CN111004327B

CN111004327B - 结合vista的抗体及其用途

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Publication number: CN111004327B
Application number: CN201911423791.8A
Authority: CN
Inventors: 胡稳奇; 李江美; 李锋
Original assignee: Beijing Huafang Tianshi Biopharmaceutical Co ltd; Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111004327A; WO2021027662A1; EP4013789A1; EP4013789A4; US10577424B1

Abstract

本发明提供一种与人VISTA特异结合的分离的单克隆抗体及其抗原结合部分。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本发明还提供包含该抗体或其抗原结合部分的双特异性分子和药物组合物，以及使用本发明抗体或其抗原结合部分的治疗方法。

Description

结合VISTA的抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种与人VISTA特异结合的抗体及其抗原结合部分，及其制备和用途，尤其是其在治疗与VISTA相关疾病中的用途，例如在治疗癌症和感染性疾病中的用途。

背景技术

作为B7家族的一员，T细胞活化V结构域Ig抑制蛋白(VISTA)，又称为PD-1H、DD1α、c10orf54、Gi24、Dies1和B7-H5，在T细胞应答的调控中起重要作用(Nowak E.C.et al.，(2017)Immunol Rev.276(1)：66-79)。VISTA是I类跨膜蛋白，在造血细胞、抗原提呈细胞和T细胞等表面表达，VISTA的胞外结构域与PD-L1存在一定的同源性(Lines J.L.et al.，(2014)Microenvironment and Immunology.74(7)：1924-32)。

当在抗原提呈细胞表面表达时，VISTA作为共抑制配体，与T细胞表面的共刺激受体结合，抑制T细胞应答。同时，另有研究称VISTA作为共抑制受体在CD4+T细胞表面表达(Flies D.B.et al.，(2014)J Clin Invest.124(5)：1966-1975)。在VISTA-Ig融合蛋白的存在下经抗CD3抗体刺激的CD4+CD8+T细胞增殖较慢，且生成的IFNγ和IL-2量减少(LinesJ.L.et al.，(2014)同上；WangL.et al.，(2011)JExpMed.208(3)：577-592)。从感染LP-BM5逆转录病毒的小鼠中分离出的髓样抑制细胞(MDSC)被证明以VISTA依赖的方式抑制B细胞增殖(Green K.A.et al.，(2015)J Virol.89(18)：9693-9698)。此外，在天然不表达VISTA的MCA105纤维肉瘤上进行VISTA过表达，会显著地增加肿瘤生长(Wang L.et al.，(2011)同上)。

VISTA在肿瘤微环境(TME)中高表达于例如单核髓样抑制细胞(M-MDSC)和调节性T细胞(Treg)，VISTA抗体单一疗法可以通过减少MDSC和肿瘤特异性Treg的数量来改变TME的抑制特性(Mercier I.L.et al.，(2014)Microenvironment and Immunology.74(7)：1933-44)。还有研究显示，在很多实体瘤模型(包括B16/OVA黑色素瘤、B16/BL6黑色素瘤、MB49膀胱癌、和PTEN/BRAF诱导性黑色素瘤，不论免疫原性状态或来源如何)中，阻断性VISTA单抗的单一疗法显著减少肿瘤生长(Mercier I.L.et al.，(2014)CancerRes.74(7)：1933-1944)。由于在动物模型中得到的鼓舞人心的结果，有两种VISTA抗体JNJ-61610588和JNJ-63723283(Janssen)在患有晚期实体瘤，例如非小细胞肺癌，的患者中开展了I/II期临床试验(NCT02671955：A study of safety，pharmacokinetics，pharmacodynamics of JNJ-61610588 in participants with advanced cancer；Calvo E.et al.，(2018)ClinicalOncology 36(5-suppl)：58)。在另一个正在开展的临床试验中，对晚期肿瘤和白血病患者施用对VISTA、PD-L1和PD-L2通路起拮抗作用的小分子CA-170(Curis)(NCT02812875：Astudy of CA-170(oral PD-L1，PD-L2 and VISTA checkpoint antagonist)in patientswith advanced tumors and lymphomas)。VISTA抗体与靶向CTLA-4、PD-1或其他免疫检查点负性调节物的药物的联合疗法也被大量讨论和研究(Deng J.et al.，(2016)JImmunother Cancer.4：86；Kondo Y.et al.，(2015)J Immunol.194(1suppl)：69.32；KondoY.et al.，(2016)Oral Oncol.57：54-60)。

领域内仍需要更多具有改善的药物特征的VISTA抗体。

发明内容

本发明提供一种分离的单克隆抗体，例如，与VISTA(例如，人VISTA和猴VISTA)结合的鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部分。

本发明的抗体或其抗原结合部分可以用于多种应用，包括检测VISTA蛋白，治疗或预防VISTA相关疾病，例如癌症和感染性疾病。

因此，在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，含有重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ ID NOs：1、2和3的氨基酸序列，或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分能够与VISTA结合。

在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其包含SEQ ID NOs：7-10中任一氨基酸序列，或包含任一与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分能够与VISTA结合。

在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ IDNOs：4、5和6的氨基酸序列，或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分能够与VISTA结合。

在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，其包含SEQ ID NOs：11-14中任一氨基酸序列，或包含任一与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分能够与VISTA结合。

在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，各包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区，轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含SEQ ID NOs：1、2、3、4、5和6的氨基酸序列，或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分能够与VISTA结合。

在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：7和11；(2)SEQ IDNOs：8和12；(3)SEQ ID NOs：9和13；(4)SEQ ID NOs：9和14；(5)SEQ ID NOs：10和13；或(6)SEQ ID NOs：10和14的氨基酸序列，或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分能够与VISTA结合。

在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，重链恒定区可以是例如人IgG1恒定区，具有例如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，与重链可变区的C端连接，轻链恒定区可以是例如人κ恒定区序列，具有例如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，与轻链可变区的C端连接，其中该抗体或其抗原结合部分能够与VISTA结合。

本发明的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4亚型。本发明的抗体可以包含κ恒定区。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab‘2片段。

本发明的抗体或其抗原结合部分与现有VISTA抗体例如JNJ-VSTB174(以下也称为JNJ，JANSSEN PHARMACEUTICA)相比，具有相当或更高的人/猴VISTA特异结合亲和力/活性。本发明的抗体或其抗原结合部分促进T细胞活化，并且与JNJ相比，提供相当或更好的T细胞活化效果，例如促进T细胞分泌更多的IFN-γ。

本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本发明抗体或其结合部分的结合特异性。

本发明还提供药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分、或其双特异性分子，以及药学上可接受的载体。

