FI98219C - Menetelmä urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin tuottamiseksi - Google Patents

Description

9 u 2 1 y

Menetelmä urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaatto-rin tuottamiseksi

Keksintö koskee uutta menetelmää proteiinien, tarkemmin sanottuna urokinaasityyppisten seriiniprote-aasien tuottamiseksi. Mainittuun menetelmään sisältyy geeniteknologialla aikaansaatujen hiivakantojen käyttö. Edelleen keksintö koskee uusia urokinaasityyppisiä proteiineja, tällaisia proteiineja koodittavia DNA-sekvensse-jä, tällaisen DNA-sekvenssin sisältäviä yhdistelmävekto-reita, mainittuja geeniteknologisesti aikaansaatuja hii-vakantoja ja menetelmiä mainittujen DNA-sekvenssien, yh-distelmävektorien ja hiivakantojen tuottamiseksi.

Urokinaasiplasminogeenin aktivaattori eli uroki-naasityyppinen plasminogeenin aktivaattori (käytetään jäljempänä lyhennettä "u-PA") on seriiniproteaasi, joka proteolyyttisen katkaisun avulla aktivoi plasminogeenin plasmiiniksi. Plasmiini on voimakas proteaasi, joka kykenee hajottamaan veritulppien fibriiniverkon liukoisiksi hajoamistuotteiksi.

u-PA eristettiin ensimmäiseksi ihmisen virtsasta, mutta viljeltyjen munuaissolujen ja eräiden kasvainsolulin-jojen tiedetään myös erittävän sitä. Sitä valmistuu ensin yksiketjuisena molekyylinä (käytetään jäljempänä lyhennettä "scu-PA") ja se voidaan proteolyyttisesti plasmiinin vaikutuksesta muuntaa kaksiketjuiseen muotoon (käytetään jäljempänä lyhennettä "tcu-PA"), jossa kyseiset kaksi ketjua ovat kiinni toisissaan disulfidisillan välityksellä. u-PA:ssa on ainut glykosyloitumiskohta Asn302:ssa.

Koska scu-PA:11a on vain vajavaista amidolyyttistä , aktiivisuutta molekyylipainoltaan pieniä synteettisiä substraatteja kohtaan, sitä pidettiin viime aikoihin asti aktiivisen tcu-PA-entsyymin varsinaisena proteolyyttisesti inaktiivisena prekursorina. Uudenroat tulokset ovat kuitenkin osoittaneet, että scu-PA aktivoi e- r ' ' -1 < .

S < · / ! S

2 7 V- " plasminogeenia tehokkaasti plasmiiniksi, ja että sillä on huomattavasti suurempi selektiivisyys fibriinin suhteen kuin tcu-PA:lla (ks. H.R. Lijnen et ai., J. Biol. Chem. 261, 1253 (1986)). scu-PA:n yllättävän fibrinolyyttisen aktiivisuuden ja tulppaspesifisyyden mekanismeja on tutkittu (Lijnen et ai., supra; D. Collen et ai., J.

Biol. Chem. 261, 1259 (1986)). On osoitettu, että scu-PA ei ole inaktiivinen tsymogeeni, vaan aktivoi plasmino-geenin muuttumatta ensin tcu-PA:ksi. tcu-PA-.sta poiketen inhiboi tähän mennessä tuntematon plasman komponentti kompetitiivisesti scu-PA:ta, johon inhiboitumiseen on fibriinillä tai fibriinin fragmenteilla, so. hyytymällä, käänteinen vaikutus. Kiertäessään veressä ei scu-PA näin ollen in vivo-olosuhteissa aktivoi plasminogeenia.

Sen fibrinolyyttinen aktiivisuus säilyy kohdistuakseen rajoitetusti oikeaan kohteeseen. Sitä vastoin tcu-PA kykenee aktivoimaan plasminogeenin missä tahansa verenkierron kohdassa, mistä on seurauksena ei-toivottuja sivuvaikutuksia, kuten verenvuotoja. Nämä ominaisuudet tekevät scu-PA:sta etusijalle asetettavan urokinaasityyp-pisen plasminogeenin aktivaattorin.

Geeniteknologian keinoin on nyt mahdollista tuottaa proteiineja, kuten scu-PA:ta, teollisessa mittakaavassa. Kirjallisuudessa on kuvattu geeniteknologisia menetelmiä scu-PA:n tuottamiseksi sillä perusteella, että perimän u-PA-DNA:n (A. Riccio et ai., Nucleic Acids Research 13, 2759 (1985)) ja U-PA-cDNA:n (W.E. Holmes et ai., Biotechnology 2> 923 (1985)) rakenne tunnetaan. Niinpä ilmentyminen E. colissa on saatu tapahtumaan seuraavien julkaisujen mukaisesti: W.E. Holmes et ai. (supra), P. Jacobs et ai., (DNA 139 (1985)), M.E. Winkler et ai. (Biochemistry .25, 4041 (1986)), M. Nagai et ai. (Gene .36,183 (1985)), sekä belgialainen patenttijulkaisu no. 900 826, japanilainen patenttijulkaisu no. 61 181 377 ja eurooppalainen patenttihakemus julkaisu no. 92 182. scu-PA:n ilmentämistä eläinsoluissa on selostettu euroop-

3 O f: OIO

/1/. i 7 palaisissa patenttihakemusjulkaisuissa no. 92 182 ja 154 272. Kaikkiin näihin ennestään tunnettuihin menetelmiin liittyy vakavia haittoja. On osoittautunut vaikeaksi kasvattaa eläinsoluja suuressa mittakaavassa, mikä kuitenkin on edellytys näiden solujen tuottamien proteiinien edulliselle ja taloudelliselle tuotannolle. Eläinsolujen generaatioaika on huomattavasti pitempi kuin mikro-organismien, mikä vaatii pitempää fermentointi-aikaa, jotta saavutetaan riittävän korkea solutiheys. Lisäksi eläinsoluja viljeltäessä saavutettava solutiheys on huomattavasti alhaisempi kuin mikro-organismeja suuressa mittakaavassa viljeltäessä yleensä saavutettu solutiheys. Lisäksi kantojen parantaminen on vaikeampaa kuin mikro-organismeilla. Toisaalta E. colissa tuotetuista proteiinivalmisteista löytyy usein kontaminoivia endotok-siineja. Nämä pitää poistaa kalliilla ja aikaavievillä puhdistuksilla. E. colin tuottamat proteiinit ovat aina glykosyloitumattomia, koska E. colilla ei ole sellaista entsyymijärjestelmää, jonka avulla hiilihydraattiketju liittyy proteiinimolekyylin tiettyihin kohtiin. Näin ollen geeniteknologialla E. colissa tuotettu scu-PA on glykosyloitumatonta, toisin kuin luontainen scu-PA. Kirjallisuudessa on mainittu, että E. colin tuottama scu-PA esiintyy amorfisena liukenemattomana polymeerinä johtuen disulfidisiltojen epätäydellisestä sijainnista rivissä sekä proteiinin väärästä laskostumisesta. Näin ollen vaaditaan biologisesti aktiivisen proteiinin aikaansaamiseksi vähintään yksi lisälaskostusvaihe, jossa tarvitaan suuria määriä liuotinta (M.E. Winkler et ai., supra).

Kun otetaan huomioon ennestään tunnettujen menetelmien haitat, on olemassa jatkuva tarve paremmille menetelmille, joilla voitaisiin tuottaa biologisesti aktiivista scu-PA:ta suuressa mittakaavassa. Esillä oleva keksintö tarjoaa tällaisia menetelmiä.

Nyt on yllättäen havaittu, että S. cerevisiae-hiivasolut, jotka ovat transformoituneet yhdistelmävekto-rilla, joka sisältää ihmisen u-PA:ta koodittavan sekvenssin liitettynä S. cerevisiaen geenin signaalisekvenssin,

c ^ O ·; Q

tuottavat scu-PA:ta, jonka biologinen aktiivisuus vastaa luontaisen scu-PA:n biologista aktiivisuutta, ja joka on hiivan spesifisesti glykosyloima. Huomattakoon, että hiivan scu-PA on täysin aktiivista ilman mitään in vitro-uudelleenlaskostuksia.

Näin ollen esillä oleva keksintö koskee menetelmää ihmisen yksiketjuisen urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin tuottamiseksi siten, että sopivissa ravinneolosuhteissa viljellään S. cerevisae-hiivakantaa, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, joka sisältää S. cerevisiaen ilmentymisensäätelysekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvai-heistuksessa toiseen DNA-sekvenssiin nähden, joka koodittaa kypsää urokinaasityyppistä plasminogeenin aktivaatto-ria ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentymisensäätelysekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja DNA-jakson, joka sisältää S. cerevisiaen geenin transkrip-tionlopetussignaalit, ja mainittu urokinaasityyppinen plasminogeenin aktivaattori eristetään.

Termi "kypsää urokinaasityyppistä plasminogeenin aktivaattoria koodittava DNA-sekvenssi" on tarkoitettu kattamaan kaikki ne u-PA:n alleelliset muodot, joiden tiedetään esiintyvän ihmisen perimässä, tai jotka voidaan eristää siitä. Näistä DNA-sekvensseistä puuttuvat kaikki mahdolliset pre- ja/tai prosekvenssit.

Termin "scu-PA-proteiinit", missä tahansa sitä edellä tai jäljempänä onkin käytetty, tarkoitetaan kattavan scu-PA:n.

Erityisesti keksintö koskee menetelmää kaavan I mukaisten scu-PA-proteiinien tuottamiseksi

Ser Asti Glu Leu His Gin Vai Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cy6 Vai Ser Asn

Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe

Gly Gly Gin His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu

Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met

Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Vai Leu Gin Gin

Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu Gly Leu Gly

Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp

Cys Tyr Vai Gin Vai Gly Leu Lys Pro Leu Vai Gin Glu Cys Met 5 r γ· n r> L/ (L. i y

Vai His Asp Cys Ala Asp Gly Xj X2 Pro Ser Ser Pro Pro Glu

Glu Leu Lys Phe Gin Cys Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Yi Y2 Y3 Ile lie Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gin Pro Trp

Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Vai Thr Tyr

Vai Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Vai Ile Ser Ala

Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Vai

Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin Gly Glu Met

Lys Phe Glu Vai Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala

Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg

Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gin Pro Ser Arg Thr Ile Gin Thr

Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gin Phe Gly Thr Ser

Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Zi Ser Z2 Asp Tyr Leu

Tyr Pro Glu Gin Leu Lys Met Thr Vai Vai Lys Leu Ile Ser His

Arg Glu Cys Gin Gin Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Vai Thr Thr

Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gin Trp Lys Thr Asp Ser Cys

Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Ser Leu Gin Gly Arg

Met Thr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu

Lys Asp Lys Pro Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser His Phe Leu Pro

Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu jossa kaavassa kumpikin ryhmistä X, ja X2 voi olla Lys, Y1 on Arg, Y2 on Phe, Y3 on Lys, z, on Asn, joka on hiivaspe-sifisesti glykosyloitunut, ja Z2 on Thr.

Keksinnönmukaisia transformoituneita hiivakantoja kasvatetaan nestemäisessä ravinnealustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpi lähteitä ja epäorgaanisia suoloja.

Voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Esimerkkejä etusijalle asetettavista hiililähteistä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, manni-toli tai laktoosi, tai asetaatit, kuten natriumasetaatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni ja lihauutteet, ja 6 O o * n .> o Z i y edelleen hiivauute, mallasuute, maissinliuotusvesi sekä ammoniumsuolat, kuten ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Käytettäviksi sopivia epäorgaanisia suoloja ovat esimerkiksi natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit. Ravinnealusta voi lisäksi sisältää kasvua edistäviä aineita. Kasvua edistäviä aineita ovat esimerkiksi hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms., tai yksittäiset aminohapot.

Hiivasolut, joissa on konstitutiivisen promoottorin (esim. ADHI, GAPDH) sisältävä yhdistelmäplasmidi, ilmentävät mainittuun promoottoriin liitettyä u-PA-geeniä ilman indusointia. Jos u-PA-geeni on säädeltävissä olevan promoottorin (esim. PGK tai PH05) ohjauksessa, pitää kasvualustaan koostumusta säätää, jotta saavutetaan mRNA-transkripteja maksimaalisina määrinä, eli käytettäessä PH05-promoottoria, pitää kasvualustan sisältää epäorgaanista fosfaattia pienenä konsentraationa, jotta tämä promoottori kytkeytyy päälle.

Kasvatus suoritetaan tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Kasvatusolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH ja fermentointiaika, valitaan niin, että scu-PA-proteii-neja valmistuu maksimaaliset määrät. Valittua hiivakan-taa kasvatetaan mieluummin aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelminä ravistelemalla tai sekoittamalla o lämpötilasssa, joka on välillä noin 25 - 35 C, mielellään noin 28°C:ssa, ja alueella 4-7 olevassa pH-arvossa, mielellään pH-arvossa noin 5, noin 20 - 50 tunnin ajan, mutta mielellään siihen asti, kunnes saavutetaan scu-PA-proteiinien maksimaalinen saanto.

Tuotettu scu-PA-proteiini voi kertyä hiivasolujen sisään tai erittyä periplasmiseen tilaan. Jos scu-PA-proteiini on kertynyt solujen sisään, on ensimmäinen vaihe scu-PA-proteiinin talteenotossa sen vapauttaminen solun sisältä. Useimmissa menetelmissä solunseinä poistetaan ensin suorittamalla entsymaattinen hajotus glukosidaaseilla (infra). Sitten näin sadut sferoplas-tit käsitellään pinta-aktiivisella aineella, kuten Tri-

D

ton X-i00:lla. Vaihtoehtoisesti voidaan solujen rikkomiseen käyttää mekaanisia voimia, kuten leikkausvoimia 7 'v j / I s1 (esimerkiksi X-puristinta tai ranskalaista puristinta) tai ravistelua lasihelmien kanssa. Saatu seos rikastetaan scu-PA-proteiinin suhteen tavanomaisilla menetelmillä, kuten poistamalla suurin osa ei-proteiinimateriaalista polyetyleeni-imiinikäsittelyllä ja saostamalla proteiinit ammoniumsulfaatilla ja suorittamalla geelielektroforeesi, dialyysi, kromatografinen käsittely, kuten esimerkiksi ioninvaihtokromatorafia, ekskluusiokromatografia, HPLC tai käänteisfaasi-HPLC, erotus molekyylikoon mukaan sopivassa SephadexR-pylväässä tms. Esipuhdistetun tuotteen lopullinen puhdistuminen saadaan aikaan esimerkiksi affiniteettikromatografiällä, esimerkiksi vasta-aineaffini-teettikromatografiällä ja erityisesti affiniteettikroma-tografialla monoklonaalisia vasta-ainetia käyttäen, jolloin käytetään alalla tunnetuilla menetelmillä liukenemattomaan matriisiin kiinnitettyä monoklonaalista vasta-ainetta, tms. menetelmillä. Kaikkiin puhdistusvaiheissa käytettyihin puskuriliuoksiin on edullista lisätä pinta-aktiivista ainetta, kuten Triton X-100R:ää tai Tween 80R:tä, jotta saadaan estetyksi scu-PA-proteiinin adsorptio astian pintoihin ja parannetuksi stabiilisuutta. Pinta-aktiivista ainetta voidaan lisätä niin, että sen lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 0,01 - 1 %.

Jos hiivasolu erittää scu-PA-proteiinin periplas-miseen tilaan, voidaan käyttää yksinkertaistettua menetelmää: Proteiini otetaan talteen ilman solun rikkomista siten, että solunseinä poistetaan entsymaattisesti tai suoritetaan solunseiniä vahingoittava käsittely kemiallisilla aineilla, esimerkiksi tiolireagensseilla tai EDTA: 11a, niin, että tuotettu scu-PA-proteiini vapautuu.

Jos scu-PA-proteiini erittyy kasvualustaan, se voidaan ottaa suoraan talteen siitä.

