JPH04503151A - ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター - Google Patents
ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター1、発明の分
野
本発明は、外来タンパク質をグラム陰性細菌、特に大腸1t(E、c。
1i)の細胞質から細胞周辺腔、好ましくは細胞外液体中に外向化することに関
する。大腸菌適合性のプロモーターの支配下にE rviniacarotov
ora由来のペクチン酸リアーゼ遺伝子のシグナルペプチド配列を含有する分泌
ベクターを構築することによってこの外向化を可能にするものである。
2、発明の背景
通常、単細胞宿主中に発現された外来タンパク質は細胞質外に分泌されず、従っ
て目的産物の単離には、細胞の破壊、ならびに生成°した細胞残骸および細胞に
よって産生される所望ではない天然の細胞質タンパク質の全てからの分離が必要
となる。通常、グラム陰性細菌は、その自己のタンパク質を細胞質の外側の領域
であって細胞の内側および外側の膜の間の細胞周辺腔中に分泌する。ペリプラズ
ムからのタンパク質の単離は、細胞質からの単離に比べてかなり簡単である。細
胞壁の破壊は必要とされるが、細胞膜の破断は必要ではなく、従って、細胞質の
残骸による外来タンパク質の汚染が避けられる。細胞外培地に分泌されたタンパ
ク質の単離および分離は、勿論、常法によって行われる。
2.19組換えDNA法
組換えDNA法の出現は、治療処方または工業過程において価値を有する実質的
に純粋なタンパク質を大量に製造するための「工場」として単細胞微生物を利用
する可能性を開いた。簡単に言うと、組換えDNA法は特定のDNA配列をDN
A媒体またはベクター、通常はファージまたはプラスミドのどちらかに挿入する
ことを必要とする。はとんどの場合、ベクター中に挿入されるDNA配列はベク
ターにとって外来のものであり、挿入されるDNA配列とベクターDNA配列は
天然においては遺伝情報を交換しないのが普通である生物群から導かれるか、ま
たは挿入されるDNAが部分的もしくは全合成によるものであることもある。こ
れらDNAベクターの調製方法は今では当分野で周知である。例えば、Cohe
nおよびB oyer[米国特許N o、 4.237.224 ;その記載は
本明細書の一部を構成する〕は、制限酵素と連結を使用することによる組換えプ
ラスミドの調製について記載している。次いで、得られたプラスミドを適合する
単細胞宿主中に入れ、これにより外来遺伝子を細胞に導入する。外来タンパク質
の発現を達成するためには、組換えプラスミドは宿主細胞中で自律的に複製する
ことができるものでなければならず、また、好ましくは形質転換された宿主細胞
の同定を可能にするマーカー機能を有しているであろう。適切な複製、転写およ
び翻訳シグナルの全てがプラスミドに正しく配置されているときには、外来遺伝
子は形質転換細胞およびその子孫中で発現されるであろう。
2.2.タンパク質の分布
細胞によるタンパク質産生の進行はその翻訳によっては終了しない。通常、あら
ゆる細胞内に産生されるタンパク質は細胞全体には見い出されず、むしろ、区画
される傾向にある。ある種のタンパク質は分泌され、即ち細胞質から放出され、
他のものは分泌されない。
細胞質外へのある種のタンパク質の分布はシグナル配列の支配下にある。細胞か
ら分泌される運命にあるこれら細胞タンパク質は、約16〜30アミノ酸残基の
、その大部分が疎水性であるN−末端配列を有しているのが普通である。この疎
水性領域がシグナルの機能に必須である。この領域の翻訳によって生成するペプ
チドは細胞膜に結合するものと考えられている。タンパク質の残りの翻訳が続く
につれて、この非シグナル部分は脂質二重層を通って引き出される。
次いで、酵素シグナルペプチダーゼによってシグナル配列が残りのタンパク質か
ら切断される。
シグナル配列およびペプチドの機能の理解は、研究者等を、大腸菌の翻訳および
輸送機序を利用して通常は大腸菌によって産生されないタンパク質(原核性およ
び真核性の両外来タンパク質が含まれる)を製造しようとする試みに向かわせた
。しかし、目的タンパク質の成功裏の分泌には、遺伝子が宿主細胞プロモーター
によって認識されつるシグナル配列と結合していることが必要とされる。適合す
るシグナル配列が存在しないと、外来タンパク質は宿主細胞によって発現されう
るが、細胞質を越えて細胞周辺腔または細胞外液体中には分布しないであろう。
宿主細胞において種々の外来タンパク質を発現させ、そして分泌させうるベクタ
ーは、明らかに、大量の価値あるタンパク質を製造するために組換え法を用いる
際に極めて大きな利点を与えるであろう。本発明の分泌ベクターはそのような利
点を与えるものであり、驚くべきことに大腸菌には非天然のシグナル配列を有し
ている。
4、
第1図は、pelB遺伝子を含有するプラスミドpss1004、およびara
B A Dプロモーターの支配下にあるpelB遺伝子を含有するpss103
8を創製するために用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例6.