本发明还包括编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸分子的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本发明还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备VISTA抗体的方法，包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。

另一方面，本发明提供一种增强受试者免疫应答的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的组合物、或双特异性分子。

在另一方面，本发明提供一种治疗受试者中感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部分。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的组合物、或双特异性分子。在一些实施方式中，可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用其他抗感染药物，例如抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生物剂。

在另一个方面，本发明提供在受试者中预防、治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。癌症可以是实体瘤或非实体瘤，包括但不限于，B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肠腺癌、胰腺癌、肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、肺癌和鼻咽癌。在一些实施方式中，癌症可以选自黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤、和肠腺癌。在一些实施方式中，该方法包括施用本发明的组合物、或双特异性分子。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用，例如PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体和/或CTLA-4抗体。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂，例如表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。本发明的抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

附图描述

图1示出小鼠VISTA抗体在APC介导的T细胞激活中所起的作用：100μg/ml的161E5抗体的处理增加T细胞的IFN-γ分泌(A)，VISTA抗体161E5以剂量依赖方式增加T细胞的IFN-γ分泌(B)。

图2示出嵌合161E5抗体对人VISTA(A)、猴VISTA(B)和小鼠VISTA(C)的结合活性。

图3示出嵌合161E5抗体对HEK293A/人VISTA(A)、HEK293A/猴VISTA(B)以及HEK293A/小鼠VISTA(C)的结合活性。

图4示出嵌合和人源化161E5抗体对人VISTA(A)、猴VISTA(B)和小鼠VISTA(C)的结合活性。

图5示出嵌合和人源化161E5抗体对HEK293A/人VISTA(A)、HEK293A/猴VISTA(B)和HEK293A/小鼠VISTA(C)的结合活性。

图6示出人源化161E5抗体以剂量依赖方式诱导T细胞分泌IFN-γ，其中来自供体3的T细胞和来自供体2的树突细胞(A)以及来自供体2的T细胞和来自供体3的树突细胞(B)用于检测中。

图7示出经溶剂、人源化抗体161E5VH2VL3、抗小鼠PD-1抗体、或161E5VH2VL3联合抗小鼠PD-1抗体处理的各组小鼠的平均肿瘤体积(A)，经溶剂、人源化抗体161E5VH3VL3、抗小鼠PD-1抗体、或161E5VH3VL3联合抗小鼠PD-1抗体处理的各组小鼠的平均肿瘤体积(B)；小鼠对溶剂(C)、抗小鼠PD-1抗体(D)、人源化抗体161E5VH2VL3(E)、人源化抗体161E5VH2VL3联合小鼠PD-1抗体(F)、人源化抗体161E5VH2VL3(G)、或人源化抗体161E5VH2VL3联合抗小鼠PD-1抗体(H)的应答存在个体差异。

图8示出经溶剂处理的小鼠肿瘤切片的CD3(A)、CD8(B)和CD4(C)染色；以及经人源化抗体161E5VH2VL3处理的小鼠肿瘤切片的CD3(D)、CD8(E)和CD4(F)染色。

具体实施方式

为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“VISTA”是指T细胞活化V结构域Ig抑制蛋白。该术语包括变体、异体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人VISTA特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的VISTA蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人VISTA蛋白特异的抗体可以完全地对人VISTA蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的VISTA蛋白交叉反应。

术语“人VISTA”是指具有人氨基酸序列的VISTA蛋白，例如Genbank登录号为NP_071436的氨基酸序列。术语“猴VISTA”和“鼠VISTA”分别指具有猴和小鼠的VISTA序列的蛋白，例如分别具有Genbank登录号为XP_015311697和Genbank登录号为NP_001153044的序列。

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即C_H1、C_H2和C_H3。各轻链由轻链可变区(简称V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C_L构成。V_H和V_L区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各V_H和V_L由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，VISTA蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂V_L和V_H构成的Fv片段；(v)由V_H构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中V_L和V_H区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与VISTA蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合VISTA蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人VISTA蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的VISTA蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

术语“小鼠源抗体”是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠框架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。

术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。

术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。

术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。

在本文中，“特异结合人VISTA”的抗体是指与人VISTA(也可能是其他非人物种的VISTA)结合但是基本不与非VISTA蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人VISTA蛋白，即K_D值在5.0x10^-8M以下，优选1.0x10^-8M以下，更优选为5.0x 10^-9M以下。

术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的K_D为1.0x 10^-6M以上，更优选1.0x 10^-5M以上，更优选1.0x 10^-4M以上、1.0x 10^-3M以上，更优选1.0x 10^-2M以上。

术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的K_D为1.0x 10^-6M以下，优选5.0x 10^-8M以下，更优选1.0x 10^-8M以下、5.0x 10^-9M以下，更优选1.0x 10^-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指K_D为1.0x 10^-6M以下，优选1.0x 10^-7M以下，更优选1.0x 10^-8M以下。

术语“K_assoc”或“K_a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“K_dis”或“K_d”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“K_D”是指解离常数，由K_d与K_a比(K_d/K_a)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的K_D值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体K_D的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如Biacore^TM系统测得。

术语“EC₅₀”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病严重程度的本发明抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。

本发明的多个方面在以下更加具体地加以描述。

VISTA抗体具有对人VISTA的结合特异性以及其他有益的功能特征

本发明的抗体或其抗原结合部分以高亲和力特异性地结合人VISTA，例如，K_D值为4.0x 10^-10M以下，优选为2.0x 10^-10M以下，进一步优选为3.0x 10^-11M以下，并阻断VISTA-VSIG3相互作用。抗体还具有与猴VISTA的交叉反应性，不与小鼠VISTA结合。

相比于JNJ-VSTB174，本发明的抗体或其抗原结合部分结合不同的VISTA表位，并具有更强的促进T细胞活化的效果，例如促使T细胞分泌更多的IFN-γ。

本发明的抗体或其抗原结合部分具有与现有VISTA抗体相当或更好的体内抗肿瘤效果，并且可以与例如PD-1抗体联用。

优选的本发明抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。

VISTA单克隆抗体

本发明的抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。VISTA抗体的V_H氨基酸序列包含或列于SEQ ID NOs：7-10。VISTA抗体的V_L氨基酸序列包含或列于SEQ ID NOs：11-14。抗体的重链/轻链可变区序列号列于以下表1中，一些抗体具有相同的V_H或V_L。所有抗体的重链恒定区可以是氨基酸序列例如为SEQ ID NO：15的人IgG1恒定区，所有抗体的轻链恒定区可以是氨基酸序列例如为SEQ ID NO：16的人κ恒定区。各全长抗体的重链可变区的C端与重链恒定区的N端连接，轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端连接。重链恒定区可以基因修饰成不诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。