Riippuen käytetystä isäntäkannasta sekä puhdistus-menetelmistä, voivat esillä olevan keksinnön mukaiset scu-PA-proteiinit olla kontaminoituneita pienillä määrillä vastaavaa kaksiketjuista muotoa johtuen isäntäsolujen vapauttamasta proteolyyttisestä aktiivisuudesta. Kaksi-ketjuisen muodon erottaminen halutusta yksiketjuisesta CTO 10 8 S y* £- \? muodosta (scu-PA) voidaan suorittaa alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten suorittamalla kromatografia bents- p imidiini-Sepharose :11a (ks. M.E. Winkler et ai.. Biochemistry 25, 4041 (1986)).

Yllättäen eroavat keksinnönmukaisesti tuotetut scu-PA-proteiinit E. colista saadusta scu-PA:sta siinä, että niillä on ihmisen luontaisen scu-PA:n biologinen aktiivisuus ilman, että tarvitsisi suorittaa uudelleenlas-kostus, ja siinä, että ne ovat hiivan spesifisesti glyko-syloimia Asn302:ssa. Hiivan spesifisesti suorittamasta glykosyloinnista johtuen eroavat keksinnönmukaiset scu-PA- proteiinit myös viljellyistä tai transformoituneista eläinsoluista eristetystä scu-PA:sta ja ovat' näiri ollen uusia.

Näin ollen keksintö koskee myös scu-PA:ta, jossa on hiivalle ominainen glykosyloituneisuus, ja erityisesti sellaisia, joissa on Saccaromyces cerevisiaelle ominainen glykosyloituneisuus.

Keksinnönmukaiset transformoituneet S. cere-visiae-hiivakannat voidaan valmistaa geeniteknologisin menetelmin seuraavien vaiheiden kautta: - valmistetaan scu-PA:ta koodittava rakennegeeni, - sijoitetaan näin saatu rakennegeeni sopivaan vektoriin, - transformoidaan S. cerevisiae näin saadulla yhdistelmä-vektorilla, ja valitaan transformoituneet isännät trans-formoitumattomien joukosta.

u-PA:n cDNA:n ja perimän u-PA:n DNA:n nukleotidi-sekvenssit tunnetaan (W.E. Holmes et ai., Biotechnology 2_, 923 (1985); A. Riccio et ai., Nucleic Acids Research 13, 2759 (1985)). Kun u-PA:n cDNA-sekvenssi ja perimän vastaava Dna-sekvenssi tunnetaan, voidaan u-PA:ta koodittava rakennegeeni valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä. Nämä DNA-sekvenssit voidaan valmistaa mm. eristämällä mRNA scu-PA:ta tuottavista ihmisen soluista, kuten ihmisen karsinoomasoluista tai ihmisen alkion munuaisso-luista, valitsemalla haluttu mRNA-laji esim. hybridisoi-malla sopivan DNA-koettimen kanssa, valmistamalla tuolle 9 C f O 1 ο

✓ L· S

mRNA:lie komplementaarinen yksisäikeinen DNA ja sen jälkeen siitä kaksisäikeinen komplementaarinen DNA (ds cDNA) tai eristämällä perimän DNA ihmisen soluista ja valitsemalla haluttu DNA sopivaa DNA-koetinta käyttäen ja tarvittaessa mutatoimalla näin saatu cDNA tai perimän DNA tai valmistamalla rakennegeeni kemiallisesti syntetisoimalla. Keksinnönmukaiset rakennegeenit valmistetaan mielellään mRNA-tietä käyttäen.

Näin ollen esillä olevan keksinnön mukaiset yhdis-telmävektorit sisältävät hiivan ilmentymisensäätelysek-venssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sek-venssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toiseen DNA-sekvenssiin nähden, joka koodittaa kypsää urokinaasityyppistä plasmino-geenin aktivaattoria, ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentymisensäätelysekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja DNA-sekvenssin, joka sisältää hiivan geenin transkriptionlopetussignaalit.

Hiivan ilmentymisensäätelysekvenssit johdetaan hiivan, erityisesti Saccharomyces cerevisiaen perimän DNArsta. scu-PA:n ilmentämiseen käytetään mielellään voimakkaasti ilmentyvän hiivageenin ilmentymisensäätely-sekvenssiä. Näin ollen voidaan käyttää TRPl-geenin, ADHI- tai ADHII-geenin, happofosfataasigeenin (PH05), enolaasigeenin, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi-geenin (GAPDH), 3-fosfoglyseraattikinaasigeenin (PGK), heksokinaasigeenin, pyruvaattidekarboksylaasigeenin, fosfofruktokinaasigeenin, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi-geenin, 3-fosfoglyseraattimutaasigeenin, pyruvaattiki-naasigeenin, trioosifosfaatti-isomeraasigeenin, fosfoglu-koosi-isomeraasigeenin tai glukokinaasigeenin promoottoria tai a- tai oC-teki jää koodittavan hiivan parit-teluferomonigeenin promoottoria. On myös mahdollista käyttää yhdistelmäpromoottoreita, jotka koostuvat yhden ’ hiivageenin ylävirran aktivointisekvensseistä (UAS) sekä toisen hiivageenin alavirran promoottorielementeistä, jotka sisältävät funktionaalisen TATA-jakson, jolloin esimerkkinä mainittakoon yhdistelmäpromoottori, joka sisältää hiivan PH05-geenin UAS(:t) sekä GAPDH-geenin 10 η r- .-1 o > iz i.y alavirran elementit, joissa on mukana hiivan funktionaalinen TATA-jakso. Etusijalle asetettavat keksinnönmukaiset vektorit sisältävät promoottorin, johon liittyy transkription ohjattavuus. Tämäntyyppiset promoottorit, esimerkiksi PH05-geenin promoottori ja PH05-GAPDH-yhdistelmä-promoottori, voidaan kytkeä päälle tai pois päältä kasvatusolosuhteita muuttamalla. Esimerkiksi PH05-pro-moottorin toiminta voidaan tukahduttaa, kun vain nostetaan ravinnealustan sisältämää epäorgaanisen fosfaatin pitoisuutta. Toinen edullinen keksinnönmukainen promoottori on GAPDH-geenin promoottori ja erityisesti sen funktionaaliset fragmentit, jotka alkavat välillä -550 - -180 olevista nukleotideista, erityisesti nukleotidista -540, -263 tai -198, ja päättyvät nukleotidiin -5 GAPDH-geenissä.

Signaalipeptidiä koodittava DNA-sekvenssi ("signaa-lisekvenssi") on mielellään johdettu sellaisesta eukaryoo-tin, esimerkiksi ihmisen tai hiivan, geenistä, joka koodittaa tavallisesti erittyvää polypeptidiä. Sopivia signaalisekvenssejä ovat esimerkiksi ihmisen perimän DNA:sta saatava u-PA:n signaalisekvenssi, hiivan signaali-sekvenssit, kuten hiivan invertaasigeenin, o<-tekijägeenin, feromonipeptidaasigeenin (KEX1), "tappajatoksiinigeenin" ja tukahdutettavissa olevan happofosfataasigeenin (PHOS) signaali- ja preprosekvenssit ja Aspergillus awamorin glukoamylaasin signaalisekvenssi. Vaihtoehtoisesti voidaan rakentaa yhdistelmäsignaalisekvenssejä siten, että liitetään promoottoriin luontaisesti liittyvän geenin signaalisekvenssin (jos sellainen on) osa u-PA:n signaalisekvenssin osaan. Sellaiset yhdistelmät ovat edullisia, jotka mahdollistavat signaalisekvenssin ja kypsän scu-PA:n aminohapposekvenssin välisen tarkan . katkeamisen. Prekursorimolekyylien tarkkaa prosessointia helpottamaan voidaan rakenteisiin sisällyttää myös lisä-sekvenssejä, kuten pro- ja välikesekvenssejä, joissa saattaa olla spesifisiä prosessointisignaaleja, tai joista nämä spesifiset prosessointisignaalit saattavat 11 η Γ' yj o kz j >' puuttua. Vaihtoehtoisesti voidaan aikaansaada yhdistelmä-proteiineja, jotka sisältävät sisäisiä prosessointisignaa-leja, jotka mahdollistavat oikean kypsymisen in vivo tai in vitro. Prosessointisignaalit voivat sisältää esimerkiksi Lys-Arg-tähteen, jonka hiivan Golgi-kalvois-sa sijaitseva endopeptidaasi tunnistaa. Etusijalla asetettavat keksinnönmukaiset signaalisekvenssit kuuluvat hiivan PH05-geenille ja koodittavat seuraavan kaavan mukaista signaalipeptidiä

Met Phe Lys Ser Vai Vai Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala, tai hiivan invertaasigeenille ja kooditttavat seuraavan kaavan mukaista signaalipeptidiä

Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala, tai ihmisen u-PA-geenille ja koodittavat seuraavan kaavan mukaista signaalipeptidiä

Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Vai Leu Vai Vai Ser Asp Ser Lys Gly.

Hiivan transkriptionlopetussignaalit sisältävä DNA-sekvenssi on mielellään sellainen hiivageenin 3'-reu-nasekvenssi, joka sisältää oikeat signaalit transkription lopettamiselle ja polyadenyloitumiselle. Sopivia 3'-reuna-sekvenssejä ovat esimerkiksi luontaisesti siihen geeniin kuuluvat, jota käytetään ilmentymisensäätelysekvenssiä. Etusijalle asetettavat reunasekvenssit ovat hiivan PH05-geenille kuuluvia.

Keksinnönmukaiset yhdistelmäplasmidit sisältävät promoottorin, signaali sekvenssin, u-PA-.ta koodittavan DNA-sekvenssin ja 3'-reunasekvenssien lisäksi lisä-DNA-sekvenssin(-sekvenssejä), joka(jotka) suorittaa(suorittavat) tärkeitä tehtäviä, esimerkiksi mainituilla yhdistel-mäplasmideilla transformoituneiden solujen lisääntymisessä. Lisä-DNA-sekvenssi(-sekvenssit) voi(voivat) olla johdettu (johdettuja) prokaryoottisistä ja/tai eukaryootti-sista soluista ja sisältää kromosomaalisia ja/tai ekstra-kromosomaalisia DNA-sekvenssejä. Lisä-DNA-sekvenssit voi- i2 Q " o ·; o vat olla peräisin (tai koostua) esimerkiksi plasmidi-DNArsta, kuten bakteeriperäisestä tai eukaryoottisesta plasmidi-DNA:sta, virus-DNA:sta ja/tai kromosomaalisesta DNArsta, kuten bakteerin, hiivan tai korkeamman eukaryoo-tin kromosomaalisesta DNArsta. Etusijalle asetettavat yhdistelmäplasmidit sisältävät lisä-DNA-sekvenssejä, jotka on johdettu bakteeriplasmideista, erityisesti Escherichia colin plasmidista pBR322 tai pUC19:lle sukua olevista plasmideista, bakteriofagi X :sta, hiivan 2p-plasmi-dista ja/tai hiivan kromosomaalisesta DNArsta.

Keksinnönmukaisissa edullisissa yhdistelmäplasmi-deissa sisältävät lisä-DNA-sekvenssit hiivan replikoitu-misen aloituskohdan ja vaiintamerkkigeenin hiivaa varten. Yhdistelmäplasmidit, jotka sisältävät hiivan replikoi-tumisen aloituskohdan, esimerkiksi autonomisesti repli-koituvan segmentin (ars), pysyvät hiivasolussa yllä kromosominulkopuolisesti transformoitumisen jälkeen ja replikoituvat autonomisesti mitoosissa. Yhtä hyvin voidaan käyttää yhdistelmäplasmideja, jotka sisältävät hiivan 2ji-plasmidi-DNA: lie homologisia sekvenssejä.

Nämä yhdistelmäplasmidit uudelleenryhmittyvät solun sisässä ennestään olevien hiivan 2^i-plasmidien kanssa tai replikoituvat autonomisesti itse, jos replikoitumisen aloituskohta on läsnä. 2|i-sekvenssit ovat erityisen sopivia suurella frekvenssillä transformoiviin plasmidei-hin ja tuottavat suuria kopiomääriä.

Mitä tulee hiivaan tarkoitettuun valintamerkkigee-niin, voidaan käyttää mitä tahansa merkkigeeniä, joka mahdollistaa transformanttien valinnan merkin fenotyyppi-sen ilmentymisen perusteella. Sopivia dominoivia merkkejä hiivalle ovat erityisesti antibioottiresistenssiä ilmentävät ja auksotrofisten hiivamutanttien tapauksessa geenit, jotka täydentävät isännän vajavuutta. Tällaiset geenit antavat esimerkiksi vastustuskyvyn G418-antibiootille tai hygromysiinille tai prototrofian auksotrofiselle hiivamutantille, esimerkiksi URA3-, LEU2-, HIS3- tai TRPl-geenin.

On edullista, jos keksinnönmukaisissa yhdistelmä-plasmideissa läsnä olevat lisä-DNA-sekvenssit sisältävät C ^ ί r,

it U

X j <· v ί_ ί / myös replikoitumisen aloituskohdan ja valintamerkkigee-nin bakteeri-isäntää, erityisesti Escherichia colia varten. E. colin replikoitumisen aloituskohdan ja E. colin merkin läsnäoloon hiivan yhdistelmäplasmidissa liittyy hyödyllisiä seikkoja. Ensinnäkin, suuria määriä yhdistelmäplasmidi-DNA:ta voidaan saada kasvattamalla ja monistamalla E. colissa ja toiseksi, yhdis-telmäplasmidien rakentaminen on edullista suorittaa E. colissa käyttämällä hyväksi E. coliin perustuvaa laajaa kloonausteknologiaa. E. colin plasmidit, kuten pBR322 tms., sisältävät sekä E. colin replikoitumisen aloituskohdan että E. colin merkkigeenin, joka antaa vastustuskyvyn antibiooteille, esimerkiksi tetrasyklii-nille tai ampisilliinille, ja niitä voidaan edullisesti käyttää hiivan yhdistelmävektoreissa.

Lisä-DNA-sekvensseistä, jotka sisältävät esimerkiksi replikoitumisen aloituskohdat ja merkkigeenit hiiva-ja bakteeri-isäntää varten (ks. edellä), käytetään jäljempänä nimitystä "vektori-DNA", joka siis yhdessä hiivan promoottorin ja scu-PA-proteiinia koodittavan alueen kanssa muodostaa keksinnönmukaisen yhdistelmäplasmidin.

Esillä olevan keksinnön edullinen toteutustapa koskee yhdistelmäplasmideja, jotka kykenevät replikoitu-maan autonomisesti hiivaisäntäkannassa, ja joissa on valintamerkki, ja mainitut yhdistelmäplasmidit sisältävät hiivan ilmentymisensäätelysekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodit-taa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuk-sessa toiseen DNA-sekvenssiin nähden,joka koodittaa kypsää urokinaasityyppistä plasminogeenin aktivaattoria tai sen mutanttia, ja DNA-sekvenssin, joka sisältää hiivageenin transkriptionlopetussignaalit, ja mainittu DNA-jakso on sijoitettu yhdessä transkriptionaloitus-ja -lopetussignaalien kanssa ja kooditettujen luennanaloi-tussignaalien ja -lopetussignaalien kanssa mainittuun yh-distelmävektoriin mainitun ilmentymisensäätelysekvenssin 14 '·<'*. ί ohjaukseen niin, että transformoituneessa hiivakannassa tapahtuu geenin ilmentyminen ja syntyy mainittua uro-kinaasityyppistä plasminogeenin aktivaattoria tai sen mutanttia.

Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdistelmävektorit valmistetaan alalla tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi liittämällä yhteen hiivan ilmentymisensäätelysekvenssi, DNA-jakso, joka koostuu signaalipeptidiä koodattavasta alueesta ja u-PA:ta tai sen mutanttia koodittavasta DNA-sekvenssistä, ja hiivageenin 3'-reunasekvenssi ja vektori-DNA.

