BR112018016461A2 - anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos - Google Patents

anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos Download PDF

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Abstract

a presente invenção se refere a anticorpos e fragmentos que se ligam a um supressor de ig de domínio v de ativação de célula t (vista), e métodos de provocação de certas respostas biológicas com o uso dos anticorpos. os métodos de identificação dos anticorpos anti-vista com capacidade de provocação de certas respostas biológicas são também incluídos.

Description

1/142
ANTICORPOS E FRAGMENTOS ANTI-VISTA, USOS DOS
MESMOS E MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DOS MESMOS PEDIDO(S) RELACIONADO(S) [0001] Este pedido reivindica o benefício do
Pedido Provisório n° US 62/294.922, depositado em 12 de
fevereiro de 2016. Os ensinamentos integrais do pedido supracitado são incorporados no presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] A expressão de reguladores imunes negativos por células cancerosas ou células imunes no microambiente tumoral pode suprimir a resposta imune do hospedeiro contra o tumor. Para combater de modo eficaz o câncer, é desejável bloquear a supressão mediada por tumor da resposta imune de hospedeiro. Consequentemente, há uma necessidade por agentes terapêuticos novos e eficazes que inibem reguladores imunes negativos no microambiente tumoral que suprime respostas imunes antitumorais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0003] A presente invenção fornece, em uma modalidade, um método de provocação de uma resposta biológica em um indivíduo. O método compreende as etapas de administrar a um indivíduo um anticorpo que se liga a uma proteína de Supressor de Ig de domínio V de Ativação de célula T (VISTA), ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, em uma quantidade suficiente para provocar uma resposta biológica no indivíduo. Em certas modalidades, a resposta biológica é selecionada a partir do grupo que consiste em uma diminuição no número de células imunes em circulação; uma diminuição no número de granulócitos em
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2/142 medula óssea e baço; um aumento no número de neutrófilos, macrófagos, células T ou uma combinação dos mesmos em um microambiente tumoral (TME); e um aumento no nível de um ou mais citocinas (por exemplo, quimiocinas); ou qualquer combinação dessas respostas. Em uma modalidade particular, o anticorpo que se liga a VISTA, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende uma região de Fc que se liga a um receptor de Fc (por exemplo, receptor de CD16) em células imunes (por exemplo, células NK).
[0004] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método de identificação de um anticorpo que se liga a uma proteína de Supressor de Ig de domínio V de Ativação de célula T (VISTA) e provoca uma resposta biológica. O método compreende as etapas de fornecer um anticorpo que se liga a VISTA, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, a uma célula, tecido, órgão ou organismo, e determinar se o anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo induz uma resposta biológica na célula, tecido, órgão ou organismo. Em certas modalidades, a resposta biológica é selecionada a partir do grupo que consiste em ativação de monócitos; ativação de células T; uma diminuição no número de células imunes em circulação; uma diminuição no número de granulócitos em medula óssea e baço; um aumento no número de neutrófilos, macrófagos ou ambos em um microambiente tumoral; e um aumento no nível de uma ou mais citocinas; ou qualquer combinação dessas respostas. Em uma modalidade particular, o anticorpo que se liga a VISTA, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, compreende uma região de Fc que se liga a um receptor de Fc (por exemplo, receptor de CD16) em células imunes (por exemplo, células
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NK) .
[0005] Os métodos da presente invenção são úteis para, por exemplo, caracterizar anticorpos que se ligam à proteína VISTA e para triar anticorpos anti-VISTA candidatos em relação a atividades biológicas associadas à eficácia terapêutica potencial.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0006] O arquivo de pedido de patente contém pelo menos um desenho colorido. As cópias desta patente ou da publicação de pedido de patente com desenho (s) colorido(s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0007] Figuras 1A-1C: Gráficos que mostram expressão de VISTA em Expressão de Células TF1 de LMA de proteína VISTA por citometria de fluxo são mostrados na linhagem celular TF-1 de LMA.
[0008] Figuras 2A-2E: Gráficos que mostram estratégias de coloração e comutação para identificação de Subconjuntos de Mieloide e Linfoide Humanos.
[0009] Figuras 3A-3G: Gráficos que mostram expressão de VISTA em Subconjuntos de Mieloide e Linfoide Humanos de um doador saudavelmente normal.
[0010] Figura 4: Gráfico que mostra expressão de VISTA em Subconjuntos de Mieloide e Linfoide Humanos através de múltiplos doadores saudavelmente normais.
[0011] Figuras 5A-5B: Gráfico que mostra estratégias de coloração e comutação para identificação de expressão de VISTA em monócitos e macrófagos humanos.
[0012] Figuras 6A-6C: Gráficos que mostram expressão de VISTA em monócitos e macrófagos humanos.
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4/142 [0013] Figuras 7A-7E: Gráficos que mostram
estratégiaí s de coloração e comutação para identificação de
expressão Humanas. de VISTA em Subconj untos de Células T e NK
^0014] Figuras 8A-8G: Gráficos que mostram
expressão de VISTA em Subconj untos de Células T e NK
Humanas de um doador saudavelmente normal.
[0015] Figura 9: Gráfico que mostra expressão de VISTA em Subconjuntos de Células T e NK Humanas através de múltiplos doadores saudavelmente normais.
[0016] Figuras 10A-10D: Gráficos que mostram estratégias de coloração e comutação para identificação de expressão de VISTA em Subconjuntos de Célula Dendrítica Humana.
[0017] Figuras 11A-11C: Gráficos que mostram expressão de VISTA em Subconjuntos de Célula Dendrítica Humana e basófilos de um doador saudavelmente normal.
[0018] Figura 12: Gráfico que mostra expressão de VISTA em Subconjuntos de Célula Dendrítica Humana e basófilos através de múltiplos doadores saudavelmente normais.
[0019] Figuras 13A-13D: Análise de expressão de VISTA em células periféricas humanas saudáveis. Perfil de expressão de VISTA em células periféricas humanas saudáveis com o uso de análise de citometria de fluxo multicolorida: Amostras de sangue total de 2 indivíduos diferentes foram analisadas em relação à expressão de VISTA em (Figura 13A) monócitos (SSClo'CDllbhiCD14hiCD16· veCD33+veHLA-DR+veCDl 9~ve) (Figura 13B) neutrófilos (SSChiCDl 7 7+CDl lbhiCDl 41OCD1 6+veCD33+veHLA-DR~veCDl 9~ve ) .
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5/142
Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas com o uso de gradiente Ficoll para análise de (Figura 13C) células T de CD4+ (CD3+veCD4+ve) , e (Figura 13D) células T de
CD8+ (CD3+veCD8+ve) .
[0020] Figuras 14A-14C: Análise de expressão de VISTA em células de sangue periférico de um paciente com câncer de pulmão e um doador de controle saudável. Perfil de expressão de VISTA em células de sangue periférico de paciente com câncer de pulmão com o uso de análise de citometria de fluxo multicolorida: Plotagem de FACS representativa (Figura 14A) de um indivíduo é mostrada. Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas por Ficoll e analisadas em relação à expressão de VISTA em (Figura 14B) monócitos (CD14+ CDllbf CD33+ HLADR+ CD15-) e (Figura 14C) células supressoras derivadas de mieloide (CD14-CDllb+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+).
[0021] Figuras 15A-15C: Perfil de expressão de VISTA em células de sangue periférico de um paciente com câncer de cólon, com o uso de análise de citometria de fluxo multicolorida: Plotagem de FACS representativa (Figura 15A) de um indivíduo é mostrada. Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas por Ficoll e analisadas em relação à expressão de VISTA em (Figura 15B) monócitos (CD14+ CDllbf CD33+ HLADR+ CD15-) e (Figura 15C) células supressoras derivadas de mieloide (CD14-CDllb+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+).
[0022] Figuras 16A-16D: Perfil de expressão de VISTA em células de sangue periférico de macaco-cinomolgo com o uso de análise de citometria de fluxo multicolorida: Sangue total de 4 macacos diferentes foi analisado em
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6/142 relação à expressão de VISTA em (Figura 16A) monócitos (SSC1OCD1 lbhiCDl 4hiHLA-DRhiCDl 6~veCDl 9~ve) e (Figura 16B) neutrófilos (CDllbhiCD14loHLA-DR’veCD16’veCD19’ve) . Células mononucleares de sangue periférico de três macacos foram isoladas com o uso de gradiente Ficoll para análise de (Figura 16C) células T de CD4+ (TCRa/[3+veCD4+ve) e (Figura 16D) células T de CD8+ (TCRa/[3+veCD8+ve) .
[0023] Figura 17: Gráfico que mostra valores de expressão absolutos de RNA de VISTA em linhagens celulares Heme.
[0024] Figura 18: Células A20 de camundongo foram estavelmente transfectadas com GFP ou VISTA humana. As foram incubadas com peptídeo ova e com células T de DO11.10. A expressão de CD25 pelas células T foi medida 24 horas após a incubação ter começado. As células A20-huVISTA suprimem a expressão de CD25 pelas células T, mas essa leitura é significativamente restaurada por incubação com VSTB95.
[0025] Figuras 19A-19F: Gráficos que mostram resultados de ELISA de VISTA humana.
[0026] Figuras 20A-20F: Resultados de FACS de VISTA humana, que mostram anticorpos anti-VISTA que ligam a células que expressam VISTA humana.
[0027] Figuras 21A-21D: Estudo de diluição de 6 candidatos de anticorpo anti-VISTA na reação de linfócito misturada de 30 pg/ml a 0,0 pg/ml.
[0028] Figuras 22A-22B: Estudos de diluição de 6 candidatos de anticorpo anti-VISTA no ensaio de EBS (contagens de CMM individuais e concentrações de IFN-g) de 30 pg/ml a 0,0 pg/ml.
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7/142 [0029] Figura 23: Plotagem de sensorgrama com o uso de anticorpo anti-VISTA VSTB85 revestido em um pedaço de Proteon RPS e proteína VISTA com os competidores indicados dispostos sobre o pedaço (competidores listados na Tabela 16).
[0030] Figura 24: Projeto experimental para modelo tumoral de bexiga murina MB49 [0031] Figuras 25A-25B: Crescimento tumoral de MB49 em camundongo C57B1/6 fêmea. Gráficos ilustram crescimento tumoral em camundongos individuais tratados com anticorpo de VISTA anticamundongo (Figura 25B) ou IgG de controle (Figura 25A).
[0032] Figura 26: Sequência de aminoácidos de VISTA humana (SEQ ID NO:46).
[0033] Figura 27: Múltiplo alinhamento de sequências de ortólogos de VISTA [0034] Figura 28: Regiões de VISTA humana delimitadas por anticorpos VSTB50 e VSTB60 (topo) ou anticorpos VSTB95 e VSTB112 (fundo), como determinado por TDH [0035] Figura 29: Epítopo de VISTA delimitado por VSTB112. (Topo) VISTA é mostrada em desenho com fitas identificadas. Resíduos tendo pelo menos um átomo dentro de 5 Â de VSTB112 no complexo possuem cor azul. As esferas de cores azul e laranja destacam uma quebra de cadeia, e as esferas de cores ciano e verde marcam os terminais N e C da estrutura de VISTA, respectivamente. (Fundo) Sequência de construto de VISTA usada em determinação de estrutura. Os círculos abaixo da sequência são usados para indicar resíduos que realizam apenas contatos de cadeia principais
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8/142 com VSTB112, os triângulos indicam um contato de cadeia lateral e os quadrados indicam o contato de cadeia lateral que resulta em uma interação de ligação de hidrogênio ou ponte de sal como calculado por PISA. Os formatos são coloridos para indicar a CDR que tem o maior número de átomos em contato pelo determinado resíduo com cores de CDR definidas na Figura 59. Os elementos estruturais secundários são como definido no programa MOE com setas amarelas representando β-fitas e retângulos vermelhos indicando a-hélices.
[0036] Figura 30: Parátopo de VSTB112. (Topo) O antígeno de VISTA é mostrado em ilustração e VSTB112 dentro de 5 angstrom (Â) de VISTA é mostrado em superfície com cores usadas para designar identidade de CDR como especificado na sequência abaixo. O contato de resíduos de estrutura adjacentes a uma CDR são coloridos de modo similar à sequência de CDR (Fundo) correspondente de região de Fv de VSTB112. Fundos coloridos especificam CDRs de acordo com definições de Rabat. Os círculos abaixo da sequência são usados para indicar resíduos que realizam apenas contatos de cadeia principais com VISTA, os triângulos indicam um contato de cadeia lateral e os quadrados indicam o contato de cadeia lateral que resulta em uma interação de ligação de hidrogênio ou ponte de sal como calculado por PISA.
[0037] Figura 31: Comparação de regiões de epítopo identificadas por cristalografia e troca de deutério de hidrogênio (TDH). Sequência de construto de VISTA usada em determinação de estrutura. Os círculos abaixo da sequência são usados para indicar resíduos que
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9/142 realizam apenas contatos de cadeia principais com VSTB112, os triângulos indicam um contato de cadeia lateral e os quadrados indicam o contato de cadeia lateral que resulta em uma interação de ligação de hidrogênio ou ponte de sal como calculado por PISA.
[0038] Figura 32: Ativação de monócitos de CD14+ em PBMC total por VSTB174 (derivado de VSTB112) . Em cada parte do experimento, as células foram incubadas com PBS, anticorpo de controle de IgGl, ou VSTB174 a 1, 0,1 ou 0,01 ug/ml. Painel esquerdo mostra IFM de CD80; painel direito mostra IFM de HLA-DR (dois doadores testados com resultados representativos mostrados).
[0039] Figura 33: Gráfico que mostra atividade de CCDA de VSTB174 direcionada contra células K562-VISTA.
[0040] Figura 34: Gráfico que mostra atividade de FCDA de VSTB174 direcionada contra células K562-VISTA. Ambos os anticorpos apresentaram o mesmo Fab, mas VSTB174 tem um Fc de IgGl e VSTB140 tem IgG2 silenciosa de Fc.
[0041] Figura 35: Gráfico que mostra fagocitose mediada por mAbs de VSTB174, VSTB149 ou VSTB140 contra K562-VISTA. Cada mAb foi testado com 7 doses de meio logaritmo, na faixa de 0,0008 pg/ml a 0,56 ug/ml.
[0042] Figura 36: Gráfico que mostra fagocitose mediada por mAbs de VSTB174, VSTB149 ou VSTB140 contra células K562 de linhagem celular de mieloma. Cada mAb foi testado com 7 doses de meio logaritmo, na faixa de 0,0008 pg/ml a 0,56 ug/ml.
[0043] Figura 37: Estudo de eficácia tumoral de MB49 que avalia VSTB123 1, 5, 7,5, e 10 mg/kg em camundongos VISTA-KI fêmeas. Os volumes tumorais foram de
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10/142 aproximadamente 50 mm3 quando a dosagem começou no dia 6 após o implante. VSTB123 é o Fab de VSTB112 enxertado sobre um arcabouço de Fc de camundongo e se liga a VISTA humano no camundongo VISTA-KI.
[0044] Figura 38: O gráfico mostra que as células CD14+ que expressam níveis altos/intermediários de VISTA são encontradas em 13/13 amostras de câncer de pulmão, assim como em tecido pulmonar distante e sangue periférico de pacientes.
[0045] Figura 39: Coloração de IHC para VISTA em câncer de pulmão com o uso de GG8.
[0046] Figura 40: Anticorpo anti-VISTA dispara ativação de monócito através de reticulação de CD16. A expressão de PD-L1 é usada como um marcador de ativação de mieloide com o uso de PBMCs humanas. Anti-CD16, usado como o controle positivo, induziu ativação de monócito robusta; Bloco de Fc (mistura de fragmentos de IgGl Fc) , usado como o controle negativo, bloqueou a ativação de monócito. VSTB112, mas não VSTB140, induz ativação de monócito em comparação com o controle de IgGl humana.
[0047] Figura 41: Esquemático de projeto de estudo para efeito de VSTB123 ou VSTB124 no crescimento de tumores MB49 estabelecidos em camundongos hVISTA Kl (knockin). Os anticorpos foram injetados em dias de estudo 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19, 21, 24 e 26. As amostras de sangue foram coletadas nos dias -2, -1, 0, 4, 7, 11, 14, 18, 24, 31 e 39. Se as amostras de sangue forem retiradas no mesmo dia que uma injeção de anticorpo, as amostras de sangue foram retiradas primeiramente.
[0048] Figuras 42A e 42B: Crescimento tumoral
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11/142 de MB49 em camundongos fêmeas hVISTA KI (Figura 42A) e sobrevivência de camundongos que portam tumores MB49 após tratamento com VSTB123 ou VSTB124 em camundongos fêmeas hVISTA Kl (Figura 42B) . Na Figura 42A, as medições de volume tumoral médio (mm3) são mostradas para camundongos fêmeas tratadas com VSTB123 ou VSTB124 em comparação com o grupo de controle de IgG2 de camundongo. 0 período de tratamento foi dos dias 5-26. Média +/- EPM mostrado. Observa-se que os eixos geométricos y diferem dentre os gráficos. Os dados para os camundongos fêmeas são representados em gráfico até o dia 33, quando >70 % de camundongos ainda estavam vivos em cada grupo (n=6 ou 7 por grupo). Na Figura 42B, o percentual de sobrevivência de camundongos fêmeas hVISTA Kl é representado em gráfico, VSTB123 10 mg/kg, p = 0,0108. O período de tratamento foi dos dias 5-26.
[0049] Figura 43: Alteração em vezes em expressão de 41 citocinas por PBMC tratada com VSTB174. PBMC total de três doadores humanos saudáveis foram tratados com VSTB174 ou anticorpos de controle de IgGl por 24 horas nas concentrações indicadas. A produção de citocina foi analisada por um kit multiplex de 41 citocinas. A alteração em vezes média em expressão sobre o controle de IgGl é mostrada como um mapa de calor com um escala de cor logarítmica. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre médias de tratamento e amostra de controle. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, * * **p<0, 0001. Fora da faixa (OOR) denota que todas as amostras para aquela citocina naquele doador estavam além dos limites de detecção precisa (> acima, < abaixo).
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12/142 [0050] Figuras 44A e 44B: Ativação de macrófago em tumores MB49. A Figura 44A mostra um esquemático do projeto de estudo. A Figura 44B indica macrófagos de CD80+ aumentados no microambiente tumoral com VSTB123, mas não VSTB124. Os camundongos hVISTA Kl que portam tumor MB49 foram tratados com VSTB123, VSTB124 ou m!gG2a de controle e seus tumores foram analisados, 24 h após a terceira dose, para determinar a expressão relativa de CD80 em macrófagos infiltrantes em tumor. Cada grupo conteve 5 camundongos. As barras horizontais indicam médias. *p<0,05.
[0051] Figura 45: Migração de células MPO+
para o microambiente tumoral. [0052] Figura 46: VSTB174 induz diminuição
transiente em neutrófilos. [0053] Figura 47 : Mecanismo de ação proposto
de anticorpo anti-VISTA (por exemplo, VSTB174).
[0054] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0055] A seguir, uma descrição de modalidades exemplificativas da invenção.
[0056] A presente invenção se refere a anticorpos para ligante de familia de Imunoglobulina inovadores designados como Supressor de Imunoglobulina de dominio V de Ativação de célula T (VISTA) (Genbank: JN602184) (Wang et al., 2010, 2011). VISTA possui homologia a PD-L1, mas exibe um padrão de expressão exclusivo que é restrito ao compartimento hematopoiético. Especificamente, VISTA é constitutiva e altamente expressa em células mieloides CDllbhigh, e expressas em niveis inferiores de células T de CD4+ e CD8+. O homólogo humano compartilha
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13/142 aproximadamente 85 % de homologia com VISTA murina e tem padrões de expressão similares (Lines et al., Cancer Research 74:1924, 2014). VISTA expressada em células que apresentam antigeno (APCs) suprime proliferação de célula T de CD4+ e CD8+ e produção de citocina através de um receptor cognato independente de PD-1. Em um modelo de doença de EAE passiva (encefalomielite autoimune experimental), um anticorpo monoclonal especifico de VISTA melhorou as respostas imunes dependentes de célula T e exacerbou a doença. A superexpressão de VISTA em células tumorais prejudicou a imunidade antitumoral protetora em hospedeiros que portam tumor. Os estudos de VISTA humana confirmaram sua função supressora em células T humanas (Lines et al Cancer Research 74:1924, 2014) . Os estudos de Flies et al. também identificaram VISTA (chamada de PD-1H) como uma molécula imunossupressora potente (Flies et al., 2011) . VISTA é descrita em detalhes adicionais no Pedido Publicado n° US 20130177557 Al e Patentes n° US7.919.585 e US8.236.304, todas as quais são incorporadas no presente documento a titulo de referência em sua totalidade.
[0057] VISTA é um regulador imune negativo inovador que suprime respostas imunes. Como descrito, por exemplo, no Exemplo 12 no presente documento, o tratamento com um anticorpo monoclonal especifico de VISTA em modelos tumorais murinos demonstrou reversão do caráter supressor do microambiente imune tumoral e melhora de imunidade antitumoral protetora, dessa forma, demonstrando o potencial de um anticorpo monoclonal de VISTA como um terapêutico inovador para imunoterapia de câncer.
[0058] ANTICORPOS E FRAGMENTOS DA PRESENTE
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INVENÇÃO [0059] O termo anticorpo pretende incluir anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e anticorpos anti-idiotipicos (anti-Id), assim como fragmentos, regiões ou derivados dos mesmos, fornecidos por qualquer técnica conhecida, como, mas sem limitação a, divagem enzimática, sintese de peptideo ou técnicas recombinantes. Os anticorpos anti-VISTA da presente invenção são capazes de se ligar a porções de VISTA que modulam, regulam ou melhoram uma resposta imune. Em algumas modalidades, os anticorpos inibem competitivamente um ou mais dos anticorpos anti-VISTA descritos no presente documento. Os métodos para determinar se dois ou mais anticorpos competem em relação à ligação ao mesmo alvo são conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio de ligação competitiva pode ser usado para determinar se um anticorpo bloqueia a ligação de um outro anticorpo ao alvo. Tipicamente, um ensaio de ligação competitiva envolve o uso de antigeno-alvo purificado (por exemplo, PD-1) ligado a um substrato sólido ou células, uma molécula de ligação de teste não identificada e uma molécula de ligação de referência identificada. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de identificação ligada à superfície sólida ou células na presença da molécula de ligação de teste. Usualmente, a molécula de ligação de teste está presente em excesso. Tipicamente, quando uma molécula de ligação competidora está presente em excesso, a mesma inibirá a ligação especifica de uma molécula de ligação de referência a um antígeno comum em pelo menos 50Petição 870180139997, de 10/10/2018, pág. 17/204
15/142 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 %, 70-75 % ou mais. Em algumas modalidades, a inibição competitiva é determinada com o uso de um ensaio ELISA de inibição competitiva.
[0060] Os anticorpos policlonais são populações heterogêneas de moléculas de anticorpo derivadas dos soros de animais imunizados com um antígeno. Um anticorpo monoclonal contém uma população substancialmente homogênea de anticorpos específicos a antigenos, cuja população contém sitios de ligação de epitopo substancialmente similares. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Consulte, por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); Patente US n° 4.376.110; Ausubel et al. , eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, e Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); e Harlow e Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, e Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), cujos conteúdos são incorporados inteiramente no presente documento a titulo de referência. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD e qualquer subclasse da mesma. Um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser cultivado in vitro, in situ ou in vivo.
[0061] A invenção também abrange fragmentos de digestão, porções especificadas e variantes dos mesmos, incluindo miméticos de anticorpo ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou a função de um anticorpo ou fragmento especificado ou porção do mesmo,
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16/142 incluindo anticorpos de cadeia única e fragmentos dos mesmos. Os fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a uma proteína VISTA de mamífero. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo capazes de ligação a VISTA ou porções da mesma, incluindo, mas sem limitação a, fragmentos Fab (por exemplo, por digestão de papaína), Fab' (por exemplo, por digestão de pepsina e redução parcial) e F(ab')2 (por exemplo, por digestão de pepsina), facb (por exemplo, por digestão de plasmina), pFc' (por exemplo, por digestão de pepsina ou plasmina), Fd (por exemplo, por digestão de pepsina, redução parcial e reagregação) , Fv ou scFv (por exemplo, por técnicas de biologia molecular), são abrangidos pela invenção (consulte, por exemplo, Colligan, Immunology, supra). Os fragmentos de anticorpo da presente invenção também incluem aqueles discutidos e descritos em Aaron L. Nelson, mAbs 2:1, 77-83 (janeiro/fevereiro de 2010), cujos conteúdos são incorporados a título de referência em sua totalidade.
[0062] Tais fragmentos podem ser produzidos, por exemplo, por divagem enzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, como conhecido na técnica e/ou como descrito no presente documento. Os anticorpos também podem ser produzidos em uma variedade de formas truncadas com o uso de genes de anticorpo nos quais um ou mais códons de parada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. Por exemplo, um gene de combinação que codifica uma porção de cadeia pesada de F(ab')2 pode ser projetado para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CHI e/ou a região de articulação da cadeia pesada. As várias porções de anticorpos podem ser unidas quimicamente por
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17/142 técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua com o uso de técnicas de engenharia genética.
[0063] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina, ou porção da
mesma (por exemplo, região variável, CDR) tem cerca de 70-
100 % de identidade (por exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75,
76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor incluído nesses) com a sequência de aminoácidos da cadeia de sequência variável correspondente descrita no presente documento. De preferência, 70-100 % de identidade de aminoácido (por exemplo, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor incluído nesses) são determinados com o uso de um algoritmo de computador adequado, como conhecido na técnica.
[0064] Os exemplos de sequências de regiões de cadeia pesada e cadeia leve variáveis são fornecidos no presente documento.
[0065] Os anticorpos da presente invenção, ou variações especificadas dos mesmos, podem compreender qualquer número de resíduos de aminoácido contíguos de um anticorpo da presente invenção, em que esse número é selecionado a partir do grupo de números inteiros que consiste em de 10-100 % do número de resíduos contíguos em um anticorpo anti-TNF. Opcíonalmente, essa subsequência de aminoácidos contíguos tem pelo menos cerca de 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,
170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 , 250 ou mais
aminoácidos em comprimento, ou qualquer faixa ou valor
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18/142 incluído nesses. Adicionalmente, o número de tais subsequências pode ser qualquer número inteiro selecionado a partir do grupo que consiste em 1 a 20, como pelo menos
2, 3, 4 ou 5.
[0066] Como será apreciado por aqueles elementos versados na técnica, a presente invenção inclui pelo menos um anticorpo biologicamente ativo da presente invenção. Os anticorpos biologicamente ativos têm uma atividade específica de pelo menos 20 %, 30 %, ou 40 %, e de preferência pelo menos 50 %, 60 %, ou 70 %, e com máxima preferência pelo menos 80 %, 90 % ou 95 %-100 % daquele anticorpo nativo (não sintético), endógeno ou relacionado e conhecido. Os métodos de ensaio e quantificação de medidas de atividade enzimática e especificidade de substrato, são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica.
[0067] Similaridade substancial se refere a um composto que tem pelo menos 85 % (por exemplo, pelo menos 95 %) de identidade e pelo menos 85 % (por exemplo, pelo menos 95 %) de atividade do anticorpo nativo (não sintético), endógeno ou relacionado e conhecido.
[0068] Como usado no presente documento, o termo anticorpo humano se refere a um anticorpo no qual substancialmente toda parte da proteína (por exemplo, domínios CDR, estrutura, CL, CH (por exemplo, CHI, CH2, CH3) , articulação, (VL, VH) ) é substancialmente não imunogênica em humanos, com apenas alterações ou variações de seguência menos expressivas. De modo similar, os anticorpos designados de primata (macaco, babuíno, chimpanzé e similares), roedor (camundongo, rato, e similares) e outros mamíferos designam tais anticorpos
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19/142 específicos de espécies, subgênero, gênero, subfamília e família. Adicionalmente, os anticorpos quiméricos podem incluir qualquer combinação dos supracitados. Tais alterações ou variações opcionalmente e, de preferência, retêm ou reduzem a imunogenicidade em humanos ou outras espécies em relação a anticorpos não modificados. Assim, um anticorpo humano é distinto de um anticorpo quimérico ou humanizado. Ressalta-se que um anticorpo humano pode ser produzido por um animal não humano ou célula procariota ou eucariota que é capaz de expressar genes de imunoglobulina humana funcionalmente rearranjados (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeia leve). Adicionalmente, quando um anticorpo humano é um anticorpo de cadeia única, o mesmo pode compreender um peptídeo ligante que não é encontrado em anticorpos humanos nativos. Por exemplo, um Fv pode compreender um peptídeo ligante, como dois a cerca de outros resíduos de glicina ou outros resíduos de aminoácido, que conectam a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve. Considera-se que tais peptídeos ligantes sejam de origem humana.