表1和表7中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR通过Kabat编号系统确定。然而，正如本领域已知的，CDR区域也可以通过其他系统如Chothia、IMGT、AbM或Contact编号系统/方法，基于重链/轻链可变区序列而确定。

与人VISTA结合的其他VISTA抗体的V_H和/或V_L序列(或CDR序列)可以与本发明抗体的V_H和/或V_L序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当V_H和V_L(或其中的CDR)混合并配对时，特定V_H/V_L配对中的V_H序列可以由结构近似的V_H序列取代。相似地，优选特定V_H/V_L配对中的V_L序列由结构近似的V_L序列取代。

因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：

(a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及

(b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一VISTA抗体的V_L，其中该抗体特异结合人VISTA。

在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：

(a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及

(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一VISTA抗体的CDR，其中该抗体特异结合人VISTA。

在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括VISTA抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人VISTA的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一VISTA抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。

此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer etal.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashiet al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis andStoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6，156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献均通过引用的方式全部并入本文。

在另一实施方式中，本发明的抗体包含VISTA抗体的重链可变区的CDR2以及至少VISTA抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一VISTA抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人VISTA。优选这些抗体(a)竞争结合VISTA；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本发明VISTA抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含VISTA抗体的轻链可变区CDR2，或者另一VISTA抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体特异结合人VISTA。在另一实施方式中，本发明的抗体可以包括VISTA抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一VISTA抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体特异结合人VISTA。

保守修饰

在另一实施方式中，本发明的抗体包含与本发明VISTA抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；deWildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelleyand O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6 and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：

(a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

(b)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

(c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或

(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且

(e)该抗体特异结合人VISTA。

本发明的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人VISTA的高亲和力，且设计成不引发对VISTA表达细胞的ADCC或CDC。

在多个实施方式中，抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本发明抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。

基因修饰的抗体

本发明的抗体可以以具备本发明VISTA抗体的一个或多个V_H/V_L序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，V_H和/或V_L)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个框架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，框架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。

在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的框架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmannet al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queenet al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本发明的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本发明单克隆抗体的V_H和V_LCDR序列，它们可以含有不同的框架序列。

这样的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。

通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschμl et al.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。

用于本发明抗体的优选框架序列是结构上与本发明抗体所用的框架序列相似的那些。V_H CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该框架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的框架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的框架区中。例如，在一些情况下，将框架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一类的可变区修饰是将V_H和/或V_LCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。

此外，在另一实施方式中，本发明提供分离的VISTA单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)V_H CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_H CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_L CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_L CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_L CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。

本发明的基因改造抗体包括在V_H和/或V_L的框架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些框架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的框架残基。这些残基可以通过将抗体框架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。

另一类的框架修饰包括对框架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。

此外，作为框架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本发明的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。

在一个实施方式中，C_H1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变C_H1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。

在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的C_H2-C_H3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。

在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本发明重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。

本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C₁-C₁₀)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本发明的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。

抗体的物理特性

本发明的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。

例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)JImmunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选VISTA抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。

在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。

各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选VISTA抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。

编码本发明抗体的核酸分子

在另一方面，本发明提供编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本发明的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。

优选的本发明核酸分子包括编码VISTA单克隆抗体的V_H和V_L序列或CDR的那些。一旦获得了编码V_H和V_L的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_H或V_L的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。

编码V_H区的分离DNA可以通过可操作地连接V_H编码DNA与编码重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H区的DNA可以可操作地与仅编码重链C_H1恒定区的另一DNA分子连接。

编码V_L区的分离DNA可以通过可操作地连接V_L编码DNA与编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。

为创建scFv基因，编码V_H和V_L的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)₃的另一片段连接，从而V_H和V_L序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中V_H和V_L区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。

本发明单克隆抗体的制备

本发明的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。

制备本发明单克隆抗体的转染瘤的生成

本发明的抗体还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。

术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。

抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而V_H与载体中的C_H可操作地连接，V_L与载体中的C_L可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。

优选的用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。

双特异性分子

另一方面，本发明涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本发明抗体的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。

在实施方式中，除Fc结合特异性和VISTA结合特异性外，双特异性分子还具有第三特异性，例如对PD-1的结合特异性。

双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)₂构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)。

药物组合物

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的一种或多种抗体，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗体或药物，例如PD-1抗体或CTLA-4抗体。本发明的药学组合物还可以与另一抗癌剂、或抗微生物剂联合使用。

药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。

优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本发明的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。

药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。

与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。

给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。

对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重，更常见的为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案涉及每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。本发明VISTA的优选给药方案包括静脉内施用，1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体以以下给药时间表中的一个进行给药：(i)每四周给药六次，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后1mg/kg体重每三周一次。在一些方法中，剂量调整成实现约1-1000μg/ml的血药浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。

“治疗有效量”的本发明VISTA抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加、或对感病性引起的损伤或无能的预防能力。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。

药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、透皮贴剂、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。

在某些实施方式中，本发明的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本发明的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawaet al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoeet al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

本发明的用途和方法

本发明的抗体(组合物和双特异性分子)具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症或感染性疾病的治疗和/或预防。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。

考虑到本发明VISTA抗体的促进T细胞活化并从而抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本发明提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本发明的抗体，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本发明抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肠腺癌、胰腺癌、肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、肺癌和鼻咽癌，不管是原发癌还是转移癌。此外，难治的或复发的恶性肿瘤可能可以用本发明的抗体进行抑制。

在另一方面，本发明提供一种治疗受试者中感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部分。在一些实施方式中，可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用其他抗感染药物，例如抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生物剂。

总体而言，本发明的抗体可以用来增强受试者的免疫应答。

本发明的这些和其他方法在以下进一步讨论。

联合疗法

本发明提供本发明VISTA抗体或其抗原结合部分与一种或多种能有效抑制受试者中肿瘤生长或加强免疫应答的其他抗体一起施用的联合疗法。在一个实施方式中，本发明提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用VISTA抗体以及一种或多种其他抗体，例如LAG-3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体和/或CTLA-4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。

VISTA信号通路阻断可另外与标准癌症治疗结合。例如，VISTA信号通路激活可以与CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断、以及化疗相结合。例如，化疗剂可以与VISTA抗体一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。例如，表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-FU可以施用给接受VISTA抗体疗法的患者。

任选地，VISTA与一种或多种其他抗体(例如，CTLA-4抗体和/或LAG-3抗体和/或PD-1抗体)的组合还可以与免疫原性剂结合，免疫原型剂为例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、和转染有表达免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He et al.，(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原肽，例如gp100肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1、和/或酪氨酸酶、或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。

