消除对于PD-L1⁺细胞的ADCC作用，例如改造成具有SEQ ID NO：33氨基酸序列的人IgG1(N297A)恒定区。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如具有SEQ ID NO：34氨基酸序列的人κ恒定区。其中，重链恒定区的N端与重链可变区的C端连接，轻链恒定区的N端与轻链可变区的C端连接。

本申请的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本申请的抗体可以是例如IgG4、IgG1、或IgG2的全长抗体。在一些实施方式中，本申请的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或F(ab′)₂片段。

本申请的抗体或其抗原结合部分为拮抗型PD-L1抗体及其抗原结合部分，可以与人/猴PD-L1结合，并能够阻断PD-L1-PD-1结合，促进T细胞激活，并具有体内抗肿瘤效果。可选地，本申请的抗体减弱或消除对于PD-L1⁺细胞的ADCC。

本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的免疫交联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素或抗癌剂相连接。本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本申请抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)或基因改造T细胞受体(TCR)的一部分。本申请还提供具有上述CAR和/或TCR的免疫细胞，包括T细胞、NK细胞等。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒承载。

本申请还包括编码本申请抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本申请还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备PD-L1抗体的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。

本申请还提供药物组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、免疫交联物、双特异性分子、免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

一个方面，本申请提供在受试者中增强免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物。增强免疫应答包括激活T细胞。

一个方面，本申请提供在受试者中治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。癌症可以是实体瘤或血液瘤，包括但不限于，黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、神经内分泌癌、套细胞淋巴瘤、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、和滤泡型淋巴瘤。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本申请抗体或其抗原结合部分一起施用，例如PD-1抗体、STAT3抗体和ROR1抗体、TIM-3抗体和/或CTLA-4抗体。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂。本申请的抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

在一个方面，本申请提供在受试者中治疗或减缓感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或其抗原结合部分。感染性疾病可以是由病毒、细菌、真菌、支原体等引起的慢性感染，例如由乙肝病毒、丙肝病毒、HIV和SIV引起的慢性感染。在一些实施方式中，至少一种其他抗感染剂可以与本申请抗体或其抗原结合部分一起施用，例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗支原体剂等。

基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由。。。组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。

附图说明

图1示出小鼠PD-L1抗体在抗原递呈细胞(APC)诱导的T细胞激活中所起的作用。100μg/ml的PD-L1抗体，包括3C2和56E5，的处理增加激活后T细胞的IFN-γ分泌(A)，且这些抗体以剂量依赖方式增加T细胞的IFN-γ分泌(B)。

图2示出嵌合PD-L1抗体对HEK293A/人PD-L1(A)、HEK293A/猴PD-L1(B)以及HEK293A/小鼠PD-L1(C)的结合活性。

图3示出嵌合PD-L1抗体3C2和56E5阻断PD-L1与PD1的相互作用

图4示出嵌合PD-L1抗体3C2和56E5以剂量依赖方式增加经APC细胞诱导的T细胞的IFN-γ分泌。

图5示出人源化3C2抗体对HEK293A/人PD-L1(A)、HEK293A/猴PD-L1(B)和HEK293A/小鼠PD-L1(C)的结合活性。

图6示出人源化56E5抗体对HEK293A/人PD-L1(A)、HEK293A/猴PD-L1(B)和HEK293A/小鼠PD-L1(C)的结合活性。

图7示出人源化PD-L1抗体3C2和56E5以剂量依赖方式增加经APC细胞诱导的T细胞的IFN-γ分泌。

图8示出不同PD-L1抗体与56E5VH5VL4竞争结合的SPR曲线，第二相抗体分别为3C2VH4VL4(A)、56E5VH5VL4(B)、Atezolizumab(C)、Avelumab(D)、和Duralumab(E)。

图9示出不同PD-L1抗体与3C2VH4VL4竞争结合的SPR曲线，第二相抗体分别为3C2VH4VL4(A)、56E5VH5VL4(B)、Atezolizumab(C)、Avelumab(D)、和Duralumab(E)。

图10示出人源化PD-L1小鼠经人源化PD-L1抗体56E5VH5VL4、3C2VH6VL5、和Avelumab处理后的平均肿瘤体积(A)和平均肿瘤重量(B)。

具体实施方式

为更好理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“PD-L1”是指程序性死亡配体1。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人PD-L1特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的PD-L1蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人PD-L1蛋白特异的抗体可以完全地对人PD-L1蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的PD-L1蛋白交叉反应。

术语“人PD-L1”是指具有人氨基酸序列的PD-L1蛋白，例如具有GenBank登陆号为AAI13735.1的氨基酸序列的PD-L1蛋白(Strausberg R.L.et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)：16899-16903)，或由例如SEQ ID NO：35所示核苷酸编码的PD-L1蛋白。术语“猴PD-L1”是指具有猴氨基酸序列的PD-L1蛋白，例如具有NCBI登录号为XP_005581836.1的氨基酸序列的PD-L1蛋白，或由例如SEQ ID NO：36的核苷酸编码的PD-L1蛋白。术语“小鼠PD-L1”是指具有小鼠氨基酸PD-L1蛋白，例如具有GenBank登录号为AAH66841.1的氨基酸序列的PD-L1蛋白(Strausberg R.L.et al.，(2002)同上)，或由例如SEQ ID NO：37的核苷酸编码的PD-L1蛋白。

本文中的术语“抗体”意在包括IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即C_H1、C_H2和C_H3。各轻链由轻链可变区(简称V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C_L构成。V_H和V_L区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各V_H和V_L由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，PD-L1蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂V_L和V_H构成的Fv片段；(v)由V_H构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中V_L和V_H区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与PD-L1蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合PD-L1蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人PD-L1蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的PD-L1蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

术语“鼠源抗体”是指可变区骨架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。

术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。

术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。

术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。

在本文中，“特异结合人PD-L1”的抗体是指与人PD-L1(还可能是其他非人物种的PD-L1)结合但是基本不与非PD-L1蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人PD-L1蛋白，即K_D值为5.0x10^-8M以下，更优选为1.0x10^-9M以下。

