CN102639559B - 用于制备多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于在特征为具有非功能性<i>KEX1</i>基因的酵母转化体中生产带有C-末端甘氨酸的多肽的改良方法。所述方法尤其相当适合生产带有与C-末端甘氨酸连接的芳族氨基酸残基的多肽。所述酵母菌株可具有选自<i>PEP4</i>、<i>YPS1</i>、<i>MKCl</i>、<i>YPS3</i>、<i>YPS5</i>、<i>YPS6</i>、<i>YPS7</i>、<i>PRB1</i>、<i>STE13</i>和<i>KEX2</i>的另外的非功能性蛋白酶基因。
Description
发明领域
本发明涉及一种用于在基因修饰的酵母菌株中制备多肽的方法。
发明背景
用适宜的包含编码异源蛋白的DNA序列的表达载体转化酵母细胞后在酵母中表达所述蛋白已经成功地用于多种多肽,例如胰岛素前体、胰高血糖素、胰高血糖素样肽和它们的功能类似物。
然而,经常发现表达产物是各种期望的具有不同的氨基酸链长度的多肽前体的异质混合物。这是因为酵母产生大量负责加工较大的前体分子以释放成熟多肽的蛋白水解酶。包括PEP4和KEX1基因产物在内的大量蛋白酶负责这样的酵母蛋白降解。
使用KEX1破坏株用于重组体蛋白的表达早先已有描述。因此,EP341215和US 6,103,515描述使用缺乏KEX1的酵母菌株用于产生不带碱性C-末端氨基酸的肽,例如hANP、EGF、结缔组织活化肽-III、水蛭素和水蛭素变体。
大半已知的神经肽和内分泌肽是α-酰胺化的,且在大多数情况下,此结构特征对受体识别、信号转导和因此对生物学功能是必不可少的。α-酰胺化源自于C-末端甘氨酸,其被酶促转变为酰胺。
如果细胞具有用于体内α-酰胺化的必要机器(machinery),那么可直接在生产细胞中生产α-酰胺化肽。然而,包括酵母在内的一些有机体不能产生α-酰胺化,因为它们不表达用于体内α-酰胺化的必要酶,因此通过细胞生产的肽不得不通过随后的体外步骤α-酰胺化。
如果酵母被用作重组体生产细胞,一个解决方案是生产带有C-末端甘氨酸的前体多肽,然后在随后的体外过程中用α-酰胺化酶将其转变为α-酰胺化肽(D. J. Merkler (1994). C-Terminal amidated peptides: Production by the in vitro enzymatic amidation of glycine extended peptides and the importance of the amide to bioactivity (C-末端酰胺化肽:通过甘氨酸延伸肽的体外酶促酰胺化进行生产和酰胺对生物活性的重要性). Enzyme Microb. Technol.: 16(450-456)。
然而,意想不到地,本发明的发明人等已发现C-末端甘氨酸被从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达的大量肽中切除,使得随后转化为α-酰胺化肽不可能。
本发明通过使用不切除C-末端甘氨酸残基的基因修饰的酵母菌株提供一种针对该问题的解决方案。
发明概述
在一个方面,本发明涉及一种在酵母中制备带有C-末端Gly的多肽的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因。
可通过使用熟知的技术使KEX1基因无功能。因此,在一个实施方案中简单地缺失KEX1基因,而在另一个实施方案中通过位点特异突变(例如通过同源重组)使KEX1基因无功能。
在一个实施方案中,本发明涉及一种在具有非功能性KEX1基因的酵母菌株中制备多肽的方法,其中所述多肽具有甘氨酸作为其C-末端氨基酸残基,且其中所述方法包括以下步骤:
a) 将包含编码多肽的DNA序列的酵母菌株在用于在酵母菌株中表达多肽的条件下培养,和
b) 分离表达的多肽。
表达的多肽可从细胞培养物或从酵母细胞中分离,这取决于表达的多肽是否从酵母细胞中分泌。
如果C-末端倒数第二个氨基酸是以下氨基酸残基之一,那么C-末端甘氨酸特别不稳定:Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg。因此,在一个实施方案中,C-末端倒数第二个氨基酸为Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile或Arg。
“C-末端倒数第二个氨基酸”意指与C-末端氨基酸残基(在该情形中是甘氨酸残基)的N-末端连接的氨基酸残基。
特别地,当C-末端倒数第二个氨基酸是疏水氨基酸残基且特别是芳族氨基酸残基时,C-末端甘氨酸更不稳定。因此,在另一个实施方案中,与C-末端Gly邻接的氨基酸残基是Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、Ile或Met,和在另一个实施方案中,与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Val、Leu、Ile或Met,和在另一个实施方案中,与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr、Phe或Trp。
在又一个实施方案中,与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr。
除非功能性KEX1基因之外,酵母菌株可具有另外的非功能性蛋白酶基因。因此,在一个实施方案中,酵母菌株可具有至少一种选自PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因。
所述多肽的大小也可能是相关的,在另一个实施方案中,多肽在主链中具有约25至约75个氨基酸残基。在另一个实施方案中,多肽在主链中具有约25至约60个氨基酸残基,和在又一个实施方案中,多肽在主链中具有约25至约45个氨基酸残基。
酵母菌株可以是任何能表达和分泌外源DNA的酵母菌株。然而,在一个实施方案中,酵母菌株是酿酒酵母菌株。
本发明的方法可包括另外酶促转变表达和分泌的多肽。因此,在本发明一个实施方案中,通过在另外的体外步骤中用α-酰胺化酶进行酶促转变,将带有C-末端Gly的表达和分泌的多肽转变为酰胺。
发明详述
如提到的,已证明在酿酒酵母菌株中带有C-末端甘氨酸的肽的表达是成问题的,因为甘氨酸被有效切除,特别是如果C-末端倒数第二个氨基酸是酪氨酸,如在PP (胰多肽)、PYY和淀粉状蛋白毒素(amylin)中,根据本发明,已发现在酵母菌株中负责切割C-末端甘氨酸的蛋白酶是Kex1p蛋白酶。
“Kex1”或“Kex1p”意指优先催化脱去C-末端赖氨酰和/或精氨酰残基的丝氨酸羧肽酶(Shilton BH, Thomas DY, Cygler M 1997 Crystal structure of Kex1 deltap, a prohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母的激素原加工羧肽酶Kex1 Δp的晶体结构). Biochemistry 36: 9002-9012)。Kex1p或羧肽酶yscα是膜相关外肽酶,并在酵母中放毒者因子和交配因子的成熟中有重要作用。该酶对C-末端碱性氨基酸残基(Arg和Lys)有高的特异性。KEX1酶的特异性由a.o. Heim等, Eur. J. Biochem 226: 341-353 (1994))使用脱硫水蛭素(desulfato-hirudin)及其突变体作为模型底物进一步研究。
