CN117003883A

CN117003883A - 结合tigit和vegf的双特异性分子及其用途

Info

Publication number: CN117003883A
Application number: CN202210462385.8A
Authority: CN
Inventors: 李江美; 胡稳奇; 李锋
Original assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2023-11-07
Also published as: US20230348629A1

Abstract

本申请涉及一种与TIGIT和VEGF特异结合的双特异性分子，及其在治疗肿瘤中的用途。

Description

结合TIGIT和VEGF的双特异性分子及其用途

技术领域

本申请涉及一种与TIGIT以及VEGF结合的双特异性分子、以及该双特异性分子在治疗肿瘤疾病中的用途。

背景技术

TIGIT和免疫调控

TIGIT，一种抑制性免疫检查点，是脊灰病毒受体(PVR)/结合素家族的一员，全称为T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域，又名Vsig9(包含V-set和免疫球蛋白结构域的蛋白9)、Vstm3(包含V-set和跨膜结构域的蛋白3)、或WUCAM(华盛顿大学细胞粘附分子)。TIGIT基因位于人类第16号染色体，编码由244个氨基酸组成的I型跨膜蛋白。人TIGIT分子胞外区长141个氨基酸，有1个免疫球蛋白V样结构域；跨膜区23个氨基酸；胞质区较短，含有2个抑制性基序，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白尾部酪氨酸(ITT)样基序。TIGIT的胞外免疫球蛋白V样结构域与其他PVR/结合素家族成员的该结构域序列非常类似，包括DNAX辅助分子-1(DNAM-1)、CD226、CD133、CD155、CD111、CD112、CD96等。

TIGIT表达于激活的CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞、NK细胞、调节性T细胞(Treg)以及滤泡辅助性T细胞。其与共刺激受体CD226竞争结合肿瘤细胞和抗原提呈细胞表达的CD155(PVR)，且其与CD155的结合亲和性比CD266-CD155结合亲和性要高得多。TIGIT和CD226的关系类似于CTLA-4与CD28，CD226表达于初始和静息T细胞，而TIGIT在抗原刺激或其他炎性刺激下迅速表达，两者之间的抗衡影响着效应T细胞的功能。例如，TIGIT与CD155的结合，阻断T细胞受体通路，抑制CD4⁺T细胞分泌促炎症因子(Shibuya K et al.，(1999)Immunity 11：615-623；Lozano E et al.，(2013)J Immunol 191：3673-3680)。约20-90％的静息NK细胞表达TIGIT，且表达水平在急性或慢性病毒侵染、癌症后升高。TIGIT与CD115的结合主要经ITT样基序引发人NK细胞的抑制性信号通路，抑制NK细胞对肿瘤细胞的识别能力以及分泌干扰素(IFN)-α的能力(Holder KA，Grant MD.(2020)Front Cell Infect Microbiol.10：175；Stanietsky N et al.，(2009)Proc Natl Acad Sci U S A 106：17858-17863；Liu Set al.，(2013)Cell Death Differ 20：456-464)。而TIGIT的表达可促进Treg的抑制作用，且TIGIT⁺Treg可上调TIM3的表达，协同抑制抗肿瘤免疫反应(Kurtulus S et al.，(2015)JClin Invest.125(11)：4053-4062)。

研究表明，TIGIT通过多种途径抑制先天免疫和获得性免疫。已开发出靶向TIGIT的抗体，在多种类型的癌症中进行临床测试。例如，Oncomed公司开发的Etigilimab(OMP-313M32)，目前已经在多种实体瘤，包括结直肠癌、子宫内膜癌、和胰腺癌等中，开展单药以及与纳武单抗(Nivolumab，PD-1抗体)联用的1期临床试验，检测其安全性、药效、药动和剂量摸索。1期实验结果显示，该药在20mg/kg的剂量下安全耐受。另一个TIGIT阻断型抗体，替瑞利尤单抗(Tiragolumab)，是由罗氏公司开发的一款抗体药物。针对该抗体药物的临床试验显示，该药与PD-L1抗体药物阿替利珠单抗(Atezolizumab)联用，可以在多种类型的肿瘤中起到协同作用，尤其是在非小细胞肺癌的治疗中，效果显著。其他TIGIT抗体，包括BMS-986207、BGB-A1217、AB154等，也处在单药或与其他抗肿瘤药物联用的临床试验中，涵盖多种实体瘤，包括多发骨髓瘤和黑色素瘤(Chauvin J，Zarour HM.，(2020)Journal forImmunoTherapy of Cancer 8：e000957)。

另有研究表明，Fc区对于TIGIT抗体的抗肿瘤效力而言是必不可少的。具有Fc区的TIGIT抗体可增强CD8⁺T细胞的活性，引发巨噬细胞和NK细胞对Treg的ADCP和ADCC，而Treg的的清除进一步增加CD8⁺T细胞的浸润(Argast GM et al.，(2018)Cancer Res.78(13S)：5627-27)。抗体Fc与FcγR的结合还可活化髓细胞，引起多种细胞因子和趋化因子的表达，以及持续的颗粒酶B以及穿孔素释放(Han JH et al.，(2020)Front Immunol.11：573405)。

VEGF和肿瘤免疫环境

血管内皮生长因子(VEGF)是一类分子量大小为40-45kDa的促血管生成因子家族，其三级结构为两片反向平行的同二聚体，家族蛋白成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和PlGF。VEGF，尤其是VEGF-A，在调节正常机体和疾病相关的血管生成和血管通透性中起着重要的作用。

在许多肿瘤中，VEGF水平升高与不良的临床结果相关。一方面，VEGF主要通过与其受体(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)结合，使VEGFR胞内信号转导区的酪氨酸发生磷酸化，激活细胞内信号通路，最终导致血管内皮细胞的生长、增殖和成熟，生成结构异常、易渗漏的新生血管。另一方面，VEGF抑制抗肿瘤免疫反应。其抑制树突状细胞(DC)的成熟，导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)失活，还强烈诱导Treg、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和骨髓来源抑制细胞(MDSC)，诱导免疫抑制的肿瘤微环境(TME)。缺氧的肿瘤微环境可通过直接或通过上调VEGF，将TAM、Treg和MDSC招募到肿瘤微环境中，支持肿瘤细胞逃脱免疫监视。此外，VEGF还以VEGFR2依赖的方式增强CD8⁺CTL和Treg上PD-1的表达，并协同白细胞介素(IL)-10和前列腺素E3诱导内皮细胞Fas配体的表达，导致CTL而不是Treg的耗尽。

贝伐单抗(bevacizumab)在2004年被美国FDA批准用于转移性结直肠癌的治疗，后来逐渐扩展到例如非鳞状非小细胞肺癌、肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、和宫颈癌的临床应用上(FerraraN，AdamisAP.(2016)15(6)：385-403)。此外，VEGF阻断剂与PD-1抗体的联合疗法已在多种肿瘤，如肾细胞癌、非小细胞肺癌和肝细胞癌，中显示出强大的疗效。KEYNOTE 524研究的一期结果显示，仑伐替尼联合PD-1单抗使肿瘤缩小，且该缩小是持久的，中位随访时间为10.6个月，表明联合治疗的抗肿瘤活性较强。IMbrave150是一项全球性III期、多中心、开放性研究，PD-L1联合VEGF抗体中期分析结果显示，两大主要终点——总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)都具有统计学意义和临床意义的改善。

靶向TIGIT和VEFG的双特异性分子

鉴于VEGF和TIGIT均在肿瘤微环境中表达，且对免疫细胞浸润、Treg免疫抑制功能有着调控作用，构建VEGF/TIGIT双特异性分子，可通过VEGF在肿瘤中的富集表达而增强抗体药物在肿瘤部位富集，同时阻断两个通路，更好地改善肿瘤免疫微环境。

迄今还未见有关于VEGF/TIGIT双特异性分子的报道。

对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。

发明内容

本申请的发明人设计了一种双特异性分子，其能够同时与TIGIT和VEGF特异结合，相比于现有的单特异性抗体如贝伐单抗和替瑞利尤单抗，具有相当或更高的人/猴TIGIT结合活性/亲和力、VEGF-A结合力，以相当或更高的活性抑制由VEGF诱导的细胞增殖、阻断TIGIT-PVR结合、激活T细胞、以及引发对TIGIT⁺细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。去岩藻糖化后，该双特异性分子的ADCC效应显著增强。此外，该双特异性分子具有较强的体内抗肿瘤活性，且与PD-L1抗体联用时抗肿瘤活性进一步增强。

在第一个方面，本申请提供一种双特异性分子，其可以包含TIGIT结合域和VEGF结合域。TIGIT结合域可以是特异结合TIGIT的抗体或其抗原结合部分。VEGF结合域可以是特异结合VEGF的抗体或其抗原结合部分。TIGIT结合域和VEGF结合域可以例如以Fab-Fab、Fv-Fv、scFv-Fab、scFv-Fv等形式结合，只要两个结合域分别保留TIGIT和VEGF特异结合性，且能够阻断TIGIT-PVR以及VEGF-VEGFR结合。在一个实施方式中，VEGF可以是VEGF-A。