术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的K_D为1.0x10^-6M以上，更优选1.0x10^-5M以上，更优选1.0x10^-4M以上、1.0x10^-3M以上，更优选1.0x10^-2M以上。

术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的K_D为1.0x10^-6M以下，优选5.0x10^-8M以下，更优选1.0x10^-8M以下、5.0x10^-9M以下，更优选1.0x10^-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指K_D为10^-6M以下，优选10^-7M以下，更优选10^-8M以下。

术语“EC₅₀”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体，例如PD-L1抗体，结合的靶细胞例如自身免疫疾病中的免疫细胞裂解。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本申请抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。

术语“拮抗型PD-L1抗体”是指在能够阻断或抑制由PD-L1与其配体如PD-1相互作用引发的PD-L1信号通路的PD-L1抗体。拮抗型PD-L1抗体可以促进T细胞激活，细胞因子释放，增强免疫效应，可应用于癌症和慢性感染等治疗中。

本申请的多个方面在以下更加具体地加以描述。

PD-L1抗体具有对人PD-L1的结合特异性以及其他有益的功能特征

本申请的抗体以可以与人和猴PD-L1特异性结合，且结合活性与现有技术抗体例如Atezolizumab相当或更佳。本申请的抗体还可以阻断PD-L1-PD-1结合或相互作用，且阻断活性与现有技术抗体例如Atezolizumab相当或更好。

更重要的是，本申请的抗体具有与现有技术抗体例如Atezolizumab相当或更强的T细胞激活能力，且体内抗肿瘤活性与现有技术如Atezolizumab相当，甚至更好。

优选的本申请抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。

PD-L1单克降抗体

本申请的示例性抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。

本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区CDR和轻链可变区CDR通过Kabat编号系统确定，且CDR区氨基酸序列的SEQ ID NO列于表1中。领域内熟知，重链可变区和轻链可变区CDR可以通过例如Chothia、IMGT、AbM或Contact编号系统/方法确定。

本申请中示例性抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区序列的SEQ ID NO也列于以下表1中，一些抗体具有相同的V_H或V_L。

本申请抗体可以具有重链恒定区，例如可以是IgG1恒定区，例如包含如SEQ IDNO：33所示氨基酸序列的人IgG1恒定区。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如人κ恒定区，其可以包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列

与人PD-L1结合的其他PD-L1抗体的V_H和/或V_L序列(或CDR序列)可以与本申请抗体的V_H和/或V_L序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当V_H和V_L(或其中的CDR)混合并配对时，特定V_H/V_L配对中的V_H序列可以由结构近似的V_H序列取代。相似地，优选特定V_H/V_L配对中的V_L序列由结构近似的V_L序列取代。

因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：

(a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及

(b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一PD-L1抗体的V_L，其中该抗体特异结合人PD-L1。

在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：

(a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及

(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一PD-L1抗体的CDR，其中该抗体特异结合人PD-L1。

在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括PD-L1抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人PD-L1的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一PD-L1抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。

此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer etal.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashiet al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.90：4374-8(1993)；Polymenis andStoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献军通过引用的方式全部并入本文。

在另一实施方式中，本申请的抗体包含PD-L1抗体的重链可变区的CDR2以及至少PD-L1抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一PD-L1抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人PD-L1。优选这些抗体(a)竞争结合PD-L1；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请PD-L1抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含PD-L1抗体的轻链可变区CDR2，或者另一PD-L1抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体特异结合人PD-L1。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包括PD-L1抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一PD-L1抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体特异结合人PD-L1。

保守修饰

在另一实施方式中，本申请的抗体包含与本申请PD-L1抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；deWildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelleyand O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6 and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：

(a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

(b)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

(c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且

(e)该抗体特异结合人PD-L1。

本申请的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人PD-L1的高亲和力，以及可选的减弱或消除对于PD-L1表达细胞的ADCC作用。

在多个实施方式中，抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。

基因修饰的抗体

本申请的抗体可以以具备本申请PD-L1抗体的一个或多个V_H/V_L序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，V_H和/或V_L)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，骨架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。

在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmannet al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queenet al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的V_H和V_L CDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。

这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。

通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.，(1997))，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。

用于本申请抗体的优选骨架序列是结构上与本申请抗体所用的骨架序列相似的那些。V_H CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一类的可变区修饰是将V_H和/或V_L CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。

此外，在另一实施方式中，本申请提供分离的PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)V_H CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_H CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_L CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_L CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_L CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。

本申请的基因改造抗体包括在V_H和/或V_L的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些骨架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过将抗体骨架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。

另一类的骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。

此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。

在一个实施方式中，C_H1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变C_H1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。

在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的C_H2-C_H3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。

在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。

本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C₁-C₁₀)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。

抗体的物理特性

本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。

例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)JImmunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选PD-L1抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。

在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。

各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选PD-L1抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。

编码本申请抗体的核酸分子

在另一方面，本申请提供编码本申请抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。

优选的本申请核酸分子包括编码PD-L1单克隆抗体的V_H和V_L序列或CDR的那些。一旦获得了编码V_H和V_L的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_H或V_L的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。

编码V_H区的分离DNA可以通过可操作地连接V_H编码DNA与编码重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H区的DNA可以可操作地与仅编码重链C_H1恒定区的另一DNA分子连接。

编码V_L区的分离DNA可以通过可操作地连接V_L编码DNA与编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。

为创建scFv基因，编码V_H和V_L的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)₃的另一片段连接，从而V_H和V_L序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中V_H和V_L区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。

本申请单克隆抗体的制备

本申请的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。

制备本申请单克隆抗体的转染瘤的生成

本申请的抗体还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。

术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。

抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而V_H与载体中的C_H可操作地连接，V_L与载体中的C_L可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。

优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。

免疫交联物

本申请的抗体或其抗原结合部分可以与治疗剂交联，形成免疫交联物，例如抗体-药物交联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Git、Val-Lys、Lys、Git、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备。