1.1に挙げる。
第2A図は、pelBシグナルペプチド暗号領域の配列、および対応するアミノ
酸配列を示すものである。第2B図は、pelBシグナル配列を含有するプラス
ミドpi NG 173、およびlacプロモーターの下流にpelBシグナル
配列を含有するプラスミドpRR175の構築に用いた方法の概略を示すもので
ある。その詳細は実施例6゜2に挙げる。
第3図は、araB A Dプロモーターの支配下にあるpelBシグナル配列
および植物タウマチン遺伝子を含有するプラスミドpr NG 177−1の構
築に用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例6.3.2に挙げる
。
第4図は、プレータウマチン リーダーペプチド配列と共に植物タウマチン遺伝
子を含有するプラスミドpING177−3のI築i:用いた方法の概略を示す
ものである。その詳細は実施例6.3.3に挙げる。
第5図は、キメラマウスーヒ)L5抗体軽鎖の発現に用いたプラスミドの構築に
用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例6.4.2に挙げる。
第6図は、キメラマウス−ヒトL6構築重鎮の発現に用いたプラスミドの構築に
用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例6.4.2に挙げる。
第7図は、キメラマウス−ヒトL6抗体Fabの発現に用いたプラスミドの構築
に用いた方法の概略を示すものである。その詳細は実施例6.4.2に挙げる。
第8図は、pFKloo、pFKlol、pFK102、pF K 103、お
よびpFK104中の軽鎖およびFd遺伝子カセyトの制限地図を示すものであ
る。これらのプラスミドは、第6図および第7図に示したプラスミドを用い、本
明細書の記載のようにして構築した。
矢印はlacプロモーターからの転写の方向を示す。E 、 carotovo
raおよび真核性の非暗号配列は白の部分で示す。pelBリーダー配列は網目
の部分で示し、抗体遺伝子(Fd)および軽鎖(K)は黒の部分で示す。
4、発明の要約
本発明は、細菌宿主細胞の形質転換に用いたときに、発現された外来タンパク質
の外向化を可能にするプラスミド分泌ベクターを提供するものである。このプラ
スミドは、グラム陰性細菌のペクチン酸リアーゼのシグナル配列をコードしてい
るDNA配列を含有している。次いで、これらのプラスミドを用いて、実質的に
シグナル配列と非宿主タンパク質遺伝子配列からなるフラグメントを含有してい
る誘導体プラスミド、およびこのフラグメントが宿主適合性のプロモーター配列
に隣接して配置されているプラスミドを調製した。
このプロモーター配列を含有している後者のプラスミドは、細菌宿主細胞の形質
転換に用いると、宿主細胞が外来タンパク質を翻訳し、そして外向化することを
可能にする。即ち、本発明は、細胞の溶解、および細胞質不純物を除去するため
に必要とされる付随の厳格な精製工程を必要とせずに、宿主細胞によって外来タ
ンパク質を大量に産生させうる手段を提供するものである。即ち、宿主から発現
された非宿主タンパク質の単離は、それらがこのようにして外向化されうるとき
には、著しく容易になるであろう。ペクチン酸リアーゼ(pel)のシグナル配
列は大腸菌細胞系でよく機能し、本発明の分泌ベクターはこの系で用いられる実
質的に全てのタンパク質の分泌を引き起こしつることが示された。タンパク質の
細胞周辺腔または細胞外環境への分泌は、特定のタンパク質をコードしている既
知の遺伝子配列を、プラスミドベクターのpelシグナル配列および適当なプロ
モーター配列の後のある位置に挿入し、次いで細菌宿主細胞をこの分泌ベクター
で形質転換することによって達成される。
本明細書に開示したようにして、細菌宿主細胞の形質転換に用いたときに宿主細
胞の細胞質膜の外側に外来タンパク質を分泌させる組換えプラスミドを調製した
。本発明は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子を大腸菌中にクローンし、そして発現さ
せると、大量のペクチン酸リアーゼが細胞周辺腔または細菌が増殖している培養
液中に分泌されるという観察に基づいている。このことは、ペクチン酸リアーゼ
シグナル配列が非−E rvinia細菌系で認識され、そして翻訳されるとい
う結論に導く。プラスミドが外来タンパク質遺伝子と共にpel遺伝子のシグナ
ル配列を含んで調製されると、宿主適合性のプロモーターの存在下では、pel
遺伝子のシグナル配列がタンi<り質をさせうることが発見された。本発明の分
泌ベクターは、その利用性が単一の菌株に限定されず、多種多様の容易に利用で
きる大腸菌株(その全ては、少なくともある種の組換えタンパク質を直接培養培
地に普通に分泌する)において効率的に機能することが示されており、特に有用
である。また、本プラスミドは、原核性および真核性の両方の広範な外来遺伝子
配列を用いて操作しうろことかわかっている。さらに、このようにして製造した
タンパク質は、その天然の、および適切な立体配置で分泌されることが確かめら
れている。
これらプラスミドの調製およびそれらの細菌形質転換における利用の方法を、以
下でさらに詳しく説明する。
5.1.ペクチン酸リアーゼ遺伝子の同定および単離ペクチン酸リアーゼは、ポ
リガラクツロン酸の加水分解を触媒する酵素の1つであり、多数の植物病原性の
細菌および菌類において見い出されている。PLa、PLbおよびPLcと呼ば
れる3種のペクチン酸リアーゼが細菌E rwinia carotovora
から同定されており、また、類似の酵素が細菌E rwinia chrysa
nthemi[Keen et al、 、 J、 Baならびに菌類Rhiz
octonia 5olaniにおいて知られている。E 、 car。
tovora[Lei et al、 + Gene 35 : H−70,1
985]およびE 、 chrysanthemi [Keen et al、
;上記コの両方から遺伝子が単離されている。本発明においては、E 、 c
arotovora由来のpelB遺伝子をペクチン酸リアーゼシグナル配列の
供給源として用いた。プラスミドpss1004[Lei et al、 、
J、 Bacteriol、169 : 4379−4383.1987]は、
E 、 carotovoraのpelB遺伝子を含有している。シグナル配列
近辺の制限部位を、この遺伝子のDNA配列に基づいて同定した。また、N−末
端アミノ酸配列を調べてリーダーペプチドの位置を確認した。pss1004プ
ラスミドをHaelllおよびEcoRI制限酵素で処理することによってリー
ダー配列を含有するフラグメントを得た。pelBシグナルペプチドの遺伝子配
列および対応するアミノ酸配列を第2A図に示す。別の方法によれば、このペプ
チド配列は既知のペプチド合成法によって化学的に合成することもできる。
