KR20240034218A - 항-tnf 항체 조성물을 생산하기 위한 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법에 관한 것이다.
Description
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 파일명이 "JBI6003 SequenceListing 07072022"이고, 생성일이 2022년 7월 6일이고, 크기가 57 kb인 XML 포맷 서열 목록으로서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고, 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS: drug substance) 또는 약물 제품(DP: drug product)을 생산하기 위한 제조 방법에 관한 것이다.
TNF 알파는 17 kD 단백질 서브유닛의 가용성 동종삼량체이다. 막-결합된 26 kD 전구체 형태의 TNF가 또한 존재한다.
단핵구 또는 대식세포 이외의 세포 또한 TNF 알파를 생산한다. 예를 들어, 인간 비-단핵구성 종양 세포주는 TNF 알파 및 CD4+ 및 CD8+ 말초 혈액 T 림프구를 생산하며, 일부 배양된 T 및 B 세포주 또한 TNF 알파를 생산한다.
TNF 알파는 연골 및 뼈의 분해와 같은 조직 손상, 부착 분자의 유도, 혈관 내피 세포에 대한 응혈촉진 활성 유도, 호중구 및 림프구의 부착의 증가, 및 대식세포, 호중구, 및 혈관 내피 세포로부터의 혈소판 활성화 인자의 방출의 자극을 유발하는 염증 촉진 작용을 야기한다.
TNF 알파는 감염, 면역 장애, 신생물 병리학, 자가면역 병리학, 및 이식편-대-숙주 병리학과 관련되어 있다. TNF 알파와 암 및 감염성 병리학의 연계는 종종 숙주의 이화 상태와 관련된다. 암 환자는 일반적으로 거식증과 관련된 체중 감소를 겪는다.
암 및 다른 질환과 관련된 광범위한 소모는 "악액질"로 알려져 있다. 악액질은 악성 성장에 반응하는 진행성 체중 감소, 거식증, 및 제지방 체중(lean body mass)의 지속적인 잠식을 포함한다. 악액질 상태는 많은 암 이환률 및 사망률을 야기한다. TNF 알파가 암, 감염성 병리학, 및 다른 이화 상태에서 악액질에 관여한다는 증거가 있다.
TNF 알파는 발열, 권태감, 거식증, 및 악액질을 포함하는 그램-음성 패혈증 및 내독소 쇼크(endotoxic shock)에서 중심 역할을 하는 것으로 여겨진다. 내독소는 TNF 알파 및 다른 사이토카인의 단핵구/대식세포 생산 및 분비를 강력하게 활성화한다. TNF 알파 및 다른 단핵구-유래 사이토카인은 내독소에 대한 대사 및 신경호르몬 반응을 매개한다. 인간 지원자에 대한 내독소 투여는 발열, 빈맥, 증가된 대사 속도, 및 스트레스 호르몬 방출을 포함하는 플루형 증상을 동반하는 급성 질병을 유발한다. 그램-음성 패혈증을 앓고 있는 환자에서는 순환 TNF 알파가 증가한다.
따라서, TNF 알파는 염증성 질환, 자가면역 질환, 바이러스, 박테리아, 및 기생충 감염, 악성종양, 및/또는 신경퇴행성 질환에 연루되어 있으며, 류마티스 관절염 및 크론병과 같은 질환에서 특이적 생물학적 요법에 대한 유용한 표적이다. TNF 알파에 대한 단클론 항체를 이용하는 개방-표지 시험에서의 유익한 효과가 염증의 억제와 함께, 그리고 류마티스 관절염 및 크론병에서의 재발 후 성공적인 재치료와 함께 보고되었다. 무작위 이중-맹검 위약-대조 시험에서의 유익한 결과가 또한 염증의 억제와 함께 류마티스 관절염에서 보고되었다.
인간 이외의 포유류에서 TNF에 대한 중화 항혈청 또는 mAb는 실험적 내독소혈증 및 균혈증에서 유해한 생리학적 변화를 제거하고 치명적인 챌린지 후의 사망을 예방하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는, 예를 들어 설치류 치사 검정 및 영장류 병리학 모델 시스템에서 입증되었다.
hTNF의 추정 수용체 결합 좌위(receptor binding loci)가 개시되어 있으며, TNF의 아미노산 11 내지 13, 37 내지 42, 49 내지 57, 및 155 내지 157로 이루어진 TNF 알파의 수용체 결합 좌위가 개시되어 있다.
인간외 포유류, 키메라, 다클론(예를 들어, 항-혈청) 및/또는 단클론 항체(Mab) 및 단편(예를 들어, 이의 단백질 분해 또는 융합 단백질 생산물)은 일부 경우에 소정의 질환을 치료하고자 시도하기 위해 조사되고 있는 잠재적인 치료제이다. 그러나, 그러한 항체 또는 단편은 인간에게 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러한 면역 반응은 순환으로부터의 항체 또는 단편의 면역 복합체-매개 제거(immune complex-mediated clearance)를 유발하고, 반복 투여를 치료에 부적합하게 하여, 환자에 대한 치료적 유용성을 감소시키고 항체 또는 단편의 투여를 제한할 수 있다. 예를 들어, 인간외 부분을 포함하는 항체 또는 단편의 반복된 투여는 혈청 병 및/또는 아나필락시스로 이어질 수 있다. 이들 및 다른 문제를 피하기 위하여, 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 키메라화 및 인간화를 포함하는, 그러한 항체 및 이의 부분의 면역원성을 감소시키기 위한 다수의 접근법이 취해졌다. 그러나, 이들 및 다른 접근법은 여전히 일부 면역원성, 낮은 친화도, 낮은 결합활성을 갖거나, 세포 배양, 스케일 업(scale up), 생산, 및/또는 낮은 수율의 문제를 갖는 항체 또는 단편을 유발할 수 있다. 따라서, 그러한 항체 또는 단편은 치료 단백질로서 제조 또는 사용하기에 이상적으로 적합하지 못할 수 있다.
따라서, TNF 알파에 의해 매개되는 질환의 치료를 위한 치료제로서 사용하기 위한 항-TNF 항체 또는 그의 단편을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, 항-TNF 항체는 후속 생물학적 제제(follow-on biologic)인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, 탈아미드화된 HC Asn43은 ≤ 30% isoAsp43인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 탈아미드화는 항-TNF 항체의 엔도프로테이나제 Lys-C 소화를 사용하는 질량 분광계 펩티드 맵핑에 의해 결정되는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, DS 또는 DP의 모세관 등전점 집속(cIEF) 전기영동도는 C, 1, 2 및 3으로 확인되는 피크에 상응하는 4개의 주요(major) cIEF 피크 및 A 및 B로 확인되는 피크에 상응하는 2개의 부수적(minor) cIEF 피크를 포함하고, 4개의 주요 피크의 면적 %의 합은 ≥ 91%이고, 피크 3의 면적 % = 12 내지 33%, 피크 2의 면적 % = 34 내지 43%, 피크 1의 면적 % = 17 내지 33%, 피크 C의 면적 % = 5 내지 15%이고, 피크 B의 면적 %는 ≤ 6%인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, 방법은 pH 8에서 완료되는 합친 스테이지에 대해 70 내지 90시간의 제조 작업 범위(MOR) 및 115시간 미만의 최대 시간 제한을 포함하는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 음이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 및 바이러스 체류용 필터링 스테이지를 포함하는 3개 스테이지를 포함하고, 합친 3개 스테이지에 대해 제조 작업 범위(MOR)는 70 내지 90시간이고 최대 시간 제한은 115시간 미만인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, 방법은 2 내지 8℃에서 21일의 수확된 세포에 대한 최대 유지 시간을 포함하고, 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 음이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 및 바이러스 체류용 필터링 스테이지를 포함하는 3개 스테이지를 포함하고, 합친 3개 스테이지에 대하여 제조 작업 범위(MOR)는 70 내지 90시간이고 최대 시간 제한은 115시간 미만인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되고, 방법은 2 내지 8℃에서 21일의 수확된 세포에 대한 최대 유지 시간을 포함하고, 방법은 UNOsphere S 컬럼을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피 스테이지, Q Sepharose XL(QXL) 컬럼을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 및 NFP™ 필터를 사용한 바이러스 체류용 필터링 스테이지를 포함하는 3개 스테이지를 포함하고, 합친 3개 스테이지에 대해 제어된 실온(15 내지 24℃)에서의 제조 작업 범위(MOR)는 70 내지 90시간이고 최대 시간 제한은 115시간 미만인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 DS 또는 DP로서, 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하고, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, 총 탈아미드화는 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%인, DS 또는 DP를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 DS 또는 DP로서, 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하고, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, 총 탈아미드화는 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이고, 항-TNF 항체는 후속 생물학적 제제인, DS 또는 DP를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 DS 또는 DP로서, 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하고, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, 총 탈아미드화는 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이고, 탈아미드화된 HC Asn43은 ≤ 30% isoAsp43인, DS 또는 DP를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 DS 또는 DP로서, 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하고, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, 총 탈아미드화는 HC Asn43의 경우 ≤ 79%, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이고, DS 또는 DP의 cIEF 전기영동도는 C, 1, 2 및 3으로 확인되는 피크에 상응하는 4개의 주요 cIEF 피크 및 A 및 B로 확인되는 피크에 상응하는 2개의 부수적 cIEF 피크를 포함하고, 4개의 주요 피크의 면적 %의 합은 ≥ 91%이고, 피크 3의 면적 % = 12 내지 33%, 피크 2의 면적 % = 34 내지 43%, 피크 1의 면적 % = 17 내지 33%, 피크 C의 면적 % = 5 내지 15%이고, 피크 B의 면적 %는 ≤ 6%인, DS 또는 DP를 제공한다.
도 1은 재조합 TNF 수용체에 대한 TNFα 결합을 억제하기 위한 하이브리도마 세포 상청액에서의 TNV mAb의 능력에 대한 검정을 나타내는 도해적 표현을 나타낸다. 알려진 양의 TNV mAb를 함유하는 다양한 양의 하이브리도마 세포 상청액을 고정된 농도(5 ng/ml)의 125I-표지된 TNFα와 함께 사전 인큐베이션하였다. 재조합 TNF 수용체/IgG 융합 단백질인 p55-sf2로 사전에 코팅된 96-웰 Optiplate에 혼합물을 이전하였다. 미결합 재료를 세척해내고 감마 계수기를 사용하여 계수한 후에 mAb의 존재 하에 p55 수용체에 결합된 TNFα의 양을 결정하였다. 이들 실험에서는 8개의 TNV mAb 샘플을 시험하였지만, 간략함을 위해, DNA 서열 분석에 의해 다른 TNV mAb 중 하나와 동일한 것으로 나타난 3개의 mAb(섹션 5.2.2 참조)는 여기에 나타내지 않는다. 각각의 샘플을 이중실험으로 시험하였다. 결과는 2회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 2a 및 도 2b는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포계열 유전자는 DP-46 유전자이다. 'TNVs'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196의 서열임을 나타낸다. TNV 서열 내의 최초 3개의 뉴클레오티드는 번역 개시 Met 코돈을 정의한다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포계열 서열에서와 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 최초 19개 뉴클레오티드(밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb로 시작하는 아미노산 번역(1문자 약어)은 생식세포계열 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포계열 아미노산 번역에서 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시된다. TNV148(B)로 표지된 선은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 DNA 서열(CDR3) 내의 갭은 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않는 서열에 기인한다. TNV mAb 중쇄는 J6 결합 영역을 사용한다.
도 3은 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포계열 유전자는 인간 카파 생식세포계열 가변 영역 유전자의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 구성원이다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포계열 서열에서와 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 최초 16개 뉴클레오티드(밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb의 아미노산 번역(1문자 약어)은 생식세포계열 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포계열 아미노산 번역에서 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시된다. TNV148(B)로 표지된 선은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 DNA 서열(CDR3) 내의 갭은 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않는 서열에 기인한다. TNV mAb 경쇄는 J3 결합 서열을 사용한다.
도 4는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 생산물 및 클로닝된 PCR 생산물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추정하였다. 아미노 서열은 분비 신호 서열(신호), 프레임워크(FW), 및 상보성 결정 영역(CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. DP-46 생식세포계열 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포계열 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)는 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 상이한 서열을 나타내지 않는 한, 'TNVs'는 나타낸 서열이 모든 TNV mAb에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 서열(CDR3) 내의 대시는 서열이 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않음을 나타낸다.
도 5는 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 생산물 및 클로닝된 PCR 생산물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추정하였다. 아미노 서열은 분비 신호 서열(신호), 프레임워크(FW), 및 상보성 결정 영역(CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. Vg/38K-유형 경쇄 생식세포계열 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포계열 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. '전부'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B, 및 TNV186에 관련됨을 나타낸다.
도 6은 rTNV148B 발현 C466 세포를 제조하는 데 사용된 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드의 개략도를 나타낸다. p1783은 중쇄 플라스미드이고 p1776은 경쇄 플라스미드이다. rTNV148B 가변 영역 및 불변 영역 코딩 도메인은 흑색 박스로 나타낸다. J-C 인트론 내의 면역글로불린 인핸서는 회색 박스로 나타낸다. 관련 제한 부위를 나타낸다. 플라스미드는 Ab 유전자의 전사가 시계방향으로 진행되도록 배향하여 나타낸다. 플라스미드 p1783은 길이가 19.53 kb이고 플라스미드 p1776은 길이가 15.06 kb이다. 둘 모두의 플라스미드의 완전한 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. p1783 내의 가변 영역 코딩 서열은 BsiWI/BstBI 제한 단편을 대체함으로써 다른 중쇄 가변 영역 서열로 용이하게 대체될 수 있다. p1776 내의 가변 영역 코딩 서열은 SalI/AflII 제한 단편을 대체함으로써 다른 가변 영역 서열로 대체될 수 있다.
도 7은 5개의 rTNV148B-생산 세포주의 성장 곡선 분석의 도해적 표현을 나타낸다. 30 ml 부피 내에 1.0 × 105 세포/ml의 생존가능한 세포 밀도를 갖도록 I5Q+ MHX 배지 중에 T75 플라스크 내로 세포를 시딩함으로써 0일차에 배양을 개시하였다. 이들 연구에 사용된 세포 배양물은 형질주입 및 서브클로닝이 수행된 이후로 연속 배양되었다. 후속 날에, T 플라스크 내의 세포를 철저히 재현탁시키고, 0.3 ml 분취량의 배양물을 취하였다. 세포 계수가 1.5 × 105 세포/ml 미만으로 하락했을 때 성장 곡선 연구를 종료하였다. 분취물 내의 생존 세포의 수를 트리판 블루 배제에 의해 결정하였고, 분취물의 나머지는 이후의 mAb 농도 결정을 위해 저장하였다. 모든 샘플 분취물에 대해 인간 IgG에 대한 ELISA를 동시에 수행하였다.
도 8은 다양한 농도의 MHX 선택의 존재 하에 세포 성장 속도의 비교의 도해적 표현을 나타낸다. 세포 서브클론 C466A 및 C466B를 MHX가 없는 배지(IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민) 내로 해동시키고, 추가로 2일 동안 배양하였다. 이어서, 둘 모두의 세포 배양물을 MHX 없음, 0.2X MHX, 또는 1X MHX 중 어느 하나를 함유하는 3개의 배양물로 분할하였다. 1일 후에, 새로운 T75 플라스크에 1 × 105 세포/ml의 출발 밀도로 배양물을 시딩하고, 세포를 24시간 간격으로 1주 동안 계수하였다. 최초 5일 동안의 배가 시간을 SOP PD32.025의 수학식을 사용하여 계산하였고, 바 위에 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 2개의 rTNV148B-생산 세포주로부터의 시간 경과에 따른 mAb 생산의 안정성의 도해적 표현을 나타낸다. 형질주입 및 서브클로닝을 수행한 이후로 연속 배양 중이었던 세포 서브클론을 사용하여 24-웰 배양 접시에서 장기 연속 배양을 시작하였다. MHX 선택의 존재 및 부재 하에 I5Q 배지 중에 세포를 배양하였다. 4 내지 6일마다 배양물을 분할함으로써 세포를 지속적으로 계대배양하여, 이전의 배양물이 소모되게 하는 동안 새로운 생존가능한 배양물을 유지하였다. 배양물이 소모된 직후에, 소모된 세포 상청액의 분취물을 수집하고, mAb 농도가 결정될 때까지 저장하였다. 모든 샘플 분취물에 대해 인간 IgG에 대한 ELISA를 동시에 수행하였다.
도 10은 실시예 4의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 본 발명의 항-TNF 항체(TNV14, TNV148, 또는 TNV196)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 10 mg/kg cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이러한 체중 증가는 3 내지 7주차에 유의미하였다. 10 mg/kg TNV148로 치료한 동물은 또한 연구의 7주차에 유의미한 체중 증가를 달성하였다.
도 11a 내지 도 11c는 실시예 4에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 3주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(7주차). 1 mg/kg TNV14로 치료한 동물 및 1 mg/kg cA2로 치료한 동물은, D-PBS-치료군에 비교할 때, 3주차 후에 AI의 유의미한 감소를 나타내지 못하였다. 10 mg/kg 치료군들 사이에는, 각각을 유사한 용량의 다른 것들에 비교했을 때(10 mg/kg cA2를 10 mg/kg TNV14, 148, 및 196에 비교함) 유의미한 차이가 없었다. 1 mg/kg 치료군을 비교했을 때, 1 mg/kg TNV148은 3주, 4주, 및 7주에 1 mg/kg cA2보다 유의미하게 더 낮은 AI를 나타냈다. 1 mg/kg TNV148은 또한 3주 및 4주에 1 mg/kg TNV14-치료군보다 유의미하게 더 낮았다. TNV196은 연구의 6주차까지 AI의 유의미한 감소를 나타냈지만(D-PBS-치료군에 비교할 때), 연구 종료 시에 유의미하게 유지된 유일한 1 mg/kg 치료는 TNV148이었다.
도 12는 실시예 5의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주에, 체중에 기초하여, 8개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 대조 물품(D-PBS) 또는 3 mg/kg의 항체(TNV14, TNV148)의 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다(0주차). 1, 2, 3, 및 4주차에 모든 동물에서 주사를 반복하였다. 시험 물품 효능에 대해 군 1 내지 군 6을 평가하였다. 군 7 및 군 8의 동물로부터 얻은 혈청 샘플을 2, 3, 및 4주차에 TNV14 또는 TNV148의 면역 반응 유도 및 약동학적 제거에 대해 평가하였다.
도 13a 내지 도 13c는 관절염 지수에 기초한 실시예 5에서의 질환 중증도의 진행을 나타내는 그래프이다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 유의미하게 더 낮았으며, 이는 2주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(5주차). 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 cA2로 치료한 동물 및 3 mg/kg TNV14로 치료한 동물은, d-PBS 대조군에 비교할 때, 연구 전체에 걸쳐 임의의 시점에 AI의 임의의 유의미한 감소를 달성하지 못하였다. 3 mg/kg TNV148로 치료한 동물은 d-PBS-치료군에 비교할 때 유의미한 감소를 나타냈으며, 이는 3주차에 시작하여 5주차까지 계속되었다. 10 mg/kg cA2-치료 동물은 연구의 4 및 5주차에 cA2의 더 낮은 용량(1 mg/kg 및 3 mg/kg) 둘 모두에 비교할 때 AI의 유의미한 감소를 나타냈으며, 또한 3 내지 5주차에 TNV14-치료 동물보다 유의미하게 더 낮았다. 3 mg/kg 치료군 중 임의의 것 사이에는 유의미한 차이가 없는 것으로 보였지만, 3 mg/kg TNV14로 치료한 동물에 대한 AI는 일부 시점에 10 mg/kg 보다 유의미하게 더 높았던 반면에, TNV148로 치료한 동물은 10 mg/kg의 cA2로 치료한 동물과 유의미하게 상이하지 않았다.
도 14는 실시예 6의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 6개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 3 mg/kg 또는 5 mg/kg으로 항체(cA2, 또는 TNV148)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 이 연구는 D-PBS 및 10 mg/kg cA2 대조군을 이용하였다.
도 15는 실시예 6에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 모든 치료군은 초기 시점에 일부 보호를 나타냈으며, 5 mg/kg cA2 및 5 mg/kg TNV148은 1주차 내지 3주차에 AI의 유의미한 감소를 나타냈고 모든 치료군이 2주차에 유의미한 감소를 나타냈다. 연구 후반에, 5 mg/kg cA2로 치료한 동물은 4, 6, 및 7주차에 유의미한 감소를 갖는 일부 보호를 나타냈다. cA2 및 TNV148 둘 모두의 낮은 용량(3 mg/kg)은 6주차에 유의미한 감소를 나타냈으며, 모든 치료군이 7주차에 유의미한 감소를 나타냈다. 치료군 중 어느 것도 연구 종료 시에 유의미한 감소를 유지할 수 없었다(8주차). 임의의 치료군들(식염수 대조군을 배제함) 사이에는 임의의 시점에 유의미한 차이가 없었다.
도 16은 실시예 7의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. TNV148(하이브리도마 세포로부터 유래됨) 및 rTNV148B(형질주입된 세포로부터 유래됨)의 단일 복강내 용량의 효능을 비교하기 위한 것이다. 대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/kg의 항체(TNV148 또는 rTNV148B)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다.
도 17은 실시예 7에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 4주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(8주차). TNV148-치료군 및 1 mg/kg cA2-치료군 둘 모두는 4주차에 AI의 유의미한 감소를 나타냈다. 이전의 연구(P-099-017)는 TNV148이 단일 1 mg/kg 복강내 볼루스 후에 관절염 지수를 감소시키는 데 약간 더 효과적이었음을 나타냈지만, 본 연구는 TNV 항체-치료군의 둘 모두의 버전으로부터의 AI가 약간 더 높았음을 나타냈다. 1 mg/kg cA2-치료군은 10 mg/kg cA2 군에 비교할 때 유의미하게 증가되지 않았고 TNV148-치료군은 7주차 및 8주차에 유의미하게 더 높았지만(6주차는 제외함), 연구 중 임의의 지점에 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148, 및 1 mg/kg TNV148B 사이에는 AI의 유의미한 차이가 없었다.
도 18은 골리무맙 제조 공정의 9개의 스테이지의 개요를 나타낸다.
도 19는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 전배양 및 확장 단계를 위한 스테이지 1 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 20은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 500 L 또는 1000 L 생산 생물반응기 공정 단계를 위한 스테이지 2 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 21은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 직접 생산물 포획(DPC) 단계를 위한 스테이지 3 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 22는 단백질 A 컬럼에서 용리된 골리무맙에 대한 대표적인 용리 프로파일을 나타낸다.
도 23은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, DPC 용리액의 해동 및 풀링을 위한 스테이지 4 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 24는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, DPC 용리액의 용매/세제(S/D) 처리를 위한 스테이지 5 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 25는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 골리무맙의 양이온 교환 크로마토그래피를 위한 스테이지 6 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 26은 골리무맙에 대한 대표적인 양이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 27은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 골리무맙의 양이온 교환 크로마토그래피를 위한 스테이지 7 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 28은 골리무맙에 대한 대표적인 음이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 29는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, NFP™ 바이러스 제거 여과를 위한 스테이지 8 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 30은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, FB로의 최종 한외여과/투석여과를 위한 스테이지 9 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 31은 단백질 내 아스파라긴에 대한 고리형 이미드 매개 반응을 나타내며; 도면은 문헌[(Voorter, de Haard-Hoekman et al. 1988)]에서 수정되었다.
도 32는 골리무맙의 대표적인 Lys C 펩티드 맵 크로마토그램(214 nm)을 나타낸다(CNTO 148). 관심 대상의 변성(회색) 및 모(흑색) 펩티드가 표지된다. 약 34분에서의 피크는 CNTO 148과 관련이 없다.
도 33a 내지 도 33c는 펩티드 1-58 및 1-59(좌측 패널)의 레벨의 변화를 보여주는 강제 탈아미드화 조건 하에서 0, 4, 8 및 24시간 후의 골리무맙의 펩티드 맵 분석을 보여준다. 변화는 Asn43으로부터 Asp43 및 isoAsp43으로의 탈아미드화에 의해, 그리고 isoAsp43의 Asp43으로의 이성질화에 의해 유발되었다(상단 우측 패널; 펩티드 1-58 및 1-59의 Asn, Asp, 및 isoAsp 형태의 상대 피크 면적을 사용하여 존재비를 계산하였음). 펩티드 1-58 및 1-59의 Asn43, Asp43 및 isoAsp43 형태는 질량 분석법(MS)(하부 우측 패널)에 의해 그리고 합성 Asp43 펩티드 1-58(미도시)에 대한 체류 시간 비교에 의해 확인되었다.
도 34는 C, 1, 2 및 3으로 표지된 4개의 주요 피크(major peak) 및 B로 표지된 하나의 부수적 피크(minor peak)를 갖는 골리무맙의 대표적인 cIEF 전기영동도 프로파일을 나타낸다. pI 7.6 및 9.5의 내부 표준물질이 또한 표지되어 있다.
도 35a 내지 도 35c는 스테이지 6 중간 유지의 시작부터 스테이지 8 중간 유지의 종료까지 누적 시간의 함수로서 cIEF 동형 피크 면적(%) 및 총 Asn43 탈아미드화(%)를 나타낸다. 2차(피크 3, 2 및 HC Asn43 탈아미드화) 또는 순수 선형(피크 1, C 및 B) 모델(실선), 평균과 연관된 하위 및 상위 3SD 경계(점선) 및 HC Asn43 탈아미드화에 대한 허용 기준(단속선)에서 유래된 데이터의 추정 평균이 도시되어 있다.
도 36은 골리무맙에 대한 효력과 % LC cycAsn93의 상관 분석을 나타낸다. LC cycAsn93 백분율은 탈아미드화 분석을 사용하여 측정되었다. 다양한 양의 LC cycAsn93를 사용한 상이한 배치로부터 취해진 49개의 시점에 대한 결과가 나타나 있다. 통계 분석을 시판용 소프트웨어로 수행하였으며; r은 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)이다.
도 37은 형광 검출과 함께 순상 음이온 교환 HPLC를 사용한 골리무맙 기준 표준물질의 올리고당 분석을 위한 대표적인 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 상이한 종과 관련된 피크는 표지되어 있다. *는 골리무맙과 관련되지 않은 시스템 피크를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포계열 유전자는 DP-46 유전자이다. 'TNVs'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196의 서열임을 나타낸다. TNV 서열 내의 최초 3개의 뉴클레오티드는 번역 개시 Met 코돈을 정의한다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포계열 서열에서와 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 최초 19개 뉴클레오티드(밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb로 시작하는 아미노산 번역(1문자 약어)은 생식세포계열 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포계열 아미노산 번역에서 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시된다. TNV148(B)로 표지된 선은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 DNA 서열(CDR3) 내의 갭은 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않는 서열에 기인한다. TNV mAb 중쇄는 J6 결합 영역을 사용한다.
도 3은 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포계열 유전자는 인간 카파 생식세포계열 가변 영역 유전자의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 구성원이다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포계열 서열에서와 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 최초 16개 뉴클레오티드(밑줄)는 가변 영역을 PCR-증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb의 아미노산 번역(1문자 약어)은 생식세포계열 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포계열 아미노산 번역에서 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시된다. TNV148(B)로 표지된 선은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 DNA 서열(CDR3) 내의 갭은 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않는 서열에 기인한다. TNV mAb 경쇄는 J3 결합 서열을 사용한다.
도 4는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 생산물 및 클로닝된 PCR 생산물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추정하였다. 아미노 서열은 분비 신호 서열(신호), 프레임워크(FW), 및 상보성 결정 영역(CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. DP-46 생식세포계열 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포계열 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)는 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 상이한 서열을 나타내지 않는 한, 'TNVs'는 나타낸 서열이 모든 TNV mAb에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 서열(CDR3) 내의 대시는 서열이 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않음을 나타낸다.
도 5는 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 생산물 및 클로닝된 PCR 생산물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추정하였다. 아미노 서열은 분비 신호 서열(신호), 프레임워크(FW), 및 상보성 결정 영역(CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. Vg/38K-유형 경쇄 생식세포계열 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포계열 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. '전부'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B, 및 TNV186에 관련됨을 나타낸다.
도 6은 rTNV148B 발현 C466 세포를 제조하는 데 사용된 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드의 개략도를 나타낸다. p1783은 중쇄 플라스미드이고 p1776은 경쇄 플라스미드이다. rTNV148B 가변 영역 및 불변 영역 코딩 도메인은 흑색 박스로 나타낸다. J-C 인트론 내의 면역글로불린 인핸서는 회색 박스로 나타낸다. 관련 제한 부위를 나타낸다. 플라스미드는 Ab 유전자의 전사가 시계방향으로 진행되도록 배향하여 나타낸다. 플라스미드 p1783은 길이가 19.53 kb이고 플라스미드 p1776은 길이가 15.06 kb이다. 둘 모두의 플라스미드의 완전한 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. p1783 내의 가변 영역 코딩 서열은 BsiWI/BstBI 제한 단편을 대체함으로써 다른 중쇄 가변 영역 서열로 용이하게 대체될 수 있다. p1776 내의 가변 영역 코딩 서열은 SalI/AflII 제한 단편을 대체함으로써 다른 가변 영역 서열로 대체될 수 있다.
도 7은 5개의 rTNV148B-생산 세포주의 성장 곡선 분석의 도해적 표현을 나타낸다. 30 ml 부피 내에 1.0 × 105 세포/ml의 생존가능한 세포 밀도를 갖도록 I5Q+ MHX 배지 중에 T75 플라스크 내로 세포를 시딩함으로써 0일차에 배양을 개시하였다. 이들 연구에 사용된 세포 배양물은 형질주입 및 서브클로닝이 수행된 이후로 연속 배양되었다. 후속 날에, T 플라스크 내의 세포를 철저히 재현탁시키고, 0.3 ml 분취량의 배양물을 취하였다. 세포 계수가 1.5 × 105 세포/ml 미만으로 하락했을 때 성장 곡선 연구를 종료하였다. 분취물 내의 생존 세포의 수를 트리판 블루 배제에 의해 결정하였고, 분취물의 나머지는 이후의 mAb 농도 결정을 위해 저장하였다. 모든 샘플 분취물에 대해 인간 IgG에 대한 ELISA를 동시에 수행하였다.
도 8은 다양한 농도의 MHX 선택의 존재 하에 세포 성장 속도의 비교의 도해적 표현을 나타낸다. 세포 서브클론 C466A 및 C466B를 MHX가 없는 배지(IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민) 내로 해동시키고, 추가로 2일 동안 배양하였다. 이어서, 둘 모두의 세포 배양물을 MHX 없음, 0.2X MHX, 또는 1X MHX 중 어느 하나를 함유하는 3개의 배양물로 분할하였다. 1일 후에, 새로운 T75 플라스크에 1 × 105 세포/ml의 출발 밀도로 배양물을 시딩하고, 세포를 24시간 간격으로 1주 동안 계수하였다. 최초 5일 동안의 배가 시간을 SOP PD32.025의 수학식을 사용하여 계산하였고, 바 위에 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 2개의 rTNV148B-생산 세포주로부터의 시간 경과에 따른 mAb 생산의 안정성의 도해적 표현을 나타낸다. 형질주입 및 서브클로닝을 수행한 이후로 연속 배양 중이었던 세포 서브클론을 사용하여 24-웰 배양 접시에서 장기 연속 배양을 시작하였다. MHX 선택의 존재 및 부재 하에 I5Q 배지 중에 세포를 배양하였다. 4 내지 6일마다 배양물을 분할함으로써 세포를 지속적으로 계대배양하여, 이전의 배양물이 소모되게 하는 동안 새로운 생존가능한 배양물을 유지하였다. 배양물이 소모된 직후에, 소모된 세포 상청액의 분취물을 수집하고, mAb 농도가 결정될 때까지 저장하였다. 모든 샘플 분취물에 대해 인간 IgG에 대한 ELISA를 동시에 수행하였다.
도 10은 실시예 4의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 본 발명의 항-TNF 항체(TNV14, TNV148, 또는 TNV196)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 10 mg/kg cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이러한 체중 증가는 3 내지 7주차에 유의미하였다. 10 mg/kg TNV148로 치료한 동물은 또한 연구의 7주차에 유의미한 체중 증가를 달성하였다.
도 11a 내지 도 11c는 실시예 4에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 3주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(7주차). 1 mg/kg TNV14로 치료한 동물 및 1 mg/kg cA2로 치료한 동물은, D-PBS-치료군에 비교할 때, 3주차 후에 AI의 유의미한 감소를 나타내지 못하였다. 10 mg/kg 치료군들 사이에는, 각각을 유사한 용량의 다른 것들에 비교했을 때(10 mg/kg cA2를 10 mg/kg TNV14, 148, 및 196에 비교함) 유의미한 차이가 없었다. 1 mg/kg 치료군을 비교했을 때, 1 mg/kg TNV148은 3주, 4주, 및 7주에 1 mg/kg cA2보다 유의미하게 더 낮은 AI를 나타냈다. 1 mg/kg TNV148은 또한 3주 및 4주에 1 mg/kg TNV14-치료군보다 유의미하게 더 낮았다. TNV196은 연구의 6주차까지 AI의 유의미한 감소를 나타냈지만(D-PBS-치료군에 비교할 때), 연구 종료 시에 유의미하게 유지된 유일한 1 mg/kg 치료는 TNV148이었다.
도 12는 실시예 5의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주에, 체중에 기초하여, 8개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 대조 물품(D-PBS) 또는 3 mg/kg의 항체(TNV14, TNV148)의 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다(0주차). 1, 2, 3, 및 4주차에 모든 동물에서 주사를 반복하였다. 시험 물품 효능에 대해 군 1 내지 군 6을 평가하였다. 군 7 및 군 8의 동물로부터 얻은 혈청 샘플을 2, 3, 및 4주차에 TNV14 또는 TNV148의 면역 반응 유도 및 약동학적 제거에 대해 평가하였다.
도 13a 내지 도 13c는 관절염 지수에 기초한 실시예 5에서의 질환 중증도의 진행을 나타내는 그래프이다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 유의미하게 더 낮았으며, 이는 2주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(5주차). 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 cA2로 치료한 동물 및 3 mg/kg TNV14로 치료한 동물은, d-PBS 대조군에 비교할 때, 연구 전체에 걸쳐 임의의 시점에 AI의 임의의 유의미한 감소를 달성하지 못하였다. 3 mg/kg TNV148로 치료한 동물은 d-PBS-치료군에 비교할 때 유의미한 감소를 나타냈으며, 이는 3주차에 시작하여 5주차까지 계속되었다. 10 mg/kg cA2-치료 동물은 연구의 4 및 5주차에 cA2의 더 낮은 용량(1 mg/kg 및 3 mg/kg) 둘 모두에 비교할 때 AI의 유의미한 감소를 나타냈으며, 또한 3 내지 5주차에 TNV14-치료 동물보다 유의미하게 더 낮았다. 3 mg/kg 치료군 중 임의의 것 사이에는 유의미한 차이가 없는 것으로 보였지만, 3 mg/kg TNV14로 치료한 동물에 대한 AI는 일부 시점에 10 mg/kg 보다 유의미하게 더 높았던 반면에, TNV148로 치료한 동물은 10 mg/kg의 cA2로 치료한 동물과 유의미하게 상이하지 않았다.
도 14는 실시예 6의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 6개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 3 mg/kg 또는 5 mg/kg으로 항체(cA2, 또는 TNV148)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 이 연구는 D-PBS 및 10 mg/kg cA2 대조군을 이용하였다.
도 15는 실시예 6에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 모든 치료군은 초기 시점에 일부 보호를 나타냈으며, 5 mg/kg cA2 및 5 mg/kg TNV148은 1주차 내지 3주차에 AI의 유의미한 감소를 나타냈고 모든 치료군이 2주차에 유의미한 감소를 나타냈다. 연구 후반에, 5 mg/kg cA2로 치료한 동물은 4, 6, 및 7주차에 유의미한 감소를 갖는 일부 보호를 나타냈다. cA2 및 TNV148 둘 모두의 낮은 용량(3 mg/kg)은 6주차에 유의미한 감소를 나타냈으며, 모든 치료군이 7주차에 유의미한 감소를 나타냈다. 치료군 중 어느 것도 연구 종료 시에 유의미한 감소를 유지할 수 없었다(8주차). 임의의 치료군들(식염수 대조군을 배제함) 사이에는 임의의 시점에 유의미한 차이가 없었다.
도 16은 실시예 7의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg 197 체중 변화를 나타낸다. TNV148(하이브리도마 세포로부터 유래됨) 및 rTNV148B(형질주입된 세포로부터 유래됨)의 단일 복강내 용량의 효능을 비교하기 위한 것이다. 대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/kg의 항체(TNV148 또는 rTNV148B)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다.
도 17은 실시예 7에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 4주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(8주차). TNV148-치료군 및 1 mg/kg cA2-치료군 둘 모두는 4주차에 AI의 유의미한 감소를 나타냈다. 이전의 연구(P-099-017)는 TNV148이 단일 1 mg/kg 복강내 볼루스 후에 관절염 지수를 감소시키는 데 약간 더 효과적이었음을 나타냈지만, 본 연구는 TNV 항체-치료군의 둘 모두의 버전으로부터의 AI가 약간 더 높았음을 나타냈다. 1 mg/kg cA2-치료군은 10 mg/kg cA2 군에 비교할 때 유의미하게 증가되지 않았고 TNV148-치료군은 7주차 및 8주차에 유의미하게 더 높았지만(6주차는 제외함), 연구 중 임의의 지점에 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148, 및 1 mg/kg TNV148B 사이에는 AI의 유의미한 차이가 없었다.
도 18은 골리무맙 제조 공정의 9개의 스테이지의 개요를 나타낸다.
도 19는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 전배양 및 확장 단계를 위한 스테이지 1 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 20은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 500 L 또는 1000 L 생산 생물반응기 공정 단계를 위한 스테이지 2 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 21은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 직접 생산물 포획(DPC) 단계를 위한 스테이지 3 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 22는 단백질 A 컬럼에서 용리된 골리무맙에 대한 대표적인 용리 프로파일을 나타낸다.
도 23은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, DPC 용리액의 해동 및 풀링을 위한 스테이지 4 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 24는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, DPC 용리액의 용매/세제(S/D) 처리를 위한 스테이지 5 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 25는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 골리무맙의 양이온 교환 크로마토그래피를 위한 스테이지 6 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 26은 골리무맙에 대한 대표적인 양이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 27은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, 골리무맙의 양이온 교환 크로마토그래피를 위한 스테이지 7 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 28은 골리무맙에 대한 대표적인 음이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 29는 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, NFP™ 바이러스 제거 여과를 위한 스테이지 8 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 30은 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 포함하는, FB로의 최종 한외여과/투석여과를 위한 스테이지 9 제조 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 31은 단백질 내 아스파라긴에 대한 고리형 이미드 매개 반응을 나타내며; 도면은 문헌[(Voorter, de Haard-Hoekman et al. 1988)]에서 수정되었다.
도 32는 골리무맙의 대표적인 Lys C 펩티드 맵 크로마토그램(214 nm)을 나타낸다(CNTO 148). 관심 대상의 변성(회색) 및 모(흑색) 펩티드가 표지된다. 약 34분에서의 피크는 CNTO 148과 관련이 없다.
도 33a 내지 도 33c는 펩티드 1-58 및 1-59(좌측 패널)의 레벨의 변화를 보여주는 강제 탈아미드화 조건 하에서 0, 4, 8 및 24시간 후의 골리무맙의 펩티드 맵 분석을 보여준다. 변화는 Asn43으로부터 Asp43 및 isoAsp43으로의 탈아미드화에 의해, 그리고 isoAsp43의 Asp43으로의 이성질화에 의해 유발되었다(상단 우측 패널; 펩티드 1-58 및 1-59의 Asn, Asp, 및 isoAsp 형태의 상대 피크 면적을 사용하여 존재비를 계산하였음). 펩티드 1-58 및 1-59의 Asn43, Asp43 및 isoAsp43 형태는 질량 분석법(MS)(하부 우측 패널)에 의해 그리고 합성 Asp43 펩티드 1-58(미도시)에 대한 체류 시간 비교에 의해 확인되었다.
도 34는 C, 1, 2 및 3으로 표지된 4개의 주요 피크(major peak) 및 B로 표지된 하나의 부수적 피크(minor peak)를 갖는 골리무맙의 대표적인 cIEF 전기영동도 프로파일을 나타낸다. pI 7.6 및 9.5의 내부 표준물질이 또한 표지되어 있다.
도 35a 내지 도 35c는 스테이지 6 중간 유지의 시작부터 스테이지 8 중간 유지의 종료까지 누적 시간의 함수로서 cIEF 동형 피크 면적(%) 및 총 Asn43 탈아미드화(%)를 나타낸다. 2차(피크 3, 2 및 HC Asn43 탈아미드화) 또는 순수 선형(피크 1, C 및 B) 모델(실선), 평균과 연관된 하위 및 상위 3SD 경계(점선) 및 HC Asn43 탈아미드화에 대한 허용 기준(단속선)에서 유래된 데이터의 추정 평균이 도시되어 있다.
도 36은 골리무맙에 대한 효력과 % LC cycAsn93의 상관 분석을 나타낸다. LC cycAsn93 백분율은 탈아미드화 분석을 사용하여 측정되었다. 다양한 양의 LC cycAsn93를 사용한 상이한 배치로부터 취해진 49개의 시점에 대한 결과가 나타나 있다. 통계 분석을 시판용 소프트웨어로 수행하였으며; r은 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)이다.