在一个实施方式中，本申请的双特异性分子可以包含1个TIGIT结合域、和1个VEGF结合域。在一个实施方式中，本申请的双特异性分子可以包含2个TIGIT结合域、和2个VEGF结合域。

在一个实施方式中，TIGIT结合域可以以Fab或Fv形式存在，VEGF结合域可以以Fab或Fv形式存在。在一个实施方式中，TIGIT结合域可以以scFv形式存在，VEGF结合域可以以Fab或Fv形式存在。

双特异性分子还可以包含重链恒定区、和/或轻链恒定区。重链恒定区可以具有FcR结合活性，以便双特异性分子行使ADCC、ADCP、和CDC等效应功能。

在一个实施方式中，本申请的双特异性分子可以包含：

i)第一多肽链，从N端到C端含有特异结合TIGIT的重链可变区、和重链恒定区；

ii)第二多肽链，含有特异结合TIGIT的轻链可变区；

iii)第三多肽链，从N端到C端含有特异结合VEGF的重链可变区、和重链恒定区；以及

iv)第四多肽链，含有特异结合VEGF的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区和第二多肽链中特异结合TIGIT的轻链可变区结合形成能够特异地结合TIGIT的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区与第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区结合形成能够特异地结合VEGF的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

第一多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ IDNOs：1、2和3所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3。第二多肽链中特异结合TIGIT的轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：4、5和6所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。第一多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区可以包含与SEQ ID NO：13具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，第二多肽链中特异结合TIGIT的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：14具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方式中，VEGF可以是VEGF-A。第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：7、8和9所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3。第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：10、11和12所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区可以包含与SEQ ID NO：15具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第一多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构的重链恒定区，例如带有T366S/L368A/Y407V突变的人IgG1重链恒定区或其功能片段。第一多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构且结合FcR如FcγR的重链恒定区，如具有SEQ ID NO：19(X1＝S、X2＝A、X3＝V)的人IgG1重链恒定区。第三多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构的重链恒定区，例如带有T366W突变的人IgG1重链恒定区或其功能片段。第三多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构且结合FcR如FcγR的重链恒定区，如具有SEQ ID NO：19(X1＝W、X2＝L、X3＝Y)的人IgG1重链恒定区。

或者，第一多肽链的重链恒定区可以为带有杵结构、且结合FcR如FcγR的重链恒定区，例如具有SEQ ID NO：19(X1＝W、X2＝L、X3＝Y)的人IgG1重链恒定区。第三多肽链的重链恒定区可以为带有臼结构、且结合FcR如FcγR的重链恒定区，如具有SEQ ID NO：19(X1＝S、X2＝A、X3＝V)的人IgG1重链恒定区。

第二多肽链和/或第四多肽链还可以在C端包含轻链恒定区，如人κ或λ轻链恒定区，例如具有SEQ ID NO：20所示的轻链恒定区。

在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含与SEQ ID NOs：21、14、23和16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含与SEQ ID NOs：21、22、23和24具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，本申请的双特异性分子可以包含：

i)第一多肽链，含有特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的重链可变区、和特异结合TIGIT的轻链可变区；

ii)第二多肽链，含有特异结合VEGF的轻链可变区；

iii)第三多肽链，含有特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的重链可变区、和特异结合TIGIT的轻链可变区；以及

iv)第四多肽链，含有特异结合VEGF的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合VEGF的重链可变区和第二多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区结合形成能够特异地结合VEGF的抗原结合片段，第一多肽链中特异结合特异结合TIGIT的重链可变区和特异结合TIGIT的轻链可变区结合形成能够特异地结合TIGIT的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区和第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区结合形成能够特异地结合VEGF的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区和特异结合TIGIT的轻链可变区结合形成能够特异地结合TIGIT的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

VEGF可以是VEGF-A。第一和第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区可以相同或不同，第二和第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区可以相同或不同。第一和第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：7、8和9所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3。第二和第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：10、11和12所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。第一和第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区可以包含与SEQ ID NO：15具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，第二和第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区可以包含与SEQ IDNO：16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第一和第三多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区可以相同或不同，特异结合TIGIT的轻链可变区可以相同或不同。第一和第三多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1、2和3所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3。第一和第三多肽链中特异结合TIGIT的轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：4、5和6所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。特异结合TIGIT的重链可变区可以包含与SEQ IDNO：13具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，特异结合TIGIT的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：14具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

第一和第三多肽链中的重链恒定区可以为具有FcR如FcγR结合力的重链恒定区或其功能片段，例如人IgG1重链恒定区或其功能片段。在一个实施方式中，重链恒定区包含SEQ ID NO：19(X1＝T、X2＝L、X3＝Y)的氨基酸序列。当重链恒定区的C端与多肽例如特异结合TIGIT的重链可变区、特异结合TIGIT的轻链可变区等连接时，为提高重链恒定区与多肽之间的连接稳定性，可以将重链恒定区C末端的赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)。

第一多肽链可以从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的重链可变区、和特异结合TIGIT的轻链可变区；或者特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的轻链可变区、和特异结合TIGIT的重链可变区。第三多肽链可以从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的重链可变区、和特异结合TIGIT的轻链可变区；或者特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的轻链可变区、和特异结合TIGIT的重链可变区。

第一和第三多肽链中，重链恒定区可以经第一接头与特异结合TIGIT的重链可变区或特异结合TIGIT的轻链可变区连接。第一接头可以是约5-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，第一接头可以是约10-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，第一接头可以是约10-20氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，第一接头可以是GS接头，例如包含SEQ IDNO：17或18的氨基酸序列的GS接头。在一个实施方式中，第一接头包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的GS接头。

第一和第三多肽链中，特异结合TIGIT的重链可变区可以经第二接头与特异结合TIGIT的轻链可变区连接。第二接头可以是约5-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，第二接头可以是约10-30氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，第二接头可以是约10-20氨基酸长度的肽。在一个实施方式中，第二接头可以是GS接头，例如包含SEQ ID NO：17或18的氨基酸序列的GS接头。在一个实施方式中，第二接头包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的GS接头。

在一个实施方式中，第一和第三多肽链可以从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的重链可变区、和特异结合TIGIT的轻链可变区。在一个实施方式中，第一和第三多肽链可以从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、第一接头、特异结合TIGIT的重链可变区、第二接头、和特异结合TIGIT的轻链可变区。

在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含与SEQ ID NOs：25、16、25和16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含与SEQ ID NOs：25、24、25和24具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

本申请的双特异性分子可以为去岩藻糖化的双特异性分子。例如可以通过在某些哺乳动物细胞系中重组表达双特异性分子，以去岩藻糖化。可表达去岩藻糖化蛋白如本申请双特异性分子的细胞系包括但不限于，Slc35C1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系以及共表达β-1，4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II。

本申请还包括编码本申请双特异性分子或其功能片段的核酸分子，以及包含该核酸分子的表达载体以及包含或在其基因组中整合有该核酸分子或表达载体的宿主细胞。本申请还提供使用含有上述宿主细胞来制备双特异性分子或其功能片段的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达双特异性分子或其功能片段，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离双特异性分子或其功能片段。

本申请还提供药物组合物，其包含本申请的双特异性分子或其功能片段、其编码核酸分子、表达载体、或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

在第二个方面，本申请提供在受试者中治疗或减缓TIGIT通路和/或VEGF通路相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。

在一些实施方式中，TIGIT和/或VEGF通路相关疾病为肿瘤，例如实体瘤，包括，但不限于，结直肠癌、肝癌、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、多发骨髓瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、肝细胞癌、和宫颈癌。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物可以和靶向PD-1/PD-L1通路的抑制剂联合使用。靶向PD-1/PD-L1通路的抑制剂可以是PD-1抗体或PD-L1抗体。

本申请还提供本申请药物组合物在治疗TIGIT通路和/或VEGF通路相关疾病中的用途。TIGIT通路和/或VEGF通路相关疾病包括但不限于肿瘤、和眼底新生血管疾病。肿瘤可以为实体瘤，例如结直肠癌、肝癌、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、多发骨髓瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、肝细胞癌、和宫颈癌。眼底新生血管疾病可以包括，但不限于，糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、湿性年龄相关性黄斑变性、和脉络膜新生血管。在一些实施方式中，TIGIT通路和/或VEGF通路相关疾病可以为动脉粥样硬化、脓毒症、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征。

在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入本申请。

应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由……组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。

基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

附图说明

以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。

图1示出本申请双特异性分子的构象图。

图2示出本申请双特异性分子对人VEGF-A(A)、小鼠VEGF-A(B)、人VEGF-B(C)、以及人VEGF-C(D)的结合活性。

图3示出本申请双特异性分子对由VEGF引发的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的抑制作用。