本发明描述了使用具有非功能性KEX1基因的酵母菌株表达具有C-末端甘氨酸氨基酸残基的小肽。已显示该甘氨酸对Kex1p的切割非常不稳定,使得难以在酵母中有效表达这些肽。
在该上下文中,“小肽”意指具有至多约75个氨基酸残基的肽。在一个实施方案中,所述肽具有至多约60个氨基酸残基,在另一个实施方案中,所述肽具有至多约50个氨基酸残基。在又一个实施方案中,所述肽具有约25至约45个氨基酸残基。
本发明可生产的肽的说明性而非限制性实例是淀粉状蛋白毒素、淀粉状蛋白毒素类似物、PP和PP类似物、PYY和PYY类似物、GLP-1和GLP-1类似物、催产素、加压素、降钙素、胃泌素、NPY、FMRF酰胺、分泌素、GFHR、CRF、神经激肽A、胃泌素释放肽和α-MSH。
在一个实施方案中,可生产的肽选自具有与甘氨酸残基连接的芳族氨基酸残基的肽。因此,在一个实施方案中,所述肽选自胃泌素、NPY、FMRF酰胺和淀粉状蛋白毒素及其类似物。
表述“多肽”意在涵盖“肽”以及“蛋白”。本文使用的“类似物”意指具有形式上可通过缺失和/或交换天然存在的多肽中存在的至少一个氨基酸残基从天然存在的多肽的结构衍生的分子结构的多肽。增加和/或交换的氨基酸残基可为可编码的氨基酸残基或者是其它天然存在的残基或者是完全合成的氨基酸残基。
蛋白酶的活性可通过破坏编码蛋白酶的宿主基因来消除,从而产生丢失包括调节区和/或编码区在内的全部或部分蛋白酶基因的非回复型菌株,或备选地,活性可通过经典诱变步骤或通过引入特异性位点突变来降低或消除。使用经典技术破坏编码Kex1p蛋白酶的基因依赖同源重组,其中两个相似或相同链的DNA互换核苷酸序列。这允许将重组事件特异性地导向KEX1基因座,从而KEX1开放阅读框与用于选择正确缺失的标记基因互换(Rothstein R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast (靶向、破坏、置换和等位基因拯救:酵母中的整合DNA转化). 1991. Methods Enzymol. 194:281-301)。在这样的一个方式中,用由侧翼为与KEX1基因侧翼DNA序列同源的DNA序列的标记基因组成的线性DNA片段(来自质粒或通过PCR产生)转化酵母菌株。成功的整合将用可选择的标记基因代替KEX1基因。适宜的标记是营养缺陷型标记例如URA3、HIS3、LEU2、TRP1,或给予针对G418、潮霉素等的抗性的主要抗生素标记。
可适用于下调蛋白酶活性的适宜的其它方法包括在酵母中引入反义构建体和/或核酶构建体,例如Atkins等(Antisense and Development 5: 295-305, 1995)和Nasr等(Mol. Gen Genet 249: 51-57, 1995)。Rothstein (Method in Enzymol, 194: 281-301,1991)描述了在酵母菌株中破坏KEX1基因的一个有用的方法。
取决于期望的终产物,可对酵母宿主细胞进行进一步基因操作。作为实例,可使一个或多个另外的蛋白酶基因无功能。这样的蛋白酶基因的实例是PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2。这对于避免表达的肽的额外降解可能是必要的。
在一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的一个蛋白酶基因。
在另一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的两个蛋白酶基因。
在另一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的三个蛋白酶基因。
在另一个实施方案中,酵母菌株被敲除KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13 和 KEX2的四个蛋白酶基因。
在一个实施方案中,使KEX1和PEP4基因无功能。这样的酵母菌株特别适宜用于表达带有C-末端甘氨酸的淀粉状蛋白毒素、PP和PYY及其类似物。
在另一个实施方案中,酵母菌株具有破坏的KEX1基因和破坏的酵母天冬氨酰蛋白酶3 (Yap3p)基因(YPS1)。破坏酵母天冬氨酰蛋白酶3 (Yap3p)基因在WO 95/23857中被描述用于生产重组人白蛋白(rHA),和在描述生产短链多肽的US 6,110,703中有述。
因此,本发明另一个实施方案包括敲除了KEX1和YAP3IYPS1基因二者的酵母菌株。
表述“敲除”意指该基因全部缺失或者如先前所述使其无功能。
本发明的方法产生带有完整C-末端的非降解肽。这有高的商业价值,因为生产同质产物将显著减少纯化成本。
在再一方面,本发明涉及一种用于制备C-末端酰胺化肽的方法,所述方法包括以下步骤:a)在用于在酵母菌株中表达多肽的条件下培养具有非功能性KEX1基因和包含编码带有C-末端Gly的多肽的DNA序列的酵母菌株,b)来自步骤a)的表达的多肽的体外α-酰胺化,和b) C-末端酰胺化肽的分离和纯化。
在另一方面,本发明提供一种具有非功能性KEX1基因的酵母细胞培养物,其包含编码带有C-末端Gly残基的多肽的多核苷酸序列,所述多核苷酸序列或DNA序列与编码酵母启动子和前导序列(原序列(pro sequence)或前原序列(prepro sequence))的多核苷酸序列或DNA序列和/或酵母表达和分泌所述多肽所必要的其它多核苷酸序列或DNA序列有效连接。
所述编码多肽的DNA可与用于引入合适宿主的多种其它DNA序列相连。伴随DNA取决于宿主的性质、将DNA引入宿主的方式和是否期望在宿主染色体上维持或整合游离基因。
通常,将DNA在用于表达的合适的取向和正确的阅读框内插入表达载体,例如质粒。然后通过标准技术将载体引入宿主,通常,选择转化的宿主细胞是必要的。
在载体中,多核苷酸序列或DNA序列与编码酵母启动子和前导序列(原序列或前原序列)的多核苷酸序列或DNA序列和/或酵母表达和分泌所述多肽所必要的其它多核苷酸序列或DNA序列有效连接。
如果期望整合,那么将DNA在用于表达的合适的取向和正确的阅读框(其侧翼为任何非必要酵母基因、转座子序列或核糖体基因的同源序列)内插入酵母整合质粒载体,例如pJJ215、pJJ250、pJJ236、pJJ248、pJJ242 (Jones & Prakash, Yeast 6: 363,1990)或pDP6 (Fleig 等 Gene 46:237, 1986)。优选地,侧翼序列为酵母蛋白酶基因或用作选择标记的基因。然后通过发生在侧翼序列中的同源重组将DNA整合在宿主染色体上,这通过使用Rothstein (Method in Enzymol, 194: 281-301, 1991)和Cregg等(Bio/Technol. 11:905-910, 1993)所示的标准技术。
然后将被本发明的重组DNA转化的宿主细胞在本领域技术人员考虑到本文公开的教导而知晓的适当条件下培养同样知晓的足够时间,以使能够表达和分泌待根据本发明的方法生产的多肽。
有用的酵母质粒载体包括POT (Kjeldsen 等 Gene 170: 107-112, 1996)和YEp13、YEp24 (Rose and Broach, Methods in Enzymol. 185: 234-279, 1990)和pG质粒(Schena 等 Methods in Enzymol. 194: 289-398, 1991)。
用于转化酿酒酵母的方法包括原生质球转化、醋酸锂转化和电穿孔,参照Methods in Enzymol. 第194卷 (1991)。优选地,转化如本文实施例中所述。