도 37은 형광 검출과 함께 순상 음이온 교환 HPLC를 사용한 골리무맙 기준 표준물질의 올리고당 분석을 위한 대표적인 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 상이한 종과 관련된 피크는 표지되어 있다. *는 골리무맙과 관련되지 않은 시스템 피크를 나타낸다.
본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 및 그러한 항-TNF 항체를 생산하는 제조 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는, "항-종양 괴사 인자 알파 항체", "항-TNF 항체", "항-TNF 항체 부분", 또는 "항-TNF 항체 단편" 및/또는 "항-TNF 항체 변이체" 등은 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 TNF 수용체 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 부분과 같으나 이에 제한되지 않는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함하며, 이는 본 발명의 항체 내로 혼입될 수 있다. 그러한 항체는 선택적으로 특이적 리간드에 추가로 영향을 주며, 이는 그러한 항체가 시험관내에서, 원위치에서, 그리고/또는 생체내에서 적어도 하나의 TNF 활성 또는 결합, 또는 TNF 수용체 활성 또는 결합을 조절, 감소, 증가, 길항화, 작용화, 완화, 경감, 차단, 억제, 제거, 및/또는 방해하는 경우와 같으나 이에 제한되지 않는다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분, 또는 변이체는 적어도 하나의 TNF, 또는 이의 특정 부분, 변이체, 또는 도메인에 결합할 수 있다. 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분, 또는 변이체는 또한 선택적으로, RNA, DNA, 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호전달, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 적어도 하나의 TNF 활성 또는 기능에 영향을 줄 수 있다. 용어 "항체"는 추가로 항체, 이의 분해 단편, 특정 부분, 및 변이체를 포함하고자 하며, 항체 모방체(mimetic)를 포함하거나, 단일쇄 항체 및 이의 단편을 포함하는, 항체 또는 이의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능적 단편은 포유류 TNF에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab(예를 들어, 파파인 분해에 의함), Fab'(예를 들어, 펩신 분해 및 부분적인 환원에 의함), 및 F(ab')2(예를 들어, 펩신 분해에 의함), facb(예를 들어, 플라스민 분해에 의함), pFc'(예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의함), Fd(예를 들어, 펩신 분해, 부분적인 환원, 및 재응집에 의함), Fv 또는 scFv(예를 들어, 분자생물학 기술에 의함) 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는, TNF 또는 이의 부분에 결합할 수 있는 항체 단편이 본 발명에 포함된다(예를 들어, 문헌[Colligan, Immunology, 상기 문헌] 참조).
이러한 단편은 본 기술 분야에 알려져 있고/있거나 본원에 기재된 바와 같이 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 천연의 정지 부위의 상류에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단 형태로 생산될 수 있다. 예를 들어, 중쇄의 CH1 도메인 및/또는 힌지 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하도록, F(ab')2 중쇄 부분을 암호화하는 조합 유전자를 설계할 수 있다. 항체의 다양한 부분은 통상의 기술에 의해 화학적으로 함께 연결될 수 있거나, 유전 공학 기술을 사용하여 연속 단백질로서 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "인간 항체"는 단백질의 실질적으로 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들어 CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH))이, 단지 사소한 서열 변화 또는 변이만을 가지면서, 인간에서 실질적으로 비면역원성인 항체를 지칭한다. 유사하게, 영장류(원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류(마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그, 햄스터 등), 및 다른 포유류로 지정된 항체는 그러한 종, 아속, 속, 아과, 과 특이적 항체를 지정한다. 추가로, 키메라 항체는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 변화 또는 변이는 선택적으로 그리고 바람직하게는, 변형되지 않은 항체에 비해 인간 또는 다른 종에서의 면역원성을 유지시키거나 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다. 인간 항체는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비인간 동물 또는 원핵 또는 진핵세포에 의해 생산될 수 있다는 점이 주목된다. 또한, 인간 항체가 단일쇄 항체일 때, 인간 항체는 천연 인간 항체에서는 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러한 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 간주된다.
2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체인 이중특이성(bispecific)(예를 들어, DuoBody®), 이종특이성(heterospecific), 이형접합성(heteroconjugate), 또는 유사한 항체 또한 사용할 수 있다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 적어도 하나의 TNF 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 본 기술 분야에 알려져 있다. 통상적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생산은 2개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초한다(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305:537(1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이러한 하이브리도마(콰드로마(quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 실행되는 정확한 분자의 정제는 번거롭고 생산물 수율이 낮을 수 있으며, 이중특이성 항체 생산을 용이하게 하기 위한 상이한 전략이 개발되어 왔다.
전장 이중특이성 항체는, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이에서의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있는데, 이는 공동발현을 사용하거나 또는 무세포 환경에서의 시험관내에서, 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입하여 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 이종이량체 형성을 유리하게 함으로써 행해진다. Fab 아암 교환 반응은 이황화물-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화보다 이종이량체화를 선호하도록 조작될 수 있다. 생성된 생산물은, 각각이 별개의 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 이중특이성 항체이다.
본원에서 사용되는, "동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본원에서 사용되는, "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는, "이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본원에서 사용되는, "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"노브-인-홀(knob-in-hole)" 전략(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2006/028936호 참조)이 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 간략하게 말해서, 인간 IgG 내에 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이화되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공동발현 이후, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 다음과 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
하나의 CH3 표면에서 양성 하전된 잔기 및 제2의 CH3 표면에서 음성 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 US2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 US2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 US2010/028637호, 또는 미국 특허 출원 공개 US2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같이 하기의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
전술된 방법에 더하여, 이중특이성 항체는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 상기 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체 및 제2 단일특이성 2가 항체는 이종이량체 안정성을 촉진하는 CH3 도메인에서의 소정 치환을 갖도록 조작되며; 항체는 힌지 영역의 시스테인이 이황화물 결합 이성질화를 거치기에 충분한 환원 조건 하에서 함께 인큐베이션되어; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 적어도 20℃의 온도에서 적어도 90분 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항-TNF 항체(TNF 항체로도 칭함)는 선택적으로 TNF에 대한 고친화도 결합 및 선택적으로 그리고 바람직하게는 낮은 독성 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 개별 성분, 예를 들어 가변 영역, 불변 영역 및 프레임워크가 개별적으로 및/또는 공동으로, 선택적으로 그리고 바람직하게는 낮은 면역원성을 갖는 본 발명의 항체, 특정 단편 또는 변이체가 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 항체는 선택적으로 측정가능한 정도로 증상을 완화하며, 낮고/낮거나 허용가능한 독성을 보이면서 장기간 동안 환자를 치료할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 낮거나 허용 가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도뿐만 아니라 다른 적합한 특성이 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다. 본원에서 "낮은 면역원성"은 치료한 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만에서 유의미한 HAHA, HACA, 또는 HAMA 반응을 야기하고/하거나 치료한 환자에서 낮은 역가(이중 항원 효소 면역검정으로 측정할 때, 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만)를 야기하는 것으로서 정의된다(전체적으로 본원에 참고로 포함된 문헌[Elliott et al., Lancet 344:1125--1127 (1994)]).
유용성: 본 발명의 단리된 핵산은, 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성, 및/또는 신경 장애 또는 질환 중 적어도 하나로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 TNF 병태를 진단, 모니터링, 조절, 치료, 완화시키거나, 그의 발병의 예방을 돕거나, 그의 증상을 감소시키기 위해 세포, 조직, 기관, 또는 동물(포유류 및 인간을 포함함)에서 측정하거나 작용하기 위해 사용될 수 있는 적어도 하나의 항-TNF 항체 또는 이의 특정 변이체의 생산을 위해 사용될 수 있다.
그러한 방법은 증상, 효과, 또는 기전의 그러한 조절, 치료, 완화, 예방, 또는 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유효량은 본원에 기재되거나 관련 기술 분야에 알려진 바와 같이 알려진 방법을 사용하여 실행되고 결정될 때, 단일(예를 들어, 볼루스), 다중, 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 500 mg/kg의 양, 또는 단일, 다중, 또는 연속 투여당 0.01 내지 5000 μg/ml의 혈청 농도를 달성하는 양, 또는 그 안의 임의의 유효 범위 또는 값을 포함할 수 있다. 인용. 본원에 인용된 모든 간행물 또는 특허는 전체적으로 본원에 참고로 포함되며, 이는 그들이 본 발명의 시점에서의 최신의 기술을 나타내고/나타내거나 본 발명의 설명 및 실시가능성을 제공하기 때문이다. 간행물은 임의의 학술 간행물 또는 특허 간행물, 또는 모든 기록 형식, 전자 형식 또는 인쇄 형식을 포함하는 임의의 매체 형식으로 이용가능한 임의의 다른 정보를 가리킨다. 하기 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다: 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY(1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY(1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)].
본 발명의 항체: 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역의 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역의 전부를 포함하는 본 발명의 적어도 하나의 항-TNF 항체는 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포, 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 선택적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY(1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조하며, 이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
단리되고/되거나 TNF 단백질 또는 이의 부분과 같은 적절한 면역원성 항원(합성 펩티드와 같은 합성 분자를 포함함)에 대해 인간 TNF 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 인간 항체를 발생시킬 수 있다. 다른 특이적 또는 일반적 포유류 항체를 유사하게 발생시킬 수 있다. 면역원성 항원의 제조 및 단클론 항체 생산은 임의의 적합한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
하나의 접근법에서는, 적합한 불멸 세포주(immortal cell line), 예를 들어, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 골수종 세포주, 또는 이종골수종(heteromyloma), 이의 융합 생산물, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 본 기술 분야에 알려진 임의의 다른 적합한 세포주를 융합함으로써 하이브리도마가 생산된다. 단리되거나 클로닝된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도선, 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 항체 생산 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 내인성 또는 이종성 핵산으로서, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵생물, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유류, 설치류, 말류, 양류, 염소, 양, 영장류, 진핵생물, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중, 또는 삼중 가닥, 혼성화 등 또는 이들의 임의의 조합으로서 발현하는 임의의 다른 세포에 대해서는, 예를 들어, www.atcc.org, www.lifetech.com. 등을 참조한다. 예를 들어, 전체적으로 본원에 참고로 포함되는, 문헌[Ausubel, 상기 문헌] 및 문헌[Colligan, Immunology, 상기 문헌, 챕터 2]을 참조한다.
항체 생산 세포는 또한 관심의 대상이 되는 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초혈, 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻을 수 있다. 임의의 다른 적합한 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 항체, 이의 특정 단편 또는 변이체를 인코딩하는 이종 또는 내인성 핵산을 또한 발현할 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 알려진 방법을 사용하여 단리될 수 있고, 제한 희석 또는 세포 분류, 또는 다른 알려진 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 원하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 세포를 적합한 검정(예를 들어, ELISA)에 의해 선별할 수 있다.
필요한 특이성의 항체를 생산하거나 단리하는 다른 적합한 방법이 사용될 수 있으며, 이는 펩티드 또는 단백질 라이브러리(비제한적인 예로서, 박테리오파지, 리보솜, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA 등, 디스플레이 라이브러리; 예를 들어, Cambridge antibody Technologies(영국 캠브리지셔 소재); MorphoSys(독일 마르틴스레이드/플라네그 소재); Biovation(영국 스코틀랜드 아버딘 소재); BioInvent(스웨덴 룬드 소재); Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma(미국 캘리포니아주 버클리 소재); Ixsys로부터 입수가능 함)로부터 재조합 항체를 선택하는 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, EP 368,684호, PCT/GB91/01134호; PCT/GB92/01755호; PCT/GB92/002240호; PCT/GB92/00883호; PCT/GB93/00605호; US 08/350260(5/12/94)호; PCT/GB94/01422호; PCT/GB94/02662호; PCT/GB97/01835호; (CAT/MRC); WO90/14443호; WO90/14424호; WO90/14430호; PCT/US94/1234호; WO92/18619호; WO96/07754호; (Scripps); EP 614 989(MorphoSys); WO95/16027호(BioInvent); WO88/06630호; WO90/3809호(Dyax); US 4,704,692호(Enzon); PCT/US91/02989호(Affymax); WO89/06283호; EP 371 998호; EP 550 400호; (Xoma); EP 229 046호; PCT/US91/07149호(Ixsys)를 참조함; 또는 추계적으로 생성된 펩티드 또는 단백질 - US 5723323호, 5763192호, 5814476호, 5817483호, 5824514호, 5976862호, WO 86/05803호, EP 590 689호(Ixsys, 현재 Applied Molecular Evolution(AME), 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨))로부터 재조합 항체를 선택하는 방법, 또는 본 기술 분야에 알려지고/알려지거나 본원에 기재된 바와 같이 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, SCID 마우스, 문헌[Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997)]; 문헌[Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996)]; 문헌[Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998)], 관련 특허 및 출원과 더불어 각각 전체적으로 참고로 포함됨)의 면역화에 의존하는 방법을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 기법은 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997)]; 문헌[Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)]); 단세포 항체 생산 기술(예를 들어, 선택된 림프구 항체 방법("SLAM")(미국 특허 제5,627,052호, 문헌[Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987)]; 문헌[Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)]); 겔 마이크로소적 및 유세포측정(문헌[Powell et al., Biotechnol. 8:333--337 (1990)]; One Cell Systems(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재); 문헌[Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995)]; 문헌[Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)]); B-세포 선택(문헌[Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994)]; 문헌[Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)])을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또한, 비인간 또는 인간 항체를 유전자 조작하거나 인간화하는 방법이 사용될 수 있으며, 이는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화되거나 조작된 항체는 인간외 공급원, 비제한적 예로서 마우스, 쥐, 토끼, 인간외 영장류 또는 다른 포유류로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 알려진 인간 서열의 "도입" 가변, 불변, 또는 다른 도메인으로부터 취해진다. 알려진 인간 Ig 서열은, 예를 들어 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/~hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximt1.imt.uni-marburg.de/~rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr_products.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)]에 개시되어 있으며, 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
이러한 유입된 서열은 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화도, 결합 속도(on-rate), 해리 속도(off-rate), 결합력(avidity), 특이성, 반감기, 또는 본 기술 분야에 알려진 임의의 다른 적합한 특성을 감소시키거나, 향상시키거나, 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 인간외 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부가 유지되는 반면에, 가변 및 불변 영역의 인간외 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체된다. 항체는 또한 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유함으로써 선택적으로 인간화될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간화 항체는 모(parental) 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적(conceptual) 인간화 생산물을 분석하는 과정에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이에 대한 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서의 잔기의 가능성이 있는 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원과 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가가 달성되도록 공통 서열 및 도입 서열로부터 FR 잔기가 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 준다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 조작은, 각각 전체적으로 본원에 참고로 포함된, 문헌[Winter](문헌[Jones et al., Nature 321:522 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)]), 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)]; 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)], 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)]; 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 제5723323호, 제5976862호, 제5824514호, 제5817483호, 제5814476호, 제5763192호, 제5723323호, 제5,766886호, 제5714352호, 제6204023호, 제6180370호, 제5693762호, 제5530101호, 제5585089호, 제5225539호; 제4816567호, PCT/: US98/16280호, US96/18978호, US91/09630호, US91/05939호, US94/01234호, GB89/01334호, GB91/01134호, GB92/01755호; WO90/14443호, WO90/14424호, WO90/14430호, EP 229246호, 그 안에 인용된 참고문헌에 기재된 것들과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 임의의 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 항체의 인간화 또는 유전자 조작을 수행할 수 있다.
또한 선택적으로 항-TNF 항체는 본원에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스, 쥐, 햄스터, 인간외 영장류 등)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 본원에 기재된 방법과 같은 적합한 방법을 사용하여, 인간 항-TNF 항체를 생산하는 세포를 그러한 동물로부터 단리하고 불멸화할 수 있다.
인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스는 알려진 방법(비제한적인 예로서, 각각 전체적으로 본원에 참고로 포함된, Lonberg 등에게 허여된 미국 특허 제5,770,428호, 제5,569,825호, 제5,545,806호, 제5,625,126호, 제5,625,825호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 및 제5,789,650호; Jakobovits 등의 WO 98/50433호, Jakobovits 등의 WO 98/24893호, Lonberg 등의 WO 98/24884호, Lonberg 등의 WO 97/13852호, Lonberg 등의 WO 94/25585호, Kucherlapate 등의 WO 96/34096호, Kucherlapate 등의 EP 0463 151 B1호, Kucherlapate 등의 EP 0710 719 A1호, Surani 등의 미국 특허 제5,545,807호, Bruggemann 등의 WO 90/04036호, Bruggemann 등의 EP 0438 474 B1호, Lonberg 등의 EP 0814 259 A2호, Lonberg 등의 GB 2 272 440 A호, 문헌[Lonberg et al. Nature 368:856-859(1994)], 문헌[Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591(1994)], 문헌[Green et al, Nature Genetics 7:13-21(1994)], 문헌[Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156(1997)], 문헌[Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295(1992)], 문헌[Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)], 문헌[Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93(1995)], 및 문헌[Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851(1996)])에 의해 생산될 수 있다. 일반적으로, 이러한 마우스는 기능적으로 재배열되거나, 기능적으로 재배열될 수 있는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 적어도 하나의 도입유전자(transgene)를 포함한다. 상기 마우스에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실되어, 내인성 유전자에 의해 인코딩되는 항체를 생산하는 동물의 능력을 제거할 수 있다.
통상적으로 펩티드 디스플레이 라이브러리를 사용하여 유사한 단백질 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 선별할 수 있다. 이러한 방법은 원하는 기능 또는 구조를 갖는 개별 구성원에 대한 펩티드의 큰 집합의 스크리닝을 포함한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 디스플레이된 펩티드 서열의 길이는 3 내지 5000개 이상의 아미노산, 종종 5 내지 100개의 아미노산, 종종 약 8 내지 25개의 아미노산일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 직접적인 화학적 합성 방법 외에도, 몇몇 재조합 DNA 방법이 기재되어 있다. 하나의 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에 펩티드 서열을 디스플레이하는 것을 포함한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 방법이 PCT 특허 공개 91/17271호, 91/18980호, 91/19818호 및 93/08278호에 기재되어 있다. 펩티드의 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 시험관내에서의 화학적 합성 및 재조합 방법 모두의 양태를 포함한다. PCT 특허 공개 92/05258호, 92/14843호 및 96/19256호를 참조한다. 또한 미국 특허 제5,658,754호; 및 제5,643,768호를 참조한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 선별 검사 키트는 Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 Cambridge Antibody Technologies(영국 캠브리지셔 소재)와 같은 공급처로부터 구매가능하다. 예를 들어, Enzon에 양도된 미국 특허 제4704692호, 제4939666호, 제4946778호, 제5260203호, 제5455030호, 제5518889호, 제5534621호, 제5656730호, 제5763733호, 제5767260호 및 제5856456호; Dyax에 양도된 제5223409호, 제5403484호, 제5571698호, 제5837500호, Affymax에 양도된 제5427908호, 제5580717호; Cambridge antibody Technologies에 양도된 제5885793호; Genentech에 양도된 제5750373호, Xoma, Colligan에 양도된 제5618920호, 제5595898호, 제5576195호, 제5698435호, 제5693493호, 제5698417호, 상기 문헌; 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조하며, 상기 특허 및 간행물 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 항체는 또한, 우유 내에 그러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물 또는 포유류, 예컨대 염소, 소, 말, 양 등을 제공하기 위한 적어도 하나의 항-TNF 항체를 암호화하는 핵산을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 알려진 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 비제한적인 예로서, 미국 특허 제5,827,690호; 제5,849,992호; 제4,873,316호; 제5,849,992호; 제5,994,616호; 제5,565,362호; 제5,304,489호 등을 참조하지만, 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
식물 부분, 또는 그로부터 배양된 세포에서 그러한 항체, 특정 부분, 또는 변이체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포(비제한적인 예로서, 담배 및 옥수수)를 제공하기 위한 적어도 하나의 항-TNF 항체를 암호화하는 핵산을 사용하여 본 발명의 항체를 추가로 제조할 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 유전자도입 담배 잎이, 예를 들어 유도성 프로모터를 사용하여 다량의 재조합 단백질을 제공하는 데 성공적으로 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 또한, 유전자도입 옥수수는 다른 재조합 시스템에서 생산되거나, 천연 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성으로, 상업 생산 수준으로 포유류 단백질을 발현하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌[Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 담배 종자 및 감자 덩이줄기를 포함하는, 항체 단편, 예컨대 단일쇄 항체(scFv)를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자로부터 항체가 또한 다량으로 생산되었다. 예를 들어, 문헌[Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 알려진 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999)], 문헌[Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995)]; 문헌[Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995)]; 문헌[Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994)]; 및 그 안에 인용된 참고문헌을 또한 참조한다. 상기 참고문헌 각각은 본원에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 발명의 항체는 광범위한 친화도(KD)로 인간 TNF에 결합할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 적어도 하나의 인간 mAb는 선택적으로 높은 친화도로 인간 TNF에 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 mAb는 약 10-7 M 이하, 비제한적인 예로서 0.1 내지 9.9(또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) × 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 KD로 인간 TNF에 결합할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY(1984)]; 문헌[Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY(1992)]; 및 본원에 기재된 방법을 참조한다). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 파라미터(예를 들어, KD, Ka, Kd)의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제, 예컨대 본원에 기재된 완충제를 사용하여 행해진다.
핵산 분자. 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 중 적어도 하나의 연속 아미노산의 적어도 70 내지 100%를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 이의 특정 단편, 변이체, 또는 공통 서열, 또는 이들 서열 중 적어도 하나를 포함하는 기탁된 벡터와 같은 본원에 제공된 정보를 사용하여, 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역의 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역의 전부를 포함하는 적어도 하나의 항-TNF 항체를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 본원에 기재되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같은 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 RNA 형태, 예를 들어 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태 또는 cDNA 및 클로닝에 의해 얻어지거나 합성에 의해 생성된 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 삼중가닥, 이중가닥 또는 단일가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 한 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나, 안티-센스 가닥으로도 언급되는 비코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는, 선택적으로 적어도 하나의 인트론을 갖는 개방 해독틀(ORF: open reading frame)을 포함하는 핵산 분자, 비제한적인 예로서, 적어도 하나의 CDR의 적어도 하나의 특정 부분, 예컨대 적어도 하나의 중쇄(예를 들어, 서열 번호 1 내지 3) 또는 경쇄(예를 들어, 서열 번호 4 내지 6)의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 핵산 분자; 항-TNF 항체 또는 가변 영역(예를 들어, 서열 번호 7, 8)에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기 기재된 것들과는 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 본원에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같은 적어도 하나의 항-TNF 항체를 여전히 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 코드는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 항-TNF 항체를 코딩하는 그러한 축퇴 핵산 변이체를 생성하는 것은 당업자에게 일상적일 것이다. 예를 들어, 상기 Ausubel 등의 문헌을 참조하며, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 단리된 핵산 분자의 비제한적인 예는 각각 HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC 가변 영역 및 LC 가변 영역을 암호화하는 핵산의 비제한적인 예에 상응하는 서열 번호 10, 11, 12, 13, 14, 15를 포함한다.
본원에 나타낸 바와 같이 항-TNF 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는, 그 자체로 항체 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것들; 전체 항체 또는 이의 일부에 대한 코딩 서열; 항체, 단편, 또는 부분에 대한 코딩 서열과 더불어, 추가의 서열, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, mRNA의 리보솜 결합 및 안정성)를 포함하는, 전사, mRNA 프로세싱에서 역할을 담당하는 전사되고 번역되지 않는 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 비-코딩 서열과 함께, 적어도 하나의 인트론과 같은, 전술한 추가의 코딩 서열이 있거나 없는, 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열; 추가의 작용기를 제공하는 것들과 같은, 추가의 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 항체를 암호화하는 서열은 항체 단편 또는 일부를 포함하는 융합된 항체의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드. 본 발명은 선택적인 혼성화 조건 하에 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 이러한 실시형태의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리하고/하거나, 검출하고/하거나, 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리에서 부분 또는 전장의 클론을 동정하거나, 단리하거나, 증폭하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 cDNA 서열 또는 게놈이거나, 그렇지 않으면 인간 또는 포유류의 핵산 라이브러리로부터의 cDNA에 상보성이다.
바람직하게는, cDNA 라이브러리는 적어도 80%의 전장 서열, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%의 전장 서열, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 제시를 증가시키도록 정규화될 수 있다. 낮거나 중등의 엄격성 혼성화 조건은 전형적이지만 비배타적으로, 상보성 서열에 비해 감소된 서열 동일성을 갖는 서열과 함께 사용된다. 중등 및 높은 엄격성 조건은 동일성이 더 큰 서열에 대해 선택적으로 사용될 수 있다. 낮게 엄격한 조건은 약 70%의 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적인 혼성화를 허용하고 동원성(orthologous) 또는 이원성(paralogous) 서열을 확인하는 데 사용될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 항체의 적어도 일부를 암호화할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 선택적 혼성화에 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 Ausubel의 문헌; 상기 Colligan의 문헌을 참조하며, 각각 전체는 본원에 참조로 포함된다.
핵산의 작제. 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산은 (a) 재조합 방법; (b) 합성 기술; (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조할 수 있다.
핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 외에도 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위는 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 배제한 본 발명의 핵산은 선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.
추가의 서열은 클로닝 및/또는 발현에서 이들의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나, 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 개선하기 위해 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다).
핵산 작제를 위한 재조합 방법. 당업자에게 알려진 임의의 수의 클로닝 방법을 사용하여 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 본 발명의 단리된 핵산 조성물을 생물학적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 엄격한 조건 하에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 확인하기 위해 사용된다. RNA의 단리, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 작제는 당업자에게 잘 알려져 있다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다).
핵산 스크리닝 및 단리 방법. 본원에 개시된 것들과 같은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 프로브를 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여, 동일하거나 상이한 유기체 내의 상동 유전자를 단리하는 데 사용할 수 있다. 다양한 정도의 혼성화 엄격성이 검정에 사용될 수 있으며; 혼성화 배지 또는 세척 배지가 엄격할 수 있음을 당업자는 인정할 것이다. 혼성화 조건이 더 엄격해지면, 이중체(duplex)를 형성하기 위해 프로브와 표적 사이의 상보성 정도가 더 커야 한다. 엄격성 정도는 온도, 이온 강도, pH, 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 엄격성은 예를 들어, 포름아미드 농도를 0% 내지 50%의 범위 내에서 조정하여, 반응 용액의 극성을 변경하여 편리하게 변동된다. 검출가능한 결합에 필요한 상보성 정도(서열 동일성)는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성에 따라 변동될 것이다. 상보성 정도는 최적으로 100%, 또는 70 내지 100%, 또는 상기 범위 내의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머에서의 작은 서열 변화는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성을 감소시켜 보상될 수 있음을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있고, 과도한 실험을 실시하지 않으면서, 본원에 제시된 교시 및 지침을 기초로 하여 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
알려진 DNA 또는 RNA 증폭 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 과정(예를 들어, Mullis 등의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호; Tabor 등의 제4,795,699호 및 제4,921,794호; Innis의 제5,142,033호; Wilson 등의 제5,122,464호; Innis의 제5,091,310호; Gyllensten 등의 제5,066,584호; Gelfand 등의 제4,889,818호; Silver 등의 제4,994,370호; Biswas의 제4,766,067호; Ringold의 제4,656,134호 참조) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭(Malek등의 미국 특허 제5,130,238호, 상표명 NASBA)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 참고문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다)
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 관련 유전자의 서열을 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 증폭할 수 있다. 또한, PCR 및 다른 시험관내 증폭 방법은, 예를 들어 발현되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하고, 샘플 내의 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하는 핵산을 제조하거나, 핵산 서열분석 또는 기타 목적에 유용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자를 지도하기에 충분한 기술의 예는 문헌[Berger, 상기 문헌], 문헌[Sambrook, 상기 문헌], 및 문헌[Ausubel, 상기 문헌]뿐만 아니라 Mullis 등의 미국 특허 제4,683,202호(1987); 및 문헌[Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA(1990)]에서 확인된다. 게놈 PCR 증폭을 위한 구매가능한 키트가 본 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)를 참조한다. 추가로, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)은 긴 PCR 생산물의 수율을 개선하기 위해 사용될 수 있다.
핵산 작제를 위한 합성 방법. 본 발명의 단리된 핵산은 또한 알려진 방법에 의해 직접 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌] 참조). 화학적 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하는데, 이는 상보성 서열과의 혼성화에 의해 또는 단일 가닥을 주형으로서 사용하여 DNA 폴리머라제에 의한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자라면 DNA의 화학적 합성이 약 100개 이상의 염기의 서열로 제한될 수 있는 반면, 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 라이게이션에 의해 얻어질 수 있음을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트. 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 항체를 암호화하는 cDNA 또는 게놈 서열을 사용하여 적어도 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 작제할 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도되는 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도할 전사 개시 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 본 발명의 핵산의 발현을 유도하기 위해 이종성 및 비-이종성(즉, 내인성) 프로모터 둘 모두를 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 요소로서의 역할을 하는 단리된 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향조절 또는 하향조절하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비-이종성 형태의 적절한 위치(상류, 하류 또는 인트론 내)에 도입될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체내(in vivo)에서 또는 시험관내(in vitro)에서 변경될 수 있다.
벡터 및 숙주 세포. 본 발명은 또한, 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 항-TNF 항체의 생산에 관한 것이다. 예를 들어, 각각 전체적으로 본원에 참고로 포함된 문헌[Sambrook, et al., 상기 문헌]; 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌]을 참조한다.
폴리뉴클레오티드는 숙주 내에서의 증식을 위해 선택가능한 마커를 함유하는 벡터에 선택적으로 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터가 침전물, 예를 들어 인산칼슘 침전물 내에, 또는 하전된 지질과의 복합체 내에 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 적합한 패키징(packaging) 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키징된 후, 숙주 세포 내로 형질도입될 수 있다.
DNA 삽입물은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 발현 작제물은 전사 개시를 위한 부위, 종결을 위한 부위 및 전사된 영역에서 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 시작점에 있는 번역 개시 부위 및 번역될 mRNA의 말단에 적절하게 위치한 종결 코돈(예를 들어, UAA, UGA, 또는 UAG)을 포함할 것이며, 포유류 또는 진핵 세포 발현에는 UAA 및 UAG가 바람직하다.
발현 벡터는 바람직하게 그러나 선택적으로 적어도 하나의 선택가능한 마커를 포함할 것이다. 그러한 마커는, 예를 들어, 진핵 세포 배양을 위한 메토트렉세이트(MTX), 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호; 제4,656,134호; 제4,956,288호; 제5,149,636호; 제5,179,017호), 암피실린, 네오마이신(G418), 마이코페놀산, 또는 글루타민 신테타제(GS)(미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호) 저항성 유전자, 및 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 세균 또는 원핵세포에서의 배양을 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 저항성 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(상기 특허는 전체적으로 본원에 참고로 포함됨). 전술된 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건이 본 기술 분야에 알려져 있다. 적절한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다. 숙주 세포 내로의 벡터 구조물의 도입은 인산칼슘 형질주입, DEAE-덱스트란 매개 형질주입, 양이온성 지질 매개 형질주입, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook, 상기 문헌, 챕터 1-4 및 16-18]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, Chapters 1, 9, 13, 15, 16]과 같이 당업계에 기재되어 있다.
본 발명의 적어도 하나의 항체는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가의 이종성 기능성 영역 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 정제 동안, 또는 후속 취급 및 저장 동안 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 개선하기 위해 항체의 N-말단에 부가될 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티가 정제를 용이하게 하기 위해 본 발명의 항체에 부가될 수 있다. 그러한 영역은 항체 또는 적어도 하나의 이의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌[Sambrook, 상기 문헌, 챕터 17.29-17.42 및 18.1-18.74]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, 챕터 16, 17, 및 18]에 기재되어 있다.
당업자는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산의 발현에 이용가능한 많은 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다.
대안적으로, 본 발명의 핵산은 본 발명의 항체를 암호화하는 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의한) 턴온(turn on)에 의해 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 전체적으로 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호 및 제5,733,761호에 기재되어 있는 바와 같이 본 기술 분야에 알려져 있다.
항체, 이의 특정 부분 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양물의 예는 포유류 세포이다. 포유류 세포 시스템은 종종 세포의 단일층 형태로 존재할 수 있지만, 포유류 세포 현탁액 또는 생물반응기도 사용될 수 있다. 온전한 글리코실화 단백질을 발현할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있고, COS-1(예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들어, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들어, ATCC CRL-10), CHO(예를 들어, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들어, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들은, 예를 들어 American Type Culture Collection(미국 버지니아주 매나서스 소재, www.atcc.org)으로부터 용이하게 입수가능하다. 바람직한 숙주 세포는 림프구 기원의 세포, 예컨대 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 기탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 기탁 번호 CRL-1851)이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 하기 발현 제어 서열 중 하나 이상, 비제한적인 예로서 복제 기원; 프로모터(예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 면역글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40 라지 T Ag 폴리 A 부가 부위), 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., 상기 문헌]; 문헌[Sambrook, et al., 상기 문헌]을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질 생산에 유용한 다른 세포가 알려져 있고/있거나, 예를 들어 세포주 및 하이브리도마의 American Type Culture Collection 카탈로그(www.atcc.org) 또는 다른 알려진 또는 상업 공급원으로부터 이용가능하다.
진핵 숙주 세포가 사용될 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열은 전형적으로 벡터에 통합된다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사물의 정확한 스플라이싱을 위한 서열이 또한 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40으로부터의 VP1 인트론이다 (문헌[Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)]). 추가로, 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 숙주 세포 내의 복제를 조절하는 유전자 서열은 벡터 내로 도입될 수 있다.
항체의 정제. 항-TNF 항체는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")도 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각이 전체적으로 본원에 참고로 포함되는, 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology] 또는 문헌[Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조한다.
본 발명의 항체는 천연 정제된 생산물, 화학적 합성 절차의 생산물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충, 및 포유류 세포를 포함하는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생산물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있으며, 글리코실화가 바람직하다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌[Sambrook, 상기 문헌, 섹션 17.37-17.42]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, 챕터 10, 12, 13, 16, 18, 및 20], 문헌[Colligan, Protein Science, 상기 문헌, 챕터 12-14]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
항-TNF 항체. 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역의 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역의 전부를 포함하는 본 발명의 단리된 항체는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 본원에 개시된 항체 아미노산 서열, 또는 임의의 단리되거나 제조된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 TNF에 결합함으로써 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 실질적으로 중화시킨다. 적어도 하나의 TNF 단백질 또는 단편의 적어도 하나의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 바람직하게는 실질적으로 중화시키는 항체, 이의 특정 부분, 또는 변이체는 단백질 또는 단편에 결합함으로써 TNF 수용체에 대한 TNF의 결합을 통해 또는 다른 TNF-의존성 또는 TNF-매개 기전을 통해 매개되는 활성을 억제할 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "중화 항체"는 TNF-의존성 활성을 검정에 따라 약 20 내지 120%만큼, 바람직하게는 약 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이상만큼 억제할 수 있는 항체를 지칭한다. TNF-의존성 활성을 억제하는 항-TNF 항체의 능력은 바람직하게는 본원에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 적어도 하나의 적합한 TNF 단백질 또는 수용체 검정에 의해 평가된다. 본 발명의 인간 항체는 임의의 부류(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등) 또는 동종형일 수 있으며, 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 항체는 IgG 중쇄 또는 정의된 단편, 예를 들어, 동종형, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 적어도 하나를 포함한다. 본원에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 적어도 하나의 인간 경쇄(예를 들어, IgG, IgA) 및 IgM(예를 들어, γ1, γ2, γ3, γ4) 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스 또는 다른 트랜스제닉 인간외 포유류를 사용함으로써 이러한 유형의 항체가 제조될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항-인간 TNF 인간 항체는 IgG1 중쇄 및 IgG1 경쇄를 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "항체" 또는 "항체들"은 BPCI Act(Biologics Price Competition and Innovation Act of 2009) 및 전세계적으로 유사한 법칙 및 규제 하에서 승인된 바이오시밀러(biosimilar) 항체 분자를 포함한다. BPCI Act 하에서, 임상적으로 비활성인 성분에 있어서의 사소한 차이에도 불구하고, 항체가 참조 제품과 "고도로 유사하다"는 것을 데이터가 나타내고, 안전성, 순도, 및 효력의 관점에서, 참조 제품과 동일한 임상 결과를 생산할 것으로 "예상되는" 경우, 그러한 항체는 바이오시밀러인 것으로 입증될 수 있다(문헌[Endocrine Practice: February 2018, Vol. 24, No. 2, pp. 195-204]). 이들 바이오시밀러 항체 분자는 단축된 승인 경로로 제공되며, 그럼으로써 본 출원인은 규제 승인을 확보하기 위하여 이노베이터 참조 제품의 임상 데이터에 의존한다. 성공적인 임상 시험에 기초하여 FDA 승인된 오리지널 이노베이터 참조 항체와 비교하여, 바이오시밀러 항체 분자는 본원에서 "후속 생물학적 제제(follow-on biologic)"로 지칭된다. 본원에 제시된, SIMPONI®(골리무맙)는 성공적인 임상 시험에 기초하여 FDA 승인된 오리지널 이노베이터 참조 항-TNF 항체이다. 골리무맙은 2009년 이래로 미국에서 판매되어 왔다.
본 발명의 적어도 하나의 항체는 적어도 하나의 TNF 단백질, 서브유닛, 단편, 부분, 또는 이들의 임의의 조합에 특이적인 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합한다. 적어도 하나의 에피토프는 상기 단백질의 적어도 하나의 부분을 포함하는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함하고, 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 적어도 하나의 세포외, 가용성, 친수성, 외부, 또는 세포질 부분으로 이루어진다. 적어도 하나의 특정 에피토프는 서열 번호 9의 연속 아미노산의 전체 특정 부분에 대한 적어도 1 내지 3개의 아미노산 중 적어도 하나의 아미노산 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 적어도 하나의 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3) 또는 변이체 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3) 또는 변이체를 포함하는 항원-결합 영역을 포함할 것이다. 비제한적인 예로서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 및/또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 상응하는 CDR 1, 2, 및/또는 3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 1, 2, 및/또는 3)을 갖는 적어도 하나의 중쇄 CDR(즉, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 상응하는 CDR 1, 2, 및/또는 3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 4, 5, 및/또는 6)을 갖는 적어도 하나의 경쇄 CDR(즉, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR은 본원에 기재된 바와 같은 mAb TNV148, TNV14, TNV15, TNV196, TNV118, TNV32, TNV86 중 적어도 하나의 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 갖는다. 그러한 항체는, 종래의 기법을 사용하여 항체의 다양한 부분들(예를 들어, CDR, 프레임워크)을 함께 화학적으로 연결하거나, 재조합 DNA 기술의 종래 기법을 사용하여 항체를 인코딩하는 (하나 이상의) 핵산 분자를 제조하고 발현시키거나, 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
항-TNF 항체는 정의된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 항-TNF 항체는, 선택적으로 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 중 적어도 하나 및/또는 선택적으로 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 인간 TNF에 결합하고 정의된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체는 파지 디스플레이와 같은 적합한 방법(문헌[(Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)]) 또는 본 기술 분야에 알려져 있고/있거나 본원에 기재된 바와 같은 유전자도입 동물을 사용하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 트랜스유전자 및 기능적으로 재배열될 수 있는 인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 인간 TNF 또는 이의 단편으로 면역화하여 항체의 생산을 유도할 수 있다. 필요한 경우, 항체 생산 세포가 단리될 수 있고, 하이브리도마 또는 다른 불멸화 항체-생산 세포는 본원에 기재된 및/또는 본 기술 분야에 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체, 특정 부분 또는 변이체는 적합한 숙주 세포에서 코딩 핵산 또는 이의 일부를 사용하여 발현될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체, 항원-결합 단편, 면역글로불린 사슬 및 CDR에 관한 것이다. 바람직하게는, 그러한 항체 또는 항원-결합 단편 및 그러한 사슬 또는 CDR을 포함하는 항체는 높은 친화도(예를 들어, 약 10-9 M 이하의 KD)로 인간 TNF에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환 및 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산의 것들과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성(예를 들어, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 제2 아미노산에 의한 제1 아미노산의 대체를 지칭한다. 보존적 치환은 하기 군 내의 하나의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 대체를 포함한다: 라이신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 아스파르테이트 (D) 및 글루타메이트 (E); 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 아이소류신 (I), 프롤린 (P), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 시스테인 (C) 및 글리신 (G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
아미노산 코드. 본 발명의 항-TNF 항체를 구성하는 아미노산은 종종 약어로 표시된다. 아미노산 표기는 본 기술 분야에서 잘 이해되는 바와 같이 아미노산을 그의 1문자 코드, 그의 3문자 코드, 명칭, 또는 3뉴클레오티드 코돈(들)에 의해 표기함으로써 표시할 수 있다 (문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc.,New York, 1994] 참조):
본원에 특정된 바와 같이, 본 발명의 항-TNF 항체는 천연 돌연변이 또는 인간에 의한 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 포함할 수 있다.
물론, 당업자가 실행할 아미노산 치환의 수는 상기 기재된 것들을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라진다. 일반적으로 말하면, 임의의 주어진 항-TNF 항체, 단편, 또는 변이체에 대한 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실의 수는 본원에 특정된 바와 같이 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 이하, 예컨대 1 내지 30개 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값일 것이다.
기능에 필수적인 본 발명의 항-TNF 항체 내의 아미노산을 본 기술 분야에 알려진 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌, 챕터 8, 15]; 문헌[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)])에 의해 확인할 수 있다. 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성된 돌연변이 분자를 적어도 하나의 TNF 중화 활성과 같으나 이에 제한되지 않는 생물학적 활성에 대해 시험한다. 결정화, 핵자기 공명, 또는 광친화도 표지화(문헌[Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 문헌[de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)])와 같은 구조 분석에 의해 항체 결합에 결정적인 부위를 확인할 수도 있다.