双特异性分子

另一方面，本申请涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。

双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)₂构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，cited supra；Gao and Suresh，BioconjugateChemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)。

嵌合抗原受体

本申请还提供包含PD-L1单链抗体scFv的嵌合抗原受体，该scFv包含本申请中所述的重链和轻链CDR、或重链和轻链可变区。

PD-L1嵌合抗原受体可以包含(a)含有PD-L1 scFv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导结构域。

编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒

溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本发明的抗体与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本发明抗体的溶瘤病毒可以引入人体中。

药物组合物

在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的一种或多种抗体或其抗原结合部分、抗体或抗原结合部分编码载体、免疫交联物、免疫细胞、双特异抗体、和/或溶瘤病毒，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体、抗感染抗体、或免疫增强抗体，或者非抗体类抗肿瘤剂、抗感染剂、或免疫增强剂。本申请的药学组合物可以与例如另一抗癌剂、另一抗感染剂、或另一免疫增强剂联合使用。

药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。

优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。

药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。

与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分。

给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。

对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重。示例性的治疗方案涉及每周施用一次。本申请PD-L1的优选给药方案包括静脉内施用。

“治疗有效量”的本申请PD-L1抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。

药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。

在某些实施方式中，本申请的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawaet al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoeet al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

本申请的用途和方法

本申请的药物组合物具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症、和感染性疾病的治疗，或者更笼统地讲，用于癌症和感染性疾病患者的免疫增强。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长、减少或消除病原体。

考虑到本申请药物组合物的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本申请提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本申请的药物组合物，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本申请抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、神经内分泌癌、套细胞淋巴瘤、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、和滤泡型淋巴瘤，原发或转移的。此外，难治的或复发的恶性肿瘤可能可以用本申请的抗体抑制。

本申请的药物组合物可以用于减少或消除病原体，本申请提供治疗感染性疾病的方法，包括向该受试者施用本申请的药物组合物。感染性疾病可以是由病毒、细菌、真菌、支原体等引起的，例如由乙肝病毒、丙肝病毒、HIV或SIV引起的慢性感染。

本申请的这些和其他方法在以下进一步讨论。

联合疗法

本申请提供本申请药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效抑制受试者中的肿瘤生长。在一个实施方式中，本申请提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用PD-L1药物组合物以及一种或多种其他抗体，例如PD-1抗体和/或CTLA-4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在另一个方面，本申请提供癌症治疗方法，其中本申请的PD-L1药物组合物与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。其他可以与PD-L1药物组合物联合的疗法包括但不限于免疫原性剂施用、白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。

本申请还提供本申请药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效减少或消除受试者中的病原体，例如病毒、细菌、真菌、支原体。例如，本申请的药物组合物可以与抗感染剂联用，包括，但不限于，抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂和抗支原体剂等。

本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。

此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。

本申请还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。

实施例

实施例1稳定表达人、猴或小鼠PD-L1的HEK293A细胞株的构建

使用HEK293A细胞来构建稳定过表达人、猴或小鼠PD-L1的细胞系。简单而言，合成人、猴或小鼠PD-L1的cDNA序列(氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：35、36和37所示)，并经酶切克隆到pLV-EGFP(2A)-Puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)中。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-PD-L1与psPAX和pMD2.G质粒通过脂质体转染的方式转染到HEK293T细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与Lipofectamine 3000试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从HEK293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染HEK293A细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人、猴、或小鼠PD-L1的HEK293A细胞(分别为HEK293A/人PD-L1、HEK293A/猴PD-L1、HEK293A/小鼠PD-L1)。转染的HEK293A细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(Cat#：A11138-03，Gibco)的DMEM+10％FBS培养基中7天。人和猴PD-L1的表达使用市售的PD-L1抗体(PE-人PD-L1抗体，Biolegend，美国，Cat#：393607)通过流式分析仪经FACS分析。相似地，小鼠PD-L1的表达通过市售的小鼠PD-L1抗体(PE-小鼠PD-L1抗体，Biolegend，美国，Cat#：124307)经FACS确证。

实施例2制备产生小鼠抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞系

小鼠抗人PD-L1单克隆抗体通过杂交瘤融合技术获得，方案略做改动。

免疫

10只BALB/c小鼠(维通利华，中国)通过交叉注射重组人PD-L1(ECD)-hFc(义翘神州，中国，Cat#：10084-H02H)和重组猴PD-L1(ECD)-hFc(义翘神州，中国，Cat#：90251-C02H)进行免疫，具体免疫流程如表2所示。人PD-L1(ECD)-hFc蛋白和猴PD-L1(ECD)-hFc蛋白用等体积的完全Freund佐剂(Cat#：F5881-10*10ML，Sigma，美国)或不完全Freund佐剂(Cat#：F5506-6*10ML，Sigma，美国)或PBS超声乳化。

每次加强免疫后1周，从每只小鼠鼠尾取50μl血清，经ELISA检测滴度，具体使用重组人PD-L1(ECD)-his(Cat#：10084-H08H，义翘神州，中国)和猴PD-L1(ECD)-hFc(Cat#：90251-C02H，义翘神州，中国)进行结合测试。还通过使用实施例1中制备的过表达人、猴、小鼠PD-L1的HEK293A细胞经FACS进行滴度测试。

表2.免疫方案

基于最后一次加强之后的ELISA检测和FACS检测结果，将所有10只小鼠用于下一步的杂交瘤细胞系制备。

杂交瘤细胞系的制备

通过杂交瘤融合技术制备杂交瘤细胞系，方案略做修改。

在最后一次免疫加强4天后，处死小鼠，取脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基(Cat#：SH30243.01B，Hyclone，美国)清洗3次。处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(CRL-1581，ATCC，美国)与上述分离的小鼠脾细胞按1∶4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG(Cat#：P7181，Sigma，美国)融合的方式进行。融合后的细胞用DEME清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640(Cat#：C22400500CP，Gibco，美国)+10％FBS+1X HAT(Cat#：H0262，Sigma，美国))。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×10⁴细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO₂的潮湿细胞培养箱培养7天。之后，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1X HAT)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，经ELISA和FACS筛选杂交瘤细胞。

