KR890005068B1 - 인체인슐린-유사생장인자의 제조방법 - Google Patents

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Description

인체인슐린-유사생장인자의 제조방법

본 발명은 인체인슐린-유사생장인자(IGF)의 효과적인 합성방법 및 조성물에 관한 것이다.

생체내에서 생장호르몬의 투여에 따른체세포생장은 유사분열물질인 인슐린 유사 펩티드군에 의해 유도되며 이 펩티드의 혈청농도는 생장호르몬에 의존한다고 여겨지고 있다. 이들 폴리펩티드는 소마토메딘(somatomedin)-C, 소마토메틴-A, 및 인슐린-유사생장인자 I 및 II(IGF I 및 IGF II)를 포함한다. IGF I 및 IGF II는 인체의 혈청에서 분리될 수 있으며 이것의 아미노산 서열은 대체로 인슐린의 아미노산 서열과 일치한다. 현재 이들 생장인자의 극소량만이 인체 혈청으로부터 분리되어 얻을 수 있다. 그러므로, DNA재조합 방법에 의해 생장인자를 비교적 대량으로 생산할 수 있다는 것은 과학적 및 임상적으로 대단히 흥미있는 것이다.

인체인슐린-유사생장인자 I 및 II(IGF I 및 II)의 아미노산 서열은 Rinderknecht & Humbel(1978) J. Biol. Chem. 253 : 2769-2776 및 Rinderknecht & Humbel(1978) FEBS Letters 89 : 283-286에 의해 각각 처음으로 결정되었다. IGF 수용체의 본체는 Massague 및 Czecn(1982) H. Biol. Chem. 257 : 5038-5045에 설명되어 있다. Kurjan 및 HerskowitzCell(1982)30: 933-934는 4개의 성숙한 α-인자텐덤(tandem)복사체를 함유하는 추정 α-인자전구체와 그서열을 설명하고 처리기작(processing mechanism)에 대해 추정했다. 효모의 분자 생물학에 관한 1981ColdSpring Harbor 회의에 제출한 Kurjan 및 Herskowitz의 "성숙한α-인자의 4개 템담 반복체를 함유하는 추저α-인자전구체"표제의 논문은 P242의 적요에서α-인자를 α-인자를 암호하는 서열 및 이 두 서열 사이의 간극을 암호하는 서열을 설명하고 있다.

본 발명은 성숙된 인체인슐린-유사생성인자(IGF)의 효과적인 제조방법 및 조성물을 제공한다. 특히 효모숙주에서 "전구"-IGF I 및 "전구"-IGF II의 발현은 이 폴리펩티드가 영양배지로 분비되는 것을 촉진시킨다. DNA구조물은 천연 및 합성공급원을 포함한 다방면에서 얻어진 DNA서열을 결합시켜 생성된다. 생성된 DNA구조물은 효모내에서 안정하게 복제되며, 영양배지에서 고수득율로 분리할 수 있는 처리된 "전구"-폴리펩티드의 효과적이며 고수준의 생산을 제공한다.

본 발명은 인체슐린 유사생장인자(IGF I 및 II)를 발현할 수 있는 DNA서열을 제공한다. 이들 DNA서열을 벡터(Vector) 내로 삽입시킬 수 있으며, 그 결과 생성된 플라스미드는 민감성 숙주를 형질전환 시키는 데 사용된다. 민감성 숙주를 상기 재조합 플라스미드로 형질전환 시킴으로써 인슐린 유사생장인자 유전자가 발현되고 폴리펩티드가 생성된다.