본 발명의 항-TNF 항체는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 중 적어도 하나의 연속 아미노산 중 1개 내지 전부로부터 선택된 적어도 하나의 부분, 서열, 또는 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
추가로, 항-TNF 항체는 서열 번호 7, 8 중 적어도 하나의 연속 아미노산의 70 내지 100% 중 적어도 하나의 폴리펩티드를 선택적으로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 부분(예를 들어, 가변 영역, CDR)의 아미노산 서열은 서열 번호 7, 8 중 적어도 하나의 상응하는 사슬의 아미노산 서열에 대해 약 70 내지 100%의 동일성(예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)을 갖는다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 8의 서열과 비교할 수 있거나, 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 7과 비교할 수 있다. 바람직하게는, 70 내지 100% 아미노산 동일성(즉, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)은 본 기술 분야에 알려진 바와 같이 적합한 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정된다.
예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 서열 번호 7, 8에 제공된다. 본 발명의 항체 또는 이의 특정 변이체는 본 발명의 항체로부터의 임의의 수의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 여기서 그 수는 항-TNF 항체 내의 연속 잔기의 수의 10 내지 100%로 이루어진 정수의 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 연속된 아미노산들의 이러한 하위서열(subsequence)은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 또는 그 이상의 아미노산 길이 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이다. 또한, 그러한 하위서열의 개수는 1 내지 20, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 또는 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 정수일 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 항체를 포함한다. 생물학적으로 활성인 항체는 천연(비-합성), 내인성, 또는 관련되고 알려진 항체의 활성의 20%, 30%, 또는 40% 이상, 바람직하게는 50%, 60%, 또는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80%, 90%, 또는 95% 내지 1000% 이상인 고유 활성(specific activity)을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성의 검정 방법 및 정량화 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형된, 본원에 기재된 인간 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 약동학적 특성이 개선된(예를 들어, 생체내 혈청 반감기 증가) 항체 또는 항원-결합 단편을 생산할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체기, 지방산기 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 특정 실시형태에서, 친수성 중합체기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있으며, 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합되는 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체기, 지방산기 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 다이-카르복실산을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친수성 중합체기"는 옥탄 중에서보다 물 중에서 더 가용성인 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 폴리라이신은 옥탄 중에서보다 물 중에서 더 가용성이다. 따라서, 폴리라이신의 공유 부착에 의해 변형된 항체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체의 변형에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 예를 들어 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), PPG 등), 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체 (예를 들어, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥사이드 (예를 들어, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 변형시키는 친수성 중합체는 별개의 분자 실체(entity)로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20,000이 사용될 수 있으며, 여기서 아래첨자는 달톤 단위의 중합체의 평균 분자량이다. 친수성 중합체기는 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환된 친수성 중합체를 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트와 커플링될 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예를 들어, N,N-카르보닐 다이이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 하이드록실기와 커플링될 수 있다.
본 발명의 항체의 변형에 적합한 지방산과 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나, 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체를 변형시키기에 적합한 지방산은, 예를 들어 n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트라이아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄다이오산, 테트라데칸다이오산, 옥타데칸다이오산, 도코산다이오산 등을 포함된다. 적합한 지방산 에스테르에는 선형 또는 분지형 저급 알킬기 포함하는 다이카르복실산의 모노-에스테르가 포함된다. 저급 알킬기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형제"는 활성화기를 포함하는 적합한 유기기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. "활성화기"는 적절한 조건 하에 제2 화학기와 반응하여 변형제와 제2 화학기 사이의 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화기에는 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS) 등과 같은 친전자성 기가 포함된다. 티올과 반응할 수 있는 활성화기에는, 예를 들어 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤일, 피리딜 다이설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 등이 포함된다. 알데하이드 작용기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자와 커플링될 수 있고, 아지드기는 3가 인산기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화기를 분자 내로 도입하기에 적합한 방법은 본 기술 분야에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA(1996)]을 참조한다). 활성화기는 유기기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 결합되거나, 링커 모이어티, 예를 들어 2가 C1 내지 C12 기(여기서 하나 이상의 탄소 원자는 산소, 질소, 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있음)를 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 모이어티에는, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- 및 -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-가 포함된다. 예를 들어, 모노-Boc-알킬다이아민 (예를 들어, 모노-Boc-에틸렌다이아민, 모노-Boc-다이아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보다이이미드 (EDC)의 존재 하에 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 링커 모이어티를 포함하는 변형제를 제조할 수 있다. 기재된 바와 같이, 다른 카르복실레이트에 커플링될 수 있거나, 말레산 무수물과 반응시키고 생성된 생산물을 고리화하여 지방산의 활성화 말레이미도 유도체를 생산할 수 있는 1차 아민을 노출시키기 위해, 트라이플루오로아세트산(TFA)으로 처리함으로써 생산물로부터 Boc 보호기를 제거할 수 있다. (예를 들어, 그의 전체 교시 내용이 본원에 참고로 포함된 WO 92/16221호(Thompson 등)를 참조한다.)
본 발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 변형제와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민-반응성 변형제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 부위 비특이적 방식으로 항체에 결합될 수 있다. 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항원-결합 단편의 이황화물 결합(예를 들어, 사슬내 이황화물 결합)을 환원시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형제와 반응시켜 본 발명의 변형된 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 항체의 특이적인 부위에 결합하는 유기 모이어티를 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 예컨대 역 단백질 분해(reverse proteolysis)(문헌[Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992)]; 문헌[Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; 문헌[Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233:-2241 (1997)]; 문헌[Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996)]; 문헌[Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)]), 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
항-TNF 항체 조성물에 대한 항-개별특이형 항체. 단클론 또는 키메라 항-TNF 항체에 더하여, 본 발명은 또한 본 발명의 그러한 항체에 특이적인 항-개별특이형(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 다른 항체의 항원-결합 영역과 일반적으로 관련된 독특한 결정자를 인식하는 항체이다. 항체 또는 그의 CDR 함유 영역을 갖는 Id 항체의 공급원과 동일한 종 및 유전자 유형의 동물(예를 들어, 마우스 품종)을 면역화함으로써 항-Id를 제조할 수 있다. 면역화 동물은 면역화 항체의 개별특이형 결정자를 인식하고 반응하여 항-Id 항체를 생산할 것이다. 항-Id 항체는 또한 "면역원"으로서 사용되어 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도하여, 소위 항-항-Id 항체를 생산할 수 있다.
항-TNF 항체 조성물. 본 발명은 또한, 비-천연 발생 조성물, 혼합물, 또는 형태로 제공되는, 본원에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 그 초과의 이의 항-TNF 항체를 포함하는 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8의 연속 아미노산의 70 내지 100%, 또는 이의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-TNF 항체 아미노산 서열의 1개 또는 2개 이상의 전장, C- 및/또는 N-말단 결실 변이체, 도메인, 단편, 또는 특정 변이체를 포함하는 비-천연 발생 조성물을 포함한다. 바람직한 항-TNF 항체 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 70 내지 100%의 항-TNF 항체 서열 중의 일부, 또는 이의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체를 함유하는 적어도 하나의 CDR 또는 LBR로서 1개 또는 2개 이상의 전장, 단편, 도메인, 또는 변이체를 포함한다. 추가로 바람직한 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 70 내지 100% 중 적어도 하나의 40 내지 99%, 또는 이의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체를 포함한다. 본 기술 분야에 알려지거나 본 발명에 기재된 바와 같이, 그러한 조성 백분율은 액체 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼, 또는 콜로이드로서 중량, 부피, 농도, 몰 농도, 몰랄 농도를 기준으로 한다.
본 발명의 항-TNF 항체 조성물은, 그러한 조정, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에 대한 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 TNF 길항제(비제한적인 예로서, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 이의 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제(예를 들어, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살진), 근육 이완제, 안정제, 비스테로이드 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제(예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤리드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예를 들어, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역화, 면역글로불린, 면역억제제(예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조병제, 항정신병제, 불안 완화제, 수면제, 교감신경자극제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함하는, 적어도 하나의 조성물 또는 약학적 조성물의 임의의 적합하고 유효한 양을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 사이토카인의 비제한적인 예는 IL-1 내지 IL-23 중 임의의 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 용량은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT(2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)]을 참조하며, 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
그러한 항암제 또는 항감염제는 적어도 하나의 본 발명의 항체와 회합, 결합, 동시-제형화 또는 동시 투여되는 독소 분자를 또한 포함할 수 있다. 독소는 선택적으로 병리학적 세포 또는 조직을 선택적으로 살해하는 작용을 할 수 있다. 병리학적 세포는 암 또는 다른 세포일 수 있다. 그러한 독소는, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소, 베놈 독소, 또는 박테리아 독소 중 적어도 하나로부터 선택된 독소의 적어도 하나의 기능적 세포독성 도메인을 포함하는 정제되거나 재조합된 독소 또는 독소 단편일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 용어 독소는 또한, 사멸을 유발할 수 있는 독소 쇼크를 포함하는, 인간 및 다른 포유류에서 임의의 병리학적 병태를 야기할 수 있는 임의의 천연 발생 돌연변이 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생산되는 내독소 및 외독소 둘 모두를 포함한다. 그러한 독소는 장독성 이. 콜라이 열-불안정성 장독소(LT), 열-안정성 장독소(ST), 시겔라(Shigella) 세포독소, 아에로모나스(Aeromonas) 장독소, 독성 쇼크 증후군 독소-1(TSST-1), 스타필로코커스(Staphylococcus) 장독소 A(SEA), B(SEB), 또는 C(SEC), 스트렙토코커스 장독소 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 박테리아는 하기 종의 균주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 장독성 이. 콜라이(ETEC), 장출혈성 이. 콜라이(예를 들어, 혈청형 0157:H7의 균주),스타필로코커스 종(예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오게네스(Staphylococcus pyogenes)), 시겔라 종(예를 들어, 시겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디(Shigella boydii), 및 시겔라 소네이(Shigella sonnei)), 살모넬라 종(예를 들어, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 콜레라-수이스(Salmonella cholera-suis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)), 클로스트리듐(Clostridium) 종(예를 들어, 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium dificile), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)), 캄플로박터(Camphlobacter) 종(예를 들어, 캄플로박터 제주니(Camphlobacter jejuni), 캄플로박터 페투스(Camphlobacter fetus)), 헬리코박터(Helicobacter) 종(예를 들어, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 에어로모나스(Aeromonas) 종(예를 들어, 에어로모나스 소브리아(Aeromonas sobria), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 카비아(Aeromonas caviae)), 플레이소모나스 시겔로이데스(Pleisomonas shigelloides), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 비브리오(Vibrio) 종(예를 들어, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(ibrio parahemolyticus)), 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코사이(Streptococci). 예를 들어, 문헌[Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990)]; 문헌[Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991)]; 문헌[Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990)]; 문헌[Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992]; 문헌[Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991)]; 문헌[Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990)]을 참조하며, 이들 참고문헌의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 항-TNF 항체 화합물, 조성물, 또는 조합은 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 방부제, 아주번트 등과 같으나 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 임의의 적합한 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 보조제가 바람직하다. 이러한 무균 용액의 제조 방법의 비제한적인 예는 문헌[Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co.(Easton, PA) 1990]과 같이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 기술 분야에 잘 알려지거나 본원에 기재된 바와 같이 항-TNF 항체, 단편, 또는 변이체 조성물의 투여 방식, 용해도, 및/또는 안정성에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 일상적으로 선택될 수 있다.
본 조성물에 유용한 약학적 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 및 올리고당류를 포함하는 당; 유도체화된 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이는 단독으로 또는 조합하여 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%를 차지하면서 개별적으로 또는 조합하여 존재할 수 있다. 예시적인 단백질 부형제는 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 완충 용량에서도 기능할 수 있는 대표적인 아미노산/항체 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 류신, 아이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글리신이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제는, 예를 들어, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(글루시톨), 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 본 발명에 사용하기 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스 및 라피노스이다.
항-TNF 항체 조성물은 완충제 또는 pH 조절제를 또한 포함할 수 있으며; 전형적으로, 완충제는 유기산 또는 유기 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 석신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 트로메타민 염산염 또는 인산염 완충제를 포함한다. 본 조성물에 사용하기에 바람직한 완충제는 시트레이트와 같은 유기산 염이다.
추가로, 본 발명의 항-TNF 항체 조성물은 폴리비닐피롤리돈, 피콜(중합체 당), 덱스트레이트(예를 들어, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제(예를 들어, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"과 같은 폴리소르베이트), 지질(예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), 및 킬레이트제(예를 들어, EDTA)와 같은 중합체 부형제/첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항-TNF 항체, 부분, 또는 변이체 조성물에 사용하기에 적합한 이들 및 추가의 알려진 약학적 부형제 및/또는 첨가제는, 예를 들어 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995)], 및 문헌["Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)]에 열거된 바와 같이 본 기술 분야에 알려져 있으며, 이들의 개시내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들어, 당류 및 알디톨) 및 완충제 (예를 들어, 시트레이트) 또는 중합체 물질이다.
제형. 상기 언급된 바와 같이 본 발명은, 약학적으로 허용가능한 제형 내에 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는, 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 갖는 인산염 완충제인 안정한 제형과 더불어, 방부제를 함유하는 보존된 용액 및 제형 및 약학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도의 보존된 제형을 제공한다. 보존된 제형은 적어도 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐머큐릭 니트라이트, 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부탄올, 염화마그네슘(예를 들어, 6수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살, 또는 수성 희석제 중의 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택되는 적어도 하나의 알려진 방부제를 함유한다. 임의의 적합한 농도 또는 혼합물, 예컨대 0.001 내지 5%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 비제한적인 예로서 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4., 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이 본 기술 분야에 알려진 바와 같이 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 방부제를 포함하지 않거나, 0.1 내지 2%의 m-크레졸(예를 들어, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1 내지 3%의 벤질 알코올(예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1., 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001 내지 0.5%의 티메로살(예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001 내지 2.0%의 페놀(예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005 내지 1.0%의 알킬파라벤(들)(예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이 본 발명은, 포장 재료, 및 선택적으로 수성 희석제 내의 처방된 완충제 및/또는 방부제와 함께 적어도 하나의 항-TNF 항체의 용액을 포함하는 적어도 하나의 바이알을 포함하는 제조 물품을 제공하며, 상기 포장 재료는 그러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있음을 표시하는 표지를 포함한다. 본 발명은 포장 재료, 동결건조된 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 제1 바이알, 및 처방된 완충제 또는 방부제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 제조 물품을 추가로 포함하며, 상기 포장 재료는 적어도 하나의 항-TNF 항체를 수성 희석제 내에 재구성하여 24시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있는 용액을 형성하도록 환자에게 지시하는 표지를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 적어도 하나의 항-TNF 항체는 포유류 세포 또는 트랜스제닉 제조를 포함하는 재조합 수단에 의해 생산될 수 있거나, 본원에 기재되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같은 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본 발명의 생산물에서 적어도 하나의 항-TNF 항체의 범위는 재구성시에, 습윤/건조 시스템에서의 경우, 약 1.0 μg/ml 내지 약 1000 mg/ml의 농도를 산출하는 양을 포함하지만, 더 낮거나 높은 농도가 사용가능하고 의도하는 전달 비히클에 좌우되며, 예를 들어 용액 제형은 경피 패치, 폐, 경점막, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과는 상이할 것이다.
바람직하게는, 선택적으로 수성 희석제는 약학적으로 허용되는 방부제를 추가로 포함한다. 바람직한 방부제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 제형에 사용되는 방부제의 농도는 항미생물 효과를 얻기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택되는 방부제에 따라 좌우되며, 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
다른 부형제, 예를 들어 등장화제, 완충제, 산화방지제, 방부제 인핸서가 선택적으로 바람직하게 희석제에 첨가될 수 있다. 글리세린과 같은 등장화제는 알려진 농도에서 통상 사용된다. 생리학적으로 허용되는 완충제는 바람직하게는 개선된 pH 제어를 제공하기 위해 첨가된다. 제형은 약 pH 4 내지 약 pH 10과 같은 넓은 범위의 pH를 포함할 수 있고, 바람직한 범위는 약 pH 5 내지 약 pH 9이며, 가장 바람직한 범위는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 바람직하게는 본 발명의 제형은 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 갖는다. 바람직한 완충제는 인산염 완충제, 가장 바람직하게는 인산나트륨, 특히 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다.
약학적으로 허용가능한 가용화제, 예를 들어 Tween 20(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween 40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), Tween 80(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트), Pluronic F68(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체), 및 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80 또는 폴록사머 184 또는 188, 플루로닉® 폴리올, 다른 블록 공중합체, 및 킬레이트제, 예컨대 EDTA 및 EGTA와 같은 다른 첨가제가 응집을 감소시키기 위해 제형 또는 조성물에 선택적으로 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제형을 투여하기 위해 사용될 경우에 특히 유용하다. 약학적으로 허용되는 계면활성제의 존재는 단백질 응집 성향을 완화시킨다.
본 발명의 제형은 수성 희석제 중의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 방부제와 적어도 하나의 항-TNF 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 적어도 하나의 항-TNF 항체와 수성 희석제 중의 방부제를 혼합하는 단계는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 실행한다. 적합한 제형을 제조하기 위해, 예를 들어, 원하는 농도의 단백질 및 방부제를 제공하기에 충분한 양으로 완충 용액 중의 측정된 양의 적어도 하나의 항-TNF 항체를 완충 용액 중의 원하는 방부제와 조합한다. 이러한 방법의 변형이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.
특허 청구되는 제형은 투명한 용액으로서, 또는 물, 방부제, 및/또는 부형제, 바람직하게는 인산염 완충제 및/또는 식염수 및 선택된 염을 수성 희석제 중에 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 필요한 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고, 환자 치료의 단일 또는 다수의 사이클에 충분하므로 현재 사용되는 것보다 더 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.
본 발명의 특허 청구되는 제조 물품은 즉시 내지 24시간 이상의 기간에 걸쳐 투여하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명에서 청구되는 제조 물품은 환자에게 상당한 이점을 준다. 본 발명의 제형은 선택적으로 약 2 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 저장되고 장기간 동안 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있으며, 따라서 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 또는 96시간 이상의 기간에 걸쳐 용액이 유지 및/또는 사용될 수 있음을 패키지 표지에 표시하는 것이 가능하다. 보존된 희석제가 사용된 경우, 상기 표지는 1 내지 12개월, 반년, 1년 반 및/또는 2년의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 적어도 하나의 항-TNF 항체의 용액은 수성 희석제 중에 적어도 하나의 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 혼합을 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행한다. 적합한 희석제를 제조하기 위하여, 예를 들어 원하는 농도의 단백질 및 선택적으로 방부제 또는 완충제를 제공하기에 충분한 양으로 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 적어도 하나의 항체를 조합한다. 이러한 방법의 변형이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.
특허 청구되는 생산물은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 필요한 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고, 환자 치료의 단일 또는 다수의 사이클에 충분하므로 현재 사용되는 것보다 더 편리한 치료 요법을 제공한다.
특허 청구되는 생산물은 투명한 용액, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 약국, 병원, 또는 그러한 다른 기관 및 시설에 제공함으로써 환자에게 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우 투명한 용액은 최대 1 리터 또는 그보다 훨씬 더 큰 크기일 수 있으며, 큰 저장소를 제공하여, 거기에서 적어도 하나의 항체 용액으로부터 작은 부분을 1회 또는 다회 취하여 작은 바이알에 옮기고, 약국 또는 병원을 통해 고객 및/또는 환자에게 제공할 수 있다.
이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 공인된 장치는, 예를 들어, Becton Dickensen(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재, www.bectondickenson.com), Disetronic(스위스 부르그도르프 소재, www.disetronic.com); Bioject(미국 오레곤주 포틀랜드 소재, www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical(영국 피터버러 소재, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재, www.mediject.com)에 의해 제조되거나 개발된 바와 같은 용액 전달을 위한 펜-주입기 장치(pen-injector device), 예컨대 BD Pens, BD Autojector, Humaject, NovoPen, B-DPen, AutoPen, 및 OptiPen, GenotropinPen, Genotronorm Pen, Humatro Pen, Reco-Pen, Roferon Pen, Biojector, Iject, J-tip Needle-Free Injector, Intraject, Medi-Ject를 포함한다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 공인된 장치는 HumatroPen®과 같은 재구성된 용액의 전달을 위한 카트리지 내의 동결건조된 약물을 재구성하기 위한 펜-주입기 시스템을 포함한다.
현재 특허 청구되는 생산물은 포장 재료를 포함한다. 포장 재료는 규제 당국이 요구하는 정보 이외에 제품을 사용할 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 포장 재료는 2개의 바이알, 습윤/건조 생산물에 대하여 적어도 하나의 항-TNF 항체를 수성 희석제 중에 재구성하여 용액을 형성하고 용액을 2 내지 24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용하도록 하는 설명서를 환자에게 제공한다. 단일 바이알, 용액 생산물의 경우, 표지는 그러한 용액을 2 내지 24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용할 수 있음을 나타낸다. 현재 특허 청구되는 생산물은 인간의 의약품 용도로 유용하다.
본 발명의 제형은 적어도 하나의 항-TNF 항체 및 선택된 완충제, 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 함유하는 인산염 완충제를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에 적어도 하나의 항체와 완충제를 혼합하는 단계는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 실행한다. 적합한 제형을 제조하기 위하여, 예를 들어 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 적어도 하나의 항체를, 원하는 농도의 단백질 및 완충제를 제공하기에 충분한 양의 물 중의 원하는 완충제와 조합한다. 이러한 방법의 변형은 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.
특허 청구되는 안정하거나 보존된 제형은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제 중의 방부제 또는 완충제 및 부형제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 필요한 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고, 환자 치료의 단일 또는 다수의 사이클에 충분하므로 현재 사용되는 것보다 더 편리한 치료 요법을 제공한다.
본원에 기재된 안정하거나 보존된 제형 또는 용액 중의 적어도 하나의 항-TNF 항체는 SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프, 또는 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 당업자가 인정하는 다른 수단을 포함하는 다양한 전달 방법을 통해 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.
치료적 응용. 본 발명은 또한, 본 기술 분야에 알려지거나 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 적어도 하나의 이중 인테그린 항체를 사용하여 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 적어도 하나의 TNF 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 비만, 면역 관련 질환, 심혈관 질환, 감염성 질환, 악성 질환, 또는 신경 질환 중 적어도 하나를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 TNF 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 류마티스 관절염, 연소성, 전신 발현 연소성 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 강직성 척추염, 위궤양, 혈청 음성 관절병증, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 항인지질 증후군, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너 육아종증, 유육종증, 고환염/정관 절제술 역전 과정, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 전신 염증성 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성 패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 노출, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란 증후군, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론병, 겸상적혈구 빈혈증, 당뇨병, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 담마진, 전신 아나필락시스, 피부염, 악성 빈혈, 용혈성 질환, 혈소판 감소증, 임의의 기관 또는 조직의 이식편 거부반응, 신장 이식 거부반응, 심장 이식 거부반응, 간 이식 거부반응, 췌장 이식 거부반응, 폐 이식 거부반응, 골수 이식(BMT) 거부반응, 피부 동종이식 거부반응, 연골 이식 거부반응, 뼈 이식편 거부반응, 소장 이식 거부반응, 태아 흉선 임플란트 거부반응, 부갑상선 이식 거부반응, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부반응, 동종이식 거부반응, 항-수용체 과민 반응, 그레이브스병, 레이노병, B형 인슐린-내성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체 매개 세포독성, III형 과민 반응, 전신 홍반성 루푸스, POEMS 증후군(다발성 신경병증, 기관거대증, 내분비병증, 단클론 감마병증, 및 피부변성 증후군), 다발성 신경병증, 기관거대증, 내분비병증, 단클론 감마병증, 피부변성 증후군, 항인지질 증후군, 천포창, 피부경화증, 혼재성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 백반, 혈관염, MI후 심장절개 증후군, IV형 과민증, 접촉성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식 거부반응, 세포내 유기체에 의한 육아종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨병, 혈색소증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병성 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 원발성 담즙성 간경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성 섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 요법, 항-cd3 요법, 사이토카인 요법, 화학요법, 방사선 요법(비제한적인 예로서, 무력증, 빈혈, 악액질 등), 만성 살리실레이트 중독 등 중 적어도 하나를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 면역 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 각각이 전체적으로 참고로 포함되는 문헌[Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999)], 문헌[Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)]을 참조한다.
본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 심장 기절(cardiac stun) 증후군, 심근경색증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재협착, 당뇨병성 동맥경화성 질환, 고혈압, 동맥성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전, 폐심장증, 원발성 폐고혈압, 심부정맥, 이소성 심방 박동, 심방 조동, 심방 세동(지속성 또는 발작성), 관류후 증후군, 심폐 바이패스 염증 반응, 혼돈성 또는 다소성 심방 빈맥, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 특정 부정맥, 심실세동, 히스 다발(His bundle) 부정맥, 방실 차단, 다발 갈래 차단, 심근 허혈 장애, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근경색증, 심근병증, 확장형 울혈성 심근병증, 제한성 심근병증, 심장 판막 질환, 심내막염, 심낭 질환, 심종양, 대동맥류 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 그의 분지의 폐쇄, 말초 혈관 장애, 동맥 폐쇄성 장애, 말초 아테롬성 동맥경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 장애, 레이노 현상 및 레이노병, 말단청색증, 피부홍통증, 정맥 질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥루, 림프부종, 지방부종, 불안정성 협심증, 재관류 손상, 펌프 후(post pump) 증후군, 허혈-재관류 손상 등 중 적어도 하나를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 심혈관 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 그러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 급성 또는 만성 박테리아 감염, 박테리아, 바이러스, 및 진균 감염을 포함하는 급성 또는 만성 기생 또는 감염 과정, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염(A 형, B 형, 또는 C 형 등), 화농성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 이. 콜라이 0157:h7, 용혈성 요독 증후군/혈전용해성 혈소판감소성 자반증, 말라리아, 뎅기 출혈열, 레슈마니아증, 한센병, 독성 쇼크 증후군, 스트렙토코커스 근염, 가스 괴저, 마이코박테리움 투버쿨로시스(mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium) 세포내감염(intracellulare), 뉴모시스티스 카리니(pneumocystis carinii) 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염/부고환염, 레지오넬라(legionella), 라임병, 인플루엔자 a, 엡스테인-바르 바이러스, 바이러스-관련 혈구탐식성 증후군, 활성 뇌염/무균성 수막염 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 감염성 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포, 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프모세포성 백혈병(CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군(MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버키트 림프종, 다중 흑색종, 카포시 육종, 결장직장 암종, 췌장 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 부신생물 증후군/악성종양의 과칼슘혈증, 고형 종양, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암 관련 골통 등 중 적어도 하나를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 악성 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 신경 변성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 합병증, 탈수초 질환, 예컨대 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌 장애, 예컨대 피질 척수계 병변; 기저 신경절의 장애 또는 소뇌 장애; 과다운동성 운동 장애, 예컨대 헌팅턴 무도병 및 노인성 무도병; 약물 유도 운동 장애, 예컨대 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도되는 것들; 운동저하 장애, 예컨대 파킨슨병; 진행성 핵상마비; 소뇌의 구조 병변; 척수소뇌 변성증, 예컨대 척수성 운동실조, 프리드리히 운동실조, 소뇌 피질 변성증, 다발성 체계 변성증(멘셀(Mencel), 데제린-토마스(Dejerine-Thomas), 사이-드래거(Shi-Drager), 및 마카도-조셉(Machado-Joseph)); 전신 장애(레프섬 병, 무베타지질단백혈증, 운동실조, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다발계통 장애); 탈수초 코어 장애, 예컨대 다발성 경화증, 급성 횡단성 척추염; 및 운동 단위의 장애, 예컨대 신경성 근위축증(전각 세포 변성증, 예컨대 근위축성 측삭경화증, 유아 척수성 근위축증 및 연소성 척수성 근위축증); 알츠하이머 질환; 중년의 다운 증후군; 미만성 루이소체병; 루이소체형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프 증후군; 만성 알코올 의존증; 크로이츠펠트-야콥병; 아급성 경화성 범뇌염; 할러포르텐-스파츠 병; 및 권투 선수 치매 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 신경 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 선택적으로 적어도 하나의 TNF 항체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992)]을 참조한다.
본 발명의 임의의 방법은 그러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 방법은 선택적으로 그러한 면역 질환의 치료를 위한 동시-투여 또는 병용 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 항-TNF 항체, 이의 특정 부분, 또는 변이체의 투여는 적어도 하나의 TNF 길항제(비제한적인 예를 들어, TNF-항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 이의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제(예를 들어, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살진), 근육 이완제, 안정제, 비스테로이드 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제(예를 들어, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예를 들어, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역화, 면역글로불린, 면역억제제(예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조병제, 항정신병제, 불안 완화제, 수면제, 교감신경자극제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 적어도 하나를 사전에, 동시에, 및/또는 사후에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 용량은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT(2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)]을 참조하며, 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 조성물, 병용 요법, 동시-투여, 장치, 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제(적어도 하나의 본 발명의 항체, 이의 특정 부분, 및 변이체를 추가로 포함함)는 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; TNF 합성, TNF 방출, 또는 표적 세포에 대한 그의 작용을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 탈리도마이드, 테니댑, 포스포다이에스테라제 억제제(예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 작용제 및 A2b 아데노신 수용체 인핸서; TNF 수용체 신호전달을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나제 억제제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 메탈로프로테이나제 억제제; TNF 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제(예를 들어, 캅토프릴); 및 TNF 생산 및/또는 합성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 MAP 키나제 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는, "종양 괴사 인자 항체", "TNF 항체 ", "TNFα 항체 ", 또는 단편 등은 시험관내, 원위치, 및/또는 바람직하게는 생체내에서 TNFα 활성을 감소, 차단, 억제, 제거, 또는 방해한다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 TNF 인간 항체는 TNFα에 결합할 수 있고, 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 TNFα에 특이적으로 결합하는 이의 특정 돌연변이체 또는 도메인을 포함한다. 적합한 TNF 항체 또는 단편은 또한, TNF RNA, DNA, 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호전달, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 제거, 방해, 방지, 및/또는 억제할 수 있다.
키메라 항체 cA2는 A2로 표기되는 고친화도 중화 마우스 항-인간 TNFα IgG1 항체의 항원 결합 가변 영역 및 카파 면역글로불린인 인간 IgG1의 불변 영역으로 이루어진다. 인간 IgG1 Fc 영역은 동종이계 항체 이펙터 기능을 개선하며, 순환 혈청 반감기를 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 결합활성 및 에피토프 특이성은 쥐과 항체 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 쥐과 항체 A2의 가변 영역을 암호화하는 핵산에 대한 바람직한 공급원은 A2 하이브리도마 세포주이다.
키메라 A2(cA2)는 용량 의존적 방식으로 천연 및 재조합 인간 TNFα 둘 모두의 세포독성 효과를 중화시킨다. 키메라 항체 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 검정으로부터, 키메라 항체 cA2의 친화도 상수는 1.04×1010 M-1인 것으로 계산되었다. 경쟁적 억제에 의해 단클론 항체 특이성 및 친화도를 결정하는 바람직한 방법은 문헌[Harlow, et al., antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988]; 문헌[Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992-2000)]; 문헌[Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983)]; 문헌[Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000)]; 및 문헌[Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983)]에서 확인할 수 있으며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 쥐과 단클론 항체 A2는 c134A로 표기된 세포주에 의해 생산된다. 키메라 항체 cA2는 c168A로 표기된 세포주에 의해 생산된다.
본 발명에 사용될 수 있는 단클론 항-TNF 항체의 추가의 예가 본 기술 분야에 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,231,024호; 문헌[
, A. et al., Cytokine 2(3):162-169 (1990); 미국 특허 출원 제07/943,852호(1992년 9월 11일자로 출원됨); 국제특허 공개 제WO 91/02078호(Rathjen 등, 1991년 2월 21일자로 공개됨); EPO 특허 공개 제0 218 868호(Rubin 등, 1987년 4월 22일자로 공개됨); EPO 특허 공개 제0 288 088호(Yone 등, 1988년 10월 26일자); 문헌[Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986)]; 문헌[Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987)]; 문헌[Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987)]; 문헌[Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987)]; 및 문헌[Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987)]을 참조하며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨).
TNF 수용체 분자. 본 발명에 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 높은 친화도로 TNFα에 결합하고(예를 들어, 국제특허 공개 제WO 92/07076호(Feldmann 등, 1992년 4월 30일자로 공개됨)); 문헌[Schall et al., Cell 61:361-370 (1990)]; 및 문헌[Loetscher et al., Cell 61:351-359 (1990)]을 참조하며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨) 선택적으로 낮은 면역원성을 보유하는 것들이다. 특히, 55 kDa(p55 TNF-R) 및 75 kDa(p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 기능부를 포함하는 이들 수용체의 절단 형태(예를 들어, 문헌[Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223:831-840 (1994)] 참조)가 또한 본 발명에 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 절단 형태는 소변 및 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα 억제성 결합 단백질로서 검출되었다(문헌[Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)]). TNF 수용체 다량체 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자, 및 이의 유도체 및 단편 또는 부분은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 수용체 분자의 추가의 예이다. 본 발명에 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자는 증상의 양호한 내지 우수한 경감 및 낮은 독성으로 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 그의 능력을 특징으로 한다. 낮은 면역원성 및/또는 높은 친화도와 더불어, 정의되지 않은 다른 특성이 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다.
본 발명에 유용한 TNF 수용체 다량체 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 링커 또는 다른 비펩티드 링커, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 통해 연결된 2개 이상의 TNF 수용체의 ECD의 전부 또는 기능부를 포함한다. 다량체 분자의 발현을 유도하기 위해 다량체 분자는 분비되는 단백질의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이들 다량체 분자 및 그의 생산 방법은 미국 특허 출원 제08/437,533호(1995년 5월 9일자로 출원됨)에 기재되어 있으며, 그 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 면역수용체 융합 분자는 하나 이상의 면역글로불린 분자의 적어도 하나의 부분 및 하나 이상의 TNF 수용체의 전부 또는 기능부를 포함한다. 이들 면역수용체 융합 분자는 단량체, 또는 이종다량체 또는 동종다량체로서 조립될 수 있다. 면역수용체 융합 분자는 또한 1가 또는 다가일 수 있다. 그러한 TNF 면역수용체 융합 분자의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 생산 방법은 본 기술 분야에 기재되어 있다(문헌[Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991)]; 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991)]; 문헌[Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)]; 문헌[Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 (1994)]; 문헌[Butler et al., Cytokine 6(6):616-623 (1994)]; 문헌[Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994)]; 미국 특허 제5,447,851호(Beutler 등); 및 미국 특허 출원 제08/442,133호(1995년 5월 16일자로 출원됨), 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨). 면역수용체 융합 분자의 생산 방법은 또한 미국 특허 제5,116,964호(Capon 등); 미국 특허 제5,225,538호(Capon 등); 및 문헌[Capon et al., Nature 337:525-531 (1989)]에서 확인할 수 있으며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
TNF 수용체 분자의 기능적 등가물, 유도체, 단편, 또는 영역은 TNF 수용체 분자의 부분, 또는 TNF 수용체 분자를 암호화하는 TNF 수용체 분자 서열의 부분을 지칭하며, 이는 본 발명에 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자와 기능적으로 유사하기에(예를 들어, 높은 친화도로 TNFα에 결합하고 낮은 면역원성을 보유함) 충분한 크기 및 서열을 갖는다. TNF 수용체 분자의 기능성 등가물은 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자와 기능적으로 유사한(예를 들어, 높은 친화도로 TNFα에 결합하고 낮은 면역원성을 보유함) 변형된 TNF 수용체 분자를 포함한다. 예를 들어, TNF 수용체 분자의 기능적 등가물은 "침묵(silent)" 코돈 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 함유할 수 있다(예를 들어, 하나의 산성 아미노산으로 다른 산성 아미노산을 치환함; 또는 동일하거나 상이한 소수성 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈으로 소수성 아미노산을 암호화하는 다른 코돈을 치환함). 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2000)]을 참조한다.
사이토카인은 임의의 알려진 사이토카인을 포함한다. 예를 들어 문헌[CopewithCytokines.com]을 참조한다. 사이토카인 길항제는 임의의 항체, 단편 또는 모방체, 임의의 가용성 수용체, 단편 또는 모방체, 임의의 소분자 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
치료적 치료. 본 발명의 임의의 방법은, TNF 매개 장애의 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, TNF 매개 장애를 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 그러한 방법은 선택적으로 그러한 면역 질환의 치료를 위한 동시-투여 또는 병용 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 항-TNF 항체, 이의 특정 부분, 또는 변이체의 투여는 적어도 하나의 TNF 길항제(비제한적인 예로서, TNF-항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 이의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제(예를 들어, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살진), 근육 이완제, 안정제, 비스테로이드 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제(예를 들어, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예를 들어, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역화, 면역글로불린, 면역억제제(예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조병제, 항정신병제, 불안 완화제, 수면제, 교감신경자극제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 적어도 하나를 사전에, 동시에, 및/또는 사후에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
통상적으로, 병리학적 병태의 치료는 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물의 효과적인 양 또는 투여량을 투여함으로써 이루어지며, 이는 조성물에 함유된 고유 활성에 따라, 합산하여 평균적으로 용량당 환자의 킬로그램당 약 0.01 내지 500 밀리그램 이상의 범위의 적어도 하나의 항-TNF 항체, 바람직하게는 단일 또는 다중 투여당 환자의 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램 이상의 항체이다. 대안적으로, 유효 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여당 0.1 내지 5000 μg/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 용량이 임상의에게 알려져 있으며, 물론 특정 질병의 상태, 투여되는 조성물의 고유 활성 및 치료할 특정 환자에 따라 달라질 것이다. 일부의 경우, 요구되는 치료량을 달성하기 위해, 반복 투여, 즉 요구되는 일일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 특정 모니터링 또는 계량 용량의 개별적인 투여를 반복하는 것이 필요할 수 있다.
바람직한 용량은 선택적으로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및/또는 100 내지 500 mg/kg/투여, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율을 포함할 수 있거나, 단일 또는 다중 투여당 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 및/또는 5000 μg/ml 혈청 농도, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율의 혈청 농도를 달성하기 위한 것이다.
대안적으로, 투여되는 투여량은 알려진 인자, 예컨대 특정 작용제의 약력학적 특징, 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 변동될 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 용량은 체중 1 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 통상적으로, 원하는 결과를 얻기 위해, 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.1 내지 10 밀리그램/킬로그램/투여 또는 서방형이 효과적이다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는, 본 발명의 적어도 하나의 항체 0.1 내지 100 mg/kg/일, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/kg/일의 1회 또는 주기적 투여량으로서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 또는 추가로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52주 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 또는 추가로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20년 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합에, 단일, 주입, 또는 반복 용량을 사용하여 제공할 수 있다.
체내 투여에 적합한 투여형(조성물)은 일반적으로 단위 또는 용기당 약 0.1 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이러한 약학적 조성물에서, 활성 성분은 대체로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 내지 99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.
비경구 투여의 경우, 항체는 약학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 함께 또는 별도로 제공되는 용액, 현탁액, 에멀젼, 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 1 내지 10% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충제 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형은 알려진 기술 또는 적합한 기술에 의해 멸균된다.
적합한 약학적 담체는 본 분야의 표준 참고문헌인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 최신판에 기재되어 있다.
대안적 투여. 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-TNF 항체의 약학적 유효량을 투여하기 위해 알려지고 개발된 많은 투여 방식이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 하기 설명에서는 폐 투여가 사용되지만, 본 발명에 따라 다른 투여 방식을 사용하여 적합한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 TNF 항체는, 흡입 또는 본원에서 기재되거나 본 기술 분야에 알려진 다른 방식에 의한 투여에 적합한 임의의 다양한 장치 및 방법을 사용하여, 용액, 에멀젼, 콜로이드, 또는 현탁액으로서, 또는 건조 분말로서 담체 중에 전달될 수 있다.
비경구 제형 및 투여. 비경구 투여용 제형은 통상적인 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사를 위한 수성 또는 유성 현탁액은 알려진 방법에 따라 적당한 유화제 또는 습윤화제 및 현탁제를 사용하여 제조될 수 있다. 주사용 제제는 용매 중의 수용액 또는 멸균 주사용 용액 또는 현탁액과 같은 비독성의 비경구 투여가능한 희석제일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 염수 등이 허용되며; 통상의 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 다이- 또는 트라이-글리세라이드를 포함하는 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구적 투여는 본 기술 분야에 알려져 있으며, 미국 특허 제5,851,198호에 기재된 기체 가압 무-바늘 주사 장치, 및 전체적으로 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,839,446호에 기재된 레이저 천공 장치와 같은 통상적인 주사 수단을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대안적 전달. 본 발명은 추가로, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복막내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 수단에 의한 적어도 하나의 항-TNF 항체의 투여에 관한 것이다. 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물은, 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구(피하, 근육내, 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여에 사용하기 위해; 특히 크림 및 좌약과 같으나 이에 제한되지 않는 반고체 형태로 질 또는 직장 투여에 사용하기 위해; 정제 또는 캡슐의 형태와 같으나 이에 제한되지 않는 협측 또는 설하 투여를 위해; 또는, 분말, 점비제(nasal drop), 또는 에어로졸 또는 소정 제제의 형태와 같으나 이에 제한되지 않는 비강내; 또는 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치 내의 약물 농도를 증가시키기 위한 다이메틸 설폭사이드와 같은 화학적 인핸서를 갖거나(전체적으로 본원에 참고로 포함된 문헌[Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994]), 단백질 및 펩티드를 함유하는 제형의 피부 상의 적용을 가능하게 하는 산화제(WO 98/53847호), 또는 전기천공과 같이 일시적 수송 경로를 생성하거나 이온영동법과 같이 피부를 통해 하전된 약물의 이동성을 증가시키기 위한 전기장의 적용, 또는 음파영동과 같은 초음파의 적용(미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)을 갖는, 겔, 연고, 로션, 현탁액, 또는 패치 전달 시스템과 같으나 이에 제한되지 않는 경피 투여를 위해 제조될 수 있다(상기 간행물 및 특허는 전체적으로 본원에 참고로 포함됨).
