JP5850848B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
a)前記ポリペプチドをコードするDNA配列を含む前記酵母菌株を、前記酵母菌株中で前記ポリペプチドを発現するための条件下で培養するステップと、
b)発現された前記ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法に関する。
a)前記ポリペプチドをコードするDNA配列を含む酵母菌株を、前記酵母菌株中で前記ポリペプチドを発現する条件下で培養するステップと、
b)発現された前記ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法;
一般的手順
発現プラスミドは全て、EP171,142に記載されているのと同様なC-POT型である。これらは、S.セレビジエにおけるプラスミド選択および安定化のためにシゾサッカロミセス・ポンベトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含有していることを特徴とする、2μベースの発現ベクターである。プラスミドはまた、S.セレビジエトリオースリン酸イソメラーゼのプロモーターおよびターミネーターを含有している。これらの配列は、プラスミドpKFN1003中の対応配列(WO9010075に記載)と類似している。種々の融合タンパク質のクローニングを容易にするために、MFα1プレ-プロリーダーをコードするDNA配列を、NcoI部位を組み入れるように変化させた。これを、MFα1*プレ-プロリーダーと称する。したがって、NcoI-XbaI断片を、当該インスリンコンストラクトをコードするNcoI-XbaI断片に単に置き換える。このようなNcoI-XbaI断片は、合成オリゴヌクレオチドおよびPCRを用いて標準的な技術に従って合成できる。α-リーダーに加えて、他のリーダーを使用することもできる。
Δkex1::TRP1-ΔFA遺伝子破壊
trp1-ΔFA欠失対立遺伝子変異を以下のようにして構築した:
trp1-ΔFA対立遺伝子をコードする合成DNA断片を、合成オリゴヌクレオチド(Horecka J、Jigami Y(1999)、Yeast.:15(1769〜74)、The trp1-ΔFA designer deletion for PCR-based gene functional analysis in Saccharomyces cerevisiae.)および標準的な技術を用いてPCRによって合成した。
TRP1遺伝子破壊の選択に使用する方法は、5-フルオロアントラニル酸を含有する培地上での成長がトリプトファン生合成経路の酵素によって代謝拮抗を引き起こす対抗選択手順を含む。アントラニル酸のトリプトファンへの変換に必要な酵素を欠く酵母細胞は、5-フルオロアントラニル酸に耐性を示す(Toyn,J.H.、Gunyuzlu,P.L.、White,H.、Thompson,L.A.およびG.F.Hollis(2000)、Yeast:16(553〜560)、A counterselection for the tryptophan pathway in yeast:5-fluoroanthranilic acid resistance.)。
518bpのKEX1 5'UTR DNA配列、続いてSphI制限エンドヌクレアーゼ部位、続いてSbf1制限エンドヌクレアーゼ部位、続いて304bpのKEX1 3'UTR DNA配列から構成されるΔkex1-D0対立遺伝子の合成DNA断片を、商業的供給源からインビトロDNA合成によって構築し、得られたものをpMAベクターにクローニングした(Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germany)。このプラスミドを、pFI472と名付けた。SphIおよびSbf1制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するTRP1-FAカセットを含有する合成DNA断片を、商業的供給源からインビトロDNA合成によって構築し、得られたものをpMA-RQベクター(GeneArt ag)にクローニングした。このプラスミドを、pFI468と名付けた。Δkex1::TRP1-FA遺伝子破壊対立遺伝子を含有するプラスミドpFI473を、2つのDNA断片、即ち、SphIおよびSbf1によるpFI472の消化後に得られた3163bp断片並びにSphIおよびSbfIによるpFI468の消化後に得られた872bp断片のライゲーションによって構築した。最後に、pFI473を、XhoIおよびHincIIによって消化させ、Δkex1::TRP1-FA対立遺伝子を含有する1707bp DNA断片を単離し、LiAc手順によるyFI810の形質転換に用いた(Gietz,R.D.およびWood,R.(2002)、Methods in Enzymology:350,(87〜96)、Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.)。形質転換後、Δkex1::TRP1-FA欠失変異体を選択するために、酵母細胞を、トリプトファンを含まない最少培地プレートに蒔いた。KEX1遺伝子座へのΔkex1::TRP1-FA対立遺伝子の正確な組込みを確認するために、TRP+形質転換体をPCRによって特性決定した。酵母菌株yFI815を、Δkex1::TRP1-FA欠失変異体(MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 trp1-δ-FA tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2 kex1::TRP1-FA,pSA281)として単離した。
Δkex1::KanMX4遺伝子破壊
KEX1遺伝子が欠失し、遺伝子型がMatα his3D1 leu2D0 lys2D0 ura3D0 kex1 D0::kanMX4である酵母菌株を、Euroscarf欠失菌株コレクション(deletion strain collection)から購入した(Acc. no.Y14570)。この酵母菌株において、KEX1オープンリーディングフレームをコードするDNA断片は、抗生物質G418/ジェネテシンに対する耐性を与えるKanMX4ドミナント選択可能マーカーで置き換えられている(Wach,A.、Brachat,A.、Poelmann,R.およびPhilippsen,P.(1994)、Yeast:10(1793〜808)、New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae.)。