5.21分厳ヱ又又二Ω贋葺
適切なシグナル配列を含有するフラグメントが同定され、そして単離されたなら
、次いで、これをクローニング媒体、好ましくはプラスミド中に挿入する。本ベ
クターを、当分野で既知の通常のベクター構築法に従って調製する。本明細書お
よび請求の範囲で用いる「分泌」なる用語はタンパク質の細胞周辺腔への輸送を
意味し、そして「排出」なる用語はタンパク質の培養培地への輸送を意味する。
挿入した遺伝子の転写および翻訳を最終的に達成するためには、この遺伝子は選
択した宿主細胞に適合するプロモーターの支配下に置かれていなければならない
。プロモーターは、RNAポリメラーゼが付着し、転写を開始するDNAの領域
である。選択されるプロモーターは、宿主細胞生物から単離されたか、またはそ
こで機能することができるあらゆるプロモーターであってよい。例えば、大腸菌
は、それ自体、そのバクテリオファージまたはそのプラスミドに関係したlac
またはrec Aプロモーターなどの移しいプロモーターを有している。また、
λフアージPt、およびPRプロモーターなどのファージプロモーターを用いて
、それに隣接してDNAセグメントを有するようにコードされている産物を高レ
ベルで産生させることもできる。この産物は天然、合成または組換えのものであ
ってよい。
また、遺伝子の効率的な翻訳を達成するためには開始シグナルが必要である。例
えば、大腸菌mRNAでは、リポソーム結合部位は翻訳開始コドン(AUGまた
はGUG)および16SリポソームRNAの3゛−末端の塩基に相補性の別の配
列を含んでいる。いくつかのこれら後者配列(S hine−D algarn
oまたは5−D)は、大腸菌および他の適切な宿主細胞型で同定されていた。宿
主細胞系に適合するあらゆる5D−ATG配列を用いることができる。これらに
は、フッファージλのN遺伝子もしくはcro遺伝子、または大腸菌トリプトフ
ァンE、D、C,BもしくはA遺伝子が含まれるが、これらに限定はされない。
インビトロでのDNAフラグメントのクローニングベクターへの挿入のためには
多数の方法が存在する。DNAリガーゼは、2本鎖DNA鎖中の隣接ヌクレオチ
ドの間の1本鎖の傷をふさぐ酵素である。従って、この酵素を用いて、ある種の
制限酵素によって生成し、アニーリングされた付着末端を共有結合によって結合
させることができる。また、これとは別に、DNAリガーゼを用いて平滑末端フ
ラグメントの間のホスホンエステル結合の形成を触媒させることができる。最後
に、酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてフラグメント
の末端にホモポリマー性の3’−1本鎖尾部を形成させることもできる。即ち、
ある集団の3°−末端にオリ:r(dA)配列を、そして第2の集団の3°−末
端にオリゴ(dT)グロックを付加することによって、2種類の分子をアニーリ
ングしてダイマー環状体を形成させることができる。これら方法のどれかを用い
て、遺伝子セグメント、プロモーターおよびその他のコントロール要素をベクタ
ー中の特定の部位に連結することができる。即ち、タンパク質の遺伝子配列がベ
クターのATG配列に関して正しいリーディング・フレーム内にあるように、特
定タンパク質の暗号配列を、選択したベクター中に、ベクターのプロモーターお
よびコントロール要素ならびにpel/グナル配列との特別の関係のもとに連結
する。
通常、使用されるベクターは、形質転換された細胞が同定されうるように、アン
ピシリン耐性あるいはテトラサイクリン耐性などのマーカー機能を有している。
ベクターは既知のあらゆる発現ベクターまたはそれらの誘導体であってよい。最
もよく用いられるベクターは、pBR322、pAc105、pVA5、pAc
Yc177、PKH47、pAcYc184、pUBllo、pMB9、p’B
R325、Co1E L pSC101、pBR313、pML21、R3F
2124、pcRlあるいはRP4などのプラスミドベクター、λgtll、λ
gt−WES−λB、 Charon 28、Charon 4 A、λgt−
1−λBC。
λgt−1−λB、M13mp7、M13a+p8、M13mp9などのバクテ
リオファージベクター;SV40およびアデノウィルスベクター、ならびに酵母
ベクターである。
本発明は、好ましくはクローニングベクターとしてプラスミドを用いる。例えば
、大腸菌での多数の異なるタンパク質のクローニングにおいて、本実施例で採用
した方法は、始めにPLbシグナル配列を独立してクローンすることであった。
これは、完全なペクチン酸すアーゼB配列を含有しているプラスミドpsslo
04からHaell[+ E coRI消化フラグメントを単離することによっ
て行った。
次いで、このフラグメントをpB R322プラスミド(SspIで消化し、5
stlリンカ−と連結し、次いでEcoRIで消化しておいた)に連結した。こ
うして得られたのがpelBシグナル配列を含有するプラスミドpi NG l
73である。このpr NG 173プラスミドを、目的タンパク質の配列を
含むプラスミドに後に連結することができるpelBシグナル配列のクローニン
グ媒体として用いた。このようにして調製したプラスミドは、関係タンパク質の
遺伝子配列に隣接したpelBシグナル配列からなるハイブリッド遺伝子を含有
している。次いで、適切なプロモーター配列をこのハイブリッド遺伝子の5°−
末端に挿入して最終の発現ベクターを創製することができる。
また、始めにプロモーター配列とpelBシグナル配列を含有するプラスミドを
調製し、次にタンパク質遺伝子配列をプロモーター−シグナル配列の下流に挿入
してもよい。本発明において特に有用であることがわかったプロモーターは、大
腸菌宿主系と組み合わせたときの大腸菌1acプロモーターおよびS almo
nella typhimuriumのaraBADプロモーターである。しか
し、選択した宿主系に適合する他のあらゆる適切なプロモーターも用いることが
できる。上記の方法によって調製したのはL6キメラFabおよびタウマチンの
遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターであるが、あらゆる種類のタンパク質
遺伝子を本ベクターおよび方法に用いることができることは当業者には明らかで
あろう。
5.3.形質転換
適切なプロモーターを有するベクターが得られたなら、このプラスミドを用いて
宿主細菌を形質転換する。例えば、処理した実質的に全ての大腸菌株が形質転換
可能(ただし、形質転換率は異なる)であったので、本発明は単一の菌株での使
用に限定されない。形質転換に用いられる方法の大部分は、細菌細胞の塩化カル
シウム処理によってベクターDNAの取込みが実質的に増強されるというMan
delおよびHiga[J、 Mo1. Biol、 53 : 159−16
2.1970]の観察に依存している。