특히, 신규 DNA구조물은 폴리펩티드 전구체를 처리(processing)하여 성숙된 폴리펩티드 생성물을 영양배지에 분배할 수 있는 효모숙주에서 상기 폴리펩티드 전구체("전구"-IGF 및 "전구"-IGF II)를 생성하는 데 제공된다. DNA 구조물은 효모숙주에서 안정하게 유지될 수 있는 복제 시스템, 효과적인 프로모터(Promoter), 리딩프레임(reading frame) 내에 리더(leader) 및 처리시그날(Singnal)을 포함하고 있는 구조 유전자, 및 구조유전자 하부에 전사 터미네이터(terminator) 서열을 포함한다. 임의로, 다른 유전자 서열이 전사조절, 유전자의 증가, 외인성 전자조절을 위해 제공될 수 있다. "전구"-IGF I 및 "전구"-IGF II는 성숙 폴리펩티드를 암호한 DNA서열이 리딩프레임에서 효모숙주에 의해 쉽게 인지되는 처리시그날(Signal)을 포함하여 리더(leader)서열과 결합되어 있는 상태를 의미한다. 그러므로, "전구"-는 효모숙주의 관련된 분비 및 처리시그날을 포함하고 있는 상태를 의미하는 것이지 목적 폴리펩티드를 암호하는 유전자와 관련된 처리시그날(Signal)을 의미하지 않는다.

DNA구조물 제조에 있어서, 복제 시스템, 프로모터(promoter), 리더(leader) 및 처리시그날(Signal)을 포함한 구조유전 및 터미네이터(terminator)는 얻어진 플라즈미드내에서 적절히기능할 수있도록 미리 결정된 순서대로 함께 배열될 필요가 있다. 하기에 기술된 바와같이, 어댑터(adaptor)분자는 서열의 방향 및 순서를 적절하게 하기위해 사용될 수 있다.

사용되는 IGF I 및 IGF II유전자는 염색체DNA, cDNA, 합성DNA, 또는 이것들의 조합체일 수 있다. 리더(leader) 및 처리시그날(Signal)은 폴리펩티드를 분비하는 효모에서 천연적으로 생성된 DNA 서열로부터 정상적으로 유도 해낼 수 있다. 효모에 의해 분비되는 폴리펩티드는

-인자-

-인자, 산성 인산효소들을 포함한다. 복제시스템, 프로모터(promoter) 및 터미네이터(terminator)를 가지는 구조물을 포함하는 보존서열은 공지되어 있으며 문헌에 기술되어 있다.

본 발명의 DNA구조물을 제조하기 위해 결합하는 여러가지 DNA서열은 여러 공급원에서 유도된 것이기 때문에, 연결 또는 어댑터(adaptor)분자를 경유하여 이 서열들을 결합시키는 것이 수월할 것이다. 특히, 어댑터는 리더 및 처리시그날 서열을 암호하는 사상체(strand)의 3'-말단을 이것의 각각의 상보 DNA사상체와 함께 IGF암호 사상체의 5'-말단에 연결시키는 데 바람직하게 이용될 수 있다.

리더 및 처리시그날 서열은 내부적으로 3'-말단근처로 제한되므로 암호부위의 예정된 수의 염기쌍이 결손된다. 그러므로, 리더 및 처리시그날 서열이 IGF암호사상체에 결합될 때 소실염기쌍을 제공하며, IGF암호사상체가 리더서열에 대해 적절한 리딩프레임 내에 위치하도록 어댑터를 제조할 수 있다. 합성 IGF암호부위 및/또는 어댑터의 3'-말단에 폴리펩티드의 C-말단이 천연적으로 생성되는 C-말단과 동일하도록 번역 종료코돈을 제공한다.

어댑터는 암호서열내에 약 5 내지 40개의 염기를 가지는 데, 통상적으로 약 8 내지 35개의 염기를 가지며, 결합성(cohesive) 또는 블런트(blunt)말단을 가질수 있는데, 결합성말단이 바람직하다. 바람직한 것은 어댑터의 말단이 많은 제한효소와 관련된 결합말단을 가짐으로써 어댑터가 적절한 상보 결합 말단을 가지는 두 개의 상이한 DNA서열을 선택적으로 연결시키는 역할을 할수 있도록 하는 것이다.

