JPH0824565B2 - ポリペプチドの製造における改良 - Google Patents
ポリペプチドの製造における改良Info
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- JPH0824565B2 JPH0824565B2 JP1112294A JP11229489A JPH0824565B2 JP H0824565 B2 JPH0824565 B2 JP H0824565B2 JP 1112294 A JP1112294 A JP 1112294A JP 11229489 A JP11229489 A JP 11229489A JP H0824565 B2 JPH0824565 B2 JP H0824565B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換DNA技術の分野に関し、そして特に、
遺伝子操作された酵母細胞によるポリペプチドの製造の
ための改良された方法、該遺伝子操作された細胞、及び
該酵母細胞の製造方法に関する。
遺伝子操作された酵母細胞によるポリペプチドの製造の
ための改良された方法、該遺伝子操作された細胞、及び
該酵母細胞の製造方法に関する。
最近、非常に多数の異種蛋白質が、該蛋白質、例えば
α−インターフェロン〔IFNα,Hitzeman等（1981）Natu
re 294,717-722〕、リゾチーム〔Oberto等（1985）Gene
40,57-65〕、α−アミラーゼ〔Sato等（1986）Gene 5
0,247-257〕、組織プラスミノーゲン活性化因子〔t-P
A、ヨーロッパ特許出願No.143,081〕、又はデスルファ
トヒルジン〔ヨーロッパ特許出願No.225,633〕をコード
するDNA配列を含んで成る適当な発現ベクターによる酵
母細胞の形質転換後に酵母において発現されている。し
かしながら、多くの場合、異質蛋白質は純粋な形では合
成されず、Ｃ−末端が短縮された蛋白質のごとく部分的
に分解された蛋白質の混合物として合成される。例え
ば、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（hANP）の酵母
での発現は、Ｃ−末端を異にする２つの形の成熟hANPの
分泌をもたらす〔Vlasuk等（1986）J.Biol.Chem.261,47
98-4796〕。主たる形は該蛋白質の最後の２個のアミノ
酸（Agr 150及びTry 151）を欠いており、他方少い方は
完全な長さの物質である。酵母における表皮成長因子
（EGF）の発現の後に同様の結果が得られ〔Georgr-Nasc
imento等（1988）Biochemistry 27,797-802〕、この場
合、最後のアミノ酸（Arg 53）又は最後の２個のアミノ
酸（Leu 52及びArg 53）が欠けており、そして完全な長
さのEGFが生産されなかったという意味において、分泌
された発現生成物は不均一であった。
α−インターフェロン〔IFNα,Hitzeman等（1981）Natu
re 294,717-722〕、リゾチーム〔Oberto等（1985）Gene
40,57-65〕、α−アミラーゼ〔Sato等（1986）Gene 5
0,247-257〕、組織プラスミノーゲン活性化因子〔t-P
A、ヨーロッパ特許出願No.143,081〕、又はデスルファ
トヒルジン〔ヨーロッパ特許出願No.225,633〕をコード
するDNA配列を含んで成る適当な発現ベクターによる酵
母細胞の形質転換後に酵母において発現されている。し
かしながら、多くの場合、異質蛋白質は純粋な形では合
成されず、Ｃ−末端が短縮された蛋白質のごとく部分的
に分解された蛋白質の混合物として合成される。例え
ば、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（hANP）の酵母
での発現は、Ｃ−末端を異にする２つの形の成熟hANPの
分泌をもたらす〔Vlasuk等（1986）J.Biol.Chem.261,47
98-4796〕。主たる形は該蛋白質の最後の２個のアミノ
酸（Agr 150及びTry 151）を欠いており、他方少い方は
完全な長さの物質である。酵母における表皮成長因子
（EGF）の発現の後に同様の結果が得られ〔Georgr-Nasc
imento等（1988）Biochemistry 27,797-802〕、この場
合、最後のアミノ酸（Arg 53）又は最後の２個のアミノ
酸（Leu 52及びArg 53）が欠けており、そして完全な長
さのEGFが生産されなかったという意味において、分泌
された発現生成物は不均一であった。
非常に最近分子生物学者から大きな注目をあびたポリ
ペプチドはヒルジンである。
ペプチドはヒルジンである。
ヒルジンはヒル〔ヒルド・メディシナリス（Hirudo
medicinalis）中に自然に存在する抗凝固物質である。
ヒルジンは単一のポリペプチド種ではなく、ヒルジン変
形体１（HV1）、ヒルジン変形体２（HV2）（ヨーロッパ
特許出願No.158,564を参照のこと）、ヒルジン変形体PA
（PCT出願No.86/03493を参照のこと）及びdes−(Val)2
−ヒルジン（ヨーロッパ特許出願No.158986を参照のこ
と）と称する少なくとも４種類の代表から成る同様な作
用を有するポリペプチドの類である。これらの変形体は
アミノ酸の数により相互に構造を異にする（具体的に
は、HV1のＮ−末端配列はVal−Val−Tyrであり、HV2及
びPAのそれはIle−Thr−Tyrであり、そして、des−(Va
l)2−ヒルジンのそれはThr−Tyrである）が、しかしな
がらＮ−末端における疎水性アミノ酸の蓄積、Ｃ−末端
における極性アミノ酸の蓄積、硫酸モノエステルとして
存在するチロシン残基（Tyr63）、３個のジスルフィド
橋及び抗凝固活性を共通に有する。
medicinalis）中に自然に存在する抗凝固物質である。
ヒルジンは単一のポリペプチド種ではなく、ヒルジン変
形体１（HV1）、ヒルジン変形体２（HV2）（ヨーロッパ
特許出願No.158,564を参照のこと）、ヒルジン変形体PA
（PCT出願No.86/03493を参照のこと）及びdes−(Val)2
−ヒルジン（ヨーロッパ特許出願No.158986を参照のこ
と）と称する少なくとも４種類の代表から成る同様な作
用を有するポリペプチドの類である。これらの変形体は
アミノ酸の数により相互に構造を異にする（具体的に
は、HV1のＮ−末端配列はVal−Val−Tyrであり、HV2及
びPAのそれはIle−Thr−Tyrであり、そして、des−(Va
l)2−ヒルジンのそれはThr−Tyrである）が、しかしな
がらＮ−末端における疎水性アミノ酸の蓄積、Ｃ−末端
における極性アミノ酸の蓄積、硫酸モノエステルとして
存在するチロシン残基（Tyr63）、３個のジスルフィド
橋及び抗凝固活性を共通に有する。
最近、ヒルジン変形体をコードするcDNA及び合成遺伝
子がクローン化されそして微生物宿主中で発現されてい
る。発現生成物はTyr63の硫酸モノエステルを欠き、…
そしてそれ故に「デスルファトヒルジン」と称される…
が、これらは天然の硫酸基を有するヒルジンとおよそ同
じ生物学的活性を示す。デスルファトヒルジン変形体HV
1は大腸菌（Escherichia coli）（ヨーロッパ特許出願
No.158,564及びNo.168,342）において、及びサッカロミ
セス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）
（ヨーロッパ特許出願No.168,342,No.200,655,No.225,6
33、及びNo.252,854）において発現されている。同様
に、デスルファトヒルジンHV2は大腸菌において（ヨー
ロッパ特許出願No.158,564）、及びサッカロミセス・セ
レビシエーにおいて（ヨーロッパ特許出願No.200,655、
及びPCT出願No.86/01224）発現されており、そしてdes
−(Val)2−デスルファトヒルジンは大腸菌において（ヨ
ーロッパ特許出願No.158,986）発現されている。
子がクローン化されそして微生物宿主中で発現されてい
る。発現生成物はTyr63の硫酸モノエステルを欠き、…
そしてそれ故に「デスルファトヒルジン」と称される…
が、これらは天然の硫酸基を有するヒルジンとおよそ同
じ生物学的活性を示す。デスルファトヒルジン変形体HV
1は大腸菌（Escherichia coli）（ヨーロッパ特許出願
No.158,564及びNo.168,342）において、及びサッカロミ
セス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）
（ヨーロッパ特許出願No.168,342,No.200,655,No.225,6
33、及びNo.252,854）において発現されている。同様
に、デスルファトヒルジンHV2は大腸菌において（ヨー
ロッパ特許出願No.158,564）、及びサッカロミセス・セ
レビシエーにおいて（ヨーロッパ特許出願No.200,655、
及びPCT出願No.86/01224）発現されており、そしてdes
−(Val)2−デスルファトヒルジンは大腸菌において（ヨ
ーロッパ特許出願No.158,986）発現されている。
一般に、ヒルジン化合物の発現効率及び収量は、宿主
微生物としてS.セレビシエー（S. cerevisiae）が選択
される場合に高い。しかしながら、使用される特定に酵
母株とは無関係に、発現生成物はＣ−末端配列を相互に
異にする複数のデスルファトヒルジン種の不均一混合物
である。例えば、ヒルジン変形型HV1遺伝子を含有する
培養された酵母から得られる培養液は、Ｃ−末端アミノ
酸Cln65、又はＣ−末端アミノ酸Leu64及びGln65を欠く
かなりの量の類似体が夾雑したデスルファトヒルジンHV
1を含むことが見出された。
微生物としてS.セレビシエー（S. cerevisiae）が選択
される場合に高い。しかしながら、使用される特定に酵
母株とは無関係に、発現生成物はＣ−末端配列を相互に
異にする複数のデスルファトヒルジン種の不均一混合物
である。例えば、ヒルジン変形型HV1遺伝子を含有する
培養された酵母から得られる培養液は、Ｃ−末端アミノ
酸Cln65、又はＣ−末端アミノ酸Leu64及びGln65を欠く
かなりの量の類似体が夾雑したデスルファトヒルジンHV
1を含むことが見出された。
デスルファトヒルジン、hANP又はEGFのごとき完全な
長さの蛋白質及びこれらのＣ−末端が短縮された誘導体
の個々の成分への分離、並びにこれらの成分の均一形態
への精製は多くの労力と時間を要する。これらの付帯的
な費用と考慮して、酵母においてデスルファトヒルジン
のごとき均一な蛋白質の経済的な生産を可能にする改良
された方法が必要とされている。酵母において均一な異
種蛋白質を製造する方法を提供するのが本発明の目的で
ある。
長さの蛋白質及びこれらのＣ−末端が短縮された誘導体
の個々の成分への分離、並びにこれらの成分の均一形態
への精製は多くの労力と時間を要する。これらの付帯的
な費用と考慮して、酵母においてデスルファトヒルジン
のごとき均一な蛋白質の経済的な生産を可能にする改良
された方法が必要とされている。酵母において均一な異
種蛋白質を製造する方法を提供するのが本発明の目的で
ある。
異種蛋白質のＣ−末端が短縮された誘導体が該蛋白質
をコードする対応するDNA配列を含有する形質転換され
た酵母の培養液から単離されるのは、完全なデスルファ
トヒルジンのごとき一次発現生成物に対する内因性（en
dogenous）酵母プロテアーゼの翻訳後作用に基くもので
あるが、Ｃ−末端分解を行う特定のプロテアーゼはまだ
同定されていない。一般に蛋白質分解に関与する最も重
要な酵母プロテアーゼはエンドペプチダーゼyscA及びys
cB並びにカルボキシエキソペプチダーゼyscY及びyscSで
ある。プロテアーゼA,B,Y及び／又はＳ活性を欠く酵母
株の使用によりデスルファトヒルジンのごとき外来遺伝
子産物のランダムな分解を部分的に減少せしめることが
できる。しかしながら、Ｃ−末端において１個又は２個
のアミノ酸を欠くかなりの量の蛋白質がなお観察され
る。
をコードする対応するDNA配列を含有する形質転換され
た酵母の培養液から単離されるのは、完全なデスルファ
トヒルジンのごとき一次発現生成物に対する内因性（en
dogenous）酵母プロテアーゼの翻訳後作用に基くもので
あるが、Ｃ−末端分解を行う特定のプロテアーゼはまだ
同定されていない。一般に蛋白質分解に関与する最も重
要な酵母プロテアーゼはエンドペプチダーゼyscA及びys
cB並びにカルボキシエキソペプチダーゼyscY及びyscSで
ある。プロテアーゼA,B,Y及び／又はＳ活性を欠く酵母
株の使用によりデスルファトヒルジンのごとき外来遺伝
子産物のランダムな分解を部分的に減少せしめることが
できる。しかしながら、Ｃ−末端において１個又は２個
のアミノ酸を欠くかなりの量の蛋白質がなお観察され
る。
驚くべきごとに、カルボキシペプチダーゼyscα活性
を欠く酵母変異株は異種蛋白質のＣ−末端からアミノ酸
を除去することができず、そしてそれ故に完全な（真正
な）蛋白質を生じさせることが今や見出された。カルボ
キシペプチダーゼyscαは膜結合エキソペプチダーゼで
あり、そしてよく知られているように、キラー・ファク
ター（killer factor）及びメイティング・ファクター
（mating factor）αの成熟において重要な役割を演ず
る〔J.C.Wagner及びD.H.Wolf（1987）,FEBS Letters 22
1,423を参照のこと〕。このものはKEX1遺伝子の発現生
成物である。発表されたデータ〔P.S.Rendueles及びD.
H.Wolf（1988）,FEMS Microbiol.Rev.54,17〕によれ
ば、yscαの作用はＣ−末端塩基性アミノ酸残基（Arg,L
ys）に強く限定される。これらのデータ、及びデスルフ
ァトヒルジンのＣ−末端アミノ酸が塩基性ではない（例
えば、デスルファトヒルジン変形体HV1においてはGln及
びLeuである）事実から、カルボキシペプチダーゼyscα
活性を欠く酵母変異株の使用によりＣ−末端が短縮され
たデスルファトヒルジン類似体の面倒な分離を伴わない
で均一なデスルファトヒルジンを製造することができる
ことが全く驚くべきことであり予想外のことである。
を欠く酵母変異株は異種蛋白質のＣ−末端からアミノ酸
を除去することができず、そしてそれ故に完全な（真正
な）蛋白質を生じさせることが今や見出された。カルボ
キシペプチダーゼyscαは膜結合エキソペプチダーゼで
あり、そしてよく知られているように、キラー・ファク
ター（killer factor）及びメイティング・ファクター
（mating factor）αの成熟において重要な役割を演ず
る〔J.C.Wagner及びD.H.Wolf（1987）,FEBS Letters 22
1,423を参照のこと〕。このものはKEX1遺伝子の発現生
成物である。発表されたデータ〔P.S.Rendueles及びD.
H.Wolf（1988）,FEMS Microbiol.Rev.54,17〕によれ
ば、yscαの作用はＣ−末端塩基性アミノ酸残基（Arg,L
ys）に強く限定される。これらのデータ、及びデスルフ
ァトヒルジンのＣ−末端アミノ酸が塩基性ではない（例
えば、デスルファトヒルジン変形体HV1においてはGln及
びLeuである）事実から、カルボキシペプチダーゼyscα
活性を欠く酵母変異株の使用によりＣ−末端が短縮され
たデスルファトヒルジン類似体の面倒な分離を伴わない
で均一なデスルファトヒルジンを製造することができる
ことが全く驚くべきことであり予想外のことである。
カルボキシペプチダーゼyscα活性を欠く酵母変異株
が適当なベクターにより形質転換された場合に完全な長
さで生産される他の異種蛋白質、例えばhANP,EGF又は結
合組織活性化ペプチド−III〔CTAP−III,Mullenbach等
（1986）J.Biol.Chem.261,719-722〕についても同じこ
とが言える。
が適当なベクターにより形質転換された場合に完全な長
さで生産される他の異種蛋白質、例えばhANP,EGF又は結
合組織活性化ペプチド−III〔CTAP−III,Mullenbach等
（1986）J.Biol.Chem.261,719-722〕についても同じこ
とが言える。
従って、本発明は、酵母にとって異種性である蛋白質
の製造のための改良された方法に関し、この方法は、カ
ルボキシペプチダーゼyscαを欠いておりそして該異種
蛋白質をコードするDNA配列に作用可能に連結された（o
perably linked）酵母プロモーターを含んで成るハイブ
リドベクターにより形質転換されている酵母株を培養
し、そして該異種蛋白質を単離することを特徴とする。
の製造のための改良された方法に関し、この方法は、カ
ルボキシペプチダーゼyscαを欠いておりそして該異種
蛋白質をコードするDNA配列に作用可能に連結された（o
perably linked）酵母プロモーターを含んで成るハイブ
リドベクターにより形質転換されている酵母株を培養
し、そして該異種蛋白質を単離することを特徴とする。
本発明は特に、酵母にとって異種性の蛋白質を均一な
形で製造するための改良された方法に関し、この方法
は、酵母プロモーター、該プロモーターに使用可能に連
結されたシグナルペプチドをコードする第一DNA配列、
該第一DNA配列に適切なリーディングフレーム内に連結
された該異種蛋白質をコードする第二DNA配列及び酵母
転写停止シグナルを含有するDNA配列を含んで成るハイ
ブリドベクターにより形質転換された前記の酵母株を培
養し、そして該異種蛋白質を単離することを特徴とす
る。
形で製造するための改良された方法に関し、この方法
は、酵母プロモーター、該プロモーターに使用可能に連
結されたシグナルペプチドをコードする第一DNA配列、
該第一DNA配列に適切なリーディングフレーム内に連結
された該異種蛋白質をコードする第二DNA配列及び酵母
転写停止シグナルを含有するDNA配列を含んで成るハイ
ブリドベクターにより形質転換された前記の酵母株を培
養し、そして該異種蛋白質を単離することを特徴とす
る。
本発明の方法により製造することができる異種蛋白質
は、酵母における発現の後に、カルボキシペプチダーゼ
yscαによる翻訳後Ｃ−末端分解に対して感受性の蛋白
質である。この様な異種蛋白質は、Lys,Arg,Tyr,Ala,Le
u,Gln,Glu,Asp,Asn及びSerから成る群から選択される２
個のＣ−末端アミノ酸により特徴付けられる。好ましい
異種蛋白質は上記のもの、特にデスルファトヒルジンで
ある。
は、酵母における発現の後に、カルボキシペプチダーゼ
yscαによる翻訳後Ｃ−末端分解に対して感受性の蛋白
質である。この様な異種蛋白質は、Lys,Arg,Tyr,Ala,Le
u,Gln,Glu,Asp,Asn及びSerから成る群から選択される２
個のＣ−末端アミノ酸により特徴付けられる。好ましい
異種蛋白質は上記のもの、特にデスルファトヒルジンで
ある。
最も好ましい観点において、本発明はデスルファトヒ
ルジンの改良された製造方法に関し、この方法は、カル
ボキシペプチダーゼyscα活性を欠く酵母株であって、
酵母プロモーター、該プロモーターに作用可能に連結さ
れたシグナルペプチドをコードする第一DNA配列、該第
一DNA配列に適切なリーディングフレーム内に連結され
たデスルファトヒルジンをコードする第二DNA配列及び
酵母転写停止シグナルを含有するDNA配列を含んで成る
ハイブリドベクターにより形質転換された該酵母株を培
養し、そしてデスルファトヒルジンを単離することを特
徴とする。
ルジンの改良された製造方法に関し、この方法は、カル
ボキシペプチダーゼyscα活性を欠く酵母株であって、
酵母プロモーター、該プロモーターに作用可能に連結さ
れたシグナルペプチドをコードする第一DNA配列、該第
一DNA配列に適切なリーディングフレーム内に連結され
たデスルファトヒルジンをコードする第二DNA配列及び
酵母転写停止シグナルを含有するDNA配列を含んで成る
ハイブリドベクターにより形質転換された該酵母株を培
養し、そしてデスルファトヒルジンを単離することを特
徴とする。
「デスルファトヒルジン」なる語は、文献に記載され
ているか、又はデスルファトヒルジンをコードするDNA
を含有する形質転換された微生物株から得られるデスル
ファトヒルジン化合物を包含する意味に用いられる。こ
のようなデスルファトヒルジンは例えば、デスルファト
ヒルジン変形体HV1,HV1（修飾形a,b）,HV2,HV2（修飾形
a,b,c）,PA,PAの変形体、及びdes（Val2）−デスルファ
トヒルジンである。
ているか、又はデスルファトヒルジンをコードするDNA
を含有する形質転換された微生物株から得られるデスル
ファトヒルジン化合物を包含する意味に用いられる。こ
のようなデスルファトヒルジンは例えば、デスルファト
ヒルジン変形体HV1,HV1（修飾形a,b）,HV2,HV2（修飾形
a,b,c）,PA,PAの変形体、及びdes（Val2）−デスルファ
トヒルジンである。
好ましいデスルファトヒルジンは次の式（Ｉ）： X1 Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn X
2 Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X3 Asn Gln Cys V
al Thr Gly Glu Gly Thr Pro X4 Pro Gln Ser X5 Asn A
sp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu X6 （Ｉ） 〔式中 （ａ）X1はジペプチド残基Val−Valを表わし、X2，X3及
びX4はそれぞれLysであり、X5はHisであり、そしてX6は
ペプチド残基Glu-Try-Leu-Glnであり〔HV1〕；あるい
は、 （ｂ）X2がIle又はGluであり、そしてX1及びX3〜X6が
（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形ａ〕；
あるいは、 （ｃ）X3がIle又はGluであり、そしてX1，X2及びX4〜X6
が（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形
ａ〕；あるいは、 （ｄ）X4がIle又はGluであり、そしてX1〜X3，X5及びX6
が（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形
ａ〕；あるいは、 （ｅ）X5はLeu又はAspであり、そしてX1〜X4及びX6が
（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形ａ〕；
あるいは、 （ｆ）X6がGlu-Tyr、Glu-Tyr-Leu、Glu-Asp-Leu-Gln、G
lu-Glu-Leu-Gln、Glu-Tyr-Lys-Arg、Glu-Asp-Lys-Arg、
Glu-Lys-Leu-Gln、Ser-Phe-Arg-Tyr、Trp-Glu-Leu-Ar
g、Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro及びGlu-Tyr-Leu-Gln-Argから
成る群から選択され、そしてX1〜X5が（ａ）において定
義した通りであり〔HV1修飾形ｂ〕；あるいは、 （ｇ）X1がThrを表わし、そしてX2〜X6が（ａ）におい
て定義した通りである〔des（Val2）−デスルファトヒ
ルジン）〕で表わされるデスルファトヒルジン化合物；
あるいは 次の式（II）： Y1 Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn L
ys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys
Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Y2 Pro Glu Ser His As
n Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Y3 Leu G
ln （II） 〔式中、 （ａ）Y1がＮ−末端ペプチド残基Ile-Thrを表わし、Y2
がAsnであり、そしてY3がTyrであり〔HV2〕；あるい
は、 （ｂ）Y2がLys,Arg又はHisであり、Y1及びY3が（ａ）に
おいて定義した通りであり〔HV2修飾形ａ〕；あるいは （ｃ）Y3がGlu又はAspであり、そしてY1及びY2が（ａ）
において定義した通りであり〔HV2修飾形ｂ〕；あるい
は （ｄ）Y1がＮ−末端ジペプチド残基Val−Valであり、そ
してY2及びY3が（ａ）において定義した通りであり（HV
2修飾形ｃ）〕 で表わされるデスルファトヒルジン化合物；あるいは、 次の式（III）： Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gl
n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser
His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Al
a Tyr Asp Glu （III） で表わされるデスルファトヒルジン化合物（PA）、及び
Ｎ−末端における１もしくは２個のアミノ酸の又はＣ−
末端における18,10,9,6,4もしくは２個のアミノ酸の一
次構造の短縮により特徴付けられる該PAの変形体であ
る。
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn X
2 Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X3 Asn Gln Cys V
al Thr Gly Glu Gly Thr Pro X4 Pro Gln Ser X5 Asn A
sp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu X6 （Ｉ） 〔式中 （ａ）X1はジペプチド残基Val−Valを表わし、X2，X3及
びX4はそれぞれLysであり、X5はHisであり、そしてX6は
ペプチド残基Glu-Try-Leu-Glnであり〔HV1〕；あるい
は、 （ｂ）X2がIle又はGluであり、そしてX1及びX3〜X6が
（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形ａ〕；
あるいは、 （ｃ）X3がIle又はGluであり、そしてX1，X2及びX4〜X6
が（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形
ａ〕；あるいは、 （ｄ）X4がIle又はGluであり、そしてX1〜X3，X5及びX6
が（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形
ａ〕；あるいは、 （ｅ）X5はLeu又はAspであり、そしてX1〜X4及びX6が
（ａ）において定義した通りであり〔HV1修飾形ａ〕；
あるいは、 （ｆ）X6がGlu-Tyr、Glu-Tyr-Leu、Glu-Asp-Leu-Gln、G
lu-Glu-Leu-Gln、Glu-Tyr-Lys-Arg、Glu-Asp-Lys-Arg、
Glu-Lys-Leu-Gln、Ser-Phe-Arg-Tyr、Trp-Glu-Leu-Ar
g、Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro及びGlu-Tyr-Leu-Gln-Argから
成る群から選択され、そしてX1〜X5が（ａ）において定
義した通りであり〔HV1修飾形ｂ〕；あるいは、 （ｇ）X1がThrを表わし、そしてX2〜X6が（ａ）におい
て定義した通りである〔des（Val2）−デスルファトヒ
ルジン）〕で表わされるデスルファトヒルジン化合物；
あるいは 次の式（II）： Y1 Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn L
ys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys
Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Y2 Pro Glu Ser His As
n Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Y3 Leu G
ln （II） 〔式中、 （ａ）Y1がＮ−末端ペプチド残基Ile-Thrを表わし、Y2
がAsnであり、そしてY3がTyrであり〔HV2〕；あるい
は、 （ｂ）Y2がLys,Arg又はHisであり、Y1及びY3が（ａ）に
おいて定義した通りであり〔HV2修飾形ａ〕；あるいは （ｃ）Y3がGlu又はAspであり、そしてY1及びY2が（ａ）
において定義した通りであり〔HV2修飾形ｂ〕；あるい
は （ｄ）Y1がＮ−末端ジペプチド残基Val−Valであり、そ
してY2及びY3が（ａ）において定義した通りであり（HV
2修飾形ｃ）〕 で表わされるデスルファトヒルジン化合物；あるいは、 次の式（III）： Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gl
n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser
His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Al
a Tyr Asp Glu （III） で表わされるデスルファトヒルジン化合物（PA）、及び
Ｎ−末端における１もしくは２個のアミノ酸の又はＣ−
末端における18,10,9,6,4もしくは２個のアミノ酸の一
次構造の短縮により特徴付けられる該PAの変形体であ
る。
最も好ましいデスルファトヒルジン化合物は、X1〜X6
が（ａ）において定義した通りである式（Ｉ）の化合物
である。
が（ａ）において定義した通りである式（Ｉ）の化合物