ベクターDNAを塩化カルシウム処理した細菌に短い期間(通常は12〜24時
間を越えない)暴露する。次いで、暴露した細胞を形質転換体についてスクリー
ニングする。これは、ベクター由来の適切なマーカーの性質を発現している細菌
を選択することによって行われる。例えば、テトラサイクリン含有のマーカーを
有するプラスミドが用いられたときには、細菌をテトラサイクリン含有の培地で
増殖させ、増殖し続ける細菌を推定の形質転換体として回収する。
次イで、これらの細菌を目的のタンパク質の産生についてさらにスクリーニング
してもよい。
5.4.遺伝子産物の単離
本発明は、遺伝子産物を細胞周辺腔または周囲の増殖培地のどちらかから単離す
ることを可能にするものである。発現されたタンパク質の位置は、宿主として用
いた特定の菌株に依存するようである。
本発明の最も予想外の特徴の1つは、試験した菌株の全てが少なくとも一部の組
換え産物を培養培地中に排出することができるということである。菌株の間の主
な相違は、細胞周辺腔中に分泌された量に対する、排出された産物、即ち培地中
に輸送された産物の量の比率である。高レベルの排出を示す大腸菌株にはMC1
061、JM103および706が含まれる。培養液中に排出されるタンパク質
はそれから既知のタンパク質回収法によって容易に単離することができるが、細
胞周辺腔に局在化しているタンパク質の回収は細胞質膜を破壊することなくタン
パク質の放出を達成するために細胞壁の浸透を必要とする。ペリプラズムタンパ
ク質を除去する方法の1つは、ZinderおよびArndt[PNAS US
A 42 : 586−590.1956コが最初に記載した方法であり、細胞
壁の除去を含むものである。簡単に説明すると、細胞を卵アルブミン(リゾチー
ムを含有する)で処理し、細胞壁の大部分が除去されたスフ二ロプラストの細胞
株を生成させる。また、ペリプラズムタンパク質は、細胞壁の除去を必要としな
いが、代わりにタンパク質の放出を引き起こす機序によって単離することもでき
る。細胞をエチレンジアミン四酢酸(EDTA)含有の高張スクロース培地に入
れる。この培地は細胞に水を失わせ、収縮させ、それによって細胞質膜を細胞壁
から取り去る。次いで、この細胞を塩化マグネシウム溶液中に入れ、浸透圧ショ
ックを与える。即ち、細胞の外側の浸透圧を減少させ、水を細胞中に急激に取り
込ませ、細胞を膨潤させ、外側の膜を越えてペリプラズムタンパク質が排除され
るようにする。上記方法の変法は当業者には明らがであろう。
6.実施例
本分泌ベクターを用いて大腸菌中で種々の別種タンパク質を分泌させることに成
功した。以下に挙げる実施例は、上記の開示に従う多数の別種プラスミドの製造
方法を詳しく説明するものである。
Erwinia carotovora由来のペクチン酸リアーゼ遺伝子を含有
している。pelB遺伝子は2つのDrar制限部位の間に位置している。この
遺伝子の単離は、プラスミドpsH2111のDraIによる消化とアガロース
ゲルでの1.9キロ塩基フラグメントの同定によって行った。次いで、単離した
フラグメントを、SmaIで消化しておいたプラスミドpUC8に連結した。得
られたプラスミドはpss1004である(第1図参照)。
次いで、プラスミドpss1004をNdel、T、DNAポリメラーゼおよび
Hindll!で処理し、得られたフラグメントをプラスミドpi T2(Nc
ol、T、DNAポリメラーゼおよびHindl[lで消化しておいた)に連結
してプラスミドps31038を得た(第1図)。
プラスミドpIT2は、Salmonella typhimuriumのar
aB A DプロモーターおよびaraC遺伝子の両方を含有している[Joh
nson et al、。
Gene 34 : 137−145.1985]。次いで、このプラスミドを
用いて大腸菌株706を形質転換した。従って、プラスミドpss1038のp
etB遺伝子の発現は、araB A Dプロモーターの支配下にあり、増殖培
地中のアラビノースの存在によって作動するものと予想される。
6.1,2. PLBの排出および精製プラスミドpss1038を担持する大
腸菌細胞706 (F\pro、thr、 Ieu、 argH,his、 I
ac、 phoS t、 rpsL、 1ky−207)を用いてPLbの産生
および排出の特徴を調べた。この大腸菌細胞をTYE[1゜5%トリプトン、1
%酵母エキスおよび0.5%NaCf2]中で増殖させ、37°Cでインキュベ
ートし、増殖の対数期(0,D、、、、=0.6付近)に1%のアラビノースを
増殖培地に加えてaraB A Dプロモーターを作動させ、PLbの産生を開
始させた。4時間のインキュベートの後(0,D、54o=約2.5)、培養ブ
ロスを遠心し、この大腸菌細胞の培養培地からPLbを直接精製した。培養液を
濃縮し、A m1con(メンブランYM2)で脱塩し、次いで、CM−52カ
ラム(pH7゜4)に通し、0.2MNaCQで溶離することによってタンパク
質を精製した。これらの簡単な工程によって精製されたPLは、SDSゲル電気
泳動とそれに続くクーマノシー・ブルー染色で判定すると、95%以上の純度を
有していた。
6.21分叉二ヱl二咥贋1
pss1004プラスミドをpelBのシグナル配列の供給源として用いた。こ
の配列を、pss1004の制限酵素Hae[11による消化、S st I
D N Aリンカ−との連結、およびそれに続<EcoRIによる消化によって
単離した。5°−末端非暗号領域およびリーダーペプチドを含有するEcoRI
−5str DNAフラグメントを、次いで5splおよびEcoRIで消化
したpB R322プラスミドに連結した。このように調製したシグナルペプチ
ドを含有しているプラスミドはpl NG 173である。第2図は、このシグ
ナルペプチドのDNA配列、およびpI NG 173プラスミドの製造方法を
示すものである。このプラスミドを用いて、以下のように別の誘導体を構築した
。
タウマチンは植物Thaumatococcus danielliから初めて
単離されたタンパク質甘味料である。タウマチンは207個のアミノ酸を含み、
スクロースより2,000〜5,000倍甘い。タウマチンは8つのジスルフィ
ド結合を有しており、タウマチンの3次構造がその生物学的機能に必須である。
6、3.2.ペクチン酸リアーゼBのシグナル配列および合成の植物タウマチン
遺伝子を担持するプラスミドの構築上記のプラスミドpI NG 173由来の
PLbシグナルペプチドをコードしているDNA配列を、大腸菌宿主系でタウマ
チンを分泌させるため、プラスミドpING174由来のタウマチン遺伝子の前
にクローンした。得られたプラスミドpING177−1を用いて大腸菌におい
てタウマチンを発現させ、分泌させた。これは、PLbリーダーペプチドの5°
−非暗号領域の50bpに融合させたara B遺伝子の一部およびaraB
A Dプロモーターを有している。このプラスミドを調製するため、プラスミド