图4示出本申请双特异性分子对HEK293A/人TIGIT(A)、HEK293A/猴TIGIT(B)、以及HEK293A/小鼠TIGIT(C)的结合活性。

图5示出50ng/ml(A)和50μg/ml(B)游离人VEGF-A蛋白对本申请双特异性分子结合HEK293A/人TIGIT的影响。

图6示出本申请双特异性分子对PVR-TIGIT相互作用的阻断效果。

图7示出本申请双特异性分子以剂量依赖方式诱导T细胞分泌IFN-γ(A)和IL-2(B)。

图8示出本申请双特异性分子以剂量依赖方式引发NK92细胞(A)和PBMC(B)对HEK293A/人TIGIT细胞的ADCC效应。

图9示出以SPR方式定量测定本申请双特异性分子对人TIGIT蛋白(A-C)和人VEGF-A蛋白(D-F)的结合亲和力。

图10示出经SPR定量测定MBS310-6(A和B)、以及MBS310-7(C和D)同时结合人TIGIT蛋白和人VEGF-A蛋白的能力。

图11示出去岩藻糖化的本申请双特异性分子以剂量依赖方式引发NK92细胞对HEK293A/人TIGIT细胞的ADCC(A)，并增强NK-92细胞的激活(B)。

图12示出PBMC人源化PDX非小细胞肺癌皮下移植瘤模型中70E11VH2VL4-AF、MBS310-6-AF、PD-L1抗体阿替利珠单抗、以及阿替利珠单抗与MBS310-6-AF联用处理的平均肿瘤体积。

具体实施方式

为更好理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“TIGIT”是指T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人TIGIT特异的结合域可以在某些情况下与另一物种例如猴的TIGIT蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人TIGIT蛋白特异的结合域可以完全地对人TIGIT蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的TIGIT蛋白交叉反应。

术语“人TIGIT”是指具有人氨基酸序列的TIGIT蛋白，例如具有SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的TIGIT蛋白。术语“猴TIGIT”是指具有猴氨基酸序列的TIGIT蛋白，例如具有SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的TIGIT蛋白。术语“小鼠TIGIT”是指具有小鼠氨基酸序列的TIGIT蛋白，例如具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的TIGIT蛋白。

术语“VEGF”是指血管内皮生长因子，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和PlGF。“人VEGF-A”是指具有人氨基酸序列的VEGF-A蛋白。因不同的mRNA剪切，VEGF-A具有多种异构体，包括VEGF165等。

本文中的术语“抗体”意在包括IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合片段)。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即C_H1、C_H2和C_H3。各轻链由轻链可变区(简称V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C_L构成。V_H和V_L区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各V_H和V_L由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(Clq)。本申请的抗体恒定区被设计成具有弱结合或不结合免疫系统细胞和补体系统蛋白。

本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，TIGIT蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂V_L和V_H构成的Fv片段；(v)由V_H构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中V_L和V_H区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

术语“FcR”是指在一些细胞表面表达的可以结合免疫球蛋白Fc的分子，分为两类。一类存在于效应细胞，如B淋巴细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞等的表面，引发对靶细胞的吞噬和毒性等，在免疫系统中发挥重要作用，包括Fcα受体、Fcε受体、和Fcγ受体，其中Fcγ受体属于免疫球蛋白超家族，是引发对微生物的吞噬作用的最重要的FcR，包括FcγRI(FcgRIa，CD64)、FcγRIIA(FcgRIIa，CD32A)、FcγRIIB(FcgRIIa，CD32B)、和FcγRIIIA(FcgRIIIa，CD16A)等。另一类是多聚Ig受体和新生IgG转运受体(FcRn)。FcRn主要在内皮细胞中表达，其蛋白结构和MHC-I分子类似，可以和IgG的Fc部分结合，阻止IgG分子被溶酶体裂解，可以起到增长IgG体内半衰期的作用，参与到IgG的体内转运、维持和分布代谢过程中。

术语“双特异性”或“双特异”分子是指特异性结合两个靶分子、或同一靶分子上两个不同表位的分子。双特异性分子包括本申请中特异结合TIGIT和VEGF的双特异性分子。相对而言，“单特异性”分子是指特异结合某一个靶分子，尤其是某一个靶分子上一个表位的分子，例如结合TIGIT的单特异性抗体、和结合VEGF的单特异性抗体。

双特异性分子的“功能片段”是指双特异性分子中保留有双特异性分子的靶点(TIGIT和VEGF-A)特异结合性、以及任选的FcR结合性的部分。

重链恒定区的“功能片段”是指重链恒定区中保留有特定活性如FcR结合活性、补体系统蛋白结合活性的部分。

本文中提到的“同一性”或“序列同一性”是指在进行序列比对后，一条序列中与参照序列中核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸百分比，如果需要的话，在序列对比中引入空格来达到两条序列间最大的序列一致性百分比。本领域技术人员可以通过多种方法，例如使用计算机软件，来进行两两序列对比或多序列比对，以确定两条或多条核酸或氨基酸序列之间的序列一致性百分比，此类计算机软件为例如ClustalOmega、T-coffee、Kalign和MAFFT等。

术语“EC₅₀”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

术语“IC₅₀”，又称为半抑制浓度，是指对指定的生物过程抑制一半时所需的药物或抑制剂的浓度。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本申请抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。

术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体如本申请双特异性分子中TIGIT结合域结合的靶细胞例如Treg裂解。

术语“ADCP”或“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”是指通过例如本申请双特异性分子同时结合于靶细胞如Treg和效应细胞如巨噬细胞，从而诱导效应细胞对靶细胞进行吞噬。

术语“CDC”或“补体依赖的细胞毒性”是指通过例如本申请双特异性分子的TIGIT结合域结合靶细胞如Treg，和靶细胞形成复合物而激活补体经典途径，形成攻膜复合物(MAC)，从而裂解靶细胞。

本申请的多个方面在以下更加具体地加以描述。

本申请的多特异性抗体具有有益特征

本申请的发明人设计了一种双特异性分子，其能够同时与TIGIT和VEGF特异结合。当将VEGF结合域以scFv的形式连接在IgG型TIGIT抗体的重链C端时，VEGF的结合活性降低。而将TIGIT结合域以scFv形式连接在IgG型VEGF抗体的重链C端时，或者将TIGIT结合域以及VEGF结合域分别以半抗体形式组合时，则保留有TIGIT和VEGF的高结合力。

本申请的两种示例性双特异性分子，相比于现有的单特异性抗体如贝伐单抗和替瑞利尤单抗，具有相当或更高的人/猴TIGIT结合活性/亲和力、VEGF-A结合力，以相当或更高的活性抑制由VEGF诱导的细胞增殖、阻断TIGIT-PVR结合、激活T细胞、以及引发对TIGIT⁺细胞的ADCC。去岩藻糖化后，示例性双特异性分子的ADCC效应显著增强。本申请的示例性双特异性分子还具有体内抗肿瘤活性，且与PD-L1抗体存在一定的协同效应。

本申请双特异性分子中包含的TIGIT抗体70E11VH2VL4为人源化的抗体或其抗原结合部分。

本申请双特异性分子中使用的单特异性抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR和轻链可变区CDR通过Kabat编号系统确定。领域内熟知，重链可变区和轻链可变区CDR可以通过例如Chothia、IMGT、AbM或Contact编号系统/方法确定。

双特异性分子

本申请的双特异性分子可以包含TIGIT结合域和VEGF结合域。VEGF可以是VEGF-A。

除TIGIT和VEGF结合特异性外，本申请的双特异性分子还可以具有例如FcR结合性。因此，在本申请中，术语“双特异性分子”也可以包括具有三种或更多种特异结性的分子，在一些实施方式中可称为“多特异性分子”。

双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)₂构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，cited supra；Cao and Suresh，BioconjugateChemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)。

由于VEGF和TIGIT均在肿瘤微环境中表达，且对免疫细胞浸润、Treg免疫抑制功能有着调控作用，本申请的VEGF/TIGIT双特异性分子，可通过结合肿瘤中富集表达的VEGF如VEGF-A，而在肿瘤部位富集，同时阻断两个通路，更好地改善肿瘤免疫微环境。

在本申请的双特异性分子中，TIGIT结合域可以是特异结合TIGIT的抗体或其抗原结合部分。VEGF结合域可以是特异结合VEGF的抗体或其抗原结合部分。TIGIT结合域和VEGF结合域可以例如以Fab-Fab、Fv-Fv、scFv-Fab、scFv-Fv等形式结合，只要两个结合域保留分别保留TIGIT和VEGF特异结合性，且能够阻断TIGIT-PVR以及VEGF-VEGFR结合。在一个实施方式中，VEGF可以是VEGF-A。

在一个实施方式中，本申请的双特异性分子可以包含1个TIGIT结合域、和1个VEGF结合域。在一个实施方式中，本申请的双特异性分子可以包含2个TIGIT结合域、和2个VEGF结合域。在一个实施方式中，TIGIT结合域可以以Fab或Fv形式存在，VEGF结合域可以以Fab或Fv形式存在。在一个实施方式中，TIGIT结合域可以以scFv形式存在，VEGF结合域可以以Fab或Fv形式存在。

本申请的双特异性分子可以包含：

ii)第二多肽链，含有特异结合TIGIT的轻链可变区；

iv)第四多肽链，含有特异结合VEGF的轻链可变区，

特异结合TIGIT的重链可变区和轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ IDNOs：1、2、3、4、5和6所示的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。特异结合TIGIT的重链可变区和轻链可变区可以包含如SEQ ID NOs：13和14所示的氨基酸序列。

VEGF可以是VEGF-A。特异结合VEGF的重链可变区和轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：7、8、9、10、11和12所示的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。特异结合VEGF的重链可变区和轻链可变区可以包含如SEQ ID NOs：15和16所示的氨基酸序列。