폐/비강 투여. 폐 투여의 경우, 바람직하게는 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물은 폐 또는 부비동(sinus)의 하기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 본 발명에 따라, 적어도 하나의 항-TNF 항체는 흡입에 의한 치료제의 투여를 위해 본 기술 분야에 알려진 임의의 다양한 흡입 또는 비내 장치에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비강 또는 폐포 내에 에어로졸화된 제형을 침착시킬 수 있는 이들 장치는 정량 흡입기, 네뷸라이저(nebulizer), 건조 분말 발생기, 분무기 등을 포함한다. 항체의 폐 또는 비내 투여를 유도하기에 적합한 다른 장치 또한 본 기술 분야에 알려져 있다. 그러한 모든 장치는 에어로졸 중의 항체를 분배하기 위해 투여에 적합한 제형을 사용할 수 있다. 그러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성 둘 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. Ventolin® 정량 흡입기와 같은 정량 흡입기는 전형적으로 추진제 기체를 사용하며, 흡기 중에 구동(actuation)을 필요로 한다 (예를 들어, WO 94/16970호, WO 98/35888호 참조). Turbuhaler™(Astra), Rotahaler®(Glaxo), Diskus®(Glaxo), Spiros™ 흡입기(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 시판되는 장치, 및 Spinhaler® 분말 흡입기(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 분말의 호흡-구동을 사용한다(전체적으로 본원에 참고로 포함된 US 4668218호(Astra), EP 237507호(Astra), WO 97/25086호(Glaxo), WO 94/08552호(Dura), US 5458135호(Inhale), WO 94/06498호(Fisons)). AERx™(Aradigm), Ultravent® 네뷸라이저(Mallinckrodt), 및 Acorn II® 네뷸라이저(Marquest Medical Products)(US 5404871호(Aradigm), WO 97/22376호)와 같은 네뷸라이저는 용액으로부터 에어로졸을 생산하는 반면에, 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소입자 에어로졸을 생성하며, 상기 참고문헌은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 구매가능한 흡입 장치의 이들 특이적 예는 본 발명의 실시에 적합한 특이적 장치를 대표하는 것으로 의도되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 바람직하게는, 적어도 하나의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본 발명의 적어도 하나의 항체를 투여하기 위한 흡입 장치의 몇몇의 바람직한 특성이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 유리하게는 신뢰성있고, 재현가능하며, 정확하다. 양호한 호흡성을 위해, 흡입 장치는, 예를 들어 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 내지 5 μm의 작은 건조 입자를 선택적으로 전달할 수 있다.
분무로서의 TNF 항체 조성물의 투여. TNF 항체 조성물 단백질을 포함하는 분무는 적어도 하나의 항-TNF 항체의 현탁액 또는 용액을 압력 하에 노즐에 통과시킴으로써 생산할 수 있다. 노즐 크기 및 구성, 적용된 압력, 및 액체 공급 속도는 원하는 출력 및 입자 크기를 달성하도록 선택될 수 있다. 전기분무는, 예를 들어 모세관 또는 노즐 공급과 연결된 전기장에 의해 생산될 수 있다. 유리하게는, 분무기에 의해 전달되는 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm 범위의 입자 크기를 갖는다.
분무기와 함께 사용하기에 적합한 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 제형은 통상적으로 용액 1 ml 당 또는 gm 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 농도, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 비제한적인 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/ml 또는 mg/gm로 수용액 중의 항체 조성물 단백질을 포함한다. 제형은 부형제, 완충제, 등장화제, 방부제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연과 같은 제제를 포함할 수 있다. 제형은 또한, 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물과 같은, 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 제제를 포함할 수 있다. 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질 제형은 또한, 에어로졸을 형성함에 있어서 용액의 연무화(atomization)에 의해 야기되는 항체 조성물 단백질의 표면-유도 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상의 계면활성제가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제형의 약 0.001 내지 14 중량%의 범위일 것이다. 본 발명의 목적상 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. TNF 항체, 또는 특정 부분 또는 변이체와 같은 단백질의 제형화를 위해 본 기술 분야에 알려진 추가의 제제가 또한 제형 내에 포함될 수 있다.
네뷸라이저에 의한 TNF 항체 조성물의 투여. 항체 조성물 단백질은 제트 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저와 같은 네뷸라이저에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 제트 네뷸라이저에서는, 압축 공기 공급원을 사용하여 오리피스(orifice)를 통해 고속 공기 제트를 생성한다. 노즐 너머로 기체가 팽창함에 따라 저압 영역이 생성되고, 이는 액체 저장소에 연결된 모세관을 통해 항체 조성물 단백질의 용액을 흡인한다. 모세관으로부터의 액체 흐름은 그것이 튜브에서 나감에 따라 불안정한 필라멘트 및 소적으로 전단되어, 에어로졸을 생성한다. 소정의 제트 네뷸라이저로부터 원하는 성능 특성을 달성하기 위해 소정 범위의 구성, 유속, 및 배플 유형이 사용될 수 있다. 초음파 네뷸라이저에서는, 고주파 전기 에너지를 사용하여 진동, 기계적 에너지를 생성하며, 전형적으로는 압전 변환기(piezoelectric transducer)를 사용한다. 이 에너지는 직접 또는 커플링 유체를 통해 항체 조성물 단백질의 제형에 전달되어 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성한다. 유리하게는, 네뷸라이저에 의해 전달되는 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm 범위의 입자 크기를 갖는다.
제트 또는 초음파 네뷸라이저와 함께 사용하기에 적합한 적어도 하나의 항-TNF 항체의 제형은 전형적으로 용액 1 ml 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 농도의 적어도 하나의 항-TNF 항체 단백질을 포함한다. 제형은 부형제, 완충제, 등장화제, 방부제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연과 같은 제제를 포함할 수 있다. 제형은 또한 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물과 같은, 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 제제를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 적어도 하나의 항-TNF 항체의 제형화에 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 적어도 하나의 항-TNF 항체 제형은 또한, 에어로졸 형성시에 용액의 연무화에 의해 야기되는 적어도 하나의 항-TNF 항체의 표면-유도 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탈 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상의 계면활성제가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제형의 약 0.001 내지 4 중량%의 범위일 것이다. 본 발명의 목적상 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 항체 단백질과 같은 단백질의 제형화를 위해 본 기술 분야에 알려진 추가의 제제가 또한 제형 내에 포함될 수 있다.
정량 흡입기에 의한 TNF 항체 조성물의 투여. 정량 흡입기(MDI)에서는, 추진제, 적어도 하나의 항-TNF 항체, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 기체를 포함하는 혼합물로서 캐니스터(canister) 내에 함유된다. 계량 밸브를 작동시키면 혼합물을 바람직하게는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm의 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 방출한다. 원하는 에어로졸 입자 크기는 제트 밀링, 분무 건조, 임계점 응축 등을 포함하여 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 생산된 항체 조성물 단백질의 제형을 사용하여 얻을 수 있다. 바람직한 정량 흡입기는 3M 또는 Glaxo에 의해 제조되고 하이드로플루오로카본 추진제를 사용하는 것들을 포함한다.
정량 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 적어도 하나의 항-TNF 항체의 제형은 일반적으로, 예를 들어 계면 활성제의 보조를 받아 추진제 중에 현탁된 비수성 매질 중의 현탁액으로서 적어도 하나의 항-TNF 항체를 함유하는 미세 분할된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 이러한 목적을 위해 사용되는 임의의 통상의 재료, 예컨대 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로다이플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134 a(하이드로플루로알칸-134 a), HFA-227(하이드로플루로알칸-227) 등을 포함하는, 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 하이드로카본일 수 있다. 바람직하게는 추진제는 하이드로플루오로카본이다. 계면활성제는 화학적 분해 등에 대해 활성 제제를 보호하기 위해 추진제 중의 현탁액으로서의 적어도 하나의 항-TNF 항체를 안정화하도록 선택될 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트라이올레에이트, 대두 레시틴, 올레산 등을 포함한다. 일부 경우에 에탄올과 같은 용매를 사용하는 용액 에어로졸이 바람직하다. 단백질의 제형화를 위해 본 기술 분야에 알려진 추가의 제제가 또한 제형 내에 포함될 수 있다.
본원에 기재되지 않은 장치를 통한 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물의 폐 투여에 의해 본 발명의 방법이 달성될 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.
경구 제형 및 투여. 경구용 제형은 장 벽의 투과성을 인공적으로 증가시키기 위한 아주번트(예를 들어, 레소르시놀 및 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 동시-투여와 더불어, 효소적 분해를 억제하기 위한 효소 억제제(예를 들어, 췌장 트립신 억제제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실올)의 동시-투여에 의존한다. 경구 투여용 고체-유형 투여형의 활성 성분 화합물은 수크로스, 락토스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트래거캔스 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체, 및 글리세라이드를 포함하는 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이러한 투여형은 또한, 예를 들어 비활성 희석제, 윤활제(예컨대, 마그네슘 스테아레이트. 파라벤), 보존제(예컨대, 소르브산, 아스코르브산, α-토코페롤), 항산화제(예컨대, 시스테인), 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 향미제, 방향제 등과 같은 다른 유형(들)의 첨가제를 함유할 수 있다.
정제 및 환제는 장용 코팅 제제로 추가로 가공될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 의학적 용도로 허용가능한 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액, 및 용액 제제를 포함한다. 이들 제제는 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 리포좀 또한 인슐린 및 헤파린에 대한 약물 전달 시스템으로서 기재되었다(미국 특허 제4,239,754호). 더 최근에는, 혼합 아미노산의 인공 중합체(프로테이노이드)의 미소구체가 의약품을 전달하기 위해 사용되었다(미국 특허 제4,925,673호). 추가로, 생물학적 활성 제제를 경구 전달하기 위해 사용되는, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제5,5,871,753호에 기재된 담체 화합물이 본 기술 분야에 알려져 있다.
점막 제형 및 투여. 점막 표면을 통한 흡수를 위해 적어도 하나의 항-TNF 항체를 투여하는 조성물 및 방법은 복수의 미크론 미만의 입자, 점막부착성 거대분자, 생물활성 펩티드, 및 에멀젼 입자의 점막부착을 달성함으로써 점막 표면을 통한 흡수를 촉진하는 수성 연속상을 포함하는 에멀젼을 포함한다(미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀젼의 적용에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 협측, 설하, 비강, 질, 폐, 위, 장, 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여용 제형, 예를 들어 좌제는 부형제로서, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비강내 투여용 제형은 고체일 수 있으며, 부형제로서, 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 점비제의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 협측 투여용 부형제는 당, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 전호화 전분(pregelinatined starch) 등을 포함한다(미국 특허 제5,849,695호).
경피 제형 및 투여. 경피 투여를 위해, 적어도 하나의 항-TNF 항체는 리포좀 또는 중합체 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 미소구체(달리 언급되지 않는 한, 집합적으로 마이크로입자로 지칭됨)와 같은 전달 장치 내에 캡슐화된다. 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 이의 공중합체와 같은 폴리하이드록시산, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 및 폴리포스파진과 같은 합성 중합체, 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 다른 단백질, 알기네이트 및 다른 다당류와 같은 천연 중합체, 및 이들의 조합으로 이루어진 마이크로입자를 포함하는 다수의 적합한 장치가 알려져 있다(미국 특허 제5,814,599호).
장기간의 투여 및 제형. 장기간의 시간에 걸쳐, 예를 들어, 단일 투여로부터 1주 내지 1년의 기간 동안 대상에게 본 발명의 화합물을 전달하는 것이 간혹 바람직할 수 있다. 다양한 서방성 데포(depot) 또는 임플란트 투여형이 이용될 수 있다. 예를 들어, 투여형은 체액 중의 낮은 용해도를 갖는 화합물의 약학적으로 허용가능한 비독성 염, 예를 들어, (a) 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 다이-설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 다염기산을 갖는 산 부가염; (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온을 갖거나, 예를 들어 N,N'-다이벤질-에틸렌다이아민 또는 에틸렌다이아민으로부터 형성된 유기 양이온을 갖는 염; 또는 (c) (a)와 (b)의 조합, 예를 들어 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 방금 기재된 것들과 같은 비교적 불용성인 염은 겔, 예를 들어, 주사용으로 적합한, 예를 들어 참깨유를 갖는 알루미늄 모노스테아레이트 겔로 제형화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 다른 유형의 주사용 서방성 데포 제형은, 예를 들어 미국 특허 제3,773,919호에 기재된 바와 같은 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체와 같은 천천히 분해되는 비독성 비항원성 중합체에 캡슐화되기 위해 분산된 화합물 또는 염을 함유할 것이다. 화합물, 또는 바람직하게는 상기 기재된 것들과 같은 비교적 불용성인 염은 또한 특히 동물에 사용하기 위해, 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛으로 제형화될 수 있다. 추가의 서방성 데포 또는 임플란트 제형, 예를 들어 기체 또는 액체 리포좀이 문헌에 알려져 있다(미국 특허 제5,770,222호 및 문헌["Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978]).
본 발명을 일반적으로 기재하였지만, 이는 예시로서 제공되고 제한으로서 의도되지 않는 하기 실시예를 참조함으로써 더 용이하게 이해될 것이다.
실시예 1: 포유류 세포에서의 TNF 항체의 클로닝 및 발현.
전형적인 포유류 발현 벡터는 mRNA 전사의 개시를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소, 항체 코딩 서열, 및 전사의 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 신호를 함유한다. 추가의 요소는 인핸서, 코작(Kozak) 서열 및 RNA 스플라이싱의 공여 및 수용 부위에 인접하는 개재된 서열을 포함한다. 고 효율 전사는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLVI, HIVI로부터의 긴 말단 반복체 (LTR: long terminal repeat), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 프로모터로 달성될 수 있다. 그러나, 세포성 요소도 사용될 수 있다 (예를 들어, 인간 액틴 프로모터). 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 발현 벡터는, 예를 들어 pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCX(Clonetech Labs, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-), 또는 pcDNA3.1/Hygro (+/-)(Invitrogen), PSVL 및 PMSG(Pharmacia, 스웨덴 웁살라 소재), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC 37146), 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포는 인간 HeLa 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 세포 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 퀘일 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다.
대안적으로, 유전자는 염색체 내로 통합된 유전자를 함유하는 안정적인 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 또는 하이그로마이신과 같은 선택가능한 마커를 이용하는 동시-형질주입은 형질주입된 세포의 확인 및 단리를 가능하게 한다.
형질주입된 유전자는 또한 대량의 암호화된 항체를 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 목적 유전자의 수백 또는 심지어 수천 개의 카피를 운반하는 세포주를 개발하는 데 유용하다. 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 합성효소(GS)이다(문헌[Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991)]; 문헌[Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)]). 이러한 마커를 사용하여, 포유류 세포를 선택 배지에서 증식시켜, 최고의 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이러한 세포주는 염색체 내로 통합된 증폭된 유전자(들)를 함유한다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 NSO 세포는 항체 생산에 종종 사용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)의 강력한 프로모터(LTR)(문헌[Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)]) + CMV-인핸서의 단편(문헌[Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)])을 함유한다. 예를 들어, 제한효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp7l8을 갖는 다중 클로닝 부위는 목적 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터는 3' 인트론에 더하여 쥐 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.
CHO 세포에서의 클로닝 및 발현. TNF 항체의 발현을 위해 벡터 pC4를 사용한다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr (ATCC 기탁 번호 37146)의 유도체이다. 이 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 제어 하에서 마우스 DHFR 유전자를 함유한다. 이러한 플라스미드로 형질주입된, 다이하이드로폴레이트 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소- 또는 다른 세포는 화학요법제 메토트렉세이트로 보충된 선택 배지 (예를 들어, 알파 마이너스 MEM, Life Technologies(미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재))에서 세포를 배양하여 선택할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 내성인 세포에서 DHFR 유전자의 증폭은 잘 문서화되어 있다(예를 들어, 문헌[F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978)]; 문헌[J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990)]; 및 문헌[M. J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)] 참조). 증가하는 농도의 MTX 중에서 성장된 세포는 DHFR 유전자의 증폭 결과물로서의 표적 효소인 DHFR을 과다생산함으로써 약물에 저항성을 발현한다. 제2 유전자가 DHFR 유전자에 연결되어 있으면, 그것은 통상 동시증폭되고 과발현된다. 증폭된 유전자(들)의 1,000개 초과의 카피를 운반하는 세포주를 개발하는 데 이 접근법이 사용될 수 있음이 본 기술 분야에 알려져 있다. 후속으로, 메토트렉세이트가 취출될 때, 숙주 세포의 하나 이상의 염색체(들)에 통합된 증폭된 유전자를 함유하는 세포주가 수득된다.
플라스미드 pC4는 관심 유전자의 발현을 위해 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복(LTR)의 강력한 프로모터(문헌[Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438--447 (1985)])+ 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)의 전초기 유전자의 인핸서로부터 단리된 단편(문헌[Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)])을 함유한다. 프로모터의 하류에는 유전자의 통합을 가능하게 하는 BamHI, XbaI, 및 Asp718 제한 효소 절단 부위가 있다. 이들 클로닝 부위 뒤에, 플라스미드는 래트 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 또한, 다른 고효율 프로모터, 예를 들어 인간 베타-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 또는 다른 레트로바이러스, 예를 들어 HIV 및 HTLVI로부터의 긴 말단 반복부가 발현을 위해 사용될 수 있다. 포유류 세포에서 조절되는 방식으로 TNF를 발현하기 위해 Clontech의 Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템을 사용할 수 있다(문헌[M. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)]). mRNA의 폴리아데닐화를 위해, 예를 들어 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 다른 신호가 마찬가지로 사용될 수 있다. 염색체에 통합된 관심 유전자를 운반하는 안정한 세포주가 또한 선택가능한 마커, 예컨대 gpt, G418, 또는 하이그로마이신으로의 동시-형질감염 시에 선택될 수 있다. 초기에 하나 초과의 선택가능한 마커, 예를 들어 G418 + 메토트렉세이트를 사용하는 것이 유리하다.
플라스미드 pC4를 제한 효소로 분해한 후, 본 기술 분야에 알려진 방법으로 송아지 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화한다. 이어서, 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 단리한다.
이어서, 단리된 가변 및 불변 영역을 암호화하는 DNA 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 라이게이션한다. 이어서, 이. 콜라이 HB101 또는 XL-1 블루 세포를 형질전환하고, 예를 들어 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4 내로 삽입된 단편을 함유하는 박테리아를 확인한다.
활성 DHFR 유전자가 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 형질주입에 사용된다. 리포펙틴을 사용하여 5 μg의 발현 플라스미드 pC4를 0.5 μg의 플라스미드 pSV2-neo와 함께 동시 형질주입한다. 플라스미드 pSV2-neo는 우성 선택가능한 마커, G418을 포함하는 항생제의 군에 대한 내성을 부여하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 neo 유전자를 함유한다. 1 μg /ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 중에 세포를 시딩한다. 2일 후에, 세포를 트립신처리하고 하이브리도마 클로닝 플레이트(Greiner(독일 소재)) 내에서 10, 25, 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 + 1 μg /ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 중에 시딩한다. 약 10 내지 14일 후에, 단일 클론을 트립신처리한 후, 상이한 농도의 메토트렉세이트(50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 사용하여 6-웰 페트리 접시 또는 10 ml 플라스크에 시딩한다. 이어서, 가장 높은 농도의 메토트렉세이트에서 성장하는 클론을 심지어 더 높은 농도의 메토트렉세이트 (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM)를 함유하는 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴다. 100 내지 200 mM의 농도에서 성장하는 클론을 수득할 때까지 동일한 절차를 반복한다. 예를 들어, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석에 의해 원하는 유전자 생산물의 발현을 분석한다.
실시예 2: 트랜스제닉 마우스를 사용하는 인간 TNF와 반응성인 고친화도 인간 IgG 단클론 항체의 생성.
요약. 하나 이상의 TNF-매개 질환의 치료를 위한 TNF의 작용을 억제하기 위해 치료적으로 사용될 수 있는 고친화도의 완전 인간 단클론 항체를 생성하기 위해 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스가 사용되었다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 (CBA/J × C57/BL6/J) F2 하이브리드 마우스를 인간 재조합 TNF로 면역화한다(문헌[Taylor et al., Intl. Immunol. 6:579-591 (1993)]; 문헌[Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994)]; 문헌[Neuberger, M., Nature Biotech. 14:826 (1996)]; 문헌[Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)]). 몇몇 융합체는 완전 인간 TNF 반응성 IgG 단클론 항체의 하나 이상의 패널을 산출하였다. 완전 인간 항-TNF 항체를 추가로 특징분석한다. 모두가 IgG1κ이다. 그러한 항체는 1×109 내지 9×1012의 어딘가에서 친화도 상수를 갖는 것으로 확인된다. 이들 완전 인간 단클론 항체의 의외로 높은 친화도는, 이들이 TNF 관련 질환, 병리학, 또는 장애에서 치료적 응용을 위한 적합한 후보가 되게 한다.
약어. BSA - 소 혈청 알부민; CO2 - 이산화탄소; DMSO - 다이메틸 설폭사이드; EIA - 효소 면역검정; FBS - 소 태아 혈청; H2O2 - 과산화수소; HRP - 호스래디쉬 퍼옥시다제; ID - 피내; Ig - 면역글로불린; TNF - 조직 괴사 인자 알파; IP - 복강내; IV - 정맥내; Mab 또는 mAb-단클론 항체; OD - 광학 밀도; OPD - o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드; PEG - 폴리에틸렌 글리콜; PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신; RT - 실온; SQ - 피하; v/v - 부피당 부피; w/v - 부피당 중량.
물질 및 방법
동물. 인간 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스는 본 기술 분야에 알려져 있고((예를 들어, GenPharm International(미국 캘리포니아주 산호세 소재); Abgenix(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 등으로부터) 구매가능함), 이는 인간 면역글로불린을 발현하지만 마우스 IgM 또는 Igκ는 발현하지 않는다. 예를 들어, 그러한 트랜스제닉 마우스는 V(D)J 결합, 중쇄 클래스 스위칭, 및 체세포 돌연변이를 받아 인간 서열 면역글로불린의 레퍼토리를 생성하는 인간 서열 트랜스유전자를 함유한다(문헌[Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994)]). 경쇄 트랜스유전자는, 예를 들어, 생식세포계열 인간 Vκ 영역의 거의 절반을 포함하는 효모 인공 염색체 클론으로부터 부분적으로 유래될 수 있다. 또한, 중쇄 트랜스유전자는 인간 μ 및 인간 γ1(문헌[Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845--851 (1996)]) 및/또는 γ3 불변 영역 둘 모두를 암호화할 수 있다. 적절한 유전자형 계통으로부터 유래된 마우스를 면역화 및 융합 과정에 사용하여, TNF에 대한 완전 인간 단클론 항체를 생성할 수 있다.
면역화. 하나 이상의 면역화 일정을 사용하여 항-TNF 인간 하이브리도마를 생성할 수 있다. 하기 예시적인 면역화 프로토콜 후에 최초 몇몇 융합을 수행할 수 있지만, 다른 유사한 알려진 프로토콜이 사용될 수 있다. 몇 마리의 14 내지 20주령 자성 마우스 및/또는 수술적으로 거세된 트랜스제닉 웅성 마우스를 100 내지 400 μL의 최종 부피(예를 들어, 200) 중에 동일한 부피의 TITERMAX 또는 완전 프로인트(Freund) 아주번트로 유화시킨 1 내지 1000 μg의 재조합 인간 TNF로 IP 및/또는 ID 면역화한다. 각각의 마우스는 또한 선택적으로 2개의 SQ 부위 각각에 100 μL 생리 식염수 중의 1 내지 10 μg을 받을 수 있다. 이어서, 마우스는 1 내지 7, 5 내지 12, 10 내지 18, 17 내지 25, 및/또는 21 내지 34일 후에 동일한 부피의 TITERMAX 또는 불완전 프로인트 아주번트로 유화시킨 TNF로 IP(1 내지 400 μg) 및 SQ(1 내지 400 μg × 2) 면역화될 수 있다. 12 내지 25일 및 25 내지 40일 후에 항-응고제 없이 후안와 천공에 의해 마우스를 채혈할 수 있다. 이어서, 혈액을 1시간 동안 RT에서 응고시키고, 혈청을 수집하고, 알려진 방법에 따라 TNF EIA 검정을 사용하여 적정한다. 반복된 주사가 역가(titer)의 증가를 야기하지 않을 때 융합을 수행한다. 그 시점에, 100 μL 생리 식염수에 희석된 1 내지 400 μg TNF의 최종 IV 부스터 주사를 마우스에게 제공할 수 있다. 3일 후에, 경추 탈골에 의해 마우스를 안락사시키고, 비장을 무균적으로 적출하고, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 μg/mL 암포테리신 B(PSA)를 함유하는 10 mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 침지시킬 수 있다. 비장을 PSA-PBS로 멸균적으로 관류함으로써 비장세포를 수확한다. 세포를 차가운 PSA-PBS 중에 1회 세척하고, 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 계수하고, 25 mM Hepes를 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시킨다.
세포 융합. 예를 들어 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 알려진 방법에 따라 쥐과 골수종 세포 대 생존가능한 비장 세포의 1:1 내지 1:10 비로 융합을 실행할 수 있다. 비제한적인 예로서, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화할 수 있다. 이어서, 37℃에서 1 mL의 50%(w/v) PEG/PBS 용액(PEG 분자량 1,450, Sigma) 중에 30초에 걸쳐 펠렛을 천천히 재현탁시킬 수 있다. 이어서, 25 mM Hepes(37℃)를 함유하는 10.5 mL의 RPMI 1640 배지를 1분에 걸쳐 천천히 첨가함으로써 융합을 중단시킬 수 있다. 융합된 세포를 500 내지 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서, 세포를 HAT 배지(25 mM Hepes, 10% Fetal Clone I 혈청(Hyclone), 1 mM 피루브산나트륨, 4 mM L-글루타민, 10 μg/mL 겐타마이신, 2.5% Origen 배양 보충물(Fisher), 10% 653-조건화 RPMI 1640/Hepes 배지, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI 1640 배지)에 재현탁시킨 후, 200 μL/웰로 15개의 96-웰 평탄 바닥 조직 배양 플레이트 내에 플레이팅한다. 이어서, 플레이트를 7 내지 10일 동안 5% CO2 및 95% 공기를 함유하는 가습된 37℃ 인큐베이터에 넣는다.
마우스 혈청 중의 인간 IgG 항-TNF 항체의 검출. 고체상 EIA를 사용하여 인간 TNF에 특이적인 인간 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 스크리닝할 수 있다. 약술하면, 플레이트를 PBS 중의 2 μg/mL의 TNF로 하룻밤 코팅할 수 있다. 0.02%(v/v) Tween 20을 함유하는 0.15 M 식염수에 세척한 후, PBS 중의 1%(w/v) BSA, 200 μL/웰로 RT에서 1시간 동안 웰을 차단할 수 있다. 플레이트를 즉시 사용하거나 향후 사용을 위해 -20℃에서 냉동시킨다. 마우스 혈청 희석액을 TNF 코팅된 플레이트 상에서 1시간 동안 RT에서 50 μL/웰로 인큐베이션한다. 플레이트를 세척한 후, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:30,000으로 희석된 50 μL/웰의 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적)로 프로빙한다. 플레이트를 다시 세척할 수 있고, 100 μL/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액(0.1 M 시트르산 및 0.2 M 인산나트륨, 0.01% H2O2 및 1 mg/mL OPD)을 RT에서 15분 동안 첨가한다. 이어서 정지 용액(4 N 황산)을 25 μL/웰로 첨가하고, 자동화 플레이트 분광광도계를 통해 490 nm에서 OD를 판독한다.
하이브리도마 상청액 중의 완전 인간 면역글로불린의 검출. 적합한 EIA를 사용하여, 전체 인간 면역글로불린을 분비하는 성장 양성 하이브리도마를 검출할 수 있다. 약술하면, 96 웰 팝-아웃(pop-out) 플레이트(VWR, 610744)를 탄산나트륨 완충제 중의 10 μg/mL 염소 항-인간 IgG Fc로 4℃에서 하룻밤 코팅할 수 있다. 플레이트를 세척하고 1% BSA-PBS로 37℃에서 1시간 동안 차단하고 즉시 사용하거나 -20℃에서 냉동시킨다. 희석되지 않은 하이브리도마 상청액을 37℃에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:10,000으로 희석된 HRP 표지된 염소 항-인간 카파로 프로빙한다. 이어서, 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션한다.
전체 인간 항-TNF 반응성의 결정. 상기와 같이, 적합한 RIA 또는 다른 검정을 사용하여 하이브리도마를 TNF에 대한 반응성에 대해 동시에 검정할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같이 상청액을 염소 항-인간 IgG Fc 플레이트 상에서 인큐베이션하고 세척한 후, 웰당 적절한 계수를 갖는 방사성표지된 TNF로 RT에서 1시간 동안 프로빙한다. 웰을 PBS로 2회 세척하고, 결합된 방사성표지된 TNF를 적합한 계수기를 사용하여 정량화한다.
인간 IgG1κ 항-TNF 분비 하이브리도마를 세포 배양에서 확장시키고, 제한 희석에 의해 연속적으로 서브클로닝할 수 있다. 생성된 클론 집단을 확장시키고 냉동 배지(95% FBS, 5% DMSO) 중에 동결보존하고 액체 질소 중에 저장할 수 있다.
동종형 결정. 항체의 동종형 결정은 특정 역가에 대해 마우스 면역 혈청을 스크리닝하기 위해 사용되는 것과 유사한 포맷으로 EIA를 사용하여 달성될 수 있다. TNF를 상기 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트 상에 코팅하고, 2 μg/mL의 정제된 항체를 RT에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션할 수 있다. 플레이트를 세척하고, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:4000으로 희석된 HRP 표지된 염소 항-인간 IgG1 또는 HRP 표지된 염소 항-인간 IgG3으로 프로빙한다. 플레이트를 다시 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션한다.
인간 TNF와 인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동역학. 예를 들어, TNF 포획 EIA 및 BIAcore 기술을 사용하여 항체에 대한 결합 특징을 적합하게 평가할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 검정에서 2 μg/mL의 TNF로 코팅된 EIA 플레이트에의 결합에 대해 정제된 인간 TNF 항체의 등급화된 농도를 평가할 수 있다. 이어서, 상대 결합 효율을 나타내는 반-로그 플롯으로서 OD가 제시될 수 있다.
정량적 결합 상수는, 예를 들어 하기와 같이, 또는 임의의 다른 알려진 적합한 방법에 의해 얻어질 수 있다. BIAcore CM-5(카르복시메틸) 칩을 BIAcore 2000 단위에 넣는다. HBS 완충제(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v P20 계면활성제, pH 7.4)를 안정한 기준선이 얻어질 때까지 5 μL/분으로 칩의 플로우 셀 위로 유동시킨다. 200 μL의 물 중의 15 mg의 EDC(N-에틸-N'-(3-다이메틸-아미노프로필)-카르보다이이미드 하이드로클로라이드)의 용액(100 μL)을 200 μL의 물 중의 2.3 mg의 NHS(N-하이드록시석신이미드)의 용액 100 μL에 첨가한다. 40 μL의 생성된 용액을 칩 상에 주사한다. 6 μL의 인간 TNF 용액(10 mM 아세트산나트륨 중의 15 μg/mL, pH 4.8)을 칩 상에 주사하여, 약 500 RU의 증가를 유발한다. 완충제를 TBS/Ca/Mg/BSA 작동 완충제(20 mM Tris, 0.15 M 염화나트륨, 2 mM 염화칼슘, 2 mM 아세트산마그네슘, 0.5% Triton X-100, 25 μg/mL BSA, pH 7.4)로 변경하고, 칩 위로 하룻밤 유동시켜 그것을 평형화하고 임의의 미반응 석신이미드 에스테르를 가수분해하거나 캡핑한다.
항체를 작동 완충제 중에 33.33, 16.67, 8.33, 및 4.17 nM로 용해시킨다. 유속을 30 μL/분으로 조정하고 기기 온도를 25℃로 조정한다. 동역학 실행을 위해 2개의 플로우 셀을 사용하며, 하나는 그 위에 TNF가 고정된 것이고(샘플) 두 번째는 유도체화되지 않은 플로우 셀이다(블랭크). 120 μL의 각각의 항체 농도를 30 μL/분으로 플로우 셀 위에 주사한 후(회합 단계), 중단되지 않는 360초의 완충제 유동(해리 단계)이 이어진다. 2 M 구아니딘 티오시아네이트의 각각 30 μL의 순차적 2회 주사에 의해 칩의 표면을 재생한다(조직 괴사 인자 알파/항체 복합체가 해리됨).
데이터의 분석은 본 기술 분야에 알려진 바와 같이 BIA 평가 3.0 또는 CLAMP 2.0을 사용하여 실행한다. 각각의 항체 농도에 대해, 샘플 센소그램으로부터 블랭크 센소그램을 감산한다. 해리(kd, sec-1) 및 회합(ka, mol-1 sec-1) 둘 모두에 대해 전반적 적합(global fit)을 실행하고 해리 상수(KD, mol)를 계산한다(kd/ka). 포획된 항체의 RU가 100을 초과할 만큼 항체 친화도가 충분히 높은 경우에는, 항체의 추가 희석이 실행된다.
결과 및 토의
항-인간 TNF 단클론 항체의 생성. 몇몇 융합을 수행하고 각각의 융합을 15개의 플레이트에 시딩하며(1440 웰/융합), 이는 인간 TNF에 특이적인 수십 개의 항체를 산출한다. 이들 중에서, 일부는 인간 및 마우스 Ig 사슬의 조합으로 이루어진 것으로 확인된다. 나머지 하이브리도마는 인간 중쇄 및 경쇄만으로 이루어진 항-TNF 항체를 분비한다. 인간 하이브리도마 중 모두가 IgG1κ일 것으로 예상된다.
인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동역학. 이들 하이브리도마 중 대부분 또는 전부로부터 정제된 항체가 농도-의존적 방식으로 TNF에 결합함이 ELISA 분석에 의해 확인되었다. 도 1 및 도 2는 이들 항체의 상대 결합 효율의 결과를 나타낸다. 이 경우에, 항체의 동족 항원(에피토프)에 대한 항체의 결합활성을 측정한다. EIA 플레이트에 직접 TNF를 결합시키는 것은 단백질의 변성을 야기할 수 있고, 외견상의 결합 친화도는 비변성 단백질에 대한 결합을 반영할 수 없음에 유의하여야 한다. 소정 범위의 농도에 걸쳐 50%의 결합이 확인된다.
인간 항체의 BIAcore 분석을 사용하여 정량적 결합 상수가 얻어지며, 인간 단클론 항체 중 몇 개는 1×10-9 내지 7×10-12 범위의 KD로 매우 높은 친화도인 것으로 밝혀진다.
결론.
인간 TNF로 면역화된 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 하이브리드 마우스로부터의 비장세포를 이용하여 몇몇 융합을 수행한다. IgG1κ 동종형의 몇몇 완전 인간 TNF 반응성 IgG 단클론 항체의 세트가 생성된다. 완전 인간 항-TNF 항체를 추가로 특징분석한다. 생성된 항체 중 몇 개는 친화도 상수가 1×109 내지 9×1012였다. 이들 완전 인간 단클론 항체의 의외로 높은 친화도는, 이들이 TNF-의존성 질환, 병리학, 또는 관련 병태에서 치료적 응용에 적합하게 한다.
실시예 3: 인간 TNFα에 대해 반응성인 인간 IgG 단클론 항체의 생성.
요약. 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대해 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 (CBA/J × C57BL/6J) F2 하이브리드 마우스(1 내지 4 마리)를 재조합 인간 TNFα로 면역화하였다. GenTNV로 명명된 하나의 융합은 고정된 재조합 TNFα에 결합하는 8개의 전체적 인간 IgG1κ 단클론 항체를 산출하였다. 확인 직후에, 8개의 세포주를 추가의 특징분석을 위해 분자 생물학으로 이전하였다. 이들 Mab는 서열이 전체적으로 인간이므로, 이들은 인간에서 cA2(Remicade)보다 덜 면역원성일 것으로 예상된다.
약어. BSA - 소 혈청 알부민; CO2 - 이산화탄소; DMSO - 다이메틸 설폭사이드; EIA - 효소 면역검정; FBS - 소 태아 혈청; H2O2 - 과산화수소; HC - 중쇄; HRP - 호스래디쉬 퍼옥시다제; ID - 피내; Ig - 면역글로불린; TNF - 조직 괴사 인자 알파; IP - 복강내; IV - 정맥내; Mab - 단클론 항체; OD - 광학 밀도; OPD - o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드; PEG - 폴리에틸렌 글리콜; PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신; RT - 실온; SQ - 피하; TNFα - 종양 괴사 인자 알파; v/v - 부피당 부피; w/v - 부피당 중량.
서론. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 재조합 인간 TNFα에 특이적인 전체적 인간 단클론 항체를 생성하였다. cA2(Remicade)가 TNFα-매개 질환에 관여하는 염증 과정을 치료적으로 억제하기 위해 사용되듯이, 혈청 반감기의 증가 및 면역원성에 관련된 부작용의 감소의 이점과 함께 이들 독특한 항체가 사용될 수 있기를 희망한다.
재료 및 방법.
동물. 마우스 IgM 또는 Igκ가 아닌 인간 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 마우스는 GenPharm International에 의해 개발되었다. 이들 마우스는 V(D)J 결합, 중쇄 클래스 스위칭, 및 체세포 돌연변이를 받아 항원-특이적 인간 면역글로불린(1)의 레퍼토리를 생성하는 기능적 인간 항체 트랜스유전자를 함유한다. 경쇄 트랜스유전자는, 생식세포계열 인간 Vκ 유전자좌의 거의 절반을 포함하는 효모 인공 염색체 클론으로부터 부분적으로 유래된다. 몇몇 VH 유전자에 더하여, 중쇄(HC) 트랜스유전자는 인간 μ 및 인간 γ1(2) 및/또는 γ3 불변 영역 둘 모두를 암호화한다. HCo12/KCo5 유전자형 계통으로부터 유래된 마우스를 면역화 및 융합 과정에 사용하여 본원에 기재된 단클론 항체를 생성하였다.
인간 TNFα의 정제. Sepharose 4B(Pharmacia)에 커플링된 TNFα 수용체-Fc 융합 단백질(p55-sf2)(5)로 패킹된 컬럼을 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 C237A 세포로부터의 조직 배양 상청액으로부터 인간 TNFα를 정제하였다. 세포 상청액을 그의 부피의 1/9의 10x 둘베코 PBS(D-PBS)와 혼합하고 4℃에서 4 mL/분으로 컬럼에 통과시켰다. 이어서, 컬럼을 PBS로 세척하고 TNFα를 0.1 M 시트르산나트륨, pH 3.5로 용리시키고, 2 M Tris-HCl pH 8.5로 중화시켰다. 정제된 TNFα를 10 mM Tris, 0.12 M 염화나트륨 pH 7.5로 완충제 교환하고, 0.2 um 주사기 필터를 통해 여과하였다.
면역화. 대략 16주령 자성 GenPharm 마우스를, 0일차, 12일차, 및 28일차에 동일한 부피의 Titermax 아주번트로 유화시킨 TNFα(로트 JG102298 또는 JG102098) 총 100 μg으로 IP(200 μL) 및 ID(꼬리의 기부에서 100 μL) 면역화하였다. 21일차 및 35일차에 항-응고제 없이 후안와 천공에 의해 마우스를 채혈하였다. 혈액을 RT에서 1시간 동안 응고시키고, 혈청을 수집하고, TNFα 고체상 EIA 검정을 사용하여 적정하였다. 28일차의 주사 후 7주 동안 마우스가 휴식하도록 한 후에 GenTNV로 명명된 융합을 수행하였다. 이어서, TNFα에 대해 1:160의 특이적 인간 IgG 역가를 갖는 마우스에게 100 μL의 생리 식염수에 희석된 50 μg의 TNFα의 최종 IV 부스터 주사를 제공하였다. 3일 후에, 경추 탈골에 의해 마우스를 안락사시키고, 비장을 무균적으로 적출하고, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 μg/mL 암포테리신 B(PSA)를 함유하는 10 mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 침지시켰다. 비장을 PSA-PBS로 멸균적으로 관류함으로써 비장세포를 수확하였다. 세포를 차가운 PSA-PBS 중에 1회 세척하고, Coulter 계수기를 사용하여 계수하고, 25 mM Hepes를 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다.
세포주. 비-분비 마우스 골수종 융합 파트너, 653을 Centocor의 제품 개발군으로부터 5-14-97일에 세포 생물학 서비스(CBS) 그룹에 접수하였다. 세포주를 10%(v/v) FBS(Cell Culture Labs), 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-글루타민(모두 JRH Biosciences로부터 입수함)으로 보충된 RPMI 배지(JRH Biosciences) 중에 확장시키고, 95% FBS 및 5% DMSO(Sigma) 중에 동결보존한 후, CBS 내의 증기상 액체 질소 냉동기에 저장하였다. 세포 은행은 멸균상태였고(Quality Control Centocor, 맬버른 소재) 마이코플라즈마가 없었다(Bionique Laboratories). 융합될 때까지 세포를 대수기 배양으로 유지하였다. 이들을 PBS에 세척하고, 계수하고, 융합 전에 트리판 블루 염료 배제를 통해 생존력을 결정하였다(>95%).