pI NG l 73の5stIおよびEcoRIフラグメントを、タウマチン
遺伝子を含有するプラスミドpl NG 174にクローンした。plNG17
4をBas+HIおよびPstrで消化し、pr NG 173からのリーダー
配列をその制限部位に連結し、pING176を得た。後者のプラスミドをNd
elおよびXholで消化し、得られたフラグメント(タウマチン遺伝子に隣接
してペクチン酸リアーゼのリーダー配り11を含有する)をプラスミドplNG
61の5alI、XhoI部位にクローンした。得られたプラスミドはaraB
A Dプロモーターの支配下にPLbリーダー配列をコードしている遺伝子お
よびタウマチン遺伝子を含有しており、これをpI NG 177−1と命名し
た。この構築工程の詳細を第3図に示す。
6.3.3.大腸菌の組換え株からのタウマチンの産生およびそのプラスミドp
l NG 177−1を保持している大腸菌株706をTYEブロス(1f2)
中で増殖させた。O,D、=0.35のときに、細胞を1%(v/v)アラピ/
−スで誘導した(約12時間)。次いで、培養物を収穫し、細胞周辺腔タンパク
質の特徴を5DS−PAGE、ウェスタン分析およびRIA検定により適切に折
り畳まれたタウマチンについて調べた。5DS−PAGEおよびウェスタン分析
の両方は、大腸菌細胞がタウマチンを合成することができることを示した。また
、RIA検定も、大腸菌の細胞周辺腔に分泌されたタウマチンが適切に折り畳ま
れていることを示した(第1表)。さらに、プレータウマチンシグナルペプチド
を用いて大腸菌中でタウマチンを分泌させた。プレータウマチンシグナルペプチ
ド配列およびタウマチンの構造遺伝子を含有するプラスミドpr NG 177
−3を用いてタウマチンを産生させた。構築工程の詳細は第4図に示す。細胞増
殖および誘導の条件は上述のものと同じである。RIA検定の結果は、プレータ
ウマチンシグナルペプチドによって導かれる適切に折り畳まれたタウマチンの産
生が、PLbリーダーペプチドによって導かれる産生よりもその効率が劣ってい
ることを示した(第1表)。
プラスミド RIA交差反応性タウマチン(μg)/細胞(生重量9)培 地
可溶性細胞抽出物 全分泌量
177−1 5.4 35.2 40.6177−3 1.8 6.3 8.1
抗体のFab分子は1個のジスルフィド架橋によって結合した2つの非同−のタ
ンパク重鎖を含有している。この2つの鎖は無傷抗体の軽鎖とFdである。この
抗体のFd分子は抗体重鎖のV、J、およびCHIタンパク質を含有している。
L6キメラ軽鎖およびFd遺伝子の適切なc D N Aクローンは既に同定さ
れていた。本実施例では、PLbリーダーペプチドをコードしている配列を用い
て、L6キメラ抗体の免疫学的に活性かつ適切に組み立てられたFabを培養増
殖培地に排出させた。
6.4.2.L6キメラ抗体の大腸菌発現および排出系の作成プラスミドpl
NG 173のS st I s E coRIフラグメントをpUC18にク
ローンしてpRR175を得た。このプラスミドは、lacプロモーターの下流
にpelBリーダーおよび隣接の上流非暗号配列を含有している。pRR175
構築の概略を第2図に示す。
無傷のし6キメラ軽鎖遺伝子(シグナル配列プロセッシング部位にAatll制
限部位を、およびこの遺伝子の下流に唯一のBgl11部位を含む)を、酵母発
現プラスミドpING1298(第5図)から1200bpのDNAフラグメン
トとして切り出した。このフラグメントをプラスミドpRR175に挿入した。
得られたプラスミドpRR177−8は、親プラスミド中に存在するlacプロ
モーターの下流に、pelBリーダーとL6軽鎖遺伝子のフレーム内融合を含ん
でいた。
このプラスミドの多数の誘導体を構築し、pRR177−8中のpelB::軽
鎖遺伝子融合体の5°および3°の両末端から非暗号配列を削除した。上流の非
暗号配列は、pelB!J−グー配列開始コドンから一48bpのNdel制限
部位を用いて削除し、pRR180−2を得た(第5図)。3゛非暗配列は、酵
母中でのL6軽鎖の発現に最適のプラスミドルlN01431由来のフラグメン
トをpRR180−2中に置換することによって削除し、pRR191を得た(
第5図を参照)。これらの構築を第5図に示す。別のブラスミ)”pRR190
はpRR]、91に類似しているが、軽鎖遺伝子の3°末端に90bpの非暗号
真核性DNAを含有している。
シグナル配列プロセッシング部位に5stl制限部位、部位指向性の突然変異誘
発によって導入されアミノ酸226のところに終止コドンを創製するBclI部
位、および遺伝子の下流に唯一のBamH[制限部位を含有する無傷のし6キメ
ラFd遺伝子を、酵母発現プラスミドpING1406から880bpのDNA
フラグメントとして切り出した(第6図)。このDNAフラグメントをプラスミ
ドpRR175中に挿入し、lacプロモーターの下流のpelBリーダー配列
とL6 Fd遺伝子からなるフレーム内融合体pRR178−5を得た。
pRR178−5に含まれる配列の5゛および3°の両末端から非暗号配列を削
除するために多数の誘導体を構築した。3°非暗号配列は、酵母中でのL6Fd
の発現を最適にしたプラスミドpl NG 1428(Fd遺伝子の終止コドン
にすぐ続いてXholリンカ−を含有している)からの制限フラグメントを置換
することによって削除し、プラスミドpRR186を得た(第6図)。リーダー
配列から−48のところのNde1部位の上流のE 、 carotovora
のDNA配列の除去によってプラスミドpRR196を得た。これらプラスミド
の構築を第6図に示す。
細菌誘導のFabを産生させるためには、軽鎖およびFdの両方が同時に細胞内
に産生されることが必要である。これら遺伝子のそれぞれを用いて別々に構築し
たプラスミドを用い、1個のプロモーターから両方の遺伝子が転写されるように
並べられた両遺伝子含有の一連の発現ベクターを構築した。これは、2つの遺伝
子の間の非暗号DNAを60bpまて最少化するような方法で行った。それぞれ
の遺伝子は、翻訳開始に必要なリポソーム結合部位、および−48からpelB
リーター:、抗体遺伝子連結点までの同じDNA配列を有している。2つの遺伝
子を一緒に並べるためにはいくつかのクローニング工程が必要であった。pRR
180−2中のpelBリーダーに結合した軽鎖遺伝子の一部をpRR186中
のFd遺伝子の下流にクローンしてpFKlooを得た。軽鎖遺伝子の残りをp
RR177−8からpFKlooにサブクローンしてpFKlolを得た。同様
に、pRR190およびpRR191からの真核性配列の3°欠失を含むDNA
フラグメントをpFKlolにクローンしてそれぞれpFK103およびpF
K 102を得た。pRR192およびpFKlolからのDNAフラグメント
を連結し、Fd遺伝子から一48bpの上流の配列の欠失を含むpFK104を
得た。これらプラスミド中のFdおよび軽鎖遺伝子カセットの地図を第8図に示