第一多肽链和第三多肽链的重链恒定区可以分别带有臼结构和杵结构。

第二多肽链和/或第四多肽链还可以在C端包含轻链恒定区，如人κ或λ轻链恒定区。

在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含SEQ ID NOs：21、14、23和16所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含SEQID NOs：21、22、23和24所示的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，本申请的双特异性分子可以包含：

ii)第二多肽链，含有特异结合VEGF的轻链可变区；

iv)第四多肽链，含有特异结合VEGF的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合VEGF的重链可变区和第二多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区结合形成能够特异地结合VEGF的抗原结合片段，第一多肽链中特异结合特异结合TIGIT的重链可变区和特异结合TIGIT的轻链可变区结合形成能够特异地结合TIGIT的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区和第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区结合形成能够特异地结合VEGF的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合特异结合TIGIT的重链可变区和特异结合TIGIT的轻链可变区结合形成能够特异地结合TIGIT的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区通过例如杵-臼、共价或二硫键等作用结合在一起。

VEGF可以是VEGF-A。第一和第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区可以相同或不同，第二和第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区可以相同或不同。特异结合VEGF的重链可变区和轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：7、8、9、10、11和12所示的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。特异结合VEGF的重链可变区和轻链可变区可以分别包含如SEQ ID NOs：15和16所示的氨基酸序列。

第一和第三多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区可以相同或不同，特异结合TIGIT的轻链可变区可以相同或不同。特异结合TIGIT的重链可变区和轻链可变区可以包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1、2、3、4、5和6所示的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。特异结合TIGIT的重链可变区和轻链可变区可以分别包含如SEQ IDNOs：13和14所示的氨基酸序列。

第一和第三多肽链中的重链恒定区可以为具有FcR如FcγR结合力的重链恒定区或其功能片段。当重链恒定区的C端连接特异结合TIGIT的重链可变区或特异结合TIGIT的轻链可变区时，为提高两者之间的连接稳定性，可以将重链恒定区C末端的赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)。

第一和第三多肽链中，重链恒定区可以经第一接头与特异结合TIGIT的重链可变区或特异结合TIGIT的轻链可变区连接。

第一和第三多肽链中，特异结合TIGIT的重链可变区可以经第二接头与特异结合TIGIT的轻链可变区连接。

在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含SEQ ID NOs：25、16、25和16所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，第一、第二、第三和第四多肽链分别包含SEQID NOs：25、24、25和24所示的氨基酸序列。

接头

接头，包括本申请中的第一接头和第二接头，可以由肽键连接的氨基酸构成，优选肽键连接的5-30个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一种或多种可以糖基化，如本领域技术人员所了解的。在一个实施方式中，5-30个氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和赖氨酸。在一个实施方式中，接头由大部分有空键位阻的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头为多聚甘氨酸，特别是多聚(Gly-Ala)、以及多聚丙氨酸。本申请中的示例性接头可以如SEQ ID NOs：17或18所示。

接头也可以是非肽类接头。例如，可以使用烷基接头，例如-NH-、-(CH₂)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以经任何非空间位阻基团例如低级烷基(例如C_1-6低级酰基)、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等进行取代。

堡守修饰

本申请的双特异性分子包含与本申请分子存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变双特异性分子结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请双特异性分子中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请双特异性分子的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的双特异性分子可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。

基因修饰的双特异性分子

本申请双特异性分子中用到的抗体或其抗原结合部分可以以具备本申请双特异性分子的一个或多个V_H/V_L序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，V_H和/或V_L)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，骨架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。

在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmannet al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queenet al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本申请的双特异性分子，其中包含的重链可变区和/或轻链可变区，可以包含本申请中的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，和/或VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，但含有不同的骨架序列。

这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。

通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.，(1997))，将蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。

用于本申请双特异性分子的优选骨架序列是结构上与本申请中所用抗体的骨架序列相似的那些。V_H CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一类的可变区修饰是将V_H和/或V_LCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。

本申请的基因改造抗体包括在V_H和/或V_L的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些骨架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过将抗体骨架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。

另一类的骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。

此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的双特异性分子可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变双特异性分子的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的双特异性分子可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变双特异性分子的一个或多个功能特性。

在一个实施方式中，C_H1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变C_H1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。

在另一个实施方式中，对双特异性分子的Fc铰链区进行突变，以降低双特异性分子的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的C_H2-C_H3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。

在另一实施方式中，修饰双特异性分子的糖基化。例如，可以制备去糖基化的双特异性分子(即，双特异性分子缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加双特异性分子对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变双特异性分子序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

此外，可以制备具有改变的糖基化类型的双特异性分子，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基双特异性分子，或者具有增加的平分型GlcNac结构的双特异性分子。改变的糖基化形式被证明能增加双特异性分子的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，Slc35c1基因剔除细胞系(参见US2018/0022820A1中保藏号为CGMCCNo.14287的CHO细胞系)。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)BiotechnolBioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合双特异性分子Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的双特异性分子的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Bio1.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的双特异性分子也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的双特异性分子表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，双特异性分子的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。

本文双特异性分子的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。双特异性分子可以PEG化，例如来增加生物(例如，血清)半衰期。为使双特异性分子PEG化，双特异性分子通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于双特异性分子的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C₁-C₁₀)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的双特异性分子是去糖基化的双特异性分子。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本申请的双特异性分子。参见，例如EPO 154316和EP 0 401 384。

编码本申请双特异性分子的核酸分子

在另一方面，本申请提供编码本申请双特异性分子或其片段的核酸分子，例如编码构成双特异性分子的多肽链的核酸分子。

核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。优选的本申请核酸分子可以包括编码VEGF/TIGIT单克隆抗体的V_H和V_L序列或CDR的那些。一旦获得了编码V_H和V_L的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_H或V_L的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。

编码V_H区的分离DNA可以通过可操作地连接V_H编码DNA与编码重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H区的DNA可以可操作地与仅编码重链C_H1恒定区的另一DNA分子连接。

编码V_L区的分离DNA可以通过可操作地连接V_L编码DNA与编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是K和λ恒定区。

为创建scFv基因，编码V_H和V_L的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)₃的另一片段连接，从而V_H和V_L序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中V_H和V_L区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。

对于本申请中的双特异性分子，可以先获得编码TIGIT抗体的CDR、V_H和V_L、VEGF抗体的V_H和V_L、以及接头等的序列，然后根据所需的双特异性分子的形式来组合这些序列。例如，编码VEGF重链可变区、重链恒定区、TIGIT重链可变区、接头、和TIGIT轻链可变区的序列可以按需可操作地连接在一起。

本申请双特异性分子的制备

本申请的双特异性分子的制备可以通过i)将编码双特异性分子的各多肽链的序列插入一个或多个表达载体，其中一个或多个表达载体与转录和翻译调控序列可操作地连接；ii)用表达载体转导或转染宿主细胞，以及iii)表达多肽链以形成本申请的双特异性分子。

术语“调控序列”包括控制基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。

表达载体可以编码促进双特异性分子多肽链从宿主细胞分泌的信号肽。多肽链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到多肽链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除双特异性分子多肽链基因和调控序列外，本申请的表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

编码双特异性分子不同多肽链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请双特异性分子在理论上是可行的，优选双特异性分子在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的双特异性分子。

本申请可用的表达载体的例子包括但不限于质粒、病毒载体、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、可转化人工染色体(TAC)、哺乳动物人工染色体(MAC)和人工附加染色体(HAEC)。

优选的用于表达本申请双特异性分子的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码双特异性分子基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中双特异性分子表达、或优选地足以使得使双特异性分子分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备双特异性分子。双特异性分子可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。

药物组合物

在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的一种或多种双特异性分子、编码双特异性分子的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、和/或包含该核酸分子的宿主细胞，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体、或者非抗体类抗肿瘤剂。本申请的药学组合物可以与例如另一抗癌剂联合使用。

药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice ofPharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。

药物组合物适合于经口、静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的双特异性分子可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。优选地，本申请的药物组合物经口施用。

药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。

与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。

给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，双特异性分子可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。

对于本申请双特异性分子的施用，具体可以由医学工作者，如医生，根据受试者的具体情况，如性别、年龄、既往病史等进行确定。

“治疗有效量”的本申请双特异性分子，引起疾病症状严重程度的降低、或无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于肿瘤患者，“治疗有效量”优选地，与对照受试者相比，将肿瘤减少至少约20％、更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，且更优选地至少约80％，甚至完全消除肿瘤。

药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。

在某些实施方式中，本申请的双特异性分子以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的双特异性分子穿越血脑屏障，双特异性分子可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

本申请的用途和方法

本申请的药物组合物具有多种体外和外内应用，例如可以用于肿瘤疾病的治疗和缓解。

本申请的药物组合物可以用于治疗或减缓肿瘤疾病。肿瘤疾病可以为例如实体瘤，包括，但不限于，结直肠癌、肝癌、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、多发骨髓瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、肝细胞癌、和宫颈癌。