其他可以与VISTA抗体联合的疗法包括但不限于白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。

本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。

此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。

本发明还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。

实施例

实施例1稳定表达人、猴或小鼠VISTA的HEK293A细胞株的构建

使用HEK293A细胞来构建稳定过表达人、猴或小鼠VISTA的细胞系。简单而言，合成人、猴或小鼠VISTA的cDNA序列(分别如SEQ ID NOs：17、18和19所示)，并经酶切克隆到pLV-EGFP(2A)-Puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)的EcoRI和BamHI位点之间。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-VISTA与psPAX以及pMD2.G质粒通过脂质体转染的方式转染到HEK293T细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与Lipofectamine 3000试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从HEK293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染HEK293A细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人、猴、或小鼠VISTA的HEK293A细胞(分别为HEK293A/人VISTA、HEK293A/猴VISTA、HEK293A/小鼠VISTA)。转染的HEK293A细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(Cat#：A11138-03，Gibco)的DMEM+10％FBS培养基中7天。人和猴VISTA的表达通过流式分析仪经FACS分析，使用市售可得的VISTA抗体(PE-人VISTA抗体，Cat#：12-1088-42，Invitrogen，美国)。相似地，小鼠VISTA的表达通过市售可得的小鼠VISTA抗体(PE-小鼠VISTA抗体，Cat#：B198378，Biolegend，美国)经FACS确证。

实施例2制备产生小鼠抗人VISTA单克隆抗体的杂交瘤细胞系

小鼠抗人VISTA单克隆抗体通过常规杂交瘤融合技术获得，方案略做改动。

免疫

13只BALB/c小鼠(维通利华，中国)通过交叉注射重组人VISTA(ECD)-hFc蛋白(Cat#：13482-H02H，义翘神州，中国)和/或猴VISTA(ECD)-his蛋白(Cat#：90801-K08H，义翘神州，中国)进行免疫，具体免疫流程如表2所示。人VISTA(ECD)-hFc蛋白和猴VISTA(ECD)-his蛋白用等体积的完全Freund佐剂(Cat#：F5881-10*10ML，Sigma，美国)或不完全Freund佐剂(Cat#：F5506-6*10ML，Sigma，美国)或PBS超声乳化。

表2.免疫方案

每次加强免疫后1周，从每只小鼠鼠尾取50μl血清，经ELISA检测滴度，具体使用重组人VISTA(ECD)-his(Cat#：13482-H08H，义翘神州，中国)、猴VISTA(ECD)-his(Cat#：90801-K08H，义翘神州，中国)和小鼠VISTA(ECD)-his(Cat#：511550-M08H，义翘神州，中国)进行结合测试。还通过使用实施例1中制备的过表达人、猴、小鼠VISTA的HEK293A细胞经FACS进行滴度测试。

基于最后一次加强之后的ELISA检测和FACS检测结果，血清滴度较高的10只小鼠被选出用于下一步的杂交瘤细胞系制备。

杂交瘤细胞系的制备

通过常规的杂交瘤融合技术制备杂交瘤细胞系，方案略做修改。

在最后一次免疫加强4天后，处死小鼠，取脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基(Cat#：SH30243.01B，Hyclone，美国)清洗3次。处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(CRL-1581，ATCC，美国)与上述分离的小鼠脾细胞按1∶4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG(Cat#：P7181，Sigma，美国)融合的方式进行。融合后的细胞用DEME清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640(Cat#：C22400500CP，Gibco)+10％FBS+1XHAT(H0262，Sigma))。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×10⁴细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO₂的潮湿细胞培养箱培养7天。之后，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1X HAT)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，经ELISA和FACS筛选杂交瘤细胞。

通过ELISA筛选杂交瘤细胞系

首先通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人VISTA结合的杂交瘤克隆，在ELISA中使用人VISTA(ECD)-his(Cat#：13482-H08H，义翘神州，中国)。对与人VISTA结合的杂交瘤克隆进一步测试其与猴或小鼠VISTA结合的能力，在ELISA中使用猴VISTA(ECD)-his(Cat#：90801-K08H，义翘神州，中国)和小鼠VISTA(ECD)-his(Cat#：511550-M08H，义翘神州，中国)作为检测抗原。

经上述ELISA，筛选出151个与人和猴VISTA有特异结合力的杂交瘤细胞系。

通过FACS检测筛选杂交瘤细胞系

对筛选出的151个杂交瘤细胞系进一步测试其与HEK293A细胞上表达的人、猴或小鼠VISTA的结合能力，使用实施例1中的制备HEK293A/人VISTA细胞、HEK293A/猴VISTA细胞、和HEK293A/鼠VISTA细胞。

基于上述FACS筛选，得到120个对HEK293A/人VISTA细胞以及HEK293A/猴VISTA细胞有高结合力的杂交瘤克隆，但是这120个杂交瘤克隆不与HEK-293A/小鼠VISTA细胞结合。

产生VISTA抗体的杂交瘤细胞的亚克隆

对上述120个杂交瘤克隆进行2轮亚克隆。在亚克隆过程中，选出各克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的ELISA和FACS检测进行特征确证。经该步骤得到的亚克隆确定为单克隆杂交瘤细胞系。最终得到106个对人和猴VISTA呈现出高结合力的亚克隆，每个亚克隆得自不同的原始母克隆。

实施例3小鼠VISTA单克隆抗体的纯化

从实施例2得到的106个克隆中，挑取28个对人和猴VISTA具有高结合力的克隆，进行进一步的研究。首先将28个所选克隆的单克隆小鼠抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在T175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清杂交瘤培养基(Gibco，美国，Cat#：12045-076)和1％HT补充液(Gibco，Cat#：11067-030)。细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养10天。收集培养物，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#：17040501，GE，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH 7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。

通过使用κ和λ-小鼠快速分型试剂盒(Thermal，美国，Cat#：26179)和小鼠单克隆抗体分型试剂(Sigma，美国，Cat#：IS02-1KT)来确定纯化抗体的亚型，检测步骤与试剂盒说明书中的一致。

大部分克隆，包括163G11，产生IgG1/κ抗体，而161E5产生IgG2a/κ抗体。克隆163G11和161E5的表达滴度分别为17.6和8.6mg/L。

实施例4纯化的小鼠VISTA抗体与人和猴VISTA结合

纯化的小鼠VISTA单克隆抗体首先通过ELISA检测来确定其与重组人、猴或小鼠VISTA蛋白的结合亲和力。

ELISA板用500ng/ml人VISTA(ECD)-his(Cat#：13482-H08H，义翘神州，中国)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的VISTA抗体(最高浓度40.0μg/ml)，室温孵育1小时。ELISA板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Cat#：A9309-1ml，Simga，美国)，室温孵育1小时。ELISA板用新鲜配制的Ultra-TMB(BD，美国，Cat#：555214)室温显色5分钟。之后用SpectraMax^R i3X(Molecular Devies，美国)在450nm读值。