す。プラス、、 トpFK102は、ベクターpUc18中のlacプロモータ
ーの支配下に連続してクローンされたFdおよび軽鎖遺伝子を含有している。犬
腸閤株、例えばJ M ] 03 F ’ 1aciQ [Messing e
t al、、Nucl、Ac1ds Res、 9− : 309.1981]
においては、ペリプラズムに蓄積する軽鎖の量は、Iacプロモーター誘導物質
イソプロピルB−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)によって影響されな
い。さらに、細菌の増殖は比較的遅<(pUc18を含む細胞に比べて)、細菌
コロニーは小さく、乾燥した、そして雑な、形態の変化を示す。このことは、構
成的な外来遺伝子の発現が細胞増殖にとって有害であることを示唆している。こ
の遺伝子カセットをもっと緊密に調節されるプロモーターのもとに配置するため
に2つの方法を用いた。
第1には、pFK104からのPst I −EcoRT 7ラグメントをpI
T206に連結して、Fdおよび軽鎖遺伝子カセットを、その特徴がよく調へら
れている大腸菌における強力なプロモーターであるSalmonella ty
phimurium araBプロモーターの直接支配のもとに置いた。plT
206の制限地図およびp17104の構築を第7図に示す。細菌遺伝子の発現
のためにara Bプロモーターおよびその調節タンパク質Aracを用いるこ
とは、米国特許出願N o、 695.309(1985年1月28日出願)、
およびN o、 797.472(1985年11月13日出願)に記載されて
いる。得られたプラスミドplT104は、培養増殖培地へのアラビノースの添
加によって軽鎖の合成について調節されている。アラピ/−スの添加によって少
なくとも10倍の誘導が為される。増殖培地に分泌されるFabは10倍以上に
増加するが、細胞の増殖はアラビノースによる誘導の後に停止する。このことは
、Fab遺伝子の高レベルの発現が細胞増殖にとって有害であることを示すもの
である。plT104を保持している細菌コロニーは、アラビノースの非存在下
で増殖させたとき、表現型によってはpIT206を保持している大腸菌と区別
することができない。
第2には、IacプロモーターのリプレッサーであるIaci遺伝子を含有して
いるDNAフラグメントを高コピー発現ベクターpFKI02にクローンした。
高コピー数ベクターからの1aciの発現は、高コピー数ベクター上でのIac
プロモーターの発現を調節するのに有用である[Ru5sel et al、、
Plasmid、 in press(1987) ; Hsuing et
al、。
kbのEcoRIフラグメントを切り出し、T4ポリメラーゼで充填して平滑末
端にし、PStIリンカ−と連結し、そしてpFK102の唯一のPst1部位
にクローンしてpF K 1021aciを得た。pFK1021aciの地図
を第7図に示す。正しいクローンを同定するために用いた選択方法は、得られた
プラスミドpF K 1021aciがa能的に抑制されたlacプロモーター
を含有していることを確実にした。
MacConkey−ラクトースプレート上で白色または淡いピンクである全て
のコロニーは1aci挿入体を有するプラスミドを含んでおり、一方、pFK1
02だけを含有している形質転換体は赤色であり、高コピー数1mci遺伝子に
よるlacプロモーターの機能的な抑制を示した。第3表は、pF K 102
1aciを含有する細胞からの細菌性Fabの発現がpFK102からの発現に
類似していることを示すものである。異iなコロニーを形成し、ブロス培養でゆ
っくりと増殖するpFK102含有の細胞とは異なり、pFK1021aci含
有の細胞はpUc18含有の細胞に似ている。
6.4.3.細菌産生のFABの発現および精製通常の大腸菌形質転換法によっ
て、プラスミドDNAを大腸菌JM103またはMC1061のいずれかに導入
した。細菌培養物を、適当な抗生物質(ペニシリン250μ9/ 112または
テトラサイクリン15μ?/112)を追加したTYE[トリプトン1.5%、
酵母エキス1゜0%、およびNaCQ O,5%]中で増殖させた。5R(l〜
112の容量中、37℃で光学密度0D600=0.8(約4xlO@細胞/l
ρ)になるまで細菌培養物を増殖させ、その一部をIPTG(0,2mM)、ラ
クトース(1,0%)またはアラビノース(1,0%)で誘導した。培養物をさ
らに4〜21時間増殖させた。それぞれの培養物の一部を軽鎖産生について分析
した。文献記載[Yanagida et al、 、 1986. J、 B
acteriol、 166 : 937]のように浸透圧ショックによって大
腸菌細胞の細胞周辺腔からタンパク質を放出させた。これとは別に、培養上清を
抗体鎖の存在について直接検定した。
L6軽鎖の定量は、ヤギ抗−ヒトに軽鎖抗体(にl)を用いるELISAによっ
た。Fdは、マウスモノクローナル抗−ヒトFd抗体(Calbiochem)
ヲ用イるELISAによって検出することができた。第2表は、大腸菌培養上清
中の軽鎖反応性物質の発現についての代表的データを示すものである。これは大
腸菌中で発現される真核性タンパク質の特有の性質であるかもしれないが、ある
種の条件下では、細菌性タンパク質が大腸菌から放出されることが知られている
[^brahmsen et at、 、 1186. NAR14: 74g
?−7500 ; Pages et al、 、 1986. JA Ba
cteriol、 16ト13883゜第3表は、ペリプラズム中に分泌された
軽鎖の量を培養上清中の量と比較するものである。軽鎖反応性物質は、クローン
した軽鎖単独または軽鎖とFdを保持するプラスミド含有培養物中に存在する。
Fabの最良の産生体(pFK102およびpFK 1021aci)は、通常
、培養培地中に300−1000ny/z(lのELISA反応性軽鎖を排出す
る。
!z嚢大大腸ペリプラズムからの軽鎖の定量プラスミド n9/培養物肩ρ
pRR17500
pRR177−88,511
pRR180399412
大腸菌JM103またはMC1061(結果は類似)をそれぞれのプラスミドで
形質転換した。0D600=0.8になるまで新鮮な形質転換体をTYE中、3
7°Cで培養した。培養物を分割し、誘導物質(IPTG)を0.2+nMて加
えた(−または+ IPTG)。細胞を37°Cで4時間増殖させた。ペリプラ
ズムタンパク質抽出物を調製し、その一部を、ヤギ抗ヒトに抗体を用いるELI
SAにより軽鎖について試験した。それぞれの値は少なくとも2回の独立した実
験の平均である。抗体遺伝子の5′および3“の非暗号配列の除去は、ペリプラ
ズムにおける軽鎖の蓄積の増加に有効であった。
pRR1900nd 200 nd*
pRR190+ 5 188 241 ndpFK102 12 nd 68