通过ELISA筛选杂交瘤细胞系

首先通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人PD-L1结合的杂交瘤克隆，在ELISA中使用人PD-L1(ECD)-his(Cat#：10084-H08H，义翘神州，中国)。对与人PD-L1结合的杂交瘤克隆进一步测试其与猴PD-L1结合的能力，在ELISA中使用猴PD-L1(ECD)-hFc(Cat#：90251-C02H，义翘神州，中国)作为检测抗原。

经上述ELISA，筛选出249个与人和猴PD-L1有特异结合力的杂交瘤细胞系。

通过FACS检测筛选杂交瘤细胞系

对筛选出的249个杂交瘤细胞系进一步测试其与HEK293A细胞上表达的人、猴或小鼠PD-L1的结合能力，使用实施例1中制备的HEK293A/人PD-L1细胞、HEK293A/猴PD-L1细胞、和HEK293A/小鼠PD-L1细胞。

基于上述FACS筛选，得到88个对HEK293A/人PD-L1细胞以及HEK293A/猴PD-L1细胞有高结合力的杂交瘤克隆。

产生PD-L1抗体的杂交瘤细胞的亚克降

对上述88个杂交瘤克隆进行2轮亚克隆。在亚克隆过程中，选出各克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的ELISA和FACS检测进行特征确证。经该步骤得到的亚克隆确定为单克隆杂交瘤细胞系。最终得到79个对人和猴PD-L1呈现出高结合力的亚克隆，每个亚克隆得自不同的原始母克隆。

实施例3小鼠PD-L1单克隆抗体的纯化

从实施例2得到的79个克隆中，挑取10个对人和猴PD-L1具有高结合力的克隆，进行进一步的研究。首先将10个所选克隆的单克隆小鼠抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在T175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清杂交瘤培养基(Gibco，美国，Cat#：12045-076)和1％HT补充液(Gibco，Cat#：11067-030)。细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养10天。收集培养物，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#：17040501，GE，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH 7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。

通过使用κ和λ-小鼠快速分型试剂盒(Thermal，美国，Cat#：26179)和小鼠单克隆抗体分型试剂(Sigma，美国，Cat#：IS02-1KT)来确定纯化抗体的亚型，检测步骤与试剂盒说明书中的一致。

大部分克隆，包括3C2和56E5，产生IgG1/κ抗体，而其他部分抗体产生IgG2a/κ或者IgG2b/κ抗体。克隆3C2和56E5的表达滴度分别为6.3和7.8mg/L。

实施例4小鼠PD-L1单克降抗体与HEK293A细胞表达的人和猴PD-L1结合

为确定PD-L1抗体是否与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠PD-L1结合，分别使用实施例1构建的稳定过表达人、猴或小鼠PD-L1的HEK293A细胞进行FACS细胞结合检测。简单而言，将100μl培养基中的10⁵个HEK293A细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的PD-L1抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。

表3.小鼠PD-L1抗体与人、猴以及小鼠PD-L1的结合亲和力

数据表明，所有小鼠PD-L1单克隆抗体均对人以及猴PD-L1表现出高结合力，但不与小鼠PD-L1结合。两种代表性抗体的结合力的EC₅₀总结在表3中。

实施例5抗原表位竞争

通过竞争ELISA的方法检测抗体之间的抗原结合表位竞争。简单而言，96孔ELISA检测板用100μl 0.5μg/ml的PD-L1(ECD)-His(义翘神州，中国，Cat#：10084-H08H)4度包被过夜。这些孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2小时。Atezolizumab抗体(按照专利WO2020226986中的氨基酸序列合成表达，恒定区为IgG1(N297A)/κ)、avelumab抗体(按照专利WO2013079174A1中的氨基酸序列合成表达，恒定区为IgG1/κ)、durvalumab抗体(按照专利US20190276543A1中的氨基酸序列合成表达，恒定区为IgG1(L234F、L235E、P331S)/κ)或者Hel抗体(LifeTein，美国，Cat#：LT12031)稀释到5μg/ml，分别取100μl加入孔中室温孵育1小时。板用PBST清洗3遍，加入100μl 1μg/ml纯化的本申请抗体，室温孵育1小时。ELISA板用PBST洗3遍后加入20000倍稀释的抗小鼠Fc-HRP(Cat#：A9309-1MC，Simga，美国)，室温孵育1小时。继续用PBST洗液洗3遍后，用新鲜配制的Ultra-TMB(Huzhou Yingchuang，中国，Cat#：TMB-S-003)室温显色5分钟，并用酶标仪(Thermo Multiscan FC)在450nm进行读值。

10种抗体中的9种，包括3C2抗体，与atezolizumab、avelumab和durvalumab不存在抗原表位竞争，表明这些抗体与上述几种抗体结合不同的抗原表位。56E5，与atezolizumab、avelumab和durvalumab存在抗原表位竞争，表明该抗体与上述抗体结合相同或者相似的抗原表位。

实施例6小鼠PD-L1抗体抑制人PD-L1-PD-1相互作用

众所周知，PD-1是PD-L1的配体。使用实施例1制备的稳定过表达人PD-L1的HEK293A细胞，经FACS进行阻断检测。简单而言，将100μl培养基中的10⁵个HEK293A/人PD-L1细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的PD-L1抗体。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍。之后，加入100μl 200μg/ml PD1-hFc融合蛋白(义翘神州，中国，Cat#：10377-H02H)4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍，加入500倍稀释的PE-山羊抗人IgG(Cat#：PAI-86078，Thermofisher，美国)。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍，使用FACS仪(BD)检测细胞荧光度。

