KR20210116540A - 소아 특발성 관절염의 치료를 위한 항-tnf 항체 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-TNF 항체, 예를 들어 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 항-TNF 항체 골리무맙을 이용하는, 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis, JIA), 특히 다발성 소아 특발성 관절염(polyarticular juvenile idiopathic arthritis, pJIA)의 치료에 사용하기 위한, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

소아 특발성 관절염의 치료를 위한 항-TNF 항체 조성물 및 방법

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원은 파일명이 "JBI6042USPSP3SeqListing.txt"이고, 작성일이 2019년 9월 10일이며, 크기가 25 kb인 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 항-TNF 항체, 예를 들어 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 항-TNF 항체 골리무맙을 이용하는, 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis, JIA), 특히 다발성 소아 특발성 관절염(polyarticular juvenile idiopathic arthritis, pJIA)의 치료에 사용하기 위한, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

TNF 알파는 17 kD 단백질 서브유닛의 가용성 동종삼량체이다. 막-결합된 26 kD 전구체 형태의 TNF가 또한 존재한다.

단핵구 또는 대식세포 이외의 세포 또한 TNF 알파를 생산한다. 예를 들어, 인간 비-단핵구성 종양 세포주는 TNF 알파 및 CD4+ 및 CD8+ 말초 혈액 T 림프구를 생산하며, 일부 배양된 T 및 B 세포주 또한 TNF 알파를 생산한다.

TNF 알파는 연골 및 뼈의 분해와 같은 조직 손상, 부착 분자의 유도, 혈관 내피 세포에 대한 응혈촉진 활성 유도, 호중구 및 림프구의 부착의 증가, 및 대식세포, 호중구, 및 혈관 내피 세포로부터의 혈소판 활성화 인자의 방출의 자극을 유발하는 염증 촉진 작용을 야기한다.

TNF 알파는 감염, 면역 장애, 신생물 병리학, 자가면역 병리학, 및 이식편-대-숙주 병리학과 관련되어 있다. TNF 알파와 암 및 감염성 병리학의 연계는 종종 숙주의 이화 상태와 관련된다. 암 환자는 일반적으로 거식증과 관련된 체중 감소를 겪는다.

암 및 다른 질환과 관련된 광범위한 소모는 "악액질"로 알려져 있다. 악액질은 악성 성장에 반응하는 진행성 체중 감소, 거식증, 및 제지방 체중(lean body mass)의 지속적인 잠식을 포함한다. 악액질 상태는 많은 암 이환률 및 사망률을 야기한다. TNF 알파가 암, 감염성 병리학, 및 다른 이화 상태에서 악액질에 관여한다는 증거가 있다.

TNF 알파는 발열, 권태감, 거식증, 및 악액질을 포함하는 그램-음성 패혈증 및 내독소 쇼크(endotoxic shock)에서 중심 역할을 하는 것으로 여겨진다. 내독소는 TNF 알파 및 다른 사이토카인의 단핵구/대식세포 생산 및 분비를 강력하게 활성화한다. TNF 알파 및 다른 단핵구-유래 사이토카인은 내독소에 대한 대사 및 신경호르몬 반응을 매개한다. 인간 지원자에 대한 내독소 투여는 발열, 빈맥, 증가된 대사 속도, 및 스트레스 호르몬 방출을 포함하는 플루형 증상을 동반하는 급성 질환을 유발한다. 그램-음성 패혈증을 앓고 있는 환자에서는 순환 TNF 알파가 증가한다.

따라서, TNF 알파는 염증성 질환, 자가면역 질환, 바이러스, 박테리아, 및 기생충 감염, 악성종양, 및/또는 신경퇴행성 질환에 연루되어 있으며, 류마티스 관절염 및 크론병과 같은 질환에서 특이적 생물학적 요법에 대한 유용한 표적이다. TNF 알파에 대한 단일클론 항체를 이용하는 개방-표지 시험에서의 유익한 효과가 염증의 억제 및 류마티스 관절염 및 크론병에서의 재발 후 성공적인 재치료와 함께 보고되었다. 무작위 이중-맹검 플라세보-대조 시험에서의 유익한 결과가 또한 염증의 억제와 함께 류마티스 관절염에서 보고되었다.

인간 이외의 포유류에서 TNF에 대한 중화 항혈청 또는 mAb는 실험적 내독소혈증 및 균혈증에서 유해한 생리학적 변화를 제거하고 치명적인 챌린지 후의 사망을 예방하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는, 예를 들어 설치류 치사 검정 및 영장류 병리학 모델 시스템에서 입증되었다.

hTNF의 추정 수용체 결합 좌위(receptor binding loci)가 개시되어 있으며, TNF의 아미노산 11 내지 13, 37 내지 42, 49 내지 57, 및 155 내지 157로 이루어진 TNF 알파의 수용체 결합 좌위가 개시되어 있다.

인간외 포유류, 키메라, 다클론(예를 들어, 항-혈청) 및/또는 단일클론 항체(Mab) 및 단편(예를 들어, 이의 단백질 분해 또는 융합 단백질 생성물)은 일부 경우에 소정의 질환을 치료하고자 시도하기 위해 조사되고 있는 잠재적인 치료제이다. 그러나, 그러한 항체 또는 단편은 인간에게 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 면역 반응은 순환으로부터의 항체 또는 단편의 면역 복합체-매개 제거(immune complex-mediated clearance)를 유발하고, 반복된 투여를 요법에 부적합하게 하여, 환자에 대한 치료 이익을 감소시키고 항체 또는 단편의 재투여를 제한할 수 있다. 예를 들어, 인간외 부분을 포함하는 항체 또는 단편의 반복된 투여는 혈청 병 및/또는 아나필락시스로 이어질 수 있다. 이들 및 다른 문제를 피하기 위하여, 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 키메라화 및 인간화를 포함하는, 그러한 항체 및 이의 부분의 면역원성을 감소시키기 위한 다수의 접근법이 취해졌다. 그러나, 이들 및 다른 접근법은 여전히 일부 면역원성, 낮은 친화도, 낮은 결합활성을 갖거나, 세포 배양, 스케일 업(scale up), 생산, 및/또는 낮은 수율의 문제를 갖는 항체 또는 단편을 유발할 수 있다. 따라서, 그러한 항체 또는 단편은 치료 단백질로서 제조 또는 사용하기에 이상적으로 적합하지 못할 수 있다.

이러한 문제들 중 하나 이상을 극복한 TNF 억제제를 제공할 필요성은 현재 시판되는 항-TNF 항체 및 다른 TNF 억제제, 예를 들어, REMICADE®(인플릭시맙), HUMIRA®(아달리무맙), 및 SIMPONI®(골리무맙)와 같은 항-TNF 항체의 개발로 이어졌다. 다른 TNF 억제제는, 예를 들어, 페길화된 항체 단편인 CIMZIA®(세르톨리주맙 페골), 및 가용성 TNF 수용체 융합 단백질인 ENBREL®(에타너셉트)을 포함한다. TNF 억제제의 검토에 관해서는, 예를 들어, 문헌[Lis et al., Arch Med Sci. 2014 Dec 22; 10(6): 1175-1185]을 참조한다.

일반적인 실시 형태 및 바람직한 실시 형태는 본 명세서에 첨부된 독립항 및 종속항에 의해 각각 정의되어 있으며, 이들은 간략함을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양의 다른 바람직한 실시 형태, 특징 및 이점이 첨부 도면과 관련하여 취해진 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 상기 환자는 2세 내지 17세인 소아 환자이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 상기 환자는 2세 내지 17세인 소아 환자이고 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 상기 환자는 2세 내지 17세인 소아 환자이고 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)이고, 항-TNF 항체는 80mg/m²의 정맥내(IV) 용량으로, 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 투여된다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체는 80mg/m²의 정맥내(IV) 용량으로, 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 투여되고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 28주의 치료 후 환자는 비활성 질환에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체는 80mg/m²의 정맥내(IV) 용량으로, 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 투여되고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 항-TNF 항체로 28주의 치료 후 환자는 비활성 질환에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 28주의 치료 후 환자의 29% 초과는 비활성 질환에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체는 80mg/m²의 정맥내(IV) 용량으로, 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 투여되고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 항-TNF 항체로 28주의 치료 후 환자의 29% 초과는 비활성 질환에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 28주의 치료 후 환자는 JIA 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology, ACR) 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 및 JIA ACR 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖는다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 28주의 치료 후 환자의 83% 초과는 JIA ACR 30에 대한 기준을 충족하고, 환자의 79% 초과는 JIA ACR 50에 대한 기준을 충족하고, 환자의 70% 초과는 JIA ACR 70에 대한 기준을 충족하고, 환자의 46% 초과는 JIA ACR 90에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체는 80mg/m²의 정맥내(IV) 용량으로, 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 투여되고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 28주의 치료 후 환자의 83% 초과는 JIA ACR 30에 대한 기준을 충족하고, 환자의 79% 초과는 JIA ACR 50에 대한 기준을 충족하고, 환자의 70% 초과는 JIA ACR 70에 대한 기준을 충족하고, 환자의 46% 초과는 JIA ACR 90에 대한 기준을 충족한다.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TNF 항체에 의한 28주의 치료 후 환자는 소아 관절염 질환 활성 점수(Juvenile Arthritis Disease Activity Score, JADAS) 10, JADAS 27, 및 JADAS 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 JADAS의 기저선으로부터의 변화를 갖는, 방법.

제10항에 있어서, JADAS 10을 갖는 환자는 기저선으로부터의 중위값 감소가 14 초과이고, JADAS 27을 갖는 환자는 기저선으로부터의 중위값 감소가 16 초과이고, JADAS 71을 갖는 환자는 기저선으로부터의 중위값 감소가 20 초과인, 방법.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체를 임상적으로 안전하다고 입증되고 임상적으로 유효하다고 입증된 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체는 80mg/m²의 정맥내(IV) 용량으로, 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 투여되고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 28주의 치료 후, JADAS 10을 갖는 환자는 기저선으로부터의 중위값 감소가 14 초과이고, JADAS 27을 갖는 환자는 기저선으로부터의 중위값 감소가 16 초과이고, JADAS 71을 갖는 환자는 기저선으로부터의 중위값 감소가 20 초과이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는 데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는 데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 환자의 10% 초과는 8주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 환자의 20% 초과는 16주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 환자의 29% 초과는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는 데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 상기 소아 환자는 2세 내지 17세이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는 데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는 데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, IV 용량은 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 80 mg/m²이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는 데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 소아 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖는다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖고, 4주의 치료 후 환자의 50% 초과는 JIA ACR 30 및 JIA ACR 50에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖고, 12주의 치료 후 환자의 50% 초과는 JIA ACR 30, JIA ACR 50, 및 JIA ACR 70에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖고, 28주의 치료 후 환자의 83% 초과는 JIA ACR 30에 대한 기준을 충족하고, 환자의 79% 초과는 JIA ACR 50에 대한 기준을 충족하고, 환자의 70% 초과는 JIA ACR 70에 대한 기준을 충족하고, 환자의 46% 초과는 JIA ACR 90에 대한 기준을 충족한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖고, 상기 소아 환자는 2세 내지 17세이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖고, 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖고, IV 용량은 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 80 mg/m²이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 소아 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(Juvenile Arthritis Disease Activity Score, JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖는다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖고, 환자의 10% 초과는 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 및 28주의 치료 후 JADAS 10, JADAS 27, 및 JADAS 71 최소 질환 활성 질환을 갖는다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖고, 환자의 15% 이상은 24주의 치료 및 28주의 치료 후 JADAS 10, JADAS 27, 및 JADAS 71 최소 질환 활성 질환을 갖는다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖고, 상기 소아 환자는 2세 내지 17세이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖고, 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖고, IV 용량은 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 80 mg/m²이다.

소정 실시 형태에서, 본 발명은 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법을 제공하는데, 본 방법은 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖고, 본 방법은 메토트렉세이트(MTX)를 소아 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

도 1은 재조합 TNF 수용체에 대한 TNFα 결합을 억제하기 위한 하이브리도마 세포 상청액에서의 TNV mAb의 능력에 대한 검정을 나타내는 도해적 표현을 나타낸다. 알려진 양의 TNV mAb를 함유하는 다양한 양의 하이브리도마 세포 상청액을 고정된 농도(5 ng/ml)의 ¹²⁵I-표지된 TNFα와 함께 사전 인큐베이션하였다. 재조합 TNF 수용체/IgG 융합 단백질인 p55-sf2로 사전에 코팅된 96-웰 Optiplate에 혼합물을 이전하였다. 미결합 재료를 세척해내고 감마 계수기를 사용하여 계수한 후에 mAb의 존재 하에 p55 수용체에 결합된 TNFα의 양을 결정하였다. 이들 실험에서는 8개의 TNV mAb 샘플을 시험하였지만, 간략함을 위해, DNA 서열 분석에 의해 다른 TNV mAb 중 하나와 동일한 것으로 나타난 3개의 mAb는 여기에 나타내지 않는다. 각각의 샘플을 이중실험으로 시험하였다. 결과는 2회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 2a 및 도 2b는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포계열 유전자는 DP-46 유전자이다. 'TNVs'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196의 서열임을 나타낸다. TNV 서열 내의 최초 3개의 뉴클레오티드는 번역 개시 Met 코돈을 정의한다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포계열 서열에서와 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 최초 19개 뉴클레오티드(밑줄)는 가변 영역을 PCR 증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb로 시작하는 아미노산 번역(1문자 약어)은 생식세포계열 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포계열 아미노산 번역에서 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시된다. TNV148(B)로 표지된 선은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 DNA 서열(CDR3) 내의 갭은 알려져 있지 않거나 당시에 생식세포계열 유전자에 존재하지 않는 서열에 기인하였다. TNV mAb 중쇄는 J6 결합 영역을 사용한다.
도 3은 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 DNA 서열을 나타낸다. 나타낸 생식세포계열 유전자는 인간 카파 생식세포계열 가변 영역 유전자의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 구성원이다. TNV mAb 유전자 서열 내의 점은 뉴클레오티드가 생식세포계열 서열에서와 동일함을 나타낸다. TNV 서열의 최초 16개 뉴클레오티드(밑줄)는 가변 영역을 PCR 증폭하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 성숙 mAb의 아미노산 번역(1문자 약어)은 생식세포계열 유전자에 대해서만 나타낸다. 생식세포계열 아미노산 번역에서 3개의 CDR 도메인은 굵은체 및 밑줄로 표시된다. TNV148(B)로 표지된 선은 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 DNA 서열(CDR3) 내의 갭은 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않는 서열에 기인한다. TNV mAb 경쇄는 J3 결합 서열을 사용한다.
도 4는 TNV mAb 중쇄 가변 영역의 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 생성물 및 클로닝된 PCR 생성물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추정하였다. 아미노 서열은 분비 신호 서열(신호), 프레임워크(FW), 및 상보성 결정 영역(CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. DP-46 생식세포계열 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포계열 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)는 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. 상이한 서열을 나타내지 않는 한, 'TNVs'는 나타낸 서열이 모든 TNV mAb에 관련됨을 나타낸다. 생식세포계열 서열(CDR3) 내의 대시는 서열이 생식세포계열 유전자에서 알려져 있지 않거나 존재하지 않음을 나타낸다.
도 5는 TNV mAb 경쇄 가변 영역의 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열(1문자 약어)은 클로닝되지 않은 PCR 생성물 및 클로닝된 PCR 생성물 둘 모두로부터 결정된 DNA 서열로부터 추정하였다. 아미노 서열은 분비 신호 서열(신호), 프레임워크(FW), 및 상보성 결정 영역(CDR) 도메인으로 분할하여 나타낸다. Vg/38K-유형 경쇄 생식세포계열 유전자에 대한 아미노산 서열은 각각의 도메인에 대해 상부 라인 상에 나타낸다. 점은 TNV mAb 내의 아미노산이 생식세포계열 유전자와 동일함을 나타낸다. TNV148(B)는 나타낸 서열이 TNV148 및 TNV148B 둘 모두에 관련됨을 나타낸다. '전부'는 나타낸 서열이 TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B, 및 TNV186에 관련됨을 나타낸다.
도 6은 rTNV148B-발현 C466 세포를 제조하기 위해 사용되는 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드의 개략적 예시를 나타낸다. p1783은 중쇄 플라스미드이고 p1776은 경쇄 플라스미드이다. rTNV148B 가변 영역 및 불변 영역 코딩 도메인은 흑색 박스로 나타낸다. J-C 인트론 내의 면역글로불린 인핸서는 회색 박스로 나타낸다. 관련 제한 부위를 나타낸다. 플라스미드는 Ab 유전자의 전사가 시계방향으로 진행되도록 배향하여 나타낸다. 플라스미드 p1783은 길이가 19.53 kb이고 플라스미드 p1776은 길이가 15.06 kb이다. 둘 모두의 플라스미드의 완전한 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. p1783 내의 가변 영역 코딩 서열은 BsiWI/BstBI 제한 단편을 대체함으로써 다른 중쇄 가변 영역 서열로 용이하게 대체될 수 있다. p1776 내의 가변 영역 코딩 서열은 SalI/AflII 제한 단편을 대체함으로써 다른 가변 영역 서열로 대체될 수 있다.
도 7은 5개의 rTNV148B-생산 세포주의 성장 곡선 분석의 도해적 표현을 나타낸다. 30 ml 부피 내에 1.0 X 10⁵ 세포/ml의 생존가능한 세포 밀도를 갖도록 I5Q+MHX 배지 중에 T75 플라스크 내로 세포를 접종함으로써 일수 0에 배양을 개시하였다. 이들 연구에 사용된 세포 배양물은 형질감염 및 서브클로닝이 수행된 이후로 연속 배양되었다. 후속 날에, T 플라스크 내의 세포를 철저히 재현탁시키고, 0.3 ml 분취량의 배양물을 제거하였다. 세포 계수가 1.5 X 10⁵ 세포/ml 미만으로 하락했을 때 성장 곡선 연구를 종료하였다. 분취물 내의 생존 세포의 수를 트리판 블루 배제에 의해 결정하였고, 분취물의 나머지는 이후의 mAb 농도 결정을 위해 저장하였다. 모든 샘플 분취물에 대해 인간 IgG에 대한 ELISA를 동시에 수행하였다.
도 8은 다양한 농도의 MHX 선택의 존재 하에 세포 성장 속도의 비교의 도해적 표현을 나타낸다. 세포 서브클론 C466A 및 C466B를 MHX가 없는 배지(IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민) 내로 해동시키고, 추가로 2일 동안 배양하였다. 이어서, 둘 모두의 세포 배양물을 MHX 없음, 0.2X MHX, 또는 1X MHX 중 어느 하나를 함유하는 3개의 배양물로 분할하였다. 1일 후에, 새로운 T75 플라스크를 1 X 10⁵ 세포/ml의 출발 밀도에서 배양물로 접종하고, 세포를 24시간 간격으로 1주 동안 계수하였다. 최초 5일 동안의 배가 시간을 SOP PD32.025의 수학식을 사용하여 계산하였고, 바 위에 나타낸다.
도 9는 2개의 rTNV148B-생산 세포주로부터의 시간 경과에 따른 mAb 생산의 안정성의 도해적 표현을 나타낸다. 형질감염 및 서브클로닝을 수행한 이후로 연속 배양 중이었던 세포 서브클론을 사용하여 24-웰 배양 접시에서 장기 연속 배양을 시작하였다. MHX 선택의 존재 및 부재 하에 I5Q 배지 중에 세포를 배양하였다. 매 4 내지 6일마다 배양물을 분할함으로써 세포를 지속적으로 계대배양하여, 이전의 배양물이 소모되게 하는 동안 새로운 생존가능한 배양물을 유지하였다. 배양물이 소모된 직후에, 소모된 세포 상청액의 분취물을 수집하고, mAb 농도가 결정될 때까지 저장하였다. 모든 샘플 분취물에 대해 인간 IgG에 대한 ELISA를 동시에 수행하였다.
도 10은 실시예 4의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4 주령에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/㎏ 또는 10 mg/㎏의 본 발명의 항-TNF 항체(TNV14, TNV148, 또는 TNV196)의 단일 복강내 볼루스 투여로 치료하였다. 체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이러한 체중 증가는 주수 3 내지 주수 7에 유의하였다. 10 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물은 또한 연구의 주수 7에 유의한 체중 증가를 달성하였다.
도 11a 내지 도 11c는 실시예 4에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 주수 3에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(주수 7). 1 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물 및 1 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은, D-PBS-치료군에 비교할 때, 주수 3 후에 AI의 유의한 감소를 나타내지 못하였다. 10 mg/㎏ 치료군들 사이에는, 각각을 유사한 용량의 다른 것들에 비교했을 때(10 mg/㎏ cA2를 10 mg/㎏ TNV14, 148, 및 196에 비교함) 유의한 차이가 없었다. 1 mg/㎏ 치료군을 비교했을 때, 1 mg/㎏ TNV148은 3주, 4주, 및 7주에 1 mg/㎏ cA2보다 유의하게 더 낮은 AI를 나타냈다. 1 mg/㎏ TNV148은 또한 3주 및 4주에 1 mg/㎏ TNV14-치료군보다 유의하게 더 낮았다. TNV196은 연구의 주수 6까지 AI의 유의한 감소를 나타냈지만(D-PBS-치료군에 비교할 때), 연구 종료 시에 유의하게 유지된 유일한 1 mg/㎏ 치료는 TNV148이었다.
도 12는 실시예 5의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4 주령에, 체중에 기초하여, 8개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 대조 물품(D-PBS) 또는 3 mg/㎏의 항체(TNV14, TNV148)의 복강내 볼루스 투여로 치료하였다(주수 0). 주수 1, 주수 2, 주수 3, 및 주수 4에 모든 동물에서 주사를 반복하였다. 시험 물품 효능에 대해 군 1 내지 군 6을 평가하였다. 군 7 및 군 8의 동물로부터 얻은 혈청 샘플을 주수 2, 주수 3, 및 주수 4에 TNV14 또는 TNV148의 면역 반응 유도 및 약동학적 클리어런스(clearance)에 대해 평가하였다.
도 13a 내지 도 13c는 관절염 지수에 기초한 실시예 5에서의 질환 중증도의 진행을 나타내는 그래프이다. 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 유의하게 더 낮았으며, 이는 주수 2에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(주수 5). 1 mg/㎏ 또는 3 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물 및 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물은, d-PBS 대조군에 비교할 때, 연구 전체에 걸쳐 임의의 시점에 AI의 임의의 유의한 감소를 달성하지 못하였다. 3 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물은 d-PBS-치료군에 비교할 때 유의한 감소를 나타냈으며, 이는 주수 3에 시작하여 주수 5까지 계속되었다. 10 mg/㎏ cA2-치료 동물은 연구의 주수 4 및 주수 5에 cA2의 더 낮은 용량(1 mg/㎏ 및 3 mg/㎏) 둘 모두에 비교할 때 AI의 유의한 감소를 나타냈으며, 또한 주수 3 내지 주수 5에 TNV14-치료 동물보다 유의하게 더 낮았다. 3 mg/㎏ 치료군 중 임의의 것 사이에는 유의한 차이가 없는 것으로 보였지만, 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물에 대한 AI는 일부 시점에 10 mg/㎏ 보다 유의하게 더 높았던 반면에, TNV148로 치료한 동물은 10 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물과 유의하게 상이하지 않았다.
도 14는 실시예 6의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg197 체중 변화를 나타낸다. 대략 4 주령에, 성별 및 체중에 기초하여, 6개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 3 mg/㎏ 또는 5 mg/㎏으로 항체(cA2, 또는 TNV148)의 단일 복강내 볼루스 투여로 치료하였다. 이 연구는 D-PBS 및 10 mg/㎏ cA2 대조군을 이용하였다.
도 15는 실시예 6에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 모든 치료군은 초기 시점에 일부 보호를 나타냈으며, 5 mg/㎏ cA2 및 5 mg/㎏ TNV148은 주수 1 내지 주수 3에 AI의 유의한 감소를 나타냈고 모든 치료군이 주수 2에 유의한 감소를 나타냈다. 연구 후반에, 5 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 주수 4, 주수 6, 및 주수 7에 유의한 감소를 갖는 일부 보호를 나타냈다. cA2 및 TNV148 둘 모두의 낮은 용량(3 mg/㎏)은 주수 6에 유의한 감소를 나타냈으며, 모든 치료군이 주수 7에 유의한 감소를 나타냈다. 치료군 중 어느 것도 연구 종료 시에 유의한 감소를 유지할 수 없었다(주수 8). 임의의 치료군(식염수 대조군을 배제함) 사이에는 임의의 시점에 유의한 차이가 없었다.
도 16은 실시예 7의 대조군에 비교하여 본 발명의 항-TNF 항체에 반응한 관절염 마우스 모델 마우스 Tg197 체중 변화를 나타낸다. TNV148(하이브리도마 세포로부터 유래됨) 및 rTNV148B(형질감염된 세포로부터 유래됨)의 단일 복강내 투여의 효능을 비교하기 위한 것이다. 대략 4 주령에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/㎏의 항체(TNV148 또는 rTNV148B)의 단일 복강내 볼루스 투여로 치료하였다.
도 17은 실시예 7에 제시된 바와 같은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 주수 4에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(주수 8). TNV148-치료군 및 1 mg/㎏ cA2-치료군 둘 모두는 주수 4에 AI의 유의한 감소를 나타냈다. 이전의 연구(P-099-017)는 TNV148이 단일 1 mg/㎏ 복강내 볼루스 후에 관절염 지수를 감소시키는 데 약간 더 효과적이었음을 나타냈지만, 본 연구는 TNV 항체-치료군의 둘 모두의 버전으로부터의 AI가 약간 더 높았음을 나타냈다. 1 mg/㎏ cA2-치료군은 10 mg/㎏ cA2 군에 비교할 때 유의하게 증가되지 않았고 TNV148-치료군은 주수 7 및 주수 8에 유의하게 더 높았지만(주수 6은 제외함), 연구 중 임의의 지점에 1 mg/㎏ cA2, 1 mg/㎏ TNV148, 및 1 mg/㎏ TNV148B 사이에는 AI의 유의한 차이가 없었다.
도 18은 pJIA 임상 연구 설계의 다이어그램을 나타낸다. DBL = 데이터베이스 잠금(Database Lock), LTE = 장기간 연장(Long-term extension), MSE = 주요 이차 종점(Major secondary endpoint), PE = 일차 종점(Primary endpoint). 골리무맙 80 mg/m² IV 주입은 표시된 시간에 화살표로 표시되어 있다. 환자는 또한 연구 시작 시점과 동일한 주간 BSA-기반 용량으로 적어도 주수 28까지 상업적 MTX를 받았다.
도 19는 주수 28까지 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자의 비율을 나타낸다. JIA ACR 30, 50, 70,및 90에 대한 기호는 각각 닫힌 원, 닫힌 정사각형, 닫힌 삼각형, 및 닫힌 다이아몬드이다.
도 20은 주수 28까지 비활성 질환이 있는 환자의 비율을 나타낸다.
도 21은 주수 28까지 JADAS 10, 27, 또는 71 최소 질환 활성을 갖는 환자의 비율을 나타낸다. * 주: 이러한 분석에서, JADAS 10, 27, 및 71 종점에 대한 값들은 동일하다.
도 22는 관찰된 농도(㎍/ml) 및 조건부 가중 잔차(condition weighted residuals, CWRES)에 대해, 개별 예측(㎍/ml), 집단 예측(㎍/ml), 및 최초 투여 후 일수에 대한 집단 PK(PPK) 모델 적합도 플롯을 나타낸다.
도 23은 관찰된 Ctrough,ss(㎍/ml 단위의 혈청 골리무맙 최저 농도) 및 8주에 걸친 사후 AUC,ss(㎍*day/ml 단위의 혈청 골리무맙 농도의 AUCss)에 대한 상이한 연령 카테고리에서의 주수 28 일차 종점을 나타낸다. 상자 내의 수평선은 중위값을 나타내고; 상자의 하부 에지는 제1 사분위수를 나타내고; 상자의 상부 에지는 제3 사분위수를 나타내며; 수염(whisker)은 1.5 x IQ 범위 내에서의 가장 극단인 관찰값이다.
도 24는 관찰된 Ctrough,ss(㎍/ml 단위의 혈청 골리무맙 최저 농도) 및 8주에 걸친 사후 AUC,ss(㎍*day/ml 단위의 혈청 골리무맙 농도의 AUCss)에 대한 상이한 연령 카테고리에서의 주수 52 이차 종점을 나타낸다. 상자 내의 수평선은 중위값을 나타내고; 상자의 하부 에지는 제1 사분위수를 나타내고; 상자의 상부 에지는 제3 사분위수를 나타내며; 수염(whisker)은 1.5 x IQ 범위 내에서의 가장 극단인 관찰값이다.
도 25는 Ctrough,ss(㎍/ml 단위의 혈청 골리무맙 최저 농도) 및 8주에 걸친 사후 AUC,ss(㎍*day/ml 단위의 혈청 골리무맙 농도의 AUCss)에 대한 체중 사분위수별 주수 28 PK를 나타낸다. 상자 내의 수평선은 중위값을 나타내고; 상자의 하부 에지는 제1 사분위수를 나타내고; 상자의 상부 에지는 제3 사분위수를 나타내며; 수염(whisker)은 1.5 x IQ 범위 내에서의 가장 극단인 관찰값이다.
도 26은 Ctrough,ss(㎍/ml 단위의 혈청 골리무맙 최저 농도) 및 8주에 걸친 사후 AUC,ss(㎍*day/ml 단위의 혈청 골리무맙 농도의 AUCss)에 대한 C-반응성 단백질(CRP) 사분위수별 주수 28 PK를 나타낸다. 상자 내의 수평선은 중위값을 나타내고; 상자의 하부 에지는 제1 사분위수를 나타내고; 상자의 상부 에지는 제3 사분위수를 나타내며; 수염(whisker)은 1.5 x IQ 범위 내에서의 가장 극단인 관찰값이다.
도 27은 GO-VIVA 연구의 pIJA 대상체에 대한 상이한 연령 카테고리에서 주수 28 및 GO-FURTHER 연구의 성인 RA 대상체에서 주수 20 및 주수 36에서의 관찰된 Ctrough,ss(㎍/ml 단위의 혈청 골리무맙 최저 농도)를 나타낸다.
도 28은 GO-VIVA 연구의 pIJA 대상체에 대한 상이한 연령 카테고리 및 GO-FURTHER 연구의 성인 RA 대상체에서 주수 28에서의 8주에 걸친 사후 AUC,ss(㎍*day/ml 단위의 혈청 골리무맙 농도의 AUCss)를 나타낸다.
도 29a 내지 도29d는 혈청 골리무맙 농도(㎍/ml)에 대한 PK 사분위수에 의한 주수 52 JIA ACR 반응을 나타낸다. 도 29a는 JIC ACR 30 반응자를 나타내고, 도 29b는 JIC ACR 50 반응자를 나타내고, 도 29c는 JIC ACR 70 반응자를 나타내고, 도 29d는 JIC ACR 90 반응자를 나타낸다.

본 발명은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 및 이러한 항-TNF 항체를 생성하기 위한 제조 공정을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항-종양 괴사 인자 알파 항체", "항-TNF 항체", "항-TNF 항체 부분", 또는 "항-TNF 항체 단편" 및/또는 "항-TNF 항체 변이체" 등은 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 TNF 수용체 또는 결합 단백질의 하나 이상의 부분과 같으나 이에 한정되지 않는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함하며, 이는 본 발명의 항체 내로 혼입될 수 있다. 그러한 항체는 임의로 특이적 리간드에 추가로 영향을 주며, 그러한 항체가 시험관내에서, 원위치에서, 및/또는 생체내에서 하나 이상의 TNF 활성 또는 결합, 또는 TNF 수용체 활성 또는 결합을 조절, 감소, 증가, 길항화, 작용화, 완화, 경감, 차단, 억제, 제거, 및/또는 방해하는 경우와 같으나 이에 한정되지 않는다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분, 또는 변이체는 하나 이상의 TNF, 또는 이의 특정 부분, 변이체, 또는 도메인에 결합할 수 있다. 적합한 항-TNF 항체, 특정 부분, 또는 변이체는 또한 임의로 RNA, DNA, 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호전달, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성과 같으나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 TNF 활성 또는 기능에 영향을 줄 수 있다. 용어 "항체"는 추가로 항체, 이의 분해 단편, 특정 부분, 및 변이체를 포함하고자 하며, 항체 모방체(mimetic)를 포함하거나, 단일쇄 항체 및 이의 단편을 포함하는, 항체 또는 이의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능적 단편은 포유류 TNF에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab(예를 들어, 파파인 분해에 의함), Fab'(예를 들어, 펩신 분해 및 부분적인 환원에 의함), 및 F(ab')₂(예를 들어, 펩신 분해에 의함), facb(예를 들어, 플라스민 분해에 의함), pFc'(예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의함), Fd(예를 들어, 펩신 분해, 부분적인 환원, 및 재응집에 의함), Fv 또는 scFv(예를 들어, 분자생물학 기술에 의함) 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는, TNF 또는 이의 부분에 결합할 수 있는 항체 단편이 본 발명에 포함된다(예를 들어, 문헌[Colligan, Immunology, 상기 문헌] 참조).

그러한 단편은 본 기술 분야에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 천연 정지 부위의 상류에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단 형태로 생산될 수 있다. 예를 들어, 중쇄의 CH₁ 도메인 및/또는 힌지 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하도록, F(ab')₂ 중쇄 부분을 암호화하는 조합 유전자를 설계할 수 있다. 항체의 다양한 부분은 통상의 기술에 의해 화학적으로 함께 연결될 수 있거나, 유전 공학 기술을 사용하여 연속 단백질로서 제조될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 단백질의 실질적으로 모든 부분(예를 들어, CDR, 프레임워크, C_L, C_H 도메인(예를 들어, C_H1, C_H2, 및 C_H3), 힌지,(V_L, V_H))이, 단지 사소한 서열 변화 또는 변형만을 가지면서, 인간에서 실질적으로 비면역원성인 항체를 지칭한다. 유사하게, 영장류(원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류(마우스, 쥐, 토끼, 기니 피그, 햄스터 등), 및 다른 포유류로 지정된 항체는 그러한 종, 아속, 속, 아과, 과 특이적 항체를 지정한다. 추가로, 키메라 항체는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 변화 또는 변이는 선택적으로 그리고 바람직하게는, 변형되지 않은 항체에 비해 인간 또는 다른 종에서의 면역원성을 유지시키거나 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다. 인간 항체는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비인간 동물 또는 원핵 또는 진핵세포에 의해 생성될 수 있다는 점이 주목된다. 또한, 인간 항체가 단일쇄 항체일 때, 인간 항체는 천연 인간 항체에서는 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러한 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 간주된다.

2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체인 이중특이성(bispecific), 예를 들어, 듀오바디(DuoBody)® (이중특이성 항체), 이종특이성(heterospecific), 이형접합성(heteroconjugate) 또는 유사 항체 또한 사용할 수 있다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 하나 이상의 TNF 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 본 기술 분야에 알려져 있다. 통상적으로, 이중특이성 항체의 재조합 생성은 2개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현에 기초한다(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305:537(1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이러한 하이브리도마(콰드로마(quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성한다. 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 통상 수행되는 정확한 분자의 정제는 낮은 생성물 수율로 번거로울 수 있으며, 이중특이성 항체 생산을 용이하게 하기 위해 상이한 전략이 개발되어 왔다.

전장 이중특이성 항체는, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이에서의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있는데, 이는 공발현을 사용하거나 또는 무세포 환경에서의 시험관내에서, 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입하여 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 이종이량체 형성을 유리하게 함으로써 행해진다. Fab 아암 교환 반응은 이황화-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은, 각각이 별개의 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 이중특이성 항체이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

"노브-인-홀(knob-in-hole)" 전략(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2006/028936호 참조)이 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 간략하게 말해서, 인간 IgG 내에 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이화되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 다음과 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.

하나의 CH3 표면에서 양성 하전된 잔기 및 제2의 CH3 표면에서 음성 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 US2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 US2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 US2010/028637호 또는 미국 특허 출원 공개 US2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같이 하기의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.

전술된 방법에 더하여, 이중특이성 항체는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 상기 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체 및 제2 단일특이성 2가 항체는 이종이량체 안정성을 촉진하는 CH3 도메인에서의 소정 치환을 갖도록 조작되며; 항체는 힌지 영역의 시스테인이 다이설파이드 결합 이성질화를 거치기에 충분한 환원 조건 하에서 함께 인큐베이션되어; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항-TNF 항체(TNF 항체로도 칭함)는 임의로 TNF에 대한 고친화도 결합 및 바람직하게는 임의로 낮은 독성 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 개별 성분, 예를 들어 가변 영역, 불변 영역 및 프레임워크가 개별적으로 및/또는 공동으로, 선택적으로 그리고 바람직하게는 낮은 면역원성을 갖는 본 발명의 항체, 특정 단편 또는 변이체가 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 항체는 선택적으로 측정가능한 정도로 증상을 완화하고, 낮고/낮거나 허용가능한 독성을 보이면서 장기간 동안 환자를 치료할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 낮거나 허용가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도뿐만 아니라 다른 적합한 특성이 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다. 본 명세서에서 "낮은 면역원성"은 치료한 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만에서 유의한 HAHA, HACA, 또는 HAMA 반응을 야기하고/하거나 치료한 환자에서 낮은 역가(이중 항원 효소 면역검정으로 측정할 때, 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만)를 야기하는 것으로서 정의된다 (전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Elliott et al., Lancet 344:1125-1127 (1994)]).

유용성: 본 발명의 단리된 핵산은, 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성, 및/또는 신경 장애 또는 질환 중 하나 이상으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 TNF 병태를 진단, 모니터링, 조절, 치료, 완화시키거나, 그의 발병의 예방을 돕거나, 그의 증상을 감소시키기 위해 세포, 조직, 기관, 또는 동물(포유류 및 인간을 포함함)에서 측정하거나 작용하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 항-TNF 항체 또는 이의 특정 변이체의 생산을 위해 사용될 수 있다.

그러한 방법은 증상, 효과, 또는 기전의 그러한 조절, 치료, 완화, 예방, 또는 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유효량은 본 명세서에 기재되거나 관련 기술 분야에 알려진 바와 같이 알려진 방법을 사용하여 실행되고 결정될 때, 단일(예를 들어, 볼루스), 다중, 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 500 mg/㎏의 양, 또는 단일, 다중, 또는 연속 투여당 0.01 내지 5000 ㎍/ml의 혈청 농도를 달성하는 양, 또는 그 안의 임의의 유효 범위 또는 값을 포함할 수 있다. 인용. 본 명세서에 인용된 모든 간행물 또는 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되며, 이는 그들이 본 발명의 시점에서의 최신의 기술을 나타내고/나타내거나 본 발명의 설명 및 실시가능성을 제공하기 때문이다. 간행물은 임의의 학술 간행물 또는 특허 간행물, 또는 모든 기록 형식, 전자 형식 또는 인쇄 형식을 포함하는 임의의 매체 형식으로 이용가능한 또 다른 정보를 가리킨다. 하기 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다: 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)].

본 발명의 항체: 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역의 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역의 전부를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 항-TNF 항체는 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포, 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 임의로 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조하며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

단리되고/되거나 TNF 단백질 또는 이의 부분과 같은 적절한 면역원성 항원(합성 펩티드와 같은 합성 분자를 포함함)에 대해 인간 TNF 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 인간 항체를 발생시킬 수 있다. 다른 특이적 또는 일반적 포유류 항체를 유사하게 발생시킬 수 있다. 면역원성 항원의 제조 및 단일클론 항체 생성은 임의의 적합한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.

하나의 접근법에서는, 적합한 불멸 세포주(immortal cell line), 예를 들어, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등과 같으나 이에 한정되지 않는 골수종 세포주, 또는 이종골수종(heteromyloma), 이의 융합 생성물, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 본 기술 분야에 알려진 임의의 다른 적합한 세포주를 융합함으로써 하이브리도마가 생성된다. 단리되거나 클로닝된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도선, 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포와 같으나 이에 한정되지 않는 항체 생산 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 내인성 또는 이종성 핵산으로서, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵생물, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유류, 설치류, 말류, 양류, 염소, 양, 영장류, 진핵생물, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중, 또는 삼중 가닥, 혼성화 등 또는 이들의 임의의 조합으로서 발현하는 임의의 다른 세포에 대해서는, 예를 들어, 문헌[www.atcc.org], 문헌[www.lifetech.com.] 등을 참조한다. 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 문헌[Ausubel, 상기 문헌] 및 문헌[Colligan, Immunology, 상기 문헌, 챕터 2]을 참조한다.

항체 생산 세포는 또한 관심의 대상이 되는 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초혈, 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻을 수 있다. 임의의 다른 적합한 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 항체, 이의 특정 단편 또는 변이체를 인코딩하는 이종 또는 내인성 핵산을 또한 발현할 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 공지 방법을 사용하여 단리될 수 있고, 제한 희석 또는 세포 분류, 또는 다른 공지의 방법에 의해 클로닝될 수 있다. 원하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 세포를 적합한 검정(예를 들어, ELISA)에 의해 선별할 수 있다.

필요한 특이성의 항체를 생성하거나 단리하는 다른 적합한 방법이 사용될 수 있으며, 이는 펩티드 또는 단백질 라이브러리(이에 한정되지 않지만, 예를 들어 박테리오파지, 리보솜, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA 등, 디스플레이 라이브러리; 예를 들어, 영국 캠브리지셔 소재의 Cambridge antibody Technologies; 독일 마르틴스레이드/플라네그 소재의 MorphoSys; 영국 스코틀랜드 아버딘 소재의 Biovation; 스웨덴 룬드 소재의 BioInvent; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; 캘리포니아주 버클리 소재의 Xoma; Ixsys로부터 입수가능 함. 예를 들어, EP 368,684호, PCT/GB91/01134호; PCT/GB92/01755호; PCT/GB92/002240호; PCT/GB92/00883호; PCT/GB93/00605호; US 08/350260(5/12/94)호; PCT/GB94/01422호; PCT/GB94/02662호; PCT/GB97/01835호 (CAT/MRC); WO90/14443호; WO90/14424호; WO90/14430호; PCT/US94/1234호; WO92/18619호; WO96/07754호 (Scripps); EP 614 989(MorphoSys); WO95/16027호(BioInvent); WO88/06630호; WO90/3809호(Dyax); US 4,704,692호(Enzon); PCT/US91/02989호(Affymax); WO89/06283호; EP 371 998호; EP 550 400호 (Xoma); EP 229 046호; PCT/US91/07149호(Ixsys)를 참조함; 또는 추계적으로 생성된 펩티드 또는 단백질 - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689(Ixsys, 현 Applied Molecular Evolution(AME), 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨))로부터 재조합 항체를 선택하는 방법, 또는 본 기술 분야에 알려지고/알려지거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, SCID 마우스, 문헌[Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997)]; 문헌[Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996)]; 문헌[Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998)], 관련 특허 및 출원과 더불어 각각 전체적으로 참고로 포함됨)의 면역화에 의존하는 방법을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 기법은 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997)]; 문헌[Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)]); 단일 세포 항체 생성 기술(예를 들어, 선택된 림프구 항체 방법("SLAM")(미국 특허 제5,627,052호, 문헌[Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987)]; 문헌[Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)]); 겔 마이크로소적 및 유세포측정(문헌[Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990)]; 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 One Cell Systems; 문헌[Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995)]; 문헌[Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)]); B-세포 선택(문헌[Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994)]; 문헌[Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)])을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

또한, 비인간 또는 인간 항체를 유전자 조작하거나 인간화하는 방법이 사용될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화되거나 조작된 항체는 마우스, 쥐, 토끼, 인간외 영장류 또는 다른 포유류와 같으나 이에 한정되지 않는 인간외 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 알려진 인간 서열의 "도입" 가변, 불변, 또는 다른 도메인으로부터 취해진다.

공지된 인간 Ig 서열은 다수의 간행물 및 웹사이트, 예를 들어,

www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;

www. atcc.org/phage/hdb.html;

www. sciquest.com/;

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www. Patents.ibm.com/ibm.html. 문헌[Kabat et al.,

Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)]에 개시되어 있으며, 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

이러한 유입된 서열은 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화도, 결합 속도(on-rate), 해리 속도(off-rate), 결합력(avidity), 특이성, 반감기, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 적합한 특성을 감소시키거나, 향상시키거나, 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 인간외 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부가 유지되는 반면에, 가변 및 불변 영역의 인간외 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체된다. 항체는 또한 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 선택적으로 인간화될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간화 항체는 모(parental) 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적(conceptual) 인간화 생성물을 분석하는 과정에 의해 임의로 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이에 대한 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서의 잔기의 가능성이 있는 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원과 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가가 달성되도록 공통 서열 및 도입 서열로부터 FR 잔기가 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 준다. 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Winter](문헌[Jones et al., Nature 321:522 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)]), 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)]; 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)], 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)]; 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 제5723323호, 제5976862호, 제5824514호, 제5817483호, 제5814476호, 제5763192호, 제5723323호, 제5,766886호, 제5714352호, 제6204023호, 제6180370호, 제5693762호, 제5530101호, 제5585089호, 제5225539호; 제4816567호, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, 그 안에 인용된 참고문헌에 기재된 것들과 같지만 이로 한정되지 않는 임의의 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 항체의 인간화 또는 유전자 조작을 수행할 수 있다.

또한 임의로 항-TNF 항체는 본 명세서에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스, 쥐, 햄스터, 인간외 영장류 등)의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법과 같은 적합한 방법을 사용하여, 인간 항-TNF 항체를 생산하는 세포를 그러한 동물로부터 단리하고 불멸화할 수 있다.

인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 마우스는 알려진 방법(비제한적인 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, Lonberg 등에게 허여된 미국 특허 제5,770,428호, 제5,569,825호, 제5,545,806호, 제5,625,126호, 제5,625,825호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 및 제5,789,650호; Jakobovits 등의 WO 98/50433, Jakobovits 등의 WO 98/24893, Lonberg 등의 WO 98/24884, Lonberg 등의 WO 97/13852, Lonberg 등의 WO 94/25585, Kucherlapate 등의 WO 96/34096, Kucherlapate 등의 EP 0463 151 B1, Kucherlapate 등의 EP 0710 719 A1, Surani 등의 미국 특허 제5,545,807호, Bruggemann 등의 WO 90/04036, Bruggemann 등의 EP 0438 474 B1, Lonberg 등의 EP 0814 259 A2, Lonberg 등의 GB 2 272 440 A, 문헌[Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994)], 문헌[Taylor et al., Int . Immunol . 6(4)579-591 (1994)], 문헌[Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994)], 문헌[Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)], 문헌[Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992)], 문헌[Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993)], 문헌[Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995)], 및 문헌[Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851(1996)])에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 마우스는 기능적으로 재배열되거나, 기능적으로 재배열될 수 있는 하나 이상의 인간 면역글로불린 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 하나 이상의 도입유전자를 포함한다. 상기 마우스에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실되어, 내인성 유전자에 의해 인코딩되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거할 수 있다.