ndpFK102 + 57 828 55 40pFK1021aci 25
360 50 100*nd・測定せず
プラスミド含有の大腸菌株を増殖させ、調製し、そして検定した。
pRR190、pFKl○2、およびpFK1021aciについて、細胞を0
.2mM IPTGで誘導した。それぞれの値は少なくとも2回の独立した実験
の平均である。大腸菌培養上清の分析のためには、細菌を遠心によって除き、培
養上清を0.45μlのフィルターに通した。数値はni+/培養物x(lで表
す。
B、細菌産生の軽鎖およびFdの5DS−PAGE細菌によって生産された抗体
鎖を、還元および非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析
した。溶解した全細菌細胞のタンパク質抽出物、浸透圧ショックによって細胞周
辺腔から放出させたタンパク質、および培養上清中に排出されたタンパク質を分
析した。ウェスタン分析による完全な還元条件下でのケル分離タンパク質のニト
ロセルロースへの移動およびヤギ抗−ヒト軽鎖抗体を用いる免疫学的染色は、真
正のし6キメラ軽鎖と同一の分子量のタンパク質が存在することを明らかにした
(約23Kd)。非還元ポリアクリルアミド電気泳動条件下でのタンパク質試料
の分析は、軽鎖遺伝子単独を有するプラスミド(pRR191またはpRR19
0)を保持している細胞由来の抽出物が、より大きい分子量形態を予想させる高
い比率の軽鎖反応性物質を含んでいることを示した。この物質の多くは約46K
dで移動し、軽鎖の二量体のようである。軽鎖二量体は軽鎖だけを産生ずるミエ
ローマ細胞で観察されていた。また、他の免疫反応性のタンパク質バンドも存在
し、これは軽鎖と大腸菌タンパク質の間の非特異的なジスルフィド結合形成を示
すものであろう。軽鎖およびFd遺伝子の両方を保持している大腸菌細胞からの
タンパク質試料(ペリプラズム抽出物または培養上清)は、非還元ゲル条件下で
分離したときに、約48Kdのところに軽鎖反応性バンドを含んでおり、これは
細菌性の軽鎖二量体よりもわずかに高い分子量のところで移動する。この物質は
細菌産生のL6キメラFabである。pF K 1021aciまたはpFK1
02を保持している大腸菌においては、非還元条件下で移動するポリアクリルア
ミドゲル上で観察される48Kdのバンドが、最も主要な免疫反応性の種である
。
さらに、軽鎖だけを含有している抽出物で観察される免疫反応性タンパク質のバ
ックグラウンド塗抹は、軽鎖とFdの両方を含有している細胞からの抽出物にお
いては大きく減少していた。
C9細菌産生のFabの精製
免疫学的に、および機能的に活性な細菌性F ab(以下を参照)を、pF K
1021aciまたはp+T104を保持している大腸菌の培養上清またはべ
りブラズムタンパク質抽出物のどちらかから精製した。
ペリプラズム物質の精製のためには、4時間誘導した細胞(112)からペリプ
ラズム分画を蒸留水(50112)中に放出させた。この物質を5000xpで
20分間遠心し、0.45μmのフィルターに通した。
次ニ、コノヘリプラズム抽出物をYMIOメンプラン(Amicon) テ濃縮
して約5xQにした。この物質を出発緩衝液[IQsMKオHPO,、pH7,
5]で8倍に希釈し、1 、0 I(2/分の流速のS −S epharos
eカラム< i xa>にかげた。このカラムを出発緩衝液(25xQ)で洗浄
し、出発緩衝液中のO〜200+M NaCl2勾配液(合計容量200 m+
2)で溶離した。免疫反応性の勾配ピークを集め(溶出は約100−Mのところ
)、Centricon 10で濃縮した。精製したFabはPBS+2゜0%
BSA中で保存した。
細菌培養上清(IC)からの分泌Fabの精製のためには、誘導物質と共に21
時間増殖させた後に細胞を遠心によって除去し、その上清を0.45μ肩のフィ
ルターで濾過した。この培地をYMIOメンプラン(八s+1con)で濃縮し
て約16112とし、次いでlQmMK、HFO2で希釈して105112にし
た。この物質をS −S epharoseカラム(1、6xQ)にかけ、40
1(lの0〜200mM NaCQ勾配液で溶離した。
S −8epharoseクロマトグラフィーから回収したFabは、非還元の
Coomasgie染色した10%アクリルアミドゲルのデンシトメトリー追跡
によって測定すると70%以上の純度であった。DNA配列に基づ<Fdと軽鎖
の分子量は24.5Kdおよび23Kdであり、観察されたタンパク質の大きさ
によく一致している。2つのバンドの小さい方は、ウェスタン・プロットでヤギ
抗−ヒトに軽鎖抗血清と強く反応した。細胞周辺腔または細菌培養上清から精製
した細菌性Fabは、ここで試験した全ての分析尺度によって区別することがで
きなS −3epharoseクロマトグラフィーによって精製した細菌産生の
Fabを、L6抗原含有の細胞に対する結合について試験した。第4表に示すよ
うに、細菌性Fabはヒト結腸癌セルラインH3347に特異的に結合した。T
細胞セルラインT51からの細胞を陰性対照として用いた。標的細胞を、細菌産
生のL6キメラFab、5p210細胞中に産生させた無傷のし6キメラ抗体、
あるいはマウスの腹水から精製したマウス上6抗体と、4°Cで30分間インキ
ュベートした。これに続いて、Fab検出のためにはF ITC−ラベルしたヤ
ギ抗−ヒト軽鎖抗体と、キメラ抗体検出のためにはFITC−ラベルしたヤギ抗
−ヒト免疫グロブリンと、あるいはマウス抗体検出のためにはFITC−ラベル
したヤギ抗−ネズミ免疫グロブリンと共にインキユベートした。細胞表面への抗
体の結合をCoulter E P I C−C型細胞ソーターを用いて測定し
た。
また、細菌産生のFabは、5p210産生のキメラム6抗体と同一かつ特徴的
な、抗原ポジティブな3347結腸癌細胞の表面へのFITC−ラベルのマウス
上6抗体の結合の抑制を示す。細菌性のFabおよび5p210由来のキメラL
6は本質的に同一の結合抑制プロフィールを有しており、このことは、細菌性F
abと5p210由来のキメラL6の結合活性が同一であることを示唆する。
鼻土ス細菌性Fabの結合検定
抗 体 結合比ネ
H3347細胞 T51細胞
標準マウスL6 95 1
Sp210 キメラL6 116 1
細菌性L6Fab 54 1
標準L6Fab 16 1
*結合比は、FITC−コンジュゲートした第2の抗体で処理した対照試料より
も輝いている試験試料の倍数である。
標準のL6Fabは、マウス上6抗体の酵素消化によって調製した。
Qmnr
ヨ E 薙 百 ■J藩
ヨ 6 ”= H21コ基
5 巨 式 1 !嚢 H
E ジ 巨 3 ■ ぎ属
E 7 口 茗 ■ ぎ包
“ 4 グ 自ヨ
<hh
ト !4 の
定 =i: 定 −0
CJ !4 14 a 28
5 鰐 目 箇 1
・ 21 11と
ゴ ペ の
υ ロ ト
Q ト ト 1 !号
ua
ご 乏 r、’i !E
@4 ロ −
FIG、 3
国際調査報告
