DE68926882T2 - Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz - Google Patents
Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenzInfo
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf den Export von Fremdproteinen aus dem Cytoplasma gramnegativer Bakterien, insbesondere E. coli, in den periplasmatischen Raum und vorzugsweise in die extrazelluläre Flüssigkeit. Der Export kann durch die Konstruktion eines Sekretionsvektors ermöglicht werden, der die Signalpeptidsequenz für das Pectatlyase-Gen von Erwinia carotovora unter der Kontrolle eines E. coli-kompatiblen Promotors enthält.
- Typischerweise werden in einem einzelligen Wirt exprimierte Fremdproteine nicht aus dem Cytoplasma ausgeschieden werden, und daher erfordert die Isolation der gewünschten Produkte ein Aufbrechen der Zelle und die Abtrennung sämtlicher resultierender Zelibruchstücke und nicht gewünschter, von der Zelle produzierter nativer cytoplasmatischer Proteine. Gramnegative Bakterien sezernieren typischerweise ihre eigenen Proteine in einen periplasmatischen Raum, einen Bereich außerhalb des Cytoplasmas und innerhalb zwischen der inneren und der äußeren Membran der Zelle. Die Isolation von Proteinen aus dem Periplasma ist viel einfacher als die Isolation aus dem Cytoplasma: das Aufbrechen der Zellwand ist erforderlich, ein Aufbrechen der Zellmembran ist jedoch nicht notwendig, und es wird daher eine Kontamination der Fremdproteine mit cytoplasmatischen Bruchstücken vermieden. Die Isolation und Abtrennung von Proteinen, die in das extrazelluläre Medium sezerniert wurden, ist natürlich Routinesache.
- Das Aufkommen der DNA-Rekombinationstechnologie hat die Nutzung einzelliger Mikroorganismen als "Fabriken" für die Produktion beträchtlicher Mengen im wesentlichen reiner Proteine möglich gemacht, die bei therapeutischen Maßnahmen oder industriellen Verfahren von Wert sein können. Die DNA-Rekombinationstechnologie erfordert, kurz gesagt, die Insertion spezifischer DNA-Sequenzen in ein DNA-Vehikel oder einen Vektor, der typischerweise entweder ein Phage oder ein Plasmid ist. In den meisten Fällen ist die in den Vektor inserierte DNA-Sequenz eine dem Vektor fremde, d.h., die inserierte DNA-Sequenz und die Vektor-DNA-Sequenz stammen von Organismen, die in der Natur gewöhnlich keine genetischen Informationen austauschen, oder die inserierte DNA kann teilweise oder gänzlich synthetisch sein. Verfahren zur Herstellung dieser DNA-Vektoren sind jetzt auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
- Zum Beispiel beschreiben Cohen und Boyer in dem US-Patent Nr.4,237,224 die Herstellung rekombinanter Plasmide mittels Restriktionsenzymen und Ligation; die resultierenden Plasmide werden dann in einen kompatiblen einzelligen Wirt eingeschleust, und durch dieses Verfahren wird das Fremdgen in die Zelle eingeführt.
- Speziellere Techniken werden in den folgenden Artikeln dargelegt:
- N.T. Keen et al., Journal of Bacteriology, 168 (2): 595-606 (November 1986) bezieht sich auf die Struktur von zwei Pectatlyase-Genen und ihre Expression in E. coli.
- Die WO-A-8 900 999, die am 9.2.89 veröffentlicht wurde und somit im Sinne des Artikels 54(3) des EPÜ zum Stand der Technik gehört, offenbart Vektoren, welche die pelB-Sequenz enthalten, zur Verwendung bei der Expression von drei Antikörperfragmenten, nämlich chimärem L6-Fab, chimärer L6-L-Kette und chimärem L6-Fd.
- Die EP-A-0 133 321 handelt von DNA-Konstrukten, in denen ein gewünschtes exogenes Protein unmittelbar auf eine Sequenz folgt, die für eine Signalsequenz codiert. Als spezielle Beispiele sind die Signalpeptide von β-Lactamase und alkalischer Phosphatase angegeben.
- M. Sjöström et al., EMBO Journal 6 (3): 823-831(1987) diskutiert den Austausch der Signalpeptide verschiedener Konstrukte. Sämtliche Signalpeptide stammen von E. coli.
- C. Kato et al., Gene 54: 197-202 (1987) offenbart die Expression eines Konstrukts, das ein Gen enthält, welches ein Protein und ein Signalpeptid codiert, die beide in bezug auf E. coli exogen sind. Pectatlyasesequenzen werden nicht erwähnt.
- M.E.E. Watson, Nucleic Acids Research 12 (13): 5145-5164 (1984) ist ein Überblick, in dem eine große Zahl von Signalsequenzen angegeben sind. Es werden keine Pectatlyasesequenzen erwähnt.
- L. Edens et al., Gene 18:1-12 (1982) bezieht sich auf das Klonieren und die Expression von (Präpro-) Thaumatin in E. coli.
- S. Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (Juni 1984) bezieht sich auf die Expression von schweren Ketten und/oder leichten Ketten eines Antikörpers gegen carcinoembryonisches Antigen (CEA) in E. coli.
- Um die Expression von Fremdproteinproduktion zu erreichen, muß ein rekombinantes Plasmid zur autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage sein und wird vorzugsweise eine Markerfunktion aufweisen, welche die Identifizierung der transformierten Wirtszellen gestattet. Wenn sämtliche passenden Replikations-, Transkriptions- und Translationssignale in dem Plasmid richtig angeordnet sind, dann wird das Fremdgen in den transformierten Zellen und der resultierenden Nachkommenschaft exprimiert werden.
- Der Fortgang der Produktion eines Proteins durch eine Zelle endet nicht mit dessen Transiation. In einer bestimmten Zelle produzierte Proteine sind im allgemeinen nicht überall in der Zelle anzutreffen, sondern kommen vielmehr in bestimmten Kompartimenten vor; gewisse Proteine werden sezerniert, d.h. aus dem Cytoplasma freigesetzt, andere nicht. Der Transport eines gegebenen Proteins aus dem Cytoplasma steht unter der Kontrolle einer Signalsequenz. Jene Zellproteine, die aus der Zelle ausgeschieden werden sollen, besitzen typischerweise eine N-terminale Sequenz von etwa 16 bis 30 Aminosäureresten, von denen die meisten hydrophob sind. Diese hydrophobe Region ist wesentlich für die Signalfunktion.
- Man nimmt an, daß das aus der Translation dieser Region resultierende Peptid an die Zellmembran bindet; während die Translation des restlichen Proteins fortschreitet wird der Nicht-Signalteil durch die Lipiddoppelschicht gezogen. Die Signalsequenz wird dann durch das Enzym Signalpeptidase von dem übrigen Protein abgespalten.
