JPS59196093A - インスリンの発現方法 - Google Patents
インスリンの発現方法Info
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- JPS59196093A JPS59196093A JP59054554A JP5455484A JPS59196093A JP S59196093 A JPS59196093 A JP S59196093A JP 59054554 A JP59054554 A JP 59054554A JP 5455484 A JP5455484 A JP 5455484A JP S59196093 A JPS59196093 A JP S59196093A
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- dna
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
（発明の分野）
バイブリドＤＮＡ技法は、遺伝子の転写及び翻訳による
所望のポリペプチド生成物の製造を可能にする°。はと
んどの場合、注目するポリペプチド生成物は哺乳動物遺
伝子に関連するが、宿主細胞の選択はまず原核生物及び
下等真核生物、例えば菌類、特に酵母に向けられてきた
。これは増殖及び遺伝的操作が簡単なためである。所望
のポリペプチドの効果的な産生を供するＤＮＡ構成を形
成するするための方法の開発においては、要求される通
りにＤＮＡ断片を挿入しそして切り出すことが可能な方
法を開発しなければならない。−しばしば、種種の制御
シグナル、複製系、マーカー、及び注目する１又は複数
の構造遺伝子が異る分離源に由来する。従って、該当す
る配列中でエンドヌクレアーゼ切断、挿入及び切出しを
可能にし、複数のＤＮＡ断片を正しい方向に且つ適切な
空間的関係において配列せしめる方法を開発しなければ
ならない。さらに、目的とする構造遺伝子の効果的な転
写、翻訳又は壇加を妨害するか又は妨害する可能性があ
る配列の存在を回避しなければならず、又はこれらの配
列が不利益な効果を有しない場合にのみその存在が許さ
れる。
所望のポリペプチド生成物の製造を可能にする°。はと
んどの場合、注目するポリペプチド生成物は哺乳動物遺
伝子に関連するが、宿主細胞の選択はまず原核生物及び
下等真核生物、例えば菌類、特に酵母に向けられてきた
。これは増殖及び遺伝的操作が簡単なためである。所望
のポリペプチドの効果的な産生を供するＤＮＡ構成を形
成するするための方法の開発においては、要求される通
りにＤＮＡ断片を挿入しそして切り出すことが可能な方
法を開発しなければならない。−しばしば、種種の制御
シグナル、複製系、マーカー、及び注目する１又は複数
の構造遺伝子が異る分離源に由来する。従って、該当す
る配列中でエンドヌクレアーゼ切断、挿入及び切出しを
可能にし、複数のＤＮＡ断片を正しい方向に且つ適切な
空間的関係において配列せしめる方法を開発しなければ
ならない。さらに、目的とする構造遺伝子の効果的な転
写、翻訳又は壇加を妨害するか又は妨害する可能性があ
る配列の存在を回避しなければならず、又はこれらの配
列が不利益な効果を有しない場合にのみその存在が許さ
れる。
ＤＮＡ構成の調製に関する方法のほかに、制御シグナル
及び発現生成物についてコードする配列の選択、これら
の個々の相互作用、宿主に対するこれらの影響、宿主の
エネルギーが目的ポリペプチドの産生に用いられる効率
、及びポリペプチド生成物の分離の容易さも考慮に入れ
られる。従って、特定のポリペプチドの製造のための方
法の個々の開発は、実験計画、手順の組織化及び研究に
おける知的な実践となる。
及び発現生成物についてコードする配列の選択、これら
の個々の相互作用、宿主に対するこれらの影響、宿主の
エネルギーが目的ポリペプチドの産生に用いられる効率
、及びポリペプチド生成物の分離の容易さも考慮に入れ
られる。従って、特定のポリペプチドの製造のための方
法の個々の開発は、実験計画、手順の組織化及び研究に
おける知的な実践となる。
（従来技術の記載）
ヒト−インスリンのヒト−ＤＮＡ配列ｉｊ、Ｂｅ１１等
、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２： ５２５−５２７
に見出される。ラットの「プレ」−プロインスリンポリ
ペプチド断片の細菌中での産生が米国特許第４．３３８
．３９７号に記載されている。Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒ
ｓｋｏｗｉｔｚにｅｌｌ （１９８２） ３０：９３３
−９４３は、成熟α−ファクターの４個のタンデムコピ
ーを含有するα−ファクター前駆体を予想し、配列を記
載しそしてプロセシング機構を仮定している。
、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２： ５２５−５２７
に見出される。ラットの「プレ」−プロインスリンポリ
ペプチド断片の細菌中での産生が米国特許第４．３３８
．３９７号に記載されている。Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒ
ｓｋｏｗｉｔｚにｅｌｌ （１９８２） ３０：９３３
−９４３は、成熟α−ファクターの４個のタンデムコピ
ーを含有するα−ファクター前駆体を予想し、配列を記
載しそしてプロセシング機構を仮定している。
Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８１年に
おけるＣｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｅｅ
ｔｉｎｇ ｏｎ Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆＹｅａｓｔのＩＡＰｕｔａｔｉｖｅ
Ａｌｐｈａ−Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｏｕｒ Ｔａｎ−ｄｅｍ Ｒ
ｅｐｅａｔｓ ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ Ａｌｐｈａ−Ｆａ
ｃｔｏｒ ｊと題する要約紙は、α−ファクターについ
てコードする配列、及びこれらの２個の配列の間のスペ
ーサーを記載している。米国特許第４，３３８．．３９
７号の第３及び第４欄は有用な定義を与えており、この
定義を引用によりこの明細書に組み入れる。
おけるＣｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｅｅ
ｔｉｎｇ ｏｎ Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆＹｅａｓｔのＩＡＰｕｔａｔｉｖｅ
Ａｌｐｈａ−Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｏｕｒ Ｔａｎ−ｄｅｍ Ｒ
ｅｐｅａｔｓ ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ Ａｌｐｈａ−Ｆａ
ｃｔｏｒ ｊと題する要約紙は、α−ファクターについ
てコードする配列、及びこれらの２個の配列の間のスペ
ーサーを記載している。米国特許第４，３３８．．３９
７号の第３及び第４欄は有用な定義を与えており、この
定義を引用によりこの明細書に組み入れる。
発明の要約
酵母宿主中で「プレ」−ゾロインスリンを産生せしめ、
そしてプロセシングされた「プレ」−ゾロインスリンを
培地中に分泌せしめるための方法及び構成が提供される
。このＤＮＡ構成は種々の分離源に由来するＤＮＡ配列
を連結することによって形成され、この構成は酵母宿主
中で安定に複製されそしてプロセシングされた「プレ」
−ゾロインスリンの栄養培地中への効率的な高レベル産
生をもたらす。他方、この生成物は高収率で分離され得
る。
そしてプロセシングされた「プレ」−ゾロインスリンを
培地中に分泌せしめるための方法及び構成が提供される
。このＤＮＡ構成は種々の分離源に由来するＤＮＡ配列
を連結することによって形成され、この構成は酵母宿主
中で安定に複製されそしてプロセシングされた「プレ」
−ゾロインスリンの栄養培地中への効率的な高レベル産
生をもたらす。他方、この生成物は高収率で分離され得
る。
特定の態様の記載
酵母宿主中で哺乳動物の「プレ」−プロインスリンを効
果的に産成し、そして「プレ」−プロインスリンをプロ
セシングする新規なりＮＡ構成が提供される。この構成
は、哺乳動物「ｆし」−ゾロインスリンの転写及び翻訳
、並びにこのポリペプチド生成物のプロセシング及び培
地への分泌をもたらす。従ってこの構成は、酵母宿主中
で安定な保持を可能にする複製系；効果的なプロモータ
ー；プロインスリンについてのコード領域に連結された
リーダー及びプロセシングシグナルを含有する構造遺伝
子（このゾロインスリンについてのコード領域は分泌リ
ーダー及びプロセシングコード配列とリーディングフレ
ームが一致している）；及びこの構造遺伝子から下流に
位置するターミネータ−配列を含む。場合によっては、