Centocor의 분자 생물학에서 생산된, C237A로 명명된 재조합 세포주에 의해 인간 TNFα가 생산되었다. 세포주를 5%(v/v) FBS(Cell Culture Labs), 2 mM L-글루타민(모두 JRH Biosciences로부터 입수함), 및 0.5 :g/mL 마이코페놀산으로 보충된 IMDM 배지(JRH Biosciences) 중에 확장시키고, 95% FBS 및 5% DMSO(Sigma) 중에 동결보존한 후, CBS 내의 증기상 액체 질소 냉동기에 저장하였다(13). 세포 은행은 멸균상태였고(Quality Control Centocor, 맬버른 소재) 마이코플라즈마가 없었다(Bionique Laboratories).
세포 융합. 1:1 비의 653 쥐과 골수종 세포 및 생존가능한 쥐과 비장 세포를 사용하여 세포 융합을 실행하였다. 약술하면, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화하였다. 펠렛을 37℃에서 1 mL의 50%(w/v) PEG/PBS 용액(1,450 g/몰의 PEG 분자량, Sigma) 중에 30초 기간에 걸쳐 천천히 재현탁시켰다. 10.5 mL의 RPMI 배지(첨가제 없음)(JRH)(37℃)를 1분에 걸쳐 천천히 첨가함으로써 융합을 중단하였다. 융합된 세포를 750 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포를 HAT 배지(10% 소 태아 혈청(JRH), 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM L-글루타민, 10 μg/mL 겐타마이신, 2.5%의 Origen 배양 보충물(Fisher), 50 μM 2-메르캅토에탄올, 1% 653-조건화 RPMI 배지, 100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI/HEPES 배지)에 재현탁시킨 후, 200 μL/웰로 5개의 96-웰 평탄 바닥 조직 배양 플레이트 내에 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 7 내지 10일 동안 5% CO2 및 95% 공기를 함유하는 가습된 37℃ 인큐베이터에 넣었다.
마우스 혈청 중의 인간 IgG 항-TNFα 항체의 검출. 고체상 EIA를 사용하여 인간 TNFα에 특이적인 인간 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 스크리닝하였다. 약술하면, 플레이트를 PBS 중의 1 μg/mL의 TNFα로 하룻밤 코팅하였다. 0.02%(v/v) Tween 20을 함유하는 0.15 M 식염수에 세척한 후, PBS 중의 1%(w/v) BSA, 200 μL/웰로 RT에서 1시간 동안 웰을 차단하였다. 플레이트를 즉시 사용하거나 향후 사용을 위해 -20℃에서 냉동시켰다. 마우스 혈청을 RT에서 1시간 동안 50 μL/웰로 인간 TNFα-코팅된 플레이트 상에서 2-배 연속 희석으로 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:30,000으로 희석된 50 μL/웰의 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적)(Accurate)로 프로빙하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 100 μL/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액(0.1 M 시트르산 및 0.2 M 인산나트륨, 0.01% H2O2, 및 1 mg/mL OPD)을 RT에서 15분 동안 첨가하였다. 이어서 정지 용액(4 N 황산)을 25 μL/웰로 첨가하고, 자동화 플레이트 분광광도계를 사용하여 490 nm에서 OD를 판독하였다.
하이브리도마 상청액 중의 전체적 인간 면역글로불린의 검출. GenPharm 마우스는 마우스 및 인간 면역글로불린 사슬 둘 모두를 생성할 수 있기 때문에, 2개의 별도의 EIA 검정을 사용하여 인간 경쇄 및 인간 중쇄 둘 모두의 존재에 대해 성장-양성 하이브리도마 클론을 시험하였다. 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 코팅하고 희석하지 않은 하이브리도마 상청액을 플레이트 상에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-HBSS에 1:10,000으로 희석된 HRP-접합 염소 항-인간 카파(Southern Biotech) 항체 또는 1% BSA-HBSS에 1:30,000으로 희석된 HRP-접합 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 1시간 동안 37℃에서 프로빙하였다. 이어서, 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션하였다. 항-인간 카파 및 항-인간 IgG Fc EIA 포맷 둘 모두에서 양성 신호를 제공하지 않은 하이브리도마 클론은 폐기하였다.
동종형 결정. 항체의 동종형 결정은 특정 역가에 대해 마우스 면역 혈청을 스크리닝하기 위해 사용되는 것과 유사한 포맷으로 EIA를 사용하여 달성되었다. EIA 플레이트를 염소 항-인간 IgG(H+ L)로 탄산나트륨 완충제 중의 10 :g/mL로 4℃에서 하룻밤 코팅하고, 상기 기재된 바와 같이 차단하였다. 24 웰 배양물로부터의 순수 상청액을 RT에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:4000으로 희석된 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4(Binding Site)로 프로빙하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션하였다.
결과 및 토의. 전체적 인간 항-인간 TNFα 단클론 항체의 생성. 재조합 인간 TNFα 단백질로 면역화된 GenPharm 마우스로부터 GenTNV로 명명된 하나의 융합을 수행하였다. 이러한 융합으로부터, 196개의 성장-양성 하이브리드를 스크리닝하였다. 인간 TNFα와 반응성인 전체적 인간 IgG 항체를 분비하는 8개의 하이브리도마 세포주를 확인하였다. 이들 8개의 세포주 각각은 인간 IgG1κ 동종형의 면역글로불린을 분비하고, 제한 희석에 의해 모두 2회 서브클로닝하여 안정한 세포주를 얻었다(90% 초과로 균질함). 세포주 명칭 및 각각의 C 코드 표기가 표 1에 열거되어 있다. 각각의 세포주를 액체 질소에 저장된 12-바이알 연구 세포 은행에 냉동시켰다.
8개의 세포주 각각에 대해 24-웰 배양 접시의 웰로부터 수집한 모 세포를 2-18-99에 형질주입 및 추가의 특징분석을 위해 분자 생물학 그룹에 인계하였다.
[표 1]
결론.
Centocor에서 제조된 재조합 인간 TNFα로 면역화한 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 하이브리드 마우스로부터의 비장세포를 이용하여 GenTNV 융합을 수행하였다. IgG1κ 동종형의 전체적 인간 TNFα-반응성 IgG 단클론 항체 8개가 생성되었다. 추가의 특징분석 및 개발을 위해 모 세포주를 분자 생물학 그룹에 이전하였다. 이들 새로운 인간 항체 중 하나는 Remicade와 비교하여 감소된 면역원성 및 알레르기-유형 합병증의 잠재적인 이익을 갖는 항염증에 유용한 것으로 입증될 수 있다.
실시예 4: 인간 항-TNFα 항체를 발현하는 세포주의 클로닝 및 제조.
요약. TNV 표기를 갖는 8개의 인간 단클론 항체(mAb: monoclonal antibody)의 패널은 고정된 인간 TNFα에 외견상 높은 결합활성으로 결합하는 것으로 확인되었다. 8개의 mAb 중 7개는 재조합 TNF 수용체에 대한 huTNFα 결합을 효율적으로 차단하는 것으로 나타났다. 7개의 mAb를 암호화하는 DNA의 서열 분석에 의해 모든 mAb가 인간 V 영역을 가졌음이 확인되었다. 또한, 8개의 mAb의 원래의 패널이 TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196로 나타낸 4개의 별개의 mAb 만을 함유하도록, 3 쌍의 mAb가 서로 동일하였음이 DNA 서열에 의해 밝혀졌다. mAb의 추정된 아미노산 서열의 분석 및 시험관내 TNFα 중화 데이터의 결과에 기초하여, 추가의 연구를 위해 mAb TNV148 및 TNV14를 선택하였다.
데이터베이스 검색 중에 TNV148 중쇄 내의 위치 75(프레임워크 3)에 있는 프롤린 잔기가 동일한 하위군의 다른 인간 항체 내의 그 위치에서 확인되지 않았으므로, 알려진 생식세포계열 프레임워크 e 서열에 그것을 일치시키기 위하여 부위-지정 DNA 돌연변이유발을 수행하여 그 위치에 세린 잔기를 암호화하였다. 세린 변형된 mAb를 TNV148B로 표기하였다. 2000년 10월 7일자로 출원되고 발명의 명칭이 "IL-12 Antibodies, Compositions, Methods and Uses"이며 WO 02/12500호로서 공개된, 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제60/236,827호에 개시된 최근에 클로닝된 다른 인간 mAb의 중쇄 및 경쇄 유전자(12B75)에 기초한 새로 제조된 발현 벡터 내로 TNV148B 및 TNV14의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 PCR-증폭 DNA를 클로닝하였다.
P3X63Ag8.653(653) 세포 또는 Sp2/0-Ag14(Sp2/0) 마우스 골수종 세포를 각각의 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드로 형질주입하고 높은 수준의 재조합 TNV148B 및 TNV14(rTNV148B 및 rTNV14) mAb를 생산하는 세포주에 대해 2 라운드의 서브클로닝을 통해 스크리닝하였다. 성장 곡선 및 시간 경과에 따른 mAb 생산의 안정성의 평가에 의해 653-형질주입체 클론 C466D 및 C466C는 소모된 배양물에서 대략 125 :g/ml의 rTNV148B mAb를 안정하게 생산한 반면에 Sp2/0 형질주입체 1.73-12-122(C467A)는 소모된 배양물에서 대략 25 :g/ml의 rTNV148B mAb를 안정하게 생산한 것으로 나타났다. 유사한 분석에 의해 Sp2/0-형질주입체 클론 C476A는 소모된 배양물에서 18 :g/ml의 rTNV14를 생산한 것으로 나타났다.
서론. 인간 TNFα-면역화 GenPharm/Medarex 마우스(HCo12/KCo5 유전자형)로부터 유래된 8개의 mAb의 패널은 인간 TNFα에 결합하고 전체적 인간 IgG1, 카파 동종형을 갖는 것으로 이전에 나타났다. 단순 결합 검정을 사용하여, TNFα가 재조합 TNF 수용체에 결합하는 것을 차단하는 그들의 능력을 평가함으로써, 본 발명의 예시적인 mAb가 TNFα-중화 활성을 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하였다. 그러한 결과, DNA 서열 결과, 및 mAb 중 몇 개의 시험관내 특징분석에 기초하여, 추가로 특징분석할 mAb로서 TNV148이 선택되었다.
TNV148 mAb를 암호화하는 DNA 서열을 클로닝하고, 적합한 불변 영역을 암호화하는 유전자 발현 벡터에 적합하도록 변형하고, 잘 특징분석된 653 및 Sp2/0 마우스 골수종 세포 내로 도입하고, 생성된 형질주입 세포주를 원래의 하이브리도마 세포주보다 40-배 더 많은 mAb를 생산하는 서브클론이 확인될 때까지 스크리닝하였다.
재료 및 방법.
시약 및 세포. TRIZOL 시약은 Gibco BRL로부터 구매하였다. 프로테이나제 K는 Sigma Chemical Company로부터 입수하였다. 역전사효소는 Life Sciences, Inc.로부터 입수하였다. Taq DNA 폴리머라제는 Perkin Elmer Cetus 또는 Gibco BRL로부터 입수하였다. 제한 효소는 New England Biolabs로부터 구매하였다. QIAquick PCR 정제 키트는 Qiagen으로부터 입수하였다. QuikChange 부위-지정 돌연변이유발 키트는 Stratagene으로부터 구매하였다. Wizard 플라스미드 미니프렙 키트 및 RNasin은 Promega로부터 입수하였다. Optiplate는 Packard로부터 입수하였다. 125요오드는 Amersham으로부터 구매하였다. 주문제작 올리고뉴클레오티드는 Keystone/Biosource International로부터 구매하였다. 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드의 명칭, 식별 번호, 및 서열은 표 2에 나타낸다.
표 2. TNV mAb 유전자를 클로닝하거나 조작하거나 서열분석하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드.
올리고뉴클레오티드 5'14s 및 HuH-J6에 의해 암호화되는 아미노산은 서열 위에 나타낸다. 'M' 아미노산 잔기는 번역 시작 코돈을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 5'14s 및 HuH-J6 내의 밑줄 친 서열은 각각 BsiWI 및 BstBI 제한 부위를 표시한다. HuH-J6 내의 사선은 엑손/인트론 경계에 상응한다. 서열이 (-) 스트랜드에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 3'-5' 배향으로 작성되어 있음에 유의한다.
[표 2]
653 마우스 골수종 세포의 단일 냉동 바이알을 얻었다. 바이알을 그 날에 해동시키고, T 플라스크에서 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민(배지) 중에 확장시켰다. 이들 세포를 본원에 기재된 항-TNF DNA로 2 내지 3주 후에 형질주입시킬 때까지 연속 배양 중에 유지하였다. 배양물 중의 일부를 해동일 후 5일에 수확하고, 원심분리에 의해 펠렛화하고, 95% FBS, 5% DMSO 중에 재현탁시키고, 30개의 바이알 내로 분취하고, 냉동시키고, 향후 사용을 위해 저장하였다. 유사하게, Sp2/0 마우스 골수종 세포의 단일 냉동 바이알을 얻었다. 바이알을 해동시키고, 상기 기재된 바와 같이 새로운 냉동물을 제조하고, 냉동된 바이알을 CBC 냉동기 박스 AA 및 AB에 저장하였다. 이들 세포를 해동시키고, 본원에 기재된 모든 Sp2/0 형질주입에 사용하였다.
수용체에 대한 TNF 결합의 억제에 대한 검정. TNV mAb를 함유하는 하이브리도마 세포 상청액을 사용하여, 재조합 TNF 수용체 융합 단백질인 p55-sf2에 대한 125I-표지된 TNFα의 결합을 차단하는 mAb의 능력에 대해 검정하였다(문헌[Scallon et al. (1995) Cytokine 7:759-770]). PBS 중의 0.5 :g/ml의 p55-sf2 50 :l를 Optiplate에 첨가하여 37℃에서 1시간 인큐베이션 중에 웰을 코팅하였다. 희석제로서 PBS/0.1% BSA를 사용하여 8개의 TNV 세포 상청액의 연속 희석액을 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내에 제조하였다. 항-IL-18 mAb를 함유하는 세포 상청액을 음성 대조군으로서 포함시켰고, cA2(항-TNF 키메라 항체, Remicade, 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,770,198호)로 스파이킹된 동일한 항-IL-18 상청액을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 5 ng/ml의 최종 TNFα 농도를 갖도록 125I-표지된 TNFα(58 :Ci/:g, D. Shealy)를 100 :l의 세포 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 코팅된 Optiplate를 세척하여 미결합 p55-sf2를 제거하고 50 :l의 125I-TNFα/세포 상청액 혼합물을 Optiplate에 이전하였다. RT에서 2시간 후에, Optiplate를 PBS-Tween으로 3회 세척하였다. 100 :l의 Microscint-20을 첨가하고, 결합된 cpm을 TopCount 감마 계수기를 사용하여 결정하였다.
V 유전자의 증폭 및 DNA 서열 분석. 하이브리도마 세포를 PBS에 1회 세척한 후, RNA 제조를 위해 TRIZOL 시약을 첨가하였다. 7 × 106 내지 1.7 × 107 세포를 1 ml의 TRIZOL에 재현탁시켰다. 200 μl의 클로로포름을 첨가한 후에 튜브를 격렬하게 진탕하였다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 수성상을 새로운 마이크로퓨지 튜브에 이전하고 동일한 부피의 아이소프로판올을 첨가하였다. 튜브를 격렬하게 진탕하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 1 ml의 70% 에탄올로 1회 세척하고 진공 건조기 내에서 잠시 건조시켰다. RNA 펠렛을 40 μl의 DEPC-처리된 물로 재현탁시켰다. 1% 아가로스 겔에서 0.5 μl를 분별함으로써 RNA 제조물의 품질을 결정하였다. 사용할 때까지 RNA를 -80℃ 냉동기에 저장하였다.
중쇄 및 경쇄 cDNA를 제조하기 위하여, 11.5 μl의 부피 내에 3 μl의 RNA 및 1 μg의 올리고뉴클레오티드 119(중쇄) 또는 올리고뉴클레오티드 117(경쇄)(표 1 참조)을 포함하는 혼합물을 제조하였다. 수조 내에서 10분 동안 70℃에서 혼합물을 인큐베이션한 후, 10분 동안 얼음 상에서 냉각시켰다. 2.5 μl의 10X 역전사효소 완충제, 10 μl의 2.5 mM dNTP, 1 μl의 역전사효소(20 단위), 및 0.4 μl의 리보뉴클레아제 억제제 RNasin(1 단위)으로 구성된 별도의 혼합물을 제조하였다. 이 혼합물 13.5 μl를 냉각된 RNA/올리고뉴클레오티드 혼합물 11.5 μl에 첨가하고, 반응물을 42℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, cDNA 합성 반응물을 사용할 때까지 -20℃ 냉동기에 저장하였다.
가변 영역 코딩 서열을 PCR 증폭하기 위한 주형으로서 정제하지 않은 중쇄 및 경쇄 cDNA를 사용하였다. 5개의 올리고뉴클레오티드 쌍(366/354, 367/354, 368/354, 369/354, 및 370/354, 표 1)을 중쇄 DNA의 증폭을 프라이밍하는 그들의 능력에 대해 동시에 시험하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드 쌍(362/208 및 363/208)을 경쇄 DNA의 증폭을 프라이밍하는 그들의 능력에 대해 동시에 시험하였다. 50 μl의 총 부피 내에 2 단위의 PLATINUM ™ 고충실도(HIFI) Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 반응을 실행하였다. 각각의 반응은 2 μl의 cDNA 반응물, 10 pmol의 각각의 올리고뉴클레오티드, 0.2 mM의 dNTP, 5 μl의 10 X HIFI 완충제, 및 2 mM의 황산마그네슘을 포함하였다. 열 사이클러 프로그램은 5분 동안 95℃에 이어서 30사이클의 (30초 동안 94℃, 30초 동안 62℃, 1.5분 동안 68℃)였다. 이어서, 68℃에서 10분 동안의 최종 인큐베이션이 있었다.
직접 DNA 서열분석을 위한 PCR 생산물을 제조하기 위하여, 제조사의 프로토콜에 따라 QIAquick™ PCR 정제 키트를 사용하여 그들을 정제하였다. 50 μl의 멸균수를 사용하여 DNA를 스핀 컬럼으로부터 용리시킨 후, 진공 건조기를 사용하여 10 μl의 부피까지 건조시켰다. 이어서, 20 μl의 총 부피에 대해 1 μl의 정제된 PCR 생산물, 10 μM의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 4 μl의 BigDye Terminator™ 준비 반응 믹스, 및 14 μl의 멸균수로 DNA 서열분석 반응을 설정하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 367/354로 제조된 중쇄 PCR 생산물을 올리고뉴클레오티드 프라이머 159 및 360으로 서열분석하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 363/208로 제조된 경쇄 PCR 생산물을 올리고뉴클레오티드 34 및 163으로 서열분석하였다. 서열분석을 위한 열 사이클러 프로그램은 25 사이클의 (30초 동안 96℃, 15초 동안 50℃, 4분 동안 60℃)에 이어서 4℃에서 하룻밤이었다. 반응 생산물을 폴리아크릴아미드 겔을 통해 분별하고 ABI 377 DNA 서열분석기를 사용하여 검출하였다.
아미노산을 변화시키기 위한 부위-지정 돌연변이유발. TNV148 mAb 내의 세린 잔기로 Pro75를 대체하기 위하여 TNV148 중쇄 가변 영역 DNA 서열 내의 단일 뉴클레오티드를 변화시켰다. 제조사에 의해 기재된 바와 같은 QuikChange™ 부위-지정 돌연변이유발 방법을 사용하여, 이 변화를 실행하기 위해 상보적인 올리고뉴클레오티드, 399 및 400(표 1)을 설계하고 주문하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드를 먼저 15% 폴리아크릴아미드 겔을 통해 분별하고 주요 밴드를 정제하였다. 10 ng 또는 50 ng의 TNV148 중쇄 플라스미드 주형(p1753), 5 μl의 10x 반응 완충제, 1 μl의 dNTP 믹스, 125 ng의 프라이머 399, 125 ng의 프라이머 400, 및 1 μl의 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 돌연변이유발 반응물을 제조하였다. 멸균수를 첨가하여 총 부피를 50 μl로 만들었다. 이어서, 반응 혼합물을 30초 동안 95℃, 그리고 이어서 30초 동안 95℃, 1분 동안 55℃, 1분 동안 64℃, 및 7분 동안 68℃의 순차적 인큐베이션으로 14회 사이클링 후, 2분 동안 30℃(1 사이클)에서 인큐베이션하도록 프로그래밍된 열 사이클러 내에서 인큐베이션하였다. 이들 반응은 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 그 외에는 동일한 새로 합성된 플라스미드에 통합하도록 설계되었다. 원래의 TNV148 플라스미드를 제거하기 위하여, 샘플을 1 μl의 DpnI 엔도뉴클레아제의 첨가 후 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였으며, 이는 원래의 메틸화된 플라스미드만을 절단한다. 이어서, 1 μl의 반응물을 사용하여 표준 열-쇼크 방법에 의해 Epicurian Coli XL1-Blue 수퍼컴피턴트 이. 콜라이를 형질전환하고, LB-암피실린 한천 플레이트 상에 플레이팅한 후에 형질전환된 박테리아를 확인하였다. 제조사에 의해 기재된 바와 같이 Wizard™ 키트를 사용하여 플라스미드 미니프렙을 제조하였다. Wizard™ 컬럼으로부터 샘플을 용리시킨 후에, 플라스미드 DNA를 에탄올로 침전시켜 플라스미드 DNA를 추가로 정제하고, 이어서 20 μl의 멸균수에 재현탁시켰다. 이어서, DNA 서열 분석을 수행하여, 원하는 염기 변화를 가진 플라스미드 클론을 확인하고, TNV148 코딩 서열 내로 다른 염기 변화가 의도하지 않게 도입되지 않았음을 확인하였다. 1 μl의 플라스미드에, 섹션 4.3에 기재된 것과 동일한 파라미터를 사용하여, 3 μl의 BigDye 믹스, 1 μl의 pUC19 정방향 프라이머, 및 10 μl의 멸균수로 제조된 사이클 서열분석 반응을 적용하였다.
12B75 유전자로부터의 발현 벡터의 작제. 몇몇 재조합 DNA 단계를 수행하여, 2000년 10월 7일자로 출원되고 발명의 명칭이 "IL-12 Antibodies, Compositions, Methods and Uses"이며 WO 02/12500호로서 공개된, 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제60/236,827호에 개시된 12B75-암호화 중쇄 및 경쇄 유전자의 이전에 클로닝된 게놈 카피로부터의 새로운 인간 IgG1 발현 벡터 및 새로운 인간 카파 발현 벡터를 각각 제조하였다. 임의의 적절하게 설계된 PCR-증폭된 가변 영역에 의한 기존의 가변 영역 서열의 단순한 1-단계 대체를 허용하도록 최종 벡터를 설계하였다.
플라스미드 p1560에서 12B75 중쇄 유전자를 변형시키기 위하여, 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 6.85 kb BamHI/HindIII 단편을 p1560으로부터 pUC19로 이전하여 p1743을 제조하였다. p1560에 비교하여 이 플라스미드의 더 작은 크기는, 제조사의 프로토콜에 따라 번역 개시 부위의 바로 상류에 독특한 BsiWI 클로닝 부위를 도입하기 위한 QuikChange™ 돌연변이유발(올리고뉴클레오티드 BsiWI-1 및 BsiWI-2를 사용함)의 사용을 가능하게 하였다. 생성된 플라스미드를 p1747로 명명하였다. 가변 영역의 3' 말단에 BstBI 부위를 도입하기 위하여, SalI 및 BstBI 부위를 갖는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 이 프라이머를 pUC 역방향 프라이머와 함께 사용하여 p1747로부터 2.75 kb 단편을 증폭하였다. 이어서, 이 단편을 12B75 가변 영역 및 HindIII 부위 내의 천연 발생 SalI 부위 내로 다시 클로닝함으로써, 독특한 BstB1 부위를 도입하였다. p1750으로 표기되는 생성된 중간체 벡터는 BsiWI 및 BstBI 말단을 갖는 가변 영역 단편을 수용할 수 있었다. 불변 영역이 12B75 유전자로부터 또한 유래된 중쇄 벡터의 버전을 제조하기 위하여, HindIII 부위의 하류에 EcoRI 부위를 갖도록 p1750 내의 BamHI-HindIII 삽입물을 pBR322에 이전하였다. 이어서, 생성된 플라스미드 p1768을 HindIII 및 EcoRI으로 분해하고, 큰 BamHI-BamHI 단편을 p1560으로부터 pBC 내로 클로닝함에 의해 유래된 서브클론인, p1744로부터의 5.7 kb HindIII-EcoRI 단편에 라이게이션하였다. 이어서, 생성된 플라스미드 p1784를 BsiWI 및 BstBI 말단을 갖는 TNV Ab cDNA 단편에 대한 벡터로서 사용하였다. 추가의 작업을 실행하여 발현 벡터 p1788 및 p1798을 제조하였으며, 이는 12B75 유전자로부터의 IgG1 불변 영역을 포함하고 그들이 얼마나 많은 12B75 중쇄 J-C 인트론을 함유하는지에 의해 서로 상이하다.
플라스미드 p1558 내의 12B75 경쇄 유전자를 변형하기 위하여, 12B75 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 5.7 kb SalI/AflII 단편을 p1558로부터 플라스미드 L28의 XhoI/AflII 부위 내로 이전하였다. 이러한 새로운 플라스미드 p1745는 돌연변이유발 단계를 위한 더 작은 주형을 제공하였다. 올리고뉴클레오티드(C340salI 및 C340sal2)를 사용하여, QuikChange™ 돌연변이유발에 의해 가변 영역의 5' 말단에 독특한 SalI 제한 부위를 도입하였다. 생성된 중간체 벡터 p1746은 가변 영역 단편이 클로닝될 수 있는 독특한 SalI 및 AflII 제한 부위를 가졌다. p1746 내로 클로닝된 임의의 가변 영역 단편은 바람직하게는 경쇄 유전자의 3' 절반과 결합될 것이다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 12B75 경쇄 유전자의 3' 절반으로부터 제한 단편을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 BAHN-1 및 BAHN-2를 서로 어닐링하여, 제한 부위 BsiW1, AflII, HindII, 및 NotI을 함유하고 KpnI 및 SacI 부위 내로 라이게이션될 수 있는 말단을 함유하는 이중-가닥 링커를 형성하였다. 이 링커를 pBC의 KpnI 부위와 SacI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 p1757을 제공하였다. p1558을 AflII로 분해한 후, HindIII으로 부분적으로 분해함으로써 생성된, 12B75 경쇄 불변 영역을 함유하는 7.1 kb 단편을 p1757의 AflII 부위와 HindII 부위 사이에 클로닝하여 p1762를 수득하였다. 이러한 새로운 플라스미드는 BsiWI 및 AflII에 대한 독특한 부위를 함유하였으며, 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 BsiWI/AflII 단편을 그 안으로 이전하여 유전자의 2개의 절반을 통합할 수 있었다.
발현 플라스미드의 cDNA 클로닝 및 조립. 모든 RT-PCR 반응물(상기 참조)을 클레노우 효소로 처리하여 DNA 말단을 추가로 채웠다. 중쇄 PCR 단편을 제한 효소 BsiWI 및 BstBI로 분해한 후, 플라스미드 L28의 BsiWI 부위와 BstBI 부위 사이에 클로닝하였다(12B75-기반 중간체 벡터 p1750이 아직 제조되지 않았기 때문에 L28을 사용함). 클로닝된 삽입물의 DNA 서열 분석은 생성된 작제물이 정확하고 PCR 증폭 중에 도입된 오류가 없음을 나타냈다. 이들 L28 플라스미드 작제물(TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B, 및 TNV196에 대한)에 대해 배정된 식별 번호를 표 3에 나타낸다.
TNV14, TNV148, 및 TNV148B 중쇄에 대한 BsiWI/BstBI 삽입물을 L28 벡터로부터 새로 제조된 중간체 벡터 p1750로 이전하였다. 이들 중간체 플라스미드에 대해 배정된 식별 번호를 표 2에 나타낸다. TNV15 및 TNV196에 대해서는 이러한 클로닝 단계 및 후속 단계를 실행하지 않았다. 이어서, 가변 영역을 2개의 상이한 인간 IgG1 발현 벡터 내로 이전하였다. 제한 효소 EcoRI 및 HindIII을 사용하여 가변 영역을 Centocor의 이전에 사용된 IgG1 벡터 p104로 이전하였다. Gm(f+) 동종이형의 IgG1을 암호화하는 생성된 발현 플라스미드는 p1781(TNV14), p1782(TNV148), 및 p1783(TNV148B)로 표기된다(표 2 참조). 가변 영역을 또한 12B75(GenPharm) 유전자로부터 유래된 IgG1 불변 영역의 상류에 클로닝하였다. G1m(z) 동종이형의 IgG1을 암호화하는 그러한 발현 플라스미드가 또한 표 3에 열거되어 있다.
표 3. 다양한 중쇄 및 경쇄 플라스미드에 대한 플라스미드 식별 번호.
L28 벡터 또는 pBC 벡터는 초기 Ab cDNA 클론을 나타낸다. 그러한 플라스미드 내의 삽입물을 불완전한 12B75-기반 벡터에 이전하여 중간체 플라스미드를 제조하였다. 하나의 추가의 이전 단계는, 선형화된 후에 세포 내로 도입되거나 세포 형질주입 전에 mAb 유전자 삽입물을 정제하기 위해 사용된 최종 발현 플라스미드를 생성하였다. (ND) = 실행되지 않음.
[표 3]
경쇄 PCR 생산물을 제한 효소 SalI 및 SacII로 분해한 후, 플라스미드 pBC의 SalI 부위와 SacII 부위 사이에 클로닝하였다. 하나의 아미노산에 의해 상이한 2개의 상이한 경쇄 버전을 p1748 및 p1749로 표기하였다(표 2). DNA 서열 분석에 의해 이들 작제물이 정확한 서열을 가졌음을 확인하였다. 이어서 p1748 및 p1749 내의 SalI/AflII 단편을 중간체 벡터 p1746의 SalI 부위와 AflII 부위 사이에 클로닝하여 각각 p1755 및 p1756을 제조하였다. 이어서, p1755 및 p1756으로부터의 BsiWI/AflII 단편을 새롭게 제조된 작제물 p1762로 이전함으로써 경쇄 유전자의 이들 5' 절반을 유전자의 3' 절반에 결합시켜, 각각 최종 발현 플라스미드 p1775 및 p1776을 제조하였다(표 2).
세포 형질주입, 스크리닝, 및 서브클로닝. 다양한 TNV 발현 플라스미드로 마우스 골수종 세포의 총 15회의 형질주입을 수행하였다(결과 및 토의 섹션의 표 3 참조). 이들 형질주입은, (1) 숙주 세포가 Sp2/0이었는지, 또는 653이었는지 여부; (2) 중쇄 불변 영역이 Centocor의 이전의 IgG1 벡터에 의해 암호화되었는지, 또는 12B75 중쇄 불변 영역에 의해 암호화되었는지 여부; (3) mAb가 TNV148B, TNV148, TNV14, 또는 새로운 HC/LC 조합이었는지 여부; (4) DNA가 선형화된 플라스미드였는지, 또는 정제된 Ab 유전자 삽입물이었는지 여부; 및 (5) 중쇄 유전자 내의 완전한 J-C 인트론 서열의 존재 또는 부재에 의해 구별되었다. 또한, 몇몇 형질주입을 반복하여 많은 수의 클론이 스크리닝될 수 있는 가능성을 증가시켰다.
이전에 기재된 바와 같은 표준 조건 하에(문헌[Knight DM et al. (1993) Molecular Immunology 30:1443-1453]) 전기천공에 의해 중쇄 및 경쇄 DNA(각각 8 내지 12 :g)의 혼합물로 Sp2/0 세포 및 653 세포를 각각 형질주입시켰다. 형질주입 번호 1, 2, 3, 및 16의 경우, 형질주입 전에 제한 효소를 이용하는 분해에 의해 적절한 발현 플라스미드를 선형화하였다. 예를 들어, SalI 및 NotI 제한 효소를 사용하여 TNV148B 중쇄 플라스미드 p1783 및 경쇄 플라스미드 p1776을 각각 선형화 하였다. 나머지 형질주입의 경우, BamHI로 중쇄 플라스미드를 분해하고 BsiWI 및 NotI로 경쇄 플라스미드를 분해함으로써, mAb 유전자만을 함유한 DNA 삽입물을 플라스미드 벡터로부터 분리하였다. 이어서, mAb 유전자 삽입물을 아가로스 겔 전기영동 및 Qiex 정제 수지에 의해 정제하였다. 정제된 유전자 삽입체로 형질주입된 세포를, 선택가능한 마커의 공급원으로서의 3 내지 5 :g의 PstI-선형화된 pSV2gpt 플라스미드(p13)로 동시에 형질주입시켰다. 전기천공에 이어서, 세포를 IMDM, 15% FBS, 2 mM 글루타민 중에 96-웰 조직 배양 접시 내에 시딩하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에 인큐베이션하였다. 2일 후에, 동일 부피의 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 2 X MHX 선택(1 X MHX= 0.5 :g/ml 마이코페놀산, 2.5 :g/ml 하이포잔틴, 50 :g/ml 잔틴)을 첨가하고, 콜로니가 형성되는 동안 추가로 2 내지 3주 동안 플레이트를 인큐베이션하였다.
콜로니를 갖는 웰로부터 수집한 세포 상청액을 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 인간 IgG에 대해 검정하였다. 약술하면, 세포 상청액의 다양한 희석액을 다클론 염소 항-인간 IgG Fc 단편으로 코팅된 96-웰 EIA 플레이트 내에 인큐베이션한 후, 결합된 인간 IgG를 알칼라인 포스파타제-접합된 염소 항-인간 IgG(H+ L) 및 적절한 색 기질을 사용하여 검출하였다. 세포 상청액에서 측정되고 있는 동일한 정제된 mAb를 표준으로서 사용한 표준 곡선을 각각의 EIA 플레이트 상에 포함시켜 상청액 중의 인간 IgG의 정량화를 가능하게 하였다. 소모된 배양물에서의 추가의 생산 결정을 위해, 대부분의 인간 IgG를 생산하는 것으로 보이는 이들 콜로니 내의 세포를 24-웰 플레이트 내로 계대배양하고, 이어서 최고-생산 모 클론을 확인하였다.
더 높은 생산 서브클론을 확인하고 더 균질한 세포주를 제조하기 위해 최고-생산 모 클론을 서브클로닝하였다. IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 1 X MHX 중의 1 세포/웰 또는 4 세포/웰로 96-웰 조직 배양 플레이트를 접종하고, 콜로니가 분명해질 때까지 12 내지 20일 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 웰당 1개의 콜로니를 함유하는 웰로부터 세포 상청액을 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 선택된 콜로니를 24-웰 플레이트에 계대배양하고, 배양물을 소모되게 한 후, 그들의 상청액 중의 인간 IgG 수준을 정량화함으로써 최고-생산 서브클론을 확인하였다. 선택된 제1 라운드 서브클론에 제2 라운드의 서브클로닝을 적용할 때 이 과정을 반복하였다. 최상의 제2 라운드 서브클론을 개발을 위한 세포주로서 선택하였다.
세포 서브클론의 특징분석. 최상의 제2 라운드 서브클론을 선택하고, 성장 곡선을 수행하여 mAb 생산 수준 및 세포 성장 특징을 평가하였다. 30 ml의 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 및 1X MHX(또는 무혈청 배지) 중의 1 × 105 세포/ml로 T75 플라스크에 시딩하였다. 300 μl의 분취물을 24시간 간격으로 취하고, 생존 세포 밀도를 결정하였다. 생존 세포의 수가 1 × 105 세포/ml 미만이 될 때까지 분석을 계속하였다. 세포 상청액의 수집된 분취물을 존재하는 항체의 농도에 대해 검정하였다. 표준으로서 rTNV148B 또는 rTNV14 JG92399를 사용하여 ELISA 검정을 수행하였다. 다클론 염소 항-인간 IgG Fc로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 1시간 동안 샘플을 인큐베이션하고, 1:1000 희석에서 알칼라인 포스파타제-접합된 염소 항-인간 IgG(H+ L)로 결합된 mAb를 검출하였다.
다양한 양의 MHX 선택의 존재 하에 성장 속도를 비교하는 목적으로 2개의 세포주에 대해 상이한 성장 곡선 분석을 또한 실행하였다. MHX가 없는 배지(IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민) 내로 세포주 C466A 및 C466B를 해동시키고, 추가로 2일 동안 배양하였다. 이어서, 둘 모두의 세포 배양물을 MHX 없음, 0.2X MHX, 또는 1X MHX(1X MHX = 0.5 :g/ml 마이코페놀산, 2.5 :g/ml 하이포잔틴, 50 :g/ml 잔틴) 중 어느 하나를 함유하는 3개의 배양물로 분할하였다. 1일 후에, 새로운 T75 플라스크에 1 × 105 세포/ml의 출발 밀도로 배양물을 시딩하고, 세포를 24시간 간격으로 1주 동안 계수하였다. mAb 생산에 대한 분취물은 수집하지 않았다. SOP PD32.025에 제공된 수학식을 사용하여 이들 샘플에 대해 배가 시간을 계산하였다.
추가의 연구를 수행하여 시간 경과에 따른 mAb 생산의 안정성을 평가하였다. MHX 선택 유무에 관계없이 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민 중에 24 웰 플레이트 내에서 배양물을 성장시켰다. 배양물이 융합성이 되었을 때마다 배양물을 새로운 배양물로 분할한 후, 더 오래된 배양물을 소모되게 하였다. 이 시점에, 상청액의 분취물을 취하고 4℃에서 저장하였다. 55 내지 78일의 기간에 걸쳐 분취량을 취하였다. 이 기간의 종료 시에, 상기 약술된 바와 같이 항-인간 IgG Fc ELISA에 의해 상청액을 존재하는 항체의 양에 대해 시험하였다.
결과 및 토의.
재조합 수용체에 대한 TNF 결합의 억제.
하이브리도마 세포 상청액에 함유된 8개의 TNV mAb가 수용체에 대한 TNFα 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 단순 결합 검정을 수행하였다. 이들 각각의 세포 상청액 중의 TNV mAb의 농도를 인간 IgG에 대한 표준 ELISA 분석에 의해 먼저 결정하였다. 이어서, 재조합 p55 TNF 수용체/IgG 융합 단백질인 p55-sf2를 EIA 플레이트 상에 코팅하고, 다양한 양의 TNV mAb의 존재 하에 125I-표지된 TNFα를 p55 수용체에 결합시켰다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 8개의 TNV mAb 중의 하나(TNV122)를 제외한 모두가 p55 수용체에 대한 TNFα 결합을 효율적으로 차단하였다. 실제로, TNV mAb는 음성 대조군 하이브리도마 상청액 내로 스파이킹된 cA2 양성 대조군 mAb보다 TNFα 결합을 억제함에 있어서 더 효과적인 것으로 보였다. 이들 결과는 TNV mAb가 세포-기반 검정 및 생체내에서 TNFα 생물활성을 차단할 가능성이 매우 높았음을 나타내는 것으로 해석되었으며, 따라서 추가의 분석이 타당해졌다.
DNA 서열 분석.
RNA가 인간 mAb를 암호화한다는 것의 확인.
수용체 결합 검정에서 TNFα-차단 활성을 나타낸 7개의 TNV mAb(TNV14, TNV15, TNV32, TNV86, TNV118, TNV148, 및 TNV196)를 특징분석하는 제1 단계로서, 이들 mAb를 생산하는 7개의 하이브리도마 세포주로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 각각의 RNA 샘플을 사용하여, 완전 신호 서열, 완전 가변 영역 서열, 및 각각의 mAb에 대한 불변 영역 서열의 일부를 포함한 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 cDNA를 제조하였다. 이어서, 이들 cDNA 생산물을 PCR 반응에서 증폭하고, 단편을 먼저 클로닝하는 단계 없이, PCR-증폭된 DNA를 직접 서열분석하였다. 서열분석된 중쇄 cDNA는 마우스에 존재하는 5개의 인간 생식세포계열 유전자 중의 하나인 DP-46과 90% 초과로 동일하였다(도 2). 유사하게, 서열분석된 경쇄 cDNA는 마우스에 존재하는 인간 생식세포계열 유전자 중의 하나와 100% 또는 98% 동일하였다(도 3). 이들 서열 결과에 의해, cDNA로 전사되고 서열분석된 RNA 분자가 인간 항체 중쇄 및 인간 항체 경쇄를 암호화하였음이 확인되었다. 가변 영역이 신호 서열 코딩 서열의 5' 말단에 맵핑되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭되었으므로, 신호 서열의 최초 몇개의 아미노산은 원래의 TNV 번역 생산물의 실제 서열이 아니고, 그들은 재조합 TNV mAb의 실제 서열을 나타낸다는 것에 유의해야 한다.
독특한 중화 mAb.
각각의 mAb에 대한 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 전체 가변 영역에 대한 cDNA 서열의 분석에 의해, TNV32는 TNV15와 동일하고, TNV118은 TNV14와 동일하며, TNV86은 TNV148과 동일함이 밝혀졌다. 수용체 결합 검정의 결과는 DNA 서열 분석과 일치하였으며, 즉, TNV86 및 TNV148 둘 모두는 TNF 결합을 차단함에 있어서 TNV118 및 TNV14 둘 모두보다 대략 4배 더 양호하였다. 그러므로, 후속 연구는 단지 4개의 독특한 TNV mAb, TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196에 집중하였다.