用于酿酒酵母的合适启动子包括MFα1 启动子、半乳糖诱导型启动子(例如GAL1、GAL7和GAL10启动子)、糖酵解酶启动子(包括TPI和PGK启动子)、TRP1启动子、CYCI启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、ADH1启动子和HSP启动子。在毕赤酵母属中适宜的启动子是AOXI (甲醇利用)启动子。
转录终止信号优选真核基因的3’侧翼序列,其包含用于转录终止和聚腺苷酸化的适当信号。适宜的3’侧翼序列可为例如与使用的表达控制序列(即相当于启动子)天然连接的基因的序列。
用于提供期望多肽的分泌表达的DNA构建体包括包含通过酵母加工信号与多肽连接的前导序列的DNA序列。前导序列包含用于蛋白质易位穿过内质网的信号肽(“前序列(pre-sequence)”)和任选包含另外的序列(“原序列”),其在多肽被释放到周围培养基中之前在酵母细胞中可或可不被切割。有用的前导序列是小鼠α-淀粉酶信号肽、酿酒酵母MFα1、YAP3、BAR1、HSP150和克鲁弗酵母(S. kluyveri) MFα信号肽和酿酒酵母MFα1、YAP3、PRC、HSP150和克鲁弗酵母MFα的前原序列和在WO 92/11378、WO 90/10075和WO 95/34666中所述的合成前导序列。此外,根据本发明的方法生产的多肽可提供有如WO 95/35384所述的N-末端延伸。
编码期望肽的DNA序列可以是基因组来源或cDNA来源,例如通过制备基因组文库或cDNA文库并通过依照标准技术(参见例如:Sambrook, J, Fritsch, EF 和 Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)使用合成寡核苷酸探针杂交来筛选编码全部或部分多肽的DNA序列。编码多肽的DNA序列也可通过建立的标准方法合成制备,例如Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869所述的氨基亚磷酸酯方法或Matthes等, EMBO Journal 3 (1984), 801-805所述的方法。DNA序列也可通过使用特异性引物的聚合酶链式反应制备,例如在US 4,683,202或Saiki 等, Science 239 (1988), 487-491中所述。
引入DNA序列或重组载体的酵母宿主细胞可以是任何能表达多肽的酵母细胞,包括酵母属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.),特别是酿酒酵母或克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)菌株。适宜酵母细胞的另外实例是克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株,例如乳酸克鲁维酵母(K. lactis);汉逊酵母属(Hansenula)菌株,例如多形汉逊酵母(H. polymorpha);或毕赤酵母属(Pichia)菌株,例如巴斯德毕赤酵母(P. pastoris) (参见Gleeson 等, J. Gen. Microbiol. 132, 1986, 第3459-3465页; US 4,882,279)。
用异源DNA转化酵母细胞并从中生产异源多肽的方法描述于例如US 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、5,037,743和US 4,845,075。通过由选择标记决定的表型筛选转化的细胞,表型通常为药物抗性或在特定养分例如亮氨酸不存在下生长的能力。在酵母中使用的优选载体是在US 4,931,373中公开的POT1载体。“POT”是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)丙糖磷酸异构酶基因,和“TPI1”是酿酒酵母丙糖磷酸异构酶基因。
表述“可编码的氨基酸”或“可编码的氨基酸残基”用于指可通过核苷酸的三联体(“密码子”)编码的氨基酸或氨基酸残基。
在本上下文中,氨基酸的三字母或一字母标志以其常规意思使用,如下表中所示。除非明确指出,本文提到的氨基酸是L-氨基酸。另外,除非另外规定,肽的氨基酸序列的左端和右端分别是N-末端和C-末端。
在以下列实施例中进一步详细描述本发明,实施例不以任何方式限制所要求保护的本发明范围。附图意在被视为本发明的说明书和描述的必要组成部分。全部引用的参考文献对于其中描述的所有内容通过引用具体结合到本文中。
本发明涵盖下列实施方案:
实施方案1:在具有非功能性KEX1基因的酵母菌株中制备多肽的方法,其中,多肽具有甘氨酸作为C-末端氨基酸残基,且其中所述方法包括以下步骤:
a) 在用于在酵母菌株中表达多肽的条件下培养包含编码多肽的DNA序列的酵母菌株,和
b) 分离表达的多肽;
实施方案2:实施方案1的方法,其中多肽从培养基中分离;
实施方案3:实施方案1-2的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基选自Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg;
实施方案4:实施方案3的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、Ile和Met;
实施方案5:实施方案3的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Val、Leu、Ile和Met;
实施方案6:实施方案3的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr、Trp或Phe;
实施方案7:实施方案6的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr;
实施方案8:实施方案1-7中任一项的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13 和KEX2的至少一种另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案9:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4、YPS1和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案10:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4、YPS1和YPS3的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案11:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4、YPS3和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案12:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和YPS1的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案13:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和YPS3的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案14:