JP2980626B2 - ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター - Google Patents

ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター

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Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の分野 本発明は、外来タンパク質をグラム陰性細菌、特に大
腸菌（E.coli）の細胞質から細胞周辺腔、好ましくは細
胞外液体中に外向化することに関する。大腸菌適合性の
プロモーターの支配下にErwinia carotovora由来のペク
チン酸リアーゼ遺伝子のシグナルペプチド配列を含有す
る分泌ベクターを構築することによってこの外向化を可
能にするものである。
2.発明の背景 通常、単細胞宿主中に発現された外来タンパク質は細
胞質外に分泌されず、従って目的産物の単離には、細胞
の破壊、ならびに生成した細胞残骸および細胞によって
産生される所望ではない天然の細胞質タンパク質の全て
からの分離が必要となる。通常、グラム陰性細菌は、そ
の自己のタンパク質を細胞質の外側の領域であって細胞
の内側および外側の膜の間の細胞周辺腔中に分泌する。
ペリプラズムからのタンパク質の単離は、細胞質からの
単離に比べてかなり簡単である。細胞壁の破壊は必要と
されるが、細胞膜の破断は必要ではなく、従って、細胞
質の残骸による外来タンパク質の汚染が避けられる。細
胞外培地に分泌されたタンパク質の単離および分離は、
勿論、常法によって行われる。
2.1.組換えDNA法 組換えDNA法の出現は、治療処方または工業過程にお
いて価値を有する実質的に純粋なタンパク質を大量に製
造するための「工場」として単細胞微生物を利用する可
能性を開いた。簡単に言うと、組換えDNA法は特定のDNA
配列をDNA媒体またはベクター、通常はファージまたは
プラスミドのどちらかに挿入することを必要とする。ほ
とんどの場合、ベクター中に挿入されるDNA配列はベク
ターにとって外来のものであり、挿入されるDNA配列と
ベクターDNA配列は天然においては遺伝情報を交換しな
いのが普通である生物群から導かれるか、または挿入さ
れるDNAが部分的もしくは全合成によるものであること
もある。これらDNAベクターの調製方法は今では当分野
で周知である。例えば、CohenおよびBoyer［米国特許N
o.4,237,224;その記載は本明細書の一部を構成する］
は、制限酵素と連結を使用することによる組換えプラス
ミドの調製について記載している。次いで、得られたプ
ラスミドを適合する単細胞宿主中に入れ、これにより外
来遺伝子を細胞に導入する。外来タンパク質の発現を達
成するためには、組換えプラスミドは宿主細胞中で自律
的に複製することができるものでなければならず、ま
た、好ましくは形質転換された宿主細胞の同定を可能に
するマーカー機能を有しているであろう。適切な複製、
転写および翻訳シグナルの全てがプラスミドに正しく配
置されているときには、外来遺伝子は形質転換細胞およ
びその子孫中で発現されるであろう。
2.2.タンパク質の分布 細胞によるタンパク質産生の進行はその翻訳によって
は終了しない。通常、あらゆる細胞内に産生されるタン
パク質は細胞全体には見い出されず、むしろ、区画され
る傾向にある。ある種のタンパク質は分泌され、即ち細
胞質から放出され、他のものは分泌されない。細胞質外
へのある種のタンパク質の分布はシグナル配列の支配下
にある。細胞から分泌される運命にあるこれら細胞タン
パク質は、約16〜30アミノ酸残基の、その大部分が疎水
性であるＮ−末端配列を有しているのが普通である。こ
の疎水性領域がシグナルの機能に必須である。この領域
の翻訳によって生成するペプチドは細胞膜に結合するも
のと考えられている。タンパク質の残りの翻訳が続くに
つれて、この非シグナル部分は脂質二重層を通って引き
出される。次いで、酵素シグナルペプチダーゼによって
シグナル配列が残りのタンパク質から切断される。
シグナル配列およびペプチドの機能の理解は、研究者
等を、大腸菌の翻訳および輸送機序を利用して通常は大
腸菌によって産生されないタンパク質（原核性および真
核性の両外来タンパク質が含まれる）を製造しようとす
る試みに向かわせた。しかし、目的タンパク質の成功裏
の分泌には、遺伝子が宿主細胞プロモーターによって認
識されうるシグナル配列と結合していることが必要とさ
れる。適合するシグナル配列が存在しないと、外来タン
パク質は宿主細胞によって発現されうるが、細胞質を越
えて細胞周辺腔または細胞外液体中には分布しないであ
ろう。宿主細胞において種々の外来タンパク質を発現さ
せ、そして分泌させうるベクターは、明らかに、大量の
価値あるタンパク質を製造するために組換え法を用いる
際に極めて大きな利点を与えるであろう。本発明の分泌
ベクターはそのような利点を与えるものであり、驚くべ
きことに大腸菌には非天然のシグナル配列を有してい
る。
3.図面の簡単な説明 第１図は、pelB遺伝子を含有するプラスミドpSS100
4、およびaraBADプロモーターの支配下にあるpelB遺伝
子を含有するpSS1038を創製するために用いた方法の概
略を示すものである。その詳細は実施例6.1.1に挙げ
る。
第2A図は、pelBシグナルペプチド暗号領域の配列、お
よび対応するアミノ酸配列を示すものである。第2B図
は、pelBシグナル配列を含有するプラスミドpING173、
およびlacプロモーターの下流にpelBシグナル配列を含
有するプラスミドpRR175の構築に用いた方法の概略を示
すものである。その詳細は実施例6.2に挙げる。
第３図は、araBADプロモーターの支配下にあるpelBシ
グナル配列および植物タウマチン遺伝子を含有するプラ
スミドpING177−１の構築に用いた方法の概略を示すも
のである。その詳細は実施例6.3.2に挙げる。
第４図は、プレ−タウマチン リーダーペプチド配列
と共に植物タウマチン遺伝子を含有するプラスミドpING
177−３の構築に用いた方法の概略を示すものである。