통상적으로 펩티드 디스플레이 라이브러리를 사용하여 유사한 단백질 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법은 원하는 기능 또는 구조를 갖는 개별 구성원에 대한 펩티드의 큰 집합의 스크리닝을 포함한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 디스플레이된 펩티드 서열의 길이는 3 내지 5000개 이상의 아미노산, 종종 5 내지 100개의 아미노산, 종종 약 8 내지 25개의 아미노산일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 직접적인 화학적 합성 방법 외에도, 여러 가지 재조합 DNA 방법이 기재되어 있다. 하나의 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에 펩티드 서열을 디스플레이하는 것을 포함한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 방법이 PCT 특허 공개 91/17271호, 91/18980호, 91/19818호 및 93/08278호에 기재되어 있다. 펩티드의 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 시험관내에서의 화학적 합성 및 재조합 방법 모두의 태양을 포함한다. PCT 특허 공개 92/05258호, 92/14843호 및 96/19256호를 참조한다. 또한 미국 특허 제5,658,754호; 및 제5,643,768호를 참조한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터 및 스크리닝 키트는 Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드) 및 Cambridge antibody Technologies(영국 캠브리지셔)와 같은 공급원으로부터 구매가능하다. 예를 들어, Enzon에 양도된 미국 특허 제4704692호, 제4939666호, 제4946778호, 제5260203호, 제5455030호, 제5518889호, 제5534621호, 제5656730호, 제5763733호, 제5767260호 및 제5856456호; Dyax에 양도된 제5223409호, 제5403484호, 제5571698호, 제5837500호, Affymax에 양도된 제5427908호, 제5580717호; Cambridge antibody Technologies에 양도된 제5885793호; Genentech에 양도된 제5750373호, Xoma, Colligan에 양도된 제5618920호, 제5595898호, 제5576195호, 제5698435호, 제5693493호, 제5698417호, 상기 문헌; 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조하며, 상기 특허 및 간행물 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 항체는 또한, 우유 내에 그러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물 또는 포유류, 예컨대 염소, 소, 말, 양 등을 제공하기 위한 하나 이상의 항-TNF 항체를 암호화하는 핵산을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 알려진 방법을 사용하여 제공할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,827,690호; 제5,849,992호; 제4,873,316호; 제5,849,992호; 제5,994,616호; 제5,565,362호; 제5,304,489호 등을 참조하지만, 이로 한정되지 않으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

식물 부분, 또는 그로부터 배양된 세포에서 그러한 항체, 특정 부분, 또는 변이체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포(비제한적인 예를 들어, 담배 및 옥수수)를 제공하기 위한 하나 이상의 항-TNF 항체를 암호화하는 핵산을 사용하여 본 발명의 항체를 추가로 제조할 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 유전자도입 담배 잎이, 예를 들어 유도성 프로모터를 사용하여 다량의 재조합 단백질을 제공하는 데 성공적으로 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 또한, 유전자도입 옥수수는 다른 재조합 시스템에서 생성되거나, 천연 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성으로, 상업 생산 수준으로 포유류 단백질을 발현하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌[Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 담배 종자 및 감자 덩이줄기를 포함하는, 항체 단편, 예컨대 단일쇄 항체(scFv)를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자로부터 항체가 또한 다량으로 생산되었다. 예를 들어, 문헌[Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 알려진 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999)], 문헌[Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995)]; 문헌[Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995)]; 문헌[Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994)]; 및 그 안에 인용된 참고문헌을 또한 참조한다. 또한, 일반적으로 항체의 식물 발현에 대해서는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 상기 참고문헌 각각을 참조하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 광범위한 친화도(K_D)로 인간 TNF에 결합할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 인간 mAb는 임의로 높은 친화도로 인간 TNF에 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 mAb는 약 10^-7 M 이하, 비제한적인 예로서 0.1 내지 9.9(또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) X 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 K_D로 인간 TNF에 결합할 수 있다.

항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY(1984)]; 문헌[Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY(1992)]; 및 본 명세서에 기재된 방법을 참조한다). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 파라미터(예를 들어, K_D, K_a, K_d)의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 행해진다.

핵산 분자. 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 중 하나 이상의 연속 아미노산의 70 내지 100% 이상을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 이의 특정 단편, 변이체, 또는 공통 서열, 또는 이들 서열 중 하나 이상을 포함하는 기탁된 벡터와 같은 본 명세서에 제공된 정보를 사용하여, 서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역의 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역의 전부를 포함하는 하나 이상의 항-TNF 항체를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 본 명세서에 기재되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같은 방법을 사용하여 얻을 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 RNA 형태, 예를 들어 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태 또는 cDNA 및 클로닝에 의해 얻어지거나 합성에 의해 생성된 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 삼중가닥, 이중가닥 또는 단일가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 한 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나, 안티-센스 가닥으로도 언급되는 비코딩 가닥일 수 있다.

본 발명의 단리된 핵산 분자는, 임의로 하나 이상의 인트론을 갖는 개방 해독틀(ORF: open reading frame)을 포함하는 핵산 분자, 비제한적인 예를 들어, 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 특정 부분, 예컨대 하나 이상의 중쇄(예를 들어, 서열 번호 1 내지 3) 또는 경쇄(예를 들어, 서열 번호 4 내지 6)의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함하는 핵산 분자; 항-TNF 항체 또는 가변 영역(예를 들어, 서열 번호 7, 8)에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기 기재된 것들과는 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 본 명세서에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같은 하나 이상의 항-TNF 항체를 여전히 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전 코드는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 항-TNF 항체를 코딩하는 그러한 축퇴 핵산 변이체를 생성하는 것은 당업자에게 일상적일 것이다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al. 상기 문헌]을 참조하며, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 단리된 핵산 분자의 비제한적인 예는 각각 HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC 가변 영역 및 LC 가변 영역을 암호화하는 핵산의 비제한적인 예에 상응하는 서열 번호 10, 11, 12, 13, 14, 15를 포함한다.

본 명세서에 나타낸 바와 같이 항-TNF 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는, 그 자체로 항체 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것들; 전체 항체 또는 이의 일부에 대한 코딩 서열; 항체, 단편, 또는 부분에 대한 코딩 서열과 더불어, 추가의 서열, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, mRNA의 리보솜 결합 및 안정성)를 포함하는, 전사, mRNA 프로세싱에서 역할을 담당하는 전사되고 번역되지 않는 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 추가의 비-코딩 서열과 함께, 하나 이상의 인트론과 같은, 전술한 추가의 코딩 서열이 있거나 없는, 하나 이상의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열; 추가의 작용기를 제공하는 것들과 같은, 추가의 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 항체를 인코딩하는 서열은 항체 단편 또는 일부를 포함하는 융합된 항체의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 인코딩하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드. 본 발명은 선택적인 혼성화 조건 하에 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 이러한 실시 형태의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리하고/하거나, 검출하고/하거나, 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리에서 부분 또는 전장의 클론을 동정하거나, 단리하거나, 증폭하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 cDNA 서열 또는 게놈이거나, 그렇지 않으면 인간 또는 포유류의 핵산 라이브러리로부터의 cDNA에 상보성이다.

바람직하게는, cDNA 라이브러리는 80% 이상의 전장 서열, 바람직하게는 85% 또는 90% 이상의 전장 서열, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 제시를 증가시키도록 정규화될 수 있다. 낮거나 중등의 엄격성 혼성화 조건은 전형적이지만 비배타적으로, 상보성 서열에 비해 감소된 서열 동일성을 갖는 서열과 함께 사용된다. 중등 및 높은 엄격성 조건은 동일성이 더 큰 서열에 대해 선택적으로 사용될 수 있다. 낮은 엄격성 조건은 약 70%의 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적인 혼성화를 허용하고 동원성(orthologous) 또는 이원성(paralogous) 서열을 확인하는 데 사용될 수 있다.

임의로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 항체의 적어도 일부를 암호화할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 선택적 혼성화에 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 문헌[Colligan, 상기 문헌]을 참조한다.

핵산의 작제 . 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산은 (a) 재조합 방법; (b) 합성 기술; (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조할 수 있다.

핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 외에도 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위는 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 배제한 본 발명의 핵산은 임의로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.

추가의 서열은 클로닝 및/또는 발현에서 이들의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나, 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 개선하기 위해 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다).

핵산 작제를 위한 재조합 방법. 당업자에게 알려진 임의의 수의 클로닝 방법을 사용하여 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 본 발명의 단리된 핵산 조성물을 생물학적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 엄격한 조건 하에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 확인하기 위해 사용된다. RNA의 단리, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 작제는 당업자에게 잘 알려져 있다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다).

핵산 스크리닝 및 단리 방법. 본 명세서에 개시된 것들과 같은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 프로브를 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여, 동일하거나 상이한 유기체 내의 상동 유전자를 단리하는 데 사용할 수 있다. 다양한 정도의 혼성화 엄격성이 분석에 사용될 수 있으며; 혼성화 배지 또는 세정 배지가 엄격할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 혼성화 조건이 더 엄격해지면, 이중체(duplex)를 형성하기 위해 프로브와 표적 사이의 상보성 정도가 더 커야 한다. 엄격성 정도는 온도, 이온 강도, pH, 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 엄격성은 예를 들어, 포름아미드 농도를 0% 내지 50%의 범위 내에서 조정하여, 반응 용액의 극성을 변경하여 편리하게 변동된다. 검출가능한 결합에 필요한 상보성 정도(서열 동일성)는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성에 따라 변동될 것이다. 상보성 정도는 최적으로 100%, 또는 70 내지 100%, 또는 상기 범위 내의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머에서의 작은 서열 변화는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성을 감소시켜 보상될 수 있음을 이해해야 한다.

RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있고, 과도한 실험을 실시하지 않으면서, 본 명세서에 제시된 교시 및 지침을 기초로 하여 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

알려진 DNA 또는 RNA 증폭 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 과정(예를 들어, Mullis 등의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호; Tabor 등의 제4,795,699호 및 제4,921,794호; Innis의 제5,142,033호; Wilson 등의 제5,122,464호; Innis의 제5,091,310호; Gyllensten 등의 제5,066,584호; Gelfand 등의 제4,889,818호; Silver 등의 제4,994,370호; Biswas의 제4,766,067호; Ringold의 제4,656,134호 참조) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭(Malek등의 미국 특허 제5,130,238호, 상표명 NASBA)을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이들 참고문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌]; 또는 문헌[Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다)

예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 관련 유전자의 서열을 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 증폭할 수 있다. 또한, PCR 및 다른 시험관내 증폭 방법은, 예를 들어 발현되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하고, 샘플 내의 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하는 핵산을 제조하거나, 핵산 서열분석 또는 기타 목적에 유용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자를 지도하기에 충분한 기술의 예는 문헌[Berger, 상기 문헌], 문헌[Sambrook, 상기 문헌], 및 문헌[Ausubel, 상기 문헌]뿐만 아니라 Mullis 등의 미국 특허 제4,683,202호(1987); 및 문헌[Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA(1990)]에서 확인된다. 게놈 PCR 증폭을 위한 구매가능한 키트가 본 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)를 참조한다. 추가로, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)은 긴 PCR 생성물의 수율을 개선하기 위해 사용될 수 있다.

핵산 작제를 위한 합성 방법. 본 발명의 단리된 핵산은 또한 알려진 방법에 의해 직접 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, 등, 상기 문헌] 참조). 화학적 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하는데, 이는 상보성 서열과의 혼성화에 의해 또는 단일 가닥을 주형으로서 사용하여 DNA 폴리머라제에 의한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자라면 DNA의 화학적 합성이 약 100개 이상의 염기의 서열로 제한될 수 있는 반면, 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 라이게이션에 의해 얻어질 수 있음을 인식할 것이다.

재조합 발현 카세트. 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 항체를 암호화하는 cDNA 또는 게놈 서열을 사용하여 하나 이상의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 작제할 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도되는 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도할 전사 개시 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 본 발명의 핵산의 발현을 유도하기 위해 이종성 및 비-이종성(즉, 내인성) 프로모터 둘 모두를 사용할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 요소로서의 역할을 하는 단리된 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향조절 또는 하향조절하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비-이종성 형태의 적절한 위치(상류, 하류 또는 인트론 내)에 도입될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체내(in vivo)에서 또는 시험관내(in vitro)에서 변경될 수 있다.

벡터 및 숙주 세포. 본 발명은 또한, 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 하나 이상의 항-TNF 항체의 생산에 관한 것이다 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Sambrook, et al., 상기 문헌]; 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌]을 참조한다.

폴리뉴클레오티드는 숙주 내에서의 증식을 위해 선택가능한 마커를 함유하는 벡터에 선택적으로 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를 들어 인산칼슘 침전물 내에, 또는 하전된 지질과의 복합체 내에 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 적합한 패키징(packaging) 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키징된 후, 숙주 세포 내로 형질도입될 수 있다.

DNA 삽입물은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 발현 구조물은 전사 개시를 위한 부위, 종결을 위한 부위 및 전사된 영역에서 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 시작점에 있는 번역 개시 부위 및 번역될 mRNA의 말단에 적절하게 위치한 종결 코돈(예를 들어, UAA, UGA, 또는 UAG)을 포함할 것이며, 포유류 또는 진핵 세포 발현에는 UAA 및 UAG가 바람직하다.

발현 벡터는 바람직하게, 그러나 선택적으로 하나 이상의 선택가능한 마커를 포함할 것이다. 그러한 마커는, 예를 들어, 진핵 세포 배양을 위한 메토트렉세이트(MTX), 다이하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호; 제4,656,134호; 제4,956,288호; 제5,149,636호; 제5,179,017호, 암피실린, 네오마이신(G418), 마이코페놀산, 또는 글루타민 신테타제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호) 저항성 유전자, 및 E. 콜라이(E. coli) 및 다른 박테리아 또는 원핵세포에서의 배양을 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 저항성 유전자를 포함하지만 이로 한정되지 않는다(상기 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 상술한 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건이 당업계에 알려져 있다. 적절한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다. 숙주 세포 내로의 벡터 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Sambrook, 상기 문헌, 챕터 1-4 및 16-18]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, 챕터 1, 9, 13, 15, 16]과 같이 당업계에 기재되어 있다.

본 발명의 하나 이상의 항체는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가의 이종성 기능성 영역 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 정제 동안, 또는 후속 취급 및 저장 동안 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 개선시키기 위해 항체의 N-말단에 부가될 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티가 정제를 용이하게 하기 위해 본 발명의 항체에 부가될 수 있다. 이러한 영역은 항체 또는 적어도 하나의 이의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌[Sambrook, 상기 문헌, 챕터 17.29-17.42 및 18.1-18.74]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, 챕터 16, 17, 및 18]에 기재되어 있다.

당업자는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산의 발현에 이용가능한 많은 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다.

대안적으로, 본 발명의 핵산은 본 발명의 항체를 암호화하는 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의한) 턴온(turn on)에 의해 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호 및 제5,733,761호에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 알려져 있다.

항체, 이의 특정 부분 또는 변이체의 생성에 유용한 세포 배양물의 예는 포유류 세포이다. 포유류 세포 시스템은 종종 세포의 단일층 형태로 존재할 수 있지만, 포유류 세포 현탁액 또는 생물반응기도 사용될 수 있다. 온전한 글리코실화 단백질을 발현할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있고, COS-1(예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들어, ATCC CRL1651), HEK293, BHK21(예를 들어, ATCC CRL-10), CHO(예를 들어, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들어, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들은, 예를 들어 미국 버지니아주 매나서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 용이하게 입수가능하다. 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포 및 림프구 기원의 세포, 예컨대 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포, P3X63Ag8.653 세포(ATCC 기탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 기탁 번호 CRL-1851)이다.

이들 세포에 대한 발현 벡터는 하기 발현 제어 서열 중 하나 이상, 비제한적인 예로서 복제 기원; 프로모터(예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 하나 이상의 인간 면역글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40 라지 T Ag 폴리 A 부가 부위), 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., 상기 문헌]; 문헌[Sambrook, et al., 상기 문헌]을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질 생성에 유용한 다른 세포가 알려져 있고/있거나, 예를 들어 세포주 및 하이브리도마의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 카탈로그 또는 다른 공지의 또는 상업 공급원으로부터 이용가능하다.

진핵 숙주 세포가 사용될 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열은 전형적으로 벡터에 통합된다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사물의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40으로부터의 VP1 인트론이다(문헌[Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)]). 추가로, 당업계에 알려진 바와 같이, 숙주 세포 내의 복제를 조절하는 유전자 서열은 벡터 내로 도입될 수 있다.

항체의 정제. 항-TNF 항체는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")도 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology] 또는 문헌[Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조한다.

본 발명의 항체는 천연 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충, 및 포유류 세포를 포함하는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생성된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있으며, 글리코실화가 바람직하다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌[Sambrook, 상기 문헌]; 문헌[Ausubel, 상기 문헌, 챕터 10, 12, 13, 16, 18, 및 20], 문헌[Colligan, Protein Science, 상기 문헌, 챕터 12-14]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

예시적인 항-TNF 항체

서열 번호 1, 2, 및 3의 중쇄 가변 CDR 영역의 전부 및/또는 서열 번호 4, 5, 및 6의 경쇄 가변 CDR 영역의 전부를 포함하는 본 발명의 단리된 항체는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 본 명세서에 개시된 항체 아미노산 서열, 또는 임의의 단리되거나 제조된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 TNF에 결합함으로써 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 실질적으로 중화시킨다. 하나 이상의 TNF 단백질 또는 단편의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 바람직하게는 실질적으로 중화시키는 항체, 이의 특정 부분, 또는 변이체는 단백질 또는 단편에 결합함으로써 TNF 수용체에 대한 TNF의 결합을 통해 또는 다른 TNF-의존성 또는 TNF-매개 기전을 통해 매개되는 활성을 억제할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중화 항체"는 TNF-의존성 활성을 검정에 따라 약 20 내지 120% 만큼, 바람직하게는 약 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 이상 만큼 억제할 수 있는 항체를 지칭한다. TNF-의존성 활성을 억제하는 항-TNF 항체의 능력은 바람직하게는 본 명세서에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 하나 이상의 적합한 TNF 단백질 또는 수용체 검정에 의해 평가된다. 본 발명의 인간 항체는 임의의 부류(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등) 또는 동종형일 수 있으며, 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 인간 항체는 IgG 중쇄 또는 정의된 단편, 예를 들어, 동종형, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 하나 이상을 포함한다. 본 명세서에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 하나 이상의 인간 경쇄(예를 들어, IgG, IgA() 및 IgM (예를 들어, γ1,γ2, γ3, γ4) 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스 또는 다른 트랜스제닉 인간외 포유류를 사용함으로써 이러한 유형의 항체가 제조될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 항-인간 TNF 인간 항체는 IgG1 중쇄 및 IgG1 경쇄를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "항체들"은 BPCI Act(Biologics Price Competition and Innovation Act of 2009) 및 전세계적으로 유사한 법칙 및 규제 하에서 승인된 바이오시밀러(biosimilar) 항체 분자를 포함한다. BPCI Act 하에서는, 데이터가, 임상적으로 불활성인 성분에 있어서의 미미한 차이에도 불구하고, 항체가 참조 제품과 "고도로 유사하다"는 것을 보여주고, 안전성, 순도 및 효력의 관점에서 참조 제품과 동일한 임상 결과를 생성할 것으로 "예상되는" 경우에 그러한 항체는 바이오시밀러인 것으로 입증될 수 있다(문헌[Endocrine Practice: February 2018, Vol. 24, No. 2, pp. 195-204]). 이들 바이오시밀러 항체 분자는 단축된 승인 경로로 제공되며, 그럼으로써 본 출원인은 규제 승인을 확보하기 위하여 이노베이터 참조 제품의 임상 데이터에 의존한다. 성공적인 임상 시험에 기초하여 FDA 승인된 원래의 이노베이터 참조 항체와 대비하여, 바이오시밀러 항체 분자는 본 명세서에서 "후속 생물학적 제제(follow-on biologic)"로 지칭된다. 본 명세서에 제시된 바와 같이, SIMPONI®(골리무맙)는 성공적인 임상 시험에 기초하여 FDA 승인된 오리지널 이노베이터 참조 항-TNF 항체이다. 골리무맙은 2009년 이래로 미국에서 판매되어 왔다.

예시적인 서열

다양한 실시 형태에서, TNF 억제제는 항-TNF 항체 SIMPONI®(골리무맙), 또는 하기에 나타낸 서열을 포함하는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항-TNF 항체 SIMPONI®(골리무맙) 및 다른 항-TNF 항체에 대한 더 많은 정보에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제7,250,165호; 제7,691,378호; 제7,521,206호; 제7,815,909호; 제7,820,169호; 제8,241,899호; 제8,603,778호; 제9,321,836호; 및 제9,828,424호를 참조한다.

예시적인 항-TNF 항체 서열, 예를 들어, SIMPONI®(골리무맙)

중쇄 CDR(HCDR) 및 경쇄 CDR(LCDR)은 카바트에 의해 정의된다.

CDR이 밑줄 쳐져 있는 골리무맙 중쇄(HC)의 아미노산 서열: (서열 번호 36)

CDR이 밑줄 쳐져 있는 골리무맙 경쇄(LC)의 아미노산 서열: (서열 번호 37)

CDR이 밑줄 쳐져 있는 골리무맙 가변 중쇄(VH)의 아미노산 서열: (서열 번호 38)

CDR이 밑줄 쳐져 있는 골리무맙 가변 경쇄(VL)의 아미노산 서열: (서열 번호 39)

골리무맙 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1)의 아미노산 서열: (서열 번호 40)

골리무맙 항체 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2)의 아미노산 서열: (서열 번호 41)

골리무맙 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3)의 아미노산 서열: (서열 번호 42)

골리무맙 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1)의 아미노산 서열: (서열 번호 43)

골리무맙 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2)의 아미노산 서열: (서열 번호 44)

골리무맙 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDRL)의 아미노산 서열: (서열 번호 45)

본 발명의 하나 이상의 항체는 하나 이상의 TNF 단백질, 서브유닛, 단편, 부분, 또는 이들의 임의의 조합에 특이적인 하나 이상의 특정 에피토프에 결합한다. 하나 이상의 에피토프는 상기 단백질의 하나 이상의 부분을 포함하는 하나 이상의 항체 결합 영역을 포함하고, 에피토프는 바람직하게는 상기 단백질의 하나 이상의 세포외, 가용성, 친수성, 외부, 또는 세포질 부분으로 이루어진다. 하나 이상의 특정 에피토프는 서열 번호 9의 연속 아미노산의 전체 특정 부분에 대한 1 내지 3개 이상의 아미노산 중 하나 이상의 아미노산 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3) 또는 변이체 및 하나 이상의 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 인간 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3) 또는 변이체를 포함하는 항원-결합 영역을 포함할 것이다. 비제한적인 예로서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 및/또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 상응하는 CDR 1, 2, 및/또는 3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 1, 2, 및/또는 3)을 갖는 하나 이상의 중쇄 CDR(즉, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 상응하는 CDR 1, 2, 및/또는 3의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 4, 5, 및/또는 6)을 갖는 하나 이상의 경쇄 CDR(즉, CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR은 본 명세서에 기재된 바와 같은 mAb TNV148, TNV14, TNV15, TNV196, TNV118, TNV32, TNV86 중 하나 이상의 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 갖는다. 그러한 항체는, 종래의 기법을 사용하여 항체의 다양한 부분들(예를 들어, CDR, 프레임워크)을 함께 화학적으로 연결하거나, 재조합 DNA 기술의 종래 기법을 사용하여 항체를 인코딩하는(하나 이상의) 핵산 분자를 제조하고 발현시키거나, 임의의 다른 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

항-TNF 항체는 정의된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시 형태에서, 항-TNF 항체는 임의로 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 임의로 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 중 하나 이상을 포함한다. 파지 디스플레이와 같은 적합한 방법(문헌[Katsube, Y., et al., Int J Mol. Med, 1(5):863-868 (1998)]) 또는 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자도입 동물을 사용하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 트랜스유전자 및 기능적으로 재배열될 수 있는 인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터의 DNA를 포함하는 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 인간 TNF 또는 이의 단편으로 면역화하여 항체의 생산을 유도할 수 있다. 필요한 경우, 항체 생성 세포가 단리될 수 있고, 하이브리도마 또는 다른 불멸화 항체-생성 세포는 본 명세서에 기재된 및/또는 당업계에 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체, 특정 부분 또는 변이체는 적합한 숙주 세포에서 코딩 핵산 또는 이의 일부를 사용하여 발현될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열의 아미노산을 포함하는 항체, 항원-결합 단편, 면역글로불린 사슬 및 CDR에 관한 것이다. 바람직하게는, 그러한 항체 또는 항원-결합 단편 및 그러한 사슬 또는 CDR을 포함하는 항체는 높은 친화도(예를 들어, 약 10^-9 M 이하의 K_D)로 인간 TNF에 결합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환 및 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산의 것들과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성(예를 들어, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 제2 아미노산에 의한 제1 아미노산의 대체를 지칭한다. 보존적 치환은 하기 군 내의 하나의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 대체를 포함한다: 라이신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 아이소류신(I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C) 및 글리신(G); F, W 및 Y; C, S 및 T.

아미노산 코드. 본 발명의 항-TNF 항체를 구성하는 아미노산은 종종 약어로 표시된다. 아미노산 표기는 본 기술 분야에서 잘 이해되는 바와 같이 아미노산을 이의 1-문자 코드, 이의 3-문자 코드, 명칭, 또는 3 뉴클레오티드 코돈(들)에 의해 지정함으로써 표시될 수 있다(문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994] 참조):

본 명세서에 특정된 바와 같이, 본 발명의 항-TNF 항체는 천연 돌연변이 또는 인간에 의한 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 포함할 수 있다.

물론, 당업자가 실행할 아미노산 치환의 수는 상기 기재된 것들을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라진다. 일반적으로 말하면, 임의의 주어진 항-TNF 항체, 단편, 또는 변이체에 대한 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실의 수는 본 명세서에 특정된 바와 같이 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 이하, 예컨대 1 내지 30개 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값일 것이다.

기능에 필수적인 본 발명의 항-TNF 항체 내의 아미노산을 본 기술 분야에 알려진 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Ausubel, 상기 문헌, 챕터 8, 15]; 문헌[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085(1989)])에 의해 확인할 수 있다. 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성되는 돌연변이 분자를 하나 이상의 TNF 중화 활성과 같으나 이에 한정되지 않는 생물학적 활성에 대해 시험한다. 결정화, 핵자기 공명, 또는 광친화도 표지화(문헌[Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 문헌[de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)])와 같은 구조 분석에 의해 항체 결합에 결정적인 부위를 또한 확인할 수 있다.

본 발명의 항-TNF 항체는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 중 하나 이상의 연속 아미노산 중 1개 내지 전부로부터 선택된 하나 이상의 부분, 서열, 또는 조합을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.

추가로, 항-TNF 항체는 서열 번호 7, 8 중 하나 이상의 연속 아미노산의 70 내지 100% 중 하나 이상의 폴리펩티드를 임의로 포함할 수 있다.

일 실시 형태에서, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 부분(예를 들어 가변 영역, CDR)의 아미노산 서열은 서열 번호 7, 8 중 하나 이상의 상응하는 사슬의 아미노산 서열에 대해 약 70 내지 100%의 동일성(예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)을 갖는다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 8의 서열과 비교할 수 있거나, 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 7과 비교할 수 있다. 바람직하게는, 70 내지 100% 아미노산 동일성(즉, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)은 당업계에 공지된 바와 같이 적합한 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정된다.

예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 서열 번호 7, 8에 제공된다. 본 발명의 항체 또는 이의 특정 변이체는 본 발명의 항체로부터의 임의의 수의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 여기서 그 수는 항-TNF 항체 내의 연속 잔기의 수의 10 내지 100%로 이루어진 정수의 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 연속된 아미노산들의 이러한 하위서열(subsequence)은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 또는 그 이상의 아미노산 길이 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이다. 또한, 그러한 하위서열의 개수는 1 내지 20, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 또는 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 정수일 수 있다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 생물학적으로 활성인 항체를 포함한다. 생물학적으로 활성인 항체는 천연(비-합성), 내인성, 또는 관련되고 알려진 항체의 것의 20%, 30%, 또는 40% 이상, 바람직하게는 50%, 60%, 또는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80%, 90%, 또는 95% 내지 1000% 이상인 고유 활성(specific activity)을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성의 검정 방법 및 정량화 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형된, 본 명세서에 기재된 인간 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 약동학적 특성이 개선된(예를 들어, 생체내 혈청 반감기 증가) 항체 또는 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체기, 지방산기 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 친수성 중합체기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있으며, 폴리알칸 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

본 발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합되는 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체기, 지방산기 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 다이-카르복실산을 포함한다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "친수성 중합체기"는 옥탄 중에서보다 물 중에서 더 가용성인 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 폴리라이신은 옥탄 중에서보다 물 중에서 더 가용성이다. 따라서, 폴리라이신의 공유 부착에 의해 변형된 항체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체의 변형에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 예를 들어 폴리알칸 글리콜(예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체(예를 들어, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥사이드(예를 들어, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 변형시키는 친수성 중합체는 별개의 분자 실체(entity)로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG₅₀₀₀ 및 PEG_20,000(이때, 아래첨자는 중합체의 평균 분자량(달톤)임)이 사용될 수 있다. 친수성 중합체기는 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환된 친수성 중합체를 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트와 커플링될 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예를 들어, N,N-카르보닐 다이이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 하이드록실기와 커플링될 수 있다.

본 발명의 항체의 변형에 적합한 지방산과 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나, 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체를 변형시키기에 적합한 지방산은, 예를 들어 n-도데카노에이트(C₁₂, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C₁₄, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C₁₈, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C₂₀, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C₂₂, 베헤네이트), n-트라이아콘타노에이트(C₃₀), n-테트라콘타노에이트(C₄₀), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C₁₈, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C₂₀, 아라키도네이트), 옥탄다이오산, 테트라데칸다이오산, 옥타데칸다이오산, 도코산다이오산 등을 포함된다. 적합한 지방산 에스테르에는 선형 또는 분지형 저급 알킬기를 포함하는 다이카르복실산의 모노-에스테르가 포함된다. 저급 알킬기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "변형제"는 활성화기를 포함하는 적합한 유기기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. "활성화기"는 적절한 조건 하에 제2 화학기와 반응하여 변형제와 제2 화학기 사이의 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화기에는 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS) 등과 같은 친전자성 기가 포함된다. 티올과 반응할 수 있는 활성화기에는, 예를 들어 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤일, 피리딜 다이설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 등이 포함된다. 알데하이드 작용기는 아민- 또는 히드라지드-함유 분자와 커플링될 수 있고, 아지드기는 3가 인산기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화기를 분자 내로 도입하기에 적합한 방법은 본 기술 분야에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA(1996)]을 참조한다). 활성화기는 유기기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 결합되거나, 링커 모이어티, 예를 들어 2가 C₁ 내지 C₁₂ 기(여기서 하나 이상의 탄소 원자는 산소, 질소, 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있음)를 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 모이어티에는, 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH₂)₃-, -NH-(CH₂)₆-NH-, -(CH₂)₂-NH- 및 -CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-가 포함된다. 예를 들어, 모노-Boc-알킬다이아민(예를 들어, 모노-Boc-에틸렌다이아민, 모노-Boc-다이아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보다이이미드(EDC)의 존재 하에 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 링커 모이어티를 포함하는 변형제를 제조할 수 있다. 기재된 바와 같이, 다른 카르복실레이트에 커플링될 수 있거나, 말레산 무수물과 반응시키고 생성되는 생성물을 환화하여 지방산의 활성화 말레이미도 유도체를 제조할 수 있는 일차 아민을 노출시키기 위해, 트라이플루오로아세트산(TFA)으로 처리함으로써 생성물로부터 Boc 보호기를 제거할 수 있다. (예를 들어, 그의 전체 교시 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 WO 92/16221(Thompson 등)을 참조한다.)

본 발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 변형제와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민-반응성 변형제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 부위 비특이적 방식으로 항체에 결합될 수 있다. 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항원-결합 단편의 이황화 결합(예를 들어, 사슬내 이황화 결합)을 환원시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형제와 반응시켜 본 발명의 변형된 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 항체의 특이적인 부위에 결합하는 유기 모이어티를 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 예컨대 역 단백질 분해(reverse proteolysis)(문헌[Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992)]; 문헌[Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; 문헌[Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997)]; 문헌[Itoh et al., Bioorg . Chem ., 24(1): 59-68 (1996)]; 문헌[Capellas et al., Biotechnol . Bioeng ., 56(4):456-463 (1997)]), 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

항-Tnf 항체에 대한 항-개별특이형 항체 조성물. 단일클론 또는 키메라 항-TNF 항체에 더하여, 본 발명은 또한 본 발명의 그러한 항체에 특이적인 항-개별특이형(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 다른 항체의 항원-결합 영역과 일반적으로 관련된 독특한 결정자를 인식하는 항체이다. 항체 또는 그의 CDR 함유 영역을 갖는 Id 항체의 공급원과 동일한 종 및 유전자 유형의 동물(예를 들어, 마우스 품종)을 면역화함으로써 항-Id를 제조할 수 있다. 면역화 동물은 면역화 항체의 개별특이형 결정자를 인식하고 반응하여 항-Id 항체를 생성할 것이다. 항-Id 항체는 또한 "면역원"으로서 사용되어 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도하여, 소위 항-항-Id 항체를 생산할 수 있다.

항-Tnf 항체 조성물. 본 발명은 또한, 비-천연 발생 조성물, 혼합물, 또는 형태로 제공되는, 본 명세서에 기재되고/되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상의 이의 항-TNF 항체를 포함하는 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8의 연속 아미노산의 70 내지 100%, 또는 이의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-TNF 항체 아미노산 서열의 1개 또는 2개 이상의 전장, C- 및/또는 N-말단 결실 변이체, 도메인, 단편, 또는 특정 변이체를 포함하는 비-천연 발생 조성물을 포함한다. 바람직한 항-TNF 항체 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 70 내지 100%의 항-TNF 항체 서열 중의 일부, 또는 이의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체를 함유하는 하나 이상의 CDR 또는 LBR로서 1개 또는 2개 이상의 전장, 단편, 도메인, 또는 변이체를 포함한다. 추가로 바람직한 조성물은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 70 내지 100% 중 하나 이상의 40 내지 99%, 또는 이의 특정 단편, 도메인, 또는 변이체를 포함한다. 본 기술 분야에 알려지거나 본 발명에 기재된 바와 같이, 그러한 조성 백분율은 액체 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼, 또는 콜로이드로서 중량, 부피, 농도, 몰 농도, 몰랄 농도를 기준으로 한다.

본 발명의 항-TNF 항체 조성물은, 이러한 조정, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 대한 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 TNF 길항제(예를 들어, 비제한적인 TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 이의 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제(예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살라진), 근육 이완제, 마약(narcotic), 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제(예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예를 들어, G-CSF, 뉴포젠), 사그라모스팀(GM-CSF, 류카인), 면역화, 면역글로불린, 면역억제제(예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(풀모짐), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는, 하나 이상의 조성물 또는 약제학적 조성물의 임의의 적합한 유효량을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 사이토카인의 비제한적인 예는 IL-1 내지 IL-23 중 임의의 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2^nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT(2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA(2000)]을 참조하며, 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

그러한 항암제 또는 항감염제는 하나 이상의 본 발명의 항체와 회합, 결합, 동시-제형화 또는 동시 투여되는 독소 분자를 또한 포함할 수 있다. 독소는 임의로 병리학적 세포 또는 조직을 선택적으로 살해하는 작용을 할 수 있다. 병리학적 세포는 암 또는 다른 세포일 수 있다. 그러한 독소는, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소, 베놈 독소, 또는 박테리아 독소 중 하나 이상으로부터 선택된 독소의 하나 이상의 기능적 세포독성 도메인을 포함하는 정제되거나 재조합된 독소 또는 독소 단편일 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 용어 독소는 또한, 사멸을 유발할 수 있는 독소 쇼크를 포함하는, 인간 및 다른 포유류에서 임의의 병리학적 병태를 야기할 수 있는 임의의 천연 발생 돌연변이 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생산되는 내독소 및 외독소 둘 모두를 포함한다. 그러한 독소는 장독성 이. 콜라이 열-불안정성 장독소(LT), 열-안정성 장독소(ST), 시겔라(Shigella) 세포독소, 아에로모나스(Aeromonas) 장독소, 독성 쇼크 증후군 독소-1(TSST-1), 스타필로코커스(Staphylococcus) 장독소 A(SEA), B(SEB), 또는 C(SEC), 스타필로코커스 장독소 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 그러한 박테리아는 장독성 이. 콜라이(ETEC), 장출혈성 이. 콜라이(예를 들어, 혈청형 0157:H7의 균주),스타필로코커스 종(예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 피오게네스(Staphylococcus pyogenes)), 시겔라 종(예를 들어, 시겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디(Shigella boydii), 및 시겔라 소네이(Shigella sonnei)), 살모넬라 종(예를 들어, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 콜레라-수이스(Salmonella cholera-suis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)), 클로스트리듐(Clostridium) 종(예를 들어, 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium dificile), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)), 캄플로박터(Camphlobacter) 종(예를 들어, 캄플로박터 제주니(Camphlobacter jejuni), 캄플로박터 페투스(Camphlobacter fetus)), 헬리옥박터(Heliocbacter) 종(예를 들어, 헬리옥박터 파일로리(Heliocbacter pylori)), 에어로모나스(Aeromonas) 종(예를 들어, 에어로모나스 소브리아(Aeromonas sobria), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에어로모나스 카비아(Aeromonas caviae)), 플레이소모나스 시겔로이데스(Pleisomonas shigelloides), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 비브리오(Vibrio) 종(예를 들어, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(ibrio parahemolyticus)), 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코사이(Streptococci)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990)]; 문헌[Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991)]; 문헌[Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990)]; 문헌[Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992]; 문헌[Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991)]; 문헌[Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990)]을 참조하며, 이들 참고문헌의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 항-TNF 항체 화합물, 조성물, 또는 조합은 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등과 같으나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 임의의 적합한 보조제(auxiliary)를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 보조제가 바람직하다. 이러한 무균 용액의 제조 방법의 비제한적인 예는 문헌[Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Co.(Easton, PA) 1990]과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 문헌에 기재된 바와 같이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 기술 분야에 잘 알려지거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 항-TNF 항체, 단편, 또는 변이체 조성물의 투여 방식, 용해도, 및/또는 안정성에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 일상적으로 선택될 수 있다.

본 조성물에 유용한 약제학적 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 및 올리고당류를 포함하는 당; 유도체화된 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이는 단독으로 또는 조합하여 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%를 차지하면서 개별적으로 또는 조합하여 존재할 수 있다. 예시적인 단백질 부형제는 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 완충 용량에서도 기능할 수 있는 대표적인 아미노산/항체 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 류신, 아이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글리신이다.

본 발명에 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제는, 예를 들어, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(글루시톨), 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 본 발명에 사용하기 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스 및 라피노스이다.

항-TNF 항체 조성물은 완충제 또는 pH 조절제를 또한 포함할 수 있으며; 전형적으로, 완충제는 유기산 또는 유기 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 석신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 트로메타민 염산염 또는 인산염 완충제를 포함한다. 본 조성물에 사용하기에 바람직한 완충제는 시트레이트와 같은 유기산 염이다.

추가로, 본 발명의 항-TNF 항체 조성물은 폴리비닐피롤리돈, 피콜(중합체 당), 덱스트레이트(예를 들어, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제(예를 들어, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"과 같은 폴리소르베이트), 지질(예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), 및 킬레이트제(예를 들어, EDTA)와 같은 중합체 부형제/첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항-TNF 항체, 부분, 또는 변이체 조성물에 사용하기에 적합한 이들 및 추가의 알려진 약제학적 부형제 및/또는 첨가제는, 예를 들어 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19^th ed., Williams & Williams, (1995)], 및 문헌["Physician's Desk Reference", 52^nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)]에 열거된 바와 같이 본 기술 분야에 알려져 있으며, 이들의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물(예를 들어, 당류 및 알디톨) 및 완충제(예를 들어, 시트레이트) 또는 중합체 물질이다.

제형. 상기 언급된 바와 같이 본 발명은, 약제학적으로 허용가능한 제형 내에 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는, 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 갖는 인산염 완충제인 안정한 제형과 더불어, 보존제를 함유하는 보존된 용액 및 제형 및 약제학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도의 보존된 제형을 제공한다. 보존된 제형은 하나 이상의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐머큐릭 니트라이트, 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부탄올, 염화마그네슘(예를 들어, 6수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살, 또는 수성 희석제 중의 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택되는 하나 이상의 공지의 방부제를 함유한다. 임의의 적합한 농도 또는 혼합물, 예컨대 0.001 내지 5%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 비제한적인 예를 들어 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4., 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이 본 기술 분야에 알려진 바와 같이 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 방부제를 포함하지 않거나, 0.1 내지 2%의 m-크레졸(예를 들어, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1 내지 3%의 벤질 알코올(예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1., 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001 내지 0.5%의 티메로살(예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001 내지 2.0%의 페놀(예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005 내지 1.0%의 알킬파라벤(들)(예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.

상기 언급된 바와 같이 본 발명은, 포장 재료, 및 임의로 수성 희석제 내의 처방된 완충제 및/또는 보존제와 함께 하나 이상의 항-TNF 항체의 용액을 포함하는 하나 이상의 바이알을 포함하는 제조 물품을 제공하며, 상기 포장 재료는 그러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있음을 표시하는 표지를 포함한다. 본 발명은 포장 재료, 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 제1 바이알, 및 처방된 완충제 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 제조 물품을 추가로 포함하며, 상기 포장 재료는 하나 이상의 항-TNF 항체를 수성 희석제 내에 재구성하여 24시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있는 용액을 형성하도록 환자에게 지시하는 표지를 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 하나 이상의 항-TNF 항체는 포유류 세포 또는 트랜스제닉 제조를 포함하는 재조합 수단에 의해 생산될 수 있거나, 본 명세서에 기재되거나 본 기술 분야에 알려진 바와 같은 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.

본 발명의 생성물에서 하나 이상의 항-TNF 항체의 범위는 재구성시에, 습윤/건조 시스템에서의 경우, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 1000 mg/ml의 농도를 산출하는 양을 포함하지만, 더 낮거나 높은 농도가 사용가능하고 의도하는 전달 비히클에 좌우되며, 예를 들어 용액 제형은 경피 패치, 폐, 경점막, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과는 상이할 것이다.

바람직하게는, 선택적으로 수성 희석제는 약제학적으로 허용되는 방부제를 추가로 포함한다. 바람직한 방부제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 제형 내에 사용되는 방부제의 농도는 항-미생물 효과를 내기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택된 방부제에 좌우되며, 당업자에 의해 쉽게 결정된다.

다른 부형제, 예를 들어 등장화제, 완충제, 산화방지제, 보존제 인핸서가 임의로 바람직하게 희석제에 첨가될 수 있다. 글리세린과 같은 등장화제는 공지의 농도에서 통상 사용된다. 생리학적으로 허용되는 완충제는 바람직하게는 향상된 pH 제어를 제공하기 위해 첨가된다. 제형은 약 pH 4 내지 약 pH 10과 같은 넓은 범위의 pH를 포함할 수 있고, 바람직한 범위는 약 pH 5 내지 약 pH 9이며, 가장 바람직한 범위는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 바람직하게는 본 발명의 제형은 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 갖는다. 바람직한 완충제는 인산염 완충제, 가장 바람직하게는 인산나트륨, 특히 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다.

약제학적으로 허용가능한 가용화제, 예를 들어 Tween 20(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween 40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), Tween 80(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트), Pluronic F68(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체), 및 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80 또는 폴록사머 184 또는 188, 플루로닉® 폴리올, 다른 블록 공중합체, 및 킬레이트제, 예컨대 EDTA 및 EGTA와 같은 다른 첨가제가 응집을 감소시키기 위해 제형 또는 조성물에 임의로 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제형을 투여하기 위해 사용될 경우에 특히 유용하다. 약제학적으로 허용되는 계면활성제의 존재는 단백질 응집 성향을 완화시킨다.

본 발명의 제형은 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 나트륨 디하이드로아세테이트 및 티메로살 또는 수성 희석제 중의 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 보존제와 하나 이상의 항-TNF 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에 하나 이상의 항-TNF 항체와 보존제를 혼합하는 단계는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 실행한다. 적합한 제형을 제조하기 위해, 예를 들어, 원하는 농도의 단백질 및 보존제를 제공하기에 충분한 양으로 완충 용액 중의 측정된 양의 하나 이상의 항-TNF 항체를 완충 용액 중의 원하는 보존제와 조합한다. 이러한 방법의 변형법이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.

특허 청구되는 제형은 투명한 용액으로서, 또는 물, 보존제, 및/또는 부형제, 바람직하게는 인산염 완충제 및/또는 식염수 및 선택된 염을 수성 희석제 중에 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 필요한 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고, 환자 치료의 단일 또는 다수의 사이클에 충분하므로 현재 사용되는 것보다 더 편리한 치료 계획을 제공할 수 있다.

본 발명의 특허 청구되는 제조 물품은 즉시 내지 24시간 이상의 기간에 걸쳐 투여하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명에서 청구되는 제조 물품은 환자에게 상당한 이점을 준다. 본 발명의 제형은 선택적으로 약 2 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 저장되고 장기간 동안 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있으며, 따라서 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 또는 96시간 이상의 기간에 걸쳐 용액이 유지 및/또는 사용될 수 있음을 패키지 라벨에 표시하는 것이 가능하다. 보존된 희석제가 사용된 경우, 상기 라벨은 1 내지 12달, 반년, 1년 반 및/또는 2년의 사용을 포함할 수 있다.

본 발명에서 하나 이상의 항-TNF 항체의 용액은 수성 희석제 중에 하나 이상의 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 혼합을 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행한다. 적합한 희석제를 제조하기 위하여, 예를 들어 원하는 농도의 단백질 및 임의로 보존제 또는 완충제를 제공하기에 충분한 양으로 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 하나 이상의 항체를 조합한다. 이러한 방법의 변형법이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.

특허 청구되는 생성물은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 필요한 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고, 환자 치료의 단일 또는 다수의 사이클에 충분하므로 현재 사용되는 것보다 더 편리한 치료 계획을 제공한다.

특허 청구되는 생성물은 투명한 용액, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 약국, 병원, 또는 그러한 다른 기관 및 시설에 제공함으로써 환자에게 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우 투명한 용액은 최대 1리터 또는 그보다 훨씬 더 큰 크기일 수 있는데, 소량의 적어도 하나의 항체 용액을 1회 또는 다회 회수하여 소량의 바이알에 옮기고, 약국 또는 병원을 통해 고객 및/또는 환자에게 제공할 수 있는 큰 저장고를 제공한다.

이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 승인된 장치는 B-D^®(펜 인젝터 장치), NOvoPen^®(펜 인젝터 장치), AutoPen^®(펜 인젝터 장치), OptiPen^®(펜 인젝터 장치), Genotropin Pen^®(펜 인젝터 장치), HUMATROPEN^®(펜 인젝터 장치), BIojector^®(펜 인젝터 장치), Reco-Pen, Humaject, J-tip Needle-Free Injector, Intraject, Medi-Ject와 같은 용액의 전달을 위한 펜-인젝터 장치를 포함하고, 예를 들어, 이들은 하기에 의해 제조되거나 개발된다:

Becton Dickensen(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재, www. bectondickenson.com),

Disetronic(스위스 부르그도르프 소재, www. disetronic.com);

Bioject, 미국 오레곤주 포틀랜드 소재 (www. bioject.com);

Weston Medical(영국 피터버러 소재, www. weston-medical.com),

Medi-Ject Corp(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, www. mediject.com).

이중 바이알 시스템을 포함하는 승인된 장치는 HUMATROPEN^®(펜 인젝터 장치)과 같은 재구성된 용액의 전달을 위한 카트리지에 동결건조된 약물을 재구성하기 위한 펜-인젝터 시스템을 포함한다.

현재 특허 청구되는 생성물은 포장 재료를 포함한다. 포장 재료는 규제 당국이 요구하는 정보 이외에 제품을 사용할 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 포장 재료는 2개의 바이알, 습윤/건조 생성물에 대하여 하나 이상의 항-TNF 항체를 수성 희석제 중에 재구성하여 용액을 형성하고 용액을 2 내지 24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용하도록 하는 설명서를 환자에게 제공한다. 단일 바이알, 용액 생성물의 경우, 표지는 그러한 용액을 2 내지 24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용할 수 있음을 나타낸다. 현재 특허 청구되는 생성물은 인간의 의약품 용도로 유용하다.

본 발명의 제형은 하나 이상의 항-TNF 항체 및 선택된 완충제, 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 함유하는 인산염 완충제를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에 하나 이상의 항체와 완충제를 혼합하는 단계는 통상의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 실행한다. 적합한 제형을 제조하기 위하여, 예를 들어 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 적어도 하나의 항체를, 원하는 농도의 단백질 및 완충제를 제공하기 충분한 양의 수중의 원하는 완충제와 배합한다. 이러한 방법의 변형법이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제 사용 여부, 제형 제조 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.

특허 청구되는 안정하거나 보존된 제형은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제 중의 보존제 또는 완충제 및 부형제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 하나 이상의 항-TNF 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 필요한 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고, 환자 치료의 단일 또는 다수의 사이클에 충분하므로 현재 사용되는 것보다 더 편리한 치료 계획을 제공한다.