본 발명은 효모의

-인자의 리더 및 처리시그날에 결합된 IGF I 및 IGF II를 암호하는 합성분체들을 예시할 것이다. 효모의

-인자는Hind III및Sal I으로 절단될 수 있다.Hind III는

-인자전구체의 처리스그날(Signal) 내에서 절단을 유발하고 glu코돈의 암호사상에서 두번째 염기에 대하여 3'쪽을 절단하는 반면,Hind III인식서열은 glu코돈을 완성시키고 ala를 암호하며 성숙한

-인자의 아미노종단부 trp코돈의 첫번째 5'염기를 제공한다.

-인자유전자의 전사의 방향과 관련하여,Sal I부위가 전사 터미네이터(terminator)의 상부에 위치하고 있다. IGF를 암호하는 합성유전자는 IGF I 및 IGF II폴리펩티드의 공지된 아미노산 서열에 근거한 뉴클레오티드 서열을 가질 것이다. 바람직하게는, 합성서열은 효모숙주에 의해 우선적으로 이용되는 코돈을 이용하는데, 예컨대 효모의 당분해 효소를 암호하는 유전자에서 발견되는 코돈의 빈도수에 근거한다. 수월하게, 합성서열은 클로닝운반체(cloning vehicle) 내의 제한부위로의 삽입을 위하여 블런트 말단보다는 결합성말단을 포함할 것이다. 또한 제한부위는 IGF I/IGF II 하이브리드펩티드 분자를 생성할 수 있는 서열내로 어닐링(annealing) 될수 있는 분체를 만들기 위해 잠재성 돌연변이를 이용하여 합성 서열내로 도입될 것이다.

예를 들면, 합성분체는EcoRI에 대한 결합성말단을 가지고 있으며, PBR 328 내의EcoRI 부위에 삽입된다. 통상적으로, 합성서열은 폴리펩티드 암호부위의 각 말단에 인접해 있는 부가적인 제한부위를 포함할 것이다. 상기의 내부 제한 부위는 클로닝운반체(clonging vehicle)로 부터 암호부위를 정확히 절단하여 어댑터(adaptor)에 결합시키기 위해 선택되며, 이렇게 함으로써 리더(leader), 처리스그날(Signal) 및 암호부위를 포함한 최종 DNA구조물이 특정한 리딩프레임(reading freame) 내에 위치하여 터미네이터(terminator)와 적절한병렬이 이루어지도록 한다. 바람직하게, 제한부위는 절단부위에서 파생된 인식서열을 가질 것이며, 상기 절단은 암호부위의 인접한 곳에서 실시되어 인식 부위는 소실된다. 이것은 분열을 뉴클레오티드 서열에 관계없이 암호부위의 각 말단에서 정확하게 일어나게 한다.Hga I부위는 실시예에 나타나 있다. 합성유전자를 제조하는 데 있어서, 중복되는 단일사상체 DNA(SSDNA)분체는 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 상기 SSDNA분체들은 통상적으로 약 10내지 40염기의 길이를 가질것이다. 상당한 긴 분체를 사용할 수 있으나, 합성수득율은 감소되며 적절 서열이 우연히 분해 또는 변화되지 않았다는 것을 보장하기란 더욱 어렵게 된다. SSDNA분체는 합성된 후 적절한 순서를 이루도록 하기위해 어닐링(annealing) 조건하에서 상보염기쌍과 결합된다. 상기 분체의 말단은 결합되고, 생성된 합성 DNA분체는 통상적으로대장균(E.Coli)과 같은 세균숙주에 쿨로닝되고 증식된다. 상기에서 지적한 바와같이, 합성구조 유전자에는 클로닝 운반체(Cloning vehicle)내의 특정제한 부위 및 암호부위의 정확한 절단을 하도록하는 내부인식 부위와 상보관계인 결합성 말단이 제공될 수 있다. 합성서열의 클로닝 및 증식후, 사용량의 서열을 통상적으로 IGF암호부위의 양쪽 말단중 한곳에 있는 내부 제한부위에서 절단시킬 수 있다. 수월하게는, 사용되는 프로모터(promoter)가 리더(leader) 및 처리서열과 결합한 프로모터일 수 있다. 이런 방법으로, 효율적으로 전사되기 위한 적절한 공간배치를 갖고 있는 프로모터 및 리더(leader)서열을 모두 가지는 5'-이동성 유전자가 제공될 수 있다. 또한 전사 터미네이터(terminator)를 포함하므로써, 프로모터(promoter)/리더(leader)-제한부위(들)-터미네이터(terminator)로 구성되는 "카셋트(cassette)"가 탄생되며, 여기에 IGF 암호부위가 어댑터(adaptor)의 도움으로 삽입될 수 있다. 통상적으로, 상기 카세트(cassette)는 효모숙주로 부터의 원래 상태의 유전자 및 그 유전자의 상하부위 전사조절 서열을 포함하는 DNA분체를 분리함으로써 제공될 수 있으며, 이 카셋트의 유전자는 숙주에 의해 분비되는 폴리펩티드를 표현한다.