本申请的药物组合物可以用于治疗或减缓其他TIGIT通路和/或VEGF通路相关疾病，包括，但不限于，眼底新生血管疾病、动脉粥样硬化、脓毒症、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征。眼底新生血管疾病可以包括，但不限于，糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、湿性年龄相关性黄斑变性、和脉络膜新生血管。

本申请的药物组合物可以用于激活T细胞。

本申请提供本申请药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效治疗或减缓相关疾病，例如PD-1抗体、PD-L1抗体。

本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。

此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。

本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。在本文中描述的所有文献通过引用的方式全部并入本文。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本申请的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱离本申请的宗旨和范围。

实施例

实施例1.稳定表达人TIGIT、猴TIGIT、小鼠TIGIT、或人PVR的HEK293A细胞株的构建

使用HEK293A细胞来构建稳定过表达人TIGIT、猴TIGIT、小鼠TIGIT、或人PVR的细胞系。简单而言，分别合成人TIGIT、猴TIGIT、小鼠TIGIT、和人PVR的cDNA序列(氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：27、28、29和30所示)，并经酶切克隆到pLV-EGFP(2A)-Puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)的酶切位点之间。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-TIGIT或者pLV-EGFP(2A)-Puro-PVR与psPAX以及pMD2.G质粒通过脂质体转染的方式转染到HEK293T细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与Lipofectamine3000试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从HEK293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染HEK293A细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人、猴、或小鼠TIGIT的HEK293A细胞(分别称为HEK293A/人TIGIT、HEK293A/猴TIGIT、HEK293A/小鼠TIGIT)，或用慢病毒转染A549细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人PVR的细胞系A549/人PVR细胞。转染的HEK293A细胞和A549细胞分别培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(Cat#：A11138-03，Gibco)的DMEM+10％FBS培养基中7天。人和猴TIGIT的表达使用市售可得的TIGIT抗体(PE-人TIGIT抗体，Cat#：372703，Biolegend，美国)通过流式分析仪经FACS分析，小鼠TIGIT的表达通过市售可得的小鼠TIGIT抗体(PE-小鼠TIGIT抗体，Cat#：622205，Biolegend，美国)经FACS确证。相似地，人PVR的表达通过市售可得的人PVR抗体(PE-人PVR抗体，Cat#：566718，BD，美国)经FACS确证。

实施例2.示例性TIGIT×VEGF双特异性抗体的构建和表达

本申请采用对称和不对称的全抗体组装形式进行双特异性抗体构建，前者得到MBS310-4和MBS310-7，TIGIT和VEGF结合域均为2个，后者得到MBS310-6，TIGIT和VEGF结合域均为1个，具体双抗结构如图1所示。其中靶向TIGIT的结构域采用如SEQ ID NOs：13和14所示的重链和轻链可变区，靶向VEGF的结合域采用贝伐单抗的重链可变区(SEQID NO：15)和轻链可变区(SEQ ID NO：16)。

具体地，MBS310-4包含SEQ ID NO：26所示的抗体长链序列(即，TIGIT抗体重链可变区-重链恒定区-接头-VEGF抗体重链可变区-接头-VEGF抗体轻链可变区链)、以及SEQ IDNO：22所示的短链序列(TIGIT抗体轻链可变区-轻链恒定区链)；MBS310-7包含SEQ ID NO：25所示的抗体长链序列(VEGF抗体重链可变区-重链恒定区-接头-TIGIT抗体重链可变区-接头-TIGIT抗体轻链可变区链)、以及SEQ ID NO：24所示的抗体短链序列(VEGF抗体轻链可变区-轻链恒定区链)；MBS310-6包含SEQ ID NO：23所示的VEGF抗体重链可变区-带杵突变的重链恒定区链、SEQ ID NO：21所示的TIGIT抗体重链可变区-带臼突变的重链恒定区链、SEQ ID NO：24所示的VEGF抗体轻链可变区-轻链恒定区链、以及SEQ ID NO：22所示的TIGIT抗体轻链可变区-轻链恒定区链。

全基因合成MBS310-4、MBS310-6、MBS310-7双特异性抗体的长(重)链(包括可变区和恒定区)和短(轻)链(包括可变区和恒定区)DNA序列，分别采用ClaI和HindIII酶切短(轻)链全长基因；采用EcoRI和XhoI酶切长(重)链全长基因；HindIII和EcoR I酶切pCMV-质粒获得启动子基因片段。采用ClaI和XhoI酶切GS-载体。将回收的4个DNA片段进行连接、转化并挑取单克隆进行测序，获得含有正确序列的表达载体，MBS310-4和MBS310-7采用单细胞表达体系，MBS310-6采用双细胞体外组装的表达体系。

将上述获得的表达载体通过PEI转染HEK-293F细胞(Cobioer，中国)，简单而言，使用聚乙烯亚胺(PEI)，用所得的载体转染HEK293F细胞，DNA∶PEI比为1∶3。用于转染的总DNA为1.5μg/ml。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。MBS分子通过预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#：17040501，GE，美国)来富集纯化，后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH 7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。

实施例3.示例性TIGIT×VEGF不对称双特异性抗体(MBS310-6)的组装

将纯化的半抗体进一步通过体外方式进行组装，分别将MBS310-6-杵和MBS310-6-臼半抗体以1：1的摩尔比混合，用Tris碱缓冲溶液调节至pH 8.0，添加一定量的还原型谷胱甘肽溶液，在25℃反应并低速搅拌过夜。反应结束后用2M醋酸溶液调节pH值至5.5。通过超滤去除还原剂，终止反应。

装配后的抗体首先进行阴离子纯化。首先采用低盐Tris缓冲溶液(pH8.0)平衡阴离子层析柱，然后将样品装载到阴离子层析柱，收集流穿组分，随后使用低盐Tris缓冲溶液(pH8.0)进行冲洗直至UV280趋向于基线。用醋酸溶液将收集的流穿样品pH调至5.5。将阴离子收集的样品用30kDa超滤管浓缩至1mL，用0.2μm的过滤膜过滤。随后双特异性抗体通过阳离子进行进一步的纯化。采用低浓度乙酸盐缓冲溶液(pH 5.5)平衡阳离子层析柱，将样品上样到阳离子层析柱中。上样完毕后，再用低浓度乙酸盐缓冲溶液(pH 5.5)平衡柱子，然后进行线性梯度洗脱，0-100％高浓度醋酸盐(pH 5.5)，20CV，收集洗脱组分。纯化后的抗体经过质谱鉴定纯度高于90％，用于后续功能检测。

实施例4.示例性TIGIT×VEGF双特异性抗体与VEGF结合

纯化的TIGIT×VEGF抗体首先通过ELISA检测来确定其与重组人/猴(与人VEGF序列一致)、以及小鼠VEGF蛋白的结合力。

ELISA板分别用100μl 500ng/ml人VEGF-A(Cat#：11066-HNAN，义翘神州，中国)、小鼠VEGF-A(Cat#：50159-MNAB，义翘神州，中国)、人VEGFB-his(Cat#：VE6-H5225，百普赛斯，中国)、和人VEGFC-his(Cat#：VEC-H4225，百普赛斯，中国)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2个小时，然后分别加入100μl梯度稀释的TIGIT×VEGF双抗和阳性对照抗体贝伐单抗(重链GenBank登录号：AOZ48530.1(Front Plant Sci 7，1156(2016))，轻链GenBank登录号：2FJH L(J.Biol.Chem.281(10)，6625-6631(2006)))，最高浓度40μg/ml，室温孵育1小时。ELISA板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Cat#：A9309-1ml，Simga，美国)，室温孵育1小时。ELISA板用新鲜配制的Ultra-TMB(BD，美国，Cat#：555214)室温显色5分钟。之后用SpectraMaxR i3X(Molecular Devies，美国)在450nm读值。

结果如图2所示，MBS310-6和MBS310-7与对照抗体贝伐单抗效果相当，与人和猴VEGF-A(A)有强结合，与小鼠VEGF-A有弱结合(B)，与人VEGF-C(D)和人VEGF-B(C)基本没有结合，而MBS310-4双抗的结构影响了其VEGF结合域与VEGF-A(A)的结合，与小鼠VEGF-A(B)、人VEGF-B(C)以及人VEGF-C(D)均无结合。

实施例5.示例性TIGIT×VEGF双特异抗体阻断HUVEC细胞增殖

VEGF可以促进血管内皮细胞增殖反应，本试验根据Gospodarowicz D等的方法(PNAS，1989，86：7311)检测本申请双抗以及贝伐单抗对VEGF诱导的脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的阻断效果。

取96孔细胞培养板一块，每孔中加入0.2ml含有1×10⁴HUVEC内皮细胞(Cat#：CC-2517，Lonza，美国)的培养液、终浓度25ng/ml的VEGF(Cat#：11066-HNAN，义翘神州，中国)、以及梯度稀释的抗体(起始浓度为20μg/ml，2倍稀释，8个浓度)。细胞培养板于37℃、5％CO₂培养箱培养72h。通过CCK8检测试剂盒(Cat#：CK04，Dojindo，日本)检测细胞的增殖状况。具体地，向96孔板中每孔加入20μl CCK8溶液，37℃孵育2h左右，于酶标板中检测450nm处的吸光值。

