JPH08512202A - Yap3シグナルペプチドをコードするdna構築体 - Google Patents

Yap3シグナルペプチドをコードするdna構築体

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JPH08512202A JP7503768A JP50376895A JPH08512202A JP H08512202 A JPH08512202 A JP H08512202A JP 7503768 A JP7503768 A JP 7503768A JP 50376895 A JP50376895 A JP 50376895A JP H08512202 A JPH08512202 A JP H08512202A
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Abstract

(57)【要約】 次の配列を含んで成るDNA構築体:5′−P−SP−(LP)n−PS−HP−3′(式中、Pはプロモーター配列、SPは酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナルペプチドをコードするDNA配列、LPはリーダーペプチドをコードするDNA配列、nは0又は1、PSは酵母プロセシング部位を規定するペプチドをコードするDNA配列、そしてHPは選択した宿主生物にとって異種であるポリペプチドをコードするDNA配列である)。YAP3シグナルペプチドは酵母の中での異種タンパク質の効率的な分泌を供する。

Description

【発明の詳細な説明】 YAP3シグナルペプチドをコードするDNA構築体 発明の分野 本発明は、異種ポリペプチドの分秘のためのYAP3シグナル・ペプチドを含んで 成るDNA構築物、そのDNA構築物を含む酵母細胞並びにそのDNA構築物から酵母内 で異種ポリペプチドを製造する方法に関する。 発明の背景 酵母生物は、細胞内で合成されるがその細胞の外での機能をもつ多くのタンパ ク質を生産する。このような細胞外タンパク質を分泌タンパク質という。これら の分泌タンパク質は、小胞体(endoplasmic reticulum (ER))の膜を通しての発 現産物の有効な方向を確保する前配列(presequence)を含む前駆体又は前−タン パク質形態において細胞内に最初に発現される。通常、シグナル・ペプチドとい われる前配列は、輸送の間にそのタンパク質の残余から解裂される。一旦、分泌 経路に入れば、そのタンパク質はゴルジ体(Golgi apparatus)に運ばれる。この ゴルジ体から、このタンパク質は、区画、例えば細胞液胞(vacuole)又は細胞膜 に継がる様々な経路に追従することができ、又は外部培地に分泌されるべきタン パク質がその細胞からの経路を定められることができる(Pfeffer,S.R.and Ro thman,J.E.Ann.Rev.Biochem. 56(1989).829-852)。 酵母に対して異種であるタンパク質の酵母内での発現及び分泌についていくつ かのアプローチが提案されている。欧州公開特許出願第88 632号は、所望のタン パク質及びシグナル・ペプチドをコード するDNAを宿す発現媒体により酵母生物を形質転換し、その形質転換された生物 のカルチャーを調製し、そしてその培養基からそのタンパク質を回収することに より、酵母に対して異種のタンパク質を発現し、プロセシングし、そして分泌す る方法について記載している。シグナル・ペプチドは、所望タンパク質のシグナ ル・ペプチド自体、異種シグナル・ペプチド又は生来及び異種シグナル・ペプチ ドのハイブリッドであることができる。 酵母に異種のシグナル・ペプチドの使用に伴う問題は、その異種シグナル・ペ プチドが有効な輸送を確保せず、そして/又はそのシグナル・ペプチド後の解裂 を確保しないということであろう。 サッカロマイセス・セレビジエ(S. cerevisie)MFα1(α−ファクター) は、19アミノ酸のシグナル又はプレペプチド、その後の64アミノ酸の“リーダー (leader)”又はプロペプチドであって3つのN−結合糖添加部位を含むもの、そ の後の(Lys Arg(Asp/Glu,Ala)2-3α−ファクター)4を含んで成る165アミノ 酸のプレプロ形態として合成されている(Kurjan,J.and Herskowitz,I Cell 30(1982),933-943)。このプレプロMFα1のシグナル−リーダー部分は、サッ カロマイセス・セレビジエにおける異種タンパク質の合成と分泌を得るために広 く使用されている。 酵母と同種のシグナル/リーダー・ペプチドの使用は、一般に、米国特許明細 書第4,546,082号、欧州公開特許出願第116 201号、第123 294号、第123 544号、 第163 529号、及び第123 289号並びにデンマーク国特許出願第3614/83号から公 知である。 欧州特許第123 289号中に、サッカロマイセス・セレビジエのα−ファクター 前駆体の使用について記載されているが、WO 84/01153はサッカロマイセス・セ レビジエのインベルターゼのシグナル・ペプチドの使用について示し、そしてデ ンマーク国特許出願3614 /83は外来タンパク質のための、サッカロマイセス・セレビジエのPHO5シグナル ・ペプチドの使用について示している。 