28个VISTA单克隆抗体对猴或小鼠VISTA的物种交叉反应性进一步通过直接ELISA进行测试。具体地，将500ng/ml猴VISTA(ECD)-his(Cat#：90801-K08H，义翘神州，中国)或小鼠VISTA(ECD)-his(Cat#：511550-M08H，义翘神州，中国)包被在96孔ELISA板中，并与100μl梯度稀释的VISTA抗体(最高浓度40.0μg/m1)共同孵育。之后使用HRP-山羊抗小鼠IgG(Sigma，美国，Cat#：A9309-1ml)。VISTA抗体JNJ-VSTB174(JNJ，根据WO 2015/097536A2中公开的氨基酸序列进行制备，具有人IgG1/κ恒定区)用作参照。

两种代表性抗体的结合力的EC₅₀总结在表3中。数据示出，所有28个克隆的抗体与人以及猴VISTA结合，1个克隆的抗体还与小鼠VISTA交叉反应。

表3.代表性小鼠VISTA单抗对人、猴、或小鼠VISTA的结合力

实施例5小鼠VISTA单克隆抗体与HEK293A细胞表达的人和猴VISTA结合

为进一步确定VISTA抗体是否与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠VISTA结合，分别使用实施例1构建的稳定过表达人、猴或小鼠VISTA的HEK293A细胞进行FACS细胞结合检测。简单而言，将1×10⁵个HEK293A细胞在96孔板上铺板，并加入梯度稀释的VISTA抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。

两种代表性抗体的结合力的EC₅₀总结在表4中。数据表明，所有小鼠VISTA单克隆抗体均对人以及猴VISTA表现出高结合力，但不与小鼠VISTA结合。

表4.小鼠VISTA抗体与人、猴以及小鼠VISTA的结合亲和力

实施例6抗原表位竞争

通过竞争ELISA的方法检测抗体之间的抗原结合表位竞争。简单而言，96孔ELISA检测板用5μg/ml的JNJ抗体4℃包被过夜。这些孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2小时。0.5μg/m1人VISTA(ECD)-his蛋白(Cat#：13482-H08H，义翘神州，中国)加入检测板中，室温继续孵育1小时。板用PBST清洗3遍，加入1μg/ml纯化的抗体，室温孵育1小时。ELISA板用PBST洗3遍后加入20000倍稀释的抗小鼠Fc-HRP(Cat#：A9309-1MC，Simga，美国)，室温孵育1小时。继续用PBST洗液洗3遍后，用新鲜配制的Ultra-TMB(HuzhouYingchuang，中国，Cat#：TMB-S-003)室温显色5分钟，并用酶标仪(ThermoMultiscan FC)在450nm进行读值。

14种小鼠抗体，包括克隆163G11抗体，与JNJ存在抗原表位竞争，表明这些抗体与JNJ结合相同或相似的抗原表位。其余抗体，包括克隆161E5的抗体，与参照抗体JNJ不存在竞争，表明它们结合不同的抗原表位。

实施例7小鼠VISTA抗体抑制人VISTA-VSIG3相互作用

研究表明，VSIG3是VISTA的配体(Wang，J.et al.，(2019)Immunology.156(1)：74-85)。

合成编码在N端连接信号肽且C端连接hFc标签的人VSIG3-hFc融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO：20)，克隆到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，美国)的XhoI/BamHI限制性酶切位点之间。构建好的质粒转染至HEK-293F细胞(Cobioer，南京)。具体而言，HEK-293F细胞在Free Style^TM 293表达培养基(Cat#：12338-018，Gibco)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)转染的方式将质粒转染至细胞，DNA与PEI的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入1.5μg DNA。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，按照实施例3的方法步骤纯化该融合蛋白。

使用实施例1制备的稳定过表达人VISTA的HEK293A细胞进行阻断检测，经FACS测量。简单而言，1×10⁵个HEK293A/人VISTA细胞在96孔板上铺板，并加入梯度稀释的VISTA抗体。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍。之后，加入200μg/ml VSIG3-hFc融合蛋白。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍，加入500倍稀释的PE-山羊抗人IgG(Cat#：PAI-86078，Thermofisher，美国)。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍，使用FACS仪(BD)检测细胞荧光度。

数据示出，14种抗体中仅有一种抗体无法阻断VISTA-VSIG3之间的相互作用，其他抗体，包括161E5，都能阻断VISTA-VSIG3之间的相互作用。两种代表性抗体的EC₅₀值总结在表5中。

表5.小鼠VISTA抗体对VISTA-VSIG3相互作用的阻断力

抗体	VISG-3阻断检测EC<sub>50</sub>(M/L)
		JNJ	3.92E-09
161 E5	1.90E-08
		163G11	1.20E-08

实施例8小鼠VISTA抗体促进T细胞激活

小鼠VISTA抗体对APC介导的T细胞激活的作用通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测进行研究。

简单而言，通过梯度密度离心收集健康人供体血样中的PBMC，重悬于RPMI1640培养基中。PBMC在37℃孵育箱中培养2小时，收集贴壁细胞，即得到分离的单核细胞。单核细胞与100ng/ml重组人GM-CSF(Cat#：7954-GM，R&D，美国)以及100ng/ml重组人IL-4(Cat#：6507-IL，R&D，美国)，在补充有10％FBS的RPMI1640培养基中培养。三天后，将一半的培养基替换为新鲜培养基。在培养的第6天，将培养基替换为含有100ng/ml重组人GM-CSF、100ng/ml重组人IL-4、10ng/ml的rhTNF-α(Cat#：210-TA-100，R&D，US)、1000U/ml rhIL-6(Cat#：7270-IL-025，R&D，US)、1μg/ml PGE2(Cat#363-24-6，TOCRIS，US)、和10ng/ml IL-1β(Cat#：210-LB-025，R&D，US)的新鲜培养基。细胞再孵育2天。之后，通过梯度密度离心收集另一健康人供体血样中的PBMC，重悬于RPMI1640培养基中。使用Invitrogen Dynabeads非接触人CD4+ T细胞分离试剂盒(Cat#：11346D，Thermal Fisher Scientific，美国)从PBMC中分离出CD4+ T细胞。在96孔U形底检测板中，将来自第一供体的树突细胞和来自第二供体的CD4+T细胞分别以2.5×10⁴细胞/孔和5×10⁴细胞/孔的密度进行铺板。向孔中加入VISTA抗体(0.08-100μg/ml)、或对照抗体Hel(Cat#：LT12031，LifeTein，美国)、或JNJ抗体，板再孵育72小时。按照制造商的方法步骤，经ELISA(Cat#：SIF50，R&D，美国)确定IFN-γ浓度。实验设三个重复。