结果如图3所示，MBS310-6和MBS310-7均能跟贝伐单抗一样显著抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖，而由于VEGF结合活性的降低，MBS310-4对HUVEC的增殖没有影响。

实施例6.示例性TIGIT×VEGF双特异抗体与HEK293A细胞表达的人和猴TIGIT结合

为进一步确定TIGIT×VEGF双特异抗体是否与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠TIGIT结合，分别使用实施例1构建的稳定过表达人、猴或小鼠TIGIT的HEK293A细胞进行FACS细胞结合检测。简单而言，将100μl培养基中的10⁵个HEK293A细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。70E11VH2VL4用作对照，其为TIGIT抗体，包含本申请双特异性抗体中构成TIGIT结合域的重轻链可变区(SEQ ID NOs：13和14)、以及重轻链恒定区(SEQ ID NOs：19(X1＝T、X2＝L、X3＝Y)和20)。

结果如图4所示，MBS310-6和MBS310-7与70E11VH2VL4一样都能与人和猴TIGIT有强结合力(A、B)，但是不能结合小鼠TIGIT蛋白(C)。以MBS310-6和MBS310-7为代表的双特异性抗体的构型没有影响其中TIGIT结合域与TIGIT抗原的结合能力。

实施例7.游离VEGF对示例性TIGIT×VEGF双特异抗体与HEK293A细胞表达的人和猴TIGIT结合的影响

为了检测游离VEGF与本申请双特异性抗体结合后是否会影响这些双特异性抗体与TIGIT阳性细胞的结合力，采用实施例1构建的人TIGIT过表达的HEK293A细胞进行FACS结合力检测。简而言之，将100μl培养基中的10⁵个HEK293A细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的抗体、50μl不同终浓度的人VEGF-A游离抗原(Cat#：11066-HNAN，义翘神州，中国，终浓度为0ng/ml、50ng/ml、或50μg/ml)。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。

结果如图5所示，在存在50ng/ml VEGF-A的情况下，MBS310-6和MBS310-7与过表达人TIGIT的细胞的结合完全不受影响(A)，而50μg/ml VEGF-A的存在对MBS310-6和MBS310-7结合HEK293A/人TIGIT产生一定影响(B)，其中对MBS310-7的影响较大，对MBS310-6影响较小。

实施例8.示例性TIGIT×VEGF双特异抗体抑制人TIGIT-PVR相互作用

研究表明PVR是TIGIT的主要配体。通过FACS手段进行细胞体系的阻断实验，检测TIGIT×VEGF双特异性抗体对TIGIT-PVR相互作用的阻断效应，使用实施例1制备的稳定过表达人PVR的A549细胞。简单而言，梯度稀释的TIGIT×VEGF双特异性抗体与终浓度5μg/ml的TIGIT-mFc蛋白(Cat#：10917-H38H，义翘神州，中国)37℃混合孵育1小时，加入到96孔板中。将在100μl培养基中的10⁵个A549/人PVR细胞在96孔板上铺板，并加入100μl上述双特异性抗体与TIGIT-mFc的混合物。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的PE-山羊抗鼠IgG(Cat#：31861，Thermofisher，美国)。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍，使用FACS仪(BD)检测细胞荧光度。

结果如图6所示，MBS310-6和MBS310-7均能跟TIGIT单特异性抗体70E11VH2VL4一样，显著地阻断TIGIT和PVR蛋白的结合。

实施例9.示例性TIGIT×VEGF双特异抗体促进T细胞激活

通过T细胞活性检测来研究TIGIT×VEGF双特异性抗体对T细胞活性的调控作用。

简单而言，通过梯度密度离心收集健康人供体血样中的PBMC，重悬于RPMI1640培养基中。使用Invitrogen Dynabeads不接触人CD4⁺T细胞分离试剂盒(Cat#：11346D，Thermal Fisher Scientific，美国)从PBMC中分离出CD4⁺T细胞。CD4⁺T细胞重悬于RPMI完全培养基(90％RPMI培养基+10％胎牛血清)中，将密度调整为1.0×10⁶/ml。T细胞中添加CD3/CD28激活磁珠(Cat#：11132D，Gibco，美国)，在37℃、5％CO₂中继续培养10天以激活T细胞。

收集上述培养的CD4⁺T细胞，用RPIM培养基清洗3遍，将细胞浓度调整为2×10⁵细胞/ml。在96孔细胞培养板中预先用50μl 0.25μg/ml CD3抗体(OKT3，Cat#：GMP-10977-H001，义翘神州，中国)和50μl浓度PVR-hFc融合蛋白(Cat#：10109-H02H，义翘神州，中国)4℃包被过夜。板子用PBS清洗3遍，然后用含1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液37℃封闭90分钟。细胞培养板用PBS清洗3遍，加入上述CD4⁺T细胞150μl，以及50μl梯度稀释的本申请双特异性抗体，细胞在37℃细胞培养箱中继续培养3天，TIGIT单特异性抗体70E11VH2VL4和替瑞利尤单抗用作对照。使用制造商的方法步骤，使用IFN-γ检测试剂盒(Cat#：SIF50，R&D，美国)和IL-2检测试剂盒(人IL-2ELISA试剂盒，Cat#：S2050，R&D，美国)确定IFN-γ浓度和IL-2浓度。实验设三个重复。

如图7所示，所有抗体，包括靶向TIGIT的单特异性抗体(70E11VH2VL4和替瑞利尤单抗)、以及本申请的不同构型的双特异性抗体，都能够提高T细胞的活性，增加IFN-γ的分泌(A)，其中MBS310-6的激活效果最强。且相对于Hel对照，这些抗体以剂量依赖的方式增加T细胞分泌IFN-γ。70E11VH2VL4、MBS310-6、MBS310-7在某些浓度下对T细胞的激活能力比替瑞利尤单抗更强。

实施例10.示例性TIGIT×VEGF双特异抗体对TIGIT⁺细胞的ADCC诱导效应

进一步检测本申请双特异性抗体诱导NK92细胞对HEK293A/人TIGIT细胞的ADCC杀伤效果，使用实施例1中制备的HEK293A/人TIGIT细胞。HEK293A/人TIGIT细胞和效应细胞NK92MI-CD16a(Huabo Bio)均以1200rpm离心5分钟，随后混悬在ADCC检测培养基中(MEM培养基，Cat#：12561-056，Gibco；1％FBS，Cat#：FND500，EX-cell；1％BSA，Cat#：V900933-1KG，VETEC)，根据细胞计数看，细胞活力为约90％。调整HEK293A/人TIGIT的细胞密度为4x10⁵/ml，NK92MI-CD16a的细胞密度调整为2x10⁶/ml，两种细胞各加50μl到96孔板的各孔中，效靶比是5∶1。将待测抗体，包括本申请的双特异性抗体，分别稀释成不同浓度加入各孔，初始终浓度分别为50000ng/ml，5倍稀释，10个浓度。样本在37℃孵育4小时，然后以100μl/孔的浓度加入LDH显色液(细胞毒性检测试剂盒PLUS(LDH)，Cat#：04744926001，Roche)。避光常温放置20分钟后，板在MD SpectraMax i3上进行读数。替瑞利尤单抗作为阳性抗体对照。结果显示在图8(A)中。

对TIGIT×VEGF双抗进一步分析其经人PBMC引发对HEK293A/人TIGIT细胞的ADCC效应，其中，HEK293A/人TIGIT细胞为实施例1制备，pLV-EGFP(2A)-Puro载体本身表达GFP蛋白。人PBMC使用淋巴分离液通过密度梯度离心而获得，并在培养基(RIPM1640+10％FBS+300IUIL-2)中培养过夜。ADCC效应检测通过LIVE/DEAD死细胞染色试剂盒(Cat#：L34964，Thermo Fisher，USA)进行。靶细胞和效应细胞PBMC1200rpm离心5分钟，用ADCC实验培养基(RIPM1640培养基+1％FBS)重悬，根据细胞计数，细胞活率为约90％。靶细胞密度调整成4x10⁵/ml，PBMC细胞密度调整成8x10⁶/ml。各取50μl细胞加入各孔，效靶比20：1。在样品检测孔中加入稀释好的各种检测抗体，包括本申请的双特异性抗体，抗体最高终浓度为50000ng/ml，5倍稀释，10个浓度梯度。然后样本于37℃继续培养24小时。混合物用PBS洗3遍，然后与LIVE/DEAD死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用PBS洗3遍，用FACS进行检测。计算出GFP阳性细胞(HEK293A/人TIGIT细胞)的细胞死亡率。结果示于图8(B)。

如图8所示，所有抗体都能诱导NK92MI-CD16a和PBMC对HEK293A/人TIGIT细胞的杀伤，相比于单特异性抗体，MBS310-6和MBS310-7的ADCC引发效应减弱，MBS310-6的ADCC活性高于MBS310-7。

实施例11.示例性TIGIT×VEGF双特异性抗体对人TIGIT和VEGF的结合亲和力

通过BIAcore^TM 8K(GE Life Sciences，美国)，定量测定本申请双特异性抗体对人TIGIT和VEGF的结合亲和力。具体地，将100-200RU(反应单位)的人TIGIT-his蛋白(Cat#：10917-H08H，义翘神州，中国)或人VEGF-A(Cat#：11066-HNAN，义翘神州，中国)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR-1005-30，GE Life Sciences，美国)上，随后用1M氨基乙醇封闭芯片未反应基团。将梯度稀释(浓度从0.3μM到10μM)的抗体注入到SPR反应液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE Life Sciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU。结合速率(ka)和解离速率(kd)使用BIA评估软件中的1∶1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数K_D通过kd/ka计算得到。