다른 방법으로, 전사조절을 할 수 있는 다른 프로모터(promoter)로 천연적으로 생성된 효모의 프로모터를 대치할 수 있다. 다른 프로모터를 도입하기 위해서는 리더서열 상부의 서열결정 및/또는 제한부위 지도작성이 필요하다. 어떤 경우에는, 천연적으로 생성된 효모의 프로모터를 그대로 두고 그 프로모터와 일렬 배열된, 상부 또는 하부에 두번째 프로모터를 제공하는 것이 바람직할 수도 있다.

매우 다양한 프로모터가 사용될 수 있거나 또는 효모의 유전자로부터 얻어질 수 있다. 특히 주목되는 프로모터에는 당분해 과정의 효소, 예컨대 알코올 디히드로게나제, 글리세르알테히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 피르베이트키나제, 트리오즈포스페이트 이소메라제, 포스포글루코이소머라제, 포스포프락토키나제등의 효소와 관련된 프로모터가 포함된다. 인헨서(enhancer), 오퍼레이터(operator) 등과 같은 조절서열과 함께 상기 프로모터를 사용하고 또한 완전한 조절시스템을 가진 숙주를 이용함으로써 처리된 "전구"-IGF의 발현을 조절할 수 있다. 그러므로, 포도당과 같은 여러 소 유기분자를 이용하여 목적하는 폴리펩티드의 생산을 조절할 수 있다.

또한 온도를 변화시킴으로써 전사를 조절케할 수 있는 온도-민감성 조절 돌연변이체를 이용할 수 있다. 그러므로 불허용 온도에서 세포를 성장시킴으로써 IGF I 및 IGF II에 대한 "전구"-폴리펩티드를 발현시키기 위해 온도를 변화시키기 전에 세포를 고밀도로 배양시킬 수 있다.

다른 성능들을 구조물에 도입시킬 수 있다. 예로서, 증식은 몇 가지 유전자로써 제공될 수 있는데, 숙주에 자극을 줌으로써 숙주에 대한 자극을 감응하는 유전자와 그 측면부위(flanking regions)유전자가 증폭된다. 프로모터, 암호부위 및 "전구"-폴리펩티드의 전사를 조절하는 다른조절 시그날(Signal)의 상부에 상기 유전자를 배치하고 효모숙주에 자극(stress)을 가함으로써, 다수의 반복서열을 가진 플라스미드를 얻을 수 있으며, 그 서열은 조절서열을 가진 "전구"-폴리펩티드 유전자를 포함한다. 예시된 유전자는 메탈로티오네인 및 디히드로폴레이트리덕타제를 포함한다. 상기 구조물은 리더서열 분체외에, 숙주게놈에 대해 상동성인 다른 DNA를 포함할 수 있다. IGF유전자를 염색체(들)에 융합하는 것이 바람직하다면, 융합은 숙주염색체 DNA와 상동한 서열을 IGF유전자 구조물의 인접한 서열에 제공함으로써 증진시킬 수 있다.