[0069] Anticorpos biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados ou similares também podem ser usados, os quais são anticorpos monoclonais, de preferência humano ou humanizados, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para pelo menos uma proteína VISTA, a outra é para qualquer outro antígeno. Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção recombinante de anticorpos biespecíficos pode ser baseada
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20/142 na coexpressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesada-cadeia leve, em que as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature 305:537 (1983)). Consulte também WO 93/08829, Patentes n° US6.210.668, US6.193.967, US6.132.992, US6.106.833, US6.060.285, US6.037.453, US6.010.902, US5.989.530, US5.959.084, US5.959.083, US5.932.448, US5.833.985, US5.821.333, US5.807.706, US5.643.759, US5.601.819, US5.582.996, US5.496.549, US4.676.980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al. , EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986), cada inteiramente incorporado no presente documento a título de referência.
[0070] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico que alveja VISTA e uma segunda proteína-alvo (por exemplo, uma proteína de verificação imune). Os anticorpos biespecíficos exemplificativos incluem um anticorpo biespecífico que alveja VISTA e PD-L1 e um anticorpo biespecífico que alveja VISTA e PD-L2.
[0071] Os anticorpos humanos que são específicos para proteínas VISTA humanas ou fragmentos das mesmas podem ser aumentados contra um antígeno imunogênico apropriado, como proteína VISTA ou uma porção da mesma (incluindo moléculas sintéticas, como peptídeos sintéticos).
[0072] Outros anticorpos de mamífero específicos ou gerais podem ser similarmente aumentados. A preparação de antígenos imunogênicos e a produção de anticorpo monoclonal podem ser realizadas com o uso de qualquer técnica adequada.
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21/142 [0073] Por exemplo, um hibridoma é produzido pela fusão de uma linhagem celular imortal adequada (por exemplo, uma linhagem celular de mieloma como, mas sem limitação a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SSI, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, ou similares, ou heteromielomas, produtos de fusão dos mesmos, ou qualquer célula ou célula de fusão derivada dos mesmos, ou qualquer outra linhagem celular adequada como conhecido na técnica, consulte, por exemplo, www.atcc.org, com células que produzem anticorpo. As células que produzem anticorpo podem incluir células de baço, de sangue periférico, linfa, amígdala isoladas ou clonadas ou outras células imunes (por exemplo, células B), ou quaisquer outras células que expressam sequências de estrutura ou região determinante de complementaridade (CDR) constante ou variável de cadeia leve ou pesada. Tais células que produzem anticorpo podem ser células recombinantes ou endógenas, e também podem ser procariotas ou eucariotas (por exemplo, mamíferos, como, roedor, equino, ovino, cabra, ovelha, primata). Consulte, por exemplo, Ausubel, supra, e Colligan, Immunology, supra, capitulo 2, inteiramente incorporados no presente documento a titulo de referência.
[0074] As células que produzem anticorpo também podem ser obtidas a partir do sangue periférico ou, do baço ou nódulos linfáticos, de humanos ou outros animais adequados que foram imunizados com o antígeno de interesse. Qualquer outra célula hospedeira também pode ser usada para
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22/142 expressar ácido nucleico heterólogo ou endógeno que codifica um anticorpo, fragmento especificado ou variante do mesmo, da presente invenção. As células fusionadas (hibridomas) ou células recombinantes podem ser isoladas com o uso de condições de cultura seletivas ou outros métodos conhecidos adequados, e clonadas pela limitação de diluição ou classificação de célula, ou outros métodos conhecidos. As células que produzem anticorpos com a especificidade desejada podem ser selecionadas por um ensaio adequado (por exemplo, ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA)).
[0075] Outros métodos adequados de produção ou isolamento de anticorpos da especificidade requisitada podem ser usados, incluindo, mas sem limitação a, métodos que selecionam anticorpo recombinante a partir de uma biblioteca de peptídeo ou proteína (por exemplo, mas sem limitação a, um bacteriófago, ribossoma, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, ou similares, biblioteca de exibição; por exemplo, como disponível junto à Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, Reino Unido; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, Alemanha; Biovation, Aberdeen, Escócia, Reino Unido; Bioinvent, Lund, Suécia; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, Calif.; Ixsys. Consulte, por exemplo, documento PCT/GB91/01134; documento PCT/GB92/01755; documento PCT/GB92/002240; documento PCT/GB92/00883; documento PCT/GB93/00605; documento PCT/GB94/01422; documento PCT/GB94/02662; documento PCT/GB97/01835; documento WO90/14443; documento WO90/14424; documento WC90/14430; PCT/U594/1234; documento WO92/18619; documento WO96/07754; documento EP 614 989; documento
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WO95/16027; documento W088/06630; documento W090/3809; Patente n° US4.704.692; documento PCT/US91/02989; documento WO89/06283; documento EP 371 998; documento EP 550 400; documento EP 229 046; documento PCT/US91/07149; ou peptideos ou proteínas gerados estocasticamente --Patentes n° US5.723.323; US5.763.192; US5.814.476; US5.817.483; US5.824.514; US5.976.862; WO 86/05803, EP 590 689, cada um inteiramente incorporado no presente documento a título de referência, ou que dependem de imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998), cada inteiramente incorporado a título de referência assim como patentes e pedidos relacionados) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, como conhecido na técnica e/ou como descrito no presente documento. Tais técnicas, incluem, mas não são limitadas a, exibição de ribossoma (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:14130-14135 (novembro de 1998)); tecnologias de produção de anticorpo de célula única (Patente n° US5.627.052, Wen et al. , J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-7848 (1996)); microgotícuia de gel e citometria de fluxo (Powell et al. , Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, Mass.; Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al. , Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); Seleção de célula B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al. , Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma
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Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers
B.V., Amsterdam, Holanda (1988)).
[0076] Os métodos para manipulação ou humanização de anticorpos não humanos ou humanos também podem ser usados e são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo humanizado ou manipulado tem um ou mais resíduos de aminoácido de uma fonte que é não humana, por exemplo, mas sem limitação a camundongo, rato, coelho, primata não humano ou outro mamífero. Esses resíduos de aminoácido humano são muitas vezes chamados de resíduos de importação, que são tipicamente retirados de uma variável de importação, constante ou outro domínio de uma sequência humana conhecida. As sequências de Ig humana conhecidas são reveladas, por exemplo, em www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html, cada inteiramente incorporada no presente documento a título de referência.
[0077] Tais sequências importadas podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, melhorar ou modificar a ligação, afinidade, avidez, especificidade, meia-vida ou qualquer outra característica adequada, como conhecidos na técnica. Em geral, parte ou todas as sequências de CDR não humanas ou humanas são mantidas enquanto parte ou todas as sequências não humanas da estrutura e/ou regiões constantes são substituídas por aminoácidos humanos ou outros aminoácidos. Os anticorpos também podem ser opcionalmente humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis com o uso de modelos de imunoglobulina tridimensionais que são conhecidos pelos
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25/142 elementos versados na técnica. Os programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam na capacidade da imunoglobulina candidata em se ligar a seu antígeno. Desse modo, os resíduos de estrutura (FR) podem ser selecionados e combinados a partir das sequências consensuais e de importação de modo que a característica de anticorpo desejada, como afinidade aumentada para o antígeno-alvo (ou antígenos-alvo) , seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência de ligação a antígeno. A humanização ou manipulação de anticorpos da presente invenção pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido, como, mas sem limitação a, aqueles descritos, por exemplo, em Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et ai., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Patentes n° US5.723.323, US5.976862, US5.824514, US5.817483, US5.814476, US5.763.192, US5.723.323, US5.766.886, US5.714.352, US6.204.023, US6.180.370, US5.693.762, US5.530.101, US5.585.089, US5.225.539; US4.816.567, cada inteiramente incorporado no presente documento a título de referência, referências incluídas
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26/142 citadas nas mesmas.
[0078] O anticorpo anti-VISTA também pode ser opcionalmente gerado por imunização de um animal transgênico (por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster, primata não humano, e similares) capaz de produzir um repertório de anticorpos humanos, como descrito no presente documento e/ou como conhecido na técnica. As células que produzem um anticorpo humano anti-VISTA podem ser isoladas de tais animais e imortalizadas com o uso de métodos adequados, como os métodos descritos no presente documento.
[0079] Os animais transgênicos que podem produzir um repertório de anticorpo humanos que se ligam a antígenos humanos podem ser produzidos por métodos conhecidos (por exemplo, mas sem limitação a, Patentes n° US 5.770.428, US5.569.825, US5.545.806, US5.625.126, US5.625.825, US5.633.425, US5.661.016 e US5.789.650 expedidas para Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 Bl, Kucherlapate et al. EP 0710 719 Al, Surani et al. Patente n° US5.545.807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 Bl, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al. , Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Acid Nucleic Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720
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3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) e Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996), que são inteiramente incorporadas no presente documento a titulo de referência). Em geral, esses camundongos compreendem pelo menos um transgene que compreende DNA de pelo menos um locus de imunoglobulina humana que é funcionalmente rearranjado, ou que pode ser submetido ao rearranjo funcional. Os loci de imunoglobulina endógenos em tais camundongos podem ser rompidos ou deletados para eliminar a capacidade do animal em produzir anticorpos codificados por genes endógenos.
[0080] A triagem de anticorpos em relação à ligação especifica a proteínas ou fragmentos similares pode ser convenientemente alcançada com o uso de bibliotecas de exibição de peptideo. Esse método envolve a triagem de grandes coleções de peptideo para membros individuais que têm a função ou estrutura desejada. A triagem de anticorpo de bibliotecas de exibição de peptideo é bem conhecida na técnica. As sequências de peptideos exibidas podem ser de 3 a 5000 ou mais aminoácidos em comprimento, frequentemente de 5-100 aminoácidos de comprimento, e muitas vezes de cerca de 8 a 25 aminoácidos de comprimento. Além de direcionar os métodos de sintese quimica para gerar bibliotecas de peptideo, diversos métodos de DNA recombinante foram descritos. Um tipo envolve a exibição de uma sequência de peptideos sobre a superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de peptideos exibida. Tais métodos são descritos nas Publicações de Patente PCT n° 91/17271, 91/18980, 91/19818
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28/142 e 93/08278. Outros sistemas para gerar bibliotecas de peptideo têm aspectos tanto de síntese química in vitro quanto de métodos recombinantes. Consulte, as Publicações de Patente PCT n° 92/05258, 92/14843 e 96/19256. Consulte também as Patentes n° US5.658.754; e US5.643.768. As bibliotecas de exibição de peptideo, vetor e kits de triagem estão comercialmente disponíveis junto a tais fornecedores como Invitrogen (Carlsbad, Calif.), e Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Consulte, por exemplo, as Patentes n° US4.704.692, US4.939.666, US4,946.778, US5.260.203, US5.455.030, US5.518.889, US5.534.621, US5.656.730, US5.763.733, US5.767.260, US5.856.456; US5.223.409, US5.403.484, US5.571.698, US5.837.500, cedidas para Dyax, US5.427.908, US5.580.717; US5.885.793, cedidas para Cambridge Antibody Technologies; US5.750.373, cedidas para Genentech, US5.618.920. US5.595.898. US5.576.195. US5.698.435. US5.693.493 e US5.698.417.
[0081]
Os anticorpos da presente invenção também podem ser preparados com o uso de pelo menos um ácido nucleico que codifica anticorpo anti-VISTA para fornecer animais transgênicos, como cabras, vacas, ovelha e similares, que produzem tais anticorpos em seu leite. Tais animais podem ser fornecidos com o uso de métodos conhecidos. Consulte, por exemplo, mas sem limitação a, Patentes n° US5.827.690; US5.849.992; US4.873.316; US5.849.992; US5.994.616; US5.565.362; US5.304.489, e similares, cada uma das quais é inteiramente incorporada no presente documento a título de referência.
[0082]
Os anticorpos anti-VISTA da presente
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29/142 invenção também podem ser produzidos com o uso de plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos. Consulte também, por exemplo, Fischer et ai., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (outubro de 1999), Cramer et ai., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) e referências citadas nos mesmos; Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et ai., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); e referências citadas nos mesmos. Cada uma das referências acima é inteiramente incorporada no presente documento a título de referência.
[0083] Os anticorpos da invenção podem se ligar a VISTA humana com uma ampla faixa de afinidades (KD) . Em uma modalidade preferencial, pelo menos um anticorpo humano monoclonal da presente invenção pode se ligar opcionalmente a VISTA humana com alta afinidade. Por exemplo, um anticorpo humano monoclonal pode se ligar a VISTA humana com um KD igual a ou menor que cerca de 10~7 M, como, mas sem limitação a, 0,1-9,9 (ou qualquer faixa ou valor incluído nesses) x 10~7, 10~8, 10~9, 10~10, 10”11, 10~12, 10~13 ou qualquer faixa ou valor incluído nesses. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode se ligar a VISTA humana com uma afinidade de pelo menos IxlO-7 litro/mol, por exemplo, pelo menos IxlO-8 litro/mol, por exemplo, pelo menos IxlO-9 litro/mol.
[0084] A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. (Consulte, por exemplo, Berzofsky, et al., Antibody-Antigen Interactions, In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New
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York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman e Company: New York, N.Y. (1992); e métodos descritos no presente documento). A afinidade medida de uma interação anticorpo-antigeno particular pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, as medições de afinidade e de outros parâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) são de preferência feitas com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno, e um tampão padronizado.
[0085] MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO [0086] Com o uso das informação fornecidas no presente documento, como a sequência de nucleotideos que codifica pelo menos 70-100 % dos aminoácidos contíguos de pelo menos um dentre fragmentos, variantes ou sequências consensuais especificados dos mesmos, ou um vetor depositado que compreende pelo menos uma dessas sequências, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção que codifica pelo menos um anticorpo anti-VISTA que compreende todas as regiões CDR variáveis de cadeia pesada de SEQ ID NOS:1, 2 e 3 e/ou todas as regiões CDR variáveis de cadeia leve de SEQ ID NOS: 4, 5 e 6 pode ser obtida com o uso de métodos descritos no presente documento ou como conhecido na técnica.
[0087] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem estar na forma de RNA, como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma, ou na forma de DNA, incluindo, mas sem limitação a, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente, ou quaisquer combinações dos mesmos. O DNA pode ser de fita tripla, de fita dupla ou de fita única, ou qualquer combinação dos
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31/142 mesmos. Qualquer porção de pelo menos uma fita do DNA ou
RNA pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita senso, ou pode ser a fita de não codificação, também chamada de fita antissenso.
[0088] As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico que compreendem um quadro de leitura aberta (ORF), por exemplo, mas sem limitação a, pelo menos uma porção especificada de pelo menos uma CDR, como CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de pelo menos uma cadeia pesada ou cadeia leve; moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de codificação para um anticorpo anti-VISTA ou fragmento, por exemplo, um fragmento que compreende uma região variável; e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotideos diferentes daquelas descritas acima, mas que, devido à degeneração do código genético, ainda codificam pelo menos um anticorpo anti-VISTA como descrito no presente documento e/ou como conhecido na técnica. Seria prática de rotina para um elemento versado na técnica gerar tais variantes de ácido nucleico degeneradas que codificam anticorpos anti-VISTA específicos da presente invenção. Consulte, por exemplo, Ausubel, et ai., supra, e tais variantes de ácido nucleico são incluídas na presente invenção.
[0089] Como indicado no presente documento, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que compreendem um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-VISTA podem incluir, mas não se limitam a, aquelas que codificam a sequência de aminoácidos de um fragmento de anticorpo; a sequência de codificação para todo o anticorpo
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32/142 ou uma porção do mesmo; a sequência de codificação para um anticorpo, fragmento ou porção, assim como sequências adicionais, como a sequência de codificação de pelo menos um peptideo de fusão ou lider de sinal, com ou sem as sequências de codificação adicionais supracitadas, como pelo menos um intron, junto com sequências de não codificação adicionais, incluindo, mas sem limitação a, sequências não codificantes 5' e 3', como as sequências transcritas não traduzidas que desempenham um papel em transcrição, processamento de mRNA, incluindo sinais de emenda e poliadenilação (por exemplo, ligação de ribossoma e estabilidade de mRNA); Uma sequência de codificação adicional que codifica aminoácidos adicionais, como aqueles que fornecem funcionalidades adicionais. Assim, a sequência que codifica um anticorpo pode ser fusionada a uma sequência marcadora, como uma sequência que codifica um peptideo que facilita a purificação do anticorpo fusionado que compreende um fragmento ou porção de anticorpo.
[0090] Os genes humanos que codificam as regiões constantes (C) dos anticorpos, fragmentos e regiões da presente invenção podem ser derivados de uma biblioteca de figado fetal humano, por métodos conhecidos. Os genes de regiões C humanos podem ser derivados de qualquer célula humana incluindo aquelas que expressam e produzem imunoglobulinas humanas. A região CH humana pode ser derivada de qualquer das classes ou isótipos conhecidas de cadeias H humanas, incluindo γ, μ, α, δ ou ε e subtipos das mesmas, como Gl, G2, G3 e G4. Uma vez que o isótipo de cadeia H é responsável pelas várias funções efetoras de um anticorpo, a escolha de região CH será guiada pelas funções
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33/142 efetoras desejadas, como fixação complementar, ou atividade em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (CCDA).
[0091] COMPOSIÇÕES [0092] As composições farmacêuticas reveladas no presente documento são preparadas de acordo com procedimentos padrão e são administradas em dosagens que são selecionadas para tratar, por exemplo, reduzir, prevenir ou eliminar, ou para desacelerar ou parar a progressão de, a condição a ser tratada (Consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, e Goodman e Gilman's The Pharmaceutical Basis de Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., cujos conteúdos são incorporados no presente documento a titulo de referência, para uma descrição geral dos métodos para administrar vários agentes para terapia humana). As composições que compreendem os anticorpos e agentes revelados podem ser aplicadas com o uso de sistemas de aplicação de liberação sustentada ou controlada (por exemplo, cápsulas, matrizes biodegradáveis). Os exemplos de sistemas de aplicação de liberação atrasada para aplicação de fármaco que seriam adequados para administração das composições dos compostos revelados são descritos, por exemplo, nas Patentes n° US5.990.092; US5.039.660; US4.452.775; e US3.854.480, cujos ensinamentos integrais são incorporados no presente documento a titulo de referência.
[0093] Para preparar composições farmacêuticas a partir dos anticorpos anti-VISTA e/ou fragmentos da presente invenção, carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser sólidos ou líquidos. As preparações de forma
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34/142 sólida incluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, selos, supositórios e grânulos dispersíveis. Por exemplo, os compostos da presente invenção podem estar em forma de pó para reconstituição no momento de aplicação. Um carreador sólido pode ser uma ou mais substâncias que também podem atuar como diluentes, agentes de saborização, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, aglutinantes, conservantes, agentes de desintegração de comprimido ou um material de encapsulação. Em pós, o carreador é um sólido finamente dividido que está em uma mistura com o ingrediente ativo finamente dividido.
[0094] Os pós e comprimidos contêm, de preferência, de cerca de um a cerca de setenta por cento do ingrediente ativo. Os carreadores adequados são carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, caboximetilcelulose de sódio, uma cera com baixo ponto de fusão, manteiga de cacau e similares. Os comprimidos, pós, selos, drágeas, tiras de rápido derretimento, cápsulas e pílulas podem ser usados como formas de dosagem sólidas que contêm o ingrediente ativo adequado para administração oral.
[0095] As preparações em forma líquida incluem soluções, suspensões, enemas de retenção e emulsões, por exemplo, água ou soluções de água e propileno glicol. Para injeção parenteral, as preparações líquidas podem ser formuladas em solução em solução aquosa de polietileno glicol.
[0096] A composição farmacêutica pode estar em forma de dosagem unitária. Em tal forma, a composição é
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35/142 subdividida em doses unitárias que contêm quantidades apropriadas do ingrediente ativo. A forma de dosagem unitária pode ser uma preparação embalada, em que a embalagem contém quantidades distintas de doses unitárias. As dosagens podem ser variadas dependendo dos requisitos do paciente, da gravidade da condição a ser tratada, do composto e da via de administração a ser empregada. A determinação da dosagem apropriada para uma situação particular está incluída no âmbito da prática.
[0097] Também, a composição farmacêutica pode conter, se desejado, outros agentes compatíveis, por exemplo, agentes farmacêuticos, terapêuticos ou profiláticos. Os agentes terapêuticos ou profiláticos incluem, mas não são limitados a, peptídeo, polipeptídeo, proteínas, proteínas de fusão, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgânicas e moléculas orgânicas. Os exemplos das classes de tais agentes (por exemplo, agentes anticâncer) incluem, mas não são limitados a, citotoxinas, inibidores de angiogênese, agentes imunomodulatórios, agentes imuno-oncológicos, e os agentes usados para fornecer alívio de dor ou para compensar os efeitos prejudiciais de um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, uso de bisfosfonato para reduzir os efeitos hipercalcêmicos de glicocorticoides).
[0098]
Inibidores agentes e terapias de angiogênese que são adequados para uso nas composições e nos métodos descritos no presente documento incluem, mas não são limitados a, angiostatina (fragmento de plasminogênio);
antitrombina
III antiangiogênica;
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36/142 angiozima. Os bisfosfonatos incluem, mas não são limitados a, alendronate, clodronato, etidronate, ibandronato, pamidronato, risedronate, tiludronato e zoledronate.
[0099] Os agentes e terapias imunomodulatórios que são adequados para uso nas composições e métodos descritos no presente documento incluem, mas não são limitados a, anticorpos de receptor de célula anti-T como anticorpos anti-CD3 (por exemplo, Nuvion (Protein Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), ou anticorpos anti-CD20 Rituxan (IDEC)), anticorpos anti-CD52 (por exemplo, CAMPATH 1H (Ilex)), anticorpos anti-CDlla (por exemplo, Xanelim (Genentech)); anticitocina ou anticorpos e antagonistas de receptor de anticitocina como anticorpos de receptor antiIL-2 (Zenapax (Protein Design Labs)), anticorpos de receptor anti-IL-6 (por exemplo, MRA (Chugai)), e anticorpos anti-IL-12 (CNTO1275(Janssen)), anticorpos antiTNFalfa (Remicade(Janssen)) ou antagonista de receptor de TNF (Enbrel (Immunex)), anticorpos anti-IL-6 (BE8 (Diaclone) e siltuximabe (CNTO32 (Centocor)), e anticorpos que se ligam imunoespecificamente a antígenos associados a tumor (por exemplo, trastuzimabe (Genentech)).
[0100] Os imuno-oncológicos que são adequados para uso nas composições e métodos descritos no presente documento incluem, mas não são limitados a, ipilimumabe (anti-CTLA-4), nivolumabe (anti-PD-1), pembrolizumabe (anti-PD-1), anticorpos anti-PD-Ll e anticorpos anti-LAG-3.
[0101] A composição é de preferência feita na forma de uma unidade de dosagem que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento. Os exemplos de unidades de dosagem são comprimidos e cápsulas.
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Para propósitos terapêuticos, os comprimidos e cápsulas podem conter, além do ingrediente ativo, carreadores convencionais como agentes de ligação, por exemplo, goma acácia, gelatina, polivinilpirrolidona, sorbitol ou tragacanto; cargas, por exemplo, fosfato de cálcio, glicina, lactose, amido de mais, sorbitol ou sacarose; lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, polietileno glicol, silica ou talco; desintegrantes, por exemplo, amido de batata, agentes de saborização ou coloração, ou agentes de molhagem aceitáveis. As preparações líquidas orais em geral na forma de soluções, suspensões, emulsões, xaropes ou elixires aquosas ou oleosas podem conter aditivos adicionais como agentes de suspensão, agentes de emulsificação, agentes não aquosos, conservantes, agentes de coloração e agentes de saborização. Os exemplos de aditivos para preparações líquidas include acácia, óleo de amêndoa, álcool etílico, óleo de coco fracionado, gelatina, glicose xarope, glicerina, gorduras comestíveis hidrogenadas, lecitina, metil celulose, para-hidroxibenzoato de metila ou propila, propileno glicol, sorbitol ou ácido ascórbico.
[0102] Outros detalhes gerais a respeito dos métodos de produção e uso dos compostos e composições descritos no presente documento são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, a Patente n° US7.820.169, cujos conteúdos são incorporados em sua totalidade.
[0103] MÉTODOS DE TRATAMENTO [0104] Um elemento versado na técnica, por exemplo, um médico, pode determinar a dosagem e a via de administração adequadas para um anticorpo, fragmento ou
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38/142 composição particular para administração a um indivíduo, considerando os agentes escolhidos, a formulação farmacêutica e via de administração, vários fatores do paciente e outras considerações. De preferência, a dosagem provoca ou produz efeitos colaterais adversos mínimos ou nenhum. Em regimes de múltiplas dosagens padrão, um agente farmacológico pode ser administrado em um cronograma de dosagem que é projetado para manter uma concentração de plasma predeterminada ou ideal no indivíduo submetido ao tratamento. Os anticorpos, fragmentos e composições podem ser adicionados em quaisquer faixas de dosagem apropriadas ou quantidade terapeuticamente eficaz, por exemplo, 0,1
mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0, 6
mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0, 9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5
mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3, 0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5, 0
mg/kg, 6, 0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 8,0 mg/kg, 9, 0 mg/kg, 10,0
mg/kg, 11, 0 mg/kg, 12,0 mg/kg, 13, 0 mg/kg, 14, 0 mg/kg, 15, 0
mg/kg, 16, 0 mg/kg, 17, 0 mg/kg, 18, 0 mg/kg, 19, 0 mg/kg, 20,0
mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg e 100 mg/kg. Em uma modalidade, a dosagem da composição, anticorpo ou fragmento administrado é 0,1-15 mg/kg por administração.
[0105] 0 anticorpo ou fragmento pode ser
administrado uma vez, pelo menos uma vez, duas vezes, pelo
menos duas vezes, três vezes ou pelo menos três vezes por
dia. 0 anticorpo ou fragmento pode ser administrado uma
vez, pelo menos uma vez, duas vezes, pelo menos duas vezes, três vezes, pelo menos três vezes, quatro vezes, pelo menos quatro vezes, cinco vezes, pelo menos cinco vezes, seis vezes por semana, ou pelo menos seis vezes por semana. O
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39/142 anticorpo ou fragmento pode ser administrado uma vez por mês, pelo menos uma vez por mês, duas vezes por mês, pelo menos duas vezes por mês, três vezes por mês ou pelo menos três vezes por mês. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser administrado uma vez por ano, pelo menos uma vez por ano, duas vezes por ano, pelo menos duas vezes por ano, três vezes por ano, pelo menos três vezes por ano, quatro vezes por ano, pelo menos quatro vezes por ano, cinco vezes por ano, pelo menos cinco vezes por ano, seis vezes por ano ou pelo menos seis vezes por ano.
[0106] Os anticorpos anti-VISTA, fragmentos e composições podem, por exemplo, ser administrados através de meios parenterais ou não parenterais, incluindo, mas sem limitação a, intravenosa, subcutânea, oral, retal, intramuscular, intraperitoneal, transmucosal, transdérmica, intratecal, nasal ou topicamente. Um elemento de conhecimento comum na técnica reconhecerá que as seguintes formas de dosagem podem compreender como o ingrediente ativo, ou compostos ou um sal farmaceuticamente aceitável correspondente de um composto da presente invenção. Em algumas modalidades, as formas de dosagem podem compreender como o ingrediente ativo, ou um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável correspondente de um composto.