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案15:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3、YPS1和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案16:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和YPS1的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案17:实施方案的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案18:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和YPS5的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案19:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和YPS6的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案20:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和YPS7的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案21:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和PBR1的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案22:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和STE13的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案23:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自PEP4和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案24:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和YPS5的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案25:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和YPS6的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案26:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和YPS7的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案27:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和PBR1的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案28:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和STE13的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案29:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS3和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案30:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS1和PBR1的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案31:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS1和STE13的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案32:实施方案8的方法,其中酵母菌株具有选自YPS1和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因;
实施方案33:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性PEP4基因;
实施方案34:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS1基因;
实施方案35:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性MKC7基因;
实施方案36:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS3基因;
实施方案37:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS5基因;
实施方案38:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS6基因;
实施方案39:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS7基因;
实施方案40:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性PBR1基因;
实施方案41:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性STE13基因;
实施方案42:实施方案1的方法,其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性KEX2基因;
实施方案43:实施方案1的方法,其中酵母菌株敲除了KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的一个蛋白酶基因;
实施方案44:实施方案1的方法,其中酵母菌株敲除了KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的两个蛋白酶基因;
实施方案45:实施方案1的方法,其中酵母菌株敲除了KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX的三个蛋白酶基因;
实施方案46:实施方案1的方法,其中酵母菌株敲除了KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7(YPS2)、YPS3(YPS4)、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的四个蛋白酶基因;
实施方案47:前述实施方案中任一项的方法,其中已缺失KEX1基因;
实施方案48:前述实施方案中任一项的方法,其中通过突变,例如通过同源重组使KEX1基因无功能;
实施方案49:前述实施方案中任一项的方法,其中多肽在主链中具有25至约45个氨基酸残基;