である。
酵母宿主株、及びハイブリドベクターの構成成分は後
に詳細に記載する。
に詳細に記載する。
形質転換された酵母株は当業界において知られている
方法を用いて培養される。
方法を用いて培養される。
すなわち、本発明の形質転換された酵母株は、資化性
炭素源、窒素源及び無機塩を含有する液体培地中で培養
される。
炭素源、窒素源及び無機塩を含有する液体培地中で培養
される。
種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素
源の例として、資化性炭水化物、例えばグルコース、マ
ルトース、マンニトール、フラストースもしくはラクト
ース、又は酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムが挙げられ、
これらは単独で、又は適当に混合して使用される。適当
な窒素源には、例えばアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペ
プチド及び蛋白質並びにそれらの分解生成物、例えばト
リプトン、ペプトン又は肉エキス、さらに酵母エキス、
マルトエキス、コーンスチープリカー、並びにアンモニ
ウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又
は硝酸アンモニウムが含まれ、これらは単独で又は適当
に混合して使用される。使用することができる無機塩に
は、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカ
ルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩が含ま
れる。さらに、栄養培地はまた増殖促進物質を含有する
ことができる。増殖促進物質には、例えば微量因子、例
えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は個々のアミノ酸が含ま
れる。
源の例として、資化性炭水化物、例えばグルコース、マ
ルトース、マンニトール、フラストースもしくはラクト
ース、又は酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムが挙げられ、
これらは単独で、又は適当に混合して使用される。適当
な窒素源には、例えばアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペ
プチド及び蛋白質並びにそれらの分解生成物、例えばト
リプトン、ペプトン又は肉エキス、さらに酵母エキス、
マルトエキス、コーンスチープリカー、並びにアンモニ
ウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又
は硝酸アンモニウムが含まれ、これらは単独で又は適当
に混合して使用される。使用することができる無機塩に
は、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカ
ルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩が含ま
れる。さらに、栄養培地はまた増殖促進物質を含有する
ことができる。増殖促進物質には、例えば微量因子、例
えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は個々のアミノ酸が含ま
れる。
内因性２ミクロンDNAとそのレプリコンを担持するハ
イブリドベクターとの間の非適合性のため、この様なハ
イブリドベクターにより形質転換された酵母細胞は該ハ
イブリドベクターを喪失する傾向がある。この様な酵母
細胞は選択的条件下、すなわち増殖のためにプラスミド
によりコードされた遺伝子の発現を必要とする条件下で
増殖せしめなければならない。現在使用されておりそし
て本発明のベクター中に存在するほとんどの選択マーカ
ー（後記）は、アミノ酸合成又はプリン合成の酵素をコ
ードする遺伝子である。これは、対応するアミノ酸又は
プリン塩基を欠く合成最少培地を使用することを必要と
する。しかしながら、適当な殺生物剤に対する耐性を付
与する遺伝子も同様に使用することができる。抗生物質
耐性遺伝子を含有するベクターで形質転換された酵母細
胞は対応する抗生物質を含有する複合培地中で増殖し、
そのためより速い増殖速度及びより高い細胞密度が達成
される。
イブリドベクターとの間の非適合性のため、この様なハ
イブリドベクターにより形質転換された酵母細胞は該ハ
イブリドベクターを喪失する傾向がある。この様な酵母
細胞は選択的条件下、すなわち増殖のためにプラスミド
によりコードされた遺伝子の発現を必要とする条件下で
増殖せしめなければならない。現在使用されておりそし
て本発明のベクター中に存在するほとんどの選択マーカ
ー（後記）は、アミノ酸合成又はプリン合成の酵素をコ
ードする遺伝子である。これは、対応するアミノ酸又は
プリン塩基を欠く合成最少培地を使用することを必要と
する。しかしながら、適当な殺生物剤に対する耐性を付
与する遺伝子も同様に使用することができる。抗生物質
耐性遺伝子を含有するベクターで形質転換された酵母細
胞は対応する抗生物質を含有する複合培地中で増殖し、
そのためより速い増殖速度及びより高い細胞密度が達成
される。
完全な２ミクロンDNA（機能的複製起点を含む）を含
んで成るハイブリドベクターは内因性２ミクロンプラス
ミドを欠くサッカロミセス・セレビジエーの株（いわゆ
るcir°株）に安定に維持され、従って非選択的増殖条
件下、すなわち複合培地中で培養を行うことができる。
んで成るハイブリドベクターは内因性２ミクロンプラス
ミドを欠くサッカロミセス・セレビジエーの株（いわゆ
るcir°株）に安定に維持され、従って非選択的増殖条
件下、すなわち複合培地中で培養を行うことができる。
構成的プロモーター（例えばADH1，GAPDH）を有する
ハイブリドプラスミドを含有する酵母細胞は、異種蛋白
質をコードするDNAを該プロモーターによる制御のもと
に誘導を必要としないで発現する。しかしながら、前記
DNAが抑制されるプロモーター（例えばPGK又はPHO5）の
制御のもとにある場合は、増殖培地の組成をmRNA転写物
の最大レベルが得られるように適合させなければならな
い。すなわち、PHO5プロモーターを使用する場合、増殖
培地は、このプロモーターの抑制解除のために低濃度の
無機リン酸塩を含有しなければならない。
ハイブリドプラスミドを含有する酵母細胞は、異種蛋白
質をコードするDNAを該プロモーターによる制御のもと
に誘導を必要としないで発現する。しかしながら、前記
DNAが抑制されるプロモーター（例えばPGK又はPHO5）の
制御のもとにある場合は、増殖培地の組成をmRNA転写物
の最大レベルが得られるように適合させなければならな
い。すなわち、PHO5プロモーターを使用する場合、増殖
培地は、このプロモーターの抑制解除のために低濃度の
無機リン酸塩を含有しなければならない。
培養は常法により行われる。培養条件、例えば温度、
培地のpH及び発酵時間は、最高レベルの異種蛋白質が生
産されるように選択される。選択された酵母株は、好ま
しくは、振とう又は攪拌を伴う液深培養において、好気
的条件下で、約25℃〜35℃、好ましくは約28℃の温度
で、pH4〜７、例えばおよそpH5において、少なくとも１
時間から３日間、好ましくは満足すべき量の蛋白質が得
られるまで培養する。
培地のpH及び発酵時間は、最高レベルの異種蛋白質が生
産されるように選択される。選択された酵母株は、好ま
しくは、振とう又は攪拌を伴う液深培養において、好気
的条件下で、約25℃〜35℃、好ましくは約28℃の温度
で、pH4〜７、例えばおよそpH5において、少なくとも１
時間から３日間、好ましくは満足すべき量の蛋白質が得
られるまで培養する。
酵母中で発現される異種蛋白質は細胞内に蓄積され又
は培地中に分泌される。デスルファトヒルジンの場合、
使用される酵母株、プロモーター及びシグナルペプチド
に関係なく、生産されたデスルファトヒルジンのほとん
どが培地中に分泌され、わずかな部分のみが細胞に結合
したまま残る。分泌される化合物と細胞に細胞した化合
物との正確な比率は発酵条件、及び適用される回収方法
に依存する。一般に、これは8:1以上となる。従って、
分泌されるデスルファトヒルジンが常に支配的である。
は培地中に分泌される。デスルファトヒルジンの場合、
使用される酵母株、プロモーター及びシグナルペプチド
に関係なく、生産されたデスルファトヒルジンのほとん
どが培地中に分泌され、わずかな部分のみが細胞に結合
したまま残る。分泌される化合物と細胞に細胞した化合
物との正確な比率は発酵条件、及び適用される回収方法
に依存する。一般に、これは8:1以上となる。従って、
分泌されるデスルファトヒルジンが常に支配的である。
異種蛋白質は培地から常用手段によって単離すること
ができる。例えば、第一段階は一般に、培養液から遠心
分離により細胞を分離することから成る。得られる上清
をポリエチレンイミンで処理してほとんどの非−蛋白質
性物質を除去しそして硫酸アンモニウムにより液を飽和
して蛋白質を沈澱せしめることにより、異種蛋白質を濃
縮することができる。宿主の蛋白質は、もし存在すれ
ば、酢酸による酸性化（例えば、0.1％,pH4〜５）によ
り沈澱せしめることができる。異種蛋白質の更なる濃縮
は、該酢酸上清をｎ−ブタノールで抽出することにより
達成することができる。他の精製段階は、例えば脱塩、
クロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラフ
ィー、逆相HPLC等を包含する。混合物の構成成分の分離
はまた、透析により、ゲル電気泳動もしくはキャリヤー
−フリー電気泳動により電荷に従って、適当なセファデ
ックスカラムにより分子サイズに従って、アフィニティ
ークロマトグラフィーにより、例えば抗体、特にモノク
ローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーにより、又はアフィニティークロマトグラフィーのた
めに適当なキャリヤーに結合したトロンビンを用いて、
あるいは他の方法、特に文献に記載されている方法によ
り、行われる。
ができる。例えば、第一段階は一般に、培養液から遠心
分離により細胞を分離することから成る。得られる上清
をポリエチレンイミンで処理してほとんどの非−蛋白質
性物質を除去しそして硫酸アンモニウムにより液を飽和
して蛋白質を沈澱せしめることにより、異種蛋白質を濃
縮することができる。宿主の蛋白質は、もし存在すれ
ば、酢酸による酸性化（例えば、0.1％,pH4〜５）によ
り沈澱せしめることができる。異種蛋白質の更なる濃縮
は、該酢酸上清をｎ−ブタノールで抽出することにより
達成することができる。他の精製段階は、例えば脱塩、
クロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラフ
ィー、逆相HPLC等を包含する。混合物の構成成分の分離
はまた、透析により、ゲル電気泳動もしくはキャリヤー
−フリー電気泳動により電荷に従って、適当なセファデ
ックスカラムにより分子サイズに従って、アフィニティ
ークロマトグラフィーにより、例えば抗体、特にモノク
ローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーにより、又はアフィニティークロマトグラフィーのた
めに適当なキャリヤーに結合したトロンビンを用いて、
あるいは他の方法、特に文献に記載されている方法によ
り、行われる。
異種蛋白質が分泌されない場合、又は細胞に結合して
いる追加の異種蛋白質、すなわち細胞内又はペリプラズ
ム空間に蓄積している異種蛋白質を単離することが望ま
しい場合、幾つかの補完的精製段階が必要である。すな
わち、異種蛋白質が細胞内に蓄積されている場合、その
回収の第一段階はそれを細胞内から遊離せしめることか
ら成る。ほとんどの方法において、まずグルコシダーゼ
（後記）消化によって細胞壁が除去される。次に、生ず
るスフェロプラストがトリトンのごとき洗剤により処理
される。あるいは、細胞を破壊するために機械的力、例
えば剪断力（例えば、メープレス、フレンチプレス）、
又はガラスビーズとの振とうが適当である。異種蛋白質
が酵母宿主によりペリプラズム空間に分泌される場合、
単純化された方法を用いることができる。すなわち、異
種蛋白質は細胞溶解を伴わないで、細胞壁の酵母的除去
により、又は細胞壁を損傷して生成分の放出を可能にす
る化学物質、例えばチオール試薬又はEDTAでの処理によ
り、回収される。
いる追加の異種蛋白質、すなわち細胞内又はペリプラズ
ム空間に蓄積している異種蛋白質を単離することが望ま
しい場合、幾つかの補完的精製段階が必要である。すな
わち、異種蛋白質が細胞内に蓄積されている場合、その
回収の第一段階はそれを細胞内から遊離せしめることか
ら成る。ほとんどの方法において、まずグルコシダーゼ
（後記）消化によって細胞壁が除去される。次に、生ず
るスフェロプラストがトリトンのごとき洗剤により処理
される。あるいは、細胞を破壊するために機械的力、例
えば剪断力（例えば、メープレス、フレンチプレス）、
又はガラスビーズとの振とうが適当である。異種蛋白質
が酵母宿主によりペリプラズム空間に分泌される場合、
単純化された方法を用いることができる。すなわち、異
種蛋白質は細胞溶解を伴わないで、細胞壁の酵母的除去
により、又は細胞壁を損傷して生成分の放出を可能にす
る化学物質、例えばチオール試薬又はEDTAでの処理によ
り、回収される。
得られた異種蛋白質の混合物は、常用手段、例えばク
ロマトグラフ法、例えば逆相クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ケル濾過クロマトグラフィ
ー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー、を適用する
ことにより分離され得る。
ロマトグラフ法、例えば逆相クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ケル濾過クロマトグラフィ
ー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー、を適用する
ことにより分離され得る。
デスルファトヒルジンの場合、抗−ヒルジン抗体又は
抗−デスルファトヒルジン抗体（例えば、ハイブリドー
マ細胞からのモノクローナル抗体）を用いる試験、トロ
ンビン試験〔M.U.Bergmeyer編集、Methods in Enzymati
c Analysis,VolII,314-316頁、Verlag Chemie,Weinheim
（西独）1983）、又は血液凝固試験〔F.Markwardt等、T
hromb.Haemost.47,226（1982）〕を用いて、精製過程で
得られる画分中のヒルジン活性を検出することができ
る。他の異種蛋白質の検出のために文献中に知られてい
る類似の測定法を用いることができる。
抗−デスルファトヒルジン抗体（例えば、ハイブリドー
マ細胞からのモノクローナル抗体）を用いる試験、トロ
ンビン試験〔M.U.Bergmeyer編集、Methods in Enzymati
c Analysis,VolII,314-316頁、Verlag Chemie,Weinheim
（西独）1983）、又は血液凝固試験〔F.Markwardt等、T
hromb.Haemost.47,226（1982）〕を用いて、精製過程で
得られる画分中のヒルジン活性を検出することができ
る。他の異種蛋白質の検出のために文献中に知られてい
る類似の測定法を用いることができる。
本発明の形質転換された酵母宿主細胞は、 ◎異種蛋白質をコードするDNA配列に作用可能に連結さ
れた酵母プロモーターを含んで成るハイブリドプロモー
ター、特に、酵母プロモーター、該プロモーターに作用
可能に連結されたシグナルペプチドをコードする第一DN
A配列、該第一DNA配列と適切なリーディングフレーム内
に連結された第二DNA配列及び酵母転写停止シグナルを
含有するDNA配列を含んで成るハイブリドゲクター、を
用意し； ◎必要であれば、カルボキシペプチダーゼyscα活性を
欠く酵母変異株を用意し； ◎得られた酵母変異株を前記ハイブリドベクターにより
形質転換し；そして、 ◎未形質転換酵母細胞から形質転換された酵母細胞を選
択する。
れた酵母プロモーターを含んで成るハイブリドプロモー
ター、特に、酵母プロモーター、該プロモーターに作用
可能に連結されたシグナルペプチドをコードする第一DN
A配列、該第一DNA配列と適切なリーディングフレーム内
に連結された第二DNA配列及び酵母転写停止シグナルを
含有するDNA配列を含んで成るハイブリドゲクター、を
用意し； ◎必要であれば、カルボキシペプチダーゼyscα活性を
欠く酵母変異株を用意し； ◎得られた酵母変異株を前記ハイブリドベクターにより
形質転換し；そして、 ◎未形質転換酵母細胞から形質転換された酵母細胞を選
択する。
発現ベクター 本発明の酵母ハイブリドベクターは異質蛋白質をコー
ドするDNAに作用可能に連結された酵母プロモーターを
含んで成る。好ましいハイブリドベクターは、酵母プロ
モーター、該プロモーターに使用可能に連結されたシグ
ナルペプチドをコードする第一DNA配列、該第一DNA配列
と適切なリーディングフレーム内に連結された異種蛋白
質例えばデスルファトヒルジンをコードする第二DNA配
列及び酵母転写停止シグナルを含有するDNA配列を含ん
で成る。
ドするDNAに作用可能に連結された酵母プロモーターを
含んで成る。好ましいハイブリドベクターは、酵母プロ
モーター、該プロモーターに使用可能に連結されたシグ
ナルペプチドをコードする第一DNA配列、該第一DNA配列
と適切なリーディングフレーム内に連結された異種蛋白
質例えばデスルファトヒルジンをコードする第二DNA配
列及び酵母転写停止シグナルを含有するDNA配列を含ん
で成る。
酵母プロモーターは、PHO5,MFα１もしくはGAL1プロ
モーターのごとき抑制されるプロモーター、又は構成的
プロモーターである。デスルファトヒルジンの発現の場
合、構成的プロモーターが好ましい。
モーターのごとき抑制されるプロモーター、又は構成的
プロモーターである。デスルファトヒルジンの発現の場
合、構成的プロモーターが好ましい。
構成的酵母プロモーターは好ましくは、高度に発現さ
れる酵母遺伝子、例えば解糖系酵素をコードする遺伝子
に由来し、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、３−
ホスホグリセレート・キナーゼ（PGK）、ヘキソキナー
ゼ、ピルベート・デヒドロゲナーゼ、ホスホフラクトキ
ナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・
キナーゼ、トリオースホスフェート・イソメラーゼ、ホ
スホグルコース・イソメラーゼ及びグルコキナーゼの各
々の遺伝子のプロモーター、さらにはADH I又はTRP Iプ
ロモーター、及び上流活性化部位が除去された短縮され
た酸性ホスファターゼPHO5プロモーターである。特に好
ましいプロモーターは、GAPDHプロモーター、及びGAPDH
遺伝子の−550と−180との間のヌクレオチド、特にヌク
レオチド−540,−263又は−198から始まりそしてヌクレ
オシド−５で終るその機能的断片、並びにPHO5遺伝子の
−200と−150との間のヌクレオチド、特に−173のヌク
レオチドから始まりそしてヌクレオチド−９で終る短縮
された構成的PHO5プロモーターである。
れる酵母遺伝子、例えば解糖系酵素をコードする遺伝子
に由来し、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、３−
ホスホグリセレート・キナーゼ（PGK）、ヘキソキナー
ゼ、ピルベート・デヒドロゲナーゼ、ホスホフラクトキ
ナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・
キナーゼ、トリオースホスフェート・イソメラーゼ、ホ
スホグルコース・イソメラーゼ及びグルコキナーゼの各
々の遺伝子のプロモーター、さらにはADH I又はTRP Iプ
ロモーター、及び上流活性化部位が除去された短縮され
た酸性ホスファターゼPHO5プロモーターである。特に好
ましいプロモーターは、GAPDHプロモーター、及びGAPDH
遺伝子の−550と−180との間のヌクレオチド、特にヌク
レオチド−540,−263又は−198から始まりそしてヌクレ
オシド−５で終るその機能的断片、並びにPHO5遺伝子の
−200と−150との間のヌクレオチド、特に−173のヌク
レオチドから始まりそしてヌクレオチド−９で終る短縮
された構成的PHO5プロモーターである。
シグナルペプチドをコードするDNA配列（「シグナル
配列」）は好ましくは、通常分泌されるポリペプチドを
コードする酵母遺伝子に由来するものである。ヒルのゲ
ノムDNAから得られるヒルジン・シグナル配列も選択さ
れ得る。酵母シグナル配列は例えば酵母インベルター
ゼ、α−ファクター、フェロモンペプチダーゼ（KEX
1）、「キラートキシン（killer toxin）」及び抑制性
酸性ホスファターゼ（PHO5）の各遺伝子シグナル配列及
びプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワモリ（As
pergillue awamori）からのグルコアミラーゼシグナル
配列である。あるいは、使用されるプロモーターに天然
にリンクしている遺伝子（例えばPHO5）のシグナル配列
（もし存在すれば）の部分とヒルジンシグナル配列の部
分との連絡により融合シグナル配列を構成することがで
きる。シグナル配列とデスルファトヒルジンのアミノ酸
配列との間の正確な開裂を可能にする組み合わせが好ま
しい。特異的なプロセシングシグナルを担持しているか
又は担持していないプロ配列又はスペーサー配列のごと
き追加の配列を構成物中に含めることにより前駆体分子
の正確なプロセシングを促進することもできる。あるい
は、生体内又は生体外で適正な成熟を可能にする内部プ
ロセシングシグナルを含有する融合蛋白質を生じさせる
こともできる。例えば、プロセシングシグナルは、ゴル
ジ（Golgi）膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼに
より認識されるLys−Arg残基を含有する。本発明の好ま
しいシグナル配列は、次の式： Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Se
r Leu Ala Asn Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母PHO5遺
伝子のシグナル配列、及び次の式： Me Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe
Ala Ala Lys Ile Ser Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
配列」）は好ましくは、通常分泌されるポリペプチドを
コードする酵母遺伝子に由来するものである。ヒルのゲ
ノムDNAから得られるヒルジン・シグナル配列も選択さ
れ得る。酵母シグナル配列は例えば酵母インベルター
ゼ、α−ファクター、フェロモンペプチダーゼ（KEX
1）、「キラートキシン（killer toxin）」及び抑制性
酸性ホスファターゼ（PHO5）の各遺伝子シグナル配列及
びプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワモリ（As
pergillue awamori）からのグルコアミラーゼシグナル
配列である。あるいは、使用されるプロモーターに天然
にリンクしている遺伝子（例えばPHO5）のシグナル配列
（もし存在すれば）の部分とヒルジンシグナル配列の部
分との連絡により融合シグナル配列を構成することがで
きる。シグナル配列とデスルファトヒルジンのアミノ酸
配列との間の正確な開裂を可能にする組み合わせが好ま
しい。特異的なプロセシングシグナルを担持しているか
又は担持していないプロ配列又はスペーサー配列のごと
き追加の配列を構成物中に含めることにより前駆体分子
の正確なプロセシングを促進することもできる。あるい
は、生体内又は生体外で適正な成熟を可能にする内部プ
ロセシングシグナルを含有する融合蛋白質を生じさせる
こともできる。例えば、プロセシングシグナルは、ゴル
ジ（Golgi）膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼに
より認識されるLys−Arg残基を含有する。本発明の好ま
しいシグナル配列は、次の式： Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Se
r Leu Ala Asn Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母PHO5遺
伝子のシグナル配列、及び次の式： Me Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe
Ala Ala Lys Ile Ser Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
異種蛋白質をコードするゲノムDNA配列は天然源から
単離することができ、あるいはコピーDNA（cDNA）を対
応する相補的mRNAから生産することができ又は化学的及
び酵素的方法により生産することができる。これらはそ
れ自体知られている方法により行うことができる。
単離することができ、あるいはコピーDNA（cDNA）を対
応する相補的mRNAから生産することができ又は化学的及
び酵素的方法により生産することができる。これらはそ
れ自体知られている方法により行うことができる。
例えば、デスルファトヒルジンをコードするDNA配列
はヒルのゲノムDNAから単離することができ、あるいは
デスルファトヒルジンmRNAに相補的な二本鎖デスルファ
トヒルジンDNA（デスルファトヒルジンds cDNA）を調製
することができ、あるいはデスルファトヒルジンのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子を化学的方法及び酵素的方
法で調製することができる。
はヒルのゲノムDNAから単離することができ、あるいは
デスルファトヒルジンmRNAに相補的な二本鎖デスルファ
トヒルジンDNA（デスルファトヒルジンds cDNA）を調製
することができ、あるいはデスルファトヒルジンのアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子を化学的方法及び酵素的方
法で調製することができる。
酵母転写停止シグナルを含有するDNA配列は好ましく
は、転写停止及びポリアデニレーションのための適切な
シグナルを含有する酵母遺伝子の３′フランキング配列
である。適当な３′フランキング配列は例えば使用され
るプロモーターに天然にリンクしている酵母遺伝子のそ
れである。好ましいフランキング配列は酵母PHO5遺伝子
のそれである。
は、転写停止及びポリアデニレーションのための適切な
シグナルを含有する酵母遺伝子の３′フランキング配列
である。適当な３′フランキング配列は例えば使用され
るプロモーターに天然にリンクしている酵母遺伝子のそ
れである。好ましいフランキング配列は酵母PHO5遺伝子
のそれである。
酵母プロモーター、シグナルペプチドをコードする任
意的DNA配列、異種蛋白質をコードするDNA配列及び酵母
転写停止シグナルを含有するDNA配列が作用可能に（ope
rably）連結される。すなわち、これらがその正常な機
能を維持する態様で並置（juxtapose）される。この並
びは、プロモーターがシグナル配列−異種蛋白質遺伝子
複合体の適切な発現を行い、転写停止シグナルが転写及
びポリアデニレーションの適切な停止を行い、そしてシ
グナル配列が適当なリーディングフレーム内で異種蛋白
質遺伝子に連結していて該シグナル配列の最終コドンが
異種蛋白質の遺伝子の第一コドンに直接に結合してお
り、そして該蛋白質の分泌が起こる、こととなる様な並
びである。プロモーター及びシグナル配列が異る遺伝子
に由来する場合、プロモーターは好ましくは、主要mRNA
開始（mojor mRNA start）と該プロモーターに天然にリ
ンクしている遺伝子のATGとの間でシグナル配列に連結
される。シグナル配列は翻訳開始のためにそれ自信のAT
G有すべきである。これらの配列の連結は、エンドヌク
レアーゼの認識配列を担持する合成オリゴヌクレオチド
リンカーにより行うことができる。
意的DNA配列、異種蛋白質をコードするDNA配列及び酵母
転写停止シグナルを含有するDNA配列が作用可能に（ope
rably）連結される。すなわち、これらがその正常な機
能を維持する態様で並置（juxtapose）される。この並
びは、プロモーターがシグナル配列−異種蛋白質遺伝子
複合体の適切な発現を行い、転写停止シグナルが転写及
びポリアデニレーションの適切な停止を行い、そしてシ
グナル配列が適当なリーディングフレーム内で異種蛋白
質遺伝子に連結していて該シグナル配列の最終コドンが
異種蛋白質の遺伝子の第一コドンに直接に結合してお
り、そして該蛋白質の分泌が起こる、こととなる様な並
びである。プロモーター及びシグナル配列が異る遺伝子
に由来する場合、プロモーターは好ましくは、主要mRNA
開始（mojor mRNA start）と該プロモーターに天然にリ
ンクしている遺伝子のATGとの間でシグナル配列に連結
される。シグナル配列は翻訳開始のためにそれ自信のAT
G有すべきである。これらの配列の連結は、エンドヌク
レアーゼの認識配列を担持する合成オリゴヌクレオチド
リンカーにより行うことができる。
発現カセットとは別に、本発明のハイブリドベクター
は酵母複製起点を含んで成る。従って、このハイブリド
ベクターは複製起点を含有する２ミクロンDNA由来のDNA
セグメントを、又は２ミクロンDNAを有しない酵母株を
使用する場合には全２ミクロンDNAを含んで成る。後の
タイプのベクターが好ましい。