LC/MSD TOF機器(Agilent)を用いるLC-MS分析を使用して、製造業者が推奨する設定に従って、酵母上清中の分泌ペプチドの分子量を測定した。添付ソフトウェアを用いて、TICクロマトグラムのデコンボリューションを行った。多数の完全長グリシン欠失菌種が、デコンボリューション処理されたスペクトルから得られ、これを、完全長ペプチドvs完全長グリシン欠失ペプチドのプールの割合の評価に用いた(table 1(表1))。
酵母発現系の構築およびEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38の産生
発現プラスミドは、EP171,142に記載されているのと同様なC-POT型のものである。これらは、S.セレビジエにおけるプラスミド選択および安定化のためのシゾサッカロミセス・ポンベトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含有することを特徴とする、2μ-ベースの発現ベクターである。プラスミドはまた、S.セレビジエトリオースリン酸イソメラーゼのプロモーターおよびターミネーターを含有する。これらの配列は、他の全ての配列と同様に、以下を除いてプラスミドpKFN1003中の対応配列(WO9010075に記載)と類似している:1)リーダーおよびインスリン産物の融合タンパク質をコードするEcoRI-XbaI断片の配列。2)サイレント変異が導入されており、結果として発現ベクター中の2μ-領域のNcoI部位が除去されている。種々の融合タンパク質のクローニングを容易にするために、MFα1プレ-プロリーダーをコードするDNA配列を、NcoI部位を組み入れるように変化させた(図1を参照)。これを、MFα1*プレ-プロリーダーと称する。したがって、NcoI-XbaI断片は、当該前駆体分子をコードするNcoI-XbaI断片によって単に置き換えられている。このようなNcoI-XbaI断片は、合成により構築することもできるし、または合成オリゴヌクレオチドおよびPCRを用いて標準的な技術に従って合成することもできる。α-リーダーに加えて、他のリーダーも使用できる。EEAEAK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38をコードする配列を含有する合成DNA断片は、Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germanyから入手した。酵母中での発現を容易にするために、合成アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38に、N末端伸長EEAEKをコードする5'DNA配列(SEQ ID NO:1)を付け加えた。合成DNAをNcoIおよびXbaIで消化し、改変cPOT型発現ベクターのNcoI-XbaIベクター断片につなぎ合わせた(図1)。これにより、配列EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTYG (SEQ ID NO:4)を有するEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、G38をコードする発現プラスミドpSA281を得た。このDNA配列は、以下の配列を有する:
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaat tttgccaccaactaatgttggttctaatacttatggt(SEQ ID NO:5)。
酵母発現系の構築およびPP類似体前駆体分子PP(1〜36)K26 G37の産生
PP(1〜36)K26、G37をコードする配列を含有する合成DNA断片を、Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germanyから入手した。合成DNAをNcoIおよびXbaIで消化し、改変cPOT型発現ベクターのNcoI-XbaIベクター断片につなぎ合わせた(図1)。これにより、以下のアミノ酸配列
APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRKYINMLTRPRYG(SEQ ID NO:6)を有するPP(1〜36)K26 G37をコードする発現プラスミドpSA228を得た。対応するDNA配列は以下の通りである:
gcaccattggaaccagtttacccaggtgataacgcaactccagagcagatggctcagtatgctgcagatttaagaaagtatataa atatgttaacaagaccaagatatggt(SEQ ID NO:7)。
酵母発現系の構築およびEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、X37、G38の産生
C末端グリシン残基の隣のアミノ酸の同一性の効果を調べるために、C末端Glyに結合しているアミノ酸残基(アミノ酸残基No.37)がA、G、F、I、M、S、P、T、W、R、L、QまたはNであるEEAEK-アミリン(1〜37)K1E、S28P、S29P、X37、G38をコードする配列を含有する合成DNA断片を、Geneart AG、BioPark、Josef-Engert-Str. 11、D-93053 Regensburg、Germanyから入手した。合成DNAをNcoIおよびXbaIで消化し、改変cPOT型発現ベクターのNcoI-XbaIベクター断片につなぎ合わせた(図1)。
EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTAG (配列番号:8)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTGG (配列番号:9)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTFG (配列番号:10)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTIG (配列番号:11)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTMG (配列番号:12)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTSG (配列番号:13)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTPG (配列番号:14)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTTG (配列番号:15)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTWG (配列番号:16)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTRG (配列番号:17)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTLG (配列番号:18)、EEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTQG (配列番号:19)およびEEAEKCNTATCATQR-LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTNG (配列番号:20)、