如图1中A所示，在用克隆161E5的小鼠VISTA抗体处理的孔中，检测到最高量的IFN-γ。且如图1中B所示，相对于Hel以及JNJ抗体对照，161E5处理的T细胞分泌出更高量的IFN-γ，且161E5对于T细胞的这种作用是剂量依赖型的。

实施例9嵌合VISTA抗体的表达和纯化

选取161E5进行进一步的研究。首先通过PCR方法对这个抗体的杂交瘤细胞进行重链/轻链可变区序列的克隆，使用文献中提及的引物(Juste et al.，(2006)，AnalBiochem.，1；349(1)：159-61)，并测序。序列总结在表1和表7中。通过将编码可变区和人IgG1/K恒定区(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：15和16)的序列插入到pCDNA3.1(Invitrogen，美国)的限制性酶切位点XhoI/BamHI之间来构建表达载体。重链可变区的C端与人IgG1恒定区的N端连接，轻链可变区的C端与人K恒定区的N端连接。

将上述获得的表达载体PEI转染HEK-293F细胞(Cobioer，中国)。具体而言，HEK-293F细胞在Free Style^TM 293表达培养基(Cat#：12338-018，Gibco)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)转染的方式将各表达载体转染至细胞，DNA与PEI的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入DNA的量是1.5μg。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，按照实施例3的方法步骤纯化单克隆抗体。

实施例10嵌合161E5抗体与人或猴VISTA结合

根据实施例4的方法步骤，进一步通过ELISA方法检测嵌合VISTA抗体对人VISTA、猴VISTA和小鼠VISTA的结合力。并且，根据实施例5的方法步骤，检测嵌合抗体与实施例1制备的HEK293A/人VISTA细胞、HEK293A/猴VISTA细胞以及HEK293A/小鼠VISTA细胞的结合力。结果分别显示在图2和图3。

如图2所示，161E5嵌合抗体对人VISTA(图2，A)和猴VISTA(图2，B)均有高结合力，不结合小鼠VISTA(图2，C)。图3示出的结合结果与图2类似。

实施例11 VISTA抗体的人源化改造

基于上述相关的功能试验，对161E5进行人源化改造和进一步研究。小鼠抗体的人源化改造通过互补决定区(CDR)移植法(美国专利5,225,539)进行，具体方法详见下文。

为选出鼠源抗体161E5的人源化受体框架，将161E5的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与161E5同源度最高的人种系IGVH和IGVK作为人源化改造的框架。所选择的重链种系受体序列是人IGHV1-46*01，所选择的轻链种系受体序列是人IGKV4-1*01。

对161E5的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。

基于上述的结构建模，161E5重链鉴定出9个潜在的回复突变(M48I、G49A、V68A、M70L、R72V、T74K、V79A、A40R、Y95F)，轻链鉴定出5个潜在的回复突变(E1N、V3M、I64V、A66D、A49S)。

如表1所示，对于161E5，共设计出示例性的3个人源化重链可变区和3个人源化轻链可变区，得到5个示例性的人源化抗体。

合成编码人源化重链可变区加人IgG1恒定区的序列、以及编码轻链可变区加人K恒定区的序列，重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：15和16，并分别利用EcoR I/Xho I和Cla I/Hind III限制性酶切位点克隆到GS表达载体(Invitrogen，美国)中，重链可变区的C端与人IgG1恒定区的N端连接，轻链可变区的C端与人K恒定区的N端连接。所有表达构建体均经测序证实。用表达载体转染EXPiCHO表达系统(Invitrogen，美国)，并瞬时表达5个人源化VISTA抗体，方法步骤如实施例9所述。人源化抗体按照实施例3所述进行纯化。

实施例12嵌合和人源化161E5抗体的特征鉴定

根据实施例4的方法步骤，进一步通过ELISA检测嵌合嵌合和人源化161E5抗体对人VISTA、猴VISTA和小鼠VISTA的结合力。并且，根据实施例5的方法步骤，检测嵌合和人源化抗体与实施例1制备的HEK293A/人VISTA细胞、HEK293A/猴VISTA细胞以及HEK293A/小鼠VISTA细胞的结合力。结果分别显示在图4和图5。

还通过BIAcore^TM 8K(GE Life Sciences，美国)来定量测定嵌合或人源化161E5抗体对人和猴VISTA的结合亲和力。具体地，将100-200RU(反应单位)的人VISTA(ECD)-his蛋白(Cat#：13482-H08H，义翘神州，中国)或猴VISTA(ECD)-his蛋白(Cat#：90801-K08H，义翘神州，中国)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR-1005-30，GE Life Sciences，美国)上，随后用1M氨基乙醇封闭芯片上的未反应基团。梯度稀释(浓度从0.3μM到10μM)的抗体注入到SPR反应液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE Life Sciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU。结合速率(k_a)和解离速率(k_d)使用BIA评估软件中的1∶1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数K_D通过k_d/k_a计算得到。

此外，根据实施例8的方法步骤，通过MLR检测来测试抗体刺激T细胞应答的能力。

如图4和图5所示，人源化161E5抗体的结合力与其各自的嵌合抗体相似。

通过BIAcore^TM测量的嵌合或人源化161E5抗体的结合亲和力显示在表6中。嵌合和人源化161E5具有与JNJ相当或更高的人VISTA结合力。

表6.VISTA抗体对人/猴VISTA的结合亲和力

此外，人源化161E5抗体还能够促进T细胞激活。图6示出了两个代表性人源化抗体与JNJ抗体激活T细胞的能力，该激活能力通过IFNγ的分泌量进行表征。可见，与JNJ处理相比，经本发明人源化抗体处理的T细胞分泌更多的IFN-γ，显示出本申请抗体更强的T细胞激活能力。

实施例13人源化抗体有体内抗肿瘤效果

对抗体161E5VH2VL3和161E5VH3VL3的体内抗肿瘤效果进行研究，该抗体具有人IgG1/K恒定区。所使用的动物模型通过对VISTA靶点人源化的转基因小鼠(GemPharmatechCo.Ltd，中国)植入MC38小鼠肠腺癌而建立。