再転制御、遺伝子の増幅、転写の外的制御等のための他
の配列を有することができる。
果的に産成し、そして「プレ」−プロインスリンをプロ
セシングする新規なりＮＡ構成が提供される。この構成
は、哺乳動物「ｆし」−ゾロインスリンの転写及び翻訳
、並びにこのポリペプチド生成物のプロセシング及び培
地への分泌をもたらす。従ってこの構成は、酵母宿主中
で安定な保持を可能にする複製系；効果的なプロモータ
ー；プロインスリンについてのコード領域に連結された
リーダー及びプロセシングシグナルを含有する構造遺伝
子（このゾロインスリンについてのコード領域は分泌リ
ーダー及びプロセシングコード配列とリーディングフレ
ームが一致している）；及びこの構造遺伝子から下流に
位置するターミネータ−配列を含む。場合によっては、
再転制御、遺伝子の増幅、転写の外的制御等のための他
の配列を有することができる。
「プレ」−プロインスリン遺伝子とは、ヒト−プロイン
スリンについてコードし、酵母宿主により効率的に認識
されるリーダ配列及びプロセシングシグナルとリーディ
ングフレームが一致している遺伝子を意味する。すなわ
ち「プレ」とは、酵母宿主と関連する分泌及びプロセシ
ングシグナルを意味し、ゾロインスリン遺伝子と共に天
然に存在し天然のプレプロペプチドをプロインスリンに
プロセシングするためのヒトの配列と区別される。
スリンについてコードし、酵母宿主により効率的に認識
されるリーダ配列及びプロセシングシグナルとリーディ
ングフレームが一致している遺伝子を意味する。すなわ
ち「プレ」とは、酵母宿主と関連する分泌及びプロセシ
ングシグナルを意味し、ゾロインスリン遺伝子と共に天
然に存在し天然のプレプロペプチドをプロインスリンに
プロセシングするためのヒトの配列と区別される。
この構成の調製においては、個々の配列をあらかじめ定
められた順序で一緒にすることにより、存在する複数の
配列が各段階において妨害されそれらの機能が不都合な
影響を受けることがないこと、及び導入される各配列が
他の配列との関係において適切に位置し、これらの個々
の機能が満たされ得ることを保証することが必要でおる
。さらに、構成を有利に調製するためにアダプター分子
を使用することができる。
められた順序で一緒にすることにより、存在する複数の
配列が各段階において妨害されそれらの機能が不都合な
影響を受けることがないこと、及び導入される各配列が
他の配列との関係において適切に位置し、これらの個々
の機能が満たされ得ることを保証することが必要でおる
。さらに、構成を有利に調製するためにアダプター分子
を使用することができる。
使用されるゾロインスリン遺伝子は染色体ＤＮＡ 。
ｃ ＤＮＡ ％合ｇＤＮＡ、又はこれらを組合わせたも
のであってよい。プロインスリン遺伝子は哺乳動物遺伝
子でアリ、そして制御シグナル、リーダー及びプロセシ
ングシグナル、並びに転写ターミネータ−シグナルは宿
主に由来しそして宿主によって認識される配列であるで
あろうから、幾つかの配列をコネクター配列又はアダプ
ター配列によｐ連結するのが有用であろう。すなわち、
制御部位を適切に選択することによｐ、コード鎖の内側
であり５′−末端の近くにおいて制限（ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔ ）され幾つかの塩基対が欠失したプロインスリン遺
伝子を得ることができる。同様にして、リーダー及びプ
ロセシングシグナル配列を、コード鎖の内側であって３
′−末端の近くで制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔ ） して多
数の塩基対を欠失せしめることができる。
のであってよい。プロインスリン遺伝子は哺乳動物遺伝
子でアリ、そして制御シグナル、リーダー及びプロセシ
ングシグナル、並びに転写ターミネータ−シグナルは宿
主に由来しそして宿主によって認識される配列であるで
あろうから、幾つかの配列をコネクター配列又はアダプ
ター配列によｐ連結するのが有用であろう。すなわち、
制御部位を適切に選択することによｐ、コード鎖の内側
であり５′−末端の近くにおいて制限（ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔ ）され幾つかの塩基対が欠失したプロインスリン遺
伝子を得ることができる。同様にして、リーダー及びプ
ロセシングシグナル配列を、コード鎖の内側であって３
′−末端の近くで制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔ ） して多
数の塩基対を欠失せしめることができる。
（特にことわらないかぎゃ、５′−及び３′−の標示は
コード鎖について用いる。）アダプターが！ロインスリ
ン遺伝子の適切なリーディングフレームをもたらすよう
に制御部位が選択される。
コード鎖について用いる。）アダプターが！ロインスリ
ン遺伝子の適切なリーディングフレームをもたらすよう
に制御部位が選択される。
アダプターは合成的に調製することができるので、アダ
ゲタ−のコドンは、天然に存在する哺乳動物のコドンで
はなく、酵母宿主により選択的に用いられるコドン、例
えば解糖系酵素の遺伝子中に存在するコドンであること
が好ましい。アダプターはコード配列中に約２０〜４０
、さらに一般的には約２５〜３５の塩基を有し、そして
接着末端又は平滑末端、好ましくは接着末端を有する。
ゲタ−のコドンは、天然に存在する哺乳動物のコドンで
はなく、酵母宿主により選択的に用いられるコドン、例
えば解糖系酵素の遺伝子中に存在するコドンであること
が好ましい。アダプターはコード配列中に約２０〜４０
、さらに一般的には約２５〜３５の塩基を有し、そして
接着末端又は平滑末端、好ましくは接着末端を有する。
好ましくは、アダプターの末端は異なる接着末端を有し
、該アダプターの正しい方向付けを保証する。従って、
連結されるべき２つの末端も文具なる末端を有するであ
ろう。
、該アダプターの正しい方向付けを保証する。従って、
連結されるべき２つの末端も文具なる末端を有するであ
ろう。
リーダー及びプロセシングシグナルのために、酵母由来
の天然のＤＮＡ配列を使用することができる。酵母によ
り分泌されるポリ４ゾチドにはα−ファクター、ａ−フ
ァクター等が含まれる。
の天然のＤＮＡ配列を使用することができる。酵母によ
り分泌されるポリ４ゾチドにはα−ファクター、ａ−フ
ァクター等が含まれる。
この発明を、酵母α−ファクターの制御シグナル、リー
ダー及びプロセシングシグナル、並びに転写ターミネー
ターと共に、プロインスリンのｃＤＮＡを用いて説明す
る。
ダー及びプロセシングシグナル、並びに転写ターミネー
ターと共に、プロインスリンのｃＤＮＡを用いて説明す
る。
酵母α−ファクターは旦す型■及び旦す■によυ制限す
ることができる。Ｈｋ ｎｄ ＩＩＩは、α−ファクタ
ーのプロセシングシグナル中ｇｌｕコドンのコード鎖の
第２塩基において切断し、他方認識配列はｇｌｕコドン
を満たしそしてａｌｔをコードする。
ることができる。Ｈｋ ｎｄ ＩＩＩは、α−ファクタ
ーのプロセシングシグナル中ｇｌｕコドンのコード鎖の
第２塩基において切断し、他方認識配列はｇｌｕコドン
を満たしそしてａｌｔをコードする。
Ｓａｌ １部位はα−ファクター転写ターミネータ−に
先行する。
先行する。
ヒト−プロインスリンｃ ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩにょシ
制限されて、プロインスリンの完全コート配列及びフラ
ンク配列を有する断片（拍：ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）をも
たらす。足部ＲＩ−肋徂ＲＩ断片を拍」Ｒ■により部分
消化してコード配列の内部を切断することにより、５／
−末端においてコード配列の一部分が欠落した不完全断
片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）が得られ
る。この塩基対はアダツタ−により与えられ、このアダ
プターは彫副ＲＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片とリーディングフ
レームが適切に一致するようにリーダー及びプロセシン
グシグナル断片（Ｈｉｎｄｌ１部位）に結合する。アダ
プターは単一断片として調製することができ、又は２以
上の単一鎖を連結することによって調製することができ
る。アダプターが、プロセシングシグナル及び発現され
るべき遺伝子の必要なコドンを再構成する。
制限されて、プロインスリンの完全コート配列及びフラ
ンク配列を有する断片（拍：ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）をも
たらす。足部ＲＩ−肋徂ＲＩ断片を拍」Ｒ■により部分
消化してコード配列の内部を切断することにより、５／
−末端においてコード配列の一部分が欠落した不完全断
片（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）が得られ
る。この塩基対はアダツタ−により与えられ、このアダ