米国特許明細書第4,546,082号、EP第116 201号、第123 294号、第123 544号、 及び第163 529号は、サッカロマイセス・セレビジエからのα−ファクター・シ グナル−リーダー(MFα1又はMFα2)が酵母における発現異種タンパク質の分 泌方法において使用されるような方法について記載している。所望タンパク質の ための遺伝子の5′末端においてサッカロマイセス・セレビジエMα1シグナル /リーダー配列をコードするDNA配列を融合することにより、その所望タンパク 質の分泌とプロセシングが立証された。 多数の分泌タンパク質は、2つの連続的塩基性アミノ酸のカルボキシ末端にお いてペプチド結合を解裂することができるタンパク質分解プロセシング系に晒さ れるように経路を定められる。この酵素活性は、KEX2遺伝子によりコードされた サッカロマイセス・セレビジエにある(Julius,D.A.et al.,Cell 37(1984b) ,1075)。KEX2遺伝子産物によるその生成物のプロセシングは、活性なサッカロ マイセス・セレビジエの接合因子α(MFα又はα−因子)の分泌に必要であるが 、活性サッカロマイセス・セレビジエ接合因子aの分泌においては関連しない。 酵母内で発現される異種タンパク質の分泌を提供するためのマウス唾液アミラ ーゼ・シグナル・ペプチド(又はその突然変異体)の使用は、WO 89/02463とWO 90/10095中に記載されている。本発明の目的は、異種タンパク質の酵母中での より効率的な発現及び/又は分泌を提供することである。 発明の要約 酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(aspartic protease 3)のシ グナル・ペプチドが、マウス唾液アミラーゼ・シグナル・ペプチドに比較して酵 母内で発現されるタンパク質の改良された分泌を提供することができることが、 驚ろくべきことに発見された。 従って、本発明は、以下の配列: 5′-P-SP-(LP)n-PS-HP-3′ {配列中、 Pがプロモーター配列であり、 SPが酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナル・ペプチドをコード するDNA配列であり、 LPがリーダー・ペプチドをコードするDNA配列であり、 nが0又は1であり、 PSが酵母プロセシング部位を定めるペプチドをコードするDNA配列であり、そ して HPが選択された宿主生物に対し異種であるポリペプチドをコードするDNA配列 である。}を含んで成るDNA構築物に関する。 用語“シグナル・ペプチド”は、天然において優位に疎水性であり、そして酵 母内で発現される細胞外タンパク質の前駆体形態のN−末端配列として存在する 前配列(presequence)を意味すると解される。このシグナル・ペプチドの働き は、異種タンパク質が分泌されて小胞体に入ることを許容することである。この シグナル・ペプチドは、上記過程の経過において解裂除去される。このYAP3シグ ナル配列は、その生来の遺伝子に融合されたことが先に報告されている(M.Egel -Mitani et al.,Yeast 6,1990,pp.127-137)。このYAP3シグナル配列が異 種ポリペプチドをコードするDNA配列に融合されているようなDNA構築物は、新規 であると信じられる。このYAP3シグナル・ペプチドは、酵母における異種ポリペ プチドの効率的な分泌を提供することが先に報告されていない。 本明細書中、表現“リーダー・ペプチド”は、小胞体からゴルジ体そしてさら に培地への分泌ための分泌液胞まで異種ポリペプチドを向けること(すなわち、 細胞壁を横切る又は少なくとも細胞膜を通しての細胞の細胞周辺腔への発現ポリ ペプチドの輸出を許容する機能を有するポリペプチドを示すと解される 表現“異種ポリペプチド(heterologous polypeptide)”は天然における宿主酵 母生物により生産されないポリペプチドを示すことを意図される。 他の態様においては、本発明は、本発明に係るDNA構築物を含んで成る組換え 発現ベクターに関する。 さらなる態様においては、本発明は、本発明に係る組換え発現ベクターにより 形質転換された細胞に関する。 そしてさらなる態様においては、本発明は、異種ポリペプチドの製造方法、す なわち、異種ポリペプチドを発現することができ、そして本発明に係るDNA構築 物により形質転換される細胞を好的な培地中で培養して上記異種ポリペプチドの 発現と分泌を得て、その後、この異種ポリペプチドをその培地から回収すること を含んで成る方法に関する。 発明の詳細な説明 特定の態様においては、上記YAP3シグナル・ペプチドは以下の配列: 又はこのYAP3シグナル・ペプチドと高程度の相同性(少なくとも60%、より好ま しくは少なくとも70%の、配列同一性)をもつペプチドをコードする好適なその 修飾物によりコードされる。“好適な修 飾物”の例は、そのペプチドの他のアミノ酸配列を生じさせないが、このDNA配 列がその中に導入される酵母生物のコドンの用い方に対応することができるヌク レオチド置換、あるいは(そのアミノ酸配列がシグナル・ペプチドとしてもはや 機能しない程度まで修飾されてはならないけれども)そのペプチドの異なるアミ ノ酸配列を生じさせるヌクレオチド置換である。