본 명세서에 기재된 안정하거나 보존된 제형 또는 용액 중의 하나 이상의 항-TNF 항체는 SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프, 또는 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 당업자가 인정하는 다른 수단을 포함하는 다양한 전달 방법을 통해 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.

치료적 응용. 본 발명은 또한, 본 기술 분야에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 하나 이상의 이중 인테그린 항체를 사용하여 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 하나 이상의 TNF 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 비만, 면역 관련 질환, 심혈관 질환, 감염성 질환, 악성 질환, 또는 신경 질환 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 TNF 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 류마티스 관절염, 소아성, 전신 발현 소아성 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 강직성 척추염, 위궤양, 혈청 음성 관절증, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 항인지질 증후군, 홍채섬모체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너 육아종증, 유육종증, 고환염/정관 복원술, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 전신 염증성 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 발열, 요로성 패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리 방사선 노출, 급성 췌장염, 성인 호흡 곤란 증후군, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론병, 겸상적혈구 빈혈증, 당뇨, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 연중 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 두드러기, 전신성 아나필락시스, 피부염, 악성 빈혈, 용혈성 질환, 혈소판 감소증, 임의의 기관 또는 조직의 이식편 거부반응, 신장 이식 거부반응, 심장 이식 거부반응, 간 이식 거부반응, 췌장 이식 거부반응, 폐 이식 거부반응, 골수이식(BMT) 거부반응, 피부 동종이식편 거부반응, 연골 이식 거부반응, 골 이식편 거부반응, 소장 이식 거부반응, 태아 흉선 임플란트 거부반응, 부갑상선 이식 거부반응, 기관 또는 조직의 이종이식편 거부반응, 동종이식편 거부반응, 항-수용체 과민 반응, 그레이브스병, 레이노병, B형 인슐린-저항성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체-매개 세포독성, III형 과민 반응, 전신 홍반성 루푸스, POEMS 증후군(다발성 신경병증, 장기종대, 내분비병증, 단일클론성 감마글로불린병증, 및 피부변성 증후군), 다발성 신경병증, 장기종대, 내분비병증, 단일클론성 감마글로불린병증, 피부변성 증후군, 항인지질 증후군, 천포창, 피부경화증, 혼합 결합조직병, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활동 간염, 원발성 담즙성 간경화, 백반증, 혈관염, MI후 심장절개 증후군, IV형 과민증, 접촉성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식편 거부반응, 세포내 유기체에 의한 육아종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨병, 혈색소침착증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병성 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 원발성 담즙성 간경화, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭포성 섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신염, 사구체신염, 급성 신부전, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 요법, 항-cd3 요법, 사이토카인 요법, 화학요법, 방사선 요법(예를 들어, 무력증, 빈혈, 악액질 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 만성 살리실산염 중독 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 면역 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 각각이 전체적으로 참고로 포함되는 문헌[Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999)], 문헌[Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)]을 참조한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 심장 기절(cardiac stun) 증후군, 심근경색증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재협착, 당뇨병성 동맥경화성 질환, 고혈압, 동맥성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전, 폐심장증, 원발성 폐고혈압, 심부정맥, 이소성 심방 박동, 심방 조동, 심방 세동(지속성 또는 발작성), 관류후 증후군, 심폐 바이패스 염증 반응, 혼돈성 또는 다소성 심방 빈맥, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 특정 부정맥, 심실세동, 히스 다발(His bundle) 부정맥, 방실 차단, 다발 갈래 차단, 심근 허혈 장애, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근경색증, 심근병증, 확장형 울혈성 심근병증, 제한성 심근병증, 판막성 심장병, 심내막염, 심낭 질환, 심종양, 대동맥류 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 복부대동맥 및 그의 분지의 폐쇄, 말초 혈관 장애, 동맥 폐쇄성 장애, 말초 아테롬성 동맥경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 장애, 레이노 현상 및 레이노병, 말단청색증, 피부홍통증, 정맥 질환, 정맥혈전증, 정맥류, 동정맥루, 림프부종, 지방부종, 불안정성 협심증, 재관류 손상, 펌프 후(post pump) 증후군, 허혈-재관류 손상 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 심혈관 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 그러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 임의로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 급성 또는 만성 박테리아 감염, 박테리아, 바이러스, 및 진균 감염을 포함하는 급성 또는 만성 기생 또는 감염 과정, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염(A 형, B 형, 또는 C 형 등), 화농성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 이. 콜라이 0157:h7, 용혈성 요독 증후군/혈전용해성 혈소판감소성 자반증, 말라리아, 뎅기 출혈열, 레슈마니아증, 한센병, 독성 쇼크 증후군, 연쇄상구균성 근염, 가스 괴저, 결핵균(mycobacterium tuberculosis), 세포내 계형 결핵균(mycobacterium avium intracellulare), 폐포자충 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염/부고환염, 레지오넬라(legionella), 라임병, 인플루엔자 a, 엡스테인-바 바이러스, 바이러스-관련 혈구탐식 증후군, 바이러스성 뇌염/무균성 수막염 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 감염성 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포, 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프모세포성 백혈병(CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군(MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버키트 림프종, 다중 흑색종, 카포시 육종, 결장직장 암종, 췌장 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 부신생물 증후군/악성종양의 과칼슘혈증, 고형 종양, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암 관련 골통 등 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 악성 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서 신경 변성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 합병증, 탈수초 질환, 예컨대 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌 장애, 예컨대 피질 척수계 병변; 기저 신경절의 장애 또는 소뇌 장애; 과다운동성 운동 장애, 예컨대 헌팅턴 무도병 및 노인성 무도병; 약물 유도 운동 장애, 예컨대 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도되는 것들; 운동저하 장애, 예컨대 파킨슨병; 진행성 핵상마비; 소뇌의 구조 병변; 척수소뇌 변성증, 예컨대 척수성 운동실조, 프리드리히 운동실조, 소뇌 피질 변성증, 다발성 체계 변성증(멘셀(Mencel), 데제린-토마스(Dejerine-Thomas), 사이-드래거(Shi-Drager), 및 마카도-조셉(Machado-Joseph)); 전신성 장애(레프섬 병, 무베타지질단백혈증, 운동실조, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다발계통 장애); 탈수초 코어 장애, 예컨대 다발성 경화증, 급성 횡단성 척추염; 및 운동 단위의 장애, 예컨대 신경성 근위축증(전각 세포 변성증, 예컨대 근위축성 측삭경화증, 유아 척수성 근위축증 및 연소성 척수성 근위축증); 알츠하이머 질환 중년의 다운 증후군; 미만성 루이소체병; 루이소체형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프 증후군; 만성 알코올 의존증; 크로이츠펠트-야콥병; 아급성 경화성 범뇌염; 할러포르텐-스파츠 병; 및 권투 선수 치매를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 신경 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 선택적으로 적어도 하나의 TNF 항체 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Merck Manual, 16^th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992)]을 참조한다.

본 발명의 임의의 방법은 그러한 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의로 이러한 면역 질환의 치료를 위한 동시-투여 또는 병용 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하나 이상의 항-TNF 항체, 이의 특정 부분, 또는 변이체의 투여는 하나 이상의 TNF 길항제(비제한적인 예를 들어, TNF-항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 이의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제(예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살라진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제(예를 들어, 아미노글리코사이드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예를 들어, G-CSF, 뉴포젠), 사르그라모스팀(GM-CSF, 류카인), 면역화, 면역글로불린, 면역억제제(예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(풀모짐), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 하나 이상을 사전에, 동시에, 및/또는 사후에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2^nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT(2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA(2000)]을 참조하며, 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 조성물, 병용 요법, 동시-투여, 장치, 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제(하나 이상의 본 발명의 항체, 이의 특정 부분, 및 변이체를 추가로 포함함)는 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; TNF 합성, TNF 방출, 또는 표적 세포에 대한 그의 작용을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 탈리도마이드, 테니댑, 포스포다이에스테라제 억제제(예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 작용제 및 A2b 아데노신 수용체 인핸서; TNF 수용체 신호전달을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나제 억제제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 메탈로프로테이나제 억제제; TNF 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제(예를 들어, 캅토프릴); 및 TNF 생산 및/또는 합성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 MAP 키나제 억제제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "종양 괴사 인자 항체", "TNF 항체 ", "TNFα 항체 ", 또는 단편 등은 시험관내, 원위치, 및/또는 바람직하게는 생체내에서 TNFα 활성을 감소, 차단, 억제, 제거, 또는 방해한다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 TNF 인간 항체는 TNFα에 결합할 수 있고, 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 TNFα에 특이적으로 결합하는 이의 특정 돌연변이체 또는 도메인을 포함한다. 적합한 TNF 항체 또는 단편은 또한, TNF RNA, DNA, 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호전달, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 제거, 방해, 방지, 및/또는 억제할 수 있다.

키메라 항체 cA2는 A2로 표기되는 고친화도 중화 마우스 항-인간 TNFα IgG1 항체의 항원 결합 가변 영역 및 카파 면역글로불린인 인간 IgG1의 불변 영역으로 이루어진다. 인간 IgG1 Fc 영역은 동종이계 항체 이펙터 기능을 개선하며, 순환 혈청 반감기를 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 결합활성 및 에피토프 특이성은 쥐과 항체 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 특정 실시 형태에서, 쥐과 항체 A2의 가변 영역을 암호화하는 핵산에 대한 바람직한 공급원은 A2 하이브리도마 세포주이다.

키메라 A2(cA2)는 용량 의존적 방식으로 천연 및 재조합 인간 TNFα 둘 모두의 세포독성 효과를 중화시킨다. 키메라 항체 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 검정으로부터, 키메라 항체 cA2의 친화도 상수는 1.04xl0¹⁰ M^-1인 것으로 계산되었다. 경쟁적 억제에 의해 단클론 항체 특이성 및 친화도를 결정하는 바람직한 방법은 문헌[Harlow, et al., antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988]; 문헌[Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992-2000)]; 문헌[Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983)]; 문헌[Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000)]; 및 문헌[Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983)]에서 확인할 수 있으며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

특정 실시 형태에서, 쥐과 단일클론 항체 A2는 c134A로 표기된 세포주에 의해 생산된다. 키메라 항체 cA2는 c168A로 표기된 세포주에 의해 생산된다.

본 발명에 사용될 수 있는 단일클론 항-TNF 항체의 추가의 예가 본 기술 분야에 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,231,024호; 문헌[

, A. et al., Cytokine 2(3):162-169 (1990); 미국 특허 출원 제07/943,852호(1992년 9월 11일자로 출원됨); 국제특허 공개 제WO 91/02078호(Rathjen 등, 1991년 2월 21일자로 공개됨); EPO 특허 공개 제0 218 868호(Rubin 등, 1987년 4월 22일자로 공개됨); EPO 특허 공개 제0 288 088호(Yone 등, 1988년 10월 26일자); 문헌[Liang, et al., Biochem . Biophys . Res. Comm . 137:847-854 (1986)]; 문헌[Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987)]; 문헌[Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987)]; 문헌[Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987)]; 및 문헌[Hirai, et al., J. Immunol. Meth . 96:57-62 (1987)]을 참조하며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨).

TNF 수용체 분자. 본 발명에 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 높은 친화도로 TNFα에 결합하고(예를 들어, 국제특허 공개 제WO 92/07076호(Feldmann 등, 1992년 4월 30일자로 공개됨)); 문헌[Schall et al., Cell 61:361-370 (1990)]; 및 문헌[Loetscher et al., Cell 61:351-359 (1990)]을 참조하며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨) 임의로 낮은 면역원성을 보유하는 것들이다. 특히, 55 kDa(p55 TNF-R) 및 75 kDa(p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 기능부를 포함하는 이들 수용체의 절단 형태(예를 들어, 문헌[Corcoran et al., Eur . J. Biochem. 223:831-840 (1994)] 참조)가 또한 본 발명에 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 절단 형태는 소변 및 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα 억제성 결합 단백질로서 검출되었다(문헌[Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)]). TNF 수용체 다량체 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자, 및 이의 유도체 및 단편 또는 부분은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 수용체 분자의 추가의 예이다. 본 발명에 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자는 증상의 양호한 내지 우수한 경감 및 낮은 독성으로 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 그의 능력을 특징으로 한다. 낮은 면역원성 및/또는 높은 친화도와 더불어, 정의되지 않은 다른 특성이 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다.

본 발명에 유용한 TNF 수용체 다량체 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 링커 또는 다른 비펩티드 링커, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 통해 연결된 2개 이상의 TNF 수용체의 ECD의 전부 또는 기능부를 포함한다. 다량체 분자의 발현을 유도하기 위해 다량체 분자는 분비되는 단백질의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이들 다량체 분자 및 그의 생산 방법은 미국 특허 출원 제08/437,533호(1995년 5월 9일자로 출원됨)에 기재되어 있으며, 그 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 면역수용체 융합 분자는 하나 이상의 면역글로불린 분자의 하나 이상의 부분 및 하나 이상의 TNF 수용체의 전부 또는 기능부를 포함한다. 이들 면역수용체 융합 분자는 단량체, 또는 이종다량체 또는 동종다량체로서 조립될 수 있다. 면역수용체 융합 분자는 또한 1가 또는 다가일 수 있다. 그러한 TNF 면역수용체 융합 분자의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 생산 방법은 본 기술 분야에 기재되어 있다(문헌[Lesslauer et al., Eur . J. Immunol . 21:2883-2886 (1991); 문헌[Ashkenazi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10535-10539 (1991)]; 문헌[Peppel et al., J. Exp . Med . 174:1483-1489 (1991); 문헌[Kolls et al., Proc . Natl. Acad. Sci . USA 91:215-219 (1994); 문헌[Butler et al., Cytokine 6(6):616-623 (1994); 문헌[Baker et al., Eur . J. Immunol . 24:2040-2048 (1994); 미국 특허 제5,447,851호(Beutler 등); 및 미국 특허 출원 제08/442,133호(1995년 5월 16일자로 출원됨), 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 면역수용체 융합 분자의 생산 방법은 또한 미국 특허 제5,116,964호(Capon 등); 미국 특허 제5,225,538호(Capon 등); 및 문헌[Capon et al., Nature 337:525-531 (1989)]에서 확인할 수 있으며, 이들 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

TNF 수용체 분자의 기능적 등가물, 유도체, 단편 또는 영역은 TNF 수용체 분자의 부분, 또는 TNF 수용체 분자를 암호화하는 TNF 수용체 분자 서열의 부분을 지칭하며, 이는 본 발명에 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자와 기능적으로 유사하기에(예를 들어, 높은 친화도로 TNFα에 결합하고 낮은 면역원성을 보유함) 충분한 크기 및 서열을 갖는다. TNF 수용체 분자의 기능성 등가물은 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자와 기능적으로 유사한(예를 들어, 높은 친화도로 TNFα에 결합하고 낮은 면역원성을 보유함) 변형된 TNF 수용체 분자를 포함한다. 예를 들어, TNF 수용체 분자의 기능적 등가물은 "침묵(silent)" 코돈 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 함유할 수 있다(예를 들어, 하나의 산성 아미노산으로 다른 산성 아미노산을 치환함; 또는 동일하거나 상이한 소수성 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈으로 소수성 아미노산을 암호화하는 다른 코돈을 치환함). 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2000)]을 참조한다.

사이토카인은 임의의 알려진 사이토카인을 포함한다. 예를 들어 문헌[CopewithCytokines.com]을 참조한다. 사이토카인 길항제는 임의의 항체, 단편 또는 모방체, 임의의 가용성 수용체, 단편 또는 모방체, 임의의 소분자 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

치료적 치료. 본 발명의 임의의 방법은, TNF 매개 장애의 조절, 치료, 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함하는, TNF 매개 장애를 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의로 이러한 면역 질환의 치료를 위한 동시-투여 또는 병용 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하나 이상의 항-TNF 항체, 이의 특정 부분, 또는 변이체의 투여는 하나 이상의 TNF 길항제(비제한적인 예를 들어, TNF-항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 이의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제(예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 설파살라진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제(예를 들어, 아미노글리코사이드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨병 관련 제제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예를 들어, G-CSF, 뉴포젠), 사르그라모스팀(GM-CSF, 류카인), 면역화, 면역글로불린, 면역억제제(예를 들어, 바실릭시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항우울제, 항조제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(풀모짐), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 하나 이상을 사전에, 동시에, 및/또는 사후에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안전한"은, 그것이 본 발명의 항-TNF 항체(예를 들어, 항-TNF 항체 골리무맙)를 이용하는 조성물, 용량, 투여 계획, 치료, 또는 방법에 관련될 때, 치료 표준 또는 다른 항 TNF 제제와 같은 다른 비교자에 비교하여 유해 사건(AE) 및 심각한 유해 사건(SAE)의 허용가능한 빈도 및/또는 허용가능한 중증도를 갖는 유리한 위험:이익 비를 지칭한다. 유해 사건은 의약품을 투여한 환자에서의 바람직하지 않은 의료 사건이다. 특히, "안전한"은, 그것이 본 발명의 항-TNF 항체를 이용하는 조성물, 용량, 투여 계획, 치료, 또는 방법에 관련될 때, 예를 들어, 주입 반응, 간담도 실험실 비정상, TB를 포함하는 감염, 및 악성종양을 포함하는 유해 사건의 허용가능한 빈도 및/또는 허용가능한 중증도를 지칭한다.

조성물, 용량, 투여 계획, 치료, 또는 방법과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효능" 및 "효과적인"은, 본 발명의 항-TNF 항체(예를 들어, 항-TNF 항체 골리무맙)를 이용하는 특정 조성물, 용량, 투여량, 치료, 또는 방법의 유효성을 지칭한다. 효능은 본 발명의 작용제에 반응하는 질환 경과의 변화에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-TNF 항체는 개선, 바람직하게는 치료되는 장애의 중증도를 반영하는 하나 이상의 지표의 지속적인 개선을 유도하기에 충분한 양 및 시간 동안 환자에게 투여된다. 치료의 양 및 시간이 충분한지 여부를 결정하기 위해 대상체의 병, 질환, 또는 병태의 정도를 반영하는 다양한 지표를 평가할 수 있다. 이러한 지표는, 예를 들어 문제의 장애의 질환 중증도, 증상, 또는 징후의 임상적으로 인정된 지표를 포함한다. 개선의 정도는 일반적으로 징후, 증상, 생검물, 또는 임상 증상의 개선 또는 질환 활성의 임의의 다른 척도를 나타내는 다른 시험 결과에 기초하여 결정할 수 있는 의사 또는 다른 적절하게 훈련된 개인에 의해 결정된다. 예를 들어, 본 발명의 항-TNF 항체는 소아 특발성 관절염(JIA), 및 특히 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)과 관련된 환자의 병태의 개선을 달성하기 위해 투여될 수 있다. JIA 및/또는 pJIA의 치료에 대한 효능은, 예를 들어 비활성 질환에 대한 기준을 충족하는 환자, JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 및/또는 JIA ACR 90으로부터 선택되는 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖는 환자, 및/또는 JADAS 10, JADAS 27, 및/또는 JADAS 71로부터 선택되는 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS)의 기저선으로부터의 감소를 갖는 환자에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, (독립적으로 사용되거나 용어 "안전한" 및/또는 "유효한"을 수식하는 데 사용되는) 용어 "임상적으로 입증된"은 미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration), EMEA 또는 해당 국가 규제 기관의 승인 기준을 충족한 임상 시험에 의해 입증되었음을 의미할 것이다. 예를 들어, 임상 연구는 약물의 효과를 임상적으로 입증하는 데 사용되는 적절한 규모의 무작위 배정 이중-맹검 연구일 수 있다.

전형적으로, 병리학적 병태의 치료는 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물의 안전하고 효과적인 양 또는 투여량을 투여함으로써 이루어지며, 이는 조성물에 함유된 고유 활성에 따라, 합산하여 평균적으로 용량당 환자의 킬로그램당 약 0.01 내지 500 밀리그램 이상의 범위의 하나 이상의 항-TNF 항체, 바람직하게는 단일 또는 다중 투여당 환자의 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램 이상의 항체이다. 대안적으로, 유효 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여당 0.1 내지 5000 ㎍/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 투여량이 임상의에게 알려져 있으며, 물론 특정 질환의 상태, 투여되는 조성물의 특정 활성 및 치료할 특정 환자에 따라 달라질 것이다. 일부의 경우, 요구되는 치료량을 달성하기 위해, 반복 투여, 즉 요구되는 일일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 특정 모니터링 또는 계량 용량의 개별적인 투여를 반복하는 것이 필요할 수 있다.

바람직한 용량은 임의로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및/또는 100 내지 500 mg/㎏/투여, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율을 포함할 수 있거나, 단일 또는 다중 투여당 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 및/또는 5000 ㎍/ml 혈청 농도, 또는 이의 임의의 범위, 값, 또는 분율의 혈청 농도를 달성하기 위한 것이다.

대안적으로, 투여되는 투여량은 알려진 인자, 예컨대 특정 작용제의 약력학적 특징, 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강, 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 변동될 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 투여량은 체중 1 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 통상적으로, 원하는 결과를 얻기 위해, 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.1 내지 10 밀리그램/킬로그램/투여 또는 서방형이 효과적이다.

비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는, 본 발명의 하나 이상의 항체 0.1 내지 100 mg/㎏, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/㎏/일의 1회 또는 주기적 투여량으로서, 일수 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 중 하나 이상, 또는 대안적으로 또는 추가로 주수 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52 중 하나 이상, 또는 대안적으로 또는 추가로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20년 중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합에, 단일, 주입, 또는 반복 용량을 사용하여 제공할 수 있다.

체내 투여에 적합한 투여형(조성물)은 일반적으로 단위 또는 용기당 약 0.1 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이러한 약제학적 조성물에서, 활성 성분은 대체로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 내지 99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.

비경구 투여의 경우, 항체는 약제학적으로 허용가능한 비경구 비히클과 함께 또는 별도로 제공되는 용액, 현탁액, 에멀젼, 또는 동결건조 분말로서 제형화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 1 내지 10% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조 분말은 등장성(예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예를 들어, 완충제 및 방부제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형을 알려진 기술 또는 적합한 기술에 의해 살균시킨다.

적합한 약제학적 담체는 본 분야의 표준 참고문헌인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 최신판에 기재되어 있다.

대안적 투여. 본 발명에 따른 하나 이상의 항-TNF 항체의 약제학적 유효량을 투여하기 위해 알려지고 개발된 많은 투여 방식이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 폐 투여가 하기 설명에서 사용되며, 다른 투여 방식이 적합한 결과를 보이면서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

본 발명의 TNF 항체는, 흡입 또는 본 명세서에서 기재되거나 본 기술 분야에 알려진 다른 방식에 의한 투여에 적합한 임의의 다양한 장치 및 방법을 사용하여, 용액, 에멀젼, 콜로이드, 또는 현탁액으로서, 또는 건조 분말로서 담체 중에 전달될 수 있다.

비경구 제형 및 투여. 비경구 투여용 제형은 통상적인 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사를 위한 수성 또는 유성 현탁액은 알려진 방법에 따라 적당한 유화제 또는 습윤화제 및 현탁제를 사용하여 제조될 수 있다. 주사용 제제는 용매 중의 수용액 또는 멸균 주사용 용액 또는 현탁액과 같은 비독성의 비경구 투여가능한 희석제일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 염수 등이 허용되며; 통상의 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 다이- 또는 트라이-글리세라이드를 포함하는 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구적 투여는 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 제5,851,198호에 기재된 기체 가압 무-바늘 주사 장치, 및 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,839,446호에 기재된 레이저 천공 장치와 같은 통상적인 주사 수단을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

대안적 전달. 본 발명은 추가로, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복막내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 수단에 의한 하나 이상의 항-TNF 항체의 투여에 관한 것이다. 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물은, 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구(피하, 근육내, 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여에 사용하기 위해; 특히 크림 및 좌약과 같으나 이에 한정되지 않는 반고체 형태로 질 또는 직장 투여에 사용하기 위해; 정제 또는 캡슐의 형태와 같으나 이에 한정되지 않는 협측 또는 설하를 위해; 또는, 분말, 점비제(nasal drop), 또는 에어로졸 또는 소정 제제의 형태와 같으나 이에 한정되지 않는 비강내; 또는 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치 내의 약물 농도를 증가시키기 위한 다이메틸 설폭사이드와 같은 화학적 인핸서를 갖거나(전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994]), 단백질 및 펩티드를 함유하는 제형의 피부 상의 적용을 가능하게 하는 산화제(WO 98/53847), 또는 전기천공과 같이 일시적 수송 경로를 생성하거나 이온영동법과 같이 피부를 통해 하전된 약물의 이동성을 증가시키기 위한 전기장의 적용, 또는 음파영동과 같은 초음파의 적용(미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)을 갖는, 겔, 연고, 로션, 현탁액, 또는 패치 전달 시스템과 같으나 이에 한정되지 않는 경피 투여를 위해 제조될 수 있다(상기 간행물 및 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨).

폐/비강 투여. 폐 투여의 경우, 바람직하게는 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물은 폐 또는 부비동(sinus)의 하기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 본 발명에 따라, 하나 이상의 항-TNF 항체는 흡입에 의한 치료제의 투여를 위해 본 기술 분야에 알려진 임의의 다양한 흡입 또는 비내 장치에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비강 또는 폐포 내에 에어로졸화된 제형을 침착시킬 수 있는 이들 장치는 정량 흡입기, 네뷸라이저(nebulizer), 건조 분말 발생기, 분무기 등을 포함한다. 항체의 폐 또는 비내 투여를 유도하기에 적합한 다른 장치 또한 본 기술 분야에 알려져 있다. 그러한 모든 장치는 에어로졸 중의 항체를 분배하기 위해 투여에 적합한 제형을 사용할 수 있다. 그러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성 둘 모두) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. VENTOLIN^®(정량 흡입기)과 같은 정량 흡입기는 전형적으로 추진제 기체를 사용하며, 흡기 중에 구동(actuation)을 필요로 한다(예를 들어, WO 94/16970, WO 98/35888 참조). Turbuhaler(Astra), Rotahaler(Glaxo), DISKUS^®(흡입기)(Glaxo), SPIROS^®(흡입기)(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 시판되는 장치, 및 Spinhaler® 분말 흡입기(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 분말의 호흡-구동을 사용한다(전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). AERX^®(네뷸라이저) Aradigm, ULTRAVENT^®(네뷸라이저)(Mallinckrodt), 및 Acorn II 네뷸라이저(Marquest Medical Products)(US 5404871 Aradigm, WO 97/22376)와 같은 네뷸라이저는 용액으로부터 에어로졸을 생성하는 반면에, 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소입자 에어로졸을 생성하며, 상기 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 구매가능한 흡입 장치의 이들 특이적 예는 본 발명의 실시에 적합한 특이적 장치를 대표하는 것으로 의도되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 바람직하게는, 하나 이상의 항-TNF 항체를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본 발명의 하나 이상의 항체를 투여하기 위한 흡입 장치의 몇몇 바람직한 특성이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 유리하게는 신뢰성 있고, 재현가능하며, 정확하다. 양호한 호흡성을 위해, 흡입 장치는, 예를 들어 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 5 μm의 작은 건조 입자를 선택적으로 전달할 수 있다.

분무로서의 TNF 항체 조성물의 투여. TNF 항체 조성물 단백질을 포함하는 분무는 하나 이상의 항-TNF 항체의 현탁액 또는 용액을 압력 하에 노즐에 통과시킴으로써 생성할 수 있다. 노즐 크기 및 구성, 적용된 압력, 및 액체 공급 속도는 원하는 출력 및 입자 크기를 달성하도록 선택될 수 있다. 전기분무는, 예를 들어 모세관 또는 노즐 공급과 연결된 전기장에 의해 생성될 수 있다. 유리하게는, 분무기에 의해 전달되는 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm 범위의 입자 크기를 갖는다.

분무기와 함께 사용하기에 적합한 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 제형은 전형적으로 용액 1 ml 당 또는 gm 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 비제한적인 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/ml 또는 mg/gm의 농도로 수용액 중의 항체 조성물 단백질을 포함한다. 제형은 부형제, 완충제, 등장화제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연과 같은 제제를 포함할 수 있다. 제형은 또한, 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물과 같은, 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 제제를 포함할 수 있다. 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질 제형은 또한, 에어로졸을 형성함에 있어서 용액의 연무화(atomization)에 의해 야기되는 항체 조성물 단백질의 표면-유도 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상의 계면활성제가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제형의 약 0.001 내지 14 중량%의 범위일 것이다. 본 발명의 목적상 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. TNF 항체, 또는 특정 부분 또는 변이체와 같은 단백질의 제형화를 위해 본 기술 분야에 알려진 추가의 제제가 또한 제형 내에 포함될 수 있다.

네뷸라이저에 의한 TNF 항체 조성물의 투여. 항체 조성물 단백질은 제트 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저와 같은 네뷸라이저에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 제트 네뷸라이저에서는, 압축 공기 공급원을 사용하여 오리피스(orifice)를 통해 고속 공기 제트를 생성한다. 노즐 너머로 기체가 팽창함에 따라 저압 영역이 생성되고, 이는 액체 저장소에 연결된 모세관을 통해 항체 조성물 단백질의 용액을 흡인한다. 모세관으로부터의 액체 흐름은 그것이 튜브에서 나감에 따라 불안정한 필라멘트 및 소적으로 전단되어, 에어로졸을 생성한다. 주어진 제트 네뷸라이저로부터 원하는 성능 특성을 달성하기 위해 소정 범위의 구성, 유속, 및 배플 유형이 사용될 수 있다. 초음파 네뷸라이저에서는, 고주파 전기 에너지를 사용하여 진동, 기계적 에너지를 생성하며, 전형적으로는 압전 변환기(piezoelectric transducer)를 사용한다. 이 에너지는 직접 또는 커플링 유체를 통해 항체 조성물 단백질의 제형에 전달되어 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성한다. 유리하게는, 네뷸라이저에 의해 전달되는 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm 범위의 입자 크기를 갖는다.

제트 또는 초음파 네뷸라이저와 함께 사용하기에 적합한 하나 이상의 항-TNF 항체의 제형은 전형적으로 용액 1 ml 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 농도의 하나 이상의 항-TNF 항체 단백질을 포함한다. 제형은 부형제, 완충제, 등장화제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연과 같은 제제를 포함할 수 있다. 제형은 또한 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는 탄수화물과 같은, 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 제제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물 단백질의 제형화에 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 하나 이상의 항-TNF 항체의 제형화에 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 하나 이상의 항-TNF 항체 제형은 또한, 에어로졸 형성시에 용액의 연무화에 의해 야기되는 하나 이상의 항-TNF 항체의 표면-유도 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알코올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탈 지방산 에스테르와 같은 다양한 통상의 계면활성제가 사용될 수 있다. 양은 일반적으로 제형의 0.001 내지 4 중량%의 범위일 것이다. 본 발명의 목적상 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 항체 단백질과 같은 단백질의 제형화를 위해 본 기술 분야에 알려진 추가의 제제가 또한 제형 내에 포함될 수 있다.

정량 흡입기에 의한 TNF 항체 조성물의 투여. 정량 흡입기(MDI)에서는, 추진제, 하나 이상의 항-TNF 항체, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 기체를 포함하는 혼합물로서 캐니스터(canister) 내에 함유된다. 계량 밸브의 작동은, 바람직하게는, 약 10 μm 미만, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 5 μm, 가장 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 3 μm의 크기 범위의 입자를 함유하는 혼합물을 에어로졸로서 방출한다. 원하는 에어로졸 입자 크기는 제트 밀링(jet-milling), 분무 건조, 임계점 응축 등을 포함한, 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 생성된 항체 조성물 단백질의 제형을 채용함으로써 얻어질 수 있다. 바람직한 정량 흡입기는 3M 또는 Glaxo에 의해 제조되고 하이드로플루오로카본 추진제를 사용하는 것들을 포함한다.

정량 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 하나 이상의 항-TNF 항체의 제형은 일반적으로, 예를 들어 계면 활성제의 보조를 받아 추진제 중에 현탁된 비수성 매질 중의 현탁액으로서 하나 이상의 항-TNF 항체를 함유하는 미세 분할된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 이러한 목적을 위해 사용되는 임의의 통상의 재료, 예컨대 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로다이플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a(하이드로플루로알칸-134a), HFA-227(하이드로플루로알칸-227) 등을 포함하는, 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 하이드로카본일 수 있다. 바람직하게는 추진제는 하이드로플루오로카본이다. 계면활성제는 화학적 분해 등에 대해 활성 제제를 보호하기 위해 추진제 중의 현탁액으로서의 하나 이상의 항-TNF 항체를 안정화하도록 선택될 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트라이올레에이트, 대두 레시틴, 올레산 등을 포함한다. 일부 경우에 에탄올과 같은 용매를 사용하는 용액 에어로졸이 바람직하다. 단백질의 제형화를 위해 본 기술 분야에 알려진 추가의 제제가 또한 제형 내에 포함될 수 있다.

본 명세서에 기재되지 않은 장치를 통한 하나 이상의 항-TNF 항체 조성물의 폐 투여에 의해 본 발명의 방법이 달성될 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.

경구 제형 및 투여. 경구용 제형은 장 벽의 투과성을 인공적으로 증가시키기 위한 보조제(예를 들어, 레소르시놀 및 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 동시-투여와 더불어, 효소적 분해를 억제하기 위한 효소 억제제(예를 들어, 췌장 트립신 억제제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실올)의 동시-투여에 의존한다. 경구 투여용 고체-유형 투여형의 활성 성분 화합물은 수크로스, 락토스, 셀룰로오스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트래거캔스 고무, 아라비아 고무, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체, 및 글리세라이드를 포함하는 하나 이상의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이들 투여형은 또한 다른 유형(들)의 첨가제, 예를 들어, 비활성 희석제, 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 파라벤, 보존제, 예컨대 소르브산, 아스코르브산, 알파-토코페롤, 항산화제, 예컨대 시스테인, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 향미제, 방향제 등을 함유할 수 있다.

정제 및 환제는 장용 코팅 제제로 추가로 가공될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 의학적 용도로 허용가능한 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액, 및 용액 제제를 포함한다. 이들 제제는 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 리포좀 또한 인슐린 및 헤파린에 대한 약물 전달 시스템으로서 기재되었다(미국 특허 제4,239,754호). 더 최근에는, 혼합 아미노산의 인공 중합체(프로테이노이드)의 미소구체가 의약품을 전달하기 위해 사용되었다(미국 특허 제4,925,673호). 추가로, 생물학적 활성 제제를 경구 전달하기 위해 사용되는, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제5,5,871,753호에 기재된 담체 화합물이 본 기술 분야에 알려져 있다.

점막 제형 및 투여. 점막 표면을 통한 흡수를 위해 하나 이상의 항-TNF 항체를 투여하는 조성물 및 방법은 복수의 미크론 미만의 입자, 점막부착성 거대분자, 생물활성 펩티드, 및 에멀젼 입자의 점막부착을 달성함으로써 점막 표면을 통한 흡수를 촉진하는 수성 연속상을 포함하는 에멀젼을 포함한다(미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀젼의 적용에 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 협측, 설하, 비강, 질, 폐, 위, 장, 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여용 제형, 예를 들어 좌제는 부형제로서, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비강내 투여용 제형은 고체일 수 있으며, 부형제로서, 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 점비제의 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 협측 투여용 부형제는 당, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 전호화 전분(pregelinatined starch) 등을 포함한다(미국 특허 제5,849,695호).

경피 제형 및 투여. 경피 투여를 위해, 하나 이상의 항-TNF 항체는 리포좀 또는 중합체 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 미소구체(달리 언급되지 않는 한, 집합적으로 마이크로입자로 지칭됨)와 같은 전달 장치 내에 캡슐화된다. 폴리락트산, 폴리글리콜산, 및 이의 공중합체와 같은 폴리하이드록시산, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 및 폴리포스파진과 같은 합성 중합체, 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 다른 단백질, 알기네이트 및 다른 다당류와 같은 천연 중합체, 및 이들의 조합으로 이루어진 마이크로입자를 포함하는 다수의 적합한 장치가 알려져 있다(미국 특허 제5,814,599호).

장기간의 투여 및 제형. 장기간의 시간에 걸쳐, 예를 들어, 단일 투여로부터 1주 내지 1년의 기간 동안 대상체에게 본 발명의 화합물을 전달하는 것이 간혹 바람직할 수 있다. 다양한 서방성 데포(depot) 또는 임플란트 투여형이 이용될 수 있다. 예를 들어, 투여형은 체액 중의 낮은 용해도를 갖는 화합물의 약제학적으로 허용가능한 비독성 염, 예를 들어, (a) 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 다이-설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 다염기산을 갖는 산 부가염; (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온을 갖거나, 예를 들어 N,N'-다이벤질-에틸렌다이아민 또는 에틸렌다이아민으로부터 형성된 유기 양이온을 갖는 염; 또는 (c) (a)와 (b)의 조합, 예를 들어 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 방금 기재된 것들과 같은 비교적 불용성인 염은 겔, 예를 들어, 주사용으로 적합한, 예를 들어 참깨유를 갖는 알루미늄 모노스테아레이트 겔로 제형화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 다른 유형의 주사용 서방성 데포 제형은, 예를 들어 미국 특허 제3,773,919호에 기재된 바와 같은 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체와 같은 천천히 분해되는 비독성 비항원성 중합체에 캡슐화되기 위해 분산된 화합물 또는 염을 함유할 것이다. 화합물, 또는 바람직하게는 상기 기재된 것들과 같은 비교적 불용성인 염은 또한 특히 동물에 사용하기 위해, 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛으로 제형화될 수 있다. 추가의 서방성 데포 또는 임플란트 제형, 예를 들어 기체 또는 액체 리포좀이 문헌에 알려져 있다(미국 특허 제5,770,222호 및 문헌["Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978]).

본 발명을 일반적으로 기재하였지만, 이는 예시로서 제공되고 제한으로서 의도되지 않는 하기 실시예를 참조함으로써 더 용이하게 이해될 것이다.

실시예 1: 포유류 세포에서의 TNF 항체의 클로닝 및 발현.

전형적인 포유류 발현 벡터는 mRNA 전사의 개시를 매개하는 하나 이상의 프로모터 요소, 항체 코딩 서열, 및 전사의 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 신호를 함유한다. 추가의 요소는 인핸서, Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱의 공여 및 수용 부위에 인접하는 개재된 서열을 포함한다. 고 효율 전사는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLVI, HIVI로부터의 긴 말단 반복체 (LTR), 및 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 초기 프로모터로 달성될 수 있다. 그러나, 세포성 인자도 사용될 수 있다 (예를 들어, 인간 액틴 프로모터). 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 발현 벡터는, 예를 들어 pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCX(Clonetech Labs, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-), 또는 pcDNA3.1/Hygro (+/-)(Invitrogen), PSVL 및 PMSG(Pharmacia, 스웨덴 웁살라 소재), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC 37146), 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포는 인간 Hela 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 세포 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 퀘일 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다.

대안적으로, 유전자는 염색체 내로 혼입된 유전자를 함유하는 안정적인 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 또는 하이그로마이신과 같은 선택가능한 마커를 이용하는 동시-형질감염은 형질감염된 세포의 확인 및 단리를 가능하게 한다.

형질감염된 유전자는 또한 대량의 암호화된 항체를 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR (디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 목적 유전자의 수백 또는 심지어 수천 개의 카피를 운반하는 세포주를 개발하는 데 유용하다. 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 합성효소(GS)이다(문헌[Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991)]; 문헌[Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)]). 이러한 마커를 사용하여, 포유류 세포를 선택 배지에서 증식시켜, 최고의 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이러한 세포주는 염색체 내로 혼입된 증폭된 유전자(들)를 함유한다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 NSO 세포는 항체 생성에 종종 사용된다.

발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)의 강력한 프로모터(LTR)(문헌[Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)]) + CMV-인핸서의 단편(문헌[Boshart, et al., Cell 41: 521-530(1985)])을 함유한다. 예를 들어, 제한효소 절단 부위 BamHI, XbaI 및 Asp7l8을 갖는 다중 클로닝 부위는 목적 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터는 3' 인트론에 더하여 쥐 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.

CHO 세포에서의 클로닝 및 발현. TNF 항체의 발현을 위해 벡터 pC4를 사용한다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr (ATCC 기탁 번호 37146)의 유도체이다. 이 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 제어 하에서 마우스 DHFR 유전자를 함유한다. 이러한 플라스미드로 형질감염된, 다이하이드로폴레이트 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소- 또는 다른 세포는 화학요법제 메토트렉세이트로 보충된 선택 배지 (예를 들어, 알파 마이너스 MEM, Life Technologies, 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)에서 세포를 배양하여 선택할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 내성인 세포에서 DHFR 유전자의 증폭은 잘 문서화되어 있다(예를 들어, 문헌[F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978)]; 문헌[J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990)]; 및 문헌[M. J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)] 참조). 증가하는 농도의 MTX 중에서 성장된 세포는 DHFR 유전자의 증폭 결과물로서의 표적 효소인 DHFR을 과다생성함으로써 약물에 저항성을 발현한다. 제2 유전자가 DHFR 유전자에 연결되어 있으면, 그것은 통상 동시증폭되고 과발현된다. 증폭된 유전자(들)의 1,000개 초과의 카피를 운반하는 세포주를 개발하는 데 이 접근법이 사용될 수 있음이 당업계에 알려져 있다. 후속으로, 메토트렉세이트가 취출될 때, 숙주 세포의 하나 이상의 염색체(들)에 통합된 증폭된 유전자를 함유하는 세포주가 수득된다.

플라스미드 pC4는 관심 유전자의 발현을 위해 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복(LTR)의 강력한 프로모터(문헌[Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)]) + 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)의 전초기 유전자의 인핸서로부터 단리된 단편(문헌[Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)])을 함유한다. 프로모터의 하류에는 유전자의 통합을 가능하게 하는 BamHI, XbaI, 및 Asp718 제한 효소 절단 부위가 있다. 이들 클로닝 부위 뒤에, 플라스미드는 래트 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 또한, 다른 고효율 프로모터, 예를 들어 인간 베타-액틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 또는 다른 레트로바이러스, 예를 들어 HIV 및 HTLVI로부터의 긴 말단 반복부가 발현을 위해 사용될 수 있다. 포유류 세포에서 조절되는 방식으로 TNF를 발현하기 위해 Clontech의 Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템을 사용할 수 있다(문헌[M. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)]). mRNA의 폴리아데닐화를 위해, 예를 들어 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 다른 신호가 마찬가지로 사용될 수 있다. 염색체에 통합된 관심 유전자를 운반하는 안정한 세포주가 또한 선택가능한 마커, 예컨대 gpt, G418, 또는 하이그로마이신으로의 동시-형질감염 시에 선택될 수 있다. 초기에 하나 초과의 선택가능한 마커, 예를 들어 G418 + 메토트렉세이트를 사용하는 것이 유리하다.

플라스미드 pC4를 제한 효소로 분해한 후, 본 기술 분야에 공지된 방법으로 송아지 장 포스파타제를 사용하여 탈인산화한다. 이어서, 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 단리한다.

이어서, 단리된 가변 및 불변 영역을 암호화하는 DNA 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가제로 라이게이션한다. 이어서, 대장균 HB101 또는 XL-1 블루 세포를 형질전환하고, 예를 들어 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4가 삽입된 단편을 포함하는 박테리아를 확인한다.

활성 DHFR 유전자가 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 형질감염에 사용된다. 리포펙틴을 사용하여 5 ㎍의 발현 플라스미드 pC4를 0.5 ㎍의 플라스미드 pSV2-neo와 함께 동시 형질감염한다. 플라스미드 pSV2네오는 우성 선택가능한 마커, G418을 포함하는 항생제의 군에 대한 내성을 부여하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 네오 유전자를 함유한다. 1 ㎍ /ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 중에 세포를 접종한다. 2일 후에, 세포를 트립신처리하고 하이브리도마 클로닝 플레이트(독일 소재의 Greiner) 내에서 10, 25, 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 + 1 ㎍ /ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM 중에 접종한다. 약 10 내지 14일 후에, 단일 클론을 트립신처리한 후, 상이한 농도의 메토트렉세이트(50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 사용하여 6-웰 페트리 접시 또는 10 ml 플라스크에 접종한다. 이어서, 가장 높은 농도의 메토트렉세이트에서 성장하는 클론을 심지어 더 높은 농도의 메토트렉세이트 (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM)를 함유하는 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴다. 100 내지 200 mM의 농도에서 성장하는 클론을 수득할 때까지 동일한 절차를 반복한다. 예를 들어, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석에 의해 원하는 유전자 생성물의 발현을 분석한다.

실시예 2: 트랜스제닉 마우스를 사용하는 인간 TNF와 반응성인 고친화도 인간 IgG 단일클론 항체의 생성.

요약. 하나 이상의 TNF-매개 질환의 치료를 위한 TNF의 작용을 억제하기 위해 치료적으로 사용될 수 있는 고친화도의 완전 인간 단일클론 항체를 생성하기 위해 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스가 사용되었다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대한 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 (CBA/J x C57/BL6/J) F₂ 하이브리드 마우스를 인간 재조합 TNF로 면역화한다(문헌[Taylor et al., Intl. Immunol. 6:579-591 (1993)]; 문헌[Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994)]; 문헌[Neuberger, M., Nature Biotech. 14:826 (1996)]; 문헌[Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)]). 몇몇 융합체는 완전 인간 TNF 반응성 IgG 단일클론 항체의 하나 이상의 패널을 산출하였다. 완전 인간 항-TNF 항체를 추가로 특성화한다. 모두가 IgG1κ이다. 그러한 항체는 1x10⁹ 내지 9x10¹²의 어딘가에서 친화도 상수를 갖는 것으로 확인된다. 이들 전체 인간 단일클론 항체의 의외로 높은 친화도는, 이들이 TNF 관련 질환, 병리학, 또는 장애에서 치료적 응용을 위한 적합한 후보가 되게 한다.

약어. BSA - 소 혈청 알부민; CO₂ - 이산화탄소; DMSO - 다이메틸 설폭사이드; EIA - 효소 면역검정; FBS - 소 태아 혈청; H₂O₂ - 과산화수소; HRP - 호스래디쉬 퍼옥시다아제; ID - 피내; Ig - 면역글로불린; TNF - 조직 괴사 인자 알파; IP - 복강내; IV - 정맥내; Mab 또는 mAb - 단일클론 항체; OD - 광학 밀도; OPD - o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드; PEG - 폴리에틸렌 글리콜; PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신; RT - 실온; SQ - 피하; v/v - 부피당 부피; w/v - 부피당 중량.

재료 및 방법

동물. 인간 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스는 본 기술 분야에 알려져 있고 구매가능하며(예를 들어, 미국 캘리포니아주 산호세 소재의 GenPharm International; 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재의 Abgenix 등으로부터), 이는 인간 면역글로불린을 발현하지만 마우스 IgM 또는 Igκ는 발현하지 않는다. 예를 들어, 그러한 트랜스제닉 마우스는 V(D)J 결합, 중쇄 클래스 스위칭, 및 체세포 돌연변이를 받아 인간 서열 면역글로불린의 레퍼토리를 생산하는 인간 서열 트랜스유전자를 함유한다(문헌[Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994)]). 경쇄 트랜스유전자는, 예를 들어, 생식세포계열 인간 Vκ 영역의 거의 절반을 포함하는 효모 인공 염색체 클론으로부터 부분적으로 유래될 수 있다. 또한, 중쇄 트랜스유전자는 인간 μ 및 인간 γ1(문헌[Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)]) 및/또는 γ3 불변 영역 둘 모두를 암호화할 수 있다. 적절한 유전자형 계통으로부터 유래된 마우스를 면역화 및 융합 과정에 사용하여, TNF에 대한 전체 인간 단일클론 항체를 생성할 수 있다.