プターは彫副ＲＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片とリーディングフ
レームが適切に一致するようにリーダー及びプロセシン
グシグナル断片（Ｈｉｎｄｌ１部位）に結合する。アダ
プターは単一断片として調製することができ、又は２以
上の単一鎖を連結することによって調製することができ
る。アダプターが、プロセシングシグナル及び発現され
るべき遺伝子の必要なコドンを再構成する。
プロインスリンのｃＤＮＡ遺伝子を含有する断片の他゛
端にはＥｃｏ Ｒ１認識部位が存在する。α−ファクタ
ー遺伝子はｆ−ｍｅｔコドンの第１塩基から５３３番目
の塩基にＳａｌ ｌ制限部位を有する。小型の以遠Ｒ１
−Ｓａｌ ｌアダプターがこの３′−非コード領域にお
いて２個の末端を連結するために機能し、そしてそれ由
に構成にα−ファクター転写ターミネータ−を復原する
ために機能する。
端にはＥｃｏ Ｒ１認識部位が存在する。α−ファクタ
ー遺伝子はｆ−ｍｅｔコドンの第１塩基から５３３番目
の塩基にＳａｌ ｌ制限部位を有する。小型の以遠Ｒ１
−Ｓａｌ ｌアダプターがこの３′−非コード領域にお
いて２個の末端を連結するために機能し、そしてそれ由
に構成にα−ファクター転写ターミネータ−を復原する
ために機能する。
便利には、プロモーターとして、リーダー配列と関連す
るプロモーターを使用することができる。
るプロモーターを使用することができる。
この場合、プロモーター及びリーダー配列の両者を効果
的な転写のために適切である空間的関係において含有す
る５′−ポータプル要素を有ることができる。さらに、
転写ターミネータ−を含めることにより、プロモーター
／リーダー／外来性遺伝子／ターミネータ−から成る「
カセット」を形成することもできる。このことは、酵母
由来の無傷の遺伝子、並びにこの遺伝子の上流及び下流
の転写制御配列を含有するＤＮＡ断片（この遺伝子は酵
母宿主によって分泌されるポリペプチドを発現する）を
分離することによって達成される。このことは、α−フ
ァクターを用いてすでに例示した。
的な転写のために適切である空間的関係において含有す
る５′−ポータプル要素を有ることができる。さらに、
転写ターミネータ−を含めることにより、プロモーター
／リーダー／外来性遺伝子／ターミネータ−から成る「
カセット」を形成することもできる。このことは、酵母
由来の無傷の遺伝子、並びにこの遺伝子の上流及び下流
の転写制御配列を含有するＤＮＡ断片（この遺伝子は酵
母宿主によって分泌されるポリペプチドを発現する）を
分離することによって達成される。このことは、α−フ
ァクターを用いてすでに例示した。
プロインスリンｃ ＤＮＡはそれ自体の終結コドンを有
し、ポリペプチドのＣ−末端が天然のＣ−末端と同一で
あることを保証するであろう。
し、ポリペプチドのＣ−末端が天然のＣ−末端と同一で
あることを保証するであろう。
上記の方法に代えて、天然のプロモーターの代りに転写
制御を可能にする他のプロモーターを使用することがで
きる。このためには、異なるプロモーターを導入するた
めにリーダー配列から上流の領域の配列を決定しそして
／又は制限地図を作成することが必要であろう。ある場
合には、天然のプロモーターを残留せしめ、この天然の
プロモーターの上流又は下流のいずれかに第２のプロモ
ーターを与えることが望ましいであろう。
制御を可能にする他のプロモーターを使用することがで
きる。このためには、異なるプロモーターを導入するた
めにリーダー配列から上流の領域の配列を決定しそして
／又は制限地図を作成することが必要であろう。ある場
合には、天然のプロモーターを残留せしめ、この天然の
プロモーターの上流又は下流のいずれかに第２のプロモ
ーターを与えることが望ましいであろう。
広範囲の種類のプロモーターを使用することができ、又
は酵母遺伝子から得ることができる。特に好ましいプロ
モーターには、解糖経路における酵累と関連するプロモ
ーター４例えばアルコールデヒドロダナーゼ、グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロダナーゼ、ピル
ベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ
、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ
等ためのプロモーターが含まれる。これらのプロモータ
ーを制御配列、例えばオペレーター、レプレッサー及び
デレフレッサーと共に使用することにより、そして無傷
の制御系′ｆｔ有する宿主を使用することによジ、プロ
セシングされた「ブレ」−プロインスリンの発現を制御
することができる。
は酵母遺伝子から得ることができる。特に好ましいプロ
モーターには、解糖経路における酵累と関連するプロモ
ーター４例えばアルコールデヒドロダナーゼ、グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロダナーゼ、ピル
ベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ
、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ
等ためのプロモーターが含まれる。これらのプロモータ
ーを制御配列、例えばオペレーター、レプレッサー及び
デレフレッサーと共に使用することにより、そして無傷
の制御系′ｆｔ有する宿主を使用することによジ、プロ
セシングされた「ブレ」−プロインスリンの発現を制御
することができる。
すなわち、目的ポリペプチドの産生の制御のために棟々
の小有機分子、例えはグルコ−スキ用いることができる
。
の小有機分子、例えはグルコ−スキ用いることができる
。
また、温度を変えることによって転写を調節することを
可能にする温度感受性変異株を使用することもできる。
可能にする温度感受性変異株を使用することもできる。
すなわち、非許容的温度（ＱＱｎｅ−ｐｅｒｍｉｓｓｉ
ｖｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ）において細胞を増殖
せしめることにより細胞を高濃度に増殖せしめ、この後
温度を変えることによりプロセシングされた「２？し」
−プロインスリンを発現せしめる０その他の能力を構成
中に導入することもできる。
ｖｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ）において細胞を増殖
せしめることにより細胞を高濃度に増殖せしめ、この後
温度を変えることによりプロセシングされた「２？し」
−プロインスリンを発現せしめる０その他の能力を構成
中に導入することもできる。
例えば、宿主に対するストレスの際に、増幅されたスト
レスに対して遺伝子のみならず７ランク領域も応答する
場合、遺伝子は増幅をもたらす。このような遺伝子を、
プロモーター及び「ブレ」−プロインスリンの転写制御
をもたらす他の制御遺伝子より上流に導入し、そして酵
母宿主をストレスすることにより、「ブレ」−プロイン
スリン遺伝子をその制御配列と共に含有する数の反復配
列を有するプラスミドが得られる。
レスに対して遺伝子のみならず７ランク領域も応答する
場合、遺伝子は増幅をもたらす。このような遺伝子を、
プロモーター及び「ブレ」−プロインスリンの転写制御
をもたらす他の制御遺伝子より上流に導入し、そして酵
母宿主をストレスすることにより、「ブレ」−プロイン
スリン遺伝子をその制御配列と共に含有する数の反復配
列を有するプラスミドが得られる。
代表的な遺伝子にはメタロチオネイン遺伝子及びジヒド
ロフオレートレダクターゼ遺伝子が含まれる。
ロフオレートレダクターゼ遺伝子が含まれる。
構成はリーダー配列断片のほかに宿主染色体に相同の他
のＤＮＡ ’ｉｉ含有することができる。プロインスリ
ン遺伝子を染色体に組み込むことが望ましい場合には、
プロインスリン遺伝子構成の周縁に位置し宿主染色体Ｄ
ＮＡと相同の配列を用いて組込みを強化することができ
る。
のＤＮＡ ’ｉｉ含有することができる。プロインスリ
ン遺伝子を染色体に組み込むことが望ましい場合には、
プロインスリン遺伝子構成の周縁に位置し宿主染色体Ｄ
ＮＡと相同の配列を用いて組込みを強化することができ
る。
酵母宿主によ！ｌｌ認識される複製系を用いる。従って
、複製系が酵母宿主にとって本来的なものであることが
好ましい。多数の酵母ベクターがＢｏｔａｔｅｉｎ等、
Ｇｅｎｅ（１９７９）旦：１７−２４により報告されて
いる。２μｍグラスミド複製系を含有するＹＥｐプラス
ミドが特に好ましい。これらのシラスミドは多コピー数
において容易に保持される。以上の方法′に代えて、又
はこれに加えて、ＡＲ８Ｉ及び９忍１の組合わせを用い
て安定な保持を得ることができる。
、複製系が酵母宿主にとって本来的なものであることが
好ましい。多数の酵母ベクターがＢｏｔａｔｅｉｎ等、
Ｇｅｎｅ（１９７９）旦：１７−２４により報告されて
いる。２μｍグラスミド複製系を含有するＹＥｐプラス
ミドが特に好ましい。これらのシラスミドは多コピー数
において容易に保持される。以上の方法′に代えて、又
はこれに加えて、ＡＲ８Ｉ及び９忍１の組合わせを用い