は酵母複製起点を含んで成る。従って、このハイブリド
ベクターは複製起点を含有する２ミクロンDNA由来のDNA
セグメントを、又は２ミクロンDNAを有しない酵母株を
使用する場合には全２ミクロンDNAを含んで成る。後の
タイプのベクターが好ましい。
本発明の好ましいハイブリドベクターは中断されない
形の完全な２ミクロンDNAを含有する。すなわち、２ミ
クロンDNAは制限エンドヌクレアーゼにより一度開裂さ
れ、この線状化されたDNAがベクターの他の成分と連結
された後に再還化される。REP1,REP2及びFLP遺伝子並び
にORI,STB,IR1及びIR2部位の正常な機能が維持される様
に当該制限部位が選択される。場合によっては、該制限
部位はＤ遺伝子も無傷のまま維持されるように選択され
る。好ましい制限部位は、Ｄ遺伝子内に位置するユニー
クPst I、並びに前記すべての遺伝子及び部位の外側に
位置するユニークHpa I部位及びSnaB I部位である。
形の完全な２ミクロンDNAを含有する。すなわち、２ミ
クロンDNAは制限エンドヌクレアーゼにより一度開裂さ
れ、この線状化されたDNAがベクターの他の成分と連結
された後に再還化される。REP1,REP2及びFLP遺伝子並び
にORI,STB,IR1及びIR2部位の正常な機能が維持される様
に当該制限部位が選択される。場合によっては、該制限
部位はＤ遺伝子も無傷のまま維持されるように選択され
る。好ましい制限部位は、Ｄ遺伝子内に位置するユニー
クPst I、並びに前記すべての遺伝子及び部位の外側に
位置するユニークHpa I部位及びSnaB I部位である。
好ましくは、本発明のハイブリドベクターは、１個又
は複数個の、特に１個又は２個の酵母用選択遺伝子マー
カー並びに細菌宿主、特に大腸菌用の選択遺伝子マーカ
ー及び複製起点を含有する。
は複数個の、特に１個又は２個の酵母用選択遺伝子マー
カー並びに細菌宿主、特に大腸菌用の選択遺伝子マーカ
ー及び複製起点を含有する。
酵母用選択遺伝子マーカーについては、マーカー遺伝
子の表現型発現に基いて形質転換体の選択を容易にする
任意のマーカー遺伝子を使用することができる。酵母の
ための適当なマーカーは例えば、抗生物質耐性を発現す
るもの、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の障
害を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は例えば抗
生物質G418、ハイグロマイシンもしくはブレオマイシン
に対応する耐性を付与し、又は栄養要求性酵母変異株に
原栄養性、例えばURA3，LEU2，LYS2又はTRP1遺伝子を提
供する。
子の表現型発現に基いて形質転換体の選択を容易にする
任意のマーカー遺伝子を使用することができる。酵母の
ための適当なマーカーは例えば、抗生物質耐性を発現す
るもの、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の障
害を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は例えば抗
生物質G418、ハイグロマイシンもしくはブレオマイシン
に対応する耐性を付与し、又は栄養要求性酵母変異株に
原栄養性、例えばURA3，LEU2，LYS2又はTRP1遺伝子を提
供する。
ハイブリドベクターの増幅が大腸菌中で便利に行われ
るように、大腸菌遺伝子マーカー及び大腸菌複製起点を
含めるのが有利である。これらは、大腸菌複製起点及び
アンピシリンのごとき抗生物質に対する耐性を付与する
大腸菌遺伝子マーカーの両者を含有する、大腸菌プラス
ミド、例えばpBR322、又はpUCプラスミド、例えばpUC18
もしくはpUC19から得ることができる。
るように、大腸菌遺伝子マーカー及び大腸菌複製起点を
含めるのが有利である。これらは、大腸菌複製起点及び
アンピシリンのごとき抗生物質に対する耐性を付与する
大腸菌遺伝子マーカーの両者を含有する、大腸菌プラス
ミド、例えばpBR322、又はpUCプラスミド、例えばpUC18
もしくはpUC19から得ることができる。
本発明のハイブリドベクターは当業界において知られ
ている方法により、例えば異種蛋白質をコードするDNA
配列に作用可能に連結された酵母プロモーターを含んで
成る発現カセットと、酵母用選択遺伝子マーカー並びに
酵母宿主用及び細菌宿主用複製起点を含有するDNA断片
とを所定の順序に連結することにより製造することがで
きる。
ている方法により、例えば異種蛋白質をコードするDNA
配列に作用可能に連結された酵母プロモーターを含んで
成る発現カセットと、酵母用選択遺伝子マーカー並びに
酵母宿主用及び細菌宿主用複製起点を含有するDNA断片
とを所定の順序に連結することにより製造することがで
きる。
カルボキシペプチダーゼyscα活性を欠く酵母 本発明の酵母株はカルボキシペプチダーゼyscα活性
を欠くものである。好ましくは、本発明の酵母株は二
重、三重又は四重変異株である。すなわち、他のペプチ
ダーゼ活性をも欠いている。
を欠くものである。好ましくは、本発明の酵母株は二
重、三重又は四重変異株である。すなわち、他のペプチ
ダーゼ活性をも欠いている。
広範囲の種類のプロテアーゼが酵母サッカロミセス・
セレビシエーにおいて特徴付けられている〔T.Achstett
er及びD.H.Wolf（1985）,Yeart1,139-157を参照のこ
と〕。これらのほとんどのプロテアーゼの活性を欠く変
異株が単離されそして生化学的に研究されている。ある
種のプロテアーゼの不存在の結果が解明され、そして幾
つかの性質はプロテアーゼ欠損変異株を新たに単離する
ために有用であることが証明されている。自然に生ずる
変異の頻度は低いから、酵母は変異原、例えばＸ−線も
しくはU.V照射により、又は非常に効率的なそして多く
の死滅を伴わないで遺伝子当り１×10-4〜10-3の率で変
異を誘発することができる化学変異剤により処理され
る。本発明の酵母株において欠けているプロテアーゼは
細胞代謝において必須の機能を行わず、従ってこれらの
蛋白質の活性を完全に破壊する変異菌は致死的ではな
い。記載されるプロテアーゼ（yscα,yscB,yscA,yscY及
びyscS）の各変異株タイプを変異誘発後に別々の単離す
ることができる。単離及び選択は、当業界においてよく
知られているコロニー・スクリーニング・アッセイに基
く。
セレビシエーにおいて特徴付けられている〔T.Achstett
er及びD.H.Wolf（1985）,Yeart1,139-157を参照のこ
と〕。これらのほとんどのプロテアーゼの活性を欠く変
異株が単離されそして生化学的に研究されている。ある
種のプロテアーゼの不存在の結果が解明され、そして幾
つかの性質はプロテアーゼ欠損変異株を新たに単離する
ために有用であることが証明されている。自然に生ずる
変異の頻度は低いから、酵母は変異原、例えばＸ−線も
しくはU.V照射により、又は非常に効率的なそして多く
の死滅を伴わないで遺伝子当り１×10-4〜10-3の率で変
異を誘発することができる化学変異剤により処理され
る。本発明の酵母株において欠けているプロテアーゼは
細胞代謝において必須の機能を行わず、従ってこれらの
蛋白質の活性を完全に破壊する変異菌は致死的ではな
い。記載されるプロテアーゼ（yscα,yscB,yscA,yscY及
びyscS）の各変異株タイプを変異誘発後に別々の単離す
ることができる。単離及び選択は、当業界においてよく
知られているコロニー・スクリーニング・アッセイに基
く。
所望の単一の又は複数のプロテアーゼ欠損を誘導する
第二のそして一層効率的な方法は、部位特定変異誘発
（site-directed mutagenesis）又は遺伝子中断（gene-
disruption）もしくは遺伝子置換（gene replacement）
である。プロテアーゼyscB、カルボキシペプチダーゼys
cY及びカルボキシペプチダーゼyscαの場合の様に遺伝
子配列が知られている時には、適切に設計されたオリゴ
デオキシヌクレオチドの調製を用いる良く知られた部位
特定変異誘発法〔例えば、M.J.Zoller及びM.Smith（198
3）,Methods Enzymol.100,468〕を用いる挿入、置換又
は欠失によりゲノム性プロテアーゼ遺伝子を欠損させる
ことができる。あるいは、ゲノム性プロテアーゼ遺伝子
を外来DNAにより置き換えることができ、又は該外来DNA
を該プロテアーゼ遺伝子の適当な制限酵素部位に挿入す
ることができる。例えば、ペプチダーゼyscα活性を欠
く酵母変異株（kex-変異株）を調製するため、ゲノムKE
X1遺伝子中に存在する適当な制限酵素部位に外来DNAを
挿入する。使用される酵母株がアミノ酸又はプリン合成
の酵素をコードする染色体遺伝子中に欠陥を有する場
合、対応する無傷の遺伝子を染色体KEX1遺伝子に挿入
し、そして栄養要求酵母株に原栄菌性を付与しそして同
時にKEX1からkex1への遺伝子型の変化を行うことがき
る。遺伝子置換法又は部位特定変異誘発は当業界におい
て一般に用いられ、そして絶対的に再現性がある。
第二のそして一層効率的な方法は、部位特定変異誘発
（site-directed mutagenesis）又は遺伝子中断（gene-
disruption）もしくは遺伝子置換（gene replacement）
である。プロテアーゼyscB、カルボキシペプチダーゼys
cY及びカルボキシペプチダーゼyscαの場合の様に遺伝
子配列が知られている時には、適切に設計されたオリゴ
デオキシヌクレオチドの調製を用いる良く知られた部位
特定変異誘発法〔例えば、M.J.Zoller及びM.Smith（198
3）,Methods Enzymol.100,468〕を用いる挿入、置換又
は欠失によりゲノム性プロテアーゼ遺伝子を欠損させる
ことができる。あるいは、ゲノム性プロテアーゼ遺伝子
を外来DNAにより置き換えることができ、又は該外来DNA
を該プロテアーゼ遺伝子の適当な制限酵素部位に挿入す
ることができる。例えば、ペプチダーゼyscα活性を欠
く酵母変異株（kex-変異株）を調製するため、ゲノムKE
X1遺伝子中に存在する適当な制限酵素部位に外来DNAを
挿入する。使用される酵母株がアミノ酸又はプリン合成
の酵素をコードする染色体遺伝子中に欠陥を有する場
合、対応する無傷の遺伝子を染色体KEX1遺伝子に挿入
し、そして栄養要求酵母株に原栄菌性を付与しそして同
時にKEX1からkex1への遺伝子型の変化を行うことがき
る。遺伝子置換法又は部位特定変異誘発は当業界におい
て一般に用いられ、そして絶対的に再現性がある。
多重プロテアーゼ欠損株、例えばyscα活性及びyscB
活性を欠く株を作製するための現在の方法は減数分裂交
配（meiotic crossing）及びそれに続く４分子分析（te
rad analysis）である。二倍体細胞に由来する４分子
（tetrad）を標準的な遺伝的方法によって分離（dissec
t）する。４分子（tetrad）の４個の胞子間のランダム
類別（assortment）が次の交配における二重変異株及び
多重変異株の構成を可能にする。これに代る系として、
ランダム胞子分析を使用することもできる。
活性を欠く株を作製するための現在の方法は減数分裂交
配（meiotic crossing）及びそれに続く４分子分析（te
rad analysis）である。二倍体細胞に由来する４分子
（tetrad）を標準的な遺伝的方法によって分離（dissec
t）する。４分子（tetrad）の４個の胞子間のランダム
類別（assortment）が次の交配における二重変異株及び
多重変異株の構成を可能にする。これに代る系として、
ランダム胞子分析を使用することもできる。
個々のプロテアーゼを欠く変異株及び二重変異株をも
酵母遺伝子貯蔵機関から入手可能であるから、三重変異
株及び四重変異株を、既知の逐次的な減数分裂交配法に
より再現可能に構成することができる。
酵母遺伝子貯蔵機関から入手可能であるから、三重変異
株及び四重変異株を、既知の逐次的な減数分裂交配法に
より再現可能に構成することができる。
サッカミセス・セレビシエーの適当な出発株には、例
えば、Yeast Genetic Stock Center,Berleley、から得
られるkex1 96株；酵母ペプチダーゼＡ（yscA）陰性株A
B103（ATCC 20673）及びAB110（ATCC 20796）；酵母ペ
プチダーゼＢ（yscB）陰性株HT246,H426及びH449（後者
はさらにcir°である）（Deutshe Sammlung von Mikroo
rganismen,Braunshweig,西独に、それぞれDSM No.4084,
4232及び4413として寄託されている）；酵母ペプチダー
ゼB,Y及びＳ（yscB,yscY及びyscS）陰性株BY232-31-4
2）；並びに酵母ペプチダーゼA,B,Y及びＳ（yscA,yscB,
yscY及びyscC）陰性株ABYSが含まれる。
えば、Yeast Genetic Stock Center,Berleley、から得
られるkex1 96株；酵母ペプチダーゼＡ（yscA）陰性株A
B103（ATCC 20673）及びAB110（ATCC 20796）；酵母ペ
プチダーゼＢ（yscB）陰性株HT246,H426及びH449（後者
はさらにcir°である）（Deutshe Sammlung von Mikroo
rganismen,Braunshweig,西独に、それぞれDSM No.4084,
4232及び4413として寄託されている）；酵母ペプチダー
ゼB,Y及びＳ（yscB,yscY及びyscS）陰性株BY232-31-4
2）；並びに酵母ペプチダーゼA,B,Y及びＳ（yscA,yscB,
yscY及びyscC）陰性株ABYSが含まれる。
前記のごとく、本発明の好ましい酵母株は内因性２ミ
クロンDNAを欠いている。２ミクロンプラスミドは、サ
ッカロミセス・セレビシエーのほとんどの株に含まれて
いる高コピー数の自己複製性染色体外DNA要素である。
２ミクロンプラスミドの最も顕著な構造的特徴は、該プ
ラスミドを異る長さの２つのDNA領域に分ける各559bpの
２つの逆方向反復配列（IR1及びIR2）である。これらの
２つのIR配列間の相同性組換えが２つの分子異性体（Ａ
形及びＢ形）の生成をもたらす。２ミクロンプラスミド
の安定性はプラスミドによりコードされた３つの機能に
より与えられる。REP（２−ミクロンプラスミドの複製
に使用される遺伝子）−１遺伝子産物及びREP2遺伝子産
物は、２ミクロンプラスミドの安定な分配のために必要
なトランス（trans）−作用蛋白質である。これら２つ
の内、分配の効率がREP1遺伝子産物の遺伝子量に依存す
る〔A.Cashmers等（1986）Mol.Gem.Genet.203,154〕点
において,REP1がおそらく一層重要である。これら２つ
の蛋白質は、該プラスミドに対する重要なシス（cis）
−作用要素であるSTB（REP3）に作用する〔M.Jayaram等
（1985）,Mol.Cell.Biol.5,2466-2475;B.Viet等（198
5）,Mol.Cell.Biol.5,2190-2196〕。
クロンDNAを欠いている。２ミクロンプラスミドは、サ
ッカロミセス・セレビシエーのほとんどの株に含まれて
いる高コピー数の自己複製性染色体外DNA要素である。
２ミクロンプラスミドの最も顕著な構造的特徴は、該プ
ラスミドを異る長さの２つのDNA領域に分ける各559bpの
２つの逆方向反復配列（IR1及びIR2）である。これらの
２つのIR配列間の相同性組換えが２つの分子異性体（Ａ
形及びＢ形）の生成をもたらす。２ミクロンプラスミド
の安定性はプラスミドによりコードされた３つの機能に
より与えられる。REP（２−ミクロンプラスミドの複製
に使用される遺伝子）−１遺伝子産物及びREP2遺伝子産
物は、２ミクロンプラスミドの安定な分配のために必要
なトランス（trans）−作用蛋白質である。これら２つ
の内、分配の効率がREP1遺伝子産物の遺伝子量に依存す
る〔A.Cashmers等（1986）Mol.Gem.Genet.203,154〕点
において,REP1がおそらく一層重要である。これら２つ
の蛋白質は、該プラスミドに対する重要なシス（cis）
−作用要素であるSTB（REP3）に作用する〔M.Jayaram等
（1985）,Mol.Cell.Biol.5,2466-2475;B.Viet等（198
5）,Mol.Cell.Biol.5,2190-2196〕。
サッカロミセス・セレビシエーのこのようなcir°株
は知られており、又は当業界において知られている方法
により調製することができる〔例えば、C.P.Hollenbery
（1982）Curr.Top.Microbiol.Immun.96,119〕。
は知られており、又は当業界において知られている方法
により調製することができる〔例えば、C.P.Hollenbery
（1982）Curr.Top.Microbiol.Immun.96,119〕。
次に記載する別法は、第二のプラスミドによる２ミク
ロンプラスミドのキュアリング（curing）がSTB（有糸
分裂の際に娘細胞に２−ミクロンプラスミドを安定に伝
達することを司る遺伝子であってREP3ともいう）部位の
増加に関与してREP1蛋白質及びREP2蛋白質を消耗（titr
ate out）するという仮定に基いている。REP1蛋白質及
びREP2蛋白質の相対的減少が内因性２ミクロンプラスミ
ドの不安定性を導くであろう。
ロンプラスミドのキュアリング（curing）がSTB（有糸
分裂の際に娘細胞に２−ミクロンプラスミドを安定に伝
達することを司る遺伝子であってREP3ともいう）部位の
増加に関与してREP1蛋白質及びREP2蛋白質を消耗（titr
ate out）するという仮定に基いている。REP1蛋白質及
びREP2蛋白質の相対的減少が内因性２ミクロンプラスミ
ドの不安定性を導くであろう。
好ましくは、使用される第二プラスミドはREP2遺伝子
に欠陥を有するか該遺伝子を欠くものである。この様な
プラスミドの例として、REP1遺伝子とは別に逆方向反復
配列（IR2）を欠くpDP38が挙げられる。これはその高コ
ピー数発現を内因性２ミクロンプラスミドによるREP1蛋
白質の補完に依存せしめる。このものは、２個の酵母遺
伝子マーカー、すなわち、高コピー数状態及び低コピー
数状態の両方において用いられるURA3、並びに高コピ数
状態においてのみ用いられるdLEU2を含有する〔E.Erhar
t等、J.Bacteriol.（1963）625〕。
に欠陥を有するか該遺伝子を欠くものである。この様な
プラスミドの例として、REP1遺伝子とは別に逆方向反復
配列（IR2）を欠くpDP38が挙げられる。これはその高コ
ピー数発現を内因性２ミクロンプラスミドによるREP1蛋
白質の補完に依存せしめる。このものは、２個の酵母遺
伝子マーカー、すなわち、高コピー数状態及び低コピー
数状態の両方において用いられるURA3、並びに高コピ数
状態においてのみ用いられるdLEU2を含有する〔E.Erhar
t等、J.Bacteriol.（1963）625〕。
Ura-及びLeu-である酵母株をプラスミドpDP38により
形質転換し、そしてUra+コロニーを選択する。ウラシル
不含有プレート上での選択（Ura選択）が、ロイシン不
含有プレート上での選択（Leu選択）に比べて非常に良
好な形質転換頻度を与える。URA3遺伝子は欠陥dLEU2遺
伝子よりも非常に良好に発現されるからである。単一コ
ロニーを選択し、そしてLeu選択プレート上にストリー
クする。これにより種々のサイズ及び形態のコロニーが
生ずる。最も小さいコロニーの幾つかを、Ura選択プレ
ート上に再ストリークし、そしてLeu選択プレート上に
レプリカプレートする。Ura選択のもとで増殖すること
ができるがしかしLeu選択のもとでは非常に緩慢にのみ
増殖することができるコロニーを選択する。Ura選択プ
レート上での増殖はプラスミドpDP38がなお存在するこ
と、及びLeu選択のもとでの緩慢な増殖がこのプラスミ
ドの喪失に基くものではないことを示しており、そして
Leu選択のもとでの増殖の失敗はpDP38がこのマーカーを
補完できないことを意味する。後者の事実は二様に説明
することができる。A:pDP38上のLEU2遺伝子が変異して
いる；又はB:このプラスミドはそのコピー数を上昇せし
めることができないためにLeu2を補完することができ
ず、REP1遺伝子産物を補完するために２ミクロンプラス
ミドが利用されない（すなわち失われている）ことを意
味する。
形質転換し、そしてUra+コロニーを選択する。ウラシル
不含有プレート上での選択（Ura選択）が、ロイシン不
含有プレート上での選択（Leu選択）に比べて非常に良
好な形質転換頻度を与える。URA3遺伝子は欠陥dLEU2遺
伝子よりも非常に良好に発現されるからである。単一コ
ロニーを選択し、そしてLeu選択プレート上にストリー
クする。これにより種々のサイズ及び形態のコロニーが
生ずる。最も小さいコロニーの幾つかを、Ura選択プレ
ート上に再ストリークし、そしてLeu選択プレート上に
レプリカプレートする。Ura選択のもとで増殖すること
ができるがしかしLeu選択のもとでは非常に緩慢にのみ
増殖することができるコロニーを選択する。Ura選択プ
レート上での増殖はプラスミドpDP38がなお存在するこ
と、及びLeu選択のもとでの緩慢な増殖がこのプラスミ
ドの喪失に基くものではないことを示しており、そして
Leu選択のもとでの増殖の失敗はpDP38がこのマーカーを
補完できないことを意味する。後者の事実は二様に説明
することができる。A:pDP38上のLEU2遺伝子が変異して
いる；又はB:このプラスミドはそのコピー数を上昇せし
めることができないためにLeu2を補完することができ
ず、REP1遺伝子産物を補完するために２ミクロンプラス
ミドが利用されない（すなわち失われている）ことを意
味する。
これら２つの可能性は非常に容易に区別することがで
きる。第一の場合、前記コロニーに見られる最小の増殖
（pDP38を有しない細胞が全く増殖しないのに対して）
は、幾らかのLEU2の発現が存在することを示す。第二の
点は直接に試験することができる。なぜなら、２ミクロ
ンプラスミドの非存在下においてはpDP38はARSタイプの
プラスミドとしてのみ機能する、すなわちそれは非常に
不安定であって少数世代の後ほとんどのコロニーはそれ
を失うからである。従って、単一コロニーをYPDプレー
ト上にストリークし、単一コロニーを取り、そしてウラ
シル不含有プレー上にレプリカプレートした場合、少数
のみがUra選択のもとで増殖するであろう。増殖しない
コロニーをpUC及び２ミクロン配列についてのハイブリ
ダイゼーションによりチェックする。ハイブリダイゼー
ションシグナルを示さないコロニーはプラスミドpDP38
及び内因性２ミクロンプラスミドを含有しない（cir°
株）。
きる。第一の場合、前記コロニーに見られる最小の増殖
（pDP38を有しない細胞が全く増殖しないのに対して）
は、幾らかのLEU2の発現が存在することを示す。第二の
点は直接に試験することができる。なぜなら、２ミクロ
ンプラスミドの非存在下においてはpDP38はARSタイプの
プラスミドとしてのみ機能する、すなわちそれは非常に
不安定であって少数世代の後ほとんどのコロニーはそれ
を失うからである。従って、単一コロニーをYPDプレー
ト上にストリークし、単一コロニーを取り、そしてウラ
シル不含有プレー上にレプリカプレートした場合、少数
のみがUra選択のもとで増殖するであろう。増殖しない
コロニーをpUC及び２ミクロン配列についてのハイブリ
ダイゼーションによりチェックする。ハイブリダイゼー
ションシグナルを示さないコロニーはプラスミドpDP38
及び内因性２ミクロンプラスミドを含有しない（cir°
株）。
yscα活性の欠損に加えて、本発明の好ましい酵母株
はさらに、yscA,yscB,yscY及びyscSから成る群から選択
されたペプチダーゼ活性をさらに欠いており、さして２
ミクロンDNAを欠いている。最も好ましい酵母株はyscα
活性及びyscY活性を欠いており、そして場合によっては
さらにyscB活性及びyscS活性、又はyscA活性及びyscB活
性を欠いており、そして２ミクロンDNAを欠いている。
はさらに、yscA,yscB,yscY及びyscSから成る群から選択
されたペプチダーゼ活性をさらに欠いており、さして２
ミクロンDNAを欠いている。最も好ましい酵母株はyscα
活性及びyscY活性を欠いており、そして場合によっては
さらにyscB活性及びyscS活性、又はyscA活性及びyscB活
性を欠いており、そして２ミクロンDNAを欠いている。
本発明の酵母株は異種蛋白質の製造のために有利に使
用することができる。驚くべきことには、酵母にとって
異種性の蛋白質をコードする遺伝子を含有するハイブリ
ドベクターを担持する本発明のkex1株は該蛋白質を均一
な形で、すなわちＣ−末端が短縮されたいかなる副生成
物も伴わないで生産する。
用することができる。驚くべきことには、酵母にとって
異種性の蛋白質をコードする遺伝子を含有するハイブリ
ドベクターを担持する本発明のkex1株は該蛋白質を均一
な形で、すなわちＣ−末端が短縮されたいかなる副生成
物も伴わないで生産する。
形質転換された酵母株 本発明はさらに、カルボキシペプチダーゼyscα活性
を欠いており、そして異種蛋白質をコードするDNA配列
に作用可能に連結された酵母プロモーターを含んで成る
ハイブリドベクターにより形質転換されている酵母株に
関する。
を欠いており、そして異種蛋白質をコードするDNA配列
に作用可能に連結された酵母プロモーターを含んで成る
ハイブリドベクターにより形質転換されている酵母株に
関する。
本発明の酵母宿主株には、カルボキシペプチダーゼys
cα及び場合によっては更なるペプチダーゼ活性を欠い
ており、そして場合によっては内因性２ミクロンプラス
ミド（前記参照のこと）が除去されているサッカロミセ
ス・セレビシエーの株が含まれる。
cα及び場合によっては更なるペプチダーゼ活性を欠い
ており、そして場合によっては内因性２ミクロンプラス
ミド（前記参照のこと）が除去されているサッカロミセ
ス・セレビシエーの株が含まれる。
前記の形質転換された酵母株の製造方法は、カルボキ
シペプチダーゼyscα活性を欠く酵母株を前記ハイブリ
ドベクターにより形質転換することを含む。
シペプチダーゼyscα活性を欠く酵母株を前記ハイブリ
ドベクターにより形質転換することを含む。
本発明のハイブリドベクターによる酵母の形質転換
は、Hinnen等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75,1929（197
8）〕により記載されている方法により行うことができ
る。この方法は次の３つの段階に分けることができる。
は、Hinnen等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75,1929（197
8）〕により記載されている方法により行うことができ
る。この方法は次の３つの段階に分けることができる。
（１）グルコシダーゼの種々の調製物、例えばカタツム
リの腸液（例えば、グルスラーゼ（Glusulase）又はヘ
リカーゼ（Helicase）〕又は微生物からの酵素混合物
〔例えばチモリアーゼ（Zymolyase）〕を浸透圧的に安
定な溶液中で用いて酵母細胞壁又はその部分を除去す
る。
リの腸液（例えば、グルスラーゼ（Glusulase）又はヘ
リカーゼ（Helicase）〕又は微生物からの酵素混合物
〔例えばチモリアーゼ（Zymolyase）〕を浸透圧的に安
定な溶液中で用いて酵母細胞壁又はその部分を除去す
る。
（２）「裸の」酵母細胞（スフェロプラスト）をPEG
（ポリエチレングリコール）及びCa++イオンの存在下で
DNAベクターにより処理する。
（ポリエチレングリコール）及びCa++イオンの存在下で
DNAベクターにより処理する。
（３）寒天の固層中で、細胞壁を再生しそして形質転換
された細胞を選択する。この再生は便利にはスフェロプ
ラストを寒天中に包埋することにより行われる。例え
ば、溶融した寒天（約50℃）をスフェロプラストと混合
する。この溶液を酵母増殖温度（約30℃）に冷却した後
固層が得られる。この固層は、スフェロプラストからの
必須巨大分子の急速な拡散及び喪失を防止し、そしてこ
れによって細胞壁の再生を促進するためのものである。
しかしながら、あらかじめ形成された寒天層の表面にス
フェロプラストをプレートすることによっても（効率は
低いが）細胞壁の再生を行うことができる。
された細胞を選択する。この再生は便利にはスフェロプ
ラストを寒天中に包埋することにより行われる。例え
ば、溶融した寒天（約50℃）をスフェロプラストと混合
する。この溶液を酵母増殖温度（約30℃）に冷却した後
固層が得られる。この固層は、スフェロプラストからの
必須巨大分子の急速な拡散及び喪失を防止し、そしてこ
れによって細胞壁の再生を促進するためのものである。
しかしながら、あらかじめ形成された寒天層の表面にス
フェロプラストをプレートすることによっても（効率は
低いが）細胞壁の再生を行うことができる。
好ましくは、再生寒天は、再生及び形質転換された細
胞の選択が同時に可能なように調製される。アミノ酸又
は核酸生合成経路の酵素をコードする酵母遺伝子が一般
に選択マーカー（前記）として使用されるから、再生は
好ましくは酵母最小寒天中で行われる。非常に高効率の
再生が必要な場合、次に二段階法、すなわち、（１）富
複合培地中での細胞壁の再生、及び（２）選択寒天プレ
ート上への細胞層のレプリカによる形質転換された細胞
の選択、を用いる方法が有利である。
胞の選択が同時に可能なように調製される。アミノ酸又
は核酸生合成経路の酵素をコードする酵母遺伝子が一般
に選択マーカー（前記）として使用されるから、再生は
好ましくは酵母最小寒天中で行われる。非常に高効率の
再生が必要な場合、次に二段階法、すなわち、（１）富
複合培地中での細胞壁の再生、及び（２）選択寒天プレ
ート上への細胞層のレプリカによる形質転換された細胞
の選択、を用いる方法が有利である。
本発明の他の態様は（IV）： X1 Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys
Leu Gys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn X
3 Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X3 Asn Gln Cys V
al Thr Gly Glu Gly Thr Pro X4 Pro Gln Ser X5 Asn A
sp Gly Aps Phe Glu Glu Ile Pro Glu X6 （IV） （式中、X1はジペプチド残基Va1−Va1を表わし、X2，
X3及びX4はLysであり、X5はHisであり、そしてX6はGlu-
Tyr-Lys-Arg、Ser-Phe-Arg-Tyr及びTrp-Glu-Leu-Argか
ら成る群から選択される） で表わされるデスルファトヒルジンに関する。
Leu Gys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn X
3 Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu X3 Asn Gln Cys V
al Thr Gly Glu Gly Thr Pro X4 Pro Gln Ser X5 Asn A
sp Gly Aps Phe Glu Glu Ile Pro Glu X6 （IV） （式中、X1はジペプチド残基Va1−Va1を表わし、X2，
X3及びX4はLysであり、X5はHisであり、そしてX6はGlu-
Tyr-Lys-Arg、Ser-Phe-Arg-Tyr及びTrp-Glu-Leu-Argか
ら成る群から選択される） で表わされるデスルファトヒルジンに関する。
本発明の方法により得られる既知の異種蛋白質はそれ
自体既知の方法でヒト及び動物の疾患の治療及び予防の
ために使用することができる。例えば、ヒトANPはナト
リウム利尿活性、利尿活性及び血管弛緩活性を有し、そ
して心臓血管系の恒常性調節のために使用することがで
きる。
自体既知の方法でヒト及び動物の疾患の治療及び予防の
ために使用することができる。例えば、ヒトANPはナト
リウム利尿活性、利尿活性及び血管弛緩活性を有し、そ
して心臓血管系の恒常性調節のために使用することがで
きる。
本発明の方法により得られるデスルファトヒルジン化
合物は、ヨーロッパ特許出願No.168,324に記載されてい
るように、天然ヒルジンと同様に、血栓症の治療及び予
防のため、急性ショック療法のため、消費凝結血状症の
療法等のために使用することができる。
合物は、ヨーロッパ特許出願No.168,324に記載されてい
るように、天然ヒルジンと同様に、血栓症の治療及び予
防のため、急性ショック療法のため、消費凝結血状症の
療法等のために使用することができる。
本発明はさらに、例に記載されているような、形質転
換された酵母株、該ハイブリドベクター及び該形質転換
された酵母株の製造方法、並びにデスルファトヒルジン
化合物の製造方法に関する。
換された酵母株、該ハイブリドベクター及び該形質転換
された酵母株の製造方法、並びにデスルファトヒルジン
化合物の製造方法に関する。
次の実験の部において、本発明の種々の態様を図面に
言及しながら説明する。
言及しながら説明する。
実験の部 例1.S.セレジヒエーkex1変異株96とS.セレビシエーSYS
株との交配及びα−ファクター分泌活性とカルボキシペ
プチダーゼyscα（KEX1遺伝子）活性に対する胞子の分
析 yeast Genetic Stock Center、バークレー、米国、か
ら得られるS.セレビシエーkex1変異株96（a,kex1,ade2,
thr1）を、野性型KEX1対立遺伝子を担持するS.セレビシ
エー株BYS232-31-42（α,prb1-1,prc1-1,pcs1-3,lys2,l
eu2,his7）〔Achstetter,T.及びWolf.D.H.（1985）,EMB
O J.4,173-177;Wolf.D.H.及びEhmann,C.（1981）J.Bact
eriol.147418-426〕に交配する。遺伝子型がkex1/KEX1
である二倍体ヘテロ接合細胞をこの交配から単離する。
この二倍体細胞に由来する４分子（tetrdad）を標準的
な遺伝的技法〔Hawthorne,D.C.及びMortimer,R.K.（196
0）,Genetics,45,1085-1110;Method in Yeast Genetics
1986（Sherm,F.等減収）Cold Spring Harbor Laborato
ry,N.Y.〕に従って分離（dissect）する。
株との交配及びα−ファクター分泌活性とカルボキシペ
プチダーゼyscα（KEX1遺伝子）活性に対する胞子の分
析 yeast Genetic Stock Center、バークレー、米国、か
ら得られるS.セレビシエーkex1変異株96（a,kex1,ade2,
thr1）を、野性型KEX1対立遺伝子を担持するS.セレビシ
エー株BYS232-31-42（α,prb1-1,prc1-1,pcs1-3,lys2,l
eu2,his7）〔Achstetter,T.及びWolf.D.H.（1985）,EMB
O J.4,173-177;Wolf.D.H.及びEhmann,C.（1981）J.Bact
eriol.147418-426〕に交配する。遺伝子型がkex1/KEX1
である二倍体ヘテロ接合細胞をこの交配から単離する。
この二倍体細胞に由来する４分子（tetrdad）を標準的
な遺伝的技法〔Hawthorne,D.C.及びMortimer,R.K.（196
0）,Genetics,45,1085-1110;Method in Yeast Genetics
1986（Sherm,F.等減収）Cold Spring Harbor Laborato
ry,N.Y.〕に従って分離（dissect）する。
20の４分子（tetrad）の各々の４個の胞子を、α−フ
ァクターを分泌するそれらの能力について試験する。KE
X1野性型コロニーとkex1変異株コロニーとを区別するた
め、フェロモン−超感受性試験株S.セレビシエーRC 629
（a,sst-2,ade2-1,vra1,his6,met1,can1,cyn2,rme）を
用いる〔chan,R.K.及びOtte,C.K.（1982）,Mol.Cell.Bi
ol.2,11-20;Chan,R.K.及びOtte,C.K.（1982）,Mol.Cel
l.Biol.2,21-29〕。単一核遺伝子によりコードされた形
質から予想されるように、分析したすべての４分子（te
trad）から、各４分子（tetrad）の２個の胞子はａ−フ
ァクターを分泌し、他方、他の２個の胞子はα−ファク
ターを分泌する。α−メイティングタイプの野性型KEX1
コロニーは試験株の増殖を大巾に阻害し、そしてそれ故
に自らの周囲に大きなハローを形成する。なぜなら、そ
れらはα−ファクター前駆体を完全に生産することがで
きそして１個の前駆体分子から４個の活性なα−ファク
ター分子を生成するからである。これに対して、kex1変
異体コロニーは試験株の増殖をあまり阻害せず、そして
それ故に自らの周囲に小さいハローを形成する。なぜな
ら、これらは１個の前駆体分子から１個の成熟α−ファ
クター分子を生成することができるだけであるからであ
る。
ァクターを分泌するそれらの能力について試験する。KE
X1野性型コロニーとkex1変異株コロニーとを区別するた
め、フェロモン−超感受性試験株S.セレビシエーRC 629
（a,sst-2,ade2-1,vra1,his6,met1,can1,cyn2,rme）を
用いる〔chan,R.K.及びOtte,C.K.（1982）,Mol.Cell.Bi
ol.2,11-20;Chan,R.K.及びOtte,C.K.（1982）,Mol.Cel
l.Biol.2,21-29〕。単一核遺伝子によりコードされた形
質から予想されるように、分析したすべての４分子（te
trad）から、各４分子（tetrad）の２個の胞子はａ−フ
ァクターを分泌し、他方、他の２個の胞子はα−ファク
ターを分泌する。α−メイティングタイプの野性型KEX1
コロニーは試験株の増殖を大巾に阻害し、そしてそれ故
に自らの周囲に大きなハローを形成する。なぜなら、そ
れらはα−ファクター前駆体を完全に生産することがで
きそして１個の前駆体分子から４個の活性なα−ファク
ター分子を生成するからである。これに対して、kex1変
異体コロニーは試験株の増殖をあまり阻害せず、そして
それ故に自らの周囲に小さいハローを形成する。なぜな
ら、これらは１個の前駆体分子から１個の成熟α−ファ
クター分子を生成することができるだけであるからであ
る。
前記のファロモン測定においてkex1遺伝子において欠
陥がある（defective）と同定された５つの完全な４分
子（tetrad）の胞子をカルボキシペプチダーゼyscαの
比活性について最終的に試験する。細胞を増殖せしめ、
その膜を調製し、そしてWagner,J.C.及びWolf,D.H.（19
87）FEBS Lett.,221,2,423-426に記載されているように
して基質としてCbz-Tyr-Lys-Argを用いてカルボキシペ
プチダーゼについて試験する。カルボキシペプチダーゼ
yscαの活性がkex1変異株細胞において欠けているとい
う事実はKEX1がこの酵素の構造遺伝子であることを示す
ものである。このことは、カルボキシペプチダーゼysc
αがα−ファクターのカルボキシ末端のプロセシングに
確かに関与していることを意味する。
陥がある（defective）と同定された５つの完全な４分
子（tetrad）の胞子をカルボキシペプチダーゼyscαの
比活性について最終的に試験する。細胞を増殖せしめ、
その膜を調製し、そしてWagner,J.C.及びWolf,D.H.（19
87）FEBS Lett.,221,2,423-426に記載されているように
して基質としてCbz-Tyr-Lys-Argを用いてカルボキシペ
プチダーゼについて試験する。カルボキシペプチダーゼ
yscαの活性がkex1変異株細胞において欠けているとい
う事実はKEX1がこの酵素の構造遺伝子であることを示す
ものである。このことは、カルボキシペプチダーゼysc
αがα−ファクターのカルボキシ末端のプロセシングに
確かに関与していることを意味する。
例2.プロテアーゼyscB,yscY及びyscSの異なる欠損に基
く、確認されたkex1変異株の分類 例１で得た５株のS.セレビシエーkex1変異株を、他の
プロテアーゼ（プロテイナーゼyscB、カルボキシペプチ
ダーゼyscY及びカルボキシペプチダーゼyscS）並びに追
加の増殖因子要求に関して分類する。
く、確認されたkex1変異株の分類 例１で得た５株のS.セレビシエーkex1変異株を、他の
プロテアーゼ（プロテイナーゼyscB、カルボキシペプチ
ダーゼyscY及びカルボキシペプチダーゼyscS）並びに追
加の増殖因子要求に関して分類する。
YPD（ディフコ）培地での定常期から調製したkex1変
異株の細胞材料を、エッペンドルフ小遠心管中の200ml
の20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.2）中に懸濁し、そしてガ
ラスビーズ（直径0.4mm）を体積の３分の２まで加え
る。この懸濁液をボルテックスミキサー上で１分間ずつ
３回激しく振とうし、振とうと振とうとの間に氷上で冷
却する。
異株の細胞材料を、エッペンドルフ小遠心管中の200ml
の20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.2）中に懸濁し、そしてガ
ラスビーズ（直径0.4mm）を体積の３分の２まで加え
る。この懸濁液をボルテックスミキサー上で１分間ずつ
３回激しく振とうし、振とうと振とうとの間に氷上で冷
却する。
５分間の遠心分離により上清粗抽出物が回収される。
プロテアーゼを活性化しそして抽出物からの遊離アミノ
酸を除去するため、0.1mM ZnCl2を含む0.1Mイミダゾー
ル−HCl緩衝液（pH5.2）に対して前記抽出物を透析す
る。
プロテアーゼを活性化しそして抽出物からの遊離アミノ
酸を除去するため、0.1mM ZnCl2を含む0.1Mイミダゾー
ル−HCl緩衝液（pH5.2）に対して前記抽出物を透析す
る。
プロテアーゼyscB活性をアゾコール（Azocoll）テス
ト〔R.E.Ulane等（1976）,J.Biol.Chem.251,3367;E.Cab
ib等（1973）,Biochem.Biophys.Res.Commun.50,186;T.S
aheki等（1974）,Eur.J.Biochem.42,621〕により測定す
る。蛋白質濃度を測定した後、各サンプルのアリコート
を0.1Mリン酸ナトリウム（NaPi）緩衝液（pH7.0）によ
り100μｌまでに満たして必要な同じ蛋白質濃度に調整
する。この蛋白質溶液に500μｌのアゾコール（Azocol
l）の懸濁液〔10mlの0.1M NaPi緩衝液（pH7.0）中240m
g〕を加える。これらの混合物を30℃にて１時間振とう
しながらインキュベートする。500μｌの10％トリクロ
ロ酢酸を添加して反応を停止させた後、この混合物を２
回遠心し、そして上清の520nmにおける吸収スペクトル
を測定する。
ト〔R.E.Ulane等（1976）,J.Biol.Chem.251,3367;E.Cab
ib等（1973）,Biochem.Biophys.Res.Commun.50,186;T.S
aheki等（1974）,Eur.J.Biochem.42,621〕により測定す
る。蛋白質濃度を測定した後、各サンプルのアリコート
を0.1Mリン酸ナトリウム（NaPi）緩衝液（pH7.0）によ
り100μｌまでに満たして必要な同じ蛋白質濃度に調整
する。この蛋白質溶液に500μｌのアゾコール（Azocol
l）の懸濁液〔10mlの0.1M NaPi緩衝液（pH7.0）中240m
g〕を加える。これらの混合物を30℃にて１時間振とう
しながらインキュベートする。500μｌの10％トリクロ
ロ酢酸を添加して反応を停止させた後、この混合物を２
回遠心し、そして上清の520nmにおける吸収スペクトル
を測定する。
カルボキシペプチダーゼyscY及びyscSの活性を、発色
基質Cbz-Gln-Leuを用いて測定する〔D.H.Wolf等（197
8）,FEBS Lett.91,59;D.H.Wolf等（1977）,Eur.J.Bioch
em.73,553〕。透析された抽出物を３分割し、それらの
内に２つにフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMS
F）を最終濃度1mMに、又はEDTAを最終濃度5mMに加えて
２種類のプロテアーゼ活性を選択的にブロックする。す
なわち、PMSFはカルボキシペプチダーゼyscY活性を阻害
し、そしてEDTAはカルボキシペプチダーゼyscSの活性を
阻害する。阻害剤との混合物をそれぞれ25℃にて１時間
インキュベートして阻害を完結する。蛋白質濃度を測定
した後、阻害剤を伴う２つのアリコート、及び各サンプ
ルの対照としての阻害剤を伴わない１つのアリコートを
0.1M NaPi緩衝液（pH7.4）により50μｌまで満たして同
じ蛋白質量にする。これらの蛋白質溶液に次の試験溶液
を加える。
基質Cbz-Gln-Leuを用いて測定する〔D.H.Wolf等（197
8）,FEBS Lett.91,59;D.H.Wolf等（1977）,Eur.J.Bioch
em.73,553〕。透析された抽出物を３分割し、それらの
内に２つにフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMS
F）を最終濃度1mMに、又はEDTAを最終濃度5mMに加えて
２種類のプロテアーゼ活性を選択的にブロックする。す
なわち、PMSFはカルボキシペプチダーゼyscY活性を阻害
し、そしてEDTAはカルボキシペプチダーゼyscSの活性を
阻害する。阻害剤との混合物をそれぞれ25℃にて１時間
インキュベートして阻害を完結する。蛋白質濃度を測定
した後、阻害剤を伴う２つのアリコート、及び各サンプ
ルの対照としての阻害剤を伴わない１つのアリコートを
0.1M NaPi緩衝液（pH7.4）により50μｌまで満たして同
じ蛋白質量にする。これらの蛋白質溶液に次の試験溶液
を加える。
500μｌの試験溶液I: 0.1M NaPi緩衝液（pH7.4）中 Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ 0.24mg/ml 西洋ワサビ・パーオキシダーゼ 0.40mg/ml 0.01mM MnCl2 50μｌの試験溶液II: 水中 ｏ−ジアニシジン 2mg/ml 500μｌの試験溶液III: 0.2Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）中 20mM Cbz-Gly-Leu これらの混合物を28℃にて１時間インキュベートし、
そして100μｌの20％Triton X-100を添加して反応を停
止させた後、405nmにおける吸光度を測定する。
そして100μｌの20％Triton X-100を添加して反応を停
止させた後、405nmにおける吸光度を測定する。
その後の形質転換のため、アデニン、スレオニン、リ
ジン及びヒスチジンが供給されておりそしてロイシンを
含有するか又は含有しない最少培地プレート上でのレプ
リカ法により、ロイシンについてアミノ酸栄養要求マー
カーをスコアーする。
ジン及びヒスチジンが供給されておりそしてロイシンを
含有するか又は含有しない最少培地プレート上でのレプ
リカ法により、ロイシンについてアミノ酸栄養要求マー
カーをスコアーする。
上記のアッセイにより、四重のプロテアーゼ欠損
（α,prb-1,prc-1,cps-3,kex1）及びさらにロイシン要
求を示すS.セレビシエーBYSkex1と称する１株の変異株
を単離する。
（α,prb-1,prc-1,cps-3,kex1）及びさらにロイシン要
求を示すS.セレビシエーBYSkex1と称する１株の変異株
を単離する。
例3.サッカロミセス・セレビシエー・プロテアーゼ四重
欠損株の形質転換 プラスミドpJDB 207/PH05-HIR（ヨーロッパ特許出願N
o.225633）を、プロテアーゼ四重欠損株BYSkex1（α,pr
b-1,prc-1,cps-3,kex-1,leu2）及び対照としてのKEX1野
性型株BYS232-31-42（α,prb-1,prc-1,cps-3,lys2,leu
2,his7）に、Hinnen等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA75,192
9（1978）〕により記載された形質転換法を用いて導入
する。
欠損株の形質転換 プラスミドpJDB 207/PH05-HIR（ヨーロッパ特許出願N
o.225633）を、プロテアーゼ四重欠損株BYSkex1（α,pr
b-1,prc-1,cps-3,kex-1,leu2）及び対照としてのKEX1野
性型株BYS232-31-42（α,prb-1,prc-1,cps-3,lys2,leu
2,his7）に、Hinnen等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA75,192
9（1978）〕により記載された形質転換法を用いて導入
する。
上記２種類の異る酵母株を100mlのYPD培地中初期対数
期（OD600＝0.2）から収得し、25mlの0.8Mソルビトール
により洗浄し、そして5mlの同じソルビトール溶液中に
再懸濁する。これらの5ml細胞懸濁液に30μｌのチモリ
アーゼ（zymolyase）〔アースロバクター・ルテウス（A
rthrobacter luteus）からのZYMOLYASE-100T、生化学
工業株式会社;10mg/ml0.8Mソルビトール〕を加える。こ
れらの混合物のそれぞれを、100mlの振とうフラスコ中
振とう機上（100回／分）上30℃にて約30分間攪拌す
る。５分間の間隔で100μｌのサンプルを採取し、10ml
の蒸留水中に懸濁し、そして600nmでの稀釈物の吸光度
を測定してスフェロプラスト化の進行過程を調節する。
良好なスフェロプラスト形成を得るためには、チモリア
ーゼによる処理の前後の吸光度の差が10の係数より大で
なければならない。スフェロプラスト化された細胞を0.
8Mソルビトールにより２回洗浄し、25mlのHE30倍地（YP
D培地中2Mソルビトール）に再懸濁し、そして100mlの振
とうフラスコ中で振とう機（110回／分）上で緩和に攪
拌しながら30℃にて１時間インキュベートする。細胞を
遠心分離し（3000rpm、５分間）、そして1mlのHE31溶液
〔10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM CaCkl2、0.9Mソルビ
トール〕中に注意深く再懸濁する。これらの100μｌの
細胞懸濁液に４μｇのプラスミドDNAを加える。この混
合物を室温にて15分間インキュベートする。1mlの20％
ポリエチレングリコール（PEG）4000を各チューブに加
え、そしてさらに30分間室温にてインキュベートし、遠
心し（3000rpm、３分間）、そして500μｌの0.8Mソルビ
トールに再懸濁する。スファトプラストをDNAと共に10m
lの再生寒天（1Mマンニトール、6.8g/l、イースト・ニ
トロゲン・ベースw/o AA（ディフコ）、10g/l L−アス
パラギン、1.0g/l L−ヒスチジン、1.0g/l アデニン、
1.0g/l スレオニン、1.0g/lリジン及び３％寒天）と混
合し、そして同じ組成の基礎寒天層を含むプレート上上
層として注加する。このプレートを、形質転換体コロニ
ーが出現するまで30℃にて96時間インキュベートする。
期（OD600＝0.2）から収得し、25mlの0.8Mソルビトール
により洗浄し、そして5mlの同じソルビトール溶液中に
再懸濁する。これらの5ml細胞懸濁液に30μｌのチモリ
アーゼ（zymolyase）〔アースロバクター・ルテウス（A
rthrobacter luteus）からのZYMOLYASE-100T、生化学
工業株式会社;10mg/ml0.8Mソルビトール〕を加える。こ
れらの混合物のそれぞれを、100mlの振とうフラスコ中
振とう機上（100回／分）上30℃にて約30分間攪拌す
る。５分間の間隔で100μｌのサンプルを採取し、10ml
の蒸留水中に懸濁し、そして600nmでの稀釈物の吸光度
を測定してスフェロプラスト化の進行過程を調節する。
良好なスフェロプラスト形成を得るためには、チモリア
ーゼによる処理の前後の吸光度の差が10の係数より大で
なければならない。スフェロプラスト化された細胞を0.
8Mソルビトールにより２回洗浄し、25mlのHE30倍地（YP
D培地中2Mソルビトール）に再懸濁し、そして100mlの振
とうフラスコ中で振とう機（110回／分）上で緩和に攪
拌しながら30℃にて１時間インキュベートする。細胞を
遠心分離し（3000rpm、５分間）、そして1mlのHE31溶液
〔10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM CaCkl2、0.9Mソルビ
トール〕中に注意深く再懸濁する。これらの100μｌの
細胞懸濁液に４μｇのプラスミドDNAを加える。この混
合物を室温にて15分間インキュベートする。1mlの20％
ポリエチレングリコール（PEG）4000を各チューブに加
え、そしてさらに30分間室温にてインキュベートし、遠
心し（3000rpm、３分間）、そして500μｌの0.8Mソルビ
トールに再懸濁する。スファトプラストをDNAと共に10m
lの再生寒天（1Mマンニトール、6.8g/l、イースト・ニ
トロゲン・ベースw/o AA（ディフコ）、10g/l L−アス
パラギン、1.0g/l L−ヒスチジン、1.0g/l アデニン、
1.0g/l スレオニン、1.0g/lリジン及び３％寒天）と混
合し、そして同じ組成の基礎寒天層を含むプレート上上
層として注加する。このプレートを、形質転換体コロニ
ーが出現するまで30℃にて96時間インキュベートする。
単一の形質転換された酵母コロニーを拾い、そしてア
デニン、スレオニン、リジン及びヒスチジンが補充され
ているがロイシンを含有しない酵母合成最少培地（8.4g
/lイースト・ニトロゲン・ベースw/o AA、10g/l L−ア
スパラギン及び1.0g/l L−ヒスチジン）中で増殖せしめ
る。プロテアーゼ四重欠損株BYSkex1からのコロニー、
及びプロテアーゼ三重欠損対照株BYSKEX1からのそれ
を、それぞれサッカロミセス・セレビシエーBYSkex1/pJ
DB207/PHO5-HIR、及びサッカロミセス・セレビシエーBY
SKEX1/pJDB207/PH05-HIRと称する。
デニン、スレオニン、リジン及びヒスチジンが補充され
ているがロイシンを含有しない酵母合成最少培地（8.4g
/lイースト・ニトロゲン・ベースw/o AA、10g/l L−ア
スパラギン及び1.0g/l L−ヒスチジン）中で増殖せしめ
る。プロテアーゼ四重欠損株BYSkex1からのコロニー、
及びプロテアーゼ三重欠損対照株BYSKEX1からのそれ
を、それぞれサッカロミセス・セレビシエーBYSkex1/pJ
DB207/PHO5-HIR、及びサッカロミセス・セレビシエーBY
SKEX1/pJDB207/PH05-HIRと称する。
例4.pJBD207/PH05-HIRによるサッカロミセス・セレビシ
エー形質転換体の培養 サッカロミセス・セレビシエー形質転換体BYSkex1/pJ
DB207/PHO5-HIR及びBYSKEX1/pJDB207/PH05-HIRの細胞を
前培養として10mlの酵母完全培地HE41〔4.5g/l カザミ
ノ酸、4g/l 酵母エキス、20g/l サッカロース、20g/l
グルコース、3.6g/l(NH4)2SO4、0.2g/l MgSO4・7H
2O、0.013g/l CaCl2・H2O及び1ml/l微量元素混合物（10
g/lのFeSO4・7H2O、50g/lのZnSO4・7H2O、3.3g/lのCuSO
4・5H2O、3g/lのMgSO4・H2O、2g/lのCoCl2・6H2O及び1g
/l(NH4)6Mo7O24・4H2O）〕中で攪拌しそして約48時間、
定常期に対するまで培養する。収得した細胞を0.9％NaC
l中で洗浄する。50mlの上記酵母合成培地に５％種接材
料を接種する。培養物をOD600＝0.3の細胞密度まで接種
し、そして28℃、250rpmにて72時間まで攪拌した。
エー形質転換体の培養 サッカロミセス・セレビシエー形質転換体BYSkex1/pJ
DB207/PHO5-HIR及びBYSKEX1/pJDB207/PH05-HIRの細胞を
前培養として10mlの酵母完全培地HE41〔4.5g/l カザミ
ノ酸、4g/l 酵母エキス、20g/l サッカロース、20g/l
グルコース、3.6g/l(NH4)2SO4、0.2g/l MgSO4・7H
2O、0.013g/l CaCl2・H2O及び1ml/l微量元素混合物（10
g/lのFeSO4・7H2O、50g/lのZnSO4・7H2O、3.3g/lのCuSO
4・5H2O、3g/lのMgSO4・H2O、2g/lのCoCl2・6H2O及び1g
/l(NH4)6Mo7O24・4H2O）〕中で攪拌しそして約48時間、
定常期に対するまで培養する。収得した細胞を0.9％NaC
l中で洗浄する。50mlの上記酵母合成培地に５％種接材
料を接種する。培養物をOD600＝0.3の細胞密度まで接種
し、そして28℃、250rpmにて72時間まで攪拌した。
酵母完全培地HEを用いてHPLC分析におけるバックグラ
ンド吸収を除去する。
ンド吸収を除去する。
例5.サッカロミセス・セレビシエー形質転換体BYSkex1/
pJDB207/PHO5-HIR及びBYSKEX1/pJDB207/PHO5-HIRの発酵
培養物からのヒルジン−65並びにそのカルボキシ−末端
分解生成物であるヒルジン−64及びヒルジン−63の逆相
HPLCによる分析 液体酵母培養物からのサンプルを遠心により調製して
透明な溶液を生成せしめ、これを1M酢酸により1:10（v/
v）で稀釈し、そして次の条件下でHPLC分析にかける。
pJDB207/PHO5-HIR及びBYSKEX1/pJDB207/PHO5-HIRの発酵
培養物からのヒルジン−65並びにそのカルボキシ−末端
分解生成物であるヒルジン−64及びヒルジン−63の逆相
HPLCによる分析 液体酵母培養物からのサンプルを遠心により調製して
透明な溶液を生成せしめ、これを1M酢酸により1:10（v/
v）で稀釈し、そして次の条件下でHPLC分析にかける。
HIBAR（メルク）カラム（４×125mm）に逆相広孔シリ
カ材料（タイプ71252,300-5-C18,MACHEREYNAGEL）、５
μｍの粒子直径及び300Aのポロシティーを有する球状固
定相、を充填する。カラムの端にステンレス鋼製のフリ
ットを装着する。移動相Ａは0.1％（v/v）トリフルオロ
酢酸を含有する水〔Nanopure（商標）、BARNSTEAD〕か
ら成る。移動相Ｂは0.08％のトリフルオロ酢酸を含有す
る80％（v/v）のアセトニトリル（HPLCグレード、FLUK
A）及び20％の移動相Ａから成る。
カ材料（タイプ71252,300-5-C18,MACHEREYNAGEL）、５
μｍの粒子直径及び300Aのポロシティーを有する球状固
定相、を充填する。カラムの端にステンレス鋼製のフリ
ットを装着する。移動相Ａは0.1％（v/v）トリフルオロ
酢酸を含有する水〔Nanopure（商標）、BARNSTEAD〕か
ら成る。移動相Ｂは0.08％のトリフルオロ酢酸を含有す
る80％（v/v）のアセトニトリル（HPLCグレード、FLUK
A）及び20％の移動相Ａから成る。
クロマトグラフ分離を下記のグラジエントで1.5ml/分
の流速で行い、そして溶出液を216nmにおける吸光度に
よりモニターする。
の流速で行い、そして溶出液を216nmにおける吸光度に
よりモニターする。
系の検定のための標準溶液を、1mlの水に1mgの純粋な
デスルファトヒルジンを溶解することにより調製する。
50μｌのこの標準溶液をカラムに注入し、そして上記の