Yhdistelmäplasmidien valmistamiseen on edullista käyttää kartoitettua, rengasmaista vektori-DNA:ta, esimerkiksi bakteeriplasmidi-DNA:ta tms. (ks. edellä), jossa on vähintään yksi restriktiokohta, mielellään kaksi tai useampia restriktiokohtia. On edullista, jos vektori-DNA sisältää replikoitumisen aloituskohdat ja merkkigeenit hiivaisännälle ja/tai bakteeri-isännälle. Vektori-DNA katkaistaan sopivaa restriktioendonuk-leaasia käyttäen. Katkaistu DNA liitetään DNA-fagment-tiin(-fragmentteihin), joka(jotka) sisältää(sisältävät) hiivan ilmentymisensäätelysekvenssin, mainitun DNA-jakson ja mainitun DNA-sekvenssin, joka sisältää trans-kriptionlopetussignaalit. Ennen mainitun(mainittujen) DNA-fragmentin(-fragmenttien) liittämistä tai sen jälkeen (tai myös samanaikaisesti) on myös mahdollista tuoda mukaan replikoitumisen aloituskohdat ja/tai merkkigeenit hiiva- tai bakteeri-isäntää varten. Kaikissa tapauksissa valitaan katkaisu- ja liittämisolosuhteet niin, etteivät vektori-DNA:n oleelliset funktiot eikä säätely-sekvenssin ilmentyminen häiriinny. Yhdistelmävektori voidaan rakentaa peräjälkeen liittämällä tai liittämällä yhteen kaksi DNA-jaksoa, jotka sisältävät kaikki tarvittavat sekvenssit.

DNA-jaksojen in vitro-yhteenliittämiseen voidaan käyttää erilaisia menetelmiä. Tasaiset päät (täydelli- 15 Ο Γ 9 1 o S 'w' ί.- : ’ set emäsparit sisältävät DNA-kahdenteet), joita eräät restriktioendonukleaasit saavat aikaan, voidaan liittää suoraan yhteen T4 DNA-ligaasin avulla. Tavallisemmin DNA-jaksot liitetään yhteen yksisäikeisten kohesiivisten päidensä avulla ja suljetaan kovalenttisesti DNA-ligaasin, esimerkiksi T4 DNA-ligaasin, avulla. Yksisäikei-set "kohesiiviset päät" voidaan muodostaa katkaisemalla DNA toisentyyppisillä endonukleaaseilla, jotka tuottavat porrastettuja päitä (DNA-kahdenteen kaksi säiettä katkeaa eri kohdista, jotka ovat muutaman nukleotidin päässä toisistaan). Yksisäikeisiä päitä voidaan myös muodostaa lisäämällä nukleotideja tasaisiin päihin tai porrastettuihin päihin käyttämällä terminaalista transferaasia ("ho-mopolymeerihännitYs") tai yksinkertaisesti vain syömällä tasapäisen DNA-jakson toista säiettä taaksepäin sopivan eksonukleaasin, kuten λ-eksonukleaasin, avulla. Vielä eräs tapa saada aikaan porrastettuja päitä on liittää tasapäiseen DNA-jaksoon kemiallisesti syntetisoitu kytki-jä-DNA, joka sisältää porrastettuja päitä muodostavan endonukleaasin tunnistuskohdan, ja katkaista näin saatu DNA vastaavalla endonukleaasilla.

Keksinnönmukaisen yhdistelmävektorin komponentit, kuten hiivan promoottori, u-PA:n tai sen mutantin raken-negeeni signaalisekvenssi mukaanluettuna, transkription-lopettaja, replikoitumissysteemi jne., liitetään yhteen määrätyssä järjestyksessä, jotta oikea toiminta voidaan taata. Komponentit liitetään yhteen yhteisten restriktio-kohtien avulla tai käyttämällä synteettisiä kytkijämo-lekyylejä, jotta voidaan olla varmoja komponenttien oikeasta suunnasta ja järjestyksestä.

Keksinnönmukaiset transformoituneet hiivakannat valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla eli transformoimalla hiivakanta yhdistelmävektorilla, joka sisältää hiivan ilmentymisensäätelysekvenssin. DNA-jakso, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodit-taa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuk- 16 - „ _

{y; '/ Ί O

sessa toiseen DNA-sekvenssiin nähden, joka koodittaa kypsää urokinaasityyppistä plasminogeenin aktivaattoria tai sen mutanttia, joka DNA-jakso on mainitun ilmenty-misensäätelysekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja DNA-sekvenssin, joka sisältää hiivageenin transkription-lopetussignaalit.

Sopivia hiivaisäntäorganismeja ovat erityisesti Saccharo-myces cerevisiae-kannat.

Hiivasolujen transformointi suoritetaan alalla tunnetuilla menetelmillä. Transformointi voidaan suorittaa esimerkiksi julkaisussa Hinnen et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978) kuvatulla menetelmällä.

Tämä menetelmä voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen, jotka ovat seuraavat: (1) Poistetaan hiivan solunseinä tai sen osia.

(2) "Paljaat" hiivasolut (sferoplastit) käsitellään transformoivalla DNA:11a PEG:n (polyetyleeniglykoli) 2+ ja Ca -ionien läsnäollessa.

(3) Solunseinä regeneroidaan ja transformoituneet solut valitaan kiinteässä agarkerroksessa.

Etusijalle asetettava menetelmä on seuraava: (1) Hiivan solunseinä poistetaan entsymaattisesti käyttämällä erilaisia glukosidaasivalmisteita, kuten

R R

etanan suolinestettä (esim. Glusulase tai Helicase ) tai mikro-organismeista saatuja enstyymiseoksia (esim.

p

Zymolase ), osmoottisesti stabiloiduissa liuoksissa (esim. 1 M sorbitoli).

(2) Hiivan sferoplastit aggregoituvat PEG:n läsnäollessa ja indusoituu sytoplasman kalvojen paikallisia fuusioita. "Fuusionkaltaisten" olosuhteiden aikaansaaminen on välttämätöntä ja monista hiivasoluista tulee diploidisia tai jopa triploidisia transformointi-prosessin kuluessa. Rikastaminen transformanttien suhteen voidaan suorittaa menetelmillä, jotka mahdollistavat fuusioituneiden sferoplastien valinnan, eli transformoituneet solut voidaan helposti seuloa esiin ennalta valittujen fuusioitumistuotteiden joukosta.

ii im i liiti nm 17 or O 10 (3) Koska solunseinättömät hiivasolut eivät jakaannu, pitää solunseinät regeneroida. Tämä regenerointi on edullista suorittaa peittämällä sferoplastit agariin. Sferoplastit voidaan esimerkiksi sekoittaa sulaan (noin 50°C) agariin. Kun liuos jäähdytetään hiivan kasvu-lämpötilaan (noin 30°C), saadaan kiinteä kerros. Tämä agarkerros estää elintärkeiden makromolekyylien nopean diffuusion ja menetyksen sferoplasteista ja mahdollistaa näin ollen solunseinän regeneroitumisen. Solunseinän regeneroituminen voidaan myös saavuttaa (vaikkakin pienemmällä teholla) maljäämällä sferoplastit ennalta muodostettujen agarkerrosten pinnalla.

Regenerointiagar on edullista valmistaa niin, että transformoituneiden solujen regenerointi ja valinta voidaan suorittaa samalla kertaa. Koska valintamerkkeinä käytetään’yleensä sellaisia hiivageenejä, jotka koodit-tavat aminohapon biosynteettisen reitin entsyymiä (supra), on regenerointi edullista suorittaa hiivan minimiravinne-agarissa. Jos hyvin suuria regeneroitumistehokkuuksia tarvitaan, on seuraava kaksivaiheinen menetelmä edullinen: (1) solunseinät regeneroidaan ravinnerikkaassa alustassa ja (2) transformoituneet solut valitaan maljaa-malla solukerroksen jäljennös valinta-agarmaljassa.

Jos yhdistelmävektori ei sisällä mitään merkki-geeniä, voidaan transformiotuneet solut tunnistaa myös vaihtoehtoisilla menetelmillä. Tällaisia menetelmiä ovat esimerkiksi in situ-hybridisointi leimatun DNA-fragmentin kanssa, joka on homologinen yhdistelmävekto-rin sekvenssien kanssa (esim. Hinnen et al:n, supra, menetelmällä), in situ-immunomääritykset edellyttäen, että mukaan sisällytetyn geenin tuotteen vasta-ainetta on tarjolla, tai muut seulontamenetelmät, jotka mittaavat transformoivan(transformoivien) plasmidin(plasmidien) geenituotteitä.

Vaihtoehtoisesti voidaan hiiva yhteistransformoida keksinnönmukaisella yhdistelmävektorilla ja toisella, hiivan merkkigeenin sisältävällä vektorilla. Jos näillä ie Ο Γ 1;.

kahdella eri vektorilla on samoja DNA-sekvenssejä (nämä voivat olla bakteeriperäisiä sekvenssejä), tapahtuu rekombinaatio ja seurauksena on fuusioitunut valinta-kelpoinen yhdistelmämolekyyli.

Keksinnönmukaisen yhdistelmäplasmidin sisältävien transformoituneiden hiivakantojen scu-PA:n tai sen mutanttien tuotantoa voidaan parantaa mutatoinnilla ja valinnalla käyttämällä alalla tunenttuja valintamenetelmiä. Mutatointi voidaan suorttaa esimerkiksi UV-säteilytyksellä tai sopivilla kemiallisilla aineilla. Erityisen edullista on saada aikaan proteaasivajaita mutantteja, erityisesti tällaisia hiivamutantteja, jotta vältytään tuotetun scu-PA:n tai sen mutanttien solujen sisällä tapahtuvalta proteolyytiseltä hajoamiselta.

Sopivat mutantit voidaan valita ja eristää tavanomaisilla keinoilla.

Keksinnönmukaisesti valmistettavissa olevilla scu-PA-proteiineilla, erityisesti näillä uusilla scu-PA-proteii-neilla, on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia.

Niitä voidaan käyttää ihmisillä vastaavalla tavalla kuin ennestään tunnettuja plasminogeenin aktivaattorei-ta haluttaessa ehkäistä tai hoitaa trombooseja tai muita tiloja, joissa on toivottavaa saada aikaan paikallinen fibrinolyyttinen tai proteolyyttinen aktiivisuus plasminogeeninaktivoitumismekanismin kautta, joista tiloista mainittakoon arterioskleroosi, sydän- ja aivoinfarkti, laskimotronboosit, tranboembolia, leikkausten jälkeiset tran-boosit, trariboflebiitti ja diabetekseen liittyvät verisuonisairaudet.

Keksinnön mukaisista proteiineista voidaan valmistaa farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät terapeuttisesti tehokkaan määrän vaikuttavaa ainetta (scu-PA) sekä orgaanisia tai epäorgaanisia, kiinteitä tai nestemäisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantaja-aineita, jotka soveltuvat parenteraaliseen, kuten intravenoosi-seen, antotapaan eivätkä ole haitallisessa vuorovaikutuksessa vaikuttavien aineosien kanssa.

19 k-z. ib1 tai epäorgaanisia, kiinteitä tai nestemäisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantaja-aineita, jotka soveltuvat parenteraaliseen, kuten intravenoosiseen, antotapaan eivätkä ole haitallisesssa vuorovaikutuksessa vaikuttavien aineosien kanssa.

Erityisesti infuusioliuokset, mielellään vesiliuokset tai -suspensiot, ovat sopivia ja ne on mahdollista valmistaa ennen käyttöä esimerkiksi lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisältävät vaikuttavaa ainetta yksin tai kantaja-aineen, kuten mannitolin, laktoosin, glukoosin, albumiinin tms., kanssa. Farmaseuttiset koostumukset voidaan steriloida ja niihin voidaan haluttaessa sekoittaa apuaineita, kuten esimerkiksi säilöntäaineita, stabilointiaineita, emulgointiaineita, liuotusaineita, puskurointiaineita ja/tai osmoottisen paineen säätöön suoloja, kuten natriumkloridia. Sterilointi voidaan suorittaa suodattimilla, joiden huokoskoko on pieni (halkaisija 0,45 jm tai pienempi), minkä jälkeen valmiste voidaan haluttaessa lyofilisoida. Steriilisyyden pysymistä varten voidaan myös lisätä antibiootteja. Esimerkiksi keksinnönmukainen scu-PA-proteiini formuloidaan steriloiduksi vesiliuokseksi, joka sisältää 5 % glukoosia ja haluttaessa myös stabilointiaineita ja suoloja.

Farmaseuttiset koostumukset jaetaan annosyksik-kömuotoihin, esimerkiksi ampulleihin, jotka sisältävät 1 - 2000 mg farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta annosyksikköä kohti ja noin 1 - 20 mg, mielellään noin 3 - 15 mg vaikuttavaa ainetta (scu-PA) annosyksikköä kohti.

Riippuen sairauden laadusta ja potilaan iästä ja tilasta, on noin 70 kg painavan potilaan hoidossa käytettävä vuorokausiannos alueella 20 - 150 mg, mielellään 45 - 100 mg, siis 24 tuntia kohti.

Menetelmässä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi esillä olevan keskinnön mukainen biologisesti aktiivinen proteiini sekoitetaan faarmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen.

20 ΟΠΟΙΟ

^ i- \ S

Keksinnön mukaisia uusia proteiineja voidaan käyttää ihmiseen ennaltaehkäisevässä tai hoitotarkoituk-sessa.

Edelleen keksintö koskee uusia yhdistelmäplasmideja, mainituilla yhdistelmäplasmideilla transformoituneita hiivakantoja ja menetelmiä näiden tuottamiseksi.

Erityisesti keksintö koskee scu-PA-proteiineja, yhdistelmävektoreita, transformoituneita hiivaisäntiä ja menetelmiä näiden tuottamiseksi, kuten esimerkeissä on selostettu.

Seuraavassa kokeellisessa osassa selostetaan esillä olevan keksinnön eri toteutustapoja liitteenä olevien piirrosten avulla.

Kuva 1 esittää ihmisen u-PA-cDNA:n restriktioendo-nukleaasikarttaa.

Kuva 2 esittää ihmisen u-PA-cDNA:n nukleotidisek-venssiä ja siitä pääteltyä aminohapposekvenssiä. Kypsän proteiinin ensimmäinen aminohappo on alleviivattu.

Kuva 3 on kaavioesitys plasmidin pCSl6 rakentamisesta.

Kuva 4 on kaavioesitys plasmidin pCS16/UPA rakentamisesta, joka plasmidi sisältää u-PA-cDNA:n.

Kuva 5 on kaavioesitys plasmidin pJDB207/PHO5-I-UPA rakentamisesta (lyhenteet: SS = signaalisekvenssi, t = transkription lopettaja, p = promoottori ja L = kytkijä).

Kuva 6 esittää GAPDHrn promoottorialueen DNA-sekvenssiä.

Kuva 7 on kaavioesitys plasmidin p31GAPDL-IT rakentamisesta.

Kuva 8 esittää tässä keksinnössä käytettyjä GAPDH-geenin promoottorielementtejä.

Ku/a 9 on kaavioesitys plasmidin pJDB207/GAPDL-I-UPA rakentamisesta.

Kuva 10 on kaavioesitys plasmidin pJDB207/GAPDL-UPA rakentamisesta.

21 n o ^ -1 o

Kuva 11 ja kuva 12 esittävät plasmidin pDP38 rakentamista plasmidin pDP33 kautta.

Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraa-villa esimerkeillä.

Esimerkki 1; u-PA:n koodittavan alueen sisältävän plasmidin pCS16/UPA rakentaminen A) Plasmidin pCS16, (ks. kuva 3) rakentaminen

Plasmidista pUN121 (B. Nilsson et ai., Nucl. Acids.

Res. U, 8019 - 8030 (1983)) saatu 1,5 ke:n Pstl-BamHI- fragmentti, joka sisältää lambda-fagin cl-geenin ja osan tetrasykliiniresistenssigeenistä, kloonataan Pstl:llä ja BamHI:llä katkaistuun plasmidiin pUC18 (J. Norrander et ai., Gene 2j5, 101 - 106 (1983)). Näin saatu klooni katkaistaan Pstl:llä. Yli ulottuvat 3'-päät poistetaan reaktiolla T4 DNA-polymeraasin kanssa (T. Maniatis et ai., Molecular Cloning (1982), s. 395) ja tasaisiin päihin liitetään Xhol-kytkijät (5'-CCTGGAGG-31, Biolabs).