[0107] Os anticorpos anti-VISTA da invenção podem ser administrados como parte de uma terapia de combinação (por exemplo, entre si, ou com um ou mais outros agentes terapêuticos). Os compostos da invenção podem ser administrados antes, após ou ao mesmo tempo que um ou mais outros agentes terapêuticos. Em algumas modalidades, um composto da invenção e outro agente terapêutico podem ser
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40/142 coadministrados simultaneamente (por exemplo, concomitantemente) como formulações separadas ou como uma formulação conjunta. Alternativamente, os agentes podem ser administrados sequencialmente, como composições separadas, dentro de um periodo de tempo apropriado, como determinado pelo médico versado (por exemplo, um tempo suficiente para permitir uma sobreposição dos efeitos farmacêuticos das terapias) . Um composto da invenção e um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados em uma única dose ou em múltiplas doses, em uma ordem e em um cronograma adequado para alcançar um efeito terapêutico desejado.
[0108] A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente. Em algumas modalidades, os compostos e as composições da presente invenção são usados para tratar ou prevenir câncer. O câncer pode incluir qualquer tumor maligno ou benigno de qualquer sistema de órgão ou corpo. Os exemplos incluem, mas não são limitados a, os seguintes: de mama, digestivo/gastrointestinal, endócrino, neuroendócrino, ocular, geniturinário, célula germinal, ginecológico, cabeça e pescoço, hematológico/sanguineo, musculoesqueletal, neurológico, respiratório/torácico, de bexiga, cólon, retal, pulmonar, endometrial, renal, pancreático, hepático, estomacal, testicular, esofágico, de próstata, cerebral, cervical, ovariano e de tiroide. Outros cânceres podem incluir leucemias, melanomas e linfomas, e qualquer câncer descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o tumor sólido é infiltrado com células mieloides e/ou T. Em algumas modalidades, o câncer é uma
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41/142 leucemia, linfoma, sindrome mielodisplásica e/ou mieloma. Em algumas modalidades, o câncer pode ser qualquer tipo de leucemia, incluindo uma leucemia linfocitica ou uma leucemia mielógena, como, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocitica crônica (LLC), leucemia mieloide (mielógena) aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia das células pilosas, leucemia prolinfocitica de célula T, leucemia linfocitica granular grande ou leucemia de célula T adulta. Em algumas modalidades, o linfoma é um linfoma histocitico, linfoma folicular ou linfoma de Hodgkin, e em algumas modalidades, o câncer é um mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido, por exemplo, um melanoma, ou
câncer de bexiga. Em uma modalidade particular, o câncer é
um câncer de pulmão, como um câncer de pulmão de célula não
pequena (CPCNP).
[0109] A presente invenção também fornece um
método para modular ou tratar pelo menos uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, mas sem limitação a, pelo menos uma dentre: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA) , LLA de célula B, célula T ou FAB, leucemia mieloide aguda (LMA) , leucemia mielocitica crônica (LMC), leucemia linfocitica crônica (LLC), leucemia das células pilosas, sindrome mielodisplásica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma de não Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaringeo, histiocitose maligna, sindrome paraneoplásica/hipercalcemia de tumores sólidos malignos,
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42/142 adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença metastática, ressorção óssea relacionada a câncer, dor óssea relacionada a câncer e similares. Em algumas modalidades, o tumor sólido é infiltrado com células mieloides e/ou T. Em uma modalidade particular, o tumor sólido é um câncer de pulmão, como um câncer de pulmão de célula não pequena (CPCNP).
[0110] Em algumas modalidades, os compostos e terapias descritos no presente documento são coadministrados com uma vacina (como uma vacina de vetor viral, vacina bacteriana, vacina à base de célula, vacina de DNA, vacina de RNA, vacina de peptideo ou vacina de proteína) . Tais vacinas são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Jeffrey Schlom, Therapeutic Cancer Vaccines: Current Status and Moving Forward, J Natl Cancer Inst; 104:599-613 (2012), cujos conteúdos são incorporados no presente documento em sua totalidade.
[0111] Em algumas modalidades, os compostos e terapias descritos no presente documento são coadministrados com agentes para quimioterapia, terapias hormonais e terapias biológicas, e/ou bisfosfonatos. Em algumas modalidades, o agente (ou agentes) para quimioterapia incluem um ou mais dos seguintes: arboplatina (Paraplatina), cisplatina (Platinol, Platinol-AQ), ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), doxorubicina (Adriamycin), etopósido (VePesid), fluorouracila (5-FU), gemcitabina (Gemzar), irinotecano (Camptosar), paclitaxel (Taxol), topotecano (Hycamtin), vincristina (Oncovin, Vincasar PFS), vinblastina (Velban).
[0112] Em outras modalidades, os compostos e
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43/142 terapias anti-VISTA descritos no presente documento são coadministrados com um ou mais anticorpos de verificação imune, como, por exemplo, nivolumabe, pembrolizumabe, tremelimumabe, ipilimumabe, anticorpo anti-PD-Ll, anticorpo anti-PD-L2, anticorpo anti-TIM-3, anti-LAG-3v, anticorpo anti-OX40 e anticorpo anti-GITR.
[0113] Em uma outra modalidade, os compostos e terapias anti-VISTA descritos no presente documento são coadministrados com um inibidor de molécula pequena de indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO).
[0114] Os compostos e composição anti-VISTA da invenção podem ser administrados a um indivíduo em necessidade do mesmo para prevenir (incluindo prevenir a recorrência de câncer) ou tratar (por exemplo, gerenciar ou melhorar um câncer ou um ou mais sintomas do mesmo) câncer. Qualquer agente ou terapia (por exemplo, quimioterapias, terapias de radiação, terapias alvejadas, como imatinibe, sorafenibe e vemurafenibe, terapias hormonais, e/ou terapias biológicas ou imunoterapias) que é conhecido por ser útil, ou que tem sido usado ou está sendo atualmente usado para a prevenção, tratamento, gerenciamento ou melhora de câncer ou um ou mais sintomas do mesmo pode ser usado em combinação com um composto ou composição da invenção descrito no presente documento. Agentes anticâncer, mas sem limitação a: 5-fluoruracila; acivicina; aldesleucina; altretamina; aminoglutetimida; ansacarina; anastrozol; antramicina; asparaginase; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; bicalutamida; sulfato de bleomicina; sódio brequinar; bropirimina; bussulfano; carboplatina; carmustina; cloridrato de carubicina;
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44/142 carzelesina; cedefingol; clorambucila; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; cloridrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; cloridrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; cloridrato de eflornitina; enloplatina; enpromato; epipropidina; cloridrato de epirrubicina; erbulozol; cloridrato de esorrubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etopósido; fosfato de etopdsido; fazarabina; fenretinida; floxurridina; fosfato de fludarabina; fluorouracila; flurocitabina; fosquidona; sódio de fostriecina; gemcitabina; cloridrato de gemcitabina; hidroxiureia; cloridrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluindo interleucina II, ou rIL2 recombinante), interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-m; interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gama-I b; iproplatina; cloridrato de irinotecano; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; cloridrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; cloridrato de losoxantrona; masoprocol; cloridrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalano; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitomicina; mitosper; mitotano; cloridrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; ormaplatina; paclitaxel; pegaspargase; porfromicina; prednimustina; cloridrato de procarbazina; puromicina; rogletimida; cloridrato de
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45/142 safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico;
esparsomicina; espiromustina; espiroplatina;
estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tegafur; cloridrato de teloxantrona; temoporfina; teniposideo; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; topotecano; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; mostarda de uracila; uredepa; vapreotideo; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; cloridrato de zorubicina. As terapias alvejadas incluem, mas não são limitadas a, inibidores de tirosina quinase (por exemplo, imatinibe, sorafenibe e vemurafenibe) . A invenção também abrange a administração de um composto anti-VISTA da invenção em combinação com terapia de radiação que compreende o uso de raios x, raios gama e outras fontes de radiação para destruir as células de câncer. Os tratamentos de câncer são conhecidos na técnica e foram descritos em tal literatura como o Physician's Desk Reference (57a ed., 2003) .
[0115] Os anticorpos anti-VISTA descritos no presente documento são também úteis, por exemplo, no tratamento de doença infecciosas crônicas, como HIV, HBV, HCV e HSV, dentre outras. [0116] Várias propriedades e informações de sequência para selecionar anticorpos anti-VISTA da invenção são fornecidas nas Tabelas IA, IB e 2 no presente
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46/142 documento .
[0117] Tabela IA: Sequências de CDR de anticorpos humanos anti-VISTA Humanas ou Humanizadas de
Seleção Completa
ID de mAb Família de VH cdrl de cadeia pesada (Imgt) cdr2 de cadeia pesada (Imgt) cdr3 de cadeia pesada (Imgt) cdrl de cadeia leve (Imgt) dr2 de cadeia leve (Imgt) cdr3 de cadeia leve (Imgt)
VST B50 B GYTFTN YG (SEQ ID NO: 1) INPYTG EP (SEQ ID NO: 2) AREGYGNYIFP Y (SEQ ID NO: 3) ESVDTYANS L (SEQ ID NO: 4) RAS (SEQ ID NO: 5) QQTNEDPR T (SEQ ID NO:6)
VST B53 GYTFTH YT (SEQ ID NO: 7) IIPSSG YS (SEQ ID NO: 8) ARGAYDDYYDY YAMDY (SEQ ID NO:9) QTIVHSNGN TY (SEQ ID NO:10) KVS (SEQ ID NO:11) FQASHVPW T (SEQ ID NO:12)
VST B60 B GYTFTN YG (SEQ ID NO:13) INTYTG ES (SEQ ID NO:14) ARDYYGIYVSA Y (SEQ ID NO:15) ESVDNYANS F (SEQ ID NO:16) RAS (SEQ ID NO:17) QQSHEDPY T (SEQ ID NO:18)
VST B95 GFTFRN YG (SEQ ID NO:19) IISGGS YT (SEQ ID NO:20) ARIYDHDGDYY AMDY (SEQ ID NO:21) QSIVHSNGN TY (SEQ ID NO:22) KVS (SEQ ID NO:23) FQGSHVPW T (SEQ ID NO:24)
VST Bll 2 D GGTFSS YA (SEQ ID NO:25) IIPIFG TA (SEQ ID NO:26) ARSSYGWSYEF DY (SEQ ID NO:27) QSIDTR (SEQ ID NO:28) SAS (SEQ ID NO:29) QQSAYNPI T (SEQ ID NO:30)
VST Bll 6 D GGTFSS YA (SEQ ID NO:31) IIPIFG TA (SEQ ID NO:32) ARSSYGWSYEF DY (SEQ ID NO:33) QSINTN (SEQ ID NO:34) AAS (SEQ ID NO:35) QQARDTPI T (SEQ ID NO:36)
[0118] Tabela 1B: Sequências de Cadeia Leve ou
Pesada de anticorpos humanos anti-VISTA Humanas ou Humanizadas de Seleção Completa
ID de proteína
AA CDS de cadeia pesada
AA CDS de cadeia leve
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47/142
ID de proteína ΆΆ CDS de cadeia pesada AA CDS de cadeia leve
VSTB50 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGY TFTNYGLNWVRQAPGQGLEWMGWINPY TGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYL QIC S LKAE DTAVYYCAREGYGNYIF PY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:47) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASES VDTYANSLMHWYLQKPGQPPQLLIYRAS NLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCQQTNEDPRTFGQGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:48)
VSTB53 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTHYTIHWVRQAPGQGLEWMGYIIPS SGYSEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYM ELSSLRSEDTAVYYCARGAYDDYYDYY AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:49) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQT IVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCFQASHVPWTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NQ:50)
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48/142
ID de proteína ΆΆ CDS de cadeia pesada AA CDS de cadeia leve
VSTB60 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGY TFTNYGMTWVRQAPGQGLEWMGWINTY TGESTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYL QIC S LKAEDTAVYYCARDYYGIYVSAY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:51) DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASES VDNYANSFMHWYLQKPGQSPQLLIYRAS NLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA EDVGVYYCQQSHEDPYTFGQGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:52)
VSTB95 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF TFRNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIISG GSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVYYCARIYDHDGDYYA MDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:53) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQS IVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDVGVYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:54)
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49/142
ID de proteína ΆΆ CDS de cadeia pesada AA CDS de cadeia leve
VSTB112 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG TFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPI FGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSSYGWSYEFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:55) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS IDTRLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQSAYNPITFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:56)
VSTB116 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG TFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPI FGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSSYGWSYEFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:57) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS INTNLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQARDTPITFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:58)
Petição 870180139997, de 10/10/2018, pág. 52/204
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ID de proteína ΆΆ CDS de cadeia pesada AA CDS de cadeia leve
VSTB140* QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG TFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPI FGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSSYGWSYEFD YWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS IDTRLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQSAYNPITFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:56)
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK TVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDP
EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:59)
VSTB149** QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG TFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPI FGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSSYGWSYEFD YWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS IDTRLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQSAYNPITFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPDVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNAALPAPIAKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:60)
THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:56)
Petição 870180139997, de 10/10/2018, pág. 53/204
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ID de proteína ΆΆ CDS de cadeia pesada AA CDS de cadeia leve
VSTB174* QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGG TFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPI FGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSSYGWSYEFD YWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS IDTRLNWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQSAYNPITFGQGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:56)
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:61)
*As sequências de região constante em VSTB140, VSTB149 e VSTB174 estão sublinhadas. A0s residues de aminoácido que conferem resistência à protease na cadeia pesada de VSTB149 são indicados em negrito.
[0119] Tabela 2: Constante de dissociação (KD) para selecionar anticorpos anti-VISTA
Amostra KD (M) kal (1/Ms) kdl (1/s)
Sl 1,71E-10 1,6 9E+0 6 2,89E04 1,09E-10 1,11E+06 1,21E04
S40 5,07E-10 1,46E+05 7,40E05 6,96E-10 1,39E+05 9,6 9E05
S41 6,32E-10 4,82E+05 3,05E04 3,10E-10 7,08E+05 2,19E04
S42 1,04E-10 1,05E+06 1,09E04 2,65E-10 5,13E+05 1,36E04
S43 2,64E-11 1,25E+06 3,SOEOS 5,28E-11 1,18E+06 6,22E05
S44 2,53E-11 1,23E+06 3,12E05 6,40E-11 9,93E+05 6,36E05
S45 2,35E-11 1,58E+06 3,72E05 2,58E-11 1,46E+06 3,77E05
S46 1,06E-10 1,56E+06 1,66E04 2,96E-10 1,50E+06 4,44E04
S47 3,56E-10 5,14E+05 1,83E04 2,52E-10 5,69E+05 1,43E04
S33 8,30E-10 1,23E+06 1,02E03 1,22E-09 8,96E+05 1,10E03
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Amostra KD (M) kal (1/Ms) kdl (1/s)
S34 1,08E-09 5,95E+05 6,43E04 2,80E-09 5,20E+05 1,46E03
S35 8,06E-11 2,08E+06 1,68E04 1,35E-10 1,78E+06 2,41E04
S36 6,29E-11 1,77E+06 1,12E04 2,90E-11 1,58E+06 4,58E05
S37 2,23E-09 5,10E+05 1,14E03 4,43E-09 3,94E+05 1,75E03
S38 2,26E-09 5,18E+05 1,17E03 2,03E-09 5,37E+05 1,09E03
S39 5,62E-10 3,97E+05 2,23E04 3,47E-10 4,15E+05 1,44E04
S25 1,31E-09 6,21E+05 8,12E04 1,10E-09 5,65E+05 6,24E04
S26 Sem ligação 3,53E-09 2,38E+05 8,41E04
S27 1,13E-09 8,8 6E+0 5 9,97E04 1,61E-09 7,12E+05 1,15E03
S48 3,12E-10 1,24E+06 3,87E04 1,21E-09 8,78E+05 1,06E03
S28 2,03E-09 1,08E+06 2,19E03 2,03E-09 9,30E+05 1,88E03
S29 3,78E-11 1,42E+06 5,38E05 8,90E-11 9,06E+05 8,06E05
S30 Sem ligação Sem ligação
S31 Ligação fraca Ligação fraca
S32 Ligação fraca Ligação fraca
S15 9,34E-11 6,46E+05 6,04E05 5,13E-10 3,50E+05 1,80E04
S16 1,26E-10 5,54E+0 5 6,9 9E05 1,92E-10 4,43E+05 8,53E05
S17 7,68E-10 9,88E+05 7,59E04 4,10E-10 7,09E+05 2,91E04
S18 2,28E-09 4,90E+05 1,12E03 1,05E-09 3,13E+05 3,29E04
S19 1,54E-09 1,02E+06 1,58E03 2,86E-10 7,03E+05 2,01E04
S20 1,48E-09 6,67E+05 9,85E04 4,57E-10 6,3 6E+0 5 2,91E04
S21 3,18E-09 3,16E+05 1,00E03 1,34E-09 2,70E+05 3,60E04
S22 2,98E-09 1,09E+06 3,25E03 1,27E-09 1,25E+06 1,SOEOS
S6 6,36E-10 5,28E+05 3,36E04 3,02E-10 5,98E+05 1,80E04
S7 6,75E-10 1,31E+06 8,87E04 3,27E-10 1,15E+06 3,75E04
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Amostra KD (M) kal (1/Ms) kdl (1/s)
S8 1,15E-10 1,89E+06 2,18E04 5,97E-11 1,25E+06 7,48E05
S9 1,67E-10 1,87E+06 3,11E04 9,31E-11 1,27E+06 1,18E04
S10 8,90E-11 1,55E+06 1,38E04 4,30E-11 1,22E+06 5,27E05
S12 4,94E-10 1,57E+06 7,76E04 2,39E-10 1,19E+06 2,86E04
S13 1,02E-10 1,42E+06 1,44E04 6,46E-11 9,55E+05 6,17E05
S14 2,02E-10 1,26E+06 2,55E04 7,55E-11 1,12E+06 8,43E05
Sl 2,06E-10 1,60E+0 6 3,29E04 8,35E-11 1,21E+06 1,01E04
S2 1,56E-10 9,74E+05 1,52E04 8,66E-11 7,25E+05 6,28E05
S3 4,33E-11 9,07E+05 3,93E05 4,89E-11 7,41E+05 3,63E05
S4 1,52E-10 8,98E+05 1,36E04 7,54E-11 6,93E+05 5,23E05
S49 1,45E-10 1,01E+06 1,46E04 1,04E-10 7,28E+05 7,60E05
S5 2,13E-10 1,25E+06 2,67E04 1,37E-10 8,51E+05 1,17E04
MÉTODOS DE PROVOCAÇÃO DE UMA RESPOSTA BIOLÓGICA [0120] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de provocação de uma resposta biológica em um indivíduo com o uso de um anticorpo que se liga a uma proteína de Supressor de Ig de domínio V de Ativação de célula T (VISTA). O método compreende as etapas de administrar a um indivíduo um anticorpo que se liga a uma proteína VISTA, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, em uma quantidade suficiente para provocar uma resposta biológica no indivíduo.
[0121] Em certas modalidades, a resposta biológica que é provocada pelo anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno, que se liga a VISTA é uma diminuição no número de células imunes em circulação; uma diminuição no
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54/142 número de granulócitos em medula óssea e/ou baço; um aumento no número de neutrófilos, macrófagos, células T ou uma combinação dos mesmos em um microambiente tumoral (TME) ; um aumento no nível de uma ou mais citocinas; ou qualquer combinação dessas respostas.
[0122] Em uma modalidade, a resposta biológica que é provocada é uma diminuição no número de células imunes em circulação. As células imunes em circulação que são diminuídas podem ser, por exemplo, monócitos, neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a diminuição no número de células imunes em circulação é transiente.
[0123] Como usado no presente documento, uma diminuição transiente no número de células imunes em circulação se refere a uma diminuição temporária em relação a um nível antes de administração do anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno, em que o nível diminuído é restaurado para, ou ultrapassa, o nível anterior em um ponto no tempo subsequente.
[0124] Em uma modalidade, a resposta biológica que é provocada é uma diminuição no número de granulócitos em um ou mais tecidos (por exemplo, medula óssea) e/ou órgãos (por exemplo, baço) do indivíduo.
[0125] Em uma modalidade, a resposta biológica que é provocada é um aumento no número de células imunes em um microambiente tumoral (TME). As células imunes que são aumentadas no TME podem incluir, mas não são limitadas a, neutrófilos, macrófagos, células T ou qualquer combinação dos mesmos.
[0126] Em uma modalidade, a resposta biológica
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55/142 que é provocada é um aumento no nível de uma ou mais citocinas (por exemplo, uma ou mais quimiocinas). Os exemplos de citocinas que podem ser aumentadas em resposta para administração de um anticorpo anti-VISTA ou fragmento de ligação a antígeno incluem, por exemplo, IL-6, TNFa, MCP-3, MDC, MIP-Ιβ, IP-10, IL-lRa, GM-CSF, IL-12p70, GRO, ΜΙΡ-Ια, IL-Ιβ, RANTES, G-CSF, IL-Ία, IL-7, IL-12p40, IL-13, IFNy, ΤΝΕβ, IFNa, IL-4, IL-10, FGF-2, fractalcina, VEGF,
IL-17A, Flt3L, IL-9, TGFa, IL-15, EGF, PDGF-αα, MCP-1, IL8, SCD40L, eotaxina, IL-2, IL-3, e IL-5, e PDGF-BB.
[0127] Em uma modalidade particular, o anticorpo que se liga a VISTA, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, que é administrado ao indivíduo compreende uma região de Fc que tem função efetora (por exemplo, se liga a um receptor de Fc em uma célula). Em uma modalidade particular, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, se liga a um receptor de CD16 (por exemplo, FcvRIIIa, FcvRIIIb) em uma célula imune (por exemplo, célula NK).
[0128] Em uma modalidade, o anticorpo que se liga a VISTA, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, que é administrado ao indivíduo compreende um domínio VH de anticorpo que compreende uma CDR1 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma CDR2 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma CDR3 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e que compreende adicionalmente um domínio VL de anticorpo que compreende uma CDR1 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, uma CDR2 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma CDR3 de VL
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56/142 que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:30. Em uma modalidade particular, o anticorpo é VSTB174, ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma.
[0129] Em uma modalidade, o indivíduo ao qual o anticorpo que se liga a VISTA, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, é administrado é um mamífero. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Em uma outra modalidade, o mamífero é um primata não humano. Ainda em uma outra modalidade, o mamífero é um roedor (por exemplo, um camundongo, um rato).
[0130] Em uma modalidade, o indivíduo tem câncer (por exemplo, um tumor sólido, uma leucemia, um linfoma). Em algumas modalidades, o câncer é uma leucemia, linfoma, síndrome mielodisplásica e/ou mieloma. Em algumas modalidades, o câncer pode ser qualquer tipo de leucemia, incluindo uma leucemia linfocítica ou uma leucemia mielógena, como, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide (mielógena) aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia das células pilosas, leucemia prolinfocítica de célula T, leucemia linfocítica granular grande ou leucemia de célula T adulta. Em algumas modalidades, o linfoma é um linfoma histocítico, e em algumas modalidades, o câncer é um mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido, por exemplo, um melanoma, um câncer de mama ou câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de pulmão (por exemplo, um carcinoma pulmonar de célula não pequena (CPCNP)). Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um
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57/142 câncer de mama.
[0131] O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser administrado por qualquer meio parenteral ou não parenteral adequado incluindo, por exemplo, intravenosa (IV), subcutânea (SQ) ou oralmente (PO).
MÉTODOS DE TRIAGEM PARA ANTICORPOS ANTI-VISTA [0132] A presente invenção fornece, em uma modalidade, um método de identificação de um anticorpo que se liga a uma proteína de Supressor de Ig de dominio V de Ativação de célula T (VISTA) e provoca uma resposta biológica. O método compreende as etapas de fornecer um anticorpo que se liga a VISTA, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, por exemplo, uma célula, tecido, órgão e/ou organismo, e determinar se o anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo induz uma resposta biológica na célula, tecido, órgão ou organismo.
[0133] Em uma modalidade, a resposta biológica a ser determinada inclui ativação de monócitos; ativação de células T; uma diminuição no número de células imunes em circulação; uma diminuição no número de granulócitos em medula óssea e baço; um aumento no número de neutrófilos, macrófagos, células T ou uma combinação dos mesmos em um microambiente tumoral (TME); um aumento no nivel de uma ou mais citocinas; ou qualquer combinação dessas respostas.
[0134] Em uma modalidade, o anticorpo que se liga a VISTA, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, a ser identificado de acordo com o presente método compreende uma região de Fc que tem função efetora (por exemplo, se liga a um receptor de Fc em uma célula). Em uma modalidade particular, o anticorpo ou fragmento de ligação
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58/142 a antígeno do mesmo, se liga a um receptor de CD16 (por exemplo, FcvRIIIa, FcvRIIIb) em uma célula imune (por exemplo, célula NK).
[0135] Em uma modalidade, o anticorpo que se liga a VISTA, ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, a ser identificado de acordo com o presente método compreende um domínio VH de anticorpo que compreende uma CDR1 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25, uma CDR2 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma CDR3 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27, e que compreende adicionalmente um dominio VL de anticorpo que compreende uma CDR1 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28, uma CDR2 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma CDR3 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:30.
[0136] Em uma modalidade, a resposta biológica pode ser avaliada em vários tipos de amostras, incluindo, mas sem limitação a, uma amostra de tecido, uma amostra de fluido biológico (por exemplo, plasma, soro, linfa, sangue total, espinhal, amniótico, de mamífero ou outro fluido derivado de animal), uma amostra de célula (ou células) (por exemplo, uma célula tumoral, uma célula imune), e similares. As amostras podem incluir, por exemplo: (a) preparações que compreendem tecidos e/ou células frescas não fixadas; (b) espécimes de tecido fixas e embebidas, como material arquivado; e (c) tecidos ou células congelados. Assim, as amostras podem ser frescas ou conservadas, por exemplo, em solução liquida, congeladas rapidamente ou liofilizadas, manchadas ou secas, embebidas
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59/142 ou fixadas em lâminas ou outros suportes.
[0137] Em algumas modalidades, as amostras de tecido ou célula são fixadas ou embebidas. Fixadores são usados, por exemplo, para conservar as células e tecidos de uma maneira reproduzivel e semelhante à vida. Os fixadores também estabilizam células e tecidos, os protegendo assim contra os rigores de técnicas de processamento e coloração. Por exemplo, as amostras que compreendem blocos, seções ou manchas de tecido podem ser imersas em um fluido fixador, ou no caso de manchas, secas.
[0138] Qualquer meio de amostragem de um indivíduo, por exemplo, por coleta de sangue, punção lombar, esfregaço de tecido ou raspagem, ou biópsia de tecido pode ser usado para obter uma amostra. Assim, a amostra pode ser um espécime de biópsia (por exemplo, tumor, pólipo, massa (sólida, célula)), aspirado, mancha ou amostra de sangue. A amostra pode ser um tecido gue tem tumor (por exemplo, crescimento canceroso) e/ou células tumorais, ou é suspeito de ter um tumor e/ou células tumorais. Por exemplo, uma biópsia tumoral pode ser obtida em uma biópsia aberta, um procedimento no qual toda uma massa (biópsia excisional) ou parte da massa (biópsia incisional) é removida de uma área-alvo. Alternativamente, uma amostra tumoral pode ser obtida através de uma biópsia percutânea, um procedimento realizado com um instrumento similar à agulha através de uma pequena incisão ou punção (com ou sem o auxilio de um dispositivo de imageamento) para obter células individuais ou agrupamentos de células (por exemplo, uma aspiração de agulha fina (AAF) ) ou um núcleo ou fragmento de tecidos (biópsia de núcleo).
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60/142 [0139] As amostras podem ser examinadas citologicamente (por exemplo, mancha), histologicamente (por exemplo, seção congelada ou parafina) ou com o uso de qualquer outro método adequado (por exemplo, métodos de diagnóstico molecular). Uma amostra tumoral também pode ser obtida por colheita in vitro de células humanas cultivadas derivadas de um tecido do indivíduo. As amostras tumorais podem ser, se desejado, armazenadas antes da análise por meios de armazenamento adequados que conservam uma proteína e/ou ácido nucleico da de amostra em uma condição analisável, como congelamento rápido, ou um regime de congelamento controlado. Se desejado, o congelamento pode ser realizado na presença de um crioprotetor, por exemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO), glicerol ou propanodiolsacarose. As amostras tumorais podem ser reunidas, como apropriado, antes ou após o armazenamento para propósitos de análise.