ようにクロマトグラフ処理して系を検定する。
デスルファトヒルジンを溶解することにより調製する。
50μｌのこの標準溶液をカラムに注入し、そして上記の
ようにクロマトグラフ処理して系を検定する。
第１図に、S.セレビシエーBYSkex1/pJDB207/PHO5-HI
R、及びS.セレビシエーBYSKE1/pJDB207/PHO5‐HIRの培
養物から得たヒルジン類の分析的逆相液体クロマトグラ
フを示す。クロマトグラフィー条件は上記の通りであ
る。これから明らかなように、BYSKEX1/pJDB207/PHO5‐
HIR株とは異り、ペプチダーゼyscα陰性株BYSkex1/pJDB
207/PHO5‐HIRは、Ｃ−末端アミノ酸Gluを欠くＣ−末端
短縮形副生成物デスルファトヒルジンHIR-64及びＣ−末
端アミノ酸Leu及びGlnを欠くHIR-63を実質的に含有しな
いデスルファトヒルジン生成物（「HIR-65」）を生産す
る。
R、及びS.セレビシエーBYSKE1/pJDB207/PHO5‐HIRの培
養物から得たヒルジン類の分析的逆相液体クロマトグラ
フを示す。クロマトグラフィー条件は上記の通りであ
る。これから明らかなように、BYSKEX1/pJDB207/PHO5‐
HIR株とは異り、ペプチダーゼyscα陰性株BYSkex1/pJDB
207/PHO5‐HIRは、Ｃ−末端アミノ酸Gluを欠くＣ−末端
短縮形副生成物デスルファトヒルジンHIR-64及びＣ−末
端アミノ酸Leu及びGlnを欠くHIR-63を実質的に含有しな
いデスルファトヒルジン生成物（「HIR-65」）を生産す
る。
例6.好ましい酵母コドンを有するヒルジンHV1遺伝子の
生体外合成 ヒルジンmRNAの最適の翻訳を保証するため、ヒルジン
発現カセットのコード配列は好ましい酵母コドン〔B.Ha
ll,J.Biol.Chem.257（1982）3026〕を用いて設計され
る。このコード配列は、デスルファトヒルジンHV1のコ
ード配列にインフレーム融合したPHO5シグナル配列を含
有する。合成DNAの５′−末端はEcoRI制限部位の接着末
端を含有する。３′末端において、終止コドンTAGのす
ぐ後にBamHI部位の接着末端が存在する。257bpのRcoRI
−BamHI DNA断片の配列を第２図に示す。
生体外合成 ヒルジンmRNAの最適の翻訳を保証するため、ヒルジン
発現カセットのコード配列は好ましい酵母コドン〔B.Ha
ll,J.Biol.Chem.257（1982）3026〕を用いて設計され
る。このコード配列は、デスルファトヒルジンHV1のコ
ード配列にインフレーム融合したPHO5シグナル配列を含
有する。合成DNAの５′−末端はEcoRI制限部位の接着末
端を含有する。３′末端において、終止コドンTAGのす
ぐ後にBamHI部位の接着末端が存在する。257bpのRcoRI
−BamHI DNA断片の配列を第２図に示す。
第２図はまた、二本鎖DNA断片の生体外合成のための
方法を示す。アプライド・バイオシステムズ・モデル38
0B合成機上でホスホルアミダイト法〔M.H.Caruthers,Ch
emical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments
（H.G.Gassen及びA.Lang編集）を用いて21種類のオリゴ
ヌクレオチドを合成する。個々のオリゴヌクレオチドの
配列を第２図に示す。オーバーラップはユニークであ
る。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを50mMTris−HC
l（pH8.0）中に10pmol/μｌの濃度で溶解する。21種類
のオリゴヌクレオチドは２つのグループ、すなわち
〔Ａ〕DNA断片の５′−側半分を代表するNo.1〜11、及
び〔Ｂ〕３′−側半分のためのNo.12〜21、に配分され
る。２つのグループを別々に処理する。１つのグループ
の10μmolずつのオリゴヌクレオチドを混合する。オリ
ゴヌクレオチドを20μｌの25mM Tris−HCl（pH8.0）,10
mM MgCl2,10mM NaCl,3mM DTT,0.4mM ATP及び８ユニット
のポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）中で37℃
にて１時間リン酸化する。室温にて30分間置いた後、両
混合物（Ａ及びＢ）をそれぞれ水浴中で95℃にて５分間
加熱する。サンプルを水浴中に一夜置いて室温まで徐々
に放冷する。次に、アニールされたオリゴヌクレオチド
混合物Ａ及びＢを氷上に貯蔵する。
方法を示す。アプライド・バイオシステムズ・モデル38
0B合成機上でホスホルアミダイト法〔M.H.Caruthers,Ch
emical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments
（H.G.Gassen及びA.Lang編集）を用いて21種類のオリゴ
ヌクレオチドを合成する。個々のオリゴヌクレオチドの
配列を第２図に示す。オーバーラップはユニークであ
る。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを50mMTris−HC
l（pH8.0）中に10pmol/μｌの濃度で溶解する。21種類
のオリゴヌクレオチドは２つのグループ、すなわち
〔Ａ〕DNA断片の５′−側半分を代表するNo.1〜11、及
び〔Ｂ〕３′−側半分のためのNo.12〜21、に配分され
る。２つのグループを別々に処理する。１つのグループ
の10μmolずつのオリゴヌクレオチドを混合する。オリ
ゴヌクレオチドを20μｌの25mM Tris−HCl（pH8.0）,10
mM MgCl2,10mM NaCl,3mM DTT,0.4mM ATP及び８ユニット
のポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）中で37℃
にて１時間リン酸化する。室温にて30分間置いた後、両
混合物（Ａ及びＢ）をそれぞれ水浴中で95℃にて５分間
加熱する。サンプルを水浴中に一夜置いて室温まで徐々
に放冷する。次に、アニールされたオリゴヌクレオチド
混合物Ａ及びＢを氷上に貯蔵する。
プラスミドpBR322をEcoRI及びBamHIにより完全に切断
する。4kbの大断片を分取用0.6％アガロースゲル上で単
離する。DNAを電気溶出により回収し、DE52イオン交換
クロマトグラフィーにより精製し、そして例７に記載す
るようにしてエタノール沈澱する。DNAを0.4pmol/μｌ
の濃度で水に再溶解する。
する。4kbの大断片を分取用0.6％アガロースゲル上で単
離する。DNAを電気溶出により回収し、DE52イオン交換
クロマトグラフィーにより精製し、そして例７に記載す
るようにしてエタノール沈澱する。DNAを0.4pmol/μｌ
の濃度で水に再溶解する。
10μｌのアニールされたオリゴヌクレオチドＡ（5pmo
lずつのオリゴヌクレオチド１〜11）、9.5μｌの混合物
Ｂ（5pmolずつのオリゴヌクレオチド12〜21）、0.4pmol
の4kb EcoRI−BamHI pBR322断片及び400ユニットのT4 D
NAリガーゼ（バイオラブス）を15℃にて16時間インキュ
ベートする。
lずつのオリゴヌクレオチド１〜11）、9.5μｌの混合物
Ｂ（5pmolずつのオリゴヌクレオチド12〜21）、0.4pmol
の4kb EcoRI−BamHI pBR322断片及び400ユニットのT4 D
NAリガーゼ（バイオラブス）を15℃にて16時間インキュ
ベートする。
10μｌのアリコートを用いてコンピテント大腸菌HB10
1 Ca++株を形質転換する。12個の形質転換されたアンピ
シリン耐性コロニーを別々に、100μg/mlのアンピシリ
ンを含有するLB培地中で増殖せしめる。プラスミドDNA
をHolmes等〔Anal.Biochem.114（1981）193〕の方法に
より調製し、そしてEcoRI及びBamHI制限消化により分析
する。257bp EcoRI−BamHI挿入部を有するプラスミドDN
Aを両鎖についてのDNA配列決定によりさらに分析する。
オリゴヌクレオチド3,11,12,14及び20（第２図を参照の
こと）を配列決定プライマーとして用いる。両DNA鎖に
ついて正しい配列を有する１個のクローンを選択し、そ
してpBR322/YHIRと称する。
1 Ca++株を形質転換する。12個の形質転換されたアンピ
シリン耐性コロニーを別々に、100μg/mlのアンピシリ
ンを含有するLB培地中で増殖せしめる。プラスミドDNA
をHolmes等〔Anal.Biochem.114（1981）193〕の方法に
より調製し、そしてEcoRI及びBamHI制限消化により分析
する。257bp EcoRI−BamHI挿入部を有するプラスミドDN
Aを両鎖についてのDNA配列決定によりさらに分析する。
オリゴヌクレオチド3,11,12,14及び20（第２図を参照の
こと）を配列決定プライマーとして用いる。両DNA鎖に
ついて正しい配列を有する１個のクローンを選択し、そ
してpBR322/YHIRと称する。
例7.プラスミドpJPD207/GAPFL-YHIRの作製 pJDB207/GAPFL-YHIRは、酵母グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の短い構
成的プロモーターの制御のもとにデスルファトヒルジン
変形体HV1を発現するための酵母プラスミドである。デ
スルファトヒルジンのコード配列は好ましい酵母コドン
から成る。
−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の短い構
成的プロモーターの制御のもとにデスルファトヒルジン
変形体HV1を発現するための酵母プラスミドである。デ
スルファトヒルジンのコード配列は好ましい酵母コドン
から成る。
10μｇのプラスミドpBR322/YHIRを制限エンドヌクレ
アーゼBamHI及びEcoRIにより消化する。257bp EcoRI−B
amHI断片を1.2％分取用アガロースゲル上で他のDNA断片
から分離する。DNAのバンドを臭化エチジウムにより染
色し、そして360nmのUV光のもとで可視化する。257bp D
NAバンドをゲルから切り取り、そして0.2×TBE緩衝液
（TBE:90mM Tris塩基、90mM硼酸、2.5mM EDTA,pH8.3）
中に100mAにて45分間電気溶出する。45秒間極性を変え
た後、DNA溶液を集め、そして0.15M NaClに調製する。
このDNAをDE52イオン交換体（ワットマン）のベッド100
μｌに吸着せしめ、そして400μｌの高塩緩衝液〔10mM
Tris−HCl（pH8.0）,1mM EDTA,1.5M NaCl〕中で溶出す
る。DNAをエタノール沈澱せしめそして0.1pmol/μｌの
濃度で水に再懸濁する。
アーゼBamHI及びEcoRIにより消化する。257bp EcoRI−B
amHI断片を1.2％分取用アガロースゲル上で他のDNA断片
から分離する。DNAのバンドを臭化エチジウムにより染
色し、そして360nmのUV光のもとで可視化する。257bp D
NAバンドをゲルから切り取り、そして0.2×TBE緩衝液
（TBE:90mM Tris塩基、90mM硼酸、2.5mM EDTA,pH8.3）
中に100mAにて45分間電気溶出する。45秒間極性を変え
た後、DNA溶液を集め、そして0.15M NaClに調製する。
このDNAをDE52イオン交換体（ワットマン）のベッド100
μｌに吸着せしめ、そして400μｌの高塩緩衝液〔10mM
Tris−HCl（pH8.0）,1mM EDTA,1.5M NaCl〕中で溶出す
る。DNAをエタノール沈澱せしめそして0.1pmol/μｌの
濃度で水に再懸濁する。
プラスミドpJDB207/GAPFL-HIR（ヨーロッパ特許出願N
o.225,633）は、酵母酸性ホスファターゼ（PHO5）のシ
グナル配列にインフレーム融合したデスルファトヒルジ
ンの合成遺伝子（大腸菌のコドンの使用に基く）を含有
する。この遺伝子は、シャトルベクターpJDB207上の酵
母の短い構成的グリセルアルデヒド−３−ホスフェート
・デヒドロゲナーゼ（GAPFL）プロモーターの制御のも
とに発現される。10μｌのプラスミドpJDB207/GAPFL-HI
RをSalI及びEcoRIで消化する。478bp SalI−EcoRI断片
はSal−Bam pBR322部分及びGAPFLプロモーターを含有す
る。このDNA断片を0.8％分取用アガロースゲル上で単離
し、電気溶出し、そしてDE52クロマトグラフィー及びエ
タノール沈澱により精製する。DNAを0.1pmol/μｌの濃
度で水中に再懸濁する。５μｇのpJDB207/GAPFL-HIRをS
alI及びBamHIにより消化する。大6.7kbベクター断片を
上記のようにして単離する。
o.225,633）は、酵母酸性ホスファターゼ（PHO5）のシ
グナル配列にインフレーム融合したデスルファトヒルジ
ンの合成遺伝子（大腸菌のコドンの使用に基く）を含有
する。この遺伝子は、シャトルベクターpJDB207上の酵
母の短い構成的グリセルアルデヒド−３−ホスフェート
・デヒドロゲナーゼ（GAPFL）プロモーターの制御のも
とに発現される。10μｌのプラスミドpJDB207/GAPFL-HI
RをSalI及びEcoRIで消化する。478bp SalI−EcoRI断片
はSal−Bam pBR322部分及びGAPFLプロモーターを含有す
る。このDNA断片を0.8％分取用アガロースゲル上で単離
し、電気溶出し、そしてDE52クロマトグラフィー及びエ
タノール沈澱により精製する。DNAを0.1pmol/μｌの濃
度で水中に再懸濁する。５μｇのpJDB207/GAPFL-HIRをS
alI及びBamHIにより消化する。大6.7kbベクター断片を
上記のようにして単離する。
0.2pmolの478bp SalI−EcoRIプロモーター断片、PHO5
シグナル配列及び合成ヒルジン遺伝子（酵母コドン）を
含有する257bp EcoRI−BamHI断片0.2pmol、並びに0.1pm
olの6.7kbベクター断片を10μｌの60mM Tris−HCl（pH
7.5）,10mM MgCl2,5mM DTT,1mM ATP及び200ユニットのT
4 DNAリガーゼ（バイオラブス）中で15℃にて６時間連
結せしめる。連結混合物の１μｌのアリコートを用いて
コンピテント大腸菌HB101細胞を形質転換する。
シグナル配列及び合成ヒルジン遺伝子（酵母コドン）を
含有する257bp EcoRI−BamHI断片0.2pmol、並びに0.1pm
olの6.7kbベクター断片を10μｌの60mM Tris−HCl（pH
7.5）,10mM MgCl2,5mM DTT,1mM ATP及び200ユニットのT
4 DNAリガーゼ（バイオラブス）中で15℃にて６時間連
結せしめる。連結混合物の１μｌのアリコートを用いて
コンピテント大腸菌HB101細胞を形質転換する。
12個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを別
々に、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地中で
増殖せしめる。プラスミドDNAをHolmes等（前掲）の方
法により調製し、そしてSalI/HindIII二重消化により分
析する。予想通りの制限パターンを有する単一クローン
をpJDB207/GAPFL-YHIRと称する。
々に、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地中で
増殖せしめる。プラスミドDNAをHolmes等（前掲）の方
法により調製し、そしてSalI/HindIII二重消化により分
析する。予想通りの制限パターンを有する単一クローン
をpJDB207/GAPFL-YHIRと称する。
同様にして、プラスミドpJDB207/GAPEL-HIR（ヨーロ
ッパ特許出願No.225,633）の543bp SalI−EcoRIプロモ
ーター断片を用いて作製を行うことができる。生ずる新
しいプラスミドをpJDB207/GAPEL-YHIRと称する。
ッパ特許出願No.225,633）の543bp SalI−EcoRIプロモ
ーター断片を用いて作製を行うことができる。生ずる新
しいプラスミドをpJDB207/GAPEL-YHIRと称する。
例8.プラスミドpJDB207/PHO5（−173）−HIRの作製 pJDB207/PHO5（−173）−HIRは、短いPHO5プロモータ
ーの制御のもとにデスルファトヒルジン変形体HV1を発
現せしめるための酵母プラスミドである。PHO5（−17
3）プロモーター要素は酵母PHO5プロモーターの−９位
から−173位（BstEII制限部位）のヌクレオチド配列を
含有するがしかし上流制御配列（UAS）を有しない。従
ってPHO5（−173）プロモーターは構成的プロモーター
のように挙動する。
ーの制御のもとにデスルファトヒルジン変形体HV1を発
現せしめるための酵母プラスミドである。PHO5（−17
3）プロモーター要素は酵母PHO5プロモーターの−９位
から−173位（BstEII制限部位）のヌクレオチド配列を
含有するがしかし上流制御配列（UAS）を有しない。従
ってPHO5（−173）プロモーターは構成的プロモーター
のように挙動する。
プラスミドpJDB207/PHO5（Eco）‐HIR（EP 225,633）
は、PHO5シグナル配列のATGに対して−８位にEcoRI部位
が導入されている完全な長さの制御されるPHO5プロモー
ター、デスルファトヒルジンのためのコード配列、及び
これに続くPHO5転写停止断片を含有する。この例は、短
いPHO5（−173）プロモーター要素による制御されるPHO
5プロモーターの置換を記載する。
は、PHO5シグナル配列のATGに対して−８位にEcoRI部位
が導入されている完全な長さの制御されるPHO5プロモー
ター、デスルファトヒルジンのためのコード配列、及び
これに続くPHO5転写停止断片を含有する。この例は、短
いPHO5（−173）プロモーター要素による制御されるPHO
5プロモーターの置換を記載する。
20μｇのプラスミドpJDB207/PHO5（Eco）‐HIRをBstE
IIにより消化する。制限断片の接着末端を、200μｌの6
0mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,0.1mMずつのdATP,
dCTP,dGTP及びTTP中で室温にて30分間、Klenow DNAポリ
メラーゼ（１ユニット／μgDNA）と反応せしめることに
よりフィルインする。フェノール抽出の後、DNAをエタ
ノール沈澱せしめる。4.16μｇのBamHIリンカー（５′
−CGGATCCG−３′；バイオラブス）を、100μｌの60mM
Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM DTT,0.5mM ATP及
び18ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリン
ガー）中で37℃にて45分間リン酸化する。75℃にて15分
間の後、反応混合物を室温まで徐々に冷却する。アニー
ルされたオリゴヌクレオチドリンカーを−20℃にて貯蔵
する。
IIにより消化する。制限断片の接着末端を、200μｌの6
0mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,0.1mMずつのdATP,
dCTP,dGTP及びTTP中で室温にて30分間、Klenow DNAポリ
メラーゼ（１ユニット／μgDNA）と反応せしめることに
よりフィルインする。フェノール抽出の後、DNAをエタ
ノール沈澱せしめる。4.16μｇのBamHIリンカー（５′
−CGGATCCG−３′；バイオラブス）を、100μｌの60mM
Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM DTT,0.5mM ATP及
び18ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリン
ガー）中で37℃にて45分間リン酸化する。75℃にて15分
間の後、反応混合物を室温まで徐々に冷却する。アニー
ルされたオリゴヌクレオチドリンカーを−20℃にて貯蔵
する。
プラスミドpJDB207/PHO5（Eco）‐HIRの〔BstEII〕／
平滑末端断片4pmolを15℃にて16時間、100倍過剰のリン
酸化されそしてアニールされたBamHIリンカーと共に、2
08μｌの60mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM DT
T,3.5mM ATP及び800ユニットのT4 DNAリガーゼ（バイオ
ラブス）中でインキュベートする。85℃にて10分間リガ
ーゼを不活性化した後、10mMEDTA,300nM酢酸ナトリウム
（pH6.0）及び0.54容量のイソプロパノールの存在下で
のDNAの沈澱により過剰のリンカーを除去する。DNAをBa
mHI及びEcoRIにより消化する。DNA断片を0.8％分取用ア
ガロースゲル上で分離する。172bpのBamHI−EcoRIプロ
モーター断片を電気溶出及びエタノール沈澱によりゲル
から回収する。このDNAを0.1pmol/μｌの濃度に再懸濁
する。
平滑末端断片4pmolを15℃にて16時間、100倍過剰のリン
酸化されそしてアニールされたBamHIリンカーと共に、2
08μｌの60mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM DT
T,3.5mM ATP及び800ユニットのT4 DNAリガーゼ（バイオ
ラブス）中でインキュベートする。85℃にて10分間リガ
ーゼを不活性化した後、10mMEDTA,300nM酢酸ナトリウム
（pH6.0）及び0.54容量のイソプロパノールの存在下で
のDNAの沈澱により過剰のリンカーを除去する。DNAをBa
mHI及びEcoRIにより消化する。DNA断片を0.8％分取用ア
ガロースゲル上で分離する。172bpのBamHI−EcoRIプロ
モーター断片を電気溶出及びエタノール沈澱によりゲル
から回収する。このDNAを0.1pmol/μｌの濃度に再懸濁
する。
プラスミドpJDB207/PHO5（Eco）‐HIRをEcoRI及びHin
dIIIにより消化する。643bp EcoRI−HindIII断片を前記
の様にして単離する。このDNA断片はデスルファトヒル
ジンのコード配列にインフレーム融合したPHO5シグナル
配列及びPHO5転写停止断片を含有する。該プラスミドを
またHindIII及びBamHIで切断する。6.6kbベクター断片
を単離する。
dIIIにより消化する。643bp EcoRI−HindIII断片を前記
の様にして単離する。このDNA断片はデスルファトヒル
ジンのコード配列にインフレーム融合したPHO5シグナル
配列及びPHO5転写停止断片を含有する。該プラスミドを
またHindIII及びBamHIで切断する。6.6kbベクター断片
を単離する。
0.2pmolずつの172bp BamHI−EcoRI断片及び643bp Eco
RI−HindIII断片並びに0.1pmolの6.6kbベクター断片
を、10μｌの60mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM
DTT,1mM ATP及び400ユニットのT4 DNAリガーゼ（バイ
オラブス）中で15℃にて６時間連結する。この連結混合
物の１μｌのアリコートを100μｌのカルシウム処理さ
れた形質転換コンピテント大腸菌HB101細胞に加える。
RI−HindIII断片並びに0.1pmolの6.6kbベクター断片
を、10μｌの60mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM
DTT,1mM ATP及び400ユニットのT4 DNAリガーゼ（バイ
オラブス）中で15℃にて６時間連結する。この連結混合
物の１μｌのアリコートを100μｌのカルシウム処理さ
れた形質転換コンピテント大腸菌HB101細胞に加える。
12個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを、
100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地中で増殖せ
しめる。プラスミドDNAを調製し、そしてBamHI及びSalI
/HindIII消化により分析する。予想通りの断片断片を有
する１つのクローンを選択し、そしてpJDB207/PHO5（−
173）−HIRと称する。
100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地中で増殖せ
しめる。プラスミドDNAを調製し、そしてBamHI及びSalI
/HindIII消化により分析する。予想通りの断片断片を有
する１つのクローンを選択し、そしてpJDB207/PHO5（−
173）−HIRと称する。
例9.プラスミドpDP34の作製 酵母２ミクロンの共有結合で閉環されたDNAをサッカ
ロミセス・セレビシエーS288C株から単離する。細胞を
５μg/mlのチモリアーゼ（100,000ユニット／μｇ）と
共に37℃にて20分間インキュベートして細胞壁を消化す
る。スフェロプラストを２％SDSにより溶解する。次にE
DTAを25mMに加え、臭化エチジウムを1mg/lに加え、そし
て塩化セシウムを1.55g/mlの最終密度に加える。プラス
ミドDNAを、42,000rpm,15℃にて42時間の遠心分離によ
り染色体DNAから分離する。２ミクロンプラスミドをシ
リンジにより勾配から切り出す。NaCl飽和イソプロパノ
ールによる抽出によって臭化エチジウムを除去し、そし
てプラスミドDNAを最終的にエタノール沈澱せしめる。
次に、精製された２ミクロンプラスミドDNAをPst Iによ
り線状化し、そしてpUC19〔J.Norrander等、Gene26（19
83）,101〕のPstI部位にクローニングしてプラスミドpD
P31を得る。
ロミセス・セレビシエーS288C株から単離する。細胞を
５μg/mlのチモリアーゼ（100,000ユニット／μｇ）と
共に37℃にて20分間インキュベートして細胞壁を消化す
る。スフェロプラストを２％SDSにより溶解する。次にE
DTAを25mMに加え、臭化エチジウムを1mg/lに加え、そし
て塩化セシウムを1.55g/mlの最終密度に加える。プラス
ミドDNAを、42,000rpm,15℃にて42時間の遠心分離によ
り染色体DNAから分離する。２ミクロンプラスミドをシ
リンジにより勾配から切り出す。NaCl飽和イソプロパノ
ールによる抽出によって臭化エチジウムを除去し、そし
てプラスミドDNAを最終的にエタノール沈澱せしめる。
次に、精製された２ミクロンプラスミドDNAをPst Iによ
り線状化し、そしてpUC19〔J.Norrander等、Gene26（19
83）,101〕のPstI部位にクローニングしてプラスミドpD
P31を得る。
プラスミドpJDB207を制限酵素KpnI及びHpaIにより消
化する。生ずる0.55kb HpaI−KpnI断片は２ミクロン配
列とdLEU2遺伝子の欠陥プロモーターとの間の連結部を
含有する。
化する。生ずる0.55kb HpaI−KpnI断片は２ミクロン配
列とdLEU2遺伝子の欠陥プロモーターとの間の連結部を
含有する。
プラスミドpUC7/LEU2は、プラスミドpUC7〔J.Vieira
等、Gene19（1982）,259〕のSalI部位にクローン化され
たLEU2遺伝子〔A.Andreadis等、Cell,31（1982）,319〕
の酵母ゲノム性2.2kb XhoI−SalI断片を含有する。プラ
スミドpUC7/LEU2をKpnI及びHpaIにより切断する。4.25k
b KpnI−HpaI断片をpJDB207の0.55kb HpaI−KpnI断片に
連結する。これによりプラスミドpDP30が生じ、このプ
ラスミドにおいては、プラスミドpJDB207中のもとの２
ミクロン/dLEU2融合が、完全なターミネーターを有する
LEU2遺伝子の前に置かれている。pDP30をHpaI及びSalI
により消化し、そして完全なLEU2遺伝子を含有する1.85
kb断片を精製し、そしてプラスミドpDP31の8.7kb SalI
−HpaI断片にクローニングする。生ずるプラスミドpDP3
3（第３図を参照のこと）を、50μg/mlの臭化エチジウ
ムの存在下でのHindIIIによる部分消化〔M.Oesterlund
等、Gene20（1982）121〕により線状化し、そしてURA3
遺伝子〔M.Rose等、Gene29（1984）,113〕を含有する1.
17kb HindIII断片と連結する。URA3遺伝子の挿入は大腸
菌株pyrF（M.Rose等、前掲）への形質転換により選択さ
れる。陽性クローンをプラスミドpDP34（第４図を参照
のこと）と称する。
等、Gene19（1982）,259〕のSalI部位にクローン化され
たLEU2遺伝子〔A.Andreadis等、Cell,31（1982）,319〕
の酵母ゲノム性2.2kb XhoI−SalI断片を含有する。プラ
スミドpUC7/LEU2をKpnI及びHpaIにより切断する。4.25k
b KpnI−HpaI断片をpJDB207の0.55kb HpaI−KpnI断片に
連結する。これによりプラスミドpDP30が生じ、このプ
ラスミドにおいては、プラスミドpJDB207中のもとの２
ミクロン/dLEU2融合が、完全なターミネーターを有する
LEU2遺伝子の前に置かれている。pDP30をHpaI及びSalI
により消化し、そして完全なLEU2遺伝子を含有する1.85
kb断片を精製し、そしてプラスミドpDP31の8.7kb SalI
−HpaI断片にクローニングする。生ずるプラスミドpDP3
3（第３図を参照のこと）を、50μg/mlの臭化エチジウ
ムの存在下でのHindIIIによる部分消化〔M.Oesterlund
等、Gene20（1982）121〕により線状化し、そしてURA3
遺伝子〔M.Rose等、Gene29（1984）,113〕を含有する1.