て安定な保持を得ることができる。
各操作の後、適当でおれば構成をクローニングして、目
的とする構成を純粋な形でそしてさらに操作するのに十
分な量において得る。好ましくは、原核生物、特に互、
り中でクローニングができるように、シャトルベクター
（すなわち酵母及び細菌の複製開始点を含有するベクタ
ー）を用いる。
的とする構成を純粋な形でそしてさらに操作するのに十
分な量において得る。好ましくは、原核生物、特に互、
り中でクローニングができるように、シャトルベクター
（すなわち酵母及び細菌の複製開始点を含有するベクタ
ー）を用いる。
シラスミドは、酵母細胞又はスフェロプラストを用いそ
して形質転換のためのカルシウム沈澱ＤＮＡを用いる任
意の便利な手段により、又はその他の常用技法により、
酵母に導入することができる。変性された宿主は、発現
グラスミドを構成するためのベクターに通常備なえられ
ている遺伝的マーカーに従って選択することができる。
して形質転換のためのカルシウム沈澱ＤＮＡを用いる任
意の便利な手段により、又はその他の常用技法により、
酵母に導入することができる。変性された宿主は、発現
グラスミドを構成するためのベクターに通常備なえられ
ている遺伝的マーカーに従って選択することができる。
栄養要求宿主を用い、グラスミドはこの宿主を補完（ｃ
ｏｍ−ｐｌｅｍｅｎｔ） Ｌそして原栄養性を付与する
遺伝子を有する。この方法に代えて、適当な殺生物剤、
例えば抗生物質、重金属、毒素又はこれらに類するもの
に対する耐性を、マーカーとしてプラスミドに導入する
ことができる。次に、親細胞をストレスしプラスミドを
含有する細胞を選択する栄養培地を用いることにより選
択を行う。次にプラスミド含有細胞を適当な栄養培地中
に増殖せしめ、そして分泌された目的ポリペプチドを常
法に従って分離する。このポリペプチドをクロマトグラ
フィー、抽出等により精製する。ポリペプチドは培地中
に成熟型として存在するであろうから、目的ポリペプチ
ドを連続的に取り出しながら栄養培地を循環することが
できる。
ｏｍ−ｐｌｅｍｅｎｔ） Ｌそして原栄養性を付与する
遺伝子を有する。この方法に代えて、適当な殺生物剤、
例えば抗生物質、重金属、毒素又はこれらに類するもの
に対する耐性を、マーカーとしてプラスミドに導入する
ことができる。次に、親細胞をストレスしプラスミドを
含有する細胞を選択する栄養培地を用いることにより選
択を行う。次にプラスミド含有細胞を適当な栄養培地中
に増殖せしめ、そして分泌された目的ポリペプチドを常
法に従って分離する。このポリペプチドをクロマトグラ
フィー、抽出等により精製する。ポリペプチドは培地中
に成熟型として存在するであろうから、目的ポリペプチ
ドを連続的に取り出しながら栄養培地を循環することが
できる。
次に、この発明を具体的に説明するために例を記載する
がこれによりこの発明の範囲を限定するものではない。
がこれによりこの発明の範囲を限定するものではない。
ｊｌ（
１、ｐｈｉｎｓ １−１９のＥｃｏＲＩ消化約７００ｐ
！Ｏｐｈｉｎｓ １−１９ （ｐＢＲ３２８の旦輩−Ｒ
１部位においてクローニングされた、児全なヒト−ノロ
インスリン遺伝子を含有する５１７ｂｐのｅＤＮＡ ）
を、約１６００ユニツトの貯Ｒ１にューイングランドビ
オラブス）と共に、１ｍｔ中で１３７℃にて約４．５時
間（完了まで）製造者により指定された緩衝条件下でイ
ンキ−ベートした。
！Ｏｐｈｉｎｓ １−１９ （ｐＢＲ３２８の旦輩−Ｒ
１部位においてクローニングされた、児全なヒト−ノロ
インスリン遺伝子を含有する５１７ｂｐのｅＤＮＡ ）
を、約１６００ユニツトの貯Ｒ１にューイングランドビ
オラブス）と共に、１ｍｔ中で１３７℃にて約４．５時
間（完了まで）製造者により指定された緩衝条件下でイ
ンキ−ベートした。
（ｐｈｉｎｓ １−１９は、Ｂｅ１１等、前記、により
記載されたプラスミドがら、Ｐｓｔｌ開裂、Ｂａ１３１
切断、α」ＲＩリンカ−の付加、及びｐＢＲ３２８への
挿入により誘導される。） 凰並Ｒ１−澹四Ｒ１断片を５チ非変性条件下のポリアク
リルアミドダル電気泳動により分離した。
記載されたプラスミドがら、Ｐｓｔｌ開裂、Ｂａ１３１
切断、α」ＲＩリンカ−の付加、及びｐＢＲ３２８への
挿入により誘導される。） 凰並Ｒ１−澹四Ｒ１断片を５チ非変性条件下のポリアク
リルアミドダル電気泳動により分離した。
ダルを１μ９／ｍｔのエチジウムプロミド溶液中で約１
０分間染色し、そして長波長ＵＶ光のもとて可視化した
。５１７ｂｐ断片に対応するバンドを切り取り、そして
電気溶出［Ｓｍ１ｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
。
０分間染色し、そして長波長ＵＶ光のもとて可視化した
。５１７ｂｐ断片に対応するバンドを切り取り、そして
電気溶出［Ｓｍ１ｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
。
（１９８０）灸５：３７１−３８０）にょクグルから分
離した。ＤＮＡを濃縮し、そしてこれを指定された条件
下でエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ ） −ｄカラムＣ５ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｕｅ１１社）に通す
ことによ！ｌｌ精製した。
離した。ＤＮＡを濃縮し、そしてこれを指定された条件
下でエルチップ（Ｅｌｕｔｉｐ ） −ｄカラムＣ５ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｕｅ１１社）に通す
ことによ！ｌｌ精製した。
２、 ＥｃｏＲＩ［を用いるＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
の ヒα刹Ｒ１−用胆Ｒ１断片（約１７μ９）
を、約３ユニツトのＥｃｏＲｌｌ（ペセスダリザーチラ
ブス）と共に、１７０μ・ｔの容積において、３７℃に
て指定された緩衝条件下でインキュベートした。同量の
アリコートを１８．２１、及び２５分間目に採取した０ ＥｃｏＲＩ［−ＥｃｏＲＩ （長断片）の ３９２ｂｐ
の且要ＲＩＩ−均徂Ｒ１断片を、前記のごトく、ポリア
クリルアミドダル電気泳動、電気溶出、及びエルチップ
−ｄクロマトグラフィーにより分離した。
の ヒα刹Ｒ１−用胆Ｒ１断片（約１７μ９）
を、約３ユニツトのＥｃｏＲｌｌ（ペセスダリザーチラ
ブス）と共に、１７０μ・ｔの容積において、３７℃に
て指定された緩衝条件下でインキュベートした。同量の
アリコートを１８．２１、及び２５分間目に採取した０ ＥｃｏＲＩ［−ＥｃｏＲＩ （長断片）の ３９２ｂｐ
の且要ＲＩＩ−均徂Ｒ１断片を、前記のごトく、ポリア
クリルアミドダル電気泳動、電気溶出、及びエルチップ
−ｄクロマトグラフィーにより分離した。
３、 ＥｃｏＲＩ［−ＥｃｏＲＩ断片と合成断片との
−□インスリンコード領域のほとんどを含有するＥｃｏ
Ｒｌ−ＥｃｏＲｉ部分消化断片を、シリコン加工しり１
．５ ｍｌノエッペンドルフ管中で水を蒸発せしめるこ
とにより乾燥した（８０μ９，０．３５ピコモル）。
−□インスリンコード領域のほとんどを含有するＥｃｏ
Ｒｌ−ＥｃｏＲｉ部分消化断片を、シリコン加工しり１
．５ ｍｌノエッペンドルフ管中で水を蒸発せしめるこ
とにより乾燥した（８０μ９，０．３５ピコモル）。
この訣レッドに、１０ピコモルの５′−燐酸化合成断片
３及び４、並びに２５ピコモルの断片２及び５を加え、
容積を１４μｔとした。断片２〜５は次のＤＮＡ配列（
５′→３′で示す）を有する。
３及び４、並びに２５ピコモルの断片２及び５を加え、
容積を１４μｔとした。断片２〜５は次のＤＮＡ配列（
５′→３′で示す）を有する。
２、 ＡＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣ
３、ＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣ
ＴＣＡＣＡ４、 ＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡ
ＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＣ５、ＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡ
Ｇ これに、５μ９のポリ−Ａ（５μｔ）、 ２５０ｒ＋４
（２） ＥＤＴＡ （１ｆｉｔ ）、２Ｍ酢酸ナトリウ
Ａ（２０μｔ）を加えた。この溶液を６０℃に５分間加
熱することにより残存キナーゼを失活せしめ、そして次
に２５ピコモルの５７−ヒドロキシン合成断片１及び６
を加えた。断片１及び６は次のＤＮＡ配列を有する。
ＴＣＡＣＡ４、 ＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡ
ＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＣ５、ＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡ
Ｇ これに、５μ９のポリ−Ａ（５μｔ）、 ２５０ｒ＋４