实施方案50:前述实施方案中任一项的方法,其中多肽选自淀粉状蛋白毒素、淀粉状蛋白毒素类似物、PP和PP类似物、PYY和PYY类似物、GLP-1和GLP-1类似物、催产素、加压素、降钙素、胃泌素、NPY、FMRF酰胺、分泌素、GFHR、CRF、神经激肽A、胃泌素释放肽和α-MSH;
实施方案51:实施方案50的方法,其中多肽选自PP、PYY和淀粉状蛋白毒素;
实施方案52:实施方案50的方法,其中多肽是淀粉状蛋白毒素;
实施方案53:实施方案50的方法,其中多肽是PP;
实施方案54:实施方案50的方法,其中多肽是PYY;
本发明涵盖本文所描述的实施方案和方面的任何组合。
实施例
一般步骤
所有表达质粒是C-POT型,与在EP 171,142中所述那些相似。它们是基于2μ的表达载体,特征在于,含有用于在酿酒酵母中质粒选择和稳定化目的的粟酒裂殖酵母丙糖磷酸异构酶基因(POT)。质粒也含有酿酒酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子。这些序列与质粒pKFN1003 (在WO 9010075中所述)中的对应序列相似。为有利于克隆不同融合蛋白,改变编码MFα1前原前导序列的DNA序列以掺入NcoI位点,且称其为MFα1*前原前导序列。因此,将NcoI-XbaI片段简单地替换为编码目标胰岛素构建体的NcoI-XbaI片段。这样的NcoI-XbaI片段可根据标准技术使用合成寡核苷酸和PCR合成。除了α-前导序列之外,可使用其它前导序列。
酵母转化体及其衍生物通过转化宿主菌株酿酒酵母菌株制备。将酵母菌株在YPGaL(1% Bacto酵母提取物、2% Bacto蛋白胨、2%半乳糖、1% 乳糖)上培养至600 nm的O.D.为0.6。通过离心收获100 ml培养物,用10 ml水洗涤,重离心和并重悬在10 ml包含1.2 M山梨醇、25 mM Na2EDTA pH = 8.0和6.7 mg/ml二硫苏糖醇的溶液中。将悬液在30℃孵育15分钟,离心,并将细胞重悬在10 ml包含1.2 M山梨醇、10 mM Na2EDTA、0.1 M柠檬酸钠、pH 0 5.8和2 mg NovozymC3234的溶液中。将悬液在30℃孵育30分钟,通过离心收集细胞,在10 ml 1.2 M山梨醇和10 ml CAS (1.2 M山梨醇、10 mM CaCl2、10 mM Tris HCl (Tris = 三(羟甲基)-氨基甲烷) pH = 7.5)中洗涤,并重悬在2 ml CAS中。对于转化,将1 ml CAS悬浮细胞与大约0.1 mg质粒DNA混合,并在室温下静置15分钟。加入1 ml (20%聚乙二醇4000、10 mM CaCl2、10 mM Tris HCl、pH = 7.5),将混合物在室温下进一步静置30分钟。离心混合物,将沉淀重悬在0.1 ml SOS (1.2 M山梨醇、33% v/v YPD、6.7 mM CaCl2)中,在30℃孵育2小时。然后离心悬液,将沉淀重悬在0.5 ml 1.2 M山梨醇中。然后,在52℃下加入上层琼脂(Sherman 等 (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory的SC培养基)包含1.2 M山梨醇和2.5%琼脂),将悬液倾倒在包含相同琼脂固化的含山梨醇的培养基的平板上层。
实施例1
Δkex1::TRP1- Δ FA基因破坏
如下构建trp1-ΔFA缺失等位基因突变:
通过使用合成寡核苷酸的PCR (Horecka J, Jigami Y. (1999). The trp1- Δ FA designer deletion for PCR-based gene functional analysis in Saccharomyces cerevisiae (用于酿酒酵母中基于PCR的基因功能分析的trp1- Δ FA设计缺失). Yeast.: 15 (1769-74))和标准技术合成编码trp1-ΔFA等位基因的合成DNA片段。
trp1-ΔFA片段由来自KEX1 5’UTR区的476 bp片段直接与来自KEX1 3’UTR区的525 bp片段融合组成,这样避免同源DNA序列与用于在pFA6a-TRP1质粒中作为选择标记的TRP1-FA盒重叠(Longtine, M.S., McKenzie, A., Demarini, D., Shah, N.G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P. 和 Pringle, J.R. (1998). Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母中多功能和经济的基于PCR的基因缺失和修饰的另外模块). Yeast: 14., (953-961))。按照制造商(Invitrogen)所述将trp1-ΔFA PCR片段克隆到TOPO-CR2.1载体中以产生质粒pFI379。
trp1-ΔFA缺失酵母菌株如下得到:
用于选择TRP1基因破坏的方法包括反选步骤,在包含5-氟邻氨基苯甲酸的培养基上生长通过色氨酸生物合成途径中的酶产生抗代谢作用。缺乏将邻氨基苯甲酸转化为色氨酸所需要的酶的酵母细胞对5-氟邻氨基苯甲酸有抗性(Toyn, J.H., Gunyuzlu, P.L., White, H., Thompson, L.A. 和 G.F. Hollis (2000). A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance (酵母中色氨酸途径的反选:5-氟邻氨基苯甲酸抗性). Yeast: 16 (553-560))。
用质粒pSA281转化酵母宿主菌株NNY574 (MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2)以建立yFI754,质粒pSA281是用于淀粉状蛋白毒素类似物前体EEAEK(SEQ ID NO:1)-淀粉状蛋白毒素 (1-37)-K1E、S28P、S29P、G38的分泌表达的酵母表达载体。pSA281的质粒主链基于cPOT型载体,通过补充宿主菌株的Δ-tpi1突变而有助于在包含葡萄糖作为唯一碳源的丰富培养基上生长。
使用pFI379作为模板和合成寡核苷酸和标准方法,通过PCR扩增trp1-ΔFA片段。通过LiAc方法(Gietz 和 Wood, 2002)将trp1-ΔFA PCR片段直接用于yFI754的转化。转化后,将酵母细胞铺板在YEPD琼脂上,并在30 ?C孵育过夜,然后影印培养至包含5-氟邻氨基苯甲酸的极限培养基上。通过使用5-氟邻氨基苯甲酸针对TRP1基因的存在进行反选(Toyn 等, 2000),完成将trp1-ΔFA缺失等位基因整合到基因组中的酵母细胞的选择,产生trp1- Δ FA酵母菌株yFI810。
Δkex1::TRP1-FA基因破坏等位基因如下构建:
由518 bp的KEX1 5’UTR DNA序列、接着SphI限制性内切核酸酶位点、接着Sbf1限制性内切核酸酶位点、接着304 bp的KEX1 3’UTR DNA序列组成的Δkex1-D0等位基因的合成DNA片段,其通过商业来源的体外DNA合成而构建和得到,并将其克隆到pMA载体中(Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Germany)。将该质粒命名为pFI472。包含侧翼为SphI和Sbf1限制性内切核酸酶位点的TRP1-FA盒的合成DNA片段通过商业来源的体外DNA合成构建和得到,并将其克隆到pMA-RQ载体(GeneArt ag)中。将该质粒命名为pFI468。通过连接以下两个DNA片段来构建包含Δkex1::TRP1-FA基因破坏等位基因的质粒pFI473:用SphI和Sbf1消化pFI472后得到的3163 bp片段以及用SphI和Sbf1消化pFI468后得到的872 bp片段。最后,用XhoI和HincII消化pFI473,分离包含Δkex1::TRP1-FA等位基因的1707 bp DNA片段并用于通过LiAc步骤转化yFI810 (Gietz, R.D. 和 Wood, R. (2002). Transformation of yeast by lithium acetate / single-stranded carrier DNA / polyethylene glycol method (通过醋酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇方法转化酵母). Methods in Enzymology: 350, (87 – 96))。转化后,将酵母细胞铺板在无色氨酸的极限培养基平板上,以选择Δkex1::TRP1-FA缺失突变体。通过PCR表征TRP+转化体,以证实将Δkex1::TRP1-FA等位基因正确整合到KEX1基因座中。分离酵母菌株yFI815作为Δkex1::TRP1-FA缺失突变体(MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 trp1-Δ-FA tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2 kex1::TRP1-FA, pSA281)。
实施例2
Δkex1::KanMX4基因破坏
缺失KEX1基因并具有基因型Matα his3D1 leu2D0 lys2D0 ura3D0 kex1D0::kanMX4的酵母菌株购自Euroscarf缺失菌株保藏中心(Euroscarf deletion strain collection) (保藏号Y14570)。在该酵母菌株中,编码KEX1开放阅读框的DNA片段由KanMX4显性选择标记代替,该选择标记赋予对抗生素G418/遗传霉素的抗性(Wach A., Brachat, A., P?elmann R. and Philippsen, P. (1994). New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae (用于酿酒酵母中经典或基于PCR的基因破坏的新的异源模块). Yeast: 10 (1793-808)。
从Y14570分离基因组DNA,并在使用合成寡核苷酸oTKLH68 (cccggaaccgaaaaacaatgtgga) (SEQ ID NO:2)和oILLa482 (agttcagtagtgtgaattaaataaaacagtcagttcttgatggattgtaccctttaaag-aatttatctttatg) (SEQ ID NO:3)的标准PCR反应中用作模板,以扩增包含Δkex1::KANMX4缺失等位基因盒的合成DNA片段。该DNA片段直接用于通过LiAc方法转化yFI650 (具有cPOT质粒pSA082的宿主菌株NNY574) (Gietz, R.D. 和 Wood, R. (2002). Transformation of yeast by lithium acetate / single-stranded carrier DNA / polyethylene glycol method (通过醋酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇方法转化酵母). Methods in Enzymology: 350, (87 – 96))。转化后,将酵母细胞铺板在YEPD琼脂上,在30?C孵育过夜,随后影印培养到选择性YEPD琼脂 + 200 mg/L G418上。分离在30?C进一步孵育3天后出现的酵母克隆并通过PCR表征,以证实将Δkex1::KanMX4等位基因正确整合到KEX1基因座中。分离酵母菌株yFI750作为Δkex1::KanMX4缺失突变体(MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 trp1-Δ-FA tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2 kex1::KanMX4, pSA082)。通过无葡萄糖选择地培养多代来诱导从yFI750除去cPOT质粒。将所得酵母菌株yFI751 (MATα ura3-D0 leu2-D0 his3-D0 trp1-Δ-FA tpi1::URA3 yps1::HIS3 pep4::LEU2 kex1::KanMX4)用作新的宿主菌株,以用cPOT型酵母表达载体转化。
实施例3
根据制造商推荐的设置,使用LC/MSD TOF仪器(Agilent)进行LC-MS分析用于测定酵母上清液中的分泌肽的分子量。使用随附的软件进行TIC色谱图的去卷积。从去卷积谱图得到全长和甘氨酸缺失物类的丰度,并用于估计全长肽对全长肽和甘氨酸缺失肽混合物的百分比(表1)。
表1:
根据表1看来,在具有缺失的(非功能性) KEX1基因的菌株中带有C-末端甘氨酸的多肽的表达大约使全长产物表达翻倍。
实施例4
酵母表达系统的构建和EEAEK-淀粉状蛋白毒素(1-37) K1E、S28P、S29P、G38的生产
表达质粒是C-POT型,与在EP 171,142中所述那些相似。它们是基于2μ的表达载体,特征在于,包含用于在酿酒酵母中质粒选择和稳定化目的的粟酒裂殖酵母丙糖磷酸异构酶基因(POT)。这些质粒也包含酿酒酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子。这些序列中除以下之外的所有其他序列与质粒pKFN1003(在WO 90100075中所述)中的对应序列相似:1)编码前导序列和胰岛素产物的融合蛋白的EcoRI-XbaI片段序列。2)引入沉默突变导致除去表达载体中2μ-区中的NcoI-位点。为了有助于克隆不同融合蛋白,改变编码MFα1前原前导序列的DNA序列以掺入NcoI位点(见图1),并称为MFα1*前原前导序列。这样,NcoI-XbaI片段简单地由编码目标前体分子的NcoI-XbaI片段替换。这样的NcoI-XbaI片段可根据标准技术使用合成寡核苷酸和PCR合成构建或者合成。除α-前导序列之外,可使用其它前导序列。包含编码EEAEAK-淀粉状蛋白毒素 (1-37) K1E、S28P、S29P、G38的序列的合成DNA片段获自Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Germany。合成的淀粉状蛋白毒素(1-37) K1E、S28P、S29P、G38提供有编码N-末端延伸EEAEK (SEQ ID NO:1)的5’ DNA序列,以有助于在酵母中表达。用NcoI和XbaI消化合成的DNA,并将其与改良的cPOT型表达载体的NcoI – XbaI载体片段连接(图1)。这产生编码具有序列EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTYG (SEQ ID NO: 4)的EEAEK-淀粉状蛋白毒素(1-37) K1E、S28P、S29P、G38的表达质粒pSA281。该DNA序列具有以下序列:
gaagaagctgaaaaagaatgtaatactgctacttgtgctactcaaagattggctaattttttggttcattcttctaataattttggtccaattttgccaccaactaatgttggttctaatacttatggt (SEQ ID NO:5)。
表达质粒在大肠杆菌(E. coli)中增殖,在氨苄青霉素存在下生长和使用标准技术(Sambrook 等, 1989)分离。通过合适的限制性核酸酶(例如EcoRI、NcoI、XbaI)针对插入检查质粒DNA,序列分析显示其包含Ext_淀粉状蛋白毒素 (1-37) K1E、S28P、S29P、G38的合适序列。
将质粒转化入酿酒酵母菌株NNY547和yFI751中。通过在YPD (1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)琼脂(2%)平板上利用葡萄糖作为碳源来选择含有质粒的酵母转化体。将所得酵母菌株接种到5 ml包含葡萄糖作为唯一碳源的生长培养基上生长。培养在30℃进行3天。离心后取出上清液用于LC/MS分析,通过该方法如上所述证实分泌的分子的性质。
实施例5
酵母表达系统的构建和PP类似物前体分子PP(1-36) K26 G37的生产
包含编码PP(1-36) K26、G37的序列的合成DNA片段获自Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Germany。用NcoI和XbaI消化合成DNA,并将其与改良的cPOT型表达载体的NcoI – XbaI载体片段连接(图1)。这产生编码有下列氨基酸序列的PP(1-36) K26 G37的表达质粒pSA228:
APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRKYINMLTRPRYG (SEQ ID NO:6)。对应的DNA序列如下:
gcaccattggaaccagtttacccaggtgataacgcaactccagagcagatggctcagtatgctgcagatttaagaaagtatataaatatgttaacaagaccaagatatggt (SEQ ID NO:7)。
如上所述,证实表达载体的性质,将质粒转化入酿酒酵母,培养酵母菌株并收获分泌的蛋白。
实施例6
酵母表达系统的构建和EEAEK-淀粉状蛋白毒素(1-37) K1E、S28P、S29P、X37、G38的生产
为了检查与C-末端甘氨酸残基邻接的氨基酸的性质的影响,从Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Germany得到包含编码EEAEK-淀粉状蛋白毒素(1-37) K1E、S28P、S29P、X37、G38的序列的合成DNA片段,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基(氨基酸残基第37号)是A、G、F、I、M、S、P、T、W、R、L、Q或N。用NcoI和XbaI消化合成DNA,并将其与改良的cPOT型表达载体的NcoI – XbaI载体片段连接(图1)。
这产生编码以下序列的表达质粒:EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTAG (SEQ ID NO:8)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTGG (SEQ ID NO:9)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTFG (SEQ ID NO:10)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTIG (SEQ ID NO:11)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTMG (SEQ ID NO 12)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTSG (SEQ ID NO:13)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTPG (SEQ ID NO:14)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTTG (SEQ ID NO:15)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTWG (SEQ ID NO:16)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTRG (SEQ ID NO:17)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTLG (SEQ ID NO:18)、EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTQG (SEQ ID NO:19)和EEAEKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTNG (SEQ ID NO:20),
对应的DNA序列如下:
。
如上在实施例3和4中所述,证实表达载体的性质,将质粒转化入酿酒酵母,培养酵母菌株,收获分泌的蛋白并分析。从去卷积谱图得到全长和甘氨酸缺失物类的丰度,并用于估计全长肽对全长肽和甘氨酸缺失肽的混合物的百分比。从表2显示结果。从表2看来,当与Gly连接的氨基酸残基是Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg之一时,淀粉状蛋白毒素分子中的C-末端Gly被切除。
表2
Claims (52)
1.用于在具有非功能性KEX1基因的酵母菌株中制备多肽的方法,其中,与C-末端Gly连接的氨基酸残基选自Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg,且其中,所述多肽具有甘氨酸作为其C-末端氨基酸残基,且其中所述方法包括以下步骤:
a) 将包含编码所述多肽的DNA序列的所述酵母菌株在用于在所述酵母菌株中表达所述多肽的条件下培养,和
b) 分离表达的多肽。
2.权利要求1的方法,其中所述多肽从培养基中分离。
3.权利要求1的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基选自Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg。
4.权利要求1的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基选自Tyr、Trp、Phe、Leu、Ile和Met。
5.权利要求1的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基选自Leu、Ile和Met。
6.权利要求1的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基选自Tyr、Trp和Phe。
7.权利要求1的方法,其中与C-末端Gly连接的氨基酸残基是Tyr。
8.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株是酿酒酵母菌株。