表4.小鼠PD-L1抗体对PD-L1-PD-L1相互作用的阻断力

抗体	<![CDATA[VISG-3阻断检测EC<sub>50</sub>(M/L)]]>
		Atezolizumab	1.13E-11
3C2	1.47E-11
		56E5	1.00E-11

数据示出，仅有两种抗体无法阻断PD-L1-PD-1之间的相互作用。其他8个抗体，包括3C2和56E5，都能显著地阻断PD-1-PD-L1的相互作用，两种代表性抗体的EC₅₀值总结在表4中。

实施例7小鼠PD-L1抗体促进T细胞激活

小鼠PD-L1抗体对APC介导的T细胞激活的作用通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测进行研究。

简单而言，通过梯度密度离心收集健康人供体血样中的PBMC，重悬于RPMI1640培养基中。PBMC在37℃孵育箱中培养2小时，收集贴壁细胞，即得到分离的单核细胞。单核细胞在补充有100ng/ml重组人GM-CSF(Cat#：7954-GM，R&D，美国)、100ng/ml重组人IL-4(Cat#：6507-IL，R&D，美国)和10％FBS的RPMI1640培养基中培养。三天后，将一半的培养基替换为新鲜培养基。在培养的第6天，将培养基替换为含有100ng/ml重组人GM-CSF、100ng/ml重组人IL-4、10ng/ml rhTNF-α(Cat#：210-TA-100，R&D，US)、1000U/ml rhIL-6(Cat#：7270-IL-025，R&D，US)、1μg/ml PGE2(Cat#363-24-6，TOCRIS，US)和10ng/mlIL-1β(Cat#：210-LB-025，R&D，US)的培养基。细胞再孵育2天。之后，通过梯度密度离心收集另一健康人供体血样中的PBMC，重悬于RPMI1640培养基中。使用Invitrogen Dynabeads不接触人CD4+ T细胞分离试剂盒(Cat#：11346D，Thermal Fisher Scientific，美国)从PBMC中分离出CD4+ T细胞。在96孔U形底检测板中，将来自第一供体的树突细胞和来自第二供体的CD4+ T细胞以2.5×10⁴细胞/孔和5×10⁴细胞/孔的密度进行铺板，培养基总体积为150μl。向孔中加入50μl PD-L1抗体(0.1-10μg/ml)、或对照抗体Hel(Cat#：LT12031，LifeTein，美国)，板再孵育72小时。使用制造商的方法步骤，经ELISA(Cat#：SIF50，R&D，美国)确定IFN-γ浓度。实验设三个重复。

如图1中A所示，在用克隆3C2和56E5的小鼠PD-L1抗体处理的孔中，检测到最高量的IFN-γ。且相对于Hel对照，这些抗体增加T细胞分泌IFN-γ，且为剂量依赖的方式(图1，B)。

实施例8嵌合PD-L1抗体的表达和纯化

选取3C2和56E5进行进一步的研究。首先通过PCR方法对这个抗体的杂交瘤细胞进行重链/轻链可变区序列的克隆，使用文献中提及的引物(Juste et al.，(2006)AnalBiochem.349(1)：159-161)，并测序。序列总结在表1和表8中。通过将编码可变区和人IgG1(N297A)/κ恒定区(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：33和34)的序列插入到pCDNA3.1(Invitrogen，美国)的限制性酶切位点XhoI/BamHI之间来构建表达载体。

将上述获得的表达载体PEI转染HEK-293F细胞(Cobioer，中国)。具体而言，HEK-293F细胞在Free Style^TM 293表达培养基(Cat#：12338-018，Gibco)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)转染的方式将各表达载体转染至细胞，DNA与PEI的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入DNA的量是1.5μg。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，按照实施例3的方法步骤纯化单克隆抗体。

实施例9嵌合PD-L1单克隆抗体与人或猴PD-L1结合

通过ELISA方法检测嵌合PD-L1抗体对人PD-L1、猴PD-L1和小鼠PD-L1的结合力。简而言之，ELISA板用100μl 500ng/ml人PD-L1 (ECD)-his(Cat#：10084-H08H，义翘神州，中国)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的PD-L1抗体(最高浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。ELISA板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗人IgG-HRP(Cat#：31410，Thermal，美国)室温孵育1小时。ELISA板用新鲜配制的Ultra-TMB(BD，美国，Cat#no.：555214)室温显色5分钟。之后用SpectraMaxR i3X(Molecular Devies，美国)在450nm读值。

PD-L1嵌合抗体对猴或小鼠PD-L1的物种交叉反应性进一步通过直接ELISA进行测试。具体地，将100μl 500ng/ml猴PD-L1(ECD)-his(Cat#：90251-C08H，义翘神州，中国)或小鼠PD-L1(ECD)-his(Cat#：50010-M08H，义翘神州，中国)包被在96孔ELISA板中，并与100μl梯度稀释的PD-L1抗体(最高浓度40μg/ml)共同孵育。之后使用山羊抗人IgG-HRP(Cat#：31410，Thermal，美国)室温孵育1小时。ELISA板用新鲜配制的Ultra-TMB(BD，美国，Cat#no.：555214)室温显色5分钟。之后用SpectraMaxRi3X(Molecular Devies，美国)在450nm读值。PD-L1抗体Atezolizumab用作参照。PD-L1嵌合抗体的结合力的EC₅₀总结在表5中。数据表明，所有嵌合抗体均对人以及猴PD-L1表现出高结合力，但不与小鼠PD-L1结合。而且，3C2和56E5与人以及猴PD-L1结合力与参照抗体相当，或略好于参照抗体。

表5.嵌合PD-L1抗体与人、猴以及小鼠PD-L1的结合亲和力

此外，根据实施例4的方法步骤，对获得的嵌合抗体检测它们与实施例1制备的HEK293A/人PD-L1细胞、HEK293A/猴PD-L1细胞以及HEK293A/小鼠PD-L1细胞的结合力。结果显示在图2中。