（２） ＥＤＴＡ （１ｆｉｔ ）、２Ｍ酢酸ナトリウ
Ａ（２０μｔ）を加えた。この溶液を６０℃に５分間加
熱することにより残存キナーゼを失活せしめ、そして次
に２５ピコモルの５７−ヒドロキシン合成断片１及び６
を加えた。断片１及び６は次のＤＮＡ配列を有する。
１、 ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＴ
６、 ＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＡ
この方法によりコンヵテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ
）の形成が回避される。これらの断片は、酵母α−ファ
クタープロセシングシグナルからゾロインスリン遺伝子
中のＥｃｏＲＩＩ制限部位までのコドンを、ｈｉｓ及び
ｌｅｕのコドンにおいて架橋し、そしてさらにプロイン
スリン遺伝子を含有する断片のＥｃ。
）の形成が回避される。これらの断片は、酵母α−ファ
クタープロセシングシグナルからゾロインスリン遺伝子
中のＥｃｏＲＩＩ制限部位までのコドンを、ｈｉｓ及び
ｌｅｕのコドンにおいて架橋し、そしてさらにプロイン
スリン遺伝子を含有する断片のＥｃ。
ＲＩ制限部位午酵母α−ファクターを含有する断片のと
り■制限部位（ＥｃｏＲｉ部位及び、ＫＬ１部位はいず
れもこれらそれぞれのコード領域より下流にある）とを
架橋するアダプターとなる。
り■制限部位（ＥｃｏＲｉ部位及び、ＫＬ１部位はいず
れもこれらそれぞれのコード領域より下流にある）とを
架橋するアダプターとなる。
この混合物を攪拌し、２００μｔの９５％エタノールを
加え、そしてチューブを一８０℃にて２０分間保持する
ことによ、Ｑ ＤＮＡを沈澱せしめる。
加え、そしてチューブを一８０℃にて２０分間保持する
ことによ、Ｑ ＤＮＡを沈澱せしめる。
１２．８００Ｇにて１０分間遠心分離した後、溶液をｒ
カントし、冷エタノールで洗浄し、そして蒸発乾燥した
。断片のアニーリングを、１８μＬの水を加え、渦流攪
拌し、９０℃に加熱しそして１時間かけて１４℃に冷却
することによシ達成したＯ全容積２７μｔに５ＱｍＭの
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｔ（ｐＨ７，８）、ｌＱｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、ｌｑ／ｍＡのスノソーミジン、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１或のＡＴＰ （リゼーション緩衝液）
を含有するように溶液を調整した。
カントし、冷エタノールで洗浄し、そして蒸発乾燥した
。断片のアニーリングを、１８μＬの水を加え、渦流攪
拌し、９０℃に加熱しそして１時間かけて１４℃に冷却
することによシ達成したＯ全容積２７μｔに５ＱｍＭの
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｔ（ｐＨ７，８）、ｌＱｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、ｌｑ／ｍＡのスノソーミジン、１０ｍＭジチオ
スレイトール、１或のＡＴＰ （リゼーション緩衝液）
を含有するように溶液を調整した。
６ワイス（Ｗｅｉａｓ）−＋−ニットのＴ ４ ＤＮＡ
リガーゼ（３μｔ）を加えることにより連結反応（ｌｉ
ｇａｔｔｏｎ）を開始した。１４℃にて２時装置いた後
、予想される４４３ｂｐのＨｉｎｄ ｍ −Ｓａｌ Ｉ
断片を、非変性条件下の７％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。エチジウムプロミド（０，５μ
ｇ／ｍｌ−”）で染色することによジノ々ンドを可視化
し、切υ取り、そして電気溶出した。バッグの内容物を
取り出し、５μｇのポリ−Ａを加え、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱し、そして乾燥した。断片’ｋＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（３ユニツト）ヲ用い、３７℃にて１時間
合計２０μｔのリゼーション緩衝液中で、５′−燐酸化
した。
リガーゼ（３μｔ）を加えることにより連結反応（ｌｉ
ｇａｔｔｏｎ）を開始した。１４℃にて２時装置いた後
、予想される４４３ｂｐのＨｉｎｄ ｍ −Ｓａｌ Ｉ
断片を、非変性条件下の７％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した。エチジウムプロミド（０，５μ
ｇ／ｍｌ−”）で染色することによジノ々ンドを可視化
し、切υ取り、そして電気溶出した。バッグの内容物を
取り出し、５μｇのポリ−Ａを加え、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱し、そして乾燥した。断片’ｋＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（３ユニツト）ヲ用い、３７℃にて１時間
合計２０μｔのリゼーション緩衝液中で、５′−燐酸化
した。
ｐＡＢ １１３は、ＨｉｎｄｌＩ［及びＳａｌ １部位
が除去されているｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位におい
てクローニングされた酵母α−ファクター遺伝子を含有
する１、８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を含んで成るプラス
ミドである。ｐＡＢ １１３はプラスミドｐＡＢ１０１
から誘導され、このものは、シラスミドＹＥ ｐ ２４
のＢａｍＨ１部位においてクローニングされた部分５ａ
ｕ３Ａ断片としてα−ファクター遺伝子を含有する。
が除去されているｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位におい
てクローニングされた酵母α−ファクター遺伝子を含有
する１、８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を含んで成るプラス
ミドである。ｐＡＢ １１３はプラスミドｐＡＢ１０１
から誘導され、このものは、シラスミドＹＥ ｐ ２４
のＢａｍＨ１部位においてクローニングされた部分５ａ
ｕ３Ａ断片としてα−ファクター遺伝子を含有する。
ｐＡＢ １０１は、ＹＥｐ２４中にクローニングされた
酵母遺伝子ライブラリーを、公表されているα−７アク
ターコード領域（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｇｋｏｗｉｔ
ｚ。
酵母遺伝子ライブラリーを、公表されているα−７アク
ターコード領域（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｇｋｏｗｉｔ
ｚ。
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １９８１ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ 、Ｍｅｅｔｉｎｇｏｎ ｔｈｅ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｌｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔ
ｓ、 ２４２頁）と相同の合成オリゴヌクレオチドグロ
ーブを用いてスクリーニングすることにより得られる◇
ｐＡＢ １１３をエンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｎ［及び
坦■によシ完全消化した。
ｇ Ｈａｒｂｏｒ 、Ｍｅｅｔｉｎｇｏｎ ｔｈｅ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｌｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔ
ｓ、 ２４２頁）と相同の合成オリゴヌクレオチドグロ
ーブを用いてスクリーニングすることにより得られる◇
ｐＡＢ １１３をエンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｎ［及び
坦■によシ完全消化した。
前記のようにして調製した連結生成物を含有するサンプ
ルを６０℃に加熱し、そして１００ｎＨの消化されたｐ
ＡＢ １１３を加えた。この溶液を、１５分間かけて１
４℃に冷却し、２ワイスユニツトのＴ４ リガーゼを
加え、そして１４℃にて２時間連結を行った。
ルを６０℃に加熱し、そして１００ｎＨの消化されたｐ
ＡＢ １１３を加えた。この溶液を、１５分間かけて１
４℃に冷却し、２ワイスユニツトのＴ４ リガーゼを
加え、そして１４℃にて２時間連結を行った。
エタノール沈澱の後、ベレットを７５ｍＭのＣａｃｔ２
に入れ、そしてこれを用いてコンピテントＥ、コリＨＢ
１０１細胞を形質転換した。
に入れ、そしてこれを用いてコンピテントＥ、コリＨＢ