9.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4、YPS1和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因。
10.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4、YPS1和YPS3的另外的非功能性蛋白酶基因。
11.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4、YPS3和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因。
12.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和YPS1的另外的非功能性蛋白酶基因。
13.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和YPS3的另外的非功能性蛋白酶基因。
14.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因。
15.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3、YPS1和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因。
16.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和YPS1的另外的非功能性蛋白酶基因。
17.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和MKC7的另外的非功能性蛋白酶基因。
18.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和YPS5的另外的非功能性蛋白酶基因。
19.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和YPS6的另外的非功能性蛋白酶基因。
20.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和YPS7的另外的非功能性蛋白酶基因。
21.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和PRB1的另外的非功能性蛋白酶基因。
22.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和STE13的另外的非功能性蛋白酶基因。
23.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自PEP4和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因。
24.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和YPS5的另外的非功能性蛋白酶基因。
25.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和YPS6的另外的非功能性蛋白酶基因。
26.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和YPS7的另外的非功能性蛋白酶基因。
27.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和PRB1的另外的非功能性蛋白酶基因。
28.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和STE13的另外的非功能性蛋白酶基因。
29.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS3和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因。
30.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS1和PRB1的另外的非功能性蛋白酶基因。
31.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS1和STE13的另外的非功能性蛋白酶基因。
32.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有选自YPS1和KEX2的另外的非功能性蛋白酶基因。
33.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性PEP4基因。
34.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS1基因。
35.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性MKC7基因。
36.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS3基因。
37.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS5基因。
38.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS6基因。
39.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性YPS7基因。
40.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性PRB1基因。
41.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性STE13基因。
42.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株具有非功能性KEX1基因和非功能性KEX2基因。
43.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株敲除了KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的一个蛋白酶基因。
44.权利要求1的方法,其中所述酵母菌株敲除了KEX1基因和选自PEP4、YPS1、MKC7、YPS3、YPS5、YPS6、YPS7、PRB1、STE13和KEX2的两个蛋白酶基因。
45.权利要求1的方法,其中已缺失KEX1基因。
46.权利要求1的方法,其中通过突变使KEX1基因无功能。
47.权利要求1的方法,其中所述多肽在主链中由25至45个氨基酸残基组成。
48.权利要求1的方法,其中所述多肽选自淀粉状蛋白毒素、淀粉状蛋白毒素类似物、胰多肽及其类似物、酪酪肽及其类似物、胰高血糖素样肽1及其类似物、催产素、加压素、降钙素、胃泌素、神经肽Y、FMRF酰胺、分泌素、生长因子激素受体、促肾上腺皮质素释放因子、神经激肽A、胃泌素释放肽和α-促黑素细胞激素。
49.权利要求48的方法,其中所述多肽选自胰多肽、酪酪肽和淀粉状蛋白毒素。
50.权利要求48的方法,其中所述多肽是淀粉状蛋白毒素。
51.权利要求48的方法,其中所述多肽是胰多肽。
52.权利要求48的方法,其中所述多肽是酪酪肽。
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