[0140] Em uma modalidade, a resposta biológica pode ser determinada com o uso de um ensaio in vitro incluindo, por exemplo, métodos imunológicos e imunoquímicos incluindo, mas sem limitação a, citometria de fluxo (por exemplo, análise FACS), um ensaio de liberação de citocina, um ensaio de liberação de quimiocina, um ensaio de ativação celular, um ensaio de proliferação celular, um ensaio de migração celular, ensaios de imunossorvente ligado (ELISA), incluindo ensaios de quimioluminescência, radioimunoensaio, immunoblot (por exemplo, Western blot), imuno-histoquímica (IHC), imunoprecipitação e outros métodos quantitativos à base de anticorpo (por exemplo, ensaios baseados em microesfera
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Luminex®) . Outros métodos adequados incluem, por exemplo, espectroscopia de massa.
[0141] Em uma modalidade, a resposta biológica pode ser determinada in vivo em um animal não humano. Em uma modalidade, o animal não humano é um primata não humano. Ainda em uma outra modalidade, o animal não humano
é um roedor (por exemplo, um camundongo, um rato). Em
algumas modalidades, o animal não humano é um animal
transgênico. [0142] Em uma modal idade, o animal não humano
tem câncer (por exemplo, um tumor sólido, uma leucemia, um linfoma). Em algumas modalidades, o câncer é uma leucemia, linfoma, sindrome mielodisplásica e/ou mieloma. Em algumas modalidades, o câncer pode ser qualquer tipo de leucemia, incluindo uma leucemia linfocítica ou uma leucemia mielógena, como, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC) , leucemia mieloide (mielógena) aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia das células pilosas, leucemia prolinfocítica de célula T, leucemia linfocítica granular grande ou leucemia de célula T adulta. Em algumas modalidades, o linfoma é um linfoma histocítico, e em algumas modalidades, o câncer é um mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido, por exemplo, um melanoma, um câncer de mama ou câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de pulmão (por exemplo, um carcinoma pulmonar de célula não pequena (CPCNP)). Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de mama.
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62/142 [0143] Em uma modalidade, a resposta biológica a ser avaliada é uma diminuição no número de células imunes em circulação. As células imunes em circulação que são diminuídas podem ser, por exemplo, monócitos, neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a diminuição no número de células imunes em circulação é transiente.
[0144] Em uma modalidade, a resposta biológica a ser avaliada é uma diminuição no número de granulócitos em um ou mais tecidos (por exemplo, medula óssea) ou órgãos (por exemplo, baço) do indivíduo.
[0145] Em uma modalidade, a resposta biológica a ser avaliada é um aumento no número de células imunes em um microambiente tumoral (TME). As células imunes que são aumentadas no TME podem incluir, mas não são limitadas a, neutrófilos, macrófagos, células T ou qualquer combinação dos mesmos.
[0146] Em uma modalidade, a resposta biológica a ser avaliada é um aumento no nível de uma ou mais citocinas (por exemplo, uma ou mais quimiocinas). Os exemplos de citocinas que podem ser aumentadas em resposta para administração de um anticorpo anti-VISTA ou fragmento de ligação a antígeno incluem, por exemplo, IL-6, TNFa, MCP-3, MDC, ΜΙΡ-1β, IP-10, IL-lRa, GM-CSF, IL-12p70, GRO, ΜΙΡ-Ια, IL-Ιβ, RANTES, G-CSF, IL-Ία, IL-7, IL-12p40, IL-13, IFNy, ΤΝΕβ, IFNa, IL-4, IL-10, FGF-2, fractalcina, VEGF, IL-17A, Flt3L, IL-9, TGFa, IL-15, EGF, PDGF-αα, MCP-1, IL8, SCD40L, eotaxina, IL-2, IL-3, e IL-5, e PDGF-BB.
EXEMPLOS [0147] EXEMPLO 1: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE
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VISTA EM CÉLULAS HEMATOPOIÉTICAS HUMANAS [0148] Métodos:
[0149] Preparação e Coloração de PBMCs Humanas
Frescas para Expressão de VISTA [0150] A expressão de VISTA foi testada em PBMCs humanas recém-isoladas (células mononucleares de sangue periférico) de diversos doadores. Biotina de antiVISTA humana (GA-1) foi usada para coloração (5 pg/ml). A IgGl de camundongo, K-biotina (Clone MOPC-21 a 5 pg/ml) foi usada como um controle de isótipo.
[0151] Material de Doador [0152] As amostras de sangue foram obtidas junto à Biological Specialty Corp. (Colmar, PA, EUA) e foram coletadas e analisadas no mesmo dia. 10 ml de sangue total gue contêm sulfato de heparina foram levados para análise.
[0153] Preparação de Amostra [0154] O sangue foi diluído 1:1 em PBS estéril. 22 ml de sangue de cordão diluído foram dispostos em camadas sobre Ficoll-Hypaque estéril de 20 ml (GE Healthcare n° de Catálogo 17-144003) em tubos cônicos de 50 ml. Os tubos foram centrifugados a 1800 rpm por 20 minutos à temperatura ambiente. As células mononucleares na interface após centrifugação foram colhidas com o uso de um pipetador de 1 ml e combinadas em dois tubos cônicos de 50 ml. PBS estéril foi adicionado a cada tubo para produzir o volume de até 50 ml e as células foram centrifugadas a 300 g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 50 ml de PBS estéril e tubos foram girados a 300 g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante
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64/142 foi descartado. As células foram combinadas e ressuspensas em 50 ml de PBS estéril antes da contagem.
[0155] Protocolo de Coloração: Um frasco congelado que contém 5xl07 PBMCs foi usado para controles de compensação e como um controle para coloração.
[0156] Os seguintes reagentes e/ou consumiveis foram usados:
[0157] Tampão de Coloração FACS (BSA) da BD Biosciences (n° de Catálogo 554657) suplementado com 0,2 % de EDTA; Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco n° de Catálogo 14190); Placa de fundo redondo de polipropileno de 96 poços (BD n° 3077); Tubos de agrupamento de polipropileno de 1,2 ml (Corning n° 4451); Clone de Anti-VISTA biotinilado GA-1 de ImmunoNext n° de Lote 080612B (usado a 5 pg/ml); mlgGl biotinilado, controle de isótipo K (Clone MOPC-21); Biolegend n° de Catálogo400104, n° de Lote B116649 (usado a 5 pg/ml); Anticorpos anti-humanos (consulte tabela de coloração abaixo); Corante vivo/morto quase infravermelho (Invitrogen, n° de Catálogo L10119); e reagentes de estreptavidina incluindo STP-APC (BD Biosciences n° de Catálogo 554067, n° de Lote 04251) (usado a diluição 1:200 em tampão de FACS), STP-PE (Biolegend n° de Catálogo 405203, n° de Lote B139688) (usado a diluição 1:200 em tampão de FACS), STP-PE Cy7 (mostrou ligação não especifica em amostras de controle de isótipo), STP-Q605 (Invitrogen n° de Catálogo Q10101MP, n° de Lote 53449A) (usado a diluição 1:200 em tampão de FACS).
[0158] Protocolo de Coloração de Superfície Celular
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65/142 [0159] Antes da coloração, IxlO6 células foram transferidas para placas de fundo redondo de 96 poços e foram lavadas com 150 μΐ de PBS. As placas foram, então, centrifugadas a 1300 rpm a 4 °C por 3 minutos.
[0160] Subsequentemente, as células foram lavadas novamente em PBS e centrifugadas como descrito acima.
[0161] A coloração vivo/morto foi, então, realizada em 50 μΐ de PBS contendo 0,25 μΐ de corante vivo/morto quase infravermelho. Após 10 minutos à temperatura ambiente, os poços foram lavados com 150 μΐ de tampão de coloração de FACs e centrifugadas a 1300 rpm a 4 °C por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado.
[0162] As células foram bloqueadas com soro humano a 1:100 em 50 μΐ de tampão de coloração de FACs. As placas foram incubadas a 4 °C por 15 minutos. Os poços foram, então, lavados com 150 μΐ de tampão de coloração de FACs e centrifugados a 1300 rpm a 4 °C por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado.
[0163] Um coquetel contendo os seguintes anticorpos foi, então, adicionado a cada poço para coloração de superfície: Os coquetéis são descritos nas Tabelas 3-6 abaixo. Cada coquetel seria utilizado separadamente dos outros dependendo das populações de interesse.
[0164] Tabela 3: Cepa de Linhagem
Alvo
Flúor Antígeno Camundongo Rato Humano Isótipo Clone Fornecedor N° de Catálogo N° de Lote Titulador (pl/106 células)
VIC/AF488 GDI 9 X mlgGl HIB19 Biolegend 302206 2
PE CDllb X mlgGl, K ICRF44 BD Bio. 555388 45134 2
PerCP-Cy5.5 H1A-DR X mIgG2a., K G46-6 BD Bio. 560652 25161 0,5
PE Cy7 GDI 6 X mlgGl, K 3G8 BD Bio. 557744 87825 0,2
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Alvo
Flúor Antígeno Camundongo Pato Humano Isótipo Clone Fornecedor N° de Catálogo N° de Lore Titulador (pl/106 células)
APC Cy7 NIR Vivo/ Marte X
AF700 CD56 X mlgGl, K B159 BD Bio. 557919 19470 1
AEC/AF647 VISTA-Bio X
EB/V450 CD3 X mlgGl, K UCHT1 BD Bio. 558117 90926 0,5
Q605 CD14 X m!gG2a, K LuK4 Invitrcgen Q10013 1049158 0,2
[0165] Tabela 4: Coloração de Célula T
Alvo
Flúor Antígeno Camundongo Rato Humano Isótipo Clone Fornecedor N° de Catálogo N° de Lote Titulador (pl/106 células)
HTC/ AF488 CD4 X mlgGl, K RPAT4 BD Bio. 555346 38460 2
PE VTS^i- Bio X
PerCPCy5.5 CD8 X mlgGl, K RPA- T8 BD Bio. 560662 1037 0,5
PE Cy7 CD56 X mlgGl, K B159 BD Bio. 557747 47968 0,5
APC Cy7 NIR X
AF700 CD45RO X mIgG2a, K ucm Biolegend 304218 B143062 1
AEC/AF647 TCRgd X mlgG, K BI Biolegend 331212 B126473 2
PB/V450 CD45RA X mIgG2b, K HI100 BD Bio. 560363 90928 0,5
Q655 CD3 X mIgG2a S4.1 Invitrcgen Q10012 982352 0,5
[0166] Tabela 5: Cepa de DC
Alvo
Flúor Antígeno Camundongo Rato Humano Isótipo Clone Fornecedor N° de Catálogo N° de Lote Titulador (μ1/106 células)
FITC/ AF488 Linl X Mix Mix BD Bio. 340546 2152758 5
PE CDllc X mlgGl, K BD Bio. 555392 45123 2
PerCPCy5.5 HIA-DR X mIgG2a, K G46-6 BD Bio. 560652 25161 0,5
APC Cy7 Nffi X
APC/AF6 47 CD83 X mlgGl, K HB15e BD Bio. 551073 57688 2
BV421 CD123 X mlgGl, K 6H6 Biolegend 306017 B148193 0,5
Q605 VISIA-Bio X
[0167] Tabela 6: Cepa de Mieloide
Alvo
Flúor Antigeno Camundongo Pato Humano Isótipo Clone Fornecedor N° * Catálogo N° de lote Titulador (μ1/106 células)
FITC/ AF488 CD33 X mlgGL HM3-4 Biolegend 303304 B100963 3
FE CDllb X mlgGL, K ICRF44 PD Bio. 555388 45134 2
APC Cy7 NER X
AFC/AF64 7 VISIA-Bio X
Q605 CD45 X mlgGL, K HI30 Invitrcgen Q10051 880470 1
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67/142 [0168] Após a coloração de superfície, as células foram lavadas duas vezes como anteriormente descrito com tampão de coloração de FACs e centrifugadas a 1300 rpm a 4 °C por 5 minutos. As amostras foram ressuspensas em 50 μΐ de tampão de coloração de FACs que contém a estreptavidina fluorescentemente identificada apropriada. As amostras foram incubadas a 4 °C por 30 minutos. As células foram lavadas com 150 μΐ de tampão de coloração de FACs e centrifugadas a 1300 rpm a 4 °C por 5 minutos. Essa etapa de lavagem foi repetida antes de as amostras terem sido ressuspensas em 250 μΐ de tampão de coloração de FACs. As amostras foram analisadas em um analisador de célula BD LSRFortessa™ (BD Biosciences) no mesmo dia.
[0169] Análise de Dados [0170] Os dados de citometria de fluxo foram reanalisados com o uso de software FlowJo Versão 9 para comutar populações fenotipicas especificas. A enumeração de média geométrica foi usada para comparar a expressão de VISTA em diferentes subconjuntos de célula. Cada população foi normalizada para fundo pela subtração de valores de controle de isótipo dos valores médios das amostras tratadas com anti-VISTA. Os gráficos foram preparados em Prism e as estatísticas foram realizadas com o uso de teste T de Student se apenas duas amostras foram comparadas, ou ANOVA de um fator com testes posteriores de Bonferroni.
[0171] Resultados:
[0172] Expressão de VISTA em Subconjuntos de
Mieloide e Linfoide Humanos:
[0173] Como mostrado nas Figuras 2A-2E, 3A-3G,
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4, 5A-5B e 6A-6C, a expressão de VISTA em mondcitos de CD14+ foi significativamente diferente de todas as outras populações (p < 0,001). Nenhuma diferença significativa entre outras populações foi vista. Os monócitos expressaram os niveis mais altos de VISTA em sangue periférico, com o subconjunto CD14+CD16~ tendo expressão significativamente mais alta do que as células CD141OCD16+. Embora APCs tenham mostrado expressão moderada de VISTA, os subconjuntos de linfoide mostraram niveis de expressão baixa.
[0174] Expressão de VISTA em Subconjuntos T e NK Humanos:
[0175] Como mostrado nas Figuras 7A-7E, 8A-8G e 9, com os subconjuntos NK, as células CD5610 exibiram niveis de expressão significativamente mais altos de VISTA do que as células NK de CD56H1. Dentre os subconjuntos de célula T, as células de memória CD8+ expressaram os niveis de expressão mais altos, embora não sejam significativamente mais altos que células T de CD8+ maduras ou de CD4+.
[0176] Expressão de VISTA em Subconjuntos de Célula Dendritica Humana:
[0177] Como mostrado nas Figuras 10A-10D, 11A11C e 12, não foi visualizada nenhuma diferença significativa em expressão de VISTA; DCs e basófilos exibiram baixa expressão de VISTA, com células dendriticas plasmacitoides (pDCs) geralmente sendo mais altas, mas não em uma proporção significativa.
[0178] Conclusão: Esses resultados mostram expressão de VISTA em vários subconjuntos de célula imune, e que VISTA é expressa em monócitos mais altos, com alguma
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69/142 expressão em diferentes subconjuntos de célula T e células
NK, e pouca a nenhuma expressão em células B.
[0179] CÉLULAS DE SANGUE EXEMPLO 2 : PERIFÉRICO EXPRESSÃO DE VISTA EM
[0180] [0181] Métodos: Coloração de sangue total : Sangue total
recém-isolado (100 μΐ) foi corado com coquetéis de
anticorpo como indicado abaixo por incubação por 30 minutos a 4 °C. As hemácias (RBCs) foram lisadas com tampão de lise de RBC e as células remanescentes foram lavadas lx com tampão de coloração. As células foram ressuspensas em 200 μΐ de tampão de coloração. Os dados foram coletados com o uso de um citômetro de fluxo MACSQuant e analisados com o uso de software de análise FlowJo.
[0182] Coloração de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs): As células mononucleares de sangue periférico foram isoladas do sangue total com o uso de gradiente Ficoll. As IxlO6 PBMCs recém-isoladas foram coradas com coquetéis de anticorpo em 100 μΐ de tampão de coloração. As amostras foram incubadas por 30 minutos a 4 °C, então, lavadas uma vez com tampão de coloração. As células foram ressuspensas em 100 μΐ de tampão de coloração. Os dados foram coletados com o uso de citômetro de fluxo MACSQuant® (Miltenyi Biotec) e analisados com o uso de software de análise FlowJo.
[0183] Os anticorpos usados foram os anticorpos CDllb, CD33, CD177, CD16, CD15, CD14, CD20, HLADR, CD3, CD4, CD8, CD127, CD69 e FOXP3 (Biolegend, San Diego, CA, EUA) . O anti-VISTA humana de camundongo conjugado por APC (clone GG8) foi feito pela ImmuNext
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70/142 (Lebanon, NH, EUA).
[0184] Conclusões:
[0185] Expressão de VISTA em células periféricas humanas saudáveis [0186] As células mononucleares de sangue periférico e de sangue total foram analisadas em relação à expressão de VISTA com o uso de citometria de fluxo multicolorida. Como mostrado nas Figs. 15A e 15B, o nível de expressão de VISTA mais alto foi detectado em monócitos seguido por neutrófilos. Tanto as células T de CD4+ quanto as células T de CD8+ expressaram baixo nível de VISTA como mostrado nas Figuras 13C e 13D.
[0187] Expressão de VISTA em células de sangue periférico de paciente com câncer [0188] Como mostrado nas Figuras 14A-C, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de pacientes com câncer de pulmão foram analisadas. A Figura 14A é uma Plotagem de FACS representativa que mostra a análise de células supressoras derivadas de monócitos de CD14+ e mieloide de CD15+ (MDSCs). Os resultados sugerem que as células fenotipicamente CD15+ são MDSCs derivadas de neutrófilo. Adicionalmente, essas células estão ausentes em amostras de sangue saudáveis. A Figura 14B é um histograma representativo de expressão de VISTA em monócitos derivados de paciente com câncer e saudável, sugerindo um nível de expressão de VISTA mais alto em células de paciente com câncer em comparação com controles saudáveis. O nível de VISTA similarmente mais alto foi encontrado em MDSCs em pacientes com câncer, como mostrado na Figura 14C.
[0189] A Figura 15A é uma Plotagem de FACS
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71/142 representativa que mostra a presença de MDSCs derivadas de neutrófilo no sangue de pacientes com câncer de cólon. As Figuras 15B e 15C são histogramas representativos que mostram nivel mais alto de expressão de VISTA em monócitos de pacientes com câncer em comparação com amostras de sangue de doador saudável.
[0190] Expressão de VISTA em células de sangue periférico de macaco-cinomolgo [0191] Como mostrado nas Figuras 16A e 16B, a análise de citometria de fluxo de sangue total de revelou o padrão de expressão de VISTA similar a células humanas. Tanto os monócitos quanto os neutrófilos expressaram o nivel de VISTA mais alto em comparação com células T de CD4+ (Figura 16C) e CD8+ (Figura 16D) .
[0192] EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DE VISTA EM LINHAGENS DE CÉLULAS MALIGNAS HEME NO NÍVEL DE RNA E NÍVEL DE PROTEÍNA [0193] Devido ao fato de que VISTA é expressa em malignâncias heme, um anticorpo anti-VISTA poderia alvejar potencialmente as células malignas para destruição, assim como bloquear VISTA e promover respostas imunes antitumorais.
[0194] Os dados incluem análise RNAseq de -140 linhagens celulares malignas heme (algumas linhagens celulares são repetidas na análise). Os dados são mostrados na Figura 17.
[0195] Os valores de RNAseq são listados como valores de FPKM (Fragmentos Por Quilobase de Exon por Milhão de Fragmentos mapeados).
[0196] Essencialmente, isso significa que
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72/142 todas as leituras que se enquadram nas regiões exônicas de um gene foram contadas e normalizadas tanto pelo comprimento do gene quanto pelo número total de leituras por amostra (para contabilizar diferenças interamostra). 0 valor de corte é 1; acima de 1 é positivo para expressão de VISTA (no nivel de RNA) , abaixo de 1 é negativo para expressão de VISTA.
[0197] Os resultados indicaram que muitas linhagens celulares são positivas no nivel de RNA, principalmente leucemias mieloides agudas e leucemias mieloides crônicas. Isso pode ser esperado uma vez que VISTA é altamente expressa em células mieloides normais, e devido ao fato de que se acredita que sua função atenue respostas imunes, incluindo respostas imunes antitumorais.
[0198] EXEMPLO 4: GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA VISTA [0199] Panning (Seleção) de Fago [0200] Vinte e quatro experimentos de panning de fago foram executados para enriquecer fago em relação a VISTA-His de cinomologo. A proteína VISTA cinomolga foi usada para esses experimentos, tendo em vista que mostrou melhor conjugação de biotina do que a proteína VISTA humana. Para determinar o sucesso dos experimentos de fago, os agrupamentos de fago dos ciclos de panning individuais foram adicionados a placas de neutravidina revestidas com VISTA-His cinomolga biotiniladas e detectados com um anticorpo anti-M13 conjugado por HRP. As colônias individuais foram selecionadas a partir dos ciclos de seleção de fago e as proteínas Fabs foram produzidas em placas de 96 poços. Os sobrenadantes de Fab expressados
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73/142 foram ensaiados para ligação a VISTA-His cinomolga biotinilada. Isso resultou em mais que 200 acertos.
[0201] As regiões VH e VL das placas de Fab foram amplificadas, submetidas para sequenciamento de DNA e foram exportadas como arquivos FASTA. Mediante a seleção dos clones que devem ser convertidos e testados como MABs, os clones foram escolhidos com base em diversidade de sequência assim como com riscos de modificação póstraducional limitados e com menos resíduos hidrofóbicos possíveis.
[0202] As VH e VL dos clones de fago foram subclonadas em vetores de expressão IgGl/capa mamíferos e transfectados em células HEK293. Os anticorpos foram purificados em resina de afinidade de Fluxo Rápido de Sefarose de Proteína A. A concentração dos MABs de fago foi determinada por ELISA quantitativa com o uso de medições Nanodrop, o painel de anticorpo foi expresso em níveis altos. A análise SDS-PAGE demonstrou a integridade de cada variante de anticorpo expressada.
[0203] A maturação em linha dos anticorpos de fago foi feita pela amplificação dos domínios de VH das misturas de anticorpo policlonal do último ciclo de panning para clonagem formando vetores de fago que têm diversidade na VL. Isso resultou em um agrupamento de VH enriquecido que foi amostrado com diversidade adicional a VL. Os fagos foram retirados através de 1-2 ciclos de panning estringente com a expectativa de identificar aglutinados de afinidade muito alta para proteína ECD de VISTA His. Um ELISA de Fab monoclonal foi executado para determinar o sucesso da maturação. Os dados de ELISA e expressão foram
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74/142 normalizados para um clone de referência definido para 100 % do original de experimento de panning e os clones maturados por afinidade com sinal de ligação mais alto a antígeno de VISTA cinomolga em comparação com o clone de referência foram identificados. Esse processo gerou diversos clones que demonstraram até 200 % de ligação quando triados em concentração de antígeno baixa (1 nM) , os clones com mais alta afinidade foram sequenciados e produzidos como MABs.
[0204] Geração de hibridoma [0205] Um grupo de camundongos BALB/cAnNCrl recebeu uma injeção intraperitoneal (IP) de 50 pg de proteína recombinante Hu VISTA-Ig (Sino) emulsificada em Adjuvante de Freund Completo seguido duas semanas depois por uma injeção IP de 50 pg de proteína recombinante Hu VISTA-Ig emulsificada em Adjuvante de Freund Incompleto. Duas semanas depois, os camundongos receberam uma injeção IP de 50 pg de proteína recombinante VISTA-Fc cino emulsificada em Adjuvante de Freund Incompleto. Todos os camundongos receberam uma injeção final de 25 pg de VISTA humana e 25 pg de cino na base de cauda em PBS, cinco dias antes da colheita de baço para fusão.
[0206] Um outro grupo de camundongos BALB/cAnNCrl receberam uma injeção IP de 50 pg de proteína recombinante VISTA-His Hu emulsificada em Adjuvante de Freund Completo. Duas semanas depois, os camundongos receberam uma injeção IP de 50 pg de proteína recombinante VISTA-His Hu emulsificada em Adjuvante de Freund Incompleto. Duas semanas depois, os camundongos receberam uma injeção IP de 50 pg de proteína recombinante VISTA-His
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Cino emulsificada em Adjuvante de Freund Incompleto. Duas semanas depois, todos os camundongos receberam uma injeção final de 25 pg de VISTA-His Hu e 25 pg de VISTA-His cinomolga em PBS, três dias antes da colheita de baço para fusão.
[0207] No dia de fusão, os camundongos foram eutanasiados por asfixia com CO2, os baços foram removidos e colocados em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato fria. Uma suspensão de célula única de esplenócitos foi preparada pela trituração de baços através de uma peneira de malha fina com um pistilo pequeno e enxágue com PBS à temperatura ambiente. As células foram lavadas uma vez em PBS e submetidas à lise de RBC. Em suma, as células foram ressuspensas em 3 ml de tampão de lise de RBC (Sigma n° R7757) por cada baço e colocadas em gelo por 5 minutos. As células foram novamente lavadas uma vez em PBS à temperatura ambiente e identificadas em relação à classificação magnética. De acordo com as instruções do fabricante, as células foram identificadas com microesferas magnéticas de Thyl.2 antimurina, CDllb antimurina e IgM antimurina (Miltenyi Biotec n° 130-049-101, 130-049-601 e 130-047-301 respectivamente), então, classificadas com o uso de uma coluna de MS com um Midi MACS. As frações de célula negativas (frações de célula positivas foram descartadas) foram fusionadas para células FO. A fusão foi executada a uma razão 1:1 de células de mieloma murinas para células de baço viáveis. Em suma, as células de baço e mieloma foram misturadas, peletizadas e lavadas uma vez em 50 ml de PBS. O pélete foi ressuspenso com 1 ml de solução de polietileno glicol (PEG) (2 g de PEG peso molecular
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4000, 2 ml de DMEM, 0,4 ml de DMSO) por 10e8 esplenócitos a 37 °C per 30 segundos. A mistura célula/fusão foi, então, imersa em um banho de água a 37 °C por aproximadamente 60 segundos com agitação moderada. A reação de fusão foi parada pela adição lenta a 37 °C de DMEM por 1 minuto. Permitiu-se que as células fusionadas repousassem por 5 minutos à temperatura ambiente e, então, centrifugadas a 150 x g por 5 minutos. As células foram, então, ressuspensas em Meio E-HAT (MediumE (Stemcell Technologies n° de Catálogo 03805) que contém HAT (Sigma n° de Catálogo H0262) e propagadas em placas de cultura de tecido de poliestireno de fundo liso de 96 poços (Corning n° 3997).
[0208] Um EIA de captura foi usado para triar sobrenadantes de hibridoma para anticorpos específicos para VISTA cino. Em suma, as placas (Nunc-Maxisorp n° 446612) foram revestida a 4 pg/ml por pelo menos 60 minutos com anticorpo de IgG anticamundongo de cabra (Fc) (Jackson n° 115-006-071) em tampão de revestimento (Thermo 28382). As placas foram bloqueadas com 200 μΐ/poço de 0,4 % (p/v) albumina bovina sérica (BSA) em PBS a por 30 minutos à TA. As placas foram lavadas uma vez e 50 μΐ/poço de hibridoma sobrenadante foram adicionados e incubados à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. As placas foram lavadas uma vez e 50 μΐ/poço de 0,1 pg/ml de VISTA-huIg cino foram adicionados e incubados à TA por 30 minutos. As placas foram lavadas uma vez e 1:40.000 de Estreptavidina HRP (Jackson 016-030-084) em 0,4 % de BSA/PBS foi adicionado a placas e incubado por 30 minutos à TA. As placas foram lavadas 3x e subsequentemente desenvolvidas com o uso de 100 μΐ/poço de substrato Turbo TMB (Thermo Scientific
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34022) incubando aproximadamente por 10 minutos à TA. A reação foi parada com o uso de 25 μΙ/poço de Ácido Sulfúrico a 4 N e absorbância foi medida a 450 nm com o uso de um espectrofotômetro de placa automatizado. Quinze dos acertos principais foram selecionados para subclonagem pela limitação de diluição e foram triados no mesmo formato de triagem principal.