１０１細胞を形質転換した。
８個の形質転換体を得、これらの各々からプラスミドＤ
ＮＡを抽出した（： Ｂｉｒｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ 、
Ｊ。
ＮＡを抽出した（： Ｂｉｒｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ 、
Ｊ。
Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ （１９７９）７ ：１５
１３）。組換プラスミドをＰｓｔｌ及びＳａｌ ｌによ
り消化し、そしてα−７アクターープロインスリン挿入
部に特異的な３１９．２０７．７９．４８．３１、及び
２７ｂｐの予想される断片の収得を電気泳動的に試験し
た。８個の形質転換体の内、ｐｙｉｎｓ −Ｌ ２、
−３、−４、−５と標示する５個の形質転換体がα−７
アクターーノロインスリン挿入部を含有していた。陽性
形質転換体の各々について１ｔの培養物からプラスミド
ＤＮＡを調製した。
１３）。組換プラスミドをＰｓｔｌ及びＳａｌ ｌによ
り消化し、そしてα−７アクターープロインスリン挿入
部に特異的な３１９．２０７．７９．４８．３１、及び
２７ｂｐの予想される断片の収得を電気泳動的に試験し
た。８個の形質転換体の内、ｐｙｉｎｓ −Ｌ ２、
−３、−４、−５と標示する５個の形質転換体がα−７
アクターーノロインスリン挿入部を含有していた。陽性
形質転換体の各々について１ｔの培養物からプラスミド
ＤＮＡを調製した。
５、 ｐｙｉｎｓ−１、−２、−３、−４、−５のＥ
ｃｏＲｉ逍化 各形質転換体からのプラスミドＤＮＡ （１００μｇ）
を、２４０ユニツトの均独Ｒ１（ＢＲＬ）と共に４時間
２００μｔの容積において指定された緩衝条件のもとて
インキ−ベートした。
ｃｏＲｉ逍化 各形質転換体からのプラスミドＤＮＡ （１００μｇ）
を、２４０ユニツトの均独Ｒ１（ＢＲＬ）と共に４時間
２００μｔの容積において指定された緩衝条件のもとて
インキ−ベートした。
ＥｃｏＲＩ −ＥｃｏＲＩ断の ・
２０５６ ｂｐ以ココＲ１均１Ｒ■断片を５チポリアク
リルアミド電気泳動により分離した（この方法に代えて
アガロースを使用することもできる）。
リルアミド電気泳動により分離した（この方法に代えて
アガロースを使用することもできる）。
グルをエチジクムプロミドで染色し、そして予想される
ＵＶ−可視化バンドを切り出した。ＤＮＡを、前記のご
とく、電気溶出によ９分離し、そしてクロマトグラフィ
ーにより精製した。
ＵＶ−可視化バンドを切り出した。ＤＮＡを、前記のご
とく、電気溶出によ９分離し、そしてクロマトグラフィ
ーにより精製した。
各［ｐｙｉｎＪクローン（約４μｇ）を、次のＤＮＡ配
列を有する５′−燐酸化旦！Ｊ ＲＩ −ＪＬａｕＨＩ
アダプター１．０Ｂｇと共に、２０００ユニツトのＴ４
ＤＮＡリガーゼにューイングランドビオラブス）の存
在下でインキュベートした。
列を有する５′−燐酸化旦！Ｊ ＲＩ −ＪＬａｕＨＩ
アダプター１．０Ｂｇと共に、２０００ユニツトのＴ４
ＤＮＡリガーゼにューイングランドビオラブス）の存
在下でインキュベートした。
５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＧＧ−３’ ；及び、５
′−ＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＧ−３’反応は、９００μ
ｔの指定された緩衝液中で１８℃にて２．５時間行った
。サンプルを６５℃に１０分間加熱し、フェノール抽出
し、そして２５０μｔの指定さｈた緩衝液中で３７℃に
て４時間、１００ユニ、トのＢａｍＨＩ （ＢＲＬ ）
を用いて消化した。
′−ＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＧＧ−３’反応は、９００μ
ｔの指定された緩衝液中で１８℃にて２．５時間行った
。サンプルを６５℃に１０分間加熱し、フェノール抽出
し、そして２５０μｔの指定さｈた緩衝液中で３７℃に
て４時間、１００ユニ、トのＢａｍＨＩ （ＢＲＬ ）
を用いて消化した。
ル狸ＨＩ−−四Ｈ１α−７アクタ一−プロインスリン断
片を、上記のようにして、１チアガロースグル電気泳動
、電気溶出及びこれに続くカラムクロマトグラフィーに
より精製した＠ −７、ｐｃ１／１のＢａｍＨ１部
位へのＢａｍＨｌ−ＢａｍＨ■断片の連結 ｐｙｉｍｓ −１のＢａｍＨｌ −ＢａｍＨｌ断片０．
７μｇ及び他のｐｙｉｎ＋ｓからの同様の断片０．４μ
ｇを、一定量の拠Ｈ■消化ｐｃ１／１と連結し、この場
合のモル比を断片１０：ベクター１とした。〔プラスミ
ドｐｃ１／１はｐＪＤＢ ２１９ （Ｂｅｇｇｇ、Ｎａ
ｔｕｒｅ、１９７８ 。
片を、上記のようにして、１チアガロースグル電気泳動
、電気溶出及びこれに続くカラムクロマトグラフィーに
より精製した＠ −７、ｐｃ１／１のＢａｍＨ１部
位へのＢａｍＨｌ−ＢａｍＨ■断片の連結 ｐｙｉｍｓ −１のＢａｍＨｌ −ＢａｍＨｌ断片０．
７μｇ及び他のｐｙｉｎ＋ｓからの同様の断片０．４μ
ｇを、一定量の拠Ｈ■消化ｐｃ１／１と連結し、この場
合のモル比を断片１０：ベクター１とした。〔プラスミ
ドｐｃ１／１はｐＪＤＢ ２１９ （Ｂｅｇｇｇ、Ｎａ
ｔｕｒｅ、１９７８ 。
翻’５：１０４）の誘導体であムｐＪＢＢ ２１９中の
細菌シラスミドｐＭＢ９に対応する領域はｐｃｌ／ｌ中
でｐＢＲ３２２により置換されている。ｐ Ｃ１／Ｉ
Ｕ完全な２μｍ複製因子、酵母以狙ユ遺伝子及び完全な
ｐＢＲ３２２を含有している。〕すべての連結反応は、
５ ｐｇ／ｍＡのＤＮＡ濃度及び８００ユニツトのＴ４
リガーゼにューイングランドビオラブス）を用いて２１
℃にて２．５時間行った。
細菌シラスミドｐＭＢ９に対応する領域はｐｃｌ／ｌ中
でｐＢＲ３２２により置換されている。ｐ Ｃ１／Ｉ
Ｕ完全な２μｍ複製因子、酵母以狙ユ遺伝子及び完全な
ｐＢＲ３２２を含有している。〕すべての連結反応は、
５ ｐｇ／ｍＡのＤＮＡ濃度及び８００ユニツトのＴ４
リガーゼにューイングランドビオラブス）を用いて２１
℃にて２．５時間行った。
エタノール沈澱の後、ＤＮＡを７５ｍＭのＣａＣｔ２１
００μｔに再懸濁し、そしてこれを用いて且、ヨＨＢ
１０１細胞を形質転換した。
００μｔに再懸濁し、そしてこれを用いて且、ヨＨＢ
１０１細胞を形質転換した。
各「ｐｙｉｎＪのクローンについて数百側ずつの形質転
換体を得た。５種類の「ｐｙｉｎｓＪクローンのそれぞ
れに由来する４個ずつの形質転換体を、プラスミドＤＮ
Ａ ｅ抽出し、これをＰ８ｔＩにューイングランドビオ
ラブス）により消化することによｐ試験した。このＰｓ
ｔＩは、挿、入部の存在下で・２０７．４８、及び２７
ｂｐの特異的な断片を生じさせるものと予想される。試
験した２０個の形質転換体の内の１４個がα−ファクタ
ー−プロインスリン挿入部を含有していることが見出さ
れたＯこれらの形質転換体にもとの［ｐｙｉｎｓ ｊク
ローンの各々を代表している。もとのｒｐｙｉｎａＪｐ
ローンの各々に由来する形質転換体からプラスミド標品
を調製した。
換体を得た。５種類の「ｐｙｉｎｓＪクローンのそれぞ
れに由来する４個ずつの形質転換体を、プラスミドＤＮ
Ａ ｅ抽出し、これをＰ８ｔＩにューイングランドビオ
ラブス）により消化することによｐ試験した。このＰｓ
ｔＩは、挿、入部の存在下で・２０７．４８、及び２７
ｂｐの特異的な断片を生じさせるものと予想される。試
験した２０個の形質転換体の内の１４個がα−ファクタ
ー−プロインスリン挿入部を含有していることが見出さ
れたＯこれらの形質転換体にもとの［ｐｙｉｎｓ ｊク
ローンの各々を代表している。もとのｒｐｙｉｎａＪｐ
ローンの各々に由来する形質転換体からプラスミド標品
を調製した。
このテラスミドを用いて酵母ΔＢ１０３細胞（α。
県４−３．ｌｅｕ ２−３．ｌｅｕ ２−１１２．ｕｒ
ａ ３−５２．ｈｉｓ４−４卸）を形質転換し、そして
Ｌｅｕ形質転換体を選択した。
ａ ３−５２．ｈｉｓ４−４卸）を形質転換し、そして
Ｌｅｕ形質転換体を選択した。
細 地のインスリンのラジオ ムノア、七を酵母形質
転換体ＡＢ１０３（ｐＹｉｎｓｌ又はｐＹｉｎｓ５）を
、ロイシンを含有しない最少プレート上に「斑点」とし
て増殖せしめた。殺菌したプラスチック製植菌耳を用い
て各床の幾らかを、ロイシンを含有しない最少培地２ｍ
Ｌに植付けた。この培養物及びＡＢ １０３ （ｐｃ１
／１）の対照培養物を飽和状態まで増殖せしめた。ペッ
クマンＪ６Ｂ遠心分離機中で２．５０Ｏｒｐｍで１０分
間遠心分離することにより細胞をペレットにした。上清
清を取り出し、アマージャム製のキットを用いてＲＩＡ
７ツセイした。１．１０、及び１００μｔの上清液を測
定した。
転換体ＡＢ１０３（ｐＹｉｎｓｌ又はｐＹｉｎｓ５）を
、ロイシンを含有しない最少プレート上に「斑点」とし
て増殖せしめた。殺菌したプラスチック製植菌耳を用い
て各床の幾らかを、ロイシンを含有しない最少培地２ｍ
Ｌに植付けた。この培養物及びＡＢ １０３ （ｐｃ１
／１）の対照培養物を飽和状態まで増殖せしめた。ペッ
クマンＪ６Ｂ遠心分離機中で２．５０Ｏｒｐｍで１０分
間遠心分離することにより細胞をペレットにした。上清