Sitten suoritetaan katkaisu Xholrllä ja yhteenliittäminen uudestaan renkaaksi. Erällä yhteenliittämisseosta trans-2 + formoidaan Ca -käsitellyt E. coli HBlOl-solut. Yksittäisten ampisilliinille resistenttien pesäkkeiden DNA analysoidaan. Useista oikeista klooneista valitaan yksi ja sille annetaan nimeksi pCSlö.

B) Plasmidin PCS16/UPA (ks. kuva 4) rakentaminen

Urokinaasin cDNA valmistetaan ihmisen Hep3^ ' soluista saadusta mRNArsta (ks. T. Maniatis et ai., ss. 188 - 246, supra). Kun u-PA-cDNA:n 1,3 ke:n Smal-BamHI-fragmentti ja 1 ke:n BamHI-EcoRI-fragmentti kloonataan plasmidin pUN121 Smal- ja EcoRI-kohtiin (B. Nilsson 22 g Γ 91 g et ai., Nucl. Acids. Res. 1Λ, 8019 - 8030 (1983), saadaan plasmidi pcUK176. Kuvassa 1 on esitetty ihmisen u-PA-cDNA-liitannäisen restriktioendonukleaasikartta. u-PA-liitännäisen nukleotidisekvenssi ja siitä päätelty aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 2. u-PA-cDNA-liitän-näinen alakloonataan plasmidiin pCSl6. Alakloonattu cDNA ulottuu Smal-kohdasta, joka on luetuksi tulemattomalla 5'-alueella (kuva 1), PvuII-kohtaan, joka on nukleotidiasemissa 1439 - 1444 (kuva 2) luetuksi tulemattomalla 3'-alueella.

15 pg plasmidia pcUK176 katkaistaan PvuIIrlla.

379 ep:n PvuII-fragmentti erotetaan muista fragmenteista 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-bo-raatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. DNA elektroeluoidaan, puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografisesti (Whatman) ja saostetaan etanolilla. 1,2 pg yksisäikeistä Xhol-kytki-jää (5'-CCTCGAGG-3') fosforyloidaan 5'-päästään, kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja annetaan emäspariutua itsensä kanssa huoneenlämpötilassa ja varastoidaan -20°C: ssa. 0,9 pg kinasoitua kaksisäikeistä Xhol-kytkijää liitetään 80-kertaisena molaarisena ylimääränä pcUK176:n 379 ep:n PvuII-fragmentin tasaisiin päihin (ks. edellä) 20 pl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs), reaktioajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. Saatua seosta kuumennetaan 10 minuuttia 85°C:ssa. Ylimääräiset kytkijämolekyylit poistetaan saostamalla 0,54 tilavuudella isopropanolia siten, että läsnä on 10 mM EDTA ja 300 mM natriumasetaattia pH 6,0, saostusajan ollessa 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. DNA katkaistaan XhoI:llä ja BamHI: llä. 121 ep:n BamHI-Xhol-fragmentti eristetään 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraat-ti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. 6 pig plasmidia pcUK176 kat kaistaan Smal:llä ja BamHI:llä. 1,3 ke:n Smal-BamHi-fragmentti, joka sisältää surimman osan u-PA:ta koodattavasta sekvenssistä, eristetään. 6 yug plasmidia pCSl6 23 C 9 9 -1 0 ·'* «L. ί katkaistaan Smal:llä ja XhoI:llä. 2,7 ke:n vektorifrag-mentti eristetään. DNA-fragmentit elektroeluoidaan geelistä ja saostetaan etanolilla. 0,2 pmol 1,3 ke:n Smal-BamHI-fragmenttia, 0,2 pmol 121 ep:n BamHI-XhoI-fragmenttia (nämä kaksi fragmenttia muodostavat täydellisen u-PA:ta koodittavan sekvenssin) ja 0,1 pmol 2,7 ke:n vektorifragmenttia liitetään yhteen 10 jil:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia, 15°C:ssa. 1 ui:n ja 3 pl:n erät yhteenliittämiseosta lisätään 100 ^il:aan Ca^+:lla käsiteltyjä HBlOl-soluja. Transformointi suoritetaan julkaisussa A. Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 25.1929 (1978) kuvatulla tavalla. 12 ampisillii-nille vastustuskykyistä pesäkettä kasvatetaan LB-alus-tassa, joka sisältää 100 mg/1 ampisilliiniä. DNA eristetään menetelmällä Holmes et ai.. Anal. Biochem. 114, 193 (1981) ja analysoidaan suorittamalla restriktiokat-kaisut EcoRI:llä, PvuII:lla ja XhoI:llä.

Vastaavalla tavalla alakloonataan plasmidiin pCS16 urokinaasi-cDNA, joka ulottuu Smal-kohdasta (nukleotidi-asemat 1-6, kuva 2) Pstl-kohtaan, joka on nukleotidiase-missa 1637 - 1642 (ks. kuva 2). Plasmidi pcUKl76 katkaistaan Pstl:llä. Porrastetut päät muunnetaan tasaisiksi reaktiolla T4 DNA-polymeraasin kanssa, kuten Maniatis et ai. (supra, s. 395) ovat selostaneet. 1,2 ke:n DNA-fragmentit eristetään. Lisätään Xhol-kytkijät, kuten edellä on selostettu. DNA katkaistaan BamHIrllä ja XhoI:llä ja 315 ep:n BamHI-XhoI-fragmentti eristetään. 0,2 pmol tätä fragmenttia liitetään 1,3 ke:n Smal-BamHI-fragmenttiin ja 2,7 ke:n vektorifragmenttiin (ks. edellä).

Yhteenliittämisseoksella transformoidaan E. coli HB101 2+

Ca -solut. Plasmidi-DNA:lie, joka on saatu yhdestä odotetut restriktiofragmentit sisältävästä kloonista, annetaan nimeksi pCS16/UPA-13. Tämä plasmidi sisältää u-PA-cDNA-liitännäisen, joka ulottuu luetuksitulemattomalla 5'-alueella olevasta Smal-kohdasta (kuva 1) PstI- 24 p ·- ,'-' ,-j r'.

b v,. z ί y kohtaan, joka on nukleotidiasemassa 1641 (kuva 2) luetuksi-tulemattomalla 3'-alueella. Ainoa ero plasmidiin PCS16/UPA verrattuna on pitemmälle ulottuva luetuksi tulematon 3'-alue.

Esimerkki 2: Plasmidin p31RIT-12 rakentaminen, joka plas- midi sisältää PH05-promoottorin ja invertaasin signaali-sekvenssin A) Oligodeoksiribonukleotidien syntetisointi invertaasin signaalisekvenssiä varten: DNA-syntetisaattorilla (malli 380B, Applied Biosys-tems) syntetisoidaan neljä oligodeoksiribonukleotidia: 1-1, 1-2, 1-3 ja 1-4. Suojauksen poiston jälkeen synteettiset fragmerrtitpuhdistetaan 12-prosenttisessa polyakryy-liamidigeelissä, joka sisältää 8 mol/1 ureaa. Suolasta vapaat, puhtaat oligodeoksiribonukleotidit saadaan käyttämällä Sep. Pak'ia (Waters Associates). Nämä fragmentit muodostavat invertaasin signaalisekvenssiä koodittavan kahdenteen, joka sisältää hiivassa usein käytettyjä kodoneja.

Hindlll

EcoRI MetLeuLeuGinAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 5'AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3’ 1-2 3'GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'

AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla 1-3 5'GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3' 1-4 3'CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'

Hgal_

XhoI

B) Invertaasin signaalisekvenssin alakloonaus plasmidiin £31 a) Vektorin valmistus.

1,5 jxg plasmidia p31R/SS-TPAÄ2 (eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan 1 tunti 37°C:ssa 10 yksiköllä EcoRI :tä (Boehringer) 50 jil-.ssa C P 9 1 0 2 5 s k, L·. \ y liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^, 100 mM NaCl ja 6 mM merkaptoetanolia. Sitten lisätään 1 jil 2,5 M NaCl-liuosta ja 10 yksikköä XhoI:tä (Boehringer) ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. 4,2 ke:n vektori eristetään 0,8-prosenttisessa preparatiivisessa agaroosigeelissä. Geeliviipale siirretään Micro Colloi-dor-putkeen (Sartorius GmbH), peitetään 200 yul:lla TE-puskuria ja elektroeluoidaan (elektroforesoidaan 90 mA:n viralla 50 minuuttia). TE-liuos kerätään talteen ja saostetaan 2,5 tilavuudella absoluuttista etanolia sen jälkeen, kun on lisätty 0,1 tilavuutta 10 x TNE-puskuria. DNA-pelletti pestään kylmällä 80-prosenttisel-la etanolilla ja kuivataan vakuumissa. DNA uudelleensus-pendoidaan 6 yjl:aan TE-puskuria (40 pmol/yul).

b) Oliqodeoksiribonukleotidien (I—1, 1-2, 1-3, 1-4) emäspariutus, kinasointi ja liittäminen vektoriin

Liuosta, joka sisältää 10 pmol kutakin neljää deoksiribonukleotidia 10 ^ul:ssa 0,5 M Tris.HCl-puskuria, pH 8, inkuboidaan 5 minuuttia 95°C:ssa vesihauteella. Vesihaude jäähdytetään hitaasti 5 tunnissa 30°C:een.

Tähän emäspariutettuun liuokseen lisätään 0,1 M MgC^-liuosta, 0,1 M NaCl-liuosta, 30 mM DTT-liuosta ja 4 mM ATP-liuosta (2 ^ul) kutakin) ja 8 yksikköä (1 ^il) polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kinasointi suoritetaan 1 tunnissa 37°C:ssa. Emäspariutetut, kinasoidut oligonukleotidit ja 60 pmol EcoRI-XhoI-katkaistua p31R/SS-TPAd2-vektoria (1,5 ui) liitetään yhteen käyttämällä 400 yksikköä (1 ui) T4 DNA-ligaasia (Biolabs) reaktioajan ollessa 17 tuntia 14°C:ssa. Reaktio pysäytetään inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. 10 yal:lla tätä yhteenliittämisseosta transformoidaan E. coli HB101 2+

Ca -solut (M. Dagert ja S.D. Ehrlich, Gene 56, 23 -28 (1979)). Poimitaan 20 amp** pesäkettä. DNA valmistetaan nopealla eristysmenetelmällä (D.S. Holmes ja M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193 - 197 (1981). DNA

26 C f 7 I; katkaistaan EcoRI:llä ja XhoI:llä, leimataan radioaktii-visesti EcoRI-päästä ja analysoidaan 6-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä, joka sisältää 8 mol/1 ureaa, käyttämällä merkkinä HaeIII:lla katkaistua pBR322-DNA: ta. Kaikista 20 kloonista saaduissa DNA-valmisteissa havaitaan oikeaa kokoa oleva vyöhyke. Yhtä kloonia kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, joka sisältää 100 jUg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA eristetään ja sille annetaan nimeksi p3lRIT-12.

Esimerkki 3: Plasmidin pJDB207/PHQ5-I-UPA (kuva 5) rakentaminen

Plasmidi pJDB207/PHO5-I-UPA sisältää PH05-promoot-torin, invertaasin signaalisekvenssin, kypsää urokinaa-sia koodittavan sekvenssin ja PH05:n transkriptionlopetus-sekvenssin peräkkäisessä järjetyksessä hiivan ilmentä-misvektoriin pJDB207 kloonattuina.

20 ng plasmidia pCSl6/UPA katkaistaan täysin 40 yksiköllä EcoRI:tä. Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen katkaistaan EcoRI:llä katkaistu DNA vielä Taql:llä 65°C: ssa. Saadut fragmentit erotetaan prepratiivisessa 1,2-prosenttisessa agaroosigeelissä. 462 ep:n Taq-EcoRI- fragmentti eristetään elektroeluutiolla geelistä ja saostetaan etanolilla.

DNA-fragmentin Tagl-kohtaan liitetään seuraavan kaavan mukainen oligodeoksiribonukleotidi (i) 5’-ctgcaagcaatgaacttcatcaagttccat-3' (II) 3'- TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5'

Kytkijä palauttaa kypsää u-PA:ta koodittavan sekvenssin 5’-pään (nukleotidit 130 - 154, kuva 2) ja saa aikaan lukuvaiheistuksessa olevan liittymisen invertaasin signaalisekvenssiin. Kytkijän 5'-CTGCA-sekvenssi täyttää invertaasin signaalisekvenssin vastaa-

C Γ ? Ί O

2 7 '' ^ 1 van sisempänä olevan 3'-pään, joka on syntynyt Hgal-katkaisussa.

300 pmol kutakin oligodeoksinukleotidia I ja II fosforyloidaan ja emäspariutetaan. 5,25 jxq (600 pmol) fosforyloitua, kaksisäikeistä kytkijä-DNA:ta liitetään 1,7 ymgraan (5,6 pmol) 462 ep:n TaqI-EcoRI-fragment-ia (ks. edellä) 175 jil:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT ja 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia, reaktioajan ollessa 16 tuntia 15°Crssa. T4 DNA-ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 10 minuuttia 85°C:ssa. Kytkijäylimäärä poistetaan saosta-malla siten, että läsnä on 10 mM EDTA, 300 mM natrium-asetaattia, pH 6,0, ja 0,54 tilavuutta isopropanolia.

DNA katkaistaan Pstlrllä. Näin saadaan yksi ainut 312 ep:n fragmentti, joka sisältää kytkijän liittyneenä u-PA:n DNA-sekvenssiin, joka ulottuu nukleotidiin 436 asti (Pstl-kohta, ks. kuva 2). DNA-fragmentti puhdistetaan elektroeluutiolla ja saostetaan etanolilla.

Plasmidi pCS16/UPA katkaistaan XhoI:llä ja Pstlrllä. 1007 ep:n Pstl-XhoI-fagmentti eristetään ja puhdistetaan. Tämä fragmentti sisältää suurimman osan urokinaasia koodittavasta sekvenssistä.

Plasmidi p31RIT-12 (ks. esimerkki 2) katkaistaan Sällillä ja Xholrllä. Eristetään 882 eprn Sall-Xhol-fragmentti geelistä elektroeluutiolla ja etanolisaostuk-sella. Saatu fragmentti katkaistaan vielä BamHIrllä ja Hgalrllä. Eristetään 591 eprn BamHI-Hgal-fragmentti, joka sisältää PH05-promoottorialueen ja invertaasin signaalisekvenssin.

Plasmidi pJDB207(PH05-TPA 18 (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 143 081) katkaistaan BamHIrllä ja Xholrllä. 6,8 kern vektorifragmentti eristetään preparatiivisessa, 0,6-prosenttisessa garoosigeelissä, joka on tehty Tris-asetaattipuskuriin, pH 8,2.

DNA elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla.

Kaikki DNA-fragmentit uudelleensuspendoidaan veteen Q r ο η o 28 i .,· pitoisuuteen 0,1 praol/yul. 0,2 pmol 591 ep:n BamHI-Hgal- fragmenttia, 0,2 pmol 312 ep:n Hgal-Pstl-fragmenttia, 0,2 pmol 1007 ep:n Pstl-XhoI-fragmenttia ja 0,1 pmol 6,8 ke:n BamHI-XhoI-vektorifragmenttia liitetään yhteen 15 tunnissa 15°C:ssa 10 jil:ssa liuosta, jossa on 50

mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP

ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia. 1 ul:lla yhteenliit- 2+ tämlsseosta transformoidaan E. coll HB101 Ca -solut. Poimitaan 12 amp -pesäkettä ja niitä kasvatetaan LB-alus-tassa, joka sisältää 100 mg/ml ampisilliiniä. DNA valmistetaan nopealla eristysmenetelmällä (D.S. Holmes et ai., Anal. Biochem. 114, 193 (1981)). Kun plasmidi-DNA:lle suoritetaan restriktiokatkaisut Hindlllrlla ja EcoRIrllä, havaitaan odotetut restriktiofragmentit. Yhden kloonin plasmidi-DNA valitaan ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-I-UPA.

Esimerkki 4: Plasmidin pJDB207/PHQ5-UPA rakentaminen Tämä rakenne koostuu PH05-promoottorista ja PH05:n signaalisekvenssistä, jotka on liitetty lukuvaiheistuk-seen kypsää urokinaasia koodittavan sekvenssin kanssa ja kloonattu hiivan pJDB207-vektoriin.

Seuraavan kaavan mukainen oligodeoksiribonukleoti-dikytkijä (I) 5' -CCAATGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT- 3' ( II) 3' -GGTTACGTTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5' antaa PH05-signaalisekvenssin 8 nukleotidia (5'-CCAATGCA) (signaalisekvenssin sisäisestä Ball-kohdasta prosessoin-tikohtaan asti) ja saa aikaan lukuvaiheistuksessa olevan liittymisen kypsää u-PA:ta koodittavaan sekvenssiin (nukleotidiasemat 130 - 154, kuva 2). Tämä kytkijä liitetään pCS16/UPA:n 462 ep:n TaqI-EcoRI-fragmenttiin (ks. esimerkki 3). Fosforylointi, emäspariutus ja yhteen- 29 P - .- r·-.

bc-Z i y liittäminen tehdään esimerkin 3 mukaisesti. DNA katkaistaan Ball:llä ja Pstl:llä. 315 ep:n fragmentti eristetään. Tämä DNA-fragmentti sisältää u-PA-geenin DNA-sekvenssin asemassa 436 olevaan Pstl-kohtaan asti (kuva 2).

Plasmidi p31 (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561) katkaistaan Ballzllä ja BamHIrllä. Eristetään 584 ep:n BamHI-Ball-fragmentti, joka sisältää PH05-promoottorin ja suurimman osan PH05:n signaalisek-venssistä. DNA-fragmentit puhdistetaan elektroeluutiol-la' ja DE52-kromatografiällä, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/pl.

0,2 pmol 584 ep:n BamHI-Ball-fragmenttia, 0,2 pmol 315 ep:n Ball-Pstl-fragmenttia, 0,2 pmol 1007 ep:n Pstl-XhoI-fragmenttia (ks. esimerkki 3) ja 0,1 pmol 6,8 ke:n BamHI-Xhol-vektorifragmenttia (ks. esimerkki 3) liitetään yhteen ja yhteenliittämisseoksella transfor- Ό moidaan E. coli HB101. Poimitaan 6 amp -pesäkettä ja niitä kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää 100 mg/1 ampisilliinia. Plasmidi-DNA valmistetaan nopealla DNA:n eristysmenetelmällä ja analysoidaan BamHI/Pstl-kaksois-katkaisulla. Valitaan yksi klooni, jossa on odotetut restriktiofragmentit, ja sille annetaan nimeksi PJDB207/PHO5-UPA.

Esimerkki 5: Plasmidin pJDB207/PHQ5-SSUPA rakentaminen Tämä plasmidi sisältää urokinaasigeenin ja uroki-naasin signaalisekvenssin PH05-promoottorin ohjauksessa hiivan ilmentämisvektorissa pJDB207.

20 yug plasmidia pCS16/UPA-13 (ks. esimerkki 1) katkaistaan täysin 100 yksiköllä Bgll :tä (nukleotidi-asemat 76 - 86, kuva 2). Syntyneet 3. f ragmenttia erotetaan preparatiivisessa l-prosenttisessa agaroosigeelis-sä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3.

1,7 ke:n Bgll-fragmentti elektroeluoidaan ja saostetaan etanolilla.

30 ο Γι ο i η y L il i jr·

Seuraavan kaavan mukaisessa oligodeoksiribonukleo-tidikytkijässä (I) 5'-AATTCGATTACCAATGAGAGCCCTGC-3' (II) 3'- GCTAATGGTTACTCTCGGG -5' on EcoRI-kohta liittyneenä PH05:n koodittamattoman 5'-alueen 8 nukleotidiin sen ATG:n edessä ja u-PA:n koodittavan sekvenssin nukleotidit 70 - 82 (kuva 2), kun ATG luetaan mukaan. Kytkijä liitetään porrastettuihin Bgll-päihin, kuten esimerkissä 3 on selostettu.

DNA katkaistaan EcoRI:llä ja Pstlrllä.

Eristetään 380 ep:n fragmentti, joka sisältää u-PA:n signaalisekvenssin ja osan kypsää u-PA:ta koodit-tavasta sekvenssistä ulottuen nukleotidiin 436 asti (PstI-kohta, kuva 2).

Plasmidi p31R (ks. eurooppalainen patenttihakemus-julkaisu no. 100 561) katkaistaan BamHI:llä ja EcoRI:llä ja eristetään 534 ep.-n BamHI-EcoRI-fragmentti, joka sisältää PH05-promoottorin. DNA-fragmentit elektroelu-oidaan agaroosigeelistä, puhdistetaan DE52-kromatografi-sesti, saostetaan etanolilla ja uudelleensuspendoi-daan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/pg.

0,2 pmol 534 ep;n BamHI-EcoRI-fragmenttia, 0,2 pmol 380 ep:n EcoRI-Pstl-fragmenttia, 0,2 pmol 1007 ep:n Pstl-XhoI-fragmenttia (ks. esimerkki 3) ja 0,1 pmol 6,8 ke:n BamHI-Xhol-vektorifragmenttia (ks. esimerkki 3)-liitetään yhteen ja yhteenliittämisseoksella

2+ R

transformoidaan E. coli HB101 Ca -solut. 12 amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, joka sisältää 100 mg/1 anpisilliinia. DNA valmistetaan nopealla DNA:n eristysmenetelmällä ja analysoidaan BamHI- ja EcoRI-katkaisulla. Valitaan yhden kloonin plasmidi-DNA ja sille annetaan nimeksi pJDB207/PHO5-SSUPA.

Esimerkki 6: Plasmidin pJDB207R/PHQ5-UPA rakentaminen

Kypsää urokinaasia koodittava sekvenssi liitetään 31 p. - i~ ^ r y o /. ί y PH05-promoottoriin. Tähän rakenteeseen ei sisälly sig-naalisekvenssiä ja se onkin tehty vertailutarkoituksia varten.

Seuraavan kaavan mukainen oligodeoksiribonukleo-tidikytkijä (I) 5' -AATTCATGAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT -3' (II) 3'- GTACTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5' sisältää ATG:n ja u-PA:n nukleotidit 130 - 154 (ks. kuva 2), jotka koodittavat kypsän urokinaasin aminohappoja Serl - Ser9. Oligonukleotidit fosforyloidaan, emäspariutetaan ja liitetään plasmidin pCS16/UPA 462 ep:n TaqI-EcoRI-fragmenttiin (ks. esimerkki 3). DNA katkaistaan EcoRI:llä ja Pstl:llä. Eristetään 315 ep:n EcoRI-Pstl-fragmentti,joka sisältää ATG:n ja kypsää u-PA:ta koodittavan sekvenssin asemassa 436 olevaan Pstl-kohtaan asti (kuva 2).

Plasmidi p31R (ks. eurooppalainen patenttihakemus-julkaisu no. 100 561) katkaistaan BamHI:llä ja EcoRI:llä ja 534 ep:n BamHI-EcoRI-fragmentti eristetään preparatii-visessa 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä. Tämä fragmentti sisältää PH05-promoottorin.

Kaikki DNA-fragmentit elektroeluoidaan, puhdistetaan DE52-kromatografiällä, saostetaan etanolilla ja uudel-leensuspendoidaan veteen pitoisuuteen 0,1 pmol/^ul. 0,2 pmol 534 ep:n BamHI-EcoRI-fragmenttia, 0,2 pmol 315 ep:n EcoRI-Pstl-fragmenttia ja 0,2 pmol 1007 ep:n Pstl-Xhol-fragmenttia (ks. esimerkki 3) ja 0,1 pmol 6,9 ke:n BamHI-XhoI-vektorifragmenttia (ks. esimerkki 3) liitetään yhteen ja yhteenliittämisseoksella transformoidaan E.

2+ R

coli HB101 Ca tavalliseen tapaan. Poimitaan 8 amp - pesäkettä ja niitä kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää 100 mg/1 ampisilliinia. Valmistetaan plasmidi-DNA ja analysoidaan se katkaisemalla BamHI:llä ja EcoRIillä.

Yhden pesäkkeen plasmidi-DNA:lie, jolla on odotettu 32 gr ° 1 o restriktiokuvio, annetaan nimeksi pJDB207R/PHO5-UPA.

Esimerkki 7: Hiivan GAPDH-geenin kloonaus konstitutii visen promoottorinsa kanssa a) Hiivan geenikirjaston rakentaminen 30 pg suurimolekyylipainoista hiivan kokonais-DNA:ta (M.V. Olsen et ai., J. Mol. Biol. 1^2, 387 (1979)), joka on saatu villityyppisestä Saccharomyces cerevisiae-kannasta S288C, inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa 2 yksikön kanssa ECoRI-metylaasia (New England Biolabs) 250 pl:ssa EcoRI-metylointipuskuria valmistajan ohjeiden mukaan. DNA saostetaan etanolilla ja uudelleensus-pendoidaan 500 pl:aan puskuria, jossa on 25 mM Tris-HCl pH 8,5 ja 2 mM MgC^ (EcoRI*-puskuri) (H. Meyer, FEBS Lett. 9JD, 341 (1979)), ja pilkotaan EcoRI :llä (Boehringer), kunnes DNA-fragmenttien kokojakautuman maksimi on 30 - 50 ke:n alueella (XDNA:n Xhol-katkaisu antaa tarvittavat 33 ke:n ja 17 ke:n merkit). EcoRI*-olosuhteissa pilkottu hiivan DNA fraktioidaan koon mukaan sakkaroosigradientissa (5 - 20 % sakkaroosia puskurissa, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 1 mM EDTA) frak-tiointiajan ollessa 6 tuntia nopeudella 38 000 min 1 SW 40-roottorissa. Gradientin päältä kerätään 30 jaetta, joiden kunkin tilavuus on 0,4 ml. Jae 16 sisältää DNA-fragmentit, joiden koko on 30 - 40 ke. Tämän jakeen DNA (3 pg) saostetaan etanolilla ja liitetään 16 tunnin ajan 15°C:ssa 15 pl:n kokonaistilavuudessa 1 pg:aan kosmidivektoria pYcl (B. Hohn et ai., teoksessa "Genetic Engineering", Voi. 2, s. 169, New York 1980), joka on sitä ennen linearisoitu EcoRI:llä. Yhteenliittäminen suoritetaan 300 yksiköllä T4 DNA-ligaasia (New England Biolabs) käyttämällä valmistajan kuvaamaa puskurisystee-miä. DNA pakataan in vitro bakteriofagiin\ (B. Hohn, teoksessa "Methods in Enzymology", Voi. 68, s. 299,

New York 1979) ja nain kootuilla fageilla transdusoidaan 33 ρ ' n < <-' ΠΖ ί y E. coli-kanta HB101 (r^, mk, leu , pro , recA). Trans-dusoinnin tehokkuus on noin 5000 ampisilliinille resistenttiä pesäkettä per μς pYcl-vektoria. Poimitaan 3000

D

amp -pesäkettä ja niitä kasvatetaan erikseen mikrotiter-levyjen koloissa LB-alustassa (10 g Bacto-Tryptone:a (Difco), 5 g Bacto Yeast Extract:ia (Difco) ja 10 g NaCl), joka sisältää 100 ^ig/ml ampisilliinia.

b)Hiivan GAPDH-geenin eristäminen • - .Edellä kuvattu geenikirjasto seulotaan synteettisel lä oligonukleotidilla (valmistettu fosfotriesterimenetel-mällä: K. Itakura et ai., J. Am. Chem. Soc. 91_, 7327 (1975); J.F.M. de Rooij et ai., Red. Trav. Chim. Pays-Bas 9j5, 537 (1979)), jonka rakenne on seuraava: 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'. 10 ug oligonukleotidia 3 2 kinasoidaan käyttämällä 10 jil f- P-ATP:tä (3000 Ci/mmol, 10 pCi/pl Amersham) ja T4-polynukleotidikinaasia (Boeh-ringer) 50 y.l:n kokonaistilavuudessa Maniatis et ai:n kuvaamalla tavalla ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, s. 125). Pesäkehybridisointi suoritetaan samojen tekijöiden kuvaamalla tavalla (s. 312). Positiiviset kloonit havaitaan autoradiografiällä käyttämällä Kodak X-5-röntgenfilmiä. Kun plasmidi-DNA eristetään (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 100 561), saadaan yhdistelmäklooni, joka sisältää GAPDH:ta koodittavan 2100 ep:n Hindlll-fragmentin (J.P. Holland et ai., J. Biol. Chem. 254, 9839 (1979)). Lopullinen todiste sille, että kloonattu DNA on oikea, saadaan DNA:n sekventoinnilla, jossa käytetään edellä mainittua oligonukleotidia sekä dideoksisekventiontime-netelmää, kuten G.F. Hong (Bioscience Reports 1, 243 (1981)) on selostanut kaksisäikeiselle DNA:lie. Kloonatulla GAPDH-geenillä on sama sekvenssi kuin Holland et al:n (J. Biol. Chem. 255, 2596 (1980)) julkaisemalla pgap491:llä.

34 pi ' -1 r S << L i ' c) GAPDH-promoottorin valmistus 649 ep:n Tagl-fragmentti, joka kattaa GAPDH-geenin nukleotidit -27 - -675, kun laskenta aloitetaan ATG-kodo- nin vierestä (ks. kuva 6), eristetään katkaisemalla edellä mainittu yhdistelmäplasmidi Taql:llä (New England Biolabs) ja erottamalla DNA-fragmentit 1,2-prosenttisessa agaroosigeelissä ja uuttamalla DNA kuumalla fenolilla.

Taql-fragmentti kloonataan pBR322:n Clal-kohtaan seuraa-valla tavalla. 1 pg plasmidia pBR322 katkaistaan kolmella yksiköllä Clalrtä (New England Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan. 300 ng fenoloitua, katkaistua vektoria liitetään noin 300 ng:aan liitettävää DNA:ta (649 ep:n Taq-fragmentti) käyttämällä 200 yksikköä T4 DNA-ligaasia 20 pl:n kokonaistilavuudessa. E. coli HBlOl-solut transformoidaan ampisilliinille resistenteiksi ja valmistetaan plasmidi-DNA ja analysoidaan se restriktioanalyysillä (Taql, Dral). Taql-fragmentin suunta todetaan käyttämällä restriktioendonukleaasia Dral yhdessä plasmidien BamHI-kohdan kanssa ja valitaan plasmidi, jossa on aseman -675 Taq-kohta lähellä plasmidin pBR322 Hindlll-kohtaa.

Tälle plasmidille annetaan nimeksi pBR322/GAPDH ja se linearisoidaan käyttämällä BamHIrtä (New England Biolabs). DNA uudelleensuspendoidaan 10 mM Tris-liuokseen, pH

8,0, pitoisuuteen 0,5 pg/ml. 16 pg Sali-katkaistua DNA:ta pilkotaan 2 yksiköllä eksonukleaasia Bal31 (BRL) 100 pl:ssa liuosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgC^, 12 mM CaC^ ja 1 mM EDTA. 2 pg:n erät DNA:ta otetaan 1, 2, 3, 4, 5 ja 6 minuutin inku-boinnin jälkeen (30°C) ja kuhunkin erään sekoitetaan välittömästi 50 pl fenolia ja 60 p1 TNE-liuosta. Sen jälkeen uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla ja DNA uudelleensuspendoidaan 10 mm Tris-liuokseen, pH 8,0, pitoisuuteen 100 pg/ml. Jotta Bal31:n aikaansaama eksonukleolyyttinen hajoaminen saadaan analysoiduksi, 0,5 pg kunakin ajankohtana saatua DNA:ta 35 or 910 s Kj L·- 1 katkaistaan BamHI-endonukleaasilla ja analysoidaan 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-bo-raattipuskuriin, pH 8,3 (90 mM Tris.HCl, pH 8,3, 90 mM boorihappo ja 2,5 mM EDTA). Bal31-pilkkomisessa poistuu keskimäärin 100 emäsparia fragmentin kummastakin päästä minuutissa.