可能性のある修飾の他の例は、 その配列のいずれかの末端における又は内部での3又は3の倍数のヌクレオチド の挿入、又はその配列のいずれかの末端における又は内部での3又は3の倍数の ヌクレオチドの欠失である。 配列5′−P−SP−(LP)n−PS−HP−3′中、nは好ましくは1である。換言 すれば、YAP3シグナル・ペプチドはいくつかの場合においては、その自体、異種 ポリペプチドの分泌及び/又はプロセシングを提供するけれども、リーダー又は プロ−ペプチド配列が好ましくは存在する。このリーダーは酵母MFα1リーダー ・ペプチド又は合成リーダー・ペプチド、例えばWO 89/02463又はWO 92/11378 中に開示されたリーダー・ペプチドの中の1又は酵母において異種ポリペプチド 分泌を行うことができるその誘導体であることができる。用語“合成(syntheti c)”は、着目のリーダー・ペプチドが天然においては存在しないことを示すと 意図される。合成酵母リーダー・ペプチドは、例えば、WO 89/02463又はWO 92 /11378中に記載された手順に従って構築されることができる。 DNA配列PSによりコードされた酵母プロセシング部位は、好適には、LysとArg のいずれかの対の組合せ、例えばLys-Arg,Arg-Lys,Lys-Lys又はArg-Argであっ て他の種内でのサッカロマイセス・セレビジエのKEX2プロテアーゼ又は等価なプ ロテアーゼによる異種ポリペプチドのプロセシングを許容するものであることが できる(D.A.Julius et al.,Cell 37,1984,1075ff.)。KEX2プロセシング が便利でない場合、例えばそれがポリペプチド産物の解裂を導くであろう場合に は、他のプロテアーゼのためのプロセシング部位であって、そのポリペプチド産 物内にはないアミノ酸の組合せを含んで成るもの、例えばFXaのためのプロセシ ング部位、Ile-Glu-Gly-Argが代わりに選ばれることができる(Sambrook,Frits ch and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,Cold Spring Ha rbor,New York,1989参照)。 本発明に係る方法により作られる異種タンパク質は、酵母内で有利には生産さ れることができるいずれかのタンパク質であることができる。このようなタンパ ク質の例は、アプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアーゼ・ インヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、 インターロイキン、グルカゴン、組織プラスミノーゲン・アクチベーター、トラ ンスフォーミング成長因子α又はβ、血小板由来成長因子、酵母、又はその機能 的アナログである。本明細書中、用語“機能的アナログ(functional analogue) ”は、生来のタンパク質と同様の機能をもつポリペプチドを示すと意味され(こ れは、生来のタンパク質の生物学的活性のレベルよりもむしろその性質に関する ものとして理解されることを意図される)。このポリペプチドは生来のタンパク 質と構造的に類似のものであることができ、そして生来のタンパク質のC−とN −末端のいずれか又は両方への1以上のアミノ酸の付加、生来のアミノ酸配列内 の1又は多数の異なる部位における1以上のアミノ酸の置換、アミノ酸配列内の 1又はいくつかの部位における又は生来のタンパク質のいずれのの又は両端にお ける1以上のアミノ酸の欠失、あるいは生来のアミノ酸配列内の1以上のアミノ 酸部位における1以上のアミノ酸の挿入により、生来のタンパク質から誘導され ることができる。このような修飾は上述のタンパク質 のいくつかについてよく知られている。 本発明に係るDNA構築物は、確立された標準的な方法、例えばS.L.Beaucage an d M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters 22,1981,pp.1859-1869により記載さ れたホスホアミジット法、又はMatthes et al.,EMBO Journal 3,1984,pp.801 -805により記載された方法により、合成により製造されることができる。このホ スホアミジット法に従って、オリゴヌクレオチドを、例えば自動DNA合成装置内 で合成し、精製し、アニールし、ライゲートし、そして酵母発現ベクター内にク ローン化する。配列5′−P−SP−(LP)n−PS−HP−3′が単一操作で調製され る必要はないが、この方法で合成により調製された2以上のオリゴヌクレオチド からアセンブルされることができることに留意すべきである。 DNA配列5′−P−SP−(LP)n−PS−HP−3′の1以上の部分はゲノム又はcDNA 起源をもつこともでき、例えばゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そして標 準的な技術(Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:A Laborat ory Manual ,Cold Spring Harbor,New York,1989参照)に従って合成オリゴ ヌクレオチド・プローブを使用したハイブリダイゼーションにより上記部分をコ ードするDNA配列(典型的にはHP)をスクリーニングすることにより得られるこ とができる。