- Das Erkennen der Funktion von Signalsequenzen und -peptiden hat Forscher dazu veranlaßt, die Translations- und Transportmechanismen von E. coli zur Produktion und Gewinnung von Proteinen zu benutzen, die normalerweise nicht von E. coli produziert werden; diese schließen sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Fremdproteine ein. Die erfolgreiche Sekretion der betreffenden Proteine erfordert jedoch, daß das Gen mit einer Signalsequenz verbunden ist, die von einem Promotor der Wirtszelle erkannt werden kann. Ohne eine kompatible Signalsequenz mag das Fremdprotein von der Wirtszelle exprimiert werden, wird jedoch nicht über das Cytoplasma hinaus in entweder den periplasmatischen Raum oder die extrazelluläre Flüssigkeit transportiert. Natürlich würde ein Vektor, der sowohl die Expression als auch die Sekretion einer Vielzahl verschiedener Fremdproteine in einer Wirtszelle steuern könnte, einen enormen Vorteil bei der Verwendung von Rekombinationstechnik zur Produktion wertvoller Proteine in großen Mengen bieten. Die Sekretionsvektoren der vorliegenden Erfindung bieten einen solchen Vorteil, und zwar überraschenderweise mit einer Signalsequenz, die für E. coli nicht nativ ist.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor bereitgestellt, der zur Transformation eines bakteriellen Wirtes geeignet ist, wobei der Vektor eine für ein Pectatlyase-Signalpeptid codierende DNA-Sequenz angrenzend an eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Protein codiert, das ein anderes ist als:
- (a) Pectatlyase oder
- (b) ein Antikörperfragment, das L6 chimäres Fab, eine L6 chimäre leichte Kette oder L6 chimäres Fd ist,
- wobei der Vektor gestatten kann, daß das Protein exprimiert und zum Periplasma eines gramnegativen Wirtes transportiert wird, oder daß es exprimiert und in bezug auf den Wirt extrazellulär transportiert wird.
- Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen 2 bis 11 offenbart.
- Die Vektoren können Plasmid-Sekretionsvektoren sein, die, wenn sie zur Transformation von bakteriellen Wirtszellen verwendet werden, den Export von exprimierten Fremdproteinen ermöglichen. Die Plasmide können eine DNA-Sequenz aufweisen, die für eine Pectatlyase-Signalsequenz eines gramnegativen Bakteriums codiert. Diese Plasmide können wiederum zur Herstellung abgeleiteter Plasmide verwendet werden, die ein Fragment enthalten, das im wesentlichen aus der Signalsequenz und einer Nicht-Wirtsprotein-Gensequenz besteht, und von Plasmiden, in denen dieses Fragment angrenzend an eine wirtskompatible Promotorsequenz angeordnet ist. Die letzteren Plasmide, welche die Promotorsequenz enthalten, sind, wenn sie zur Transformation einer bakteriellen Wirtszelle verwendet werden, in der Lage, die Transiation und den Export der Fremdproteine durch die Wirtszelle zu steuern. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Mittel bereit, durch das Fremdproteine in großem Umfang von Wirtszellen produziert werden können, ohne daß eine Zell-Lyse und die damit verbundenen, zur Entfernung von cytoplasmatischen Verunreinigungen erforderlichen umfassenden Reinigungsverfahren notwendig sind. Die Isolation von exprimierten Nicht-Wirtsproteinen aus dem Wirt würde daher beträchtlich vereinfacht werden, wenn diese auf diese Weise nach außen gebracht werden können. Die Signalsequenz der Pectatlyase (pel) funktioniert gut in dem E.-coli-Zellsystem, und es hat sich gezeigt, daß die vorliegenden Sekretionsvektoren die Sekretion von praktisch jedem in diesem System verwendeten Protein bewirken können. Die Sekretion des Proteins in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung wird durch Insertion einer bekannten, für ein bestimmtes Protein codierenden Gensequenz in den Plasmidvektor an einem Punkt nach der pel-Signalsequenz und einer geeigneten Promotorsequenz und die anschließende Transformation einer bakteriellen Wirtszelle mit dem Sekretionsvektor erreicht,
- Wie hier dargelegt, sind rekombinante Plasmide hergestellt worden, die, wenn sie zur Transformation von bakteriellen Wirtszellen verwendet werden, die Sekretion von Fremdproteinen aus der cytoplasmatischen Membran der Wirtszelle hinaus erlauben. Die Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß, wenn Pectatlyase-Gene kloniert und in E. coli exprimiert werden, große Mengen an Pectatlyase entweder in den periplasmatischen Raum oder in das Kulturmedium ausgeschieden werden, in dem das Bakterium vermehrt wird. Dies führt zur Schlußfolgerung, daß die Pectatlyase-Signalsequenz in einem Nicht-Erwinia-Bakteriensystem erkannt und translatiert wird. Als Plasmide hergestellt wurden, welche die Signalsequenz des pel-Gens in Kombination mit einem Fremdprotein-Gen enthielten, hat sich herausgestellt, daß in Gegenwart eines wirtskompatiblen Promotors die Signalsequenz für das pel-Gen imstande ist, den Transport des Proteins aus dem Cytoplasma in den periplasmatischen Raum oder über die Zellwand hinaus in die extrazelluläre Umgebung zu steuern. Die Sekretionsvektoren der vorliegenden Erfindung sind insofern besonders gut verwendbar, als ihre Brauchbarkeit nicht auf einen einzigen Stamm begrenzt ist, sondern sich gezeigt hat, daß sie in vielen verschiedenen leicht erhältlichen E.-coli-Stämmen effizient funktionieren, von denen alle zumindest einen Teil des rekombinanten Proteins laufend direkt in das Kulturmedium sezernieren. Es hat sich ebenfalls gezeigt, daß die Plasmide mit einem weiten Bereich fremder Gen sequenzen, sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen, funktionsfähig sind. Des weiteren wurde bestätigt, daß die so erzeugten Proteine in ihrer natürlichen und richtigen Konfiguration sezerniert werden.
- Die vorliegende Erfindung wird nun mittels Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, wobei:
- Figur 1 die Verfahren darstellt, die zur Schaffung des Plasmids pSS1004, welches das pelB-Gen enthält, und des Plasmids pSS1038, welches das pelB-Gen unter der Kontrolle des araBAD-Promotors enthält, verwendet wurden. Einzelheiten sind in Beispiel 2.1.1. angegeben.
- Figur 2A zeigt die Sequenz der das pelB-Signalpeptid codierenden Region und die entsprechende Aminosäuresequenz Figur 2B stellt das Verfahren dar, das bei der Konstruktion des Plasmids pING173, das die pelB-Signalsequenz enthält, und des Plasmids pRR175, das die pelB-Signalsequenz stromabwärts des lac-Promotors enthält, angewendet wurde. Einzelheiten sind in Beispiel 2.2. angegeben.
- Figur 3 stellt das Verfahren dar, das bei der Konstruktion des Plasmids pING177-1 angewendet wurde, das die pelB-Signalsequenz und das pflanzliche Thaumatin-Gen unter der Kontrolle des arabad-Promotors enthält. Einzelheiten sind in Beispiel 2.3.2. angegeben.
- Figur 4 stellt die Verfahren dar, denen man bei der Konstruktion des Plasmids pING177-3 folgte, welches das pflanzliche Thaumatin-Gen mit der Präthaumatin-Leaderpeptidsequenz enthält. Einzelheiten sind in Beispiel 2.3.3. angegeben.
- Figur 5 stellt die Verfahren dar, die bei der Konstruktion der für die Expression der chimären Maus/Mensch-L6-Antikörper-Leicht-Kette verwendeten Plasmide angewendet wurden. Einzelheiten sind in Beispiel 2.4.2. angegeben.
- Figur 6 stellt die Verfahren dar, die bei der Konstruktion der für die Expression der chimären Maus/Mensch-L6-Antikörper-Schwere-Kette verwendeten Plasmide angewendet wurden. Einzelheiten sind in Beispiel 2.4.2. angegeben.
- Figur 7 stellt die Verfahren dar, die bei der Konstruktion der für die Expression von chimärem Maus/Mensch-L6-Antikörper-Fab verwendeten Plasmide angewendet wurden. Einzelheiten sind in Beispiel 2.4.2. angegeben.