その詳細は実施例6.3.3に挙げる。
第５図は、キメラマウス−ヒトL6抗体軽鎖の発現に用
いたプラスミドの構築に用いた方法の概略を示すもので
ある。その詳細は実施例6.4.2に挙げる。
第６図は、キメラマウス−ヒトL6構築重鎖の発現に用
いたプラスミドの構築に用いた方法の概略を示すもので
ある。その詳細は実施例6.4.2に挙げる。
第７図は、キメラマウス−ヒトL6抗体Fabの発現に用
いたプラスミドの構築に用いた方法の概略を示すもので
ある。その詳細は実施例6.4.2に挙げる。
第８図は、pFK100、pFK101、pFK102、pFK103、および
pFK104中の軽鎖およびFd遺伝子カセットの制限地図を示
すものである。これらのプラスミドは、第６図および第
７図に示したプラスミドを用い、本明細書の記載のよう
にして構築した。矢印はlacプロモーターからの転写の
方向を示す。E.carotovoraおよび真核性の非暗号配列は
白の部分で示す。pelBリーダー配列は網目の部分で示
し、抗体遺伝子（Fd）および軽鎖（Ｋ）は黒の部分で示
す。
4.発明の要約 本発明は、細菌宿主細胞の形質転換に用いたときに、
発現された外来タンパク質の外向化を可能にするプラス
ミド分泌ベクターを提供するものである。このプラスミ
ドは、グラム陰性細菌のペクチン酸リアーゼのシグナル
配列をコードしているDNA配列を含有している。次い
で、これらのプラスミドを用いて、実質的にシグナル配
列と非宿主タンパク質遺伝子配列からなるフラグメント
を含有している誘導体プラスミド、およびこのフラグメ
ントが宿主適合性のプロモーター配列に隣接して配置さ
れているプラスミドを調製した。このプロモーター配列
を含有している後者のプラスミドは、細菌宿主細胞の形
質転換に用いると、宿主細胞が外来タンパク質を翻訳
し、そして外向化することを可能にする。即ち、本発明
は、細胞の溶解、および細胞質不純物を除去するために
必要とされる付随の厳格な精製工程を必要とせずに、宿
主細胞によって外来タンパク質を大量に産生させうる手
段を提供するものである。即ち、宿主から発現された非
宿主タンパク質の単離は、それらがこのようにして外向
化されうるときには、著しく容易になるであろう。ペク
チン酸リアーゼ（pel）のシグナル配列は大腸菌細胞系
でよく機能し、本発明の分泌ベクターはこの系で用いら
れる実質的に全てのタンパク質の分泌を引き起こしうる
ことが示された。タンパク質の細胞周辺腔または細胞外
環境への分泌は、特定のタンパク質をコードしている既
知の遺伝子配列を、プラスミドベクターのpelシグナル
配列および適当なプロモーター配列の後のある位置に挿
入し、次いで細菌宿主細胞をこの分泌ベクターで形質転
換することによって達成される。
5.発明の詳細な説明 本明細書に開示したようにして、細菌宿主細胞の形質
転換に用いたときに宿主細胞の細胞質膜の外側に外来タ
ンパク質を分泌させる組換えプラスミドを調製した。本
発明は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子を大腸菌中にクロー
ンし、そして発現させると、大量のペクチン酸リアーゼ
が細胞周辺腔または細菌が増殖している培養液中に分泌
されるという観察に基づいている。このことは、ペクチ
ン酸リアーゼシグナル配列が非−Erwinia細菌系で認識
され、そして翻訳されるという結論に導く。プラスミド
が外来タンパク質遺伝子と共にpel遺伝子のシグナル配
列を含んで調製されると、宿主適合性のプロモーターの
存在下では、pel遺伝子のシグナル配列がタンパク質を
細胞質から細胞周辺腔に、または細胞壁を越えて細胞外
環境に分布させうることが発見された。本発明の分泌ベ
クターは、その利用性が単一の菌株に限定されず、多種
多様の容易に利用できる大腸菌株（その全ては、少なく
ともある種の組換えタンパク質を直接培養培地に普通に
分泌する）において効率的に機能することが示されてお
り、特に有用である。また、本プラスミドは、原核性お
よび真核性の両方の広範な外来遺伝子配列を用いて操作
しうることがわかっている。さらに、このようにして製
造したタンパク質は、その天然の、および適切な立体配
置で分泌されることが確かめられている。
これらプラスミドの調製およびそれらの細菌形質転換
における利用の方法を、以下でさらに詳しく説明する。
5.1.ペクチン酸リアーゼ遺伝子の同定および単離 ペクチン酸リアーゼは、ポリガラクツロン酸の加水分
解を触媒する酵素の１つであり、多数の植物病原性の細
菌および菌類において見い出されている。PLa、PLbおよ
びPLcと呼ばれる３種のペクチン酸リアーゼが細菌Erwin
ia carotovoraから同定されており、また、類似の酵素
が細菌Erwinia chrysanthemi［Keen et al.,J.Bacterio
l. 168:595−606,1986］およびPseudomonas fluoresce
ns、ならびに菌類Rhizoctonia solaniにおいて知られて
いる。E.carotovora［Lei et al.,Gene 35:63−70,198
5］およびE.chrysanthemi［Keen et al.;上記］の両方
から遺伝子が単離されている。本発明においては、E.ca
rotovora由来のpelB遺伝子をペクチン酸リアーゼシグナ
ル配列の供給源として用いた。プラスミドpSS1004［Lei
et al.,J.Bacteriol. 169:4379−4383,1987］は、E.c
arotovoraのpelB遺伝子を含有している。シグナル配列
近辺の制限部位を、この遺伝子のDNA配列に基づいて同
定した。また、Ｎ−末端アミノ酸配列を調べてリーダー
ペプチドの位置を確認した。pSS1004プラスミドをHae I
IIおよびEcoR I制限酵素で処理することによってリーダ
ー配列を含有するフラグメントを得た。pelBシグナルペ
プチドの遺伝子配列および対応するアミノ酸配列を第2A
図に示す。別の方法によれば、このペプチド配列は既知
のペプチド合成法によって化学的に合成することもでき
る。
5.2.分泌ベクターの構築 適切なシグナル配列を含有するフラグメントが同定さ
れ、そして単離されたなら、次いで、これをクローニン