如图2所示，嵌合抗体对人PD-L1(图2，A)和猴PD-L1(图2，B)均有高结合力，不结合小鼠PD-L1(图2，C)。

实施例10嵌合PD-L1单克隆抗体阻断PD-L1-PD-1相互作用

进一步检测嵌合抗体对PD-L1蛋白与PD-1蛋白之间相互作用的阻断效果。采用实施例1中制备的HEK293A/人PD-L1细胞系，采取实施例6中的实验方法进行检测。结果如图3所示，两个嵌合抗体都能显著地阻断PD-L1蛋白和PD-1蛋白之间的相互作用。56E5抗体显示出最强的阻断效果，好于Atezolizumab。

实施例11嵌合PD-L1单克隆抗体促进T细胞激活。

进一步检测PD-L1嵌合抗体对T细胞的激活效果，采取实施例7中的实验方法。IFN-γ的分泌通过商品化检测试剂盒(R&D，US，Cat#：STA00C)按照说明书进行操作检测。

实验结果如图4所示，所有检测的抗体都能促进T细胞的活性，增加IFN-γ的分泌。抗体56E5在0.01μg/mL的低剂量下，与Atezolizumab相比有更强的T细胞激活效应。3C2在各剂量下与Atezolizumab相比均有更强的T细胞激活效应。

实施例12 PD-L1抗体的人源化改造

基于上述相关的功能试验，对3C2和56E5进行人源化改造和进一步研究。小鼠抗体的人源化改造通过互补决定区(CDR)移植法(美国专利5,225,539)进行，具体方法详见下文。

为选出鼠源抗体3C2和56E5的人源化受体框架，将3C2和56E5的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与3C2和56E5同源度最高的人种系IGVH和IGVK作为人源化改造的框架。对于3C2，所选择的重链种系受体序列是人IGHV1-46*01，所选择的轻链种系受体序列是人IGKV1-33*01。对于56E5，所选择的重链种系受体序列是人IGHV4-31*02，所选择的轻链种系受体序列是人IGKV4-1*01。

对3C2和56E5的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。

表6.人源化突变氨基酸总结

基于上述的结构建模，3C2重链鉴定出10个潜在的回复突变(M48I、M70L、R72V、R87T、R38K、A40R、T28S、Y95F、R67K、V68A)，轻链鉴定出7个潜在的回复突变(K45R、Y49S、F71Y、T22S、K42N、T85V、F73L)。56E5重链鉴定出10个潜在的回复突变(S30T、W47Y、I48M、S70T、R87T、K43N、G44K、V71R、V67I、T68S)，轻链鉴定出4个潜在的回复突变(121M、R18K、A19V、V89L)。

如表1和表6所示，对于3C2，共设计出5个人源化重链可变区和4个人源化轻链可变区，共得到13个人源化抗体。对于56E5，共设计出4个人源化重链可变区和3个人源化轻链可变区，共得到12个人源化抗体。所有序列信息总结在表1、表6和表8中。

合成编码人源化重链可变区加人IgG1(N297A)恒定区的序列、以及编码轻链可变区加人κ恒定区的序列，重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：33和34，并分别利用EcoR I/Xho I和Cla I/Hind III限制性酶切位点克隆到GS表达载体(Invitrogen，美国)中。所有表达构建均经测序证实。用表达载体转染EXPiCHO表达系统(Invitrogen，美国)，并瞬时表达25个人源化PD-L1抗体，方法步骤如实施例8所述。人源化抗体按照实施例3所述进行纯化。

实施例13人源化PD-L1抗体的PD-L1结合/亲和力鉴定

根据实施例4的方法步骤，进一步通过FACS检测人源化抗体与实施例1制备的HEK293A/人PD-L1细胞、HEK293A/猴PD-L1细胞以及HEK293A/小鼠PD-L1细胞的结合力。结果分别显示在图5和图6。

还通过BIAcore^TM 8K(GE Life Sciences，美国)来定量测定嵌合或人源化PD-L1抗体对人和猴PD-L1的结合亲和力。具体地，将100-200RU(反应单位)的人PD-L1(ECD)-his蛋白(Cat#：10084-H08H，义翘神州，中国)或猴PD-L1(ECD)-his蛋白(Cat#：90251-C08H，义翘神州，中国)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR-1005-30，GE Life Sciences，美国)上，随后用1M氨基乙醇封闭芯片未反应基团。梯度稀释(浓度从0.3μM到10μM)的抗体注入到SPR反应液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE Life Sciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU。结合速率(k_a)和解离速率(k_d)使用BIA评估软件中的1∶1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数K_D通过k_d/k_a计算得到。通过BIAcore^TM测量的嵌合或人源化抗体的结合亲和力显示在表7中。

表7.PD-L1抗体对人/猴PD-L1的结合亲和力

如图5和图6所示，人源化PD-L1抗体与人和猴PD-L1都有很强的亲和力，其结合力与各自母本相当。

如表7所示，人源化3C2和56E5抗体与Atezolizumab相比有更好或者相当的人PD-L1亲和力。

实施例14人源化PD-L1单克隆抗体促进T细胞激活。

进一步检测PD-L1人源化单克隆抗体对T细胞的激活效果，采取实施例7中的实验方法。IFN-γ的分泌通过商品化检测试剂盒(R&D，US，Cat#：STA00C)按照说明书进行操作检测。

实验结果如图7所示，所有检测的人源化抗体都能剂量依赖地促进T细胞的活性，增加IFN-γ的分泌。其中，抗体56E5VH5VL4和3C2VH4VL4具备最好的T细胞激活效应。

实施例15人源化PD-L1单克隆抗体的表位鉴定

为了进一步确定人源化抗体的表位信息，进行了一个竞争性SPR的生物学试验检测。简而言之，1μg/ml的人PD-L1(ECD)-his蛋白(义翘神州，中国，Cat#：10084-H08H)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR-1005-30，GE Life Sciences，美国)上，随后用1M氨基乙醇封闭芯片未反应基团。5μg/ml的56E5VH5VL4或者3C2VH4VL4抗体注入到SPR反应液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE Life Sciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。随后继续注入第二个PD-L1抗体(56E5VH5VL4、3C2VH4VL4、atezolizumab、avelumab或者durvalumab)，浓度为5μg/ml，速度控制在30μL/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU，并使用BIA评估软件中的1∶1配对模型的公式进行模拟计算。