清を取り出し、アマージャム製のキットを用いてＲＩＡ
７ツセイした。１．１０、及び１００μｔの上清液を測
定した。
ｐＹｉｎｓ５−２Ｂ １６
ｐＹｉｎｓ５−３Ａ １３
ｐＹｉｎｓ５−３Ｂ ３３２
ｐＣ１／１ ０ｐＹｉｎｇｌ−４Ａ
６０ｐＹｉｎｓ５−２Ｂ
３２ｐＹ１ｎｓ５−３Ｂ ２２ｐＹｉ
ｎｓ７−ＩＡ １５ｐＹｉｎｓ７−２Ａ
４６ｐＹｉｎｓ８−４ ４
８ 脂肪形成バイオアツセイ（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｂｉｏａ−ｓｓａｙ）〔Ｍｏｏｄｙ等、Ｈｏｒｍ、Ｍｅ
ｔａｂ、Ｒｅａ、（１９７４）旦：１２−１６）におい
て、１μｇのサンプルは２７−のインスリン活性を示し
た。サンプルはプラスミドｐＹｉｎｓｌ−４Ａから次の
ようにして得た。この特徴付けのために酵母培養物を遠
心分離して細胞を除去し、そして上清液を酢酸によりｐ
Ｈ３に酸性化した。この材料を、ビオレックス（Ｂｉｏ
ｒｅｘ）−７０に吸着し、カラムを０．ＩＮ酢酸及び５
０チエタノールで洗浄し、そして８０チ工タノール中１
０ｍＭＨＣ７で溶出することにより精製した。溶出物を
ロータリーエバポレーターにより乾燥し、そして少ｔ。
ｐＣ１／１ ０ｐＹｉｎｇｌ−４Ａ
６０ｐＹｉｎｓ５−２Ｂ
３２ｐＹ１ｎｓ５−３Ｂ ２２ｐＹｉ
ｎｓ７−ＩＡ １５ｐＹｉｎｓ７−２Ａ
４６ｐＹｉｎｓ８−４ ４
８ 脂肪形成バイオアツセイ（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｂｉｏａ−ｓｓａｙ）〔Ｍｏｏｄｙ等、Ｈｏｒｍ、Ｍｅ
ｔａｂ、Ｒｅａ、（１９７４）旦：１２−１６）におい
て、１μｇのサンプルは２７−のインスリン活性を示し
た。サンプルはプラスミドｐＹｉｎｓｌ−４Ａから次の
ようにして得た。この特徴付けのために酵母培養物を遠
心分離して細胞を除去し、そして上清液を酢酸によりｐ
Ｈ３に酸性化した。この材料を、ビオレックス（Ｂｉｏ
ｒｅｘ）−７０に吸着し、カラムを０．ＩＮ酢酸及び５
０チエタノールで洗浄し、そして８０チ工タノール中１
０ｍＭＨＣ７で溶出することにより精製した。溶出物を
ロータリーエバポレーターにより乾燥し、そして少ｔ。
水に入れた。上記の結果はインスリン活性ベゾチドの存
在を示す。
在を示す。
この発明に従えば、新規な構成が提供され、この構成は
ベクターに挿入され、「プレ」−ゾロインスリンの発現
、プロセシング及び分泌がもたらされる。こうして、天
然のヒト−インスリンと同一の配列を有するポリペプチ
ドが得られる。分泌により細胞数に対する収量が非常に
増加し、その後の調製操作及び精製が非常に単純化され
る。
ベクターに挿入され、「プレ」−ゾロインスリンの発現
、プロセシング及び分泌がもたらされる。こうして、天
然のヒト−インスリンと同一の配列を有するポリペプチ
ドが得られる。分泌により細胞数に対する収量が非常に
増加し、その後の調製操作及び精製が非常に単純化され
る。
以上、この発明を説明及び例によｐいく分詳細に記載し
たが、これは理解を明確にするためのものであυ、この
発明の範囲内において幾つかの変更及び変法を行うこと
ができることに言うまでもない。
たが、これは理解を明確にするためのものであυ、この
発明の範囲内において幾つかの変更及び変法を行うこと
ができることに言うまでもない。
なお、細胞系ｐＹｉｎａｌは、１９８３年４月６日、Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ Ａ ２０６７０としてＡ、Ｔ、Ｃ，
Ｃ，に寄託された。
ｃｃｅｓｓｉｏｎ Ａ ２０６７０としてＡ、Ｔ、Ｃ，
Ｃ，に寄託された。
以下余白
第１頁の続き
０発 明 者 パブ口・ディー・ティー・バレンズエラ
アメリカ合衆国カリフォルニア
・サンフランシスコ・アバーテ
ラス４５５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、「プレ」−プロインスリンを酵母において発現せし
め、この「プレ」−ゾロインスリンのプロセシング及び
分節を供する改良された方法（ここで、「プレ」とは酵
母分泌及びプロセシングシグナルの存在を意図する）で
ｈ−ｚて；プロインスリンについてコードする第１のＤ
ＮＡ配列を含有し、そしてこのＤＮＡ配列の第１塩基に
又はその下流にコード鎖の５′−末端を有する第１のＤ
ＮＡ断片を調製し； 酵母−認識分泌及びプロセシングシグナルについてコー
ドする第２のＤＮＡ配列を含有し、そしてこのプロセシ
ングシグナルの末端塩基又はその上流にコード鎖の３′
−末端を有する第２のＤＮＡ断片を調製しくここで、前
記の第１の断片及び第２の断片の少なくとも一方はその
末端をコード配列の内部に有する）； 前゛記第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片を、この
第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片の欠損した・塩
基対についてコードするアダプタ下により連結□しくこ
こで、前記第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片は同
一のリーディングフレーム中にあって「フレ」−プロイ
ンスリン遺伝子を供する）；そして、 前記「プレ」−プロインスリン遺伝子を酵母中の発現ベ
クター中でクローニングする（これにより、前記「プレ
」−ゾロインスリンが分泌され、そしてプロセシングさ
れル）； ことを含んで成る方法。 ２、前記分泌及びプロセシングシグナルが酵母α−ファ
クターシグナル又はその部分である特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ３、 プロセシングされた「フレ」−ゾロインスリン
の改良された製造方法であって； ヒトインスリンｃ ＤＮＡ断片を、発現プラスミド中分
泌及びプロセシングシグナルから下流に、この分泌及び
プロセシングシグナルとリーディングフレームが一致す
るように、ｃＤＮＡのコード領域の５７−塩基対の少な
くとも１部分を含有しそしてこのｃＤＮＡ断片に相補的
な末端を有するアダプターを用いて挿入しくここで、前
記ｃ ＤＮＡ断片は、前記アダプターに相補的な末端を
供するように前記ｃＤＮＡのコード鎖の５′−末端の近
くで制限されており、こうして前記発現プラスミド中で
前記分泌配列及びプロセシングシグナルのＤＮＡ配列と
リーディングフレームが一致する完全なプロインスリン
遺伝子が得られる）； 前記発現プラスミドを酵母宿主に導入し、モしてこの酵
母宿主を増殖せしめ、こうして「プレ」−プロインスリ
ンを産生及びプロセシングせしめ；そして、 前記プロセシングされた「プレ」−プロインスリンを栄
養培地から分離する； ごとを含んで成る方法。 ４、アダプタ、−が、Ｎ−末端のｐｈｅコドンの少なく
とも一部分と関連する塩基対を含有しそして第１のｈｉ
ａコドンの少なくとも一部分にまで延びている特許請求
の範囲第３項記載の方法。 ５、前記分泌及びプロセシングシグナルがα−ファクタ
ー分泌及びプロセシングシグナルでおる特許請求の範囲
第４項記載の方法。 ６、前記アダプターが前記α−ファクターのプロセシン
グシグナル中のＨｉｎｄｎ［制限部位から前記ｈｉｓコ
ドンの前記部分まで延びている特許請求の範囲第５項記
載の方法。 ７、前記ベクターが酵母によって認識される複製系を含
有する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記発現ベクターが旦・ヨにより認識される複製系
を含有する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、前記酵母複製系が２μｍシラスミド又はその部分を
含んで成る特許請求の範囲第７項記載の方法０ １０、酵母−認識ＤＮＡ分泌及びプロセシングシグナル
と、プロインスリンについてコードするコード配列であ
って前記の分泌及びグロセミングシグナルとリーディン
グフレームが一致しているものと金含んで成るＤＮＡ構
成。 １１、酵母により認識される複製系を含有する特許請求
の範囲第１０項記載のＤＮＡ構成。 １２、前記コード配列の少なくとも一部分が、酵母によ
って優先的に利用されそしてヒトのコドンとは異るコド
ンを有する特許請求の範囲第１１項記載の構成。 １３、前記分泌及びプロセシングシグナルがα−ファク
ター分泌及びプロセシングシグナル又はその部分である
特許請求の範囲第１１項記載の構成。 １４、前記構成が旦、牡により認識される複製系を含有
する特許請求の範囲第１３項記載の構成。 １５、前記酵母複製系が２μｍシラスミド又はその部分
を含んで成る特許請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ構成
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48302383A | 1983-04-07 | 1983-04-07 | |