사용되는 복제시스템은 효모숙주에 의해 인지된다. 그러므로, 복제시스템이 효모숙주에 그대로 존재하는 것이 바람직하다. 많은 효모벡터가 Botseinet al.,Gene(1979)8 : 17-24에 의해 보고되었다. 그중 특히 주목되는 것은 YEp플라스미드이며, 2㎛의 플라스미드 복제시스템을 가지고 있다. 이들 플라스미드는 다수의 카피스(copy number)로 안정하게 유지된다. 다른 방법 또는 부가적인 방법으로, 안정하게 유지되게 하기 위해ARS1및CEN4의 조합물을 이용할 수 있다.

각 조작후, 적절하게 구조물은 클로닝시켜 목적하는 구조물은 순수하게 얻을 수 있으며 또한 다음 조작을 위해 충분하게 얻을 수 있다. 바람직하게는, 셔틀 벡터(snuttle vector)(즉, 효모와 박테리아 복제원(replication origin) 둘 모두를 함유함)를 사용하여 원핵세포 특히 대장균(E.Coil내에서 클로닝 될수 있다.

플라스미드는 어떠한 용이한 방법으로도 효모숙주에 도입시킬 수 있는데, 효모 숙주세포 또는 구상세포(spheroplast)를 이용하며, 형질전환에 필요한 칼슘 침전 DNA 또는 리포좀(Liposome) 또는 다른 통상적인 방법을 이용한다.

변형된 숙주는 발현 플라스미드를 제작하기 위해 사용되는 벡터에 통상적으로 제공되는 유전자 마커(genctic marker)에 따라서 선택될 수 있다. 자가영양 숙주가 이용될 수 있는데, 여기에서 플라스미드는 숙주를 보완하여 기본 유기영양(prototrophy)를 제공하는 유전자를 가진다. 다른 방법으로, 적절한 살균제, 예르들면 항생제, 중금속, 독소 등에 대한 내성인자가 마커로서 플라스미드에 포함될 수 있다. 플라스미드를 함유한 세포를 선별하기 위해 모(母) 세포에 자극을 가하는 영양배지를 사용함으로써 선별이 이루어질 수 있다. 그래서 플라스미드를 함유한 세포는 적절한 영양배지에서 성장되고, 분비된 목적 폴리펩티드는 통상적인 방법에 의해 분리될 수 있다. 폴리펩티드는 크로마토그래피, 여과, 추출 등으로 정제할 수 있다. 폴리펩티드는 영양배지에서 성숙된 형태로 존재하게 되므로, 목적 폴리펩티드를 연속적으로 제거함으로써 영양배지를 계속 반복이용할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[실시예]

바람직한효모의 코돈을 포함하는 인체인슐린 유사생장인자 I 및 II(IGF I 및 II)에 대한 뉴클레오티드 서열은 Rinderknecht & Humbel(1978) J. Biol. Chem. 253 : 2769-2776 및 Rinderkencht & Humbel(1978) FEBS Letters 89 : 283-286에 각각 발표된 아미노산 서열에 근거하여 고안되었다. 이 서열은(암호사아체는 5'→3'방향임) 하기와 같다.

IGF I

IGF II

상기 서열은 양쪽 말단에EcoRI 결합성말단을 가지고 있다. IGF I에 대한 암호는 암호사상체의 16번째 염기에서 시작하여 225번째 염기에서 종결된다.HgaI제한부위는 각 말단에 위치한다.Hga I인식부위(5'-GACGC-3')는 IGF I 암호부위의 외부에 있는데, 즉 합성서열의 말단 및Hga I절단부위의 사이에 있다. IGF II 합성서열은 16번째 염기에서 시작하여 219번째 염기로 종결되는 암호사상체로 유사하게 구성되어 있다. 상기에서 설명한 IGF I 서열을 가진 IGF I에 대한 합성 DNA분체는 포스포아미디트(phosphoramidite) 방법을 이용하여 20개의 중복 SSDNA 단편들을 합성하여 제조할 수 있다(1983년 1월 12일에 출원되는 계류중인 출원번호 457, 412참조). 상기한 SSDNA 서열은 하기와 같다.