면역화. 하나 이상의 면역화 일정을 사용하여 항-TNF 인간 하이브리도마를 생성할 수 있다. 하기 예시적인 면역화 프로토콜 후에 최초 몇몇 융합을 수행할 수 있지만, 다른 유사한 알려진 프로토콜이 사용될 수 있다. 몇 마리의 14 내지 20 주령의 자성 마우스 및/또는 수술적으로 거세된 트랜스제닉 웅성 마우스를 100 내지 400 μL의 최종 부피(예를 들어, 200) 중에 동일한 부피의 TITERMAX 또는 완전 프로인트 보조제로 유화시킨 1 내지 1000 ㎍의 재조합 인간 TNF로 IP 및/또는 ID 면역화한다. 각각의 마우스는 또한 임의로 2개의 SQ 부위 각각에 100 μL 생리 식염수 중의 1 내지 10 ㎍을 받을 수 있다. 이어서, 마우스는 1 내지 7, 5 내지 12, 10 내지 18, 17 내지 25 및/또는 21 내지 34일 후에 동일한 부피의 TITERMAX 또는 불완전 프로인트 보조제로 유화시킨 TNF로 IP(1 내지 400 ㎍) 및 SQ(1 내지 400 ㎍ x 2) 면역화될 수 있다. 12 내지 25일 및 25 내지 40일 후에 항-응고제 없이 후-안와 천공에 의해 마우스를 채혈할 수 있다. 이어서, 혈액을 1시간 동안 RT에서 응고시키고, 혈청을 수집하고, 알려진 방법에 따라 TNF EIA 검정을 사용하여 적정한다. 반복된 주사가 역가(titer)의 증가를 야기하지 않을 때 융합을 수행한다. 그 시점에, 100 μL 생리 식염수에 희석된 1 내지 400 ㎍ TNF의 최종 IV 부스터 주사를 마우스에게 제공할 수 있다. 3일 후에, 경추 탈골에 의해 마우스를 안락사시키고, 비장을 무균적으로 제거하고, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/mL 암포테리신 B(PSA)를 함유하는 10 mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 침지시킬 수 있다. 비장을 PSA-PBS로 멸균적으로 관류함으로써 비장세포를 수확한다. 세포를 차가운 PSA-PBS 중에 1회 세척하고, 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 계수하고, 25 mM Hepes를 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시킨다.

세포 융합. 예를 들어 본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 알려진 방법에 따라 쥐과 골수종 세포 대 생존가능한 비장 세포의 1:1 내지 1:10 비로 융합을 실행할 수 있다. 비제한적인 예로서, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화할 수 있다. 이어서, 37℃에서 1 mL의 50%(w/v) PEG/PBS 용액(PEG 분자량 1,450, Sigma) 중에 30초에 걸쳐 펠렛을 천천히 재현탁시킬 수 있다. 이어서, 25 mM Hepes(37℃)를 함유하는 10.5 mL의 RPMI 1640 배지를 1분에 걸쳐 천천히 첨가함으로써 융합을 중단시킬 수 있다. 융합된 세포를 500 내지 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서, 세포를 HAT 배지(25 mM Hepes, 10% Fetal Clone I 혈청(Hyclone), 1 mM 피루브산나트륨, 4 mM L-글루타민, 10 ㎍/mL 겐타마이신, 2.5% Origen 배양 보충물(Fisher), 10% 653-조건화 RPMI 1640/Hepes 배지, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI 1640 배지)에 재현탁시킨 후, 200 μL/웰로 15개의 96-웰 평탄 바닥 조직 배양 플레이트 내에 플레이팅한다. 이어서, 플레이트를 7 내지 10일 동안 5% CO₂ 및 95% 공기를 함유하는 가습된 37℃ 인큐베이터에 넣는다.

마우스 혈청 중의 인간 IgG 항-TNF 항체의 검출. 고체상 EIA를 사용하여 인간 TNF에 특이적인 인간 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 스크리닝할 수 있다. 약술하면, 플레이트를 PBS 중의 2 ㎍/mL의 TNF로 하룻밤 코팅할 수 있다. 0.02%(v/v) Tween 20을 함유하는 0.15 M 식염수에 세척한 후, PBS 중의 1%(w/v) BSA, 200 μL/웰로 RT에서 1시간 동안 웰을 차단할 수 있다. 플레이트를 즉시 사용하거나 향후 사용을 위해 -20℃에서 냉동시킨다. 마우스 혈청 희석액을 TNF 코팅된 플레이트 상에서 1시간 동안 RT에서 50 μL/웰로 인큐베이션한다. 플레이트를 세척한 후, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:30,000으로 희석된 50 μL/웰의 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적)로 프로빙한다. 플레이트를 다시 세척하고, 100 μL/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액(0.1 M 시트르산 및 0.2 M 인산나트륨, 0.01% H₂O₂ 및 1 mg/mL OPD)을 RT에서 15분 동안 첨가한다. 이어서 정지 용액(4 N 황산)을 25 μL/웰로 첨가하고, 자동화 플레이트 분광광도계를 통해 490 nm에서 OD를 판독한다.

하이브리도마 상청액 중의 완전 인간 면역글로불린의 검출. 적합한 EIA를 사용하여, 전체 인간 면역글로불린을 분비하는 성장 양성 하이브리도마를 검출할 수 있다. 약술하면, 96 웰 팝-아웃 플레이트(VWR, 610744)를 탄산나트륨 완충제 중의 10 ㎍/mL 염소 항-인간 IgG Fc로 4℃에서 하룻밤 코팅할 수 있다. 플레이트를 세척하고 1% BSA-PBS로 37℃에서 1시간 동안 블로킹하고 즉시 사용하거나 -20℃에서 냉동시킨다. 희석되지 않은 하이브리도마 상청액을 37℃에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:10,000으로 희석된 HRP 표지된 염소 항-인간 카파로 프로빙한다. 이어서, 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션한다.

전체 인간 항-TNF 반응성의 결정. 상기와 같이, 적합한 RIA 또는 다른 검정을 사용하여 하이브리도마를 TNF에 대한 반응성에 대해 동시에 검정할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같이 상청액을 염소 항-인간 IgG Fc 플레이트 상에서 인큐베이션하고 세척한 후, 웰당 적절한 계수를 갖는 방사성 표지된 TNF로 RT에서 1시간 동안 프로빙한다. 웰을 PBS로 2회 세척하고, 결합된 방사성표지된 TNF를 적합한 계수기를 사용하여 정량화한다.

인간 IgG1κ 항-TNF 분비 하이브리도마를 세포 배양에서 확장시키고, 제한 희석에 의해 연속적으로 서브클로닝할 수 있다. 생성된 클론 집단을 확장시키고 냉동 배지(95% FBS, 5% DMSO) 중에 동결보존하고 액체 질소 중에 저장할 수 있다.

동종형 결정. 항체의 동종형 결정은 특정 역가에 대해 마우스 면역 혈청을 스크리닝하기 위해 사용되는 것과 유사한 포맷으로 EIA를 사용하여 수행할 수 있다. TNF를 상기 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트 상에 코팅하고, 2 ㎍/mL의 정제된 항체를 RT에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션할 수 있다. 플레이트를 세척하고, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:4000으로 희석된 HRP 표지된 염소 항-인간 IgG₁ 또는 HRP 표지된 염소 항-인간 IgG₃으로 프로빙한다. 플레이트를 다시 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션한다.

인간 TNF와 인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동역학. 예를 들어, TNF 포획 EIA 및 BIAcore 기술을 사용하여 항체에 대한 결합 특징을 적합하게 평가할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 검정에서 2 ㎍/mL의 TNF로 코팅된 EIA 플레이트에의 결합에 대해 정제된 인간 TNF 항체의 등급화된 농도를 평가할 수 있다. 이어서, 상대 결합 효율을 나타내는 반-로그 플롯으로서 OD가 제시될 수 있다.

정량적 결합 상수는, 예를 들어 하기와 같이, 또는 임의의 다른 알려진 적합한 방법에 의해 얻어질 수 있다. BIAcore CM-5(카르복시메틸) 칩을 BIAcore 2000 단위에 넣는다. HBS 완충제(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v P20 계면활성제, pH 7.4)를 안정한 기저선이 얻어질 때까지 5 μL/분으로 칩의 플로우 셀 위로 유동시킨다. 200 μL의 물 중의 15 mg의 EDC(N-에틸-N'-(3-다이메틸-아미노프로필)-카르보다이이미드 하이드로클로라이드)의 용액(100 μL)을 200 μL의 물 중의 2.3 mg의 NHS(N-하이드록시석신이미드)의 용액 100 μL에 첨가한다. 40 μL의 생성되는 용액을 칩 상에 주입한다. 6 μL의 인간 TNF 용액(10 mM 아세트산나트륨 중의 15 ㎍/mL, pH 4.8)을 칩 상에 주입하여, 약 500 RU의 증가를 유발한다. 완충제를 TBS/Ca/Mg/BSA 작동 완충제(20 mM 트리스, 0.15 M 염화나트륨, 2 mM 염화칼슘, 2 mM 아세트산마그네슘, 0.5% Triton X-100, 25 ㎍/mL BSA, pH 7.4)로 변경하고, 칩 위로 하룻밤 유동시켜 그것을 평형화하고 임의의 미반응 석신이미드 에스테르를 가수분해하거나 캡핑한다.

항체를 작동 완충제 중에 33.33, 16.67, 8.33, 및 4.17 nM로 용해시킨다. 유속을 30 μL/min으로 조정하고 기기 온도를 25℃로 조정한다. 동역학 실행을 위해 2개의 플로우 셀을 사용하며, 하나는 그 위에 TNF가 고정된 것이고(샘플) 두 번째는 유도체화되지 않은 플로우 셀이다(블랭크). 120 μL의 각각의 항체 농도를 30 μL/min으로 플로우 셀 위에 주입한 후(회합 단계), 중단되지 않는 360초의 완충제 유동(해리 단계)이 이어진다. 2 M 구아니딘 티오시아네이트의 각각 30 μL의 순차적 2회 주입에 의해 칩의 표면을 재생한다(조직 괴사 인자 알파/항체 복합체가 해리됨).

데이터의 분석은 본 기술 분야에 알려진 바와 같이 BIA 평가 3.0 또는 CLAMP 2.0을 사용하여 실행한다. 각각의 항체 농도에 대해, 샘플 센소그램으로부터 블랭크 센소그램을 감산한다. 해리(k_d, sec^-1) 및 회합(k_a, mol^-1 sec^-1) 둘 모두에 대해 전반적 적합(global fit)을 실행하고 해리 상수(K_D, mol)를 계산한다(k_d/k_a). 포획된 항체의 RU가 100을 초과할 만큼 항체 친화도가 충분히 높은 경우에는, 항체의 추가 희석이 실행된다.

결과 및 토의

항-인간 TNF 단일클론 항체의 생성. 몇몇 융합을 수행하고 각각의 융합을 15개의 플레이트에 접종하며(1440 웰/융합), 이는 인간 TNF에 특이적인 수십 개의 항체를 산출한다. 이들 중에서, 일부는 인간 및 마우스 Ig 사슬의 조합으로 이루어진 것으로 확인된다. 나머지 하이브리도마는 인간 중쇄 및 경쇄만으로 이루어진 항-TNF 항체를 분비한다. 인간 하이브리도마 중 모두가 IgG1κ일 것으로 예상된다.

인간 항-인간 TNF 항체의 결합 동역학. 이들 하이브리도마 중 대부분 또는 전부로부터 정제된 항체가 농도-의존적 방식으로 TNF에 결합함이 ELISA 분석에 의해 확인되었다. 도 1 및 도 2는 이들 항체의 상대 결합 효율의 결과를 나타낸다. 이 경우에, 항체의 동족 항원(에피토프)에 대한 항체의 결합활성을 측정한다. EIA 플레이트에 직접 TNF를 결합시키는 것은 단백질의 변성을 야기할 수 있고, 외견상의 결합 친화도는 비변성 단백질에 대한 결합을 반영할 수 없음에 유의하여야 한다. 소정 범위의 농도에 걸쳐 50 퍼센트의 결합이 확인된다.

인간 항체의 BIAcore 분석을 사용하여 정량적 결합 상수가 얻어지며, 인간 단일클론 항체 중 몇 개는 1x10^-9 내지 7x10^-12 범위의 K_D로 매우 높은 친화도인 것으로 밝혀진다.

결론.

인간 TNF로 면역화된 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 하이브리드 마우스로부터의 비장세포를 이용하여 몇몇 융합을 수행한다. IgG1κ 동종형의 몇몇 완전 인간 TNF 반응성 IgG 단일클론 항체의 세트가 생성되었다. 완전 인간 항-TNF 항체를 추가로 특성화한다. 생성된 항체 중 몇 개는 친화도 상수가 1x10⁹ 내지 9x10¹²였다. 이들 전체 인간 단일클론 항체의 의외로 높은 친화도는, 이들이 TNF-의존성 질환, 병리학, 또는 관련 병태에서 치료적 응용에 적합하게 한다.

실시예 3: 인간 TNFα에 대해 반응성인 인간 IgG 단일클론 항체의 생성.

요약. 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대해 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 (CBA/J x C57BL/6J) F₂ 하이브리드 마우스(1 내지 4 마리)를 재조합 인간 TNFα로 면역화하였다. GenTNV로 명명된 하나의 융합은 고정된 재조합 인간 TNFα에 결합하는 8개의 전체적 인간 IgG1κ 단일클론 항체를 산출하였다. 확인 직후에, 8개의 세포주를 추가의 특성화를 위해 분자 생물학으로 이전하였다. 이들 Mab는 서열이 전체적으로 인간이므로, 이들은 인간에서 cA2(Remicade)보다 덜 면역원성일 것으로 예상된다.

약어. BSA - 소 혈청 알부민; CO₂ - 이산화탄소; DMSO - 다이메틸 설폭사이드; EIA - 효소 면역검정; FBS - 소 태아 혈청; H₂O₂ - 과산화수소; HC - 중쇄; HRP - 호스래디쉬 퍼옥시다아제; ID - 피내; Ig - 면역글로불린; TNF - 조직 괴사 인자 알파; IP - 복강내; IV - 정맥내; Mab - 단일클론 항체; OD - 광학 밀도; OPD - o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드; PEG - 폴리에틸렌 글리콜; PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신; RT - 실온; SQ - 피하; TNFα - 종양 괴사 인자 알파; v/v - 부피당 부피; w/v - 부피당 중량.

서론. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 재조합 인간 TNFα에 특이적인 전체적 인간 단일클론 항체를 생성하였다. cA2(Remicade)가 TNFα-매개 질환에 관여하는 염증 과정을 치료적으로 억제하기 위해 사용되듯이, 혈청 반감기의 증가 및 면역원성에 관련된 부작용의 감소의 이점과 함께 이들 독특한 항체가 사용될 수 있기를 희망한다.

본 명세서에서 정의된 바와 같이, 용어 "반감기"는 약물(예를 들어, 요법적 항-TNFα 항체)의 혈장 농도가 1회의 제거 반감기 후에 절반이 되는 것을 나타낸다. 따라서, 각각의 후속하는 반감기에서, 더 적은 약물이 제거된다. 1회의 반감기 후, 체내에 남아 있는 약물의 양은 50%, 2회의 반감기 후 25% 등이다. 약물의 반감기는 그의 클리어런스 및 분포 부피에 의존한다. 제거 반감기는 체내의 약물의 양과 무관한 것으로 간주된다.

재료 및 방법.

동물. 마우스 IgM 또는 Igκ가 아닌 인간 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 마우스는 GenPharm International에 의해 개발되었다. 이들 마우스는 V(D)J 결합, 중쇄 클래스 스위칭, 및 체세포 돌연변이를 받아 항원-특이적 인간 면역글로불린(1)의 레퍼토리를 생산하는 기능적 인간 항체 트랜스유전자를 함유한다. 경쇄 트랜스유전자는, 생식세포계열 인간 Vκ 유전자좌의 거의 절반을 포함하는 효모 인공 염색체 클론으로부터 부분적으로 유래된다. 몇몇 VH 유전자에 더하여, 중쇄(HC) 트랜스유전자는 인간 μ 및 인간 γ1 (2) 및/또는 γ3 불변 영역 둘 모두를 암호화한다. HCo12/KCo5 유전자형 계통으로부터 유래된 마우스를 면역화 및 융합 과정에 사용하여 본 명세서에 기재된 단일클론 항체를 생성하였다.

인간 TNFα의 정제. Sepharose 4B(Pharmacia)에 커플링된 TNFα 수용체-Fc 융합 단백질(p55-sf2)(5)로 패킹된 컬럼을 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 C237A 세포로부터의 조직 배양 상청액으로부터 인간 TNFα를 정제하였다. 세포 상청액을 그의 부피의 1/9의 10x 둘베코 PBS(D-PBS)와 혼합하고 4 ^o C에서 4 mL/min으로 컬럼에 통과시켰다. 이어서, 컬럼을 PBS로 세척하고 TNFα를 0.1 M 시트르산나트륨, pH 3.5로 용출시키고, 2 M 트리스-HCl pH 8.5로 중화시켰다. 정제된 TNFα를 10 mM 트리스, 0.12 M 염화나트륨 pH 7.5로 완충제 교환하고, 0.2 um 주사기 필터를 통해 여과하였다.

면역화. 대략 16 주령의 자성 GenPharm 마우스를, 일수 0, 12, 및 28에 동일한 부피의 Titermax 보조제로 유화시킨 TNFα(로트 JG102298 또는 JG102098) 총 100 ㎍으로 IP(200 μL) 및 ID(꼬리의 기부에서 100 μL) 면역화하였다. 일수 21 및 35에 항-응고제 없이 후안와 천공에 의해 마우스를 채혈하였다. 혈액을 RT에서 1시간 동안 응고시키고, 혈청을 수집하고, TNFα 고체상 EIA 검정을 사용하여 적정하였다. 일수 28의 주사 후 7주 동안 마우스가 휴식하도록 한 후에 GenTNV로 명명된 융합을 수행하였다. 이어서, TNFα에 대해 1:160의 특이적 인간 IgG 역가를 갖는 마우스에게 100 μL의 생리 식염수에 희석된 50 ㎍의 TNFα의 최종 IV 부스터 주사를 제공하였다. 3일 후에, 경추 탈골에 의해 마우스를 안락사시키고, 비장을 무균적으로 제거하고, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/mL 암포테리신 B(PSA)를 함유하는 10 mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 침지시켰다. 비장을 PSA-PBS로 멸균적으로 관류함으로써 비장세포를 수확하였다. 세포를 차가운 PSA-PBS 중에 1회 세척하고, 쿨터(Coulter) 계수기를 사용하여 계수하고, 25 mM Hepes를 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다.

세포주. 비-분비 마우스 골수종 융합 파트너, 653을 5-14-97에 Centocor의 제품 개발군으로부터 세포 생물학 서비스(CBS) 그룹 내로 수용하였다. 세포주를 10%(v/v) FBS(Cell Culture Labs), 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-글루타민(모두 JRH Biosciences로부터 입수함)으로 보충된 RPMI 배지(JRH Biosciences) 중에 확장시키고, 95% FBS 및 5% DMSO(Sigma) 중에 동결보존한 후, CBS 내의 증기상 액체 질소 냉동기에 저장하였다. 세포 은행은 멸균상태였고(Quality Control Centocor, 맬버른 소재) 마이코플라스마가 없었다(Bionique Laboratories). 융합될 때까지 세포를 대수기 배양으로 유지하였다. 이들을 PBS에 세척하고, 계수하고, 융합 전에 트리판 블루 염료 배제를 통해 생존력을 결정하였다(95% 초과).

Centocor의 분자 생물학에서 생성된, C237A로 명명된 재조합 세포주에 의해 인간 TNFα가 생산되었다. 세포주를 5%(v/v) FBS(Cell Culture Labs), 2 mM L-글루타민(모두 JRH Biosciences로부터 입수함), 및 0.5 :g/mL 마이코페놀산으로 보충된 IMDM 배지(JRH Biosciences) 중에 확장시키고, 95% FBS 및 5% DMSO(Sigma) 중에 동결보존한 후, CBS 내의 증기상 액체 질소 냉동기에 저장하였다(13). 세포 은행은 멸균상태였고(Quality Control Centocor, 맬버른 소재) 마이코플라스마가 없었다(Bionique Laboratories).

세포 융합. 1:1 비의 653 쥐과 골수종 세포 및 생존가능한 쥐과 비장 세포를 사용하여 세포 융합을 실행하였다. 약술하면, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화하였다. 펠렛을 37℃에서 1 mL의 50%(w/v) PEG/PBS 용액(1,450 g/몰의 PEG 분자량, Sigma) 중에 30초 기간에 걸쳐 천천히 재현탁시켰다. 10.5 mL의 RPMI 배지(첨가제 없음)(JRH)(37℃)를 1분에 걸쳐 천천히 첨가함으로써 융합을 중단하였다. 융합된 세포를 750 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포를 HAT 배지(10% 소 태아 혈청(JRH), 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM L-글루타민, 10 ㎍/mL 겐타마이신, 2.5%의 Origen 배양 보충물(Fisher), 50 μM 2-메르캅토에탄올, 1% 653-조건화 RPMI 배지, 100 μM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 RPMI/HEPES 배지)에 재현탁시킨 후, 200 μL/웰로 5개의 96-웰 평탄 바닥 조직 배양 플레이트 내에 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 7 내지 10일 동안 5% CO₂ 및 95% 공기를 함유하는 가습된 37℃ 인큐베이터에 넣었다.

마우스 혈청 중의 인간 IgG 항-TNFα 항체의 검출. 고체상 EIA를 사용하여 인간 TNFα에 특이적인 인간 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 스크리닝하였다. 약술하면, 플레이트를 PBS 중의 1 ㎍/mL의 TNFα로 하룻밤 코팅하였다. 0.02%(v/v) Tween 20을 함유하는 0.15 M 식염수에 세척한 후, PBS 중의 1%(w/v) BSA, 200 μL/웰로 RT에서 1시간 동안 웰을 차단하였다. 플레이트를 즉시 사용하거나 향후 사용을 위해 -20℃에서 냉동시켰다. 마우스 혈청을 RT에서 1시간 동안 50 μL/웰로 인간 TNFα-코팅된 플레이트 상에서 2-배 연속 희석으로 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:30,000으로 희석된 50 μL/웰의 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적)(아큐레이트(Accurate))로 프로빙하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 100 μL/웰의 시트레이트-포스페이트 기질 용액(0.1 M 시트르산 및 0.2 M 인산나트륨, 0.01% H₂O₂, 및 1 mg/mL OPD)을 RT에서 15분 동안 첨가하였다. 이어서 정지 용액(4 N 황산)을 25 μL/웰로 첨가하고, 자동화 플레이트 분광광도계를 사용하여 490 nm에서 OD를 판독하였다.

하이브리도마 상청액 중의 전체적 인간 면역글로불린의 검출. GenPharm 마우스는 마우스 및 인간 면역글로불린 사슬 둘 모두를 생성할 수 있기 때문에, 2개의 별도의 EIA 검정을 사용하여 인간 경쇄 및 인간 중쇄 둘 모두의 존재에 대해 성장-양성 하이브리도마 클론을 시험하였다. 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 코팅하고 희석하지 않은 하이브리도마 상청액을 플레이트 상에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-HBSS에 1:10,000으로 희석된 HRP-접합 염소 항-인간 카파(Southern Biotech) 항체 또는 1% BSA-HBSS에 1:30,000으로 희석된 HRP-접합 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 1시간 동안 37℃에서 프로빙하였다. 이어서, 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션하였다. 항-인간 카파 및 항-인간 IgG Fc EIA 포맷 둘 모두에서 양성 신호를 제공하지 않은 하이브리도마 클론은 폐기하였다.

동종형 결정. 항체의 동종형 결정은 특정 역가에 대해 마우스 면역 혈청을 스크리닝하기 위해 사용되는 것과 유사한 포맷으로 EIA를 사용하여 수행하였다. EIA 플레이트를 염소 항-인간 IgG(H+L)로 탄산나트륨 완충제 중의 10 :g/mL로 4℃에서 하룻밤 코팅하고, 상기 기재된 바와 같이 차단하였다. 24 웰 배양물로부터의 순수 상청액을 RT에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, RT에서 1시간 동안 1% BSA-PBS에 1:4000으로 희석된 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄(바인딩 사이트(Binding Site))로 프로빙하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션하였다.

결과 및 토의. 전체적 인간 항-인간 TNFα 단일클론 항체의 생성. 재조합 인간 TNFα 단백질로 면역화된 GenPharm 마우스로부터 GenTNV로 명명된 하나의 융합을 수행하였다. 이러한 융합으로부터, 196개의 성장-양성 하이브리드를 스크리닝하였다. 인간 TNFα와 반응성인 전체적 인간 IgG 항체를 분비하는 8개의 하이브리도마 세포주를 확인하였다. 이들 8개의 세포주 각각은 인간 IgG1κ 동종형의 면역글로불린을 분비하고, 제한 희석에 의해 모두 2회 서브클로닝하여 안정한 세포주를 얻었다(90% 초과로 균질함). 세포주 명칭 및 각각의 C 코드 표기가 표 1에 열거되어 있다. 각각의 세포주를 액체 질소에 저장된 12-바이알 연구 세포 은행에 냉동시켰다.

8개의 세포주 각각에 대해 24-웰 배양 접시의 웰로부터 수집한 모 세포를 2-18-99에 형질감염 및 추가의 특성화를 위해 분자 생물학 그룹에 인계하였다.

[표 1]

결론.

Centocor에서 제조된 재조합 인간 TNFα로 면역화한 인간 가변 및 불변 영역 항체 트랜스유전자를 함유하는 하이브리드 마우스로부터의 비장세포를 이용하여 GenTNV 융합을 수행하였다. IgG1κ 동종형의 전체적 인간 TNFα-반응성 IgG 단일클론 항체 8개가 생산되었다. 추가의 특성화 및 개발을 위해 모 세포주를 분자 생물학 그룹에 이전하였다. 이들 새로운 인간 항체 중 하나는 Remicade와 비교하여 감소된 면역원성 및 알레르기-유형 합병증의 잠재적인 이익을 갖는 항염증에 유용한 것으로 입증될 수 있다.

참고문헌:

Taylor, et al.,. International Immunology 6:579-591 (1993).

Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994).

Neuberger, M. Nature Biotechnology 14:826 (1996).

Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996).

Scallon, et al., Cytokine 7:759-770 (1995).

실시예 4: 인간 항-TNFα 항체를 발현하는 세포주의 클로닝 및 제조.

요약. TNV 표기를 갖는 8개의 인간 단일클론 항체(mAb)의 패널은 고정된 인간 TNFα에 외견상 높은 결합활성으로 결합하는 것으로 확인되었다. 8개의 mAb 중 7개는 재조합 TNF 수용체에 대한 huTNFα 결합을 효율적으로 차단하는 것으로 나타났다. 7개의 mAb를 암호화하는 DNA의 서열 분석에 의해 모든 mAb가 인간 V 영역을 가졌음이 확인되었다. 또한, 8개의 mAb의 원래의 패널이 TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196로 나타낸 4개의 별개의 mAb 만을 함유하도록, 3쌍의 mAb가 서로 동일하였음이 DNA 서열에 의해 밝혀졌다. mAb의 추정된 아미노산 서열의 분석 및 시험관내 TNFα 중화 데이터의 결과에 기초하여, 추가의 연구를 위해 mAb TNV148 및 TNV14를 선택하였다.

데이터베이스 검색 중에 TNV148 중쇄 내의 위치 75(프레임워크 3)에 있는 프롤린 잔기가 동일한 하위군의 다른 인간 항체 내의 그 위치에서 확인되지 않았으므로, 알려진 생식세포계열 프레임워크 e 서열에 그것을 일치시키기 위하여 부위-지정 DNA 돌연변이유발을 수행하여 그 위치에 세린 잔기를 암호화하였다. 세린 변형된 mAb를 TNV148B로 표기하였다. 2000년 10월 7일자로 출원되고 발명의 명칭이 "IL-12 항체, 조성물, 방법, 및 용도(IL-12 Antibodies, Compositions, Methods and Uses)"이며 WO 02/12500으로서 공개된, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제60/236,827호에 개시된 최근에 클로닝된 다른 인간 mAb의 중쇄 및 경쇄 유전자(12B75)에 기초한 새로 제조된 발현 벡터 내로 TNV148B 및 TNV14의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 PCR-증폭 DNA를 클로닝하였다.

P3X63Ag8.653(653) 세포 또는 Sp2/0-Ag14(Sp2/0) 마우스 골수종 세포를 각각의 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드로 형질감염하고 높은 수준의 재조합 TNV148B 및 TNV14(rTNV148B 및 rTNV14) mAb를 생산하는 세포주에 대해 2 라운드의 서브클로닝을 통해 스크리닝하였다. 성장 곡선 및 시간 경과에 따른 mAb 생산의 안정성의 평가에 의해 653-형질감염체 클론 C466D 및 C466C는 소모된 배양물에서 대략 125 :g/ml의 rTNV148B mAb를 안정하게 생산한 반면에 Sp2/0 형질감염체 1.73-12-122(C467A)는 소모된 배양물에서 대략 25 :g/ml의 rTNV148B mAb를 안정하게 생산한 것으로 나타났다. 유사한 분석에 의해 Sp2/0-형질감염체 클론 C476A는 소모된 배양물에서 18 :g/ml의 rTNV14를 생산한 것으로 나타났다.

서론. 인간 TNFα-면역화 GenPharm/Medarex 마우스(HCo12/KCo5 유전자형)로부터 유래된 8개의 mAb의 패널은 인간 TNFα에 결합하고 전체적 인간 IgG1, 카파 동종형을 갖는 것으로 이전에 나타났다. 단순 결합 검정을 사용하여, TNFα가 재조합 TNF 수용체에 결합하는 것을 차단하는 그들의 능력을 평가함으로써, 본 발명의 예시적인 mAb가 TNFα-중화 활성을 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하였다. 그러한 결과, DNA 서열 결과, 및 mAb 중 몇개의 시험관내 특성화에 기초하여, 추가로 특성화할 mAb로서 TNV148이 선택되었다.

TNV148 mAb를 암호화하는 DNA 서열을 클로닝하고, 적합한 불변 영역을 암호화하는 유전자 발현 벡터 내로 적합되도록 변형하고, 잘 특성화된 653 및 Sp2/0 마우스 골수종 세포 내로 도입하고, 생성되는 형질감염 세포주를 원래의 하이브리도마 세포주보다 40-배 더 많은 mAb를 생산하는 서브클론이 확인될 때까지 스크리닝하였다.

재료 및 방법.

시약 및 세포. TRIZOL 시약은 Gibco BRL로부터 구매하였다. 프로테이나제 K는 Sigma Chemical Company로부터 입수하였다. 역전사효소는 Life Sciences, Inc.로부터 입수하였다. Taq DNA 폴리머라제는 Perkin Elmer Cetus 또는 Gibco BRL로부터 입수하였다. 제한 효소는 New England Biolabs로부터 구매하였다. QIAquick PCR 정제 키트는 Qiagen으로부터 입수하였다. QuikChange 부위-지정 돌연변이유발 키트는 Stratagene으로부터 구매하였다. Wizard 플라스미드 미니프렙 키트 및 RNasin은 Promega로부터 입수하였다. Optiplate는 Packard로부터 입수하였다. ¹²⁵요오드는 Amersham으로부터 구매하였다. 주문제작 올리고뉴클레오티드는 Keystone/Biosource International로부터 구매하였다. 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드의 명칭, 식별 번호, 및 서열은 표 2에 나타낸다.

[표 2]

TNV mAb 유전자를 클로닝하거나 조작하거나 서열분석하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드.

올리고뉴클레오티드 5'14s 및 HuH-J6에 의해 암호화되는 아미노산은 서열 위에 나타낸다. 'M' 아미노산 잔기는 번역 시작 코돈을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 5'14s 및 HuH-J6 내의 밑줄 친 서열은 각각 BsiWI 및 BstBI 제한 부위를 표시한다. HuH-J6 내의 사선은 엑손/인트론 경계에 상응한다. 서열이 (-) 스트랜드에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 3'-5' 배향으로 작성되어 있음에 유의한다.

653 마우스 골수종 세포의 단일 냉동 바이알을 얻었다. 바이알을 그 날에 해동시키고, T 플라스크에서 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민(배지) 중에 확장시켰다. 이들 세포를 본 명세서에 기재된 항-TNF DNA로 2 내지 3주 후에 형질감염시킬 때까지 연속 배양 중에 유지하였다. 배양물 중의 일부를 해동일 후 5일에 수확하고, 원심분리에 의해 펠렛화하고, 95% FBS, 5% DMSO 중에 재현탁시키고, 30개의 바이알 내로 분취하고, 냉동시키고, 향후 사용을 위해 저장하였다. 유사하게, Sp2/0 마우스 골수종 세포의 단일 냉동 바이알을 얻었다. 바이알을 해동시키고, 상기 기재된 바와 같이 새로운 냉동물을 제조하고, 냉동된 바이알을 CBC 냉동기 박스 AA 및 AB에 저장하였다. 이들 세포를 해동시키고, 본 명세서에 기재된 모든 Sp2/0 형질감염에 사용하였다.

수용체에 대한 TNF 결합의 억제에 대한 검정. TNV mAb를 함유하는 하이브리도마 세포 상청액을 사용하여, 재조합 TNF 수용체 융합 단백질인 p55-sf2에 대한 ¹²⁵I-표지된 TNFα의 결합을 차단하는 mAb의 능력에 대해 검정하였다(문헌[Scallon et al. (1995) Cytokine 7:759-770]). PBS 중의 0.5 :g/ml의 p55-sf2 50 :l를 Optiplate에 첨가하여 37℃에서 1시간 인큐베이션 중에 웰을 코팅하였다. 희석제로서 PBS/0.1% BSA를 사용하여 8개의 TNV 세포 상청액의 연속 희석액을 96-웰 둥근 바닥 플레이트 내에 제조하였다. 항-IL-18 mAb를 함유하는 세포 상청액을 음성 대조군으로서 포함시켰고, cA2(항-TNF 키메라 항체, Remicade, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,770,198호)로 스파이킹된 동일한 항-IL-18 상청액을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 5 ng/ml의 최종 TNFα 농도를 갖도록 ¹²⁵ I-표지된 TNFα(58℃i/:g, D. Shehey)를 100 :l의 세포 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 코팅된 Optiplate를 세척하여 미결합 p55-sf2를 제거하고 50 :l의 ¹²⁵I-TNFα/세포 상청액 혼합물을 Optiplate에 이전하였다. RT에서 2시간 후에, Optiplate를 PBS-Tween으로 3회 세척하였다. 100 :l의 Microscint -20을 첨가하고, 결합된 cpm을 TopCount 감마 계수기를 사용하여 결정하였다.

V 유전자의 증폭 및 DNA 서열 분석. 하이브리도마 세포를 PBS에 1회 세척한 후, RNA 제조를 위해 TRIZOL 시약을 첨가하였다. 7 X 10⁶ 내지 1.7 X 10⁷ 세포를 1 ml의 TRIZOL에 재현탁시켰다. 200 μl의 클로로포름을 첨가한 후에 튜브를 격렬하게 진탕하였다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 수성상을 새로운 마이크로퓨지 튜브에 이전하고 동일한 부피의 아이소프로판올을 첨가하였다. 튜브를 격렬하게 진탕하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 1 ml의 70% 에탄올로 1회 세척하고 진공 건조기 내에서 잠시 건조시켰다. RNA 펠렛을 40 μl의 DEPC-처리된 물로 재현탁시켰다. 1% 아가로스 겔에서 0.5 μl를 분별함으로써 RNA 제조물의 품질을 결정하였다. 사용할 때까지 RNA를 -80℃ 냉동기에 저장하였다.

중쇄 및 경쇄 cDNA를 제조하기 위하여, 11.5 μl의 부피 내에 3 μl의 RNA 및 1 ㎍의 올리고뉴클레오티드 119(중쇄) 또는 올리고뉴클레오티드 117(경쇄)(표 1 참조)을 포함하는 혼합물을 제조하였다. 수조 내에서 10분 동안 70℃에서 혼합물을 인큐베이션한 후, 10분 동안 얼음 상에서 냉각시켰다. 2.5 μl의 10X 역전사효소 완충제, 10 μl의 2.5 mM dNTP, 1 μl의 역전사효소(20 단위), 및 0.4 μl의 리보뉴클레아제 억제제 RNasin(1 단위)으로 구성된 별도의 혼합물을 제조하였다. 이 혼합물 13.5 μl를 냉각된 RNA/올리고뉴클레오티드 혼합물 11.5 μl에 첨가하고, 반응물을 42℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, cDNA 합성 반응물을 사용할 때까지 -20℃ 냉동기에 저장하였다.

가변 영역 코딩 서열을 PCR 증폭하기 위한 주형으로서 정제하지 않은 중쇄 및 경쇄 cDNA를 사용하였다. 5개의 올리고뉴클레오티드 쌍(366/354, 367/354, 368/354, 369/354, 및 370/354, 표 1)을 중쇄 DNA의 증폭을 프라이밍하는 그들의 능력에 대해 동시에 시험하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드 쌍(362/208 및 363/208)을 경쇄 DNA의 증폭을 프라이밍하는 그들의 능력에 대해 동시에 시험하였다. 50 μl의 총 부피 내에 2 단위의 PLATINUM™ 고충실도(HIFI) Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 PCR 반응을 실행하였다. 각각의 반응은 2 μl의 cDNA 반응물, 10 pmol의 각각의 올리고뉴클레오티드, 0.2 mM의 dNTP, 5 μl의 10 X HIFI 완충제, 및 2 mM의 황산마그네슘을 포함하였다. 열 사이클러 프로그램은 5분 동안 95℃에 이어서 30사이클의(30초 동안 94℃, 30초 동안 62℃, 1.5분 동안 68℃)였다. 이어서, 68℃에서 10분 동안의 최종 인큐베이션이 있었다.

직접 DNA 서열분석을 위한 PCR 생성물을 제조하기 위하여, 제조자의 프로토콜에 따라 QIAquick™ PCR 정제 키트를 사용하여 그들을 정제하였다. 50 μl의 멸균수를 사용하여 DNA를 스핀 컬럼으로부터 용출시킨 후, 진공 건조기를 사용하여 10 μl의 부피까지 건조시켰다. 이어서, 20 μl의 총 부피에 대해 1 μl의 정제된 PCR 생성물, 10 μM의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 4 μl의 BigDye Terminator™ 준비 반응 믹스, 및 14 μl의 멸균수로 DNA 서열분석 반응을 설정하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 367/354로 제조된 중쇄 PCR 생성물을 올리고뉴클레오티드 프라이머 159 및 360으로 서열분석하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 363/208로 제조된 경쇄 PCR 생성물을 올리고뉴클레오티드 34 및 163으로 서열분석하였다. 서열분석을 위한 열 사이클러 프로그램은 25 사이클의(30초 동안 96℃, 15초 동안 50℃, 4분 동안 60℃)에 이어서 4℃에서 하룻밤이었다. 반응 생성물을 폴리아크릴아미드 겔을 통해 분별하고 ABI 377 DNA 서열분석기를 사용하여 검출하였다.

아미노산을 변화시키기 위한 부위-지정 돌연변이유발. TNV148 mAb 내의 세린 잔기로 Pro⁷⁵를 대체하기 위하여 TNV148 중쇄 가변 영역 DNA 서열 내의 단일 뉴클레오티드를 변화시켰다. 제조자에 의해 기재된 바와 같은 QuikChange™ 부위-지정 돌연변이유발 방법을 사용하여, 이 변화를 실행하기 위해 상보적인 올리고뉴클레오티드, 399 및 400(표 1)을 설계하고 주문하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드를 먼저 15% 폴리아크릴아미드 겔을 통해 분별하고 주요 밴드를 정제하였다. 10 ng 또는 50 ng의 TNV148 중쇄 플라스미드 주형(p1753), 5 μl의 10x 반응 완충제, 1 μl의 dNTP 믹스, 125 ng의 프라이머 399, 125 ng의 프라이머 400, 및 1 μl의 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 돌연변이유발 반응물을 제조하였다. 멸균수를 첨가하여 총 부피를 50 μl로 만들었다. 이어서, 반응 혼합물을 30초 동안 95℃, 그리고 이어서 30초 동안 95℃, 1분 동안 55℃, 1분 동안 64℃, 및 7분 동안 68℃의 순차적 인큐베이션으로 14회 사이클링 후, 2분 동안 30℃(1 사이클)에서 인큐베이션하도록 프로그래밍된 열 사이클러 내에서 인큐베이션하였다. 이들 반응은 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 그 외에는 동일한 새로 합성된 플라스미드에 통합하도록 설계되었다. 원래의 TNV148 플라스미드를 제거하기 위하여, 샘플을 1 μl의 DpnI 엔도뉴클레아제의 첨가 후 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였으며, 이는 원래의 메틸화된 플라스미드만을 절단한다. 이어서, 1 μl의 반응물을 사용하여 표준 열-쇼크 방법에 의해 에피쿠리안 콜라이(Epicurian Coli) XL1-블루 수퍼컴피턴트 이. 콜라이를 형질전환하고, LB-암피실린 한천 플레이트 상에 플레이팅한 후에 형질전환된 박테리아를 확인하였다. 제조자에 의해 기재된 바와 같이 Wizard™ 키트를 사용하여 플라스미드 미니프렙을 제조하였다. Wizard™ 컬럼으로부터 샘플을 용출시킨 후에, 플라스미드 DNA를 에탄올로 침전시켜 플라스미드 DNA를 추가로 정제하고, 이어서 20 μl의 멸균수에 재현탁시켰다. 이어서, DNA 서열 분석을 수행하여, 원하는 염기 변화를 가진 플라스미드 클론을 확인하고, TNV148 코딩 서열 내로 다른 염기 변화가 의도하지 않게 도입되지 않았음을 확인하였다. 1 μl의 플라스미드에, 섹션 4.3에 기재된 것과 동일한 파라미터를 사용하여, 3 μl의 빅다이 믹스, 1 μl의 pUC19 정방향 프라이머, 및 10 μl의 멸균수로 제조된 사이클 서열분석 반응을 적용하였다.

12B75 유전자로부터의 발현 벡터의 작제. 몇몇 재조합 DNA 단계를 수행하여, 2000년 10월 7일자로 출원되고 발명의 명칭이 "IL-12 항체, 조성물, 방법, 및 용도"이며 WO 02/12500으로서 공개된, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제60/236,827호에 개시된 12B75-암호화 중쇄 및 경쇄 유전자의 이전에 클로닝된 게놈 카피로부터의 새로운 인간 IgG1 발현 벡터 및 새로운 인간 카파 발현 벡터를 각각 제조하였다. 임의의 적절하게 설계된 PCR-증폭된 가변 영역에 의한 기존의 가변 영역 서열의 단순한 1-단계 대체를 허용하도록 최종 벡터를 설계하였다.

플라스미드 p1560에서 12B75 중쇄 유전자를 변형시키기 위하여, 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 6.85 kb BamHI/HindIII 단편을 p1560으로부터 pUC19로 이전하여 p1743을 제조하였다. p1560에 비교하여 이 플라스미드의 더 작은 크기는, 제조자의 프로토콜에 따라 번역 개시 부위의 바로 상류에 독특한 BsiWI 클로닝 부위를 도입하기 위한 QuikChange™ 돌연변이유발(올리고뉴클레오티드 BsiWI-1 및 BsiWI-2를 사용함)의 사용을 가능하게 하였다. 생성되는 플라스미드를 p1747로 명명하였다. 가변 영역의 3' 말단에 BstBI 부위를 도입하기 위하여, SalI 및 BstBI 부위를 갖는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 이 프라이머를 pUC 역방향 프라이머와 함께 사용하여 p1747로부터 2.75 kb 단편을 증폭하였다. 이어서, 이 단편을 12B75 가변 영역 및 HindIII 부위 내의 천연 발생 SalI 부위 내로 다시 클로닝함으로써, 독특한 BstB1 부위를 도입하였다. p1750으로 표기되는 생성되는 중간체 벡터는 BsiWI 및 BstBI 말단을 갖는 가변 영역 단편을 수용할 수 있었다. 불변 영역이 12B75 유전자로부터 또한 유래된 중쇄 벡터의 버전을 제조하기 위하여, HindIII 부위의 하류에 EcoRI 부위를 갖도록 p1750 내의 BamHI-HindIII 삽입물을 pBR322에 이전하였다. 이어서, 생성되는 플라스미드 p1768을 HindIII 및 EcoRI으로 분해하고, 큰 BamHI-BamHI 단편을 p1560으로부터 pBC 내로 클로닝함에 의해 유래된 서브클론인, p1744로부터의 5.7 kb HindIII-EcoRI 단편에 라이게이션하였다. 이어서, 생성되는 플라스미드 p1784를 BsiWI 및 BstBI 말단을 갖는 TNV Ab cDNA 단편에 대한 벡터로서 사용하였다. 추가의 작업을 실행하여 발현 벡터 p1788 및 p1798을 제조하였으며, 이는 12B75 유전자로부터의 IgG1 불변 영역을 포함하고 그들이 얼마나 많은 12B75 중쇄 J-C 인트론을 함유하는지에 의해 서로 상이하다.

플라스미드 p1558 내의 12B75 경쇄 유전자를 변형하기 위하여, 12B75 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 5.7 kb SalI/AflII 단편을 p1558로부터 플라스미드 L28의 XhoI/AflII 부위 내로 이전하였다. 이러한 새로운 플라스미드 p1745는 돌연변이유발 단계를 위한 더 작은 주형을 제공하였다. 올리고뉴클레오티드(C340salI 및 C340sal2)를 사용하여, QuikChange™ 돌연변이유발에 의해 가변 영역의 5' 말단에 독특한 SalI 제한 부위를 도입하였다. 생성되는 중간체 벡터 p1746은 가변 영역 단편이 클로닝될 수 있는 독특한 SalI 및 AflII 제한 부위를 가졌다. p1746 내로 클로닝된 임의의 가변 영역 단편은 바람직하게는 경쇄 유전자의 3' 절반과 결합될 것이다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 12B75 경쇄 유전자의 3' 절반으로부터 제한 단편을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오티드 BAHN-1 및 BAHN-2를 서로 어닐링하여, 제한 부위 BsiW1, AflII, HindII, 및 NotI을 함유하고 KpnI 및 SacI 부위 내로 라이게이션될 수 있는 말단을 함유하는 이중-가닥 링커를 형성하였다. 이 링커를 pBC의 KpnI 부위와 SacI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 p1757을 제공하였다. p1558을 AflII로 분해한 후, HindIII으로 부분적으로 분해함으로써 생성된, 12B75 경쇄 불변 영역을 함유하는 7.1 kb 단편을 p1757의 AflII 부위와 HindII 부위 사이에 클로닝하여 p1762를 수득하였다. 이러한 새로운 플라스미드는 BsiWI 및 AflII에 대한 독특한 부위를 함유하였으며, 프로모터 및 가변 영역을 함유하는 BsiWI/AflII 단편을 그 안으로 이전하여 유전자의 2개의 절반을 통합할 수 있었다.

발현 플라스미드의 cDNA 클로닝 및 조립. 모든 RT-PCR 반응물(상기 참조)을 클레노우 효소로 처리하여 DNA 말단을 추가로 채웠다. 중쇄 PCR 단편을 제한 효소 BsiWI 및 BstBI로 분해한 후, 플라스미드 L28의 BsiWI 부위와 BstBI 부위 사이에 클로닝하였다(12B75-기반 중간체 벡터 p1750이 아직 제조되지 않았기 때문에 L28을 사용함). 클로닝된 삽입물의 DNA 서열 분석은 생성되는 작제물이 정확하고 PCR 증폭 중에 도입된 오류가 없음을 나타냈다. 이들 L28 플라스미드 작제물(TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B, 및 TNV196에 대한)에 대해 배정된 식별 번호를 표 3에 나타낸다.