この場合においては、シグナル・ペプチドをコードするゲノム又は cDNA配列は、異種タンパク質をコードするゲノム又はcDNA配列に連結されること ができ、その後、そのDNA配列は、よく知られた手順に従って、配列5′−P−S P−(LP)n−PS−HP−3′をコードする合成オリゴヌクレオチドの挿入により修飾 されることができる。 最終的に、DNA配列5′−P−SP−(LP)n−PS−HP−3′は、(適宜)合成、ゲ ノム又はcDNA起源の断片、すなわち標準的な技術に 従って上記DNA配列の全体の中のさまざまな部分に対応する断片をアニーリング することにより調製された、混合された合成とゲノム、混合された合成とcDNA、 又は混合されたゲノムとcDNA起源を有することができる。従って、シグナル・ペ プチド又は異種ポリペプチドをコードするDNA配列がゲノム又はcDNA起源を有す ることができ、一方、配列5′−P−SP−(LP)n−PSが合成により調製されるこ とができることが構想されることができる。 配列5′−P−SP−(LP)n−PS−HP−3′を担持する組換え発現ベクターは、 酵母生物内で複製することができるいずれかのベクターであることができる。こ のベクターにおいては、プロモーター配列(P)は、酵母内で転写活性を示すい ずれかのDNA配列であることができ、そして酵母に対して同種又は異種のいずれ かであるタンパク質をコードする遺伝子から得られることができる。プロモータ ーは好ましくは、酵母と同種のタンパク質をコードする遺伝子から得られる。好 適なプロモーターの例は、サッカロマイセス・セレビジエのMFα1,TPI,ADHI ,ADHII又はPGKプロモーター、又は他の酵母種、例えばシゾサッカロマイセス・ ポンベ(Schizosaccharomyces pombe )からの対応のプロモーターである。好 適なプロモーターの例は、例えば、Russell and Hall,J.Biol.Chem. 258 ,19 83,pp.143-149; Russell,Nature 301 ,1983,pp.167-169;Ammerer,Meth .Enzymol101 ,1983,pp.192-201;Russellet al,J.Biol.Chem. 258 ,1983 ,pp.2674-2682;Hitzeman et al,J.Biol.Chem. 225 ,1980,pp.12073-12080 ;Kawasaki and Fraenkel, Biochem.Biophys.Res.Comm. 108 ,1982,及びT.Al ber and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1,1982,pp.419-434により記載され ている。 上記配列は、また、好適なターミネーター、例えばTPIターミネ ーター(T.Alber and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1,1982,pp.419-434参 照)、又は酵母CYCIターミネーターに作用可能な状態で接続されなければならな い。 本発明に係る組換え発現ベクターは、さらに、そのベクターが酵母内で複製す ることを可能にするDNA配列を含んで成る。このような配列の例は、酵母プラス ミド2μ複製遺伝子REPI-3と複製起点である。このベクターは、選択マーカー、 例えばシゾサッカロマイセス・ポンベTPI遺伝子であってP.R.Russell,Gene 40 ,1985,pp.125-130により記載されるようなもの、又は酵母URA3遺伝子をも含ん で成る。 配列5′−P−SP-(LP)n−PS-HP-3′を酵母複製に必要な情報を含む好適な酵 母ベクターに挿入するために使用される手順は当業者によく知られている(例え ば、Sambrook,Fritsch and Maniatis,引用書中、参照)。このベクターは、こ の配列全体を含むDNA構築物を最初に調製し、そしてその後この断片を好適な発 現ベクター中に挿入するか、又は個々の要素のための遺伝情報を含むDNA断片(例 えば、プロモーター配列、シグナル配列、リーダー配列、又は異種ポリペプチド をコードするDNA)を順番に挿入してその後ライゲーションするかのいずれかによ り構築されることができる。 本発明に係るベクターにより形質転換される酵母生物は、培養の間に、大量の 着目の異種ポリペプチドを作り出すいずれかの好適な酵母であることができる。 