具体地，小鼠在第0天在侧腹部皮下注射1×10⁶MC38细胞，随机分成六组，每组8只。六组小鼠在第0、4、7、11、14和18天分别腹腔注射161E5VH2VL3(10mg/kg)、161E5VH3VL3(10mg/kg)、抗小鼠PD-1抗体(InVivoMAb小鼠PD-1(CD279)，Cat#BE0146，USA)(2.5mg/kg)、161E5VH2VL3+抗小鼠PD-1抗体(10mg/kg+2.5mg/kg)、161E5VH3VL3+抗小鼠PD-1抗体(10mg/kg+2.5mg/kg)、或PBS。

随时间追踪肿瘤大小和小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤的长边(D)和短边(d)，并通过公式TV＝0.5x D x d²计算肿瘤体积。在抗体组肿瘤达到3.5cm³前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。

在第21天处死小鼠。分离肿瘤，进行称重、拍照，然后在4％多聚甲醛缓冲液(Cat#：P0098，Beyotime，中国)中固定，包埋在石蜡中，并切成0.5μm厚的切片。组织切片用二甲苯和乙醇脱石蜡。之后，切片在10mM柠檬酸+0.05％Tween-20(pH 6.0)中于120℃煮10分钟，进行抗原修复。随后切片通过2％H₂O₂对内源性的过氧化酶进行灭活，PBS清洗3遍后，切片通过10％的山羊血清(上海浩然生物技术有限公司，Cat#C0005，中国)进行封闭，并分别与0.5μg/ml小鼠CD3抗体(Cell Signaling Technology，货号#99940，美国)、CD4抗体(CellSignaling Technology，货号#25229，美国)、以及CD8抗体(Cell Signaling Technology，货号#98941，美国)4℃孵育过夜。切片经过PBS清洗后加入二抗(辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体，polymer-based power vision^TM，Duiven，荷兰)继续在常温下孵育1个小时。最终切片通过DAB显色试剂盒进行显色(索莱宝，货号：DA1015，中国)。组织切片还用Mayer‘s苏木素染液(Carl Roth GmbH，卡尔斯鲁厄，德国)进行复染，之后进行评分。

如图7所示，与PBS对照组相比，161E5VH2VL3和161E5VH3VL3抗体的处理显著抑制了小鼠肿瘤生长，尽管个体应答反应不同。当161E5VH2VL3与PD-1抗体组合使用时，抗肿瘤效果比单抗体处理更好。图8中的结果显示，与PBS对照组相比，161E5VH2VL3抗体能够显著增加肿瘤里浸润的CD3和CD8阳性的T细胞数量。

本申请中提及的几个重要序列总结在表7中。

表7.序列

尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。

序列表

<110> 北京天广实生物技术股份有限公司

北京华放天实生物制药有限责任公司

<120> 结合VISTA的抗体及其用途

<130> 55556 00018

<150> US 16/541,193

<151> 2019-08-15

<160> 20

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化161E5抗体的VH-CDR1

<400> 1

Asp Tyr Tyr Ile Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化161E5抗体的VH-CDR2

<400> 2

Arg Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化161E5抗体的VH-CDR3

<400> 3

Asp Asp Ser Phe Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化161E5抗体的VL-CDR1

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化161E5抗体的VL-CDR2

<400> 5

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠、嵌合和人源化161E5抗体的VL-CDR3

<400> 6

His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合161E5抗体的VH

<400> 7

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Arg Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Ser Phe Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体161E5-VH0VL0的VH

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Ser Phe Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体161E5-VH2VL2和161E5-VH2VL3的VH

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Arg Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Ser Phe Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体161E5-VH3VL2和161E5-VH3VL3的VH

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Arg Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Ser Phe Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠和嵌合161E5抗体的VL

<400> 11

Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体161E5-VH0VL0的VL

<400> 12

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile

50 55 60

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体161E5-VH2VL2和161E5-VH3VL2的VL

<400> 13

Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体161E5-VH2VL3和161E5-VH3VL3的VL