TNV14, TNV148, 및 TNV148B 중쇄에 대한 BsiWI/BstBI 삽입물을 L28 벡터로부터 새로 제조된 중간체 벡터 p1750로 이전하였다. 이들 중간체 플라스미드에 대해 배정된 식별 번호를 표 2에 나타낸다. TNV15 및 TNV196에 대해서는 이러한 클로닝 단계 및 후속 단계를 실행하지 않았다. 이어서, 가변 영역을 2개의 상이한 인간 IgG1 발현 벡터 내로 이전하였다. 제한 효소 EcoRI 및 HindIII을 사용하여 가변 영역을 Centocor의 이전에 사용된 IgG1 벡터 p104로 이전하였다. Gm(f+) 동종이형의 IgG1을 암호화하는 생성되는 발현 플라스미드는 p1781(TNV14), p1782(TNV148), 및 p1783(TNV148B)로 표기된다(표 2 참조). 가변 영역을 또한 12B75(GenPharm) 유전자로부터 유래된 IgG1 불변 영역의 상류에 클로닝하였다. G1m(z) 동종이형의 IgG1을 암호화하는 그러한 발현 플라스미드가 또한 표 3에 열거되어 있다.

[표 3]

다양한 중쇄 및 경쇄 플라스미드에 대한 플라스미드 식별 번호.

L28 벡터 또는 pBC 벡터는 초기 Ab cDNA 클론을 나타낸다. 그러한 플라스미드 내의 삽입물을 불완전한 12B75-기반 벡터에 이전하여 중간체 플라스미드를 제조하였다. 하나의 추가의 이전 단계는, 선형화된 후에 세포 내로 도입되거나 세포 형질감염 전에 mAb 유전자 삽입물을 정제하기 위해 사용된 최종 발현 플라스미드를 생성하였다. (ND) = 실행되지 않음.

경쇄 PCR 산물을 제한 효소 SalI 및 SacII로 분해한 후, 플라스미드 pBC의 SalI 부위와 SacII 부위 사이에 클로닝하였다. 하나의 아미노산에 의해 상이한 2개의 상이한 경쇄 버전을 p1748 및 p1749로 표기하였다(표 2). DNA 서열 분석에 의해 이들 작제물이 정확한 서열을 가졌음을 확인하였다. 이어서 p1748 및 p1749 내의 SalI/AflII 단편을 중간체 벡터 p1746의 SalI 부위와 AflII 부위 사이에 클로닝하여 각각 p1755 및 p1756을 제조하였다. 이어서, p1755 및 p1756으로부터의 BsiWI/AflII 단편을 새롭게 제조된 작제물 p1762로 이전함으로써 경쇄 유전자의 이들 5' 절반을 유전자의 3' 절반에 결합시켜, 각각 최종 발현 플라스미드 p1775 및 p1776을 제조하였다(표 2).

세포 형질감염, 스크리닝, 및 서브클로닝. 다양한 TNV 발현 플라스미드로 마우스 골수종 세포의 총 15회의 형질감염을 수행하였다(표 3 참조). 이들 형질감염은, (1) 숙주 세포가 Sp2/0이었는지, 또는 653이었는지 여부; (2) 중쇄 불변 영역이 Centocor의 이전의 IgG1 벡터에 의해 암호화되었는지, 또는 12B75 중쇄 불변 영역에 의해 암호화되었는지; (3) mAb가 TNV148B, TNV148, TNV14, 또는 새로운 HC/LC 조합이었는지; (4) DNA가 선형화된 플라스미드였는지, 또는 정제된 Ab 유전자 삽입물이었는지 여부; 및 (5) 중쇄 유전자 내의 완전한 J-C 인트론 서열의 존재 또는 부재에 의해 구별되었다. 또한, 몇몇 형질감염을 반복하여 많은 수의 클론이 스크리닝될 수 있는 가능성을 증가시켰다.

이전에 기재된 바와 같은 표준 조건 하에(문헌[Knight DM et al. (1993) Molecular Immunology 30:1443-1453]) 전기천공에 의해 중쇄 및 경쇄 DNA(각각 8 내지 12 :g)의 혼합물로 Sp2/0 세포 및 653 세포를 각각 형질감염시켰다. 형질감염 번호 1, 2, 3, 및 16의 경우, 형질감염 전에 제한 효소를 이용하는 분해에 의해 적절한 발현 플라스미드를 선형화하였다. 예를 들어, SalI 및 NotI 제한 효소를 사용하여 TNV148B 중쇄 플라스미드 p1783 및 경쇄 플라스미드 p1776을 각각 선형화 하였다. 나머지 형질감염의 경우, BamHI로 중쇄 플라스미드를 분해하고 BsiWI 및 NotI로 경쇄 플라스미드를 분해함으로써, mAb 유전자만을 함유한 DNA 삽입물을 플라스미드 벡터로부터 분리하였다. 이어서, mAb 유전자 삽입물을 아가로스 겔 전기영동 및 Qiex 정제 수지에 의해 정제하였다. 정제된 유전자 삽입체로 형질감염된 세포를, 선택가능한 마커의 공급원으로서의 3 내지 5 :g의 PstI-선형화된 pSV2gpt 플라스미드(p13)로 동시에 형질감염시켰다. 전기천공에 이어서, 세포를 IMDM, 15% FBS, 2 mM 글루타민 중에 96-웰 조직 배양 접시 내에 접종하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에 인큐베이션하였다. 2일 후에, 동일 부피의 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 2 X MHX 선택(1 X MHX= 0.5 :g/ml 마이코페놀산, 2.5 :g/ml 하이포잔틴, 50 :g/ml 잔틴)을 첨가하고, 콜로니가 형성되는 동안 추가로 2 내지 3주 동안 플레이트를 인큐베이션하였다.

콜로니를 갖는 웰로부터 수집한 세포 상청액을 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 인간 IgG에 대해 검정하였다. 약술하면, 세포 상청액의 다양한 희석액을 다클론 염소 항-인간 IgG Fc 단편으로 코팅된 96-웰 EIA 플레이트 내에 인큐베이션한 후, 결합된 인간 IgG를 알칼라인 포스파타제-접합된 염소 항-인간 IgG(H+L) 및 적절한 색 기질을 사용하여 검출하였다. 세포 상청액에서 측정되고 있는 동일한 정제된 mAb를 표준으로서 사용한 표준 곡선을 각각의 EIA 플레이트 상에 포함시켜 상청액 중의 인간 IgG의 정량화를 가능하게 하였다. 소모된 배양물에서의 추가의 생산 결정을 위해, 대부분의 인간 IgG를 생산하는 것으로 보이는 이들 콜로니 내의 세포를 24-웰 플레이트 내로 계대배양하고, 이어서 최고-생산 모 클론을 확인하였다.

더 높은 생산 서브클론을 확인하고 더 균질한 세포주를 제조하기 위해 최고-생산 모 클론을 서브클로닝하였다. IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 1 X MHX 중의 1 세포/웰 또는 4 세포/웰로 96-웰 조직 배양 플레이트를 접종하고, 콜로니가 분명해질 때까지 12 내지 20일 동안 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터 내에 인큐베이션하였다. 웰당 1개의 콜로니를 함유하는 웰로부터 세포 상청액을 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 선택된 콜로니를 24-웰 플레이트에 계대배양하고, 배양물을 소모되게 한 후, 그들의 상청액 중의 인간 IgG 수준을 정량화함으로써 최고-생산 서브클론을 확인하였다. 선택된 제1 라운드 서브클론에 제2 라운드의 서브클로닝을 적용할 때 이 과정을 반복하였다. 최상의 제2 라운드 서브클론을 개발을 위한 세포주로서 선택하였다.

세포 서브클론의 특성화. 최상의 제2 라운드 서브클론을 선택하고, 성장 곡선을 수행하여 mAb 생산 수준 및 세포 성장 특징을 평가하였다. 30 ml의 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민, 및 1X MHX(또는 무혈청 배지) 중의 1 X 10⁵ 세포/ml로 T75 플라스크를 접종하였다. 300 μl의 분취물을 24시간 간격으로 취하고, 생존 세포 밀도를 결정하였다. 생존 세포의 수가 1 X 10⁵ 세포/ml 미만이 될 때까지 분석을 계속하였다. 세포 상청액의 수집된 분취물을 존재하는 항체의 농도에 대해 검정하였다. 표준으로서 rTNV148B 또는 rTNV14 JG92399를 사용하여 ELISA 검정을 수행하였다. 다클론 염소 항-인간 IgG Fc로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 1시간 동안 샘플을 인큐베이션하고, 1:1000 희석에서 알칼라인 포스파타제-접합된 염소 항-인간 IgG(H+L)로 결합된 mAb를 검출하였다.

다양한 양의 MHX 선택의 존재 하에 성장 속도를 비교하는 목적으로 2개의 세포주에 대해 상이한 성장 곡선 분석을 또한 실행하였다. MHX가 없는 배지(IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민) 내로 세포주 C466A 및 C466B를 해동시키고, 추가로 2일 동안 배양하였다. 이어서, 둘 모두의 세포 배양물을 MHX 없음, 0.2X MHX, 또는 1X MHX(1X MHX = 0.5 :g/ml 마이코페놀산, 2.5 :g/ml 하이포잔틴, 50 :g/ml 잔틴) 중 어느 하나를 함유하는 3개의 배양물로 분할하였다. 1일 후에, 새로운 T75 플라스크를 1 X 10⁵ 세포/ml의 출발 밀도에서 배양물로 접종하고, 세포를 24시간 간격으로 1주 동안 계수하였다. mAb 생산에 대한 분취물은 수집하지 않았다. SOP PD32.025에 제공된 수학식을 사용하여 이들 샘플에 대해 배가 시간을 계산하였다.

추가의 연구를 수행하여 시간 경과에 따른 mAb 생산의 안정성을 평가하였다. MHX 선택이 있거나 없는 IMDM, 5% FBS, 2 mM 글루타민 중에 24 웰 플레이트 내에서 배양물을 성장시켰다. 배양물이 융합성이 되었을 때마다 배양물을 새로운 배양물로 분할한 후, 더 오래된 배양물을 소모되게 하였다. 이 시점에, 상청액의 분취물을 취하고 4℃에서 저장하였다. 55 내지 78일의 기간에 걸쳐 분취량을 취하였다. 이 기간의 종점에, 상기 약술된 바와 같이 항-인간 IgG Fc ELISA에 의해 상청액을 존재하는 항체의 양에 대해 시험하였다.

결과 및 토의.

재조합 수용체에 대한 TNF 결합의 억제.

하이브리도마 세포 상청액에 함유된 8개의 TNV mAb가 수용체에 대한 TNFα 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 단순 결합 검정을 수행하였다. 이들 각각의 세포 상청액 중의 TNV mAb의 농도를 인간 IgG에 대한 표준 ELISA 분석에 의해 먼저 결정하였다. 이어서, 재조합 p55 TNF 수용체/IgG 융합 단백질인 p55-sf2를 EIA 플레이트 상에 코팅하고, 다양한 양의 TNV mAb의 존재 하에 ¹²⁵I-표지된 TNFα를 p55 수용체에 결합시켰다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 8개의 TNV mAb 중의 하나(TNV122)를 제외한 모두가 p55 수용체에 대한 TNFα 결합을 효율적으로 차단하였다. 실제로, TNV mAb는 음성 대조군 하이브리도마 상청액 내로 스파이킹된 cA2 양성 대조군 mAb보다 TNFα 결합을 억제함에 있어서 더 효과적인 것으로 보였다. 이들 결과는 TNV mAb가 세포-기반 검정 및 생체내에서 TNFα 생물활성을 차단할 가능성이 매우 높았음을 나타내는 것으로 해석되었으며, 따라서 추가의 분석이 타당해졌다.

DNA 서열 분석.

RNA가 인간 mAb를 암호화한다는 것의 확인.

수용체 결합 검정에서 TNFα-차단 활성을 나타낸 7개의 TNV mAb(TNV14, TNV15, TNV32, TNV86, TNV118, TNV148, 및 TNV196)를 특성화하는 제1 단계로서, 이들 mAb를 생산하는 7개의 하이브리도마 세포주로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 각각의 RNA 샘플을 사용하여, 완전 신호 서열, 완전 가변 영역 서열, 및 각각의 mAb에 대한 불변 영역 서열의 일부를 포함한 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 cDNA를 제조하였다. 이어서, 이들 cDNA 생성물을 PCR 반응에서 증폭하고, 단편을 먼저 클로닝하는 단계 없이, PCR-증폭된 DNA를 직접 서열분석하였다. 서열분석된 중쇄 cDNA는 마우스에 존재하는 5개의 인간 생식세포계열 유전자 중의 하나인 DP-46과 90% 초과로 동일하였다(도 2). 유사하게, 서열분석된 경쇄 cDNA는 마우스에 존재하는 인간 생식세포계열 유전자 중의 하나와 100% 또는 98% 동일하였다(도 3). 이들 서열 결과에 의해, cDNA로 전사되고 서열분석된 RNA 분자가 인간 항체 중쇄 및 인간 항체 경쇄를 암호화하였음이 확인되었다. 가변 영역이 신호 서열 코딩 서열의 5' 말단에 맵핑되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭되었으므로, 신호 서열의 최초 몇개의 아미노산은 원래의 TNV 번역 생성물의 실제 서열이 아니고, 그들은 재조합 TNV mAb의 실제 서열을 나타낸다는 것에 유의해야 한다.

독특한 중화 mAb.

각각의 mAb에 대한 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 전체 가변 영역에 대한 cDNA 서열의 분석에 의해, TNV32는 TNV15와 동일하고, TNV118은 TNV14와 동일하며, TNV86은 TNV148과 동일함이 밝혀졌다. 수용체 결합 검정의 결과는 DNA 서열 분석과 일치하였으며, 즉, TNV86 및 TNV148 둘 모두는 TNF 결합을 차단함에 있어서 TNV118 및 TNV14 둘 모두보다 대략 4배 더 양호하였다. 그러므로, 후속 연구는 단지 4개의 독특한 TNV mAb, TNV14, TNV15, TNV148, 및 TNV196에 집중하였다.

4개의 mAb의 관련성

DNA 서열 결과에 의해, 4개의 TNV mAb의 중쇄를 암호화하는 유전자가 모두 서로 고도로 상동성이며, 모두 동일한 생식세포계열 유전자, DP-46으로부터 유래된 것으로 보인다는 것이 밝혀졌다(도 2). 또한, 중쇄 CDR3 서열 각각이 그렇게 유사하고 동일한 길이이므로, 그리고 그들이 모두 J6 엑손을 사용하므로, 그들은 단일 VDJ 유전자 재배열 사례에 이어서 각각의 mAb를 독특하게 만든 체세포 변화에 의해 발생한 것으로 보였다. DNA 서열 분석에 의해, 4개의 mAb 사이에 단지 2개의 별개의 경쇄 유전자가 존재함이 밝혀졌다(도 3). TNV14 및 TNV15의 경쇄 가변 영역 코딩 서열은 서로 동일하고 인간 카파 사슬의 Vg/38K 패밀리의 대표적인 생식세포계열 서열과 동일하다. TNV148 및 TNV196 경쇄 코딩 서열은 서로 동일하지만 2개의 뉴클레오티드 위치에서 생식세포계열 서열과 상이하다(도 3).

4개의 mAb의 추정된 아미노산 서열에 의해 실제 mAb의 관련성이 밝혀졌다. 4개의 mAb는 4개의 별개의 중쇄를 함유하지만(도 4), 단지 2개의 별개의 경쇄만을 함유한다(도 5). TNV mAb 서열과 생식세포계열 서열 사이의 차이는 주로 CDR 도메인에 국한되었지만, mAb 중쇄 중 3개는 또한 프레임워크 영역에서 생식세포계열 서열과 상이하였다(도 4). DP-46 생식세포계열-암호화 Ab 프레임워크 영역에 비교하여, TNV14는 동일하였으며, TNV15는 1개의 아미노산에 의해 상이하였고, TNV148은 2개의 아미노산에 의해 상이하였으며, TNV196은 3개의 아미노산에 의해 상이하였다.

cDNA의 클로닝, 부위-특이적 돌연변이유발, 및 최종 발현 플라스미드의 조립. cDNA의 클로닝. PCR 증폭된 가변 영역의 DNA 서열에 기초하여, 발현 벡터 내로 클로닝될 코딩 서열을 적응시킬 목적으로 PCR 증폭의 다른 라운드를 수행하기 위해 새로운 올리고뉴클레오티드를 주문하였다. 중쇄의 경우, 이러한 제2 라운드의 PCR의 생성물을 제한 효소 BsiWI 및 BstBI로 분해하고, 플라스미드 벡터 L28(표 2에 나타낸 플라스미드 식별 번호) 내로 클로닝하였다. 경쇄의 경우, 제2 라운드 PCR 생성물을 SalI 및 AflII로 분해하고, 플라스미드 벡터 pBC 내로 클로닝하였다. 이어서, 개별 클론을 서열분석하여, 그들의 서열이 PCR 산물의 직접 서열분석으로부터 얻어진 이전의 서열과 동일하다는 것을 확인하였으며, 이에 의해 잠재적으로 불균질한 분자 집단에서 각각의 위치에 가장 풍부한 뉴클레오티드가 밝혀졌다.

TNV148을 변화시키기 위한 부위-특이적 돌연변이유발. mAb TNV148 및 TNV196은 TNFα 생물활성을 중화시킴에 있어서 차선의 mAb(TNV14)보다 4배 더 강력한 것으로 일관되게 관찰되었다. 그러나, 상기 기재된 바와 같이, TNV148 및 TNV196 중쇄 프레임워크 서열은 생식세포계열 프레임워크 서열과 상이하였다. TNV148 중쇄 서열과 다른 인간 항체의 비교는, 다수의 다른 인간 mAb가 프레임워크 1 내의 위치 28에서 Ile 잔기를 함유한 반면에(성숙한 서열만을 계수함), 프레임워크 3 내의 위치 75에서의 Pro 잔기는 그 위치에서 특이한 아미노산임을 나타냈다.

TNV196 중쇄의 유사한 비교는 프레임워크 3 내의 생식세포계열 서열과 상이한 3개의 아미노산이 인간 mAb에서 희귀할 수 있음을 시사하였다. 인간에게 투여될 경우에 이들 차이는 TNV148 및 TNV196을 면역원성이 되게 할 수 있는 가능성이 있었다. TNV148은 단지 하나의 관심 아미노산 잔기를 가졌고, 이 잔기는 TNFα 결합에 중요하지 않은 것으로 여겨졌기 때문에, 위치 75에서 Pro 잔기 대신에 생식세포계열 Ser 잔기가 암호화되도록 부위-특이적 돌연변이유발 기술을 사용하여 (플라스미드 p1753에서) TNV148 중쇄 코딩 서열 내의 단일 뉴클레오티드를 변화시켰다. 생성되는 플라스미드를 p1760으로 명명하였다(표 2 참조). 생성되는 유전자 및 mAb를 TNV148B로 명명하여 그것을 원래의 TNV148 유전자 및 mAb와 구별하였다(도 5 참조).

최종 발현 플라스미드의 조립. 게놈 단편으로서 이전에 클로닝된 12B75 중쇄 및 경쇄 유전자에 기초한 새로운 항체 발현 벡터를 제조하였다. 상이한 TNV 발현 플라스미드를 제조하였지만(표 2 참조), 각각의 경우에, 5' 측면 서열, 프로모터, 및 인트론 인핸서는 각각의 12B75 유전자로부터 유래되었다. 경쇄 발현 플라스미드의 경우, 완전 J-C 인트론, 불변 영역 코딩 서열, 및 3' 측면 서열 또한 12B75 경쇄 유전자로부터 유래되었다. 최종 생산 세포주(p1781 및 p1783, 하기 참조)를 생성한 중쇄 발현 플라스미드의 경우, 인간 IgG1 불변 영역 코딩 서열은 Centocor의 이전에 사용된 발현 벡터(p104)로부터 유래되었다. 중요하게는, 본 명세서에 보고된 최종 생산 세포주는 원래의 하이브리도마 유래 TNV mAb(G1m(z))와는 상이한 TNV mAb의 동종이형(Gm(f+))을 발현한다. 이는 GenPharm 마우스로부터 유래된 12B75 중쇄 유전자는 CH1 도메인의 C-말단에서 Arg 잔기를 암호화하는 반면에, Centocor의 IgG1 발현 벡터 p104는 그 위치에서 Lys 잔기를 암호화하기 때문이다. 다른 중쇄 발현 플라스미드(예를 들어 p1786 및 p1788)를 제조하였으며, 여기서 J-C 인트론, 완전 불변 영역 코딩 서열, 및 3' 측면 서열은 12B75 중쇄 유전자로부터 유래되었지만, 그러한 유전자로 형질감염된 세포주는 생산 세포주로서 선택되지 않았다. 최종 발현 플라스미드를 생성할 향후 PCR-증폭된 V 영역의 1-단계 클로닝을 가능하게 하도록 신중하게 벡터를 설계하였다.

PCR 증폭된 가변 영역 cDNA를 L28 또는 pBC 벡터로부터 중간-단계, 12B75-기반 벡터로 이전하였으며, 이는 프로모터 영역 및 J-C 인트론의 일부를 제공하였다(플라스미드 식별 번호에 대해서는 표 2 참조). 이어서, 항체 유전자의 5' 절반을 함유하는 제한 단편을 이들 중간-단계 벡터로부터 최종 발현 벡터로 이전하였으며, 이는 각각의 유전자의 3' 절반을 제공하여 최종 발현 플라스미드를 형성하였다(플라스미드 식별 번호에 대해서는 표 2 참조).

세포 형질감염 및 서브클로닝. 발현 플라스미드를 제한 분해에 의해 선형화하거나, 각각의 플라스미드 내의 항체 유전자 삽입물을 플라스미드 골격으로부터 정제해내었다. Sp2/0 및 653 마우스 골수종 세포를 전기천공에 의해 중쇄 및 경쇄 DNA로 형질감염시켰다. 15개의 상이한 형질감염을 실행하였으며, 이들 중 대부분은 Ab, Ab 유전자의 특이적 특성, 유전자가 선형화된 전체 플라스미드 상에 있는지, 또는 정제된 유전자 삽입물 상에 있는지 여부, 및 숙주 세포주에 의해 정의되는 바와 같이 독특하였다(표 4에 요약됨). 마이코페놀산에 대해 내성인 클론으로부터의 세포 상청액을 ELISA에 의해 인간 IgG의 존재에 대해 검정하고, 정제된 rTNV148B를 참조 표준 곡선으로서 사용하여 정량화하였다.

최고-생산 rTNV148B 세포주

rTNV148B 형질감염 2로부터의 최선-생산 653 모 세포주 중 10개(소모된 24-웰 배양물 중에 5 내지 10 :g/ml를 생산함)를 서브클로닝하여 더 높은 생산 세포주에 대해 스크리닝하고 더 균질한 세포 집단을 제조하였다. 모 세포주 2.320, 2.320-17, 및 2.320-20의 서브클론 중 2개는 소진된 24-웰 배양물 중에 대략 50 :g/ml를 생산하였으며, 이는 그들의 모 세포주에 비해 5배 증가였다. 서브클로닝된 세포주 2.320-17 및 2.320-20의 서브클로닝의 제2 라운드가 이어졌다.

각각의 mAb를 암호화하는 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 식별 번호를 나타낸다. 정제된 mAb 유전자 삽입물을 이용하여 실행된 형질감염의 경우, 플라스미드 p13(pSV2gpt)를 gpt 선택가능한 마커의 공급원으로서 포함시켰다. 중쇄 불변 영역은 Remicade를 암호화하기 위해 사용된 동일한 인간 IgG1 발현 벡터('구(old)')에 의해, 또는 12B75(GenPharm/Medarex) 중쇄 유전자 내에 함유된 불변 영역('신(new)')에 의해 암호화되었다. H1/L2는 TNV14 중쇄 및 TNV148 경쇄로 구성된 "신규" mAb를 지칭한다. 플라스미드 p1783 및 p1801은 단지 그들의 중쇄 유전자가 얼마나 많은 J-C 인트론을 함유하는지에 의해 상이하다. 세포 클론에 대한 일반 명칭의 최초 숫자를 정의하는 형질감염 번호는 우측에 나타낸다. 본 명세서에 기재된 rTNV148B-생산 세포주 C466(A, B, C, D) 및 C467A는 각각 형질감염 번호 2 및 1로부터 유래되었다. rTNV14-생산 세포주 C476A는 형질감염 번호 3으로부터 유래되었다.

[표 4]

소모된 24-웰 배양 상청액에 대한 ELISA 분석은 이들 제2 라운드 서브클론이 모두 98 내지 124 :g/ml를 생산하였음을 나타냈으며, 이는 제1 라운드 서브클론에 비해 2배 이상의 증가였다. 표 5에 나타낸 바와 같이 이들 653 세포주에 C 코드 표기를 배정하였다.

rTNV148B 형질감염 1로부터의 최선-생산 Sp2/0 모 세포주 중 3개를 서브클로닝하였다. 모 세포주 1.73의 2회 라운드의 서브클로닝은 소모된 24-웰 배양물 중에 25 :g/ml를 생산한 클론의 확인으로 이어졌다. 이러한 Sp2/0 세포주를 C467A로 표기하였다(표 5).

최고-생산 rTNV14 세포주

rTNV14 형질감염 3으로부터의 최선-생산 Sp2/0 모 세포주 중 3개를 1회 서브클로닝하였다. 서브클론 3.27-1은 19 :g/ml의 생산으로 소모된 24-웰 배양물에서 최고-생산자인 것으로 확인되었다. 이 세포주를 C476A로 표기하였다(표 5).

[표 5]

선택된 생산 세포주 및 그들의 C 코드의 요약

원래의 클론 명칭의 최초 숫자는 어느 형질감염으로부터 세포주가 유래되었는지를 나타낸다. 본 명세서에 보고된 C-코드로 나타낸 모든 세포주는 제한 효소로 선형화된 중쇄 및 경쇄 전체 플라스미드를 이용하는 형질감염으로부터 유래되었다.

서브클로닝된 세포주의 특성화

세포주 성장 특징을 더 신중하게 특성화하고 더 큰 규모로 mAb-생산 수준을 결정하기 위하여, T75 배양물을 사용하여 성장 곡선 분석을 수행하였다. 결과는 4개의 C466 시리즈의 세포주 각각이 1.0 X 10⁶ 내지 1.25 X 10⁶ 세포/ml의 피크 세포 밀도 및 110 내지 140 :g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달하였음을 나타냈다(도 7). 반면에, 최선-생산 Sp2/0 서브클론, C467A는 2.0 X 10⁶ 세포/ml의 피크 세포 밀도 및 25 :g/ml의 최대 mAb 축적 수준에 도달하였다(도 7). rTNV14-생산 세포주, C476A에 대해서는 성장 곡선 분석을 실행하지 않았다.

추가의 성장 곡선 분석을 실행하여 상이한 농도의 MHX 선택에서의 성장 속도를 비교하였다. 이러한 비교는, MHX의 부재 하에 배양된 C466 세포가 정상 양의 MHX(1X) 중에 배양된 동일한 세포보다 더 빠르게 성장하는 것으로 보였다는 최근의 관찰에 의해 촉구되었다. 마이코페놀산과 같은 화합물의 세포독성 농도는 여러 자릿수에 걸쳐 측정되는 경향이 있으므로, 낮은 농도의 MHX의 사용은 mAb 생산의 안정성을 희생시키지 않으면서 유의하게 더 빠른 세포 배가 시간을 유발할 수 있는 것으로 생각되었다. 세포주 C466A 및 C466B를 MHX 없음, 0.2X MHX, 또는 1X MHX 중 어느 하나 중에 배양하였다. 생존 세포 계수를 7일 동안 24시간 간격으로 취하였다. 결과에 의해 MHX 농도-의존적 세포 성장 속도가 밝혀졌다(도 8). 세포주 C466A는 1X MHX에서 25.0시간의 배가 시간을 나타냈지만 MHX 없음에서는 단지 20.7시간이었다. 유사하게, 세포주 C466B는 1X MHX에서 32.4시간의 배가 시간을 나타냈지만 MHX 없음에서는 단지 22.9시간이었다. 중요하게는, 0.2X MHX에서 둘 모두의 세포주에 대한 배가 시간은 1X MHX에서보다 MHX 없음에서 관찰된 것과 더 유사하였다(도 8). 이러한 관찰은, 배가 시간이 중요한 파라미터인 생물반응기에서의 향상된 세포 성능이 더 적은 MHX를 사용함으로써 실현될 수 있을 것이라는 가능성을 제기한다. 그러나, 안정성 시험 결과(하기 참조)는 세포주 C466D가 MHX가 존재하지 않는 경우에도 60일 이상 동안 rTNV148B를 안정하게 생산할 수 있음을 시사하지만, 안정성 시험은 또한 MHX의 부재에 비교하여 MHX의 존재 하에 세포가 배양되었을 때 더 높은 mAb 생산 수준을 나타냈다.

대략 60일의 기간에 걸쳐 다양한 세포주로부터 mAb 생산을 평가하기 위하여, MHX 선택을 함유하거나 함유하지 않은 배양물에 대해 안정성 시험을 수행하였다. 모든 세포주가 높은 mAb 생산을 유지하지는 않았다. 단지 2주의 배양 후에, 클론 C466A는 연구 시작점에서보다 대략 45% 더 적게 생산하고 있었다. 클론 C466B로부터의 생산 또한 유의하게 하락하는 것으로 보였다. 그러나, 클론 C466C 및 C466D는 상당히 안정한 생산을 유지하였으며, C466D는 최고 절대 생산 수준을 나타낸다(도 9).

결론

인간 TNFα에 대한 8개의 인간 mAb의 초기 패널로부터, 단백질 서열 및 TNF 중화 효능을 포함한 몇몇 기준에 기초하여, TNV148B와 더불어 TNV14가 바람직한 것으로 선택되었다. 100 :g/ml 초과의 rTNV148B 및 19 :g/ml의 rTNV14를 생산하는 세포주를 제조하였다.

실시예 5: 단일 볼루스 주사를 사용하는 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구

대략 4 주령에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코 PBS(D-PBS) 또는 1 mg/㎏ 또는 10 mg/㎏의 본 발명의 항-TNF 항체(TNV14, TNV148, 또는 TNV196)의 단일 복강내 볼루스 투여로 치료하였다.

결과: 체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이러한 체중 증가는 주수 3 내지 주수 7에 유의하였다. 10 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물은 또한 연구의 주수 7에 유의한 체중 증가를 달성하였다. (도 10을 참조한다).

도 11a 내지 도 11c는 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 주수 3에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(주수 7). 1 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물 및 1 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은, D-PBS-치료군에 비교할 때, 주수 3 후에 AI의 유의한 감소를 나타내지 못하였다. 10 mg/㎏ 치료군들 사이에는, 각각을 유사한 용량의 다른 것들에 비교했을 때(10 mg/㎏ cA2를 10 mg/㎏ TNV14, 148, 및 196에 비교함) 유의한 차이가 없었다. 1 mg/㎏ 치료군을 비교했을 때, 1 mg/㎏ TNV148은 3주, 4주, 및 7주에 1 mg/㎏ cA2보다 유의하게 더 낮은 AI를 나타냈다. 1 mg/㎏ TNV148은 또한 3주 및 4주에 1 mg/㎏ TNV14-치료군보다 유의하게 더 낮았다. TNV196은 연구의 주수 6까지 AI의 유의한 감소를 나타냈지만(D-PBS-치료군에 비교할 때), 연구 종료 시에 유의하게 유지된 유일한 1 mg/㎏ 치료는 TNV148이었다.

실시예 6: 다중 볼루스 투여로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구

대략 4 주령에, 체중에 기초하여, 8개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 대조 물품(D-PBS) 또는 3 mg/㎏의 항체(TNV14, TNV148)의 복강내 볼루스 투여로 치료하였다(주수 0). 주수 1, 주수 2, 주수 3, 및 주수 4에 모든 동물에서 주사를 반복하였다. 시험 물품 효능에 대해 군 1 내지 군 6을 평가하였다. 군 7 및 군 8의 동물로부터 얻은 혈청 샘플을 주수 2, 주수 3, 및 주수 4에 TNV14 또는 TNV148의 면역 반응 유도 및 약동학적 클리어런스에 대해 평가하였다.

결과: 체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. (도 12를 참조한다).

도 13a 내지 도 13c는 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 유의하게 더 낮았으며, 이는 주수 2에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(주수 5). 1 mg/㎏ 또는 3 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물 및 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물은, d-PBS 대조군에 비교할 때, 연구 전체에 걸쳐 임의의 시점에 AI의 임의의 유의한 감소를 달성하지 못하였다. 3 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물은 d-PBS-치료군에 비교할 때 유의한 감소를 나타냈으며, 이는 주수 3에 시작하여 주수 5까지 계속되었다. 10 mg/㎏ cA2-치료 동물은 연구의 주수 4 및 주수 5에 cA2의 더 낮은 용량(1 mg/㎏ 및 3 mg/㎏) 둘 모두에 비교할 때 AI의 유의한 감소를 나타냈으며, 또한 주수 3 내지 주수 5에 TNV14-치료 동물보다 유의하게 더 낮았다. 3 mg/㎏ 치료군 중 임의의 것 사이에는 유의한 차이가 없는 것으로 보였지만, 3 mg/㎏ TNV14로 치료한 동물에 대한 AI는 일부 시점에 10 mg/㎏ 보다 유의하게 더 높았던 반면에, TNV148로 치료한 동물은 10 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물과 유의하게 상이하지 않았다.

실시예 7: 단일 복강내 볼루스 투여로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구

대략 4 주령에, 성별 및 체중에 기초하여, 6개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 3 mg/㎏ 또는 5 mg/㎏으로 항체(cA2, 또는 TNV148)의 단일 복강내 볼루스 투여로 치료하였다. 이 연구는 D-PBS 및 10 mg/㎏ cA2 대조군을 이용하였다.

체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 모든 치료는 유사한 체중 증가를 달성하였다. 3 또는 5 mg/㎏의 TNV148 또는 5 mg/㎏의 cA2로 치료한 동물은 연구 초기(주수 2 및 주수 3)에 유의한 양의 체중이 증가했다. TNV148로 치료한 동물만이 이후의 시점에 유의한 체중 증가를 유지했다. 3 및 5 mg/㎏ TNV148-치료 동물 둘 모두는 7주에 유의성을 나타냈고, 3 mg/㎏ TNV148 동물은 주사 후 8주에 여전히 유의하게 상승하였다. (도 14를 참조한다).

도 15는 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 모든 치료군은 초기 시점에 일부 보호를 나타냈으며, 5 mg/㎏ cA2 및 5 mg/㎏ TNV148은 주수 1 내지 주수 3에 AI의 유의한 감소를 나타냈고 모든 치료군이 주수 2에 유의한 감소를 나타냈다. 연구 후반에, 5 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 주수 4, 주수 6, 및 주수 7에 유의한 감소를 갖는 일부 보호를 나타냈다. cA2 및 TNV148 둘 모두의 낮은 용량(3 mg/㎏)은 주수 6에 유의한 감소를 나타냈으며, 모든 치료군이 주수 7에 유의한 감소를 나타냈다. 치료군 중 어느 것도 연구 종료 시에 유의한 감소를 유지할 수 없었다(주수 8). 임의의 치료군(식염수 대조군을 배제함) 사이에는 임의의 시점에 유의한 차이가 없었다.

실시예 8: 항-TNF 항체 및 변형된 항-TNF 항체 사이의 단일 복강내 볼루스 투여로서 항-TNF 항체 및 대조군을 사용하는 관절염 마우스 연구

TNV148(하이브리도마 세포로부터 유래됨) 및 rTNV148B(형질감염된 세포로부터 유래됨)의 단일 복강내 투여의 효능을 비교하기 위한 것이다. 대략 4 주령에, 성별 및 체중에 기초하여, 9개의 치료군 중 하나에 Tg197 연구 마우스를 배정하고, 둘베코=S PBS(D-PBS) 또는 1 mg/㎏의 항체(TNV148, rTNV148B)의 단일 복강내 볼루스 투여로 치료하였다.

체중이 투여 전으로부터의 변화로서 분석되었을 때, 10 mg/㎏ cA2로 치료한 동물은 연구 전체에 걸쳐 D-PBS-치료 동물보다 일관되게 더 높은 체중 증가를 나타냈다. 이러한 체중 증가는 주수 1 및 주수 3 내지 주수 8에 유의하였다. 1 mg/㎏ TNV148로 치료한 동물은 또한 연구의 주수 5, 주수 6, 및 주수 8에 유의한 체중 증가를 달성하였다. (도 16을 참조한다).

도 17은 관절염 지수에 기초한 질환 중증도의 진행을 나타낸다. 10 mg/㎏ cA2-치료군의 관절염 지수는 D-PBS 대조군보다 더 낮았으며, 이는 주수 4에 시작하여 연구의 나머지 전체에 걸쳐 계속되었다(주수 8). TNV148-치료군 및 1 mg/㎏ cA2-치료군 둘 모두는 주수 4에 AI의 유의한 감소를 나타냈다. 이전의 연구(P-099-017)는 TNV148이 단일 1 mg/㎏ 복강내 볼루스 후에 관절염 지수를 감소시키는 데 약간 더 효과적이었음을 나타냈지만, 본 연구는 TNV 항체-치료군의 둘 모두의 버전으로부터의 AI가 약간 더 높았음을 나타냈다. 1 mg/㎏ cA2-치료군은 10 mg/㎏ cA2 군에 비교할 때 유의하게 증가되지 않았고 TNV148-치료군은 주수 7 및 주수 8에 유의하게 더 높았지만(주수 6은 제외함), 연구 중 임의의 지점에 1 mg/㎏ cA2, 1 mg/㎏ TNV148, 및 1 mg/㎏ TNV148B 사이에는 AI의 유의한 차이가 없었다.

실시예 9: GO-VIVA - 메토트렉세이트 요법에도 불구하고 활성 다발성 경과 소아 특발성 관절염이 있는 소아 대상체에서, 인간 항-TNFα 항체인 정맥주사 골리무맙의 다시설 개방-표지 시험

프로토콜 번호: CNTO148JIA3003

개요

골리무맙은 인간 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 높은 친화도 및 특이성으로 결합하고 TNFα 생물활성을 중화시키는 전체 인간 단일클론 항체(mAb)이다. TNFα는 주요 염증 매개자로서, 높은 수준의 TNFα는 류마티스 관절염(RA) 및 소아 특발성 관절염(JIA)과 같은 질환의 병태생리에 연루되어 있다. 정맥내(IV) 사용을 위한 SIMPONI^®(골리무맙)는 다발성 JIA(pJIA)가 있는 환자에게 (다른 이용가능한 항-TNFα 작용제와 비교하여) 대체 투여 경로 및 편리한 투여 계획(즉, 8주마다[q8w] 투여)을 제공하기 위해 스폰서에 의해 개발되고 있다.

목적 및 가설

일차 목적

본 연구의 일차 목적은 2개월 이상 동안의 메토트렉세이트(MTX) 요법에도 불구하고 활성 관절염이 있는 5개 이상의 관절에 의해 나타나는 pJIA가 있는 대상체(2세 내지 18세 미만)에서 골리무맙을 정맥내 투여한 후 약동학(PK)을 평가하는 것이다.

이차 목적

본 연구의 이차 목적은 pJIA가 있는 대상체에서 PK, 효능(징후 및 증상의 완화, 신체적 기능, 및 삶의 질), 안전성(유해 사건[AE], 심각한 AE[SAE], 및 실험실 파라미터의 평가), 및 면역원성(골리무맙에 대한 항체)과 관련하여 IV 골리무맙을 평가하는 것이다.

가설

본 연구에서는 공식적인 가설 시험은 계획되어 있지 않다.

연구 설계의 개요

이는 현재 MTX 치료에도 불구하고 활성 pJIA가 있는 대상체에서 IV 골리무맙의 PK, 안전성 및 효능을 평가하기 위한 3상, 개방-표지, 단일군, 다시설 연구이다. 연구 집단은 적어도 3개월의 pJIA 의료 이력이 있고 5개 이상의 관절에서 활성 관절염이 있는 2세 내지 18세 미만의 MTX를 받은 pJIA가 있는 대상체로 구성될 것이다. 대략 120명의 대상체가 주수 0에 등록되어, 대략 100명의 대상체가 주수 52에서 연구에 남도록 할 것이다. 등록 패턴은 2세 내지 최대 6세에서 대략 10%, 6세 내지 최대 12세에서 대략 20%, 12세 내지 18세 미만에서 대략 70%의 대상체 집단을 생성할 것으로 예상된다.

모든 대상체는 주수 0, 주수 4에, 그리고 주수 28까지 8주마다(±3일) 그리고 그 이후 8주마다(±1주) 80 mg/m²의 골리무맙을 (30±10분에 걸쳐) IV 주입으로 받을 것이다(최대 단일 용량 240 mg[최대 체표면적(BSA) 3.0 m² x 80 mg/m²]). (문서화된 안전상의 이유로 더 낮은 용량의 MTX가 투여되지 않는 한, 또는 문서화된 국가 또는 현장 규정이 BSA가 1.67 m² 이상인 대상체에서 15 mg/주 또는 그 이상의 용량을 금지하지 않는 한) 상업적 MTX는 BSA가 1.67 m² 미만인 대상체에서 10 내지 30 mg/m²/주의 안정적인 용량 또는 주수 28까지 BSA가 1.67 m² 이상인 대상체에서 15 mg/주의 안정적인 최소 용량으로 투여되어야 한다. 주수 52에서 연구를 완료한 대상체는 연구의 장기간 연장(LTE) 상으로 진입하도록 하는 옵션을 가질 것이다. LTE 동안, 모든 대상체는 80 mg/m²의 IV 골리무맙을 주수 244까지 8주마다(±1주; 최대 단일 용량 240 mg) 계속 받을 것이다. 주수 244 방문을 완료한 모든 대상체는 주수 252에서 안전성 추적관찰 방문에 참여할 것으로 예상된다. (pJIA 적응증에 대한 약물 상업화 전에 최대 252주 연구를 완료한 대상체에 대한) 주수 252 후의 골리무맙은 (상업적 약물이 대상체에게 접근가능하지 않은 경우) 약물이 대상체의 국가에서 pJIA에 사용하도록 승인 및 시판될 때까지 또는 아동에게 유익한 것으로 입증된 기간 동안 제공될 것이다.

이는 동일한 BSA-기반 용량의 IV 골리무맙을 받은 모든 대상체에 의한 개방-표지 연구이기 때문에, 외부 데이터 모니터링 위원회는 구성되지 않을 것이다.

연구의 종료는 LTE에서 마지막 대상체에 대한 마지막 추적관찰 평가로서 정의된다.

대상체 집단

연구 대상체는 등록 시점에 체중이 15 ㎏ 초과인 2세 내지 18세 미만의 연령이어야 한다.

질환의 발병은 대상체의 16번째 생일 이전이어야 하고, 적어도 3개월 동안 지속되어야 하고, 하기의 하위유형 중 하나의 활성 pJIA이어야 한다: 류마티스 인자 양성 또는 음성 pJIA; 3개월 이상 동안 전신 증상이 없으나 3개월 이상 동안 다발관절염이 있는 전신성 JIA; 확장된 소수관절형 JIA; 부착부염-관련 관절염 또는 다발성 소아 건선성 관절염(polyarticular juvenile psoriatic arthritis, PsA).

대상체는 스크리닝 및 등록 시 미국 류마티스 학회(ACR) 기준에 의해 정의된 바와 같이 활성 관절염이 있는 관절이 5개 이상이어야 한다. 대상체는 경구, 근육내 또는 피하 MTX를 (스크리닝 전 2개월 이상 동안) 매주 10 mg/m² 이상의 용량으로 현재 사용함에도 불구하고 활성 pJIA가 있어야 한다.

투여량 및 투여

골리무맙

연구는 1개의 활성 치료군을 가질 것이며, 모든 대상체는 주수 0, 주수 4에, 그리고 주수 28까지 8주마다(±3일) 그리고 그 이후 주수 244까지 8주마다(±1주) 80 mg/m²의 골리무맙을 IV 주입으로 받을 것이다. BSA는 각각의 방문 시 계산될 것이고, 골리무맙의 용량은 필요에 따라 조정되어 용량을 80 mg/m²으로 유지할 것이다. BSA는 모스텔러(Mosteller) 식을 사용하여 계산될 것이다: BSA(m²) = ([키(cm) x 체중(㎏)]/3600)^1/2. 최대 단일 용량은 골리무맙 240 mg일 것이다.

메토트렉세이트

대상체는 연구 시작 시점과 동일한 BSA-기반 용량(BSA가 1.67 m² 미만인 대상체의 경우 주당 10 내지 30 mg/m² 또는 BSA가 1.67 m² 이상인 대상체의 경우 적어도 15 mg/주)으로 상업적 MTX를 적어도 주수 28까지 받을 것이다. MTX로 인한 불내성 또는 AE가 발생하지 않는 한, 대상체가 주수 28 방문까지 MTX의 동일한 투여 경로 및 용량을 유지하도록 모든 노력을 기울여야 한다.

대상체는 또한 매주 MTX 투여한 다음 날에 주어진 (MTX 용량의 절반으로) 폴린산 또는 매주 5 mg 이상의 상업적 엽산을 받을 것이다. 12세 미만의 아동의 경우, 엽산 또는 폴린산의 투여는 의사의 재량에 달려 있을 것이다.

효능 평가 및 종점

효능 평가는 하기를 포함한다:

관절 평가(활성 관절의 수 및 제한된 운동 범위를 갖는 관절의 수)

질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가

아동 건강 평가 설문(CHAQ; 전반적인 행복감(Well-being)에 대한 부모/대상체 평가 및 통증에 대한 부모/대상체 평가를 포함함)

CRP

일차 효능 종점 또는 주요 이차 종점이 계획되어 있지 않다. 다른 효능 종점은 하기를 포함한다:

시간 경과에 따른 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 CHAQ의 기저선으로부터의 변화.

시간 경과에 따른 CRP 농도

시간 경과에 따른 비활성 질환이 있는 대상체의 비율.

시간 경과에 따른 pJIA에 대한 투약에 대한 임상 관해에 있는 대상체의 비율

각각의 방문 시 pJIA 코어 세트의 기저선으로부터의 개선

주수 52까지 시간 경과에 따른 질환 하위유형, 및/또는 연령별 JIA ACR 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70 및 JIA ACR 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, 27, 및 71 점수의 기저선으로부터의 변화

시간 경과에 따른 JADAS 10, 27, 및 71 최소 질환 활성을 달성하는 대상체의 비율

약동학적 평가 및 종점

혈청 골리무맙 농도는 주수 0, 주수 4, 주수 8, 주수 12, 주수 20, 주수 28, 주수 52, 주수 100, 주수 148, 주수 196, 및 주수 244에 평가되고 시간 경과에 따라 요약될 것이다. 주수 28까지의 데이터에 의한 집단 PK 분석은 골리무맙의 PK를 특성화하도록 그리고 pJIA가 있는 소아 집단에서 PK의 중요한 공변량을 식별하도록 수행될 것이다.

골리무맙 농도가 요약될 것이고, PK 노출은 주수 52까지 그리고 LTE까지 평가될 것이다.

본 연구에서의 일차 종점은 주수 28에서의 PK 노출(주수 28에서의 최저 농도) 및 (집단 PK 모델링 및 시뮬레이션으로부터의) 8주의 1회 투여 간격에 걸친 베이지안 정상-상태 곡선 아래 면적[AUCss]이다.

주요 이차 PK 종점은 다음을 포함한다:

주수 52에서의 PK 노출(주수 52에서의 최저 농도) 및 (집단 PK 모델링 및 시뮬레이션으로부터의) 주수 52에서의 베이지안 AUCss.

안전성 평가

안전성 평가는 하기의 평가를 포함한다: AE; 주입 반응; 알레르기 반응; 임상 실험실 검사(혈액학, 화학, 및 임신 검사); 바이탈 사인: 신체 검사; 키 및 체중; 포도막염; 및 결핵의 조기 검출.

면역원성 평가

골리무맙에 대한 항체는 주수 0, 주수 4, 주수 8, 주수 12, 주수 28, 주수 52, 주수 100, 주수 148, 주수 196, 및 주수 244에서 모든 대상체로부터 수집된 혈청 샘플에서 평가될 것이다.

통계학적 방법

대상체 정보

인구통계 및 기저선 질환 특성 및 이전의 약물 데이터는, 연구에 등록된 모든 대상체들이 연구 작용제 투여를 받았는지 여부에 관계없이, 그들에 대해 요약될 것이다. 약동학적 데이터는 연구 작용제의 적어도 1회 투여를 받은 모든 대상체에 대해 요약될 것이다. 효능 분석은 연구에 등록된 모든 대상체에 대해 요약될 것이다. 안전성 평가는 모든 치료된 대상체에 대해 요약될 것이다.