[0209] Todas as linhagens celulares de hibridoma reativas a VISTA cino foram submetidas à triagem cruzada com o uso de Ig de VISTA humana para analisar a reatividade cruzada. Em suma, as placas (Nunc-Maxisorp n° 446612) foram revestidas a 4pg/ml com Fc anti-ms de cabra (Jackson n° 115-006-071) em 0,1 M de tampão de carbonatobicarbonato de sódio, pH 9,4 (Pierce 28382 BupH™) O/N a 4 °C. Sem lavagem, os poços foram bloqueados com 200 μΐ de bloco (0,4 % de BSA (Sigma) (p/v) em PBS (Invitrogen) ) durante a noite a 4 °C. Após a remoção da solução de bloco, os sobrenadantes de hibridoma não diluidos foram incubados em placas revestidas por 30 minutos à TA. As placas foram lavadas uma vez com PBST (0,02 % de Tween 20 (Sigma) (p/v) em PBS) e, então, incubadas por 30 minutos com Hu VISTA-Ig diluida em 100 ng/ml em bloco. As placas foram lavadas uma vez com e sondadas com anti-humano-Fc-HRP de cabra (Jackson n° 109-036-098) diluido 1:10.000 em bloco por 30 minutos à TA. As placas foram lavadas novamente e subsequentemente desenvolvidas com o uso de 100 μΙ/poço de substrato Turbo TMB (Thermo Scientific 34022) incubando aproximadamente por 10 minutos à TA. A reação foi parada com o uso de 25 μΙ/poço de Ácido Sulfúrico a 4 N e absorbância foi medida a 450 nm com o uso de um espectrofotômetro de placa
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78/142 automatizado .
[0210]
Os hibridomas que demonstraram ser reativos tanto a VISTA humana quanto a cinomolga tiveram suas sequências de anticorpos de região V clonadas. As células de hibridoma foram preparadas antes das reações de transcriptase reversa (RT) com Sistema de cDNA Direto de células Superscript III da Invitrogen. Em suma, o meio de cultura foi descartado e a placa colocada em gelo e ressuspensa em 200 μΐ de PBS fria. Quarenta microlitros foram transferidos para uma placa de Reação PCR de 96 poços rápida MicroAmp e a placa foi colocada em uma base de placa de metal frio, vedada com filme plástico e girada a 700 rpm por 3 minutos. A PBS foi descartada e, em cada poço, 10 μΐ de tampão Ressuspensão e 1 μΐ de Melhorador de Lise foi adicionado. A placa foi vedada e incubada a 75 °C por 10 min e armazenada a -80 °C.
[0211]
Para a reação de RT, cada poço continha μΐ de água, 1,6 μΐ de tampão de 10X DNase, 1,2 μΐ de 50 mM de EDTA, 2 μΐ de Oligo(dT)20 (50 mM) e 1 μΐ de 10 mM de dNTP Mix. A placa foi incubada a 70 °C por 5 min, seguido por incubação em gelo para 2 min, então, os seguintes reagentes foram adicionados para cada poço; 6 μΐ de tampão 5X RT, 1 μΐ de RNaseOUT™ (40 U/μΙ) , 1 μΐ de Superscript™ III RT (200 U/μΙ) e 1 μΐ de 0,1 M de DTT. A placa foi vedada e colocada em um ciclador térmico pré-aquecida para 50 °C e incubada a 50 °C por 50 minutos, seguido por inativação (5 min de incubação a 85 °C) . A reação foi resfriada em gelo e o cDNA de fita simples foi armazenado a -80 °C até o próximo uso.
[0212]
Para amplificações de região V, 20 μΐ
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79/142 de reações PCR foram usados. Cada poço continha 16,2 μΐ de água, 2,0 μΐ de 10X tampão de Reação PCR, 0,8 μΐ de MgSO4 (50 mM) , 0,4 μΐ de 10 mM de dNTP, 0,15 μΐ de 100 uM de mistura de iniciador Direto, 0,05 μΐ de 100 uM de iniciador Reverso, 0,2 μΐ de enzima HiFi Tag. O cDNA, preparado como descrito acima, foi transferido (2 μΙ/poço) para a mistura de componentes de PCR, a placa foi vedada e uma reação de amplificação foi executada; Para VH, o programa foi (i) 94 °C por 1 min (ii) 94 °C por 15 s (iii) 55 °C por 30 s (iv) 68 °C por 1 min. As etapas (ii - iv) foram repetidas por um total de 35 ciclos seguido por uma extensão final a 68 °C por 3 min. Para VL, o programa foi (i) 94 °C por 1 min (ii) 94 °C por 15 s (iii) 55 °C por 30 s (iv) 65 °C por 30 s, (v) 68 °C por 1 min. As etapas (ii - v) foram repetidas por um total de 35 ciclos seguido por uma extensão final a 68 °C por 3 min.
[0213] Os iniciadores dianteiros foram prémisturados e tal mistura foi usada na razão 3:1 com o iniciador reverso. Os produtos de PCR foram verificados em um gel de agarose. As reações foram preparadas para clonagem de infusão pela adição de Melhorador (In-fusion HC Cloning Kit, n° de catálogo 639650, Clontech). Cinco microlitros da reação PCR foram transferidos para uma placa de PCR seguido pela transferência de 2 μΐ de melhorador/poço. A placa foi vedada e incubada em um ciclador térmico (15 min a 37 °C e 15 min a 80 °C). O vetor de destino (vDR243 ou vDR301) foi preparado por digestão de Esp3I; (1,5 pg de vetor foram digeridos em 3 μΐ tampão Tango, 2 1 de Esp3I e água em uma reação de 30 μΐ a 37 °C por 2 horas).
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80/142 [0214] Para clonagem por infusão, 2 μΐ de produto de PCR tratado com melhorador foi misturado com 100 ng de vetor digerido por Esp3I e 2 μΐ de 5X de enzima de infusão (Clontech). A reação de infusão foi feita em formato de placa de PCR de 96 poços. A placa foi incubada por 15 min a 50 °C em uma máquina de PCR e As células competentes Stella foram transformadas por choque de calor por 40 segundos a 42 °C sem agitação e espalhadas em placas de ágar LB com antibiótico selecionado e incubadas durante a noite a 37 °C. No próximo dia, as colônias foram coletadas em placas de poço profundo de 96 poços que contêm meios de LB/Carbenicilina e crescidas durante a noite a 37 °C. Os estoques congelados foram feitas a partir de mistura de cultura durante a noite com volume igual de 30 % p/v de glicerol. As regiões V foram sequenciadas com o uso de iniciador de sequenciamento SPF0052. As sequências foram analisadas, um poço positivo por hibridoma vH e vL foi escolhida, rearranjadas em novas placas e crescidas durante a noite em meio rico com ampicilina. Os clones, então, tiveram DNA miniprep preparado para transfecção em pequena escala placa de 96 poços.
[0215] Quarenta e oito sequências de hibridoma de camundongo selecionadas tanto para cadeia pesada quanto foram adaptadas à estrutura humana com o uso de um programa de software interno. Uma estrutura humana foi escolhida para cada camundongo vH ou vL. As sequências de DNA de região V foram obtidas através de retrotradução. As regiões de DNA sintético que correspondem às sequências de aminoácidos de AEH foram solicitadas junto à Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EUA) . A clonagem foi
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81/142 realizada em vDR149 e vDR157 pré-cortados, IgGl humano e capa humana respectivamente. Kits Endo-free Maxi-prep da
Qiagen foram usados para preparar o DNA. As culturas de
Expi293 (100 ml) foram usadas para expressar esse painel de anticorpo.
[0216] EXEMPLO 5: Protocolo para ensaio de supressão de célula T de Ig de VISTA humana in vitro [0217] Células A20 de camundongo foram estavelmente transfectadas com GFP ou VISTA humana. As foram incubadas com peptideo ova e com células T de DO11.10. A expressão de CD25 pelas células T foi medida 24 horas após a incubação ter começado. As células A20-huVISTA suprimem a expressão de CD25 pelas células T, mas essa leitura é significativamente restaurada por incubação com VSTB95 (Figura 18).
[0218] EXEMPLO 6: ADAPTAÇÃO DE REGIÕES DE ESTRUTURA HUMANA DE ANTICORPOS ANTI-VISTA [0219] As sequências de hibridomas de camundongo tanto para cadeia pesada quanto para cadeia leve foram adaptadas à estrutura humana por enxerto de CDR (Jones, et al. Nature, 321: 522-525 (1986) com o uso de um programa de software interno. O programa delineia a regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das sequências de região V de acordo com as definições de Rabat (Wu, T. T. & Rabat, E. A. (1970). J Exp Med, 132, 211-50) e compara as regiões de estrutura com os genes de linha germinativa humana com o uso de Blast. A linha germinativa humano com a identidade de sequência mais alta com as estruturas de camundongo foi escolhida como gene aceitante para adaptação à estrutura humana (AEH). Em poucos casos, os genes de
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82/142 linha germinativa humano muito relacionados foram escolhidos em vez disso com base em experiência prévia com estruturas humanas expressadas em poços. As sequências de DNA para as estruturas humanas escolhidas para cada uma das regiões V vH ou vL de camundongo foram obtidas através de retrotradução. As regiões de DNA sintético que correspondem às sequências de aminoácidos de AEH foram solicitadas junto à Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EUA) . A clonagem foi realizada em IgGl humana e capa humana, respectivamente.
[0220] EXEMPLO 7: Construtos de Anticorpo Anti-VISTA [0221] Informações de sequência e plasmídeo para as moléculas para desenvolvimento de linhagem celular: Os construtos de plasmídeo foram gerados para anticorpos anti-VISTA que tem as regiões variáveis VSTB112 e regiões constantes de IgGlK (VSTB174, novo número devido a uma alteração alotípica na região constante), um região constante IgG2sigma (VSTB140) ou uma região constante resistente à protease de IgGl (VSTB149) .
[0222] Vetores Lonza [0223] O sistema de vetor de expressão de ovário de hamster chinês (OHG) pEE6.4 e pEE12.4 (Lonza Biologies, PLC) foi estabelecido em Biologies Research (BR) e Pharmaceutical Development & Manufacturing Sciences (PDMS) como o sistema de expressão principal para geração de mAbs terapêuticos em linhagens celulares de expressão em mamífero. Cada vetor contém um promotor de citomegalovírus humano (huCMV-MIE) para acionar a expressão da cadeia pesada (HC) ou cadeia leve (LC) e contém o gene de
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83/142 resistência à ampicilina. 0 vetor pEE12.4 também inclui o gene que codifica a enzima glutamina sintetase (GS) . As condições de crescimento que requerem atividade de glutamina sintetase coloca pressão seletivas nas células para manter o vetor de expressão (GS Gene Expression System Manual Versão 4.0). pEE6.4 foi usado para clonar o gene HC e pEE12.4 para clonar o gene LC como vetores de gene único. O plasmídeo de gene duplo Lonza é criado a partir desses dois vetores de genes únicos Lonza.
[0224] Sequências de Aminoácidos de Regiões de
Cadeia Pesada Variáveis de mAbs de VISTA Selecionados [0225] >VSTB112 cadeia pesada (SEQ ID NO:37) [0226] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQ
APGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SSYGWSYEFDYWGQGTLVTVSS [0227] >VSTB50 cadeia pesada (SEQ ID NO:38) [0228] QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLNWVRQ
APGQGLEWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAEDTAVYYCAR EGYGNYIFPYWGQGTLVTVSS [0229] >VSTB53 cadeia pesada (SEQ ID NO:39) [0230] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTHYTIHWVRQ
APGQGLEWMGYIIPSSGYSEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GAYDDYYDYYAMDYWGQGTLVTVS S [0231] >VSTB95 cadeia pesada (SEQ ID NQ:40) [0232] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYGMSWVRQ APGKGLEWVASIISGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR IYDHDGDYYAMDYWGQGTTVTVSS [0233] Sequências de Aminoácidos de Regiões de Cadeia Leve Variáveis de mAbs de VISTA Selecionados [0234] >VSTB50 cadeia leve (SEQ ID NO:41)
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84/142 [0235] DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASESVDTYANSLMHW
YLQKPGQPPQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQTNED
PRTFGQGTKLEIK [0236] >VSTB53 cadeia leve (SEQ ID NO:42) [0237] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASH VPWTFGQGTKLEIK [0238] >VSTB95 cadeia leve (SEQ ID NO:43) [0239] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSH VPWTFGQGTKLEIK [0240] >VSTB112 cadeia leve (SEQ ID NO:44) [0241] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDTRLNWYQQK PGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSAYNPITF GQGTKVEIK [0242] >VSTB116 cadeia leve (SEQ ID NO:45) [0243] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINTNLNWYQQK PGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQARDTPITF GQGTKVEIK [0244] EXEMPLO 8: ELISA e triagem FACS de anticorpos anti-VISTA [0245] Esses experimentos foram para determinar a capacidade dos anticorpos produzidos em se ligarem à proteína VISTA humana ou cinomolga em um ELISA, assim como para determinar, com o uso de triagem de FACS, a capacidade dos anticorpos a se ligarem à proteína VISTA na superfície de células K562 (linhagem celular de leucemia mieloide humana) que expressam proteínas VISTA humanas ou cinomolgas.
[0246] Métodos:
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85/142 [0247] Resumo do Procedimento de ELISA: As placas foram revestidas durante a noite a 4 °C com 1 pg/ml de proteínas SB0361 (humano) ou SB0361 (cino (cinomolga)), que são os domínios extracelulares de VISTA das respectivas espécies. Os anticorpos foram diluídos para 1 pg/ml como uma concentração inicial com diluições graduais de 1:4 diluições para um total de 4 concentrações e incubados à temperatura ambiente (RT) por 2 horas. Anti-IgGl humana-HRP de camundongo (peroxidase de rábano) foi usado para detecção e incubado por 1 hora à TA. Todas as lavagens
foram realizadas com o uso de PBS-Tween (0,05 %) .
[0248] Resumo do Procedimento de FACS: 2 x 105
células K562-G8 (humano) ou K562-C7 (cino) foram coradas
com 5 pg/ml de cada anticorpo de teste e incubadas por 30 minutos a 4 °C. O anticorpo anti-IgGl humana-PE de cabra (ficoeritrina) foi usado como um anticorpo de detecção secundário a 5 pg/ml. As células foram processadas em um BD Fortessa e analisadas com o uso de software FlowJo (Tree Star, Inc., Ashlang, OR, EUA) em relação à IFM (intensidade de fluorescência média) da população viva.
[0249] Análise de Dados/Resultados: Para cada anticorpo, uma pontuação subjetiva (Yes/Não) foi dada em relação a se o anticorpo se ligou de modo robusto ou não tanto para a análise ELISA quanto para a análise FACS para cada um dos 4 ensaios. Se um anticorpo apresentou um resultado Não para ligação em cada ensaio, o mesmo foi repetido para confirmar que foi negativo. Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo e nas Figuras 19A-19F e 20A20F.
[0250] Tabela 7.
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Código INX ELISA Hu ELISA Cino FACS Hu FACS Cino
1 S S S S
2 S S S S
3 S S S S
4 S S S S
5 S S S S
6 S S S S
7 S S S S
8 S S S S
9 S S S S
10 S S s S
11 N N N N
12 S S s S
14 S S s S
16 s s s s
17 s s s s
18 s s s s
19 s s s s
20 s s s s
21 s s s s
22 s s s s
23 N N N N
24 N N N N
25 s s s s
26 N s N s
28 S s S s
30 N N N N
31 N N N N
32 N N N N
33 S S S S
34 S s S s
35 s s s s
36 s s s s
37 s s s s
38 s s s s
39 s s N N
40 s s s s
41 s s s s
42 s s s s
43 s s s s
44 s s s s
45 s s s s
46 s s s s
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Código INX ELISA Hu ELISA Cino FACS Hu FACS Cino
47 S S S S
48 S S S S
49 S S S S
[0251] EXEMPLO 9: Resultados de triagem de
anticorpos anti- VISTA humana com o uso da reação de
linfócito misturada (RLM) e ensaios de ativação de
Enterotoxina B de Staphylococcus (EBS)
[0252] 0 propósito desse estudo foi apresentar
dados que suportem a identificação de múltiplos anticorpos α-VISTA funcionais que melhoram as respostas imunes celulares no ensaio de reação de linfócito misturada (RLM), assim como o ensaio de ativação de enterotoxina B de staphylococcus (EBS).
[0253] A reação de linfócito misturada (RLM) é um ensaio imunológico padrão que depende de não correspondência de classe I e II de MHC para acionar uma resposta de célula T alogênica. As células mononucleares de sangue periférico são isoladas de dois indivíduos não correspondidos, incubados juntos e como um resultado dessas
não correspondências, a proliferação e a produção de
citocina ocorrem. [0254] Material e Métodos: [0255] Os meios AB a 10 % pela combinação de 500 ml de RPMI com foram preparados 50 ml de soro AB
humano, 5 ml de Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/ml), 5 ml de L-glutamina (lOOx) e 10 ml de HEPES (1M) . Os meios foram armazenados por não mais que 14 dias. 1 mCi de timidina tritiada foi preparado pela diluição de 0,2 ml de estoque de timidina (1 mCi/ml) em 9,8 ml de RPMI.
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88/142 [0256] Os anticorpos de VISTA solúveis foram diluídos para 20 pg/em meios de soro AB a 10 %. 100 μΐ das soluções de anticorpo apropriadas foram adicionados aos poços apropriados de uma placa com fundo em U de 96 poços (Falcon n° de produto 353077 ou equivalente) . Após várias populações celulares terem sido adicionadas, a concentração final foi 10 pg/ml.
[0257] Isolamento de leucócitos: Os doadores tinham pelo menos 18 anos de idade, em geral saudáveis e selecionados aleatoriamente da população local. O sangue de doador foi transferido a partir dos tubos de isolamento para elementos cônicos de 50 ml. Foram adicionados 15 ml de Ficoll 1077 por 25 ml de sangue com cuidado para não misturar com o sangue. As células foram centrifugadas a 1250 g por 25 minutos à temperatura ambiente sem parada. Os leucócitos foram isolados na interfase do Ficoll e do soro e diluiram as células em 40 ml de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS). As células foram centrifugadas a 453 g (1500 rpm) por 10 minutos a 4 °C. As células foram ressuspensas em 50 ml de HBSS e quantificadas pela transferência de 500 μΐ para um tubo separado.
[0258] Configuração de placa de 96 poços de reação de linfócito misturada (RLM): Foi determinado o número apropriado de células estimulantes e células responsivas necessárias para o ensaio com base no número de amostras a ser analisado. A população estimulante é propagada a 0,5 x 105 células/poço e a população responsiva é propagada a 1,0 x 105 células/poço de uma placa com fundo em U de 96 poços. Todas as condições precisam ser realizadas em triplicata. O número apropriado de células
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89/142 estimulantes foram pipetado em um novo elemento cônico e centrifugado como anteriormente descrito. As células foram ressuspensas em 10 ml e irradiadas com 4000 rads. As células foram centrifugadas como anteriormente descrito e ressuspensas a uma concentração de 1 x 106/ml em meios de soro AB a 10 % e foram adicionados 50 μΐ aos poços apropriados. Foi isolado o número exigido de células responsivas e as mesmas foram centrifugadas como anteriormente descrito e ressuspensas a uma concentração de 2 x 106/ml em meios de soro AB a 10 % e foram adicionados 50 μΐ aos poços apropriados. As células foram incubadas por 5 dias a 37 °C e 5 % de CO2. No quinto dia, foram removidos 30 μΐ de sobrenadante para análise de produção de gama interferon (IFN-γ)) . No quinto dia, foram adicionados 25 μΐ de uma solução de timidina tritiada de 40 pCi/ml a cada poço e incubados por 8 horas a 37 °C e 5 % de CO2. As células foram transferidas para a placa de microcintilação de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. As mesmas foram quantificadas com o uso do contador de microcintilação de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de IFN-γ foi determinada por ELISA (eBioscience n° de Catálogo 88-7316-88) com o uso do protocolo do fabricante.
[0259] Análise de dados: Foram calculadas as contagens médias por minuto (CMM) ou concentração de IFN-γ para os poços não tratados. Foi calculada a CMM média ou IFN-γ para cada um dos grupos de teste. Logio transformou o conjunto de dados. Com o uso de pontuações em vez de 12 RLM para cada composto, foi calculada a média para o conjunto de 12 grupos de teste de cada pontuação média de composto
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90/142 para 12 experimentos = Σ [ (logic (CMM média de triplicata para composto de teste)) - (logic (CMM média de triplicata para tratamento Não))]/12 [0260]
Critérios de aceitação :
Todos os reagentes de teste e controles apropriados foram testados em relação à endotoxina antes da execução do ensaio e têm níveis de < 0,1 EU/mg. As células responsivas tiveram sozinhas contagens de CMM abaixo de 700 CMM em média indicando que as células foram quiescentes quando incubadas sozinhas. A CMM para o grupo de RLM foi pelo menos 2 vezes mais alta do que a CMM para células responsivas incubadas sozinhas indicando que uma reação ocorreu e que os doadores são uma não correspondência. Todos os ensaios de RLM incluíram uma proteína de controle negativo de IgGl humana. O resultado do controle negativo de IgGl humana não foi estatisticamente diferente das amostras não tratadas com base no uso de um teste T de Student.
[0261]
Triagem de anticorpos anti-VISTA
RLM: Triagem inicial de todos os compostos. Antes da execução de RLM com os anticorpos anti-VISTA, foi confirmado que os anticorpos se ligam tanto a VISTA ligada à célula através de análise FACS quanto a proteína VISTA através de ELISA. Os anticorpos S26 (VSTB77), S30 (VSTB86), S31 (VSTB88), S32 (VSTB90) e S39 (VSTB74) falharam nessa triagem inicial, mas foram ainda testados no ensaio. Para o propósito de inicialização de triagem, todos os anticorpos foram testados a 10 pg/ml no RLM com proliferação e IFN-γ sendo os parâmetros medidos (Figuras 21A-21D e 22A-22B).
[0262] Seleção de seis anticorpos principais. A partir da triagem inicial, seis candidatos foram
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91/142 escolhidos para análise adicional: VSTB112 (S2), VSTB116 (S5) , VSTB95 (S16), VSTB50 (S41), VSTB53 (S43) e VSTB60 (S47) .
[0263] Estudos de diluição dos seis candidatos mais importantes no RLM: Ajustes de protocolo. O protocolo é idêntico como anteriormente descrito com o ajuste no qual os anticorpos foram diluidos para as seguintes concentrações: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0, 1, 0,03, 0, 01 e 0 pg/ml.
[0264] Determinação de valores IC50: As contagens de CMM brutas e as concentrações de IFN-γ foram usadas para determinar o IC50 para cada um dos anticorpos. Os cálculos de IC50 foram determinados através do uso do programa EZ-R stats. Seis responsivos individuais foram usados para determinar os valores IC50. As contagens de CMM e as concentrações de IFN-γ individuais no RLM com titulações de dose dos candidatos principais.
[0265] Tabela 8: Valores IC50 tanto para CMM quanto para IFN-γ no RLM
VSTB112 (S2) VSTB116 (S5) VSTB95 (S16) VSTB50 (S41) VSTB53 (S43) VSTB60 (S47)
CM M -0, 67 -0,78 -0,54 -0, 12 -0,33 0,02
Gci. ma -0,42 -0,16 0,22 0,06 0,27 0,4
** Os valores estão em logio de concentrações de anticorpo.
[0266] Conclusão: A triagem inicial indicou que múltiplos anticorpos específicos de VISTA foram capazes de melhorar a resposta imune celular de MLR. Os anticorpos foram, então, classificados com base na eficácia e na variância e com base nesses resultados, VSTB112, VSTB116,
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VSTB95, VSTB50, VSTB53 e VSTB60 foram escolhidos para avaliar experimentos de titulação de dose. VSTB60 induziu uma resposta mais fraca do que os outros cinco anticorpos nos experimentos de titulação de dose.
[0267] Ensaio de ativação de enterotoxina B de staphylococcus (EBS): EBS é um superantigeno bacteriano que induz ativação de células T de νβ+ especificas. As células mononucleares de sangue periférico são isoladas e incubadas com o antígeno de EBS em cultura, o que induz uma produção de citocina robusta. Esse ensaio foi conduzido nos cinco candidatos principais.
[0268] Preparação de meios AB a 10 %, preparação de 1 mCi de timidina tritiada, preparação de anticorpos VISTA solúveis e isolamento de leucócitos foram todos realizados como anteriormente descrito acima no RLM.
[0269] Configuração de placa 96 poços de EBS: Foi determinado o número apropriado de células responsivas necessárias para o ensaio com base no número de amostras a ser analisado. A população responsiva é propagada a 2,0 x 105 células/poço de uma placa com fundo em U de 96 poços. Todas as condições precisam ser realizadas em triplicata. As células foram centrifugadas como anteriormente descrito e ressuspensas a uma concentração de 4 x 106/ml em meios de soro AB a 10 % e foram adicionados 50 μΐ aos poços apropriados. Foi adicionado 50 μΐ de meios de soro AB a 10 % que contém o antígeno de EBS a uma concentração de 40 ng/ml. Nos experimentos descritos, EBS foi obtido junto à Sigma Aldrich (n° de Catálogo S0812). A concentração final no poço estava a 10 ng/ml. As células foram incubadas por 3 dias a 37 °C e 5 % de CCf. No terceiro dia, foram removidos
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93/142 μΐ de sobrenadante para análise de produção de IFN-γ. Foram adicionados 25 μΐ de uma solução de timidina tritiada de 1 mCi/ml a cada poço e incubados por 8 horas a 37 °C e 5 % de CO2 · As células foram transferidas para a placa de microcintilação de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. As mesmas foram quantificadas com o uso do contador de microcintilação de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de IFN-γ foi determinada por ELISA (eBioscience n° de Catálogo 88-7316-88) com o uso do protocolo do fabricante.
[0270] Protocolo: Análise de dados. Foram calculadas as contagens médias por minuto (CMM) ou a concentração de IFN-γ para cada um dos anticorpos em todas as concentrações. Os critérios de aceitação foram realizados como anteriormente descrito. A determinação de valores IC50 foi realizada como descrito. As contagens de CMM e as concentrações de IFN-γ individuais no ensaio de EBS com titulações de dose dos candidatos principais.
[0271] Tabela 9: Valores IC50 tanto para CMM quanto para IFN-γ no EBS.
VSTB112 (S2) VSTB116 (S5) VSTB95 (S16) VSTB50 (S41) VSTB53 (S43) VSTB60 (S47)
CM M -1,16 -1,44 -1, 12 -0,74 -1,06 não realizado
GcL ma -1,24 -0,35 0,05 1, 69 -1,05 não realizado
** Os valores estão em loglO c e concentrações de
anticorpo.
[0272] Conclusões: Os anticorpos específicos de VISTA melhoraram a produção de citocina e a proliferação de uma maneira dependente de dose no EBS ensaio. Os valores IC50 do estudo de EBS foram em geral similares aos
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94/142 resultados dos estudos de diluição de RLM.
[0273] EXEMPLO 10: ENSAIO DE BINARIZAÇÃO DE
EPÍTOPO [0274] Métodos: O sistema ProteOn XPR36 (BioRad) foi usado para realizar binarização de epítopo. Os pedaços de ProteOn GLC (BioRad, n° de Catálogo 176-5011) foram revestidos com dois conjuntos de 6 anticorpos monoclonais (mAbs) com o uso das instruções do fabricante para química de acoplamento de amina (BioRad, n° Catálogo 176-2410).
[0275] Os mAbs competidores foram préincubados em excesso (250 nM de concentração final) com VISTA humana (25 nM de concentração final) por 4 horas à temperatura ambiente e 6 de uma vez foram executados sobre o pedaço revestido com os painéis de mAbs revestidos com um tempo de associação de 4 minutos seguido por dissociação por 5 minutos. Após cada ciclo, os pedaços foram regenerados com 100 mM de ácido fosfórico.
[0276] A análise de dados envolveu o agrupamento de todos os sensorgramas por ligante e a aplicação de um assistente de alinhamento, que realiza automaticamente um alinhamento de eixo geométrico X e S, e remoção de artefato. Uma correção Interspot foi, então, aplicada aos dados.
[0277] Um mAb não competidor foi definido como tendo um sinal de ligação no mesmo sinal ou > Al (ligação a VISTA humana apenas).
[0278] Um mAb competidor foi definido como tendo que tem sinal de ligação << sinal Al (isto é, ligação a VISTA humana apenas).