- Figur 8 zeigt die Restriktionskarten der Leicht-Ketten- und Fd-Genkassette in pFK100, pFK101, pFK102, pFK103, pFK104. Diese Plasmide wurden wie im Text beschrieben unter Verwendung der in Figur 6 und 7 dargestellten Plasmide konstruiert. Der Pfeil gibt die Richtung der Transkription vom lac-Promotor her an. E.-carotovora- und eukaryotische nichtcodierende Sequenzen sind als weiße Balken dargestellt. Die pelB-Leadersequenz ist schraffiert, und der schwarze Balken stellt die Antikörper-Gene Fd und leichte Kette (K) dar.
- Pectatlyase ist eines der Enzyme, welche die Hydrolyse von Polygalacturonsäure katalysieren, und kommt in mehreren phytopathogenen Bakterien und Pilzen vor. Drei Pectatlyasen, die als PLa, PLb und PLc bezeichnet werden, sind aus dem Bakterium Erwinia carotovora identifiziert worden, und ähnliche Enzyme sind auch bei dem Bakterium Erwinia chrysanthemi (Keen et al., J. Bacteriol. 168: 595-606, 1986) und Pseudomonas fluorescens sowie dem Pilz Rhizoctonia solani bekannt. Die Gene von sowohl E. carotovora (Lei et al., Gene 35: 63-70, 1985) als auch E. chrysanthemi (Keen et al. oben) sind isoliert worden.
- Im vorliegenden Fall wurde das pelB-Gen von E. carotovora als Quelle der Pectatlyase-Signalsequenz verwendet. Das Plasmid pSS1004 (Lei et al., J. Bacteriol. 169: 4379-4383, 1987) enthält das E.-carotovora-pelB-Gen. Die Restriktionsorte um die Signalsequenz wurden anhand der DNA-Sequenz des Gens identifiziert. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde ebenfalls bestimmt, um die Lage des Leaderpeptids zu bestätigen. Behandlung des pSS1004-Plasmids mit den Restriktionsenzymen HaeIII und EcoRI erzeugte ein Fragment, das die Leadersequenz enthielt. Die Gensequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz des pelB-Signalpeptids sind in Figur 2A dargestellt. Alternativ kann die Peptidsequenz mittels bekannter Verfahren der Peptidsynthese chemisch synthetisiert werden.
- Sobald das Fragment, das die richtige Signalsequenz enthält, identifiziert und isoliert ist, wird es in ein Klonierungsvehikel, vorzugsweise ein Plasmid, inseriert. Die vorliegenden Vektoren werden gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten allgemeinen Prinzipien der Vektorkonstruktion hergestellt. Wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, bezieht sich "Sekretion" auf den Transport des Proteins in den periplasmatischen Raum und "Exkretion" bezieht sich auf den Transport des Proteins in das Kulturmedium.
- Um schließlich die Transkription und Translation des inserierten Gens zu erreichen, muß das Gen unter die Kontrolle eines Promotors gebracht werden, der mit der gewählten Wirtszelle kompatibel ist. Ein Promotor ist eine DNA-Region, an der RNA-Polymerase bindet und die Transkription initiiert. Der gewählte Promotor kann irgendeiner sein, der aus dem Wirtszellorganismus isoliert wurde oder in diesem funktionsfähig ist. Zum Beispiel besitzt E. coli zahlreiche Promotoren wie den lac- oder recA-Promotor, die mit ihm, seinen Bakteriophagen oder seinen Plasmiden assoziiert sind. Es können auch Phagenpromotoren wie der PL- und der PR-Promotor vom λ-Phagen verwendet werden, um eine Produktion großer Mengen der codierten Produkte zu steuern, deren DNA-Segmente daran angrenzen. Die Produkte können natürlich, synthetisch oder rekombinant sein.
- Ein Startsignal ist ebenfalls erforderlich, um eine effiziente Translation des Gens zu erzielen. Zum Beispiel umfaßt bei E.-coli-mRNA eine Ribosomen-Bindungsstelle das Translationsstartcodon (AUG oder GUG) und eine weitere Sequenz, die zu den Basen des 3'-Endes der 16S-ribosomalenRNA komplementär ist. Mehrere dieser letzteren Sequenzen (Shine-Dalgarno oder S-D) sind in E. coli und anderen geeigneten Wirtszelltypen identifiziert worden. Jede SD-ATG-Sequenz, die mit dem Wirtszellsystem kompatibel ist, kann verwendet werden. Diese schließen das cro-Gen oder N-Gen des Coliphagen Lambda oder die Tryptophan-E-, -D-, -C-, -B- oder -A-Gene von E. coli ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
- Es gibt mehrere Methoden für die Insertion von DNA-Fragmenten in Klonierungsvektoren in vitro. DNA-Ligase ist ein Enzym, das Einzelstrangbrüche zwischen benachbarten Nudeotiden in einer doppelsträngigen DNA-Kette schließt; dieses Enzym kann daher dazu verwendet werden, die durch bestimmte Restriktionsenzyme erzeugten kohäsiven Enden nach dem Ringschließen kovalent zu verbinden. Alternativ kann DNA-Ligase verwendet werden, um die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen Fragmenten mit stumpfen Enden zu katalysieren. Schließlich kann das Enzym terminale Desoxynucleotidyltransferase verwendet werden, um homopolymere 3'-Einzelstrang-Schwänze an den Enden von Fragmenten zu bilden; durch Zugabe von Oligo(dA)-Sequenzen zu den 3'-Enden einer Population und von Oligo(dT)-Blöcken zu den 3'-Enden einer zweiten Population können sich die beiden Molekültypen ringschließen, um dimere Kreise zu bilden. Jede dieser Methoden kann verwendet werden, um das Gensegment, den Promotor und andere Kontrollelemente in spezifische Orte in dem Vektor zu ligieren. So wird die codierende Sequenz für ein bestimmtes Protein in den gewählten Vektor in einer bestimmten Beziehung zum Vektor-Promotor und den Kontrollelementen und zur pel-Signalsequenz ligiert, so daß die Proteingensequenz in bezug auf die Vektor-ATG-Sequenz im richtigen Leseraster ist. Der verwendete Vektor wird typischerweise eine Markerfunktion wie Ampicillin-Resistenz oder Tetracyclin-Resistenz aufweisen, so daß transformierte Zellen identifiziert werden können. Beim Vektor kann es sich um irgendeinen der bekannten Expressionsvektoren oder deren Abkömmlinge handeln; unter den am häufigsten verwendeten finden sich Plasmid-Vektoren wie pBR322, pAC105, pVA5, pACYC177, pKH47, pACYC184, pUB110, PMB9, pBR325, ColE1, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124, pCR1 oder RP4; Bakteriophagen-Vektoren wie Lambda gt11, Lambda gt-WES-Lambda B, Charon 28, Charon 4A, Lambda gt-1-Lambda BC, Lambda-gt-1-Lambda B, M13mp7, M13mp8. M13mp9; SV40- und Adenovirus-Vektoren und Hefe-Vektoren.
- Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise ein Plasmid als Klonierungsvektor. Zum Beispiel war die in den vorliegenden Beispielen gewählte Methode bei der Klonierung mehrerer verschiedener Proteine in E. coli eine zunächst getrennte Klonierung der PLB-Signalsequenz. Dies wurde durch Isolation des HaeIII+EcoRI-Verdau-Fragments aus dem Plasmid pSS1004 erreicht, das die gesamte Pectatlyase-B-Sequenz enthält. Dieses Fragment wird dann in ein pBR322-Plasmid ligiert, das mit SspI verdaut, mit einem SstI-Linker ligiert und dann mit EcoRI verdaut worden ist. So entsteht das Plasmid pING173, das die peib-Signal sequenz enthält. Das pING173-Plasmid wird dann als Klonierungsvehikel für die pelB-Signalsequenz verwendet, die anschließend in ein Plasmid ligiert werden kann, das die Sequenz des Proteins enthält, das von Interesse ist. Das so hergestellte Plasmid enthält ein Hybridgen, das aus der pelB-Signalsequenz angrenzend an die Gensequenz des relevanten Proteins besteht; es kann dann eine geeignete Promotorsequenz am 5'-Ende des Hybridgens inseriert werden und somit der schließliche Expressionsvektor geschaffen werden. Alternativ kann zunächst ein Plasmid hergestellt werden, das die Promotorsequenz und die pelB-Signalsequenz enthält, und dann die Protein-Gensequenz stromabwärts der Promotor/Signal-Sequenzen inseriert werden. Promotoren, die sich als besonders gut verwendbar in der vorliegenden Erfindung erwiesen haben, sind der AraBAD-Promotor von Salmonella typhimunum und der lac-Promotor von E. coli in Kombination mit einem E.-coli-Wirtssystem. Jedoch kann auch jeder andere geeignete Promotor, der mit dem gewählten Wirtssystem kompatibel ist, Verwendung finden. Mittels des obigen Verfahrens sind Plasmid-Expressionsvektoren hergestellt worden, welche die Gene für Thaumatin und chimäres L6-Fab enthalten, es ist jedoch für den Fachmann leicht ersichtlich, daß Gene für jeden Proteintyp in den vorliegenden Vektoren und Verfahren verwendet werden können.
- Sobald ein Vektor mit dem geeigneten Promotor gewonnen worden ist, kann das Plasmid zur Transformation eines Wirtsbakteriums verwendet werden. Zum Beispiel ist praktisch jeder behandelte E.-coli-Stamm transformierbar gewesen (wenn auch mit unterschiedlichen Transformationsraten), so daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung mit einem einzigen Stamm beschränkt ist. Die Mehrheit der bei Transformationen eingesetzten Techniken gründet sich auf die Beobachtung von Mandel und Higa (J. Mol. Biol. 53: 159-162, 1970), daß die Aufnahme von Vektor-DNA durch Behandlung der Bakterienzellen mit Calciumchlorid wesentlich gesteigert wird. Die mit Calciumchlorid behandelten Bakterien werden für eine kurze Zeitdauer, gewöhnlich nicht länger als 12-24 Stunden, Vektor-DNA ausgesetzt. Die exponierten Zellen werden dann auf Transformanten gescreent; dies erfolgt durch Selektion auf jene Bakterien, welche die entsprechenden Marker-Eigenschaften vom Vektor exprimieren. Wenn zum Beispiel ein Plasmid mit einem Marker für Tetracyclin-Resistenz verwendet wurde, werden die Bakterien in einem Medium kultiviert, das Tetracyclin enthält, und jene Bakterien, die sich weiter vermehren, werden als vermeintliche Transformanten gesammelt. Diese Bakterien können dann weiter auf die Produktion des Proteins von Interesse gescreent werden.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Isolation des Genprodukts entweder aus dem periplasmatischen Raum oder aus dem umgebenden Kulturmedium. Der Ort des exprimierten Proteins scheint von dem speziellen Stamm abzuhängen, der als Wirt verwendet wird. Einer der am wenigsten erwarteten Aspekte der vorliegenden Erfindung ist, daß sämtliche getesteten Stämme in der Lage waren, zumindest einen Teil des rekombinanten Produkts in das Kulturmedium auszuscheiden. Der Hauptunterschied zwischen Stämmen ist das Verhältnis der Menge des ausgeschiedenen (d.h. in das Medium transportierten) Produkts zu der in den periplasmatischen Raum abgegebenen Menge. Unter jenen E.-coli-Stämmen, die hohe Exkretionspegel zeigen, finden sich MC1061, JM103 und 706. Während Proteine, die in das Kulturmedium abgegeben werden, leicht durch bekannte Proteingewinnungstechniken aus diesem isoliert werden können, erfordert die Gewinnung von Protein, das sich in dem periplasmatischen Raum befindet, die Penetration der Zellwand, um eine Freisetzung der Proteine ohne Zerstörung der cytoplasmatischen Membran zu erreichen. Eine Technik der Gewinnung periplasmatischer Proteine ist die ursprünglich von Zinder und Arndt (PNAS USA 42: 586-590, 1956) beschriebene, die eine Entfernung der Zellwand beinhaltet. Kurz, die Zellen werden mit Ovalbumin behandelt, das Lysozym enthält, wodurch Zellkugeln oder Sphäroplasten entstehen, bei denen große Teile der Zellwand fehlen. Periplasmatische Proteine können auch durch einen Mechanismus isoliert werden, der keine Entfernung der Zellwand erfordert, sondern statt dessen die Freisetzung der Proteine bewirkt. Zellen werden in ein hypertones Saccharosemedium gebracht, das Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält; dieses Medium bewirkt, daß die Zellen Wasser verlieren und schrumpfen, so daß sich die Cytoplasmamembran von der Zellwand zurückzieht. Die Zellen werden dann in eine Magnesiumchloridlösung gegeben, die einen osmotischen Schock auslöst: Der osmotische Druck außerhalb der Zelle sinkt, wodurch ein schnelles Eindringen von Wasser in die Zelle bewirkt wird, was die Zelle aufbläht und den Ausstoß von periplasmatischen Proteinen über die ußere Membran hinaus verursacht. Abänderungen bei den obigen Verfahren werden für einen Fachmann leicht ersichtlich sein.
- Die vorliegenden Sekretionsvektoren sind erfolgreich bei E. coli zur Sekretion einer Vielzahl verschiedener Proteintypen verwendet worden. Die folgenden Beispiele erläutern ausführlich Herstellungsverfahren für eine Anzahl verschiedener Plasmidtypen gemäß der oben gegebenen Offenbarung. Wo Beispiele nicht im Schutzumfang der vorliegenden Ansprüche liegen, sind sie nicht Beispiele der vorliegenden Erfindung, sondern werden zu Informationszwecken gegeben.
- Plasmid pSH2111 (Lei et al., Gene 35: 63-70, 1085) enthält die Pectatlyase-Gene von Erwinia carotovora. Das peib-Gen liegt zwischen zwei DraI-Restriktionsorten; die Isolation des Gens erfolgt durch Verdauung des Plasmids pSH2111 mit DraI und die Identifizierung eines 1,9-Kilobasen-Fragments auf einem Agarosegel. Das isolierte Fragment wurde dann in das Plasmid pUC8 ligiert, das mit SmaI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid ist pSS1004 (siehe Fig. 1).
- Das Plasmid pSS1004 wurde dann mit NdeI T&sub4;-DNA-Polymerase und HindIII behandelt, und das resultierende Fragment wurde in Plasmid pIT2 ligiert, das mit NcoI, T&sub4;-DNA-Polymerase und HindIII verdaut worden war, um Plasmid pSS1038 zu erzeugen (Figur 1). Das Plasmid pIT2 enthält sowohl den araBAD-Promotor von Salmonella typhimunum als auch das araC-Gen (Johnson et al. - Gene 34: 137-145, 1985). Das Plasmid wurde dann zur Transformation des E.-coli-Stammes 706 verwendet. Es war somit zu erwarten, daß die Expression des peib-Gens auf Plasmid pSS1038 unter der Kontrolle des arabad-Promotors steht und durch die Gegenwart von Arabinose im Kulturmedium ausgelöst wird.