샘플 크기

샘플 크기 결정은 통계학적 고려사항에 기초하지 않았다. 목표는 집단 PK 모델 및, 실현가능한 경우, 노출-반응 모델을 구축하기에 충분할 샘플 크기를 갖는 것이다. 추가로, 합리적인 안전성 평가를 제공할 샘플 크기가 또한 고려하였다. 이들 고려사항에 따라, 20명의 대상체가 탈락하거나 이들이 PK 샘플을 제공하지 않는 경우, 대략 100명의 대상체의 샘플 크기가 주수 52에서 연구에서 남아 있을 것이라는 가정 하에 대략 120명의 대상체의 샘플 크기가 선택되었다. 이러한 샘플 크기는 대략 100명의 대상체로부터 1년의 안전성 데이터를 제공할 뿐만 아니라 PK 시점의 간헐적 샘플링을 감안할 때 집단 PK 모델을 구축하기에 충분한 것으로 생각된다.

효능 분석

일차 효능 종점 분석 및 주요 이차 효능 종점 분석이 계획되어 있지 않다.

하기는 연구에 등록된 모든 대상체에 대해 요약될 것이다:

시간 경과에 따른 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 CHAQ의 기저선으로부터의 변화.

시간 경과에 따른 CRP 농도

시간 경과에 따른 비활성 질환이 있는 대상체의 비율.

시간 경과에 따른 pJIA(ACR 기준)에 대한 투약에 대한 임상 관해에 있는 대상체의 비율

시간 경과에 따른 pJIA 코어 세트의 기저선으로부터의 개선

주수 52까지 시간 경과에 따른 질환 하위유형, 및/또는 연령별 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 JADAS 10, 27, 및 71 점수의 기저선으로부터의 변화

시간 경과에 따른 JADAS 10, 27, 및 71 최소 질환 활성을 달성하는 대상체의 비율

약동학적 분석

본 연구의 일차 목적은 JIA 집단에서 골리무맙 PK 노출(집단 PK 모델링 및 시뮬레이션으로부터 8주의 투여 간격에 대한 베이지안 AUCss 및 주수 28에서의 최저 농도)을 특성화하는 것이다.

혈청 골리무맙 농도가 시간 경과에 따라 요약될 것이다. 또한, 주수 28까지의 데이터에 대한 집단 PK 분석은 골리무맙의 PK를 특성화하도록 그리고 JIA가 있는 소아 집단에서 PK의 중요한 공변량을 식별 및 정량화하도록 수행될 것이다. 비선형 혼합 효과 모델링(nonlinear mixed effects modeling, NONMEM) 접근법을 사용하여 클리어런스 및 분포 부피가 추정될 것이다.

안전성 분석

안전성은 주수 252까지의 AE, 임상 실험실 검사, 및 바이탈 사인 소견의 요약을 평가함으로써 평가될 것이다.

면역원성 분석

연구 동안 골리무맙에 대한 항체의 발생률 및 역가는 골리무맙의 투여를 받고 골리무맙에 대한 항체의 검출을 위해 수집된 적절한 샘플을 갖는 모든 대상체(즉, 그의 첫 번째 골리무맙 투여 후 얻은 적어도 1개의 샘플을 갖는 대상체)에 대해 시간 경과에 따라 요약될 것이다.

약동학적/약력학적 분석

혈청 골리무맙 농도와 효능 사이의 관계가 조사될 것이다. 노출-반응 관계를 설명하기 위해 적합한 PK/약력학(PD) 모델이 조사되고 개발될 것이다.

1. 서론

SIMPONI®(골리무맙)는 면역글로불린 G1 중쇄 동종형(G1m[z] 동종이형) 및 카파 경쇄 동종형을 갖는 전체 인간 단일클론 항체(mAb)이다. 골리무맙의 분자량은 149,802 내지 151,064 달톤의 범위이다. 골리무맙은 서열 번호 36을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37을 포함하는 경쇄(LC)를 갖는다. 골리무맙의 분자량은 149,802 내지 151,064 달톤의 범위이다.

골리무맙은 높은 친화도 및 특이성으로 인간 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 가용성 형태 및 막관통 생물활성 형태 둘 모두와 고친화성의 안정한 복합체를 형성하며, 이는 TNFα의 그의 수용체에 대한 결합을 방지하고 TNFα 생물활성을 중화시킨다. 다른 TNFα 수퍼패밀리 리간드에 대한 결합은 관찰되지 않았으며; 특히, 골리무맙은 인간 림프독소에 결합하거나 중화시키지 않는다. TNFα는 활성화된 단핵구, 대식세포 및 T 세포에 의해 막관통 단백질로서 주로 합성되며, 이는 자가-회합하여 생물활성 동종삼량체를 형성하고, 이는 단백질 분해에 의해 세포 표면으로부터 신속하게 방출된다. p55 또는 p75 TNF 수용체에 대한 TNFα의 결합은 수용체 세포질 도메인의 클러스터링(clustering)으로 이어지고 신호전달을 개시한다. 종양 괴사 인자 α는, 다양한 자극에 반응하여 생성되고 후속으로 카스파제-의존성 아폽토시스 경로의 활성화 및 전사 인자인 핵 인자(NF)- κB 및 활성화인자 단백질-1(AP-1)을 통해 염증 반응을 촉진하는 주요 감시 사이토카인(sentinel cytokine)으로서 확인되어 있다. 종양 괴사 인자 α는 또한 배중심 내의 면역 세포의 조직화에서 그의 역할을 통해 면역 반응을 조절한다. TNFα의 상승된 발현은 류마티스성 관절염(RA)과 같은 만성 염증성 질환뿐만 아니라, 건선성 관절염(PsA) 및 강직성 척추염(AS)과 같은 척추관절병증에도 연관되어 있다. TNFα는 이들 질환의 특징인 관절 염증 및 구조적 손상의 중요한 매개체이다.

항-TNFα 작용제의 임상 연구에서 입증된 바와 같이, TNFα 활성을 차단하면 과도한 TNFα에 의해 야기되는 유해 효과를 예방할 수 있다. 정맥내(IV) 사용을 위한 SIMPONI®(골리무맙)는 다발성 JIA(pJIA)가 있는 환자에게 (다른 이용가능한 항-TNFα 작용제와 비교하여) 대체적으로 투여 경로 및 편리한 투여 계획(즉, 8주마다[q8w] 투여)을 제공하기 위해 개발되고 있다.

1.1. 배경

1.1.1. 소아 특발성 관절염

소아 특발성 관절염은 16세 이전에 시작하여 6주 이상 동안 지속되며 원인을 알 수 없는 모든 형태의 관절염을 포함하는 배제 진단이다.¹⁸ 이는 아동에서 가장 일반적인 만성 류마티스 질환이며 국제 류마티스 학회(International League of Associations for Rheumatology, ILAR) 분류에 따라, 뚜렷한 임상 양상 및 특징에 의해 특성화되는 7가지 하위유형(전신 관절염, 소수관절염, 류마티스 인자[RF]-음성 다발관절염, RF-양성 다발관절염, 부착부염-관련 관절염, 건선성 관절염, 미분화 관절염)으로 분류된다.¹⁶

JIA의 이질성(heterogeneity)은 다수의 인자가 질환의 병인 및 발병기전에 기여하고 유전적 및 환경적 인자 둘 모두가 연루되어 있다는 것을 나타낸다. 이들은 촉발 기전, 인간 백혈구 항원(HLA) 및 비-HLA 분자와 질환 발달 사이의 연결, 및 조직 염증 및 관절 파괴로 이어지는 면역학적 비정상으로서 감염을 연루시키는 것을 포함한다. 질환 발달에 있어서의 감염의 역할은 아직 입증되어 있지 않다.¹⁸ 그러나, JIA에서, HLA-DR5 및 HLA-DR8 유전자좌 항원이 소수관절형 관절염이 있는 어린 여아에서 연관된 기여 요소로서 연루된 반면, HLA-DR4는 나이가 더 많은 아동에서 Rf-양성 다발성 관절염에 연루되고, HLA-B27은 나이가 더 많은 남아에서 소수관절형 질환과 연루된다.^15,17

JIA의 병인 및 발병기전이 아직 불분명하지만, 성인 RA의 진행에서 역할을 하는 동일한 세포 유형 및 기본 기전이 아마도 수반된다.¹⁵수반된 세포 개체에는 다수의 염증성 사이토카인 및 염증의 매개체를 만드는 대식세포가 포함된다. TNFα와 같은 대식세포 유래 사이토카인은 RA가 있는 환자의 관절에서 뿐만 아니라 이 질환의 전신 징후에서 만성 염증 과정의 유도 및 지속에 결정적으로 중요한 역할을 하는 것으로 보이지만,⁶ 전신성 JIA에서 TNFα의 역할은 설득력이 떨어진다.³

일부 연구는, RA가 있는 성인 환자에서 상승된 염증성 사이토카인(예를 들어, 인터루킨-1 베타[IL-1β], 인터루킨-6[IL-6], 및 TNFα)의 수준이 JIA가 있는 환자의 활액과 혈청에서도 상승된다는 것을 보여주었다.^9,19,12,3,20 본 연구는 또한, 다양한 JIA 하위군을 갖는 환자들 중에서 상이한 사이토카인 프로파일을 발견하였다.

소아 특발성 관절염은 아동에서 단기간 및 장기간 장애의 중요한 원인이지만,¹⁴ 치료법의 새로운 진보는 임상적으로 중요한 진전을 입증하였다. 지난 10년 동안, 연구는, 환자의 40% 내지 60%가 추적관찰 시 JIA에 대한 투약물을 복용하는 동안 비활성 질환이나 임상적 관해가 나타났다는 것을 보여주었다. 기능성 결과는, 심각한 기능 장애를 가진 환자의 2.5% 내지 10%로, 지난 10년 동안 개선되었다.¹⁸ 그러나, JIA의 특히 심각한 합병증은 선형 성장 억제, 골다공증, 국소 성장 교란, 대식세포 활성화 증후군 및 홍채섬모체염을 포함한다.¹⁸

JIA의 치료 목적은 질환의 완전 통제를 얻고, 아동의 신체적 및 심리적 완전성을 보존하고, 질환 또는 그의 요법과 관련된 어떠한 장기간 영향도 방지하는 것이다. JIA에서 치료의 주류는 NSAID, 관절내 및 전신 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트(MTX) 및 다른 DMARD였다. 생물학적 투약물의 도입은 기존의 항류마티스 작용제에 내성을 갖는 JIA가 있는 환자의 치료를 위한 중요한 새로운 치료 옵션을 제공하였다.¹⁸ pJIA의 치료를 위한 현재 승인된 생물학적 요법은 에타너셉트, 아달리무맙, 아바타셉트, 및 토실리주맙을 포함하고; 카나키누맙 및 토실리주맙은 전신성 JIA에 대해 승인되었다.

1.1.2. 류마티스 관절염 및 소아 특발성 관절염의 골리무맙 임상 연구

SC 주사로서 주어진 골리무맙은 RA, PsA, 강직성 척추염(AS), 및 궤양성 대장염이 있는 성인에게 효과적인 것으로 입증되었다. 정맥내 골리무맙은 RA가 있는 성인에게도 효과적인 것으로 입증되었다. 다른 항-TNFα 작용제는 JIA가 있는 대상체의 치료에 효과적이었다. 스폰서는 소아 PsA를 포함한 JIA의 다수의 하위유형의 치료에서 SC 골리무맙의 사용과 연관된 이점과 위험을 평가하기 위해 BSA-기반 투여량의 SC 골리무맙에 대한 연구(CNTO148JIA3001)를 수행하였다.

성인에서 IV 골리무맙에 대한 CNTO148ART3001 연구의 결과와 JIA가 있는 대상체에서 SC 골리무맙에 대한 CNTO148JIA3001 연구 결과는 하기에 기재되어 있다.

1.1.2.1. 성인 류마티스 관절염에서의 정맥내 골리무맙

무작위화되고 플라세보-조절된 다시설 이중-맹검 연구인 CNTO148ART3001의 일차 목적은, MTX 요법에도 불구하고 활성 RA가 있는 성인 대상체에서 골리무맙 2 mg/㎏ + MTX의 IV 투여의 임상 효능을 MTX 단독 IV 투여와 비교하여 평가하는 것이었다. 대략 564명의 대상체를 계획하였고, 592명을 무작위 배정하였다.

대상체는, 동시 MTX 요법에도 불구하고, 스크리닝 및 기저선에서 6개 이상의 압통 관절 및 6개 이상의 종창 관절로 정의되는 활성 RA가 있었던 스크리닝 이전 적어도 3개월 동안 RA 진단을 받은 18세 이상의 남성 또는 여성이었다. 스크리닝에서, 대상체는 1.0 mg/dL 이상(정상 상한값=1.0 mg/dL)의 C-반응성 단백질(CRP) 측정치를 가져야 했고 RF-양성이어야 했다.

골리무맙에 무작위 배정된 대상체는 30±10분의 주입 시간에 걸쳐 2 mg/㎏의 골리무맙을 정맥내로 받았다. 추가로, 대상체는 연구 전반에 걸쳐 상업적 MTX의 안정한 용량(15 mg 내지 25 mg/주)을 유지하였다.

무작위 배정은 1.5 mg/dL 미만 또는 1.5 mg/dL 이상의 스크리닝 CRP를 기초로 하여 계층화하였다. 대상체는 주수 0, 주수 4에, 그리고 그 후 8주마다(q8w) 골리무맙 + MTX 또는 플라세보 + MTX에 2:1로 무작위 배정되었다. 전체 연구에 대한 치료의 지속기간은 12주의 안전성 추적관찰 기간과 함께 100주였다.

총 592명의 대상체 중 570명(96%)이 24-주 연구를 완료하였다. 나머지 22명(4%)의 대상체는 주수 24 전에 연구를 중단하였다. 대부분의 중단은 AE로 인한 것이었다: 골리무맙 + MTX 군 내의 9명[2.3%]의 대상체 및 플라세보 + MTX 군 내의 2명[1.0%]의 대상체).

플라세보 + MTX 군 내의 대상체(24.9%, p<0.001)와 비교하여, 골리무맙 + MTX 군 내의 대상체의 훨씬 더 높은 비율(58.5%)이 주수 14에 일차 종점인 ACR 20 반응을 달성하였다. 치료 효과는 스크리닝 시 CRP가 1.5 mg/dL 이상이거나 또는 1.5 mg/dL 미만인 대상체에서 일관되었다. 골리무맙 + MTX 군과 플라세보 + MTX 군 사이의 ACR 20 반응자 비율의 유의한 차이는 빠르면 주수 2에 관찰되었다. 주요 이차 효능 종점이 또한 달성되었다. 플라세보 + MTX 군 내의 대상체(40.1%, p<0.001)와 비교하여, 골리무맙 + MTX 군 내의 대상체의 훨씬 더 높은 비율(81.3%)이 주수 14에서 (CRP을 사용하여) 우수하거나 보통인 질환 활성 지수 점수(DAS) 28 반응을 보였다.

플라세보 + MTX 군 내의 대상체(0.125, p<0.001)와 비교하여, 골리무맙 + MTX 군 내의 대상체에서 주수 14에 건강 평가 설문 장애 지수(HAQ-DI) 장애 점수가 유의하게 더 크게 개선되었다(0.500). 또한, 주수 14(각각 43.1%와 비교하여 68.4%, p<0.001)와 주수 24(각각 45.2%와 비교하여 67.6%, p<0.001) 둘 모두에서 플라세보 + MTX 군과 비교하여 골리무맙 + MTX 군에서 HAQ-DI의 임상 관련 개선에 유의한 차이(0.25 이상)가 있었다. 골리무맙 + MTX를 받은 대상체는 플라세보 + MTX를 받은 대상체(13.2%, p<0.001)와 비교하여 주수 24에서 유의하게 더 높은 ACR 50 반응률(34.9%)을 나타내었다.

작은 집단 크기를 갖는 하위 군(즉, 15명 미만의 대상체)을 제외하고 RA에 대한 인구통계, 기저선 임상적 특징, 및 투약물에 대한 사전 노출의 하위군 내에서 일관된 치료 이점이 관찰되었다.

주수 12에서 플라세보 + MTX 치료에 비해 골리무맙 + MTX 치료에서, 36-항목 약식 건강 조사(SF-36) 및 SF-36 도구의 8개 척도 모두의 정신적 및 육체적 구성요소 요약 점수에서 통계학적으로 유의하게 더 큰 개선이 관찰되었다(모든 비교에 대해 p<0.001). 이러한 개선은 주수 24까지 유지되었다.

CNTO148ART3001에서 주수 16(조기 탈출 전 플라세보-대조 기간)까지, 플라세보군 내의 대상체의 43.7%와 골리무맙군 내의 47.3%가 AE를 보였으며; AE의 가장 높은 발생률은, 감염 및 침입 기관계 분류(SOC)가, 플라세보군 및 골리무맙군에서 각각 20.8% 및 24.3%였고, 상기도 감염(URTI)이 가장 빈번하게 보고된 AE였다(플라세보군 및 골리무맙군에서 각각 5.6% 및 5.1%). 주수 112까지, 골리무맙-치료된 대상체의 79.1%가 AE를 보였으며; AE의 가장 높은 발생률은 감염 및 침입 SOC에서 였으며(50.5%) URTI는 가장 빈번하게 보고된 AE였다(11.5%).

CNTO148ART3001에서 주수 16까지, 플라세보군 내의 대상체의 1.0% 및 골리무맙군 내의 대상체의 3.8%가 SAE를 보였다. 각각의 SOC 내의 SAE의 발생률은 1.0% 미만이었고, 1명 초과의 대상체에서 SAE가 발생하지 않았다. 주수 112까지, 골리무맙-치료된 대상체의 18.2%가 SAE를 보였으며; SAE의 가장 높은 발생률은 감염 및 침입 SOC(5.5%) 및 근골격 및 결합 조직 장애 SOC(3.4%)에서 발생했으며 가장 빈번하게 보고된 SAE는 RA였다(2.1%).

주수 24까지, CNTO148ART3001 연구에서 1명의 환자가 사망하였는데; 이 대상체는 플라세보 + MTX를 이용한 치료에 무작위 배정되었고, 골리무맙을 받은 적이 없으며, 추정된 뇌혈관 사고(뇌졸중)로 사망하였다. 주수 112까지, CNTO148ART3001 연구에서 추가로 5명의 대상체가 사망하였다. 플라세보 + MTX를 이용한 치료로 무작위 배정된 2명의 대상체가 둘 모두 골리무맙 2 mg/㎏ + MTX로 전환한 후 사망하였는데; 사망의 원인은 돌연사(n=1) 및 중증 탈수, 클로스트리듐 디피실레 대장염, 및 심방세동의 합병증(n=1)이었다. 2 mg/㎏ 골리무맙 + MTX를 이용한 치료에 무작위 배정된 3명의 대상체가 연구에서 사망하였는데; 보고된 사망 원인은 급성 복부 증후군(이후 복막 결핵증[TB]으로 진단됨, n=1), 추정된 심근 경색(MI, n=1), 및 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii)로 인한 화농성 폐농양에 따른 부차적인 패혈성 쇼크(n=1)였다.

CNTO148ART3001 연구에서 주수 16까지 악성종양은 보고되지 않았다. 연구 작용제를 투여하기 전에 플라세보 + MTX 군에서 보고된 비치료-유발 폐선암 1건이 있었다. 플라세보-대조 기간(주수 24)까지, 골리무맙군에서 1건의 악성종양(유방암)이 보고되었다. 주수 112까지, 기저세포 암종, 만성 림프구성 백혈병의 가족력이 있는 대상체에서의 만성 림프구성 백혈병, 제자리 자궁경부암, 보웬병, 및 기저 세포 암종을 포함한 5개의 추가 악성종양이 보고되었다. 주수 112까지 림프종은 보고되지 않았다.

CNTO148ART3001에서 주수 16까지, 골리무맙군 내의 대상체의 0.8%가 맹장염, 균혈증, 및 간질성 폐질환(의 합병증)을 포함한 심각한 감염을 보였다. 플라세보군 내의 대상체는 심각한 감염을 갖지 않았다. 주수 112까지, 골리무맙-치료된 대상체의 6.2%가 심각한 감염을 보였다. 1명 초과의 대상체에서 발생하는 심각한 감염은 폐렴(n=5), UTI(n=4), 및 단독(n=2)이었다.

CNTO148ART3001에서 주수 16까지, 플라세보군 내의 대상체의 0.5% 및 골리무맙군 내의 대상체의 2.5%가 주입 반응을 보였다. 주수 112까지, 골리무맙-치료된 대상체의 3.9%가 주입 반응을 보였고 주입의 0.4%가 주입 반응으로 인해 악화되었다. 모든 플라세보 주입은 진정한 일치된 플라세보가 아니라 0.9% 생리 식염수로만 이루어졌다는 점에 유의해야 한다. 연구 작용제 중단을 필요로 하는 심각한 주입 반응은 언급되지 않았다. 연구 약물과 연관되지 않은 아나필락시스의 경우가 있었다.

주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 8주마다(±1주) 투여로 2 mg/㎏ 골리무맙을 IV 투여한 후, 41.56 ㎍/mL의 중위값 피크 혈청 골리무맙 농도(즉, 주입 후 골리무맙 농도)가 주수 4에서 관찰되었다. 이러한 피크는 4주마다(q4w) 50 mg의 SC 골리무맙 투여에 대해 보고된 것보다 높다. MTX와 함께 2 mg/㎏로 IV 골리무맙을 8주마다 받은 대상체의 중위값 최저 혈청 골리무맙 농도는 주수 12에 0.28 ㎍/mL였고 주수 20에 0.22 ㎍/mL였으며; 이러한 수준은 SC 골리무맙 50mg에서 보고된 수준과 유사하다. 골리무맙에 대한 전반적인 노출은 유사한 노출 기간에 걸쳐 SC 골리무맙 50mg에 대한 노출의 대략 3배이다.

IV 골리무맙 프로그램으로부터의 데이터는 플라세보를 받은 대상체와 비교하여 골리무맙으로 치료된 대상체에서 더 적은 방사선학적 진행을 나타내었다. 주수 24에 골리무맙 + MTX 치료군과 플라세보 + MTX 사이의 총 반 데어 헤지드 변형된 샤프(vdH-S) 점수(플라세보 + MTX: 1.09 ± 3.194, 골리무맙 2 mg/㎏ + MTX: 0.03 ± 1.899 [p<0.001])의 기저선으로부터의 변화에 유의한 차이가 있었다. IV 골리무맙에 유리한 유의한 차이가 미란 및 관절 공간 협착 점수의 기저선으로부터의 변화에서도 또한 관찰되었다. 최소 검출가능 변화에 기초한 방사선학적 진행이 있는 대상체의 비율은, 총 vdH-S 점수(p<0.001)와 미란(p=0.001) 및 관절 공간 협착 측정치(p=0.01) 둘 모두에 대해 플라세보 + MTX와 비교할 때 골리무맙 + MTX로 치료된 대상체의 경우가 유의하게 낮았다.

1.1.2.2. 소아 특발성 관절염에서의 피하 골리무맙

CNTO148JIA3001은 MTX에 의한 현재 치료에도 불구하고 활성 pJIA가 있는 소아 대상체에서 4주마다(q4w) 주어진 BSA-기반 (최대 50 mg/용량까지) 30 mg/m² SC 골리무맙의 무작위 회수, 이중 맹검, 플라세보-대조, 병렬-군, 다시설 연구였다. 연구 집단은 적어도 6개월의 pJIA 의료 이력이 있고 5개 이상의 관절에서 활성 관절염이 있는 2세 내지 18세 미만의 MTX를 받은 pJIA가 있는 대상체로 구성되었다. 모든 대상체는 주수 0부터 주수 16까지 연구의 활성 치료 부분에서 SC 골리무맙을 받았다. 주수 16에서, JIA ACR 30 반응자는 무작위로 배정되어 32주 동안 플라세보 또는 골리무맙을 받았고; 이러한 32-주 기간 동안 플레어(flare)를 경험한 플라세보에 무작위 배정된 대상체는 골리무맙 요법을 다시 시작했다. 플라세보-대조 기간은 주수 48까지였으며, 장기간 연장은 주수 48부터 주수 248까지로 계획되었다.

대략 170명의 대상체가 계획되었고, 173명의 대상체가 연구에 등록되었다. 173명의 대상체 모두가 주수 48 효능 및 안전성 분석에 포함되었다. 173명의 대상체 중 19명이 주수 16까지 연구 작용제를 중단하였고(원인: 효능의 결여[n=14]; AE[n =4]; 동의 철회[n =1]), 154명의 대상체가 무작위 회수에 들어갔다(76명은 플라세보에 그리고 78명은 골리무맙을 지속하였다).

등록된 173명의 대상체의 기저선 질환 특성은, CNTO148JIA3001에서 수치적으로 더 낮은 평균 및 중위값 CRP/ESR 수준을 제외하고, pJIA에서의 항-TNFα 작용제의 다른 임상 연구와 비교할 만한 중등도 내지 중도의 JIA가 있는 집단을 구성하였다.

주수 16에 JIA ACR 30 반응자였던 대상체의 비율은 87.3%였다. 추가로, 주수 16에서 JIA ACR 50, JIA ACR 70, 및 JIA ACR 90 반응자의 비율은 각각 79.2%, 65.9%, 및 36.4%였다.

본 연구는 그의 일차 및 주요 이차 종점을 충족하지 못했는데, 이는 주수 16과 주수 48 사이에 플라세보를 받도록 무작위 배정된 대상체와 비교하여, 주수 16에서 JIA ACR 30 반응자였지만 주수 16과 주수 48 사이에 질환의 플레어를 경험하지 못했던 대상체의 비율이 주수 16과 주수 48 사이에 지속적인 골리무맙 치료로 무작위 배정된 대상체에서 유의하게 다르지 않았기 때문이다(59% 대 52.6%, p=0.41). 모든 민감도 분석 및 주요 이차 종점은 치료군들 사이에 통계학적으로 유의한 차이가 없음을 입증하였다. 스폰서는 사전-명시된 효능 종점이 충족되지 않았기 때문에 연구의 장기간 연장을 조기에 종료하였다.

0.1 내지 1.0 mg/dL 범위의 주수 0 CRP 수준을 기초로 하여 플레어 발생률을 평가한 사후 분석은, 대체적으로 기저선 CRP 수준이 더 높은 대상체들 중에서, 골리무맙 요법을 계속 받은 대상체는 주수 16에 플라세보로 무작위 배정되었던 대상체보다 플레어 에피소드가 유의하게 적었다는 것을 입증하였다.

주수 48까지의 관찰된 데이터를 기초로 하여 JIA ACR 반응률을 분석했을 때(주수 0을 기저선으로 사용하고 주수 48까지 각각의 방문 시 약물/플라세보 효과를 비교함), 89% 내지 95.9%의 JIA ACR 30 반응률 및 53.4% 내지 56.2%의 JIA ACR 90 반응률이 주수 48에서 달성되었다. 주수 48까지의 코어 세트의 개선은 주수 16에 플라세보로 무작위 배정된 대상체와 비교하여 주수 16에 골리무맙으로 무작위 배정된 대상체의 모든 방문 시 유사했으며, 모두 질환에서 임상적으로 의미 있는 개선, 예를 들어, 질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가에서 94.6% 및 95.1%의 중위값 백분율 개선 및 활성 관절 수에서 90.9% 및 100%의 중위값 백분율 개선을 나타내었다.

약동학(PK) 및 면역원성 데이터를 CNTO148JIA3001에서 주수 48까지 수집하였다. 골리무맙 30 mg/m² SC를 받고 활성 치료를 유지하도록 무작위 배정된 pJIA가 있는 대상체에서 주수 12, 주수 24 및 주수 48에 중위값 최저 골리무맙 농도는 각각 1.16 ㎍/mL, 1.12 ㎍/mL, 및 0.95 ㎍/mL였고, 이는 주수 48까지 정상-상태 수준이 유지되었다는 것을 나타낸다. 더욱이, 정상-상태 최저 골리무맙 농도는 pJIA가 있는 대상체에서 상이한 연령군, 체중 사분위수, 체질량 지수 사분위수 및 체중 카테고리에 걸쳐 유사하였다. 전반적으로, 이러한 농도는 SC 골리무맙으로 치료된 C0524T06에서 (MTX에도 불구하고) 성인 활성 RA 집단에서 관찰된 PK 노출과 유사했으며, 따라서 30 mg/m² SC q4w의 BSA-기반 골리무맙 계획이 골리무맙 50 mg SC q4w를 받은 성인 RA 집단에서 볼 수 있는 것과 비교가능한 농도를 생성하기에 충분하다는 가설을 뒷받침하였다. 추가로, PK 및 효능 분석은 유사한 효능(JIA ACR 30 반응에 의해 측정된 바와 같음, 및 플레어 발생률)이 정상-상태 최저 골리무맙 농도 사분위수의 4개 하위군 내의 pJIA가 있는 대상체에서 나타났음을 보여주었다. 추가로, 플레어가 있는 대상체와 플레어가 없는 대상체 사이에서는 외견상의 PK 차이가 관찰되지 않았다.

면역원성과 관련하여, 최근 개발된 약물 내성 면역검정 분석을 사용하여 대상체의 40.1%에서 골리무맙에 대한 항체가 발달하였다. 새로운 약물 내성 면역검정은 성인 골리무맙 RA 연구에서 이전에 사용된 검정과 비교하여 더 민감하며, 검출가능한 혈청 골리무맙 수준에도 불구하고 골리무맙에 대한 항체의 검출을 가능하게 한다. 무작위 배정되어 골리무맙 30 mg/m² SC + MTX에 계속 있는 대상체 중 30.8%에서 골리무맙에 대한 항체가 발달하였고; 항체 역가는 낮은 경향이 있었다. PK, 효능, 및 안전성에 대한 면역원성의 효과를 평가할 때, 양성 항-골리무맙 항체 상태는 역가 수준이 1:100 초과일 때 정상-상태 최저 골리무맙 농도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 효능에 대한 항체의 효과는 덜 민감하여, 효능의 명백한 감소와 상관관계를 나타내기 위해 1:1000 초과의 더 높은 역가를 필요로 하였다. JIA가 있는 대상체의 대략 5%에서만 역가가 1:1000 초과인 항-골리무맙 항체가 발달했기 때문에, 면역원성은 CNTO148JIA3001의 일차 종점의 달성 부족에 대한 기여 요인이 아닌 것으로 결정되었다. 추가로, 양성 항-골리무맙 항체 상태는 주사-부위 반응의 더 높은 발생률과 연관되어 있는 것으로 보이지 않았다.

주수 48까지 AE를 보고한 대상체의 비율은 87.9%였다. AE의 가장 일반적으로 보고된 기관계 분류는 감염 및 침입(67.1%)이었고, 주로 상기도 감염 및 비인두염이었다. 플라세보로 무작위 배정된 대상체(82.9%) 및 지속적인 골리무맙 치료로 무작위 배정된 대상체(78.2%)에 대해 주수 16과 주수 48 사이로 보고된 AE에는 뚜렷한 차이가 없었지만; 연구의 무작위 회수 부분의 모든 대상체는 재-무작위화 전에 16주 동안 골리무맙에 노출되었다는 점에 유의해야 한다. 심각한 유해 사건은 13.3%의 대상체에 의해 보고되었다. 가장 일반적으로 보고된 SAE는 JIA의 악화(6.4%)였다. 대상체의 2.9%에서 심각한 감염(폐렴, 요로 감염, 대상 포진, 상기도 감염, 및 신우신염)이 보고되었으며, 주수 48까지 사망, 악성종양, 또는 탈수초 사건은 없었다. 활성 TB의 보고가 없었고 심각한 기회성 감염도 없었다. 주수 48까지, 비정상 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 측정치를 갖는 (그리고 간 기능 검사[LFT]에 영향을 미칠 수 있는 잠복성 TB에 대한 동시 치료를 받지 않는) 대상체의 수는 29.5%(51/167)였으며, 51명의 대상체 중 39명이 3 X ULN 미만의 상승을 가졌다.

ALT가 8 X ULN 초과까지 상승한 2명의 대상체가 있었지만 어느 대상체도 간독성과 일치하는 Hy의 법칙에 대한 기준을 충족하지 못했다. 대상체는 TB 예방을 받지 않았으며; 대상체들 중 한 명은 이미 비정상인 기저선 ALT를 가졌다. LFT 비정상이 있는 모든 대상체는 MTX 투약의 변화에 의해 보존적으로 관리되었지만, 1명의 대상체는 상승된 LFT에 대해 중단되었다.

주수 48까지 주사-부위 반응이 있는 주사의 발생률은 0.8% 였고; 골리무맙 치료를 재개한 플라세보에 무작위 배정된 대상체에서 혈청병-유사 반응에 대한 SAE 보고가 1건 있었다.

CNTO148JIA3001 연구가 그의 종점을 충족하지 못했지만, 주수 48까지의 관찰된 데이터를 기초로 하여 JIA ACR 반응률을 분석했을 때(주수 0을 기저선으로 사용하고 주수 48까지 각각의 방문 시 약물/플라세보 효과를 비교함), 연구는 pJIA가 있는 소아에서 SC 골리무맙으로 달성할 수 있는 효능에 대한 가능성을 보여주었다. 따라서, 이는 MTX에 부적절한 반응을 보이는 pJIA가 있는 대상체에서 IV 골리무맙의 연구를 지원한다.

1.2. 연구를 위한 전반적인 이론적 근거

정맥내 골리무맙은 RA가 있는 성인의 치료에 효능이 있는 것으로 입증되었다(섹션 1.1.2.1). 항-TNFα 작용제를 포함하는 다른 생물학적 작용제는 pJIA가 있는 대상체의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 생물학적 주입 요법이 pJIA의 치료에 이용가능하지만, 이러한 병태에 대한 승인된 정맥내로 투여되는 항-TNFα 작용제가 현재는 없다. 아동에 대해 본 연구에서 제안되고 RA가 있는 성인에서 연구된 8주마다 30분 주입의 패러다임은 약물 요법에 대한 의사의 더 정밀한 조사가 필요하거나 요청될 수 있는 환자의 집단에 적절할 수 있다. 특히 소아 집단에서, (즉, 8주마다 유지 관리 일정으로) 약물 투여 횟수의 감소는 다른 생물학적 작용제와 비교하여 (더 적은 수의 IV 투여로 인한) 더 적은 통증 및 더 큰 편리함을 제공할 수 있다. 더욱이, 이전의 항-TNFα 작용제가 효과가 없었던 환자에서 상이한 항-TNFα 작용제로 전환하는 것은 질환의 추가의 증상 완화를 제공할 수 있다.

본 연구의 일차 목적은 이러한 대상체에서 IV 골리무맙의 안전성 및 효능의 평가와 함께, pJIA에서 IV 골리무맙의 PK를 특성화하는 것이다. 본 연구는 또한, 이전에 항-TNFα 경험이 있는 대상체(연구 집단의 최대 30%)뿐만 아니라 소아 PsA를 포함하여 JIA의 여러 하위유형을 가진 대상체를 포함할 것이다.

연구는 MTX 치료에 부적절한 반응을 보이는 성인 RA 대상체에서 체중-기반(2 mg/㎏) 용량의 IV 골리무맙에 의해 나타나는 반응과의 유사성을 입증하려는 의도로, 비스테로이드성 항염증제, 코르티코스테로이드, 및/또는 항-TNFα 작용제를 이용한 사전 치료뿐만 아니라 MTX 치료에 대해 부적절한 반응을 보이는 pJIA가 있는 대상체에 대해 BSA-기반(80 mg/m², 체중 70 ㎏의 성인 RA 환자의 2 mg/㎏ 용량과 동등할 것으로 예상됨) IV 골리무맙에 대한 반응으로 PK 데이터를 얻도록 설계되었다. pJIA가 있는 대상체에 대한 80 mg/m² 용량은 성인 RA 집단에서 CNTO148ART3001에서 연구된 2 mg/㎏ 용량을 기초로 한다.

2. 목적 및 가설

2.1. 목적

일차 목적

본 연구의 일차 목적은 2개월 이상 동안의 MTX 요법에도 불구하고 활성 관절염이 있는 5개 이상의 관절에 의해 나타나는 pJIA가 있는 대상체(2세 내지 18세 미만)에서 골리무맙을 정맥내 투여한 후 PK를 평가하는 것이다.

이차 목적

본 연구의 이차 목적은 pJIA가 있는 대상체에서 PK, 효능(징후 및 증상의 완화, 신체적 기능, 및 삶의 질), 안전성(AE, SAE, 및 실험실 파라미터의 평가), 및 면역원성(골리무맙에 대한 항체)과 관련하여 IV 골리무맙을 평가하는 것이다.

2.2. 가설

본 연구에서는 공식적인 가설 시험은 계획되어 있지 않다.

3. 연구 설계 및 이론적 근거

3.1. 연구 설계의 개요

이는 현재 MTX 치료에도 불구하고 활성 pJIA가 있는 대상체에서 IV 골리무맙의 PK, 안전성 및 효능을 평가하기 위한 3상, 개방-표지, 단일군, 다시설 연구이다. 연구 집단은 적어도 3개월의 pJIA 의료 이력이 있고 5개 이상의 관절에서 활성 관절염이 있는 2세 내지 18세 미만의 MTX를 받는 pJIA가 있는 대상체로 구성될 것이다. 대략 120명의 대상체가 주수 0에 등록되어, 대략 100명의 대상체가 주수 52에서 연구에 남도록 할 것이다. 등록 패턴은 2세 내지 최대 6세에서 대략 10%, 6세 내지 최대 12세에서 대략 20%, 12세 내지 18세 미만에서 대략 70%의 대상체 집단을 생성할 것으로 예상된다.

모든 대상체는 주수 0, 주수 4에, 그리고 주수 28까지 8주마다(q8w)(±3일) 그리고 그 후 주수 244까지 8주마다(±1주) 30±10분에 걸쳐 주어진 80 mg/m²의 골리무맙(최대 단일 용량 240 mg)을 IV 주입으로 받을 것이다. 체표면적은 각각의 방문 시 측정된 대상체의 키 및 체중을 기초로 하여 계산될 것이며, BSA-기반 용량의 골리무맙은 필요에 따라 조정되어 용량을 80 mg/m²으로 유지할 것이다. 대상체는 또한 섹션 6.2에 약술된 바와 같이 연구 시작 시점과 동일한 BSA-기반 투여량(BSA가 1.67 m² 미만인 대상체의 경우 주당 10 내지 30 mg/m²의 MTX, 또는 BSA가 1.67 m² 이상인 대상체의 경우 최소 15 mg/주)으로 상업적 MTX를 주수 28까지 매주 받을 것이다.

BSA에 기초하여 골리무맙의 80 mg/m²의 용량으로 대상체를 유지하도록 모든 노력이 이루어져야 하고, 80 mg/m² 미만으로 감소하거나 80 mg/m² 초과로 증가하거나 또는 투여 간격의 (예를 들어, 8주에서 6주로의) 단축은 방문 시 허용되지 않을 것이다.

이는 개방-표지 연구이며, 모든 대상체는 IV 골리무맙의 동일한 BSA-기반 용량을 받는다. 안전성 데이터는 연구의 의료 모니터에 의해 일상적으로 평가될 것이다. 따라서, 외부 데이터 모니터링 위원회는 설치되지 않을 것이다.

연구 설계의 다이어그램이 도 18에 제공되어 있다.

3.1.1. 주수 0 내지 주수 28

주수 28까지, 대상체는 모니터링될 것이고, 질환 활성 및 안전성은 4주마다 조사 현장에서 평가될 것이다.

연구 집단의 50% 미만이 주수 28에 치료에 대한 적절한 반응(미국 류마티스 학회 소아 30%[JIA ACR 30] 반응)을 달성하는 경우, 연구는 중단될 것이다.

모든 대상체가 주수 28 방문을 완료한 후, 데이터베이스는 PK, 안전성 및 효능을 평가하기 위해 잠겨질 것이다. 추가의 안전성, 효능, 및 PK 데이터베이스 잠금이 현재 주수 52에 계획되어 있다. 최종 데이터베이스 잠금은 주수 252에 수행될 것이다.

백그라운드 투약물(즉, MTX, 다른 DMARD, 코르티코스테로이드, 및 NSAID)에 대한 어떠한 변경도, 백그라운드 투약물에 대한 변경을 필요로 하는 안전 문제(예를 들어, 상승된 간 기능 검사)가 없는 한, 섹션 8에서 제공된 매개변수를 초과하는 투여량(예를 들어, 10 mg/일 이하의 프레드니손 또는 0.20 mg/㎏/일 이하 중 더 낮은 것)의 증가 또는 감소의 측면에서 그리고/또는 주수 0 내지 주수 28 사이의 투여 경로의 측면에서, 이루어져서는 안된다.

대상체가 추적관찰 소실인 경우, 연구 현장 직원은 대상체에게 연락하고 중단/탈퇴의 이유를 결정하기 위해 모든 가능한 노력을 실행해야 한다. 추적관찰을 위해 취해진 조치는 문서로 기록되어야 한다.

대상체가 본 연구를 완료하기 전에 탈퇴하는 경우, 탈퇴의 이유가 CRF 및 근거 문서에 문서로 기록되어야 한다. 탈퇴한 대상체에게 배정된 연구 약물은 다른 대상체에게 배정되지 않아도 된다. 탈퇴한 대상체는 대체되지 않을 것이다.

3.1.2. 주수 28 내지 주수 52

주수 28부터 주수 52까지, 주입은 8주마다(±1주) 계속 수행될 것이지만; 대상체는 조사 현장에서 적극적으로 모니터링될 것이고 질환 활성 및 안전성은 주수 0 내지 주수 28 사이에서 4주마다보다는 오히려 8주마다 조사 현장에서 평가될 것이다. 상기에 언급된 바와 같이, 주수 28 후에 대상체는, 섹션 8에서 약술된 바와 같이, MTX, 다른 DMARD, 코르티코스테로이드, 및 NSAID를 변경/추가하도록 허용될 것이다.

3.1.3. 주수 52 내지 주수 252(장기간 연장)

주수 52에서 연구를 완료한 대상체는 본 연구의 장기간 연장(LTE) 상으로 진입하도록 하는 옵션을 가질 것이다. 장기간 연장에 들어가지 않기로 선택한 대상체는 연구 작용제의 마지막 투여 후 추가의 8-주 안전성 추적관찰 방문을 완료하도록 권장될 것이다.

장기간 연장 동안, 모든 대상체는 주수 244까지 골리무맙을 8주마다(±1주) 계속 받을 것이다. 252주의 전체 시험 기간을 완료한 아동 - 그를 위한 약물이 유익한 것으로 입증되었지만 pJIA 적응증에 대해 구매가능하지 않음 - 의 (또는 환자가 약값을 지불할 보험에 대한 자격이 없는) 경우 IV 골리무맙은 스폰서에 의해 계속 제공될 것이다. 주수 52 내지 주수 252에서, 질환 활성이 16주마다 모니터링될 것이고, 평가될 것이고, CRF에 기록될 것이며; 주입 및 안전성 측정이 조사 현장에서 8주마다 행해질 것이다.

상기에 언급된 바와 같이, 주수 28 후에 대상체는, 섹션 8에서 약술된 바와 같이, 이러한 분류의 작용제에 대한 (적절한 경우) BSA-기반 투여량의 증가 도는 감소를 포함한, MTX, 다른 DMARD, 코르티코스테로이드, 및 NSAID를 변경/추가하도록 허용될 것이다.

주수 244 방문을 완료한 모든 대상체는 주수 252에서 안전성 추적관찰 방문에 참여할 것으로 예상된다. 주수 244 이전의 임의의 시점에서 연구 작용제를 중단한 이러한 대상체는 또한, 연구 작용제의 마지막 투여 후 대략 8주 후에 안전성 추적관찰 방문을 위해 복귀할 것으로 예상된다.

최종 데이터베이스 잠금은 주수 252에 있을 것이다.

3.1.4. 연구 종료 정의

연구의 종료는 장기간 연장에서 마지막 대상체에 대한 마지막 추적관찰 평가로서 정의된다.

3.2. 연구 설계의 이론적 근거

3.2.1. 맹검, 대조군, 연구 단계/기간, 치료군

이는 pJIA가 있는 대상체에서 IV 골리무맙의 PK를 평가하기 위한 단일군 개방-표지 연구이며, 이때 모든 대상체는 주수 52까지 동일한 BSA-기반 용량의 IV 골리무맙을 받는다. 주수 52에서 연구를 완료한 대상체는 주수 252까지 본 연구의 장기간 연장(LTE) 상으로 진입하도록 하는 옵션을 가질 것이다.

3.2.2. 용량 선택

성인 약물 용량과는 달리, 소아 약물 용량(비경구)은, 일반적으로 그의 성숙한 기관계에서 변화가 발생함에 따라, 다양한 연령에 걸친 아동에게서 관찰되는 PK 변동성을 관리하기 위해 체중-기반(mg/㎏) 또는 BSA-기반(mg/m²) 용량으로서 개별적으로 계산된다.^10,22 다른 승인된 항-TNFα 작용제(예를 들어, 아달리무맙 및 에타너셉트)에 대한 체중-기반 또는 BSA-기반 용량 정규화를 통해 성인 대상체부터 소아 대상체로의 용량 외삽의 성공적인 결과는 류마티스 질환에서 항-TNFα 작용제에 대한 임상 반응이 성인과 아동 사이에서 유사할 것이라는 가정을 뒷받침한다. 즉, 성인과 아동 사이에 내재된 PK 차이가 고려된 후, 유사한 약물 반응이 성인 및 아동 둘 모두에서 유사한 약물 노출에 의해 예상될 것이다.

24주까지 RA가 있는 성인에 대한 3상 IV 연구(CNTO148ART3001)로부터의 데이터는 주수 0, 주수 4에, 그리고 그 후 8주마다(±1주) 골리무맙 2 mg/㎏이 대부분의 성인에서 RA 치료를 위한 최적의 투여 계획인 것을 보여주었다. 아동의 경우, 골리무맙 80 mg/m²(2 mg/㎏/1.73 m²)은 체중이 70 ㎏인 성인 대상체(1.73 m²의 BSA를 가짐)에 대해 2 mg/㎏과 대략 동등할 것이다. 따라서, 현재의 연구(CNTO148JIA3003)에서, 골리무맙 80 mg/m²의 용량이 pJIA 집단에서 골리무맙의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 선택되었다.

3.2.3. 이론적 근거

pJIA 집단에서 IV 골리무맙에 대한 개방-표지 연구 설계는 성인 RA 및 pJIA에서 다른 항-TNFα 작용제의 연구로부터의 데이터, 성인 RA에서 IV 골리무맙의 스폰서의 연구(CNTO148ART3001)로부터의 PK 및 효능 데이터, pJIA에서 SC 골리무맙에 대한 스폰서의 경험(CNTO148JIA3001), 및 소아 류마티스학 국제 시험 기구(PRINTO) 및 소아 류마티스학 협력 연구 그룹(PRCSG)으로부터의 피드백을 기반으로 한다.

스폰서는 제안된 개방-표지 CNTO148JIA3003 연구로부터 생성된 PK 데이터를 활용하여 RA에 대한 CNTO148ART3001 연구로부터의 성인 PK 데이터를 외삽할 것이며, 이는 RA가 있는 성인 환자에 대한 IV 골리무맙(정맥내 사용을 위한 SIMPONI ARIA/SIMPONI)의 승인에 대한 기초로서 역할을 한 중추 연구였다. 추가로, 보조적 노출-반응의 평가를 조사하기 위해 효능(PD) 데이터가 수집될 것이다.

4. 대상체 집단

적격한 대상체에 대한 스크리닝이 본 연구 약물의 투여 전 6주 이내에 수행될 것이다.

본 연구에서 대상체를 등록하기 위한 선정 기준 및 제외 기준은 하기 2개의 하위섹션에 기재되어 있다. 하기 선정 또는 제외 기준에 관하여 의문이 있는 경우, 연구자는 연구에 대상체를 등록하기 전에 적절한 스폰서 대표와 상의해야 한다.