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95/142 [0279] Resultados: No Exemplo de sensorgrama mostrado na Figura 23, o anticorpo VSTB85 foi revestido no pedaço de Proteon RPS e a proteína VISTA pré-incubada com os competidores indicados foi executada sobre o pedaço. VSTB50 é um exemplo de um anticorpo não competidor, tendo em vista que uma resposta positiva foi vista quando o complexo VISTA/VSTB50 foi executado. GG8, VSTB49 e VSTB51 formados em complexo com VISTA não se ligaram ao VSTB85 revestido no pedaço e foram, portanto, classificados como competidores para o mesmo sítio de ligação em VISTA como VSTB85.
[0280] Tabela 10:
Conjunto de anostra n° 1: accplador a sensor Conjunto de anostra n° 2: aoo plador a sensor
LI L2 L3 L4 L5 L6 U L2 L3 L4 L5 L6
Amostras Grupo GG8 B85 B95 B104 B112 B113 B50 B53 B66 B67 ffi8
QG8 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB100.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB101.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB102.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB103.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB104.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB105.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB106.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB107.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB108.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB109.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB110.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB111.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB112.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB113.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB114.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB115.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB116.001 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB49.002 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB51.002 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB53.002 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB59.002 1 S S S S S S N S N S S S
VSTB65.002 1 S S S s s s N S N S S S
VSTB67.002 1 s S S s s s N s N S S s
VSTB70.002 1 s s s s s s N s N S S s
VSTB81.002 1 s s s s s s N s N S s s
VSTB92.002 1 s s s s s s N s N s s s
VSTB95.002 1 s s s s s s N s N s s s
VSTB97.002 1 s s s s s s N s N s s s
VSTB98.002 1 s s s s s s N s N s s s
VSTB99.002 1 s s s s s s N s N s s s
VSTB50.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB54.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB56.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB60.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB63.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB66.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB73.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB76.002 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB78.002 2 N N N N N N S N S N N N
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Conjunto de anostra n° 1: accplador a sensor Conjunto de anostra n° 2: aocplador a sensor
LI L2 L3 L4 L5 L6 U L2 L3 L4 L5 L6
VSTB84.001 2 N N N N N N S N S N N N
VSTB85.001 3 S S S S S S N S N S - S
VSTB74.001 4 N N N N N N N N N N N N
K8 5 S I S S S S N S N S S S
S =Sim corpetiu (sinal « que Al-VISTA humana apenas)
N = Não oarpetiu (sinal > que Al-VISTA humana apenas)
I = Não oonclusivo (sinal similar a Al-VISTA humana apenas) [0281] Exemplo 11: Determinação de Afinidade de ProteOn [0282] Os anticorpos foram capturados em pedaços de ProteOn com o uso de superficies revestidas com Fc anti-IgG. Os anticorpos foram testados em relação à ligação de domínios extracelulares (ECDs) de VISTA humana e cinomolga (cino) em concentrações de proteínas VISTA na faixa de 0,39 nM a 100 nM. Permitiu-se que os antigenos se ligassem/associassem aos pedaços revestidos com anticorpo por 4 minutos, após esse tempo, a dissociação foi monitorada por 30 minutos. Os pedaços foram regenerados com dois tratamentos de 100 mM de ácido fosfórico por 18 segundos. Todos os experimentos foram executados a 25 °C e os dados foram ajustados ao modelo de ligação Langmuir 1:1.
[0283] EXEMPLO 12: EFEITOS DE TRATAMENTO ANTIVISTA EM UM MODELO TUMORAL DE BEXIGA MURINA MB49 [0284] Métodos:
[0285] Os camundongos C57B1/6 foram injetados com células tumorais de MB49. Uma vez que os tumores foram estabelecidos, o tratamento anti-VISTA foi iniciado. O crescimento tumoral foi, então, monitorado 3 vezes/semana. Os camundongos foram eutanasiados, de acordo com as regulações da IACUC, uma vez os tumores alcançaram 15 mm em qualquer dimensão.
[0286] Para cada experimento, um frasco
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97/142 congelado de células de MB49 foi descongelado e crescido em RPMI 1640 (+ L-Glut) com 10 % de soro e os antibióticos penicilina/estreptomicina. Após três dias em cultura, as células foram colhidas com o uso de StemPro Accutase e ressuspensas em RPMI a uma concentração de 5xl06 células/ml e 50 μΐ injetados por camundongo.
[0287] Os camundongos C57B1/6 fêmeas, com idades de 6-8 semanas foram adquiridos junto Instituto Nacional do Câncer. Mediante a chegada, permitiu-se que os mesmos se aclimatizassem por um dia antes de terem seus flancos direitos raspados e suas caudas tatuadas. Os mesmos foram, então, injetados três a cinco dias depois.
[0288] Injeção Tumoral (Intradérmica): Os camundongos foram injetados intradermicamente (i.d.) em seu flanco raspado com 50 μΐ de suspensão de célula de MB49 (—250.000 células).
[0289] Monitoramento de Crescimento Tumoral: O crescimento tumoral foi medido com o uso de calibradores eletrônicos primeiramente através da maior dimensão (L) e em segundo lugar a um ângulo de 90° em relação à primeira medição (W) . O volume tumoral foi derivado da seguinte forma:
[02 90] Volume = (L2M2)/2 [0291] Os tumores foram considerados estabelecidos uma vez que alcançaram ~5 mm em diâmetro (—60 mm3 de volume) . Uma vez estabelecido, o tratamento foi iniciado. O crescimento tumoral foi medido três vezes por semana no curso de tratamento e até que o experimento fosse terminado.
[0292] Tratamento anti-VISTA: O anticorpo
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98/142 monoclonal 13F3-mIgG2a quimerizado foi injetado intraperitonealmente a 10 mg/kg. Os cronogramas de injeção foram três vezes por semana por quatro semanas.
[0293] Eutanásia de camundongos: De acordo com os requisitos da IACUC, os animais foram eutanasiados uma vez que seus tumores alcançaram 15 mm na dimensão mais longa.
[0294] Análise de eficácia: Os volumes tumorais de camundongo foram analisados com o uso de Excel para gerenciamento de dados, e GraphPad Prism para representação gráfica. A análise estatística foi realizada com o uso de um macro para software de computação estatística R.
[0295] O projeto experimental é mostrado na Figura 24.
[0296] Resultados:
[0297] O tratamento de Chl3F3-mIgG2a em camundongos fêmeas levou à rejeição tumoral completa (RO) em 70 % dos animais e à remissão parcial (RP) em 30 % (n=7) (Tabela 13 e Figura 25B). Em contrapartida, todos os camundongos tratados com m!gG2a de controle mostraram crescimento progressivo dos tumores (6/6) (Figura 25A) . Esses dados demonstram que o tratamento anti-VISTA pode ter um efeito profundo no crescimento tumoral.
[0298] Tabela 11: Remissão completa (RC) versus remissão parcial (RP)
13F3 IgG2a Fêmea (n=7)
RC 5
RP 2 até dia 32
[0299] A sequência de VISTA humana é mostrada
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99/142 nas Figuras 26 e 27, adaptada a partir de Wang et ai.,
2011, supra, cujos conteúdos são incorporados no presente documento em sua totalidade.
[0300] EXEMPLO 13: Mapeamento de epitopo de anticorpos anti-VISTA com o uso de estudos de Troca de hidrogênio/deutério (H/D) [0301] Para identificar os epitopos para VSTB50, 60, 95 e 112 em VISTA humana, a troca de hidrogênio/deutério em solução-espectrometria de massa (TDH-MS) foi realizada com o uso dos Fabs correspondentes. Para troca de H/D, os procedimentos usados para analisar a perturbação de Fab foram similares àqueles descritos anteriormente (Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14:171182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45:8488-8498, 2006) com algumas modificações. Os Fabs foram preparados a partir das IgGs com digestão de papaina e captura de proteína A com o uso de kit de Preparação de Fab Pierce (Thermo Scientific, n° de Catálogo 44985). A sequência de proteína VISTA humana contém seis sitios de glicosilação ligado a N. Para aprimorar a cobertura de sequência, a proteína foi deglicosilada com PNGase F. A proteína VISTA deglicosilada foi incubada em uma solução de água deuterada por tempos predeterminados resultando em incorporação de deutério em átomos de hidrogênio trocáveis. A proteína VISTA deuterada estava em complexo com Fab de VSTB50, VSTB60, VSTB95 ou VSTB112 em 46 μΐ de óxido de deutério (D2O) a 4 °C por 30 s, 2 min, 10 min e 60 min. A reação de troca foi arrefecida por pH baixo e as proteínas foram digeridas com pepsina. Os níveis de deutério no peptídeo identificado foram monitorados a partir do desvio de massa em LC-MS. Como um
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100/142 controle de referência, a proteína VISTA foi processada de modo similar exceto pelo fato de que não estava no complexo com as moléculas de Fab. As regiões ligadas ao Fab foram inferidas como sendo aqueles sítios relativamente protegidos contra troca e, dessa forma, que contêm uma fração de deutério mais alta do que a proteína VISTA de referência. Cerca de 94 % da proteína poderíam ser mapeados para peptídeo específico.
[0302] Os mapas de perturbação de TDH-MS em solução de VISTA com VSTB50 / VSTB60, e VSTB95 / VSTB112 são mostrados na Figura 28 topo e fundo, respectivamente. Dois grupos de epítopo foram identificados. O VSTB50 AntiVISTA reconhece o mesmo epítopo que o VSTB60; VSTB95 se liga a uma outra região de epítopo diferentes da que o VSTB112 se liga em VISTA. VSTB50 e 60 Anti-VISTA compartilham o mesmo epítopo que compreende segmentos, losNLTLLDSGLm (SEQ ID NO: 62) e i36VQTGKDAPSNCi46 (SEQ ID NO:63) (Figura 28 topo). VSTB95 e 112 Anti-VISTA parecem alvejar epítopos similares, que compreendem segmentos 27PVDKGHDVTF36 (SEQ ID NO: 75) e 54RRPIRNLTFQDL65 (SEQ ID NO:65) (Figura 28 fundo). Existem dois outros segmentos que mostram perturbação fraca por VSTB95 e 112, incluindo resíduos 39-52 e 118-134. No entanto, os níveis da redução não são tão fortes quando as regiões anteriores (27-36 e 54-65) no mapa de diferencial. Embora um peptídeo, iqqTMRio2z que mostra perturbação forte por VSTB95 e 112, seja localizado na outra face da superfície de VISTA, o mesmo está distante das regiões de epítopo, 27-36 e 54-65. Essa perturbação podería ser devido ao efeito alostérico. Esses resultados de TDH-MS fornecem os epítopos de nível de
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101/142 peptideo para os anticorpos anti-VISTA. Não houve regiões sobrepostas de epítopo para esses dois grupos de epítopo.
Esses resultados estão de acordo com os dados de binarização de competição anteriores, devido ao fato de que não competem entre si.
[0303] EXEMPLO 14: Determinação de estrutura do complexo ECD:Fab de VSTB112 de VISTA humana por cristalografia de proteína [0304] Em um esforço para determinar a estrutura de VISTA e para delinear o epítopo e parátopo que definem a interação entre domínio extracelular de VISTA (ECD) e o fragmento Fab de anticorpo principal VSTB112, o complexo foi cristalizado e a estrutura determinada como 1,85 Â de resolução. A estrutura do ECD de VISTA humana em complexo com o fragmento Fab do anticorpo VSTB112 foi determinada em um esforço tanto para determinar a própria estrutura de ECD de VISTA quanto para definir o epítopo/parátopo para essa interação. A estrutura revela VISTA para adotar um aumento de IgV com um topologia de cadeia similar à cadeia Va de RCT. Além da ligação de dissulfeto canônica que conecta as fitas de B e F nas faces frontal e posterior do sanduíche β, a estrutura revela que o ECD tem duas ligações de dissulfeto adicionais, um atrelando a alça CC' à folha frontal e um segundo entre as fitas A' e G' . Embora os contatos de cristal entre as moléculas de VISTA estejam presentes, os mesmos são menores e não há evidência de um dímero de ECDs de VISTA com base nessa estrutura. É mostrado que o epítopo VSTB112 compreende as porções das alças BC, CC' e FG de VISTA junto com os resíduos da folha de beta frontal (C'CFG) mais
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102/142 próxima dessas alças. O parátopo é orientado em grande parte em direção às interações de cadeia pesada com CDR L3 realizando contato minimo.
[0305] Epitopo/parátopo que define interação
VISTA:VSTB112 [0306] Fab de VSTB112 oculta uma área de superfície de 1024,3 Â2 mediante a ligação de ECD de VISTA, com ocultação da contagem de superfície de cadeia pesada para 715,3 Â2 desse total. Sete ligações de hidrogênio e 4 interações de ponte de sal são formadas entre cadeia leve de VISTA e VSTB112 e 10 hidrogênios e 2 interações de ponte de sal entre cadeia pesada de VISTA e VSTB112. VSTB112 reconhece os resíduos nas fitas C' , C, F e G de folhas frontais nas extremidades próximas à alça FG assim como os resíduos nas alças BC, FG e CC' (Figuras 29 e 30) . As interações com a alça CC' contabilizam a maioria dos contatos com a cadeia leve de Fab apenas com os resíduos E125 e R127 na alça FG realizando interações de cadeia leve adicionais. Os resíduos 119 a 127 que correspondem à alça FG de VISTA contabilizam 38 % do total de 1034,8 Â2 de área de superfície ocultada mediante VSTB112 de ligação. Notavelmente, essa alça é altamente polar, compreendida da seguinte sequência -IRHHHSEHR- (SEQ ID NO:76). Adicionalmente, W103 na CDR H3 de VSTB112 é muito bem compactado contra a cadeia principal de resíduos H122 e H123 de VISTA, e VISTA H121 produz uma borda na interação com o anel aromático de F55 em CDR H2.
[0307] Uma comparação de regiões de epitopo identificadas por cristalografia e TDH é mostrada na Figura
31.
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103/142 [0308] EXEMPLO 15: ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T E
MONÓCITOS POR ANTICORPOS ANTI-VISTA [0309] O efeito funcional de anticorpos antiVISTA foi avaliado em dois ensaios in vitro, reação de leucócito misturada (RLM) e EBS (enterotoxina B de Staphylococcus). Ambos os ensaios medem a proliferação de célula Tea indução de citocina como suas leituras principais, mas esses efeitos são devido a diferentes mecanismos. Na RLM, as células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de dois doadores humanos diferentes são incubadas, e a não correspondência de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) entre células T de um doador e células dendriticas do outro doador resulta em proliferação de célula T e produção de interferon (IFNy). No ensaio de EBS, as PBMCs de um único doador são incubadas com um superantigeno bacteriano, que liga diretamente a proteina MHC Classe II nas células que apresentam superfície de antígeno (APC) ao receptor de célula T (RCT) em células T, provocando a ativação, proliferação de célula T e secreção de citocina. Em ambos os ensaios, VSTB112, que é a molécula parental de VSTB174, demonstrou indução dependente de dose de proliferação de célula T e produção de citocina, e foi mais potente dentre os candidatos (Figuras 21A-21D, Tabela 12).
[0310] Tabela 12. Valores de EC50 para as leituras de ensaio RLM. VSTB112 (parente de VSTB174) foi a molécula mais potente.
Candidato EC50 de proliferação (pg/ml) EC50 de produção de IFNy (pg/ml)
VSTB112 0,21 0,38
VSTB116 0, 17 0, 69
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Candidato EC50 de proliferação (pg/ml) ECso de produção de IFNy (pg/ml)
VSTB95 0,29 1, 67
VSTB50 0,77 1, 14
VSTB53 0,47 1,88
VSTB60 1, 04 2,48
[0311] Ensaios de Ativação de Monócito [0312] Os dados do ensaio, mostrados na Tabela 12, foram gerados com VSTB112, a molécula parental de VSTB174. Para mais bem compreender a atividade de VSTB174, os ensaios de ativação de monócito foram conduzidos. Os resultados mostram que a incubação de VSTB174 com PBMCs totais induziram a regulação ascendente de marcadores de ativação (CD80 e HLA-DR) em monócitos de CD14+, indicando um efeito de ligação de anticorpo a um subconjunto de célula imune conhecido por expressar altos niveis de VISTA (Figura 32) . Uma questão adicional é se os efeitos em ativação de monócito em PBMC total poderíam ser facilitados por qualquer anticorpo que se liga a VISTA e tem um Fc de IgGl. Os anticorpos VSTB103 e VSTB63 se ligam a VISTA com alta afinidade (KD 6,36E-10 e 8,30E-10 respectivamente) e a células que expressam proteína VISTA, similar a VSTB112 e VSTB111. VSTB103 está na mesma binarização de epítopo que VSTB112, enquanto VSTB63 está em uma binarização de epítopo diferente; nenhum anticorpo facilitou a ativação de monócito. Em conjunto, esses resultados mostram que um mecanismo pelo qual VSTB174 pode exercer seu efeito em ativação/proliferação de célula T é através da ativação de monócito facilitada por células NK.
[0313] Preparação de Meios [0314] 500 ml de RPMI 1640 (Corning, 10-040
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CV) foram combinados com 50 ml de soro AB humano (Valley Biomedical, Inc, n° de Lote 3C0405), 5 ml de penicilina/estreptomicina (Lonza, 17-602E) 10.000 U/ml, 5 ml de L-glutamina (lOOx) (Gibco, 25030-081) e 10 ml de HEPES (IM) (Fisher BP299-100, n° de Lote -1) . Os meios foram armazenados por não mais que 14 dias a 4 °C.
[0315] Preparação de anticorpos de VISTA e de controle solúveis [0316] Os anticorpos foram diluídos para 2X a concentração desejada em meios de soro AB a 10 %: VSTB174: lote VSTB174.003 [0317] Foram adicionados 100 μΐ das soluções de anticorpo apropriadas aos poços apropriados de uma placa com fundo em U de 96 poços (Falcon, 353077). Após as várias populações celulares terem sido adicionadas em 100 μΐ, a concentração final de cada anticorpo foi 1, 0,1 ou 0,01 g/ml. O anticorpo de controle de IgGl ONTO 3930 (Lote 6405, ENDO <0,1 EU/mg) foi adicionado a uma concentração final de 1 pg/ml.
[0318] As PBMCs foram isoladas.
de idade, [0319] em geral Os doadores tinham pelo menos 18 anos saudáveis e selecionados aleatoriamente
da população local. [0320] partir do tubo de 0 sangue isolamento do doador foi transferido a para elementos cônicos de 50
ml.
[0321] 15 ml de Ficoll 1077 (SIGMA, 10771)
foram adicionados com cuidado para não misturar com o
sangue . Isso foi por 25 [0322] As ml de células sangue. foram centri fugadas a 1250 g
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106/142 por 25 minutos à temperatura ambiente sem freio.
[0323] Os leucócitos foram isolados na interfase do Ficoll e o soro e as células foram diluídos em 40 ml de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS).
[0324] As células foram centrifugadas a 453 g (1500 rpm) por 10 minutos a 4 °C.
[0325] As células foram ressuspensas em 50 ml de HBSS e foram contadas pela transferência de 500 1 para um tubo eppendorf separado.
[0326] Adicionalmente, um kit de isolamento Pan Monocyte da Miltenyi foi usado de acordo com as instruções do fabricante (n° de Catálogo 130-096-537) para isolar células CD14+ por seleção negativa em vários grupos
de tratamento.
[0327] Configuração de cultura in vi tro
[0328] 0 número apropriado de células
necessárias foi determinado para o ensaio com base no
número de amostras a ser analisado. A população responsiva foi propagada a 2,0xl05 células/poço de uma placa com fundo em U de 96 poços. Para a população negativamente selecionada de CD14, 0,5xl05 células foram propagadas. Todas as condições foram realizadas em triplicata.
[0329] As células foram centrifugadas como descrito acima e ressuspensas a uma concentração de 2xlOs/ml para a população total de PBMC e 0,5xl06/ml para a população negativamente selecionada de CD14 em meios de soro AB a 10 % e adicionados 100 1 de anticorpo de teste aos poços apropriados trazendo o volume total em cada poço para 200 1.
[0330] As células foram incubadas por 1, 2, ou
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107/142 dias a 37° C e 5 % de CO2.
[0331] Coloração de anticorpo e citometria de fluxo [0332] A placa com fundo em U de 96 poços foi centrifugada por 5 minutos a 453 g e o sobrenadante foi removido.
[0333] As células foram lavadas com 200 μΐ de PBS e centrifugadas como na etapa 5.5.1.
[0334] O sobrenadante foi descartado e ressuspenso em 50 μΐ de PBS que contém os seguintes anticorpos :
• CD14-APC (clone HCD14) 1:250 (Biolegend n° de catálogo 325608)
• HLA-DR-PE Cy7 (clone L243) 1:250 (Biolegend
n° de catálogo • 307616) CD80-PE ( clone 2D10) 1:250 (Biolegend n° de
catálogo 305208) • inibidor de ligação de FcR Hu (eBioscience
n° de catálogo 14-9161-73) [0335] foi incubado por 20 minutos em gelo molhado no escuro.
[0336] 150 μΐ de PBS foram adicionados e centrifugados como na etapa 5.5.1.
[0337] 150 1 de tampão de PBS foram adicionados e analisados através de FACS.
[0338] As amostras foram executadas em um citômetro de fluxo de 10 parâmetros Miltenyi MACSQuant e analisadas com o uso de FlowJo 9.7.5 em relação à expressão de HLA-DR e CD80 na população CD14+. A intensidade de fluorescência média (IFM) geométrica, uma estatística que
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108/142 define a tendência central de um conjunto de números, fol usada como a estatística de definição para comparar os tratamentos .
[0339] Análise Estatística [0340] Todas as estatísticas foram executadas
Prism GraphPad, versão 6. As comparações pareadas dentre os grupos foram feitas em cada um dos pontos no tempo com o uso de ANOVA de um fator com correção Tukey para multiplicidade. Valores P menores que 0,05 para todos os testes e comparações foram considerados significativos. Para todos os gráficos e tabelas, * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, ****p<0,0001.
[0341] EXEMPLO 16: ATIVIDADES DE CODA E FCDA
DE ANTICORPOS ANTI-VISTA [0342] VSTB174 tem um Fc de IgGl, que pode conferir citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (CCDA) e atividade de fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (FCDA). Ambos os tipos de ensaios foram conduzidos e mostraram que VSTB174 podería realizar lise ou fagocitose de células K562-VISTA (Figuras 33-34), mas não células parentais de linhagem celular de mieloma K562 (dados não mostrados) . Um mecanismo de ação adicional de VSTB174 para modular a ação inibitória de VISTA pode ser a lise ou imersão de células que expressam altos níveis de VISTA, removendo assim as mesmas do microambiente local.
[0343] EXEMPLO 17: ATIVIDADES DE FCDA DE
ANTICORPOS ANTI-VISTA ADICIONAIS [0344] Um ensaio de fagocitose in vitro foi usado para estudar a melhoria de fagocitose mediada por
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109/142 macrófago de células que expressam ectopicamente VISTA por mAbs anti-VISTA humana (VSTB173 e VSTB174). Esses mAbs foram clonados em diferentes cadeias principais de Fc (IgGl WT (tipo selvagem), IgGl RP (resistente à protease), e IgG2o) e foram postuladas para ter potencialmente diferentes atividades em relação à melhoria de fagocitose. As cadeias principais de IgGl e IgGl RP são capazes de se ligarem aos receptores de Fc e têm o potencial de provocar FCDA, enquanto a IgG2o não se liga aos receptores de Fc e não deve mediar FCDA.
[0345] Os anticorpos anti-VISTA foram testados em ensaios de FCDA com células parentais de K562 parental e alvo de K562-VISTA. Como mostrado nas Figuras 35-36, VSTB174, VSTB149, VSTB173 e VSTB145 melhoraram a fagocitose de hMac de células K562-VISTA. Os anticorpos VSTB140 ou VSTB132 de VISTA, com o Fc de IgG2o que não se ligou aos receptores de Fc, não melhorou a fagocitose como esperado. Os mAbs VSTB174 e VSTB173 de VISTA com Fc de IgGl mostraram fagocitose mais robusta que VSTB149 e VSTB145 com o Fc de IgGIPR (consulte as Tabelas 13 e 14 para os valores de ECso) · [0346] Tabela 13. Valores de EC50 de mAb de
Anti-VISTA humana.
Tratamento VSTB174 VSTB149 VSTB140
EC50 0,0782 0,1142 NA
[0347] Tabela 14. Valores de EC50 de mAb de
Anti-VISTA humana.
Tratamento VSTB173 VSTB145 VSTB132
EC50 0,0146 0,1075 NA
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110/142 [0348] VSTB174 e VSTB173 mostraram melhoria fraca de fagocitose de células parentais K562 na concentração mais alta (Figuras 35-36) , o que pode ser devido à baixa expressão de VISTA pelas células K562. Os outros anticorpos anti-VISTA não melhoraram a fagocitose das células K562.
[0349] Os anticorpos de controle negativo foram, cada um, testados em duas concentrações diferentes no ensaio de fagocitose de K562-VISTA, mas não induziram qualquer fagocitose. Esse resultado indica que a fagocitose mediada pelos anticorpos anti-VISTA é especifica e devido à expressão de antígeno de VISTA pelas células K562-VISTA.
[0350] EXEMPLO 18: ATIVIDADES DE CODA DE ANTICORPOS ANTI-VISTA ADICIONAIS [0351] A fim de testar sua capacidade de induzir CCDA, os seguintes três anticorpo humanos antiVISTA foram testados:
VSTB174 (IgGl)
VSTB149 (IgGl RP)
VSTB174.LF (IgGl LF (baixa fucose)).
[0352] Cada anticorpo foi testado em seis concentrações diferentes dentro da mesma placa, em triplicata por dois experimentos separados por um total de seis pontos de dados.
[0353] VSTB174, VSTB149 e VSTB174.LF demonstraram cada um atividade mensurável de CCDA a 10, 1, 0,1 e 0,01 pg/ml, enquanto apenas o anticorpo de LF demonstrou atividade mensurável de CCDA a 0,001 pg/ml; nenhum dos anticorpos demonstrou CCDA a 0,0001 pg/ml. Como cada um desses anticorpos tem um Fc variante de IgGl ou
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IgGl, esse resultado é esperado. O anticorpo de LF demonstrou potência de CCDA aumentada como evidenciado pelo valor de EC50 menor para a curva de anticorpo de LF (0,002293 pg/ml) em comparação com a curva de anticorpo de IgGl regular (0,02381 pg/ml). A curva de anticorpo RP de IgGl teve um valor de EC50 similar à curva de IgGl regular (0,01846 pg/ml).
[0354] Tabela 15. Valores de EC50 (pg/ml) de três anticorpos anti-VISTA testados como determinado por análise de CCDA.
Anticorpo anti-VISTA ECso (pg/ml)
VSTB174 (IgGl) 0,02381
VSTB149 (IgGl RP) 0,01846
VSTB174.LF (IgGl LF) 0,002293
[0355] Os anticorpos de IgGl humana, IgGl humana RP e IgGl humana LF mostraram todos extermínio mediado por CCDA mensurável nas concentrações de anticorpo de 10, 1, 0,1 e 0,01 pg/ml, enquanto apenas o anticorpo LF mostrou extermínio na concentração de anticorpos de 0,001 pg/ml. Nenhum dos anticorpos anti-VISTA mostrou extermínio na concentração de anticorpo de 0,0001 pg/ml.
[0356] O anticorpo de LF mostrou aproximadamente extermínio de CCDA 10 vezes mais potente que o anticorpo IgGl ou o anticorpo IgGl RP regular, como visto nos valores de EC50.
[0357] EXEMPLO 19: AFINIDADE DE VSTB174 PARA VISTA HUMANA E CINOMOLGA [0358] A afinidade de VSTB174 para domínio extracelular de VISTA (ECD) de humano e macaco-cinomolgo foi determinada por métodos de ressonância de plásmon de
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112/142 superfície (RPS) métodos em um instrumento ProteOn. VSTB174 exibiu valores de KD muito similares para cada proteína, l,56E-10 M para ECD de VISTA humana e 8,66E-11 M para VISTA cinomolga.
[0359] EXEMPLO 20: ANTICORPOS DE VISTA EXIBEM EFICÁCIA EM MODELOS TUMORAIS MURINOS [0360] Cepas, Reagentes e Modelos Tumorais de Camundongo [0361] Para os estudos in vivo, camundongos knockin (VISTA-KI) de VISTA humana cruzados com um antecedente C57B1/6 foram usados.