| US483023 | 1983-04-07 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6185950A Division JP2511251B2 (ja) | 1983-04-07 | 1994-08-08 | 成熟インスリンの生産のための遺伝子系 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59196093A true JPS59196093A (ja) | 1984-11-07 |
| JP2512416B2 JP2512416B2 (ja) | 1996-07-03 |
Family
ID=23918330
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59054554A Expired - Lifetime JP2512416B2 (ja) | 1983-04-07 | 1984-03-23 | インスリンの発現方法 |
| JP6185950A Expired - Lifetime JP2511251B2 (ja) | 1983-04-07 | 1994-08-08 | 成熟インスリンの生産のための遺伝子系 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6185950A Expired - Lifetime JP2511251B2 (ja) | 1983-04-07 | 1994-08-08 | 成熟インスリンの生産のための遺伝子系 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0121884B1 (ja) |
| JP (2) | JP2512416B2 (ja) |
| AT (1) | ATE71661T1 (ja) |
| CA (1) | CA1341372C (ja) |
| DE (1) | DE3485444D1 (ja) |
| DK (1) | DK172738B1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986003779A1 (en) * | 1984-12-21 | 1986-07-03 | Earth Chemical Company, Limited | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms |
| JPS61221200A (ja) * | 1985-03-22 | 1986-10-01 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | インシュリンの製造方法 |
| JPS61271988A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Agency Of Ind Science & Technol | プラスミド |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| EP0170266B1 (en) * | 1984-07-30 | 1993-03-24 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for producing protein, and vector, recombinant dna and transformant used therefor |
| DE3685985T2 (de) * | 1985-04-09 | 1992-12-17 | Collaborative Res Inc | Mutanten von saccharomyces cerevisiae mit stark vermehrter sekretion. |
| RU2091490C1 (ru) * | 1985-10-25 | 1997-09-27 | Зимодженетикс, Инк. | Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов |
| US5024941A (en) * | 1985-12-18 | 1991-06-18 | Biotechnica International, Inc. | Expression and secretion vector for yeast containing a glucoamylase signal sequence |
| US5037743A (en) * | 1988-08-05 | 1991-08-06 | Zymogenetics, Inc. | BAR1 secretion signal |
| DE4336810A1 (de) * | 1993-10-28 | 1995-05-18 | Basf Ag | Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen in Hefe |
| US6142857A (en) * | 1998-01-06 | 2000-11-07 | Speedfam-Ipec Corporation | Wafer polishing with improved backing arrangement |
| JPH11300608A (ja) * | 1998-04-20 | 1999-11-02 | Nec Corp | 化学機械研磨装置 |
| CA2471363C (en) | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
-
1984
- 1984-02-23 DK DK198400927A patent/DK172738B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-02-29 CA CA000448492A patent/CA1341372C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-03-23 JP JP59054554A patent/JP2512416B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-02 AT AT84103611T patent/ATE71661T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-02 EP EP84103611A patent/EP0121884B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-02 DE DE8484103611T patent/DE3485444D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-08-08 JP JP6185950A patent/JP2511251B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986003779A1 (en) * | 1984-12-21 | 1986-07-03 | Earth Chemical Company, Limited | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms |
| JPS61221200A (ja) * | 1985-03-22 | 1986-10-01 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | インシュリンの製造方法 |
| JPS61271988A (ja) * | 1985-05-27 | 1986-12-02 | Agency Of Ind Science & Technol | プラスミド |
| JPH0256076B2 (ja) * | 1985-05-27 | 1990-11-29 | Kogyo Gijutsuin |
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|---|---|
| DK172738B1 (da) | 1999-06-21 |
| EP0121884A3 (en) | 1987-01-14 |
| EP0121884B1 (en) | 1992-01-15 |
| EP0121884A2 (en) | 1984-10-17 |
| CA1341372C (en) | 2002-07-02 |
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| DE3485444D1 (de) | 1992-02-27 |
| JP2511251B2 (ja) | 1996-06-26 |
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| DK92784D0 (da) | 1984-02-23 |
| ATE71661T1 (de) | 1992-02-15 |
| DK92784A (da) | 1984-10-08 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |