NO179046B

NO179046B - Fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt human enkelt kjede urokinase-type plasminogenaktivator

Info

Publication number: NO179046B
Application number: NO881615A
Authority: NO
Inventors: Bernd Meyhack; Jutta Heim; Rolf Burgi
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-04-15
Filing date: 1988-04-14
Publication date: 1996-04-15
Also published as: JPS63296689A; US5175105A; IL86058A; NO881615D0; NO179046C; FI881713A0; ES2061719T3; DK203588D0; MX168507B; FI98219B; IL86058A0; NO881615L; DE3888386T2; HUT46360A; HU204557B; AU1462688A; DD274053A5; MY103358A; FI98219C; NZ224243A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt human enkelt kjede uro-kinasetype plasminogenaktivator. Nevnte fremgangsmåte innbefatter bruk av gjærstammer som er genetisk omkonstruerte.

Urokinase eller urokinase-type plasminogenaktivator (nedenfor referert til som "u-Pa") er en serie protease som aktiverer plasminogen til plasmin ved proteolytisk spaltning. Plasmin er en potent protease som har evnen til å degradere fibrin-nettverket til blodpropper for å danne oppløselige degra-der ingsprodukter .

u-PÅ blir først isolert fra human urin og er også kjent for å bli utskilt av dyrkede nyreceller og noen svulstcellelinjer. u-PA blir opprinnelig produsert som et enkelt kjedemolekyl (nedenfor referert til som "scu-PA") og kan bli proteolytisk omdannet ved virkningen av plasmin til en to-kjedet form (nedenfor referert til som "tcu-PA") hvori de to kjedene forblir bundet til hverandre via en disulfidbro. u-PA har et unikt glykosyleringssete ved Asn302.

Siden scu-PA bare har mindre amidolytisk aktivitet mot lav molekylvekt syntetiske substrater, ble den helt til nylig sett på som en sann proteolytisk uaktiv forløper for det aktive enzymet tcu-PA. Nye resultater, beviser derimot at scu-PA aktiverer plasminogen til plasmin effektivt og at den har en betraktelig høyere selektivitet for fibrin enn tcu-PA [jfr. H.R. Lijnen et al., J. Biol.Chem. 261, 1253 (1986)]. Mekanismen for den overraskende fibrinolytiske aktiviteten og proppspesifisiteten til scu-PA er blitt undersøkt [Lijnen et al. supra; D. Coilen et al. J.Biol.Chem. 261, 1259 (1986)]. Det ble demonstrert at scu-PA ikke er et uaktivt zymogen, men aktiverer plasminogen uten å på forhånd ha vært transformert til tcu-PA. I motsetning til tcu-PA, blir scu-PA konkurrerende inhibert av en ennå ukjent plasmakomponent hvor inhibering blir reversert av fibrin eller fibrinfragmenter, dvs. ved proppen. Mens scu-PA sirkulerer i blodet under in vivo forhold, aktiverer den derfor Ikke plasminogen. scu-PA's fibrinolytiske aktivitet forblir begrenset til det ordentlige målet. I motsetning til dette, har tcu-PA evnen til å aktivere plasminogen på et hvilket som helst sted innenfor det sirkulatoriske systemet, som dermed medfører uønskede sideeffekter såsom blødning. Disse egenskapene gjør at scu-PA er den foretrukne urokinase-type plasminogenaktivatoren.

På grunn av rekombinant DNA-teknologi er det nå mulig å fremstille proteiner såsom scu-PA på industriell basis. Basert på den kjente strukturen til genomisk u-PA DNA [A. Riccio et al. Nucleic Acids Research 13, 2759 (1985)] og u-PA cDNA [W.E.Holmes et al. Biotechnology 3, 923 (1985)] er fremgangsmåter for fremstilling av scu-PA ved bruk av rekombinant DNA-teknologi blitt beskrevet i litteraturen. Ekspresjon i E. coli er dermed blitt oppnådd ved W.E. Holmes et al. (supra), P. Jacobs et al. [DNA 4, 139 (1985)], M.E. Vinkler et al. [Biochemistry 25, 4041 (1986)], M. Nagai et al. [Gene 36, 183 (1985)]; se også Belgisk patentnr. 900 826, Japansk patentnr. 61 181 377, og Europa patentsøknad nr. 92 182. Ekspresjon av scu-PA i dyreceller er beskrevet i Europa Patentsøknad nr. 92 182 og 154 272. Alle disse kjente fremgangsmåtene er ufordelaktige: Det har vist seg å være vanskelig å dyrke dyreceller i stor scala, som er en forutsetning for billig og innbringende fremstilling av proteiner produsert fra disse cellene. Generasjonstiden til dyreceller er betraktelig høyere enn for mikroorganismer, og medfører derfor til en forlenget fermenteringsperiode for å oppnå en tilstrekkelig høy celletetthet. Celletettheten, som tilveiebringes ved oppdyrking av dyreceller er betraktelig lavere enn celletettheten som generelt oppnås ved oppdyrking i stor scala av mikroorganismer. Stammeforbedringer er vanskelig å oppnå sammenlignet med mikroorganismer. På den andre siden, blir forurensende endoksiner ofte funnet i proteinpreparater fra E. coli. Disse må bli eliminert ved bruk av dyre og tidkrevende rensningssteg. Proteiner produsert av E. coli er nødvendigvis uglykosylerte fordi E. coli mangler det enzymatiske systemet som er ansvarlig for binding av karbohydratkjeder til hensiktsmessige kjeder i protein-molekyl. Rekombinant scu-PA er derfor, i motsetning til naturlig scu-PA, uglykosylert når fremstilt ved E. coli. Det ble rapportert at scu-PA produsert av E. coli eksisterer som en amorf uoppløselig polymer, på grunn av den ikke perfekte rekkefølgen av disulfidbroene og på grunn av en ikke korrekt folding av proteinet. Minst et refoldingssteg i tillegg som innbefatter store kvantiteter av oppløsningsmiddel er derfor nødvendig for å oppnå et biologisk aktivt protein (M.E. Vinkler et al., supra).

Tatt i betraktning av ulempene til kjente fremgangsmåter er det nødvendig med forbedrede fremgangsmåter som gjør det mulig for produksjon av biologisk aktiv scu-PA i stor scala. Det er en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe slike fremgangsmåter.

Det er overraskende blitt oppdaget at gjærceller transformert med en hybrid vektor som bærer den humane u-PA kodende sekvensen bundet til signalsekvensen til et gjærgen produserer scu-PA som har en biologisk aktivitet svarende til naturlig scu-PA og er gjærspesifikt glykosylert. En bør merke seg at gjær scu-PA er fullstendig aktivt uten noen in vitro refoldingsfremgangsmåte.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt human enkelt kjede urokinase-type plasminogenaktivator med formel I

Ser Asn Glu Leu His Gin Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gin His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu Gin Gin Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu Gin Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gin Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gin GLu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly X-^ X2 Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gin Cys Cly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Y1 Y2

Y3 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gin Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin Gly Glu Met Lys Phe Glu Val GLu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gin Pro Ser Arg Thr Ile Gin Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gin Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Z1 Ser Z2 Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gin Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gin Gin Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Ley Cys Ala Ala Asp Pro Gin Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gin Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu

hvor Xi og X2 uavhengig fra hverandre representerer Lys, et aminosyreresidie som er forskjellig fra et basisk aminosyreresidie eller en kjemisk binding, Y^ er Arg, et aminosyreresidie forskjellig fra et basisk aminosyreresidie eller en kjemisk binding, Y2 er Phe, et surt aminosyreresidie eller en kjemisk binding, Y3 er Lys, et aminosyreresidie som er forskjellig fra et basisk aminosyreresidie eller en kjemisk binding, Z± er Asn som er gjær-spesifikt glykosylert eller som er annet aminosyreresidie, og Z2 er Thr eller et annet aminosyreresidie forskjellig fra Ser, kjennetegnet ved at den innbefatter oppdyrking under hensiktsmessige naeringsbetingelser en gjærstamme transformert med en hybrid vektor inneholdende en gjaerekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment inneholdende en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid oppstrøms for og i leseramme med en andre DNA-sekvens som koder for biologisk aktiv urokinase-type

plasminogenaktivator, hvor DNA-segmentet er under transkripsjonen kontroll til nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens inneholdende transkripsjonstermineringssignaler til et gjærgen, og isolering av nevnte biologiske aktive urokinase-type plasminogenaktivator.

DNA-sekvens som koder for biologisk aktiv urokinase-type plasminogenaktivator kan omfatte alle allele former av u-PA som er kjent for å eksistere eller kan bli isolert fra det humane genomet. Disse DNA-sekvensene mangler pre- og/eller pro-sekvenser.

Mutanter av scu-PA er spesielt de mutantene som gjør proteinet proteaseresistent. Slike scu-PA mutanter er kovalent modifiserte ved proteolysesetene ved proteaser som er tilstede i blod såsom trombin eller plasmin, slik at de ikke lenger er mottagelige for proteasehydrolyse ved disse stedene. Målsetene innbefatter Lysl35 til Lysl36 (spalting ved dette setet danner den såkalte lavmolekylvektformen av scu-PA eller LUK; se figur 2 i vedlagte tegninger), Argl56 til Phel57 (mottagelig for trombinangrep) og Lysl58 til Ilel59 (spalting ved dette setet av plasmin danner tcu-PA). Egnede scu-PA mutanter har setespesifikke substitusjoner, insersjoner eller delesjoner av aminosyreresidier ved en eller flere av disse målsetene. Spesielt foretrukket er de mutanter hvori et aminosyreresidie eller begge aminosyreresidier som danner målsetene blir deletert eller hvori minst et av disse aminosyreresidiene blir erstattet av andre aminosyreresidier slik at de resulterende mutantene er resistente mot proteolytisk angrep.

I andre mutanter av scu-PA er det unike N-glykosyleringssetet ved Asn30<2> (Asn30<2->Ser-Thr) modifisert slik at glykosylering ikke kan skje ved dette setet. Det er velkjent at en forutsetning for N-bundet glykosylering i pattedyrceller er tilstedeværelse av tripeptidsekvensen -Asn-L-Thr(eller Ser)-hvori Asn er mottakeren og L kan være hvilken som helst av 20 genetisk kodede aminosyrene med unntagelse av prolin eller asparaginsyre hindrer glykosylering.

Betegnelsen "scu-PA proteiner" er ment å innbefatte scu-PA og mutanter derav.

Betegnelsen "aminosyreresidie" er ment å omfatte residiene til alle genetisk kodete aminosyrer, såsom sure aminosyreresidier, f.eks. residiene til glutaminsyre og asparginsyre, basisk aminsyreresidier, for eksempel residiene til arginin, lysin og histidin, og nøytrale aminosyreresidier, for eksempel residiene til asparagin, glutamin, glysin, alanin, leucin, isoleucin, serin, treonin, tyrosin eller prolin.

For å forhindre glykosylering ved N-glykosyleringssetet må tripeptidsekvensene som gjenkjennes som signaler for N-glykosylering bli forandret. Erstatning av Asn (Z^) og/eller (Z2) residiene i den ovenfor angitte tripeptide sekvensen med en hvilken som helst annen aminosyre ville forhindre dannelsen av glykosidiske bindinger ved dette setet. Modifikasjon av N-glykosyleringssetet blir ikke gjort på proteinnivå. Istedenfor, er det hensiktsmessig å modifisere genet som koder for scu-PA på en slik måte at ved ekspresjon av nevnte modifiserte gen i en vert blir en mutant scu-PA produsert hvori N-glykosyleringssetet er forandret på en slik måte at glykosylering ikke kan foregå ved dette setet. Spesielt blir asparagin substituert med valin, leucin, isoleucin, alanin eller, spesielt, glutamin, og treonin med valin, metionin eller, spesielt, alanin.

I en foretrukket fremstilling vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for produksjon av proteiner med formel I hvori % i er Lys, Gly eller Ser, X2 står for Lys, Y± er Arg, Y2 er Phe, Asp eller Glu, Y3 er Lys, Z± er Asn eller Gin og <Z>2 er Thr.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en plasminogenaktivator som er kjennetegnet ved at den innbefatter at den blir selektert fra gruppen bestående av scu-PA, [Glyl35]-scu-PA, [Serl35]-scu-PA, [Aspl57]-scu-PA, [Serl35,Aspl57]-scu-PA og [Glyl35,Aspl57]-scu-PA hvori Asn<3>^<2> er gjær spesifikt glykosylert, og videre [Gln302]-scu-PA, [Glyl35,Aspl57,Gln302]-scu-PA og [Serl35,Aspl57,Gln302]-scu-PA.

De transformerte gjærstammene i henhold til oppfinnelsen blir dyrket i et væskemedium inneholdende fordøyelige kilder av karbon, nitrogen og uorganiske salter.

Forskjellige karbonkilder kan benyttes. Eksempler på foretrukne karbonkilder er fordøyelige karbohydrater, såsom glukose, maltose, mannitol eller laktose, eller en acetat såsom natriumacetat, som enten kan bli brukt alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogenkilder innbefatter, for eksempel, aminosyrer, såsom casaminosyrer, peptider og proteiner og deres degraderingsprodukter, såsom trypton, pepton eller kjøttekstrakter, videre gjærekstrakt, malt-ekstrakt, maisekstraktvæske, og ammoniumsalter, såsom ammoniumklorid, sulfat eller nitrat, som enten kan bli brukt alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter som kan bli benyttet innbefatter for eksempel sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium. I tillegg så kan næringsmediumet også inneholde vekstfremmende stoffer. Stoffer som fremmer vekst innbefatter for eksempel sporelementer, såsom jern, sink, mangan og lignende, eller individuelle aminosyrer.

Gjærceller som inneholder hybride plasmider med en konstitu-tiv promoter (f.eks. ADHI, GAPDH) uttrykker u-PA-genet som er festet til nevnte promoter uten induksjon. Men hvis u-PA-genet er under kontroll av en regulert promoter (f.eks. PGK eller PH05) må sammensetningen av vekstmediumet bli adaptert for å oppnå maksimumsnivået av mRNA-transkripter, dvs. når PH05-promoteren blir brukt må vekstmediumet inneholde en liten konsentrasjon av uorganisk fosfat for derepresjon av denne promoteren.

Dyrking blir utført ved å benytte konvensjonelle teknikker. Dyrkingsbetingelsene, såsom temperatur, pE til mediumet og fermenteringstid blir valgt slik at maksimalnivåer av scu-PA proteiner blir produsert. En valgt gjaerstamme blir fortrinnsvis latt vokse under aerobe betingelser i nedsenket kultur med risting eller omrøring ved en temperatur på omtrent 25 til 35°C, fortrinns ved omtrent 28°C, ved en pH-verdi på fra 4 til 7, for eksempel ved omtrentelig pH 5, og i omtrent 20 til 50 timer, fortrinnsvis helt til et maksimalt utbytte av scu-PA proteiner er oppnådd.

Produsert scu-PA protein kan akkumulere innenfor gjærcellene eller kan bli skilt ut i periplasmaområdet. I tilfellet scu-PA proteinet er akkumulert innenfor cellene, består det første steget for utvinning av scu-PA-proteinet i frigjøring av proteinet fra cellen innside. I de fleste tilfeller blir celleveggen først fjernet ved enzymatisk fordøying med glukosidaser (infra). Deretter, blir de resulterende sferoplastene behandlet med detergenter, såsom "Triton" X-100. Alternativt så er mekaniske krefter, såsom kuttingkrefter (for eksempel X-press, French-press) eller rysting med glasskuler, er egnet for brekking av celler. Den resulterende blandingen blir anriket for scu-PA protein ved konvensjonelle fremgangsmåter, såsom fjerning av mesteparten av det ikke-proteinholdige materialet ved behandling med polyetylenimin, presipitasjon av proteinene ved bruk av ammoniumsulfat, gelelektroforese, dialyse, kromatografi, for eksempel, ionebyttekromatografi, størrelse-ekskluderingskromatografi, HPLC eller revers fase HPLC, molekylær gelfiltrering på en egnet "Sephadex" kolonne, eller lignende. Den endelige rensing av pre-renset produkt blir også, for eksempel, ved affinitetskromatografi, for eksempel antistoff-affinitetskromatografi, spesielt monoklonale antistoff-kromatografi ved bruk av monoklonale anti-u-PA-antlstoffer fiksert på en uoppløselig matrise ved bruk av kjente fremgangsmåter og lignende. En detergent, spesielt en ikke-ionisk detergent, såsom "Triton" X-100 eller "Tween 80", blir satt til alle bufferoppløsningene som blir brukt i rensingsstegene, for å forhindre adsorpsjon av scu-PA til karoverflåtene og for å forbedre stabiliteten. Detergenten kan bli tilsatt til en final konsentrasjon på 0.01-156.

I de tilfeller hvor scu-PA-proteinet blir skilt ut i periplasmaområdet av gjærcellene, kan en forenklet protokoll bli benyttet: Proteinet blir utvunnet uten cellelysis ved enzymatisk fjerning av celleveggen eller ved behandling med kjemiske midler, f.eks. tiolreagenser eller EDTA, som forårsaker celleveggsskader som tillater at det produserte scu-PA-proteinet blir frigjort. I det tilfellet hvor scu-PA proteinet blir skilt ut i kulturmediet, kan det bli utvunnet direkte derifra.

Avhengig av vertsstammen og rensningsfremgangsmåten som blir benyttet kan scu-PA-proteinet i henhold til foreliggende oppfinnelse være forurenset med små mengder av de korresponderende tokjedeformene som skyldes proteolytisk aktivitet frigjort fra vertsceller. Separasjon av tokjedeformen fra den ønskede enkjedeformen (scu-PA) blir tilveiebragt ved fremgangsmåter som blir kjent innenfor fagområdet såsom ved kromatografi på benzamidin-Sepharose [jfr. M.E. Vinkler et al. Biochemistry 25, 4041 (1986)].

Overraskende ble det oppdaget at scu-PA-proteinet i henhold til foreliggende oppfinnelse er forskjellig fra scu-PA-proteinet fra E.coli idet at de utviser biologisk aktivitet til naturlig humant scu-PA uten at det er nødvendig med noen refoldingfremgangsmåte og ved det at de er gjærspesifikt glykosylert ved Asn302. På grunn av gjærspesifikk glykosylering er scu-PA-proteinet i henhold til oppfinnelsen også forskjellig fra scu-PA isolert fra dyrkete eller transformerte dyreceller og dermed nye.

Oppfinnelsen vedrører spesielt fremgangsmåte for fremstilling av protein med formel I hvori er Lys, Gly eller Ser, X2 er Lys, Yi er Arg, Y2 er Phe, Asp eller Glu, Y3 er Lys, Z^ er Gin og Z2 er Thr.

De transformerte gjærstammene kan bli fremstilt ved rekombi-nante DNA-teknikker som innbefatter følgende steg preparering av et strukturelt gen som koder for scu-PA

eller en mutant derav,

inkorporering av det tilveiebragte strukturelle genet inne

i en hensiktsmessig vektor,

transformering av en egnet vertsorganisme med den produserte hybride vektoren

og selektering av transformerte verter fra ikke-transformerte verter.

Nukleotidsekvensene til u-PA cDNA og til genomisk u-PA DNA er kjente [W.E. Holmes et al., Biotechnology 3, 923 (1985); A. Riccio et al. Nucleic Acids Research 13, 2759 (1985)]. Ved at man kjenner cDNA og de genome DNA-sekvensene til u-PA kan det strukturelle genet som koder for u-PA eller en mutant derav bli fremstilt ved bruk av kjente fremgangsmåtene. Fremgangsmåtene for fremstilling av disse DNAene innbefatter isolering av mRNA fra humane celler som produserer scu-PA såsom humane kreftceller eller humane embryo nyreceller, selektering av det ønskede mRNA, f.eks. ved hybridisering med en egnet DNA-probe, preparering av enkelttrådet DNA komplementær til mRNA, deretter dobbelttrådet komplementær DNA (ds cDNA) derifra, eller isolering av genomisk DNA fra humane celler og selektering av det ønskede DNA ved bruk av en egnet DNA-probe, og, hvis nødvendig, mutering av cDNA eller genomisk DNA som er tilveiebragt, eller fremstilling av det strukturelle genet ved kjemisk syntese. Fortrinnsvis, så blir de strukturelle genene i henhold til oppfinnelsen fremstilt via mRNA-ruten og, hvis mutanter er ønskelig, ved mutagenese av den primært tilveiebragte u-PA cDNA. Det strukturelle genet som koder for en mutant u-PA kan bli fremstilt ved å kutte bort en del av DNA som inneholder kodonet(ene) for den uønskede aminosyre-residiet(ene) fra den modne foreldre u-PA-genet og erstatte det med et DNA-segment hvori nevnte kodon(er) har blitt substituert med kodon(er) som koder for det (de) ønskede aminosyreresidiet(ene), eller tilveiebringe deoksyribnukleo-tid substitusjonen ved bruk av seterettet mutagenese [jfr. M.J. Zoller et al. Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein et al. Science 229, 1193 (1985)].

De hybride vektorene i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter en gjærekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment bestående av en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid oppstrøms for og i leseramme med en andre DNA-sekvens som koder for moden urokinase-type plasminogenaktivator eller en mutant derav, hvor DNA-segmentet er under transkripsjonen kontroll til nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens som inneholder transkripsjonstermineringssginaler til et gjærgen.

Gjærekspresjonskontrollsekvenser blir avledet fra det genomiske DNA fra gjær, spesielt fra Saccharomyces cerevisiae. Ekspresjonskontrollsekvensen til et sterkt uttrykt gjærgen blir brukt for ekspresjon av scu-PA. Dermed, promoter til TRPl-genet, ADHI eller ADHII-genet, syrefosfatase (PH05) genet, en promoter til enolase, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 3-fosfoglyserat kinase (PGK), hekso-kinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat isomerase, 3-fosfoglycerat mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat isomerase, fosfoglukose isomerase og glukokinase gener, eller en promoter til gjær paring feromon-gener som koder for a- eller a-faktor, kan bli benyttet. Det er også mulig å bruke hybride promotere innbefattende oppstrøms aktiveringssekvenser (UAS) til et gjærgen og nedstrøms promoterelementer innbefattende en funksjonell TATA-boks til et annet gjærgen, for eksempel en hybrid promoter innbefattende UAS(ene) til gjær PH05-genet og nedstrøms promoter elementer som inneholder en funksjonell TATA-boks av gjær GAPDH-genet. Foretrukne vektorer til foreliggende oppfinnelse inneholder promotere med transkripsjonen kontroll. Promotere av denne type, f.eks. promoteren til PH05-genet og PH05-GAPDH hybride promotere, kan bli slått på eller av ved variasjon av vekstbetingelser. For eksempel, så kan PH05-promoteren bli hemmet hvis ønskelig, bare ved å øke konsen-trasjonen av uorganisk fosfat i mediumet. En annen foretrukket promoter i henhold til oppfinnelsen er promoteren til GAPDH-genet, spesielt funksjonelle fragmenter derav begynnede ved nukleotidene mellom -550 og -180, spesielt ved nukleotid -540, -263 eller -198, og som slutter ved nukleotid -5 ved GAPDH-genet.

DNA-sekvensen som koder et signalpeptid ("signalsekvens") blir fortrinnsvis avledet fra eukaryote, for eksempel humane eller gjær, gener som koder for polypeptider som vanligvis blir utskilt. Egnede signalsekvenser er, for eksempel, u-PA signal sekvensen tilveiebragt fra genomisk humant DNA, gjærsignalsekvenser, såsom signal og prepro sekvensene til gjærinvertase, a-faktor, feromon peptidase (KEX1), "drepende toksin" og undertrykt syrefosfatase (PH05) gener og glukoamy-lase signalsekvensen fra Aspergillus awamori. Alternativt, så kan sammensluttede signalsekvenser bli konstruert ved ligering av deler av signalsekvensen (hvis tilstede) av genet som naturlig er bundet til promoteren som blir brukt, med en del av u-PA signalsekvensen. Kombinasjoner som er gunstige er de som tillater en nøyaktig spalting mellom signalsekvensen og den modne scu-PA aminosyresekvensen. Tilleggssekvenser, såsom pro- eller spacer-sekvenser som enten inneholder spesifikke uttrykkingssignaler eller ikke kan også bli innbefattet i konstruksjoner for å lette nøyaktig uttrykking av forløper-molekyler. Alternative sammensluttede proteiner kan bli dannet som inneholder indre uttrykkings-signaler som tillater riktig modning in vivo eller in vitro. For eksempel, så inneholder uttrykkingssignalene et Lys-Arg residie, som blir oppdaget av en gjærendopeptidase som ligger i Golgi-membraner. De foretrukne signalsekvensene i henhold til foreliggende oppfinnelse er i gjær PH05-genet som koder for et signalpeptid med følgende formel: Met Phe Lys Ser Val Val Tyr SER Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala,

gjær invertasegen som koder for et signalpeptid med følgende formel:

Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala

Ala Lys Ile Ser Ala,

og det humane u-PA-genet som koder for et signalpeptid som har følgende formel:

Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu VAI

Val Ser Asp Ser Lys Gly.

En DNA-sekvens som inneholder gjær transkripsjon terminer-ingssignaler er fortrinnsvis den 3' flankerende sekvensen til et gjærgen som inneholder riktige signaler for transkrip-sjonsterminering og polyadenylering. Egnede 3' flankerende sekvenser er for eksempel de av gjærgenene som naturlig er bundet til ekspresjonskontrollsekvensen som blir benyttet. De foretrukne flankerende sekvensene er de til gjær PH05-genet.

Hybride plasmider inneholder bortsett fra promoteren, signalsekvens, DNA-sekvens som koder for u-PA eller en mutant derav og 3' flankerende sekvenser i tillegg DNA-sekvens(er) som utfører viktige funksjoner, for eksempel, ved propagering av celler transformert med nevnte hybride plasmider. Tilleggs DNA-sekvens(er) kan bli avledet fra prokaryote og/eller eukaryote celler og kan innbefatte kromosomal og/eller ekstra-kromosomale DNA-sekvenser. For eksempel, kan tilleggs DNA-sekvenser stamme fra (eller bestå av) plasmi DNA, såsom bakteriell eller eukaryot plasmid-DNA, viral DNA og/eller kromosomalt DNA, såsom bakteriell, gjær eller høyere eukaryotisk kromosomalt DNA. Foretrukne hybride plasmider inneholder tilleggs DNA-sekvenser avledet fra bakterielle plasmider, spesielt Escherichia coli plasmid pBR322 eller pUC19 relaterte plasmider, bakteriofag X, gjær 2p plasmid, og/eller gjærkromosomal DNA.

I de foretrukne hybride plasmidene bærer tilleggs DNA-sekvensene et gjær replikasjonsorigo, og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridplasmider inneholdende et gjær-replikasjonsorigo, f.eks. et autonomt replikerende segment-ers) er ekstrakromosomalt opprettholdt innenfor gjærcellen etter transformasjon og blir autonomt replikert ved mitose. Hybride plasmider som inneholder sekvenser som er homologe til gjær 2jj plasmid DNA kan også bli brukt. Disse hybride plasmidene rekombinerer med gjær 2jj plasmidene som allerede er tilstede innenfor cellen eller vil replikere autonomt på egen hånd hvis replikasjonsorigo er tilstede. 2p sekvenser er spesielt egnede for høy-frekvens transformasjonsplasmider og medfører høyt kopiantall.

Når det gjelder de selektive genmarkørene for gjær, kan et hvilken som helst markørgen bli benyttet som letter selek-sjonen for transformanter på grunn av den fenotypiske ekspresjonen av markøren. Egnede dominante markører for gjær er spesielt de som uttrykker antibiotikaresistens eller, når det gjelder auxotrofe gjærmutanter, gener som komplementerer vertslesjoner. Korresponderende gener medfører, for eksempel, resistens mot antibiotika G418 eller hygromycin eller tilveiebringer prototrofi i en auxotrof gjærmutant, for eksempel URA3, LEU2, HIS3 eller TRP1 genet.

Tilleggs DNA-sekvensene som er tilstede i de hybride plasmidene i henhold til oppfinnelsen innbefatter også et replikasjonsorigo og en selektiv genetisk markør for en bakteriell vert, spesielt Escherichia coli. Nyttige egenskaper er assosiert med nærvær av et E. coli replikasjonsorigo og en E. coli markør i en gjærhybridplasmid. For det første kan store mengder av hybrid plasmid DNA bli tilveiebragt ved vekst og amplifisering i E. coli, og for det andre, er det hensiktsmessig å konstruere hybride plasmider i E. coli ved bruk av hele repertoaret av kloningsteknologi som er basert på E. coli. E. coli-plasmider såsom pBR322 og lignende, inneholder både E. coli replikasjonsorigo og E. coli genetiske markører som medfører resitens mot antibiotika, for eksempel tetra-cyklin og ampicillin, og er fordelaktig benyttet som del av gjærhybridvektorer.

Tilleggs DNA-sekvenser som inneholder, for eksempel, replikasjonsorigo og genetiske markører for gjær og en bakteriell vert (se ovenfor) er heri etter referert til som "vektor DNA" som sammen med gjærpromoteren og scu-PA protein kodende regionen danner et hybrid plasmid i henhold til oppfinnelsen.

Hybride vektorer blir fremstilt ved bruk av fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet, f.eks. ved å koble en gjærekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment bestående av det signalpeptidkodende området og en DNA-sekvens som koder for u-PA eller en mutant derav, 3'-flankerende sekvensen til et gjærgen og vektor-DNA.

For fremstilling av hybride plasmider, kan hensiktsmessige kartlagte sirkulære vektor-DNA, for eksempel bakterielt plasmid-DNA eller lignende (se ovenfor), som minst har et restriksjonssete, fortrinnsvis to eller mere restriksjonsseter, bli benyttet. Vektor-DNA inneholder fortrinnsvis allerede replikasjonsorigoer og genmarkører for gjær og/eller en bakteriell vert. Vektor-DNA blir spaltet ved bruk av en hensiktsmessig restriksjonsendonuklease. DNA som er blitt utsatt for restriksjonsendonuklease blir legert til DNA-fragmentet(ene) som inneholder gjærekspresjonskontrollsekven-sen, nevnte DNA-segment og nevnte DNA-sekvens inneholdende transkripsjonsterorineringssignaler. Før eller etter binding av nevnte DNA-fragment(ene) (eller samtidig med), er det også mulig å innføre replikasjonsorigoer og/eller markører for gjær eller en bakteriell vert. I alle tilfeller, velges restriksjons- og ligeringsbetingelsene på en slik måte slik at det ikke er noen innblanding med de essensielle funksjoner til vektor-DNA og til ekspresjonskontrollsekvens. Den hybride vektoren kan bli bygget opp sekvensielt eller ved ligering av to DNA-segmenter som inneholder alle sekvenser som er av interesse.

Forskjellige teknikker kan bli benyttet til å feste DNA-segmentene in vitro. Butte ender (DNA-duplekser som er helt base-paret) som blir dannet av visse restriksjonsendonuklea-ser kan bli ligert med T4 DNA-ligase. Vanligvis, blir DNA-segmentene festet ved deres enkelt-trådete kohesive ender og kovalent lukket av DNA-ligase, f.eks. T4 DNA-ligase. Slike enkelt-trådet "kohesive termini" kan bli dannet ved å spalte DNA med en annen endonukleaseklasse som danner overhengende ende (de to trådene i DNA-dupleksen blir spaltet ved forskjellige steder med en avstand på noen få nukleotider). Enkelttråder kan også bli dannet ved å tilføye nukleotider til butte ender eller overhengende ender ved bruk av terminal transferase ("homopolymerisk vedheng") eller ved å spise en tråd av et butt-endet DNA-segment med en egnet eksonuklease, såsom X eksonuklease. En annen fremgangsmåte for å danne overhengende ender innbefatter ligering til det butt-endete DNA-segmentet et kjemisk syntetisert linker-DNA som inneholder et gjenkjenningssete for en overhengende-ende dannende endonuklease og spalting av det resulterende DNAet med den respektive endonukleasen.

Komponentene til den hybride vektoren såsom gjærpromoter, strukturelle genet for u-PA eller en mutant derav innbefattende en signalsekvens, transkripsjonsterminator, replikasjonssystem osv., er festet sammen i en forutbestemt rekkefølge for å forsikre riktig funksjon. Komponentene er festet gjennom felles restriksjonsseter eller ved syntetiske linkermolekyler for å forsikre riktig orientering og rekkefølge av komponentene.

De transformerte gjærstammene blir laget ved bruk av kjente fremgangsmåter, transformering av en gjærstamme med en hybrid vektor inneholdende en gjærekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment inneholdende en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid oppstrøms og i leseramme med en andre DNA-sekvens som koder for fullt utviklet urokinase-type plasminogenaktivator eller en mutant derav, hvor DNA-segmentet er under transkripsjonen kontroll til nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens inneholdende transkripsjonstermineringssignaler til et gjærgen.

Egnede gjærvertsorganismer innbefatter arter fra Kluyvero-myces, Candida, Pichia, Saccharomyces, Yarrowia, Torulopsis og relaterte slekter (jfr. J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam 1971), spesielt stammene til Saccharomyces cerevisiae.

Transformasjon av gjærvertscellene tilveiebringes ved kjente fremgangsmåter. For eksempel, kan transformasjon bli tilveiebragt i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929(1978)]. Denne fremgangsmåten kan bli delt i tre steg:

(1) Fjerning av gjærcelleveggen eller deler derav.

(2) Behandling av "nakne" gjærceller (sferoplaster) med den transformerende DNA i nærvær av PEG (polyetylenglykol) og Ca<2+> ioner. (3) Regenerering av celleveggen og seleksjon av de transformerte cellene i agar med fast lag.

Foretrukket fremgangsmåte:

ad (1): Gjærcelleveggen blir fjernet enzymatisk ved bruk av forskjellige preparater av glukosidaser, såsom snegle tarmsafter (f.eks. Glusulase eller Helicase) eller enzym- blandinger tilveiebragt fra mikroorganismer (f.eks. Zymolyase) i osmotisk stabiliserte oppløsninger (f.eks. 1 M sorbitol).

ad (2): Gjær-sferoplaster aggregerer i nærvær av PEG og lokale fusjoner av cytoplasmamembranene blir indusert. Dannelse av "fusjons-1ignende" betingelser er av avgjørende betydning og mange transformerte gjærceller blir diploide eller triploide i løpet av transformasjon. Fremgangsmåter som tillater seleksjon av fuserte sferoplaster kan bli brukt for å anrike transformanter, dvs. transformerte celler kan lett bli utsortert fra preselekterte fusjonsprodukter.

ad (3): Siden gjærceller uten cellevegg ikke deler seg må celleveggen bli regenerert. Denne regenereringen blir hensiktsmessig utført ved å nedsenke sferoplastene i agar. For eksempel, så blir smeltet agar (omtrent 50°C) blandet med sferoplastene. Ved avkjøling av oppløsningen til gjærvekst-temperaturer (omtrent 30°C), dannes et fast lag. Dette agarlaget benyttes for å forhindre rask diffusjon og tap av essensielle makromolekyler fra sferoplastene og dermed lette regenerering av celleveggen. Celleveggregenerering kan også tilveiebringes (men med lav effektivitet) ved utsåing av sferoplastene på overflaten av ferdiglagete agarlag.

Regenereringsagaren blir fremstilt på en slik måte at den tillater regenerering og seleksjon av transformerte celler på samme tid. Siden gjærgener som koder for enzymer til amio-syre-biosyntetiske veier vanligvis blir benyttet som selektive markører (ovenfor), utføres regenereringen i gjærminimal mediumagar. Hvis det er nødvendig med veldig høy effektivitet på regenereringen er følgende to steg fordelaktige: (1) regenerering av celleveggen i et rikt kompleks medium, og (2) seleksjon av de transformerte cellene ved kopiutsåing (replica plating) cellelaget på selektive agarskåler.

Hvis den hybride vektoren ikke inneholder markørgen kan de transformerte cellene også bli identifisert ved bruk av alternative fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter innbefatter, for eksempel, in situ hybridisasjon med et merket DNA-fragment som er homolog til sekvensene til den hybride vektoren [f.eks. i henhold til Hinnen et al., ovenfor], in situ immunoanalyser hvis et antistoff for produktet til det innførte genet er tilgjengelig, eller andre utsorteringsfrem-gangsmåter som måler genprodukter som er kodet av det transformerende plasmidet(ene).

Alternativt, så kan gjær bli ko-transformert med en hybrid vektor i henhold til oppfinnelsen og en andre vektor inneholdende en genetisk markør for gjær. Hvis de to forskjellige vektorene har DNA-sekvenser som er felles (disse kan være bakterielle sekvenser), foregår rekombinasjon som fører til et fusert selekterbart hybrid molekyl.

De transformerte gjærstammene som inneholder de hybride plasmidene kan bli forbedret når det gjelder produksjon av scu-PA eller mutanter derav ved mutasjon og seleksjon ved bruk av kjente fremgangsmåter. Mutasjon kan tilveiebringes, for eksempel, ved U.V. bestråling eller egnede kjemiske reagenser. Spesielt foretrukket er produksjon av protease-manglende mutanter, spesielt gjærmutanter, for å forhindre proteolytisk nedbryting av det produserte scu-PA eller mutanter derav innenfor cellene. Egnede mutanter kan bli selektert og isolert ved konvensjonelle fremgangsmåter.

scu-PA-proteiner, tilveiebragt i henhold til foreliggende oppfinnelse, spesielt nye scu-PA-proteiner, tilveiebringer verdifulle farmakologiske egenskaper. De kan bli benyttet i analogi til kjente plasminogenaktivatorer i mennesker for forhindring eller behandling av blodpropp eller andre tilstander hvor det er ønskelig å produsere lokal fibrinolyt-isk eller proteolytisk aktivitet via plasminogenaktiverings-mekanismen, såsom åreforkalkning, hjertemuskel infarkt og

hjerneslag, blodpropp i venene, tromboemboli, post-operativ blodpropp, tromboflebitis og diabetisk vaskulopaties.

Farmasøytiske preparater som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av det aktive ingredienset (scu-PA eller mutanter derav) sammen med en organisk eller uorganisk, fast eller væske farmasøytisk akseptable bærere som er egnede for parenteral, såsom intravenøs, administrering og som ikke på en skadelig måte reagerer med de aktive ingredienser kan bli dannet.

Det finnes egnede infusjonsoppløsninger, fortrinnsvis vannholdige oppløsninger eller suspensjoner, som det er mulig å fremstille før bruk, for eksempel fra frysetørrede preparater som inneholder det aktive ingredienset alene eller sammen med en bærer, såsom mannitol, laktose, glukose, albumin og lignende. Det farmasøytiske preparatet kan bli sterilisert og, hvis ønskelig, blandet med tilsetningsstoffer, for eksempel konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, emulger-ingsmidler, oppløsningsmidler, buffere og/eller salter, såsom natriumklorid, for regulering av det osmotiske trykket. Sterilisering kan bli tilveiebragt ved steril filtrering gjennom filtere med liten porestørrelse (0,45 jjm diameter eller mindre) hvorpå preparatene kan bli frysetørret, hvis ønskelig. Antibiotika kan også bli tilsatt for å bevare steriliteten. For eksempel, er scu-Pa-protein i henhold til oppfinnelsen formulert i en sterilisert vannholdig oppløsning inneholdende 556 glukose og eventuelt stabiliseringsmidler og salter.

De farmasøytiske preparater er fordelt i enhetlige doserings-former, for eksempel ampuller, innbefattende 1 til 2000 mg av en farmasøytisk akseptabel bærer pr. enhetsdosering og omtrent 1 til 20 mg, fortrinnsvis omtrent 3 til 15 mg, av det aktive ingredienset (scu-PA eller en mutant derav) per enhetsdosering.

Avhengig av type sykdom og alder og pasientens tilstand, er den daglige dosen som blir administrert for behandling av en pasient som omtrent veier 70 kg i et område fra 20 til 150 mg, fortrinnsvis fra 45 til 100 mg, pr. 24 timer.

Beskrivelse av tegningene.

I den følgende eksperimentelle delen er forskjellige frem-stillinger av foreliggende oppfinnelse beskrevet med refer-anse til vedlagte tegninger hvori: Fig. 1 er et restriksjonsendonukleasekart av humant u-PA cDNA. Fig. 2 illustrerer den nukleotide sekvensen og utledet aminosyresekvens til humant u-PA cDNA. Den første aminosyren til det fullt utviklede protein er understreket. Fig. 3 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pCS16. Fig. 4 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pCS16/UPA inneholdende u-PA cDNA. Fig. 5 er et skjematisk diagram som viser konstruksjonen av plasmid pJDB207/PH05-I-UPA (forkortelser som blir benyttet: SS signalsekvens; t transkripsjonsterminator; p promoter; L linker). Fig. 6 tilveiebringer DNA-sekvensen til promoterregionen til

GAPDH.

Fig. 7 illustrerer skjematisk konstruksjonen av plasmid p31GAPDL-IT. Fig. 8 illustrerer promoterelementene til GAPDH-genet som blir brukt i foreliggende oppfinnelse. Fig. 9 viser skjematisk konstruksjonen av plasmid pJDB2 07/GAPDL-I-UPA. Fig. 10 er et skjematisk diagram som illustrerer konstruksjonen av plasmid pJDB207/GAPDL-UPA. Fig. 11 og fig. 12 viser skjematisk konstruksjonen av plasmid pDP38 via plasmid pDP33. Fig. 13 tilveiebringer DNA-sekvensen til de muterte u-PA-genene og de korresponderende aminosyresekvensene til mutant scu-PA-proteiner i henhold til oppfinnelsen.

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse og innbefatter ikke en begrensning derav.

Eksempel 1: Konstruksjon av plasmid pCS16/ UPA inneholdende den u- PA- kodende regionen

A) Konstruksjon av plasmid pCS16 ( se fig. 3)

Et 1.5 kb Pstl-BamHI fragment av plasmid pUN121 [B. Nilsson et al. Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)] inneholder cl-genet til fag lambda og deler av tetracyklinresistensgenet blir klonet inn i pUC18 [J. Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)], spaltet med Pstl og BamHI. Den resulterende klonen blir spaltet med Pstl. De 3'-overhengende endene blir fjernet i en reaksjon med T4 DNA-polymerase [T. Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), s. 395] og Xhol linkere (5'-CCTGGAGG-3', Biolabs) blir ligert til butte ender. Etter spalting med Xhol blir molekylet igjen sirkularisert ved ligering. En aliquot av ligeringsblandingen blir brukt til å transformere Ca<++> behandlede E.coli EBlOl-celler. DNAet til individuelle ampicillin resistenter, transformerte kolonier blir analysert. En av flere riktige kloner blir valgt og referert til som pCS16.

B) Konstruksjon av plasmid pCS16/ UPA ( se fig. 4)

Urokinase cDNA blir fremstilt fra mRNA tilveiebragt fra humane Hep3-celler [jfr. T. Maniatis et al., s. 188-246, ovenfor]. Et 1.3 kb Smal-BamHI fragment og et 1 kb BamHI-EcoRi fragment av u-PA cDNA blir klonet inn i Smal, EcoRI setene til pUN121 [B. Nilsson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)] som gir plasmid pcUK176. Restriksjons-endonukleasekartet til det humane u-PA cDNA innskuddet er vist i fig. 1. Nukleotidsekvensen og avledet aminosyresekvens til u-PA innskuddet er gitt i fig. 2. u-PA cDNA innskuddet blir subklonet inn i plasmid pCS16. Subklonet cDNA rekker fra Smal setet i 5' ikketranslatert region (fig. 1) til PvuII-setet ved nukleotidposisjonene 1439-1444 (fig. 2) i 3' ikke-translaterte regionen.

15 jig plasmid pcUK176 blir spaltet med PvuII. Det 379 bp PvulI-fragmentet blir separert fra andre fragmenter på en 1.5 & agarosegel i Tris-borat-EDTA-buffer pH 8.3. DNAet blir elektroeluert, renset ved DE52 (Whatman) ionebyttekromatografi og presipitert med etanol. 1.2 jig enkelttrådet Xhol-linkere (5'-CCTCGAGG-3') blir fosforylert ved 5' endene, varmet opp i 10 min ved 75°C, selvsammensmelting i løpet av avkjøling til romtemperatur og lagring ved -20° C. 0.9 jig av det kinasebehandlede, dobbelttrådete Xhol-linkere blir ligert ved et 80-ganger molart overskudd til de butte endene av 379 bp Pvul I-fragmentet til pcUK176 (se ovenfor) i 20 jjI 60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3.5 mM ATP og 400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 16 timer. Blandingen blir varmet opp i 10 minutter ved 85"C. Linkermolekyler i overskudd blir fjernet ved presipitering med 0.54 volum isopropanol i nærvær av 10 mM EDTA og 300 mM natriumacetat pH 6.0 i 30 min. ved romtemperatur. DNAet blir spaltet med Xhol og BamHI. Et 121 bp BamHI-XhoI fragment blir isolert på en 1.5 1o agarosegel i Tris-borat-EDTA-buf f er pH 8.3. 6 jig plasmid pcUK176 blir spaltet med Smal og BamHI. Et 1.3 kb Smal-BamHI fragment bestående av mesteparten av u-PA kodende sekvensen blir isolert. 6 jig plasmid pCS16 blir spaltet med

Smal og Xhol. 2.7 kb vektorf ragmentet blir isolert. DNA-fragmentene blir elektroeluert fra gelen og etanol presipitert. 0.2 pmol av 1.3 kb Smal-BamHI fragment, 0.2 pmol av 121 bp BamHI-XhoI fragmentet (begge fragmentene sammen innbefatter hele u-PA kodende sekvens) og 0.1 pmol av 2.7 kb vektor-fragmenter blir ligert i 10 pl 60 mM Tris.HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3.5 mM ATP og 400 enheter T4 DNA-ligase ved 15°C. En og 3 pl aliquoter av ligeringsblandingen blir satt til 100 jjI Ca<++->behandlet E.coli HBlOl-celler. Transformer-ingen blir utført som beskrevet [A. Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. 12 ampicillin-resistente kolonier blir latt vokse i LB-medium inneholdende 100 mg/l ampicillin. DNA blir isolert i henhold til Holmes et al.

[Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] og analysert ved EcoRI, PvuII og Xhol restriksjonsspaltinger. Plasmid DNA av en enkelt klon med de ventede restriksjonsfragmentene er referert til som pCS16/UPA.

På en analog måte blir urokinase cDNA fra Smal-setet (nukleotidposisjoner 1-6, fig. 2) til Pstl-setet ved nukleotidposisjonene 1637-1642 (se fig. 2) blir subklonet i plasmid pCS16. Plasmid pcUK176 blir spaltet med Pstl. Overhengende ender blir omdannet til butte ender i en reaksjon med T4 DNA-polymerase som beskrevet av Maniatis et al. (ovenfor, s. 395). Det 1.2 kb DNA-fragmentet blir isolert. Xhol-linkere blir satt til som beskrevet ovenfor. DNAet blir spaltet med BamHI og Xhol og et 315 bp BamHI-Xhol-fragment blir isolert. 0.2 pmol av dette fragmentet blir ligert til det 1.3 kb Smal-BamHI fragmentet og 2.7 kb vektorfragmentet (se ovenfor). Ligeringsblandingen blir brukt til å transformere E. coli HB101 Ca<++> celler. Plasmid DNA fra en enkelt klon med de ventede restriksjonsfragmentene er referert til som pCS16/UPA-13. Dette plasmidet inneholder u-PA cDNA innskuddet fra Smal setet i 5' ikketranslaterte regionen (fig. 1) til Pstl-setet ved nukleotidposisjon 1641 (fig. 2) i 3' ikketranslatert region. Den eneste forskjellen i henhold til plasmid pCS16/UPA er den utvidete 3' ikke-translaterte regionen.

Eksempel 2: Konstruksjon av plasmid p31RIT- 12 inneholdende PH05 promoter og invertase signalsekvensen

A) Fremstilling av oligodeoksyribonukleotider for invertasesignalsekvens: Fire oligodeoksyribonukleotider: I-l, 1-2, 1-3, 1-4 blir fremstilt ved bruk av DNA-syntesemaskin (modell 380B Applied Biosystems). Etter deblokkering blir fragmentene renset på en 12 % polyakrylamidgel inneholdende 8 M urea. Salt-frie rene oligodeoksyribonukleotider blir tilveiebragt ved bruk av Sep. Pak (Waters Associates). Disse fragmentene består av en dupleks som koder for invertasesignalsekvensen med de ofte brukte gjærkodonene.

B) Subkloning av invertasesignalsekvens i plasmid p31

a) Fremstilling av vektor:

1.5 pg p31R/SS-TPAA2 (Europa patentsøknad nr. 143,081) blir

spaltet med 10 TJ EcoRI (Boehringer) i 50 pl 10 mM Tris.HCl pH 7.5, 6 mM MgClg, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanol i en time ved 37°C. Etter tilsetting av 1 pl 2.5 M NaCl, 10 U Xhol (Boehringer) blir tilsatt og inkubert ved 37°C i en time. 4.2 kb vektoren blir isolert på en 0.856 preparativ agarosegel. Gelbiten blir overført til et Micro Colloidor rør (Sartorius GmbH), og dekket med 200 pl TE og elektroeluert (elektro-forert ved 90 mA i 50 min. ) TE-oppløsningen blir samlet og

presipitert i 2.5 volumer absolutt etanol etter tilsetting av 0.1 volum 10 x TNE. DNA-pelleten blir vasket med kald 80$ etanol og tørket i vakuum. DNAet blir resuspendert i 6 pl TE (40 pmol/pl). b) Sammensmelting av oligodeoksyribonukleotid ( I- l. 1- 2. 1- 3.

1- 4), kinasebehandling og ligering med vektor

En oppløsning inneholdende 10 pmol av hver av de fire deoksyribonukleotidene i 10 pl på 0.5 M Tris.HCl pH 8 blir inkubert på 95°C i 5 minutter på et vannbad. Vannbadet blir sakte avkjølt i 30° C over en periode på 5 timer. Til denne sammensmeltningsblandingen blir 2 pl av hver av 0.1 M MgClg, 0.1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ATP og 8 U (1 pl) polynukleotidkinase (Boehringer). Kinasebehandling blir utført ved 37°C i en time. Sammensmeltet, kinasebehandlet oligodeoksyribonu-kleotidene og 60 pmol av p31R/SS-TPAA2 EcoRI-XhoI spaltet vektor (1.5 pl) blir ligert med 400 U (1 pl) T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 14°C i 17 timer. Reaksjonen blir stoppet ved inkubering ved 65°C i 10 min. 10 pl av denne ligeringsblandingen blir brukt for transformasjon av E. coli HB101 Ca<++ >celler [M. Dagert og S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979)]. 20 amp<R> kolonier blir plukket, DNA blir fremstilt ved den raske isoleringsfremgangsmåten [D.S. Holmes og M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)]. DNA blir spaltet med EcoRI og Xhol, radioaktivt merket med EcoRI-enden og analysert på en 6$ polyakrylamidgel inneholdende 8 M urea ved bruk av radioaktiv merket pBR322 Haelll spaltet DNA som markør. Bånd i riktig størrelse er observert for DNA fra alle 20 klonene. En klon blir latt vokse i 100 ml LB-medium inneholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA blir isolert og er referert til som p31RIT-12.

Eksempel 3: Konstruksjon av plasmid pJDB207/ PHO5- I- UPA (fig. 5).

pJDB207/PH05-I-UPA inneholder PH05-promoteren, invertasesignalsekvensen, den kodende sekvensen til fullt utviklet

urokinase og PH05 transkripsjonsterminatoren i en tandem oppstilling klonet inn i pJDB207 gjærekspresjonsvektoren. 20 pg av plasmid pCS16/UPA blir fullstendig spaltet med 40 enheter EcoRI. Etter fenolekstraksjon og etanolpresipitasjon blir det EcoRI-spaltetde DNAet videre spaltet med Taql ved 65°C. De resulterende fragmentene blir separert på en preparativ 1.2 # agarosegel. Det 462 bp Taql-EcoRI fragmentet blir isolert ved elektroeluering fra gelen og etanolpresipi-tas jon .

En oligodeoksyribonukleotidlinker med formelen

blir ligert til Taql-setet av DNA-fragmentet. Linkeren gjenoppretter 5' terminus til den kodende sekvensen til fullt utviklet u-PA (nukleotidene 130-154, fig. 2) og etablerer i rammefusjon til invertasesignalsekvensen. 5'-CTGCA-sekvensen til linkeren fyller den korresponderende 3' inngående enden til invertasesignalsekvensen dannet ved Hgal-spalting.

300 pmol av hver av oligodesoksynukleotid I og II blir fosforylert og sammensmeltet. 5.25 pg (600 pmol) av fosforylert, dobbelt-trådet linker DNA blir ligert til 1.7 pg (5.6 pmol) av 462 bp Taql-EcoRI-fragment (se ovenfor) i 175 pl 60 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT og 800 enheter T4 DNA-ligase ved 15°C i 16 timer. T4 DNA-ligase blir inaktivert i 10 min. ved 85°C. Linkeroverskuddet blir fjernet ved presipitasjon i nærvær av 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH 6.0 og 0.54 volumer isopropanol. DNAet blir spaltet med Pstl. Et unikt 312 bp fragment blir isolert inneholdende linkeren festet til DNA-sekvensene kodende for u-PA opp til nukleotid 436 (Pstl-setet, se fig. 2). DNA-fragmentet blir renset ved elektroeluering og presipitering med etanol.

Plasmid pCS16/UPA blir spaltet med Xhol og Pstl. Et 1007 hp Pstl-Xhol fragment blir isolert og renset. Dette fragmentet inneholder mesteparten av den kodende sekvensen for urokinase.

Plasmid p31RIT-12 (se eksempel 2) blir spaltet med Sali og Xhol. Et 882 bp Sall-Xhol fragment blir isolert fra gelen ved elektroeluering og etanolpresipitering. Fragmentet blir videre spaltet med BamHI og Hgal. Et 591 bp BamHI-Hgal fragment blir isolert som inneholder PH05-promoterregionen til invertasesignalsekvensen.

Plasmid pJDB207/PH05-TPA 18 (se Europa patentsøknad nr. 143,081) blir spaltet med BamHI og Xhol. 6.8 kb vektorfragmentet blir isolert på en preparativ 0. b% agarosegel i Tris-acetatbuffer pH 8.2. DNAet blir elektroeluert og presipitert med etanol.

Alle DNA-fragmentene blir resuspendert i vann HgO ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl. 0.2 pmol av 591 bp BamHI-Hgal fragmentet, 0.2 pmol av 312 bp Hgal-Pstl fragmentet, 0.2 pmol 1007 bp Pstl-Xhol fragment og 0.1 pmol av 6.8 kb BamHI-XhoI vektorf ragmentet blir ligert i 15 t ved 15° C i 10 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheter T4 DNA-ligase. En pl av ligeringsblandingen blir brukt til å transformere E. coli HB101 Ca<++> celler. 12 amp<R >kolonier blir plukket og latt vokse i LB-medium inneholdende 100 mg/l ampicillin. DNA blir fremstilt ved den raske isoleringsfremgangsmåten [D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. Ved restriksjonsspalting av plasmid DNA med Hindlll og EcoRI blir de ventede restriksjonsfragmentene observert. Plasmid DNA fra en enkelt klon blir selektert og referert til som pJDB207/PH05-I-UPA.

Eksempel 4: Konstruksjon av plasmid pJDB207/ PH05- UPA

Denne konstruksjonen innbefatter PH05-promoteren, PH05-signalsekvensen festet i riktig leseramme til den kodende

sekvensen til fullt utviklede kinase og PH05-transkripsjonsterminatoren klonet inn i pJDB207 gjærvektoren.

En oligodesoksyribonukleotid linker med formelen

(I) 5'-CCAATGCAAGCAATGAACTTCATCAÅGTTCCAT-3 *

(II) 3'-GGTTACGTTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5 *

tilveiebringer 8 nukleotider (5'-CCAATGCA) av PH05 signalsekvensen (fra et indre Ball sete til prosesseringssetet) og tilveiebringer en i ramme fusjon til den kodende sekvensen til fullt utviklet u-PA (nukleotidposisjoner 130-154, fig. 2). Linkeren blir ligert til Taql-setet av 462 bp Taql-EcoEI fragmentet til pCS16/UPA (se eksempel 3). Fosforylering, sammensmelting og ligering blir utført i henhold til eksempel 3. DNAet blir kuttet med Ball og Pstl. Et 315 bp fragment blir isolert. DNA-fragmentet inneholder DNA-sekvensen til u-PA-genet opp til Pstl-setet ved posisjon 436 (fig. 2).

Plasmid p31 (se Europa Patentsøknad nr. 100,561) blir spaltet med Ball og BamHI. Et 584 bp BamHI-Ball fragment blir isolert inneholdende PH05 promoter og mesteparten av PH05 signalsekvensen. DNA-fragmentene blir renset ved elektroeluering og DE52 kromatografi, presipitert med etanol og resuspendert i HgO ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl.

0.2 pmol av 584 bp BamHI-Ball fragmentet, 0.2 pmol av 315 bp Ball-Pstl fragmentet, 0.2 pmol av 1007 bp Pstl-Xhol fragmentet (se eksempel 3) og 0.1 pmol av 6.8 kb BamHI-Xhol vektorfragmentet (se eksempel 3) blir ligert og brukt til å transformere E.coli HB101. 6 amp<R> kolonier blir plukket og latt vokse i LB-medium inneholdende 100 mg/l ampicillin. Plasmid DNA blir fremstilt ved den raske DNA-fremgangsmåten og analysert med BamHI/Pstl dobbeltspaltning. En enkelt klon med de ventede restriksjonsfragmentene blir selektert og plasmid DNA blir referert til som pJDB207/PH05-UPA.

Eksempel 5: Konstruksjon av plasmid PJDB207/ PH05- SSUPA

Dette plasmidet inneholder urokinasegenet med dets eget signalsekvens under kontroll av PH05 promoteren i gjær ekspresjonsvektor pJDB207. 20 pg plasmid pCS16/UPA-13 (se eksempel 1) blir fullstendig spaltet med 100 enheter Bgll (nukleotidposisjoner 76-86, fig. 2). De resulterende 3 fragmenter blir separert på en preparativ 196 agarosegel i Tris-borat-EDTA buffer pH 8.3. 1.7 kb Bgll fragmentet blir elektroeluert og presipitert med etanol.

En oligodesoksyribonukleotid linker med formelen

har et EcoRI-sete festet til 8 nukleotider av PH05 5' ikke-kodende regionen foran dets ATG og nukleotidene 70-82 (fig. 2) av den kodende sekvensen til u-PA innbefattet ATG. Linkeren blir ligert til Bgll klebrige ender til DNA som beskrevet i eksempel 3. DNAet blir spaltet med EcoRI og Pstl.

Et 380 bp fragment blir isolert inneholdende u-PA signalsekvensen og deler av den kodende sekvensen for fullt utviklet u-PA opp til nukleotid 436 (Pstl sete, fig. 2).

Plasmid p31R (se Europa patentsøknad nr. 100,561) blir spaltet med BamHI og EcoRI og 534 bp BamHI-EcoRI fragmentet blir isolert inneholdende PH05-promoteren. DNA-fragmentene blir elektroeluert fra agarosegelen, renset ved DE52 kromato-graf i, presipitert med etanol og resuspendert i HgO ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl.

0.2 pmol av 534 bp BamHI-EcoRI fragmentet, 0.2 pmol av 380 bp EcoRI-Pstl fragmentet, 0.2 pmol av 1007 bp Pstl-Xhol fragmentet (se eksempel 3) og 0.1 pmol av 6.8 kb BamHI-XhoI vektorfragment (se eksempel 3) blir ligert og brukt til å transfor-

mere E. coli HB101 Ca<++> celler. 12 amp<R> kolonier blir latt vokse separat i LB-medium inneholdende 100 mg/l ampicillin. DNAet blir fremstilt ved den raske DNA-fremgangsmåten og analysert ved BamHI og EcoRI. Plasmid DNA fra en enkelt klon blir selektert og referert til som pJDB207/PH05-SSUPA.

Eksempel 6: Konstruksjon av plasmid pJDB207R/ PH05- UPA

Den kodende sekvensen til fullt utviklet urokinase blir festet til PH05-promoteren. Ingen signalsekvens blir satt inn i denne konstruksjon som er blitt gjort av sammenlignings-grunner.

Et oligodesoksyribonukleotidlinker med formel

inneholder et ATG og nukleotidene 130-154 til u-PA (se fig. 1) som koder for aminosyrene Serl til Ser9 til fullt utviklet urokinase. Oligonukleotidene blir fosforylert, sammensmeltet og ligert til 462 bp Taql-EcoRI fragmentet til pCS16/UPA (se eksempel 3). DNAet blir spaltet med EcoRI ogPstl. Et 315 bp EcoRI-Pstl fragment blir isolert inneholdende ATG og den kodende sekvensen for fullt utviklet u-PA opp til Pstl-setet ved posisjon 436 (fig. 2).

Plasmid p31R (se Europa patentsøknad nr. 100,561) blir spaltet med BamHI og EcoRI og 534 bp BamHI-EcoRI fragmentet blir isolert på en preparativ 1,5$ agarosegel. Dette fragmentet inneholder PH05-promoteren.

Alle DNA-fragmentene blir elektroeluert, renset ved DE52 kromatografi, presipitert med etanol og resuspendert i HgO ved en konsentrasjon på 0.1 pmol/pl. 0.2 pmol av hver av 534 bp BamHI-EcoRI fragmentet, 315 bp EcoRI-Pstl fragmentet og 1007 bp Pstl-Xhol fragment (se eksempel 3) og 0.1 pmol av 6.8 kb BamHI-XhoI vektorfragment (se eksempel 3) blir ligert og transformert inn i E. coli HB101 Ca<++> som vanlig. 8 amp<R >kolonier blir plukket og latt vokse i LB-medium inneholdende 100 mg/l ampicillin. Plasmid DNA blir fremstilt og analysert ved BamHI og EcoRI restriksjonsspalting. Plasmid DNA av en enkelt klon med det ventede restriksjonsmønsteret referert til som pJDB207R/PH05-UPA.

Eksempel 7: Kloning av gjær GAPDH- genet med dets konstitutive promoter

a) Konstruksjon av et gjærgenbibliotek

Tretti pg av totalt høy molekylvekt gjær-DNA [M.V. Olsen et

al. J. Mol. Biol. 132, 387 (1979)] fra villtype Saccharomyces cerevisiaestamme S288C blir inkubert i 30 min. ved 37°C med 2 enheter EcoRI metylase (New England Biolabs) i 250 pl EcoRI metyleringsbuffer som foreslått av leverandøren. DNA blir presipitert med etanol, resuspendert i 500 pl 25 mM Tris*HCl pH 8.5, 2 mM MgCl2 (EcoRI<*> buffer) [M. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1979)] og spaltet med EcoRI (Boehringer) helt til størrelsesfordelingen av DNA-fragmenter har en maksimum i området på 30-50 kb (et Xhol-spalting av XDNA tilveiebringer 33 kb og 17 kb markører). Gjær DNA spaltet under EcoRI*4 betingelser blir størrelses-fraksjonert på en sukrosegradient (5-2056 sukrose i 10 mM Tris*HCl pH 7.5, 1 mM EDTA) i 6 t ed 38'000 rpm i en SV 40 rotor. Tretti fraksjoner på 0.4 ml hver blir samlet fra toppen av gradienten. Fraksjon 16 inneholder DNA-fragmenter som er 30-40 kb i størrelse. DNAet fra denne fraksjonen (3 pg) blir presipitert med etanol og ligert i 16 timer ved 15° C i et totalt volum på 15 pl til 1 pg kosmid vektor pYcl [B. Hohn et al. i "Genetic Engineering", Vol. 2, s. 169, New York 1980] linearisert ved EcoRI. Ligering blir utført med 300 U T4 DNA-ligase (New England Biolabs) ved bruk av buffersystemet beskrevet av leverandøren. DNAet blir pakket in vitro inn i bakteriofag X [B.Hohn i "Methods in Enzymology", vol. 68, s. 299, New York 1979] og de sammen-satte fagene blir brukt til å transdusere E. coli stamme HB101 (rf, mf, leu<®>, pro<e>. recA). Effektiviteten av transduk-

sjonen er omtrent 5000 ampicillin-resistente kolonier per pg pYcl vektor. 3000 amp<R> kolonier blir plukket og latt vokse individuelt i brønnene på mikrotiterplater i LB-medium [10 g Bacto-Tryptone (Difco), 5 g Bacto gjærekstrakt (Difco), 10 g NaCl] inneholdende 100 pg/ml ampicillin.

b) Isolering av g. iær GAPDH- genet

Genbiblioteket beskrevet ovenfor blir screenet med en

syntetisk oligonukleotid [fremstilt ved bruk av fosfotriester fremgangsmåten: K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327

(1975); J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)] med følgende struktur: 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3' . 10 pg av oligonukleotidet blir kinasebehandlet ved bruk av 10 pl "Y-<32>P-ATP (3000 Ci/mmol, 10 pCi/pl Amersham) med T4 polynukleotidkinase (Boehringer) i et totalt volum på 50 pl som beskrevet av Maniatis et al.

["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, side 125]. Kolonihybridisering blir utført som beskrevet av samme forfatter (side 312). Positive kloner blir detektert ved autoradiografi ved bruk av Kodak X-5 røntgenfilm. Plasmid DNA isolering (se Europa patentsøknad nr. 100,561) fremstiller en hybrid klon som inneholder et 2100 bp HindiII fragment som koder for GAPDH [J.P. Holland et al., J. Biol. Chem. 254, 9839 (1979)]. Endelig bevis for autentisiteten til det klonede DNA kommer fra DNA-sekvenseringseksperiment ved bruk av ovenfor nevnte oligonukleotid i kombinasjon med dideoksy sekvenseringsprotokoll som beskrevet av G.F. Hong [Bioscience Reports 1, 243 (1981)] for dobbelttrådet DNA. Det klonede GAPDH-genet har den samme sekvensen som pgap491 publisert av Holland et al. [J. Biol. Chem. 255, 2596 (1980)].

c) Fremstilling av GAPDH- promoter

649 bp Taql fragment som innbefatter posisjon -27 til -675

fra ATG til GAPDH-genet (se figur . 6) blir isolert ved spalting av den ovenfor nevnte hybridplasmidet med Taql (New England Biolabs), separering av DNA-fragmentet på en 1. 2% bløt agarosegel og ekstrahering av DNA med varm fenol.

Kloning av Taql-fragmentet blir gjort inne i Clal-setet til pBR322: 1 pg pBR322 blir spaltet med tre enheter Clal (New England Biolabs) som beskrevet av forhandleren. 300 ng av det fenolbehandlede og spaltede vektoren blir ligert til omtrent 300 ng av innskudd DNA (649 bp Taq fragment) ved bruk av 200 U T4 DNA-ligase i et totalt volum på 20 pl. Transformering blir utført i E. coli HB101 for ampicillin resistens, plasmid DNA blir fremstilt og analysert ved restriksjonsanalyse [Taql, Dral]. Orientering av Taql fragmentet blir bestemt ved bruk av restriksjonsendonuklease Dral sammen med BamHI-setet til plasmidene og et plasmid blir valgt som har Taql-sete til posisjon -675 nære til Hindlll-setet til pBR322. Dette plasmidet betegnes pBR322/GAPDH blir linearisert ved bruk av BamHI (New England Biolabs). DNAet blir resuspendert i 10 mM Tris pH 8.0 ved en konsentrasjon på 0.5 pg/ml. 16 pg Sali spaltet DNA blir spaltet med 2 U eksonuklease Bal31 (BRL) i 100 pl 20 mM Tris pH 8.0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2 og 1 mM EDTA. Aliquoter på 2 pg DNA hver blir tatt ut etter 1, 2, 3, 4, 5 og 6 min. inkubering ved 30<0>C og deretter med en gang blandet med 50 pl fenol og 60 pl TNE. Etter ekstrahering med fenol/kloroform og etanol presipitering, blir DNA resuspendert i 10 mM Tris pH 8.0 ved en konsentrasjon på 100 pg/ml. For å analysere grad av eksonukleolytisk spalting ved Bal31 blir 0.5 pg DNA fra hvert tidspunkt spaltet med endonuklease BamHI og analysert på en 1.556 agarosegel i Tris-borat-buffer pH 8.3 (90 mM Tris*HCl pH 8.3, 90 mM borsyre, 2.5 mM EDTA). I gjennomsnittet blir 100 bp fjernet fra hver ende av fragmentet pr. 1 min. av Bal31 spalting.

Bglll linkere (5'-GGAGATCTCC-3' ) blir fosforylert, sammensmeltet og ligert til Bal31 behandlede DNA-fragmenter. Linkere i overskudd blir fjernet ved presipitering med isopropanol. DNAet blir spaltet med Bglll og deretter sirkularisert ved en konsentrasjon på 5 pg/ml i et totalt volum på 20 pl. Størrelsen av Bal31 forkortet Taql fragment blir bestemt ved restriksjonsanalyse (ved bruk av Bglll og Hindlll). Tre kloner selekteres. De inneholder DNA-fragmenter som rekker omtrent 200 hp, 265 bp og 540 bp, respektivt, fra ATG oppstrøms inn i GAPDH-promoteren. Alle tre fragmenter inneholder den sannsynlige TATA-boks ved omtrent -14 0 bp. Disse klonene inneholder enda replikasjonsorigo i pBR322 avledete delen av DNA og blir kalt pGAPDH-F, pGAPDH-E og pGAPDH-D, respektivt.

For å forlenge GAPDH-promoterelementene fra Taql-setet ved posisjon -27 til en posisjon rett ved siden av ATG til GAPDH-genet blir to syntetiske kompiimentaere oligonukleotider med følgende struktur fremstilt:

Disse oligonukleotidene tilveiebringer den genuine GAPDH-promotersekvensen fra posisjon -26 til posisjon -5 med dannelsen av et terminalt EcoRI-setet. To pg av plasmidene pGAPDH-F, pGAPDH-E og pGAPDH-D blir hver spaltet med 6 enheter Taql i 50 pl og den resulterende blandingen blir fenolbehandlet, etanolpresipitert og resuspendert i 10 pl vann. De syntetiske oligonukleotidene blir sammensmeltet ved blanding av 2 pl av hver enkelttråd i 100 pl av en oppløsning inneholdende 10 mM Tris*HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, oppvarming i 3 min. til 90° C og deretter sakte avkjølt av oppløsningen til romtemperatur (innenfor omtrent 3 timer). En pg av Taql-spaltet plasmid ble blandet med omtrent et tyve ganger molart overskudd av de sammensmeltede oligonukleotidene i et volum på 20 pl og ligert i omtrent 18 timer ved bruk av 800 TJ T4 DNA ligase. Etter inaktivering av ligasen, blir hele blandingen spaltet med 3 enheter Bglll (New England Biolabs). Bglll-EcoRI fragmentene på omtrent 200 bp, 265 bp og 540 bp, respektivt, blir separert på en 1.5$ bløt agarosegel, ekstrahert fra gelen og etanolpresipitert.

Plasmid p31RIT-12 (se eksempel 2) blir spaltet med BamHI og EcoRI. Det 3.6 kb store vektorfragmentet blir isolert. Dette fragmentet blir brukt til å klone 200 bp, 265 bp og 540 bp Bglll-EcoRI GAPDH-promoter fragmenter. Ligering, transformering og plasmidisoleringsbetingelsene er som beskrevet ovenfor. Plasmider med det riktige innskudd blir referert til som p31GAPFL-IT, p31GAPEL-IT og p31GAPDL-IT, respektivt (fig. 7).

DNA-sekvensene til Bglll-EcoRI fragmentene til plasmidene P31GAPFL-IT, p31GAPEL-IT og p31GAPDL-IT er vist i fig. 8. Den nøyaktige størrelsen på disse fragmentene er 202 bp, 267 bp og 544 bp, respektivt.

Eksempel 8: Konstruksjon av plasmid pJDB207/ GAPDL- I- UPA ( fig.

91

Dette plasmidet inneholder GAPDH-D promoteren, invertasesignalsekvensen, den kodende sekvensen til fullt utviklet urokinase og PH05 transkripsjonsterminator i en tandem rekkefølge i skyttelvektor pJDB207.

Plasmid DNA fra p31GAPDL-IT blir spaltet med Sali og Hindlll. Et 0.8 kb Sall-Hindlll fragment blir separert på en preparativ 1% agarosegel. Dette fragmentet inneholder GAPDH-D promoteren og deler av invertasesignalsekvensen.

Plasmid pJDB207/PH05-I-UPA blir spaltet med Hindlll og BamHI. Det 1239 bp Hindlll-BamHI fragmentet innbefatter den gjenvær-ende delen av invertasesignalsekvensen og mesteparten av u-PA kodende sekvensen. pJDB207/PH05-I-UPA blir også spaltet med Sali og BamHI. Det store, 6.6 kb vektorfragmentet blir isolert på en preparativ 0 .696 agarosegel i tris-acetatbuffer pH 8.2.

DNA-fragmentene blir isolert ved elektroeluering fra gelen, renset ved DE52 kromatografi og presipitert med etanol. Det 0.8 kb Sall-Hindlll fragment, det 1239 bp Hindlll-BamHI fragmentet og 6.6 kt» Sall-BamHI vektorfragment blir ligert og brukt til å transformere E. coli HB101 Ca<++> celler. Plasmid DNA fra 6 amp<R> transformanter bli analysert ved Hindlll og Sali restriksjonsspaltninger. Plasmid DNA fra en enkelt klon med de ventede restriksjonsfragmentene blir referert til som pJDB207/GAPDL-I-UPA.

I en analog konstruksjon blir et 493 bp Sall-Hindlll fragment av plasmid p31GAPFL-IT (se eksempel 7) isolert og brukt for ligering. Det resulterende plasmid DNA blir referert til som pJDB207/GAPFL-I-UPA.

På en analog måte blir pJDB207/GAPEL-I-UPA konstruert.

Eksempel 9: Konstruksjon av plasmid pJDB207/ GAPDL- UPA ( Fig.

10)

En tandem rekkefølge innbefattende GAPDH-D promoteren, PH05-signalsekvensen, urokinasekodende sekvensen og PH05-transkripsjonsterminator blir klonet inn i gjaerskyttelvektoren pJDB207.

20 pg plasmid pJDB207/PH05-UPA blir spaltet med Bglll og Sali. De resulterende to fragmenter blir separert på en preparativ 0.8$ agarosegel i tris-acetatbuffer pH 8.2. 7.6 kb og 1.1 kb Bglll-Sall fragmentene blir isolert. 1.1 kb fragmentet blir videre spaltet med Dral. Etter fenol/kloro-form ekstrahering og etanolpresipitering blir 3.5 pmol av DNAet ligert med 100-ganger overskudd av et kinasebehandlet og sammensmeltet oligodesoksyribonukleotid-linker med formelen:

med et EcoRI-sete og 8 nukleotider av PH05 5' ikke-kodende regionen foran ATG og del av Dral gjenkjenningssekvens.

Etter ligering i 16 t ved 15° C blir ligasen uaktivert, og linkere i overskudd blir fjernet ved isopropanol presipitasjon (0,54 volumer) i nærvær av 300 mM natriumacetat pH 6.0 og 10 mM EDTA. DNA blir spaltet med Bglll og EcoRI. Et 326 bp EcoRI-Bglll fragment blir isolert.

Plasmid p31GAPDL-IT blir spaltet med Sali og EcoRI. Et 0.75 kb Sall-EcoRI fragment blir isolert.

DNA-fragmenter blir isolert ved elektroeluering fra agarosegel, renset ved DE52 kromatografi og presipitert med etanol. 0.2 pmol av 0.75 kb Sall-EcoRI fragment, 0.4 pmol av 326 bp EcoRI-BgllI fragment og 0.1 pmol av 7.6 kb SalI-BgllI vektorf ragmentet blir ligert i 5.5 t ved 15° C. 1 pl av ligeringsblandingen blir brukt til å transformere E. coli HB101 Ca<++> celler. 10 amp<R> transformanter blir latt vokse og plasmid DNA blir fremstilt. Plasmid DNA blir analysert ved EcoRI restriksjonsspaltinger. Plasmid DNA fra en enkelt klon med det ventede restriksjonsmønsteret blir referert til som pJDB207/GAPDL-UPA.

På lignende måte, blir plasmidene pJDB207/GAPFL-UPA og pJDB207/GAPEL-UPA konstruert.

Eksempel 10: Konstruksjon av plasmid pDP38 (fig. 11 og fig. 12). 2 mikron kovalent lukket sirkulær DNA blir isolert fra Saccharomyces cerevisiae stamme S288C ved fordøying av celleveggen med 5 pg/ml Zymolyase 100,000 enheter/pg i 20 min. ved 37°C, deretter lysering av cellene med 2% SDS. EDTA blir deretter satt til 25 mM, cesiumklorid til en final tetthet på 1.55 g/ml, etidiumbromid til 1 mg/ml og deretter ble det hele overført til ultrasentrifugerør. Plasmid DNA blir separert fra kromosomalt DNA ved ultrasentrifugering i 42 timer ved 42.000 rpm ved 15° C. 2 mikron plasmid DNA blir tatt ut fra gradienten med en sprøyte. Etidiumbromid blir fjernet med NaCl mettet isopropanol og plasmid DNA blir deretter etanolpresipitert. Det rensede plasmid DNA blir deretter linearisert med Pstl og klonet inn i Pstl-setet til pUC19 [J. Norrander et al., Gen 26, 101 (1983)] for å tilveiebringe plasmid pDP31. Plasmid pJDB207 blir spaltet med enzymene Kpnl og Hpal. Det resulterende 0.55 kb fragmentet blir renset og klonet inn i 4.25 kb Kpnl-Hpal fragmentet til plasmid pUC7/LEU2 [et plasmid inneholdende gjærgenomisk 2.2 kb Xhol-Sall LEU2 genet [A. Andreadis et al. Cell 31, 319 (1982] klonet inn i Sall-setet til plasmid pUC7 [J. Vieira et al. Gene 19, 259 (1982)]. Dette resulterer i plasmid pDP30 hvor det opprinnelige 2 mikron/LEU2 fusjonen som i plasmid pJDB207 er plassert foran LEU2-genet pluss dets hele termina-tor. pDP30 blir spaltet med Hpal og Sali og 1.85 fragmentet inneholdende hele LEU2-genet blir renset og klonet inn i 8.7 kb Hpal-Sall fragment i plasmid pDP31. Det resulterende plasmidet, pDP33, blir linearisert med Hindlll i nærvær av. 50 pg/ml etidiumbromid [M. Oesterlund et al. Gene 20, 121

(1982)] og ligert med 1.17 kb Hind III fragmentet inneholdende URA3-genet [M. Rose et al. Gene 29, 113 (1984)]. Positiv insersjon av "DRA3 genet blir selektert for ved transformasjon inn i E. coli stamme pyrf [M. Rose et al., ovenfor]. Dette tilveiebringer plasmid pDP34. pDP34 blir spaltet med enzymet SphI. Det resulterende 8.4 kb fragmentet blir renset og selvligert for tilveiebringelse av plasmid pDP38.

Eksempel 11: Konstruksjon av plasmidene pDP38/ GAPDL- I- UPA og PDP38/ GAPDL- UPA

Vektor pDP38 (se eksempel 10) inneholder LEU2 og URA3 genene, pBR322 sekvenser og deler av gjær 2 mikron DNA. Plasmid pDP38 blir linearisert med BamHI. De resulterende klebrige endene blir fylt inn i en reaksjon med Klenow DNA-polymerase (Maniatis et al., s. 113, supra). DNA blir videre fullstendig spaltet med Sali og det store 8.4 kb fragmentet blir isolert. 10 pg plasmid pJDB207/GAPDL-I-UPA blir delvis spaltet med Hindlll (1 enhet/pg DNA) i nærvær av 10 pg/ml etidiumbromid i 28 min. ved 37°C. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetting av EDTA til en final konsentrasjon på 10 mM. De klebrige endene til DNA blir fylt i en reaksjon med Klenow DNA-polymerase. DNAet blir videre spaltet med Sali. Et 2.2 kb Sali-[Hindlll]-/butt endefragment blir isolert.

De rensede DNA-fragmentene blir ligert og transformert inn i E. coli HB101 Ca<++> celler. 24 amp<R> kolonier blir latt vokse opp. Plasmid DNA blir fremstilt og analysert ved EcoRI og Sall/Hindlll restriksjonsspaltninger. Plasmid DNA av en enkelt klon med de ventede restriksjonsfragmentene blir referert til som pDP38/GAPDL-I-UPA.

I en analog konstruksjon blir et 2.2 kb SalI-[HindIII]/butt endefragment isolert fra pJDB207/GAPDL-UPA etter fullstendig Hindlll spalting, Klenow DNA-polymerase reaksjon og Sali spalting. Dette fragmentet blir ligert inn i pDP38 som beskrevet ovenfor. En enkelt klon blir referert til pDP38/GAPDL-UPA.

På en analog måte blir 2.2 kb SalI-[HindIII]/butte endefrag-mentene isolert fra pJDB207/GAPEL-I-UPA, pJDB207/GAPFL-I-UPA, pJDB207/GAPEL-UPA og pJDB207/GAPFL-UPA. De rensede fragmentene blir ligert inn i pDP38. Ligeringsblandingen blir deretter brukt til å transformere E. coli HB101.

Plasmid DNA fra en enkelt klon er hver referert til som pDP38/GAPEL-I-UPA, pDP38/GAPFL-I-UPA, pDP38/GAPEL-UPA og pDP38/GAPFL-UPA.

Eksempel 12: Transformasjon av S. cerevisiae stammer HT246 og GRF18

Saccharomyces cerevisiae stamme HT246 (a, leu.2-3, leu2-112, prb) blir transformert med plasmidene

PJDB207/PH05-UPA

pJDB207/PH05-I-TJPA

pJDB207/PH05-SSUPA

pJDB207/PH05-UPA

pJDB207/GAPDL-UPA

pJDB2 07/GAPFL-UPA

pJDB2 07/GAPDL-1-UPA

ved bruk av transformeringsfremgangsmåten beskrevet av Hinnen et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. Transformerte gjærceller blir selektert på gjær minimalmedium-plater manglende leucin. Enkle transformerte gjærkolonier blir isolert og referert til som

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-SSUPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPDL-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPFL-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPDL-I-UPA

På en analog måte, blir Saccharomyces cerevisiae-stamme GEF18 (DSM 3665) transformert med de ovenfor nevnte plasmidene. De resulterende transformerte gjærstammene er betegnet

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-SSUPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPDL-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPDL-I-UPA

Eksempel 13: Transformasjon av Saccharomyces cerevisiae stamme HT 350

S. cerevisiae stamme HT350 blir tilveiebragt ved kryssing av stamme S. cerevisiae HT246 med en ura-3 manglende stamme såsom S. cerevisiae HT285 (a, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-

112, ura3, pep4-3) som resulterer i følgende genotype for stamme HT350 (a, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, ura3, prb, pep4-3). Stamme HT350 blir transformert med plasmidene pDP38/GAPDL-I-UPA, pDP38/GAPFL-I-UPA, pDP38/GAPEL-I-UPA, pDP38/GAPDL-UPA, pDP38/GAPFL-UPA, og pDP38/GAPEL-UPA, respektivt, ved bruk av transformeringsfremgangsmåten ved Hinnen et al. (ovenfor). Transformerte gjærceller blir selektert på gjær minimalmediumskåler manglende uracil og suplementert med leucin. Enkelttransformerte gjærkolonier blir isolert og referert til som

Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPDL-I-UPA Saccharomyces cerevisiae H350/pDP38/GAPFL-I-UPA Saccharomyces cerevisiae H350/pDP38/GAPEL-I-UPA Saccharomyces cerevisiae H350/pDP38/GAPDL-UPA

Saccharomyces cerevisiae H350/pDP38/GAPFL-UPA

Saccharomyces cerevisiae H350/pDP38/GAPEL-UPA

Eksempel 14: Fermentering av transformerte g. iærstammer Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-UPA, Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA og Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA

inneholder plasmidene med PH05-promoteren i full lengde og krever derepresjon av promoteren for ekspresjon av scu-PA. Celler av S. cerevisiae HT246 transformanter blir hver latt vokse i 10 ml gjærminimalmedium (Difco Gjærnitrogenbase uten aminosyrer som er tilsatt 2$ glukose og 20 mg/l L-histidin) i en 50 Erlenmeyer flaske med omrysting ved 30°C i 24 t inntil en tetthet på 5-7 x IO<7> celler/ml er oppnådd. Cellene fra forkulturen blir deretter vasket i 0, 996 NaCl og 2096 av forkulturcellene blir brukt til å inokulere 50 ml av et lavt Pi minimalmedium fremstilt i henhold til oppskriften på Difco Gjærnitrogenbasemediet (uten aminosyrer), men inneholdende 0,03 g/l KH2P04, 10 g/l L-asparagin istedenfor (NH4)2S04, 20 g/l glukose og 1 g/l L-histidin. Kulturene blir agitert ved

30° C i opp til 48 t ved 180 rev/min. Finale tettheter på 1 x 10<8> celler/ml (= OD^qo = 4-5) blir tilveiebragt.

Gjærtransformanter inneholdende plasmider med GAPDH-promoter i forskjellige lengder uttrykker scu-PA konstitutivt. Korresponderende transformanter inneholdende pJDB207 avledete plasmider blir latt vokse i gjaerminimalmedium forkultur (ovenfor). 2096 av den vaskede forkulturen blir inokulert inn i 50 ml av kompleks hovedkulturmedium bestående av (g/l): pepton 5, gjaerekstrakt 10, glukose 20, sukrose 40, (NH4)2S04 3, KH2P04 2, MgS04 0.5, NaCl 0.1, CaCl2 0.1, biotin 10 jjg/1. Omtrentelig 1 x IO<9> celler/ml (= OD^qo = 40-50) blir tilveiebragt etter 48 t inkubering ved 30°C og 200 revs/min.

Korresponderende transformanter inneholdende pDP38 avledete plasmider blir dyrket under uracil-seleksjon. Cellene blir latt vokse i 24 t ved 30°C og 180 revs/min i et forkulturmed-ium bestående av (g/l): kasaminosyrer 4.5, gjaerekstrakt 6.5, sukrose 20, glukose 20, (NH4)2S04 3.6, KH2P04 1, MgS04 o.2, CaCl2 0.013, sporelementer.

1096 av de vaskede f orkul turcellene blir brukt til å inokulere 50 ml selektiv hovedkulturmedium bestående av (g/l): Gjærnitrogenbase (Difco, uten aminosyrer) 5, L-asparagin 7.5, kasaminosyrer 8.5, metyl-etylsulfonat 10, adenin 0.05, L-histidin 0.04, L-leucin 0.1, L-tryptofan 1, Ca-pantotenat 0.03, glukose 30. Omtrentelig 8 x 10<8> celler/ml ( = OD60o ca-35) blir tilveiebragt etter 48 t inkubering ved 30°C og 200 revs/min.

Celler fra 2 ml blir samlet etter 24 t og 48 t, respektivt, ved sentrifugering ved 3000 rpm i 10 min Falcon 2070 rør. Cellene blir vasket en gang med 0 . 996 NaCl og sentrifugert. Cellepelleten blir suspendert i lysisbuffer [66 mM kalium-fosfat pH 7.4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem)]. Til celle-suspensjonen blir 8 g glasskuler (0.5-0.75 mm i diameter) tilsatt og suspensjonen blir rystet på en Vortex-mikser

[Scientific Instruments Inc. USA) ved høyest hastighet i 4-5 x 2 min. Mere enn 9096 av cellene blir brukket ved denne fremgangsmåten. Celledebris og glasskuler blir sedimentert ved sentrifugering i 5 min ved 3000 rpm ved 4°C. Rett før analysering av den biologiske aktiviteten blir supernatantene fortynnet opp til 500 ganger i 0.1 M Tris-HCl pH 7.4, 0.0596 Tween 80 , 0.196 bovinserumalbumin.

Eksempel 15: Bestemmelse av biologisk aktivitet

Amidolytisk aktivitet av scu-PA kan bli målt med en gang ved bruk av Kabi (KabiVitrum, Stockholm, Sverige) syntetisk tripeptid kromogensubstrat S-2444 (pyro-Glu-Gly-Arg-pNA). For bestemmelsen av innholdet av tcu-PA spaltet ved Lysl58 og/eller Lysl36 blir analysen utført i henhold til leveran-dørens anbefalinger (uten plasminaktivering). Scu-PA krever plasminaktivering før bestemmelse av dets amidolytiske aktivitet førende til følgende modifikasjoner av analysen: 100 pl scu-PA inneholdende prøver (se eksempel 14) blir preinkubert med 0.01 U humant plasmin (Boehringer Mannheim, Tyskland) i 60 min ed 37°C. 5 I.U. aprotinin (Boehringer Mannheim, Tyskland) blir satt til og blandingen inkubert videre 10 minutter ved 100 m temperatur før det kromogene substratet S-2444 (ovenfor) blir tilsatt.

Kvantitering av aktiviteten blir gjort ved å sammenligne med WHO urokinasestandard (lot 66/46) og uttrykt i internasjonale enheter (I.U.). I henhold til den kommersielle prepareringen Ukidan (Serono, Freiburg, Tyskland), har den høyt rensede urokinase isolert fra human urin en spesifikk aktivitet på 70.000-100.000 I.U./mg protein.