好適な酵母生物の例は、サッカロマイセス(Saccharomyces )の株、例えばサッ カロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス ・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、又はサッカロマイセス・ウバラム エ(Saccharomyces uvarum)、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces )、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosa ccharomyces pombe )、クルイベロマイセス(Kluiveromyces )、例えばクル イベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、ヤロウイア(Yarrowia )、例えばヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、又はハンセヌラ (Hansenula )、例えばハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha) であることができる。上記酵母細胞の形質転換は例えばプロトプラスト形成その 後のそれ自体公知のやり方での形質転換により行われることができる。 これらの細胞を培養するために使用される培地は、酵母生物を増殖させるのに 好適ないずれかの慣用培地であることができる。分泌された異種タンパク質であ って、そのかなりの部分が正しくプロセシングされた形態でその培地中に存在す るであろうものが、酵母細胞をその培地から遠心分離又は濾過により分離し、塩 、例えば硫酸アンモニウムによりその上清又は濾液のタンパク質成分を沈澱させ 、その後、各種クロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー 、アフィニティー・クロマトグラフィーその他による精製することを含む慣用の 手順により、その培地から回収されることができる。 図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照しながら以下の実施例においてさらに記載する。ここ で、 図1Aと1BはプラスミドpLaC257の構築を図示し; 図2は、pLaC257内のEcoRI−XbaI挿入物のDNA配列及び誘導アミノ酸配列( 配列番号:2)を示し; 図3Aと3BはプラスミドpLaC242Aprを図示し; 図4はpAPRSc1のEcoRI−XbaI断片のDNA配列及び誘導アミノ 酸配列(配列番号:4)を示し、ここで、イタリック体で示されるタンパク質配 列がランダムな発現クローン化DNA断片から誘導されており; 図5はプラスミドpLaC263の構築を図示し; 図6はpLaC263のEcoRI−XbaI断片のDNA配列及び誘導アミノ酸配列(配列番 号:6)を示し; 図7Aと7Bは、その生来のシグナル・ペプチドを含むヒト組織因子経路イン ヒビター(TFPI)のDNA配列及び誘導アミノ酸配列(配列番号:8)を示し; 図8Aは、プラスミドpYES-212 TFPT161-117Q内のTFPI配列のN末端に融合さ れた(WO 89/02463中に示された)spx3シグナル・ペプチドと212リーダー・ペ プチドのDNA配列及び誘導アミノ酸配列(配列番号:10)を示し; 図8Bは、プラスミドpYES-yk TFPT161-117Q内のTFPI配列のN−末端に融合さ れたYAP3シグナル・ペプチドと212リーダー・ペプチドのDNA配列及び誘導アミノ 酸配列を示し;そして 図9は、プラスミドpYES21、pP-212TFPI161-117Q;pYES-212TFPI161-117QとpY ES-ykTFPI161-117Qの制限マップを示す。 本発明をさらに以下の実施例により説明する。これらの実施例はいかなる方法 においても請求するものとして本発明の範囲を限定することを意図されない。 実施例プラスミドとDNA材料 全ての発現プラスミドは酵母内での複製のための2μDNA配列を含み、そして 酵母内での選択マーカーとしてサッカロマイセス・セレビジエURA3遺伝子又はシ ゾサッカロマイセス・ポンベのトリオース・ホスフェート・イソメラーゼ遺伝子 (POT)のいずれかを使用す る。POTプラスミドは、EP特許出願第171 142号中に記載されている。このPOT− 遺伝子を含むプラスミドは寄託されたE.コリ(E.coli)株(ATCC 39685)から 得ることができる。さらにこのPOTプラスミドはサッカロマイセス・セレビジエ のトリオース・ホスフェート・イソメラーゼ・プロモーターとターミネーター( PTPIとTTPI)を含む。それらは、pMT742(M.Egel-Mitani et al.,Gene 73, 1988,pp.113-120)と同一である(図1参照)。但し、このPTPIを含むSph-Xba I制限部位により定められる領域とシグナル/リーダー/生成物のためのコード 領域は同一でない。このURA3のプラスミドはPTPIとイソ−I−シトクロームC ターミネーター(TcycI)を使用する。 PTPIは構築作業を容易にするためにのみ、pMT742内にある配列に関して修飾 されている。内部SphI制限部位はSphI解裂、一本鎖尾の除去、そしてライゲー ションにより除去されている。さらに、プロモーターに対するいずれの影響をも たず、かつ上流にあるDNA配列が、Ba131エクソヌクレアーゼ処理その後のSphI 制限部位リンカーの付加により除去された。373塩基対のSphI−EcoRI断片上に 存在するこのプロモーター構築物は、PTPIδと命名され、そして既に記載した プラスミド内で使用されるとき、このプロモーター修飾はこのプラスミド名への δの付加により示される。 