- Zur Charakterisierung der Produktion und Exkretion von PLB wurde eine das Plasmid pSS1038 tragende E.-coli-Zelle 706 (F&supmin;, pro, thr, leu, argH, his, lac, phoSt, rpsL, lky-207) verwendet. Die E.-coli-Zellen wurden in TYE (1,5% Trypton, 1 % Hefeextrakt und 0,5% NaCl) kultiviert, bei 37ºC inkubiert, und es wurde in der logarithmischen Wachstumsphase (bei etwa OD&sub5;&sub4;&sub0; = 0,6) dem Kulturmedium 1 % Arabinose zugesetzt, um den araBAD-Promotor anzuschalten und die PLb-Produktion zu starten. Nach vier Stunden Induktion (die OD&sub5;&sub4;&sub0; betrug etwa 2,5) wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, und PLb wurde direkt aus diesem E.-coli-Zellkulturmedium reindargestellt. Die Kulturflüssigkeit wurde konzentriert und durch Amicon (Membran YM2) entsalzt, und das Protein wurde dann durch Lauf über eine CM-52-Säule bei pH 7,4 und anschließende Elution mit 0,2 M NaCl gereinigt. Die anhand dieser einfachen Schritte gereinigte PL wies laut Elektrophorese auf SDS-Gelen mit anschließender Coomassieblau-Färbung eine Reinheit von mehr als 95 % auf.
- Als Quelle für die Signalsequenz für pelB wurde das pSS1004-Plasmid verwendet. Die Sequenz wurde mittels pSS1004-Verdauung mit dem Restriktionsenzym HaeIII Ligation mit SstI-DNA-Linker und anschließende Verdauung mit EcoRI isoliert. Das EcoRI-SstI-DNA-Fragment, das die am 5'-Ende befindliche nichtcodierende Region und das Leaderpeptid enthält, wurde dann in ein mit SspI und EcoRI verdautes pBR322-Plasmid ligiert. Das so hergestellte Plasmid mit der Signalsequenz ist pING173. Figur 2 beschreibt sowohl die DNA-Sequenz für das Signalpeptid als auch das Verfahren zur Herstellung des pING173-Plasmids. Dieses Plasmid wird verwendet, um zusätzliche Abkömmlinge herzustellen, wie sie unten beschrieben sind.
- Thaumatin ist ein Protein-Süßstoff, der ursprünglich aus der Pflanze Thaumatococcus danielli isoliert worden ist. Thaumatin enthält 207 Aminosäuren und ist 2.000- bis 5.000mal süßer als Saccharose. Es weist acht Disulfidbrücken auf, und die Tertiärstruktur von Thaumatin ist wesentlich für seine biologische Wirkungsweise.
- Die oben beschriebene für das PLB-Signalpeptid codierende DNA-Sequenz von Plasmid pING173 wurde vor das Thaumatin-Gen von Plasmid pING174 kloniert, um Thaumatin in einem E.-coli-Wirtssystem zu sezernieren. Das resultierende Plasmid pING177-1 wurde zur Expression und Sekretion von Thaumatin in E. coli verwendet. Es besitzt den arabad-Promotor und einen Teil des arab-Gens, fusioniert an 50 bp der 5'-nichtcodierenden Region des PLb-Leaderpeptids. Um dieses Plasmid herzustellen, wurde das SstI+EcoRI-Fragment von Plasmid pING173 in das Plasmid pING174 kloniert, welches das Thaumatin-Gen enthält. pING174 wurde mit BamHI und PstI verdaut, und die Leadersequenz von pING173 in die Restriktionsorte ligiert, um pING176 zu erzeugen. Das letztere Plasmid wurde mit NdeI und XhoI verdaut, und das resultierende Fragment, das die Pectatlyase-Leadersequenz angrenzend an das Thaumatin-Gen enthielt, wurde in die SalI-, XhoI-Orte auf dem Plasmid pING61 kloniert. Das resultierende Plasmid enthielt das für die PLb-Leadersequenz codierende Gen und das Thaumatin-Gen unter der Kontrolle des araBAD-Promotors und wurde mit pING177-1 bezeichnet. Das genaue Konstruktionsschema ist in Figur 3 dargestellt
- Der das Plasmid pING177-1 beherbergende E.-coli-Stamm 706 wurde in einem Liter TYE-Brühe kultiviert. Bei OD = 0,35 wurden die Zellen für etwa 12 Stunden mit 1 % (Gew/Vol) Arabinose induziert. Die Kultur wurde dann geerntet, und das Periplasmaraum-Protein wurde mittels SDS-PAGE, Western-Analyse und dem RIA-Test auf richtig gefaltetes Thaumatin charakterisiert. Sowohl SDS-PAGE als auch die Western-Analyse zeigten, daß Thaumatin von E.-coli-Zellen synthetisiert werden konnte. Der RIA-Test zeigte außerdem, daß das sezernierte Thaumatin in dem periplasmatischen Raum von E. coli richtig gefaltet war (Tabelle 1), Das Präthaumatin-Signalpeptid wurde ebenfalls verwendet, um Thaumatin in E. coli zu sezernieren. Plasmid pING177-3, das die Präthaumatin-Signalpeptidsequenz und das Thaumatin-Strukturgen enthält, wurde zur Produktion von Thaumatin verwendet; das genaue Konstruktionsschema ist in Figur 4 dargestellt. Die Bedingungen für Zellwachstum und Induktion sind die gleichen wie oben beschrieben. Die Ergebnisse des RIA-Tests zeigten, daß die von dem Präthaumatin-Signalpeptid gesteuerte Produktion von richtig gefaltetem Thaumatin weniger effizient ist als die von dem PLb-Leaderpeptid gesteuerte (Tabelle 1). TABELLE 1 Sekretion von Thaumatin in Escherichia coli (E. coli K-12: 706)
- Das Fab-Molekül eines Antikörpers enthält zwei nicht-identische Proteinketten, die durch eine einzelne Disulfidbrücke verbunden sind. Bei den beiden Ketten handelt es sich um die intakte leichte Kette des Antikörpers und um Fd. Das Fd-Molekül eines Antikörpers enthält die V-, J- und CHl-Bereiche der schweren Kette des Antikörpers. Die richtigen cDNA-Klone für die L6 chimäre Leicht-Kette und Fd-Genen sind bereits identifiziert worden. In diesem Beispiel wurden die für das PLb-Leaderpeptid codierenden Sequenzen verwendet, um immunologisch aktives, richtig zusammengebautes Fab des chimären L6-Antikörpers in das Kulturmedium auszuscheiden.
- Das SstI- EcoRI-Fragment des Plasmids pING173 wurde in pUC18 kloniert, um pRR175 zu erzeugen, das die pelB-Leadersequenz und die angrenzende stromaufwärtige nichtcodierende Sequenz stromabwärts vom lac-Promotor enthält. Die Konstruktion von pRR175 ist in Figur 2 dargestellt.
- Das intakte Gen für die chimäre L6-Leicht-Kette, das einen AatII-Restriktionsort an der Signalsequenz-Prozessierungsstelle und einen einmalig vorhandenen BglII-Ort stromabwärts vom Gen enthält, wurde als 1200-bp-DNA-Fragment aus dem Hefe-Expressionsplasmid pING1298 ausgeschnitten (Figur 5). Dieses Fragment wurde in das Plasmid pRR175 inseriert. Das resultierende Plasmid pRR177-8 enthielt eine Fusion des pelB-Leaders und des Gens für die L6-Leicht-Kette im richtigen Leseraster stromabwärts vom lac-Promotor, der sich im Elternplasmid befindet. Es wurden mehrere Abkömmlinge dieses Plasmid konstruiert, um nichtcodierende Sequenzen von sowohl dem 5'- als auch dem 3'-Ende der pelB::Leicht-Kettengen-Fusion in pRR177-8 zu deletieren. Stromaufwärtige nichtcodierende Sequenzen wurden deletiert, indem von einem NdeI-Restriktionsort bei -48 bp von dem Startcodon der pelB-Leadersequenz Gebrauch gemacht wurde (Figur 5), wodurch pRR180-2 entstand. Die 3'-nichtcodierenden Sequenzen wurden durch austauschweises Einsetzen eines Fragments aus dem für die L6-Leicht-Ketten-Expression in Hefe optimierten Plasmid pING1431 (siehe Figur 5) in pRR180-2 entfernt, um pRR191 zu erzeugen. Diese Konstruktionen sind in Figur 5 dargestellt. Ein weiteres Plasmid, pRR180, ähnelt pRR191, enthält jedoch 90 bp einer nichtcodierenden eukaryotischen DNA am 3'-Ende des Leicht-Ketten-Gens.