상기 ssDNA단편을 하기와 같이 결합시킨다. A 및 I-16을 제외한 각 단편 50pmole을 T4 폴리뉴클레오티드키나아제로 5'-인산화 시킨다. 그후 50pmole의 모든 단편들을 1·5시간에 걸쳐 95°에서 25°로 냉각함으로서 단일 단계로 18μl 풀(pool)로 어닐링(annealing) 시킨다. 결합이 1mM ATP, 10mM DTT, 100mM트리스-HCl, PH 7.8, 10mM MgCl₂, 1㎍/ml 스페르미딘 및 T4 리가제(ligase)를 함유하는 30μl의 반응부피에서 이루어진다. 제1도에서 제시된 분체서열과 염기쌍으로부터 생성된 특정이중 나선형의 분체가 7% 천연폴리아크릴아미드(polyatylamide) 전기영동 겔상에서 정제된다.

[제1도]

IGF II에 대한 DNA서열도 유사하게 합성된다. 하기의 부가적인 ssDNA 단편을 제조한다.

상기 ssDNA분체 및 분체A, D 및 L 200pmole을 상기의 유사한 방법으로 결합시키는데, 여기에서 A 및 II-15을 인산화시키지 않고 하기와 같이 단편들들 배열하고 짝짓는다.

[제2도]

상기 합성 DNA서열은 pBR 328의EcoRI 부위에 삽입되어 플라스미드 p 328 IGF I 및 p 328 IGF II을 생성한다. 클로닝후, IGF 암호사상체는HgaI를 사용하여 절단된다.

그후 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 어댑터는HgaI 제한단편에 결합된다. IGF I에서는 어댑터는 하기의 서열을 가진다.

a) 5'-AGCTGAAGCT-3'

3'-CTTCGACCAGG-5'

b) 5'-CTGCTTGATAAG-3'

3'-ACTATTCAGCT-5'

암호사상체의 배향을 설명하자면, 첫번째 어댑터의 3'말단인 a)는 IGF I합성서열상의 5'HgaI 절단부위와 상보관계를 이루며, 첫번째 어댑터의 5'-말단은HindIII 결합성말단을 제공한다. 두번째 어댑터 b)는 5'말단에서 IGF I 서열의 3'-말단에 있는HgaI 절단부위와 상보관계를 이루며 이 어댑터의 3'-말단은SalI 결합성말단을 제공한다.

IGF II에서는 어댑터가 하기의 서열을 가진다.

c) 5'-AGCTGAAGCT-3'

3'-CTTCGACGAAT-5'

d) 5'-CTGAATGATAAG-3'

3'-ACTATTCAGCT-5'

상기의 첫번째 어댑터인 c)의 배향에 대해 설명하면 어댑터 3'-말단은 IGF II 합성서열에 있는 5'-HgaI 절단부위와 상보관계를 이루며, 5'말단은HindIII 결합성말단을 제공한다. 두번째 어댑터(d)의 5'-말단은 IGF II 합성서열에 있는 두번째HgaI 절단부위와 상보관계를 이루며 3'-말단은SalI 결합성 말단을 제공한다.

합성 분체 및 그에 결합된 어댑터는 제조용 겔 전기영동에 의해 정제되고 미리 엔도뉴클레아제HindIII 및SalI로 완전히 분해시킨 PAB 113 100ng에 결합된다. PAB 113은 3개의 63HindIII 단편의 결손에 의해 PAB 112에서 유도된다. PAB 112는HindIII 및SalI 부위가 결손된 PBR 322의EcoRI 부위에 클로닝된 효모의 α-인자유전자를 가지는 1.8KdEcoRI 분체를 함유하는 플라스미드이다.