最後に、多数の合成DNA断片を使用した。これらの断片のすべては、ホスホル アミジット化学及び商業的に入手可能な試薬(S.L.Beaucage and M.H.Caruthers (1981)Tetrahedron Letters 22,1859-1869)を使用して自動DNA合成装置(Appl ied Biosystems model 38OA)上で合成された。これらのオリゴヌクレオチドを変 性条件下ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により精製した。このようなDNA一 本鎖の相補対のアニーリングに先立って、これらをT4ポリヌク レオチド・キナーゼとATPによりリン酸化した。 使用した他の方法と材料の全ては、一般的技術水準の知識である(J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labor atory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1988)。 実施例1 インスリン前駆体M13(B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21))をコードするDNA配列を 含むプラスミドpLSC6315D3(WO 92/11378のExample3に記載)の発現カセットの 改変マウス唾液腺アミラーゼシグナルペプチド(MSA3sp)(WO 89/02463に記載 )を以下の工程でYAP3シグナルペプチドに置き換えた。 シグナルペプチドの簡単な交換のための構築体を作った。部位特異的突然変異 誘発を通じ、突然変異誘発プライマーNOR494 (ここで太字は突然変異を示し、そして下線を付した配列は開始コドンを示す) を適用するダブルプライマー法により、pLaC196δにおける開始コドンの直前(WO 89/02463、fig.5参照)に導入した。 得られるプラスミドをpLaC196δ-Asp718と称する(図1参照のこと)。 pLSC6315D3中の発現カセットのシグナルペプチドとリーダーペプチドとの間の 接合点を含む領域のヌクレオチド配列を、Apal-HgiAI制限フラグメントを合成D NAストレッチNOR2521/2522に置き換えることにより改良した: 得られるプラスミドをpLSC6315D3Rと称する(図1参照のこと)。 pLaC196δ-Asp718のSphI−Asp718フラグメントを、Sphl-Mlu1で切断しておい たpLSC6315D3Rプラスミド及びYAP3シグナルペプチドをコードするDNAの合成スト レッチ: 得られるプラスミドpLaC257は本質的に、MSA3シグナルペプチドがYAP3シグナ ルペプチドに置き換えられているpLSC6315D3より成る(図2参照のこと)。 酵母の形質転換:S.セレビジエ株MT663(E2-7B XE11-36a/α、Δtpi/Δtpi、 pep4-3/pep4-3)(酵母株MT663は出願92/11378との関係でドイツェ・サムルング ・フォン・マイクロオルガニズメン・ウンド・ゼルクルツレンに寄宅してあり、 そして寄託番号DSM6278が付与されている)をYPGal(1%のBacto酵母抽出物、2 %のBactoペプトン、2%のガラクトース、1%のラクテート)上で0.6の600nmで のO.D.にまで増殖させた。 100mlの培養物を遠心により回収し、10mlの水で洗い、再遠心して、そして1.2 Mのソルビトール、25mMのNa2EDTA pH8.0及び6.7mg/mlのジチオトレイトールを 含む溶液10mlに再懸濁した。その懸 濁物を30℃で15分インキュベートし、遠心し、そしてその細胞を1.2Mのソルビ トール、10mMのNa2EDTA、0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH 0 5.8及び2mgのNovo zym(商標)234を含む溶液10mlに再懸濁した。その懸濁物を30℃で30分インキュベ ートし、その細胞を遠心により回収し、1.2Mのソルビトール10ml及びCAS(1.2 Mのソルビトール、10mMのCaCl2、10mMのトリスHCl(トリス=トリス(ヒドロキ シメチル)アミノメタン)pH−7.5)10mlで洗い、そしてCAS2mlに再懸濁した。 形質転換のため、1mlのCAS懸濁細胞を約0.1μgのプラスミドpLaC257と混合し 、そして室温で15分放置した。1mlの20%のポリエチレングリコール4000、20mM のCaCl2、10mMのCaCl2、10mMのトリスHCl、pH=7.5を加え、そしてその混合物を 室温で更に30分放置した。その混合物を遠心し、そしてそのペレットを0.1mlのS OS(1.2Mのソルビトール、33%v/vのYPD、6.7mMのCaCl2、14μg/mlのロイ シン)に再懸濁し、そして30℃で2時間インキュベートした。その懸濁物を遠心 し、そしてそのペレットを1.2Mのソルビトール0.5mlに再懸濁した。