グ媒体、好ましくはプラスミド中に挿入する。本ベクタ
ーを、当分野で既知の通常のベクター構築法に従って調
製する。本明細書および請求の範囲で用いる「分泌」な
る用語はタンパク質の細胞周辺腔への輸送を意味し、そ
して「排出」なる用語はタンパク質の培養培地への輸送
を意味する。
挿入した遺伝子の転写および翻訳を最終的に達成する
ためには、この遺伝子は選択した宿主細胞に適合するプ
ロモーターの支配下に置かれていなければならない。プ
ロモーターは、RNAポリメラーゼが付着し、転写を開始
するDNAの領域である。選択されるプロモーターは、宿
主細胞生物から単離されたか、またはそこで機能するこ
とができるあらゆるプロモーターであってよい。例え
ば、大腸菌は、それ自体、そのバクテリオファージまた
はそのプラスミドに関係したlacまたはrecAプロモータ
ーなどの夥しいプロモーターを有している。また、λフ
ァージPLおよびPRプロモーターなどのファージプロモー
ターを用いて、それに隣接してDNAセグメントを有する
ようにコードされている産物を高レベルで産生させるこ
ともできる。この産物は天然、合成または組換えのもの
であってよい。
また、遺伝子の効率的な翻訳を達成するためには開始
シグナルが必要である。例えば、大腸菌mRNAでは、リボ
ソーム結合部位は翻訳開始コドン（AUGまたはGUG）およ
び16SリボソームRNAの３′−末端の塩基に相補性の別の
配列を含んでいる。いくつかのこれら後者配列（Shine
−DalgarnoまたはＳ−Ｄ）は、大腸菌および他の適切な
宿主細胞型で同定されていた。宿主細胞系に適合するあ
らゆるSD−ATG配列を用いることができる。これらに
は、コリファージλのＮ遺伝子もしくはcro遺伝子、ま
たは大腸菌トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢもしくはＡ遺
伝子が含まれるが、これらに限定はされない。
インビトロでのDNAフラグメントのクローニングベク
ターへの挿入のためには多数の方法が存在する。DNAリ
ガーゼは、２本鎖DNA鎖中の隣接ヌクレオチドの間の１
本鎖の傷をふさぐ酵素である。従って、この酵素を用い
て、ある種の制限酵素によって生成し、アニーリングさ
れた付着末端を共有結合によって結合させることができ
る。また、これとは別に、DNAリガーゼを用いて平滑末
端フラグメントの間のホスホジエステル結合の形成を触
媒させることができる。最後に、酵素末端デオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを用いてフラグメントの
末端にホモポリマー性の３′−１本鎖尾部を形成させる
こともできる。即ち、ある集団の３′−末端にオリゴ
（dA）配列を、そして第２の集団の３′−末端にオリゴ
（dT）グロックを付加することによって、２種類の分子
をアニーリングしてダイマー環状体を形成させることが
できる。これら方法のどれかを用いて、遺伝子セグメン
ト、プロモーターおよびその他のコントロール要素をベ
クター中の特定の部位に連結することができる。即ち、
タンパク質の遺伝子配列がベクターのATG配列に関して
正しいリーディング・フレーム内にあるように、特定タ
ンパク質の暗号配列を、選択したベクター中に、ベクタ
ーのプロモーターおよびコントロール要素ならびにpel
シグナル配列との特別の関係のもとに連結する。通常、
使用されるベクターは、形質転換された細胞が同定され
うるように、アンピシリン耐性あるいはテトラサイクリ
ン耐性などのマーカー機能を有している。ベクターは既
知のあらゆる発現ベクターまたはそれらの誘導体であっ
てよい。最もよく用いられるベクターは、pBR322、pAC1
05、pVA5、pACYC177、PKH47、pACYC184、pUB110、pMB
9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、
pCR1あるいはRP4などのプラスミドベクター；λgt11、
λgt−WES−λＢ、Charon28、Charon4A、λgt−１−λB
C、λgt−１−λＢ、M13mp7、M13mp8、M13mp9などのバ
クテリオファージベクター;SV40およびアデノウイルス
ベクター、ならびに酵母ベクターである。
本発明は、好ましくはクローニングベクターとしてプ
ラスミドを用いる。例えば、大腸菌での多数の異なるタ
ンパク質のクローニングにおいて、本実施例で採用した
方法は、始めにPLbシグナル配列を独立してクローンす
ることであった。これは、完全なペクチン酸リアーゼＢ
配列を含有しているプラスミドpSS1004からHae III＋Ec
oR I消化フラグメントを単離することによって行った。
次いで、このフラグメントをpBR322プラスミド（Ssp I
で消化し、Sst Iリンカーと連結し、次いでEcoR Iで消
化しておいた）に連結した。こうして得られたのがpelB
シグナル配列を含有するプラスミドpING173である。こ
のpING173プラスミドを、目的タンパク質の配列を含む
プラスミドに後に連結することができるpelBシグナル配
列のクローニング媒体として用いた。このようにして調
製したプラスミドは、関係タンパク質の遺伝子配列に隣
接したpelBシグナル配列からなるハイブリット遺伝子を
含有している。次いで、適切なプロモーター配列をこの
ハイブリッド遺伝子の５′−末端に挿入して最終の発現
ベクターを創製することができる。また、始めにプロモ
ーター配列とpelBシグナル配列を含有するプラスミドを
調製し、次にタンパク質遺伝子配列をプロモーター−シ
グナル配列の下流に挿入してもよい。本発明において特
に有用であることがわかったプロモーターは、大腸菌宿
主系と組み合わせたときの大腸菌lacプロモーターおよ
びSalmonella typhimuriumのaraBADプロモーターであ
る。しかし、選択した宿主系に適合する他のあらゆる適
切なプロモーターも用いることができる。上記の方法に
よって調製したのはL6キメラFabおよびタウマチンの遺
伝子を含有するプラスミド発現ベクターであるが、あら
ゆる種類のタンパク質遺伝子を本ベクターおよび方法に
用いることができることは当業者には明らかであろう。