17kb HindIII断片と連結する。URA3遺伝子の挿入は大腸
菌株pyrF（M.Rose等、前掲）への形質転換により選択さ
れる。陽性クローンをプラスミドpDP34（第４図を参照
のこと）と称する。
pDP34は、大腸菌用のアンピシリン耐性マーカー並び
にURA3及びdLEU2酵母選択マーカーを有する酵母−大腸
菌シャトルベクターである。このプラスミドはＡ形にお
いて完全な２ミクロン配列を含有し、そしてREP1,REP2
及びFLPプロフィシエント（proficient）である。
にURA3及びdLEU2酵母選択マーカーを有する酵母−大腸
菌シャトルベクターである。このプラスミドはＡ形にお
いて完全な２ミクロン配列を含有し、そしてREP1,REP2
及びFLPプロフィシエント（proficient）である。
例10.pDP34へのヒルジン発現カセットのクローニング プラスミドpDP34をBamHIにより消化する。制限部位の
接着末端をKlenow DNAポリメラーゼとの反応によりフィ
ルインする（T.Maniatis等、Molecular Cloning,A.Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,198
2）。DNAをSalIによりさらに切断し、そして11.8kbベク
ター断片を分取用0.6％アガロースゲル上で単離する。D
NAを電気溶出及びエタノール沈澱により回収する。種々
の発現カセットをpDP34ベクター断片のSalI部位と〔Bam
HI〕／平滑末端部位との間にクローニングする。
接着末端をKlenow DNAポリメラーゼとの反応によりフィ
ルインする（T.Maniatis等、Molecular Cloning,A.Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,198
2）。DNAをSalIによりさらに切断し、そして11.8kbベク
ター断片を分取用0.6％アガロースゲル上で単離する。D
NAを電気溶出及びエタノール沈澱により回収する。種々
の発現カセットをpDP34ベクター断片のSalI部位と〔Bam
HI〕／平滑末端部位との間にクローニングする。
プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIRをHindIIIにより消化
する。接着末端をKlenow DNAポリメラーゼにより平滑末
端に転換する。DNAをエタノール沈澱せしめ、そしてSal
Iによりさらに消化する。1.1kb SalI−〔HindIII〕／平
滑末端断片は、pBR322配列、GAPFLプロモーター、デス
ルファトヒルジンのコード配列（好ましい酵母コドン）
にインフレーム融合したPHO5シグナル配列及びPHO5転写
停止断片を有する完全な発現カセットを含有する。1.1k
b断片を分取用0.8％アガロースゲル上で単離し、電気溶
出によりゲルから回収し、そしてDE52イオン交換クロマ
トグラフィー及びエタノール沈澱により精製する。0.2p
molの1.1kb断片及び0.1pmolの11.8kbベクター断片を10
μｌの60mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM DTT,
3.5mM ATP及び400ユニットのT4 DNAリガーゼ（バイオラ
ブス）中で15℃にて16時間連結する。１μｌのアリコー
トを用いて大腸菌HB101 Ca++細胞を形質転換する。５個
の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを分析す
る。プラスミドDNAをBamHI及びSalI/BamHIにより消化す
る。正しい制限断片を有する１つのクローンを選択し、
そしてpD34/GAPFL-YHIR（第５図を参照のこと）と称す
る。
する。接着末端をKlenow DNAポリメラーゼにより平滑末
端に転換する。DNAをエタノール沈澱せしめ、そしてSal
Iによりさらに消化する。1.1kb SalI−〔HindIII〕／平
滑末端断片は、pBR322配列、GAPFLプロモーター、デス
ルファトヒルジンのコード配列（好ましい酵母コドン）
にインフレーム融合したPHO5シグナル配列及びPHO5転写
停止断片を有する完全な発現カセットを含有する。1.1k
b断片を分取用0.8％アガロースゲル上で単離し、電気溶
出によりゲルから回収し、そしてDE52イオン交換クロマ
トグラフィー及びエタノール沈澱により精製する。0.2p
molの1.1kb断片及び0.1pmolの11.8kbベクター断片を10
μｌの60mM Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,5mM DTT,
3.5mM ATP及び400ユニットのT4 DNAリガーゼ（バイオラ
ブス）中で15℃にて16時間連結する。１μｌのアリコー
トを用いて大腸菌HB101 Ca++細胞を形質転換する。５個
の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを分析す
る。プラスミドDNAをBamHI及びSalI/BamHIにより消化す
る。正しい制限断片を有する１つのクローンを選択し、
そしてpD34/GAPFL-YHIR（第５図を参照のこと）と称す
る。
同様にして、pJDB207/GAPFL-YHIR（例７を参照のこ
と）の1.2kb SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片をpDP34
ベクターにクローニングしプラスミドpDP34/GAPEL-YHIR
を得る。
と）の1.2kb SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片をpDP34
ベクターにクローニングしプラスミドpDP34/GAPEL-YHIR
を得る。
プラスミドpJDB207/PHO5（−173）−HIRをSalI及びEc
oRIで消化する。前記のようにして448bp SalI−EcoRI断
片を単離する。このDNA断片はpBR322のSalI−BamHI部分
及び短い構成的PHO5（−173）−プロモーターを含有す
る。（例８を参照のこと）。プラスミドpJDB207/GAPFL-
YHIRをHindIIIにより消化する。接着末端をKlenow DNA
ポリメラーゼにより平滑末端に転換する。このDNAをEco
RIによりさらに消化する。642bp EcoRI−〔HindIII〕／
平滑末端断片を単離する。このものはPHO5シグナル配
列、デスルファトヒルジンのコード配列（好ましい酵母
コドンを有する）及びPHO5転写停止断片を含有する。0.
2pmolずつの448bp SalI−EcoRI断片及び642bp EcoRI−
平滑末端断片並びに0.1pmolの11.8kb SalI−〔BamHI〕
／平滑末端ベクター断片を連結する。連結混合物のアリ
コートを用いて大腸菌HB101 Ca++細胞を形質転換する。
12個の形質転換体のプラスミドDNAをHamHI及びSalI/Bam
HI消化により分析する。正しいプラスミドのクローンを
選択し、そしてpDP34/PHO5（−173）−YHIRと称する
（第６図を参照のこと）。
oRIで消化する。前記のようにして448bp SalI−EcoRI断
片を単離する。このDNA断片はpBR322のSalI−BamHI部分
及び短い構成的PHO5（−173）−プロモーターを含有す
る。（例８を参照のこと）。プラスミドpJDB207/GAPFL-
YHIRをHindIIIにより消化する。接着末端をKlenow DNA
ポリメラーゼにより平滑末端に転換する。このDNAをEco
RIによりさらに消化する。642bp EcoRI−〔HindIII〕／
平滑末端断片を単離する。このものはPHO5シグナル配
列、デスルファトヒルジンのコード配列（好ましい酵母
コドンを有する）及びPHO5転写停止断片を含有する。0.
2pmolずつの448bp SalI−EcoRI断片及び642bp EcoRI−
平滑末端断片並びに0.1pmolの11.8kb SalI−〔BamHI〕
／平滑末端ベクター断片を連結する。連結混合物のアリ
コートを用いて大腸菌HB101 Ca++細胞を形質転換する。
12個の形質転換体のプラスミドDNAをHamHI及びSalI/Bam
HI消化により分析する。正しいプラスミドのクローンを
選択し、そしてpDP34/PHO5（−173）−YHIRと称する
（第６図を参照のこと）。
例11.大腸菌コドンを有するヒルジン遺伝子のための更
なる発現プラスミド 大腸菌コドンの使用に基くデスルファトヒルジン変形
体HV1の合成遺伝子を含有する発現プラスミドを例10に
記載したのと同様にして作製する。pJDP207/GAPFL-HIR
（ヨーロッパ特許出願No.225,633）の1.1kb SalI−〔Hi
ndIII〕／平滑末端断片を単離し、そしてベクターpDP34
にクローニングする。生ずる発現プラスミドは、構成的
GAPFLプロモーターの制御のもとに発現される好ましい
大腸菌コドンに基くデスルファトヒルジンの合成遺伝子
を含有するpDP34/GAPFL-HIRである。
なる発現プラスミド 大腸菌コドンの使用に基くデスルファトヒルジン変形
体HV1の合成遺伝子を含有する発現プラスミドを例10に
記載したのと同様にして作製する。pJDP207/GAPFL-HIR
（ヨーロッパ特許出願No.225,633）の1.1kb SalI−〔Hi
ndIII〕／平滑末端断片を単離し、そしてベクターpDP34
にクローニングする。生ずる発現プラスミドは、構成的
GAPFLプロモーターの制御のもとに発現される好ましい
大腸菌コドンに基くデスルファトヒルジンの合成遺伝子
を含有するpDP34/GAPFL-HIRである。
同様にして、pJDB207/PHO5（−173）−HIR（例８を参
照のこと）の1.1kb SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片
をpDP34にクローニングする。生ずるプラスミドpDP34/P
HO5（−173）は、短い構成的PHO5（−173）プロモータ
ーの制御のもとにデスルファトヒルジンの合成遺伝子
（大腸菌コドン）を含有する。
照のこと）の1.1kb SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片
をpDP34にクローニングする。生ずるプラスミドpDP34/P
HO5（−173）は、短い構成的PHO5（−173）プロモータ
ーの制御のもとにデスルファトヒルジンの合成遺伝子
（大腸菌コドン）を含有する。
例12.プラスミドpDP92中のヒルジン発現カセット 完全な２ミクロン配列を含有するベクターが真正な酵
母２ミクロン環のすべての機能を発現するとは限らな
い。クローニングによりオープンリーディングフレーム
が破壊される場合がある。今まで、「Ｄ」リーディング
フレームの遺伝子産物の機能は知られていないので、こ
の遺伝子中のユニークPstI部位を用いてdLEU2遺伝子〔B
eggs,J.D.,Nature275（1978）104-109）はクローニング
され、又はプラスミドpDP31（例９を参照のこと）にお
けるようにpUC19ベクター部分を挿入された。やっと最
近になって、Ｄ遺伝子産物がFLP遺伝子産物の発現を制
御することが示唆された〔J.A.H.Murray等、EMBO J.6,4
205（1987）〕。２ミクロン環のすべての利点を得るた
め、Ｄ遺伝子産物を含むすべての既知２ミクロン機能に
ついて堪能な（proficient）ベクターを作製する。
母２ミクロン環のすべての機能を発現するとは限らな
い。クローニングによりオープンリーディングフレーム
が破壊される場合がある。今まで、「Ｄ」リーディング
フレームの遺伝子産物の機能は知られていないので、こ
の遺伝子中のユニークPstI部位を用いてdLEU2遺伝子〔B
eggs,J.D.,Nature275（1978）104-109）はクローニング
され、又はプラスミドpDP31（例９を参照のこと）にお
けるようにpUC19ベクター部分を挿入された。やっと最
近になって、Ｄ遺伝子産物がFLP遺伝子産物の発現を制
御することが示唆された〔J.A.H.Murray等、EMBO J.6,4
205（1987）〕。２ミクロン環のすべての利点を得るた
め、Ｄ遺伝子産物を含むすべての既知２ミクロン機能に
ついて堪能な（proficient）ベクターを作製する。
ａ）プラスミドpDP92の作製（第７図を参照のこと） プラスミドpDP31（例９）をPstI及びHpaIで消化して
３つの断片を生じさせる。プラスミドpK19〔カナマイシ
ン耐性を付与する;Pridmore,R.D.Gene56（1987）309-31
2〕をSmaIにより線状化する。両消化物のDNA断片をフェ
ノール抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめる。DNA
断片を混合し、そして連結する。連結混合物を用いてコ
ンピテント大腸菌JM109株細胞〔Yanisch-Perron,G.等、
Gene33（1985）103-119〕を形質転換し〔Hanehan,D,J.,
Mol.Biol.166（1983）557-580〕、LB培地中で37℃にて
２時間発現せしめ、そして50μg/mlのカナマイシン、30
μg/mlのXGal及び７μg/mlのIPTGが補充されたLB寒天プ
レート上にプレートする。
３つの断片を生じさせる。プラスミドpK19〔カナマイシ
ン耐性を付与する;Pridmore,R.D.Gene56（1987）309-31
2〕をSmaIにより線状化する。両消化物のDNA断片をフェ
ノール抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめる。DNA
断片を混合し、そして連結する。連結混合物を用いてコ
ンピテント大腸菌JM109株細胞〔Yanisch-Perron,G.等、
Gene33（1985）103-119〕を形質転換し〔Hanehan,D,J.,
Mol.Biol.166（1983）557-580〕、LB培地中で37℃にて
２時間発現せしめ、そして50μg/mlのカナマイシン、30
μg/mlのXGal及び７μg/mlのIPTGが補充されたLB寒天プ
レート上にプレートする。
12個の白色のカナマイシン耐性コロニーを増殖せしめ
る。プラスミドをXbaI消化及びBamHI/KpnI消化により分
析する。pDP32のpUC19ベクター部分を喪失しており、Ps
tI部位の再連結により２ミクロンＤリーディングフレー
ムを再生しており、そしてHpaI部位に挿入されたpK19プ
ラスミド平滑末端を有する単一クローンをpDP91を称す
る。このプラスミドは、pK19のSmaI部位にクローニング
された２ミクロンプラスミドの大HpaI−Pst断片及び小P
stI−HpaI断片を含有する。PstI部位の再連結によりＤ
リーディングフレームが再構成されている。
る。プラスミドをXbaI消化及びBamHI/KpnI消化により分
析する。pDP32のpUC19ベクター部分を喪失しており、Ps
tI部位の再連結により２ミクロンＤリーディングフレー
ムを再生しており、そしてHpaI部位に挿入されたpK19プ
ラスミド平滑末端を有する単一クローンをpDP91を称す
る。このプラスミドは、pK19のSmaI部位にクローニング
された２ミクロンプラスミドの大HpaI−Pst断片及び小P
stI−HpaI断片を含有する。PstI部位の再連結によりＤ
リーディングフレームが再構成されている。
URA3遺伝子をプラスミドpDP34（例９を参照のこと）
からの1.17kb HindIII断片上に単離し、そしてプラスミ
ドpUC12のユニークHindIII部位にクローニングする。ア
ンピシリン耐性遺伝子と同じ方向に挿入されたURA3遺伝
子を有するクローンをpUC12/URA3と称する。プラスミド
pDP93及びpUC12/URA3の両者をSacI及びBamHIにより消化
してそれぞれ２断片を生じさせる。DNA断片を混合連結
し、そしてそれを用いてコンピテント大腸菌JM109細胞
を形質転換する。この細胞を、100μg/mlのアンピシリ
ン、30μg/mlのXGal及び７μg/mlのIPTGが補充されたLB
天然プレート上にプレートする。
からの1.17kb HindIII断片上に単離し、そしてプラスミ
ドpUC12のユニークHindIII部位にクローニングする。ア
ンピシリン耐性遺伝子と同じ方向に挿入されたURA3遺伝
子を有するクローンをpUC12/URA3と称する。プラスミド
pDP93及びpUC12/URA3の両者をSacI及びBamHIにより消化
してそれぞれ２断片を生じさせる。DNA断片を混合連結
し、そしてそれを用いてコンピテント大腸菌JM109細胞
を形質転換する。この細胞を、100μg/mlのアンピシリ
ン、30μg/mlのXGal及び７μg/mlのIPTGが補充されたLB
天然プレート上にプレートする。
12個の白色のアンピシリン耐性コロニーを増殖せしめ
る。プラスミドDNAをHindIII消化及びPvuII消化により
分析する。すべての既知機能について堪能な完全２ミク
ロン配列及びpUCベクター中にクローニングされたURA3
遺伝子を含んで成る単一クローンをpDP92と称する。
る。プラスミドDNAをHindIII消化及びPvuII消化により
分析する。すべての既知機能について堪能な完全２ミク
ロン配列及びpUCベクター中にクローニングされたURA3
遺伝子を含んで成る単一クローンをpDP92と称する。
ｂ）pDP92へのヒルジン発現カセットのクローニング 例５と同様にして、pDP92をBamHIで消化する。接着末
端をKlenow DNAポリメラーゼとの反応によりフィルイン
する。DNAをさらにSalIで切断する。10.2kbベクター断
片を単離する。プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIRの1.1kb
SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片を単離し、そしてベ
クター断片に連結する。
端をKlenow DNAポリメラーゼとの反応によりフィルイン
する。DNAをさらにSalIで切断する。10.2kbベクター断
片を単離する。プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIRの1.1kb
SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片を単離し、そしてベ
クター断片に連結する。
６個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを分
析する。プラスミドDNAをBamHI,PstI、及びSalI/BamHI
で消化する。予想通りの制限断片を有する１つのクロー
ンを選択し、そしてpDP92/GAPEL-YHIRと称する。同様に
して、pJDB207/GAPFL-YHIR（例７を参照のこと）の1.2k
b SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片を用いてプラスミ
ドpDP92/GAPEL-YHIRを得る。
析する。プラスミドDNAをBamHI,PstI、及びSalI/BamHI
で消化する。予想通りの制限断片を有する１つのクロー
ンを選択し、そしてpDP92/GAPEL-YHIRと称する。同様に
して、pJDB207/GAPFL-YHIR（例７を参照のこと）の1.2k
b SalI−〔HindIII〕／平滑末端断片を用いてプラスミ
ドpDP92/GAPEL-YHIRを得る。
10.2kb SalI−〔BamHI〕／平滑末端pDP92ベクターを
断片（上記参照のこと）を用いて、例10に記載したよう
にしてプラスミドpDP92/PHO5（−173）−YHIRを作製す
る。
断片（上記参照のこと）を用いて、例10に記載したよう
にしてプラスミドpDP92/PHO5（−173）−YHIRを作製す
る。
例13.2ミクロンDNA不含有サッカロミセス・セレビシエ
ー宿主株の作製 内因性２ミクロンプラスミドを除去するため、第一段
階においてHT246株（DSM 4048;α,leu2-3,leu2-112,pr
b）のURA3遺伝子に欠失を導入してこの株をウラシルに
ついて栄養要求性にする。Hinnen等〔Proc.Nact.Acad.S
ci.USA75,1929（1978）〕により記載された形質転換法
を用いて、HT246を１μｇのプラスミドYEp13〔Broach,
J.R.Strathern,J.N.,Hicks,J.B.（1979）Gene8,121-12
3〕により形質転換する。URA3遺伝子中に欠失を有する
プラスミドpUC12ura3Δ〔Sengstag,Ch.,Hinnen,A.,Nucl
ecic Acids Research15,233-246（1987）〕10μｇをプ
ラスミドYEp13と共に加える。約3000個のロイシン原栄
養性形質転換体を、小振とうスラスコ中の5mlの最少培
地（アミノ酸を含有しないディフコのイースト・ニトロ
ゲン・ベースに２％グルコース、0.1％ロイシン、0.1％
ウラシル及び0.25％フルオロオロシン酸を添加したも
の）に再懸濁し、そして30℃,180rpmにて60時間インキ
ュベートする。増殖する形質転換体は毒性類似体フルオ
ロオロチン酸に対して耐性であり、そしてそれ故に染色
体URA3遺伝子中にura3Δによる置換を有する。増殖した
細胞を、ペプトン20g/l、酵母エキス10g/l及びグルコー
ス20g/lを含む、完全培地上にプレートし、そして30℃
にて48時間の増殖の後、アミノ酸を含有しない最少培地
（ディフコ・オースト・ニトロゲン・ベース、２％グル
コース及び0.1％ロイシンが補充されたもの）にレプリ
カしてウラシル栄養要求株を検出する。幾つかの栄養要
求株を拾い上げ、そしてロイシン栄養要求性を付与する
プラスミドYEp13の喪失について試験する。ロイシン及
びウラシルを要求する１つのコロニーを拾い、そしてそ
の後の実験に使用する。
ー宿主株の作製 内因性２ミクロンプラスミドを除去するため、第一段
階においてHT246株（DSM 4048;α,leu2-3,leu2-112,pr
b）のURA3遺伝子に欠失を導入してこの株をウラシルに
ついて栄養要求性にする。Hinnen等〔Proc.Nact.Acad.S
ci.USA75,1929（1978）〕により記載された形質転換法
を用いて、HT246を１μｇのプラスミドYEp13〔Broach,
J.R.Strathern,J.N.,Hicks,J.B.（1979）Gene8,121-12
3〕により形質転換する。URA3遺伝子中に欠失を有する
プラスミドpUC12ura3Δ〔Sengstag,Ch.,Hinnen,A.,Nucl
ecic Acids Research15,233-246（1987）〕10μｇをプ
ラスミドYEp13と共に加える。約3000個のロイシン原栄
養性形質転換体を、小振とうスラスコ中の5mlの最少培
地（アミノ酸を含有しないディフコのイースト・ニトロ
ゲン・ベースに２％グルコース、0.1％ロイシン、0.1％
ウラシル及び0.25％フルオロオロシン酸を添加したも
の）に再懸濁し、そして30℃,180rpmにて60時間インキ
ュベートする。増殖する形質転換体は毒性類似体フルオ
ロオロチン酸に対して耐性であり、そしてそれ故に染色
体URA3遺伝子中にura3Δによる置換を有する。増殖した
細胞を、ペプトン20g/l、酵母エキス10g/l及びグルコー
ス20g/lを含む、完全培地上にプレートし、そして30℃
にて48時間の増殖の後、アミノ酸を含有しない最少培地
（ディフコ・オースト・ニトロゲン・ベース、２％グル
コース及び0.1％ロイシンが補充されたもの）にレプリ
カしてウラシル栄養要求株を検出する。幾つかの栄養要
求株を拾い上げ、そしてロイシン栄養要求性を付与する
プラスミドYEp13の喪失について試験する。ロイシン及
びウラシルを要求する１つのコロニーを拾い、そしてそ
の後の実験に使用する。
Tr889を、マーカー遺伝子LEU2及びURA3の両者を有す
るプラスミドpDP38（プラスミドpDP34から、SphIによる
消化及び生ずる8.4kb断片の再連結により得られる；第
４図を参照のこと〕により形質転換する（形質転換法は
前記）。形質転換された酵母細胞をまず、ウラシルを欠
きそしてロイシンが補充された酵母最少培地プレート上
で選択し、そして次に、ロイシンを欠きそしてウラシル
が補充された最少培地上にレプリカプレートする。10個
の１週間培養したコロニーを拾い上げ、そして別々に液
体完全培地（前記）中で約100世代増殖せしめる。こう
することにより、細胞はpDP38プラスミドを失い、そし
て−ある比率で−同時に内因性２ミクロンプラスミドを
も失う。ウラシル及びロイシンを要求するコロニー10個
を拾い、DNAを調製し、このDNAをPstIにより完全消化
し、そしてサザンブロット上で32P−ラベル化酵母２ミ
クロンDNAでプローブする。ハイブリダイゼーションシ
グナルを全く示さない１個の単離体をH449（a,leu 2-3,
leu 2-112,ura 3Δ,prb,cir°）と称し、これは酵母株H
T246に相同な（isogenic）２ミクロン不含有（cir°）
誘導体である。
るプラスミドpDP38（プラスミドpDP34から、SphIによる
消化及び生ずる8.4kb断片の再連結により得られる；第
４図を参照のこと〕により形質転換する（形質転換法は
前記）。形質転換された酵母細胞をまず、ウラシルを欠
きそしてロイシンが補充された酵母最少培地プレート上
で選択し、そして次に、ロイシンを欠きそしてウラシル
が補充された最少培地上にレプリカプレートする。10個
の１週間培養したコロニーを拾い上げ、そして別々に液
体完全培地（前記）中で約100世代増殖せしめる。こう
することにより、細胞はpDP38プラスミドを失い、そし
て−ある比率で−同時に内因性２ミクロンプラスミドを
も失う。ウラシル及びロイシンを要求するコロニー10個
を拾い、DNAを調製し、このDNAをPstIにより完全消化
し、そしてサザンブロット上で32P−ラベル化酵母２ミ
クロンDNAでプローブする。ハイブリダイゼーションシ
グナルを全く示さない１個の単離体をH449（a,leu 2-3,
leu 2-112,ura 3Δ,prb,cir°）と称し、これは酵母株H
T246に相同な（isogenic）２ミクロン不含有（cir°）
誘導体である。
例14.ゲノムKEX1遺伝子の中断によるS.セレビシエーH44
9のkex1変異体の調製 ゲノムKEX1遺伝子の中断によりS.セレビシエーH449株
（prb,leu2,ura3,cir°）からカルボキシペプチダーゼy
scα活性を除去する。この目的のため、KEX1遺伝子を酵
母ゲノムライブラリー中に同定し、そして適当なベクタ
ー中にクローニングする。選択マーカーとして機能する
URA3遺伝子をKEX1の構造遺伝子挿入することによりその
リーディングフレームを中断する。KEX1配列により挟ま
れたURA3遺伝子を含むハイブリドプラスミドDNAをUra-
酵母株H449に導入する。プラスミド上及び染色体上のKE
X1遺伝子の配列相同性が生体内組換えを可能にし、これ
が酵母細胞をUra-からUra+に、そして同時にKEX1からke
x1に形質転換する。中断されたkexl遺伝子を有する株は
機能的yscα蛋白質を合成しない。
9のkex1変異体の調製 ゲノムKEX1遺伝子の中断によりS.セレビシエーH449株
（prb,leu2,ura3,cir°）からカルボキシペプチダーゼy
scα活性を除去する。この目的のため、KEX1遺伝子を酵
母ゲノムライブラリー中に同定し、そして適当なベクタ
ー中にクローニングする。選択マーカーとして機能する
URA3遺伝子をKEX1の構造遺伝子挿入することによりその
リーディングフレームを中断する。KEX1配列により挟ま
れたURA3遺伝子を含むハイブリドプラスミドDNAをUra-
酵母株H449に導入する。プラスミド上及び染色体上のKE
X1遺伝子の配列相同性が生体内組換えを可能にし、これ
が酵母細胞をUra-からUra+に、そして同時にKEX1からke
x1に形質転換する。中断されたkexl遺伝子を有する株は
機能的yscα蛋白質を合成しない。
KEX1をコードする遺伝子を酵母ゲノムライブラリー
〔セントロマー（centromere）シャトルベクターpCS19
中;Sengstag,C.等（1987）Nucl.Acids Res.15,233〕か
ら、KEX1特遺伝オリゴヌクレオチドプローブとのコロニ
ーハイブリダイゼーションによりクローニングする。次
のオリゴヌクレオチド配列： ５′−GTCGAATCCGGCCCTTTTAGGGTGAATTCA−３′は発表
されているKEX1配列〔Dmochowska,A.等、（1987）Cell,
50,573〕に由来し、そしてyscYの配列への特に低い相同
性により全体配列から選択されたものである。このもの
はKEX1 DNAのEcoRV制限部位の上流にハイブリダイズ
し、この制限部位はURA3遺伝子の挿入のために使用され
る。URA3断片の挿入の確認のための配列決定プライマー
として同じオリゴヌクレオチドを用いることができる。
この合成オリゴヌクレオチドを放射能ラベルし、そして
遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために用いる。
約10,000個のクローン〔５×2000クローン／プレート
（φ＝140mm）〕をコロニーハイブリダイゼーション〔W
oods,D.E.等（1982）,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,79,566
1;及びWhitehead A.S.等（1983）,Proc,Natl.Acad.Sci.
USA,80,5387〕によりスクリーニングする。スクリーニ
ング法の２回の反復から５個の独立の陽性クローンが単
離される。その１つをpKEX1と同様する。KEX1特異的Hin
dIII-BamHI断片（1380bp）を切り出すため、pKEX1プラ
スミドDNAを対応する２種類のエンドヌクレオーゼによ
り消化する。各断片をSKポリリンカーを有するブルース
クリプト（Bluescript）ベクターM13＋に移行せしめ、
そしてこのクローンをM13ベクターのための共通（unive
rsal）プライマーを用いて配列決定することによりKEX1
断片を確認し、そしてpKEX1M13と命名する。
〔セントロマー（centromere）シャトルベクターpCS19
中;Sengstag,C.等（1987）Nucl.Acids Res.15,233〕か
ら、KEX1特遺伝オリゴヌクレオチドプローブとのコロニ
ーハイブリダイゼーションによりクローニングする。次
のオリゴヌクレオチド配列： ５′−GTCGAATCCGGCCCTTTTAGGGTGAATTCA−３′は発表
されているKEX1配列〔Dmochowska,A.等、（1987）Cell,
50,573〕に由来し、そしてyscYの配列への特に低い相同
性により全体配列から選択されたものである。このもの
はKEX1 DNAのEcoRV制限部位の上流にハイブリダイズ
し、この制限部位はURA3遺伝子の挿入のために使用され
る。URA3断片の挿入の確認のための配列決定プライマー
として同じオリゴヌクレオチドを用いることができる。
この合成オリゴヌクレオチドを放射能ラベルし、そして
遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために用いる。
約10,000個のクローン〔５×2000クローン／プレート
（φ＝140mm）〕をコロニーハイブリダイゼーション〔W
oods,D.E.等（1982）,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,79,566
1;及びWhitehead A.S.等（1983）,Proc,Natl.Acad.Sci.