次いで1.2 Mのソルビトールと2.5%のアガーとを含む6mlのトップアガー(Shermanら、Met hods in Yeast Genetics ,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)のSC培地)を5 2℃で加え、そしてその懸濁物を同一のアガー固形化ソルビトール含有培地を含 むプレートの上に注いだ。 形質転換コロニーを30℃で3日経過後に拾い、そして液体培養を開始するのに 使用した。一つの形質転換体を更なる特性決定のために選択した。 発酵:プラスミドpLaC257で形質転換された酵母株MT663をYPD培地(1%の酵母 抽出物、2%のペプチン)(Difco Laboratoriesより)上で増殖させた。1リット ルの株培養物を650の光学密度で24となるまで30℃で振盪した。遠心後、その上 清液を単離した。 プラスミドpLSC6315D3により形質転換され、且つ上記の通りに培養されたMT66 3細胞をMI3インスリン前駆体の収率の比較のために用いた。MI3の収率はSnel ,Damgaard and MollerupのChromatographia 24,1987,pp.329-332の方法に より、培養上清液に基づいて直接決定した。結果を以下に示す。 プラスミド MI3の収率 pSLC63.15D3(Msa3sp) 100% pLaC257(YAP3) 120% 実施例2 プラスミドpLSC6315D3を2工程で改変させた。第一に、MSA3シグナルペプチド を、SphI−ApaIフラグメントをpLaC212spx3(WO 89/02463参照のこと)由来の 類似のフラグメントと交換することによりspx3シグナルペプチドに置き換えた。 得られるプラスミドpSLC63.15spx3から、302bpのEcoRI−DdeIフラグメントを 単離し、そしてアプロチニンをコードするDNA配列を含むpKFN1003(WO 90/10075 )の204bpのNcoI−XbaIフラグメントに、合成リンカーDNA、NOR2101/2100 を通じて融合した(図3参照)。 得られるプラスミドpLaC242-Apr(図3参照)をClaIで切断し、脱リン酸化し 、そしてS.セレビジエ株MT663から単離したランダム5′−CG−突出しフラグ メントのクローニングに、WO 92/11378の詳細に従って適用した。酵母株MT663 の形質転換及び発酵は実施例1記載の通りに行った。 得られるライブラリーから、配列を図4に提示しているリーダー を含むプラスミドpAPR-Scl(WO 92/11378に記載の方法により調製)を有する酵母 形質転換体をスクリーニングにより選別した。pAPR-Sclのspx3シグナルペプチド を、pLaC257由来のSphl-StylフラグメントをpAPR-Sciの300bpのNhel-XbaIフラ グメントに合成リンカーDNA MH1338/1339 を介してpAPR-Sclの300bpのNheI−XbaIフラグメントに融合することによりYAP 3シグナルペプチドと交換した(図5参照)。 得られるプラスミドをpLaC263と称する(図5参照)。pLaC263のEcoRI−Xba IフラグメントのDNA配列及び誘導アミノ酸配列を図6に示す。 プラスミド アプロチニン収率 pAPR-Scl(Spx3sp) 100% pLaC263 136% 実施例3 DNA配列がヒト組織因子経路インヒビター(TFPI)をコードするcDNAの公開配 列(Wunら、J.Biol.Chem.263(1988)6001-6004)に由来するヒトTFPIコードする 合成遺伝子を、プラスミドpBS(+)への合成制限フラグメントの段階式クローニ ングにより調製した。得られる遺伝子は928塩基対(bp)のSalI制限フラグメン ト上に含まれていた。cDNAが14個の固有制限エンドヌクレアーゼ部位をもたらし ているのに対して、この遺伝子は縮重コドンにおける26個のサイレントヌクレオ チド置換を有していた。この928bpのSalIフラグメントのDNA配列及びヒトTFPI の対応のアミノ酸配列(プレ形態 )を図7に示す(SEQ ID NO:8)。 このDNA配列を次に、最初の161個のアミノ酸より成るTFPI変異体をコードする ために、トランケーションに付した。Asn117についてのAATコドンがGlnをコード するCAAに置き換えられているグリコシル化変異体TFPI1-161-117Glnを合成オリ ゴヌクレオチドを用いる公知の方法の部位特異的突然変異誘発により構築した。 TFPI1-161-117GlnをコードするDNA配列には合成シグナル−リーダー配列212spx 3が先行する(WO 89/02463を参照のこと)。図8A参照のこと。この構築体をプ ラスミドpP-212TFPI161-117Q(POT型のベクターに基づく)(G.Kawasaki and L.Be ll,米国特許第4,931,373号)に挿入した。図8参照のこと。 212spx3-TFPI1-161-117Glnをコードするコード領域を含む1.1kb SphI−XbaI フラグメントを単離し、そして市販のベクターpYES2.0(Stratagene)由来のプラ スミドpYES21にクローンした(図8参照)。このプラスミドは酵母における複製 のための2μ配列、 ura3株におけるプラスミド選別のための酵母URA3遺伝子、E.