<400> 14

Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1恒定区

<400> 15

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人κ恒定区

<400> 16

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 17

<211> 936

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

atgggcgtgc ccacagccct ggaagccgga agctggaggt ggggaagcct gctgttcgcc 60

ctgttcctgg ctgcctccct gggacctgtg gccgccttca aggtggccac cccctacagc 120

ctctacgtgt gccccgaggg ccagaacgtc accctgacct gcaggctgct gggacccgtg 180

gacaagggcc acgacgtgac cttctacaag acctggtaca ggagcagcag gggcgaggtg 240

cagacctgct ccgagaggag gcccatcagg aatctgacat tccaggacct gcacctgcat 300

cacggcggac accaggctgc caacaccagc cacgacctgg ctcagaggca cggactggag 360

tccgcctccg accaccatgg caacttctcc atcaccatga ggaacctgac cctgctcgac 420

agcggcctgt actgttgcct ggtggtggag atcaggcacc accacagcga gcacagagtg 480

cacggcgcca tggagctgca ggtgcagacc ggaaaggacg ccccctccaa ctgcgtggtg 540

taccccagct ccagccagga gagcgagaac atcacagccg ctgccctggc caccggagct 600

tgtatcgtgg gaatcctgtg cctgcccctg atcctgctgc tggtctacaa gcagaggcag 660

gccgcctcca acaggagagc ccaggagctg gtcagaatgg actccaacat ccagggcatc 720

gagaaccccg gattcgaagc cagccctcct gcccagggaa tccctgaggc caaggtgagg 780

caccccctgt cctacgtggc ccagaggcag cctagcgaga gcggcagaca cctgctgagc 840

gaacctagca cccctctgtc ccctcccggc cctggcgatg tgttctttcc cagcttagat 900

cctgtgcccg actcccccaa cttcgaggtc atctga 936

<210> 18

<211> 987

<212> DNA

<213> 长尾猕猴（Macaca fascicularis）

<400> 18

atgggcgtgc ctaccgcccc tgaggctgga tgttggaggt ggggttctct gctgttcgcc 60

ctgttcctgg ctgccagcct gggacctgtg gccgccttca aggtggctac cctgtacagc 120

ctgtacgtgt gccccgaggg ccagaatgtg acactgacct gcagagtgtt cggccccgtg 180

gacaagggcc acgacgtgac cttctataag acctggtaca ggagcagcag gggcgaggtc 240

cagacctgca gcgaaaggag gcccattagg aacctgacct tccaggacct gcatctgcac 300

catggcggcc accaagccgc caacaccagc cacgacctcg ctcagaggca tggcctggag 360

agcgcctccg atcaccacgg caacttcagc atcaccatga gaaacctgac cctcctggac 420

agcggactgt actgctgcct ggtggtggag atcaggcacc accacagcga gcacagagtg 480

catggcgcca tggaactcca ggtgcagacc ggcaaagacg ccccctcctc ctgcgtggct 540

taccccagca gctcccagga gagcgagagc aagggcccct ccagctgccc cttttgggtg 600

atctgctccc tgctgagcag cagctgcaca cagaccctgt tcggaacact ggccctgagc 660

ccccaggctc acaggaatcc tagccccccc cctcccctgc tgctgcacat ccctagcgct 720

agctccctgg tccagagccc cgaagcccac tcccctagca tctgctccgg cgtgagcgct 780

cctctggcca gcctggagtg gctgtgcctg ggcagccatc tctggctggg caaggtgccc 840

catgacaggt actgggtgcc ccaggccgct aaatgctgcc cctcccatca gcctcccatg 900

acctccgagg gctggggcag cagaatccag ctgctgcaga tcagcgtgtt ttgcgtcagc 960

gtgttcctga ggtgttccct gctgtga 987

<210> 19

<211> 930

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 19

atgggcgtcc ctgctgtgcc tgaagccagc agccccagat ggggaaccct gctgctggct 60

attttcctgg ccgctagcag gggcctggtg gccgccttca aggtgacaac accctacagc 120

ctctacgtgt gccctgaggg ccagaacgcc accctgacct gtaggattct cggccctgtg 180

tccaagggac acgacgtgac catctacaag acctggtacc tgagcagcag aggagaggtc 240

cagatgtgca aggagcacag gcccatcagg aacttcaccc tgcagcacct gcagcatcac 300

ggctcccacc tgaaggccaa cgctagccac gaccagcccc agaagcatgg cctggagctg 360

gccagcgacc accacggaaa cttcagcatt accctgagga acgtgacccc cagggacagc 420

ggactgtact gctgcctggt gatcgagctg aagaaccacc accccgagca gagattctac 480

ggcagcatgg agctgcaggt gcaggccggc aaaggctccg gttctacctg tatggccagc 540

aacgagcagg acagcgacag catcacagcc gctgccctgg ccacaggagc ctgtatcgtg 600

ggaatcctgt gcctgcccct gatcctgctg ctggtgtaca agcagaggca ggtggcctcc 660

catagaagag cccaggagct ggtgaggatg gacagcagca acacccaggg cattgaaaat 720

cccggcttcg agaccacacc ccctttccag ggcatgcccg aggccaagac aagacccccc 780

ctgagctacg tggcccagag acagcccagc gagagcggca ggtacctgct gtccgaccct 840

agcacacccc tgagcccccc tggccctggc gacgtgttct ttcccagcct ggaccccgtg 900

cctgatagcc ccaactccga ggccatctga 930

<210> 20

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码N端具有信号肽的人VSIG3-hFc融合蛋白的核苷酸

<400> 20

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggcgt gcatagcctg 60

gaggtctccg agtcccctgg cagcatccaa gtcgccagag gacagcctgc cgtgctgccc 120

tgtaccttca ccaccagcgc cgccctgatc aacctgaacg tcatttggat ggtgacaccc 180

ctcagcaacg ccaaccagcc cgagcaagtc attctgtacc agggcggcca gatgttcgac 240

ggagccccca gattccacgg cagggtggga tttacaggca ccatgcccgc caccaatgtg 300

tccatcttca tcaataatac acagctgagc gacaccggca cctaccagtg tctcgtgaac 360

aacctgcccg acattggcgg caggaacatc ggcgtcaccg gcctgaccgt gctggtgcct 420

cctagcgccc ctcattgtca gatccaggga agccaggaca ttggctccga cgtgattctg 480

ctgtgctcca gcgaagaggg cattcccaga cctacctacc tgtgggagaa gctcgacaat 540

acactgaagc tgcctcccac cgccacccaa gaccaagtgc agggcacagt gaccatcagg 600

aacatctccg ccctgagctc cggactgtac cagtgtgtgg cctccaatgc catcggcacc 660

agcacctgtc tgctggacct gcaggtcatc tccccccagc ccaggaatat cggcccttgc 720

cccgcccccg aactgctggg cggccctagc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaagac 780

accctgatga tcagcagaac ccccgaggtc acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgaa 840

gatcctgagg tgaagttcaa ctggtacgtc gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagaca 900

aaacccaggg aggagcagta caactccacc tatagggtgg tcagcgtgct caccgtcctg 960

catcaggact ggctgaatgg caaggaatac aagtgtaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1020

gcccccatcg agaagaccat cagcaaagcc aagggccagc ctagggagcc ccaagtgtac 1080

accctgcccc ccagcaggga cgagctgacc aaaaaccagg tgagcctgac atgcctggtg 1140

aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcctgagaat 1200

aactacaaga ccaccccccc tgtgctcgat tccgacggca gcttcttcct gtacagcaag 1260

ctgacagtgg acaaatccag atggcagcag ggcaacgtgt tcagctgttc cgtgatgcat 1320

gaggccctgc acaaccacta tacccagaag agcctgagcc tctcccccgg caag 1374

Claims

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，该轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中该重链CDR1区、CDR2区、CDR3区，和轻链CDR1区、CDR2区、CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNOs：1、2、3、4、5和6所示，其中该抗体或其抗原结合部分能够与T细胞活化V结构域Ig抑制蛋白(VISTA)结合。

2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含SEQ ID NOs：7-10中任一所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NOs：11-14中任一所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含(1)SEQ ID Nos：7和11；(2)SEQ ID Nos：8和12；(3)SEQ IDNos：9和13；(4)SEQ ID Nos：9和14；(5)SEQ ID Nos：10和13；或(6)SEQ ID Nos：10和14所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，还包含与重链可变区连接的重链恒定区、和/或与轻链可变区连接的轻链恒定区，其中所述重链恒定区包含SEQID NOs：15的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NOs：16的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。

7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4亚型。

8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人VISTA结合；(b)与猴VISTA结合；(c)不与小鼠VISTA结合；(d)阻碍VISTA-VSIG3相互作用；(e)促进T细胞活化；和(f)具有体内抗肿瘤效果。

9.一种双特异性分子，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。

10.一种核酸，编码权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。

11.一种表达载体，包含权利要求10所述的核酸。

12.一种药物组合物，包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、权利要求10所述的核酸、或权利要求11所述的表达载体，以及药学上可接受的载体。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，还包含抗肿瘤剂或抗微生物剂。

14.权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、或权利要求12或13所述的组合物在制备治疗癌症疾病的药物中的用途，其中所述癌症疾病选自黑色素瘤、胰腺癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、和肺癌。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述胃肠癌是肠癌。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述肠癌是肠腺癌。