- Das intakte Gen für chimäres L6-Fd, das einen SstI-Restriktionsort an der Signalsequenz-Prozessierungsstelle, einen durch ortsgerichtete Mutagenese eingeführten BclI-Restriktionsort, der ein Terminationscodon bei Aminosäure 226 schafft, und einen einmalig vorhandenen BamHI-Ort stromabwärts vom Gen enthält, wurde als 880-bp-DNA-Fragment aus dem Hefe-Expressionsplasmid pING1406 ausgeschnitten (Figur 6). Dieses DNA-Fragment wurde in das Plasmid pRR175 inseriert, wobei eine Fusion der pelB-Leadersequenz und des L6-Fd-Gens im richtigen Leseraster stromabwärts vom lac-Promotor, pRR178-5, erzeugt wurde. Es wurden mehrere Abkömmlinge konstruiert, um nichtcodierende Sequenzen von sowohl dem 5'- als auch dem 3'-Ende der in pRR178-5 enthaltenen Sequenz zu deletieren. Die 3'-nichtcodierenden Sequenzen wurden durch Austausch gegen ein Restriktionsfragment aus dem für die L6-Fd-Expression in Hefe optimierten Plasmid pING1428 (Figur 6), das einen XhoI-Linker unmittelbar nach dem Terminationscodon des Fd-Gens enthält, entfernt, wobei Plasmid pRR186 geschaffen wurde. Die Entfernung von E.-carotovora-DNA-Sequenzen stromaufwärts vom NdeI-Ort bei -48 bp von der Leadersequenz erzeugte Plasmid pRR196. Die Konstruktion dieser Plasmide ist in Figur 6 dargestellt.
- Für die Produktion von aus Bakterien gewonnenem Fab müssen sowohl die leichte Kette als auch Fd gleichzeitig in der Zelle hergestellt werden. Unter Verwendung der Plasmide, die mit jedem dieser Gene gesondert konstruiert worden waren, wurde eine Reihe von Expressionsvektoren konstruiert, die beide Gene hintereinander ausgerichtet enthalten, so daß von einem einzigen Promotor ausgehende Transkription beide Gene spezifizieren wird. Dies erfolgte auf eine Weise, welche die nichtcodierende DNA zwischen zwei Genen auf 60 bp minimierte Jedes Gen besitzt eine Ribosomen-Bindungsstelle, die für den Translationsstart erforderlich ist, und dieselbe DNA-Sequenz von -48 bis zur pelB-Leader::Antikörpergen-Verbindung. Verschiedene Klonierungsschritte waren erforderlich, um die beiden Gene gemeinsam auszurichten. Ein mit dem pelB-Leader verbundener Teil des Leicht-Ketten-Gens in pRR180-2 wurde stromabwärts vom Fd-Gen in pRR1B6 kloniert, um pFK100 zu erzeugen. Das übrige Leicht-Ketten-Gen wurde aus pRR177-8 in pFK100 subkloniert, um pFK101 zu erzeugen. Entsprechend wurden DNA-Fragmente mit 3'-Deletionen eukaryotischer Sequenzen aus pRR190 und prrlgl in pFK101 kloniert, wodurch jeweils pFK103 und pFK102 geschaffen wurden. DNA-Fragmente aus pRR192 und pFK101 wurden ligiert, um pFK104 zu erzeugen, das eine Deletion von Sequenzen stromaufwärts von -48 bp vom Fd-Gen enthält. Karten der Fd- und Leicht-Ketten-Genkassetten in diesen Plasmiden sind in Figur 8 dargestellt. Plasmid pFK102 enthält aufeinanderfolgend klonierte Fd- und Leicht-Ketten-Gene unter der Kontrolle des lac-Promotors in Vektor pUC18. In E.-coli-Stämmen wie JM103 F'laciQ (Messing et al., Nucl. Acids Res. 9: 309, 1981) wird die Menge an leichter Kette, die sich im Periplasma ansammelt, nicht von dem lac-Promotor-induzierenden Mittel Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid (IPTG) beeinflußt. Zudem ist das Bakterienwachstum langsamer (im Vergleich zu Zellen, die PUC 18 enthalten), und Bakterienkolonien zeigen eine veränderte Morphologie und sind klein, trocken und rauh, was vermuten läßt, daß sich konstitutive Fremdgen-Expression nachteilig auf das Zellwachstum auswirkt. Zwei Strategien wurden angewendet, um diese Genkassette unter strenger regulierte Promotoren zu bringen.
- Zunächst wurde ein PstI-bis-EcoRI-Fragment aus pFK104 an pIT206 ligiert, um die Fd- und Leicht-Ketten-Genkassette unter die direkte Kontrolle des Salmonella- typhimurium-araB-Promotors zu bringen, ein gut charakterisierter, starker Promotor in E. coli. Eine Restriktionskarte von pIT206 und die Konstruktion von pIT104 sind in Figur 7 dargestellt. Die Verwendung des araB-Promotors und seines Regulatorproteins AraC für die Expression von bakteriellen Genen ist in den US-Patentanmeldungen 695,309, eingereicht am 28. Januar 1985, und 797,472, eingereicht am 13. November 1985, beschrieben. Das resultierende Plasmid pIT104 ist nun bezüglich der Synthese von leichter Kette durch die Zugabe von Arabinose zum Kulturmedium reguliert. Durch Zugabe von Arabinose wird eine mindestens 10fache Induktion bewirkt. Trotz der mehr als 10fachen Steigerung bei der Fab-Sekretion in das Kulturmedium kommt das Zellwachstum nach Induktion mit Arabinose zum Stillstand. Dies bestätigt, daß ein hoher Expressionspegel der Fab-Gene für das Zellwachstum nachteilig ist. Bakterienkolonien, die pIT104 beherbergen, sind Phänotypisch nicht von E. coli mit pIT206 zu unterscheiden, wenn sie ohne Arabinose kultiviert werden.
- Als zweites wurde ein DNA-Fragment, welches das laci-Gen enthielt, einen Repressor des lac-Promotors, in den Expressionsvektor mit hoher Kopienzahl pFK102 kloniert. Expression von laci von einem Vektor mit hoher Kopienzahl läßt sich gut verwenden, um die Expression des lac-Promotors auf einem Vektor mit hoher Kopienzahl zu regulieren (Russel et al Plasmid, in Druck (1987); Hsuing et al., Biotechnology 4: 991 (1986)). Es wurde ein das laci-Gen enthaltendes 1,7-kb-EcoRI-Fragment auf pMC9 S (Calos et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015 (1983)) ausgeschnitten, mit T4-Polymerase aufgefüllt, um die Enden stumpf zu machen, mit PstI-Linkern ligiert und in den einmalig vorhandenen PstI-Ort von pFK102 kloniert, um pFK102laci zu erzeugen. Die Karte von pFK1022laci ist in Figur 7 dargestellt. Das zur Identifizierung des richtigen Klons verwendete Selektionsverfahren stellte sicher, daß das resultierende Plasmid pFK102laci einen funktionell reprimierten lac-Promotor enthielt. Alle weißen oder zartrosa Kolonien auf Macconkey-Lactose-Platten enthielten Plasmide mit laci-Inserten, während Transformanten, die nur pFK102 enthielten, rot waren, was die funktionelle Repression des lac-Promotors durch das in hoher Kopienzahl vorliegende laci-Gen zeigt. Tabelle III zeigt, daß die Expression von bakteriellem Fab von Zellen, die pFK102laci enthalten, der Expression von pFK102 entspricht. Anders als pFK102-haltige Zellen, die von der gewöhnlichen Form abweichende Kolonien bildeten und in Brühenkultur langsam wuchsen, ähnelten Zellen, die pFK102laci enthielten, jenen mit pUC18.