4개의 mAb의 관련성
DNA 서열 결과에 의해, 4개의 TNV mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자가 모두 서로 고도로 상동성이며, 모두 동일한 생식세포계열 유전자, DP-46으로부터 유래된 것으로 보인다는 것이 밝혀졌다(도 2). 또한, 중쇄 CDR3 서열 각각이 그렇게 유사하고 동일한 길이이므로, 그리고 그들이 모두 J6 엑손을 사용하므로, 그들은 단일 VDJ 유전자 재배열 사례에 이어서 각각의 mAb를 독특하게 만든 체세포 변화에 의해 발생한 것으로 보였다. DNA 서열 분석에 의해, 4 개의 mAb 사이에 단지 2개의 별개의 경쇄 유전자가 존재함이 밝혀졌다(도 3). TNV14 및 TNV15의 경쇄 가변 영역 코딩 서열은 서로 동일하고 인간 카파 사슬의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 생식세포계열 서열과 동일하다. TNV148 및 TNV196 경쇄 코딩 서열은 서로 동일하지만 2개의 뉴클레오티드 위치에서 생식세포계열 서열과 상이하다(도 3).
4개의 mAb의 추정된 아미노산 서열에 의해 실제 mAb의 관련성이 밝혀졌다. 4개의 mAb는 4개의 별개의 중쇄를 함유하지만(도 4), 단지 2개의 별개의 경쇄만을 함유한다(도 5). TNV mAb 서열과 생식세포계열 서열 사이의 차이는 주로 CDR 도메인에 국한되었지만, mAb 중쇄 중 3개는 또한 프레임워크 영역에서 생식세포계열 서열과 상이하였다(도 4). DP-46 생식세포계열-암호화 Ab 프레임워크 영역에 비교하여, TNV14는 동일하였으며, TNV15는 1개의 아미노산에 의해 상이하였고, TNV148은 2개의 아미노산에 의해 상이하였으며, TNV196은 3개의 아미노산에 의해 상이하였다.
cDNA의 클로닝, 부위-특이적 돌연변이유발, 및 최종 발현 플라스미드의 조립. cDNA의 클로닝. PCR 증폭된 가변 영역의 DNA 서열에 기초하여, 발현 벡터 내로 클로닝될 코딩 서열을 적응시킬 목적으로 PCR 증폭의 다른 라운드를 수행하기 위해 새로운 올리고뉴클레오티드를 주문하였다. 중쇄의 경우, 이러한 제2 라운드의 PCR의 생산물을 제한 효소 BsiWI 및 BstBI로 분해하고, 플라스미드 벡터 L28(표 2에 나타낸 플라스미드 식별 번호) 내로 클로닝하였다. 경쇄의 경우, 제2 라운드 PCR 생산물을 SalI 및 AflII로 분해하고, 플라스미드 벡터 pBC 내로 클로닝하였다. 이어서, 개별 클론을 서열분석하여, 그들의 서열이 PCR 생산물의 직접 서열분석으로부터 얻어진 이전의 서열과 동일하다는 것을 확인하였으며, 이에 의해 잠재적으로 불균질한 분자 집단에서 각각의 위치에 가장 풍부한 뉴클레오티드가 밝혀졌다.
TNV148을 변화시키기 위한 부위-특이적 돌연변이유발. mAb TNV148 및 TNV196은 TNFα 생물활성을 중화시킴에 있어서 차선의 mAb(TNV14)보다 4배 더 강력한 것으로 일관되게 관찰되었다. 그러나, 상기 기재된 바와 같이, TNV148 및 TNV196 중쇄 프레임워크 서열은 생식세포계열 프레임워크 서열과 상이하였다. TNV148 중쇄 서열과 다른 인간 항체의 비교는, 다수의 다른 인간 mAb가 프레임워크 1 내의 위치 28에서 Ile 잔기를 함유한 반면에(성숙한 서열만을 계수함), 프레임워크 3 내의 위치 75에서의 Pro 잔기는 그 위치에서 특이한 아미노산임을 나타냈다.
TNV196 중쇄의 유사한 비교는 프레임워크 3 내의 생식세포계열 서열과 상이한 3개의 아미노산이 인간 mAb에서 희귀할 수 있음을 시사하였다. 인간에게 투여될 경우에 이들 차이는 TNV148 및 TNV196을 면역원성이 되게 할 수 있는 가능성이 있었다. TNV148은 단지 하나의 관심 아미노산 잔기를 가졌고, 이 잔기는 TNFα 결합에 중요하지 않은 것으로 여겨졌기 때문에, 위치 75에서 Pro 잔기 대신에 생식세포계열 Ser 잔기가 암호화되도록 부위-특이적 돌연변이유발 기술을 사용하여 (플라스미드 p1753에서) TNV148 중쇄 코딩 서열 내의 단일 뉴클레오티드를 변화시켰다. 생성된 플라스미드를 p1760으로 명명하였다(표 2 참조). 생성된 유전자 및 mAb를 TNV148B로 명명하여 그것을 원래의 TNV148 유전자 및 mAb와 구별하였다(도 5 참조).
최종 발현 플라스미드의 조립. 게놈 단편으로서 이전에 클로닝된 12B75 중쇄 및 경쇄 유전자에 기초한 새로운 항체 발현 벡터를 제조하였다. 상이한 TNV 발현 플라스미드를 제조하였지만(표 2 참조), 각각의 경우에, 5' 측면 서열, 프로모터, 및 인트론 인핸서는 각각의 12B75 유전자로부터 유래되었다. 경쇄 발현 플라스미드의 경우, 완전 J-C 인트론, 불변 영역 코딩 서열, 및 3' 측면 서열은 또한 12B75 경쇄 유전자로부터 유래되었다. 최종 생산 세포주(p1781 및 p1783, 하기 참조)를 생성한 중쇄 발현 플라스미드의 경우, 인간 IgG1 불변 영역 코딩 서열은 Centocor의 이전에 사용된 발현 벡터(p104)로부터 유래되었다. 중요하게는, 본원에 보고된 최종 생산 세포주는 원래의 하이브리도마 유래 TNV mAb(G1m(z))와는 상이한 TNV mAb의 동종이형(Gm(f+))을 발현한다. 이는 GenPharm 마우스로부터 유래된 12B75 중쇄 유전자는 CH1 도메인의 C-말단에서 Arg 잔기를 암호화하는 반면에, Centocor의 IgG1 발현 벡터 p104는 그 위치에서 Lys 잔기를 암호화하기 때문이다. 다른 중쇄 발현 플라스미드(예를 들어 p1786 및 p1788)를 제조하였으며, 여기서 J-C 인트론, 완전 불변 영역 코딩 서열, 및 3' 측면 서열은 12B75 중쇄 유전자로부터 유래되었지만, 그러한 유전자로 형질주입된 세포주는 생산 세포주로서 선택되지 않았다. 최종 발현 플라스미드를 생성할 향후 PCR-증폭된 V 영역의 1-단계 클로닝을 가능하게 하도록 신중하게 벡터를 설계하였다.
PCR 증폭된 가변 영역 cDNA를 L28 또는 pBC 벡터로부터 중간-스테이지, 12B75-기반 벡터로 이전하였으며, 이는 프로모터 영역 및 J-C 인트론의 일부를 제공하였다(플라스미드 식별 번호에 대해서는 표 2 참조). 이어서, 항체 유전자의 5' 절반을 함유하는 제한 단편을 이들 중간-스테이지 벡터로부터 최종 발현 벡터로 이전하였으며, 이는 각각의 유전자의 3' 절반을 제공하여 최종 발현 플라스미드를 형성하였다(플라스미드 식별 번호에 대해서는 표 2 참조).
세포 형질주입 및 서브클로닝. 발현 플라스미드를 제한 분해에 의해 선형화하거나, 각각의 플라스미드 내의 항체 유전자 삽입물을 플라스미드 골격으로부터 정제해내었다. Sp2/0 및 653 마우스 골수종 세포를 전기천공에 의해 중쇄 및 경쇄 DNA로 형질주입시켰다. 15개의 상이한 형질주입을 실행하였으며, 이들 중 대부분은 Ab, Ab 유전자의 특이적 특성, 유전자가 선형화된 전체 플라스미드 상에 있는지, 또는 정제된 유전자 삽입물 상에 있는지 여부, 및 숙주 세포주에 의해 정의되는 바와 같이 독특하였다(표 4에 요약됨). 마이코페놀산에 대해 내성인 클론으로부터의 세포 상청액을 ELISA에 의해 인간 IgG의 존재에 대해 검정하고, 정제된 rTNV148B를 참조 표준 곡선으로서 사용하여 정량화하였다.
최고-제조 rTNV148B 세포주
rTNV148B 형질주입 2로부터의 최선-생산 653 모 세포주 중 -10개(소모된 24-웰 배양물 중에 5 내지 10 :g/ml를 생산함)를 서브클로닝하여 더 높은 생산 세포주에 대해 스크리닝하고 더 균질한 세포 집단을 제조하였다. 모 세포주 2.320, 2.320-17, 및 2.320-20의 서브클론 중 2개는 소모된 24-웰 배양물 중에 대략 50 :g/ml를 생산하였으며, 이는 그들의 모 세포주에 비해 5배 증가였다. 서브클로닝된 세포주 2.320-17 및 2.320-20의 서브클로닝의 제2 라운드가 이어졌다.
각각의 mAb를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 식별 번호를 나타낸다. 정제된 mAb 유전자 삽입물을 이용하여 실행된 형질주입의 경우, 플라스미드 p13(pSV2gpt)을 gpt 선택가능한 마커의 공급원으로서 포함시켰다. 중쇄 불변 영역은 Remicade를 암호화하기 위해 사용된 동일한 인간 IgG1 발현 벡터('구')에 의해, 또는 12B75(GenPharm/Medarex) 중쇄 유전자 내에 함유된 불변 영역('신')에 의해 암호화되었다. H1/L2는 TNV14 중쇄 및 TNV148 경쇄로 구성된 "신규" mAb를 지칭한다. 플라스미드 p1783 및 p1801은 단지 그들의 중쇄 유전자가 얼마나 많은 J-C 인트론을 함유하는지에 의해 상이하다. 세포 클론에 대한 일반 명칭의 최초 숫자를 정의하는 형질주입 번호는 우측에 나타낸다. 본원에 기재된 rTNV148B-생산 세포주 C466(A, B, C, D) 및 C467A는 각각 형질주입 번호 2 및 1로부터 유래되었다. rTNV14-생산 세포주 C476A는 형질주입 번호 3으로부터 유래되었다.
[표 4]
소모된 24-웰 배양 상청액에 대한 ELISA 검정은 이들 제2 라운드 서브클론이 모두 98 내지 124 :g/ml를 생산하였음을 나타냈으며, 이는 제1 라운드 서브클론에 비해 2배 이상의 증가였다. 표 5에 나타낸 바와 같이 이들 653 세포주에 C 코드 표기를 배정하였다.
rTNV148B 형질주입 1로부터의 최선-생산 Sp2/0 모 세포주 중 3개를 서브클로닝하였다. 모 세포주 1.73의 2회 라운드의 서브클로닝은 소모된 24-웰 배양물 중에 25 :g/ml를 생산한 클론의 확인으로 이어졌다. 이러한 Sp2/0 세포주를 C467A로 표기하였다(표 5).
최고-제조 rTNV14 세포주
rTNV14 형질주입 3으로부터의 최선-생산 Sp2/0 모 세포주 중 3개를 1회 서브클로닝하였다. 서브클론 3.27-1은 19 :g/ml의 생산으로 소모된 24-웰 배양물에서 최고-생산자인 것으로 확인되었다. 이 세포주를 C476A로 표기하였다(표 5).
표 5. 선택된 생산 세포주 및 그들의 C 코드의 요약.
원래의 클론 명칭의 최초 숫자는 어느 형질주입으로부터 세포주가 유래되었는지를 나타낸다. 본원에 보고된 C-코드로 나타낸 모든 세포주는 제한 효소로 선형화된 중쇄 및 경쇄 전체 플라스미드를 이용하는 형질주입으로부터 유래되었다.
[표 5]
서브클로닝된 세포주의 특징분석
세포주 성장 특징을 더 신중하게 특징분석하고 더 큰 규모로 mAb-생산 수준을 결정하기 위하여, T75 배양물을 사용하여 성장 곡선 분석을 수행하였다. 결과는 4개의 C466 시리즈의 세포주 각각이 1.0 × 106 내지 1.25 × 106 세포/ml의 피크 세포 밀도 및 110 내지 140 :g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달하였음을 나타냈다(도 7). 반면에, 최선-생산 Sp2/0 서브클론, C467A는 2.0 × 106 세포/ml의 피크 세포 밀도 및 25 :g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달하였다(도 7). rTNV14-생산 세포주, C476A에 대해서는 성장 곡선 분석을 실행하지 않았다.
추가의 성장 곡선 분석을 실행하여 상이한 농도의 MHX 선택에서의 성장 속도를 비교하였다. 이러한 비교는, MHX의 부재 하에 배양된 C466 세포가 정상 양의 MHX(1X) 중에 배양된 동일한 세포보다 더 빠르게 성장하는 것으로 보였다는 최근의 관찰에 의해 촉구되었다. 마이코페놀산과 같은 화합물의 세포독성 농도는 여러 자릿수에 걸쳐 측정되는 경향이 있으므로, 낮은 농도의 MHX의 사용은 mAb 생산의 안정성을 희생시키지 않으면서 유의미하게 더 빠른 세포 배가 시간을 유발할 수 있는 것으로 생각되었다. 세포주 C466A 및 C466B를 MHX 없음, 0.2X MHX, 또는 1X MHX 중 어느 하나 중에 배양하였다. 생존 세포 계수를 7일 동안 24시간 간격으로 취하였다. 결과에 의해 MHX 농도-의존적 세포 성장 속도가 밝혀졌다(도 8). 세포주 C466A는 1X MHX에서 25.0시간의 배가 시간을 나타냈지만 MHX 없음에서는 단지 20.7시간이었다. 유사하게, 세포주 C466B는 1X MHX에서 32.4시간의 배가 시간을 나타냈지만 MHX 없음에서는 단지 22.9시간이었다. 중요하게는, 0.2X MHX에서 둘 모두의 세포주에 대한 배가 시간은 1X MHX에서보다 MHX 없음에서 관찰된 것과 더 유사하였다(도 8). 이러한 관찰은, 배가 시간이 중요한 파라미터인 생물반응기에서의 향상된 세포 성능이 더 적은 MHX를 사용함으로써 실현될 수 있을 것이라는 가능성을 제기한다. 그러나, 안정성 시험 결과(하기 참조)는 세포주 C466D가 MHX가 존재하지 않는 경우에도 60일 이상 동안 rTNV148B를 안정하게 생산할 수 있음을 시사하지만, 안정성 시험은 또한 MHX의 부재에 비교하여 MHX의 존재 하에 세포가 배양되었을 때 더 높은 mAb 생산 수준을 나타냈다.
대략 60일의 기간에 걸쳐 다양한 세포주로부터 mAb 생산을 평가하기 위하여, MHX 선택을 함유하거나 함유하지 않은 배양물에 대해 안정성 시험을 수행하였다. 모든 세포주가 높은 mAb 생산을 유지하지는 않았다. 단지 2주의 배양 후에, 클론 C466A는 연구 시작점에서보다 대략 45% 더 적게 생산하고 있었다. 클론 C466B로부터의 생산 또한 유의미하게 하락하는 것으로 보였다. 그러나, 클론 C466C 및 C466D는 상당히 안정한 생산을 유지하였으며, C466D는 최고 절대 생산 수준을 나타낸다(도 9).
결론
인간 TNFα에 대한 8개의 인간 mAb의 초기 패널로부터, 단백질 서열 및 TNF 중화 효력을 포함한 몇몇 기준에 기초하여, TNV148B와 더불어 TNV14가 바람직한 것으로 선택되었다. 100 :g/ml 초과의 rTNV148B 및 19 :g/ml의 rTNV14를 생산하는 세포주를 제조하였다.
실시예 5: 단일 볼루스 주사를 사용하는 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구
대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 본 발명의 항-TNF 항체(TNV14, TNV148, 또는 TNV196)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다.
결과: 체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 10 mg/kg cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이러한 체중 증가는 3 내지 7주차에 유의미하였다. 10 mg/kg TNV148로 치료한 동물은 또한 연구의 7주차에 유의미한 체중 증가를 달성하였다. (도 10 참조).
도 11a 내지 도 11c는 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 3주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(7주차). 1 mg/kg TNV14로 치료한 동물 및 1 mg/kg cA2로 치료한 동물은, D-PBS-치료군에 비교할 때, 3주차 후에 AI의 유의미한 감소를 나타내지 못하였다. 10 mg/kg 치료군들 사이에는, 각각을 유사한 용량의 다른 것들에 비교했을 때(10 mg/kg cA2를 10 mg/kg TNV14, 148, 및 196에 비교함) 유의미한 차이가 없었다. 1 mg/kg 치료군을 비교했을 때, 1 mg/kg TNV148은 3주, 4주, 및 7주에 1 mg/kg cA2보다 유의미하게 더 낮은 AI를 나타냈다. 1 mg/kg TNV148은 또한 3주 및 4주에 1 mg/kg TNV14-치료군보다 유의미하게 더 낮았다. TNV196은 연구의 6주차까지 AI의 유의미한 감소를 나타냈지만(D-PBS-치료군에 비교할 때), 연구 종료 시에 유의미하게 유지된 유일한 1 mg/kg 치료는 TNV148이었다.
실시예 6: 다중 볼루스 용량으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구
대략 4주에, 체중에 기초하여, 8개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 대조 물품(D-PBS) 또는 3 mg/kg의 항체(TNV14, TNV148)의 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다(0주차). 1, 2, 3, 및 4주차에 모든 동물에서 주사를 반복하였다. 시험 물품 효능에 대해 군 1 내지 군 6을 평가하였다. 군 7 및 군 8의 동물로부터 얻은 혈청 샘플을 2, 3, 및 4주차에 TNV14 또는 TNV148의 면역 반응 유도 및 약동학적 제거에 대해 평가하였다.
결과: 체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 10 mg/kg cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. (도 12 참조).
도 13a 내지 도 13c는 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 유의미하게 더 낮았으며, 이는 2주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(5주차). 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 cA2로 치료한 동물 및 3 mg/kg TNV14로 치료한 동물은, d-PBS 대조군에 비교할 때, 연구 전체에 걸쳐 임의의 시점에 AI의 임의의 유의미한 감소를 달성하지 못하였다. 3 mg/kg TNV148로 치료한 동물은 d-PBS-치료군에 비교할 때 유의미한 감소를 나타냈으며, 이는 3주차에 시작하여 5주차까지 계속되었다. 10 mg/kg cA2-치료 동물은 연구의 4 및 5주차에 cA2의 더 낮은 용량(1 mg/kg 및 3 mg/kg) 둘 모두에 비교할 때 AI의 유의미한 감소를 나타냈으며, 또한 3 내지 5주차에 TNV14-치료 동물보다 유의미하게 더 낮았다. 3 mg/kg 치료군 중 임의의 것 사이에는 유의미한 차이가 없는 것으로 보였지만, 3 mg/kg TNV14로 치료한 동물에 대한 AI는 일부 시점에 10 mg/kg 보다 유의미하게 더 높았던 반면에, TNV148로 치료한 동물은 10 mg/kg의 cA2로 치료한 동물과 유의미하게 상이하지 않았다.
실시예 7: 단일 복강내 볼루스 용량으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구
대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 6개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 3 mg/kg 또는 5 mg/kg으로 항체(cA2, 또는 TNV148)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다. 이 연구는 D-PBS 및 10 mg/kg cA2 대조군을 이용하였다.
체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 모든 치료는 유사한 체중 증가를 달성하였다. 3 또는 5 mg/kg의 TNV148 또는 5 mg/kg cA2로 치료한 동물은 연구 초기(2 및 3주차)에 유의미한 양의 체중이 증가했다. TNV148로 치료한 동물만이 이후의 시점에 유의미한 체중 증가를 유지했다. 3 및 5 mg/kg TNV148-치료 동물 둘 모두는 7주에 유의성을 나타냈고, 3 mg/kg TNV148 동물은 주사 후 8주에 여전히 유의미하게 상승하였다. (도 14 참조).
도 15는 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 모든 치료군은 초기 시점에 일부 보호를 나타냈으며, 5 mg/kg cA2 및 5 mg/kg TNV148은 1주차 내지 3주차에 AI의 유의미한 감소를 나타냈고 모든 치료군이 2주차에 유의미한 감소를 나타냈다. 연구 후반에, 5 mg/kg cA2로 치료한 동물은 4, 6, 및 7주차에 유의미한 감소를 갖는 일부 보호를 나타냈다. cA2 및 TNV148 둘 모두의 낮은 용량(3 mg/kg)은 6주차에 유의미한 감소를 나타냈으며, 모든 치료군이 7주차에 유의미한 감소를 나타냈다. 치료군 중 어느 것도 연구 종료 시에 유의미한 감소를 유지할 수 없었다(8주차). 임의의 치료군(식염수 대조군을 배제함) 사이에는 임의의 시점에 유의미한 차이가 없었다.
실시예 8: 항-TNF 항체 및 변형된 항-TNF 항체 사이의 단일 복강내 볼루스 용량으로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구
TNV148(하이브리도마 세포로부터 유래됨) 및 rTNV148B(형질주입된 세포로부터 유래됨)의 단일 복강내 용량의 효능을 비교하기 위한 것이다. 대략 4주에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코=S PBS(D-PBS) 또는 1 mg/kg의 항체(TNV148 또는 rTNV148B)의 단일 복강내 볼루스 용량으로 치료하였다.
체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 10 mg/kg cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이러한 체중 증가는 1주차와 3 내지 8주차에 유의미하였다. 1 mg/kg TNV148로 치료한 동물은 또한 연구의 5, 6, 및 8주차에 유의미한 체중 증가를 달성하였다. (도 16 참조).
도 17은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/kg cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 4주차에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(8주차). TNV148-치료군 및 1 mg/kg cA2-치료군 둘 모두는 4주차에 AI의 유의미한 감소를 나타냈다. 이전의 연구(P-099-017)는 TNV148이 단일 1 mg/kg 복강내 볼루스 후에 관절염 지수를 감소시키는 데 약간 더 효과적이었음을 나타냈지만, 본 연구는 TNV 항체-치료군의 둘 모두의 버전으로부터의 AI가 약간 더 높았음을 나타냈다. 1 mg/kg cA2-치료군은 10 mg/kg cA2 군에 비교할 때 유의미하게 증가되지 않았고 TNV148-치료군은 7주차 및 8주차에 유의미하게 더 높았지만(6주차는 제외함), 연구 중 임의의 지점에 1 mg/kg cA2, 1 mg/kg TNV148, 및 1 mg/kg TNV148B 사이에는 AI의 유의미한 차이가 없었다.
실시예 9: SIMPONI®(골리무맙)를 제조하기 위한 제조 공정
골리무맙에 대한 배경
항-TNFα 작용제를 이용하는 요법이 염증성 관절염의 치료에 성공적으로 사용되어 왔지만, 초기 항-TNFα 작용제는 안전성, 투여 계획, 비용, 및/또는 면역원성에 대한 제한을 가졌다. 이들 제한 중 일부를 해결하기 위하여, 완전 인간 항-TNFα mAb가 개발되었고, SIMPONI®(골리무맙)로 지정되었다. 골리무맙(CNTO 148 및 rTNV148B로도 알려짐)은 면역글로불린 G1(IgG1) 중쇄 동종형(G1m[z] 동종이인자형(allotype)) 및 카파 경쇄 동종형을 갖는 완전 인간 단일클론 항체이다. 골리무맙은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는다. 골리무맙의 분자량은 149,802 내지 151,064 달톤의 범위이다.
골리무맙은 높은 친화도 및 특이성으로 인간 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 가용성 형태 및 막관통 생물활성 형태 둘 모두와 고친화성의 안정한 복합체를 형성하며, 이는 TNFα의 그의 수용체에 대한 결합을 방지하고 TNFα 생물활성을 중화시킨다. 다른 TNFα 수퍼패밀리 리간드에 대한 결합은 관찰되지 않았으며; 특히, 골리무맙은 인간 림프독소에 결합하거나 중화시키지 않는다. TNFα는 활성화된 단핵구, 대식세포 및 T 세포에 의해 막관통 단백질로서 주로 합성되며, 이는 자가-회합하여 생물활성 동종삼량체를 형성하고, 이는 단백질 분해에 의해 세포 표면으로부터 신속하게 방출된다. p55 또는 p75 TNF 수용체에 대한 TNFα의 결합은 수용체 세포질 도메인의 클러스터링(clustering)으로 이어지고 신호전달을 개시한다. 종양 괴사 인자 α는, 다양한 자극에 반응하여 생산되고 후속으로 카스파제-의존성 세포자멸 경로의 활성화 및 전사 인자인 핵 인자(NF)- κB 및 활성화인자 단백질-1(AP-1)을 통해 염증 반응을 촉진하는 주요 감시 사이토카인(sentinel cytokine)으로서 확인되어 있다. 종양 괴사 인자 α는 또한 배중심 내의 면역 세포의 조직화에서 그의 역할을 통해 면역 반응을 조절한다. TNFα의 상승된 발현은 만성 염증성 질환, 예컨대 류마티스 관절염(RA)과 더불어 건선성 관절염(PsA) 및 강직성 척추염(AS)과 같은 척추관절병증에 연결되었으며, 이들 질환의 특징인 관절 염증 및 구조적 손상의 중요한 매개체이다.
골리무맙을 사용한 임상 시험
강직성 척추염(AS)을 갖는 대상체에서 피하(SC) 투여되는 골리무맙의 전역적, 무작위 배정, 이중-맹검, 플라세보-대조 3상 연구(global, randomized, double-blind, placebo-controlled Phase 3 study)(연구 C0524T09)에서, 골리무맙은 강직성 척추염(AS)에 의해 영향을 받은 대상체에서 징후 및 증상, 신체 기능, 및 건강-관련 삶의 질(HRQOL)을 개선하는 데 효능이 있는 것으로 입증되었다. 더욱이, 안전성 분석은 SC 골리무맙이 대체로 내약성이 양호하다는 것을 보여주었으며, 다른 항-TNFα 작용제에서 관찰된 것과 유사한 안전성 프로파일을 입증하였다.
SC 골리무맙에 대해 알려진 안전성 및 효능을 고려해 볼 때, IV 골리무맙이 또한 RA, PsA, 및 AS와 같은 류마티스성 질병에서 다른 항-TNFα 작용제와 일치하는 허용되는 안전성 프로파일로 효능을 입증할 것으로 예상되었다. 정맥내 골리무맙은 RA의 치료를 위한 승인의 기반을 형성한 3 상 연구(CNTO148ART3001)에서 명확하게 연구되었다. CNTO148ART3001 연구는, 동시 메토트렉세이트(MTX) 요법에도 불구하고 활성 RA를 갖는 대상체에서, 0주차에서, 4주차에서, 그리고 그 이후로는 매 8주(q8w) 30 ± 10분의 기간에 걸쳐 투여된 골리무맙 2 mg/kg 주입의 IV 투여의 효능 및 안전성의 무작위 배정, 이중-맹검, 위약-대조, 다기관, 2-군 연구(randomized, double-blind, placebo-controlled, multicenter, 2-arm study)였다. MTX에도 불구하고 활성 RA를 갖는 대상체를 위약 주입을 제공받거나 0주차에서, 4주차에서, 그리고 24주차까지 매 8주 2 mg/kg으로 투여되는 IV 골리무맙을 제공받도록 무작위 배정하였다. 24주차에서 시작하여, 모든 대상체를 100주차까지 IV 골리무맙으로 치료하였다. IV 골리무맙이 RA 징후 및 증상, 신체 기능, 및 건강 관련 삶의 질의 개선뿐만 아니라 구조적 손상의 진행을 억제함에 있어서 실질적인 이익을 제공하였음이 입증되었다. RA의 치료에서 정맥내 투여된 골리무맙(CNTO148ART3001)은 강력한 효능, 및 낮은 주입 반응 발생률을 갖는 허용되는 안전성 프로파일을 입증하였다.
보다 최근에는, 활성 강직성 척추염(AS) 및 활성 건선성 관절염(PsA)을 갖는 대상체의 치료에서 정맥내(IV) 골리무맙의 효능 및 안전성을 평가하기 위해 2개의 3상 연구가 설계되었다. 현재 이용가능한 IV 항-TNFα 작용제는 면역원성 및 주입 반응에 대한 제한을 가지며, IV 골리무맙에 대한 30 ± 10분 주입과 비교하여 더 긴 주입 시간(60 내지 120분)을 가지므로, 대상체에서 IV 투여 경로가 평가되고 있다. 환자는 또한 SC 작용제와 비교하여 더 빈번한 투여보다는 IV 골리무맙의 유지 투여량 일정을 선호할 수 있다.
제조 공정 개요
Simponi(골리무맙)는 연속 관류 세포 배양 후 정제를 포함하는 9-스테이지 공정으로 제조된다. 제조 공정의 개요가 도 18에 제공되어 있다.
전배양, 세포 확장, 및 세포 생산이 스테이지 1 및 스테이지 2에서 수행된다. 스테이지 1에서는, 골리무맙의 HC 및 LC 서열을 발현하는 형질주입된 Sp2/0 세포의 단일 작업 세포 뱅크 바이알로부터 전배양을 개시하고, 세포를 배양 플라스크, 일회용 배양 백, 및 내부 스핀 필터가 구비된 50 L 관류 시드 생물반응기 또는 교번 접선 유동(alternating tangential flow, ATF) 중공-섬유 필터 세포 체류 시스템이 구비된 200 L 관류 시드 생물반응기 중 어느 하나에서 확장시킨다. 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기의 접종에 필요한 세포 밀도 및 부피가 얻어질 때까지 세포를 배양한다. 스테이지 2에서는, 세포 배양물을 ATF 시스템을 사용하여 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기 내에서 연속적으로 관류시킨다. 세포 배양 투과물(수확물(harvest))을 ATF 시스템으로부터 수집하며, 한편 세포는 생물반응기로 반환시키고, 배양물을 신선한 배지로 보충한다. 생물반응기로부터 취한 바이오매스는 ATF 시스템으로부터 취출된 수확물과 조합될 수 있으며, 이어서 추가의 처리를 위해 풀링된 수확물을 생성하도록 청징화될 수 있다.
세포 배양 수확물로부터의 골리무맙의 정제를 스테이지 3부터 스테이지 8까지에서, 친화성 크로마토그래피 단계 및 이온 교환 크로마토그래피 단계의 조합 및 잠재적인 바이러스 오염을 불활성화시키거나 제거하는 단계(용매/세제 처리 및 바이러스 제거 여과)에 의해 수행한다. 스테이지 3에서는, 수확물 및/또는 풀링된 수확물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 청징화하고 정제한다. 생성된 직접적 생산물 포획(DPC) 용리액을 추가의 처리 시까지 동결시킨다. 스테이지 4에서는, 해동 후에 DPC 용리액을 여과하고 풀링하고, 후속으로 스테이지 5에서는, 트라이-n-부틸 포스페이트(TNBP) 및 폴리소르베이트 80(PS 80)으로 처리하여 잠재적으로 존재하는 임의의 지질-외피보유 바이러스를 불활성화시킨다.
스테이지 6에서는, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 골리무맙 생산물로부터 TNBP 및 PS 80 시약 및 불순물을 제거한다. 스테이지 7에서는, 골리무맙 생산물을 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하여 DNA, 잠재적으로 존재하는 바이러스, 및 불순물을 제거한다. 스테이지 8에서는, 정제된 골리무맙 생산물을 희석시키고, 바이러스 체류용 필터(virus retentive filter)를 통해 여과한다.
스테이지 9에서는, 골리무맙의 최종 제조를 수행한다. 한외여과 단계는 골리무맙 생산물을 농축시키고, 투석여과 단계는 제형화 부형제를 첨가하여 공정중(in-process) 완충제 염을 제거한다. PS 80을 첨가하고, 벌크 중간체를 제형화된 벌크(formulated bulk)로서의 동결 저장을 위해 폴리카르보네이트 용기 내로 여과한다.
배치는, 특성 및 품질이 균일하도록 의도되고 규정된 제조 사이클 동안 생산된 일정량의 물질, 중간체, 또는 완성된 생산물로서 정의된다. 용어 "배치"는 하기에 적용된다:
50 L 시드 반응기 / 500 L 생산용 생물반응기
200 L 시드 생물반응기
1000 L 생산용 생물반응기
직접적 생산물 포획
하류 처리
상기 제조 공정의 다수의 스테이지 동안, 다양한 배치 번호가 할당된다. 하기에서는, 상기 제조 공정에서 배치로 규정되는 스테이지들의 요약을 제공한다.
상기 제조 공정에서의 제1 스테이지는 작업 세포 뱅크(WCB: working cell bank) 바이알로부터의 전배양의 개시이다. 각각의 전배양물 또는 백업 전배양물(backup preculture)이 배치로서 확인된다.
전배양물이 접종 기준을 충족시킬 때, 전배양물을 50 L 시드 생물반응기에 옮기고, 하나의 50 L 시드 생물반응기의 내용물을 하나의 500 L 생산용 생물반응기에 옮기고, 50 L 생물반응기 및 500 L 생물반응기의 각각의 조합은 배치로서 확인된다. 생물반응기로부터 취한 바이오매스는 ATF 시스템으로부터 취출된 수확물과 조합될 수 있으며, 이어서 추가의 처리를 위해 풀링된 수확물을 생성하도록 청징화될 수 있다. 하나의 500 L 생물반응기로부터 유래되는 모든 세포 배양 상층액 수확물 또는 풀링된 수확물은 생물반응기 배치 번호 + 특정 수확물에 상응하는 연장번호(즉, 001, 002 등)를 제공받는다.
전배양물은 또한 200 L 시드 생물반응기에 옮겨질 수 있으며, 하나의 200 L 시드 생물반응기의 내용물이 하나의 1000 L 생산용 생물반응기에 옮겨진다. 각각의 개별 200 L 및 1000 L 생물반응기가 배치로 규정된다. 하나의 1000 L 생물반응기로부터 유래되는 모든 세포 배양 상층액 수확물은 생물반응기 배치 번호 + 특정 수확물에 상응하는 연장번호(즉, 001, 002 등)를 제공받는다.
다수의 생물반응기로부터의 세포 배양 상층액 수확물의 풀링이 직접적 생산물 포획(DPC) 단백질 A 크로마토그래피 단계에서 정제를 위해 허용된다. 각각의 DPC 실행이 배치로서 확인된다. 28, 40, 60, 또는 80 cm 직경의 컬럼이 DPC를 위해 사용될 수 있다. 각각의 배치는 상이한 양의 골리무맙 출발 물질을 함유할 수 있으며, 골리무맙 출발 물질의 양에 기초하여 상이한 직경 컬럼이 사용된다. 다수의 DPC 배치를 풀링하여 하류 처리(DSP) 배치를 개시하며, 이는 변동하는 양의 골리무맙으로 개시될 수 있다.
벌크 제조 공정은 단백질 A 크로마토그래피에 의한 추가 처리(스테이지 3)를 위한 공정중 제어 허용 기준을 충족시키는 임의의 수확물의 풀링을 허용한다. 유사하게, 하류 배치를 개시하기 위하여, 공정중 제어 규격을 충족시키는 임의의 DPC 배치가 풀링될 수 있다(스테이지 4). 그러나, DPC 풀에 기여하는 세포 배양 수확물의 질량 가중 평균 경과일수(mass weighted average age)는 15일 내지 51일(종점 포함)이어야 한다.
DPC 풀의 질량 가중 평균 경과일수는 각각의 수확물에 의해 기여된 골리무맙 질량에 수확일수를 곱한 값의 합을 DPC 풀의 총 골리무맙 질량으로 나눈 값으로서 정의된다:
질량 가중 평균 =
상기 식에서, m은 풀에 대해 각각의 수확물에 의해 기여된 골리무맙 질량이고, d는 수확물 로트의 수집이 완료될 때의 생물반응기 일수이다.
입력(즉, 공정 파라미터) 및 출력(즉, 공정중 제어[IPC: in-process conrol] 및 공정 모니터링 시험[PMT: process monitoring test]) 둘 모두를 포함한 공정 변수는 제조 공정 전체에 걸쳐 제어되고, 공정 일치성 및 생산물 일치성 둘 모두를 보장하기 위해 생산 배치 기록(production batch record)에 문서로 기록된다.
제조 관리 전략의 도입
Simponi 3상 임상 시험에 사용된 DP 배치의 이용 가능한 냉동 보존액에서 생성된 데이터를 기반으로 골리무맙의 일관된 약물 물질(DS) 및 약물 제품(DP) 특성을 유지하기 위하여 통합 제조 관리 전략을 개발하였다. 제조 관리 전략에 의해, 약물 물질(DS) 및 약물 제품(DP)이 총 % HC Asn43 탈아미드화, 총 % LC Asn93 탈아미드화 및 총 % HC isoAsp43에 대한 3상 임상 시험에서 적격한 한계 내에 있는 것이 보장된다. 본원에서 사용되는, 용어 "약물 물질"("DS"로 약칭됨) 및 "약물 제품"("DP"로 약칭됨)은 상업적 약물로서, 예를 들어 임상 시험에서 또는 시판되는 약물로서 사용하기 위한 조성물을 지칭한다. DS는 질환의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방에 있어서 약리학적 활성 또는 다른 직접적인 효과를 제공하거나 인체의 구조 또는 임의의 기능에 영향을 주는 것으로 의도되는 활성 성분이다. DP(의약 제품, 의약품, 약품, 또는 의약으로도 지칭됨)는 질환의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방에 사용되거나 인체의 구조 또는 임의의 기능에 영향을 주는 약물이다. 본원에서 사용되는, 용어 "제조 관리 전략", "관리 전략" 및 "제조 방법"은 예를 들어 임상 시험에서 또는 시판 약물로서 상업적 용도로 DS 또는 DP를 생산하기 위한 공정을 지칭한다.
약술하면, % 총 HC Asn43 탈아미드화, % 총 LC Asn93 탈아미드화 및 총 % HC isoAsp43은 스테이지 6 내지 8 처리 및 유지 시간에 대해 누적 70 내지 90시간의 제조 작업 범위(MOR)를 유지함으로써 제어되며(pH 7.6 내지 8.0에서 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 스테이지) 115시간을 입증된 허용 가능한 범위(PAR)의 상한으로 설정한다. 또한 제조 관리 전략은 스테이지 2 세포 수확 유지에 소요되는 시간을 2 내지 8℃에서 최대 21일로 제한하여, DS 및 DP가 ≤79% 총 HC Asn43 탈아미드화, ≤5.8% 총 LC Asn93 탈아미드화, 및 ≤30% 총 HC isoAsp43의 임상적 적격 한계 내에 유지되는 것을 보장한다. 스테이지 6, 스테이지 7, 또는 스테이지 8에 대한 개별적인 스테이지-특이적 한계는 적용되지 않는데, 공정 제어는 이들 3개의 스테이지에 걸친 누적 시간에 기초하기 때문이다. DS 및 DP에서의 % 총 HC Asn43 탈아미드화, % 총 LC Asn93 탈아미드화, 및 % 총 HC isoAsp43을 Lys C 펩티드 매핑 분석 방법(본원에서는 탈아미드화 검정이라고도 함)을 사용하여 모니터링한다.
HC Asn43의 탈아미드화는 DS 제조 공정, 특히 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 바이러스 체류용 필터링을 포함하는 스테이지 6 내지 8(pH 7.6 내지 8.0 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서의 스테이지)에서 주로 알칼리성 pH에 의해 구동되며 보다 산성으로 제형화된 벌크 약물 물질(FB) 제형 완충제로 교환 시 정지되는 것으로 확인되었다. 그 후, HC Asn43 탈아미드화 생산물인 Asp43과 isoAsp43 사이의 이성질화는 DP 제조 및 보관 중에 계속되어 궁극적으로 isoAsp43 대 Asp43의 최종 비율이 대략 2.2:1이 되는 평형 상태로 진행하게 된다. 따라서 DP에서의 HC isoAsp43의 평형 수준은 DS에서의 HC 탈아미드화된 Asn43의 초기 수준에 따라 달라진다. 따라서, 제조 중 그리고 방출 시의 DS 및 DP에서의 % 총 HC Asn43 탈아미드화에 대해 설정된 기준은 임상적 적격성을 기초로 하며, 제품 유효 기간 동안 DP에서의 HC isoAsp43에 대해 설정된 한계인 ≤51% HC isoAsp43도 고려한다.
제조 공정 및 공정 제어의 상세한 설명
스테이지 1
전배양 및 확장
Simponi(골리무맙)의 제조에서의 제1 스테이지는 골리무맙의 HC 및 LC 서열을 발현하는 형질주입된 Sp2/0 세포의 작업 세포 뱅크(WCB) 바이알로부터의 전배양의 개시 및 배양 플라스크, 일회용 배양 백, 및 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기 내에서의 세포 배양의 후속 확장이다. 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기의 접종에 필요한 세포 밀도 및 부피가 얻어질 때까지 세포를 배양한다. 공정중 제어 및 공정 모니터링 시험을 이용한 전배양 및 확장 단계를 도시하는 스테이지 1의 흐름도가 도 19에 제공되어 있다.