根据SPR确定的抗体结合解离曲线，总结出双特异性抗体对人TIGIT和VEGF的结合亲和力，具体结合图形见图9(A-F)，亲和力数据见表1。

表1.双特异性抗体对人TIGIT和VEGF的结合亲和力

进一步地，通过桥联SPR的方法检测双特异性抗体对于两个靶抗原同时结合的亲和力参数。简而言之，采用捕获法，选用抗人Fc芯片，采用多循环动力学/捕获亲和法检测抗体的亲和力。具体地，对于先结合VEGF后结合TIGIT的检测，将1μg/mlMBS310-6或MBS310-7结合到CM5生物芯片(Cat#：10266084，GE Life Sciences，美国)上，将梯度稀释的VEGF(起始浓度2μg/ml，2倍稀释，8个浓度)和梯度稀释的TIGIT(起始浓度4μg/ml，2倍稀释，8个浓度)按序注入到SPR反应液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE Life Sciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。对于先结合TIGIT后结合VEGF的检测，将4μg/ml MBS310-6或者MBS310-7结合到CM5生物芯片上，将梯度稀释的TIGIT(起始浓度4μg/ml，2倍稀释，8个浓度)和梯度稀释的VEGF(起始浓度2μg/ml，2倍稀释，8个浓度)按序注入到SPR反应液中，速度控制在30μL/分钟。第一抗原结合时间为180秒，解离时间为500秒，随后开始第二抗原的结合，同样结合时间为180秒，解离时间不少于500秒。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU。

结果如图10所示，MBS310-6和MBS310-7均能同时结合VEGF和TIGIT，而且不受到抗原结合先后顺序的影响，其动力学结合参数跟单抗原结合时保持亲和力一致。

实施例12.示例性去岩藻糖化TIGIT×VEGF双特异性抗体的ADCC效应

通过SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞(天广实公司构建，具体见US2018/0022820A1)表达的抗体，基本上没有岩藻糖化修饰。

通过将MBS310-6的两条不对称半抗表达序列克隆到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，USA)中构建表达载体，之后转染到SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞中。

去岩藻糖化MBS310-6在CHO-K1-AF细胞中瞬时表达并进行纯化，抗体命名为MBS310-6-AF。抗体的表达、纯化，以及抗体组装参照实施例2和实施例3。

使用NK92MI-CD16a细胞为效应细胞，实施例1构建的HEK293A/人TIGIT为靶细胞，检测去岩藻糖化抗体引发ADCC杀伤效应的能力，参照实施例10的方法步骤，略作修改。具体地，HEK293A/人TIGIT细胞和效应细胞NK92MI-CD16a(Huabo Bio)均以1200rpm离心5分钟，随后混悬在ADCC检测培养基(MEM培养基，Cat#：12561-056，Gibco；1％FBS，Cat#：FND500，EX-cell；1％BSA，Cat#：V900933-1KGV，ETEC)中，根据细胞计数看，细胞活力为约90％。调整HEK293A/人TIGIT的细胞密度为4x10⁵/ml，NK92MI-CD16a的细胞密度调整为2x10⁶/ml，两种细胞各加50μl到96孔板的各孔中，效靶比5∶1。将待测抗体分别稀释成不同浓度加入各孔，初始抗体终浓度为50000ng/ml，5倍稀释，10个浓度。样本在37℃孵育4小时后，细胞用PBS洗3遍，然后与LIVE/DEAD可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用PBS洗3遍，加入2μl PE小鼠抗人CD69抗体(Cat#：555531，BD，美国)常温孵育30分钟后，离心，PBS洗3次。用FACS进行检测。计算出GFP阳性细胞(HEK293A/人TIGIT细胞)的细胞死亡率和GFP阴性细胞(NK92MI-CD16a细胞)PE染色的平均荧光强度。

结果如图11(A)所示，去岩藻糖化显著提高了MBS310-6的ADCC效应，MBS310-6-AF不仅比MBS310-6的杀伤效果强，还比单特异性母本抗体70E11VH2VL4的ADCC效果强。同时，MBS310-6-AF显著增强了NK细胞的激活，其对NK92细胞表面CD69的诱导表达量显著高于70E11VH2VL4和MBS310-6，如图11(B)所示。

实施例13.示例性双特异性抗体的体内抗肿瘤效果

对抗体MBS310-6-AF、70E11VH2VL4-AF以及PD-L1抗体阿替利珠单抗的体内抗肿瘤效果进行研究，这些抗体均具有人IgG1/κ恒定区，其中MBS310-6-AF和70E11VH2VL4-AF的Fc区是去岩藻糖化的。

具体地，待NSCLC030(人源非小细胞肺癌)PDX荷瘤小鼠的肿瘤生长至500-800mm³时，安乐死动物，剥离肿瘤，剔除坏死部分，切成约2mm×2mm×2mm的小块，用套管针接种于6-8周龄雄性NCG小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司)的右侧胁肋部皮下，每只小鼠接种一个瘤块，这一天设为第0天。在瘤块接种后，将来自正常健康成人外周血的PBMC(外周血单个核细胞)接种至小鼠体内，2×10⁶/只。待平均肿瘤体积达到50-70mm³左右时，也即第9天时，小鼠根据肿瘤体积分组，共5组，每组8只动物。各组小鼠在第9、12、16、19、23、26和30天分别腹腔注射MBS310-6-AF(20mg/kg)、70E11VH2VL4-AF(10mg/kg)、阿替利珠单抗(5mg/kg)、MBS310-6-AF(20mg/kg)+阿替利珠单抗(5mg/kg)、以及PBS。

随时间追踪肿瘤大小和小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤的长边(D)和短边(d)，并通过公式TV＝0.5x D x d²计算肿瘤体积。在抗体组肿瘤达到3.5cm³前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。

如图12所示，双特异性抗体MBS310-6-AF能显著抑制PDX肿瘤模型生长，其抗肿瘤效果显著高于单特异性抗体70E11VH2VL4-AF。在该模型中，阿替利珠单抗也具备很强的抗肿瘤生长效果，MBS310-6-AF与阿替利珠单抗的联用能增强对PDX肿瘤生长的抑制作用。

本申请的示例性序列信息如下。

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尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。

序列表

<110> 北京天广实生物技术股份有限公司

<120> 结合TIGIT和VEGF的双特异性分子及其用途

<130> 55556 00068

<160> 30

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70E11VH2VL4抗体、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中TIGIT结合域的VH-

CDR1

<400> 1

Ser Tyr Asn Val His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

CDR2

<400> 2

Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

CDR3

<400> 3

Ser Gly Thr Met Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70E11VH2VL4抗体、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中TIGIT结合域的VL-

CDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr Tyr Leu His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

CDR2

<400> 5

Asn Thr Gln Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

CDR3

<400> 6

Gln Gln Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Ile Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中VEGF结合域的VH-CDR1

<400> 7

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中VEGF结合域的VH-CDR2

<400> 8

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys

1 5 10 15

Arg

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中VEGF结合域的VH-CDR3

<400> 9

Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中VEGF结合域的VL-CDR1

<400> 10

Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中VEGF结合域的VL-CDR2

<400> 11

Phe Thr Ser Ser Leu His Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗、MBS310-4、MBS310-6、和MBS310-7中VEGF结合域的VL-CDR3

<400> 12

Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70E11VH2VL4的VH

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70E11VH2VL4的VL

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Thr Gln Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 15

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗的VH

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 贝伐单抗的 VL

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 18

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 19

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链恒定区

<220>

<221> 其他特征

<222> (249)..(249)

<223> Xaa可以是Thr、Trp、或Ser

<220>

<221> 其他特征

<222> (251)..(251)

<223> Xaa可以是Leu或Ala

<220>

<221> 其他特征

<222> (290)..(290)

<223> Xaa可以是Tyr或Val

<400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Xaa Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链恒定区

<400> 20

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 21

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310-6中TIGIT抗体重链

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 22

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310-6TIGIT抗体轻链、MBS310-4短链

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Thr Gln Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310-6中VEGF抗体重链

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310-6中VEGF抗体轻链、MBS310-7短链

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 713

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310-7长链

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

465 470 475 480

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

485 490 495

Phe Thr Ser Tyr Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

500 505 510

Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Ala Thr Ser Tyr

515 520 525

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr

530 535 540

Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

545 550 555 560

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

565 570 575

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr

595 600 605

Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Met

610 615 620

Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr

625 630 635 640

Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Gln

645 650 655

Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

660 665 670

Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Glu Ala

675 680 685

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Ile Thr Phe Gly

690 695 700

Ala Gly Thr Lys Leu Thr Ala Lys Arg

705 710

<210> 26

<211> 711

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MBS310-4长链

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Leu Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