- Plasmid-DNA wurde mittels Standardverfahren zur Transformation von E. coli in entweder E. coli JM103 oder MC1061 eingeführt. Bakterienkulturen wurden in TYE (Trypton 1,5 %, Hefeextrakt 1,0% und NaCl 0,5%) vermehrt, das mit den geeigneten Antibiotika (Penicillin 250 µg/ml oder Tetracyclin 15 µg/ml) ergänzt worden war. Bakterienkulturen wurden in Volumina von 5 ml bis 1 Liter bei 37ºC bis zu einer optischen Dichte OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,8 (etwa 4 x 10&sup8; Zellen/ml) vermehrt, und Aliquots wurden mit IPTG (0,2 mM), Lactose (1,0%) oder Arabinose (1,0%) induziert. Die Kulturen wurden für eine zusätzliche Zeitdauer von 4-21 Stunden vermehrt. Teile jeder Kultur wurden auf Leicht-Ketten-Produktion analysiert. Durch osmotischen Schock wurde wie beschrieben (Yanagida et al 1986 J. Bacteriol. 166: 937) Protein aus dem periplasmatischen Raum von E.-coli-Zellen freigesetzt. Alternativ wurden Kulturüberstände direkt auf die Anwesenheit von Antikörperketten getestet.
- Die Quantifizierung von L6-Leicht-Kette erfolgte durch ELISA mit Ziegen-Anti-Mensch-Kappa-Leicht-Ketten-Antikörper (Kappa 1). Fd konnte durch ELISA mit monoklonalem Maus-Anti-Mensch-Fd-Antikörper (Calbiochem) nachgewiesen werden. Tabelle II zeigt repräsentative Daten für die Expression von reaktivem Leicht-Ketten-Material in E.-coli-Kulturüberstand. Dies mag eine einzigartige Eigenschaft unter eukaryotischen Proteinen sein, die in E. coli exprimiert werden, jedoch ist bekannt, daß unter bestimmten Bedingungen bakterielle Proteine aus E. coli freigesetzt werden (Abrahmsen et al 1986 NAR 14: 7487-7500; Pages et al. 1986, J. Bacteriol. 169: 1386). Tabelle III vergleicht die Menge an in das Periplasma sezernierter leichter Kette mit der Menge im Kulturüberstand. Reaktives Leicht-Ketten-Material ist in plasmidhaltigen Kulturen vorhanden, die nur klonierte leichte Kette oder leichte Kette plus Fd beherbergen. Die besten Fab-Produzenten (pFK102 und pFK102laci) scheiden typischerweise 300-1000 ng/ml ELISA-reaktive leichte Kette in das Kulturmedium aus. TABELLE II Quantifizierung von leichter Kette aus E.-coli-Periplasma
- E. coli JM 103 oder MC1061 (Ergebnisse ähnlich) wurde mit jedem Plasmid transformiert. Frische Transformanten wurden in TYE bei 37ºC bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,8 kultiviert. Die Kulturen wurden geteilt, und einem Aliquot wurde bis zu einer Konzentration von 0,2 mM der Induktor (IPTG) zugesetzt (- oder + IPTG). Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37ºC vermehrt. Es wurden periplasmatische Proteinextrakte hergestellt, und Aliquots wurden mittels ELISA mit Ziegen-Anti-Mensch-Kappa-Antikörper aufleichte Kette getestet. Jeder Wert ist der Mittelwert von mindestens zwei verschiedenen Experimenten. Die Entfernung nichtcodierender Sequenzen sowohl 5' als auch 3' zum Antikörper-Gen bewirkte eine Steigerung der Leicht-Ketten-Akkumulation im Periplasma. TABELLE III Akkumulation von leichter Kette im Überstand und im Periplasma nach Induktion
- Plasmidhaltige E.-coli-Stämme wurden kultiviert, präpariert und getestet. Bei pRR190, pFK102 und pFK102laci wurden die Zellen mit 0,2 mM IPTG induziert. Jeder Wert ist der Mittelwert von mindestens zwei verschiedenen Experimenten. Für die Analyse von E.-coli-Kulturüberständen wurden die Bakterien durch Zentrifugation entfernt, und die Kulturüberstände wurden durch einen 0,45-µm-Filter geschickt. Die Werte sind in ng/ml Kultur ausgedrückt.
- *nb = nicht bestimmt
- Bakteriell produzierte Antikörperketten wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen analysiert. Proteinextrakte von lysierten ganzen Bakterienzellen, Protein, das durch osmotischen Schock aus dem periplasmatischen Raum freigesetzt wurde, und in den Kulturüberstand ausgeschiedenes Protein wurden analysiert. Der Transfer von gelgetrenntem Protein unter vollständig reduzierenden Bedingung auf Nitrocellulose und die immunologische Färbung mit Ziegen-Anti-Mensch-Leicht-Ketten-Antikörper durch Western Analyse zeigten, daß ein Protein mit demselben Molekulargewicht wie authentische chimäre L6-Leicht-Kette vorhanden war (etwa 23 kD). Die Analyse von Proteinproben unter nichtreduzierenden Polyacrylamidelektrophorese-Bedingungen zeigte, daß Extrakte aus Zellen mit einem Plasmid mit nur dem Leicht-Ketten-Gen (pRR191 oder pRR190) einen großen Anteil des reaktiven Leicht-Ketten-Materials assoziiert zu einer höhermolekularen Form enthielten. Viel von diesem Material lief bei etwa 46 kD, wobei es sich wahrscheinlich um ein Leicht-Ketten-Dimer handelt. Leicht-Ketten-Dimere sind bei Myelomzellen beobachtet worden, die nur leichte Kette produzieren. Es kommen auch andere immunreaktive Proteinbanden vor, die eine unspezifische Disulfidbrückenbildung zwischen leichter Kette und E.-coli-Proteinen repräsentieren könnten. Proteinproben (Periplasmaextrakte oder Kulturüberstände) von E.-coli-Zellen die sowohl das Leicht-Ketten- als auch das Fd-Gen beherbergen, enthalten eine reaktive Leicht-Ketten-Bande bei etwa 48 kD, wenn sie unter nichtreduzierenden Gelbedingungen aufgetrennt werden, die bei einem etwas höheren Molekulargewicht läuft als das bakterielle Leicht-Ketten-Dimer. Dieses Material ist bakteriell produziertes chimäres L6-Fab. In E. coli, das pFK102laci oder pFK102 beherbergt, ist eine bei einem Polyacrylamidlauf unter nichtreduzierenden Bedingungen beobachtete 48-kD-Bande die hervorstechendste immunreaktive Spezies. Überdies ist der verschmierte Hintergrund von immunreaktiven Proteinen, der bei Extrakten zu beobachten ist, die nur die leichte Kette enthalten, bei Extrakten von Zellen, die sowohl leichte Kette als auch Fd enthalten, stark verringert.