제조 절차
WCB로부터의 크라이오바이알(cryovial)을 해동시키고, 6 mM L-글루타민, 0.5 mg/L 마이코페놀산, 2.5 mg/L 하이포잔틴, 및 50 mg/L 잔틴이 보충된 화학적으로 한정된 하이브리도마 배지(CDH-A 배지)를 사용하여 0.2 내지 0.4 × 106개의 생존가능 세포(VC)/mL의 시딩 밀도로 희석시킨다. 해동에서의 배양 생존력은 ≥50%이어야 한다. 초기 계대배양물은 가습된 CO2 인큐베이터 내의 배양 플라스크(들) 내에 유지되는데, 이때 인큐베이터의 온도 및 CO2는 배치 기록에 규정된 범위 이내로 제어된다. 배양물을 0.6 × 106개의 VC/mL의 최소 세포 밀도가 얻어질 때까지 2 내지 3일 동안 인큐베이션한다.
배양 플라스크 및 일회용 배양 백에서 배양물을 순차적으로 확장시킴으로써 스케일-업을 달성한다. 계대배양마다 CDH-A 배지로 희석시킴으로써 0.2 내지 0.4 × 106개의 VC/mL의 세포 밀도로 시작한다. 계대배양물을 0.6 × 106개의 VC/mL의 최소 세포 밀도가 얻어질 때까지 확장 단계에서마다 2 내지 3일 동안 인큐베이션한다. 일단 일회용 배양 백에서 ≥0.8 × 106개의 VC/mL 및 ≥80%의 배양 생존력으로 충분한 배양 부피가 달성되면, 배양물을 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기 내로 접종할 수 있다.
매 전배양마다 계대배양물을 생존가능 세포 밀도(VCD), 배양 생존력, 및 현미경 검사를 위해 샘플링한다. 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기의 접종 전에, 전배양물을 생물부하(bioburden)를 위해 샘플링한다. 전배양물은 해동후 최대 30일 동안 유지될 수 있다. 미생물 오염이 검출되거나 최대 지속시간이 초과되면 전배양은 종료된다. 백업 전배양물이 시드 생물반응기의 접종 시에 보유될 수 있거나, 새로운 WCB 바이알 해동으로 시작될 수 있다. 백업 전배양물을 전술된 바와 같이 확장시키고, 1차 배양물과 동일한 공정중 제어 및 작업 파라미터 하에 둔다. 백업 전배양물은 필요에 따라 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기에 접종하기 위해 유지되고 사용될 수 있다.
전배양물이 접종 기준을 충족시킬 때, 일회용 배양 백(들)의 내용물을 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기에 옮겨서 ≥0.3 × 106개의 VC/mL의 시딩 밀도를 달성한다. 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기에 CDH-A 배양 배지를 공급하고, 전체 작업 부피에서 관류 방식으로 작동시킨다. 배양물은 세포 성장을 지원하도록 pH, 온도, 및 용존 산소 농도에 대해 제어된다. 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기 배양물을 80% 이상의 배양 생존력에서 ≥2.0 × 106개의 VC/mL의 세포 밀도가 얻어질 때까지 확장시킨다. 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기 배양물을 VCD, 배양 생존력, 및 현미경 검사를 위해 공정 전체에 걸쳐 샘플링한다. 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기의 접종 전에, 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기를 생물부하를 위해 샘플링한다. 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기의 VCD가 ≥2.0 × 106개의 VC/mL에 도달하고, 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기는 접종 준비가 되어 있지 않은 경우에는, 50 L 시드 생물반응기의 접종 후에는 6일의 최대 배양 지속시간까지 그리고 200 L 시드 생물반응기의 접종 후에는 7일의 최대 배양 지속시간까지 배양물이 계속 관류 모드로 있을 수 있다. 미생물 오염이 검출되거나 최대 지속시간이 초과되면 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기 작동은 종료된다.
스테이지 2
생물반응기 생산
상기 제조 공정에서의 제2 스테이지는 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기에서의 관류 세포 배양이다. 세포 배양 투과물(수확물)이 생산용 생물반응기로부터 수집되며, 한편 세포는 교대 접선 유동(ATF) 중공 섬유 세포-체류 디바이스를 통해 체류되고, 배양물은 신선한 배지로 보충된다. 500 L 또는 1000 L 제조 생물반응기 공정을 도시하는 흐름도가 도 20에 제공되어 있다.
제조 절차
500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기의 접종은 50 L 또는 200 L 시드 생물반응기의 내용물을 6 mM L-글루타민, 0.5 mg/L의 마이코페놀산, 2.5 mg/L 하이포잔틴, 및 50 mg/L 잔틴(CDH-A 배지)이 보충된 화학적으로 한정된 하이브리도마 배지가 담긴 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기 내로 옮김으로써 수행된다. 옮겨진 부피는 ≥0.3 × 106개의 생존가능 세포(VC)/mL의 시딩 밀도를 산출하기에 충분하여야 한다. 배양물을 34.0 내지 38.0℃의 온도, 6.80 내지 7.40의 pH, 및 10 내지 80%의 용존 산소 농도로 유지한다. 생존가능 세포 밀도(VCD), 배양 생존력, 생물부하, 및 면역글로불린 G(IgG) 농도를 위하여 500 L 또는 1000 L 생산 공정 전체에 걸쳐 샘플링을 수행한다.
접종 후에는, 배양물에 대한 배지 공급 속도를 최대 공급 속도에 도달할 때까지 미리 결정된 일정에 따라 증가시킨다. 최대 공급 속도는 하루당 0.80 내지 1.50 반응기 부피로 제어된다. 생물반응기의 전체 작업 부피에 도달할 때, ATF 시스템을 사용하여 관류를 개시하여 투과물로부터 세포를 분리한다. 투과물을 ATF 필터를 통해 연속적으로 취출하며, 한편 세포 배양물은 ATF 시스템과 생물반응기 사이에서 순환된다. ATF 투과물은 바이오공정 용기(BPC: bioprocess container) 내에 수집된다.
생물반응기로의 배지 공급은, VCD가 ≥8.5 × 106개의 VC/mL에 도달하되, 단, 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기의 접종 후 15일차 이내일 때, CDH-A로부터 6 mM L-글루타민, 0.5 mg/L 마이코페놀산, 2.5 mg/L 하이포잔틴, 50 mg/L 잔틴, 및 10 mM 아세트산나트륨이 보충된 CD 하이브리도마 배지(CDH-B 배지)로 교체된다. 생물반응기 내의 생존가능 세포 밀도는 배양물로부터의 가변 바이오매스 제거 유량에 의해 적어도 12.0 × 106개의 VC/mL의 목표로 제어된다.
생물반응기로부터 취한 바이오매스는 폐기되거나 ATF 투과물과 조합되고 여과에 의해 청징화될 수 있다.
ATF 투과물은 수확물 스트림으로서 지정된다. 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)을 5 내지 20 mM의 농도로 수확물 스트림에 첨가한다. 수확물을 생물반응기로부터의 분리 후 21일의 최대 기간 동안 2 내지 8℃ 환경에서 생물공정 용기(bioprocess container, BPC)에 저장한다. 각각의 수확물 BPC를 직접적 생산물 포획(스테이지 3) 전에 IgG 농도, 내독소, 및 생물부하를 위해 샘플링한다.
500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기에서의 관류 세포 배양 작업은 접종 후 최대 60일 동안 계속된다. 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기 작동의 최종일에, 배양물을 마이코플라즈마 및 외래성 바이러스 시험을 위해 샘플링한다. 생물반응기 IgG 농도를 모니터링하고 단지 정보를 위해 기록한다.
스테이지 3
직접적 생산물 포획(DPC)
스테이지 3에서는, 하나 이상의 500 L 또는 1000 L 생산용 생물반응기로부터의 수확물을 MabSelect™(GE Healthcare Bio-Sciences, 미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼 및 자동화 크로마토그래피 스키드를 사용하여 여과하고 정제한다. 골리무맙 생산물을 수확물로부터 포획하고, 배지 성분 및 숙주 세포 관련 불순물(예를 들어, DNA 및 숙주 세포 단백질)을 포함한 공정 관련 불순물, 및 잠재적으로 존재하는 바이러스를 제거한다. 생성된 직접적 생산물 포획(DPC) 용리액을 추가의 처리 시까지 동결시킨다. DPC 공정의 흐름도가 도 21에 제공되어 있다.
단백질 A 컬럼 준비 및 재생
수확물 로딩 전에, MabSelect™ 단백질 A 컬럼을 50 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨, 0.1% 폴리소르베이트 80(PS 80) (pH 7.3)(평형 완충제)으로 평형화시킨다. 컬럼 유출물을 pH 및 전도도에 대해 모니터링하여 컬럼이 평형화됨을 보장한다.
사용 후, MabSelect™ 단백질 A 컬럼은 6 M 구아니딘 HCl을 적용한 후 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.5)을 사용하여 헹구고, 이어서 평형 완충제 중에서 세척함으로써 재생될 수 있다. 또한 사용될 수 있는 대안적인 재생 절차는 평형 완충제, 이어서 6 M 구아니딘 HCl, 이어서 평형 완충제, 이어서 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.5), 이어서 평형 완충제를 적용하는 것을 포함한다. MabSelect™ 수지는 필요한 경우 20% 에탄올 중에 저장된다.
제조 절차
수확물을 0.45 μm 필터에 통과시키고, 20 내지 50 g/L의 부하비로 단백질 A 컬럼 상에 로딩한다. 280 nm에서의 자외선 흡광도(A280)가 ≤100 mAU/mm 경로 길이로 복귀될 때까지 평형 완충제로 컬럼을 세척한 후, 결합된 골리무맙 생산물을 갖는 컬럼을 추가 2 내지 6 컬럼 부피(CV)의 평형 완충제로 세척한다. 이후에, 4.5 내지 7.0 CV의 0.1 M 시트르산나트륨(pH 5.0)에 의한 중간 세척을 수행한다.
골리무맙 생산물을 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.5) 완충제를 사용하여 용리시킨다. 용리된 생산물의 수집은 ≥50 mAU/mm 경로 길이의 상승하는 A280 신호에서 시작하여 ≥50 mAU/mm 경로 길이의 하강하는 A280 신호에서 정지한다. 로딩, 세척 및 용리 동안 적용되는 유속은 150 내지 500 cm/h이다. 대표적인 용리 프로파일이 도 22에 제공되어 있다.
수집 후에는, 골리무맙 DPC 용리액을 1.0 M Tris 완충제(적정되지 않음) 및 필요하다면 1.0 M 시트르산(적정되지 않음)을 첨가함으로써 pH를 6.0 내지 6.5로 중화시킨다. pH 조정 동안, DPC 용리액을 혼합하여 용액의 균질성을 보장한다. pH 조정된 골리무맙 DPC 용리액을 0.2 μm 여과 전에 생물부하의 분석을 위해 샘플링한다. 두 번째의 0.2 μm 여과는 첫 번째의 0.2 μm 여과 동안 사용된 0.2 μm 필터의 완전성 시험에 합격하지 못한 경우에 수행될 수 있다.
여과된 DPC 용리액을 폴리카르보네이트 용기 내로 분취한다. 여과된 DPC 용리액을 단량체 함량, 생물부하, 내독소, 및 단백질 농도(이로부터 단계 수율을 계산하며, 이는 ≥55%이어야 함)의 분석을 위해 샘플링한다. 여과된 DPC 용리액은 ≤-40℃에서 저장하기 전에, 15 내지 25℃에서는 ≤48시간의 누적 시간 동안 그리고 2 내지 8℃에서는 ≤168시간의 누적 시간 동안 유지될 수 있다.
스테이지 4
직접적 생산물 포획(DPC) 용리액의 해동 및 풀링
스테이지 4에서는, 용매/세제 처리 전에, 다수의 직접적 생산물 포획(DPC) 용리액을 해동시키고, 여과하고, 풀링한다. 스테이지 4의 DPC 용리액의 해동 및 풀링 흐름도는 도 23에 제공되어 있다.
제조 절차
DPC 풀의 질량 가중 평균 경과일수가 15 내지 51일(종점 포함)이도록 DPC 용리액을 선택한다. 동결된 DPC 용리액을 15 내지 25℃에서 해동시킨다. 해동은 용리액에 얼음이 보이지 않을 때 완료된 것으로 간주된다. 해동은 120시간을 초과하지 않아야 한다. 해동, 풀링, 및 혼합 후, 풀링된 DPC 용리액의 pH를 시험하고, 필요하다면 1.0 M Tris(적정되지 않음) 또는 1.0 M 시트르산(적정되지 않음) 중 어느 하나를 첨가하여 pH를 5.9 내지 6.5로 조정한다. 최종 pH에 도달한 후, 풀링된 DPC 용리액을 생물부하의 분석을 위해 샘플링한다. 풀의 단백질 농도는 총 풀 부피 및 풀 내의 단백질의 총 그램수에 기초하여 계산된다. 이어서, 풀링된 DPC 용리액을 혼합 베셀(vessel) 내로 0.2 μm 여과한다. 여과되고 풀링된 DPC 용리액은 스테이지 5에서 추가로 처리하기 전에, 15 내지 25℃에서는 ≤48시간의 누적 시간 동안 그리고 2 내지 8℃에서는 ≤168시간의 누적 시간 동안 저장될 수 있다.
스테이지 5
DPC 용리액의 용매/세제(S/D) 처리
스테이지 5에서는, 풀링된 직접적 생산물 포획(DPC) 용리액을 트라이-n-부틸 포스페이트(TNBP) 및 폴리소르베이트 80(PS 80)(용매/세제[S/D] 처리)과 함께 인큐베이션하여 잠재적으로 존재하는 임의의 지질-외피보유 바이러스를 불활성화시킨다. DPC 용리액(스테이지 5)의 S/D 처리 흐름도는 도 24에 제공되어 있다.
제조 절차
2% TNBP/10% PS 80(w/w)을 함유하는 S/D 스톡 용액을 0.08 내지 0.12(v/v)의 비가 달성될 때까지, 풀링된 DPC 용리액을 갖는 혼합 베셀 내로 옮긴다. 용액을 혼합하여 용액의 균질성을 보장하고, 이어서 불활성화 베셀 내로 옮긴다. 옮긴 후에, 15 내지 25℃의 온도에서 적어도 90분 동안의 인큐베이션을 통해 바이러스 불활성화를 달성한다. 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상으로의 S/D 처리된 골리무맙 생산물의 로딩(스테이지 6)을 S/D-화학물질의 첨가(스테이지 5) 후 ≤20시간에 완료한다.
스테이지 6
양이온 교환 크로마토그래피
스테이지 6에서는, 용매/세제(S/D) 처리된 스테이지 5의 물질을 UNOsphere S™ 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및 자동화 크로마토그래피 스키드를 사용하여 정제한다. 스테이지 6은 S/D 공정 화학물질(트라이-n-부틸 포스페이트[TNBP] 및 폴리소르베이트 80[PS 80]) 및 다른 불순물을 생산물로부터 제거하도록 설계된다. 스테이지 6 양이온 교환 크로마토그래피 공정의 흐름도가 도 25에 제공되어 있다.
크로마토그래피 컬럼 준비 및 재생
로딩 전에, 충전된 컬럼을 30 mM 인산나트륨(pH 6.5) 완충제(평형 완충제)로 평형화시킨다. 컬럼 유출물을 pH 및 전도도에 대해 모니터링하여 컬럼이 평형화됨을 보장한다.
사용 후에는, UNOsphere S™ 양이온 교환 컬럼을 50 mM Tris, 1.0 M NaCl(pH 7.6 내지 8.0) 완충제로 세척한 후 1.0 M NaOH를 사용하여 위생처리함으로써 재생하고, 필요하다면 용액(0.1 M NaOH) 중에 저장한다.
제조 절차
로딩 동안, S/D-처리된 생산물을 주사용수를 사용하여 인라인(in-line)으로 희석시켜 1.5 내지 4.5 mS/cm의 부하 전도도(load conductivity)를 달성한다. 컬럼을 35 내지 55 g의 골리무맙/L의 부하비로 로딩한 후, 컬럼을 1.6 내지 6.7 컬럼 부피(CV)의 평형 완충제로 세척하고, 이후에 5.2 내지 9.8 CV의 50 mM Tris(pH 7.6 내지 8.0) 완충제로 세척한다.
이어서, 물질을 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0) 완충제를 사용하여 양이온 교환 컬럼으로부터 용리시킨다. 용리된 생산물의 수집은 ≥30 mAU/mm 경로 길이의 상승하는 280 nm에서의 자외선 흡광도(A280)에서 시작하여 ≥75 mAU/mm 경로 길이의 하강하는 A280에서 정지한다. 로딩, 세척, 및 용리 동안 적용되는 유속은 45 내지 150 cm/h이다. 대표적인 크로마토그래피 프로파일이 도 26에 제공되어 있다.
용리된 물질을 생물부하, HCP, 잔류 단백질 A, 응집체, 및 단백질 농도의 분석을 위해 샘플링한다. 단계 수율은 단백질 농도로부터 계산되며, ≥80%에 부합되어야 한다. 이어서, 스테이지 7에서의 추가 처리 전에, 생산물을 0.2 μm 여과한다.
대안적으로, 용리된 물질을 생물부하를 위해 샘플링하고, 생산물을 0.2 μm 여과하고, HCP, 잔류 단백질 A, 응집체, 및 단백질 농도의 분석을 위해 샘플링한다. 단계 수율은 단백질 농도로부터 계산되며, ≥80%에 부합되어야 한다. 이어서, 물질을 스테이지 7에서 추가로 처리한다.
골리무맙에 대한 스테이지 6부터 스테이지 8까지의 누적 처리 및 유지 시간의 검증된 허용 가능한 범위(PAR)는 115시간 이하이며, 이때 제조 작업 범위(MOR)는 제어된 실온(15 내지 25℃)에서 70 내지 90시간이다. 누적 처리 및 유지 시간은 스테이지 6의 생산물 용리의 종료 시 시작하여 스테이지 9의 생산물 농축의 시작 시 종료하는 것으로 정의되며, 활성 처리 단계뿐만 아니라 스테이지들 사이의 중간 유지 시간을 포함한다. 스테이지 6, 스테이지 7, 또는 스테이지 8에 대한 개별적인 스테이지-특이적 한계는 확립되지 않았는데, 이는, 이들 3개의 스테이지에 대해 물질 조건이 변화하지 않는다는 것을 고려해 볼 때 그러하다. 따라서, 공정 제어는 이들 3개의 스테이지에 걸친 누적 시간에 기초한다.
스테이지 7
음이온 교환 크로마토그래피
스테이지 7에서는, 스테이지 6의 물질을 Q Sepharose XL™(QXL) 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및 자동화 크로마토그래피 스키드를 사용하여 정제한다. 골리무맙은 수지를 통해 유동하는 반면, DNA, 다른 불순물, 및 바이러스(존재하는 경우)는 체류된다. 스테이지 7 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 나타내는 흐름도가 도 27에 제공되어 있다.
크로마토그래피 컬럼 준비 및 재생
로딩 전에, 음이온 교환 컬럼을 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0)(평형 완충제)으로 평형화시킨다. 컬럼 유출물을 pH 및 전도도에 대해 모니터링하여 컬럼이 평형화됨을 보장한다.
사용 후에는, Q Sepharose XL™ 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 50 mM Tris, 1.0 M NaCl(pH 7.6 내지 8.0) 완충제로 세척하고, 이어서 2.0 M NaOH를 사용하여 위생처리하고, WFI, 3.0 M KCl, 및 WFI로 연속적으로 헹구거나, 또는 (단지 Janssen Biologics BV[JBV]에서만) 이어서 1.0 M NaOH/1.0 M NaCl을 사용하여 위생처리하고, WFI로 헹구고, 필요하다면 컬럼을 용액(0.1 M NaOH) 중에 저장한다.
제조 절차
양이온 교환 크로마토그래피(스테이지 6)에 의해 정제된 물질을 50 내지 250 cm/h의 로딩 유속 및 50 내지 150 g/L의 부하비로 QXL 음이온 교환 컬럼 상에 로딩한다. 골리무맙은 컬럼을 통해 유동하고(비결합 모드), 일단 280 nm에서의 자외선 흡광도(A280)가 ≥30 mAU/mm 경로 길이로 증가하면 수집된다. 로딩 후에, 컬럼을 50 내지 250 cm/h의 유속으로 평형 완충제를 사용하여 세척한다. 생산물 관류물의 수집은 A280 판독치가 ≥80 mAU/mm 경로 길이로 복귀될 때까지 계속된다. 대표적인 크로마토그래피 프로파일이 도 28에 제공되어 있다.
관류물을 생물부하 및 단백질 농도의 분석을 위해 샘플링한다. 단계 수율은 단백질 농도로부터 계산되며, ≥80%에 부합되어야 한다. 이어서, 스테이지 8에서의 추가 처리 전에, 이 물질을 0.2 μm 여과한다.
대안적으로, 관류물을 생물부하의 분석을 위해 샘플링하고, 이어서 이 물질을 0.2 μm 여과하고 단백질 농도를 위해 샘플링한다. 단계 수율은 단백질 농도로부터 계산되며, ≥80%에 부합되어야 한다. 이후에, 스테이지 8의 처리를 위해 필요하다면, 이 물질을 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0)을 사용하여 ≤6.5 g/L의 단백질 농도로 희석시키고, 스테이지 8에서의 추가 처리 전에 혼합한다.
골리무맙에 대한 스테이지 6부터 스테이지 8까지의 누적 처리 및 유지 시간의 검증된 허용 가능한 범위(PAR)는 115시간 이하이며, 이때 제조 작업 범위(MOR)는 제어된 실온(15 내지 25℃)에서 70 내지 90시간이다. 누적 처리 및 유지 시간은 스테이지 6의 생산물 용리의 종료 시 시작하여 스테이지 9의 생산물 농축의 시작 시 종료하는 것으로 정의되며, 활성 처리 단계뿐만 아니라 스테이지들 사이의 중간 유지 시간을 포함한다. 스테이지 6, 스테이지 7, 또는 스테이지 8에 대한 개별적인 스테이지-특이적 한계는 확립되지 않았는데, 그 이유는, 공정 제어가 이들 3개의 스테이지에 걸친 누적 시간에 기초하기 때문이다.
스테이지 8
바이러스 제거 여과
스테이지 8에서는, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된 스테이지 7의 물질을 NFP™ 바이러스 체류용 필터를 통해 여과한다. 이 단계는 잠재적으로 존재하는 작은 바이러스 및 큰 바이러스 둘 모두의 제거를 목표로 한다. NFP™ 바이러스 제거 여과 단계를 보여주는 스테이지 8 흐름도가 도 29에 제공되어 있다.
NFP™ 필터 준비
사용 전에, NFP™ 필터를 NFP™ 여과 시스템 내에 설치하고, 주사용수(WFI)로 플러싱하고, 오토클레이빙한다. 오토클레이빙 후에, 필터를 WFI로 플러싱하고, 이어서 물 투과성에 대해 시험한다. 필터를 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0) 완충제로 평형화시킨다. 여과액을 pH 및 전도도에 대해 모니터링하여 NFP™ 필터가 평형화됨을 보장한다.
생산물 여과 및 완충제 헹굼 후, NFP™ 필터를 개별적으로 완전성에 대해 시험한다.
제조 절차
필요한 경우, 생산물 여과 전에, (스테이지 7에서의) 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된 생산물을 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0)을 사용하여 ≤6.5 g/L의 단백질 농도로 희석시킨다. 희석 후, 생산물 용액을 혼합하고, 이후에 0.2 μm 필터를 통해 여과한다.
이어서, 희석된 생산물을 ≤3.1 bar의 압력을 사용하여 평형화된 NFP™ 필터를 통해 여과한다. ≤725 g/m2의 막 로딩률을 적용한다. 초기 생산물 여과 플럭스 속도(flux rate)가 상기 공정을 위한 생산물 여과의 시작 후 20분 이내에 기록될 수 있다. 초기 생산물 여과 플럭스는, 생산물 여과의 시작 후, 9개의 필터에 대해서는 ≤154 L 이내로 또는 10개의 필터에 대해서는 ≤171 L 이내로 기록될 수 있다. 플럭스 감쇠를 모니터링하여 초기 플럭스 속도(0% 플럭스 감쇠로서 정의됨)로부터의 감소가 74%를 초과하지 않음을 보장한다. 플럭스 감쇠가 74%의 한계(플럭스 감쇠 한계로서 정의됨)에 도달하는 경우에, 필터는 격리될 수 있고, 그 필터에 대한 생산물 로딩이 정지될 수 있다. 격리된 필터는, 로딩 후, 완충제 플러시 단계를 위해 인라인으로 다시 놓여진다. 여과 동안, 플럭스 감쇠가 74%의 한계(플럭스 감쇠 한계로서 정의됨)에 도달하면, 여과는 정지될 수 있고 완충제 플러싱이 즉시 실행된다.
일단 여과가 완료되면, 필터를 포함하는 시스템을 ≤3.1 bar의 여과 압력을 사용하여 총 ≤10.1 L/m2을 위하여 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0) 완충제로 플러싱한다. 완충제 플러시액을 수집하고, 나머지 NFP™-여과된 생산물과 조하고, 혼합하고, 생물부하 및 단백질 농도를 위해 샘플링한다. 단계 수율은 단백질 농도로부터 계산되며, ≥90%에 부합되어야 한다. 이어서, 스테이지 9에서의 추가 처리 전에, 조합된 NFP™-여과액을 0.2 μm 필터를 통해 여과한다.
스테이지 7로부터의 희석된 물질은 NFP™ 여과 직전에 생물부하의 분석을 위해 샘플링될 수 있다. 일단 여과가 완료되면, 필터를 포함하는 시스템을 3.1 bar 이하의 여과 압력을 사용하여 총 ≤10.1 L/m2을 위하여 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0) 완충제로 플러싱한다. 완충제 플러시액을 수집하고, 나머지 NFP™-여과된 물질과 조합하고, 혼합하고, 단백질 농도의 분석을 위해 샘플링한다. 스테이지 9에서의 추가 처리 전에, 단계 수율은 단백질 농도로부터 계산되며, ≥90%에 부합되어야 한다.
골리무맙에 대한 스테이지 6부터 스테이지 8까지의 누적 처리 및 유지 시간의 검증된 허용 가능한 범위(PAR)는 115시간 이하이며, 이때 제조 작업 범위(MOR)는 제어된 실온(15 내지 25℃)에서 70 내지 90시간이다. 누적 처리 및 유지 시간은 스테이지 6의 용리의 종료 시 시작하여 스테이지 9의 농축의 시작 시 종료하는 것으로 정의되며, 활성 처리 단계뿐만 아니라 스테이지들 사이의 중간 유지 시간을 포함한다. 스테이지 6, 스테이지 7, 또는 스테이지 8에 대한 개별적인 스테이지-특이적 한계는 확립되지 않았는데, 그 이유는, 공정 제어가 이들 3개의 스테이지에 걸친 누적 시간에 기초하기 때문이다.
스테이지 9
제형화된 벌크(FB)를 얻기 위한 농축 및 투석여과
스테이지 9에서는, 스테이지 8의 물질을 농축시키고 투석여과하여 제형화 부형제를 첨가한다. 이후에, 폴리소르베이트 80(PS 80)을 농축 및 투석여과된 골리무맙 용액에 첨가하여 제형화된 벌크(FB)를 얻는다. FB를 얻기 위한 최종 한외여과/투석여과 단계를 나타내는 흐름도가 도 30에 제공되어 있다.
한외여과 시스템 준비
사용 전에, 막을 포함하는 한외여과 시스템을 50 mM Tris, 50 mM NaCl(pH 7.6 내지 8.0) 완충제로 평형화시킨다. 여과액 및 체류물(retentate)을 pH에 대해 모니터링하여 막이 평형화됨을 보장한다.
사용 후에는, 막을 포함하는 한외여과 시스템을 주사용수(WFI) 및 1.0 M NaOH로 플러싱함으로써 위생처리한다. 이어서, WFI를 시스템을 통해 플러싱하고, 표준 투수성 시험을 수행한다. 필요하다면, 시스템 및 막을 적절한 용액 중에 저장한다.
제조 절차
(스테이지 8에서의) 바이러스 제거 여과에 의해 정제된 골리무맙 생산물을 40 내지 90 g/L로 농축시키고, 8 내지 12 투석여과 부피의 10 mM 히스티딘, 4.5% 소르비톨(pH 5.3) 완충제(투석여과 완충제)를 사용하여 투석여과한다. 투석여과 후에는, 여과액 pH, 전도도, 및 오스몰랄 농도(osmolality)를 시험하여 완충제 교환이 완전히 수행됨을 보장한다. 완충제 교환 후에는, 용액을 ≤180 g/L로 과농축시키고, 이어서 시스템을 비워서 회수한다. 농축, 투석여과, 및 과농축 동안, 공급물 및 체류물 압력은 각각 ≤2.8 bar 및 ≤2.1 bar가 되도록 제어될 수 있다. 대안적으로, 막관통 압력(TMP)은 농축, 투석여과, 및 과농축 동안 ≤2.5 bar로 제어될 수 있다. 유지 탱크의 온도는 ≤35℃로 모니터링된다.
과농축된 골리무맙 생산물의 단백질 농도를 결정한 후에, 희석에 필요한 투석여과 완충제의 계산된 양의 ≤100%를 사용하여 완충제 플러시액을 갖는 시스템으로부터 나머지 생산물을 회수한다. 조합된 회수된 완충제 플러시액 및 과농축된 골리무맙 생산물의 단백질 농도를 결정한 후에, 희석에 필요한 투석여과 완충제의 계산된 양의 ≤100%를 첨가하여 생산물의 농도를 추가로 조정한다. 수율을 모니터링하고 ≥90%이어야 한다.
이어서, 10 mM 히스티딘, 4.5% 소르비톨(pH 5.3) 완충제 중 1% PS 80을 0.013 내지 0.017% (w/v)의 완충제 대 생산물 비의 농축 및 투석여과된 골리무맙 생산물에 첨가함으로써 FB를 제조한다. 첨가 후에, 골리무맙 생산물을 혼합하여 용액의 균질성을 보장한다. FB를 생물부하의 분석을 위해 샘플링하고 예비필터를 사용하여 필터링한 후, 폴리카르보네이트 용기 내로 0.2 μm 여과한다. 생산물 샘플을 골리무맙 올리고당 IPC 시험 및 FB 방출 시험을 위해 채취한다. 형광 검출을 사용하는 순상 음이온 교환 HPLC에 의해 올리고당 조성물을 분석한다. 최종 0.2 μm 여과 전 및/또는 후에, FB는 ≤-40℃에서의 저장 전에 총 ≤120시간의 시간 동안 15 내지 25℃에서 또는 2 내지 8℃에서 유지될 수 있다.
탈아미드화
탈아미드화, 이성질화 및 고리화를 포함한 고리형 이미드 매개 반응은 단백질에서 일반적인 분해 경로를 구성한다. 이 반응은 단백질 사슬 내의 아스파라긴에서 주로 일어나지만, 글루타민, 아스파르트산, 및 글루탐산에 대해서도 관찰된다(문헌[Manning, Patel et al. 1989, Aswad 1995]). 통상적으로 관찰되는 부산물은 아스파르트산, 아이소-아스파르트산, 글루탐산, 및 안정한 고리형 이미드를 포함한다.
아스파라긴 잔기에서의 고리형 이미드 형성은 일반적으로 아스파라긴의 카르보닐 탄소 상의 카르복실 아미노산 잔기의 아미노기로부터의 친핵성 공격을 수반하며, 이는 탈아미드화로 이어진다(도 31)(문헌[Voorter, de Haard-Hoekman et al. 1988]). 대안적으로, 아스파라긴 아미드 질소는 펩티드 결합 카르보닐을 공격하여, 사슬 절단을 유발할 수 있다(도 31). 반응 속도는 일차 구조(Asn-Gly가 가장 빠르게 반응하고, Asn-Ser, Asn-His 및 Asn-Thr가 뒤따름), 삼차 구조(유연하고 노출된 영역의 잔기가 노출되지 않은 잔기보다 빠르게 반응함), pH(pH 상승은 반응을 촉진할 수 있음) 및 완충제(중탄산염, 특히 인산염 음이온은 반응을 촉진함)의 영향을 받는다.
방출 및 안정성 테스트에 사용된 분석 절차가 형성된 분해물을 검출할 수 있는지를 확인하기 위해 골리무맙의 강제 탈아미노화를 조사하였다. 이 정보는 또한 제조 공정을 관리하기 위한 전체 전략의 일부로 일반적인 분해물 종의 설정된 한계를 규정하는 데 도움이 되었다. 강제 분해 연구의 결과는 골리무맙에 대해 관찰된 가장 일반적인 분해 경로가 고리형 이미드 매개 반응, 특히 중쇄(HC) 아스파라긴 43(HC Asn43)의 유의미한 탈아미드화와 경쇄(LC) Asn93(LC cycAsn93로 지정됨)에서의 고리형 석신이미드의 형성도 포함한다는 것을 보여주었다. 고리형 이미드 매개 반응은 탈아미드화 분석과 모세관 등전점 집속 절차(cIEF)를 사용하여 제조 공정 및 보관 중에 모니터링되며, 두 방법 모두 아래에 설명되어 있다.
탈아미드화 분석
탈아미드화 방법은 Lys C 펩티드 맵핑을 사용하여 HC Asn43 및 LC Asn93에서 탈아미드화와 관련된 천연 및 탈아미드화 펩티드를 분해하고 정량화한다. 본 방법은 역상 HPLC 컬럼에서 단백질 200 μg을 탈염하여 샘플 매트릭스를 제거한다. 이어서, 시험 물품의 단일 샘플은 환원되고(다이티오트리에톨), 알킬화되고(요오도아세트아미드), 엔도프로테이나제 Lys C를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 분해된다. 분해 후에, Lys C 효소는 트라이플루오로아세트산을 사용하여 불활성화되고, 생성된 펩티드는 0.1% 트라이플루오로아세트산을 함유하는 물 및 아세토니트릴의 구배로 C18 역상 HPLC 컬럼(2.1 mm × 250 mm, 약 20 μg 주입)에서 분리된다.
이 방법은 탈아미드화된 펩티드, LC40-104(LC isoAsp93 및 LC Asp93) 및 LC40-104(LC cycAsn93)로부터 Asn93을 갖는 천연 LC40-104 펩티드를 분해할 수 있다. Asn43을 갖는 2개의 천연 펩티드(HC1-58 및 HC1-59)가 탈아미드화된 형태를 갖는 탈아미드화된 펩티드(isoAsp43 및 Asp43)로부터 분리된다. 214 nm에서의 UV 흡광도를 사용하여, 용리 펩티드를 검출 및 정량화한다. 천연 및 탈아미드화된 펩티드 피크를 통합하고, 피크 면적을 사용하여 천연 LC Asn93 및 HC Asn43의 상대량(%), LC Asn93(LC isoAsp93 + LC Asp93 + LC cycAsn93) 및 HC Asn43(HC isoAsp43 + HC Asp43)의 총 탈아미드화된 형태를 계산하고 HC isoAsp43의 상대량도 계산한다. 골리무맙에 대한 대표적인 Lys C 펩티드 맵핑 크로마토그램이 도 32에 도시되어 있다. 또한, 골리무맙의 강제 탈아미드화의 시간 경과에 따른 펩티드 맵 크로마토그램이 도 33에 도시되어 있다. 크로마토그램은 HC 1-58 및 HC 1-59 펩티드가 있는 영역에서 가져온 것으로, 2개의 Asp43 펩티드가 증가하는 반면, 천연 Asn43 펩티드 및 isoAsp43 펩티드는 감소하고 있음을 보여준다.
시스템 적합성:
적절한 샘플 준비, 작업 및 컬럼 분리 효율(분해능)을 보장하기 위해, 골리무맙 기준 표준물질(RS)을 주입하여 시험 물품 분석 전에 시스템 적합성을 평가한다.
RS 주입의 크로마토그램은 골리무맙의 기준물질에 대한 대표적인 크로마토그램과 시각적으로 유사해야 한다. 크로마토그램이 시각적으로 유사하지 않으면, HPLC 분석, 효소 분해 또는 둘 다가 실패하였고, 분석이 반복되어야 한다.
HC 1-59 Asp43 및 HC 1-58 Asp43 펩티드 피크의 분해능은 1.1 이상이어야 한다(SOP의 대표적인 크로마토그램에서 확인됨). 분품해능이 ≥1.1이 아닌 경우, 분해능 실패의 원인이 교정되어야 하고, 실행이 반복되어야 한다.
골리무맙 시험 물품 샘플은 절차의 개시 및 종료 시에 RS로 괄호로 묶어야 한다.
골리무맙 시험 물품 샘플은 RS로 괄호로 묶어야 한다.
실행의 개시 및 종료 시의 LC Asn93 탈아미드화 결과는 ≤5.8%이어야 하며(현행 사양서), 그 차이는 ≤ 0.9%이어야 한다.
실행의 개시 및 종료 시의 HC isoAsp43 결과는 ≤30%이어야 하며, 그 차이는 ≤2.0%이어야 한다.
모세관 등전점 집속
모세관 등전점 집속(cIEF)은 전체 전하 또는 등전점(pI)에 기초하여 단백질을 분리한다. 이 방법은 Simponi(골리무맙) 내의 전하-기반 동형의 분포를 모니터링하기 위해 사용된다. 겔-기반 IEF 절차와는 달리, cIEF는 존재하는 하전된 종의 정량적 측정을 제공한다. 또한, cIEF는 겔-기반 방법에 비교하여 증가된 해상도, 민감성, 및 재현성을 나타낸다. cIEF 절차는 거의 기준선 해상도로 Simponi(골리무맙)의 4 내지 6개의 전하-기반 동형을 분리하는 반면에, IEF 겔 분석은 부분 해상도로 단지 4 내지 5개의 종을 분리한다. 골리무맙의 대표적인 cIEF 전기영동도는 도 34에 도시되어 있는데, C, 1, 2 및 3으로 표지된 4개의 주요 피크 및 B로 표지된 하나의 부수적 피크를 갖는다.
모세관 등전점 집속(cIEF)은 전체 전하 또는 등전점(pI)에 기초하여 단백질을 분리하도록 설계된다. 분석은 Alcott 오토샘플러(GP Instruments, Inc.)와 같은, ≤30℃의 주위 환경에서 샘플 온도를 ≤10.5℃로 유지할 수 있는 오토샘플러가 장착된 구매가능한 이미징 cIEF 분석기에서 수행된다. 분석은 전체 컬럼 검출을 가능하게 하기 위해 외측 벽 폴리이미드 코팅이 없는 내측 벽-코팅된 실리카 모세관을 사용한다. 또한, 묽은 인산 및 메틸셀룰로스의 애노드 전해질 용액, 수산화나트륨 및 메틸셀룰로스의 캐소드 전해질 용액, 및 넓은 범위(pH 3 내지 10) 및 좁은 범위(pH 8 -내지 10.5)의 양쪽 전해질의 한정된 혼합물이 사용된다. 이 검정은 중쇄 C-말단 라이신을 제거하고 다수의 C-말단 변이체의 존재에 의해 도입된 모호성을 제거하는 카르복시펩티다제 B(CPB)를 이용한 시험 물품 및 참조 표준(RS) 둘 모두의 전처리를 사용한다.
각 분석 전에 오토샘플러 온도 설정값은 4℃로 설정되고, 오토샘플러는 최소 30분간 예비 냉각되며, 실험실의 주변 실온은 ≤30℃로 유지된다. 전처리된 시험 물품 및 RS, 샘플 바이알, 바이알 인서트, 정제수를 포함한 분석에 사용된 시약, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌다이아민(TEMED)을 함유하는 모 용액(모세관 내에서의 전기영동을 최적화함), 양성 전해질, 내부 표준물질에 대한 pI 7.6 및 9.5 마커 및 메틸셀룰로스(MC)는 샘플 제조를 시작하기 전에 적어도 30분간 얼음 상에 유지된다. 샘플을 얼음 상에서 제조하고, 모 용액의 첨가 시간을 기록하고, TEMED에 대한 노출을 제어한다. 이러한 첨가 후 180분 이내에 검정이 완료되어야 한다. 시스템 적합성 대조군을 1회 주입하고, 시험 물품 및 RS를 하기 순서 표에 따라 2회 주입한다(표 6):
[표 6]
주사기 펌프에 의해 모세관 내로 샘플을 주입한 후, 모세관을 가로질러 8분 동안 전기장(3 kV)을 인가하여, pH 구배를 형성하고, 골리무맙의 전하-기반 동형을 이들의 등전점(pI)에 따라 분리한다. 280 nm에서 전체 모세관을 이미징함으로써 모세관 내의 단백질 동형이 검출되고, pI 값 대 A280의 함수로서 전기영동도의 형태로 데이터가 제시된다. 기기 소프트웨어를 사용하여 내부 pI 표준(pI 7.6 및 9.5)에 대한 비교에 의해 pI에 대한 값을 할당하고, 표준 데이터 획득 소프트웨어를 사용하여 전기영동도로부터 피크 면적을 결정한다. LOQ 이상의 모든 피크의 이중실험 주입으로부터의 평균 pI 및 평균 피크 면적 백분율, 참조 표준에 비교한 ΔpI 값, 및 피크 C, 1, 2, 및 3의 면적 %의 합을 보고한다.
유효 결과를 산출하기 위해, 하기 시스템 적합성 및 분석 허용 기준을 cIEF 절차의 수행 동안 적용한다:
1. 시스템 적합성 표준의 경우, 4개의 pI 마커 피크가 명확하게 보여야 한다. 중간 2개의 피크(pI 8.7 및 pI 9.0 마커)는 USP 방법에 의한 분해능 인자(R) ≥5.0으로 기준선으로부터 분해되어야 한다.
2. 2개의 pI 마커 피크(pI 7.6 및 pI 9.5)는 블랭크, CPB 대조군, CPB 처리된 RS 및 CPB 처리된 샘플에서 관찰되어야 한다.