[0362] Um anticorpo anti-VISTA humana foi gerado para permitir a testagem nos camundongos VISTA-KI, com o uso da região variável de VSTB174 enxertada sobre o Fc IgG2a de camundongo (VSTB123).
[0363] O câncer de bexiga MB49 foi avaliado nos camundongos VISTA Kl.
[0364] Além dos estudos publicados que demonstram que a terapia de anticorpo anti-VISTA inibe crescimento tumoral em camundongos do tipo selvagem (Le Mercier et ai., 2014), a eficácia antitumoral foi demonstrada com o anticorpo de hamster substituto em camundongos do tipo selvagem com o uso de diferentes cronogramas de dosagem, e nos camundongos VISTA-KI tratados com VSTB123.
[0365] Estudos de Eficácia In Vivo no Modelo Tumoral MB49 em Camundongos VISTA-KI [0366] Os estudos de eficácia de MB49 foram conduzidos em camundongos VISTA-KI fêmeas, a testagem de VSTB123 em diversas doses na faixa de 1-10 mg/kg. Os
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113/142 camundongos foram injetados intradermicamente com 250.000 células tumorais de MB49 no dia 0. No dia 6, a dosagem começou como indicado na Figura 37 (10 mg/kg do controle de isótipo m!gG2a, ou das doses indicadas de VSTB123; 10 camundongos/grupo).
[0367] VSTB123 foi mais eficaz em doses mais altas vs mais baixas, Como mostrado na Figura 37. As doses de 10 mg/kg e 7,5 mg/kg foram equivalentes, enquanto os tumores cresceram mais rapidamente nos camundongos dosados a 5 ou 1 mg/kg.
[0368] EXEMPLO 21: DETECÇÃO DE EXPRESSÃO DE VISTA EM TUMORES HUMANOS COM ANTICORPOS ANTI-VISTA
A Figura 1 mostra a expressão de VISTA por uma linhagem celular tumoral de LMA — isso e os dados de expressão de seq de RNA na Figura 17 suportam a ideia de que VISTA é expressa por células de LMA e que o fármaco anti-VISTA é eficaz através do alvejamento direto dessas células para modulação imune ou extermínio mediado por anticorpo.
[0369] Os dados para avaliar a expressão de VISTA em câncer de pulmão foram obtidos junto a amostras de tumor pulmonar de resseções cirúrgicas. As células foram dissociadas e caracterizadas para expressão de VISTA e muitos outros marcadores. Os resultados mostraram que os tumores pulmonares 13/13 (escamosos ou adenocarcinomas) contiveram células mieloides CD14+ VISTA+, (Figura 38).
[0370] EXEMPLO 22: DETECÇÃO DE EXPRESSÃO DE VISTA EM TUMORES PULMONARES COM O USO DE ANTICORPOS ANTIVISTA [0371] Um ensaio de imuno-histoquímica foi
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114/142 desenvolvido com o uso de clone GG8, uma IgGl de camundongo de anti-VISTA humana. Esse mAb foi usado para investigar a coloração de VISTA em seções de tumor FFPE de câncer de pulmão de célula não pequena (CPCNP).
[0372] As seções de tumor de FFPE foram tratadas com métodos de recuperação de antigeno padrão antes da coloração. O anticorpo anti-VISTA humana de camundongo GG8 foi usado a uma diluição de 1:500. A ligação de GG8 foi detectada com o uso de um anticorpo policlonal anticamundongo de coelho, seguido por HRP polimérico anticoelho. Após o contracoloração com hematoxilina, então, as seções tumorais foram pontuadas.
[0373] A expressão de VISTA em câncer de pulmão foi em sua maior parte restrita ao infiltrado imune (exemplo mostrado na Figura 39) e aos niveis altos de células positivas de VISTA estavam presentes em muitas amostras de câncer de pulmão.
[0374] EXEMPLO 23: ESTRUTURA DO DOMÍNIO EXTRACELULAR (ECD) DE VISTA HUMANA EM COMPLEXO COM O FRAGMENTO FAB DE VSTB174 [0375] As variantes de antigeno de VISTA foram geradas e purificadas para cristalografia. O Fab recombinante de VSTB174 de etiqueta His foi internamente expresso e purificado. Os cristais foram gerados e usados para coletar dados de resolução mais alta para o complexo de ECD de VISTA: Fab de VSTB174 com o uso de radiação sincroton e a determinação estrutural foi resolvida com o uso de combinações de modelagem de homologia e análises de densidade de elétron (Figura 29 (Topo)).
[0376] A estrutura do complexo de ECD de
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VISTA:Fab de VSTB174 foi determinada por cristalografia e raios x para uma resolução de 1,85Â, fornecendo a primeira estrutura do ECD de VISTA e delineando os epitopo e parátopo de VSTB174. 0 ECD de VISTA adota um aumento de IgV com uma topologia similar ao ECD de CTLA-4, mas possui uma fita C exclusiva que se estende pela folha frontal do sanduíche β. A' e C são adicionalmente atreladas quimicamente através de uma ponte de dissulfeto formada entre os resíduos C12 na fita A' e C146 na fita C. Verificou-se que seis cisteinas foram engatadas em três ligações de dissulfeto intramoleculares, e, com base em contatos de cristal, não há evidência para uma VISTA dimérica.
[0377] VSTB174 reconhece os resíduos nas fitas C' , C, F e G de folhas frontais nas extremidades próximas à alça FG assim como os resíduos nas alças BC, FG e CC'.
[0378] EXEMPLO 24: ATIVAÇÃO DE MONÓCITO POR ANTICORPOS ANTI-VISTA REQUER RETICULAÇÃO DE CD16 (FCrRIII) [0379] O presente estudo foi projetado para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-VISTA em ativar monócitos em cultura. A ativação de monócito foi analisada pela, regulação ascendente de expressão de superfície de marcadores canônicos de ativação de monócito: CD80, CD86, HLA-DR e PD-L1. Tendo em vista que VSTB174 tem um Fc ativo, os papéis de GDI6 e outros receptores de Fc em ativação de monócito mediada por anti-VISTA foram estudados. Em particular, a capacidade dos anticorpos anti-CD16, antiCD32 e anti-CD64 no bloqueio de ativação de monócito mediada por anti-VISTA foi examinada, na qual VSTB112 (Hulgd Fc ativo) ou VSTB140 (Fc silencioso de IgG2sigma)
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116/142 foi usado para, provocar a ativação de monócito. Os fragmentos Fc solúveis foram também usados no mesmo ensaio para bloquear ligação de Fc não especificamente.
[0380] A expressão de CD16 em PBMC (que carece de neutrófilos) é tipicamente restrita a células NK e monócitos inflamatórios (CD14+/-, CD16+). As células NK foram esgotadas para determinar seu papel em ativação de monócito induzida por anti-VISTA. Adicionalmente, IFN-y, um produto principal de células NK ativadas capazes de ativação de monócito foi bloqueado para analisar sua contribuição individual.
[0381] Métodos [0382] Preparação de Meios [0383] Todas as diluições e cultura foram, feitas em RPMI (Life Technologies; n° de Catálogo 118750 93) que contém 10 % de soro AB humano (Sigma-Aldrich, n° de Catálogo H5667) e 1 % de Peni/Estrep (Life Technologies; n° de Catálogo 15140-122).
[0384] Anticorpos de Bloqueio [0385] Anti-CD16 (Biolegend n° de Catálogo 302050, Clone 3G8), anti-CD32 (BD n° de Catálogo 552930, Clone FLI8.26) e anti-CD64 (Biolegend n° de Catálogo 305016, clone 10.1) foram diluídos para 20 ug/ml em meios completos como indicado. O bloco interno (IHB) foi diluido para 8 mg/ml, também em meio completo.
[0386] 50 μΐ desses estoques foram plaqueados em. triplicata em uma placa de 96 poços para cada condição de ativação/bloqueio indicada. 50 μΐ de meios que não contêm anticorpos foram usados para o controle sem bloqueio.
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117/142 [0387] Preparação de Célula [0388] 2 frascos de PBMC congelada (HemaCare
PB009C-1, lOxlO6 células por frasco) por cada doador indicado foram descongelados em um banho de água a 37 graus, diluídos para 10 ml em meios completos e centrifugados a 1500 RPM por 5 minutos.
[0389] Os meios que contêm meios de congelamento diluídos foram removidos e as células foram lavadas com 10 ml de meios frescos e giradas como supracitado. Antes dessa rotação, uma amostra de 10 μΐ foi retida para cada amostra.
[0390] As contagens de célula foram determinadas pela diluição de amostras 1:2 em azul de tripano e a contagem em um Contador de Célula Automatizado Countess™ (n° de catálogo C10227). As células foram ressuspensas em meios completos a uma concentração de 2x10° células/ml. 100 μΐ dessa preparação de célula foram adicionados a todos os poços experimentais. As placas que contêm a mistura de célula/anticorpo de bloqueio foram incubadas por 15 minutos a 37 graus C.
[0391] Ativação [0392] VSTB112, VSTB140 e o controle de isótipo HulgGl (11,76 mg/ml) foram todos diluídos para 20 pg/ml em meios completos. Após a conclusão da etapa de incubação, 50 μΐ dos estoques de anticorpo de ativação foram adicionados ao poço apropriado contendo células e reagent.es de bloqueio. A concentração final de anticorpos de bloqueio e ativação foi 5 pg/ml. A concentração final de IHB foi 2 mg/ml. As células foram incubadas a 37 graus C durante a noite (20 horas).
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118/142 [0393]
Análise [0394]
Após a incubação todas as placas experimentais foram giradas a 1500 RPM por 5 minutos. 150 μΐ do meio foram removidos por pipetagem e armazenados a 80 °C para análise posterior. 150 μΐ de tampão de FACS (Becton Dickinson; n° de catálogo 554657) foram adicionados a cada poço, misturados por pipetagem e as amostras foram giradas uma vez mais a 1500 RPM por 5 minutos. As células foram ressuspensas em 50 uL de tampão de FACS que contém 2 mg/ml do IHB e foram incubadas a 4 graus C no escuro por 20 minutos. Após incubação, 50 μΐ da seguinte mistura de coloração diluída em tampão de FACS foram adicionados a todas as amostras (todos os anticorpos diluídos 1:25) : CD14-APC (Biolegend, clone HCD14); CD80-PE (Biolegend, clone CD10); CD86-FITC (Biolegend, clone IT2.2); HLA-DR APCCy7 (Biolegend, clone L243); PD-L1 - PeCy7 (Biolegend, clone 29E2A3). As amostras foram incubadas por 30 minutos a 4 graus C no escuro. Após incubação, 100 μΐ de tampão de FACS foram adicionados a cada poço e as placas foram giradas a 1500 RPM por 5 minutos. As células foram lavadas IX como descrito acima e finalmente ressuspensas em 200 μΐ de tampão de FACS que contém Aqua LI VE/DEAD® (LifeTechnologies, n° de Catálogo L34 957) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram executadas em um BD FACS Canto™ II e analisadas com FlowJo ver9.2.
[0395] Resultados [0396]
Após a conclusão de cult as ceru..
viáveis foram analisadas em relação expressão d·
CD80, CD86, HLA-DR e PD-L1 (Figura 40, mostrando expressão de PD-L1) . Em comparação com monócitos em culturas d?
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PBMC que foram tratadas com o controle de isótipo HulgGl, os monócitos em culturas tratadas com VSTB112 aumentaram os niveis de cada um desses marcadores. 0 nível desse aumento variou de doador para doador (dados não mostrados). Os monócitos em culturas tratadas com VSTB140 não mostraram níveis elevados de ativação de marcadores indicando que um domínio ativo de Fc é requerido para o efeito (Figura 40). Adicionalmente, a adição de fragmentos Fc de inibidor de
.11 g a. ç a o c o mp e 11 α o r a (IHB) para as culturas mutc >u e, em
alguns casos, anulou completamente a ativação med iiada por
VSTB112 . Esse efeito não foi dependente de CD32 ou CD64,
posto que os anticorpos que bloqueiam esses receptores não bloquearam a ativação mediada por VSTB112 de monócito (dados não mostrados).
[0397] A expressão de CD16 em PBMC (que carece de neutrófilos) é tipicamente restrita a células NK e monócitos inflamatórios (CD14 + /-CD16 + ) . Os dados preliminares identificaram um papel para células NK na ativação in vitro de monócitos por anticorpos anti-VISTA. O esgotamento de células NK ou o bloqueio do receptor de IFNy reduziram significativamente a extensão de ativação de monócito induzida por anti-VISTA, sugerindo que tanto as células NK quanto IFNy contribuem, para a ativação de monócito mediada por anti-VISTA in vitro (dados não mostrados).
[0398] Em suma, com o uso de CD80, CD86, HLÃDR e PPJ-L1 como marcadores de ativação de monócito, a capacidade de VSTB112 (molécula parental de anticorpo VSTB174) e se derivado de Fc silencioso, VSTB140, em ativar monócitos em culturas de PBMC foi comparada com um
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120/142 anticorpo humano não especifico de controle de IgGl (ONTO 3930). Por todos os parâmetros, os monócitos foram ativados por VSTB112 e não por VSTB140. Essa atividade parece ser dependente de Fc devido à incapacidade de VSTB140 em ativar e à capacidade de fragmentos Fc solúveis em mutar parcialmente as capacidades de ativação de VSTB112 (Figura 40, mostrando PD-L1 como marcador de ativação de monócito). Adicionalmente, essa ativação foi dependente da presença de células NK nessas culturas e a produção de IFN-γ induzida por anticorpo como remoção de cada um desses componentes do sistema de cultura in vitro atenuou notavelmente a ativação de monócito (dados não mostrados). Como mostrado no presente documento, o mecanismo de ativação parece ser dependente de reticulação do receptor de Fc CD16, tendo em vista gue o mesmo pode ser completa e robustamente imitado pela adição de anticorpos gue reticulam GDI 6, até mesmo na ausência, de anticorpos de ligação a VISTA.
[0399] EXEMPLO 25: INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO TUMORAL POR ANTICORPO ANTI-VISTA REQUER FUNÇÃO EFETORA [0400] VISTA, um regulador negativo de células T, é expresso em muitas células hematopoiéticas e altamente expresso no microambiente tumoral (Le Mercier, et ai., Cancer Research 74(7):1933-44, 2014). O tratamento de camundongos que portam tumores com um anticorpo de VISTA anticamundongo in vivo resulta em crescimento tumoral significativamente reduzido (Le Mercier, et ai.).
[0401] Esse estudo foi conduzido para determinar o efeito de anticorpos anti-VISTA humana VSTB123 e VSTB124 no crescimento de tumores MB49 estabelecidos em camundongos hVISTA Kl machos ou fêmeas (knock-in). Esses
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121/142 camundongos têm o cDNA de VISTA humana preso no local do gene de camundongo VISTA, e expressam apenas VISTA humana tanto no nível de RNA quanto no nível de proteína. As células tumorais de MB49 expressam antígeno H-S macho (Wasiuk et al., Cancer Immunol Immunother 61:2273-82, 2012), urn autoantigeno em camundongos machos, mas urn antígeno exógeno em camundongos fêmeas. O tratamento foi iniciado quando os tumores alcançaram 3-5 mm em diâmetro. Os anticorpos anti-VISTA ou de controle foram dosados 3 vezes por semana a 10 e 5 mg/kg para dez doses. Todos os grupos de camundongo foram avaliados em relação a volume tumoral, sobrevivência, peso e alterações em populações imunes em sangue periférico durante o curso do experimento. A farmacocinética de fármaco (PK) e o desenvolvimento de
anticorpo antifármaco (ADA) foram também avaliados.
[0402] Métodos
[0403] Projeto de Estudo
[0404] Estudos idênticos e paralelos foram
conduzidos em camundongos hVISTA Kl machos e fêmeas. Para cada gênero, os camundongos foram divididos em 5 grupos de 6-7 camundongos tratados respectivamente com VSTB123 ou VSTB124, a 10 ou 5 mg/kg, ou anticorpo de controle de m!gG2a a 10 mg/kg. Consulte a Figura 41 para projeto experimental.
[0405] Fonte e preparação de célula [0406] As células de MB49 foram obtidas junto ao laboratório do Dr. R. Noelle (originalmente do Dr. P. Matzinger) . Foi confirmado que as células de MB49 eram livres de micoplasma e outros contaminantes (testagem IMPACT™ SC a IDDEX RADIL n° de Caso 22209-2014). Um frasco
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122/142 de célula foi descongelado e crescido em RPMI 1640 (+ LGlut) com 10 % de FBS e antibióticos peni/estrep. Após três dias em cultura, as células foram colhidas por breve incubação com StemPro® Accutase®, lavadas duas vezes e ressuspensas em RPMI frio a 5xl06 células/ml antes da injeção nos camundongos. Todos os reagentes de cultura foram adquiridos junto à Gibco and Hyclone.
[0407] Agentes de teste e dosagem [0408] VSTB123 e VSTB124 são anticorpos antiVISTA humana quiméricos feitos por Janssen. Cada um tem a
mesma região variável de anti-VISTA humana, derivada de
VSTB174, mas clonado em um Fc de IgG2a de camundongo
(VSTB123) ou um Fc silencioso de IgG2a ala/ala de
camundongo (VSTB124). Os controles de anticorpos e m!gG2a
(BioXcell BE0 085, clone 01.18.14 n° de Lote 5035/0514)
foram diluídos em PBS e administrados por injeção intraperitoneal em um volume de 0,2 ml para aplicar uma dose de 10 ou 5 mg/kg.
[0409] Camundongos [0410] Os camundongos hVISTA Kl foram procriados em Sage Labs (Boyertown, PA, EUA) . Os camundongos, com idades de 8-12 semanas, transitaram primeiramente por 3 semanas na instalação de quarentena, e, então, foram transferidos para a instalação regular. Os mesmos foram aclimatizados por 2 dias antes de terem seus flancos direitos raspados e suas caudas tatuadas. As células tumorais foram injetadas 5 dias depois.
[0411] Injeção de célula intradérmica [0412] Os camundongos foram injetados intradermicamente em seu flanco direito raspado com 50 μΐ
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123/142 de suspensão de célula de MB49 (—250.000 células). Todos os camundongos no qual a injeção não foi bem-sucedida (vazamento do sitio de injeção ou injeção subcutânea em vez de intradérmica) foram removidos do experimento.
[0413] Aleatorização, iniciação de tratamento e medição de tumor [0414] Os tumores foram medidos no dia 4 após a injeção na maioria dos camundongos machos, quando os tumores alcançaram um diâmetro entre 3 mm e 5 mm. Com base na observação de que a maioria dos camundongos mostrou evidência de crescimento tumoral por medição ou inspeção visual, os camundongos foram aleatoriamente cedidos para grupos de tratamento. O tratamento foi iniciado no dia 5. O crescimento tumoral foi monitorado 2-3 vezes por semana durante o curso do tratamento e até que o experimento fosse terminado. A fórmula (L x W2) /2 foi usada para determinar volume tumoral (Léo comprimento ou a dimensão mais longa, e W é a largura do tumor).
[0415] A remissão parcial (RP) foi alcançada quando o tumor foi metade (ou mais reduzido em tamanho, mas maior que 13,5 mm3) do volume inicial por 3 medições consecutivas. A remissão completa foi alcançada quando qualquer tumor foi menor que 13,5 mm3 por 3 medições consecutivas.
[0416] Resultados [0417] Como mostrado na Figura 42A (esquerda), os camundongos fêmeas tratados com VSTB123 a 10 mg/kg mostraram reduções significativas em volume tumoral em comparação com o grupo de controle. O efeito em crescimento tumoral podería ser detectado logo no dia 13, após 3 doses
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124/142 de anticorpo. Além disso, alguns camundongos em cada grupo de tratamento de VSTB123 mostraram regressões tumorais completas e duráveis: 5/7 camundongos no grupo de 10 mg/kg e 3/6 camundongos no grupo de 5 mg/kg. Nenhum dos 6 camundongos de grupo de controle regrediu (dados não mostrados) .
[0418] O tratamento com VSTB124 não inibiu o crescimento tumoral em fêmeas em cada dose (Figura 42A, direita). Tendo em vista que VSTB123 tem uma IgG2a de camundongo que pode se ligar a receptores de Fc, enquanto VSTB124 tem um Fc silencioso, esse resultado sugere que a ligação de Fc é importante para eficácia nesse modelo.
[0419] Os camundongos foram monitorados em relação à sobrevivência por 52 dias (Figura 42B) . Para camundongos fêmeas, as comparações de sobrevivência foram mais difíceis devido ao fato de que dois de seis animais de controle ainda estavam vivos nos 52 dias. Entretanto, 7/7 camundongos tratados com VSTB123 a 10 mg/kg estavam vivos no dia 52 (p=0,0108), enquanto 4/6 camundongos tratados com VSTB123 a 5 mg/kg ainda estavam vivos naquele dia. O tratamento de camundongos fêmeas com VSTB124 não resultou em aprimoramento de sobrevivência.
[0420] Como demonstrado no presente documento, o tratamento com VSTB123 em camundongos hVISTA Kl fêmeas que portam tumores MB49 levou à remissão completa (RC) em 85 % (5/7 camundongos) do grupo a 10 mg/kg, com um aumento significativo em sobrevivência (p=0,0108); O tratamento com VSTB123 a 5 mg/kg levou à RC em 3 dentre 6 camundongos (50 %) . Em contrapartida, VSTB124 não afetou significativamente o crescimento tumoral ou a sobrevivência. Esse resultado,
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125/142 comparado com os resultados de VSTB123, sugere que a eficácia com anticorpo anti-VISTA no modelo de MB49 pode exigir um Fc ativo.
[0421] EXEMPLO 26: VSTB174 DISPARA LIBERAÇÃO
DE CITOCINAS [0422] Os anticorpos anti-VISTA induzem ativação de monócitos de CD14+ em culturas de PBMC total, como medido por regulação ascendente de marcadores coestimulantes como CD80 e HLADR. O presente estudo determinou alterações, se houver, em citocinas em culturas de PBMC humanas cultivadas com anticorpo anti-VISTA VSTB174.
[0423] Os monócitos são leucócitos inatos que representam -10-30 % do sangue periférico isolado por centrifugação de densidade de Ficoll. Os monócitos demonstraram desempenhar papéis importantes tanto em respostas inflamatórias quanto em anti-inflamatórias com base no nivel de proteínas e citocinas coestimulantes que os mesmos expressam. Os anticorpos anti-VISTA (incluindo VSTB174) ativam monócitos de CD14+ em culturas de PBMC total como medido por regulação ascendente de marcadores coestimulantes na superfície celular, como CD80 e HLA-DR. Para determinar se o tratamento com anticorpo anti-VISTA alteraria a produção de citocinas no ensaio, as PBMCs totais foram tratadas por 24 horas com VSTB174 e os sobrenadantes foram analisados por Luminex® em relação à expressão diferencial de 41 citocinas.
[0424] Como mostrado no presente documento, a cultura do anticorpo anti-VISTA humana VSTB174 com PBMC total resultou em expressão significativamente aumentada de
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126/142 muitas citocinas em PBMCs humanas in vitro.
[0425] Métodos [0426] Preparação de meios [0427] 500 ml de RPMI 1640 (Corning, 10-040CV) foram combinados com 50 ml de soro AB humano (Valley Biomedical, Inc., n° de Lote 3C0405), 5 ml de penicilina/estreptomicina (Lonza, 17-602E) 10.000 U/ml, 5 ml de L-glutamina (lOOx) (Gibco, 25030-081) e 10 ml de
HEPES (IM) (Fisher BP299-100, foram armazenados por não mais [0428] Preparação n° de Lote -1) . Os meios que 14 dias a 4 °C.
de VSTB174 anti-VISTA e anticorpos de controle [0429] Os anticorpos foram diluídos para 2X a concentração desejada em meios de soro AB a 10 %. Foram adicionados 100 μΐ das soluções de anticorpo apropriadas aos poços apropriados de uma placa com fundo em U de 96 poços (Falcon, 353077) . Após as células terem sido adicionadas em 100 μΐ, a concentração final de cada anticorpo foi 10, 1, 0,1 ou 0,01 pg/ml. O anticorpo de controle de IgGl CNTO 3930 (Lote 6405, ENDO <0,1 EU/mg) foi adicionado a uma concentração final de 10 pg/ml. Cada condição foi executada em triplicata.
[0430] Isolamento de PBMCs [0431] Os doadores tinham pelo menos 18 anos de idade, em geral saudáveis e selecionados aleatoriamente da população local. Três doadores forneceram PBMCs para esse estudo. O sangue de doador foi transferido a partir do tubo de isolamento para elementos cônicos de 50 ml. 15 ml de Ficoll 1077 (SIGMA, 10771) foram adicionados com cuidado para não misturar com o sangue. Isso foi por 25 ml de
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127/142 sangue. As células foram centrifugadas a 1250 g por 25 minutos à temperatura ambiente sem freio. Os leucócitos foram isolados na interfase de Ficoll e soro e as células foram diluídas em 40 ml de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS). As células foram centrifugadas a 453 g (1500 rpm) por 10 minutos a 4 °C. As células foram ressuspensas em 50 ml de HBSS e contadas pela transferência de 500 μΐ para um tubo eppendorf separado.
[0432] Configuração de cultura in vitro [0433] Foi determinado o número apropriado de células necessárias para o ensaio com base no número de amostras a ser analisado. As PBMCs foram propagadas a 2,0xl05 células/poço de uma placa com fundo em U de 96 poços. Todas as condições foram realizadas em triplicatas técnicas.
[0434] As células foram centrifugadas a 453 g (1500 rpm) por 10 minutos a 4 °C e ressuspensas a uma concentração de 2xl06/ml em meios de soro AB a 10 % e foram adicionados 100 μΐ aos poços apropriados trazendo o volume total em cada poço para 200 μΐ. As células foram incubadas por 24 horas a 37 °C e 5 % de ΟΟ2. Foram coletados 100 μΐ de sobrenadante para análise por Luminex®.
[0435] Análise multiplex [0436] As citocinas foram medidas com o uso do kit MAG Premix 41 Plex cito/quimio humano da Millipore (n° de Catálogo HCYTMAG-60K-PX41, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA). As curvas de calibração de padrões de citocina recombinantes foram preparadas com etapas de diluição de três vezes na mesma matriz que as amostras. Os picos altos e baixos (sobrenadant.es de PBMCs humanas e
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128/142 células dendriticas estimuladas) foram incluídos para determinar a recuperação de citocina. Os padrões e os controles de qualidade foram medidos em triplicata técnica, em que cada amostra de teste em triplicata foi medida uma vez, e os valores brutos foram subtraídos de todas as leituras. Todos os ensaios foram executados diretamente em uma placa de filtração de 96 poços (Millipore, Billerica, MA, EUA) à temperatura ambiente e protegidos contra luz. Em suma, os poços foram pré-molhados com 100 μ.1 de PBS contendo 1 % de BSA, então, as microesferas, juntamente com uma amostra, picos ou blocos em bruto padrão foram adicionadas em um volume final de 100 μΐ, e incubadas juntas à temperatura ambiente por 30 minutos com agitação continua. As microesferas foram lavadas três vezes com 100 μΐ de PBS contendo 1 % de BSA e 0,05 % de Tween 20. Um coquetel de anticorpos biotinilados (50 μΙ/poço) foi adicionado às microesferas para incubação de 30 minutos à temperatura ambiente com agitação contínua. As microesferas foram lavadas três vezes, então, estreptavidina-PE foi adicionada por 10 minutos. As microesferas foram novamente lavadas três vezes e ressuspensas em 12 5 μΐ de PBS que contém 1 % de BSA e 0,05 % de Tween 20. A intensidade de fluorescência das microesferas foi medida com o uso do leitor de arranjo Bio-Plex©. O software Bio-Plex® Manager com cinco ajustes de curva de parâmetro foi usado para análise de dados.
[0437] Análise estatística [0438] Todas as estatísticas foram executadas em Linguagem de Computação Estatística R. Os valores de concentração de citocina abaixo da detecção (<OOR) foram
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129/142 re-escalonados para a concentração detectável mais baixa, e os valores acima da quantificação precisa (>00R) foram reescalonados para concentração linearmente quantificável máxima. Os valores extremos estatísticos foram removidos antes da análise estatística com base em p<0,05 de Grubbs e da distância extrema de mais que 1 de desvio padrão da média de grupo com o uso de uma única etapa. As comparações pareadas dentre os grupos foram feitas em cada um dos pontos no tempo com o uso de ANOVA de um fator com Diferenças Significativas Honestas de Tukey. Valores P menores que 0,05 para todos os testes e comparações foram considerados significativos. Para todos os gráficos e tabelas, * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, * * **p<0, 0001. A Figura 43 foi produzida com agrupamento hierárquico completo de citocinas com o uso da função heatmap.2 no pacote g-plots em R.