Bglll-kytkijät (5 *-GGAGATCTCC-3') fosforyloidaan, emäspariutetaan ja liitetään Bal31:llä käsiteltyihin DNA-fragmentteihin. Kytkijäylimäärät poistetaan isopro-panolilla saostamalla. DNA katkaistaan Bglllrlla ja saatetaan suoraan rengasmuotoon pitoisuudessa 5 pg/rnl 20 ^il:n kokonaistilavuudessa.· Bal31:llä lyhennetyn Tagl-fragmentin koko määritetään restriktioanalyysillä (käyttämällä Bglllrta ja Hindlllra). Valitaan kolme kloonia. Ne sisältävät DNA-fragmentit,jotka ulottuvat vastaavasti noin 2G0 emäspatia, 265 emäsparia ja 540 emäsparia ATG-kodonista ylävirtaan GAPDH-promoottoriin. Kaikki kolme fragmenttia sisältävät oletetun TATA-alueen noin -140 ep:n kohdalla. Nämä kloonit sisältävät vielä replikoitumisen aloituskohdan plasmidista pBR322 johdetussa DNA:n osassa ja ne nimetään vastaavasti seuraavasti: pGAPDH-F, pGAPDH-E ja pGAPDH-D.

Jotta GAPDH-promoottorielementit saadaan jatketuiksi asemassa -27 olevasta kohdasta aivan GAPDH-geenin ATG-kodonin viereen, syntetisoidaan kaksi synteettistä komplementaarista oligonukleotidia, joiden rakenteet ovat seuraavat: 5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3' 3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5' Nämä oligonukleotidit antavat aidon GAPDH-promoottorisek-venssin, joka ulottuu asemasta -26 asemaan -5, ja samalla päähän syntyy EcoRI-kohta. 2 μg kutakin plasmidia pGAPDH-F, pGAPDH-E ja pGAPDH-D katkaistaan 6 yksiköllä Taql:tä 50 pulissa ja saatu seos fenoloidaan, saostetaan f! ^ ·1 r-, ¥L ,: i S' 36 etanolilla ja uudelleensuspendoidaan 10 μΐ-.aan vettä. Synteettiset oligonukleotidit emäspariutetaan sekoittamalla 2 jil kutakin säiettä 100 piiraan liuosta, joka sisältää 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^ ja 50 mM NaCl, ja kuumentamalla 3 minuuttia 90°C:ssa ja jäähdyttämällä liuos hitaasti huoneenlämpötilaan (noin 3 tunnissa). 1 pg Taql:llä katkaistua plasmidia sekoitetaan noin 20-kertai-seen ylimäärään emäspariutettuja oligonukleotideja 20 jil:n tilavuudessa ja liitetään yhteen noin 18 tuntia käyttämällä 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia. Kun ligaasi on inaktivoitu, koko seos katkaistaan 3 yksiköllä BglII:ta (New England Biolabs). Bglll-EcoRI-fragmentit, joiden koot ovat vastaavasti 200 ep, 265 ep ja 540 ep, erotetaan 1,5-prosenttisessa pehmeäagargeelissä, uutetaan geelistä ja saostetaan etanolilla.

Plasmidi p31RIT-12 (ks. esimerkki 2) katkaistaan BamHI:llä ja EcoRI:llä. 3,6 ke:n pituinen suuri vektori-fragmentti eristetään. Tähän vektorifragmenttiin kloonataan 200 ep:n, 265 ep:n ja 540 ep:n Bglll-EcoRI-GAPDH-promoottorifragmentit. Yhteenliittäminen, transformointi ja plasmidin eristäminen suoritetaan edellä kuvatuissa olosuhteissa. Plasmidit, joissa on oikea liitännäinen, nimetään seuraavasti: p31GAPFL-IT, p31GAPEL-IT ja p31GAPDL-IT vastaavasti (kuva 7).

Plasmidien p31GAPFL-IT, p31GAPEL-IT ja p3lGAPDL-IT Bglll-EcoRI-fragmenttien DNA-sekvenssit on esitetty kuvassa 8. Näiden fragmenttien tarkat koot ovat 202 ep, 267 ep ja 544 ep vastaavasti.

Esimerkki 8: Plasmidin pJDB207/GAPDL-I-UPA (kuva 9) rakentaminen Tämä plasmidi sisältää GAPDH-D-promoottorin, inver-taasin signaalisekvenssin, kypsää urokinaasia koodattavan sekvenssin ja PH05:n transkription lopettajan peräkkäisessä järjestyksessä pJDB207-sukkulavektorissa.

Plasmidin p31GAPDL-IT DNA katkaistaan Sall:llä ja 37 O r' ^ '"', ? l l i y

Hindlllilla. 0,8 ke:n SalI-HindIII-fragmentti erotetaan preparatiivisessa 1-prosenttisessa agaroosigeelissä.

Tämä fragmentti sisältää GAPDH-D-promoottorin ja osan invertaasin signaalisekvenssistä.

Plasmidi pJDB207/PHO5-I-UPA katkaistaan HindIII:lla ja BamHIillä. 1239 ep:n HindIII-BamHI-fragmentti sisältää invertaasin signaalisekvenssin loppuosan ja suurimman osan u-PA:ta koodittavasta sekvenssistä. pJDB207/PHO5-I- UPA katkaistaan myös Sällillä ja BamHIillä. Suuri 6,6 kein vektorifragmentti eristetään preparatiivisessa 0,6-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka on tehty tris- asetaattipuskuriin, pH 8,2.

DNA-fragmentit eristetään elektroeluoimalla geelistä, puhdistetaan DE52-kromatografiällä ja saostetaan etanolilla.

0,8 kein SalI-HindIII-fragmentti, 1239 epin Hindlll-BamHI- fragmentti ja 6,6 kein Sall-BamHI-vektorifragmentti liitetään yhteen ja yhteenliittämisseoksella transformoi-

2+ R

daan E. coli HB101 Ca -solut. 6 amp pesäkkeen plasmidi-DNA analysoidaan katkaisemalla Hindlllilla ja Sällillä. Yhden kloonin plasmidi-DNAilie, jossa on odotetut restrik-tiofragmentit, annetaan nimeksi pJDB207/GAPDL-I-UPA.

Vastaavalla tavalla eristetään plasmidin p31GAPFL-IT 493 epin Sali-HindIII-fragmentti (ks. esimerkki 7) ja suoritetaan sen liittäminen. Näin saadulle plasmidi-DNAi lie annetaan nimeksi pJDB207/GAPFL-I-UPA.

Vastaavalla tavalla rakennetaan pJDB207/GAPEL-I-UPA.

Esimerkki 9: Plasmidin pJDB207/GAPDL-UPA rakentaminen (kuva 10) GAPDH-D-promoottori, PH05:n signaalisekvenssi, uro-kinaasia koodittava sekvenssi ja PH05:n transkription lopettaja kloonataan peräkkäiseen järjestykseen hiivan pJDB207-sukkulavektoriin.

20 ng plasmidia pJDB207/PHO5-UPA katkaistaan Bglll: 11a ja Sällillä. Näin saadut kaksi fragmenttia erotetaan preparatiivisessa 0,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, 38 n r γη r -, y c > > joka on tehty tris-asetaattipuskuriin, pH 8,2. 7,6 ke:n ja 1,1 ke:n BglII-SalI-fragraentit eristetään. 1,1 ke:n fragmentti katkaistaan vielä Dral:llä. Fenoli/klo-roformiuuton ja etanolisaostuksen jälkeen 3,5 pmol DNA: ta liitetään 100-kertaiseen ylimäärään seuraavan kaavan mukaista kinasoitua ja emäspariutettua oligodeoksiribo-nukleotidikytkijää 5 *-AATTCGATTACCAATGTTT-3' 3'- GCTAATGGTTACAAA_5' jossa on EcoRI-kohta ja 8 nukleotidia PH05:n koodit-tamattomasta 5'-alueesta ATG-kodonin edessä ja Dral:n tunnistussekvenssin osa.

Kun on liitetty yhteen 16 tuntia 15°C:ssa, ligaasi inaktivoidaan ja kytkijäylimäärä poistetaan isopropanoli-saostuksella (0,54 tilavuutta) siten, että läsnä on 300 mM natriumasetaattia, pH 6,0, ja 10 mM EDTA. DNA katkaistaan BglII:l]aja EcoRI:llä. 326 ep:n EcoRI-Bglll-fragmentti eristetään.

Plasmidi p3lGAPDL-IT katkaistaan Sall:llä ja EcoRI: llä. 0,75 ke:n Sall-EcoRI-fagmentti eristetään.

DNA-fagmentit eristetään elektroeluutiolla agaroo- sigeelistä, puhdistetaan DE52-kroma.tografiällä ja saos- tetaan etanolilla. 0,2 pmol 0,75 ke:n Sall-EcoRI-frag- menttia, 0,4 pmol 326 ep:n EcoRI-Bglll-fragmenttia ja 0,1 pmol 7,6 ke:n Sall-Bglll-vektorifragmenttia liitetään yhteen 5,5 tuntia 15°C:ssa. 1 nl:lla yhteenliittämis- 2 + seosta transformoidaan E. coli HB101 Ca -solut.

p

Kasvatetaan 10 amp transformanttia ja valmistetaan plasmidi-DNA. Plasmidi-DNA analysoidaan EcoRI-restrik-tiokatkaisulla. Yhden kloonin, jolla on odotettu rest-riktiokuvio, plasmidi-DNA:lie annetaan nimeksi pJDB2 0 7/GAPDL-UPA.

Vastaavalla tavalla rakennetaan plasraidit pJDB207/GAPFL-UPA ja pJDB207/GAPEL-UPA.

.. m i nm l i I III i 39 π ^ Ί t

Hz iy

Esimerkki 10: Plasmidin pDP38 (kuva 11 ja kuva 12) rakentaminen 2 mikronin kokoinen kovalenttisesti suljettu rengasmainen DNA eristetään Saccharomyces cerevisiae-kannasta S288C hajottamalla solunseinä käyttäen 5 ^ug/ml Zymolase:a (100 000 yksikköä/^ig) reaktioajan ollessa 20 minuuttia 37°C:ssa ja lysoimalla solut sen jälkeen 2 %:lla SDSrää. Sen jälkeen lisätään EDTArta pitoisuuteen 25 mM, keesiumkloridia lopulliseen tiheyteen 1,55 g/ml ja etidiumbromidia pitoisuuteen 1 mg/ml ja sen jälkeen koko seos siirretään ultrasentrifugiputkeen. Plasmidi-DNA erotetaan kromosomaalisesta DNA:sta ultra-sentrifugoimalla 42 tuntia nopeudella 42 000 min 15°C: ssa. 2 mikronin plasmidi otetaan gradientista ruiskun avulla. Etidiumbromidi poistetaan natriumkloridilla kyllästetyllä isopropanolilla ja plasmidi-DNA saostetaan lopuksi etanolilla. Puhdistettu plasmidi-DNA lineari-soidaan sen jälkeen Pstl:llä ja kloonataan plasmidin pUC19 Pstl-kohtaan (J. Norrander et ai., Gene 26, 101 (1983)), jolloin saadaan plasmidi pDP31. Plasmidi pJDB207. katkaistaan entsyymeillä Kpnl ja Hpal. Saatu 0,55 ke:n fragmentti puhdistetaan ja kloonataan plasmidin pUC7/LEU2 4,25 ke:n Kpnl-Hpal-fragmenttiin (tämä plasmidi sisältää 2,2 ke:n pituisessa XhoI-Sall-fragmen-tissa hiivan perimän LEU2-geenin (A. Andreadis et ai.,

Cell 21/ 319 (1982)) kloonattuna plasmidin pUC7 (J.

Vieira et ai., Gene 1£, 259 (1982) Sali-kohtaan ). Näin saadaan plasmidi pDP30, jossa alkuperäinen 2 mikronia/ LEU2-fuusio, jollainen on plasmidissa pJDB207, on sijoitettuna LEU2-geenin sekä sen täydellisen terminaat-torin eteen. Plasmidi pDP30 katkaistaan Hpal:llä ja Sall:llä ja 1,85 ke:n fragmentti, joka sisältää täydellisen LEU2-geenin, puhdistetaan ja kloonataan plasmidin pDP31 8,7 ke:n Hpal-Sall-fragmenttiin. Näin saatu plasmidi pDP33 linearisoidaan HIndlll:l]a siten, että läsnä on 50 ug/ml etidiumbromidia (M. Oesterlund et ai., Gene p r r\ -i r' y υ Z i y 40 20, 121 (1982)) ja liitetään 1,17 ke:n HindIII-fragment-tiin, joka sisältää URA3-geenin (M. Rose et al., Gene 29, 113 (1984)). Plasmidi, jossa on URA3-geenin positiivinen insertio, valitaan transformoimalla E. coli-kanta pyrf (M. Rose et al., supra). Näin saadaan plasmidi pDP34. Plasmidi pDP34 katkaistaan entsyymillä Sphl. Saatu 8,4 ke:n fragmentti puhdistetaan ja liitetään päistään yhteen, jolloin saadaan plasmidi pDP38.

Esimerkki 11: Plasmidien PDP38/GAPDL-I-UPA ja pDP38/ GAPDL-UPA rakentaminen

Vektori pDP38 (ks. esimerkki 10) sisältää LEU2-ja URA3-geenin, pBR322-sekvenssejä ja osan hiivan 2 mikronin DNA:sta. Plasmidi pDP38 linearisoidaan BamHI: llä. Syntyneet porrastetut päät täytetään reaktiolla Klenow-DNA-polymeraasin kanssa (M.aniatis et al., s.

113, supra). Sitten DNA katkaistaan vielä täysin Sali:llä ja suuri 8,4 ke:n fragmentti eristetään.

10^ig plasmidia pJDB207/GAPDL-I-UPA katkaistaan osittain Hindlllrlla (1 yksikkö/ug DNA:ta) siten, että läsnä on 10 yug/ml etidiumbromidia, ja katkaisuaika on 28 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTA:ta niin, että lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 10 mM. DNA:n porrastetut päät täytetään käyttämällä Klenow-DNA-polymeraasia. Sitten DNA katkaistaan vielä Sall:llä. 2,2 ke:n Sall-(Hind)/tasapäinen fragmentti eristetään.

Puhdistetut DNA-fragmentit liitetään yhteen ja

yhteenliittämisseoksella transformoidaan E. coli HB101 2+ R

Ca -solut. 24 amp -pesäkettä kasvatetaan. Valmistetaan plasmidi-DNA ja analysoidaan se suorittamalla katkaisut EcoRI:llä ja Sall/Hindlll:11a. Yhden kloonin plasmidi-DNA:lie, jolla on odotetut restriktiofragmentit, annetaan nimeksi pDP38/GAPDL-I-UPA.

Plasmidista pJDB207/GAPDL-UPA eristetään 2,2 ke:n Sali-(Hindlll)/tasapäinen fragmentti vastaavasti katkaisemalla ensin täysin HindIII:lla, suorittamalla Klenow- ¢:219 41 DNA-polymeraasireaktio ja sen jälkeen Sali-katkaisu.

Tämä fragmentti liitetään plasmidiin pDP38, kuten edellä on selostettu. Yhdelle kloonille annetaan nimeksi pDP 3 8/GAPDL-UPA.

Vastaavalla tavalla eristetään plasmideista pJDB207/GAPEL-I-UPA, pJDB207/GAPFL-I-UPA, pJDB207/GAPEL-UPA ja PJDB207/GAPFL-UPA 2,2 ke:n SalI-(HindIII)/tasapäi-set fragmentit. Puhdistetut fragmentit liitetään plasmidiin pDP38. Kullakin yhtenliittämisseoksella transformoidaan E. coli HB101.

Kustakin transformoinnista eristetylle yhdelle kloonille annetaan vastaavasti nimet: pDP38/GAPEL-I-UPA, pDP38/GAPFL-1-UPA, pDP38/GAPEL-UPA ja pDP38/GAPFL-UPA.