PAB 112는 플라스미드 YEP 24의BamHI 부위에 클로닝된 부분적인Sau3A 분체로서 효모의 α-인자 유전자를 함유하는 플라스미드 PAB 101에서 유도된다. PAB 101은 공지된 α-인자암호부와 상동인 효소적으로 P 32 방사선 표지된 합성올리고뉴클레오티드 프로오브(probe)를 이용하여, YEP 24에 클로닝된 효모의 게놈 라이브러리에서 선별함으로서 수득된다(Kurhan & Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor meeting on the Molecular Biology of Yeasts, page 242). 생성된 혼합물은 대장균E. ColiHB 101 세포를 형질전환 시키는데 이용되며 IGF I 및 IGF II에 대한 플라스미드 PAB 113-IGF-I 및 PAB-IGF-Ⅱ가 각각 수득된다. IGF Ⅰ및IGFⅡ 구조유전자를 가진 각각의 플라스미즈 PAB 113-IGF-Ⅰ및 PAB 113-IGF-II(각각 5㎍)은EcoRI로 완전히 분해되고, 합성된 분체는 과량의EcoRI-BamHI 어댑터와 결합하여BamHI으로 분해된다. 얻어진 1.8kdBamHI분체를 제조용 겔 전기영동에 의해 분리하고 각각의 분체 약 100ng을 미리 BamHI로 완전히 분해하여 알칼린포스 파타아제로 처리된 PC1/l 100ng에 결합시킨다.

플라스미드 PC1/l은 PJDB 219의 유도체이며(Baggs, Nature (1978) 275 : 104) 여기에서 PJDB 219내의 박테리아 플라스미드 PMB 9에 상응하는 부위는 PC1/l내의 PBR 322로 대치된다. 각 결합혼합물은E.coliHB 101 세포를 형질전환 시키는데 사용된다. 형질전화 세포는 암피실린에 대한 내성에 의하여 선별되며 이들의 플라스미드는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해에 의해 분석된다. 각 구조유전자, IGF I 또는 IGF II, 각각(PYIGF-I-10/1) 또는 (PYIGF-II-10/1)에 대한 하나의 선택된 클론에서 DNA가 제조되며, 효모 AB 103 세포를 형질전환 시키는데 사용된다. 형질전환 세포는 이들의 Leu⁺표현형에 의해 선별된다. 플라스미드(PYIGF-I-10/1)로 형질전환된 효모균주 AB 103(α,pep 4-3, leu 2-3,leu 2-112,ura 3-52,his-4-580)의 두 배양액(5 및 9미터)을 -leu 배지에서 포화될때까지(5의 광밀도 : 650nm

30℃에서 배양시키며, 다시 12시간동안 30℃에서 진탕하면서 방치한다. 원심분리에 의해 세포 상등액을 각 배양물에서 수거하고, IGF I을 이온교환수지(Bio-Rad Laboratories Inc., Richmond, California에서 시판되는 Biorex 70) 상에 흡수시켜 농축시킨다. 80%에탄올 용액중의 10mM HCl로 용출시킨후, IGF I 분획(각각 0.4ml 및 3ml)을 분석하여 총단백질 농도 및 IGF I 농도를 측정한다. 단백질 분석은 Bio-Rad-Laboratories, Inc., Richmond, California에 의한 Coomassie Blue 분석법이다. IGF I 분석은 방사선 표지된 IGF I을 사용한 통상적인 경쟁적 방사선 면역 분석법이다. 결과는 하기와 같다.

프롤락틴에 대한 비둘기군 sac의 반응을 촉진하는 펩티드의 상승효과에 근거한 IGF I의 생물학적 분석(Andersonetal. (1983) in Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E. M., ed., Walter, de Gruter, Berlin)은 상기 제조방법에 의한 IGF I 생성물이 인체혈청에서 분리된 실질 IGF I과 동등한 활성을 가진다는 것을 보여준다. 상기와 유사하게 배양된 AB 103(PYIGF-II-10/1)의 IGF II에 대한 배양물의 인체태반 막 방사선수용체 분석(Spencer et al. (1979) Act. Endocrinol. 91 : 36-48) 결과는 3.9unit/ml를 나타내는데 정상인체 혈청은 1unit/ml를 가진다. 본 발명에 의한 신규 구조물은 인체인슐린 유사생장인자 I를 처리하여 분비하고저 그 발현을 가능하게 하는 벡터에 삽입될 수 있도록 제공된다. 그러므로, 천연적으로 얻어지는 인체슐린 유사생장인자 I과 동일한 서열을 가진 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 분비 제공됨으로써, 세포수에 다라 크게 향상된 수득율을 얻을 수 있으며, 후차적인 제조조작 및 정제과정을 단순화할 수 있다.