5.3.形質転換 適切なプロモーターを有するベクターが得られたな
ら、このプラスミドを用いて宿主細菌を形質転換する。
例えば、処理した実質的に全ての大腸菌株が形質転換可
能（ただし、形質転換率は異なる）であったので、本発
明は単一の菌株での使用に限定されない。形質転換に用
いられる方法の大部分は、細菌細胞の塩化カルシウム処
理によってベクターDNAの取込みが実質的に増強される
というMandelおよびHiga［J.Mol.Biol. 53:159−162,1
970］の観察に依存している。ベクターDNAを塩化カルシ
ウム処理した細菌に短い期間（通常は12〜24時間を越え
ない）暴露する。次いで、暴露した細胞を形質転換体に
ついてスクリーニングする。これは、ベクター由来の適
切なマーカーの性質を発現している細菌を選択すること
によって行われる。例えば、テトラサイクリン耐性のマ
ーカーを有するプラスミドが用いられたときには、細菌
をテトラサイクリン含有の培地で増殖させ、増殖し続け
る細菌を推定の形質転換体として回収する。次いで、こ
れらの細菌を目的のタンパク質の産生についてさらにス
クリーニングしてもよい。
5.4.遺伝子産物の単離 本発明は、遺伝子産物を細胞周辺腔または周囲の増殖
培地のどちらかから単離することを可能にするものであ
る。発現されたタンパク質の位置は、宿主として用いた
特定の菌株に依存するようである。本発明の最も予想外
の特徴の１つは、試験した菌株の全てが少なくとも一部
の組換え産物を培養培地中に排出することができるとい
うことである。菌株の間の主な相違は、細胞周辺腔中に
分泌された量に対する、排出された産物、即ち培地中に
輸送された産物の量の比率である。高レベルの排出を示
す大腸菌株にはMC1061、JM103および706が含まれる。培
養液中に排出されるタンパク質はそれから既知のタンパ
ク質回収法によって容易に単離することができるが、細
胞周辺腔に局在化しているタンパク質の回収は細胞質膜
を破壊することなくタンパク質の放出を達成するために
細胞壁の浸透を必要とする。ペリプラズムタンパク質を
除去する方法の１つは、ZinderおよびArndt［PNAS USA
42:586−590,1956］が最初に記載した方法であり、細
胞壁の除去を含むものである。簡単に説明すると、細胞
を卵アルブミン（リゾチームを含有する）で処理し、細
胞壁の大部分が除去されたスフェロプラストの細胞球を
生成させる。また、ペリプラズムタンパク質は、細胞壁
の除去を必要としないが、代わりにタンパク質の放出を
引き起こす機序によって単離することもできる。細胞を
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）含有の高張スクロース
培地に入れる。この培地は細胞に水を失わせ、収縮さ
せ、それによって細胞質膜を細胞壁から取り去る。次い
で、この細胞を塩化マグネシウム溶液中に入れ、浸透圧
ショックを与える。即ち、細胞の外側の浸透圧を減少さ
せ、水を細胞中に急激に取り込ませ、細胞を膨潤させ、
外側の膜を越えてペリプラズムタンパク質が排除される
ようにする。上記方法の変法は当業者には明らかであろ
う。
6.実 施 例 本分泌ベクターを用いて大腸菌中で種々の別種タンパ
ク質を分泌させることに成功した。以下に挙げる実施例
は、上記の開示に従う多数の別種プラスミドの製造方法
を詳しく説明するものである。
6.1.ペクチン酸リアーゼＢの発現 6.1.1.プラスミドの構築 プラスミドpSH2111［Lei et al.,Gene 35:63−70,19
85］は、Erwinia carotovora由来のペクチン酸リアーゼ
遺伝子を含有している。pelB遺伝子は２つのDra I制限
部位の間に位置している。この遺伝子の単離は、プラス
ミドpSH2111のDra Iによる消化とアガロースゲルでの1.
9キロ塩基フラグメントの同定によって行った。次い
で、単離したフラグメントを、Sma Iで消化しておいた
プラスミドpUC8に連結した。得られたプラスミドはpSS1
004である（第１図参照）。
次いで、プラスミドpSS1004をNdd I、T4DNAポリメラ
ーゼおよびHind IIIで処理し、得られたフラグメントを
プラスミドpIT2（Nco I、T4DNAポリメラーゼおよびHind
IIIで消化しておいた）に連結してプラスミドpSS1038
を得た（第１図）。プラスミドpIT2は、Salmonella typ
himuriumのaraBADプロモーターおよびaraC遺伝子の両方
を含有している［Johnson et al.,Gene 34:137−145,1
985］。次いで、このプラスミドを用いて大腸菌株706を
形質転換した。従って、プラスミドpSS1038のpelB遺伝
子の発現は、araBADプロモーターの支配下にあり、増殖
培地中のアラビノースの存在によって作動するものと予
想される。
6.1.2.PLBの排出および精製 プラスミドpSS1038を担持する大腸菌細胞706（F-、pr
o、thr、leu、argH、his、lac、phoSt、rpsL、lky−20
7）を用いてPLbの産生および排出の特徴を調べた。この
大腸菌細胞をTYE［1.5％トリプトン、１％酵母エキスお
よび0.5％NaCl］中で増殖させ、37℃でインキュベート
し、増殖の対数期（O.D.540＝0.6付近）に１％のアラビ
ノースを増殖培地に加えてaraBADプロモーターを作動さ
せ、PLbの産生を開始させた。４時間のインキュベート
の後（O.D.540＝約2.5）、培養ブロスを遠心し、この大
腸菌細胞の培養培地からPLbを直接精製した。培養液を
濃縮し、Amicon（メンブランYM2）で脱塩し、次いで、C
M−52カラム（pH7.4）に通し、0.2M NaClで溶離するこ
とによってタンパク質を精製した。これらの簡単な工程
によって精製されたPLは、SDSゲル電気泳動とそれに続
くクーマッシー・ブルー染色で判定すると、95％以上の
純度を有していた。
6.2.分泌ベクターの構築 pSS1004プラスミドをpelBのシグナル配列の供給源と
して用いた。この配列を、pSS1004の制限酵素Hae IIIに
よる消化、Sst I DNAリンカーとの連結、およびそれに
続くEcoR Iによる消化によって単離した。５′−末端非
暗号領域およびリーダーベプチドを含有するEcoR I−Ss
t I DNAフラグメントを、次いでSstp IおよびEcoR Iで
消化したpBR322プラスミドに連結した。このように調製
したシグナルペプチドを含有しているプラスミドはpING
173である。第２図は、このシグナルペプチドのDNA配
列、およびpING173プラスミドの製造方法を示すもので
ある。このプラスミドを用いて、以下のように別の誘導
体を構築した。
6.3.タウマチンの産生および分泌 6.3.1.背景 タウマチンは植物Thaumatococcus danielliから初め
て単離されたタンパク質甘味料である。タウマチンは20
7個のアミノ酸を含み、スクロースより2,000〜5,000倍
甘い。タウマチンは８つのジスルフィルド結合を有して
おり、タウマチンの３次構造がその生物学的機能に必須
である。
6.3.2.ペクチン酸リアーゼＢのシグナル配列および合成
の植物タウマチン遺伝子を担持するプラスミドの構築 上記のプラスミドpING173由来のPLbシグナルペプチド
をコードしているDNA配列を、大腸菌宿主系でタウマチ
ンを分泌させるため、プラスミドpING174由来のタウマ
チン遺伝子の前にクローンした。得られたプラスミドpI
NG177−１を用いて大腸菌においてタウマチンを発現さ
せ、分泌させた。これは、PLbリーダーペプチドの５′
−非暗号領域の50bpに融合させたaraB遺伝子の一部およ
びaraBADプローモーターを有している。このプラスミド
を調製するため、プラスミドpING173のSst IおよびEcoR
Iフラグメントを、タウマチン遺伝子を含有するプラス
ミドpING174にクローンした。pING174をBamH IおよびPs
t Iで消化し、pING173からのリーダー配列をその制限部
位に連結し、pING176を得た。後者のプラスミドをNde I
およびXho Iで消化し、得られたフラグメント（タウマ
チン遺伝子に隣接してペクチン酸リアーゼのリーダー配
列を含有する）をプラスミドpING61のSal I、Xho I部位
にクローンした。得られたプラスミドはaraBADプロモー
ターの支配下にPLbリーダー配列をコードしている遺伝
子およびタウマチン遺伝子を含有しており、これをpING
177−１と命名した。この構築工程の詳細を第３図に示
す。
6.3.3.大腸菌の組換え株からのタウマチンの産生および
その特徴づけ プラスミドpING177−１を保持している大腸菌株706を
TYEブロス（１）中で増殖させた。O.D.＝0.35のとき
に、細胞を１％（w/v）アラビノースで誘導した（約12
時間）。次いで、培養物を収穫し、細胞周辺腔タンパク
質の特徴をSDS−PAGE、ウェスタン分析およびRIA検定に
より適切に折り畳まれたタウマチンについて調べた。SD
S−PAGEおよびウェスタン分析の両方は、大腸菌細胞が
タウマチンを合成することができることを示した。ま
た、RIA検定も、大腸菌の細胞周辺腔に分泌されたタウ
マチンが適切に折り畳まれていることを示した（第１
表）。さらに、プレ−タウマチン シグナルペプチドを
用いて大腸菌中でタウマチンを分泌させた。プレ−タウ
マチン シグナルペプチド配列およびタウマチンの構造
遺伝子を含有するプラスミドpING177−３を用いてタウ
マチンを産生させた。構築工程の詳細は第４図に示す。
細胞増殖および誘導の条件は上述のものと同じである。
RIA検定の結果は、プレ−タウマチン シグナルペプチ
ドによって導かれる適切に折り畳まれたタウマチンの産
生が、PLbリーダーペプチドによって導かれる産生より
もその効率が劣っていることを示した（第１表）。
6.4.機能キメラ抗体の産生および排出 6.4.1.背景 抗体のFab分子は１個のジスルフィド架橋によって結
合した２つの非同一タンパク質鎖を含有している。この
２つの鎖は無傷抗体の軽鎖とFdである。この抗体のFd分
子は抗体重鎖のＶ、Ｊ、およびCH1タンパク質を含有し
ている。L6キメラ軽鎖およびFd遺伝子の適切なcDNAクロ
ーンは既に同定されていた。本実施例では、PLbリーダ
ーペプチドをコードしている配列を用いて、L6キメラ抗
体の免疫学的に活性かつ適切に組み立てられたFabを培
養増殖培地に排出させた。
6.4.2.L6キメラ抗体の大腸菌発現および排出系の作成 プラスミドpING173のSst I、EcoR IフラグメントをpU
C18にクローンしてpRR175を得た。このプラスミドは、l
acプロモーターの下流にpelBリーダーおよび隣接の上流
非暗号配列を含有している。pRR175構築の概略を第２図
に示す。
無傷のL6キメラ軽鎖遺伝子（シグナル配列プロセッシ
ング部位にAat II制限部位を、およびこの遺伝子の下流
に唯一のBgi II部位を含む）を、酵母発現プラスミドpI
NG1298（第５図）から1200bpのDNAフラグメントとして
切り出した。このフラグメントをプラスミドpRR175に挿
入した。得られたプラスミドpRR177−８は、親プラスミ
ド中に存在するlacプロモーターの下流に、pelBリーダ
ーとL6軽鎖遺伝子のフレーム内融合を含んでいた。この
プラスミドの多数の誘導体を構築し、pRR177−８中のpe
lB::軽鎖遺伝子融合体の５′および３′の両末端から非
暗号配列を削除した。上流の非暗号配列は、pelBリーダ
ー配列開始コドンから−48bpのNde I制限部位を用いて
削除し、pRR180−２を得た（第５図）。３′非暗号配列
は、酵母中でおL6軽鎖の発現に最適のプラスミドp1NG14
31由来のフラグメントをpRR180−２中に置換することに
よって削除し、pRR191を得た（第５図を参照）。これら
の構築を第５図に示す。別のプラスミドpRR190はpRR191
に類似しているが、軽鎖遺伝子の３′末端に90bpの非暗
号真核性DNAを含有している。
シグナル配列プロセッシング部位にSst I制限部位、
部位指向性の突然変異誘発によって導入されアミノ酸22
6のところに終止コドンを創製するBcl I部位、および遺
伝子の下流に唯一のBamH I制限部位を含有する無傷のL6
キメラFd遺伝子を、酵母発現プラスミドpING1406から88
0bpのDNAフラグメントとして切り出した（第６図）。こ
のDNAフラグメントをプラスミドpRR175中に挿入し、lac
プロモーターの下流のpelBリーダー配列とL6 Fd遺伝子
からなるフレーム内融合体pRR178−５を得た。pRR178−
５に含まれる配列の５′および３′の両末端から非暗号
配列を削除するために多数の誘導体を構築した。３′非
暗号配列は、酵母中でのL6 Fdの発現を最適にしたプラ
スミドpING1428（Fd遺伝子の終止コドンにすぐ続いてXh
o Iリンカーを含有している）からの制限フラグメント
を置換することによって削除し、プラスミドpRR186を得
た（第６図）。リーダー配列から−48のところのNde I
部位の上流のE.carotovoraのDNA配列の除去によってプ
ラスミドpRR196を得た。これらプラスミドの構築を第６
図に示す。
細菌誘導のFabを産生させるためには、軽鎖およびFd
の両方が同時に細胞内に産生されることが必要である。
これら遺伝子のそれぞれを用いて別々に構築したプラス
ミドを用い、１個のプロモーターから両方の遺伝子が転
写されるように並べられた両遺伝子含有の一連の発現ベ
クターを構築した。これは、２つの遺伝子の間の非暗号
DNAを60bpまで最少化するような方法で行った。それぞ
れの遺伝子は、翻訳開始に必要なリボソーム結合部位、
および−48からpelBリーダー::抗体遺伝子連結点までの
同じDNA配列を有している。２つの遺伝子を一緒に並べ
るためにはいくつかのクローニング工程が必要であっ
た。pRR180−２中のpelBリーダーに結合した軽鎖遺伝子
の一部をpRR186中のFd遺伝子の下流にクローンしてpFK1
00を得た。軽鎖遺伝子の残りをpRR177−８からpFK100に
サブクローンしてpFK101を得た。同様に、pRR190および
pRR191からの真核性配列の３′欠失を含むDNAフラグメ
ントをpFK101にクローンしてそれぞれpFK103およびpFK1
02を得た。pRR192およびpFK101からのDNAフラグメント
を連結し、Fd遺伝子から−48bpの上流の配列の欠失を含
むpFK104を得た。これらプラスミド中のFdおよび軽鎖遺
伝子カセットの地図を第８図に示す。プラスミドpFK102
は、ベクターpUC18中のlacプロモーターの支配下に連続
してクローンされたFdおよび軽鎖遺伝子を含有してい
る。大腸菌株、例えばJM103F′laciQ［Messing et al.,
Nucl.Acids Res. ９:309,1981］においては、ペリプラ
ズムに蓄積する軽鎖の量は、lacプロモーター誘導物質
イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）
によって影響されない。さらに、細菌の増殖は比較的遅
く（pUC18を含む細胞に比べて）、細胞コロニーは小さ
く、乾燥した、そして雑な、形態の変化を示す。このこ
とは、構成的な外来遺伝子の発現が細胞増殖にとって有
害であることを示唆している。この遺伝子カセットをも
っと緊密に調節されるプロモーターのもとに配置するた
めに２つの方法を用いた。
第１には、pFK104からのPst I−EcoR Iフラグメント
をpIT206に連結して、Fdおよび軽鎖遺伝子カセットを、
その特徴がよく調べられている大腸菌における強力なプ
ロモーターであるSalmonella typhimurium araBプロモ
ーターの直接支配のもとに置いた。pIT206の制限地図お
よびpIT104の構築を第７図に示す。細菌遺伝子の発現の
ためにaraBプロモーターおよびその調節タンパク質AraC
を用いることは、米国特許出願No.695,309（1985年１月
28日出願）、およびNo.797,472（1985年11月13日出願）
に記載されている。得られたプラスミドpIT104は、培養
増殖培地へのアラビノースの添加によって軽鎖の合成に
ついて調節されている。アラビノースの添加によって少
なくとも10倍の誘導が為される。増殖培地に分泌される
Fabは10倍以上に増加するが、細胞の増殖はアラビノー
スによる誘導の後に停止する。このことは、Fab遺伝子
の高レベルの発現が細胞増殖にとって有害であることを
示すものである。pIT104を保持している細菌コロニー
は、アラビノースの非存在下で増殖させたとき、表現型
によってはpIT206を保持している大腸菌と区別すること
ができない。
第２には、lacプロモーターのリプレッサーであるlac
i遺伝子を含有しているDNAフラグメントを高コピー発現
ベクターpFK102にクローンした。高コピー数ベクターか
らのlaciの発現は、高コピー数ベクター上でのlacプロ
モーターの発現を調節するのに有用である［Russel et
al.,Plasmid,in press（1987）;Hsuing et al.,Biotech
nology ４:991（1986）］。pMC9 Ｓ［Calos et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015（1983）］上のlaci
遺伝子を含有する1.7kbのEcoR Iフラグメントを切り出
し、T4ポリメラーゼで充填して平滑末端にし、Pst Iリ
ンカーと連結し、そしてpFK102の唯一のPst I部位にク
ローンしてpFK102laciを得た。pFK102laciの地図を第７
図に示す。正しいクローンを同定するために用いた選択
方法は、得られたプラスミドpFK102laciが機能的に抑制
されたlacプロモーターを含有していることを確実にし
た。MacConkey−ラクトースプレート上で白色または淡
いピンクである全てのコロニーはlaci挿入体を有するプ
ラスミドを含んでおり、一方、pFK102だけを含有してい
る形質転換体は赤色であり、高コピー数laci遺伝子によ
るlacプロモーターの機能的な抑制を示した。第３表
は、pFK102laciを含有する細胞からの細菌性Fabの発現
がpFK102からの発現に類似していることを示すものであ
る。異常なコロニーを形成し、ブロス培養でゆっくりと
増殖するpFK102含有の細胞とは異なり、pFK102laci含有
の細胞はpUC18含有の細胞に似ている。
6.4.3.細菌産生のFABの発現および精製 A.クローンしたAb遺伝子を保持する大腸菌の増殖 通常の大腸菌形質転換法によって、プラスミドDNAを
大腸菌JM103またはMC1061のいずれかに導入した。細菌
培養物を、適当な抗生物質（ペニシリン250μg/mlまた
はテトラサイクリン15μg/ml）を追加したTYE［トリプ
トン1.5％、酵母エキス1.0％、およびNaCl0.5％］中で
増殖させた。5ml〜１の容量中、37℃で光学密度OD600
＝0.8（約4x108細胞/ml）になるまで細菌培養物を増殖
させ、その一部をIPTG（0.2mM）、ラクトース（1.0％）
またはアラビノース（1.0％）で誘導した。培養物をさ
らに４〜21時間増殖させた。それぞれの培養物の一部を
軽鎖産生について分析した。文献記載［Yanagida et a
l.,1986,J.Bacteriol. 166:937］のように浸透圧ショ
ックによって大腸菌細胞の細胞周辺腔からタンパク質を
放出させた。これとは別に、培養上清を抗体鎖の存在に
ついて直接検定した。
L6軽鎖の定量は、ヤギ抗−ヒトκ軽鎖抗体（κ１）を
用いるELISAによった。Fdは、マウスモノクローナル抗
−ヒトFd抗体（Calbiochem）を用いるELISAによって検
出することができた。第２表は、大腸菌培養上清中の軽
鎖反応性物質の発現についての代表的データを示すもの
である。これは大腸菌中で発現される真核性タンパク質
の特有の性質であるかもしれないが、ある種の条件下で
は、細菌性タンパク質が大腸菌から放出されることが知
られている［Abrahmsen et al.,1986,NAR 14:7487−75
00;Pages et al.,1986,J.Bacteriol. 169:1386］。第
３表は、ペリプラズム中に分泌された軽鎖の量を培養上
清中の量と比較するものである。軽鎖反応性物質は、ク
ローンした軽鎖単独または軽鎖とFdを保持するプラスミ
ド含有培養物中に存在する。Fabの最良の産生体（pFK10
2およびpFK102laci）は、通常、培養培地中に300〜1000
ng/mのELISA反応性軽鎖を排出する。
大腸菌JM103またはMC1061（結果は類似）をそれぞれ
のプラスミドで形質転換した。OD600＝0.8になるまで新
鮮な形質転換体をTYE中、37℃で培養した。培養物を分
割し、誘導物質（IPTG）を0.2mMで加えた（−または＋I
PTG）。細胞を37℃で４時間増殖させた。ペリプラズム
タンパク質抽出物を調製し、その一部を、ヤギ抗ヒトκ
抗体を用いるELISAにより軽鎖について試験した。それ
ぞれの値は少なくとも２回の独立した実験の平均であ
る。抗体遺伝子の５′および３′の非暗号配列の除去
は、ペリプラズムにおける軽鎖の蓄積の増加に有効であ
った。
プラスミド含有の大腸菌株を増殖させ、調製し、そし
て検定した。pRR190、pFK102、およびpFK102laciについ
て、細胞を0.2mM IPTGで誘導した。それぞれの値は少な
くとも２回の独立した実験の平均である。大腸菌培養上
清の分析のためには、細菌を遠心によって除き、培養上
清を0.45μｍのフィルターに通した。数値はng/培養物
ｍで表す。
B.細菌産生の軽鎖およびFdのSDS−PAGE 細菌によって生産された抗体鎖を、還元および非還元
条件下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析
した。溶解した全細菌細胞のタンパク質抽出物、浸透圧
ショックによって細胞周辺腔から放出させたタンパク
質、および培養上清中に排出されたタンパク質を分析し
た。ウェスタン分析による完全な還元条件下でのゲル分
離タンパク質のニトロセルロースへの移動およびヤギ抗
−ヒト軽鎖抗体を用いる免疫学的染色は、真正のL6キメ
ラ軽鎖と同一の分子量のタンパク質が存在することを明
らかにした（約23Kd）。非還元ポリアクリルアミド電気
泳動条件下でのタンパク質試料の分析は、軽鎖遺伝子単
独を有するプラスミド（pRR191またはpRR190）を保持し
ている細胞由来の抽出物が、より大きい分子量形態を予
想させる高い比率の軽鎖反応性物質を含んでいることを
示した。この物質の多くは約46Kdで移動し、軽鎖の二量
体のようである。軽鎖二量体は軽鎖だけを産生するミエ
ローマ細胞で観察されていた。また、他の免疫反応性の
タンパク質バンドも存在し、これは軽鎖と大腸菌タンパ
ク質の間の非特異的なジスルフィド結合形成を示すもの
であろう。軽鎖およびFd遺伝子の両方を保持している大
腸菌細胞からのタンパク質試料（ペリプラズム抽出物ま
たは培養上清）は、非還元ゲル条件下で分離したとき
に、約48Kdのところに軽鎖反応性バンドを含んでおり、
これは細菌性の軽鎖二量体よりもわずかに高い分子量の
ところで移動する。この物質は細菌産生のL6キメラFab
である。pFK102laciまたはpFK102を保持している大腸菌
においては、非還元条件下で移動するポリアクリルアミ
ドゲル上で観察される48Kdのバンドが、最も主要な免疫
反応性の種である。さらに、軽鎖だけを含有している抽
出物で観察される免疫反応性タンパク質のバックグラウ
ンド塗抹は、軽鎖とFdの両方を含有している細胞からの
抽出物においては大きく減少していた。
C.細菌産生のFabの精製 免疫学的に、および機能的に活性な細菌性Fab（以下
を参照）を、pFK102laciまたはpIT104を保持している大
腸菌の培養上清またはペリプラズムタンパク質抽出物の
どちらかから精製した。ペリプラズム物質の精製のため
には、４時間誘導した細胞（１）からペリプラズム分
画を蒸留水（50ml）中に放出させた。この物質を5000xg
で20分間遠心し、0.45μｍのフィルターに通した。次
に、このペリプラズム抽出物をYM10メンブラン（Amico
n）で濃縮して約5mlにした。この物質を出発緩衝液［10
mM K2HPO4、pH7.5］で８倍に希釈し、1.0ml/分の流速の
Ｓ−Sepharoseカラム（1ml）にかけた。このカラムを出
発緩衝液（25ml）で洗浄し、出発緩衝液中の０〜200mM
NaCl勾配液（合計容量200ml）で溶離した。免疫反応性
の勾配ピークを集め（溶出は約100mMのところ）、Centr
icon 10で濃縮した。精製したFabはPBS＋2.0％BSA中で
保存した。
細菌培養上清（１）からの分泌Fabの精製のために
は、誘導物質と共に21時間増殖させた後に細胞を遠心に
よって除去し、その上清を0.45μｍのフィルターで濾過
した。この培地をYM10メンブラン（Amicon）で濃縮して
約16mlとし、次いで10mM K2HPO4で希釈して105mlにし
た。この物質をＳ−Sepharoseカラム（1.6ml）にかけ、
40mlの０〜200mM NaCl勾配液で溶離した。Ｓ−Sepharos
eクロマトグラフィーから回収したFabは、非還元のCoom
assie染色した10％アクリルアルミドゲルのデンシトメ
トリー追跡によって測定すると70％以上の純度であっ
た。DNA配列に基づくFdと軽鎖の分子量は24.5Kdおよび2
3Kdであり、観察されたタンパク質の大きさによく一致
している。２つのバンドの小さい方は、ウェスタン・ブ
ロットでヤギ抗−ヒトκ軽鎖抗血清と強く反応した。細
胞周辺腔または細菌培養上清から精製した細菌性Fab
は、ここで試験した全ての分析尺度によって区別するこ
とができなかった。
D.細菌性L6 FabのL6抗原に対する機能的結合活性 Ｓ−Sepharoseクロマトグラフィーによって精製した
細菌産生のFabを、L6抗原含有の細胞に対する結合につ
いて試験した。第４表に示すように、細菌性Fabはヒト
結腸癌セルラインH3347に特異的に結合した。Ｔ細胞セ
ルラインT51からの細胞を陰性対照として用いた。標的
細胞を、細菌産生のL6キメラFab、Sp2/0細胞中に産生さ
せた無傷のL6キメラ抗体、あるいはマウスの腹水から精
製したマウスL6抗体と、４℃で30分間インキュベートし
た。これに続いて、Fab検出のためにはFITC−ラベルし
たヤギ抗−ヒト軽鎖抗体と、キメラ抗体検出のためには
FITC−ラベルしたヤギ抗−ヒト免疫グロブリンと、ある
いはマウス抗体検出のためにはFITC−ラベルしたヤギ抗
−ネズミ免疫グロブリンと共にインキュベートした。細
胞表面への抗体の結合をCoulter EPIC−Ｃ型細胞ソータ
ーを用いて測定した。
また、細菌産生のFabは、Sp2/0産生のキメラL6抗体と
同一かつ特徴的な、抗原ポジティブな3347結腸癌細胞の
表面へのFITC−ラベルのマウスL6抗体の結合の抑制を示
す。細菌性のFabおよびSp2/0由来のキメラL6は本質的に
同一の結合抑制プロフィールを有しており、このこと
は、細菌性FabとSp2/0由来のキメラL6の結合活性が同一
であることを示唆する。
標準のL6 Fabは、マウスL6抗体の酵素消化によって調
製した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．168，Ｎｏ. ２，（1986）ｐ．595−606 Ｇｅｒｅ，Ｖｏｌ．18（1982），ｐ. １〜12 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．81，（1984）, ｐ．3273−3277 Ｇｅｒｅ，Ｖｏｌ．34（1985），ｐ. 137〜145 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細菌宿主の形質転換に有用な組換えベクタ
    ーであって、 該ベクターは、ペクチン酸リアーゼ以外のタンパク質を
    コードするDNA配列に隣接してペクチン酸リアーゼのシ
    グナルペプチドをコードしているDNA配列を含有し、 該ベクターは、該タンパク質が発現され、グラム陰性宿
    主のペリプラズムに輸送されることを可能にし、または
    該タンパク質が発現され、宿主の細胞外に輸送されるこ
    とを可能にする組換えベクター。
  2. 【請求項２】宿主中で該タンパク質を発現するように、
    該シグナルおよびタンパク質配列と関係させて設置した
    DNAプロモーター配列をさらに含有している請求項１に
    記載のベクター。
  3. 【請求項３】プラスミドである請求項１または２に記載
    のベクター。
  4. 【請求項４】ペクチン酸リアーゼがErwinia carotovora
    のペクチン酸リアーゼＢであり、および／またはプロモ
    ーターがaraBADまたはlacプロモーターである請求項１
    〜３のいずれかに記載のベクター。
  5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載のベクター
    で形質転換された細菌宿主。
  6. 【請求項６】グラム陰性細菌である請求項５に記載の宿
    主。
  7. 【請求項７】大腸菌である請求項５または６に記載の宿
    主。
  8. 【請求項８】宿主の細胞質からタンパク質を排出させる
    ための方法であって、宿主中で該タンパク質を発現させ
    るように該シグナルおよびタンパク質配列に関係させて
    設置したプロモーターDNA配列を含有する、請求項５〜
    ７のいずれかに記載の宿主を適切な培養培地で培養する
    ことを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド、
    およびペクチン酸リアーゼ以外のタンパク質、またはそ
    れらの突然変異体もしくは組換え体をコードしているヌ
    クレオチド配列を含有する精製ポリヌクレオチドであっ
    て、該ヌクレオチド配列は、グラム陰性宿主中でベクタ
    ー中に存在する場合、該タンパク質が発現され、該宿主
    のペリプラズムへ輸送されることを可能にし、または発
    現されて宿主の細胞外に輸送されることを可能にする精
    製ポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】ペクチン酸リアーゼがErwinia carotovo
    raのペクチン酸リアーゼＢである請求項９に記載のポリ
    ヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】配列が第2A図に示される請求項10に記載
    のポリヌクレオチド。
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