bu@lA++1lllIlal^”””””’ PCT/US89/G007
7
Claims (56)
- 1.実質的にペクチン酸リアーゼのシグナルペプチドをコードしているDNA配 列からなるフラグメントを含有していることを特徴とする、細菌宿主の形質転換 に有用な組換えベクター。
- 2.該ペクチン酸リアーゼのシグナル配列に隣接して非宿主タンパク質をコード しているDNA配列をさらに含有している請求項1記載のベクター。
- 3.宿主中で該タンパク質を発現するように、該シグナルおよびタンパク質配列 と関係させて設置したDNAプロモーター配列をさらに含有している請求項2記 載のベクター。
- 4.宿主がグラム陰性細菌である請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。
- 5.宿主が大腸菌である請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。
- 6.プラスミドである請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。
- 7.プラスミドpING173である請求項1記載のベクター。
- 8.タンパク質がタウマチンである請求項2または3記載のベクター。
- 9.タンパク質が抗体またはそのフラグメントである請求項2または3記載のベ クター。
- 10.ペクチン酸リアーゼがErwinia carotovoraのペクチン 酸リアーゼBである請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。
- 11.プロモーターがaraBADまたは1acプロモーターである請求項5記 載のベクター。
- 12.プラスミドpING177−1またはその誘導体である請求項8記載のベ クター。
- 13.プラスミドpRR177−8またはその誘導体である請求項9記載のベク ター。
- 14.プラスミドpRR178−5またはその誘導体である請求項9記載のベク ター。
- 15.請求項1記載のベクターを含有する細菌宿主。
- 16.請求項2記載のベクターを含有する細菌宿主。
- 17.請求項3記載のベクターを含有する細菌宿主。
- 18.グラム陰性細菌である請求項15〜17のいずれかに記載の宿主。
- 19.大腸菌である請求項15〜17のいずれかに記載の宿主。
- 20.ベクターがプラスミドである請求項15〜17のいずれかに記載の宿主。
- 21.タンパク質がタウマチンである請求項16または17記載の宿主。
- 22.タンパク質が抗体またはそのフラグメントである請求項16または17記 載の宿主。
- 23.ペクチン酸リアーゼがErwinia carotovoraのペクチン 酸リアーゼBである請求項15〜20のいずれか記載の宿主。
- 24.プロモーターがaraBADまたはIacプロモーターである請求項23 記載の宿主。
- 25.プラスミドpING173またはその誘導体である請求項18記載の宿主 。
- 26.プラスミドpING173またはその誘導体である請求項19記載の宿主 。
- 27.受託番号NRRLで同定される請求項26記載の宿主。
- 28.プラスミドpING173−1またはその誘導体を含有する請求項21記 載の宿主。
- 29.プラスミドpING177−8またはその誘導体を含有する請求項22記 載の宿主。
- 30.プラスミドpRR178−5またはその誘導体を含有する請求項22記載 の宿主。
- 31.菌株706、MC1061またはJM103である請求項19記載の宿主 。
- 32.タンパク質をコードしているDNA配列およびプロモーターDNA配列を 含有する組換えベクターで宿主を形質転換することからなる細菌宿主においてタ ンパク質を製造するための方法であって、該タンパク質配列と該プロモーター配 列の間にペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含有している組換えベクターを用 いることを特徴とする方法。
- 33.宿主がグラム陰性細菌である請求項32記載の方法。
- 34.宿主が大腸菌である請求項32記載の方法。
- 35.ベクターがプラスミドである請求項32記載の方法。
- 36.タンパク質がタウマチンである請求項32〜35のいずれかに記載の方法 。
- 37.タンパク質が抗体またはそのフラグメントである請求項32〜35のいず れかに記載の方法。
- 38.ペクチン酸リアーゼがErwinia carotovoraのペクチン 酸リアーゼBである請求項32〜35のいずれかに記載の方法。
- 39.プロモーターがaraBADまたはIacプロモーターである請求項32 〜35のいずれかに記載の方法。
- 40.プラスミドがpING177−1またはその誘導体である請求項36記載 の方法。
- 41.プラスミドがpING177−8またはその誘導体である請求項37記載 の方法。
- 42.プラスミドがpRR178−5またはその誘導体である請求項37記載の 方法。
- 43.宿主の細胞質からタンパク質を排出させるための方法であって、非宿主タ ンパク質DNA配列に隣接してペクチン酸リアーゼのシグナルDNA配列、なら びに宿主中で該タンパク質を発現させるように該シグナルおよびタンパク質配列 に関係させて設置したプロモーターDNA配列を含有するプラスミドを含む宿主 を適切な培養培地で培養することを特徴とする方法。
- 44.宿主がグラム陰性細菌である請求項43記載の方法。
- 45.宿主が大腸菌である請求項43記載の方法。
- 46.ベクターがプラスミドである請求項43記載の方法。
- 47.タンパク質がタウマチンである請求項43〜46のいずれかに記載の方法 。
- 48.ペクチン酸リアーゼがErwinia carotovoraのペクチン 酸リアーゼBである請求項43〜46のいずれかに記載の方法。
- 49.プロモーターがaraBADまたはIacプロモーターである請求項43 〜46のいずれかに記載の方法。
- 50.大腸菌が菌株MC1061、JM103または706である請求項44記 載の方法。
- 51.プラスミドがpING177−1またはその誘導体である請求項45記載 の方法。
- 52.プラスミドがpING177−8またはその誘導体である請求項47記載 の方法。
- 53.プラスミドがpRR178−5またはその誘導体である請求項47記載の 方法。
- 54.ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド、またはその突然変異体もしくは 組換え体をコードしている精製遺伝子配列。
- 55.ペクチン酸リアーゼがErwinia carotovoraのペクチン 酸リアーゼBである請求項54記載の配列。
- 56.第2A図に示される請求項54記載の配列。
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