3. 블랭크의 분석 영역에는 pI 7.6과 pI 9.5 마커 피크 사이에 피크가 없어야 한다.
4. CPB 대조군의 분석 영역에는 pI 7.6과 pI 9.5 마커 피크 사이에 피크가 없어야 한다.
5. 오토샘플러의 트레이 온도는 모든 주입에 대해 ≤8℃로 유지되어야 한다. 이 기준은 알콧 오토샘플러에만 해당되며, ≤10.5℃의 샘플 온도를 유지하기 위한 기기 적격성 평가의 일환으로 모든 새로운 유형의 오토샘플러에 대해 다시 설정해야 한다.
6. 실험실의 주변 실온은 분석 전체에 걸쳐 ≤30℃ 로 유지되어야 한다.
7. 중복 주입의 전기영동도는 서로 유사해야 한다(기준 8 및 9에 정의됨). 복제물의 전기영동도가 유사하지 않은 경우, 해당 샘플의 데이터는 무효로 간주된다.
8. CPB 처리된 RS의 경우, 피크 C, 1, 2 및 3이 관찰되어야 한다. 피크 1, 2 및 3의 pI 범위는 8.6 내지 9.4이어야 한다. 피크 1, 2 및 3의 피크 높이의 합은 ≥15,000이어야 한다.
9. CPB 처리된 샘플의 경우, 피크 C, 1, 2 및 3이 관찰되어야 한다. 피크 1, 2 및 3의 pI 범위는 8.6 내지 9.4이어야 한다. 피크 1, 2 및 3의 피크 높이의 합은 ≥15,000이어야 한다.
10. 시험 물품 샘플은 분석의 개시 및 종료 시에 RS로 괄호로 묶어야 한다.
11. CPB 처리된 RS의 최종 주입은 모 용액의 첨가 후 3시간 이내에 완료되어야 한다.
12. 실행 개시 시의 RS에 대한 피크 3의 면적 %는 16.1% 내지 19.5%이어야 한다. 이 값은 RS Lot 08G31AA에만 해당되며, 이의 적격성 평가의 일환으로 RS의 새로운 로트마다 새로운 범위가 설정될 것이다.
13. 실행 종료 시의 RS에 대한 피크 3의 면적 %는 15.4% 내지 19.2%이어야 한다. 이 값은 RS Lot 08G31AA에만 해당되며, 이의 적격성 평가의 일환으로 RS의 새로운 로트마다 새로운 범위가 설정될 것이다.
14. 실행 개시 시의 RS에 대한 피크 3의 면적 % 결과와 실행 종료 시의 RS 결과의 차이는 ≤0.5%이어야 한다.
골리무맙 cIEF 동형의 특징분석
골리무맙의 참조 cIEF 프로파일은 대표적인 전기영동도에 나타낸 바와 같이 C, 1, 2, 및 3으로 표지된 4개의 주요 피크 및 A 및 B로 표지된 2개의 부수적 피크를 함유한다(도 34). 상이한 cIEF 피크의 예측된 실체가 표 7에 열거되어 있다. 피크 C, 1, 2 및 3은 골리무맙의 시알릴화된(SA) 및 탈아미드화된 전하 변이체 동형을 나타낸다. 중성 및 시알릴화된 올리고당의 상대적 함량은 검증된 제조 공정에 의해 생산된 DS 배치 간에 일관된 것으로 나타났다. cIEF 프로파일에서의 가변성의 주요 공급원은 HC Asn43의 탈아미드화 및 이성질화이다. cIEF 내의 염기성 피크 3은 비-탈아미드화 HC Asn43뿐만 아니라 탈아미드화 HC isoAsp43을 나타내는 반면에, 더 산성인 피크는 탈아미드화 HC Asp43 및 시알릴화도를 나타낸다.
[표 7]
탈아미드화에 대한 DS 허용 기준은 탈아미드화에 대한 DP 허용 기준과 직접 연결되어 있으며 두 가지가 동시에 결정된다. 하기 섹션에서는 DS와 DP의 탈아미드화 사이의 관계를 설명하고 DS와 DP 둘다의 탈아미드화 허용 기준에 대한 정당성을 제공한다.
HC IsoAsp43 및 HC Asp43 이성질화의 동역학
충분한 수의 안정성 시점 결과(표 8 및 표 10)를 갖는 상이한 DP 배치에 대한 isoAsp43 및 Asp43 안정성 프로파일은 Asp43에서 isoAsp43으로의 이성질화 속도(kisoAsp43)와 isoAsp43의 Asp43(kAsp43)으로의 이성질화 속도가 둘다 1차 반응인 모델에 정확하게 맞춰질 수 있다. 모델을 사용하면 각각 0.081개월-1 및 0.037개월-1의 운동 속도 상수 kisoAsp43 및 kAsp43이 생성된다. Asp43 및 isoAsp43의 농도가 이들의 평형 값에 가까워짐에 따라 반응의 평형 상수(K)는 [isoAsp43]/[Asp43] 또는 kisoAsp43/kAsp43으로 정의할 수 있으며 이는 2.2와 같다. 이 모델은 [isoAsp43]/[Asp43]의 최종 비율이 2가지 동형의 시작 농도와 무관하다고 예측한다. 이 모델은 또한 Asp43의 초기 농도가 더 높은 DP 배치가 Asp43의 초기 농도가 낮은 배치에 비해 Asp43 농도의 절대 변화가 더 크다는 것을 보여주는 사실과 일치하며, 두 조건 모두 최종 isoAsp43 대 Asp43 비율 2.2에 거의 동일하게 도달한다. 또한, Dp에서 3개 Asn43 동형(Asn43, Asp43 및 isoAsp43)의 최종 평형 농도는 전적으로 Asn43에 총 탈아미드화에 의존하며, 이는 결국 DS 제조 공정 동안 제어된 실온(15 내지 25℃)에서 골리무맙을 pH 7.6 내지 8.0에 노출시키는 데 의존하며, DP 충전 마무리 공정 또는 5 ± 3℃에서 시간 경과에 따른 DP 저장에 의해 영향을 받지 않는다. 이에 반하여, 저장 중 DP의 3개 Asn43 동형(Asn43, Asp43 및 isoAsp43)의 초기 및 중간 농도는 DP의 DS 공정에서 시작되는 총 탈아미드화와 DP 공정 시간 및 DP 저장을 통해 발생하는 이성질화 정도에 따라 달라진다. 종합적으로, 데이터는 저장 중 시간이 지남에 따라 모든 DP 전하 동형 변화가 Asn43의 탈아미드화 증가 없이 Asp43/isoAsp43 이성질화에 전적으로 기인한다는 것을 뒷받침한다.
HC Asn43 탈아미드화 종에 대한 3상 임상 노출
HC Asn43 탈아미드화 종에 대한 적절한 허용 기준을 설정하기 위한 접근 방식은 골리무맙에 대한 항체를 보이는 시험 대상체의 수를 조사하기 위한 3상 임상 노출 데이터에 대해 104주차까지 Simponi 3상 임상 시험 C0524T05, C0524T06, C0524T08, C0524T09 및 C0524T11에 사용된 DP 배치의 사용 가능한 냉동 보존액에서 생성된 데이터의 평가를 포함한다. 104주차까지의 기간은 3상 임상 시험에서 면역원성을 연구한 기간에 상응한다. 표 8은 104주차까지 3상 Simponi 시험에 사용된 사용 가능한 냉동 보존액(및 투여 시점의 저장 기간)이 있는 DP 배치와 대상체에게 투여된 용량의 수를 포함한 해당 탈아미드화 데이터를 나타낸다. 표 9는 3상 Simponi 임상 시험에 사용된 모든 DP 배치와 표 8의 탈아미드화 데이터가 있는 DP 배치에 비해 골리무맙에 대한 항체를 보이는 대상체의 수와 백분율을 포함하여 104주차까지의 대상체 노출 데이터를 요약한다.
[표 8]
[표 9]
표 9의 결과는 투여된 DP의 연령에 관계없이, Simponi 3상 임상 시험 동안 골리무맙에 대한 항체가 발생한 대상체의 백분율에 차이가 없음을 보여준다. 따라서 제품 저장 기간 대 HC Asn43 탈아미드화 및 이성질화 사이의 관계를 고려할 때 이러한 데이터는 따라서 표 8에 표시된 수준에서 항체 반응과 탈아미드화/이성질화 사이에 상관관계가 없다는 결론을 지지한다. 따라서, 표 8에 나열된 DP 로트에 대한 % 총 HC Asn43 탈아미드화 및 % isoAsp43 데이터는 이러한 탈아미드화 종에 대한 허용 기준을 확립하기 위한 임상 노출의 기초로 사용되었다.
% HC isoAsp43에 대한 허용 기준
DP 안정성 허용 기준
3상 임상 시험 동안 평가된 DP 배치에서 % HC isoAsp43의 최고 관찰 수준은 이 수준에 가까운 것으로 평가된 배치 07A201(50.8%, 18개월 안정성 시점)을 갖는 50.9%(배치 7DS1M 및 6KS1K: 각각 12 및 18 안정성 시점)였다(표 8). 이 배치는 표시된 저장 기간에 약 600회 용량으로 사용되었다. 3상 임상 시험 동안 평가된 DP 배치에 대한 역학 모델을 사용하여 예측된 % HC isoAsp43의 최고 수준은 624개 용량이 전달된 배치 05IS039(표 8)의 18개월 안정성 시점에 대해 59.1%였다. 냉동 보존액이 부족하여 이 배치에 대해 HC isoAsp43 수준이 측정되지 않았다. 이러한 임상 경험을 바탕으로 ≤51%가 HC isoAsp43에 대한 DP 안정성 허용 기준으로 확립되었다. 이 안정성 한계(≤51%)는 3상 임상 시험 동안 % HC isoAsp43을 환자 노출의 최대 수준 내로 제어하기 위한 보수적인 제안을 나타낸다.
DP 방출 허용 기준
제품 유효 기간 동안 % 총 HC Asn43 탈아미드화와 % isoAsp43(표 10, 이하 "제한된" 배치라고 지칭됨)의 제어 사양을 충족하는 것으로 제한된 DP 배치의 HC isoAsp43 수준을 평가하여 % HC isoAsp43에 대한 방출 사양을 결정하였다. 22.7 내지 34.7% HC isoAsp43의 평균 및 ± 3 SD 범위가 이들 배치로부터 계산되었으며 표 11에 기재되어 있다.
[표 10]
[표 11]
HC isoAsp43의 수준을 제한된 DP 배치 중 4개의 하위 집합에 대해 별도로 평가하였다. 이 하위 집합은, DP 배치와 충전된 DS 배치 둘다에 대해 방출 시 검출된 HC Asn43 탈아미드화 수준이, 3상 중추 시험에서의 경험을 바탕으로 % 총 HC Asn43 탈아미드화에 대한 DS 및 DP 방출 및 안정성 기준(≤79%)으로 한계에 근접하는, 최근의 DP 배치로 구성된다(앞서 설명한 "고 탈아미드화" 배치). 또한, 이러한 배치는 새로운 관리 전략에 대한 수확 유지 시간 제한 내 및 새로운 관리 전략에 대해서도 스테이지 6 내지 8의 누적 처리 및 보류 시간이 최대 115시간 또는 그 근처인 새로운 관리 전략으로 제조된 DS로 충전되었다(표 12). 따라서, 이러한 배치의 결과는 현재 개정된 제조 공정의 극단적인 상황에서 예상되는 결과를 대표한다. 22.3 내지 34.3% HC isoAsp43의 평균 및 ± 3 SD 범위를 표 11에 표시된 대로 이들 배치로부터 계산하였다. 이들 데이터에 기초하여, % HC isoAsp43에 대해 22 내지 34%의 예비 DP 방출 허용 기준을 확인하였다.
[표 12]
이러한 고 탈아미드화 DP 배치에서 HC isoAsp43의 수준은 DP 방출 시 26.3% 내지 31.1% 범위였다(표 12). 최근 데이터는 4개의 로트 모두 18개월에 HC isoAsp43의 임상적 적격 한계인 ≤51%로 충분히 유지되었으며 24개월 안정성 데이터가 이용 가능한 로트 중 2개는 24개월에 한계 내에 유지되었음을 보여준다(표 12). 고 탈아미드화 배치 및 이에 상응하는 DS 배치는, 둘다에 대해 방출 시 검출된 총 HC Asn43 탈아미드화 및 HC isoAsp 43 수준, 및 현재의 장기간 DP 안정성 시점의 HC Asn43 탈아미드화 및 HC isoAsp43의 수준과 함께 표 6에 나열되어 있다.
종합적으로, 제한된 고 탈아미드화 배치의 데이터는 방출 시 최대 30% HC isoAsp43을 함유한 DP가 22개월 유효 기간 전체를 통해 HC isoAsp43의 임상적 적격 한계인 ≤51%로 유지된다는 것을 보여준다. 데이터는 수정된 관리 전략에서 수확 유지 시간 제한(≤21일) 내 및 누적 처리에 대한 PAR의 상한 및 스테이지 6 내지 8(115시간)의 유지 시간 내에 제조된 DS로부터 채워지고, % 총 HC Asn43 탈아미드화의 임상적 적격 상한(≤79%)을 함유하고 방출 시 최대 30% HC isoAsp43을 함유하는 DP가, 적용되는 18개월의 유효 기간 전체를 통해 HC isoAsp43의 임상적 적격 한계인 ≤51%로 유지될 것이라는 것을 추가로 보여준다. 따라서, 방출 시 DP의 % HC isoAsp43에 대한 허용 기준을 ≤30%로 설정하였다.
DS 방출 허용 기준
총 HC Asn43 탈아미드화의 제어를 위한 사양(표 13)을 충족하는 DS 배치의 방출 시 HC isoAsp43 수준을, % HC isoAsp43에 대한 방출 사양 결정을 위해 평가하였다. 19.4 내지 29.9%의 평균 및 ± 3 SD 범위가 이들 배치로부터 계산되었다(표 11). 이들 데이터에 기초하여, % HC isoAsp43에 대해, 예비 DS 방출 및 안정성 허용 기준 19 내지 30%을 확인하였다. 이러한 예비 허용 기준을 추가로 평가하였으며 하기 고려 사항을 기초로 조정하였다. HC isoAsp43은 HC Asn43의 탈아미드화 생산물이다. 탈아미드화 생산물에 대해 하한을 설정하는 것은 바람직하지 않다. 따라서, 방출 시 및 안정성에 대한 DS 내 % HC isoAsp43에 대한 허용 기준을 ≤30%로 설정하였다.
[표 13]
% 총 HC Asn43 탈아미드화에 대한 DS 및 DP 방출 및 안정성 허용 기준
DS 및 DP에서의 % 총 HC Asn43 탈아미드화에 대한 허용 기준을 확립할 때 HC isoAsp43에 대한 임상적 적격성과 DP 안정성 한계를 둘다 고려하였다. HC isoAsp43 수준은 DP 제조 및 후속 저장 중에 증가하며 관찰된 수준은 DP에서 탈아미드화된 HC Asn43의 초기 수준에 따라 달라진다. 18개월 안정성 시점에 가장 높게 측정된 HC isoAsp 43 수준을 18개월에 79.5% 및 79.3%의 탈아미드화된 HC Asn43 수준을 함유한 배치 07A201 및 6KS1K(각각 50.8% 및 50.9%)에서 관찰하였다(표 8). 이러한 데이터를 기초로 ≤79%를 % 총 HC Asn43 탈아미드화에 대한 DS 및 DP 방출 및 안정성 허용 기준으로 확립하였다. 이러한 허용 기준은 하기와 같이 3상 임상 시험 동안 평가된 배치에 포함된 수준에 비해 HC Asn43 탈아미드화의 보수적인 수준을 나타낸다.
3상 임상 시험 동안 평가된 DP 배치에서 HC Asn43 총 탈아미드화의 최고 측정 수준은 배치 7DSIM의 12개월 안정성 시점에 대해 84.3%였으며, 이를 241개 용량에 사용하였다(표 8). 또한, 또 다른 3220개 용량을, HC Asn43 탈아미드화 수준이 79%에 근접하거나 79% 초과인 DP 배치로부터 전달하였다[배치 07A201: 12개월 안정성 시점, 80.2%; 배치 07A201: 18개월 안정성 시점, 79.5%; 배치 6KS1K: 6개월 안정성 시점, 79.3%; 배치 6KS1K: 9개월 안정성 시점, 78.4%; 배치 6KS1K: 12개월 안정성 시점, 79.1%; 배치 6KS1K: 18개월 안정성 시점, 79.3%; 및 배치 7DS1M: 9개월 안정성 시점, 80.9%(표 8)]. DS 배치에 대한 HC Asn43 총 탈아미드화의 최고 측정 수준은 91.0%였다(DP 배치 05IS039를 충전하는 데 사용되는 배합된 FB 배치, 표 8). DP 배치 05IS039를 3상 임상 시험 동안 3, 6, 9, 12 및 18개월 안정성 시점에 총 9522회 용량으로 투여하였다. 그러나, DP 배치 05IS039에 대해서는 냉동 보존액이 부족하여 그러한 안정성 시점에서 탈아미드화를 평가하지 않았다. 따라서, 배합된 FB 배치에 대한 HC Asn43 총 탈아미드화 결과를 생성된 DP 배치에 적용하였다. 이러한 접근법은 탈아미드화 수준이 DS 제형 완충제의 산성 pH에 의한 추가 증가에 대해 안정화되고 DP 제조 및 저장 전반에 걸쳐 안정적이기 때문에 정당화된다. 전체적으로, 이들 DP 배치를 ≤79%의 총 HC Asn43 탈아미드화 허용 기준 이상에서 상당한 임상 노출을 나타내는 약 13,000회 용량에 사용하였다. -40℃ 저장 조건 하에서 DS의 안정성은 방출 및 안정성에 대한 동일한 허용 기준을 정당화하므로 DS 탈아미드화 허용 기준, ≤79% 총 HC Asn43 탈아미드화 및 ≤30% HC isoAsp43에 대해 동일한 한계를 설정하였다.
골리무맙 효력에 대한 LC Asn93 탈아미드화의 효과
골리무맙의 탈아미드화를 위한 다른 부위는 LC Asn93이다. LC Asn93이 골리무맙의 CDR에 위치한다는 점을 고려하면, 그 부위에서의 변형이 항원 결합에 영향을 미치는가를 이해하는 것이 중요했다. LC Asn93의 탈아미드화는 비교적 안정하며, 탈아미드화 분석에서 cycAsn93로서 검출되는 고리화 중간체의 형성을 초래한다. LC Asn93의 탈아미드화가 효력에 영향을 미치는지를 이해하기 위해, 다양한 % LC cycAsn93을 갖는 골리무맙의 다수의 상이한 배치에 대한 % LC cycAsn93 대 효력을 플롯하여 상관 분석을 수행하였다(도 36). 결과는 -0.782의 피어슨 이변량 상관 계수로 통계적으로 유의미한 상관 관계를 나타내었다(p < 0.0001). 상관 관계의 증거가 인과 관계를 증명하지는 않지만, CDR 내의 LC Asn93의 위치와 결합될 때, 결과는 LC Asn93의 고리화가 효력에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 제조 관리 전략에 대한 DS 탈아미드화 허용 기준을 ≤5.8% 총 LC Asn93 탈아미드화로 설정하였다.
생물활성(효력) 검정
골리무맙의 생물활성(효력)의 측정은 WEHI 164 세포(Walter and Eliza Hall Institute(오스트레일리아 멜버른 소재)로부터 입수한 마우스 BALB/c 섬유육종 세포)를 TNFα 유도 세포독성으로부터 보호하는 골리무맙의 능력에 기초한 시험관내 검정으로 수행한다. 각각의 검정 플레이트는 500 ng/mL(6회 반복실험)의 Simponi 시험 물품 및 Simponi 참조 표준의 100-μL 연속 희석물을 함유한다. 이어서 TNF-α를 첨가하고 플레이트를 인큐베이션한다. 중화 및 인큐베이션 후에, WEHI 164 세포를 마이크로타이터 플레이트에 첨가한 후, 다른 인큐베이션 단계가 이어진다. 그 후에, 대사 기질(이는 생존 세포의 지표임)을 첨가하고, 전환된 기질을 분광광도법으로 측정한다.
4-파라미터 로지스틱 분석을 사용하여 시험 물품 및 참조 표준 중화 곡선을 적합시킨다. Simponi 참조 표준 및 Simponi 시험 물품의 50% 유효 용량(ED50)을 비교함으로써 효력을 계산한다.
유효 결과를 산출하기 위해, 생물활성 절차의 수행 중에 하기 시스템 적합성 허용 기준을 적용한다:
참조 표준:
각각의 중화 곡선은 3개의 검정 플레이트의 세포 + TNF-α 대조군의 평균 OD 값의 40% 이내의 더 낮은 평탄역, 3개의 검정 플레이트의 세포 단독 대조군의 평균 OD 값의 25% 이내의 더 높은 평탄역, 및 평탄역들 사이의 선형 부분을 갖는 S-형상 곡선이어야 한다.
각각의 곡선의 기울기는 0.7 내지 3.5이어야 한다.
각각의 곡선에 대한 r2 값은 ≥0.97이어야 한다.
모든 복제물 ED50 값은 2 ng/mL 내지 20 ng/mL이어야 한다.
평균 ED50 값(n=6)의 RSD는 ≤20%이어야 한다.
TNF-α 세포독성 곡선:
TNF-α 세포독성 곡선은 하위 평탄역, 상위 평탄역, 및 평탄역들 사이의 선형 부분을 갖는 S-형상 곡선을 나타내야 한다.
기울기는 각각의 적합된 곡선에 대해 ≤2.0이어야 한다.
TNF-α 세포독성 곡선에 대한 r2 값은 ≥0.97이어야 한다.
1.68 ng/mL의 TNF-α 농도에서의 OD 값은 0.1 내지 0.4에 속해야 한다.
대조군:
각각의 플레이트에 대한 OD 범위(세포 + TNF 대조군과 세포 단독 대조군의 평균 OD 값 사이의 차이)는 ≥0.68이어야 한다.
세포 단독 대조군의 평균 OD 값(n= 6)은 각각의 플레이트에 대해 ≥0.75이어야 한다. 세포 단독 대조군의 RSD는 ≤20%여야 한다.
세포 + TNF-α 대조군의 평균 OD 값(n= 6)은 각각의 플레이트에 대해 ≤0.50여야 한다. 그리고 TNF-α 대조군의 RSD는 ≤20%여야 한다.
시험 물품:
각각의 중화 곡선은 3개의 검정 플레이트의 세포 + TNF-α 대조군의 평균 OD 값의 40% 이내의 더 낮은 평탄역, 3개의 검정 플레이트의 세포 단독 대조군의 평균 OD 값의 25% 이내의 더 높은 평탄역, 및 평탄역들 사이의 선형 부분을 갖는 S-형상 곡선이어야 한다.
각각의 곡선의 기울기는 0.7 내지 3.5이어야 한다.
각각의 곡선에 대한 r2 값은 ≥0.97이어야 한다.
평균 ED50 비율 값(n=6)의 RSD는 ≤25%이어야 한다.
시험 물품과 참조 표준 곡선 사이의 평균 기울기 비는 0.8 내지 1.2이며, 이는 시험 물품 및 참조 표준 곡선의 기울기 값이 유사함을 보장한다(20% 이하의 차이를 가짐).
시험 물품 중화 곡선의 평균 상위 점근 값은 참조 표준의 것과 10%를 초과하여 다르지 않다(평균 상위 점근 값의 차이가 ≤10%임).
시험 물품 중화 곡선의 평균 하위 점근 값은 참조 표준의 것과 15%를 초과하여 다르지 않다(평균 하위 점근 값의 차이가 ≤15%임).
cIEF에 대한 허용 기준
탈아미드화 분석을 탈아미드화를 모니터링하는 일차 방법으로 활용하고 cIEF 검정을 전하 이질성의 일반적 모니터링으로 사용하는데, 이때 cIEF 피크 한계는 탈아미드화 검정에 의해 측정된 % 총 HC Asn43 탈아미드화, % 총 LC Asn93 탈아미드화, 및 % HC isoAsp43에 대해 임상적 적격 허용 기준을 충족하는 것에 한정된다. cIEF에 대한 허용 기준은 4개의 주요 피크(C, 1, 2, 및 3)의 ΔpI를 포함한다. 피크 A의 면적 %는 DS의 모든 배치에서 절차의 정량 한계(LOQ)(2.0%) 미만인 것으로 관찰되었으므로 cIEF 허용 기준 중 하나로 포함되지 않는다. 또한, 피크 B의 면적 %는 몇몇 배치에서 LOQ보다 약간 초과할 뿐이다. 피크 B는 또 강도가 낮기 때문에 4개 주요 피크(C, 1, 2, 및 3)의 합에 대한 허용 기준에 포함되지 않는다. 그러나, 피크 B의 면적 %는 제조 공정의 일관성 및 저장 중 DS 안정성 프로파일의 일관성을 보장하기 위해 개별 피크의 허용 기준에 포함된다.
총 HC Asn43 탈아미드화를 제어하기 위해 확립된 스테이지 6 내지 8에서 누적 시간에 대한 제조 작업 범위(MOR)
제어 전략의 초점은 총 % HC Asn43 탈아미드화, 총 % LC Asn93 탈아미드화 및 % HC isoAsp43 수준을 3상 중추 임상 시험에서 적격한 한계 내로 유지하는 것이다. 따라서, Janssen은 DS 방출 시 총 HC Asn43 탈아미드화 및 총 LC Asn93 탈아미드화를 위한 높은 공정 능력이 있는 지역에서 제조 공정을 운영하는 것을 선호한다. 이는 일상적인 제조 중 누적 스테이지 6 내지 8 처리 및 유지 시간을 목표로 하는 제조 작업 범위(MOR)를 확립하여, DS가 ≤79% 총 HCAsn43 탈아미드화, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%, 및 ≤ 30% isoAsp43의 임상적 적격 한계 내에 유지되는 것을 보장하도록 설정함으로써 달성되었다. 이 접근법은 또한 DP가 임상 연구에서 적격인 HC isoAsp43에 대한 한계 내에 유지되고 제안된 cIEF 사양 내에서 방출된 DS 및 DP 배치가 22개월 유효 기간 동안 사양 내에 유지되도록 보장한다.
스테이지 6 내지 8의 처리 및 70시간의 유지 시간이 MOR의 하한으로 확립된다. MOR에 대한 적절한 상한을 결정하기 위해, 이들 배치 중 4개(표 13)에서 이용 가능한 공정중 중간체로부터의 % 총 HC Asn43 탈아미드화 결과와 함께 % 총 HC Asn43 탈아미드화 사양(이전에는 "제한된" 배치 또는 데이터라고 함)을 충족하는 31개 DS 배치로부터의 % 총 HC Asn43 탈아미드화 방출 결과를 평가하였다. 7.6 내지 8.0의 pH 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 처리 시간이 % 총 HC Asn43 탈아미드화에 미치는 영향을 입증하기 위해 공정중 중간체로부터의 데이터를 포함한다(표 13). 공정중 샘플에 대한 % 총 HC Asn43 탈아미드화 결과 및 DS 방출 결과를 스테이지 6, 7 및 8에서 처리하는 동안 7.6 내지 8.0의 pH 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 소모된 누적 시간의 함수로 평가하였다. 순수 선형 회귀 모델(표 14)과 비교하여 이 모델에 대한 이들 데이터의 더 가까운 적합성을 기반으로 % 총 HC Asn43 탈아미드화 데이터를 모델링하기 위해 2차 모델(quadratic model)을 사용하였다. 그런 다음 그 모델을 사용하여 추정 평균 및 3개의 SD 한계를 계산하고 스테이지 6 내지 8에서 70 내지 115시간의 누적 처리 시간 이후 DS의 % 총 HC Asn43 탈아미드화 수준을 예측하였다.
[표 14]
도 35(패널 f)에 도시된 바와 같이, 스테이지 6 내지 8의 처리 및 70시간 내지 115시간까지의 유지 시간에 대한 % 총 HC Asn43 탈아미드화 결과의 플롯은 비선형 상승 추세를 보여주었다. 스테이지 6 내지 8에서 누적 시간 함수로서 탈아미드화 결과에 대한 평균 및 ±3 SD 한계를 예측하기 위해 2차 모델을 사용하여 이러한 데이터를 분석하였다. 이 분석에 대한 데이터는 표 13에 요약되어 있다. 평균 % 총 탈아미드화 결과는 70시간에서의 예측 평균 68%부터 115시간에서의 예측 평균 76%까지의 범위에 이른다. 90시간과 100시간의 3개 SD 범위는 각각 67 내지 78%와 68 내지 80%였다. 3개의 SD 결과를 기초로, 90시간을 MOR의 보수적인 상한선으로 선정하였다. 스테이지 6 내지 8의 누적 처리 및 유지 시간이 70 내지 90시간인 MOR을 통해, DS가 ≤ 79% 총 HC Asn43 탈아미드화의 임상적 적격 한계 내에서 유지되는 것이 보장된다. 최대 115시간의 누적 스테이지 6 내지 8의 처리 및 유지 시간을 경험하는 것은 드문 일로 예상되지만 이 처리 시간으로 총 탈아미드화가 79%를 초과할 가능성이 통계적으로 낮다는 점을 고려하면 허용 가능한 것으로 유지된다.
cIEF 피크 면적 대 스테이지 6 내지 8에서 누적 시간 추세
방출 시 cIEF 피크 분포를 31개의 제한된 DS 배치와 이들 배치 중 4개에서 스테이지 4, 6, 7 및 8로부터의 공정중 샘플에 대해 평가하였다(표 13). 7.6 내지 8.0의 pH 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 처리 시간이 cIEF 전하 동형 분포에 미치는 영향을 입증하기 위해 공정중 중간체의 데이터를 포함한다. 모든 샘플을 최적화된 cIEF 테스트 방법에 따라 시험하였다.
DS에서 cIEF 피크 면적에 대한 허용 기준
cIEF 동형에 대한 DS 방출 및 안정성 허용 기준을 개발하기 위해 DS 피크 면적 결과는 70 내지 115시간의 누적 스테이지 6 내지 8의 처리 및 유지 시간에 대해 추세를 나타냈다. 도 35에 나타낸 바와 같이, cIEF % 피크 면적 대 스테이지 6 내지 8의 처리 및 유지 시간의 플롯은 관심 있는 특정 피크에 따라 비선형 및 선형 추세를 둘다 보여 주었다. 데이터를 2차 및 순수 선형 회귀 모델 둘다 사용하여 평가하였으며 데이터에 가장 가까운 모델을 선택하여 MOR(70시간)의 하한 및 PAR(115시간)의 상한에서 cIEF 피크 영역에 대한 평균 및 ±3 SD 한계를 추정하였다. 피크 3과 피크 2에 대한 2차 모델의 적합도는 순수 선형 모델의 적합도보다 유의미하게 더 좋았으므로(p <0.05; 표 14), 이 파라미터에 대한 추정 평균과 3 SD 간격을 결정하는 데 2차 모델을 사용했다. 피크 1, C 및 B에 대한 2차 모델에서는 유의미한 개선(p<0.05)이 관찰되지 않았으며, 이 파라미터에 대한 추정 평균 및 3 SD 간격을 결정하는 데 선형 모델을 사용했다(표 14).
70 내지 115시간의 누적 스테이지 6 내지 8의 처리 시간을 사용하여 제조된 DS에 대해 추정된 3개의 SD 간격을 사용하여 cIEF 동형에 대한 DS 허용 기준을 도출하였다(표 15). 피크 3 및 피크 2의 경우, 허용 기준의 하한은 115시간의 최대 스테이지 6 내지 8의 처리 및 유지 시간에서 추정된 3 SD 하한을 기준으로 하였으며, 허용 기준의 상한은 70시간의 스테이지 6 내지 8의 누적 처리 및 유지 시간에서 추정된 3 SD 한계의 상한을 기준으로 하였다. 피크 1 및 피크 C의 경우, 허용 기준의 상한은 115시간의 최대 스테이지 6 내지 8의 누적 처리 및 유지 시간에 대해 추정된 3 SD 상한을 기준으로 하였으며, 허용 기준의 하한은 70시간의 스테이지 6 내지 8의 누적 처리 및 유지 시간에 대해 추정된 3 SD 한계의 하한을 기준으로 하였다.
[표 15]
cIEF 피크 면적에 대한 DS 및 DP 허용 기준
DS 및 DP cIEF 사양은 표 16에 요약되어 있다.
[표 16]
통계 모델
유의미한 실험과 데이터 수집을 통해 얻은 제조 지식을 통합하기 위해 pH, 온도 및 시간의 함수로서 HC Asn43 탈아미드화 및 cIEF 결과를 예측할 수 있는 강력한 아키텍처를 제공하기 위해 통계 모델을 개발하였다. 실제로, 탈아미드화 및 cIEF 피크 데이터 다변량 분석을 통해 예측 모델을 확립하는 데 3가지 요소를 모두 종합적으로 고려해야 한다는 사실을 입증하였다. 이 목적을 위해, 모든 관련된 이전 연구의 데이터를 5.3 내지 8.0의 pH 범위, -40 내지 25℃의 온도 범위, 및 0 내지 1000일의 시간 범위의 단일 데이터세트로 조합하였다. 이러한 데이터는 연속적이지 않지만, 서포트 벡터 머신(SVM)에 의한 예측 모델링을 '갭 필러' 역할을 하도록 사용하고, 이에 의해 탈아미드화 및 cIEF 데이터세트의 개별 특성이, 더 넓은 예측 기능을 통해 더 연속적인 범위로 통계적으로 변환되었다.
통계 모델을 사용하여 pH, 온도 및 시간 값 범위에 걸쳐 탈아미드화 수준과 cIEF 피크의 거동을 예측하는 것이 가능하였다. 제조 관리 전략과 일치하여, 모델은 스테이지 6 내지 8에 대한 제조 공정이 제어된 실온(15 내지 25℃) 및 7.6 내지 8.0의 pH에서 작동되는 경우, 탈아미드화 및 cIEF 방출 사양을 충족하는 데 3 내지 6일(72 내지 144시간)이 걸릴 것으로 예측하였다. 이에 반하여, 모델은 온도가 5℃로 감소하면 공정이 필요한 탈아미드화 값을 달성하지 못할 것이라고 예측했다. 실제로, 탈아미드화 및 cIEF 속성에 대한 일련의 연립 방정식으로 평가된 수많은 가상 제조 조건을 고려한 후, 고유한 솔루션은 DS 및 DP에 대한 탈아미드화 및 cIEF 방출 사양을 충족하는 시간, 온도 및 pH에 대해 본원에 기재된 제조 관리 전략을 가리켰다. 모델을 사용한 통계 분석 샘플은 하기에 제공되어 있다.
[표 17]
[표 18]
[표 19]
결론
따라서, 상기 설명한 바와 같이, 3상 임상 시험에서 적격한 한계 내에 있는 약물 물질(DS) 및 (DP)을 생산하기 위해 제조 관리 전략을 개발하였다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 DS 또는 DP는 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하며, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 생산된 DS 또는 DP는, ≤ 30% HC isoAsp43인 탈아미드화된 HC Asn43을 포함한다. DS 및 DP의 탈아미드화는 입증된 허용 범위(PAR)의 상한으로 115시간을 설정하고, 스테이지 6 내지 8의 처리 및 유지 시간(pH 7.6 내지 8.0에서 그리고 15 내지 25℃의 제어된 실온에서의 스테이지)에 대해 누적 70 내지 90시간의 제조 작업 범위(MOR)를 유지하여 제어된다. 스테이지 6 내지 8은 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 바이러스 체류용 필터링을 포함한다. 제조 관리 전략은 또한 스테이지 2 세포 수확 유지에 소요된 시간을 2 내지 8℃에서 최대 21일로 제한한다.
DS 및 DP에서의 % 총 HC Asn43 탈아미드화, % 총 LC Asn93 탈아미드화, 및 % HC isoAsp43 수준을 본원에서 탈아미드화 검정으로 지칭되는 Lys C 펩티드 맵핑 방법을 사용하여 모니터링한다. 또한, 방출 시 DS 및 DP에 대한 모세관 등전점 집속(cIEF) 사양을 처리 및 유지 시간, 총 HC Asn43 탈아미드화, % HC isoAsp43의 변화, 유효 기간 동안의 cIEF 피크 면적 간의 관계를 기초로 개발하였다. 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 DS 및 DP의 cIEF 전기영동도는 C, 1, 2 및 3으로 확인되는 피크에 상응하는 4개의 주요 피크 및 A 및 B로 확인되는 피크에 상응하는 2개의 부수적 cIEF 피크를 포함한다. cIEF 사양은 하기를 포함한다: 4개의 주요 피크(C, 1, 2 및 3으로 확인됨)의 % 면적의 합계 ≥ 91%, 피크 3의 면적 % = 12 내지 33%, 피크 2의 면적 % = 34 내지 43%, 피크 1의 면적 % = 17 내지 33%, 피크 C의 면적 % = 5 내지 15%, 및 부수적 피크 중 하나(B로 확인됨)의 면적 % ≤ 6%.
Claims (13)
- 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)을 생산하기 위한 제조 방법으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, HC Asn43 및 LC Asn93의 총 탈아미드화는, 방출 시 총 탈아미드화가 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이도록 제어되는, 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 탈아미드화된 HC Asn43은 방출 시 ≤ 30% isoAsp43인, 제조 방법.
- 제1항에 있어서, HC Asn43 및 LC Asn93의 탈아미드화는 항-TNF 항체의 엔도프로테이나제 Lys-C 소화를 사용하는 질량 분광계 펩티드 맵핑에 의해 결정되는, 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DS 또는 DP의 모세관 등전점 집속(cIEF) 전기영동도는 C, 1, 2 및 3으로 확인되는 피크에 상응하는 4개의 주요(major) cIEF 피크 및 A 및 B로 확인되는 피크에 상응하는 2개의 부수적(minor) cIEF 피크를 포함하며, 방출 시 상기 4개의 주요 피크의 면적 %의 합은 ≥ 91%이고, 피크 3의 면적 % = 12 내지 33%이고, 피크 2의 면적 % = 34 내지 43%이고, 피크 1의 면적 % = 17 내지 33%이고, 피크 C의 면적 % = 5 내지 15%이고, 피크 B의 면적 %는 ≤ 6%인, 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항-TNF 항체는 후속 생물학적 제제(follow-on biologic)를 포함하는, 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 7.6 내 8.0의 pH 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 완료되는 합친 스테이지에 대해, 70 내지 90시간의 제조 작업 범위(MOR) 및 115시간 미만의 최대 시간 제한을 포함하는 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 방법은, 양이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 음이온 교환 크로마토그래피 스테이지 및 바이러스 체류용 필터링 스테이지를 포함하는, 7.6 내지 8.0의 pH 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 완료되는 3개의 연속 스테이지를 포함하며, 합친 상기 3개의 연속 스테이지에 대해 제조 작업 범위(MOR)는 70 내지 90시간이고 최대 시간 제한은 115시간 미만인, 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 방법은 2 내지 8℃에서 21일의 수확된 세포에 대한 최대 유지 시간을 포함하고, 양이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 음이온 교환 크로마토그래피 스테이지 및 바이러스 체류용 필터링 스테이지를 포함하는, 7.6 내지 8.0의 pH 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 완료되는 3개의 연속 스테이지를 포함하며, 합친 상기 3개의 연속 스테이지에 대해 제조 작업 범위(MOR)는 70 내지 90시간이고 최대 시간 제한은 115시간 미만인, 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 방법은 2 내지 8℃에서 21일의 수확된 세포에 대한 최대 유지 시간을 포함하고, UNOsphere S 컬럼을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피 스테이지, Q Sepharose XL(QXL) 컬럼을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피 스테이지, 및 NFP™ 필터를 사용한 바이러스 체류용 필터링 스테이지를 포함하는, 7.6 내지 8.0의 pH 및 15 내지 25℃의 제어된 실온에서 완료되는 3개의 연속 스테이지를 포함하며, 합친 상기 3개 스테이지에 대해 제조 작업 범위(MOR)는 70 내지 90시간이고 최대 시간 제한은 115시간 미만인, 제조 방법
- 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 포유류 항-TNF 항체를 포함하는 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP)으로서, HC 아스파라긴 43(HC Asn43) 및 LC 아스파라긴 93(LC Asn93)은 탈아미드화되고, 총 탈아미드화는 HC Asn43의 경우 ≤ 79%이고, LC Asn93의 경우 ≤ 5.8%이고, 상기 DS 또는 DP는 제8항에 따른 방법에 의해 생산되는, 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP).
- 제10항에 있어서, 상기 탈아미드화된 HC Asn43은 방출 시 ≤ 30% isoAsp43인, 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP).
- 제10항에 있어서, 상기 DS 또는 DP의 모세관 등전점 집속(cIEF) 전기영동도는 C, 1, 2 및 3으로 확인되는 피크에 상응하는 4개의 주요 cIEF 피크 및 A 및 B로 확인되는 피크에 상응하는 2개의 부수적 cIEF 피크를 포함하고, 방출 시 상기 4개의 주요 피크의 면적 %의 합은 ≥ 91%이고, 피크 3의 면적 % = 12 내지 33%이고, 피크 2의 면적 % = 34 내지 43%이고, 피크 1의 면적 % = 17 내지 33%이고, 피크 C의 면적 % = 5 내지 15%이고, 피크 B의 면적 %는 ≤ 6%인, 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP).
- 제10항에 있어서, 항-TNF 항체는 후속 생물학적 제제를 포함하는, 약물 물질(DS) 또는 약물 제품(DP).
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