450 455 460

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

465 470 475 480

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp

485 490 495

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn

500 505 510

Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe

515 520 525

Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn

530 535 540

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro

545 550 555 560

His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

565 570 575

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

580 585 590

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

595 600 605

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

610 615 620

Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

625 630 635 640

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser

645 650 655

Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

660 665 670

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Thr

675 680 685

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly

690 695 700

Thr Lys Leu Thr Ala Lys Arg

705 710

<210> 27

<211> 244

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 27

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

165 170 175

Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

195 200 205

Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp

210 215 220

Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe

225 230 235 240

Thr Glu Thr Gly

<210> 28

<211> 312

<212> PRT

<213> 食蟹猕猴（Macaca fascicularis）

<400> 28

Met Ala Phe Leu Val Ala Pro Pro Met Gln Phe Val Tyr Leu Leu Lys

1 5 10 15

Thr Leu Cys Val Phe Asn Met Val Phe Ala Lys Pro Gly Phe Ser Glu

20 25 30

Thr Val Phe Ser His Arg Leu Ser Phe Thr Val Leu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Tyr Phe Arg Trp Gln Lys Arg Pro His Leu Leu Pro Val Ser Pro Leu

50 55 60

Gly Arg Ser Met Arg Trp Cys Leu Phe Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu

65 70 75 80

Arg Gln Ala Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr

85 90 95

Thr Gly Asn Ile Ser Ala Lys Lys Gly Gly Ser Val Ile Leu Gln Cys

100 105 110

His Leu Ser Ser Thr Met Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln

115 120 125

His Asp His Ser Leu Leu Ala Ile Arg Asn Ala Glu Leu Gly Trp His

130 135 140

Ile Tyr Pro Ala Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly

145 150 155 160

Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys

165 170 175

Thr Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Arg Gly Arg Ile Phe Leu

180 185 190

Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Ser Ala Arg Phe Gln Ile

195 200 205

Pro Leu Leu Gly Ala Met Ala Met Met Leu Val Val Ile Cys Ile Ala

210 215 220

Val Ile Val Val Val Val Leu Ala Arg Lys Lys Lys Ser Leu Arg Ile

225 230 235 240

His Ser Val Glu Ser Gly Leu Gln Arg Lys Ser Thr Gly Gln Glu Glu

245 250 255

Gln Ile Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu

260 265 270

Ala Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu Gln Gln Gly Asp Asp Cys Ala

275 280 285

Glu Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Ser

290 295 300

Cys Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly

305 310

<210> 29

<211> 241

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 29

Met His Gly Trp Leu Leu Leu Val Trp Val Gln Gly Leu Ile Gln Ala

1 5 10 15

Ala Phe Leu Ala Thr Gly Ala Thr Ala Gly Thr Ile Asp Thr Lys Arg

20 25 30

Asn Ile Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ser Val Ile Leu Gln Cys His Phe

35 40 45

Ser Ser Asp Thr Ala Glu Val Thr Gln Val Asp Trp Lys Gln Gln Asp

50 55 60

Gln Leu Leu Ala Ile Tyr Ser Val Asp Leu Gly Trp His Val Ala Ser

65 70 75 80

Val Phe Ser Asp Arg Val Val Pro Gly Pro Ser Leu Gly Leu Thr Phe

85 90 95

Gln Ser Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr His

100 105 110

Thr Tyr Pro Gly Gly Ile Tyr Lys Gly Arg Ile Phe Leu Lys Val Gln

115 120 125

Glu Ser Ser Val Ala Gln Phe Gln Thr Ala Pro Leu Gly Gly Thr Met

130 135 140

Ala Ala Val Leu Gly Leu Ile Cys Leu Met Val Thr Gly Val Thr Val

145 150 155 160

Leu Ala Arg Lys Lys Ser Ile Arg Met His Ser Ile Glu Ser Gly Leu

165 170 175

Gly Arg Thr Glu Ala Glu Pro Gln Glu Trp Asn Leu Arg Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Pro Gly Ser Pro Val Gln Thr Gln Thr Ala Pro Ala Gly Pro Cys

195 200 205

Gly Glu Gln Ala Glu Asp Asp Tyr Ala Asp Pro Gln Glu Tyr Phe Asn

210 215 220

Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Glu Ser Phe Ile Ala Val Ser Lys Thr

225 230 235 240

Gly

<210> 30

<211> 417

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 30

Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln

20 25 30

Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro

35 40 45

Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu

50 55 60

Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln

65 70 75 80

Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly

100 105 110

Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe

115 120 125

Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys

130 135 140

Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro

145 150 155 160

Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln

165 170 175

Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val

180 185 190

Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu

195 200 205

Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu

210 215 220

His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr

245 250 255

Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro

260 265 270

Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro

275 280 285

Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys

290 295 300

Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala

305 310 315 320

Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu

325 330 335

His Ser Gly Ile Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile

340 345 350

Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser

355 360 365

Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser

370 375 380

Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His Val Ser Tyr Ser Ala

385 390 395 400

Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro Gln Thr Glu Gly Thr

405 410 415

Arg

Claims

1.一种双特异性分子，包含：

TIGIT结合域和VEGF结合域，

所述TIGIT结合域包括特异结合TIGIT的抗体或其抗原结合部分；

所述VEGF结合域包括特异结合VEGF的抗体或其抗原结合部分。

2.如权利要求1所述的双特异性分子，包含：

i)第一多肽链，从N端到C端包含特异结合TIGIT的重链可变区、和重链恒定区；

ii)第二多肽链，包含特异结合TIGIT的轻链可变区；

iii)第三多肽链，从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、和重链恒定区；以及

iv)第四多肽链，包含特异结合VEGF的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区和第二多肽链中特异结合TIGIT的轻链可变区能够结合形成特异结合TIGIT的抗原结合部分，第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区与第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区能够结合形成特异结合VEGF的抗原结合部分，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区能够结合在一起；或者

i)第一多肽链，从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的重链可变区、和特异结合TIGIT的轻链可变区；

ii)第二多肽链，包含特异结合VEGF的轻链可变区；

iii)第三多肽链，从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、重链恒定区、特异结合TIGIT的重链可变区、和特异结合TIGIT的轻链可变区；以及

iv)第四多肽链，包含特异结合VEGF的轻链可变区，

其中第一多肽链中特异结合VEGF的重链可变区和第二多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区能够结合形成特异结合VEGF的抗原结合片段，第一多肽链中特异结合特异结合TIGIT的重链可变区和特异结合TIGIT的轻链可变区能够结合形成特异结合TIGIT的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合VEGF的重链可变区和第四多肽链中特异结合VEGF的轻链可变区能够结合形成特异结合VEGF的抗原结合片段，第三多肽链中特异结合TIGIT的重链可变区和特异结合TIGIT的轻链可变区能够结合形成特异结合TIGIT的抗原结合片段，且第一多肽链的重链恒定区与第三多肽链的重链恒定区能够结合在一起。

3.如权利要求2所述的双特异性分子，其为去岩藻糖化的分子。

4.如权利要求3所述的双特异性分子，其中所述从N端到C端包含特异结合TIGIT的重链可变区、和重链恒定区的第一多肽链中的重链恒定区带有臼结构，所述从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、和重链恒定区的第三多肽链中的重链恒定区带有杵结构；或者所述从N端到C端包含特异结合TIGIT的重链可变区、和重链恒定区的第一多肽链中的重链恒定区带有杵结构，所述从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、和重链恒定区的第三多肽链中的重链恒定区带有臼结构。

5.如权利要求4所述的双特异性分子，其中所述第二多肽链和/或第四多肽链还在C端包含轻链恒定区。

6.如权利要求1-5任一项所述的双特异性分子，所述特异结合VEGF的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：7、8和9所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3，所述特异结合VEGF的轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：10、11和12所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。

7.如权利要求6所述的双特异性分子，其中所述特异结合VEGF的重链可变区包含如SEQID NO：15所示的氨基酸序列，所述特异结合VEGF的轻链可变区包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

8.如权利要求7所述的双特异性分子，其中所述特异结合TIGIT的重链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1、2和3所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3，所述特异结合TIGIT的轻链可变区包含氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：4、5和6所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3。

9.如权利要求8所述的双特异性分子，其中所述特异结合TIGIT的重链可变区包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述特异结合TIGIT的轻链可变区包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

10.如权利要求9所述的双特异性分子，其中所述从N端到C端包含特异结合TIGIT的重链可变区、和重链恒定区的第一多肽链的重链恒定区包含SEQ ID NO：19(X1＝S、X2＝A、X3＝V)所示的氨基酸序列，所述从N端到C端包含特异结合VEGF的重链可变区、和重链恒定区的第三多肽链的重链恒定区包含SEQ ID NO：19(X1＝W、X2＝L、X3＝Y)所示的氨基酸序列。

11.一种核酸分子，其编码权利要求1-10中任一项所述的双特异性分子。

12.一种表达载体，其包含权利要求11所述的核酸分子。

13.一种宿主细胞，其包含权利要求12所述的表达载体。

14.一种组合物，包含权利要求1-10中任一项所述的双特异性分子、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体、或权利要求13所述的宿主细胞。

15.权利要求14所述的组合物在制备一种用于治疗或减缓TIGIT通路和/或VEGF通路相关疾病的药物中的用途。

16.如权利要求15所述的用途，其中TIGIT通路和/或VEGF通路相关疾病为实体瘤。