Scu-PA-innholdet kan også bli målt via dets plasminogenakti-vering ved bruk av det syntetiske tripeptidsubstratet S-2251 (KabiVitrum, Stockholm, Sverige). Analysen blir utført i henhold til leverandørens anbefalinger (KabiVitrum, ovenfor) med scu-PA inneholdende prøver som plasminogenaktivator istedenfor streptokinase.

Mengden av antigen tilstede i gjærf ermenteringsmedier "blir estimert ved bruk av dot-blott-fremgangsmåte (Bio-Rad, Richmond, USA). Et polyklonalt kanin anti-humant urin urokinase antistoff blir brukt for deteksjon.

Prøver blir tatt ved 24 t av fermenteringen og blir deretter for-behandlet som beskrevet i eksempel 14. Et sammendrag av plasminogenaktiverende (S-2251 som substrat) aktiviteter med forskjellige plasmider i 2 forskjellige stammer er gitt i Tabell 1.

En sammenligning av aktivitetene bestemt i 3 analyser er gitt i Tabell 2.

Total volumetriske titere (per ml kulturmedium) tilveiebragt etter 48 t fermentering av stamme HT246 ved bruk av plasmid pJDB207/GAPDL-I-UPA.

Resultatene indikerer at den beste scu-PA produksjon i gjær blir tilveiebragt når DNA-konstruksjonen innbefatter en gjærsignalsekvens såsom PH05 eller invertasesignalsekvens. Resultatene indikerer videre at scu-PA blir uttrykt i forskjellige gjærvert-bakgrunner, hvorpå fermenteringen under selektive betingelser (enten lav Pi-minimalmedium eller uracil seleksjon) fører til relativt høy spesifikk produksjon per OD.

Omtrent 90% av ekspresjonsproduktet er scu-PA som indikert i aktivitetsmålingene på S-2444 med eller uten plasminaktivering. Dot-blotting indikerer at mengden av antigen tilstede overskrider ikke mengden av biologisk aktivitet som blir målt. Derfor blir gjærrekombinant scu-PA foldet på riktig måte som i genuin scu-PA.

Eksempel 16: Isolering av scu- PA fra gjærceller ( 30 l kulturmedium)

S. cerevisiae stamme HT246/pJDB207/GAPDL-I-UPA blir latt vokse på samme måte som S. cerevisiae stamme GRF18/pJDB207/- GAPFL-EIR ved produksjon av hirudin (jfr. Europa patentsøknad nr. 225633). Innholdet av scu-PA inne i cellene (etter disintegrering, se eksempel 14) blir bestemt ved indirekte amidolytisk analyse ved bruk av substrat S-2251 (se eksempel 15). Etter 48 t inkubering blir cellene høstet ved sentrifugering i en Sharpless sentrifuge (Appareils Centrifuges, Rueil, Frankrike) og suspendert i et likt volum lysisbuffer [200 mM K2HP04, 0.2 % Tween 80]. Cellene blir deretter brukket i en glassperlemølle (Dyno-Mill, KDL, Bachofen AG, Basel; 4500 rpm, 18 l/h). Suspensjonen blir fortynnet 5 ganger med 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 80, og celledebris blir sedimentert i nærvær av 0.6 % polyetylenimin ved 4°C ved sentrifugering i en Westfalia separator SB7-47. Den lett turbide supernatanten blir filtrert gjennom en Zetapor Cartridge (0.22 pm porevidde) og justert til pH 6.05 med IN HC1. 1 1 kation-bytter S-Sepharose fortflytende (Pharmacia) per kg sedimentert gjærceller blir tilsatt og suspensjonen omrørt ilt ved 4°C. Kulene blir deretter overført til en kolonne med 9 cm diameter og vasket med 50 mM natriumf osf at pH 7.0, 150 mM NaCl, 0,05 % synperonic. Scu-PA blir eluert med en elueringshastighet på 30 ml/min med den samme buffer inneholdende 250 mM NaCl. Til fraksjonene inneholdende scu-PA [som målt i den direkte amidolytiske analysen; jfr. eksempel 15] blir konkanavalin A Sepharose (Pharmacia) tilsatt (1 ml gel per 0.2 mg scu-PA) og suspensjonen blir omrørt i 45 min. ved 4°C. Etter vasking med IM NaCl 10 mM natriumf osf at pH 7.0, 0.05 9o Synperonic, blir kulene overført til en kolonne med diameter 4.4 cm og scu-PA blir eluert med 0.8 M metyl-cx-D-mannopyranosid, 150 mM NaCl, 20 mM natriumacetat pE 4.0, 0.05 % Synperonic med en elueringshastighet på 1 l/h. Til fraksjonene inneholdende scu-PA, blir antiurokinase IgG-Sepharose tilsatt [renset polyklonal kanin antistoff (IgG-fraksjon) mot humant urin urokinase] og suspensjonen blir omrørt i 45 min. ved 4°C. Kulene blir deretter overført til en kolonne med diameter på 2.2 cm og vasket med IM NaCl, 10 mM natriumf osf at pE 7.0, 0.05 % Synperonic. Scu-PA blir eluert med 0. IM glycin-ECl pE 2.4, 0.0596 Synperonic med en elueringshastighet på 1 ml/min. Fraksjonene inneholdende scu-PA blir justert til pE 6 med IN NaOE.

På dette stadiet består omtrent 25-30 # av den totale aktiviteten av tcu-PA som identifisert ved den direkte amidolytiske analysen (jfr. eksempel 15).

Eluatet fra antistoffkolonnen blir applisert på en Mono-S kolonne (1 ml kolonnevolum; Pharmacia) ekvilibrert med 50 mM natriumfosfat pE 6.0, 0.05 % Synperonic. Etter vasking med ekvilibreringsbuffer, blir scu-PA eluert med en steg-lignende gradient ved ekvilibreringsbufferen og en buffer B sammensatt av 500 mM NaCl, 50 mM natriumfosfat pH 7.0, 0.05 56 Synperonic med en elueringshastighet på 1 ml/min. Ved denne elueringen, ble to aktivitetstopper observert, en topp eluerte ved det første steget ved 3096 av buffer B og den andre ved det andre steget ved 55% av buffer B. Den direkte amidolytiske analysen viste at fraksjonen som eluerte ved 3096 B har enda en høyere mengde av tcu-PA, mens fraksjonen eluert ved 5596 B har så lite som 1-396 tcu-PA.

Gjær scu-PA produsert på denne måten migrerer som et enkelt bånd på omtrent 51 KD molekylvekt i SDS polyakrylamidgelelektroforese under ikke-reduserende betingelser. Scu-PA som blir tilveiebragt har en renhet på omtrent eller mer enn 9596 som bestemt ved den direkte amidolytiske analysen (jfr. eksempel 15) og ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese under reduserende betingelser.

Eksempel 17: Glykosyleringsgrad i gjær scu- PA

Glykosylering blir bestemt med en <125>I-konkanavalin A overleggsanalyse etter gelelektroforese. Konkanavalin A er et plantelektin som spesifikt oppdager mannoseresidier. Renset scu-PA fra gjær og u-PA standard Ukidan (Serono, Freiburg, Tyskland) blir utsatt for gelelektrof orese på 1096 geler. Proteinene blir deretter fiksert til gelen i 796 eddiksyre i 30 min. Gelen blir vasket i lektinbuffer med følgende sammensetning:

Vaskinen fortsettes helt til pE-verdien er omtrent 7.3

Gelen blir deretter forsiktig belagt med 2 ml lektinbuffer inneholdende 3 mg hemoglobin, 100 pg konkanavalin A og 2 pCi 125I-konkanavalin A.

En annen identisk gel blir belagt med blandingen nevnt ovenfor suplementert med 0.2 M a-metyl-mannosid. Etter 3 t inkubasjon i et fuktet kammer blir gelene omfattende vasket i lektinbuffer, tørket og utsatt for røntgenstrålefilmer. Uten a-metyl-mannosid blir både Ukidan og gjær scu-PA merket med <125>1-konkanavalin. Deres molekylvekter er essensielt iden-tiske. I nærvær av a-metyl-mannosid, en konkurrerende inhibitor til lektin-binding, forsvinner det humane urin urokinase, mens gjær scu-PA enda er synlig. Dette indikerer at gjær scu-PA blir glykosylert og at glykosyleringen er av en annen type sammenlignet med humant urin urokinase.

Eksempel 18: Videre rensing av scu- PA

En oppløsning av scu-PA (jfr. eksempel 16) dialysert mot 0.05

M Tris-HCl pH 8.0, 0.05 % Tween 80, 0.05 M NaCl blir applisert på en 3 ml benzamidin-Sepharose kolonne (Pharmacia, Uppsala, Sverige) og vasket med Tris-HCl pH 8.0 buffer inneholdende 1 M NaCl. Scu-PA kommer fullstendig ut i gjennomstrømningsvæsken og i vaske-oppløsningen mens biprod-uktet tcu-PA blir eluert fra kolonnen med 0.05 M Tris-HCl pH 8.0 buffer, inneholdende 1 M L-arginin. Scu-PA som er blitt tilveiebragt har en renhet på omtrent eller mer enn 98%.

Eksempel 19: Mutasjon av glvkosyleringssetet ved fAsn302l til urokinase B- kjeden: a) Kloning av Pstl-BamHI fragmentet til u-PA inn i M13mpl8: Plasmidet pJDB207/PH05-I-UPA (se eksempel 3) inneholder hele det kodende området til urokinase. DNAet blir spaltet med Pstl og BamHI. 886 bp Pstl-BamHI fragmentet fra urokinasegenet inneholder glykosyleringssetet (Asn302) ved nukleotidposisjonene 1033-1041. Et annet fragment med lignende størrelse blir videre spaltet med BstEII. 886 bp Pstl-BamHI fragmentet blir isolert på en preparativ 0. 8% agarosegel. M13mpl8 RF-DNA blir spaltet med Pstl og BamHI. 7.3 kb fragmentet blir isolert på en preparativ 0. 8% agarosegel. DNA-fragmentene blir elektroeluert fra agarosegelen og renset ved DE52 kromatografi og etanolpresipitasjon.

0.1 pmol av 7.3 kb Pstl-BamHI spaltet vektor og 0.2 pmol av 886 bp Pstl-BamHI u-PA fragmentet blir ligert. 1 pl og 3pl av ligeringsblandingen blir brukt for transformering av E. coli JM109 Ca<++> celler i henhold til manualen "M13 kloning og sekvenseringshåndbok" publisert av Amersham. 12 fargeløse plaque blir plukket og enkelt-trådet DNA blir fremstilt [J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)]. Enkelt-trådet DNA blir brukt til å fremstille delvis dobbelt-trådet DNA ved sammensmelting og utviding av M13 universalprimer med Klenowpolymerase. Reaksjonsproduktet blir ekstrahert med fenol/kloroform og DNA blir presipitert med etanol. DNAet blir spaltet med Pstl og BamHI. Et 886 bp fragment indikerer at u-PA fragmentet er blitt klonet inn i M13mpl8 vektoren. En klon blir videre analysert og det riktige innskuddet blir bekreftet ved sekvensering. Klonen blir referert til som M13mpl8/UPA.

b) Mutasjon av glykosyleringssetet ved Asn302:

De mutagene og sekvenseringsprimerene blir fremstilt ved bruk

av fosforamidit fremgangsmåten [M.H. Caruthers, i: Chemical

and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, (ed. H.G. Gassen og A. Lang) Verlag Chemie, Weinheim, Federal Republic of Germany] på en Applied Biosystem Model 380B syntesemaskin.

In vitro mutagenese på enkelt-trådet templat-DNA blir utført som beskrevet ved T.A. Kunkel [Proe. Nat. Acad. Sei. USA 82, 488-492 (1985)]. Uracil inneholdende enkelt-trådet templat-DNA blir fremstilt ved en vekstcykel i E. coli stamme RZ1032 (dut~, ung-).

100 pmol av den mutagene oligonukleotidprimer W blir fosforylert i 20 pl 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.5 mM ATP og 20 enheter T4 polynukleotidkinase (Boehringer). Etter 30 min. ved 37°C blir reaksjonen stoppet ved oppvarming til 70°C i 10 min.

0.3 pmol av uracil inneholdende M13mpl8/UPA templat-DNA blir inkubert med 10 pmol fosforylert mutagen oligodesoksyribonukleotid primer " og 10 pmol M13 universal sekvenserings-primer i 30 pl 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2. Prøven blir varmet opp til 80°C og latt avkjøles i romtemperatur i et lite vannbad.

c) Forlengelses-ligeringsreaksjon:

Til den ovenfor sammensmeltede prøven blir 10 pl av en enzym-dNTP-blanding inneholdende 1 mM dNTPs, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 400 enheter T4 DNA-ligase (Biolabs, 400 U/pl) og 6 enheter Klenow DNA-polymerase (Boehringer, 6 U/pl). Inkuberingen foregår ved 15 °C over natten. d) Transformasjon av E. coli BMH71-celler: Ligeringsblandingen blir fortynnet til 200 pl med TE. 0,1 pl, 1 pl og 10 pl av forlengelses-ligeringsblandingen blir satt til kompetente E. coli BMH71 CA<2++> celler (Kunkel, ovenfor). Etter 30 min. på is blir cellene utsatt for varme-sjokk i 3 min ved 42° C og deretter holdt på is. Cellene blir sådd med topp-agar og E. coli JJM101 indikator-celler. 6 plaques blir plukket og brukt til å infektere E. coli JM109. Fag blir isolert fra supernatanten ved PEG-presipitasjon. Enkelt-trådet DNA blir fremstilt ved ekstraksjon med fenol og presipitasjon med etanol. Templat-DNA blir resuspendert i TE.

Muteasjon av AAT-kodonet (Asn302) til CAA-kodonet (Gln302) blir bekreftet for en klon ved DNA-sekvensbestemmelser med den ovenfor nevnte sekvenseringsprimeren ved bruk av kjede-termineringsfremgangsmåten [F. Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 74, 5463-67 (1977)]. Mutasjonen resultere i Asn -» Gin forandring i aminosyreposisjon 302 til u-PA og dermed eliminerer det eneste glykosyleringssetet i urokinase. W betegner mutasjon av glykosyleringssetet i u-PA B-kjeden (Asn302 -► Gln302). Ingen andre mutasjoner er tilstede i u-PA kodende sekvens. Den positive klonen blir referert til som M13mpl8/UPA-W.

Eksempel 20: Mutasjon av |" Lysl35l > Gly:

Proteolytisk spalting av scu-PA ved Lysl35-Lysl36 binding fører til dannelsen av lavmolekylvekt-urokinase. Det to-basiske spaltningssetet blir eliminert ved in vitro mutasjon av [Lysl35] til glysin.

Fremgangmsmåten for in vitro mutagenese er beskrevet i eksempel 19. Mutert enkelttrådet plusstråd blir fremstilt. Mutasjon AÅA-kodonet (Lysl35) til GGT-kodonet (Gly) blir bekreftet ved DNA-sekvensering ved bruk av M13 universal primer (Biolabs). Mutasjon [Lysl35] —> resulterer i eliminering av det protolytiske spaltningssetet ved aminosyre 135 i A-kjeden til urokinase. En klon med det muterte DNA er referert til som M13mpl8/UPA-LG.