コリ における選別のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、E.コリにおける複製 のためのColE1複製起点、超感染E.コリ株からの一本鎖DNAプラスミドの回収の ためのf1起点、及び酵母CYCI転写ターミネーターを含む。SphI−XbaIフラグ メントをCYC1ターミネーターの前においてpYES2.0にクローニングした。得られ るプラスミドpYES-212TFPI161-117Q(図9参照)をPf1MI及びEcoRIで切断して マウス唾液アミラーゼシグナルペプチドをコードする領域を除き、YAP3シグナル ペプチドをコードする二本鎖合成オリゴヌクレオチド配列 と交換し、プラスミドpYES-ykTFPI161-117Qを得た(図8B及び図9を参照のこ と)。 プラスミドpYES-212TFPI161-117Q及びpYES-ykTFPI161-117Qをハプロイド酵母 株YNG318(MATα ura3-52 leu2-Δ2 pep4-Δ1 his4-539〔cir+)に形質転 換した。プラスミド選択はUra+細胞についてである。再単離した形質転換体を、 ウラシルを欠く50mlの合成完全培地(SC-ura)の中で30℃で3日増殖させた。細 胞密度(OD600)を測定後、その培養物を遠心し、そして得られる上清液を分泌し たFXa/TF/FVIIa依存性染色体TFPI活性のレベルについて分析した(P.M.Sandse tら、Thromb.Res. 47,1987,pp 389-400)。プラスミドpYES-212TFPI161-117Q (即ち、マウス唾液アミラーゼシグナル配列を含むプラスミド)を含む株由来の 上清液に関して測定された平均活性値は0.65U/ml・ODであった。プラスミドpY ES-ykTFPI161-117Qを含む株由来の上清液について測定された平均活性値は1.00 U/ml・ODであった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI (C12P 21/02 C12R 1:865)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.以下の配列を含んで成るDNA構築体 5′-P-SP-(LP)n-PS-HP-3′ (式中、 Pはプロモーター配列、 SPは酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナルペプチドをコードす るDNA配列、 LPはリーダーペプチドをコードするDNA配列、 nは0又は1、 PSは酵母プロセシング部位を規定するペプチドをコードするDNA配列、そして HPは選択した宿主生物にとって異種であるポリペプチドをコードするDNA配列 である)。 2.前記プロモーター配列がサッカロマイセス・セレビジエのMFα1,TPI,A DH,BARIもしくはPGKプロモーター、又はシゾサッカロマイセス・ポンベのADHプ ロモーターから選ばれたものである、請求項1記載のDNA構築体。 3.前記YAP3シグナルペプチドが下記のDNA配列 又はYAP3シグナルペプチドに対して高度の相同性を有するペプチドをコードする その適当な改変体によりコードされる請求項1記載のDNA構築体。 4.nが1である請求項1記載のDNA構築体。 5.前記リーダーペプチドが酵母のMFα1リーダーペプチド又は合成リーダー ペプチドである、請求項5記載のDNA構築体。 6.PSがLys-Arg,Arg-Lys,Lys-Lys,Arg-Arg又はIle-Glu-Gly-Argをコード するDNA配列である、請求項1記載のDNA構築体。 7.異種ポリペプチドがアプロチニン、組織因子経路インヒビターもしくはそ の他のプロテアーゼインヒビター、インスリンもしくはインスリン前駆体、ヒト もしくはウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、グルカゴン様ペプ チド1、組織プラスミノゲンアクチベーター、トランスフォーミング成長因子α もしくはβ、血小板由来成長因子、酵素、又はその機能的類似体より成る群から 選ばれる、請求項1記載のDNA構築体。 8.転写終止配列を更に含んで成る、請求項1記載のDNA構築体。 9.前記転写終止配列がTPIターミネーターである、請求項8記載のDNA構築体 。 10.請求項1〜9のいづれか1項記載のDNA構築体を含んで成る組換発現ベク ター。 11.請求項10記載のベクターにより形質転換された細胞。 12.菌類細胞である、請求項11記載の細胞。 13.酵母細胞である、請求項12記載の細胞。 14.サッカロマイセスシゾサッカロマイセスクルイベロマイセスハンセ ヌラ 又はヤロイアの細胞である、請求項13記載の細胞。 15.サッカロマイセス・セレビジエ又はシゾサッカロマイセス・ポンベの細胞 である、請求項14記載の細胞。 16.異種ポリペプチドを製造する方法であって、異種ポリペプチドを発現する ことができ、且つ請求項1〜9のいづれか1項記載のDNA構築体により形質転換 された細胞を適当な培地の中で培養してこの異種ポリペプチドを発現及び分泌さ せ、次いでこの異種ポリペ プチドをこの培地から回収することを含んで成る方法。
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