Esimerkki 12: S. cerevisiae-kantojen HT246 ja GRF18 transformointi

Saccharomyces cerevisiae-kanta HT246 (a, leu2-3, leu2-112, prb) transformoidaan plasmideilla PJDB207/PHO5-UPA pJDB2 0 7/PH05-1-UPA pJDB207/PHO5-SSUPA pJDB2 0 7 R/PHO5-UPA pJDB207/GAPDL-UPA pJDB207/GAPFL-UPA pJDB207/GAPDL-I-UPA

käyttämällä Hinnen et ai:n transformointimenetelmää (Proc. Natl. Acad. Sei USA 75_, 1929 (1978)). Transformoituneet hiivasolut valitaan maljaamalla hiivan minimira-vinnealustassa, joka ei sisällä leusiinia. Eristetään yksittäiset transformoituneet hiivapesäkkeet ja niille annetaan vastaavasti nimet

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB2Q7/PH05-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-SSUPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207R/PHO5-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPDL-UPA

42 Γ~: r ι·Λ .-. , ' V ' - '

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPFL-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/GAPDL-I-UPA

Vastaavalla tavalla transformoidaan Saccharomyces cerevisiae-kanta GRF18 (DSM 3665)edellä mainituilla plasmideilla. Näin saadut transformoituneet hiivakan-nat nimetään seuraavasti:

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PHO5-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-SSUPA Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207R/PHO5-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPDL-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-UPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPDL-I-UPA.

Esimerkki 13: Saccharomyces cerevisiae-kannan HT350 transformointi S. cerevisiae-kanta HT350 saadaan risteyttämällä S. cerevisiae-kanta HT246 ura-3-vajaan kannan, kuten S. cerevisiae-kannan HT285 (c<, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, ura3, pep4-3) kanssa, jolloin kannalle HT350 saadaan seuraava genotyyppi (o(, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, ura3, prb, pep4-3). Kanta HT350 transformoidaan plasmideilla pDP38/GAPDL-I-UPA, pDP38/GAPFL-I-UPA, pDP38/GAPEL-1-UPA, pDP38/GAPDL-UPA, pDP38/GAPFL-UPA ja pDP38/GAPEL-UPA vastaavasti ja transformoinneissa käytetään Hinnen et ai:n (supra) menetelmää. Transformoituneet hiivasolut valitaan maljaamalla hiivan mini-miravinnealustassa, josta puuttuu urasiili, mutta joka on täydennetty leusiinilla. Eristetään yksittäiset transformoituneet hiivapesäkkeet ja niille annetaan seuraavat nimet:

Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPDL-I-UPA Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPFL-I-UPA Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPEL-I-UPA Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPDL-UPA

43 ΟΓοί γ· y ο λι / y

Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPFL-UPA Saccharomyces cerevisiae HT350/pDP38/GAPEL-UPA

Esimerkki 14; Transformoitujen hiivojen fermentointi

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-UPA, Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHO5-I-UPA ja Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207R/PHO5-I-UPA sisältävät plasmidin, jossa on täyspitkä PHOS-promoottori, josta syystä ne vaativat promoottorin kytkemistä päälle scu-PA:n ilmentämistä varten. Kutakin S. cerevisiae HT246-transformanttikantaa kasvatetaan erikseen 10 ml:ssa hiivan minimiravinnealustaa (Difco Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja niin, että on lisätty 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiiniä) 50 ml:n Erlenmeyer-kolveissa ravistelemalla 30°C:ssa 24 tuntia, kunnes 7 saavutetaan tiheys 5 - 7 x 10 solua/ml. Esiviljelmän solut pestään sen jälkeen 0,9-prosenttisessa NaCl-liuok-sessa ja 20 %:lla esiviljelmän soluja ympätään 50 ml matala-P^-minimiravinnealustaa, joka on valmistettu Difco Yeast Nitrogen Base-ravinnealustan reseptillä (ilman aminohappoja), mutta joka sisältää 0,03 g/1 Ki^PO^, 10 g/1 L-asparagiinia (NH4)2S04:n tilalla, 20 g/1 glukoosia ja 1 g/1 L-histidiiniä. Viljelmiä sekoitetaan 30°C: ssa korkeintaan 48 tuntia nopeudella 180 kierrosta minuu-

O

tissa. Lopulliset solutiheydet ovat 1 x 10 solua/ml (vastaa OD60Q =4-5).

Hiivatransformantit, joissa on GAPDH-promoottori eri pituisena, ilmentävät scu-PA:ta konstitutiivisesti. Vastaavat transformantit, jotka sisältävät pJDB207:sta johdetun plasmidin, kasvatetaan hiivan minimiravinnealus-tassa esiviljelmiksi (edellä). 20 %:lla pestyä esiviljel-raää ympätään 50 ml ravinnerikasta pääviljelmän ra vinne-alustaa, joka sisältää (g/1): peptonia 5, hiivauutetta 10, glukoosia 20, sakkaroosia 40, (NH^^SO^ 3, KH2P04 2, MgSO^ 0,5, NaCl 0,1, CaCl2 0,1, biotiinia 10 ug/1. Solutiheydeksi saadaan noin 1 x 10^ solua/ml (vastaa ODgQo 40 “ 45), kun inkuboidaan 48 tuntia 30°C:ssa kier- 44 PC'? ίο rosnopeudella 200 kierrosta minuutissa.

Vastaavia transformantteja, jotka sisältävät pDP38:sta johdetun plasmidin, kasvatetaan urasiilivalin-nassa. Soluja kasvatetaan 24 tuntia 30°C:ssa kierros-nopeudella 180 kierrosta minuutissa esiviljelmäalustassa, joka sisältää (g/1): kasaminohappoja 4,5, hiivauutetta 6.5, sakkaroosia 20, glukoosia 20, (NH^^SO^ 3,6, K^PO^ 1, Mg604 0,2, CaCl2 0,013 ja hivenaineita, 10 %:lla pestyä esiviljelmää ympätään 50 ml valintaan tarkoitettua pääviljelmän ravinnealustaa, joka sisältää (g/1): Yeast Nitrogen Base:a (Difco, ilman aminohappoja) 5, L-asparagiinia 7,5, kasaminohappoja 8.5, metyylietyylisulfonaattia 10, adeniinia 0,05, L-histidiiniä 0,04, L-leusiinia 0,1, L-tryptofaania 1, Ca-pantotenaattia 0,03, glukoosia 30. Solutihey-

Q

deksi saadaan noin 8 x 10 solua/ml (vastaa OD60Q n. 35), kun inkuboidaan 48 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeudella 200 kierrosta minuutissa.

24 tunnin ja 48 tunnin inkuboinnin jälkeen otetaan vastaavasti solut talteen 2 ml:sta sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 3000 min ^ Falcon 2070-putkissa. Solut pestään kerran 0,9-prosenttisella NaCl-liuoksella ja sentrifugoidaan. Solupelletti suspendoidaan lyysipus-kuriin (66 mM kaliumfosfaaatti, pH 7,4, 4 mM Zwitter-gent (Calbiochem)). Solususpensioon lisätään 8 g lasi-helmiä (halkaisija 0,5 - 0,75 mm) ja saatua suspensiota ravistellaan Vortex-sekoittimessa (Scientific Instruments Inc. USA) täydellä nopeudella 4-5x2 minuuttia. Tällöin rikkoutuu yli 90 % soluista. Rikkoutuneet solunosat ja lasihelmet sentrifugoidaan pohjaan 5 minuutissa nopeudella 3000 min ^ 4°C:ssa. Välittömästi ennen biologisen aktiivisuuden testaamista emäliuokset laimennetaan 500-kertaiseen asti liuoksella, jossa on 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,05 % Tween 80 ja 0,1 % naudan seerumin albumiinia.

45 O ·" n < >u iy

Esimerkki 15: Biologisen aktiivisuuden määrittäminen scu-PA:n amidolyyttinen aktiivisuus voidaan mitata suoraan käyttämällä Kabi:n (KabiVitrum, Tukholma, Ruotsi) synteettistä, kromogeenista tripeptidisubstraattia S-2444 (pyro-Glu-Gly-Arg-pNA). Jotta saataisiin määritetyksi Lysl58:n ja/tai Lysl36:n kohdasta katkenneen tcu-PA:n pitoisuus, suoritetaan määritys valmistajan suositusten mukaisesti {ilman plasmiinilla tapahtuvaa aktivointia). scu-PA vaatii aktivointia plasmiinilla ennen sen amido-lyyttisen aktiivisuuden määrittämistä, mistä syystä suora määritys pitää muuntaa seuraavalla tavalla: 100 yal scu-PA:ta sisältävää näytettä (ks. esimerkki 14) esi-inkuboidaan 0,01 yksikön kanssa ihmisen plasmiinia (Boehringer Mannheim, Saksa) 60 minuuttia 37°C:ssa.

Lisätään 5 kansainvälistä yksikköä aprotiniinia (Boehringer, Mannheim,Saksa) ja saatua seosta inkuboidaan vielä 10 minuuttia 100°C lämpötilassa ennen kromogeenisen substraatin S-2444 (supra) lisäämistä.

Aktiivisuuden kvantifiointi suoritetaan vertaamalla WHO:n urokinaasistandardiin (erä 66/46) ja ilmoitetaan kansainvälisinä yksiköinä (ky). Kaupallisesti saatavissa olevan valmisteen UkidanR (Serono, Freiburg, Saksa)sisältämä! ihmisen virtsasta eristetyn erittäin puhtaan urokinaa-sin ominaisaktiivisuus 70 000 - 100 000 ky/mg proteiinia.

scu-PA-pitoisuus voidaan myös määrittää sen plasmino-geenia aktivoivan vaikutuksen perusteella käyttämällä synteettistä tripeptidisubstraattia S-2251 (KabiVitrum, Tukholma, Ruotsi). Määritys suoritetaan valmistajan suositusten mukaan (KabiVitrum, supra) siten, että streptoki-naasin tilalla ovat plasminogeenin aktivaattoreina scu-PA:ta sisältävät näytteet.

Hiivan fermentointiliuoksissa läsnä oleva antigee-nimäärä arvioidaan dot-blot-menetelmällä (Bio-Rad,

Richmond, USA). Detektiossa käytetään ihmisen virtsan urokinaasiin kohdistuvaa, kanissa tuotettua polyklonaa-lista vasta-ainetta.

46 V u l Ί >' Näytteet otetaan 24 tunnin fermentoinnin jälkeen ja esikäsitellään esimerkissä 14 kuvatulla tavalla. Taulukossa 1 on esitetty yhteenveto eri plasmideilla saaduista plasminogeenia aktivoivista (substraattina S-2251) aktiivisuuksista kahdella eri kannalla.

Taulukko 1 plasmidi isäntä valinta S-2251, aktiivi suus ky/2 x 107 solua PJDB207R/PHO5-UPA HT246 leu 0 PJDB207/PHO5-SSUPA HT246 leu 2,2 PJDB207/PHO5-I-UPA HT246 leu 10 pJDB2 0 7/PH05-UPA HT246 leu 1,4 PJDB207/GAPDL-UPA HT246 leu 9 pDP 38/GAPDL-1-UPA HT350 leu 3 pDP3 8/GAPDL-1-UPA HT350 ura 5,7 PDP38/GAPFL-I-UPA HT350 leu 0,4 PDP38/GAPFL-I-UPA HT350 ura 3,4

Taulukossa 2 on esitetty kyseisillä kolmella menetelmällä määritettyjen aktiivisuuksien vertailu. Taulukossa on esitetty volymetriset kokonaistiitterit (per ml viljelmälientä) kun on fermentoitu 48 tuntia HT246-kantaa, joka sisälsi plasmidin pJDB207/GAPDL-I-UPA.

Taulukko 2 _ky/ml viljelmälientä_

Aktiivisuus kun Aktiivisuus kun dot-blottaus kohteena on kohteena on (arvio) S-2444 S-2444 S-2251 ilman plasmiinin plasmiinia kanssa _______ 25,8 215 1670 noin 1000 Q'*' Γ' Γ· L- ζ. iy 47

Tuloksista ilmenee, että paras scu-PA:n tuotto saavutetaan hiivalla, kun DNA-rakenne sisältää hiivan signaalisekvenssin, kuten PH05:n tai invertaasin signaali-senvenssin. Tuloksista ilmenee lisäksi, että scu-PA ilmenee erilaisissa hiivaisäntätaustoissa niin, että fermentointi valintaolosuhteissa (joko matala-P^-minimira-vinnealusta tai urasiilivalinta) johtaa suhteellisesti suurempaan ominaistuottoon per OD.

Noin 90 % ilmentymistuotteesta on scu-PA:ta, kun tarkastellaan S-2444:ään kohdistuvan aktiivisuuden mittaustuloksia, kun määrityksissä on aktivoitu plasmiinilla tai ei ole aktivoitu. Dot-blottaus osoittaa, että läsnä oleva antigeenin määrä ei merkitsevästi ylitä mittaamalla saatua biologista aktiivisuutta. Näin ollen geeniteknologialla hiivassa tuotettu scu-PA on laskostu-nut oikealla tavalla niin, että tuloksena on aito scu-PA.

Esimerkki 16: scu-PA:n talteenotto hiivasoluista (30 litraa viljelmälientä) S. cerevisiae-kantaa HT246/pJDB207/GAPDL-I-UPA kasvatetaan samoin kuin hirudiinin tuottamiseksi kasvatettua S. cerevisiae-kantaa GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 225633).

Solujen sisällä oleva scu-PA-määrä (solujen rikkomisen jälkeen, ks. esimerkki 14) määritetään epäsuoralla amido-lyyttisellä määritysmenetelmällä käyttämällä substraattia S-2251 (ks. esimerkki 15). 48 tunnin inkuboinnin jälkeen solut otetaan talteen sentrifugoimalla Sharples-sentrifugissa (Appareils Centrifuges, Rueil, Ranska) ja suspendoidaan yhtä suureen tilavuuteen lyysipuskuria (200 mM K^HPO^, 0,2 % Tween 80). Sitten solut rikotaan lasikuulamyllyssä (Dyno-Mill, KDL, Bachofen AG, Basel; 4500 min"’1, 18 1/h). Sitten suspensiosta tehdään viisinkertainen laimennos liuoksella, jossa on 150 mM NaCl ja 0,05 % Tween 80, ja solujen osat sentrifugoidaan pohjaan 4°C:ssa siten, että läsnä on 0,6 °/QQ polyetyleeni-imiiniä, käyttämällä Westfalia separator- laitetta SB7-47.

48 90219

Hieman samea emaliuos suodatetaan Zetapor Cartridge:n (huokoshalkaisija 0,22 pm) läpi ja sen pH:ksi säädetään 6,05 lisäämällä 1 N suolahappoa. Lisätään 1 litra katio-ninvaihtimena toimivaa S-Sepharose fast flow:ta (Pharmacia) per kg pohjaan kerrostuneita hiivasoluja ja saatua suspensiota sekoitetaan 1 tunti 4°C:ssa. Sitten helmet siirretään pylvääseen, jonka halkaisija on 9 cm, ja pestään liuoksella, jossa on 50 mM natriumfosfaattia pH 7,0, 150 mM NaCl ja 0,05 % Synperonic:ia. Sitten scu-PA eluoidaan virtausnopeudella 30 ml/min samalla puskurilla, joka sisältää 250 mM NaCl. Jakeisiin, jotka sisältävät scu-PA:n (mitattu suoralla amidolyyttisellä määritysmenetelmällä; ks. esimerkki 15) lisätään concanava-lin A Sepharose:a (Pharmacia) (1 ml geeliä per 0,2 mg scu-PA:ta) ja saatua suspensiota sekoitetaan 45 minuuttia 4°C:ssa. Sen jälkeen helmet pestään liuoksella, jossa on 1 M NaCl, 10 mM natriumfosfaattia pH 7,0 ja 0,05 % Synperonic:ia, ja pestyt helmet siirretään pylvääseen, jonka halkaisija on 4,4 cm, ja scu-PA eluoidaan virtausnopeudella 1 1/h liuoksella, jossa on 0,8 M metyy-li-c^-D-mannopyranosidia, 150 mM NaCl, 20 mM natriumase-taattia, pH 4,0, ja 0,05 % Synperonic:ia. Jakeisiin, jotka sisältävät scu-PA:ta, lisätään antiurokinaasi-IgG-Sepharose:a (kanissa tuotettu puhdistettu polyklonaa-linen vasta-aine (igG-jae), joka on aikaansaatu ihmisen virtsan urokinaasia vastaan)ja saatua suspensiota sekoitetaan 45 minuuttia 4°C:ssa. Sitten helmet siirretään pylvääseen, jonka halkaisija on 2,2 cm, ja pestään liuoksella, jossa on 1 M NaCl, 10 mM natriumfosfaattia, pH 7,0, ja 0,05 % Synperonic:ia, virtausnopeudella 1 ml/min. scu-PA:ta sisältävien jakeiden pH säädetään arvoon 6 lisäämällä 1 N NaOH-liuosta.