USA,80,5387〕によりスクリーニングする。スクリーニ
ング法の２回の反復から５個の独立の陽性クローンが単
離される。その１つをpKEX1と同様する。KEX1特異的Hin
dIII-BamHI断片（1380bp）を切り出すため、pKEX1プラ
スミドDNAを対応する２種類のエンドヌクレオーゼによ
り消化する。各断片をSKポリリンカーを有するブルース
クリプト（Bluescript）ベクターM13＋に移行せしめ、
そしてこのクローンをM13ベクターのための共通（unive
rsal）プライマーを用いて配列決定することによりKEX1
断片を確認し、そしてpKEX1M13と命名する。
HindIII断片としてURA3遺伝子を含有するプラスミドp
UC12/URA3（例12aを参照のこと）をHindIIIで消化して1
170bp HindIII断片を単離する〔Rose,M.等（1984）,Gen
e29,115を参照のこと〕。この断片の接着末端をKlenow
ポリメラーゼによりフィルインして平滑末端を形成す
る。他方、プラスミドpKEX1M13をエンドククレアーゼEc
oRVでの消化により線状化し、こうしてKEX1 HindIII-Ba
mHI断片を切り出し、そして自己連結を防止するために
アルカリホスファターゼにより脱リン酸化する。次に、
これら２種類のDNA断片を混合し、連結し、そして大腸
菌JM103株に形質転換する。形質転換体をHindIII及びBa
mHIを用いる二重消化により分析する。この場合、注目
のHindIII-BamHI断片の大きさは1380bpから2550bpに増
加する。１つの正しいクローンのDNAを、配列決定プラ
イマーとして上記のオリゴヌクレオチドを用いて配列決
定することにより、KEX1遺伝子中のEcoRV切断部位の位
置へのURA3断片の挿入を確認する。このプラスミドをpK
EX1M13-URA3と称する。
UC12/URA3（例12aを参照のこと）をHindIIIで消化して1
170bp HindIII断片を単離する〔Rose,M.等（1984）,Gen
e29,115を参照のこと〕。この断片の接着末端をKlenow
ポリメラーゼによりフィルインして平滑末端を形成す
る。他方、プラスミドpKEX1M13をエンドククレアーゼEc
oRVでの消化により線状化し、こうしてKEX1 HindIII-Ba
mHI断片を切り出し、そして自己連結を防止するために
アルカリホスファターゼにより脱リン酸化する。次に、
これら２種類のDNA断片を混合し、連結し、そして大腸
菌JM103株に形質転換する。形質転換体をHindIII及びBa
mHIを用いる二重消化により分析する。この場合、注目
のHindIII-BamHI断片の大きさは1380bpから2550bpに増
加する。１つの正しいクローンのDNAを、配列決定プラ
イマーとして上記のオリゴヌクレオチドを用いて配列決
定することにより、KEX1遺伝子中のEcoRV切断部位の位
置へのURA3断片の挿入を確認する。このプラスミドをpK
EX1M13-URA3と称する。
このpKEX1M13-URA3プラスミドのDNAをHindIII及びBam
HIで消化することによりKEX1-UR3ハイブリド断片を切り
出し、そしてベクターから分離することなくS.セレビシ
エーH449株に導入する。これは前記の方法（例３を参照
のこと）により行う。Ura3+形質転換体から膜画分を単
離した後、発色基質（例１を参照のこと）を用いてysc
αの活性を測定する。yscαのプロテアーゼ活性を示さ
ない単一の形質転換体をサッカロミセス・セレビシエー
H449kex1と命名する。
HIで消化することによりKEX1-UR3ハイブリド断片を切り
出し、そしてベクターから分離することなくS.セレビシ
エーH449株に導入する。これは前記の方法（例３を参照
のこと）により行う。Ura3+形質転換体から膜画分を単
離した後、発色基質（例１を参照のこと）を用いてysc
αの活性を測定する。yscαのプロテアーゼ活性を示さ
ない単一の形質転換体をサッカロミセス・セレビシエー
H449kex1と命名する。
例15.S.セレビシエーH449kex1株の形質転換サッカロミ
セス・セレビシエー（Saccharomyces serevisiae）H449
kex1株を、次のプラスミド： pDP34/PHO5（−173）−HIR pDP34/GAPFL−HIR pDP34/GAPEL−HIR pDP34/PHO5（−173）−YHIR pDP34/GAPFL−YHIR pDP34/GAPEL−YHIR pDP92/PHO5（−173）−YHIR pDP92/GAPFL−YHIR pDP92/GAPEL−YHIR を用いて、Hinnen等（前掲）により記載された形質転換
法により形質転換する。形質転換された酵母細胞を、ロ
イシンが補充されておりそしてウラシルを欠いている酵
母最少培地プレート上で選択する。単一形質転換細胞を
単離し、そして次のように命名する。
セス・セレビシエー（Saccharomyces serevisiae）H449
kex1株を、次のプラスミド： pDP34/PHO5（−173）−HIR pDP34/GAPFL−HIR pDP34/GAPEL−HIR pDP34/PHO5（−173）−YHIR pDP34/GAPFL−YHIR pDP34/GAPEL−YHIR pDP92/PHO5（−173）−YHIR pDP92/GAPFL−YHIR pDP92/GAPEL−YHIR を用いて、Hinnen等（前掲）により記載された形質転換
法により形質転換する。形質転換された酵母細胞を、ロ
イシンが補充されておりそしてウラシルを欠いている酵
母最少培地プレート上で選択する。単一形質転換細胞を
単離し、そして次のように命名する。
サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/PHO
5（−173）−HIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
FL−HIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
EL-HIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/PHO
5（−173）−YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
FL-YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
EL-YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP92/PHO
5（−173）−YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP92/GAP
FL-YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP92/GAP
EL-YHIR 例16.形質転換された酵母株の実験室規模での発酵 サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/PHO
5（−173）−YHIR及びサッカロミセス・セレビシエー
H449kex1/pDP34/GAPFL-YHIRの細胞をそれぞれ、次の組
成（g/l）： ディフコ イースト・ニトロゲン・ベース 6.7 アスパラギン 10 ロイシン １ グルコース ２ ０ を有する最少培地10ml中で２回前培養する。最初の前培
養は28℃,180r.p.mにて60時間行う。第２前培養は２％
の第一前培養物を接種して、28℃,180r.p.mにて24時間
行う。
5（−173）−HIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
FL−HIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
EL-HIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/PHO
5（−173）−YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
FL-YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/GAP
EL-YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP92/PHO
5（−173）−YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP92/GAP
FL-YHIR サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP92/GAP
EL-YHIR 例16.形質転換された酵母株の実験室規模での発酵 サッカロミセス・セレビシエー H449kex1/pDP34/PHO
5（−173）−YHIR及びサッカロミセス・セレビシエー
H449kex1/pDP34/GAPFL-YHIRの細胞をそれぞれ、次の組
成（g/l）： ディフコ イースト・ニトロゲン・ベース 6.7 アスパラギン 10 ロイシン １ グルコース ２ ０ を有する最少培地10ml中で２回前培養する。最初の前培
養は28℃,180r.p.mにて60時間行う。第２前培養は２％
の第一前培養物を接種して、28℃,180r.p.mにて24時間
行う。
主培養培地は次の組成を有する。
酵母エキス 49 グルコース ５ スラクトース 57 NH4NO3 0.5 MgSO4x7H2O 1.0 CaCO3 5.0 Ca3(PO4)2 2.0 主培養に約２×106細胞/mlを接種し、そして28℃,180
r.p.mにて72時間培養を行う。発酵の終りにおいて約１
×109細胞/mlが得られる。発酵中の幾つかの時点で培養
物のサンプルを取り、遠心分離により細胞を除去し、そ
して細胞上清のデスルファトヒルジンをHPLC（後記）に
より分析する。
r.p.mにて72時間培養を行う。発酵の終りにおいて約１
×109細胞/mlが得られる。発酵中の幾つかの時点で培養
物のサンプルを取り、遠心分離により細胞を除去し、そ
して細胞上清のデスルファトヒルジンをHPLC（後記）に
より分析する。
例17.50l規模におけるデスルファトヒルジン変形体HV1
の製造 50l規模でのデスルファトヒルジンの製造のための接
種源として２ミクロンプラスミドを含有しないサッカロ
ミセス・セレビシエーH449kex1/pDP34/GAPFL-YHIRの貯
蔵細胞を用いた。
の製造 50l規模でのデスルファトヒルジンの製造のための接
種源として２ミクロンプラスミドを含有しないサッカロ
ミセス・セレビシエーH449kex1/pDP34/GAPFL-YHIRの貯
蔵細胞を用いた。
貯蔵細胞のアンプルを液体窒素容器の蒸気相に貯蔵す
る。アンプルの内容物を、次の組成（g/l）： イースト・ニトロゲン・ベース 8.4 Ｌ−アルパラギン・一水和物 11.4 Ｌ−ヒスチジン 1.0 Ｌ−ロイシン 0.1 Ｄ−グルコース一水和物 20.0 を有する選択培地を収容する振とうフラスコに接種す
る。500mlのフラスコは100mlの培養を含み、これを180
回／分の振とう速度の回転振とう機上で28℃にて48時間
培養する。
る。アンプルの内容物を、次の組成（g/l）： イースト・ニトロゲン・ベース 8.4 Ｌ−アルパラギン・一水和物 11.4 Ｌ−ヒスチジン 1.0 Ｌ−ロイシン 0.1 Ｄ−グルコース一水和物 20.0 を有する選択培地を収容する振とうフラスコに接種す
る。500mlのフラスコは100mlの培養を含み、これを180
回／分の振とう速度の回転振とう機上で28℃にて48時間
培養する。
第二振とうフラスコ培養では、４個のバッフルを有す
る2lフラスコ中で前記と同じ組成の培地600mlを用い
る。第一培養からの接種レベルは５％（30ml）であり、
そして120回／分の速度の回転振とう機上で28℃にて48
時間培養する。
る2lフラスコ中で前記と同じ組成の培地600mlを用い
る。第一培養からの接種レベルは５％（30ml）であり、
そして120回／分の速度の回転振とう機上で28℃にて48
時間培養する。
第三前培養物は、４枚のバッフルを有しそして直径11
5mmの単一ディスクタービン攪拌機を有する50lのステン
レス鋼製バイオリアクター中で発酵せしめる。この培養
のためにも前記培地を用い、始発容量を30lとする。600
mlの培養物を含む2lフラスコ１本を用いて50lリアクタ
ーに接種する（２％）。28℃の温度において発酵を42時
間続ける。攪拌速度は600r.p.mであり、通気量は1rrmで
あり、そして0.3バールの上圧をかける。
5mmの単一ディスクタービン攪拌機を有する50lのステン
レス鋼製バイオリアクター中で発酵せしめる。この培養
のためにも前記培地を用い、始発容量を30lとする。600
mlの培養物を含む2lフラスコ１本を用いて50lリアクタ
ーに接種する（２％）。28℃の温度において発酵を42時
間続ける。攪拌速度は600r.p.mであり、通気量は1rrmで
あり、そして0.3バールの上圧をかける。
フィード−バッチ法のための装置をさらに備えた類似
の50lバイオリアクターを用いてデスルファトヒルジン
の生産を行う。培地は次の成分（g/l）を含有する。
の50lバイオリアクターを用いてデスルファトヒルジン
の生産を行う。培地は次の成分（g/l）を含有する。
肉ペプトン（メルク） 5.0 酵母エキス 30.0 硫酸アンモニウム 6.0 硫酸マグネシウム・五水和物 1.0 塩化ナトリウム 0.1 リン酸二水素カリウム 1.0 Ｄ−グルコース一水和物 10.0 第三前培養段階からの接種量は任意に２％である。28
℃の温度及び750r.p.mの攪拌速度で発酵を48時間続け
る。上圧は最初0.3バールに設定するが、20％飽和以上
の溶存酸素を維持するために発酵中に1.0バールに上げ
ることができる。最初の通気量は0.25rrmであるが、適
切な酸素の供給を保証するため９時間後に1rrmに上げ
る。
℃の温度及び750r.p.mの攪拌速度で発酵を48時間続け
る。上圧は最初0.3バールに設定するが、20％飽和以上
の溶存酸素を維持するために発酵中に1.0バールに上げ
ることができる。最初の通気量は0.25rrmであるが、適
切な酸素の供給を保証するため９時間後に1rrmに上げ
る。
pH値は発酵の初期において5.0に低下し、水酸化アン
モニウムの自動供給によりこのpHを保持する。
モニウムの自動供給によりこのpHを保持する。
単純な回分式培養においては、達成される菌体量、及
び従ってデスルファトヒルジン力価は最初に発酵槽に導
入された炭素源の量に依存する。今度はこの炭素源の量
はバイオリアクターの酸素移送容量及び増殖する酵母に
よるエタノールの過剰生産を回避する必要性により限定
される。このような限界はフィード−バッチ法により克
服することができる。すなわち、始発培地にはグルコー
スをほとんど導入せず、かなり高い最終バイオマス濃度
及び回分培養において達成されるのよりも約３倍高いデ
スルファトヒルジン力価を支持するためにグルコースの
フィードを行う。実際には、一定間隔で段階的に、175g
/時のグルコース一水和物の最終供給速度にまで上げ
る。
び従ってデスルファトヒルジン力価は最初に発酵槽に導
入された炭素源の量に依存する。今度はこの炭素源の量
はバイオリアクターの酸素移送容量及び増殖する酵母に
よるエタノールの過剰生産を回避する必要性により限定
される。このような限界はフィード−バッチ法により克
服することができる。すなわち、始発培地にはグルコー
スをほとんど導入せず、かなり高い最終バイオマス濃度
及び回分培養において達成されるのよりも約３倍高いデ
スルファトヒルジン力価を支持するためにグルコースの
フィードを行う。実際には、一定間隔で段階的に、175g
/時のグルコース一水和物の最終供給速度にまで上げ
る。
必要な場合には、発泡を抑制するためにシリコーン性
消泡剤を少量添加する。発酵槽からの排気の一部分を分
析して、酸素の取り込み及び二酸化炭素の発生について
の情報を得る。溶存酸素は殺菌可能な電極を用いてオン
ライン測定される。
消泡剤を少量添加する。発酵槽からの排気の一部分を分
析して、酸素の取り込み及び二酸化炭素の発生について
の情報を得る。溶存酸素は殺菌可能な電極を用いてオン
ライン測定される。
サンプルを全工程を通して６時間間隔で採取してグル
コール及びエタノール濃度、バイオアッセイ及びHPLCに
よるデスルファトヒルジンの力価、のモニターができる
ようにし、そしてさらに無菌性をチェックする。HPLCか
ら明らかな通り、生産されたデスルファトヒルジンはＣ
−末端が短縮された類似体を実質上含有しない。発酵過
程の終りにおいて、培養上清からデスルファトヒルジン
を回収することができる。
コール及びエタノール濃度、バイオアッセイ及びHPLCに
よるデスルファトヒルジンの力価、のモニターができる
ようにし、そしてさらに無菌性をチェックする。HPLCか
ら明らかな通り、生産されたデスルファトヒルジンはＣ
−末端が短縮された類似体を実質上含有しない。発酵過
程の終りにおいて、培養上清からデスルファトヒルジン
を回収することができる。
例18.50l規模で培養されたS.セレビシエーからのデスル
ファトヒルジンの回収 培養液をアンバーライトXAD-7と混合し、そして25℃
にて約４時間吸着にかける。細胞をカラム中の樹脂から
分離する。1M NaClにより洗浄した後、樹脂をTris緩衝
液（50mM,pH7.0〜8.5）により溶出する。主画分（30l）
をpH2.9に調製し、そして2lのベッドボリウムを有する
Ｓ−セファロースカラム（25mM蟻酸アンモニウム緩衝液
pH2.9により平衡化されたアミコンPA）に適用する。蟻
酸アンモニウム緩衝液（40mM,pH3.6）で洗浄した後、蟻
酸アンモニウム緩衝液（50mM,pH3.6）で溶出を行った。
主溶出画分（10l）を、Ω3K膜を装着したフィルトロン
・ミニセット（Filtron Minisett）限外濾過により濃縮
する。生ずる透明な蛋白質溶液の0.5l部分を、1.5lのベ
ッドボリウムを有するBio-Gel P-6ファインカラム（0.5
％酢酸により平衡化されたアミコンGF）に適用する。0.
5％酢酸により溶出を行う。主たる溶出画分（１）を限
外濾過により溶出し、そして次に、2lのベッドボリウム
を有するＱ−セファロース・ファスト・フロー・カラム
（25mM蟻酸アンモニウム緩衝液pH2.9により平衡化した
アミコンPA）に適用する。蟻酸アンモニウム緩衝液（50
mM,pH4.2）により溶出を行う。主たる溶出画分を限外濾
過により濃縮し、そして次に水に対してダイアフィルト
レーションする。生ずる透明な水溶液を凍結乾燥する。
この固体は純粋なデスルファトヒルジンから成り検出さ
れる量のＣ−末端短縮類似体を含有しない。
ファトヒルジンの回収 培養液をアンバーライトXAD-7と混合し、そして25℃
にて約４時間吸着にかける。細胞をカラム中の樹脂から
分離する。1M NaClにより洗浄した後、樹脂をTris緩衝
液（50mM,pH7.0〜8.5）により溶出する。主画分（30l）
をpH2.9に調製し、そして2lのベッドボリウムを有する
Ｓ−セファロースカラム（25mM蟻酸アンモニウム緩衝液
pH2.9により平衡化されたアミコンPA）に適用する。蟻
酸アンモニウム緩衝液（40mM,pH3.6）で洗浄した後、蟻
酸アンモニウム緩衝液（50mM,pH3.6）で溶出を行った。
主溶出画分（10l）を、Ω3K膜を装着したフィルトロン
・ミニセット（Filtron Minisett）限外濾過により濃縮
する。生ずる透明な蛋白質溶液の0.5l部分を、1.5lのベ
ッドボリウムを有するBio-Gel P-6ファインカラム（0.5
％酢酸により平衡化されたアミコンGF）に適用する。0.
5％酢酸により溶出を行う。主たる溶出画分（１）を限
外濾過により溶出し、そして次に、2lのベッドボリウム
を有するＱ−セファロース・ファスト・フロー・カラム
（25mM蟻酸アンモニウム緩衝液pH2.9により平衡化した
アミコンPA）に適用する。蟻酸アンモニウム緩衝液（50
mM,pH4.2）により溶出を行う。主たる溶出画分を限外濾
過により濃縮し、そして次に水に対してダイアフィルト
レーションする。生ずる透明な水溶液を凍結乾燥する。
この固体は純粋なデスルファトヒルジンから成り検出さ
れる量のＣ−末端短縮類似体を含有しない。
例19.S.セレビシエーH449におけるPRA1遺伝子の中断 S.セレビシエーH449株（DSM 4413;prb,leu2,ura3,cir
°）を遺伝子中断法により多重プロテアーゼ欠損性にす
る。遺伝子中断は減数分裂交叉に比べて、所与の株の遺
伝的バックグラウドを同一に維持しながら変異を安定に
導入するという利点を有する。
°）を遺伝子中断法により多重プロテアーゼ欠損性にす
る。遺伝子中断は減数分裂交叉に比べて、所与の株の遺
伝的バックグラウドを同一に維持しながら変異を安定に
導入するという利点を有する。
第一段階において、PRA1遺伝子〔Ammerer,G,等、（19
86）,Mol.Cell.Biol.,6,2490〕の中断によりプロテイナ
ーゼyscA活性を除去する。PRA1を全ゲノム酵母DNAから
単離し、SacI及びPstIにより消化する。２キロ断片を分
取用0.6％アガロースゲルから単離し、電気溶出し、そ
してpUC19のポリリンカー領域のPstI-SacI部位に連結す
る。このベクターを大腸菌JM109に形質転換し、そして2
80個の個別のコロニーを拾う。これらのコロニーを別々
に、LB＋amp培地を含むミクロタイタープレートのウエ
ル中で増殖せしめる。記載されている方法〔Woods,D.E.
等（1982）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79、5651〕と実質
的に同様にして公表されているPRA1配列（Ammerer等、
前掲）に由来する下記の32P−ラベル化オリゴヌクレオ
チドプローブ： ５′−AAGCCTAGTGACCTAGT−３′ を用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行う。３
個の陽性クローンを拾い、その内の１個−pUC19/PRA1−
のDNAをSacI及びXhoIにより切断し、そしてBluescript
ベクターM13＋（Stratagene Cloning Systems、サンジ
エゴ、カリホルニア）のKSポリリンカー領域に、完全な
PRA1遺伝子を含有する1.9kb断片をサブクローニングす
る。完全なURA3遺伝子〔Rose,M.等、（1984）,Gene29,1
13〕を含有する1.2kb HindIII断片を、PRA1遺伝子挿入
部のコード領域内のユニークHindIII部位に挿入する。
生ずるプラスミドをM13＋/pra::URA3と称するM13＋/pra
l::URA3をSacI/XhoIにより消化し、そして3.1kb断片を
ベクターから単離しないで用いて、前記のようにして
（例３を参照のこと）S.セレビシエーH449を形質転換す
る。ウラシル非依存性形質転換体を拾い、DNAを調製
し、SacI/XhoI消化し、そしてサザンブロッティングに
よりPRA1遺伝子の正しい中断について点検する。PRA1と
ハイブリダイズするSacI/XhoI断片の1.9kbから3.1kbへ
の正しいシフトを有する１個の形質転換体をTr1186と称
する。
86）,Mol.Cell.Biol.,6,2490〕の中断によりプロテイナ
ーゼyscA活性を除去する。PRA1を全ゲノム酵母DNAから
単離し、SacI及びPstIにより消化する。２キロ断片を分
取用0.6％アガロースゲルから単離し、電気溶出し、そ
してpUC19のポリリンカー領域のPstI-SacI部位に連結す
る。このベクターを大腸菌JM109に形質転換し、そして2
80個の個別のコロニーを拾う。これらのコロニーを別々
に、LB＋amp培地を含むミクロタイタープレートのウエ
ル中で増殖せしめる。記載されている方法〔Woods,D.E.
等（1982）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79、5651〕と実質
的に同様にして公表されているPRA1配列（Ammerer等、
前掲）に由来する下記の32P−ラベル化オリゴヌクレオ
チドプローブ： ５′−AAGCCTAGTGACCTAGT−３′ を用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行う。３
個の陽性クローンを拾い、その内の１個−pUC19/PRA1−
のDNAをSacI及びXhoIにより切断し、そしてBluescript
ベクターM13＋（Stratagene Cloning Systems、サンジ
エゴ、カリホルニア）のKSポリリンカー領域に、完全な
PRA1遺伝子を含有する1.9kb断片をサブクローニングす
る。完全なURA3遺伝子〔Rose,M.等、（1984）,Gene29,1
13〕を含有する1.2kb HindIII断片を、PRA1遺伝子挿入
部のコード領域内のユニークHindIII部位に挿入する。
生ずるプラスミドをM13＋/pra::URA3と称するM13＋/pra
l::URA3をSacI/XhoIにより消化し、そして3.1kb断片を
ベクターから単離しないで用いて、前記のようにして
（例３を参照のこと）S.セレビシエーH449を形質転換す
る。ウラシル非依存性形質転換体を拾い、DNAを調製
し、SacI/XhoI消化し、そしてサザンブロッティングに
よりPRA1遺伝子の正しい中断について点検する。PRA1と
ハイブリダイズするSacI/XhoI断片の1.9kbから3.1kbへ
の正しいシフトを有する１個の形質転換体をTr1186と称
する。
次の段階において、Tr1186（そのPRA1遺伝子中にpra
l::URA3による中断を有する）を、該pral::URA3遺伝子
挿入部への欠失の挿入により再びウラシル依存性にす
る。Tr1186を１μｇのプラスミドYE p13〔Broach,J.R.
等（1979）,Gene8,121〕、及びURA3遺伝子中に200bpの
欠失を有するプラスミドpUC12ura3delta〔Sengstag,C.
等（1978）,Nucleic Acids Research,15,233〕10μｇに
より形質転換する。3000個のロイシン非要求性（protot
rophic）酵母形質転換体を小振とうフラスコ中5mlの最
少培値（アミノ酸を含有しないデイフコ・イースト・ニ
トロゲン・ベースに２％グルコース、0.1％ロイシン、
0.1％ウラシル及び0.25％フルオロオロチン酸を添加し
たもの）に再懸濁し、そして30℃、180rpmにて60時間イ
ンキュベートする。増殖する形質転換体は毒性類似体で
あるフルオロオロチン酸に対して耐性であり、そしてそ
れ故にpral::URA3領域にura3deltaによる置換を有す
る。増殖した細胞を、ペプトン20g/l、酵母エキス10g/l
及びグルコース20g/lを含む完全培地上にプレートし、
そして30°にて48時間の増殖の後に、最少培地（アミノ
酸を含有しないデイフコ・イースト・ニトロゲン培地に
２％グルコース及び0.1％ロイシンを補充したもの）上
にレプリカ・プレートし、ウラシス要求株を検出する。
幾つかの要求株を拾い、そしてロイシン栄養要求性を付
与するプラスミドYEp13の喪失について試験する。ロイ
シン及びウラシルを要求するTr1195と称する１個のコロ
ニーを拾い、そしてその後の実験に用いる。
l::URA3による中断を有する）を、該pral::URA3遺伝子
挿入部への欠失の挿入により再びウラシル依存性にす
る。Tr1186を１μｇのプラスミドYE p13〔Broach,J.R.
等（1979）,Gene8,121〕、及びURA3遺伝子中に200bpの
欠失を有するプラスミドpUC12ura3delta〔Sengstag,C.