Eksempel 21: Mutasjon av [" Lysl35l — > Ser:

Aminosyre [Lysl35] blir mutert til serin på en måte som er analog til eksempel 20.

Mutasjonen av AAA-kodonet (Lysl35) til AGT-kodonet (Ser) blir bekreftet ved sekvensering av enkelttrådet templat-DNA ved bruk av M13 universalprimer. En klon med den riktige mutasjonen blir referert til som M13mpl8/UPA-LS.

Eksempel 22: Mutasjon av rPhe! 57] — > Asp:

Enkeltkjedet u-PA blir omdannet til tokjedet u-PA ved proteolytisk spaltning ved plasmin av Lysl58-Ilel59 binding. Trombin spalter Argl56-Phel57 bindingen. For å forhindre proteolytisk spaltning av scu-PA ved plasmin og trombin [Phel57] blir mutert til Asp.

Mutasjon av TTT-kodonet (Phel57) til GAC-kodonet (Aspl57) blir bekreftet ved DNA-sekvensering ved bruk av M13 universal primer (Biolabs). Mutasjonen [Phel57] —> Asp resulterer i eliminering av det proteolytiske spaltningssetet for trombin ved aminosyreposisjon 156 og plasmin ved aminosyreposisjon 158 i enkjede-urokinase. En klon med det muterte DNA blir referert til som M13mpl8/UPA-P.

Eksempel 23: Overføring av mutasjon rGln302l fra M13- klonen til gjærekspresjonskassetten

M13mpl8/UPA-W inneholder et mutert DNA-innskudd som koder for en aminosyresekvens med en eneste forandring (Gln302) som eliminerer glykosyleringssetet i urokinase B-kjeden. DNA-fragmentet med mutasjonen blir overført til gjærekspresjons-plasmid pJDB207/PH05-I-UPA.

Plasmid pJDB207/PH05-I-UPA blir spaltet med Sali og BamHI. Det 6,6 kb vektorfragmentet blir isolert. Den inneholder 3'-delen av u-PA-genet fra BamHI-setet ved nukleotidposisjon 1323 (Fig. 1) til posisjon 1441 (PvuII-setet med Xhol-linkere tilsatt) og PH05 transkripsjonstermineringssignaler.

pJDB207/PH05-I-UPA blir spaltet med Sali og Pstl. Det 1.2 kb Sall-Pstl fragmentet blir isolert og elektroeluert fra gelen. DNA-fragmentet inneholder Sall-BamHI sekvensen til pBR322, PH05-promoteren, invertasesignalsekvensen og den u-PA-kodende sekvensen opp til Pstl-setet.

RF-DNA blir fremstilt fra M13mpl8/UPA-W (se eksempel 19) med bruk av den raske DNA-isoleringsfremgangmsmåten [D.S. Holmes et al., Analyt. Biochem. 114 (1981), 193-197). 5 pg DNA blir spaltet med BamHI og Pstl. Etter tilsetting av 2 pg RNase (Serva) og 5 min. inkubering ved 37°C, blir 886 bp Pstl-BamHI fragmentet isolert på en preparativ 0,856 agarosegel. DNA-fragmentet blir elektroeluert og presipitert i etanol. Fragmentet inneholder mutasjon AAT —> CAA ved nukleotidposisjoner 1033-1035 (Asn302 —> Gin) i urokinase B-kjeden. 0.2 pmol av hver av 1.2 kb Sal I-Pstl fragmentet og 886 bp Pstl-BamHI fragmentet og 0.1 pmol avv 6.6 kb Sal I-BamHI vektorfragmentet blir ligert. Kompetent E. coli HB101 Ca<2++ >celler blir transformert. 12 ampicillin-resistente transformanter blir latt vokse. Plasmid DNA blir isolert og analysert ved EcoRI og Hindlll restriksjonsspaltninger. Mutasjonen (W) ved glykosyleringssetet ødelegger EcoRI-setet ved nukleotidposisjonene 1032-1037. Nærvær av mutasjonen blir bekreftet ved DNA-sekvensering. Et plasmid DNA med mutasjonen blir referert til som pJDB 2 0 7/PHO 5-1-UPA-W.

På lignende måte blir Pstl-BamHI fragmenter til M1318/UPA-P, M13mpl8/UPA-LG og M13mpl8/UPA-LS brukt for konstruksjon av pJDB207/PH05-I-UPA-P, pJDB207/PH05-I-UPA-LG og pJDB207/PH05-I-UPA-LS, respektivt.

Eksempel 24: Konstruksjon av plasmid pJDB207/ PH05- I- UPA- LGP: For å forhindre proteolytisk spalting av scu-PA, blir mutasjonene til aminosyresekvensen ved posisjon 135 (Lys —> Gly) og ved posisjon 157 (Phe —> Asp) kombinert og blir kodet i plasmid pJDB207/PH05-I-UPA-LGP.

pJDB207/PH05-I-UPA-lg (se eksempel 23) blir spaltet med Sali og Ball. Det 1,3 kb Sall-Ball fragmentet inneholder Sall-BamHI sekvensen til pBR322, PH05-promoteren, invertasesignal-

sekvensen og u-PA kodende sekvensen opp til Ball-setet som bærer Gly 135-mutasjonen.

Plasmid pJDB207/PH05-I-UPA-P (se eksempel 23) blir spaltet med Ball og BamHI. Det 0.7 kb Bal I-BamHI fragmentet er et indre fragment av u-PA kodende sekvensen som bærer Aspl57-mutasjonen.

1.3 kb SalI-BalI fragment, 0.7 kb BalI-BamHI fragment og 6.6 kb SalI-BamHI vektorfragment (eksempel 23) blir ligert. Kompetente celler fra E. coli HB101 blir transformert. Plasmid DNA til transformantene blir isolert og analysert ved restriksjonsspaltninger og DNA-sekvensering. En enkelt klon med den ventede nukleotidsekvensen som koder for mutasjonene Glyl35 og Aspl57 blir selektert og referert til som pJDB207/PH05-I-UPA-LGP.

På en analog måte blir pJDB207/PH05-I-UPA-LSP konstruert ved bruk av Sall-Ball fragmentet til pJDB207/PH05-I-UPA-LS.

Eksempel 25: Konstruksjon av plasmid pJDB207/ PH05- I- UPA- LGPW som koder for TG1V135. Aspl57. Gln302l- u- PA

Kombinasjonen av tre mutasjoner i u-PA aminosyresekvensen ved posisjonene 135, 157 og 302 resulterer i [Glyl35, Aspl57, Gln302]-u-PA. Dette nye urokinasemolekylet har det proteolytiske spaltningssetet ved posisjon 135 (Lys —> Gly) og 157 (Phe Asp) likeledes glykosyleringssetet ved posisjon 302 (Asn Gin) eliminert ved mutasjon.

Plasmid pJDB207/PH05-I-UPA-LGPW koder for urokinasemutanten og blir konstruert på følgende måte: Plasmid pJDB207/PH05-I-UPA-LGP blir spaltet med Sali og Xhol. Det 2.2 kb Sall-Xhol fragmentet blir isolert, elektroeluert fra agarosegelen, renset ved DE52-kromatografi og presipitert i etanol. Dette DNA-fragmentet inneholder tre Mstl seter i PH05 promoteren og u-PA sekvensen. 3 pg av 2.2 kb Sal I-Xhol fragmentet blir delvis spaltet med 3 enheter Mstl ilt ved 37° C. Reaksjonsproduktene blir separert på en preparativ 0,89é agarosegel og 1.7 kb Sall-Mstl fragmentet blir isolert og elektroeluert fra gelen. DNA-fragmentet inneholder Sall-BamHI sekvensen til pBR322, PH05-promotoren, invertasesignalsekvensen og u-PA kodende sekvensen opp til Mstl-setet ved nukleotid posisjon 935.

5 pg RF-DNA fra MISmplS/UPA-W (se eksempel 19) blir spaltet med BamHI og Mstl. Etter tilsetting av 2 pg RNase (Serva) og inkubering i 5 min ved 37°C blir 387 bp Mstl-BamHI fragmentet isolert på en preparativ 0.856 agarosegel. DNA-f ragmentet blir elektroeluert og presipitert i etanol. Fragmentet inneholder mutasjonen AAT —> CAA ved nukleotidposisjonene 1033-1035 (Asn302 —> Gin) i urokinase B-kjeden.

1.7 kb SalI-Mstl fragment, 387 bp Mstl-BamHI fragment og 6.6 kb SalI-BamHI vektorfragment (eksempel 23) blir ligert. Kompetente celler av E. coli HB101 blir transformert med en aliquot av 1igeringsblandingen. Plasmid DNA fra amp<R->transformanter blir isolert og analysert ved Hindlll og EcoRI restriksjonsspaltninger og ved DNA-sekvensering. En enkelt klon med den ventede nukleotidsekvensen til dets u-PA innskudd kodende for mutasjonene Glyl35, Aspl57 og Gln302 blir selektert og referert til som pJDB207/PH05-I-UPA-LGPW.

På en analog måte blir pJDB207/PH05-I-UPA-LSPW konstruert ved bruk av Sall-Mstl fragmentet til pJDB207/PH05-I-UPA-LSP.

Eksempel 26: Transformasjon av S. cerevisiae stammene HT246 og GRF18 og oppdyrking av de transformerte stammene. Saccharomyces cerevisiae stammer HT246 og GRF18 blir transformert med plasmidene

pJDB207/PH05-I-UPA-W

pJDB207/PH05-I-UPA-P

PJDB207/PH05-I-UPA-LG

pJDB207/PH05-I-UPA-LS

pJDB207/PH05-I-UPA-LGP

pJDB207/PH05-I-UPA-LSP

pJDB207/PH05-I-UPA-LGPW

pJDB207/PH05-I-UPA-LSPW

ved bruk av transformasjonskontroll beskrevet av Hinnen et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)]. Transformerte gjærceller blir selektert på gjær minimalmediumskåler som mangler leucin. Enkelte transformerte gjærkolonier blir isolert og referert til som

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-W Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-P Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LG Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LS Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LGP Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LSP Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LGPW Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PH05-I-UPA-LSPW Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-W Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-P Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LG Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LS Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LGP Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LSP Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LGPW Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LSPW.

Stammene blir dyrket på en analog måte som beskrevet i eksempel 14. scu-PA mutantproteiner blir isolert på en analog måte som beskrevet i eksemplene 16 eller 18.

Eksempel 27: Første farmasøytiske preparat for parenteral administrasjon

En oppløsning for parenteral administrasjon blir fremstilt ved oppløsning av 3 mg renset scu-PA, 25 mg mannitol og 45 mg natriumklorid i 5 ml sterilisert vann og sammenblanding av den resulterende oppløsning med et egnet volum av 5$ glukose-oppløsning. Oppløsningen blir sterilisert ved filtrering gjennom et 0,22 pm membranfilter.

Eksempel 28: Andre farmaøytiske preparat for parenteral administrasjon ( di sper sjon for in. ieks. 1on)

169.3 mg soyabønnelecitin (soyabønne fosfatid NC 95, leveran-dør: Nattermann, Cologne, Tyskland; renhet 90-96$; fettsyre-sammensetning: linolsye 61-71$, linolensyre 4-7$, oljesyre 6-13$, palmitinsyre 10-15$, stearinsyre 1,5-3,5$) og 92,7 mg ren natriumglykokolat blir løst opp i 752,5 ml sterilt vann. Oppløsningen blir justert til pH 7,4 med 1 N NaOH. 10 mg frysetørret scu-PA blir tilsatt. Blandingen blir omrørt helt til en klar oppløsning er tilveiebragt. Oppløsningen blir sterilisert ved filtrering gjennom en 0,22 pm membranfilter og fylt inn i ampuller.

Farmasøytiske preparater som inneholder scu-PA mutanter som aktiv ingrediens blir fremstilt på en analog måte som beskrevet i eksemplene 27 og 28.

Deponering av mikroorganismer

Følgende mikroorganismestammer ble deponert ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM),

<*> Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen,

<**> Mscheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig

(deponeringsdatoer og aksesjonsnummer gitt):

<*> Saccharomyces cerevisiae HT246: April 15, 1987; DSM 4084; <**> Escherichia coli HB101/pCS16: Oktober 23, 1987; DSM 4294; <**> Escherichia coli HB101/p31R/SS-TPAA2: Oktober 23, 1987; DSM 4295; <**> Escherichia coli HB101/pcUK176: Oktober 23, 1987; DSM 4290; <**> Escherichia coli JM109/pDP38: Februar 19, 1988; DSM 4414.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt human enkelt kjede urokinase-type plasminogenaktivator med formel I hvor X-L og X2 uavhengig fra hverandre representerer Lys, et aminosyreresidie som er forskjellig fra et basisk aminosyreresidie eller en kjemisk binding, er Arg, et aminosyreresidie forskjellig fra et basisk aminosyreresidie eller en kjemisk binding, Y2 er Phe, et surt aminosyreresidie eller en kjemisk binding, Y3 er Lys, et aminosyreresidie som er forskjellig fra et basisk aminosyreresidie eller en kjemisk binding, er Asn som er gjær-spesifikt glykosylert eller som er annet aminosyreresidie, og Z2 er Thr eller et annet aminosyreresidie forskjellig fra Ser, karakterisert ved at den innbefatter oppdyrking under hensiktsmessige næringsbetingelser en gjærstamme transformert med en hybrid vektor inneholdende en gjærekspresjonskontrollsekvens, et DNA-segment inneholdende en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid oppstrøms for og i leseramme med en andre DNA-sekvens som koder for biologisk aktiv urokinase-type plasminogenaktivator, hvor DNA-segmentet er under transkripsjonen kontroll til nevnte ekspresjonskontrollsekvens, og en DNA-sekvens inneholdende transkripsjonstermineringssignaler til et gjærgen, og isolering av nevnte biologiske aktive urokinase-type plasminogenaktivator .

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av en biologisk aktiv protease-resistent mutant av human enkeltkjede urokinase-type plasminogenaktivator eller en biologisk aktiv mutant av human enkeltkjede urokinase-type plasminogenaktivator, karakterisert ved at den innbefatter at glykosyleringssetet er modifisert slik at glykosylering ikke kan foregå ved dette setet.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein med formel I henhold til krav 1, karakterisert ved at Xi er Lys, Gly eller Ser, X2 står for Lys, Y^ er Arg, Y2 er Phe, Asp eller Glu, Y3 er Lys, Z^ er Asn som er gjærspesifikt glykosylert eller Gin og Z2 er Thr.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av en plasminogenaktivator, karakterisert ved at den innbefatter at den blir selektert fra gruppen bestående av scu-PA, [Glyl35]-scu-PA, [Serl35]-scu-PA, [Aspl57]-scu-PA, [Serl35,Aspl57]-scu-PA og [Glyl35,Aspl57]-scu-PA hvor Asn <302 >er gjærspesifikt glykosylert, [Gln302]-scu-PA, [Glyl35,Aspl57,Gln302]-scu-PA og [Serl35,Aspl57,Gln302]-scu-PA.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gjærstammen er en stamme fra Saccharomyces cerevisiae.