대상체 선택의 통계학적 고려사항의 논의에 대해서는, 섹션 11.2, 샘플 크기 결정을 참조한다.

선정 및 제외 기준으로부터의 편차는 그것이 연구의 과학적 무결성, 규제 승인, 또는 대상체 안전성을 잠재적으로 위태롭게 할 수 있기 때문에 허용되지 않는다. 따라서, 프로토콜에 명시된 바와 같은 기준을 준수하는 것이 필수적이다.

대략 120명의 대상체가 본 연구에 등록될 것이다. 연구 치료를 중단하거나 연구 참여를 탈퇴한 등록된 대상체는 새로운 대상체로 대체되지 않을 것이다.

제외로 이어지는 비정상적인 스크리닝 값의 재검사는 적격성을 재평가하기 위해 스크리닝 기간 중에 예정되지 않은 방문을 사용하여 1회만 허용된다. 이는 대상체 안전성에 예상되는 영향이 없는 경우에만 고려되어야 한다.

4.1. 선정 기준

각각의 잠재적 대상체는 본 연구에 등록되기 위해 하기의 모든 기준을 만족시켜야 한다.

4.2. 제외 기준

하기 기준 중 임의의 것을 충족시키는 임의의 잠재적 대상체는 연구 참여로부터 제외될 것이다.

주: 연구자는 모든 연구 등록 기준이 스크리닝 시에 충족되어 있음을 보장해야 한다. 스크리닝 후에 그러나 연구 약물의 최초 투여 전에 대상체의 상태 변화(실험실 결과 또는 추가의 의료 기록의 수령을 포함함)가 주어짐으로써 그 또는 그녀가 더 이상 모든 적격성 기준을 충족시키지 않는다면, 대상체는 연구에의 참여로부터 배제되어야 한다. 근거 문서인 섹션 17.4는 등록 기준을 충족하는 것을 뒷받침하기 위해 필요 문서화를 설명한다.

4.3. 금지사항 및 제한사항

참여에 적격하기 위하여, 잠재적 대상체는 본 연구의 과정 중에 하기 금지사항 및 제한사항을 기꺼이 준수할 수 있어야 한다:

5. 치료 배정 및 맹검

이는 개방-표지 연구이다. 모든 대상체는 주수 0, 주수 4에, 그리고 주수 28까지 8주마다(±3일) 그리고 최대 주수 244까지 8주마다(±1주) 골리무맙 80 mg/m²을 받을 것이다.

이는 개방-표지 연구이기 때문에, 맹검 절차가 적용되지는 않는다.

6. 투여량 및 투여

6.1. 골리무맙

연구는 1개의 활성 치료군을 가질 것이며, 모든 대상체는 주수 0, 주수 4에, 그리고 주수 28까지 8주마다(±3일) 그리고 그 이후 주수 244까지 8주마다(±1주) 80 mg/m²의 골리무맙(최대 단일 용량 240 mg)을 IV 주입으로 받을 것이다. 골리무맙 주입은 0.9% 식염수의 100 mL 주입 백 및 바이알 내의 골리무맙 50 mg/4 mL 액체를 사용하는 멸균 조건 하에서 약사에 의해 조제될 것이다. 대상체는 30±10분에 걸쳐 80 mg/m²의 골리무맙 IV 주입을 받을 것이다. 연구자에 의해 적절하다고 간주되는 바와 같이 주입 반응의 증거를 위해 주입 속도를 늦출 수 있으며 주입 속도의 모든 변경은 CRF에 기록해야 한다. 체표면적은 각각의 방문 시 계산될 것이고, 골리무맙의 용량은 필요에 따라 조정되어 용량을 80 mg/m²으로 유지할 것이다. 체표면적은 모스텔러 식을 사용하여 계산될 것이다: BSA(m²) = ([키(cm) x 체중(㎏)]/3600)^1/2. 추가 상세사항에 대해서는, 문헌[Site IP Manual]을 참조한다.

6.2. 메토트렉세이트

대상체는 연구 시작 시점과 동일한 BSA-기반 용량(BSA가 1.67 m² 미만인 대상체의 경우 주당 10 내지 30 mg/m² 또는 BSA가 1.67 m² 이상인 대상체의 경우 적어도 15 mg/주)으로 상업적 MTX를 주수 28까지 받을 것이다. 절대 용량은 주수 28까지 기저선으로부터 안정하게 유지되어야 한다.

MTX로 인한 불내성 또는 AE가 발생하지 않는 한, 대상체가 주수 28 방문까지 MTX의 동일한 투여 경로 및 용량을 유지하도록 모든 노력을 기울여야 한다(섹션 8). MTX 독성의 경우에 MTX 투여량을 조정하기 위한 지침은 시험 센터 파일에 제공된다.

대상체는 또한 매주 MTX 투여한 다음 날에 주어진 (MTX 용량의 절반으로) 폴린산 또는 매주 5 mg 이상의 상업적 엽산의 총 용량을 받을 것이다. 12세 미만의 아동의 경우, 엽산 또는 폴린산의 투여는 의사의 재량에 달려 있을 것이다.

주수 28 후, MTX 투여의 변경(예를 들어, 투여량의 증가 또는 감소, 투여 경로의 변경, 또는 중단)이 허용된다.

7. 치료 순응도

연구 현장 직원은 치료 배정의 준수를 보장할 것이다. 현장 직원은 각각의 방문 시 연구 주입을 투여하고 주어진 주입 양을 기록할 것이다.

모든 대상체 CRF는 스폰서에 의해 지정된 현장 모니터에 의해 모니터링될 것이다. 이러한 모니터링 방문 동안, 모든 절차는 프로토콜의 준수에 대해 평가될 것이다. 일정이 잡힌 기간 외에 제공된 치료 및 놓친 방문은 CRF에 기록될 것이다. 대상체 차트는 정확성을 보장하기 위해 검토되고, CRF의 데이터 입력과 비교될 것이다.

8. 연구전 요법 및 동시 요법

연구 작용제의 최초 투여 전에 투여된 연구전 JIA 투약물은 스크리닝 시 기록되어야 한다. 모든 동시 요법은 연구 약물의 최초 용량의 투여로 시작하여 연구 전체에 걸쳐 기록되어야 한다.

연구 약물과 상이한 모든 요법(백신, 비타민, 약초 보조제를 포함한 처방 의약품 또는 일반의약품; 전기 자극 및 침술과 같은 비약물 요법)이 CRF에 기록되어야 한다. 기록된 정보는 약물의 유형, 치료 기간, 투여 계획, 투여 경로, 및 그의 적응증에 대한 설명을 포함할 것이다. 대상체를 본 연구에 들어가게 하기 위한 명시적인 목적으로, 효과적인 기존 요법의 변형이 이루어져서는 안 된다.

코르티코스테로이드 또는 NSAIDS를 사용하는 경우, 대상체는 선정 기준 8 및 9에 따라 연구 시작 전에 이들 투약물의 안정한 용량을 유지했어야 한다(섹션 4.1). 대상체는 제외 기준 12에 따라 연구 시작 전에 TNFα를 감소시키는 것을 목표로 하는 2개 이하의 치료제로 이전에 치료되었을 수 있다(섹션 4.2). 대상체는 제외 기준 1 내지 20에 약술된 바와 같이 금지된 치료제로 시작하거나 치료되지 않았을 수 있다(섹션 4.2).

대상체는 스크리닝 전 2개월 이상 동안 MTX를 받았어야 한다. BSA가 1.67 m² 미만인 대상체의 경우, MTX 용량은 주당 10 내지 30 mg/m²이어야 하고 스크리닝 전에 4주 이상 동안 안정적이어야 한다. BSA가 1.67 m² 이상인 대상체의 경우, MTX 용량은 최소 MTX의 15 mg/주이어야 하고 스크리닝 전에 4주 이상 동안 안정적이어야 한다. 이 규칙에 대한 예외의 경우, 선정 기준 7을 참조한다. 연구 시작 시점에 코르티코스테로이드를 받은 대상체(sJIA가 있는 대상체는 제외)는 스크리닝 전 2주 이상 동안 안정한 용량을 받아야 하고, 그 용량은 10 mg/일 이하의 프레드니손 또는 프레드니손 등가량 또는 0.20 mg/㎏/일(이들 중 더 낮은 것)이어야 한다. 전신 발병 JIA가 있지만 3개월 이상 동안 전신 증상이 없는 대상체는 스크리닝 전 3일 동안 안정한 코르티코스테로이드를 유지하여야 하고 전신 증상이 나타나지 않아야 한다. NSAID 요법을 받을 경우, 용량은 스크리닝 전 2주 이상 동안 안정적이어야 한다.

백그라운드 투약물(즉, MTX, 다른 DMARD, 코르티코스테로이드, 및 NSAID)에 대한 어떠한 변경도, 백그라운드 투약물에 대한 변경을 필요로 하는 안전 문제(예를 들어, 상승된 간 기능 검사)가 없는 한, 투여량(예를 들어, 10 mg/일 이하의 프레드니손 또는 0.20 mg/㎏/일 이하 중 더 낮은 것)의 증가 또는 감소의 측면에서 그리고/또는 주수 0 내지 주수 28 사이의 투여 경로의 측면에서, 이루어져서는 안된다. 주수 28 후, 대상체는 MTX, 다른 DMARD, 코르티코스테로이드, 및 NSAID를 변경/추가하도록 허용될 것이며, 이는 투여량의 증가 또는 감소, 투여 경로의 변경, 또는 이러한 부류의 작용제로부터의 중단을 포함한다.

pJIA의 치료를 위한 코르티코스테로이드의 근육내 투여는 연구 동안 허용되지 않는다. pJIA 이외의 질환의 치료를 위해 기관지 또는 비강 흡입에 의해 투여되는 코르티코스테로이드는 연구 과정 전반에 걸쳐 필요에 따라 주어질 수 있다.

IV 코르티코스테로이드의 사용을 피하기 위해 모든 시도가 이루어져야 한다. 수술 전 예방적 요법(스트레스-용량 코르티코스테로이드) 또는 제한된 감염, 천식의 악화를 위한 요법과 같은 이유로 단기간(2주 이하) 경구 또는 IV 코르티코스테로이드를 필요로 하는 대상체의 경우, 또는 pJIA 이외의 임의의 질환의 경우, 코르티코스테로이드 요법은, 치료 의사의 의견에 따라, 적절한 대안이 없고 CRF에 문서화되어야 하는 상황으로 제한되어야 한다.

대상체는, 임상적으로 필요한 경우, 주수 52까지의 연구 동안 코르티코스테로이드의 관절내 주사를 받을 수 있다. 그러나, 관절내 주사 횟수는 임의의 24주 기간에 걸쳐 2회로 제한되어야 한다. 즉, 대상체가 2회의 관절내 주사를 받았고 24주 초과가 경과한 경우, 대상체는 다른 24주 기간에 걸쳐 최대 2회의 추가 관절내 주사를 받을 수 있다.

주수 52 후, 주사된 관절의 수는 더 이상 24주당 2회 주사로 제한되지 않는다. 스폰서는 금지 요법이 투여되는 어떠한 사례라도 미리(또는 이후 가능한 한 곧바로) 통지받아야 한다(섹션 4.3).

9. 연구 평가

9.1. 연구 절차

9.1.1. 개요

시간 및 이벤트 일정은 본 연구에 적용가능한 효능, PK, 면역원성, 및 안전성 측정의 빈도 및 타이밍을 요약한다(표, 표 7, 및 표). 모든 일정이 잡힌 연구 방문은 주수 28까지 의도된 방문의 ±3일 내에 그리고 주수 28부터 주수 244까지 ±1주 내에 이루어져야 한다. 권장된 허용가능한 윈도우가 관찰될 수 없는 경우, 방문을 예정하기 전에 스폰서와 접촉해야 한다.

아동 건강 평가 설문(CHAQ)은 대상체의 지각에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해 임의의 검사, 절차, 또는 그 방문에 대한 다른 진찰 전에 수행되어야 한다. 추가의 상세 사항에 대해서는, PRO 사용자 매뉴얼을 참조한다.

모든 일정에 잡히지 않은 방문 시, 연구자는 하기 평가를 수행할 것이다:

시스템의 검토

바이탈 사인

TB 설문

유해 사건

동시 투약물의 검토

안전성 실험실 평가

본 연구에 대상체가 참여하는 동안에는 언제든지 임신이 아님을 확고히 하기 위하여, 연구자에 의해 필요하다고 결정되거나 지역 규정에 의해 요구되는 바와 같이, 추가의 혈청 또는 소변 임신 검사가 수행될 수 있다.

연구를 위해 각각의 대상체로부터 수집될 총 혈액 부피는 대략 149.4 mL이다(표 1). 안전성 이유 또는 샘플에 관련된 기술적 문제로 반복되거나 예정되지 않은 샘플을 채취할 수 있다.

[표 1]

9.1.2. 스크리닝 단계

서면 사전 동의/승낙을 얻은 후, 그리고 주수 0 전 6주의 기간 이내에, 대상체 적격성을 확립하는 모든 스크리닝 평가가 수행될 것이다. 모든 선정 기준을 충족시키고 어떠한 제외 기준도 충족시키지 않는 대상체가 연구에 등록될 것이다. 각각의 대상체에 대해 연구 일정표를 준수하기 위해 모든 노력이 실행되어야 한다(표).

가임 여아는 스크리닝에서 음성 혈청 β-hCG 임신 검사 및 연구 작용제의 각각의 투여 전 음성 소변 임신 검사를 받아야 한다. 성적으로 활발한 대상체는, 고도로 효과적인 피임 방법을 사용하고 연구의 지속기간 동안 그리고 연구 작용제의 마지막 투여를 받은 후 6개월 동안 피임을 계속 사용할 것에 동의해야 한다. 각각의 대상체에 의해 사용되는 피임 방법(들)은 문서로 기록되어야 한다.

대상체는 스크리닝에서 TB에 대한 검사를 받아야 하고, 그의 의료 이력 평가는 TB의 이력 또는 활성 TB이 있는 개인들에 대한 알려진 개인적 노출에 관한 특정 질문을 포함해야 한다. 흉부 방사선 사진 결과 및 투베르쿨린 피부 검사 또는 다른 TB 검사에 대한 반응을 포함한 TB에 대한 과거 검사에 관해 대상체에게 문의해야 한다(섹션 4.1).

음성 QuantiFERON®(TB Gold 검사) 결과(및 QuantiFERON®(TB Gold 검사)이 승인/등록되어 있지 않거나 투베르쿨린 피부가 지역 보건 당국에 의해 규정된 국가에서의 투베르쿨린 피부 검사 결과)를 갖는 대상체는 스크리닝 절차를 계속할 자격이 있다. 새로 확인된 양성 QuantiFERON^®-TB Gold(및/또는 투베르쿨린 피부 검사) 결과를 갖는 대상체는, 활성 TB를 배제하고 잠복성 TB에 대한 적절한 치료를 개시하기 위한 평가를 받아야 한다. 잠복성 TB에 대한 적절한 치료는 면역손상된 환자에 대한 현지 국가 지침에 따라 정의된다. 면역손상된 환자에 대한 현지 국가 지침이 존재하지 않는 경우, 미국 지침을 따라야 하거나, 대상체를 연구로부터 배제해야 한다.

최초 QuantiFERON®(TB Gold 검사) 결과가 모호한 대상체는 검사를 반복해야 한다. 두 번째 QuantiFERON®(TB Gold 검사) 결과가 또한 모호한 경우에, 대상체는, 활성 TB가 배제되고, 그의 흉부 방사선 사진이 TB(활성이거나 오래된 비활성 TB)를 시사하는 이상을 나타내지 않고, 연구자에 의해 결정된 바와 같이 대상체가 TB에 대한 추가의 위험 인자를 갖지 않는 경우, 잠복성 TB에 대한 치료 없이 등록될 수 있다. 이러한 결정을 스폰서의 의료 모니터에 즉각 보고하고, 대상체의 근거 문서에 기록하고, 연구자가 서명해야 한다.

제외로 이어지는 비정상적인 스크리닝 값의 재검사는 적격성을 재평가하기 위해 스크리닝 기간 중에 예정되지 않은 방문을 사용하여 1회만 허용된다. 이는 대상체 안전성에 예상되는 영향이 없는 경우에 고려되어야만 한다.

9.1.3. 치료 단계: 주수 0 내지 주수 28

주수 0에서 시작하여, 적격인 대상체는 주수 0, 주수 4에서 그리고 주수 28까지 8주마다(±3일) 30±10분에 걸쳐 IV 주입으로 투여된 80 mg/m² 골리무맙을 받을 것이다(섹션 6.1). 대상체는 또한 연구 시작 시점과 동일한 BSA-기반 투여량으로 적어도 주수 28까지 상업적 MTX를 매주 그리고 MTX 투여 후 다음 날에 주어진 상업적 엽산 5 mg 이상을 매주 또는 (MTX 용량의 절반으로) 폴린산을 받을 것이다(섹션 6.2). 12세 미만의 아동의 경우, 엽산 또는 폴린산의 투여는 의사의 재량에 달려 있을 것이다.

대상체에게는 시간 및 이벤트 일정에 따라 안전성, 효능, PK, 및 면역원성 평가가 수행될 것이다(표). 집단 PK에 대한 혈청 골리무맙 농도를 위한 하나의 추가 샘플은 주수 0, 주수 4 및 주수 8 방문 시점을 제외한 주수 0 내지 주수 8 사이의 임의의 시간에 모든 대상체로부터 수집될 것이며; 이 샘플은 연구 작용제 투여의 적어도 24시간 전 또는 후에 수집되어야 하고 정기적으로 일정이 잡힌 방문(예를 들어, 주수 8)에서 수집되어서는 안 된다.

9.1.4. 치료 단계: 주수 28 후 주수 52까지

주수 28 후, 대상체는 주수 52까지 8주마다(±1주)에서 30±10분에 걸쳐 IV 주입으로 투여된 80 mg/m² 골리무맙을 계속 받을 것이다(섹션 6.1). 대상체는 또한 연구 시작 시점과 동일한 BSA-기반 투여량으로 상업적 MTX를 매주 그리고 MTX 투여 후 다음 날에 주어진 상업적 엽산 5 mg 이상을 매주 또는 투여되는 경우 (MTX 용량의 절반으로; 섹션 6.2) 폴린산을 받을 것이지만; MTX, 다른 DMARD, 코르티코스테로이드, 및/또는 NSAID의 증가, 감소 또는 중단은 주수 28 후에 허용가능하다. 이러한 투약물에 대한 모든 변경 및 변경 이유는 eCRF에 문서화될 필요가 있다.

대상체에게는 시간 및 이벤트 일정에 따라 안전성, 효능, PK, 및 면역원성 평가가 수행될 것이다(표).

치료의 종료/조기 탈퇴

대상체가 주수 52 전에 연구 작용제를 중단하는 경우, 대상체는 최종 안전성 추적관찰 방문을 위해 연구 작용제의 마지막 투여 후 대략 8주에 복귀해야 한다(섹션 10.2). 대상체가 주수 52 전에 연구 참여를 탈퇴하는 경우,

대상체의 동의 철회 전에 치료 종료 평가를 얻기 위해 모든 노력을 기울여야 한다.

9.1.5. 장기간 연장 단계: 주수 52 후 주수 252까지

주수 52 방문 후 장기간 연장에 들어간 대상체는 주수 244까지 8주마다(±1주) 30±10분에 걸쳐 IV 주입으로 투여된 80 mg/m² 골리무맙을 계속 받을 것이다.

대상체에게는 시간 및 이벤트 일정에 따라 안전성, 효능, PK, 및 면역원성 평가가 수행될 것이다(표 7 및 표). 동의를 철회하지 않고 주수 244 전에 연구 작용제 투여를 중단한 대상체는 마지막 연구 작용제 주입 후 대략 8주에 최종 안전성 추적관찰 방문을 위해 복귀해야 한다(섹션 10.2).

대상체는 TB의 징후 및 증상에 대해 계속 평가되어야 한다(섹션 9.4).

9.2. 효능

9.2.1. 평가

시간 및 이벤트 일정은 본 연구에 적용가능한 효능 측정의 빈도 및 타이밍을 요약한다(표, 표 7, 및 표).

9.2.1.1. 관절 평가

75개 관절 각각이 압통에 대해 평가될 것이고, 68개 관절이 표준 PRINTO/PRCSG 관절 평가에 따라 종창, 통증 및 운동 제한에 대해 평가될 것이다. 관절 평가의 수행 시 적어도 1년의 경험을 갖는 일관된 관절 평가자가 모든 관절 평가를 수행하기 위해, 각각의 연구 센터에 지정될 것이다.

훈련은 대상체 등록의 시작 전에 각각의 현장으로부터 일관된 단일 관절 평가자에게 제공될 것이며; 현장의 관절 평가자가 PRINTO 또는 PRCSG에 의해 제공되는 공인된 훈련을 받지 않은 한, 훈련은 의무적이다. 일관된 관절 평가자가 이전의 임상 연구에서 스폰서에 의해 교육을 받았다면, 그 또는 그녀는 이 훈련에 대해 면제를 받을 수 있다. 스폰서 또는 PRINTO/PRCSG 훈련의 문서는 시험 센터 파일에 보관될 것이다. 가능한 경우, 연구에 대한 일관된 관절 평가자는 연구 중에 바뀌지 않아야 한다. 그러나, 스폰서에 의해 제공되는 일관된 관절 평가자 훈련에 참석하는 각각의 현장으로부터의 평가자는 그의 부재 동안 대행을 위해 현장에서 1명의 추가 평가자를 훈련시킬 수 있다.

훈련된 임의의 추가의 일관된 관절 평가자는 또한 관절 평가자로서 1년 이상의 경험을 가질 것으로 또는 스폰서에 의해 승인될 것으로 예상된다. 현장으로부터의 지정된 일관된 관절 평가자가 현장에서 임의의 추가 평가자를 훈련시키는 경우, 훈련을 문서화하는 서신은 현장의 시험 센터 파일에 파일링되어야 한다. 더욱이, 현장에서의 1명 초과의 일관된 관절 평가자가 연구 동안 관절 평가를 수행하는 경우, 각각의 방문 시 현장에서 관절 평가를 수행하는 모든 일관된 관절 평가자의 이름이 시험 센터 파일에 나열되어야 하고 근거 문서에 문서화되어야 한다.

대상체에 대한 기저선 관절 평가를 수행하는 일관된 관절 평가자가 주수 244에서 최종 효능 평가를 통해 모든 후속 방문 동안 그 대상체에 대한 관절 평가를 또한 수행하는 것이 바람직하다.

평가불가능한 관절

과거에 또는 연구 참여 중에 외과적으로 변경되거나(즉, 보형물 배치) 의학적으로 치료된(즉, 관절내 주사) 어떠한 관절도 "평가불가능함"으로 식별하는 것이 임상 실시에서 합리적일 수 있지만, 본 연구의 목적을 위한 "평가불가능함"이라는 명칭은 약간 상이하다. 관절을 평가하는 것이 물리적으로 불가능하다면(즉, 석고붕대로 인해 접근불가능한 관절, 절단으로 인해 존재하지 않는 관절, 평가를 불가능하게 할 정도로 변형된 관절), ePRO 장치에서 일관된 관절 평가자에 의해 관절은 단지 "평가불가능함"으로 지정되어야 한다.

9.2.1.2. 미국 류마티스 학회 소아과 반응

JIA ACR 30 반응 기준⁵은 하기 6개의 구성요소들 중 적어도 3개가 기저선으로부터 30% 개선(즉, 점수 감소)되고 하기 구성요소들 중 1개 이하에서 30% 이상 악화된 것으로 정의된다:

질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가

전반적인 행복감에 대한 부모/대상체 평가

(종창이 있는 것으로 정의되거나, 또는 종창이 없는 경우, 운동 시 통증과 연관된 운동의 제한된 범위 및 압통이 있는 것으로 정의되는) 활성 관절의 수

운동의 제한된 범위를 갖는 관절의 수

CHAQ에 의한 신체적 기능

CRP

JIA ACR 50 반응, JIA ACR 70 반응, 및 JIA ACR 90 반응은 각각, 상기 6개의 구성요소들 중 적어도 3개가 기저선으로부터 50% 개선, 70% 개선, 및 90% 개선되고 상기 구성요소들 중 1개 이하에서 30% 이상 악화된 것으로 정의된다.

비활성 질환

비활성 질환은 하기가 모두 존재하는 것으로 표시된다:

활성 관절염을 갖는 관절 없음

JIA로 인한 발열, 발진, 장막염, 비장비대증, 간비대, 또는 전신 림프절병증 없음

활성 포도막염 없음

정상 CRP(기저 염증성 질환이 없는 대상체에 대해 0.287 mg/dL 이하)

활성 질환이 없음(5 mm 미만)을 나타내는 질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가

조조 강직 지속기간이 15분 미만

JIA에 대한 투약 시 임상 관해

JIA에 대한 투약 동안 임상 관해는 투약 동안 6개월 이상의 기간 동안 각각의 방문 시 비활성 질환으로 정의된다.

9.2.1.3. 질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가

질환 활성의 의사의 전반적 평가는 100 mm VAS이다. 의사는 의사가 환자의 현재 관절염 활성을 평가하게 하는 VAS를 작성해야 한다. 척도의 주요 점들은 "관절염 활성 없음" 내지 "극히 활성인 관절염"이다. 더 낮은 점수는 더 적은 질환 활성을 나타낸다. 이러한 측정치를 아동의 평가를 위한 변수들의 코어 세트에 포함시키는 과정은 문헌에 기록되었다.⁵

9.2.1.4. 아동 건강 평가 설문

대상체의 기능적 상태는 CHAQ에 의해 평가될 것이다.²¹ 부모/대상체는 이 설문을 작성하여 대상체가 8개의 기능적 영역(착의 및 몸단장, 기립, 섭식, 보행, 위생, 뻗기, 파지, 및 일상 생활의 활동)에서 과제의 수행 시 갖는 어려움의 정도를 평가할 것이다. 각각의 기능적 영역에서의 반응은 0(어려움 없음), 1(어려움이 약간 있음), 2(매우 어려움), 3(할 수 없음), 또는 4(해당 없음)로 점수화된다. 더 낮은 점수는 특정 기능적 영역에서 개선된 기능 및 과제 수행을 나타낸다.

추가로, CHAQ는 2개의 VAS 질문을 포함한다 - 하나는 대상체의 통증 수준을 평가하는 데 사용되고, 하나는 대상체의 전반적인 행복감을 평가하는 데 사용된다. CHAQ의 특성이 평가되었고 그의 유효성이 평가되었다.²¹ CHAQ는 질환 변화에 반응하는 것으로 나타났다.²¹ 0.188의 감소는 의미있는 임상 개선인 것으로 결정되었다.¹

통증에 대한 부모/대상체 평가

통증은 "통증 없음"(0 mm) 내지 "매우 중증인 통증"(100 mm)의 범위인 VAS 척도를 사용하여 지난 주 동안 대상체가 경험한 평균 통증으로서 평가될 것이다. 이러한 평가는 압통 및 종창 관절 검사 전에 부모(보호자)/대상체에 의해 작성되어야 한다.

전반적인 행복감에 대한 부모/대상체 평가

전반적인 행복감에 대한 부모/대상체 평가는 0 내지 100 mm VAS이다. 부모/대상체는 부모/대상체에게 관절염이 그의 아동/그 자신에게 미치는 모든 방식을 고려하고 이어서 대상체가 어떻게 지내고 있는지 나타낼 것을 요청하는 VAS를 작성할 것이다. 척도의 주요 점들은 "매우 좋음"(0 mm) 내지 "매우 나쁨"(100 mm)이다. 더 낮은 점수는 더 우수한 행복감을 나타낸다. 이러한 측정치를 아동의 평가를 위한 변수들의 코어 세트에 포함시키는 과정은 문헌에 기록되었다.⁵

연구 시작 시 15세 내지 18세 미만인 대상체는 부모/보호자와 공동으로 CHAQ를 작성할 수 있다. 바람직하게는, 연구 시작 시 평가를 작성한 동일한 개인(예를 들어, 부모, 보호자, 또는 대상체)은 연구 전체에 걸쳐 평가를 작성해야 한다.

9.2.1.5. C-반응성 단백질

C-반응성 단백질은 pJIA가 있는 환자에서 염증의 마커로서 유용한 것으로 입증되었고 JIA ACR 30 코어 평가의 일부이다. C-반응성 단백질은 검증된 고감수성 CRP 검정을 사용하여 중앙 실험실에서 검정될 것이다.

9.2.1.6. 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS)

최근에, pJIA에 대한 복합 질환 활성 점수인 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS)가 개발되었고; 검증 분석에서, 질환 결과를 예측하는 능력을 포함한, 우수한 계측 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. (CRP를 사용하기 위해 변형된) JADAS는 하기 변수를 평가함으로써 계산된다: (1) 100 mm 수평 VAS에서 측정된 전반적인 질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가(0은 활성 없음; 100은 VAS 둘 모두에 대해 최대 활성); (2) 21-넘버링된 원 및 100-밀리미터 수평 라인 시각 통증 척도에서 평가된 행복감 및 통증의 부모/아동 등급⁴, (3) 71, 27, 또는 10개의 관절에서 평가된 활성 관절의 수(각각 JADAS 71, JADAS 27, 및 JADAS 10); 및 (4) CRP는 하기 식에 따라 0 스케일로 절단되었다: (CRP [mg/L]-10/10), JADA-ESR에서 사용된 절단된 ESR과 유사함. 계산 전에, 10 mg/L 미만의 CRP 값은 10으로 변환되고, 110 mg/L 초과의 CRP 값은 110으로 변환된다.¹³

JADAS는 그의 4개의 구성요소의 점수들의 합으로 계산되는데, 이는 JADAS 71, JADAS 27, 및 JADAS 10에 대해 각각 0 내지 101, 0 내지 57, 및 0 내지 40의 전반적 스코어를 산출한다.

JADAS 10, 27, 및 71 최소 질환 활성^2,11의 상태는 하기 모두의 존재로 정의되었다: 다발관절염이 있는 환자에서, 3.5 이하의 질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가, 2.5 이하의 부모의 행복감의 전반적 등급, 및 1 이하의 종창 관절의 수.

JADAS 비활성 질환에 대한 기준은 1 이하의 총 JADAS 점수로 정의된다.

9.2.2. 종점

일차 종점

본 연구에서의 일차 종점은 주수 28에서의 PK 노출(주수 28에서의 최저 농도) 및 (집단 PK 모델링 및 시뮬레이션으로부터의) 8주의 1회 투여 간격에 걸친 베이지안 AUCss이다.

주요 이차 종점

주요 이차 종점은 하기를 포함한다:

주수 52에서의 PK 노출(주수 52에서의 최저 농도) 및 (집단 PK 모델링 및 시뮬레이션으로부터의) 주수 52에서의 베이지안 AUCss.

기타 종점

기타 종점은 하기를 포함한다:

시간 경과에 따른 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 CHAQ의 기저선으로부터의 변화.

시간 경과에 따른 CRP 농도

시간 경과에 따른 비활성 질환이 있는 대상체의 비율.

시간 경과에 따른 pJIA에 대한 투약에 대한 임상 관해에 있는 대상체의 비율

각각의 방문 시 pJIA 코어 세트의 기저선으로부터의 개선

주수 52까지 시간 경과에 따른 질환 하위유형, 및/또는 연령별 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 JADAS 10, 27, 및 71 점수의 기저선으로부터의 변화

시간 경과에 따른 JADAS 10, 27, 및 71 최소 질환 활성을 달성하는 대상체의 비율

9.3. 약동학적 특성 및 면역원성

9.3.1. 평가

골리무맙의 면역원성(골리무맙에 대한 항체)뿐만 아니라 PK를 평가하기 위해 혈청 샘플이 사용될 것이다. 정맥 혈액 샘플이 수집될 것이고, 각각의 혈청 샘플이 3개의 분취물(약동학, 연구 약물에 대한 항체 및 백업을 위해 각각 1개)로 나눌 것이다. 대상체의 비밀보장이 유지될 것이다. 샘플은 IV 라인과 상이한 아암에서 채취되어야 하거나, 또는 투약물을 전달하는 데 또한 사용되는 IV 라인을 사용하는 경우, 라인은 플러싱되어야 하고 각각의 PK 샘플이 채취되기 전에 남아있을 수 있는 어떠한 잔류 투약물도 제거되어야 한다. IV 라인을 사용하여 PK 샘플을 채취할 때, 처음 1mL의 혈액은 샘플을 얻기 전에 채취되어 폐기되어야 한다. 표준 치료에 따라 정맥 라인 유지관리를 따라야 한다. 골리무맙에 대한 혈청 농도 및 항체가 평가될 방문 시, 충분한 부피의 1회의 혈액 채취가 사용될 수 있다.

9.3.2. 분석 절차

약동학적 특성

스폰서에 의해 또는 그의 감독 하에 검증된, 특이적인, 그리고 민감한 방법을 사용하여 골리무맙의 농도를 결정하기 위해 혈청 샘플이 분석될 것이다.

면역원성

골리무맙에 대한 항체의 검출 및 특성화는 스폰서에 의해 또는 그의 감독 하에 검증된 검정 방법을 이용하여 수행될 것이다. 골리무맙에 대한 항체의 검출을 위해 수집된 모든 샘플은 또한 항체 데이터의 해석을 가능하게 하기 위하여 골리무맙 혈청 농도에 대해 평가될 것이다.

9.3.3. 약동학적 파라미터

혈청 골리무맙 농도는 주수 0, 주수 4, 주수 8, 주수 12, 주수 20, 주수 28, 주수 52, 주수 100, 주수 148, 주수 196, 및 주수 244에 평가되고 시간 경과에 따라 요약될 것이다.

주입 전(주입 직전) 및 주입 후(주입하고 1시간 후) 샘플은 주수 0, 주수 4, 및 주수 12에 채취되고, 추가 무작위 집단 PK 샘플은 주수 0, 주수 4 및 주수 8 방문 시가 아닌 주수 0과 주수 8 사이의 임의의 시간에 채취되고 연구 작용제 투여 전 또는 후 적어도 24시간에 수집될 것이다. 나머지 방문 각각에 대해서는, 혈청 골리무맙에 대한 단지 1개의 샘플만이 수집될 것이며, 이는 연구 작용제의 주입이 그 방문 시에 투여되는 경우에 주입 전에 수집되어야 한다. 주입 후 샘플은 IV 주입 라인과는 상이한 아암으로부터 채취되어야 하거나, IV 주입 라인이 플러싱되고 남아있을 수 있는 어떠한 잔류 투약물도 제거되어야 하고, 약물 투여에 사용된 것과 동일한 접근 라인을 사용하는 경우에 샘플을 얻기 전에 1 mL의 혈액이 채취 및 폐기되어야 한다.

주수 28까지의 데이터에 의한 집단 PK 분석은 골리무맙의 PK를 특성화하도록 그리고 pJIA가 있는 소아 집단에서 PK의 중요한 공변량을 식별하도록 수행될 것이다. 추가로, 집단 PK 모델이 사용되어 소아 및 성인에서 PK의 유사성을 평가할 것이다. NONMEM 접근법을 사용하여 클리어런스 및 분포 부피가 추정될 것이다. 더욱이, 노출과 효능 사이의 관계를 조사하고 특성화하기 위해 노출-반응 분석이 수행될 것이다.

9.3.4. 면역원성 평가(골리무맙에 대한 항체)

골리무맙에 대한 항체는 시간 및 이벤트 일정(즉, 주수 0, 주수 4, 주수 8, 주수 12, 주수 28, 주수 52, 주수 100, 주수 148, 주수 196, 및 주수 244)에 따라 모든 대상체로부터 수집된 혈청 샘플에서 평가될 것이다. 추가로, 혈청 샘플은 또한 치료를 중단했거나 연구에서 탈퇴된 대상체로부터 최종 방문 시 수집되어야 한다. 이들 샘플은 스폰서 또는 스폰서의 지정자에 의해 검사될 것이다.

혈청 샘플은 골리무맙에 결합하는 항체에 대해 스크리닝될 것이고, 확인된 양성 샘플의 역가가 보고될 것이다. 골리무맙에 대한 항체의 안정성을 검증하고/하거나 골리무맙의 면역원성을 추가로 특성화하기 위해 다른 분석이 수행될 수 있다.

연구 동안의 골리무맙에 대한 항체의 발생률이 결정될 것이다.

9.4. 안전성 평가

본 연구 동안에 일어나는 임의의 임상적으로 관련된 변화는 CRF의 유해 사건 섹션에 기록되어야 한다.

조기 탈퇴/본 연구의 종료 시점에서 지속되는 임의의 임상적으로 유의한 비정상이 소산될 때까지 또는 임상적으로 안정한 종점에 도달할 때까지 연구자에 의해 추적될 것이다.

본 연구는 시간 및 이벤트 일정에 제공된 시점에 따라 안전성 및 내약성의 하기 평가를 포함할 것이다.

유해 사건

유해 사건은 본 연구의 지속기간 동안 대상체에 의해(또는 적절한 경우, 보호자, 대리인, 또는 대상체의 법정 대리인에 의해) 보고될 것이다. 섹션 12, 유해 사건 보고에 명시된 바와 같이 유해 사건은 연구자에 의해 추적될 것이다.

임상 실험실 검사

혈청 화학 및 혈액학을 위한 혈액 샘플을 수집할 것이다. 연구자는 실험실 보고서를 검토하여야 하고, 이러한 검토를 문서로 기록하고, CRF의 유해 사건 섹션에 본 연구 동안 발생한 임의의 임상적으로 관련된 변화를 기록하여야 한다. 실험실 보고서는 근거 문서와 함께 파일링되어야 한다.

하기 검사가 중앙

실험실에 의해 수행될 것이다:

가임 여아에 대한 혈청 임신 검사가 스크리닝에서 수행될 것이다.

가임 여아에 대한 소변 임신 검사가 시간 및 이벤트 일정에 따라 수행될 것이다.

연구 전체에 걸쳐 임신이 아님을 확고히 하기 위하여, 연구자에 의해 필요하다고 결정되거나 지역 규정에 의해 요구되는 바와 같이, 추가의 혈청 또는 소변 임신 검사가 수행될 수 있다.

스크리닝 시 B형 간염 표면 항원(HBsAg), B형 간염 표면 항체(항-HBs), 및 B형 간염 코어 항체(항-HBc 전체)에 대한 혈청학.

스크리닝 시 HCV 항체에 대한 혈청학.

바이탈 사인

맥박/심박수, 호흡수, 체온, 및 혈압 측정은 시간 및 이벤트 일정에 따라 수행될 것이다(표, 표 7, 및 표).

바이탈 사인은 주입 전에; 15 및 30분에(주입 동안 15분 간격); 그리고 60 및 90분에(주입 후 1시간 관찰 기간 동안) 측정되어야 한다.

신체 검사

모든 신체 검사에서 피부 검사 및 성적 성숙을 위한 적어도 6개월마다의 태너 스테이징을 포함하는 신체 검사가 시간 및 이벤트 일정에 따라 수행될 것이다. 시스템 검토가 새로운 증상에 대해 평가하기 위해 모든 방문 시 수행될 것이며, 필요한 경우 전체 신체 검사가 연구자의 재량으로 수행될 수 있다. 본 연구의 종료 시점에서 지속되는 임의의 임상적으로 유의한 비정상이 소산될 때까지 또는 임상적으로 안정한 종점에 도달할 때까지 연구자에 의해 추적될 것이다.

키 및 체중

키는 스크리닝 시, 그리고 시간 및 이벤트 일정에 명시된 모든 시점에 측정될 것이다. 체중은, 각각의 체중 측정 시 교정된 저울을 사용하여, 시간 및 이벤트 일정에 명시된 시점에 측정될 것이다. 대상체는 신발 및 실외 의류 및 장비를 제거하도록 지시 받을 것이다.

포도막염 평가

모든 대상체는 신체 검사 및 인터뷰에 기초하여 연구자에 의해 스크리닝 시 그리고 그 후 적어도 6개월마다 새로 발병된 포도막염에 대해 평가될 것이다. 이는 눈 충혈(eye redness), 빛 과민성, 시력 변화, 및 부유물(floater)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 포도막염의 징후 및 증상의 평가로 구성된다. 임상 표준의 변화에 기초하여, 검사가 더 빈번할 수 있다.

더욱이, 모든 대상체는 연구 동안 명시된 바와 같은 (JIA 하위유형, ANA 검사 결과, JIA 발병 연령 및 JIA 지속기간에 기초한) 간격으로 안과 의사/검안사에 의해 수행되는 슬릿 램프 평가를 수행할 것이 요구된다.

대상체에게 연구 동안 포도막염이 발생하는 경우, 연구에서의 대상체의 지속적인 참여는 연구자 및 스폰서의 재량에 달려 있다.

주입 반응 평가

주입이 시작되기 전에, 적절한 개인, 투약물(예를 들어, 에피네프린, 흡입형 베타-효능제, 항히스타민제, 및 코르티코스테로이드), 및 아니필락시스를 치료하기 위한 다른 요건이 이용가능하여야 한다. 대상체는 연구자의 재량에 기초하여 주입을 시작하기 전에 예방적 약물(예를 들어, 다이펜하이드라민)로 사전투약될 수 있지만, 이것이 필수적이지는 않다. 그러나, 예방을 위한 코르티코스테로이드는 허용되지 않는다. 사전투약물은 eCRF에 기록되어야 한다.

연구자 또는 유자격 지정자는 시간 및 이벤트 일정에 따라 주입 반응에 대한 대상체를 평가할 것이다.

주입 반응은 주입 동안 또는 주입 완료의 1시간 이내에 일어나는 임의의 바람직하지 않은 또는 의도하지 않은 징후이다. 모든 대상체는 주입 반응의 증상에 대해 신중하게 관찰되어야 한다. 대상체는 주입 반응의 증상에 대해 연구 작용제의 IV 투여의 완료 후 적어도 60분 동안 관찰될 것이다. 주입 반응이 관찰되는 경우, 대상체는 연구자의 재량으로 치료되어야 한다.

연구자는 AE 페이지에 주입 반응을 기록할 것이다. 주입 반응이 관찰되지 않는 경우, 연구자는 이를 대상체의 의료 기록(근거 데이터)에서 주목할 것이다.

알레르기 반응

연구 전체에 걸쳐, 모든 대상체는 주입의 완료 후 적어도 60분 동안 알레르기 반응의 증상(예를 들어, 두드러기, 가려움, 심마진)에 대해 신중하게 관찰되어야 한다. 경도 또는 중등도의 알레르기 반응이 관찰되는 경우, 승인된 소아 용량의 아세트아미노펜 또는 NSAID 및 다이펜하이드라민이 투여될 수 있다.

천명 및/또는 호흡곤란을 동반하는 기관지 경련을 유발하고 환기 보조(ventilatory support)를 필요로 하는 주입 후의 중증 반응, 또는 40 mm Hg 초과의 수축기 혈압의 감소를 동반하는 증상성 저혈압(symptomatic hypotension)을 보이는 대상체는 임의의 추가 연구 작용제 주입을 받는 것이 허용되지 않을 것이다. 그러한 반응의 경우, 적절한 의학적 치료가 제공되어야 한다.

활성 결핵의 조기 검출

연구 참여 중에 TB 재활성화 또는 새로운 TB 감염의 조기 검출을 돕기 위해, 대상체는 일정이 잡힌 방문(시간 및 이벤트 일정 참조)에서 또는 대략 8주 내지 12주마다 전화 연락에 의해 활성 TB의 징후 및 증상에 대해 평가되어야 한다. 평가 중에 사용하기 위해 하기 일련의 질문이 제안된다.

"당신의 아동이 14일 초과의 지속기간의 새로운 기침 또는 만성 기침의 변화가 있었는가?"

:당신의 아동에게 하기 증상들 중 어느 하나가 있었는가":

- 지속되는 발열?

- 의도하지 않은 체중 손실?

- 야간 발한

"당신의 아동이 활성 TB가 있는 개인과 밀접하게 접촉한 적이 있는가?" (접촉이 "밀접한" 것으로 간주되어야 하는지 여부에 대한 불확실성이 있다면, TB 전문의에게 상담해야 한다.)

평가에서 대상체가 TB 재활성화 또는 새로운 TB 감염을 가질 수 있다는 의심이 제기되는 경우, 연구 작용제 투여가 중단되어야 하고, 가능한 경우에 TB 전문의와의 상담을 포함하는 즉각적이고 철저한 조사를 받아야 한다.

연구자는 면역저하된 대상체에서의 TB 재활성화가 파종성 질환 또는 폐외 특징(extrapulmonary feature)으로 존재할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 활성 TB의 증거를 갖는 대상체는 연구 작용제를 즉시 중단하여야 하고 적절한 치료를 위해 회부되어야 한다.

잠복성 TB의 이력 및 잠복성 TB에 대한 진행 중인 치료 또는 TB에 대한 적절한 치료를 완료했다는 문서를 갖는 대상체에 대해서는 연간 QuantiFERON®-TB Gold(및 투베르쿨린 피부) 검사가 요구되지 않는다.

연구의 수행 중에 활성 TB를 갖는 개인과의 밀접한 접촉을 경험하는 대상체는 반복 흉부 방사선, 반복 QuantiFERON®(TB Gold 검사), QuantiFERON®(TB Gold 검사)이 승인/등록되어 있지 않은 국가에서는 반복 투베르쿨린 피부 시험, 및 가능한 경우에는 대상체의 활성 TB 발병 위험 및 잠복성 TB에 대한 치료가 타당한지 여부를 결정하기 위해 TB 전문의에 대한 의뢰를 가져야 한다. 잠복성 TB의 이력 및 잠복성 TB에 대한 진행 중인 치료 또는 TB에 대한 적절한 치료를 완료했다는 문서를 갖는 대상체에 대해서는 QuantiFERON®(TB Gold 검사) (및 투베르쿨린 피부 검사)가 반복될 필요가 없다. QuantiFERON®(TB Gold 검사) 결과가 모호한 경우, 섹션 9.1.2에서 약술된 바와 같이 검사는 반복되어야 한다. 대상체는 프로토콜에 따라 예정된 모든 후속 연구 방문에 복귀하도록 권유되어야 한다.

9.5. 샘플 수집 및 취급

샘플 수집의 실제 날짜 및 시간은 CRF 또는 실험실 요청 용지에 기록되어야 한다.

모든 샘플 수집의 시기 및 빈도에 대해서는 시간 및 이벤트 일정을 참조한다.

샘플의 수집, 취급, 저장, 및 수송에 대한 지시사항은 제공될 실험실 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다. 샘플의 수집, 취급, 저장, 및 수송은 실험실 매뉴얼에 나타낸 바와 같은 명시된, 그리고 적용가능한 경우 제어된 온도 조건 하에 있어야 한다.

10. 대상체 완료/탈퇴

10.1. 완료

대상체는 그 또는 그녀가 주수 52에 평가를 완료하였다면 주요 연구를 완료한 것으로 간주될 것이다. 대상체는 그 또는 그녀가 주수 252에 평가를 완료하였다면 장기간 연장을 완료한 것으로 간주될 것이다.

10.2. 연구 치료의 중단

대상체의 연구 치료가 치료 계획의 종료 전에 중단되어야 할 경우, 이는 연구로부터의 대상체의 자동 탈퇴를 유발하지 않을 것이다.

하기 중 임의의 것이 발생되는 경우, 대상체의 연구 치료는 영구적으로 중단되어야 한다:

연구자가 안전성의 이유(예를 들어, 유해 사건)로, 연구 치료를 중단하는 것이 대상체의 최상의 관심에 있는 것이라고 여기는 경우.

대상체가 임신하게 된 경우.

천명, 및/또는 환기 보조를 필요로 하는 호흡곤란, 및/또는 연구 작용제 투여 후 발생하는 증상성 저혈압이 있거나 없는 기관지경련(새로 발병한 연구 작용제 관련 및 기존 천식의 중증 악화 둘 모두)을 초래하는 반응.