等（1978）,Nucleic Acids Research,15,233〕10μｇに
より形質転換する。3000個のロイシン非要求性（protot
rophic）酵母形質転換体を小振とうフラスコ中5mlの最
少培値（アミノ酸を含有しないデイフコ・イースト・ニ
トロゲン・ベースに２％グルコース、0.1％ロイシン、
0.1％ウラシル及び0.25％フルオロオロチン酸を添加し
たもの）に再懸濁し、そして30℃、180rpmにて60時間イ
ンキュベートする。増殖する形質転換体は毒性類似体で
あるフルオロオロチン酸に対して耐性であり、そしてそ
れ故にpral::URA3領域にura3deltaによる置換を有す
る。増殖した細胞を、ペプトン20g/l、酵母エキス10g/l
及びグルコース20g/lを含む完全培地上にプレートし、
そして30°にて48時間の増殖の後に、最少培地（アミノ
酸を含有しないデイフコ・イースト・ニトロゲン培地に
２％グルコース及び0.1％ロイシンを補充したもの）上
にレプリカ・プレートし、ウラシス要求株を検出する。
幾つかの要求株を拾い、そしてロイシン栄養要求性を付
与するプラスミドYEp13の喪失について試験する。ロイ
シン及びウラシルを要求するTr1195と称する１個のコロ
ニーを拾い、そしてその後の実験に用いる。
例20.Tr1195中のPRC1遺伝子の中断 次に、Tr1195におけるカルボキシペプチダーゼyscY活
性を除去する。yscYをコードするPRC1〔Rothman,J.H.等
（1986）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,3248〕を、セン
トロマーベクターpCS19〔Sengstag,C.等（1978）,Nucle
ic Acids Research,15,233〕中の酵母ゲノムライブラリ
ーからPRC1コード配列の５′及び３′末端に対応する次
の２種類のオリゴヌクレオチド： ５′−GAAAGCATTCACCAGTTTACTATGTGG−３′及び ５′−CGAATGGATCCCAACGGGTTTCTCC−３′ とのコロニーハイブリダイゼーションにより単離する。
１つの陽性クローンをpCS19/cpy8と称する。pCS19/cpy8
のDNAをClaI/PvuIIで消化し、0.6％分取用アガロースゲ
ルにかけ、そして2.6kb断片を単離し、電気溶出する。
完全なPRC1遺伝子を含有するこのClaI/PvuII断をpUC19
のNarI/SmaI部位にさらにサブクローニングする。生ず
るプラスミドpUC19/PRC1をユニークStuI部位で切断し、
そしてここに1.2kb URA3断片（例19を参照のこと）連結
する。この目的のため、URA3含有断片の接着HindIII末
端をKlenow DNAポリメラーゼとの反応においてフィルイ
ンし、pUC/PRC1の平滑末端化されたStaI部位と適合させ
る。
性を除去する。yscYをコードするPRC1〔Rothman,J.H.等
（1986）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,3248〕を、セン
トロマーベクターpCS19〔Sengstag,C.等（1978）,Nucle
ic Acids Research,15,233〕中の酵母ゲノムライブラリ
ーからPRC1コード配列の５′及び３′末端に対応する次
の２種類のオリゴヌクレオチド： ５′−GAAAGCATTCACCAGTTTACTATGTGG−３′及び ５′−CGAATGGATCCCAACGGGTTTCTCC−３′ とのコロニーハイブリダイゼーションにより単離する。
１つの陽性クローンをpCS19/cpy8と称する。pCS19/cpy8
のDNAをClaI/PvuIIで消化し、0.6％分取用アガロースゲ
ルにかけ、そして2.6kb断片を単離し、電気溶出する。
完全なPRC1遺伝子を含有するこのClaI/PvuII断をpUC19
のNarI/SmaI部位にさらにサブクローニングする。生ず
るプラスミドpUC19/PRC1をユニークStuI部位で切断し、
そしてここに1.2kb URA3断片（例19を参照のこと）連結
する。この目的のため、URA3含有断片の接着HindIII末
端をKlenow DNAポリメラーゼとの反応においてフィルイ
ンし、pUC/PRC1の平滑末端化されたStaI部位と適合させ
る。
生成するプラスミドpUC19/prc::URA3をAatIIにより消
化し、そしてそのAatII断片をベクターから分離するこ
となく用いて、前記のごとくS.セレビシエーTr1195を形
質転換する。１個のウラシル非依存性形質転換体〔Tr12
06〕をサザンブロッティングによりPRC1の正しい中断に
ついて試験し、そしてその後、前記のようにして（例19
を参照のこと）再びウラシル依存性にする。生ずるS.セ
レビシエー株をTr1210（pral,prbl.prcl,ura3,leu2,cir
°）と称する。
化し、そしてそのAatII断片をベクターから分離するこ
となく用いて、前記のごとくS.セレビシエーTr1195を形
質転換する。１個のウラシル非依存性形質転換体〔Tr12
06〕をサザンブロッティングによりPRC1の正しい中断に
ついて試験し、そしてその後、前記のようにして（例19
を参照のこと）再びウラシル依存性にする。生ずるS.セ
レビシエー株をTr1210（pral,prbl.prcl,ura3,leu2,cir
°）と称する。
例21.S.セレビシエーTr1210のkex1変異種の調製 記載されているようにして（例14を参照のこと）ゲノ
ムKEX1遺伝子の中断によりS.セレビシエーTr1210株から
カルボキシペプチダーゼ活性を除去する。yscαのプロ
テアーゼ活性を示さない得られるS.セレビシエー株をTr
1302（pral,prbl,prcl,ura3,leu2,cir°,kex1）と称す
る。
ムKEX1遺伝子の中断によりS.セレビシエーTr1210株から
カルボキシペプチダーゼ活性を除去する。yscαのプロ
テアーゼ活性を示さない得られるS.セレビシエー株をTr
1302（pral,prbl,prcl,ura3,leu2,cir°,kex1）と称す
る。
例22.ヒルジン変形体HV1-KR,HV1-SFRY,HV1-WQLRの作製 異るＣ−末端アミノ酸を有する異種蛋白質のyscα−
介在Ｃ−末端分解をさらに評価するため、Ｃ−末端アミ
ノ酸組成を異にするヒルジン変異体を作製する。一般的
方法として、原理的に記載されている部位特定生体外変
異誘発を用いる（Bio-Rad Muta-Gane M17 キット、Bio
-Rad、リッチモンド、カリホルニア）。
介在Ｃ−末端分解をさらに評価するため、Ｃ−末端アミ
ノ酸組成を異にするヒルジン変異体を作製する。一般的
方法として、原理的に記載されている部位特定生体外変
異誘発を用いる（Bio-Rad Muta-Gane M17 キット、Bio
-Rad、リッチモンド、カリホルニア）。
次の変異体を作製する。
1.〔Lys64‐Arg65〕ヒルジン変形体に１に対応するHV1-
KR 2.〔Ser62‐Phe63‐Arg64‐Tyr65〕HV1に対応するHV1-S
FRY 3.〔Trp62‐Glu63‐Leu64‐Arg65〕HV1に対応するHV1-W
QLR すべてのヒルジン変異体のアミノ酸配列は、それぞれ
アミノ酸61又は63までのヒルジン変形体１のそれに対応
する。
KR 2.〔Ser62‐Phe63‐Arg64‐Tyr65〕HV1に対応するHV1-S
FRY 3.〔Trp62‐Glu63‐Leu64‐Arg65〕HV1に対応するHV1-W
QLR すべてのヒルジン変異体のアミノ酸配列は、それぞれ
アミノ酸61又は63までのヒルジン変形体１のそれに対応
する。
HV1-SFRYにおいて、Ｃ−末端は心房性ナトリウム利尿
性ペプチド〔Vlasuk等（1986）,J.Biol.chem.261,4789-
4796〕と同一であり、HV1-WOLRにおいてＣ−末端は上皮
成長因子〔George-Nasci-mento,C.等、（1988）,Bioche
misty27,797-802〕に相当し、この両者はプロテアーゼ
含有野性型酵母株によりＣ−末端が分解されることが知
られている。
性ペプチド〔Vlasuk等（1986）,J.Biol.chem.261,4789-
4796〕と同一であり、HV1-WOLRにおいてＣ−末端は上皮
成長因子〔George-Nasci-mento,C.等、（1988）,Bioche
misty27,797-802〕に相当し、この両者はプロテアーゼ
含有野性型酵母株によりＣ−末端が分解されることが知
られている。
第一段階において、プラスミドpJDB207/GAPFL-HIR
（ヨーロッパ特許出願No.225633に記載されている）をS
alI−HindIIIで消化して、十分な長さヒルジン発現カセ
ットを含有する1.2kb断片を得る。この1.2kbのSalI−Hi
ndIII断片を、SalI−HindIIIで切断された、SKポリリン
カーを有するBlues-cript M13＋にサブクローニングす
る。記載されているようにして（Bio-Rad Muta-Gene M1
3キット、前記）、生ずるプラスミドM13＋/HV1を大腸菌
CJ236にトランスフェクトしてウラシルを導入する。ト
ランスフェクトされた大腸菌CJ236からの単鎖DNAを、M1
3ヘルパーファージ（Stratagene前記）の使用によって
単離する。
（ヨーロッパ特許出願No.225633に記載されている）をS
alI−HindIIIで消化して、十分な長さヒルジン発現カセ
ットを含有する1.2kb断片を得る。この1.2kbのSalI−Hi
ndIII断片を、SalI−HindIIIで切断された、SKポリリン
カーを有するBlues-cript M13＋にサブクローニングす
る。記載されているようにして（Bio-Rad Muta-Gene M1
3キット、前記）、生ずるプラスミドM13＋/HV1を大腸菌
CJ236にトランスフェクトしてウラシルを導入する。ト
ランスフェクトされた大腸菌CJ236からの単鎖DNAを、M1
3ヘルパーファージ（Stratagene前記）の使用によって
単離する。
HV1-KPを作製するため、変異原プライマー： ５′−CCGGAAGAATACAAGAGGTAGGATCCT−３′ を使用する。
HV1-SFRYのためには変異原プライマー： ５′−GAAGAAATCCCGGAATCTTTCAGATACTAGGATCCTGGTACG
−３′ を使用する。
−３′ を使用する。
HV1-WQLRのためには変異原プライマー： ５′−GAAGAAATCCCGGAATGGGAACTGAGATAGGATCCTGGTACG
−３′ を使用する。
−３′ を使用する。
200pmolの各プライマーをまず、３μｌの1M Tris−HC
l（pH8.0）、0.3μｌの1M Mgcl2、0.75μｌの0.2M DT
T、0.6μｌの20mM ATPを含有する30μｌの全容量中でリ
ン酸化する。4.5ユニットのT4ポリヌクレオチドキナー
ゼを添加し、そしてこの混合物を37℃にて15分間及び65
℃にて10分間インキュベートする。
l（pH8.0）、0.3μｌの1M Mgcl2、0.75μｌの0.2M DT
T、0.6μｌの20mM ATPを含有する30μｌの全容量中でリ
ン酸化する。4.5ユニットのT4ポリヌクレオチドキナー
ゼを添加し、そしてこの混合物を37℃にて15分間及び65
℃にて10分間インキュベートする。
次に、リン酸化されたオリゴヌクレオチドを次の条件
下で鋳型DNAとアニールせしめる。M13＋/HV1由来の0.1p
molのウラシル含有DNAを2pmolのリン酸化されたプライ
マーと共に全容量10μｌのアニール緩衝液〔20mM Tris
−HCl（pH7.4）、2mM Mgcl2、50mM Nacl〕中でインキュ
ベートする。この混合物を水浴中で80℃に加熱し、そし
て次に周囲温度に達するまで徐々に放冷する。
下で鋳型DNAとアニールせしめる。M13＋/HV1由来の0.1p
molのウラシル含有DNAを2pmolのリン酸化されたプライ
マーと共に全容量10μｌのアニール緩衝液〔20mM Tris
−HCl（pH7.4）、2mM Mgcl2、50mM Nacl〕中でインキュ
ベートする。この混合物を水浴中で80℃に加熱し、そし
て次に周囲温度に達するまで徐々に放冷する。
次に、下記の条件下で相補鎖を形成する。10μｌの各
アニール混合物を、４μｌの2mM dNTP、0.75μｌの20mM
ATP、0.75μｌの0.5M Tris−HCl（pH7.4）、0.75μｌ
の0.1M Mgcl2、2.15μｌの0.2M DTT、１ユニットのT4 D
NAポリメラーゼ及び２ユニットのT4 DNAリガーゼと共に
インキュベートする。この反応混合物を、まず氷上で５
分間、次に25℃にて５分間、そして最後に37℃にて90分
間インキュベートする。生ずる二本鎖DNAを大腸菌JM101
に形質転換する。この大腸菌株はウラシル含有鋳型を効
率的に除去し、変異した相補鎖を残す（Bio-Rad、前
記）。プラスミドを調製し、そして未変異の野性型HV1
DNAの最後の２コドン中にのみ存在すべきPstI部位の不
存在についてチェックする。
アニール混合物を、４μｌの2mM dNTP、0.75μｌの20mM
ATP、0.75μｌの0.5M Tris−HCl（pH7.4）、0.75μｌ
の0.1M Mgcl2、2.15μｌの0.2M DTT、１ユニットのT4 D
NAポリメラーゼ及び２ユニットのT4 DNAリガーゼと共に
インキュベートする。この反応混合物を、まず氷上で５
分間、次に25℃にて５分間、そして最後に37℃にて90分
間インキュベートする。生ずる二本鎖DNAを大腸菌JM101
に形質転換する。この大腸菌株はウラシル含有鋳型を効
率的に除去し、変異した相補鎖を残す（Bio-Rad、前
記）。プラスミドを調製し、そして未変異の野性型HV1
DNAの最後の２コドン中にのみ存在すべきPstI部位の不
存在についてチェックする。
変異原プライマーの約20bp上流のヒルジンコード配列
に対応する下記のプライマー： ５′−GAAGGTACCCCGAAACCGCA−３′ を用いて新たなヒルジン変異体を配列決定することによ
り正しい変異誘発をさらに確認する。
に対応する下記のプライマー： ５′−GAAGGTACCCCGAAACCGCA−３′ を用いて新たなヒルジン変異体を配列決定することによ
り正しい変異誘発をさらに確認する。
最後に、３種類の変異したSalI−HindIII断片をBlues
cript M13＋から切り出し、そしてpJDB207のSalI−Hind
III部位に再連結する。
cript M13＋から切り出し、そしてpJDB207のSalI−Hind
III部位に再連結する。
３種類の新しいプラスミドを、 1.pJDB207/GAPFL-HV1-KR 2.pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY 3.pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR と命名する。
別の方法として、そしてTr1302（前記、例21を参照の
こと）のごときcir°株を形質転換することができるよ
うに、ヒルジン変異体を全長２ミクロンベクターpDP34
（前記、例９を参照のこと）にサブクローニングする。
pDP34をユニークBamHI部位で切断し、そして接着末端を
Klenow DNAポリメラーゼを用いてフィルインして平滑末
端を生じさせる。変異したヒルジン配列（前記）をコー
ドするBluescript M13＋からのSalI−HindIII断片も平
滑末端化し、そしてpDP34の平滑末端化（BamHI）部位に
連結する。得られるプラスミドを、 1.pDP34/GAPFL-HV1-KR 2.pDP34/GAPFL-HV1-SFRY 2.pDP34/GAPFL-HV1-WQLR と命名する。
こと）のごときcir°株を形質転換することができるよ
うに、ヒルジン変異体を全長２ミクロンベクターpDP34
（前記、例９を参照のこと）にサブクローニングする。
pDP34をユニークBamHI部位で切断し、そして接着末端を
Klenow DNAポリメラーゼを用いてフィルインして平滑末
端を生じさせる。変異したヒルジン配列（前記）をコー
ドするBluescript M13＋からのSalI−HindIII断片も平
滑末端化し、そしてpDP34の平滑末端化（BamHI）部位に
連結する。得られるプラスミドを、 1.pDP34/GAPFL-HV1-KR 2.pDP34/GAPFL-HV1-SFRY 2.pDP34/GAPFL-HV1-WQLR と命名する。
例23.pJDB207/GAPFL-HIR,pJDB207/GAPFL-HV1-KR,pJDB20
7/GAPFL-HV1-SFRY及びpJDB207/GAPFL-HV1-WQLRによるS.
セレビシエーBYSKXE1株及びBYSkex1株の形質転換、並び
にpDP34/GAPFL-HV1-KR,pDP34/GAPFL-HV1-SFRY及びpDP34
/GAPFL-HV1-WQLRによるS.セレビシエーTr1210株及びTr1
302株の形質転換 pJDB207/GAPFL-HV1-KR,pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY,pJDB
207/GAPFL-HV1-WQLR及びpJDB207/GAPFL-HIRをS.セレビ
シエーBYSKEX1（MSM 4583）及びBYSkex1に、標準的方法
及びロイシン選択（例３を参照のこと）を用いて形質転
換する。同様にして、pDP34/GAPFL-HV1-KR,pDP34/GAPFL
-HV1-SFRY及びpDP34/GAPFL-HV1-WQLRをS.セレビシエーT
r1201及びTr1302株に形質転換する。
7/GAPFL-HV1-SFRY及びpJDB207/GAPFL-HV1-WQLRによるS.
セレビシエーBYSKXE1株及びBYSkex1株の形質転換、並び
にpDP34/GAPFL-HV1-KR,pDP34/GAPFL-HV1-SFRY及びpDP34
/GAPFL-HV1-WQLRによるS.セレビシエーTr1210株及びTr1
302株の形質転換 pJDB207/GAPFL-HV1-KR,pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY,pJDB
207/GAPFL-HV1-WQLR及びpJDB207/GAPFL-HIRをS.セレビ
シエーBYSKEX1（MSM 4583）及びBYSkex1に、標準的方法
及びロイシン選択（例３を参照のこと）を用いて形質転
換する。同様にして、pDP34/GAPFL-HV1-KR,pDP34/GAPFL
-HV1-SFRY及びpDP34/GAPFL-HV1-WQLRをS.セレビシエーT
r1201及びTr1302株に形質転換する。
得られる株を次の様に命名する。
S.セレビシエーBYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HIR S.セレビシエーBYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-KR S.セレビシエーBYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY S.セレビシエーBYSKEX1/pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR S.セレビシエーBYSkex1/pJDB207/GAPFL-HIR S.セレビシエーBYSkex1/pJDB207/GAPFL-HV1-KR S.セレビシエーBYSkex1/pJDB207/GAPFL-HV1-SFRY S.セレビシエーBYSkex1/pJDB207/GAPFL-HV1-WQLR S.セレビシエーTr1210/pDP34/GAPFL-HV1-KR S.セレビシエーTr1210/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY S.セレビシエーTr1210/pDP34/GAPFL-HV1-WQLR S.セレビシエーTr1302/pDP34/GAPFL-HV1-KR S.セレビシエーTr1302/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY S.セレビシエーTr1302/pDP34/GAPFL-HV1-WQLR S.セレビシエーの発酵を前記の様にして（例17を参照の
こと）最少培地中で（前培養及び主培養）中で行う。
こと）最少培地中で（前培養及び主培養）中で行う。
例24.サッカロミセス・セレビシエー形質転換体BYSkex1
及びBYSKEX1の発酵培養からのヒルジン変形体HV1及びそ
の変異体の逆相HPLCによる分析 72時間の発酵の後、酵母培養液から遠心分離によりサ
ンプルを調製して透明な溶液を得、この溶液を1M酢酸に
より1:10（v/v）で稀釈し、そして次の条件下でHPLC分
析にかける。
及びBYSKEX1の発酵培養からのヒルジン変形体HV1及びそ
の変異体の逆相HPLCによる分析 72時間の発酵の後、酵母培養液から遠心分離によりサ
ンプルを調製して透明な溶液を得、この溶液を1M酢酸に
より1:10（v/v）で稀釈し、そして次の条件下でHPLC分
析にかける。
HIBAR（メルク）カラム（４×125mm）に逆相球状シリ
カ材料（MACHEREY-NAGEL）、５μｍの粒子直径及び100A
のポロシティーを有する球状固定相を充填する。カラム
の端にステンレス鋼フリットを装着する。移動相Ａは0.
1％（v/v）トリフルオロ酢酸を含有する水〔Nanopure
（商標）、BARNSTEAD〕から成る。移動相Ｂは20％の移
動相Ａ、及び0.075％（v/v）のトリフルオロ酢酸を含有
するアセトニトリル（HPLCグレード、FLUKA）80％（v/
v）から成る。
カ材料（MACHEREY-NAGEL）、５μｍの粒子直径及び100A
のポロシティーを有する球状固定相を充填する。カラム
の端にステンレス鋼フリットを装着する。移動相Ａは0.
1％（v/v）トリフルオロ酢酸を含有する水〔Nanopure
（商標）、BARNSTEAD〕から成る。移動相Ｂは20％の移
動相Ａ、及び0.075％（v/v）のトリフルオロ酢酸を含有
するアセトニトリル（HPLCグレード、FLUKA）80％（v/
v）から成る。
クロマトグラフ分離を次のグラジエントを用いてい1.
5ml/分の流速において行い、そして溶出液を216nmにお
ける吸光度によりモニターする。
5ml/分の流速において行い、そして溶出液を216nmにお
ける吸光度によりモニターする。
系の検定のための標準溶液を、1mlの水に1mgの純粋な
デスルファトヒルジンを溶解することにより調製する。
50μｌのこの標準液をカラムに注入し、そして上記のよ
うにクロマトグラフ処理して系を検定する。
デスルファトヒルジンを溶解することにより調製する。
50μｌのこの標準液をカラムに注入し、そして上記のよ
うにクロマトグラフ処理して系を検定する。
第８図に示す結果が明らかにするところによれば、S.
セレビシエーBYSKEX1により生産されるヒルジン分解生
成物とは異なる保持時間を有する全長ヒルジン（ヒルジ
ンHV1野性型、又は変異体HV1-KR,HV1-SFRY,HV1-WQLR）
をS.セレビシエ−BYSkex1が生産する。野性型ヒルジンH
V-1は、BYSKEX1において、全長HV-1（保持時間17.05
分）並びに２種類の分解生成物「HIR-64」（保持時間1
7.8分）及び「HIR-63」（保持時間15.33分）の典型的な
混合物を示す。BYSkex1は「HIR-65」（保持時間17.05
分）のみを生産する。変異体HV1-KRの場合、BYSKEX1は
２個のＣ−末端アミノ酸を欠く分解生成物〔「HIR-63」
（保持時間15.9分〕のみを生産し、他方BYSkex1は完全
な長さのHV1-KR（保持時間14.4分）を生産する。変異体
HV1-WQLRの場合、BYSKEX1は保持時間18.6分の分解生成
物を示し、BYSkex1は完全な長さのHV1-WQLR（保持時間1
7.3分）を支配的に生産し、そしてわずかに痕跡の分解
生成物を生産する。完全な長さのHV1-SFRYはBYSKEX1で
は痕跡（保持時間17.1分）のみ見出され、そしてBYSkex
1は無傷のHV1-SFRY（保持時間17.1分）のみを示す。大
きなピーク（保持時間15.7分）はHV1-SFRYと無関係であ
る。
セレビシエーBYSKEX1により生産されるヒルジン分解生
成物とは異なる保持時間を有する全長ヒルジン（ヒルジ
ンHV1野性型、又は変異体HV1-KR,HV1-SFRY,HV1-WQLR）
をS.セレビシエ−BYSkex1が生産する。野性型ヒルジンH
V-1は、BYSKEX1において、全長HV-1（保持時間17.05
分）並びに２種類の分解生成物「HIR-64」（保持時間1
7.8分）及び「HIR-63」（保持時間15.33分）の典型的な
混合物を示す。BYSkex1は「HIR-65」（保持時間17.05
分）のみを生産する。変異体HV1-KRの場合、BYSKEX1は
２個のＣ−末端アミノ酸を欠く分解生成物〔「HIR-63」
（保持時間15.9分〕のみを生産し、他方BYSkex1は完全
な長さのHV1-KR（保持時間14.4分）を生産する。変異体
HV1-WQLRの場合、BYSKEX1は保持時間18.6分の分解生成
物を示し、BYSkex1は完全な長さのHV1-WQLR（保持時間1
7.3分）を支配的に生産し、そしてわずかに痕跡の分解
生成物を生産する。完全な長さのHV1-SFRYはBYSKEX1で
は痕跡（保持時間17.1分）のみ見出され、そしてBYSkex
1は無傷のHV1-SFRY（保持時間17.1分）のみを示す。大
きなピーク（保持時間15.7分）はHV1-SFRYと無関係であ
る。
S.セレビシエーのKEX1株であるTr1210/pDP34/GAPFL-H
V1-KR,Tr1210/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY及びTr1210/pDP34/
GAPFL-HV1-WOLRを対応するkex1株であるTr1302/pDP34/G
APFL-HV1-KR,Tr1302/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY及びTr1302/
pDP34/GAPFL-HV1-WQLRと比較した場合に類似の結果が得
られる。
V1-KR,Tr1210/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY及びTr1210/pDP34/
GAPFL-HV1-WOLRを対応するkex1株であるTr1302/pDP34/G
APFL-HV1-KR,Tr1302/pDP34/GAPFL-HV1-SFRY及びTr1302/
pDP34/GAPFL-HV1-WQLRと比較した場合に類似の結果が得
られる。
微生物の寄託 次の微生物がDeutsche Sammlung von Mikroorganisme
n（DSM）,Mascheroder Weg 1b,D-3300 Braunschweigに
寄託されている。Saccharomyces cerevisial H449;1988年２月18日寄託;
DSM 4413。Escherichia coli JM109/pDP38;1988年２月19日寄託;D
SM 4414。Escherichia coli JM109/pDP34;1988年３月14日寄託;D
SM 4473。Saccharomyces cerevisial BYS232-31-42;1988年５月
６日寄託;DSM 4583。
n（DSM）,Mascheroder Weg 1b,D-3300 Braunschweigに
寄託されている。Saccharomyces cerevisial H449;1988年２月18日寄託;
DSM 4413。Escherichia coli JM109/pDP38;1988年２月19日寄託;D
SM 4414。Escherichia coli JM109/pDP34;1988年３月14日寄託;D
SM 4473。Saccharomyces cerevisial BYS232-31-42;1988年５月
６日寄託;DSM 4583。
第１図は、S.セレビシエーの形質転換されたKEX1株及び
kex1株から得られたデスルファトヒルジンのクロマトグ
ラフを示す。 第２図は、好ましい酵母コドンを有するPHOシグナル配
列を含有するヒルジンHV1遺伝子の生体外合成を示す模
式図である。使用される21オリゴデオキシヌクレオチド
は、それぞれ番号を付した線及び点線により示される。 第３図は、プラスミドpDP33の作製方法を模式的に示
す。 第４図は、プラスミドpDP34及びpDP38の作製方法を模式
的に示す。 第５図は、発現プラスミドpDP34/GAPFL-YHIRの作製方法
を模式的に示す。 第６図は、発現プラスミドpDP34/PHO5（−173）−YHIR
の作製方法を模式的に示す。 第７図は、プラスミドpDP92の作製方法を模式的に示
す。 第８図は、S.セレビシエーBYSKEX1及びBYSkex1の培養か
らのヒルジン変異体HV1-KR,HV1-WQLR及びHV1-SFRY並び
に野性形ヒルジンのクロマトグラフを示す。
kex1株から得られたデスルファトヒルジンのクロマトグ
ラフを示す。 第２図は、好ましい酵母コドンを有するPHOシグナル配
列を含有するヒルジンHV1遺伝子の生体外合成を示す模
式図である。使用される21オリゴデオキシヌクレオチド
は、それぞれ番号を付した線及び点線により示される。 第３図は、プラスミドpDP33の作製方法を模式的に示
す。 第４図は、プラスミドpDP34及びpDP38の作製方法を模式
的に示す。 第５図は、発現プラスミドpDP34/GAPFL-YHIRの作製方法
を模式的に示す。 第６図は、発現プラスミドpDP34/PHO5（−173）−YHIR
の作製方法を模式的に示す。 第７図は、プラスミドpDP92の作製方法を模式的に示
す。 第８図は、S.セレビシエーBYSKEX1及びBYSkex1の培養か
らのヒルジン変異体HV1-KR,HV1-WQLR及びHV1-SFRY並び
に野性形ヒルジンのクロマトグラフを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４４７３ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４５８３ (72)発明者 ケンジ タカバヤシ スイス国，4057 バーゼル，アメルバッハ シュトラーセ 43 (72)発明者 ディーター ハインリヒ ボルフ ドイツ連邦共和国，7803 グンデルフィン ゲン，リンデンシュトラーセ 61 (72)発明者 ユッタ ハイム スイス国，4433 ラムリンスブルグ，ツェ ルグリリンク 17 (56)参考文献 特開 昭62−224284（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開168342（ＥＰ，Ａ) Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ，６. 〔1987〕Ｐ．2157−2163 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ, 221〔1987〕Ｐ．423−426
Claims (10)
- 【請求項１】酵母にとって異種性の均一な形態の蛋白質
の製造方法であって、カルボキシペプチダーゼyscα活
性を欠き、且つyscA、yscB、yscY及びyscS活性から成る
群から選ばれたペプチダーゼ活性をさらに欠いており、
そして該異種蛋白質をコードするDNA配列に作用可能に
連結されている酵母プロモーターを含んで成るハイブリ
ドベクターにより形質転換されている酵母サッカロミセ
ス・セレビシエー（Saccharomyces serevisiae）を培養
し、そして該異種蛋白質を単離する、ことを特徴とする
方法。 - 【請求項２】前記ハイブリドベクターが、酵母プロモー
ター、該酵母プロモーターに作用可能に連結されている
シグナルペプチドをコードする第一DNA配列、該第一DNA
配列と適切なリーディングフレーム内に連結されている
異種蛋白質をコードする第二DNA配列及び酵母転写終止
シグナルを含有するDNA配列を含んで成る、請求項１に
記載の酵母にとって異種性の蛋白質の製造方法。 - 【請求項３】前記異種蛋白質がカルボキシペプチターゼ
yscαによる翻訳後Ｃ−末端分解に対して感受性であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記異種蛋白質の２個のＣ−末端アミノ酸
がLys、Arg、Tyr、Ala、Leu、Gln、Glu、Asp、Asn及びS
erから成る群から選択されたものである、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項５】前記異種蛋白質がデスルファトヒルジンで
ある、請求項２に記載の酵母にとって異種性である蛋白
質の製造方法。 - 【請求項６】デスルファトヒルジン変形体HV1の製造の
ための、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】異種性の蛋白質を均一な形態で製造するた
めの請求項１に記載の酵母サッカロミセス・セレビシエ
ー。 - 【請求項８】内因性２ミクロンDNAを含まず、そして無
傷のREP（２−ミクロンプラスミドの複製に使用される
遺伝子）１、REP2及びFLP遺伝子（逆転反復配列の組換
えによりプラスミドの異る形態のフリッピングを生じさ
せる特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子）並びに
無傷のORI（複製起点）、STB（有糸分裂の際に娘細胞に
２−ミクロンプラスミドを安定に伝達することを司る遺
伝子）、IR（逆方向反復配列）１及びIR（逆方向反復配
列）２部位を含有する完全な２ミクロンDNAを含んで成
るハイブリドベクターにより形質転換されている、請求
項７に記載の酵母。 - 【請求項９】前記ハイブリドベクターがMFα１プロモー
ター、GAL1プロモーター、解糖系酵素をコードする遺伝
子のプロモーター、TRPIプロモーター、及び上流活性化
部位を欠いている場合があるPHO5プロモーターから成る
群から選択された酵母プロモーターを含んで成る、請求
項８に記載の酵母。 - 【請求項１０】前記ハイブリドベクターが、ヒルジンシ
グナル配列；酵母インベルターゼ、α−ファクター、フ
ェロモンペプチダーゼ（KEX1）、「キラー・トキシン」
及び抑制性酸性ホスファターゼ（PHO5）の各遺伝子のシ
グナル配列及びプレプロ配列；並びにアスペルギルス・
アワモリ（Aspergillus awamori）からのグルコアミラ
ーゼシグナル配列から選択された、酵母プロモーターに
作用可能に連結されているシグナルペプチドをコードす
るDNA配列を含んで成る、請求項８又は９に記載の酵
母。
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