Tässä vaiheessa noin 25 - 30 % kokonaisaktiivisuu-desta on tcu-PA:ta, kun toteaminen suoritetaan suoralla amidolyyttisellä määrityksellä (ks. esimerkki 15)

Vasta-ainepylväästä tullut effluentti sijoitetaan 49 O r ,Λ ·: y ( , / : l

^ d- I

Mono-S-pylvääseen (täytteen tilavuus 1 ml; Pharmacia), joka on tasapainotettu liuoksella, jossa on 50 mM nat-riumfosfaattia, pH 6,0, ja 0,05 % Synperonic:ia. Kun on pesty tasapainotuspuskurilla, scu-PA eluoidaan porrastetulla gradientilla, joka koostuu tasapainotuspus-kurista ja puskurista B, jossa on 500 mM NaCl, 50 mM natriumfosfaattia pH 7,0 ja 0,05 % Synperonic:ia, virtausnopeuden ollessa 1 ml/min. Tässä eluutiossa havaitaan kaksi aktiivisuuspiikkiä, ensimmäinen, joka eluoituu ensimmäisessä portaassa, joka sisältää 30 % puskuria B, ja toinen, joka eluoituu toisessa portaassa, joka sisältää 55 % puskuria B. Suora amidolyyttinen määritys paljasti, että 30 %:n B-määrällä eluoitunut jae sisälsi vielä suuren määrän tcu-PA:ta, kun taas 55 %:n B-määrällä eluoitunut jae sisälsi vain 1 - 3 % tcu-PA:ta.

Tällä tavoin tuotettu hiivan scu-PA vaeltaa yhtenä vyöhykkeenä, jonka molekyylimassa on noin 51 kilodaltonia, SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa ei-pelkistävissä olosuhteissa. Näin saadun scu-pA:n puhtausaste on noin 95% tai enemmän, kun arviointi suoritetaan suoralla amidolyyttisellä määrityksellä (ks. esimerkki 15) ja SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla pelkistävissä olosuhteissa.

Esimerkki 17: Hiivan scu-PA:n qlykosyloituneisuusaste 125

Glykosyloituneisuus määritetään i-konkanavaliini A-peittomenetelmällä geelielektroforeesin jälkeen. Konka-navaliini A on kasvilesitiini, joka tunnistaa spesifisesti mannoositähteitä. Hiivasta saatu puhdistettu

R

scu-PA ja u-PA-standardina käytetty Ukidan (Serono, Freiburg, Saksa) alistetaan geelielektroforeesiin käyttämällä 10-prosenttisia geelejä. Sitten proteiinit kiinnitetään geeleihin 7-prosenttisella etikkahapolla 30 minuutin kuluessa. Sitten geelit pestään puskurilla, jonka koostumus on seuraava: 50

n ' r- -·· '' y L l. i V

0,15 M NaCl 50 mM Tris.HCl pH 7,4 0,5 mM CaCl2 0,5 mM MnCl2

Pesua jatketaan, kunnes pH saavuttaa arvon 7,3. Sitten geeli peitetään varovaisesti 2 ml:11a lesitiinipusku- ria, joka sisältää 3 mg hemoglobiinia, 100 ug konkanavalii- 125 ni A:ta ja 2 jiCi I-konkanavaliini A:ta.

Toinen muuten identtinen geeli peitetään edellä mainitulla seoksella, joka sisältää täydennyksenä 0,2 M <-metyylimannosidia, Kun on inkuboitu 3 tuntia kosteus-kammiossa, geelit pestään perusteellisesti lesitiinipus-kurissa, kuivataan ja valotetaan röntgenfilmeille. Kun p ^-metyylimannosidia ei ole, sekä Ukidan että hiivan 125 scu-PA värjäytyvät I-konkanavaliinilla. Näiden mole-kyylimassat ovat oleellisesti ottaen identtiset. Kun läsnä on <*-metyylimannosidia, joka on lesitiinin sitoutumisen kompetitiivinen inhibiittori, ihmisen virtsan urokinaasi häipyy, mutta hiivan scu-PA jää vielä näkyviin. Tämä osoittaa, että hiivan scu-PA on glykosyloitu-nut, ja että sen glykosyloituneisuus on tyypiltään erilaista kuin ihmisen virtsan urokinaasin.

Esimerkki 18: scu-PA:n jatkopuhdistus scu-PA-liuos (ks. esimerkki 16), joka on dialysoitu liuosta vasten, jossa on 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 % Tween 80 ja 0,05 M NaCl, ladataan 3 ml:n bentsamidiini-Sepharose-pylvääseen (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) ja pestään Tris-HCl-puskurilla, pH 8,0, joka sisältää 1 M NaCl. scu-PA saadaan täysin talteen läpi virranneessa liuoksessa ja pesuliuoksessa, kun taas tcu-PA-sivu-tuote voidaan eluoida pylväästä 0,05 M Tris-HCl-puskurilla, pH 8,0, joka sisältää 1 M L-arginiinia. Näin saadun scu-PA:n puhtausaste on noin 98 % tai enemmän.

Π ^ Ί r -51

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LG Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LS Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-I-UPA-LGP Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PHO5-I-UPA-LSP Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PHO5-I-UPA-LGPW Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PH05-I-UPA-LSPW

Kantoja kasvatetaan kuten esimerkissä 14 on selostettu. scu-PA-mutanttiproteiinit eristetään kuten esimerkissä 16 tai 18 on selostettu.

Esimerkki 19 : Ensimmäinen farmaseuttinen koostumus parenteraalista antoa varten

Parenteraalisesti annettavaksi tarkoitettu liuos valmistetaan liuottamalla 3 mg puhdistettua scu-PA:ta, 25 mg mannitolia ja 45 mg natriumkloridia 5 ml:aan steriloitua vettä ja sekoittamalla näin saatu liuos sopivaan tilavuuteen 5-prosenttista glukoosiliuosta. Liuos steriloidaan suodattamalla 0,22 pn:n kalvosuodattimen läpi.

Esimerkki 20 : Toinen farmaseuttinen koostumus parente raalista antoa varten (injektoitava dispersio) 169,3 mg soijalesitiiniä (soybean phosphatide NC 95, valmistaja Nattermann, Köln, Saksa; puhtausaste 90 - 96 %, rasvahappokoostumus: linolihappoa 61 - 71 %, linoleenihappoa 4 - 7 %, öljyhappoa 6 - 13 %, palmitii-nihappoa 10 - 15 %, steariinihappoa 1,5 - 3,5 %) ja 92,7 mg puhdasta natriumglykokolaattia liuotetaan 752,5 ml:aan steriloitua vettä.Liuoksen pH säädetään arvoon 7,4 lisäämällä 1 N natriumhydroksidia. Lisätään 10 mg lyofi-lisoitua scu-PA:ta. Seosta sekoitetaan, kunnes saadaan kirkas liuos. Liuos steriloidaan suodattamalla 0,22 ^im:n kalvosuodattimen läpi ja annostellaan ampulleihin.

C.- <"·. y\ r - l . / s' v- i y 52

Mikro-organismien talletukset

Seuraavat mikro-organismikannat talletettiin Deutsche Sanunlung von Mikroorganismen-kokoelmiin (DSM) *Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, **Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig (talletuspäivämäärät ja kokoelmanumerot on ilmoitettu): *Saccharomyces cerevisiae HT246: 15. huhtikuuta, 1987; DSM 4084; **Escherichia coli HB101/pCS16: 23. lokakuuta, 1987; DSM 4294; **Escherichia coli HB101/p31R/SS-TPAA2: 23. lokakuuta, 1987; DSM 4295; **Escherichia coli HB101/pcUK176: 23 lokakuuta, 1987; DSM 4290; **Escherichia coli JM109/pDP38: 19. helmikuuta, 1988; DSM 4414.

Claims (7)

9C219

1. Förfarande för produktion av en enkelsträngad human plasminogenaktivator av urokinastyp, kannetecknat därav, att en stam av Saccharomyces cerevisiae, som transforme-rats med en hybridvektor, som innehäller en uttrycknings-reguleringssekvens av S. cerevisiae, ett DNA-fragment, som bestär av en första DNA-sekvens, som kodar för en signalpeptid och är uppströms av och i läsram med en andra DNA-sekvens, som kodar för en mogen plasminogenak-tivator av urokinastyp, och vilket DNA-fragment är i transkriptionell kontroll av den nämnda uttryckningsregu-leringssekvensen, och en DNA-sekvens, som innehäller transkriptionsterminationssignaler av en S. cerevisiae gen, odlas i lämpliga näringsförhällanden, och den nämnda plasminogenaktivatorn av urokinastyp isoleras.

1. Menetelmä ihmisen yksiketjuisen urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että sopivissa ravinneolosuhteissa viljellään Saccharomyces cerevisiae -kantaa, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, joka sisältää S. cerevisiaen ilmentymisensäätelysekvenssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaali-peptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toiseen DNA-sekvenssiin nähden, joka koodittaa kypsää uro-kinaasityyppistä plasminogeenin aktivaattoria, ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentymisensäätelysekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja DNA-sekvenssin, joka sisältää S.cerevisiaen geenin transkriptionlopetus-signaalit, ja mainittu urokinaasityyppinen plasminogeenin aktivaattori eristetään.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav. o ·' r> ·Ί (- 56 ’ -·' att en plasminogenaktivator produceras, som har amino-syrasekvensen av den naturliga enkelsträngade humana plasminogenaktivatorn av urokinastyp, i vilken Asn302 är jästspecifikt glykosylerad.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotetaan plasminogeenin aktivaattoria, jolla on luonnollisen ihmisen yksiketjuisen urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin aminohapposekvenssi, jossa Asn302 on hiivaspesifisesti glykosyloitunut.

3. Förfarande enligt patentkravet 1, kannetecknat därav, att ett protein enligt formeln I produceras Ser Asn Glu Leu His Gin Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn lie Hi9 Trp Cys Asn Cys Pro Ly6 Lys Phe Gly Gly Gin His Cys Glu lie Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu Gin Gin Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gin Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gin Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Xj X2 Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gin Cys Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Yi Y2 Yj lie lie Gly Gly Glu Phe Thr Thr lie Glu Asn Gin Pro Trp Phe Ala Ala He Tyr Arg Arg Hie Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu He Ser Pro Cys Trp Val lie Ser Ala Thr His Cys Phe He Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr lie Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu He Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp lie Ala Leu Leu Lys lie Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gin Pro Ser Arg Thr lie Gin Thr He Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gin Phe Gly Thr Ser Cys Glu lie Thr Gly Phe Gly Lys Glu Z\ Ser Z2 Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gin Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu He Ser His Arg Glu Cys Gin Gin Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gin Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gin Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp lie Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu it IN ( »IIH !! 4 Ht ' Pi ^ rs Λ r-- v * i vilken formel var och en av grupperna X3 och X2 kan vara Lys, Yj är Arg, Y2 är Phe, Y3 är Lys, Z1 är Asn, sora är jästspecifikt glykosylerad och Z2 är Thr.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotetaan kaavan I mukaista proteiinia Ser Asn Glu Leu His Gin Vai Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Vai Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile Hls Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gin His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Vai Leu Gin Gin Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Vai Gin Vai Gly Leu Lys Pro Leu Vai Gin Glu Cys Met Vai His Asp Cys Ala Asp Gly Xj X2 Pro Ser Ser Pro Pro Glu n-z i y Glu Leu Lys Phe Gin Cys Gly Gin Lys Thr Leu Arg Pro Yj Yj Y3 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gin Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg Ηίε Arg Gly Gly Ser Vai Thr Tyr Vai Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Vai Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Vai Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin Gly Glu Met Lys Phe Glu Vai Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gin Pro Ser Arg Thr Ile Gin Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gin Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu l\ Ser Z2 Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gin Leu Lys Met Thr Vai Vai Lys Leu lie Ser His Arg Glu Cys Gin Gin Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Vai Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gin Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Ser Leu Gin Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu jossa kaavassa kumpikin ryhmistä X3 ja X2 voi olla Lys, Y3 on Arg, Y2 on Phe, Y3 on Lys, Zx on Asn, joka on hiivaspe-sifisesti glykosyloitunut ja Z2 on Thr.

4. S. cerevisiae hybridvektor, kännetecknad därav, att den innehäller en uttryckningsreguleringssekvens av S. cerevisiae, ett DNA-fragment, som bestär av en första DNA-sekvens, som kodar för en signalpeptid och är upp-ströms av och i läsram med en andra DNA-sekvens, som kodar för en mogen plasminogenaktivator av urokinastyp, och vilket DNA-fragment är i transkriptionell kontroll av den nämnda uttryckningsreguleringssekvensen, och en DNA-sekvens, som innehäller t-ranskriptionsterminationssigna-ler av en S. cerevisiae gen.

4. S. cerevisiae -yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää S. cerevisiaen ilmentymisensäätelysek-venssin, DNA-jakson, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sek-venssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toiseen DNA-sekvenssiin nähden, joka koodittaa kypsää urokinaasityyppistä plas-minogeenin aktivaattoria, ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentymisensäätelysekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja DNA-sekvenssin, joka sisältää S. cerevisiaen geenin transkriptionlopetussignaalit.

5. S. cerevisiae hybridvektor enligt patentkravet 4, kännetecknad därav, att den innehäller PH05- eller GAPDH-promotorn av S. cerevisiae.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen S. cerevisiae -yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää S. cerevisiaen PH05- tai GAPDH-promoottorin. 55 90-219

6. S. cerevisiae hybridvektor enligt patentkravet 4, kännetecknad därav, att den innehäller en signalsekvens härledd frän PHOS-genen av S. cerevisiae, invertasgenen av S. cerevisiae, eller den humana urokinasgenen.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen S. cerevisiae -yhdis-telmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää signaa-lisekvenssin, joka on johdettu S. cerevisiaen PH05-gee-nistä, S. cerevisiaen invertaasigeenistä tai ihmisen uro-kinaasigeenistä.

7. Transformoitunut S. cerevisiae -isäntä, tunnettu siitä, että se sisältää yhdistelmävektorin, jossa on S. cerevisiaen ilmentymisensäätelysekvenssi, DNA-jakso, joka koostuu ensimmäisestä DNA-sekvenssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä ja on ylävirrassa ja lukuvaiheistuksessa toiseen DNA-sekvenssiin nähden, joka koodittaa kypsää urokinaasityyppistä plasminogeenin aktivaattoria, ja joka DNA-jakso on mainitun ilmentymisensäätelysekvenssin transkriptionaalisessa ohjauksessa, ja DNA-sekvenssin, joka sisältää S. cerevisiaen geenin transkriptionlopetus-signaalit.

7. Transformerad S. cerevisiae värd, kännetecknad därav, att den innehäller en hybridvektor, som har en uttryckningsreguleringssekvens av S. cerevisiae, ett DNA-fragment, som bestär av en första DNA-sekvens, som kodar för en signalpeptid och är uppströms av och i läsram med en andra DNA-sekvens, som kodar för en mogen plasminogenaktivator av urokinastyp, och vilket DNA-fragment är i transkriptionell kontroll av den nämnda uttryckningsregu-leringssekvensen, och en DNA-sekvens, som innehäller transkriptionsterminationssignaler av en S. cerevisiae gen.