연구 작용제의 주입 후 1 내지 14일에 발생하는 (혈청병을 시사하고, 다른 인식된 임상 증후군의 징후 및 증상을 나타내지 않는) 발열 및/또는 발진을 동반하는 근육통 및/또는 관절통을 유발하는 반응. 이들은 소양증, 안면, 손, 또는 입술 부종, 연하장애, 담마진, 인후통, 및/또는 두통을 포함하는 다른 사례를 수반할 수 있다.

기회성 감염.

악성종양.

대상체에게 시험 중 언제라도 울혈성 심부전이 발생한다.

탈수초 질환.

대상체는 연구 작용제의 투여에 대한 동의를 철회한다.

프로토콜 금지 약물의 개시.

대상체는 하기 TB 스크리닝 기준에 따라 부적격성으로 간주된다.

- 활성 TB의 진단이 이루어진다.

- 대상체가 추적관찰 평가 질문 및/또는 신체 검사에 기초하여 활성 TB를 시사하는 증상을 갖거나, 활성 TB를 갖는 사람과 최근에 밀접한 접촉을 가진 적이 있으며, 추가의 평가를 계속 받을 수 없거나 받으려 하지 않는다.

- 활성 TB가 배제될 수 있고 연구 작용제의 다음 투여 전에 잠복성 TB에 대한 적절한 치료가 개시되고 완료 시까지 계속될 수 있는 경우가 아니라면, 평가를 받는 대상체는 현재의 활성 TB의 증거를 갖는 흉부 방사선 사진 및/또는 양성 QuantiFERON® (TB Gold 검사) 결과(또는 QuantiFERON®(TB Gold 검사)이 승인/등록되어 있지 않거나 투베르쿨린 피부 검사가 지역 보건 당국에 의해 의무화된 국가에서는 양성 투베르쿨린 피부 검사 결과)를 갖는다. 모호한 QuantiFERON®(TB Gold 검사) 결과는 섹션 9.1.2에서와 같이 취급되어야 한다. 지속적으로 모호한 QuantiFERON®(TB Gold 검사) 결과를 갖는 대상체는, 활성 TB가 배제되고, 그들의 흉부 방사선 사진이 TB(활성이거나 오래된 비활성 TB)를 시사하는 비정상을 나타내지 않고, 연구자에 의해 결정된 바와 같이 대상체가 TB에 대한 추가의 위험 인자를 갖지 않는 경우, 잠복성 TB에 대한 치료 없이 계속할 수 있다. 이러한 결정을 스폰서의 의료 모니터에 즉각 보고하고, 대상체의 근거 문서에 기록하고, 연구자가 서명해야 한다.

- 잠복성 TB에 대한 치료를 받는 대상체가 이러한 치료를 조기에 중단하거나 이 요법을 준수하지 않는다.

연구 동안 연구 작용제 주입을 중단한 모든 대상체는 마지막 주입이 투여된 후 대략 8주 동안 추적될 것이다.

주: 마지막 연구 작용제 주입 후 대략 8주 후인 방문은 "최종 안전성 추적관찰 방문"으로 지칭되며, 이는 일정이 잡힌 또는 일정에 잡히지 않은 방문 시 일어날 수 있다.

연구 작용제 주입을 중단하지만 연구 참여를 종료하지 않은 대상체는 최종 안전성 추적관찰 방문 시 수행되는 하기의 평가를 받을 것이다:

안전성 평가(바이탈 사인, 시스템의 검토, AE 검토, TB 평가, 포도막염 평가, 일상적인 실험실 분석을 위한 혈액 샘플의 수집, 및 ANA/항-이중 가닥 데옥시리보핵산(dsDNA) 항체 및 골리무맙에 대한 항체의 존재의 결정).

동시 투약물 검토.

효능 평가(관절 평가, JIA 평가, 및 CRP를 위한 혈액 샘플의 수집).

최종 안전성 추적관찰 방문 시 모든 대상체에 대한 골리무맙 농도의 측정을 위해 채취된 혈액 샘플.

대상체가 연구의 종료 전에 연구 치료를 중단하는 경우, 평가는 연구 작용제의 마지막 주입 후 대략 8주에 달성되어야 한다.

10.3. 연구로부터의 탈퇴

대상체는 하기 이유들 중 임의의 이유로 연구로부터 탈퇴될 것이다:

추적관찰 소실

동의 철회

사망

대상체가 연구의 종료 전에 연구 치료를 중단하는 경우, 치료 종료 평가는 최종 안전성 추적관찰 방문 시 연구 작용제의 마지막 주입 약 8주 후에 달성되어야 한다.

대상체가 추적관찰 소실인 경우, 연구 현장 직원은 대상체에게 연락하고 중단/탈퇴의 이유를 결정하기 위해 모든 합리적인 노력을 실행해야 한다. 추적관찰을 위해 취해진 조치는 문서로 기록되어야 한다.

대상체가 본 연구를 완료하기 전에 탈퇴하는 경우, 탈퇴의 이유가 CRF 및 근거 문서에 문서로 기록되어야 한다. 탈퇴한 대상체에게 배정된 연구 약물은 다른 대상체에게 배정되지 않아도 된다. 탈퇴한 대상체는 대체되지 않을 것이다.

대상체가 연구의 종료 전에 연구로부터 탈퇴하는 경우, 동의 철회 전에 치료 종료 평가가 달성되어야 한다.

11. 통계학적 방법

통계학적 분석은 스폰서에 의해 또는 스폰서의 권한 하에 수행될 것이다. 효능 및 안전성 데이터를 분석하는 데 사용되는 통계학적 방법에 대한 전반적인 설명이 하기에 개략적으로 기술되어 있다. 특정 세부사항은 통계학적 분석 계획에서 제공될 것이다.

일반적으로, 평균, 중위값, 표준 편차, 사분위수 범위, 연속 변수의 최소값 및 최대값, 카테고리형 변수의 개수 및 백분율과 같은 기술 통계량(descriptive statistics)이 데이터를 요약하기 위해 사용될 것이다.

11.1. 대상체 정보

연구에 등록된 모든 대상체에게는 기저선 기술 통계량이 제공될 것이다.

대상체 기저선 데이터, 인구통계학 및 기저선 질환 특성이 요약될 것이다. 기저선 측정은 주수 0 연구 작용제 투여 시간 전에 취해진 가장 가까운 측정으로 정의된다.

인구통계 및 대상체 기저선 질환 특성 및 이전의 약물 데이터는, 연구에 등록된 모든 대상체들이 연구 작용제 투여를 받았는지 여부에 관계없이, 그들에 대해 요약될 것이다. 약동학적 데이터는 연구 작용제의 적어도 1회 투여를 받은 모든 대상체에 대해 요약될 것이다. 달리 명시되지 않는 한 효능 분석은 연구에 등록된 모든 대상체에 대해 요약될 것이다. 안전성 평가는 모든 치료된 대상체에 대해 요약될 것이다.

11.2. 샘플 크기 결정

샘플 크기 결정은 통계학적 고려사항에 기초하지 않았다. 본 연구의 샘플 크기를 결정하기 위해, 소아 집단에서 PK의 변동성을 고려하였다. 목표는 집단 PK 및, 실현가능한 경우, 노출-반응 모델을 구축하기에 충분할 샘플 크기를 갖는 것이다. 추가로, 합리적인 안전성 평가를 제공할 샘플 크기가 또한 고려하였다. 이들 고려사항에 따라, 20명의 대상체가 탈락하였거나 이들이 PK 샘플을 제공하지 않는 경우, 대략 100명의 대상체의 샘플 크기가, PK 시점의 간헐적 샘플링을 고려하면, 집단 PK 모델을 구축하는 데 충분할 뿐만 아니라 대략 100명의 대상체로부터 1년의 안전성 데이터를 제공하기에 충분한 것으로 생각될 것이라는 가정 하에 대략 120명의 대상체의 샘플 크기가 선택되었다.

11.3. 효능 분석

일차 종점 분석

일차 효능 종점 분석은 계획되어 있지 않다.

주요 이차 종점 분석

주요 이차 효능 종점 분석은 계획되어 있지 않다.

기타 효능 종점

하기는 연구에 등록된 모든 대상체에 대해 요약될 것이다:

시간 경과에 따른 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 비활성 질환이 있는 대상체의 비율.

시간 경과에 따른 pJIA(ACR 기준)에 대한 투약에 대한 임상 관해에 있는 대상체의 비율

시간 경과에 따른 pJIA 코어 세트의 기저선으로부터의 개선

주수 52까지 시간 경과에 따른 질환 하위유형, 및/또는 연령별 JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자인 대상체의 비율

시간 경과에 따른 CHAQ의 기저선으로부터의 변화.

시간 경과에 따른 CRP 농도

시간 경과에 따른 JADAS 10, 27, 및 71 점수의 기저선으로부터의 변화

시간 경과에 따른 JADAS 10, 27, 및 71 최소 질환 활성을 달성하는 대상체의 비율

11.4. 약동학적 분석

본 연구의 일차 목적은 pJIA 집단에서 골리무맙 PK 노출(집단 PK 모델링 및 시뮬레이션으로부터 8주의 투여 간격에 대한 베이지안 AUCss 및 주수 28에서의 최저 농도)을 특성화하는 것이다.

혈청 골리무맙 농도가 시간 경과에 따라 요약될 것이다. 또한, 주수 28까지의 데이터에 대한 집단 PK 분석은 골리무맙의 PK를 특성화하도록 그리고 pJIA가 있는 소아 집단에서 PK의 중요한 공변량을 식별 및 정량화하도록 수행될 것이다. NONMEM 접근법을 사용하여 클리어런스 및 분포 부피가 추정될 것이다. 세부사항이 집단 PK 분석 계획에서 제공될 것이고, 분석의 결과는 별도의 보고서에서 제시될 것이다.

PK 노출의 측정은 (정상-상태 C_max, C_min 및 AUC를 포함하지만 이에 한정되지 않는) IV 골리무맙 투여 후 소아 집단에서 그래프로 평가될 것이고 CNTO148ART3001에서 성인으로부터의 PK 노출과 비교될 것이다. 소아 대상체와 성인 대상체 사이의 유사성은 관찰된 농도의 기술 통계량에 더하여 육안 검사를 통해 집단 PK 모델링으로부터의 박스 플롯의 생성에 의해 평가될 것이다.

요약 골리무맙 농도가 요약될 것이고, PK 노출은 주수 52까지 그리고 LTE까지 평가될 것이다.

11.5. 면역원성 분석

연구 동안 골리무맙에 대한 항체의 발생률 및 역가는 골리무맙의 투여를 받고 골리무맙에 대한 항체의 검출을 위해 수집된 적절한 샘플을 갖는 모든 대상체(즉, 그의 첫 번째 골리무맙 투여 후 얻은 적어도 1개의 샘플을 갖는 대상체)에 대해 시간 경과에 따라 요약될 것이다.

11.6. 약동학적/약력학적 분석

혈청 골리무맙 농도와 효능 사이의 관계가 조사될 것이다. 노출-반응 관계를 설명하기 위해 적합한 PK/PD 모델이 조사되고 개발될 것이다.

11.7. 안전성 분석

유해 사건

유해 사건을 확인하기 위해 연구자에 의해 CRF에 사용된 축어적 용어는 MedDRA(국제 의학 용어 사전)를 사용하여 코딩될 것이다. 치료 단계 동안 개시된 것으로 보고된 모든 유해 사건(즉, 치료-유발 유해 사건, 및 기저선 이래로 악화된 유해 사건)이 분석에 포함될 것이다. 각각의 유해 사건에 대하여, 주어진 사건의 적어도 1회 발생을 경험한 대상체의 백분율이 치료군에 따라 요약될 것이다.

사망하거나, 유해 사건으로 인해 치료를 중단하거나, 중증 또는 심각한 유해 사건을 경험하는 대상체에 대해서는, 적절한 경우, 요약, 목록, 데이터세트, 또는 대상체 서술이 제공될 수 있다.

하기 분석을 사용하여 이러한 시험에서 대상체의 안전성을 평가할 것이다:

AE의 발생 및 유형

SAE의 발생 및 유형

합리적으로 관련된 AE의 발생 및 유형

주입 반응의 발생

ANA 및 항-dsDNA 항체의 발생

골리무맙에 대한 항체의 발생

현저하게 비정상적인 실험실(혈액학 및 화학) 파라미터의 발생

임상 실험실 검사

실험실 데이터가 실험실 검사의 유형에 따라 요약될 것이다. 기준 범위 및 현저하게 비정상적인 결과(통계학적 분석 계획에 명시됨)가 실험실 데이터의 요약에 사용될 것이다. 기저선 결과로부터의 변화는 치료 전 vs. 치료 후 교차분석(pre- versus post-intervention cross-tabulation)(정상 범위 미만, 이내, 및 초과에 대한 부류를 가짐)으로 제시될 것이다. 비정상의 빈도 집계가 수행될 것이다. 임의의 현저하게 비정상적인 실험실 결과를 갖는 대상체들의 목록이 또한 제공될 것이다.

바이탈 사인

맥박/심박수, 호흡률, 체온, 및 혈압(수축기 및 확장기) 값 및 기저선으로부터의 변화의 기술 통계량은 이벤트의 일정에서 일정이 잡힌 매 시점에서마다 요약될 것이다.

11.8. 중간 분석

중간 분석은 계획되지 않는다.

11.9. 데이터 모니터링 위원회

이는 개방-표지 연구이며, 모든 대상체는 동일한 투여량의 IV 골리무맙을 받는다. 따라서, 외부 데이터 모니터링 위원회는 이용되지 않을 것이다. 안전성 데이터는 연구의 의료 모니터 및 DRC 헌장에 정의된 바와 같은 내부 데이터 검토 위원회에 의해 일상적으로 평가될 것이다. 더욱이, 데이터는 운영 위원회에서 검토될 수 있다.

12. 유해 사건 보고

임상 연구로부터의 안전성 정보의 시기적절하고 정확하고 완전한 보고 및 분석은 대상체, 연구자, 및 스폰서의 보호에 있어서 중요하며, 전세계적인 규제 기관에 의해 법으로 규정되어 있다. 스폰서는 안전성 정보의 적절한 보고를 보장하기 위하여 전세계적인 규제 요건에 부합하는 표준 운영 절차를 확립하였으며; 스폰서 또는 그의 계열사에 의해 수행된 모든 임상 연구는 이들 절차에 따라 수행될 것이다.

12.1. 정의

12.1.1. 유해 사건의 정의 및 분류

유해 사건

유해 사건은 의약품(시험용 또는 비시험용)을 투여한 임상 연구 대상체에서의 임의의 바람직하지 않은 의료 사건이다. 유해 사건은 치료와 반드시 인과 관계를 가져야 하는 것은 아니다. 따라서, 유해 사건은 의약품(시험용 또는 비시험용)에 관련되든 아니든 관계 없이, 그러한 의약품(시험용 또는 비시험용)의 사용과 일시적으로 관련된 임의의 불리하고 의도되지 않은 징후(비정상 소견을 포함함), 증상, 또는 질환일 수 있다. (국제의약품규제조화위원회[ICH]에 따른 정의)

이는 발병 시 새로운 또는 기저선 조건으로부터 중증도 또는 빈도에 있어서 악화된 임의의 발생, 또는 실험실 검사 비정상을 포함한 진단 절차들의 비정상적인 결과를 포함한다.

주: 스폰서는 ICF의 서명을 시작으로 유해 사건을 수집한다(마지막 유해 사건 기록의 시간에 대해서는, 섹션 12.3.1, 모든 유해 사건 참조).

심각한 유해 사건

ICH 및 유럽 연합 가이드라인(Guidelines on Pharmacovigilance for Medicinal Products for Human Use)에 기초한 심각한 유해 사건은 임의의 용량에서 하기가 일어나는 임의의 바람직하지 않은 의료 사건이다:

사망에 이름

생명 위협이 있음(대상체는 이벤트 시점에서 사망 위험이 있었다. 그것은, 사건이 더 중증이었다면 가설적으로 사망을 야기하였을 수 있는 사건을 지칭하지 않는다.)

입원환자로서의 입원 또는 기존 입원의 연장을 필요로 함

지속적 또는 유의한 불능/무능을 초래함

선천성 이상/출생 결함

의약품을 통한 임의의 감염성 인자의 의심되는 전파

의학적으로 중요함*

* 신속히 처리된 보고가 또한 다른 상황, 예컨대 즉각적으로 생명을 위협하지 않을 수 있거나 사망 또는 입원으로 이어지지 않을 수 있지만, 대상체를 위태롭게 할 수 있거나 상기 정의에 열거된 다른 결과들 중 하나를 예방하기 위하여 중재를 필요로 할 수 있는 중요한 의료 사건에서도 적절한지의 여부를 결정하는 데 있어서 의학적 및 과학적 판단이 행사되어야 한다. 이들은 통상 심각한 것으로 간주되어야 한다.

심각하고 예상되지 않은 유해 사건이 일어나며, 이에 대해 연구 약물과 사건(예를 들어, 아나필락시스로 인한 사망) 사이에 인과 관계를 시사하는 증거가 있다면, 사건은, 심지어 그것이 연구 종점의 구성요소(예를 들어, 전-원인 사망률)라 하더라도, 심각하고 예상되지 않은 의심되는 유해 반응으로서 보고되어야 한다.

열거되지 않은(예상되지 않은) 유해 사건/RSI(Reference Safety Information, 안전성 정보와 관련된 참고 정보)

성질 또는 중증도가 적용가능한 제품 RSI와 일치하지 않는 경우 유해 사건은 열거되지 않은 것으로 간주된다.

시판 허가를 받은 MTX의 경우, 유해 사건의 예상은 그것이 해당 국가의 약품 제조업체가 공급한 패키지 라벨에 기재되어 있는지 여부에 의해 결정될 것이다.

약물의 사용과 관련된 유해 사건

속성이 섹션 12.1.2에 열거된 정의에 따라 가능성 있음(possible), 상당히 가능성 있음(probable), 또는 매우 가능성 높음(very likely)인 경우, 유해 사건은 약물의 사용과 관련된 것으로 간주된다.

12.1.2. 속성 정의

관련 없음(Not Related)

약물의 사용과 관련되지 않은 유해 사건.

의심스러움(Doubtful)

대안적인 설명, 예를 들어 동시 약물(들), 동반 질환(들)이 더 가능성이 높을 것 같거나, 또는 인과 관계가 가능할 거 같지 않음을 시간 관계가 시사하는 유해 사건.

가능성 있음

약물의 사용에 기인할 수 있는 유해 사건. 대안적인 설명, 예를 들어 동시 약물(들), 동반 질환(들)이 결정적이지 않다. 시간 관계는 합리적이며; 따라서, 인과 관계는 배제될 수 없다.

상당히 가능성 있음

약물의 사용에 기인할 수 있는 유해 사건. 시간 관계가 시사적이다(예를 들어, 투여중단(dechallenge)에 의해 확인됨). 대안적인 설명, 예를 들어 동시 약물(들), 동반 질환(들)이 가능성이 더 적을 거 같다.

매우 가능성이 높음

가능성이 있는 유해 반응으로서 열거되고 대안적인 설명, 예를 들어 동시 약물(들), 동반 질환(들)에 의해 합리적으로 설명될 수 없는 유해 사건. 시간 관계가 매우 시사적이다(예를 들어, 그것은 투여중단 및 재투여(rechallenge)에 의해 확인됨).

12.1.3. 중증도 기준

중증도 등급의 평가는 하기의 일반적인 카테고리 디스크립터(categorical descriptor)를 사용하여 이루어질 것이다:

경도: 쉽게 참아내어서, 최소한의 불편함을 야기하고 일상 활동을 방해하지 않는, 증상의 인식.

중등도: 정상적인 활동의 방해를 야기하기에 충분한 불편함이 존재함.

중도: 상당한 기능 손상 또는 무능화를 야기하는 극심한 고통. 정상적인 일상 활동을 방해한다.

연구자는 대상체가 직접 경험하지 않은 사건(예를 들어, 실험실 비정상)의 중증도를 평가하는 데 있어서 임상적 판단을 사용해야 한다.

12.2. 특별 보고 상황

신속히 처리된 보고 및/또는 안전성 평가를 필요로 할 수 있는 스폰서 연구 약물에 대한 관심 안전성 사건은 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다:

스폰서 연구 약물의 과다용량

스폰서 연구 약물의 의심되는 남용/오용

스폰서 연구 약물에 대한 부주의한 또는 우발적인 노출

스폰서 연구 약물의 예상된 약리학적 작용의 임의의 실패(즉, 효과의 결여)

스폰서 연구 약물의 사용으로 인한 예상치 못한 치료 또는 임상적 이익

스폰서 제품에 영향을 주는 투약 오류(스폰서 연구 약물에 대한 대상체/환자 노출이 있거나 없음, 예를 들어 명칭 혼동).

특별 보고 상황은 CRF에 기록되어야 한다. 심각한 유해 사건의 기준을 충족시키는 임의의 특별 보고 상황은 CRF의 심각한 유해 사건 페이지에 기록되어야 한다.

12.3. 절차

12.3.1. 모든 유해 사건

심각하든 심각하지 않든 어느 것이든 모든 유해 사건 및 특별 보고 상황은 서명되고 날짜가 기입된 ICF가 획득된 시점으로부터 (안전성의 추적관찰을 위한 연락을 포함할 수 있는) 대상체의 마지막 연구-관련 절차의 완료 시까지 보고될 것이다. 연구 종료의 30일 이내에 연구자에게 자발적으로 보고된 것을 포함한 심각한 유해 사건은 심각한 유해 사건 양식(Serious Adverse Event Form)을 사용하여 보고되어야 한다. 스폰서는 이 프로토콜에 명시된 시간 프레임 외에 연구자에 의해 자발적으로 보고된 임의의 안전성 정보를 평가할 것이다.

심각한 유해 사건의 정의를 충족시키는 모든 사건은, 그들이 프로토콜-특정 평가인지의 여부에 관계없이, 심각한 유해 사건으로서 보고될 것이다.

심각성, 중증도, 또는 연구 약물과의 추정된 관계에 관계없이 모든 유해 사건은 근거 문서 및 CRF에 의학 용어를 사용하여 기록되어야 한다. 가능할 때는 언제든지, 징후 및 증상이 일반적인 병인에 기인할 때 진단이 주어져야 한다(예를 들어, 기침, 콧물, 재채기, 인후통, 및 두부 울혈(head congestion)은 "상기도 감염"으로서 보고되어야 한다). 연구자는 유해 사건과 연구 요법의 관계에 관한 그들의 의견을 CRF에 기록해야 한다. 유해 사건 관리에 필요한 모든 조치는 근거 문서에 기록되어야 하고 스폰서 지시에 따라 보고되어야 한다.

스폰서는 규제 기관에 대한 유해 사건의 적절한 보고에 대한 책임을 맡는다. 스폰서는 또한 연구 약물의 사용과 관련되고 열거되지 않은(예상되지 않은) 모든 심각한 유해 사건을 시험자(및 필요한 경우 시험 기관의 책임자)에게 보고할 것이다. 연구자(또는 필요한 경우 스폰서)는 달리 요구되지 않는 한 본 프로토콜을 승인한 적절한 독립적 윤리 위원회/기관 감사 위원회(IEC/IRB)에 보고해야 하고, IEC/IRB에 의해 문서로 이러한 사건을 기록되어야 한다.

개방-표지 연구를 포함한 외래환자 단계를 갖는 모든 연구에 대해, 대상체에게는 "지갑(연구) 카드"가 제공되고, 이들은 본 연구의 지속기간 동안 이 카드를 소지하도록 지시되어야 하며, 이 카드는 하기를 나타낸다:

연구 번호

현지 언어(들)로 된, 대상체가 임상 연구에 참여하고 있다는 진술

연구자의 이름 및 24시간 연락 전화 번호

현지 스폰서 이름 및 24시간 연락 전화 번호(의료 직원의 경우에만)

현장 번호

대상체 번호

맹검의 비상 해제를 행하는 데 필요한 임의의 다른 정보

12.3.2. 심각한 유해 사건

본 연구 동안 일어나는 모든 심각한 유해 사건은 본 사건에 대해 알게 된 후 24시간 이내에 연구-현장 직원에 의해 적절한 스폰서 연락 담당자에게 보고되어야 한다.

심각한 유해 사건에 관한 정보는 심각한 유해 사건 용지를 사용하여 스폰서에게 전달될 것이며, 이때 심각한 유해 사건 용지는 연구 현장의 의사에 의해 기입되고 서명되어야 하고, 24시간 이내에 스폰서에게 전달되어야 한다. 심각한 유해 사건의 초기 보고 및 추적관찰 보고는 팩시밀리(FX)로 이루어져야 한다.

본 연구의 종료 시점까지 소산되지 않거나, 또는 본 연구에의 대상체의 참여의 중단 시에 소산되지 않은 모든 심각한 유해 사건은 다음 중 임의의 것이 일어날 때까지 추적되어야 한다:

사건이 소산됨

사건이 안정화됨

사건이 기저선으로 복귀됨(기저선 값/상태가 이용가능한 경우)

사건은 연구 약물 이외의 작용제 또는 연구 수행과 관련없는 인자에 기인할 수 있음.

임의의 추가의 정보가 획득될 수 있을 것 같지 않게 됨(추가 정보의 제공에 대한 대상체 또는 건강 관리 전문가의 거절, 추적관찰 노력에 대한 상당한 주의(due diligence)의 입증 후 추적관찰 소실)

의약품에 의한 감염성 인자의 의심되는 전파가 심각한 유해 사건으로서 보고될 것이다. 연구에서 대상체의 참여 과정 동안 발생하는 입원(또는 입원 연장)을 필요로 하는 임의의 사건은 하기에 대한 입원을 제외하고는, 심각한 유해 사건으로서 보고되어야 한다:

급성 질환 또는 유해 사건을 치료하는 것으로 의도되지 않은 입원(예를 들어, 사회적 이유, 예컨대 장기간 보호 시설에서 계류 중인 배치)

본 연구에 진입하기 전에 계획된 수술 또는 시술(CRF에 문서로 기록되어야 함). 주: ICF에 서명하기 전에 계획된 입원이고, 그러한 입원이 계획된 기저 질환(underlying condition)이 악화되지 않은 경우에는, 심각한 유해 사건으로 간주되지 않을 것이다. 원래 계획된 입원의 연장을 초래한 임의의 유해 사건은 새로운 심각한 유해 사건으로 보고되어야 한다.

연구 약물의 마지막 투여 후 2개월 이내에 연구에서의 대상체의 사망의 원인은, 사건이 예상되었는지 또는 연구 약물과 관련되어 있는지의 여부와 관계없이, 심각한 유해 사건으로 간주된다.

12.3.3. 임신

임신의 모든 초기 보고는 사건에 대해 알게 된 후 24시간 이내에 연구-현장 직원에 의해 스폰서에게 적절한 임신 통지 용지를 사용하여 보고되어야 한다. 비정상적인 임신 결과(예를 들어, 자연 유산, 사산, 및 선천성 이상)는 심각한 유해 사건으로 간주되며, 심각한 유해 사건 용지를 사용하여 보고되어야 한다. 연구 동안 임신이 되는 어떠한 대상체도 추가 연구 치료를 중단해야 한다.

정자에 대한 연구 약물의 효과는 알려져 있지 않기 때문에, 본 연구에 포함된 남성 대상체의 파트너의 임신은 사건에 대해 알게 된 후 24시간 이내에 연구-현장 직원에 의해 적절한 임신 통지 용지를 사용하여 보고될 것이다.

임신 결과 및 영아의 임의의 산후 후유증에 관한 추적관찰 정보가 요구될 것이다.

12.4. 특별 관심 사건

본 임상 연구에 참여하는 대상체에서 임의의 새로 확인된 악성종양 또는 연구 작용제(들)의 최초 투여 후 발생하는 활성 TB의 사례가 섹션 12.3의 절차에 따라 연구자에 의해 보고되어야 한다. 연구자는 또한 활성 TB가 대부분의 국가에서 보고의무가 있는 질환으로 간주된다는 점을 숙고한다. 이들 사건은 심각한 유해 사건의 정의를 충족시키는 경우에만 심각한 것으로 간주되어야 한다.

13. 연구 약물 정보

13.1. 연구 약물의 물리적 설명

검사 제품인 골리무맙은 일회용 바이알에 4 mL(50 mg, 12.5 mg/mL)의 부피로 IV 주입을 위한 멸균 액체로서 공급될 것이다. 각각의 바이알은 pH 5.5에서 히스티딘, 소르비톨, 및 폴리소르베이트 80의 수성 매질 중에 골리무맙을 함유할 것이다. 방부제는 존재하지 않는다. 이것은 스폰서의 책임 하에 제조되고 제공될 것이다.

MTX(경구 또는 주사용)는 스폰서에 의해 공급될 것이 아니라 상업적 약국으로부터 입수되어야 한다.

13.2. 제조, 취급, 및 저장

유리 바이알 내의 액체 연구 작용제가 바로 사용할 수 있도록 공급된다. 연구 현장에서, 골리무맙 용액의 바이알은 2℃ 내지 8℃(35.6ㅀF 내지 46.4ㅀF) 범위의 제어된 온도에서 안전한 냉장고에 보관되어야 한다.

결과 및 결론

다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)이 있는 환자에서 정맥내 골리무맙의 효능 및 안전성: 3상 개방-표지 연구로부터의 결과

목적:

28주의 치료와 52주의 치료를 통한 현재의 메토트렉세이트(MTX) 요법에도 불구하고 활성 다발성 경과 소아 특발성 관절염이 있는 소아 환자에서 정맥내 골리무맙의 효능 및 안전성을 평가하기 위함.

재료 및 방법

주수 28까지 기저선으로부터 현재의 메토트렉세이트(MTX) 요법(중위값 15mg/주(평균±SD: 17.42±5.50 mg/주)에도 불구하고 활성 다발성 경과 소아 특발성 관절염이 있는 2세 내지 17세 소아 환자에서, 다시설, 3상, 단일군, 개방-표지, 다시설 시험을 주수 0 및 주수 4에, 이어서 그 후 8주마다(q8w) 30분에 걸쳐 주어진 80mg/m²의 용량으로 정맥내(IV) 골리무맙을 사용하여 약동학(PK), 안전성 및 효능을 평가하도록 수행하였다. 체표면적(BSA)은 모스텔러 식을 사용하여 각각의 방문 시 측정된 대상체의 키 및 체중을 기초로 하여 계산하였다. 환자는 연구 시작 시점과 동일한 BSA-기반 용량으로 매주 상업적 MTX를 받았다. 하기의 모든 결과는 연구 작용제의 적어도 1회 용량을 받았던 모든 환자를 포함하는 전체 분석 세트에 기초한다.

기저선으로부터 주수 28까지 평가된 효능 종점은 하기를 포함하였다:

- JIA ACR 30, 50, 70, 및 90 반응자

하기 6개의 구성요소들 중 3개 이상에서 각각 30%, 50%, 70%, 또는 90% 개선되고 1개 이하의 구성요소에서 30% 이상 악화된 것으로 정의됨:

- 질환 활성에 대한 의사의 전반적 평가(PGA) (0 내지 100 mm 시각 통증 척도[VAS])

- 전반적인 행복감에 대한 부모/대상체 평가 (0-100 mm VAS)

- 활성 관절의 수

- 운동의 제한된 범위를 갖는 관절의 수

- 아동 건강 평가 설문(CHAQ; 범위, 0 내지 3)에 의한 신체적 기능

- C-반응성 단백질(CRP)

- 하기 모두의 존재로 정의되는 비활성 질환:

활성 관절염을 갖는 관절 없음

JIA로 인한 발열, 발진, 장막염, 비장비대증, 간비대, 또는 전신 림프절병증 없음

활성 포도막염 없음

정상 CRP(기저 염증성 질환이 없는 환자에 대해 0.287 mg/dL 이하)

활성 질환이 없음(5 mm 미만)을 나타내는 질환 활성에 대한 PGA

조조 강직 지속기간이 15분 미만

- 하기 변수의 평가를 기초로 하여 소아 관절염 질환 활성 점수(JADAS) 10, 27, 및 71의 기저선으로부터의 중위값 변화:

질환 활성에 대한 PGA

전반적인 행복감에 대한 부모/대상체 평가

(평가된 10개의 관절들, 27개의 관절들, 및 71개의 관절들 중) 활성 관절의 수

식, (CRP [mg/L]-10)/10을 사용하여 0 내지 10 스케일로 절단된, CRP

- JADAS 10, 27, 또는 71의 최소 질환 활성은 다음과 같이 정의됨:

3.5 cm 이하의 질환 활성에 대한 PGA

2.5 cm 이하의 전반적인 행복감에 대한 부모/대상체 평가

1개 이하의 종창 관절 수

모든 분석은, 연구 약물을 적어도 1회 용량을 받은 모든 환자를 포함하는, 전체 분석 세트를 사용하여 수행하였다.

모든 구성요소가 누락되어, 그 경우에 데이터가 무응답으로 귀속되지 않는 한, 양분된 복합 종점(dichotomous composite endpoint)에 대한 누락 데이터는 이월된 마지막 관찰을 사용하여 귀속하였다.

결과:

총 180명의 환자를 적격성에 대해 스크리닝하였고, 130명의 환자를 연구에 등록하였고, 127명을 치료하였다. 3명의 환자가 등록되었지만, 주사 공포증, IV 접근 불가, 및 MTX의 중단으로 인해 치료를 받지 못했다. 기저선 인구통계학 및 질환 특성이 표 9에 나타나 있다.

[표 9]

주수 28에서 JIA ACR 30, 50, 70 및 90 반응자의 비율은 각각 83.5%, 79.5%, 70.1% 및 46.5%였다(도 19). 29.1%의 환자는 주수 28에서 비활성 질환에 대한 기준을 충족하였다(도 20). JADAS 10, 27 및 71에 대한 기저선으로부터의 중위값 변화는 주수 28에 각각 -14.20, -16.60, 및 -20.32였다. JADAS 10, 27, 및 71 최소 질환 활성은 주수 28에서 15%의 환자에 의해 충족되었다(도 21).

주수 28까지의 주요 안전성 사건은 표 10에 나타나 있다. 관찰된 유해 사건(AE)은 일반적으로 골리무맙 및 다른 종양 괴사 인자 억제제 요법에 대한 확립된 안전성 프로파일과 일치하였다. 주수 28까지 적어도 1건의 치료-유발 AE를 경험한 환자의 비율은 77.2%였다. AE의 발생률이 가장 높은 MedDRA 기관계 분류는 감염 및 침입이었고(57.5% [73/127]); 가장 흔하게 보고된 AE는 상기도 감염(17.3%)이었고, 이어서 비인두염(15.0%)이었다. 6명의 환자가 주수 28까지 심각한 AE를 경험하였다: 파종성 대상 포진, 기관지 확장증의 감염성 악화, 패혈증, 수두, 균상식육종 및 자살 관념. 수두를 제외한, 이들 사건은 정맥내 골리무맙의 영구적인 중단을 야기하였다.

[표 10]

약동학적 노출

GO-VIVA 연구에 대한 일차 약동학(PK) 종점은 집단 PK(PPK) 모델링 및 시뮬레이션으로부터 8주의 1회 투여 간격에 걸쳐 주수 28에서의 관찰된 PK 노출(주수 28에서의 최저 농도[Ctrough,ss]) 및 정상-상태 곡선 아래 면적(AUCss)이었다. 주요 이차 종점은 주수 52에서 동일한 PK 노출 매개변수였다. 관찰된 골리무맙 Ctrough,ss는 이러한 3상 연구에서 간헐적 샘플링으로 인한 집단 PK(PPK) 모델링을 통해 AUCss의 결정을 얻은 동안 요약하였다.

집단 PK 모델

PPK 모델 개발은 상호작용을 고려한 일차 조건부 추정 방법(First Order Conditional Estimation Method with Interaction)을 사용하여 NONMEM 버전 7.3으로 수행하였다. 기본 모델은 IV 주입을 갖는 2-구획 모델로 구성되었다. 공변량 모델 구축은 환자 기저선 특성, 인구통계학, 질환 상태 및 실험실 결과뿐만 아니라 면역원성 상태를 포함하는 관련 공변량의 전방 선택 및 후방-전방 제거로 구성되었다. 이어서, 최종 PPK 모델은 pJIA(GO-VIVA) 및 성인 RA(GO-FORWARD)에 대해 독립적으로 확립시켰다. PPK 모델 적합도 플롯이 도 22에 나타나 있다.

궁극적으로, 본 연구 및 PPK 모델링으로부터의 결과는 성인 RA에서 나타낸 효능을 외삽하기 위해 pJIA 집단과 성인 RA 집단 사이의 노출의 유사성을 입증하는 것이었다.

투여

GO-VIVA에서의 모든 127명의 등록된 대상체는 주수 0, 주수 4에, 그리고 주수 28까지 8주마다(q8w) 그리고 그 후 주수 244까지 8주마다 30분에 걸쳐 주어진 80 mg/m²의 골리무맙(최대 단일 용량 240 mg)을 IV 주입으로 받았다. 체표면적(BSA)은 모스텔러 식을 사용하여 각각의 방문 시 측정된 대상체의 키 및 체중을 기초로 하여 계산하였다. 대상체는 또한 연구 시작 시점과 동일한 BSA-기반 용량으로 주수 28까지 매주 상업적 MTX를 받았다.

결과

주수 28에서, 80 mg/m² BSA-기반 투여 계획은 2세 내지 6세 미만, 6세 내지 12세 미만, 및 12세 내지 18세 미만의 pJIA 연령군에 걸쳐 유사했던 관찰된 Ctrough,ss 및 AUCss를 초래하였고(도 23), PK 노출은 주수 52까지 유지되었다(도 24). BSA-기반 투여는 또한 체중 사분위수에 걸쳐 유사한 PK 노출을 초래하였다(도 25). 더 높은 CRP 수준과 연관된 더 낮은 PK 노출 경향이 관찰되었다(도 26). 그러한 CRP는 pJIA 모델에서 통계학적으로 유의한 공변량이었고 성인 RA 모델에서 그렇지 않은 것은 부분적으로 선정 기준의 차이로 인한 것일 수 있다.

주수 28에 pJIA 대상체의 정상-상태 최저 혈청 골리무맙 농도(평균±SD: 0.50±0.427 ㎍/mL)는 성인 RA에 대해 관찰된 농도의 범위(도 27) 및 또한 PsA 및 AS에 대해 관찰된 농도의 범위 내에 있었다. 골리무맙의 IV 투여 후, 성인 RA, PsA 및 AS에서 정상-상태 최저 혈청 골리무맙 농도의 평균±SD는 각각 0.41±0.52, 0.69±0.58 및 0.74±0.51 ㎍/mL였다. AUCss는 성인 RA 대상체와 비교하여 pJIA 대상체에서 약간 더 높았지만(도 28), 생물학적 요법에서 전형적으로 보여주는 예상된 변동성 내에 있었다.

결론:

주수 0 및 주수 4에, 이어서 그 후 8주마다 80mg/m²의 용량으로 전달된 정맥내 골리무맙은 활성 다발성 JIA(pJIA)가 있는 환자에게 안전하고 효과적이다. 일관되게 높은 JIA ACR 반응률이 JIA ACR 30, 50, 70 및 90 반응에 대한 최저 혈청 골리무맙 농도 사분위수에 걸쳐 관찰되었으며(도 29a 내지 도 29d) 임상적으로 중요한 개선이 관절 증상; 신체적 기능; 및 의사, 부모, 및 대상체가 보고한 질환의 평가에서 관찰되었다. 주수 28 및 주수 52까지의 안전성 데이터는 골리무맙의 이전 연구로부터의 결과와 일치했으며 다발성 JIA(pJIA)의 치료에서 다른 부류의 종양 괴사 인자 억제제 요법에 의해 관찰된 데이터와 유사하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Bensley, Karen Clark, Michael Leu, Jocelyn Zhenhua, Xu <120> ANTI-TNF ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF JUVENILE IDIOPATHIC ARTHRITIS <130> JBI6042WOPCT1 <140> 62/792568 <141> 2019-01-15 <140> 62/820592 <141> 2019-03-19 <140> 62/899171 <141> 2019-09-12 <150> Unknown <151> Herewith <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Heavy Chain complementarity determining region 1 (CDR1). <400> 1 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Heavy Chain complementarity determining region 2 (CDR2). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is selected from Ile, Phe or Val. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is selected from Ile or Met. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is selected from Ser or Leu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is selected from Tyr or Phe. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is selected from Lys or Tyr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is selected from Ser or Tyr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is selected from Asp or Gly. <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Gly Ser Asn Lys Xaa Xaa Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Heavy Chain complementarity determining region 3 (CDR3). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is selected from Ile or Val. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is selected from Ser, Ala or Gly. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is selected from Asn or Tyr. <400> 3 Asp Arg Gly Xaa Xaa Ala Gly Gly Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Light Chain complementarity determining region 1 (CDR1). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is selected from Ser or Tyr. <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Xaa Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Light Chain complementarity determining region 2 (CDR2). <400> 5 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Light Chain complementarity determining region 3 (CDR3). <400> 6 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(126) <223> heavy chain variable region sequences as presented in original Figure 4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is selected from Ile or Thr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> complementarity determining region 1 (CDR1). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(49) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is selected from Lys or Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(66) <223> complementarity determining region 2 (CDR2). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is selected from Ile, Phe or Val. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is selected from Ile or Met. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is selected from Ser or Leu. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa at position 53 is selected from Tyr or Phe. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa at position 59 is selected from Lys or Tyr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa at position 60 is selected from Ser or Tyr. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 is selected from Asp or Gly. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(98) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 is selected from Val or Ile. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa at position 75 is selected from Ser or Pro. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78)..(78) <223> Xaa at position 78 is selected from Thr or Ala. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> Xaa at position 80 is selected from Tyr or Phe. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> Xaa at position 94 is selected from Tyr or Phe. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(115) <223> complementarity determining region 3 (CDR3). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa at position 102 is selected from Ile or Val. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (116)..(126) <223> J6 region <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Xaa Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Gly Ser Asn Lys Xaa Xaa Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Xaa Arg Phe Thr Xaa Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn Xaa Leu Xaa 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Xaa Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Xaa Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(108) <223> light chain variable region sequences as presented in original Figure 5 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(23) <223> framework 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(34) <223> complementarity determining region 1 (CDR1). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(49) <223> framework 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(56) <223> complementarity determining region 2 (CDR2). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(88) <223> framework 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(98) <223> complementarity determining region 3 (CDR3). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(108) <223> J3 region <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(157) <223> human TNF alpha monomer sequence <400> 9 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ttggtccagt cggactgg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cacctgcact cggtgctt 18 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cactgttttg agtgtgtacg ggcttaagtt 30 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gccgcacgtg tggaaggg 18 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 agtcaaggtc ggactggctt aagtt 25 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gttgtcccct ctcacaatct tcgaattt 28 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggcggtagac tactcgtc 18 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile 1 5 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tttcgtacgc caccatggac tggacctgga gcatc 35 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tttcgtacgc caccatgggg tttgggctga gctg 34 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tttcgtacgc caccatggag tttgggctga gcatg 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tttcgtacgc caccatgaaa cacctgtggt tcttc 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tttcgtacgc caccatgggg tcaaccgcca tcctc 35 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gtgccagtgg cagaggagtc cattcaagct taagtt 36 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Asp Met Arg Val 1 5 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tttgtcgaca ccatggacat gagggtcctc c 31 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tttgtcgaca ccatggaagc cccagctc 28 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ctggtttcac ctatagtttg cattcagaat tcggcgcctt t 41 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 catctccaga gacaattcca agaacacgct gtatc 35 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gtagaggtct ctgttaaggt tcttgtgcga catag 35 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> Signal sequence for heavy chain variable region sequences as presented in original Figure 4 <400> 32 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> Signal sequence for light chain variable region sequences as presented in original Figure 5 <400> 33 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly 20 <210> 34 <211> 428 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atggggtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggttcacc ttcagtagct atgctatgca ctgggtccgc caggctccgg 180 caaggggctg gagtgggtgg cagttatatc atatgatgga aaataaatac tacgcagact 240 ccgtgaaggg ccgattcacc atctagagac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg 300 aacagccaga gctgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg agagatcgag gtatatcagc 360 aggtggaata ctactactac tacggtatgg acgtctgggg gcaagggacc acggtcaccg 420 tctcctca 428 <210> 35 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccatt cactttcggc 360 cctgggacca aagtggatat caaacgt 387 <210> 36 <211> 456 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(456) <223> golimumab heavy chain (HC) <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 37 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(215) <223> golimumab light chain (LC) <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 38 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(126) <223> golimumab variable heavy chain region <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 39 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(111) <223> golimumab variable light chain region <400> 39 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> golimumab complementarity determining region heavy chain 1 (CDRH1) <400> 40 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> golimumab antibody complementarity determining region heavy chain 2 (CDRH2) <400> 41 Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> golimumab complementarity determining region heavy chain 3 (CDRH3) <400> 42 Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 1 5 10 15 Val <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> golimumab complementarity determining region light chain 1 (CDRL1) <400> 43 Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> golimumab complementarity determining region light chain 2 (CDRL2) <400> 44 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> golimumab complementarity determining region light chain 3 (CDRL3) <400> 45 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr 1 5 10

Claims (21)

1. 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis, JIA)을 치료하는 방법으로서, 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 환자의 10% 초과는 8주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 환자의 20% 초과는 16주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하고, 환자의 29% 초과는 28주의 치료 후 비활성 질환에 대한 기준을 충족하는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 소아 환자는 2세 내지 17세인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(polyarticular juvenile idiopathic arthritis, pJIA)인, 방법.
5. 제1항에 있어서, IV 용량은 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 80 mg/m²인, 방법.
6. 제1항에 있어서, 메토트렉세이트(MTX)를 소아 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
7. 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법으로서, 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 JIA 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology, ACR) 30, JIA ACR 50, JIA ACR 70, 또는 JIA ACR 90의 JIA ACR 반응에 상응하는 기저선으로부터의 개선을 갖는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 4주의 치료 후 환자의 50% 초과는 JIA ACR 30 및 JIA ACR 50에 대한 기준을 충족하는, 방법.
9. 제7항에 있어서, 12주의 치료 후 환자의 50% 초과는 JIA ACR 30, JIA ACR 50, 및 JIA ACR 70에 대한 기준을 충족하는, 방법.
10. 제7항에 있어서, 28주의 치료 후 환자의 83% 초과는 JIA ACR 30에 대한 기준을 충족하고, 환자의 79% 초과는 JIA ACR 50에 대한 기준을 충족하고, 환자의 70% 초과는 JIA ACR 70에 대한 기준을 충족하고, 환자의 46% 초과는 JIA ACR 90에 대한 기준을 충족하는, 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 소아 환자는 2세 내지 17세인, 방법.
12. 제7항에 있어서, 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)인, 방법.
13. 제7항에 있어서, IV 용량은 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 80 mg/m²인, 방법.
14. 제7항에 있어서, 메토트렉세이트(MTX)를 소아 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
15. 소아 환자에서 소아 특발성 관절염(JIA)을 치료하는 방법으로서, 항-TNF 항체의 정맥내(IV) 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-TNF 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 및 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고, 항-TNF 항체로 치료된 환자는 4주의 치료, 8주의 치료, 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 또는 28주의 치료 후 소아 관절염 질환 활성 점수(Juvenile Arthritis Disease Activity Score, JADAS) 10, JADAS 27, 또는 JADAS 71 최소 질환의 JADAS를 갖는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 환자의 10% 초과는 12주의 치료, 16주의 치료, 20주의 치료, 24주의 치료, 및 28주의 치료 후 JADAS 10, JADAS 27, 및 JADAS 71 최소 질환 활성 질환을 갖는, 방법.
17. 제15항에 있어서, 환자의 15% 이상은 24주의 치료 및 28주의 치료 후 JADAS 10, JADAS 27, 및 JADAS 71 최소 질환 활성 질환을 갖는, 방법.
18. 제15항에 있어서, 상기 소아 환자는 2세 내지 17세인, 방법.
19. 제15항에 있어서, 상기 소아 특발성 관절염(JIA)은 다발성 소아 특발성 관절염(pJIA)인, 방법.
20. 제15항에 있어서, IV 용량은 주수 0, 주수 4에, 그리고 이어서 그 후 8주마다 80 mg/m²인, 방법.
21. 제15항에 있어서, 메토트렉세이트(MTX)를 소아 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

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