- Immunologisch und funktionell aktives (siehe unten) bakterielles Fab wurde aus entweder Kulturüberständen oder periplasmatischen Proteinextrakten von E. coli, das pFK102laci oder pIT104 beherbergte, reindargestellt. Für die Reinigung von periplasmatischem Material wurde die periplasmatische Fraktion von einem Liter Zellen, die 4 Stunden induziert worden waren, in 50 ml destilliertes Wasser freigesetzt. Dieses Material wurde 20 Minuten bei 5000 g zentrifugiert und durch einen 0,45-µm-Filter flitriert. Der Periplasmaextrakt wurde dann über einer YM10-Membran (Amicon) bis auf etwa 5 ml konzentriert. Dieses Material wurde in Startpuffer (10 mM K&sub2;HPO&sub4;, pH 7,5) 8fach verdünnt und auf eine 1-ml-S-Sepharose-Säule mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 milmin gegeben. Die Säule wurde mit 25 ml Startpuffer gewaschen und mit einem NaCl-Gradienten (0 bis 200 mM) in Startpuffer (Gesamtvolumen 200 ml) eluiert. Der immunreaktive Gradientenpeak wurde gesammelt (die Elution war bei etwa 100 mM) und auf Centricon 10 konzentriert. Gereinigtes Fab wurde in PBS + 2,0% BSA aufbewahrt.
- Für die Reindarstellung von sezerniertem Fab aus 1 Liter Bakterienkulturüberstand wurden die Zellen nach 21 Stunden Wachstum mit induzierenden Mitteln durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde durch einen 0,45-µm-Filter filtriert. Das Medium wurde über einer YM110-Membran (Amicon) bis auf etwa 16 ml konzentriert, dann mit 10 mM K&sub2;HPO&sub4; auf 105 ml verdünnt. Dieses Material wurde auf eine 1,6-ml-S-Sepharose-Säule gegeben und mit einem NaCl-Gradienten (0 bis 200 mM) in 40 ml eluiert. Das aus der S-Sepharose-Chromatographie gewonnene Fab besaß laut Densitometrie-Scan eines nichtreduzierenden, mit Coomassieblau gefärbten, 10% igen Acrylamidgels eine Reinheit von mehr als 70%. Die Molekulargewichte von Fd und leichter Kette sind, basierend auf der DNA-Sequenz, 24,5 kD und 23 kD, was mit den beobachteten Proteingrößen gut übereinstimmt. Die kleinere der beiden Banden reagierte stark mit Ziegen-Anti-Mensch-Kappa-Leicht-Ketten-Antiserum auf einem Western-Blot.
- Bakterielle Fabs, die aus entweder dem periplasmatischen Raum oder Bakterienkulturüberständen reindargestellt worden sind, sind durch sämtliche hier getesteten analytischen Kriterien nicht zu unterscheiden.
- D. Funktionelle Bindungsaktivität von bakteriellem L6-Fab an das L6-Antigen
- Durch S-Sepharose-Chromatographie gereinigtes bakteriell produziertes Fab wurde auf Bindung an L6-Antigen enthaltende Zellen getestet. Wie in Tabelle IV gezeigt, bindet bakterielles Fab spezifisch an die menschliche Kolonkarzinom-Zellinie H3347. Als negative Kontrollen wurden Zellen von der T-Zellinie T51 verwendet. Targetzellen wurden 30 Minuten bei 4ºC mit bakteriell produziertem chimärem L6-Fab, intaktem chimärem L6-Antikörper, der in Sp2/0-Zellen produziert worden war, oder Maus-L6-Antikörper, der aus Maus-Aszites gewonnen worden war, inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit FITC-markiertem Ziegen-Anti-Mensch-Leicht-Ketten-Antikörper zum Nachweis von Fab, mit FITC-markiertem Ziegen-Anti-Mensch-Im munglobulin zum Nachweis von chimärem Antikörper oder mit FITC-markiertem Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin zum Nachweis von Maus-Antikörper. Antikörperbindung an die Zelloberfläche wurde mittels eines Coulter Model EPIC-C-Zellfraktionators bestimmt.
- Bakteriell produziertes Fab zeigte auch dieselbe charakteristische Hemmung der Bindung von FITC-markiertem Maus-L6-Antikörper an die Oberfläche von antigenpositiven 3347-Kolonkarzinomzellen wie der Sp2/0-produzierte chimäre L6-Antikörper. Bakterielles Fab und von Sp2/0 stammender chimärer L6 besitzen im wesentlichen identische Bindungshemmungsprofile, was darauf hinweist, daß die Avidität von bakteriellem Fab und aus SP2/O gewonnenem chimärem L6 gleich ist. TABELLE IV Bindungstests von bakteriellem Fab
- * Das Bindungsverhältnis ist der Faktor, um den eine Testprobe heller ist als eine Kontrollprobe bei Behandlung mit einem FITC-konjugierten zweiten Antikörper.
- Standard-F6-Fab wurde durch enzymatische Verdauung von Maus-L6-Antikörper hergestellt.
Claims (11)
1. Rekombinanter Vektor, der zur Transformation eines bakteriellen Wirtes
geeignet ist, wobei der Vektor eine für ein Pectatlyase-Signalpeptid codierende
DNA-Sequenz angrenzend an eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Protein codiert,
das ein anderes ist als:
(a) Pectatlyase oder
(b) ein Antikörperfragment, das L6 chimäres Fab, eine L6 chimäre leichte
Kette oder L6 chimäres Fd ist,
wobei der Vektor gestatten kann, daß das Protein exprimiert und zum Periplasma
eines gramnegativen Wirtes transportiert wird, oder daß es exprimiert und in bezug
auf den Wirt extrazellulär transportiert wird.
2. Vektor nach Anspruch 1, der außerdem eine DNA-Promotorsequenz
umfaßt, die in bezug zur Signal- und zur Proteinsequenz so angeordnet ist, daß sie
die Expression des Proteins in dem Wirt gestattet.
3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, der ein Plasmid ist.
4. Vektor nach einem vorhergehenden Anspruch, bei welchem die Pectatlyase
die Pectatlyase B von Erwinia carotovora und loder der Promotor ein araBAD- oder
lac-Promotor ist.
5. Bakterieller Wirt, der mit einem Vektor nach einem vorhergehenden
Anspruch transformiert ist.
6. Wirt nach Anspruch 5, der ein gramnegatives Bakterium ist.
7. Wirt nach Anspruch 5 oder 6 der E coli ist.
8. Verfahren, um ein Protein aus dem Cytoplasma eines Wirtes nach außen zu
bringen, wobei das Verfahren die Kultivierung in einem geeigneten Kulturmedium
eines Wirtes nach einem der Ansprüche 5 bis 7 umfaßt, der eine
Promotor-DNA-Sequenz aufweist, die in bezug zur Signal- und zur Proteinsequenz
so angeordnet ist, daß sie die Expression des Proteins in dem Wirt gestattet.
9. Gereinigtes Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die für ein
Pectatlyase-Signalpeptid und ein Protein codiert, das ein anderes ist als:
(a) Pectatlyase oder
(b) ein Antikörperfragment, das L6 chimäres Fab, eine L6 chimäre leichte
Kette oder L6 chimäres Fd ist,
oder Mutanten oder Rekombinanten davon,
wobei diese Nucleotidsequenz, wenn sie in einem Vektor in einem gramnegativen
Wirt vorhanden ist, gestatten kann, daß das Protein exprimiert und zum Periplasma
des Wirtes transportiert wird, oder daß es exprimiert und in bezug auf den Wirt
extrazellulär transportiert wird.
10. Polynucleotid nach Anspruch 9, wobei die Pectatlyase die Pectatlyase B
von Erwinia carotovora ist.
11. Polynucleotid nach Anspruch 10, wobei die Sequenz wie in Figur 2A
dargestellt ist.
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