명확한 이해를 위하여 예시와 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하였으나, 첨부한 청구범위내에서 어떤 변경 및 수정이 가능함을 명백히 밝힌다. 효모균주 사카로마이세스 세레비시아(S. cervisiae) AB 103(PYIGF-I-10/1)과 AB 103(PYIGF-II-10/1)은 1983년 4월 23일 American Type Culture Collection에 각각 기탁번호 20673과 20674로 기탁되었다.

상기 균주 사카로마이세스 세레비시아 AB 103(PYIGF-I-10/1)과 AB 103(PYIGF-II-10/1)는 1984년 9월 13일 한국과학 기술원에 각각 수탁번호 KAIST 840913-12916과 KAIST 840913-13016으로 수탁되었다.

Claims (11)

1. 적절 리딩 플레임내에 분비리더 및 숙주에 의해 인식되는 처리시그날 서열과 결합된 인체인슐린 유사생성인자(IGF)를 암호하는 유전자를 갖고 있는 기능성DNA구조물이 상기 숙주에 적합한 벡터내의 전사 개시부위의 전사 조절콘트롤하에 그 하부쪽으로 연결되어 구조 유전자를 형성하고 있는 상태로 포함되어 있는 숙주세포를 생장시키고, 분비된 인체 IGF를 분리해내는 단계로 구성된 적절한 숙주내에서 인체인슐린-유사생장인자(IGF)를 효율적으로 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, IGF유전자가 상기 숙주에 의해 우선적으로 이용되는 코돈을 가진 합성 유전자인 방법.
3. 제1항에 있어서, 인체 IGF유전자가 하기는 뉴클레오티드 서열을 가진 합성 IGF I 유전자인 방법.

   
4. 제1항에 있어서 인체의 IGF유전자가 하기는 뉴클레오티드 서열을 가진 합성 IGF II인 제조방법.

   
5. 제1항에 있어서, 숙주가 효모인 방법.
6. 제1항에 있어서, 숙주가 효모이고 운반체가 2㎛ 플라스미드의 유도체의 방법.
7. IGF를 암호하는 제1DNA 서열을 포함하며 이 DNA서열의 제1염기에 또는 그 하부에 암호 사상체의 5'-말단을 갖는 제1DNA 분체를 제조하고, 효모가 인식할 수 있는 분비 및 처리시그라날(processing signal)을 암호하는 제2DNA 서열을 포함하여 상기 처리시그날의 말단 염기에 또는 그 상부에 암호 사상체의 3'-말단을 가지는 제2DNA 분체를 제조하고, 여기에서 상기 제1 및 제2DNA 분체중의 적어도 하나가 그 말단내부에 염기쌍 ㅅ실을 일으키는 암호서열을 가지고, 제 1 및 제 2DNA 분체를 상기 제1및 제2의 DNA 분체의 염기쌍 소실을 일으키는 암호하는 어댑터(adaptor)를 사용하여 결합하고, 여기에서 상기 제1, 제2DNA 분체는 동일한공 리딩 프레임내에 존재하게 하며, 제1분체의 입접 및 하부의 종결코돈을 제공하고, "전구"-IGF 유전자를 효모내 발현벡터내로 클로닝시키며, 여기서 상기 "전구"-IGF가 분비되어 처리되는 처리되는 것을 특징으로 하는 효모분비 및 처리시그날에 의해 촉진 분비되는 인체인슐린 유사생장인자(IGF)를 효모내에서 발현시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 IGF가 IGF I인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 IGF가 IGF II인 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 발현벡터가 박테리아에 의해 인지되는 복제시스템을 포함하는 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 효모복제 체계가 2㎛플라스미드 또는 그 일부를 포함하는 방법.