をコードする発現プラスミドを得た。
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactgctggt (配列番号:21);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactggtggt (配列番号:22);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatacttttggt (配列番号:23);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactattggt (配列番号:24);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactatgggt (配列番号:25);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatacttctggt (配列番号:26);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactcctggt (配列番号:27);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactactggt (配列番号:28);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatacttggggt (配列番号:29);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactagaggt (配列番号:30);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactcttggt (配列番号:31);
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactcaaggt (配列番号:32)および
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatactaatggt (配列番号:33)。
Claims (16)
- C末端α-アミド化ポリペプチドの製造方法であって、
a)非機能性KEX1遺伝子を有し、かつ、C末端Glyを有するポリペプチドをコードするDNA配列を含む酵母菌株を、前記酵母菌株中で前記ポリペプチドを発現するための条件下で培養するステップと、
b)ステップa)由来の発現ポリペプチドをα-アミド化するステップと、
c)前記α-アミド化ポリペプチドを単離するステップと
を含む方法。 - ステップb)をin vitroで実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記α-アミド化ポリペプチドが培養培地から単離される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記C末端Glyに結合しているアミノ酸残基が、Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、IleおよびArgからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がVal、Leu、IleまたはMetである、請求項4に記載の方法。
- 前記C末端Glyに結合しているアミノ酸残基がTyr、TrpまたはPheである、請求項4に記載の方法。
- 前記酵母菌株が、PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13およびKEX2からなる群から選択される少なくとも1種のさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記酵母菌株が、PEP4およびYPS1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記酵母菌株が、PEP4およびYPS3からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記酵母菌株が、PEP4およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記酵母菌株が、YPS3およびYPS1からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記酵母菌株が、YPS3およびMKC7からなる群から選択されるさらなる非機能性プロテアーゼ遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記α-アミド化ポリペプチドが、アミリン、アミリン類似体、PPおよびPP類似体、PYYおよびPYY類似体、GLP-1およびGLP1類似体、オキシトシン、バソプレシン、カルシトニン、ガストリン、NPY、FMRFアミド、セクレチン、GFHR、CRF、ニューロキニンA、ガストリン放出ペプチドおよびα-MSHからなる群から選択される、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 前記α-アミド化ポリペプチドが、PP、PYYおよびアミリンからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記α-アミド化ポリペプチドがアミリンである、請求項13に記載の方法。
- 前記α-アミド化ポリペプチドがPPである、請求項13に記載の方法。
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