[0439]
Resultados [0440]
Para determinar efeitos de anticorpos anti-VISTA em PBMCs totais, VSTB174 foi adicionado às culturas de célula em diferentes concentrações por 24 horas, e os sobrenadantes foram analisados em relação aos niveis de 41 citocinas. As PBMCs totais tratadas com VSTB174 tiveram aumentos estatisticamente significativos na expressão de um grande número de citocinas, muitos dos quais são canonicamente expressos por células monociticas e granulociticas (Figura 43) . Cada resposta de PBMC de doador foi exclusiva na intensidade da resposta acionada por VSTB174. Os doadores 1 e 2 mostraram aumentos significativos em muito mais analitos do que o doador 3 (Figura 43) . Ademais, quando
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130/142 todos os três doadores mostraram aumentos significativos em um analito particular, a alteração em vezes sobre a linha de base foi usualmente a menor para o doador 3 (dados não mostrados).
[0441] Os efeitos de VSTB174 foram mais provavelmente detectados quando o fármaco estava presente entre 0,1-10 pg/ml, com poucos analitos significativamente regulados de modo ascendente a 0,01 pg/ml (Figura 43).
[0442] As citocinas significativamente elevadas em relação ao controle de IgGl para todos os doadores foram as seguintes: IL-6, TNFa, MCP-3, MDG, MIP1β, IP-10, IL-lRa, GM-CSF, IL-12p70 e GRO.
[0443] Algumas citocinas foram significativamente elevadas apenas nos doadores 1 e 2: MIPla, IL-Ιβ, RANTES, G-CSF, IL-la, IL-7, IL-12p40, IL-13, IFNy, TNFp, IFNa (elevada no doador 3, mas ainda próximo da linha de base), IL-4, IL-10, FGF-2, fractalcina, VEGF, IL17, Flt3L, IL-9, TGFa, IL-15, EGF, e PDGF-aa.
[0444] Duas citocinas, MCP-1 e IL-8, foram significativamente elevadas apenas no doador 3. Os níveis de linha de base dessas citocinas estiveram acima da faixa que podería ser quantificada no ensaio para os doadores 1 e 2, então, é possível que os analitos se tornaram elevados com tratamento com VSTB174, mas isso não foi mensurável (listado como OOR>) . Os níveis de linha de base e de tratamento de MCP-1 e IL-8 estiveram dentro da faixa dinâmica do ensaio para o doador 3.
[0445] Existiram diversas citocinas que não se alteraram em comparação com a linha de base em qualquer
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131/142 doador com tratamento com VSTB174: sCD40L, eotaxina, IL-5, PDGF-ββ, IL-2, IL-3. IL-2, IL-3 e SCD40L foram significativamente elevadas no doador 1 com tratamento com fármaco, mas os niveis de IL-2 e IL-3 ainda permaneceram muito baixos. sCD40L se tornou apenas elevada no doador 1 a 0,1 pg/ml de dose, e não em quaisquer outras doses.
[0446] Como demonstrado no presente documento, VSTB174 induziu a produção melhorada de muitas citocinas de PBMCs em múltiplas amostras de doador humano, de uma maneira dependente de dose.
[0447] Adicionalmente, os estudos in vivo em camundongos hVISTA Kl fêmeas também mostraram produção aumentada de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, MCP1, IP-10, IL-8, IL-6, MIP-lb, IL-10, IL-7, IFN-γ, G-CSF, RANTES, IL-15, TNFa, IL-Ιβ, MIP-la, IL-la, GM-CSF, IL12p40, IL-13, e/ou eotaxina) em resposta a VSTB123. Em particular, as citocinas reguladas de modo ascendente demonstraram estar envolvidas em recrutamento, migração ou ativação de células mieloides. Tanto os camundongos hVISTA Kl implantados com células tumorais de MB49 quanto os camundongos hVISTA Kl maduros mostraram perfis de liberação de citocina similares (dados não mostrados).
[0448] EXEMPLO 27: VSTB123 INDUZ MIGRAÇÃO DE MACRÓFAGOS DE CD80+ PARA AMBIENTE TUMORAL [0449] VISTA é um regulador negativo de células T que é expresso na maioria das células hematopoiéticas. O presente estudo foi conduzido para identificar alterações em números de população imune e fenótipo de ativação em camundongos hVISTA Kl que portam tumor MB49 em resposta ao tratamento com os anticorpos
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132/142 anti-VISTA humana VSTB123 ou VSTB124. Os camundongos hVISTA Kl têm o cDNA de VISTA humana preso no local do gene de camundongo VISTA, e foi confirmada sua expressão apenas VISTA humana tanto no nivel de RNA quanto no nivel de proteina. As células tumorais de MB49 expressam antigeno HS macho, um autoantigeno em camundongos machos, mas um antigeno exógeno em camundongos fêmeas e altamente expressado no microambiente tumoral. Como mostrado no presente documento, os camundongos com tumores responderam com infiltração de mieloide aumentada após tratamento com VSTB123 ou VSTB124, e aumentaram a expressão de marcador de ativação de CD80 em macrófagos infiltrantes em tumor com tratamento com VSTB123.
[0450] Métodos [0451] Projeto de Estudo [0452] Os camundongos hVISTA Kl foram divididos em 3 grupos de 5 camundongos fêmeas cada. Cada camundongo foi injetado com células tumorais de MB49 no flanco direito no dia 0. Nos dias 7, 9 e 11, os camundongos foram injetados com 10 mg/kg de anticorpo de controle m!gG2a, VSTB123 ou VSTB124. No dia 12, os camundongos foram eutanasiados e sangue, baços e tumores foram analisados por múltiplos parâmetros. A Figura 44A ilustra esse projeto experimental.
[0453] Camundongos [0454] Os camundongos hVISTA Kl são procriados em Sage Labs (Boyertown, PA, EUA) . Os camundongos, com idades de 8-12 semanas, transitaram primeiramente por 3 semanas na instalação de quarentena, e, então, foram transferidos para a instalação regular. Os mesmos foram
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133/142 aclimatizados por 2 dias antes de terem seus flancos direitos raspados e suas caudas tatuadas. As células tumorais foram injetadas 5 dias depois.
[0455] Fonte e preparação de célula [0456] As células de MB49 foram obtidas junto ao laboratório do Dr. R. Noelle (originalmente do Dr. P. Matzinger) . Foi confirmado que as células de MB49 eram livres de micoplasma e outros contaminantes (testagem IMPACT™ SC a IDDEX RADIL n° de Caso 22209-2014). Um frasco de célula foi descongelado e crescido em RPMI 1640 (+ LGlut) com 10 % de FBS e antibióticos peni/estrep. Após três dias em cultura, as células foram colhidas por breve incubação com StemPro® Accutase®, lavadas duas vezes e ressuspensas em RPMI frio a uma concentração de 5xl06 células/ml, e 50 ml (2,5xl05 células) injetados por camundongo. Todos os reagentes de cultura foram adquiridos junto à Gibco and Hyclone.
[0457] Injeção de célula intradérmica [0458] Os camundongos foram injetados intradermicamente em seu flanco raspado com 50 ml de suspensão de célula de MB49 (—250.000 células). Todos os camundongos no qual a injeção não foi bem-sucedida (vazamento do sítio de injeção ou injeção subcutânea em vez de intradérmica) foram removidos do experimento.
[0459] Agentes de teste e dosagem [0460] VSTB123 e VSTB124 foram gerados por Janssen. VSTB123 é um anticorpo anti-VISTA humana compreendido da região variável de VSTB174 em um arcabouço de Fc de mu!gG2a. VSTB124 é um anticorpo anti-VISTA humana compreendido da região variável de VSTB174 em um arcabouço
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134/142 de Fc de mu!gG2a com mutações ala/ala que silenciam o Fc. 0 anticorpo de camundongo de controle (m!gG2a) foi gerado por
BioXcell, clone Cl.18.4, n° de Lote 5386-2/1014, 8,4 mg/ml lx em PBS.
[0461] Os anticorpos foram diluidos em PBS para 1 mg/ml para dosagem. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com um volume de 0,2 ml, para aplicar
uma concentração final de 10 mg/kg. Como esboçado na Figura
44A, os camundongos receberam terapia de anticorpo no s dias
7, 9 e 11 após a injeção de tumor.
[0462] Colheita de tecido
[0463] Os camundongos foram eutanasiados com o
uso de CO2 em conformidade com o protocolo de IACUC
Dartmouth. Os camundongos foram exsanguinados por punção cardíaca e sangue coletado. O baço e os tumores foram dissecados.
[0464] Os baços foram dissociados com o uso de colagenase (1 mg/ml, Sigma Aldrich) em HBSS e do dissociador MACS™ moderado (Miltenyi Biotec) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram passadas através de um filtro de 40 pm, então, submetidas lise de eritrócito em 3 ml de tampão de lise de ACK (Lonza, n° de Lote 0000400419) por 5 minutos. Após 1 lavagem em HBSS, as células foram ressuspensas em PBS e imunocoradas.
[0465] Os tumores foram dissociados com o uso do Kit de Dissociação de Tumor e do dissociador MACS™ moderado (Miltenyi Biotec), seguindo as instruções do fabricante. Após a dissociação, as células foram passadas por um filtro de 40 pm, então, submetidas à lise de eritrócito com o uso de tampão de lise de ACK. Após 1
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135/142 lavagem em HBSS, as células foram ressuspensas em um volume rastreado de PBS e imunocoradas.
[0466] As suspensões de célula única do nódulo linfático de drenagem foram preparadas por ruptura mecânica e passagem através de um filtro de 40 pm. As células foram lavadas, contadas e ressuspensas em RPMI.
[0467] As amostras de sangue foram giradas para separar plasma e células de sangue total. O plasma foi coletado e subsequentemente congelado e mantido a -80 °C para ser usado para citocina e análise ELISA de ANA. As células de sangue total foram submetidas à lise de eritrócito em 3 ml de tampão de Use de ACK (Lonza, n° de Lote 0000400419) por 5 minutos. Após 1 lavagem em HBSS, as células foram ressuspensas em PBS e usadas para imunocoloração.
[0468] Citometria de fluxo [0469] As suspensões de célula única foram bloqueadas por Fc com CD16/32 antimurino (Miltenyi) (1:200) por 15 minutos a 4 °C. As células foram incubadas com coquetéis de anticorpo diluídos em PBS por 30 minutos. Após 2 lavagens em PBS, as células foram ressuspensas em solução de trabalho de Fixação/Permeabilização (eBioscience) por 30 minutos em gelo. As células foram giradas, o sobrenadante descartado e ressuspensas em PBS e incubadas durante a noite.
[0470] Painel de Mieloide:
- Live/Dead Yellow (Life Technologies) (1:1000)
- Ly6G-FITC (Biolegend, 1A8) (1:200)
- CD45-PE (Biolegend, 30-F11) (1:800)
- CD80-PE/CF594 (BD Biosciences, 16-10A1) (1:200)
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136/142
- Ly6C-PerCP/Cy5.5 (Biolegend, HK1.4) (1:100)
- CDllc-PE/Cy7 (Biolgend, N418) (1/200)
MHC classe Il-Alexa Fluor 647 (Biolegend, M5/114.15.2) (1/400)
- CD86- Alexa Fluor 700 (Biolegend, GL-1) (1/200)
- F4/80-APC/Cy7 (Biolegend, BM8) (1/200)
- CDllb-BrV421 (Biolegend, MI/70) (1/100) [0471] As células foram enxaguadas e executadas em um citômetro de fluxo de 10 cores Gallios. Todas as células foram comutadas em vivo/morto e coloração de CD45 positiva. Os granulócitos foram CDllbf, Ly6G+ e Ly6C-. Os monócitos foram CDllbf, Ly6G- e Ly6C+. Os macrófagos foram CDllbf, Ly6G-, Ly6C- e F4/80+. As células dendriticas foram comutadas em Ly6G-, Ly6C-, CDllcf e tiveram CDllb médio ou alto. Os dados de citometria de fluxo foram analisados com o uso de FlowJo.
[0472] Análise estatística [0473] Todas as estatísticas foram executadas
Prism GraphPad, versão 6. Para cada condição, os valores foram comparados com o uso de ANOVA com correção de Tukey. Em todos os casos, as comparações foram feitas nos animais tratados com controle m!gG2a. A significância é resumida por asteriscos com o uso de padrões GraphPad, com um asterisco indicando *P < 0,05, dois ** indicando P < 0,01, três *** indicando P < 0,001 e quatro **** indicando P < 0,0001.
[0474] Resultados [0475] Os tumores dissecados dos flancos de animais tratados com anti-VISTA ou anticorpo de controle foram analisados para determinar os efeitos em populações
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137/142 celulares por citometria de fluxo. Os macrófagos infiltrantes em tumor foram examinados para alterações induzidas por anti-VISTA em expressão de marcadores de ativação CD80, CD86 e MHC classe II. A Figura 44B ilustra os resultados da análise de citometria de fluxo. Os macrófagos infiltrantes em tumor, independentemente de tratamento, expressaram níveis mais altos de CD86 do que os macrófagos de baço (dados não mostrados), mas não regularam ascendentemente ainda CD86 como uma função de tratamento com anti-VISTA. Adversamente, a expressão de CD80 foi significativamente aumentada em macrófagos infiltrantes em tumor de camundongos hVISTA Kl tratados com VSTB123, mas não naqueles tratados com VSTB124 (Figura 44B).
[0476] EXEMPLO 28: VSTB123 INDUZ MIGRAÇÃO DE CÉLULAS MPO+ PARA O MICROAMBIENTE TUMORAL [0477] O presente estudo foi conduzido para identificar alterações, se houver, no ambiente tumoral em camundongos hVISTA Kl que portam tumor MB49 em resposta ao tratamento com anticorpos anti-VISTA humana VSTB123 ou VSTB124. Como mostrado no presente documento, VSTB123 induziu a migração de células coradas com mieloperoxidase para o ambiente tumoral.
[0478] Métodos [0479] Os tumores e baço foram rapidamente dissecados após óbito dos camundongos hVISTA Kl que portam tumor MB49 que foram tratados como descrito no Exemplo 27. As amostras de tumor e baço foram, então, colocadas em cassetes e fixadas por 2-3 semanas (e tipicamente fixadas por 4 dias ou menos) em 10 % de Formalina à temperatura ambiente, então, brevemente lavadas em PBS e transferidas e
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138/142 mantidas em 70 % de Etanol (Fisher Scientifics) antes de serem transferidas para a Pathology Translational Research
Core na Geisel School of Medicine em Dartmouth onde foram embebidas em parafina, seccionadas e, então, coradas.
[0480] As seções de tecido embebidas em parafina (4 pm) foram coradas com o uso de um aparelho de coloração automatizado Leica BOND RX. Após a remoção da cera, as seções foram submetidas à recuperação de antígeno (solução de recuperação de epitopo Bond 2, 100 °C, 20 minutos) e incubadas com o anticorpo principal (consulte a diluição na Tabela 17, abaixo) por 30-60 minutos, à temperatura ambiente em diluente Leica. As lâminas foram, então, lavadas 3 x por 5 min de lavagens em PBS e incubadas com o anticorpo secundário (do kit de detecção Leica Bond Refine, DS9800). Após 3 lavagens finais em PBS, as seções foram incubadas com DAB (kit de detecção de polímero Leica Bond), enxaguadas, contracoradas com hematoxilina e montadas.
[0481] As lâminas foram escaneadas com um escâner de lâmina completa Leica (Aperio® AT2, SCN400). Os escaneamento de lâmina completa foram quantificados com o uso de software HALO (Indica Labs).
[0482] Tabela 17: Anticorpos usados em coloração
.te Tf NJ' cie in tip r ea a
CD3 de camundongo coelho policlonal AB5690 Abeam EDTA 1:300
CD4 de camundongo coelho clone 1 50134- R0 01 SinoBiologicals EDTA 1:400
MPO de camundongo coelho policlonal A0398 Dako EDTA 1:1000
CDllb de camundongo coelho policlonal ab-75476 Abeam EDTA 1:300
F4/80 de camundongo coelho clone SP115 NBP2- 12506 Novus EDTA 1 :100
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139/142 [0483] Resultados [0484] As lâminas coradas com mieloperoxidase (MPO) foram escaneadas como descrito no presente documento e avaliadas em Aperio® ImageScope. As doze amostras tumorais (tumores 6 m!gG2a, 6 VSTB123) foram visualizadas individualmente e de maneira agregada. As células positivas coradas com MPO tiveram morfologia consistente com neutrófilos. Em controles tratados com IgG, as células de MPO mostraram agrupamentos demarcados por poço densos, mas focais localizados por todo o tecido tumoral. Tipicamente, esses agregados densos circundaram um único adipócito. Mais células positivas de MPO foram observadas em tumores tratados com VSTB123, mostrando uma distribuição de infiltração muito mais ampla no parênquima tumoral em comparação com controles mIgG2a.
[0485] EXEMPLO 29: VSTB174 INDUZ DIMINUIÇÃO DE NEUTRÓFILO TRANSTENTE EM SANGUE [0486] VSTB174 (CNTO 8548) foi administrado a macacos-cinomolgos por injeção de bolo intravenoso por 1 mês para avaliar a toxicidade potencial e para avaliar a reversibilidade de toxicidade potencial, se houver. Os parâmetros de patologia clínica (por exemplo, hematologia) foram medidos, incluindo massa de eritrócito e contagens de leucócitos. Como mostrado no presente documento, VSTB174 induziu uma diminuição transiente em neutrófilos circulantes .
[0487] Métodos [0488] Para propósitos desse estudo, os procedimentos descritos no presente documento se aplicam a
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140/142 todos os animais até o Dia 36.
[0489] Artigo de teste: VSTB174, a 50 mg/ml, mantido a -70 °C e protegido contra luz. Em cada dia de dosagem, novos frascos de artigo de teste de estoque foram removidos do armazenamento congelado, equilibrados por aproximadamente 1 hora à temperatura ambiente e o frasco foi girado gentilmente (não foi agitado ou submetido à vórtice) para misturar a solução até que a mesma fosse homogênea. A concentração nominal (50 mg/ml) do artigo de teste foi usada para cálculos de diluição para preparação das soluções de dose. As formulações foram preparadas pela diluição do artigo de teste com o artigo de controle (0,9 % de Cloreto de Sódio) enquanto sob uma estufa de biossegurança. A formulação de artigo de teste final foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,22 micron (membrana de PVDF) e mantida por não mais que 4 horas antes do preenchimento com seringas de tamanho apropriado para dosagem. O tamanho de seringa foi o menor possível para o volume a ser administrado. As seringas de dosagem preparadas foram usadas dentro de 4 horas de preparação. O procedimento de preparação foi mantido nos dados brutos. Os volumes residuais foram descartados.
[0490] Artigo de controle: 0,9 % de cloreto de sódio para injeção, USP; número de batelada P326603, armazenado à temperatura ambiente.
[0491] O projeto experimental é mostrado na Tabela 18.
[0492] Tabela 18: Projeto experimental
N° de Grupo Material de Teste Via de Dose Nivel de Dose (mg/kg/semana) Volume de Dose (ml/kg) Concentração de Dose (mg/ml) N° de animais
Estudo Mani Estudo de Re cupe ração
Machos Fêmeas Machos Fêmeas
1 VSTB174 IV 0 2 0 3 3 2 2
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141/142
2 VSTB174 IV 10 5 3 3 2 2
3 VSTB174 IV 30 15 3 3 2 2
4 VSTB174 IV 100 50 3 3 2 2
[0493] Administração de artigos de teste e de controle [0494] Os artigos de teste ou de controle foram administrados aos animais apropriados nos Grupos 1, 2, 3 e 4 através de injeção intravenosa (bolo lento) em uma veia periférica adequada uma vez por semana por 5 semanas (isto é, Dias 1, 8, 15, 22 e 29) por um total de 5 doses. O volume de dose para cada animal foi baseado na medição de peso corporal mais recente obtida até o dia antes da dosagem. Os animais foram temporariamente restritos para administração de dose e não foram sedados. Seringas estéreis descartáveis foram usadas para cada animal/dose. O primeiro dia de dosagem foi designado como Dia 1.
[0495] Coleta de amostra [0496] O sangue foi coletado por venipuntura. A urina foi coletada por drenagem a partir do prétratamento de recipientes da gaiola de aço inoxidável especial e no dia na necrópsia. Quando a coleta de recipiente de gaiola não foi bem-sucedida, a urina foi coletada por cistocentese na necrópsia. Após a coleta, as amostras foram transferidas para o laboratório apropriado para o processamento. Os animais foram submetidos a jejum antes das coletas químicas de sangue clinicas. As amostras foram coletadas da seguinte forma: Semana (-2), Semana (-
D , Dia 1 ( 4 horas pós-dose ), Dia 2, Dia 4, Dia 8 (pré),
Dia 15 (pré; ), Dia 22 (pré), Dia 29 (4 horas pós-dose ) , Dia
31, Dia 34, Semana 6, Semana 7 e Semana 8.
[0497] Hematologia
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142/142 [0498] As amostras de sangue foram analisadas em relação à contagem de neutrófilo (absoluta). Uma mancha de sangue foi preparada a partir de cada amostra de hematologia. As manchas de sangue foram identificadas, coradas, armazenadas e arquivadas.
[0499] Resultados [0500] Em geral, a administração de VSTB174 por uma injeção intravenosa (bolo lento) uma vez por semana por 5 semanas (isto é, Dias 1, 8, 15, 22 e 29) por um total de 5 doses foi em geral bem tolerada em macacos-cinomolgos em níveis d 30 mg/kg/semana. Os neutrófilos foram notadamente diminuídos começando no Dia 2 com um retorno gradual para a linha de base pelo Dia 29 seguido por diminuições pós-dose a 100 mg/kg/semana nos Dias 31 e 34 (Figura 46).
[0501] Os ensinamentos de todas as patentes, pedidos publicados e referências citadas no presente documento são incorporados a título de referência em sua totalidade.
[0502] Embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita em referência às modalidades exemplificadoras da mesma, será entendido por aqueles elementos versados na técnica que várias alterações em forma e detalhes podem ser feitas no mesmo sem que se afaste do escopo da invenção abrangido pelas reivindicações anexas.

Claims (7)

1. Método de provocação de uma resposta biológica em um indivíduo caracterizado por compreender administrar ao indivíduo um anticorpo que se liga a uma proteína de Supressor de Ig de domínio V de Ativação de célula T (VISTA), ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma, em uma quantidade suficiente para provocar uma resposta biológica no indivíduo, em que a resposta biológica é selecionada a partir do grupo que consiste em:
a) uma diminuição no número de células imunes em circulação;
b) uma diminuição no número de granulócitos em medula óssea e baço;
c) um aumento no número de neutrófilos, macrófagos, células T ou uma combinação dos mesmos em um microambiente tumoral; e
d) um aumento no nível de uma ou mais citocinas; ou
e) uma combinação dos mesmos.
2/7 caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é uma diminuição no número de granulócitos em medula óssea e baço.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é uma diminuição no número de células imunes em circulação.
3/Ί animal não humano é um animal transgênico.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-26, caracterizado pelo fato de que o animal não humano tem um tumor.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-27, caracterizado pelo fato de que o animal não humano tem um câncer de pulmão, câncer de bexiga ou câncer de mama.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-28, caracterizado pelo fato de que a
resposta biológica é uma diminuição no número de células imunes em circulação. 30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteri zado pelo fato de que as células imunes em
circulação são monócitos, neutrófilos, linfócitos, eosinófilos ou basófilos, ou uma combinação dos mesmos.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a diminuição no número de células imunes em circulação é transiente.
32. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é uma
diminuição no número de granulócitos em medula óssea e baço. 33. Método, de acordo com a reivindicação 17,
caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é um aumento no número de neutrófilos, macrófagos ou ambos em um microambiente tumoral.
34. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é um aumento no nível de uma ou mais citocinas, e em que as uma
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3/7
NO:25, uma CDR2 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma CDR3 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27, e que compreende adicionalmente um domínio VL de anticorpo que compreende uma CDR1 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28, uma CDR2 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma CDR3 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:30.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um primata não humano.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um roedor.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um tumor.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um câncer de pulmão, câncer de bexiga ou câncer de mama.
17. Método de identificação de um anticorpo que se liga a uma proteína de Supressor de Ig de domínio V de Ativação de célula T (VISTA) e provoca uma resposta biológica caracterizado por compreender:
a) fornecer um anticorpo que se liga à VISTA,
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3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células imunes em circulação são monócitos, neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos ou uma combinação dos mesmos.
4/Ί ou um fragmento de anticorpo do mesmo, a uma célula, tecido, órgão ou organismo; e
b) determinar se o anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo induz uma resposta biológica na célula, tecido, órgão ou organismo, em que a resposta biológica é selecionada a partir do grupo que consiste em:
i) ativação de monócitos;
ii) ativação de células T;
ill) uma diminuição no número de células imunes em circulação;
iv) uma diminuição no número de granulócitos em medula óssea e baço;
v) um aumento no número de neutrófilos, macrófagos ou ambos em um microambiente tumoral; e um aumento no nivel de uma ou mais citocinas;
ou uma combinação dos mesmos.
18 . Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a ant igeno do mesmo compreende uma região de Fc que se liga a um receptor de Fc em células imunes. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o receptor de Fc é um
receptor de CD16.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um dominio VH de anticorpo que compreende uma CDR1 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25, uma CDR2 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma CDR3 de VH que tem a sequência de
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4. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a diminuição no número de células imunes em circulação é transiente.
5/7 aminoácidos de SEQ ID NO:27, e que compreende adicionalmente um dominio VL de anticorpo que compreende uma CDR1 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28, uma CDR2 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma CDR3 de VL que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:30.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-20, caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é determinada com o uso de um ensaio in vitro.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o ensaio in vitro é um ensaio selecionado a partir do grupo que consiste em um ensaio de coloração imuno-histoquimica (IHC), um ensaio de liberação de citocina, um ensaio de liberação de quimiocina, um ensaio de ativação celular, um ensaio de proliferação celular, um ensaio de migração celular e um ensaio de citometria de fluxo.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-20, caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é determinada in vivo em um animal não humano.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um primata não humano.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um roedor.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-25, caracterizado pelo fato de que o
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5. Método, de acordo com a reivindicação 1,
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6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é um aumento no número de neutrófilos, macrófagos ou na combinação dos mesmos em um microambiente tumoral.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resposta biológica é um aumento no nível de uma ou mais citocinas, e em que as uma ou mais citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em IL-6, TNFa, MCP-3, MDC, ΜΙΡ-1β, IP-10, IL-lRa, GM-CSF, IL-12p70, GRO, ΜΙΡ-Ια, IL-Ιβ, RANTES, G-CSF, IL-la, IL-7, IL-12p40, IL-13, IFNy, ΤΝΕβ, IFNa, IL-4, IL-10, FGF2, fractalcina, VEGF, IL-17, Flt3L, IL-9, TGFa, IL-15, EGF, PDGF-αα, MCP-1, IL-8, SCD40L, eotaxina, IL-2, IL-3 e IL-5, e PDGF-BB.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo
compreende uma região de Fc que se liga a um receptor de Fc em células imunes. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o receptor de Fc é um receptor de CD16. 10. Método, de acordo com qualquer uma das
reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um domínio VH de anticorpo que compreende uma CDR1 de VH que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID
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7/7 ou mais citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em IL-6, TNFa, MCP-3, MDC, ΜΙΡ-1β, IP-10, IL-lRa, GM-CSF, IL-12p70, GRO, MTP-la, IL-Ιβ, RANTES, G-CSF, IL-la, IL-7, IL-12p40, IL-13, ΙΕΝγ, ΤΝΕβ, IFNa, IL-4, IL-10, FGF2, fractalcina, VEGF, IL-17, Flt3L, IL-9, TGFa, IL-15, EGF, PDGF-aa, MCP-1, IL-8, SCD40L, eotaxina, IL-2, IL-3 e IL-5, e PDGF-BB.
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