实验结果如图8和图9所示，56E5VH5VL4与atezolizumab、avelumab或durvalumab不能同时结合在同一个PD-L1分子上，表明这些抗体具有类似或者相同的结合表位，而56E5VH5VL4与3C2VH4VL4可以结合在同一个PD-L1蛋白分子上，表明该两个抗体具有完全不同的结合表位。与之一致的是，3C2VH4VL4与56E5VH5VL4、atezolizumab、avelumab和durvalumab都能同时结合在同一个PD-L1分子上，表明3C2VH4VL4与上述抗体具有完全不同的结合表位，是一个全新表位的抗体。

实施例16人源化抗体有体内抗肿瘤效果

对抗体56E5VH5VL4和3C2VH6VL5的体内抗肿瘤效果进行研究，该抗体具有人IgG1(N297A)/κ恒定区(SEQ ID NOs：33和34)，所使用的动物模型通过对PD-L1靶点人源化的转基因小鼠(GemPharmatechCo.Ltd，中国)植入MC38小鼠肠腺癌而建立。小鼠在第0天在侧腹部皮下注射1×10⁶ MC38细胞，随机分成7组，每组8只。小鼠在第0、4、7、11、14和18天腹腔注射56E5VH5VL4(10mg/kg)、3C2VH6VL5(10mg/kg)、Avelumab(10mg/kg，按照专利WO2013079174A1中的氨基酸序列合成表达，恒定区为IgG1/κ)或者PBS。

随时间追踪肿瘤大小和小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤的长边(D)和短边(d)，并通过公式TV＝0.5 x D x d²计算肿瘤体积。在抗体组肿瘤达到3.5cm³前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。

如图10所示，所有PD-L1抗体均能显著抑制人源化PD-L1小鼠中肿瘤的生长，且抗体56E5VH5VL4和3C2VH6VL5的体内抗肿瘤效果优于Avelumab。

本申请中提及的序列总结在表8中。

表8.序列

尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。

序列表

<110> 北京天广实生物技术股份有限公司

北京华放天实生物制药有限责任公司

<120> 结合PD-L1的抗体及其用途

<130> 55556 00054

<160> 37

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化3C2抗体的VH-CDR1

<400> 1

Asp Tyr His Val Asn

1               5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化3C2抗体的VH-CDR2

<400> 2

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化3C2抗体的VH-CDR3

<400> 3

Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr

1               5                   10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化3C2抗体的VL-CDR1

<400> 4

Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp Leu Ala

1               5                   10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化3C2抗体的VL-CDR2

<400> 5

Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr

1               5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化3C2抗体的VL-CDR3

<400> 6

Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe Thr

1               5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化56E5抗体的VH-CDR1

<400> 7

Ser Asp Tyr Trp Asn

1               5

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化56E5抗体的VH-CDR2

<400> 8

Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1               5                   10                  15

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化56E5抗体的VH-CDR3

<400> 9

Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr

1               5                   10

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化56E5抗体的VL-CDR1

<400> 10

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu

1               5                   10                  15

Thr

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化56E5抗体的L-CDR2

<400> 11

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1               5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化56E5抗体的VL-CDR3

<400> 12

Gln Asn Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr

1               5

<210> 13

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合3C2抗体的VH

<400> 13

Gln Val Gln Leu Asn Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Ala Gly Thr

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Leu Ser Phe Thr Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Ile Met Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 14

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH2VL2、3C2-VH2VL3、和3C2-VH2VL4的VH

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

His Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 15

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH3VL2、3C2-VH3VL3、和3C2-VH3VL4的VH

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 16

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH4VL2、3C2-VH4VL3、和3C2-VH4VL4的VH

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH5VL2、3C2-VH5VL3、和3C2-VH5VL4的VH

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

His Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH6VL5的VH

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

            20                  25                  30

His Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Thr Asp Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 19

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合56E5抗体的VH

<400> 19

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

            20                  25                  30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

        35                  40                  45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115

<210> 20

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体56E5-VH2VL2、56E5-VH2VL3、和56E5-VH2VL4的VH

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp

            20                  25                  30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met

        35                  40                  45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体56E5-VH3VL2、56E5-VH3VL3和56E5-VH3VL4的VH

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp

            20                  25                  30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

        35                  40                  45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115

<210> 22

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体56E5-VH4VL2、56E5-VH4VL3、和56E5-VH4VL4的VH

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp

            20                  25                  30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

        35                  40                  45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体56E5-VH5VL2、56E5-VH5VL3、和56E5-VH5VL4的VH

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp

            20                  25                  30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

        35                  40                  45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Tyr Arg Asp Trp Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合3C2抗体的VL

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gly Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH2VL2、3C2-VH3VL2、3C2-VH4VL2和3C2-VH5VL2的VL

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH2VL3、3C2-VH3VL3、3C2-VH4VL3和3C2-VH5VL3的VL

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH2VL4、3C2-VH3VL4、3C2-VH4VL4和3C2-VH5VL4的VL

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体3C2-VH6VL5的VL

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Arg Ile Asn Asn Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Ile Pro Phe

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合56E5抗体的VL

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

            20                  25                  30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

                85                  90                  95

Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

            100                 105                 110

Lys

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体56E5-VH2VL2、56E5-VH3VL2、56E5-VH4VL2和56E5-VH5VL2的VL

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

            20                  25                  30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

                85                  90                  95

Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

            100                 105                 110

Lys

<210> 31

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体56E5-VH2VL3、56E5-VH3VL3、56E5-VH4VL3和56E5-VH5VL3的VL

<400> 31

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

            20                  25                  30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

                85                  90                  95

Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

            100                 105                 110

Lys

<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体56E5-VH2VL4、56E5-VH3VL4、56E5-VH4VL4和56E5-VH5VL4的VL

<400> 32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ile Ser

            20                  25                  30

Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

                85                  90                  95

Asp Phe Gly Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

            100                 105                 110

Lys

<210> 33

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1恒定区（N297A）

<400> 33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

        35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人κ恒定区

<400> 34

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1               5                   10                  15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

            20                  25                  30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

        35                  40                  45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

    50                  55                  60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65                  70                  75                  80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

                85                  90                  95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

            100                 105

<210> 35

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 35

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1               5                   10                  15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

            20                  25                  30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

        35                  40                  45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

    50                  55                  60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65                  70                  75                  80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

                85                  90                  95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

            100                 105                 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

        115                 120                 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

    130                 135                 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145                 150                 155                 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

                165                 170                 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

            180                 185                 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

        195                 200                 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

    210                 215                 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225                 230                 235                 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

                245                 250                 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

            260                 265                 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

        275                 280                 285

Glu Thr

    290

<210> 36

<211> 290

<212> PRT

<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）

<400> 36

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Thr Ile Tyr Trp His Leu Leu

1               5                   10                  15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

            20                  25                  30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

        35                  40                  45

Asp Leu Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

    50                  55                  60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn

65                  70                  75                  80

Tyr Arg Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

                85                  90                  95

Ala Ala Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

            100                 105                 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

        115                 120                 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

    130                 135                 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145                 150                 155                 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

                165                 170                 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn

            180                 185                 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr

        195                 200                 205

Cys Ile Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

    210                 215                 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225                 230                 235                 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr

                245                 250                 255

Phe Ile Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Cys

            260                 265                 270

Gly Ile Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu

        275                 280                 285

Glu Thr

    290

<210> 37

<211> 290

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 37

Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu

1               5                   10                  15

Arg Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

            20                  25                  30

Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu

        35                  40                  45

Asp Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val

    50                  55                  60

Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn

65                  70                  75                  80

Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn

                85                  90                  95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

            100                 105                 110

Cys Cys Ile Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile Asn Gln Arg Ile Ser Val Asp

    130                 135                 140

Pro Ala Thr Ser Glu His Glu Leu Ile Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro

145                 150                 155                 160

Glu Ala Glu Val Ile Trp Thr Asn Ser Asp His Gln Pro Val Ser Gly

                165                 170                 175

Lys Arg Ser Val Thr Thr Ser Arg Thr Glu Gly Met Leu Leu Asn Val

            180                 185                 190

Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala Asn Asp Val Phe Tyr Cys

        195                 200                 205

Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn His Thr Ala Glu Leu Ile

    210                 215                 220

Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro Gln Asn Arg Thr His Trp

225                 230                 235                 240

Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr Val

                245                 250                 255

Leu Leu Phe Leu Arg Lys Gln Val Arg Met Leu Asp Val Glu Lys Cys

            260                 265                 270

Gly Val Glu Asp Thr Ser Ser Lys Asn Arg Asn Asp Thr Gln Phe Glu

        275                 280                 285

Glu Thr

    290

Claims (20)

1.一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其与PD-L1结合，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，该轻链可变区包含VLCDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中VH CDR1区、VH CDR2区、VH CDR3区、VL CDR1区、VLCDR2区和VL CDR3区的氨基酸序列分别如(1)SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、和6；或(2)SEQ IDNOs：7、8、9、10、11和12所示。

2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含SEQ ID NOs：13-23中任一所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NOs：24-32中任一所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：13和24；(2)SEQ ID NOs：14和25；(3)SEQ IDNOs：14和26；(4)SEQ ID NOs：14和27；(5)SEQ ID NOs：15和25；(6)SEQ ID NOs：15和26；(7)SEQ ID NOs：15和27；(8)SEQ ID NOs：16和25；(9)SEQ ID NOs：16和26；(10)SEQ ID NOs：16和27；(11)SEQ ID NOs：17和25；(12)SEQ ID NOs：17和26；(13)SEQ ID NOs：17和27；(14)SEQ ID NOs：18和28；(15)SEQ ID NOs：19和29所示的氨基酸序列；(16)SEQ ID NOs：20和30；(17)SEQ ID NOs：20和31；(18)SEQ ID NOs：20和32；(19)SEQ ID NOs：21和30；(20)SEQID NOs：21和31；(21)SEQ ID NOs：21和32；(22)SEQ ID NOs：22和30；(23)SEQ ID NOs：22和31；(24)SEQ ID NOs：22和32；(25)SEQ ID NOs：23和30；(26)SEQ ID NOs：23和31；或(27)SEQ ID NOs：23和32所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区为人IgG1或IgG4恒定区，所述轻链恒定区为人κ恒定区。

6.根据权利要求5所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人PD-L1结合；(b)与猴PD-L1结合；(c)不与小鼠PD-L1结合；(d)阻断PD-L1-PD-1相互作用；(e)促进T细胞激活；和/或(f)具有体内抗肿瘤效果。

8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为鼠源、嵌合或人源化抗体。

9.一种双特异性分子、免疫交联物、嵌合抗原受体、基因改造T细胞受体、或溶瘤病毒，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。

10.一种核酸，编码权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。

11.一种表达载体，包含权利要求10所述的核酸。

12.一种宿主细胞，包含权利要求11所述的表达载体。

13.一种药物组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13所述的组合物，还包含其他抗肿瘤剂、或抗感染剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述抗肿瘤剂为PD-1抗体、TIM-3抗体、STAT3抗体或ROR1抗体。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述抗感染剂为抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、或抗支原体剂。

17.权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、或权利要求14或15所述的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，其中肿瘤选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、神经内分泌癌、套细胞淋巴瘤、弥漫性大型B细胞淋巴瘤、和滤泡型淋巴瘤。

19.权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、或权利要求14、或16所述的组合物在制备治疗感染性疾病的药物中的用途，其中所述感染性疾病为病毒感染疾病、细菌感染疾病、真菌感染疾病或支原体感染疾病。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述病毒感染疾病为乙肝病毒、丙肝病毒、HIV或SIV引起的慢性感染。

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